close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

17.Сельскохозяйственная биология №3 2011

код для вставкиСкачать
???????????????????? ????????
ISSN 0131-6397
????????????????????
????????
?3/2011
(1-128)
?????? 70804
ISSN 0131-6397
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
??????????
????????
????????????????????
????
????????????????????
????????
?????
????????
????????
?3/2011
?3
2011
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Специальный выпуск, посвященный 80-летию создания Всероссийского
НИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии (1930)
и 120-летию организации Бактериологической лаборатории при
Департаменте земледелия и государственных имуществ России (1891)
Создатели российской школы сельскохозяйственной микробиологии
Б.Л. Исаченко (1871-1948)
С.С. Мережковский (1862-1930) С.П. Костычев (1877-1931)
Б.Л. Исаченко — инициатор изучения симбиотической азотфиксации, создал первую
коллекцию клубеньковых бактерий, разработал основы производства нитрагина. Полученные
им штаммы сальмонеллы до настоящего времени используются для производства родентоцидных препаратов.
С.С. Мережковский — один из организаторов Бактериологической лаборатории при
Департаменте земледелия и государственных имуществ (1891), позднее преобразованной во
ВНИИСХМ. Разработал эффективные методы микробиологического контроля грызунов.
С.П. Костычев — организатор (1930) и первый директор Всесоюзного (ныне Всероссийского) НИИ сельскохозяйственной микробиологии. Показал ведущую роль микроорганизмов
в продуктивности растений, которая связана с их положительным влиянием на состав и
физиологическую активность почвенной микрофлоры.
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
??????????
????????
????????????????????
????
????????????????????
????????
??????-?????????????
??????
???????
? ??????
1966 ????
?????
????????
????????
????? ??????? ??? ???? ? ???
?3
??? – ????
2011 ??????
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ
А.А. ЖУЧЕНКО — председатель
В.М. АНАНЬИНА, Н.Н. БАЛАШОВА, Л.А. БЕСПАЛОВА, А.А. ГОНЧАРЕНКО,
П.Л. ГОНЧАРОВ, И.В. ГОРБАЧЕВ, Н.И. ДЗЮБЕНКО, В.А. ДРАГАВЦЕВ,
С.С. ЛИТВИНОВ, В.М. ЛУКОМЕЦ, К.В. НОВОЖИЛОВ, В.Ф. ПИВОВАРОВ,
И.В. САВЧЕНКО, Б.И. САНДУХАДЗЕ, Е.Н. СЕДОВ, И.А. ТИХОНОВИЧ,
И.Е. УГРЮМОВА (зам. главного редактора), Л.М. ФЕДОРОВА (главный редактор), Е.М. ХАРИТОНОВ, Л.В. ХОТЫЛЕВА, А.К. ЧАЙКА
EDITORIAL BOARD
A.A. ZHUCHENKO — Chairman of the Editorial Board
V.M. ANANYINA, N.N. BALASHOVA, L.A. BESPALOVA, A.A. GONCHARENKO,
P.L. GONCHAROV, I.V. GORBACHEV, N.I. DZYUBENKO, V.A. DRAGAVTSEV,
S.S. LITVINOV, V.M. LUKOMETS, K.V. NOVOZHILOV, V.F. PIVOVAROV,
I.V. SAVCHENKO, B.I. SANDUKHADZE, E.N. SEDOV, I.A. TIKHONOVICH,
I.E. UGRYUMOVA (assistant editor-in-chief), L.M. FEDOROVA (editor-in-chief),
E.M. KHARITONOV, L.V. KHOTYLEVA, A.K. CHAIKA
Журнал входит в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий в Российской Федерации (Перечень ВАК), в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой
степени доктора и кандидата наук (по агрономии и лесному хозяйству, а
также по биологическим наукам).
Научные редакторы Е.В. КАРАСЕВА, Л.М. ФЕДОРОВА
Заведующая редакцией И.Н. БЕЛОЗЕРОВА
Корректор М.Л. ГЕНИНГ
Адрес редакции:
127434 г. Москва, Дмитровское ш., д. 11, офис 343,
журнал «Сельскохозяйственная биология»
Телефон/факс: + 7 (499) 977-88-19, + 7 (499) 976-32-73
E-mail: agr.biologia@mtu-net.ru Сайт в Интернете: www.agrobiology.ru
Учредитель — Российская академия сельскохозяйственных наук
Рег. № 01019 от 23 апреля 1992 года Министерства печати и информации РФ
ФГУП «Типография» Россельхозакадемии: 115598 г. Москва, ул. Ягодная, д. 12
Формат 70Ч108 1/16. Печать офсетная. Заказ
© «Сельскохозяйственная биология», 2011
Цена 400 р.
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
Эколого-генетические основы растительно-микробного симбиоза
УДК 631.46:579.64:[576.8.095.38+581.557(575)
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ КАК ОСНОВА
ЭКОЛОГИЧЕСКИ УСТОЙЧИВОГО АГРОПРОИЗВОДСТВА:
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ?
И.А. ТИХОНОВИЧ, Н.А. ПРОВОРОВ
Основу сельскохозяйственной микробиологии составляет изучение микробных сообществ, обитающих в
растениях, животных и почвах. Поскольку растения и животные создают на поверхностях, в тканях и в клетках разнообразные ниши для размещения микробных партнеров, гены, контролирующие развитие этих ниш, служат важнейшими детерминантами активности хозяйственно ценных микроорганизмов. Знания об их генетике, физиологии, молекулярной биологии и экологии позволяют создавать системы экологически устойчивого агропроизводства, в которых
продуктивность растений и животных повышена за счет изменения состава и свойств их микробных симбионтов, экологически опасные агрохимикаты (минеральные удобрения, пестициды) полностью или частично замещены препаратами микроорганизмов, снижена энергоемкость производства и повышено качество продукции.
Ключевые слова: сельскохозяйственная микробиология, микробно-растительные взаимодействия, азотфиксирующие симбиозы, арбускулярная микориза, эндофитные микроорганизмы, ризосферные ростсимулирующие бактерии,
биоконтроль вредителей и патогенов, микробиота рубца, метагеномы почвы, экологически устойчивое земледелие.
Keywords: agricultural microbiology, microbe-plant interactions, N2-fixing symbioses, arbuscular mycorrhiza, endophytic microorganisms, rhizospheric growth-stimulating bacteria, biocontrol of pests and pathogens, microbiota of rumen, metagenomes of soil, ecologically sustainable soil tillage.
В 2011 году исполняется 120 лет с начала развития сельскохозяйственной микробиологии в России: в 1891 году в Санкт-Петербурге при Департаменте земледелия и государственных имуществ была организована Бактериологическая лаборатория, задачей которой стало создание микробиологических методов борьбы с мышевидными грызунами.
Вскоре к производству «мышеубивающих» препаратов добавилось изучение инфекционных
болезней растений и животных, а также микробиологических основ изготовления молочных
продуктов и вина. После преобразования лаборатории во Всесоюзный (ныне Всероссийский) НИИ сельскохозяйственной микробиологии по инициативе его организатора и первого директора С.П. Костычева началось активное исследование полезных взаимодействий
микроорганизмов с растениями, которое и в настоящее время составляет основу научной
тематики института. В результате развития этого комплекса направлений сельскохозяйственная микробиология переросла в самостоятельную научную дисциплину, органически сочетающую фундаментальные и прикладные аспекты. При этом речь идет не только о передаче теоретических знаний в производство: огромную роль играют обратные связи практики и теории, стимулирующие постановку новых фундаментальных задач.
Сельскохозяйственная микробиология стала особенно актуальной в связи с необходимостью экологизации сельскохозяйственного производства. Интенсивные агротехнологии, обеспечив «зеленую революцию» середины XX века, привели к непредвиденным последствиям — глобальному загрязнению биосферы, неблагоприятным изменениям климата,
утрате биоразнообразия в большинстве природных экосистем и в конечном итоге к снижению качества жизни народонаселения Земли. Поэтому все большее внимание уделяется
развитию экологически устойчивых сельскохозяйственных систем, в которых продуктивность растений и животных обеспечивается использованием их биологических возможностей,
при минимальном применении экологически опасных агрохимикатов — минеральных удобрений, пестицидов, регуляторов роста (1, 2). Один из основных способов достижения этой
цели — частичное или полное замещение агрохимикатов препаратами симбиотических
микроорганизмов, которые в природе успешно обеспечивают своих хозяев питательными
веществами и защищают их от биотических и абиотических стрессов (3, 4).
Сельскохозяйственное производство зависит от активности разнообразных микроорганизмов, обеспечивающих питание и развитие растений и животных, биоконтроль вредителей (насекомые-фитофаги, грызуны) и сорных растений, плодородие почвы (табл.).
Наиболее изученные примеры сельскохозяйственно значимых симбиозов растений и животных с микроорганизмами
Тип симбиоза
Трофический
Защитный
?
Функция
Растительно-микробн
Фиксация N2:
клубеньковая
эндофитная
ризосферная
Ассимиляция нерастворимых фосфатов
почвы
Подавление растительноядных
животных
Подавление патогенных грибов
Хозяин
Микросимбионт
ые взаимодействия
Двудольные, клада Rosid 1
Злаки
Разные растения
80-90 % наземных
растений
Разные растения
Разные растения
Ризобии, Frankia
Azoarcus
Azospirillum spp.
Гломусовые грибы
Спорыньевые грибы (Clavicipitaceae), Clavibacter toxicus
Pseudomonas spp.
Работа поддержана грантами РФФИ (09-04-00907а, 09-04-91007-АНФ_а, 09-04-92865-НИСИ_а, 10-0401146-а), РФФИ-NWO (047.018.001), НШ-3440.2010.4 и Госконтрактами (02.740.11.0276, 02.740.11.0698).
3
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Биоконтрольный Подавление сорняков
Amaranthus, Orobanche,
Senecio
Взаимодействия животных с микроорган
Трофический
Расщепление целлюлозы с одновременЖвачные животные
ной утилизацией азотных шлаков хозяина и синтезом белка
(микробиота рубца)
Защитный
Активация иммунной системы хозяина
Биоконтрольный Подавление насекомых-фитофагов Lepidoptera, Coleoptera,
Diptera
Подавление грызунов
Мыши, крысы
Продолжение таблицы
Различные патогенные
грибы и бактерии (24, 25)
измами
Многочисленные
микробные сообщества,
которые включают
несколько сотен видов
Bacillus thuringiensis
Salmonella enteritidis
Исторически сельскохозяйственная микробиология возникла на основе ветеринарии:
начало работ по инфекционным болезням тутового шелкопряда, вызванным грибом Beauveria
bassiana, датировано первой половиной XIX века (5). Однако методологически она наиболее
тесно связана с почвенной микробиологией, поскольку большинство хозяйственно значимых
симбиотических микроорганизмов представляют собой продукты онтогенетической трансформации и эволюции почвенной микробиоты (рис. 1). Изучение почвенных микроорганизмов инициировал С.Н. Виноградский. Он разделил их на метаболически активные организмы
(R-стратеги), которые ассимилируют неорганические, низкомолекулярные органические вещества и быстро ферментируют высокомолекулярные органические соединения — белки,
целлюлозу, пектин, хитин («зимогенная» микрофлора), и метаболически малоактивные организмы (k-стратеги), способные к деструкции и синтезу гумусовых веществ («аутохтонная»
микрофлора) (6). Основной объект почвенной микробиологии — зимогенная микрофлора,
доступная для изучения современными молекулярно-биологическими методами. На ее хозяйственное значение первым обратил внимание С.П. Костычев, связавший активность быстро
развивающихся почвенных микроорганизмов с жизнедеятельностью растений (7). Подразумевалось, что растения служат источниками питательных субстратов — быстроусвояемых корневых экссудатов и медленнее утилизируемых остатков отмирающих органов. Используя эти
субстраты, почвенные микробы формируют биологически активное окружение растений, поставляющее генетические ресурсы для эволюции симбиотически специализированных форм.
Рис. 1. Миграция сельскохозяйственно важных микроорганизмов в
биоценозе. Широкими стрелками показаны основные направления миграции (белые — преобразование различных типов микробных сообществ,
черные — их трансформация в двухкомпонентные симбиозы), пунктирные
стрелки — гипотетические направления
миграции, изогнутые — переход микроорганизмов из животных в почву.
Эндофитная микрофлора разделена
на две группы, обитающие в корнях и
стеблях (1) и в листьях (2), с разными
источниками инфицирования.
П и т а н и е с п ом о щ ь ю м и к р о о р г а н и зм о в: с и м б и о з ы, о с н ов а н н ы е н а м у т у а л и зм е. Растения и животные формируют симбиозы с разнообразными микроорганизмами, обеспечивающими питание своих
хозяев. Значимость этих симбиозов определяется тем, что большинство высших организмов
не может полностью обеспечить свое полноценное питание, испытывая дисбаланс основных его элементов: растения и животные-фитофаги получают избыток углерода, однако испытывают дефицит других макроэлементов, в первую очередь азота и фосфора. Наилучшими моделями для изучения трофических симбиозов служат двухкомпонентные растительномикробные системы. Их мутуалистическая природа основана на положительных обратных
связях партнеров: например, растения снабжают продуктами фотосинтеза преимущественно
те части корня, из которых активно поступает азот (клубеньки) или фосфор (микоризованные
участки кортекса). Установление подобных связей основано на системной регуляции, которая
в случае бобово-ризобиального симбиоза включает элементы, как общие с системами защиты от патогенов (например, салициловую и жасмоновую кислоты), так и не участвующие в
этой защите (гены группы CLAVATA, контролирующие формирование меристем, ген HAR1,
участвующий в образовании боковых корней) (8). Важно отметить, что у бобовых системный ответ, регулирующий образование клубеньков, формируется в листьях (9), что отражает
зависимость энергоемких симбиотических процессов от фотосинтеза. В то же время регуляция усвоения связанного азота (нитратов) в основном ограничена корнем (8).
Поскольку растения и животные образуют на своих поверхностях, в тканях,
внутренних полостях, а иногда и в клетках разнообразные ниши для размещения микробных партнеров, гены хозяина, ответственные за развитие этих ниш, могут рассматриваться как важнейшие детерминанты экологических функций микросимбионтов.
Изучение двухкомпонентных симбиозов позволило нам описать феномен генетической
интеграции неродственных организмов, приводящей к образованию надорганизменных
систем наследственности — симбиогеномов (4, 10).
4
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
На субклеточном уровне симбиотрофное питание растений азотом включает диалог нескольких партнеров — растения-хозяина, его перманентных эндосимбионтов (пластиды и митохондрии, эволюционно возникшие соответственно из цианобактерий и аэробных ?-протеобактерий) и временных симбионтов (бактероиды ризобий, находящиеся в
симбиосомах) (рис. 2). Таким образом, двухкомпонентная на первый взгляд бобово-ризобиальная симбиоистема оказывается многокомпонентной и по степени функциональной
целостности превосходит эндофитные сообщества, которые будут рассмотрены ниже.
Экологически наиболее
важная форма трофического
симбиоза — арбускулярная микориза (АМ), которую наземные
растения образуют с гломусовыми грибами (Glomeromycota).
Благодаря этому симбиозу подавляющее большинство (до 90 %)
наземных растений получают основную часть минерального (в
первую очередь фосфорного)
питания (11). Более того, АМ —
эволюционный предшественник
для большинства корневых симбиозов: растительные гены, гомологичные генам регуляции
АМ, участвуют в развитии клубеньков, в формировании ризосферных ассоциаций, а также
Рис. 2. Схема взаимодействия эндосимбиотических компонентов клетки
в защите от патогенов (12). К
при симбиотрофном питании растений азотом: ФЕП — фосфоенолпируват, ОА — оксалоацетат, ФЕПК — фосфоенолпируваткарбокчислу таких генов относятся
силаза, МДГ — малатдегидрогеназа, ГС — глутаминсинтетаза, ГТС —
факторы сигнального взаимоглутаматсинтаза, ААТ — аспартатаминотрансфераза, АС — аспарадействия, например гены регинсинтаза, ЦТК — цикл трикарбоновых кислот.
цепторных киназ, которые играют важную роль практически во всех типах микробно-растительного симбиоза (13).
Важно отметить, что в природе гломусовые грибы колонизируют растения в тесной кооперации с сателлитными бактериями, населяющими поверхности гиф и их цитоплазму,
что делает АМ многокомпонентной симбиотической системой (14). Некоторые виды ризобий представляют собой продукты эволюции этих сателлитов, обеспечившей приобретение ими собственной, независимой от гриба симбиотической функции — снабжения растений азотом (15).
Несмотря на очевидные отличия от клубенькового симбиоза, ризосферные ассоциации, образуемые азотфиксирующими микроорганизмами, например Azospirillum (16), имеют с
ним ряд общих черт. Так, азоспириллы образуют с хозяевами положительные обратные
связи — стимулируют развитие корней с помощью фитогормонов (главным образом, ауксинов), а получаемые в результате усиленной корневой экссудации С-соединения используют для покрытия энергетической стоимости N2-фиксации и размножения бактерий (17).
Однако ризосферные азотфиксаторы не могут обеспечить такую же высокую эффективность симбиотрофного питания растений азотом, как клубеньковые, поскольку в
корень поступает лишь небольшая часть фиксируемого в ризосфере азота. Основные последствия от инокуляции растений азоспириллами связаны с продукцией гормонов, стимулирующих поглотительную активность корней: эффекты этой стимуляции и N2-фиксации были разделены с помощью изотопных (15N) методов (18).
У эндофитных N2-фиксаторов, обитающих в тканях или в проводящей системе
растений, эффективность выше, чем у ризосферных, так как продукты нитрогеназной активности эндофитов не рассеиваются в окружающей среде. Наиболее изученные эндофиты — представители родов Azoarcus, Gluconacetobacter, Herbaspirillum; их практическое значение определяется способностью к колонизации злаковых растений, включая рис и
пшеницу (19). Однако общая эффективность N2-фиксации у эндофитов значительно ниже, чем у ризобий, для которых подача энергии и ассимиляция продуктов фотосинтеза
обеспечиваются специализированными структурами клубенька.
Некоторые эндофиты проникают в растения при помощи векторных организмов,
которые служат для них промежуточными или даже основными хозяевами. Так, Azoarcus —
эндосимбионт гриба-аскомицета, обитающего в тканях злака Leptochloa fusca, из которого
часто выделяют этот азотфиксатор. Хотя штаммы Azoarcus легко культивируются на лабораторных средах, в почвах они обычно не выявляются, а с грибом образуют стабильные ассоциации, в которых развивают особые субклеточные структуры, содержащие нитрогеназу, —
диазосомы (20). Находясь в растениях, Azoarcus фиксирует N2, переходя в некультивируемые формы, однако диазосомы при этом не образуются. Таким образом, эндофитная N2фиксирующая система фактически трехкомпонентна, поскольку в ней роль Azoarcus заключается не только в улучшении азотного питания растения, но и в создании оптимальных
условий для развития гриба-вектора.
М и к р о б и о л о г и ч е с к и й к о н т р о л ь в р е д и т е л е й: с и м б ио з ы, о с н о в а н н ы е н а а н т а г о н и з м е. Образуя большое количество С-соеди-
5
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
нений, растения привлекают многочисленных вредителей — патогенов и растительноядных
животных. Для нейтрализации этих антагонистов растения поддерживают разнообразных
защитных симбионтов. Их биоконтрольные функции выполняются благодаря двум механизмам — прямому подавлению вредителей (синтез токсинов, антибиотиков, литических экзоферментов; конкуренция за питательные субстраты) и индукции защитных реакций хозяина.
У защитных симбионтов способность к подавлению вредителей растений могла
возникнуть до начала активного взаимодействия с самими растениями — в ходе коэволюции микроорганизмов с фитопатогенами или фитофагами, то есть растения культивируют
уже сложившихся «врагов своих врагов». Например, Pseudomonas и Serratia обладают способностью к микофагии, лизируя гифы фузариума внеклеточными хитиназами. Многие
штаммы аскомицетов рода Cordyceps являются бессимптомными эндо- и эпифитами растений и проходят полное развитие в теле насекомого-жертвы (21). Непрямое подавление патогенов часто связано с малоспецифическими эффектами: многие симбиотические организмы (ризобии, микоризные грибы, ризосферные бактерии) проникают в растения без образования некротических зон, вызывая системную устойчивость к патогенам (22). Защитные эндофиты, как и азотфиксирующие, обычно проникают в растение-хозяина с помощью организмов-векторов, которые представляют собой регулярных сожителей растений.
Примером служит коринеформная бактерия Clavibacter toxicus: она проникает в растение
вместе с нематодой Anguina, колонизируя образуемые ею галлы, откуда затем системно распространяется по всему растению (23). Присутствие этих эндофитов делает растение токсичным для животных, и таким образом Clavibacter «охраняет» его как удобную нишу для
нематоды-вектора. Фактически при этом формируется многокомпонентная система, в которой разные организмы (бактерии, нематоды, животные-фитофаги) конкурируют за Сметаболиты хозяина, а тот, в свою очередь, благодаря динамичным обратным связям обеспечивает распределение С-ресурсов в пользу наиболее полезных симбионтов.
Естественные антагонисты вредителей растений могут быть использованы для биоконтроля независимо от того, обладают ли они способностью быть симбионтами растений. Один из основоположников сельскохозяйственной микробиологии С.С. Мережковский (26) для подавления грызунов (мышей, крыс, сусликов) предложил применять вид Salmonella enteritidis, не опасный для человека и сельскохозяйственных животных. Отметим, что
некоторые бактерии, традиционно используемые для избирательного подавления определенных вредителей, оказались носителями весьма широкого спектра биоконтрольных функций.
Так, Bacillus thuringiensis — вид, широко применяемый для подавления вредных насекомых
(27, 28), активен также против многих фитопатогенных грибов (29). Другой пример полифункциональных симбионтов растений — штаммы Streptomyces, которые используются против фитопатогенов, но часто проявляют активность и против паутинных клещей (30, 31).
М н о г о к о м п о н е н т н ы е с и м б и о т и ч е с к и е с о о б щ е с т в а.
В предыдущих разделах мы отмечали, что двухкомпонентные симбиотические системы растений (бобово-ризобиальный симбиоз, арбускулярная микориза) представляют собой либо
части более сложных многокомпонентных полифункциональных сообществ, либо продукты
их эволюции. В последние годы такие сообщества стали объектами активного молекулярно-генетического исследования, основанного на подходах метагеномики, в первую очередь на
анализе генов, кодирующих эволюционно консервативные рибосомные РНК (32). Оказалось,
что все растения поддерживают в своих тканях эндофитную микрофлору, состоящую из сотен видов и почти столь же разнообразную, как и почвенные сообщества, хотя отличающуюся
от них по таксономической структуре. Некоторые эндофиты генетически и функционально
охарактеризованы (N2-фиксаторы Azoarcus, защитные симбионты Clavibacter), однако функции большинства из них (в первую очередь, некультивируемых форм) остаются неизвестными.
Изучение микробных сообществ растений показало, что концепция микробиома,
изначально предложенная J. Lederberg с соавт. (33) для характеристики совокупного генома
кишечной микрофлоры человека, может быть с полным основанием распространена на микробные сообщества растений. У них (в отличие от животных) эндосимбиотические сообщества распределены по разным органам и тканям, что делает взаимодействия с микроорганизмами чрезвычайно разнообразными. Основные функции эндофитных сообществ заключаются
в биоконтроле патогенов и вредителей, а также в освобождении растений от поступающих
извне ксенобиотиков, а возможно, и от собственных метаболических шлаков (32, 34), что
весьма актуально в отсутствие у растений выделительных систем. Способность к фиксации
N2 характерна лишь для некоторых эндофитов, так как nif-гены выявляются у небольшой
части их видов. Однако эндофиты могут выполнять и другие трофические функции, включая ассимиляцию почвенных источников азота, фосфора и железа, а также трансформацию
и перераспределение метаболитов между частями растения, что в определенной степени
компенсирует отсутствие у него пищеварительных органов. Важной функцией эндофитов,
особенно в условиях стрессов, может быть регуляция развития растений посредством активации синтеза гормонов, витаминов и других биологически активных веществ.
Основным механизмом формирования эндофитной микрофлоры служит инфицирование растений через разрывы эпидермиса, возникающие при росте боковых корней
(35). Поэтому наиболее богатая микрофлора выявляется в корнях, из которых микроорганизмы мигрирует (главным образом, по проводящим сосудам) в надземные органы. У
бактерий в этой миграции участвуют многие компоненты клетки, включая структуры клеточной стенки и капсулы, пили и жгутики, а также белковые эффекторы, выделяемые через различные секреторные системы (34). Однако в надземных органах имеются и собст-
6
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
венные очаги проникновения инфекции: например, микроорганизмы могут попадать в
растения через устьица, включаясь в состав микрофлоры листьев и стеблей. Наконец, существенную роль в формировании эндофитной микрофлоры играет вертикальная передача микроорганизмов через семена, а также их интродукция проникающими в растение
векторными организмами — беспозвоночными или грибами.
Таким образом, растение обладает двумя типами симбиоза — локализованным
и дисперсным (системным), функции которых регулируются с помощью положительных и отрицательных обратных связей. Эти связи хорошо изучены в случае локализации симбионтов в определенных частях растения: например, оно наиболее активно
снабжает продуктами фотосинтеза те участки корня, из которых в надземную часть поступают значительные количества азота или фосфора (15). Механизмы контроля эндофитного микробного сообщества мало изучены, хотя показано, что важную роль здесь
может играть регуляция по механизму quorum sensing, определяющему автоиндукцию
или авторепрессию клеточных функций бактерий с помощью лактонов гомосерина.
Растения могут вмешиваться в эту регуляцию, синтезируя сигнальные факторы, которые имитируют действие бактериальных авторегуляторов (36).
Важно отметить, что роль строгой локализации в организме хозяина для определения биологического эффекта взаимодействия различна при трофических и защитных симбиозах. Для трофических симбионтов, которые обычно не проявляют тесного родства с фитопатогенами, строгая локализация в организме хозяина сопряжена с максимальной экологической эффективностью. Например, у бобовых клубеньковые формы N2-фиксирующего
симбиоза с ризобиями более эффективны, чем бесклубеньковые (внутрикорневые эндофитные системы) (37). Возникновение сложных механизмов проникновения в корень, например переход от инфицирования через разрывы эпидермиса к поглощению ризобий через
корневые волоски, индуцируемому бактериальными Nod-факторами (38), определяет повышение эффективности N2-фиксакции.
Иное соотношение биологических эффектов системных и локализованных форм
типично для защитных симбионтов. Например, у спорыньевых грибов, для которых характерны тесные эволюционные связи с фитопатогенами, наиболее полезные для хозяина формы
обычно распределены по его организму системно (Neotyphodium, Epichloe), а усиление антагонистического действия (Claviceps) сопряжено со строгой локализацией микроорганизма в
определенных органах растения. Такая эволюционная стратегия согласуется с данными о мутантах корневого патогена Colletotrichum magna, которые приобрели свойства защитных эндосимбионтов, сопряженные с колонизацией верхней части стебля (39). В растениях банана выявлены эндофитные штаммы Fusarium oxysporum, обеспечивающие контроль эндопаразитических нематод, обусловленный как их прямым подавлением микотоксинами, так и индуцированными защитными реакциями (40). Эти примеры показывают, что многие широко распространенные патогены могли возникать из защитных симбионтов в связи с дисбалансом регуляторных связей партнеров, вызванным доместикацией и селекцией растений.
У животных в отличие от растений микробиомы локализованы в особых органах,
например в пищеварительных полостях, так как иммунные системы не позволяют микробам распространяться в тканях: у животных генетический гомеостаз поддерживается во внутренней среде более строго, чем у растений. Наиболее изученным примером микробиома
животных служит сообщество рубца, обеспечивающее деструкцию растительных полимеров
(целлюлозы, гемицеллюлозы, пектина), а также сопряженную с ней рециклизацию азотных
шлаков и основанный на ней синтез белка (41). Активизация иммунной системы животных
относится к важным функциям микрофлоры рубца. Эта система ограничивает распространение симбионтов внутренними полостями и поверхностью организма, тогда как у растений симбионты распространяются по многим тканям: растения толерантнее животных к
наличию в организме симбиотической микрофлоры, поскольку более зависимы от нее.
И с п о л ь з о в а н и е в а г р о п р о и з в о д с т в е и б и о т е х н о л о г и и.
Основой использования микроорганизмов в сельском хозяйстве служит эволюционно сложившаяся зависимость растений и растительноядных животных от симбиотических функций, выполняемых разнообразными микросимбионтами. При взаимодействии с растениями
и животными они функционально замещают агрохимикаты (средства питания и защиты),
что и определяет важность вклада микробиологии в растениеводство и животноводство. Однако
это замещение происходит, как правило, частично и лишь иногда может быть полным — например, у эволюционно молодых бобовых культур, сохранивших природный симбиотический потенциал (42). У большинства бобовых наибольшая урожайность достигается при комбинированном применении обоих источников азота (отметим, что энергетическая стоимость
фиксации N2 и усвоения нитратов различается не более чем на 10 %) (43, 44). В этом случае
использование трофических симбионтов должно базироваться на миксотрофности растений,
то есть на одновременном использовании симбиотически фиксированного и связанного азота.
К сожалению, доместикация и селекция растений привели к резкому снижению
адаптивного резерва формируемых ими симбиосистем: например, у бобовых культур произошло резкое нарушение баланса между симбиотрофным и автотрофным типами азотного питания (42). Одним из следствий этого стало преобразование клубеньковых бактерий в не фиксирующие N2 «симбионты-обманщики», которые блокируют инокуляцию
растений высокоактивными производственными штаммами (45).
В настоящее время для приготовления препаратов используется широкий круг
симбиотических микроорганизмов, стимулирующих развитие растений и животных (46).
7
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Для улучшения трофических и защитных микробно-растительных симбиозов должны быть
использованы различные подходы. Трофические симбиозы требуют эффективной колонизации растений, специфичной по отношению к генотипам обоих партнеров, что наиболее
убедительно показано для бобово-ризобиального симбиоза. В защитных симбиозах целесообразно сочетание прямого и непрямого подавления патогенов. В этом случае специфичность микросимбионтов по отношению к хозяину не столь важна, как в трофических симбиозах, однако для подавления патогенов необходима специфичность микроорганизмов по
отношению к их генотипам. Роль индукторов защитных реакций растения способны играть
не только живые микроорганизмы, но и их очищенные метаболиты, например хитозаны.
Некоторые из них могут быть получены с помощью систем синтеза Nod-факторов в гетерологичной бактерии Escherichia coli (47). Применение микробных сигналов или их синтетических аналогов, регулирующих развитие и адаптивные функции растений, относится к перспективным областям сельскохозяйственной биотехнологии.
Создание микробных препаратов — только первый этап использования сельскохозяйственно ценных микроорганизмов. В дальнейшем необходимо переходить к биоинженерии сложных полифункциональных систем. Началом таких работ может быть создание
многокомпонентных инокулятов — аналогов природных микробиомов растений. Например,
целесообразным представляется сочетание симбионтов, снабжающих растения азотом и
фосфором, что обеспечит сбалансированное питание растений. Универсальные Sym-гены
бобовых, которые отвечают за мониторинг симбиотических микробов, изначально, возможно, были факторами контроля за многокомпонентными эндофитными сообществами.
Однако условием для одновременного поддержания большого числа микроорганизмов
служит создание генотипов растений, способных обеспечивать энергией высокую метаболическую активность одновременно у нескольких типов эндосимбионтов (48, 49).
Развитие сельскохозяйственной микробиологии должно учитывать экологические и
генетические риски широкого распространения интродуцированных микроорганизмов в агросистемах. Один из таких рисков — поддержание в растениях бактерий и грибов, патогенных для
человека (включая виды Burkholderia, Escherichia, Klebsiella, Salmonella, Staphylococcus). К счастью,
было показано, что растения люцерны или арабидопсиса слабо колонизируются патогенными
для человека штаммами бактерий, хотя активно заселяются непатогенными формами, лишенными флагелл и систем экскреции белков (34). Однако в колонизацию некоторых растений
энтеробактериями могут быть вовлечены поверхностные структуры, участвующие в инфицировании человека (50), что указывает на необходимость тщательного мониторинга эндофитных сообществ, особенно в тех растениях, которые человек употребляет в пищу в сыром виде.
Итак, стремительное расширение знаний о взаимосвязях микроорганизмов с растениями и животными создает возможность для перехода к системам экологически устойчивого земледелия, в которых производство продукции экономически более выгодно, чем в
системах интенсивного земледелия, и осуществляется при минимальной нагрузке на окружающую среду. Эффективное управление симбиотическими сообществами должно быть
основано на целостности микробного населения агроценоза, связанной с его циркуляцией в системе ниш, предоставляемых растениями, животными и почвой (51, 52). Анализ
механизмов этой циркуляции позволит не только эффективно использовать микроорганизмы в сельском хозяйстве, но и контролировать эколого-генетические последствия их
широкомасштабной интродукции в агроценозы.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
8
R e g a n o l d J.P., P a p e n d i c k R.I., P a r r J.F. Sustainable agriculture. Sci. Amer., 1990, 262: 112-120.
V a n c e C.P. Symbiotic nitrogen fixation and phosphorous acquisition. Plant nutrition in the world of declining renewable resources. Plant Physiology, 2001, 127: 390-397.
H i g a T., P a r r J.F. Beneficial and effective microorganisms for a sustainable agriculture and environment. Intern. Nature Farming Research Center, Atami, Japan, 1994: 1-16.
Т и х о н о в и ч И.А., П р о в о р о в Н.А. Симбиозы растений и микроорганизмов: молекулярная
генетика агросистем будущего. СПб, 2009.
Ш т е й н х а у з Э. Микробиология насекомых. М., 1950.
В и н о г р а д с к и й С.Н. Микробиология почвы. М., 1952.
К о с т ы ч е в С.П. Новейшие исследования по биодинамике почв. Природа, 16: 355-372.
F e r g u s o n B.J., I n d r a s u m u n a r A., H a y a s h i S. e.a. Molecular analysis of legume nodule
development and autoregulation. J. Integr. Plant Biol., 2010, 52: 61-76.
K i n k e m a M., S c o t t P.T., G r e s s h o f f P.M. Legume nodulation: successful symbiosis through
short- and long-distance signaling. Funct. Plant Biol., 2006, 33: 707-721.
Т и х о н о в и ч И.А., П р о в о р о в Н.А. Симбиогенетика микробно-растительных взаимодействий. Экологическая генетика, 2003, 1: 36-46.
S m i t h S.E., R e a d D.J. Mycorrhizal symbiosis. London, 2008.
П р о в о р о в Н.А., Б о р и с о в А.Ю., Т и х о н о в и ч И.А. Сравнительная генетика и эволюционная морфология симбиозов растений с микробами-азотфиксаторами и эндомикоризными грибами. Журн. общ. биол., 2002, 63: 451-472.
D a r d i c k C., R o n a l d P. Plant and animal pathogen recognition receptors signal through non-RD
kinases. PLOS Pathogens, 2006, 2: 14-28.
A r t u r s s o n V., F i n l a y R.D., J a n s s o n J.K. Interactions between arbuscular mycorrhizal fungi
and bacteria and their potential for stimulating plant growth. Environ. Microbiol., 2006, 8: 1-10.
P r o v o r o v N.A., V o r o b y o v N.I. Evolutionary genetics of plant-microbe symbioses /I.A. Tikhonovich (ed.). N.Y., 2010.
D ц b e r e i n e r J. Isolation and identification of root associated diazotrophs. Plant and Soil, 1988, 110: 207-212.
K r a v c h e n k o L.V., L e o n o v a E.I., T i k h o n o v i c h I.A. Effect of root exudates of non-legume
plants on the response of auxin production by associated diazotrophs. Microb. Releases, 1994, 2: 267-271.
H a r d a r s o n G. Methods for enhancing symbiotic nitrogen fixation. Plant and Soil, 1993, 152: 1-17.
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
H u r e k T., H a n d l e y L.L., R e i n h o l d - H u r e k B. e.a. Azoarcus grass endophytes contribute
fixed nitrogen to the plant in an unculturable state. Molec. Plant-Microbe Interact., 2002, 15: 233-242.
K a r g T., R e i n h o l d - H u r e k B. Global changes in protein composition of N2-fixing Azoarcus sp. strain
BH72 upon diazosome formation. Journal of Bacteriology, 1996, 178: 5748-5754.
W h i t e J.F., S u l l i v a n R.F., M o y M. e.a. Evolution of Epichloл/Neotyphodium endophytes and other Clavicipitacean biotrophs. In: Symbiosis: mechanisms and model systems /J. Seckbach (ed.). Dordrecht, Boston, L., 2002: 413-424.
W h i p p s J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere. J. Exper. Bot., 2001, 52: 487-511.
R i l e y I.T., R e a r d o n T.B. Isolation and characterization of Clavibacter tritici associated with Anguina
tritici in wheat from Western Australia. Plant Pathology, 1995, 44: 805-810.
M ь l l e r - S c h д r e r H., S c h e e p e n s P.C. Biological control of weeds in crops: a coordinated
European research program (COST-816). Inegr. Pest Manag. Rev., 1997, 2: 45-50.
C h a r u d a t t a n R., D i n o o r A. Biological control of weeds using plant pathogens: accomplishments
and limitations. Crop Protection, 2000, 19: 691-695.
М е р е ж к о в с к и й С.С. Результаты полевых опытов истребления мышей бациллом, выделенным
из сусликов. Архив ветеринарных наук, 1895: 1-23.
M o h a m m e d S.H., S e a d y M.A., E n a n M.R. e.a. Biocontrol efficiency of Bacillus thuringiensis
toxins against root-knot nematode, Meloidogyne incognita. J. Cell. Mol. Biol., 2008, 7: 57-66.
R o m e i s J., M e i s s l e M., B i g l e r F. Transgenic crops expressing Bacillus thuringiensis toxins and
biological control. Nat. Biotechnol., 2006, 24: 63-71.
С м и р н о в О.В., Г р и ш е ч к и н а С.Д. Изучение действия биопрепаратов на основе Bacillus
thuringiensis на фитопатогенные грибы. Вестник защиты растений, 2010, 1: 27-35.
P u t t e r I., M a c C o n n e l l J.G., P r e i s e r F.A. e.a. Avermectins: novel insecticides, acaricides
and nematicides from a soil microorganism. Experientia, 1981, 37: 963-964.
К а н д ы б и н Н.В. Биопестициды: теория и практика. Защита растений, 1991, 1: 5-6.
R y a n R.P., G e r m a i n e K., F r a n k s A. e.a. Bacterial endophytes: recent developments and applications. FEMS Microbiol. Lett., 2008, 278: 1-9.
L e d e r b e r g J., M c C r a y A.T. «Ome sweet» omics — a genealogical treasury of words. Scientist, 2001, 15: 8.
R o s e n b l u e t h M., M a r t i n e z - R o m e r o E. Bacterial endophytes and their interactions with
hosts. Mol. Plant-Microbe Interact., 2006, 19: 827-837.
Y r j д l д K., M a n c a n o G., F o r t e l i u s C. e.a. The incidence of Burkholderia in epiphytic and
endophytic bacterial cenoses in hybrid aspen grown on sandy peat. Boreal Environ. Res., 2010, 15: 81-96.
S a n c h e z - C o n t r e r a s M., B a u e r W.D., G a o M. e.a. Quorum-sensing regulation in rhizobia
and its role in symbiotic interactions with legumes. Phil. Trans. R. Soc. B., 2007, 362: 1149-1163.
B r y a n J.A., B e r l y n G.P., G o r d o n J.C. Towards a new concept of the evolution of symbiotic nitrogen fixation in the Leguminosae. Plant and Soil, 1996, 186: 151-159.
S p r e n t J.I. Evolving ideas of legume evolution and diversity: a taxonomic perspective on the ocurrence of
nodulation. New Phytologist, 2007, 174: 11-25.
R e d m a n R.S., R a n s o n J.C., R o d r i g u e z R.J. Conversion of the pathogenic fungus, Colletotrichum magna
to a nonpathogenic, endophytic mutualist by gene disruption. Mol. Plant-Microbe Interact., 1999, 12: 969-975.
S i k o r a R.A., P o c a s a n g e L., F e l d e A. e.a. Mutualistic endophytic fungi and in planta suppressiveness to plant parasitic nematodes. Biol. Control, 2008, 46: 15-23.
H o b s o n P.N., S t e w a r t C.S. The rumen microbial ecosystem. Berlin, 1997.
П р о в о р о в Н.А., Т и х о н о в и ч И.А. Эколого-генетические принципы селекции растений на повышение эффективности взаимодействия с микроорганизмами. С.-х. биол., 2003, 3: 11-25.
К р е т о в и ч В.Л. Биохимия усвоения азота воздуха растениями. М., 1994.
A n d r e w s M., L e a P.J., R a v e n J.A. e.a. Nitrogen use efficiency. 3. Nitrogen fixation: genes and
costs. Ann. Appl. Biol., 2009, 155: 1-13.
П р о в о р о в Н.А., В о р о б ь е в Н.И. Роль горизонтального переноса генов в эволюции клубеньковых бактерий, направляемой растением-хозяином. Усп. совр. биол., 2010, 130: 336-345.
Биопрепараты в сельском хозяйстве /Под ред. И.А. Тихоновича, Ю.В. Круглова. М., 2005.
L e p p y a n e n I.V., O v t s y n a A.O., D o l g i k h E.A. e.a. New approach to the synthesis of chitin
olygomers — elisitors of plant defense reactions. Heterologous expression of Mesorhizobium loti unique enzymes controlling this synthesis. Proc. 4th Baltic Sea Symposium «Novel technologies for management of
beneficial and harmful microbes in the root system». Tune, 2008: 10.
Ш т а р к О.Ю., Д а н и л о в а Т.Н., Н а у м к и н а Т.С. и др. Анализ исходного материала гороха посевного (Pisum sativum L.) для селекции сортов с высоким симбиотическим потенциалом и
выбор параметров для его оценки. Экологическая генетика, 2006, 4: 22-28.
B o r i s o v A.Y., D a n i l o v a T.N., S h t a r k O.Y. e.a. Tripartite symbiotic system of pea (Pisum sativum L.): applications in sustainable agriculture. In: Biological nitrogen fixation: towards poverty alleviation
through sustainable agriculture /F.D. Dakora e.a. (eds.). Berlin, 2008: 15-17.
V a n d e r L e l i e D., T a g h a v i S., M o n c h y S. e.a. Poplar and its bacterial endophytes: coexistence and harmony. Crit. Rev. Plant Sci., 2009, 28: 346-358.
P o p o v a L.Yu., L o b o v a T.I., K r y l o v a T.Yu. e.a. Population dynamics of microorganisms in
the different microecosystem conditions. Adv. Space Res., 2001, 27: 1571-1579.
К у п р и я н о в А.А., С е м е н о в А.М., В а н Б р у г г е н А.Х.К. Перемещение энтеропатогенных и сапротрофных бактерий в цикле экониш: животные—экскременты—почва—растения—
животные. Изв. РАН, сер. биол., 2010, 3: 318-323.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: provorov@newmail.ru
Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года
AGRICULTURAL MICROBIOLOGY AS THE BASIS OF ECOLOGICALLY
SUSTAINABLE AGRICULTURE: FUNDAMENTAL AND APPLIED ASPECTS
I.A. Tikhonovich, N.A. Provorov
Summary
Agricultural microbiology is based on the research of microbial communities living in the plants, animals and
soils. Since the plants and animals create on their surfaces, in tissues and cells the variable niches for hosting the microbial
partners, the genes controlling development of these niches are considered as the major determinants for the activities of
agriculturally valuable microbes. Knowledge on their genetics, physiology, molecular biology and ecology enables us to
construct the sustainable agricultural systems wherein: 1) productivity of plants and animals in increased by changing the
composition and properties of the microbial symbionts; 2) ecologically dangerous agrochemicals (mineral fertilizers, pesticides) are completely or partially substituted by microbial preparations; 3) the energy consumption is decreased while the
quality of agricultural products is improved.
9
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631.46:579.64:581.138.1:581.133.9:57.044
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ УСТОЙЧИВОСТИ
И АККУМУЛЯЦИИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ У РАСТЕНИЙ?
(обзор)
А.А. БЕЛИМОВ, И.А. ТИХОНОВИЧ
Обсуждается проявление адаптивности к условиям окружающей среды в симбиозах растений и микроорганизмов — сложных биологических системах, основанных на взаимодействии партнеров. Многие симбиотрофные микроорганизмы (микоризные грибы, клубеньковые и ассоциативные бактерии) обладают высокой устойчивостью к тяжелым металлам, участвуют в процессах их трансформации в ризосфере и аккумуляции растениями. Однако специфические механизмы адаптации симбиозов к токсичным концентрациям металлов и интеграция компонентов растительно-микробных систем в стрессовых условиях изучены недостаточно.
Ключевые слова: растительно-микробные взаимодействия, стресс, тяжелые металлы.
Keywords: plant-microbe interactions, stress, heavy metals.
Растения вступают в симбиотрофные отношения с разнообразными микроорганизмами — экто- и эндомикоризными грибами, клубеньковыми бактериями, азотфиксирующими актиномицетами, ассоциативными и эндофитными бактериями и грибами, а
также цианобактериями. Эти растительно-микробные взаимодействия структурно, функционально и эволюционно сложны и чрезвычайно разнообразны (1). Накопленный экспериментальный и теоретический материал о молекулярно-генетических механизмах и
практическом значении растительно-микробных взаимодействий позволил выделить эту
совокупность знаний в отдельную дисциплину — симбиогенетику (2).
Многие свойства микроорганизмов и механизмы их положительного действия на
растения могут играть важную роль в защите последних от неблагоприятных условий среды,
поскольку положительные эффекты микроорганизмов ориентированы, в том числе, против
негативного влияния стрессоров на растения. Например, отрицательный эффект тяжелых
металлов (ТМ) проявляется в ухудшении потребления растениями азота и других питательных элементов, что в определенных условиях может быть основной причиной снижения
сопротивляемости и ингибирования роста (3). Инокуляция азотфиксаторами или бактериями, улучшающими потребление минеральных веществ, будет повышать устойчивость растений к стрессу (4, 5). В растении ТМ индуцируют окислительный стресс, тогда как микроорганизмы при инокуляции способны активировать защитные реакции, усиливая, например,
биосинтез пролина и активность антиоксидативных фементов супероксиддисмутазы, пероксидазы и каталазы (6). Универсальным антистрессовым действием обладают также бактерии, содержащие фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазу, благодаря которому в растениях снижается содержание этилена (5, 7) — сигнальной молекулы, запускающей каскад неспецифических стрессовых и адаптивных реакций.
У с т о й ч и в о с т ь м и к р о о р г а н и з м о в и р а с т и т е л ьн о - м и к р о б н ы х а с с о ц и а ц и й к т я ж е л ы м м е т а л л а м. Микроорганизмы выработали целый комплекс универсальных и специфических по отношению к
определенному стрессору механизмов устойчивости (8). К универсальным реакциям на
стресс относится биосинтез разнообразных по функциональности регуляторных белков,
например шаперонов и ?-факторов. Шапероны участвуют в процессах поддержания целостности и стабильности ДНК и РНК, транскрипции и трансляции, репарации ДНК,
структуризации белков и нормального функционирования ферментов. ?-Факторы регулируют стабилизацию клеточных мембран, биосинтез экзополисахаридов, переход клетки в
стационарную фазу и т.д. Неспецифическую устойчивость обеспечивает также биосинтез
низкомолекулярных осмопротекторов (глицин, глицинбетаин, пролин, трегалоза, глутамат, таурин, ацетилглутаминил, глутаминамид), экзополисахаридов и полиаминов.
Устойчивость микроорганизмов к ТМ и контролирующие ее гены в настоящее
время подробно изучены (9, 10). Механизмы устойчивости основаны на выводе токсикантов из клеточного пространства и изменении валентности ионов металла для перевода в менее токсичные формы. Процессы биосорбции и иммобилизации токсичных
ионов вне клетки или на клеточной стенке микроорганизмов тоже играют важную роль.
Способность активно сорбировать Cd и другие металлы описана для многих типичных
представителей ризосферной микрофлоры — Agrobacterium, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas, Rhizobium, Serracia и др. (9, 11, 12). Установлено, что карбоксильные
группы на поверхности бактерий рода Pseudomonas обеспечивают связывание до 100 мкг
Cd на 1 мг биомассы (13). Иммобилизация ТМ может также проходить вне клеток мик?
Работа поддержана грантами РФФИ (06-04-49486-a и 09-04-01614-а) и Минобрнауки РФ (ГК № 16.512.11.2162).
10
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
роорганизмов благодаря изменению рН и редокспотенциала среды, мобилизации фосфатов или продуцированию полисахаридов, сидерофоров и других веществ (14).
Таким образом, ТМ нарушают комплекс процессов в растении и индуцируют
множество специфических и неспецифических реакций (15). В то же время микроорганизмы обладают полезными для растений свойствами, благоприятное сочетание которых может оказывать в стрессовой ситуации аддитивный или синергический эффект. Это необходимо учитывать в фундаментальных исследованиях при объяснении результатов экспериментов и в практике использования бактерий для инокуляции растений. С одной стороны,
многофункциональность индивидуальных штаммов и зависимость свойств бактерий от факторов среды, которые часто нельзя контролировать, усложняет интерпретацию результатов,
с другой — открываются возможности для сочетания многих полезных функций в одном
штамме при селекции по нескольким признакам или генетическом преобразовании.
У ч а с т и е м и к р о о р г а н и з м о в в у с т о й ч и в о с т и и
а к к у м у л я ц и и т я ж е л ы х м е т а л л о в р а с т е н и я м и. Накоплен большой экспериментальный материал о роли симбиотических микоризных грибов в устойчивости и аккумуляции растениями ТМ, подтверждающий, что образование симбиоза может
служить ресурсосберегающим и экологически безопасным приемом для повышения эффективности технологий фиторемедиации (16, 17). Так, на почвах, загрязненных ТМ, при микоризации улучшались минеральное питание и рост растений, активизировался фотосинтез
(18), снижалась аккумуляция свободного пролина, стимулировалось образование азотфиксирующих клубеньков на корнях (19). Инокуляция бобовых растений устойчивыми к ТМ и
эффективными штаммами клубеньковых бактерий существенно улучшала образование и
функционирование азотфиксирующего симбиоза. Увеличение числа и массы клубеньков у
инокулированных растений сопровождалось повышением содержания леггемоглобина в
клубеньках (20), а симптомы окислительного стресса были менее выраженными (21).
В последнее десятилетие значительно возрос интерес к использованию ризосферных бактерий для стимуляции роста и регуляции поступления ТМ в растения из загрязненных почв, что отражено в серии обзорных статей (17, 22, 23). Например, производственные
штаммы ассоциативных бактерий Arthrobacter mysorens 7 и Flavobacterium sp. Л30 снижали
подвижность Cd в почве (24), а инокуляция ими ячменя улучшала рост растений и препятствовала поступлению ТМ в зерно (11). Показана также способность псевдомонад, ассоциированных с эктомикоризными грибами, усиливать иммобилизацию Cd, Zn и Pb микросимбионтом в корнях и предотвращать поступление этих металлов в побеги сосны (25). Иммобилизация металлов может происходить благодаря образованию малорастворимых комплексов с бактериальными сидерофорами, полисахаридами и другими веществами. Однако
бактериальные сидерофоры и их Fe-содержащие комплексы поглощаются растениями, поэтому в некоторых случаях возможно усиление поступления металлов в последние (26). Получены данные об одновременной стимуляции роста и выноса никеля горчицей сарептской
(Brassica juncea) при инокуляции штаммом Bacillus subtilis SJ-101, продуцирующим ауксины
и растворяющим фосфаты (27). В этих и многих других исследованиях усиление поглощения токсичных металлов происходило без негативных последствий для роста растения, что
указывает на способность бактерий повышать гомеостаз микробно-растительной системы.
Изучение микроорганизмов, ассоциированных с растениями — металлофитами, аккумуляторами и гипераккумуляторами ТМ, направлено в основном на поиск
приемов повышения эффективности фитоэкстракции металлов в целях очистки загрязненных почв. В этой связи актуальна задача улучшения роста растений на токсичных
почвах и поиска способов усиления аккумуляции токсикантов в надземной части растений. Инокуляция микроорганизмами, действие которых направлено на стимуляцию
роста растений, представляется перспективным подходом для интенсификации фитоэкстракции. Известно также, что микроорганизмы способны мобилизовывать металлы в
результате подкисления среды (например, продуцирования органических кислот) и деградации органоминеральных соединений (14, 28). Поэтому активизация в ризосфере
микробиологических процессов, направленных на повышение подвижности и доступности растениям металлов, должна способствовать усилению их выноса из почвы с растительной биомассой. Освоение потенциала микроорганизмов, мобилизирующих металлы, может служить альтернативой или дополнением к химическим методам повышения подвижности ТМ, например внесению в почву хелатирующих веществ. Отметим,
что микробиологические технологии успешно применяются для обогащения руд в горнодобывающей промышленности (29) и биоремедиации радиоактивных отходов (30).
Интересные данные получены при изучении ризосферных бактерий у перспективных для фиторемедиации растений. Обнаружено, что в ризосфере у горного салата
Thlaspi caerulescens, гипераккумулирующего Ni, Cd и Zn, больше устойчивых к металлам
бактерий, чем у клевера, растущего в той же почве (31). Из ризосферы, корней и стеблей
T. caerulescens были выделены разнообразные бактерии, среди которых доминировали представители родов Sphingomonas, Matsuebacter, Variovorax, Rhodococcus, Devosia и Phyllobacterium,
в то время как в неризосферной почве доминировали Arhtrobacter, Acidovorax и др. (32). Высокая численность и разнообразие устойчивых к металлам бактерий в ризосфере гиперак-
11
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
кумуляторов (32) подтверждают гипотезу о том, что такие растения могут обеспечивать особую экологическую нишу для специфических, в том числе устойчивых к ТМ, форм микроорганизмов (33). Однако это противоречит результатам других авторов, обнаруживших относительно низкую численность устойчивых к цинку бактерий в ризосфере металлофитов
по сравнению с неризосферной почвой при ее загрязнении (34). Подобный эффект может
быть связан с понижением содержания металла в ризосфере за счет его потребления растением и повышении конкурентоспособности у чувствительных видов. Приведенные результаты свидетельствуют о способности растений влиять на формирование бактериального сообщества ризосферы по признаку устойчивости к ТМ.
Следует признать, что в настоящее время экспериментальные данные о роли
микроорганизмов в мобилизации ТМ и эффективности процесса фитоэкстракции металлофитами, аккумуляторами и гипераккумуляторами весьма фрагментарны, несмотря
на признание перспективности этих исследований (35). Возможно, одна из причин заключается в том, что большинство таких растений относятся к семействам, которые не
образуют симбиозов с микоризными грибами и клубеньковыми бактериями, а исследования посвящены только ризосферным бактериям. Например, из ризосферы гипераккумулятора Alyssum murale были выделены устойчивые к Ni бактерии рода Sphinomonas и
Microbacterium, которые продуцировали органические кислоты и сидерофоры и повышали содержание подвижного Ni в почве, а также в инокулированных растениях (36).
Бактерии Ps. monteili, Microbacterium saperdae и Enterobacter cancerogenes мобилизовали Zn
и в 2 раза повышали его количество в инокулированных растениях T. caerulescens (37).
Инокуляция горчицы сарептской штаммами Xhanthomonas sp., Pseudomonas sp., Azomonas
sp. и Bacillus sp. снижала рН в ризосфере, повышала подвижность Сd и стимулировала
рост растений, в результате чего содержание в них Cd и его вынос из почвы существенно повышались (38). Весьма вероятно, что вещества, продуцируемые микроорганизмами в ответ на присутствие токсичных металлов для их иммобилизации или участвующие в мобилизации ТМ, могут обладать биологической активностью по отношению
к растениям. Микробные метаболиты чрезвычайно разнообразны по структуре и функциям, и многие из них участвуют в передаче сигналов между микроорганизмами и растениями (1, 39). К таким метаболитам можно отнести полисахариды, сидерофоры, органические кислоты, и другие соединения, которые участвуют в реакциях микроорганизмов на присутствие ТМ. В этой связи представляется весьма интересным изучить роль
этих веществ в растительно-микробных взаимодействиях и интеграции компонентов симбиотических систем в стрессовых условиях.
Многие симбиотрофные бактерии, как уже отмечалось, содержат АЦК деаминазу, гидролизующую аминокислоту АЦК — предшественник ингибирующего рост растений фитогормона этилена, биосинтез которого активируется в стрессовых условиях (в
том числе при токсичном действии ТМ). Благодаря бактериальной АЦК деаминазе содержание этилена в растительных тканях снижается, что стимулирует ростовые процессы (7). Это указывает на перспективность использования таких бактерий для уменьшения токсического эффекта металлов и улучшения роста растений на загрязненных почвах (7, 40, 41). Однако имеющиеся в этой связи данные фрагментарны. Так, инокуляция
рапса штаммом Serratia quinivorans SUD165 существенно снижала токсичность Ni и образование стрессового этилена у проростков (42). Еще большая стимуляция роста достигалась при использовании мутанта этого штамма с повышенной продукцией сидерофоров,
вероятно, за счет элиминирования негативного влияния ТМ на поглощение растениями
железа. Наши эксперименты с рапсом (43), горохом (5) и пастбищными бобовыми (44)
также показали, что наряду с АЦК-деаминазной активностью важным механизмом антистрессового действия у АЦК-утилизирующих бактерий из различных таксономических групп служит их способность улучшать минеральное питание растений, которое
нарушается под влиянием ТМ. Эти результаты демонстрируют необходимость более детального изучения взаимодействий растений с бактериями, содержащими АЦК деаминазу, а также роли этого фермента в устойчивости растений к ТМ и процессах потребления элементов растениями из загрязненных почв.
Как правило, при инокуляции грибами арбускулярной микоризы или клубеньковыми бактериями содержание ТМ в надземных органах у бобовых растений снижалось (17).
Вероятно, это происходило в результате аккумуляции и иммобилизации ТМ в корнях и
почве гифами микоризных грибов, а также вследствие разбавления за счет увеличения фитомассы. Однако вынос ТМ фитомассой при этом мог существенно повышаться за счет
стимуляции роста симбиотрофных растений. На загрязненных ТМ почвах положительный
эффект от фосфатмобилизующих микроорганизмов (микоризные грибы и широкий спектр
бактерий, включая клубеньковые) может быть связан не только с улучшением фосфорного
питания растений, но и со связыванием ТМ в ризосфере мобилизованными фосфатами.
Однако эта гипотеза требует экспериментального подтверждения. Регуляция поступления ТМ
в растения с помощью микроорганизмов может лежать в основе различных стратегий преодоления экологических последствий загрязнения. С одной стороны, снижение транспорта ТМ в
надземные органы при отсутствии стимуляции роста будет ограничивать использование этих
12
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
микроорганизмов для фитоэкстракции ТМ из почв, с другой — перспективно использование
таких симбиозов для технологий фитостабилизации, восстановления растительного покрова и
биоценоза ландшафтов, получения экологически чистой продукции.
Можно предположить, что направленность эффекта микроорганизмов на изменение
подвижности и аккумуляцию растениями ТМ зависит от содержания металла в почве и его
доступности для растений (28). Так, при относительно слабом и среднем загрязнении защитные механизмы растений и микроорганизмов еще не индуцированы и могут преобладать
процессы микробной мобилизации ТМ, обусловленные активным метаболизмом с подкислением среды, а также деградацией металлоорганических веществ почвы. Растения, в свою очередь, выделяют в ризосферу хелатирующие металлы вещества, которые мобилизуют питательные макро- и микроэлементы, в том числе многие ТМ. Это может приводить к негативным
последствиям для следующего звена питательной цепи (животные и человек), поскольку количество ТМ в растениях будет превышать предельно допустимые концентрации (ПДК). Вероятно, что при дальнейшем повышении содержания ТМ в почве растения (как более чувствительное звено системы) первыми индуцируют защитные механизмы. В частности, растения
выделяют в ризосферу органические кислоты и другие вещества, которые хелатируют и иммобилизуют ТМ. Микроорганизмы способны утилизировать эти корневые выделения, усиливать
поступление ТМ в корни, то есть противодействовать защитной реакции растений. Как следствие, может происходить не только нивелирование положительных эффектов растительномикробного взаимодействия, но и ингибирование роста растений. При очень высоких концентрациях ТМ в почвенном растворе, вероятно, активируются защитные реакции у микроорганизмов и в ризосфере начинают преобладать микробиологические иммобилизационные
процессы. Это может служить одним из объяснений снижения содержания ТМ в растениях в
экспериментах по фиторемедиации (17). Несомненно, предложенная схема весьма упрощена
и в природных условиях динамика и направленность процессов трансформации ТМ зависят
от сложного комплекса взаимодействующих биотических и абиотических факторов. Однако
описанный сценарий хорошо согласуется с результатами эксперимента с ивой (Salix caprea),
инокулированной эктомикоризным грибом Pisolithus tinctorius и смесью ризосферных бактерий, при выращивании на почве с низкой и высокой степенью загрязнения Cd (45).
Р о л ь р а с т и т е л ь н о г о и м и к р о б н о г о п а р т н е р о в
в у с т о й ч и в о с т и с и м б и о з а к т я ж е л ы м м е т а л л а м. Как правило,
растения менее устойчивы к ТМ, чем микроорганизмы, что, вероятно, связано с более
сложным уровнем организации. Например, сильное угнетение роста корней и побегов у
устойчивых к кадмию генотипов гороха в гидропонной культуре наблюдалось при концентрации 5 мкМ CdCl2 (46). В то же время в условиях in vitro минимальные ингибирующие
рост концентрации Cd для клубеньковых бактерий гороха Rhizobium leguminosarum bv. viciae
варьировали от 15 до 120 мкМ (45). При выращивании гороха в присутствии 0,5 мкМ Cd не
отмечалось ингибирования роста корней, однако число симбиотических клубеньков на таких корнях снижалось в 4 раза (45). В других экспериментах токсичные концентрации ТМ
для небобовых растений и ассоциированных с ними ризосферных бактерий находились
примерно в том же интервале (4, 47). В некоторых случаях даже устойчивые к ТМ микроорганизмы не оказывают положительного эффекта на растения в присутствии металлов. Так,
устойчивый к кадмию штамм Rhodococcus sp. Fp2 не усиливал ростовые процессы у гороха,
выращиваемого на загрязненной почве, поскольку у этого штамма кадмий ингибировал активность АЦК деаминазы (5). Эти данные свидетельствуют, что симбиотические отношения
между микроорганизмами и растениями могут быть очень чувствительны к ТМ и нарушаться при концентрациях металла ниже минимальных токсичных для каждого из партнеров в
отдельности. Растения (вследствие меньшей устойчивости к ТМ), вероятно, играют определяющую роль в образовании эффективной ассоциации с микроорганизмами в присутствии
токсикантов. Необходимо также учитывать, что ТМ способны существенно изменять именно те свойства микроорганизмов, которые определяют их взаимодействия с растением.
У растений устойчивость и способность аккумулировать ТМ генетически детерминированы и по этим признакам существует внутривидовой полиморфизм. Мы выявили
значительную вариабельность по устойчивости к Cd и содержанию различных ТМ в побегах
у 99 генотипов гороха (46, 48). У тех же генотипов была изучена отзывчивость на инокуляцию микоризным грибом Glomus sp. (49). Сравнение полученных данных показало, что устойчивость к Cd отрицательно коррелировала с ростстимулирующим эффектом микоризы
(45). Это свидетельствовало о повышенной симбиотрофности у чувствительных к Cd генотипов. Отрицательная корреляция была также обнаружена между количеством Cd в растениях и эффектом микоризы в отношении содержания фосфора в семенах (45), то есть генотипы с низким содержанием Cd способны более эффективно использовать симбиотрофно
накопленный фосфор. Один из механизмов защитного действия микоризы — иммобилизация металлов присутствующими в гифах полифосфатами (50). Возможно, в ходе коэволюции симбиотических партнеров некоторые генотипы растений модифицировали адаптацию
к токсичным металлам в меньшей степени, но приобрели способность эффективно использовать потенциал микросимбионта для компенсации дефицита собственной устойчивости.
Обнаруженная взаимосвязь между признаками, отвечающими за реакцию на ТМ и симбио-
13
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
трофность, может усложнять поиск и селекцию генотипов растений, которые обладают одновременно высокой устойчивостью к ТМ и отзывчивостью на инокуляцию микроорганизмами. Важно подчеркнуть, что подобное справедливо не только для бобово-микоризного
симбиоза, но и для других растительно-микробных систем. Об этом свидетельствуют наши
эксперименты с горчицей сарептской и АЦК-утилизирующим штаммом ассоциативных
бактерий Variovorax paradoxus 5C-2, когда инокуляция в большей степени стимулировала
рост чувствительных к Cd генотипов растений (45). Полученные результаты убедительно
показывают необходимость глубокого изучения роли внутривидовой изменчивости растений во взаимодействии с микроорганизмами в присутствии ТМ для создания высокопродуктивных растительно-микробных систем с высоким адаптационным потенциалом.
Таким образом, именно в неблагоприятных условиях, когда растение особенно
нуждается в поддержании нормального метаболизма и наличии достаточных питательных
ресурсов, даже небольшие позитивные воздействия микроорганизмов могут существенно
повысить устойчивость макросимбионта к стрессу (51). Симбиотрофные микроорганизмы
оказываются демпфирующим компонентом между почвенными условиями, включая токсичность ТМ, и растениями (1), а взаимодействия в этой системе представляют собой интересную модель для изучения гомеостаза растительно-микробно-почвенного континуума.
Итак, разнообразие воздействий микроорганизмов на само растение и окружающую среду обеспечивает широкий диапазон их влияния на процессы, которые в конкретной ситуации могут играть роль факторов, лимитирующих рост и жизнедеятельность растения в присутствии высоких концентраций тяжелых металлов. Изучение способности
микроорганизмов устранять факторы лимитации роста растений и поиск способов полной реализации адаптационного потенциала растительно-микробных симбиозов, в том
числе за счет приобретения новых надорганизменных качеств, представляются весьма перспективными подходами при создании устойчивых биологических систем в земледелии, а
также для восстановления биоразнообразия и плодородия загрязненных ландшафтов.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
14
Т и х о н о в и ч И.А., П р о в о р о в Н.А. Симбиозы растений и микроорганизмов: молекулярная
генетика агросистем будущего. СПб, 2009.
T i k h o n o v i c h I.F., P r o v o r o v N.A. From plant-microbe interactions to symbiogenetics: an universal paradigm for the interspecies genetic integration. Ann. Appl. Biol., 2009, 154: 341-350.
T s y g a n o v V.E., B e l i m o v A.A., B o r i s o v A.Y. e.a. A chemically induced new pea (Pisum sativum L.)
mutant SGECdt with increased tolerance to and accumulation of cadmium. Ann. of Botany, 2007, 99: 227-237.
B e l i m o v A.A., D i e t z K.-J. Effect of associative bacteria on element composition of barley seedlings
grown in solution culture at toxic cadmium concentrations. Microb. Res., 2000, 155: 113-121.
S a f r o n o v a V.I., S t e p a n o k V.V., E n g q v i s t G.L. e.a. Root-associated bacteria containing 1aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase improve growth and nutrient uptake by pea genotypes cultivated
in cadmium supplemented soil. Biol. Fertil. Soil., 2006, 42: 267-272.
S t a j n e r D., K e v r e a a n S., G a s a i c O. e.a. Nitrogen and Azotobacter chroococcum enhance oxidative stress tolerance in sugar beet. Biol. Plant., 1997, 39: 441-445.
G l i c k B.R., T o d o r o v i c B., C z a r n y J. e.a. Promotion of plant growth by bacterial ACC
deaminase. Crit. Rev. Plant Sci., 2007, 26: 227-242.
Е р м и л о в а Е.В. Молекулярные аспекты адаптации прокариот. СПб, 2007.
H u N., Z h a o B. Key genes involved in heavy-metal resistance in Pseudomonas putida CD2. FEMS Microbiol. Lett., 2007, 267: 17-22.
S i l v e r S., P h u n g L.T. Bacterial heavy metal resistance: new surprises. Annu. Rev. Microbiol., 1996, 50: 753-789.
Б е л и м о в А.А., К у н а к о в а А.М., С а ф р о н о в а В.И. и др. Использование ассоциативных бактерий для инокуляции ячменя в условиях загрязнения почвы свинцом и кадмием. Микробиология, 2004, 73: 118-125.
R o b i n s o n B., R u s s e l l C., H e d l e y M. e.a. Cadmium adsorption by rhizobacteria: implications
for New Zealand pastureland. Agric. Ecosyst. Environ., 2001, 87: 315-321.
K o m y Z.R., G a b a r R.M., S h o r i e t A.A. e.a. Characterization of acidic sites of Pseudomonas biomass
capable of binding protons and cadmium via biosorption. World J. Microbiol. Biotechnol., 2006, 22: 975-982.
G a d d G.M. Heavy metal accumulation by bacteria and other microorganisms. Experientia, 1990, 46: 834-840.
Heavy metal stress in plants: from molecules to ecosystems /M.N.V. Prasad, J. Hagemeyer (eds.). Berlin,
Heidelberg, Springer-Verlag, 1999.
G o h r e V., P a s z k o w s k i U. Contribution of the arbuscular mycorrhizal symbiosis to heavy metal
phytoremediation. Planta, 2006, 223: 1115-1122.
S a f r o n o v a V.I., P i l u z z a G., B u l l i t t a S. e.a. Use of legume-microbe symbioses for phytoremediation of heavy metal polluted soils: advantages and potential problems. In: Handbook for phytoremediation. Nova Sci. Publ. Inc., 2011 (in press).
R i v e r a - B e c e r r i l F., C a l a n t z i s C., T u r n a u K. e.a. Cadmium accumulation and buffering of cadmium-induced stress by arbuscular mycorrhiza in three Pisum sativum genotypes. J. Exp. Botany,
2002, 53: 1177-1185.
A n d r a d e S.A.L., A b r e u C.A., d e A b r e u M.F. e.a. Influence of lead additions on arbuscular
mycorrhiza and Rhizobium symbioses under soybean plants. App. Soil Ecol., 2004, 26: 123-131.
W a n i P.A., K h a n M.S., Z a i d i A. Impact of zinc-tolerant plant growth-promoting rhizobacteria on
lentil grown in zinc-amended soil. Agron. Sust. Develop., 2008, 28: 449-455.
S i n h a S., R a i U.N., B h a t t K. e.a. Fly-ash-induced oxidative stress and tolerance in Prosopis juliflora L. grown on different amended substrates. Environ. Monit. Assess., 2005, 102: 447-457.
K h a n M.S., Z a i d i A., W a n i P.A. e.a. Role of plant growth promoting rhizobacteria in the remediation of metal contaminated soils. Environ. Chem. Lett., 2009, 7: 1-19.
K a m n e v А.А., v a n d e r L e l i e D. Chemical and biological parameters as tools to evaluate and
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
improve heavy metal phytoremediation. Biosci. Reports, 2000, 20: 239-258.
P i s h c h i k V.N., V o r o b y e v N.I., C h e r n y a e v a I.I. e.a. Experimental and mathematical simulation of
plant growth promoting rhizobacteria and plant interaction under cadmium stress. Plant Soil, 2002, 242: 173-186.
K r u p a P., K o z d r у j J. Ectomycorrhizal fungi and associated bacteria provide protection against heavy
metals in inoculated pine (Pinus sylvestris L.) seedlings. Water Air Soil Pollut., 2007, 182: 83-90.
A w a d F., R o m h e l d V. Mobilization of heavy metals from contaminated calcareous soils by plant born,
microbial and synthetic chelators and their uptake by wheat plants. J. Plant Nutrit., 2000, 23: 1847-1855.
Z a i d i S., U s m a n i S., S i n g h B.R. e.a. Significance of Bacillus subtilis strain SJ-101 as a bioinoculant for
concurrent plant growth promotion and nickel accumulation in Brassica juncea. Chemosphere, 2006, 64: 991-997.
W e n z e l W.W. Rhizosphere processes and management in plant-assisted bioremediation (phytoremediation) of soils. Plant Soil, 2009, 321: 385-408.
R a w l i n g s D.E., S i l v e r S. Mining with microbes. Biotechnology, 1995, 13: 773-778.
F r a n c i s A.J. Microbial transformations of radioactive wastes and environmental restoration through bioremediation. J. Allo. Comp., 1994, 213/214: 226-231.
D e l o r m e T.A., G a g l i a r d i J.V., A n g l e J.S. e.a. Influence of the zinc hyperaccumulator Thaspi
caerulescens J. & C. Presl. and the nonmetal accumulator Trifolium pratense L. on soil microbial populations.
Canadian J. Microbiol., 2001, 47: 773-776.
L o d e w y c k x C., M e r g e a y M., V a n g r o n s f e l d J. e.a. Isolation, characterization, and identification of bacteria associated with the zinc hyperaccumulator Thlaspi caerulescens subsp. calaminaria. Int. J.
Phytorem., 2002, 4: 101-105.
S c h l e g e l H.G., C o s s o n J.P., B a k e r A.J.M. Nickel-hyperaccumulating plants provide a niche
for nickel-resistant bacteria. Bot. Acta, 1991, 104: 18-25.
B e n n i s s e R., L a b a t M., E l a s l i A. e.a. Rhizosphere bacterial populations of metallophyte plants in heavy
metal-contaminated soils from mining areas in semiarid climate. World J. Microbiol. Biotechnol., 2004, 20: 759-766.
K a m n e v A.A., V a n d e r L e l i e D. Chemical and biological parameters as tools to evaluate and
improve heavy metal phytoremediation. Biosci. Reports, 2000, 20: 239-258.
A b o u - S h a n a b R.I., D e l o r m e T.A., A n g l e J.S. e.a. Phenotypic characterization of microbes
in the rhizosphere of Alyssum murale. Int. J. Phytorem., 2003, 5: 367-379.
W h i t i n g S.N., D e S o u z a M.P., T e r r y N. Rhizosphere bacteria mobilize Zn for hyperaccumulation by Thlaspi caerulescens. Environ. Sci. Technol., 2001, 15: 3144-3150.
S h e n g X.F., X i a J.J. Improvement of rape (Brassica napus) plant growth and cadmium uptake by cadmium-resistant bacteria. Chemosphere, 2006, 64: 1036-1042.
O r t i z - C a s t r o R., C o n t r e r a s - C o r n e j o H.A., M a c i a s - R o d r i g u e z L. e.a. The role of
microbial signals in plant growth and development. Plant Signal. Behav., 2009, 4: 701-712.
G l i c k B.R. Using soil bacteria for phytoremediation. Biotechnol. Adv., 2010, 28: 367-374.
A r s h a d M., S a l e e m M., H u s s a i n S. Perspectives of bacterial ACC deaminase in phytoremediation. Trends Biotechnol., 2007, 25: 356-362.
B u r d G.I., D i x o n D.G., G l i c k B.R. A plant growth promoting bacterium that decreases nickel
toxicity in plant seedlings. Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64: 3663-3668.
B e l i m o v A.A., S a f r o n o v a V.I., S e r g e y e v a T.A. e.a. Characterisation of plant growthpromoting rhizobacteria isolated from polluted soils and containing 1-aminocyclopropane-1-carboxylate
deaminase. Canadian J. Microbiol., 2001, 47: 642-652.
B u l l i t t a S., S a f r o n o v a V., P i l u z z a G. e.a. Characterization of plant-microbe associations
from a heavy metal polluted area in SW Sardinia in view of their use in phytoremediation. Abstr. Int. Conf.
«Phytotechnologies in the 21st century: Remediation—Energy—Health—Sustainability». Parma, Italy, 2010: 147.
B e l i m o v A.A., W e n z e l W.W. The role of rhizosphere microorganisms in heavy metal tolerance of
higher plants. Aspect Appl. Biol., 2009, 98: 81-90.
M e t w a l l y A., S a f r o n o v a V.I., B e l i m o v A.A. e.a. Genotypic variation of the response to
cadmium toxicity in Pisum sativum L. J. Exp. Bot., 2005, 56: 167-178.
B e l i m o v A.A., H o n t z e a s N., S a f r o n o v a V.I. e.a. Cadmium-tolerant plant growth-promoting bacteria associated with the roots of Indian mustard (Brassica juncea L. Czern.). Soil Biol. Biochem., 2005, 37: 241-250.
B e l i m o v A.A., S a f r o n o v a V.I., T s y g a n o v V.E. e.a. Genetic variability in tolerance to cadmium and accumulation of heavy metals in pea (Pisum sativum L.). Euphytica, 2003, 131: 25-35.
Я к о б и Л.М., К у к а л е в А.С., У ш а к о в К.В. и др. Полиморфизм форм гороха посевного по
эффективности симбиоза с эндомикоризным грибом Glomus sp. в условиях инокуляции ризобиями.
С.-х. биол., 2000, 3: 94-102.
L e y v a l C., T u r n a u K., H a s e l w a n d t e r K. Effect of heavy metal pollution on mycorrhizal
colonization and function: physiological, ecological and applied aspects. Mycorrhiza, 1997, 7: 139-153.
Б е л и м о в А.А. Взаимодействие ассоциативных бактерий и растений в зависимости от биотических и абиотических факторов. Автореф. докт. дис. СПб, 2008.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: belimov@rambler.ru
MICROBIOLOGICAL ASPECTS OF RESISTANCE AND ACCUMULATION
OF HEAVY METALS BY PLANTS
A.A. Belimov, I.A. Tikhonovich
Summary
Plants and microorganisms form symbioses, which are complex biological systems having specific mechanisms of
adaptation to the environment based on interactions between symbionts. Many of symbiotrophic microorganisms, such as mycorrhizal fungi, nodule and associative bacteria, possess high tolerance to heavy metals and take part in processes of metal
transformation in the rhizosphere and accumulation by plants. However, mechanisms of adaptation of symbioses to toxic metal
concentrations and integration between components of plant-microbe systems under stress are scarcely understood. The role of
partners in maintenance of the symbiosis homeostasis under stressful conditions caused by heavy metals and possibilities for the
use of plant-microbe interactions for cultivation of agricultural crops and phytoremediation of polluted soils are discussed.
15
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631.46:579.64:574.38
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РИЗОСФЕРНЫХ БАКТЕРИЙ С РАСТЕНИЯМИ:
МЕХАНИЗМЫ ОБРАЗОВАНИЯ И ФАКТОРЫ ЭФФЕКТИВНОСТИ
АССОЦИАТИВНЫХ СИМБИОЗОВ?
(обзор)
А.И. ШАПОШНИКОВ1, А.А. БЕЛИМОВ1, Л.В. КРАВЧЕНКО1, Д.М. ВИВАНКО2
Обсуждаются механизмы положительного действия ризосферных бактерий на растения. Колонизация ризосферы интродуцентами рассматривается как необходимое условие образования растительно-бактериальной ассоциации и ключевой критерий селекции эффективных штаммов ризобактерий. Рассмотрена роль некоторых биотических факторов (смешанные культуры ризобактерий и взаимодействие интродуцентов с аборигенной микрофлорой) в
функционировании ассоциативного симбиоза и реакции растений на инокуляцию ризобактериями.
Ключевые слова: бактеризация, микробные ассоциации, ризосфера, симбиоз, фитогормоны.
Keywords: bacterisation, microbial associations, rhizosphere, symbiosis, phytohormones.
Ростстимулирующие ризобактерии (plant growth promoting rhizobacteria — PGPR)
играют важную роль в адаптации растения к внешним воздействиям (1). Таксономически
эти бактерии чрезвычайно разнообразны (2-7) (наиболее изучены представители родов
Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella, Psеudomonas и Bacillus). Они обитают в ризосфере (зона
почвы, непосредственно соприкасающаяся с корнями) (8), которая служит их основной
экологической нишей с наиболее благоприятными условиями (9), и на поверхности корней. В ризосферу из корней активно поступают сложные смеси легкодоступных органических источников энергии и углерода, что обусловливает ее высокую микробиологическую активность и образование отличающихся от почвенного микробоценоза специфических ризосферных микробных сообществ (10, 11). Разнообразие таких сообществ во многом
определяется количественным и качественным составом корневых выделений, зависящим
от вида, возраста и условий выращивания растения, а также от влияния комплекса почвенно-климатических факторов (10, 12). В свою очередь, микробиологическая активность в ризосфере приводит к существенному изменению химических и физических свойств этой зоны и накоплению продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, биологически активных
по отношению к растению. Для изучения взаимодействий растений с полезными формами
бактерий в ризосфере продуктивна концепция, согласно которой ризобактерии образуют с
растением единую растительно-микробную систему (ассоциацию) с новыми свойствами,
детерминированными положительным взаимодействием партнеров (12, 13).
В развивающемся устойчивом земледелии применение ризобактерий для улучшения
роста и питания сельскохозяйственных культур служит одним из перспективных подходов (2).
Однако механизмы взаимодействия компонентов растительно-микробных систем, условия
реализации ростстимулирующего потенциала ризобактерий и критерии отбора наиболее
эффективных ассоциативных штаммов во многом еще требуют фундаментального изучения.
Механизмы положительного действия ризобактерий
н а р а с т е н и я. Механизмы положительного влияния ризобактерий на жизнедеятельность
растений различны (14-17), и о применении этих бактерий для обработки (инокуляции) сельскохозяйственных культур накоплен огромный материал, убедительно подтверждающий эффективность такого приема получения высокого и качественного урожая (18-21). В основном
изучены взаимодействия растений с азотфиксирующими ризобактериями (диазотрофами)
(изоляция, экология, таксономия, хемотаксис и колонизация корней, выживаемость в почве,
биохимические и молекулярные механизмы процесса азотфиксации, другие механизмы взаимодействия с растениями) (22-24). Наиболее изученные ассоциативные азотфиксаторы — бактерии родов Azospirillum, Azotobacter и Klebsiella. Показано, что ассоциативная азотфиксация при
определенных условиях вносит существенный вклад в обеспечение растений азотом. Среди
недавних таких исследований представляет интерес сообщение, что при инокуляции бактерией Azospirillum amazonense растения риса содержали до 27 % N2 атмосферы (25).
К важнейшим механизмам взаимодействия в растительно-бактериальных ассоциациях относится продуцирование бактериями фитогормонов (ауксинов, цитокининов и гиббереллинов), витаминов и других биологически активных веществ (12, 26, 27). Наибольшее
внимание уделялось роли бактериальных ауксинов в стимуляции роста и питания растений,
поскольку способность синтезировать индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) широко распространена среди ризобактерий. Изучены биохимические пути и гены, ответственные за синтез ИУК, а также фенотипические эффекты экзогенных ауксинов на растения (26, 28). Показан положительный эффект бактериальных ауксинов на инициацию и удлинение корней,
развитие боковых корней и корневых волосков, что может иметь значение для ускоренного
?
Работа поддержана грантами РФФИ (06-04-49486-a, 09-04-01614-а, 09-04-13648-офи_ц, 10-04-90009-Бел_а, 1104-92501-АФГИР-Э_а).
16
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
роста, потребления питательных элементов и устойчивости растения к стрессам. Синтез
ауксинов ризосферными микроорганизмами в значительной степени определяется составом
корневых выделений, содержащих их основной метаболитический предшественник Lтриптофан (12, 26). Многие ризобактерии способны синтезировать цитокинины и гиббереллины. В качестве примера эффективной стимуляции роста растений бактериальными цитокининами можно привести эксперименты по инокуляции салата бактерией Bac. subtilis (29).
Необходимо также учитывать, что некоторые бактерии могут не только продуцировать, но и
деградировать фитогормоны. Так, описаны штаммы Ps. putida, расщепляющие ИУК, что может быть использовано для снятия ингибирующего действия суперпродуцентов ИУК, к которым относятся фитопатогены, на растения (30). Однако как ризобактерии, расщепляющие фитогормоны, так и реакция растений на эту деструкцию требуют более детального изучения (31).
Важную роль в образовании растительно-бактериальных ассоциаций могут играть
бактериальные гликопротеины — лектины, которые участвуют в колонизации корней бактериями, а также стимулируют активность растительных ферментов и ростовые процессы (32,
33). Показано сильное ростстимулирующее действие летучих метаболитов ацетоина и 2,3бутандиола, продуцируемых штаммами Bас. subtilis и Bас. amyloliquefaciens, в отношении Arabidopsis thaliana (34). Стимуляция роста A. thaliana летучими метаболитами отмечалась также у
Burkholderia cepacia и Staphylococcus epidermidis (35). Учитывая, что спектр соединений, выделяемых бактериями в среду, чрезвычайно широк, следует ожидать сообщений о новых
биологически активных веществах, положительно влияющих на метаболизм растений.
Способность ризосферных бактерий растворять труднодоступные почвенные фосфаты давно рассматривается как важный механизм положительного действия на фосфорное питание растения (36). Недавно были обобщены результаты многолетних исследований по экологии, селекции и таксономии фосфатмобилизующих бактерий, а также их ассоциаций с растениями и эффективности инокуляции (37). Изучены бактериальные гены кислых фосфатаз и
фитаз, расщепляющих органофосфаты, а также гены, участвующие в растворении минеральных фосфатов, например ответственные за биосинтез глюконовой кислоты (38). Многие бактерии могут повышать доступность фосфататов для растения за счет простого подкисления
среды в процессе жизнедеятельности, в частности при утилизации сахаров с образованием органических кислот. Благодаря такому неспецифическому эффекту в определенных условиях
очень многие ризобактерии могут функционировать как фосфатмобилизующие.
Другие механизмы, облегчающие потребление питательных элементов у растений, обнаружены при изучении их взаимодействия с бактериями рода Azospirillum (39).
Так, инокуляция активизировала транспорт протонов из клеток корней и приводила к
подкислению ризосферы, что могло мобилизовать связанные в минералах питательные
элементы, в том числе фосфор. Известны азоспириллы, обладающие пектолитической
активностью, что вызывает повышенную ионную проницаемость у кортикальных клеток корней. Кроме того, при инокуляции растения потребление питательных элементов
может изменяться из-за их трансформации в ризосфере, например с участием бактериальной нитратредуктазы (40, 41). Важную роль в повышении доступности питательных
элементов способны играть бактериальные сидерофоры — низкомолекулярные вещества, хелатирующие железо и другие металлы с образованием устойчивых комплексов (42,
43). В большей степени изучены сидерофоры, синтезируемые бактериями рода Pseudomonas (44). Продукция сидерофоров ризобактериями связана с удовлетворением их потребностей в железе и ингибированием конкурентной микрофлоры за счет образования
недоступных для нее Fe-сидерофорных комплексов. Важно, что такие комплексы могут
усваиваться растениями, хотя и в меньшей степени, чем Fe-содержащие соединения
некоторых синтетических хелаторов железа и фитосидерофоров (45).
Описаны эксперименты, свидетельствующие о повышении активности систем поглощения и транспорта питательных элементов у инокулированных растений. Так, при
инокуляции Achromobacter sp. отмечали увеличение скорости ассимиляции нитрата в корнях у рапса (46), при инокуляции в Azospirillum brasilense — индукцию экспрессии гена
LEAMT1:2 , кодирующего транспортер аммония, у томата (47). Инокуляция озимой пшеницы ризобактериями вызывала у растений изменения в составе фосфорных соединений, в
том числе увеличивала содержание кислоторастворимой фракции и АТФ (48), что может
рассматриваться как указание на изменение регуляции метаболизма питательных элементов
у инокулированных растений. Интерес к механизмам прямого воздействия ризобактерий на
системы поглощения и транспорта элементов в растениях в настоящее время возрастает
(49). Наиболее вероятно, что вышеперечисленные специфические эффекты бактерий
служат причиной повышения содержания определенного элемента в растительных тканях. Существенное влияние бактерий на рост биомассы растения может не проявиться, если дефицит этого элемента не представляет собой ростлимитирующий фактор. Однако чаще наблюдают только повышение накопления (выноса) определенных элементов, обусловленное увеличением биомассы инокулированных растений. Такое действие бактерий может
быть связано со стимуляцией роста корней, приводящей к освоению ими большего почвенного пространства и, следовательно, дополнительных питательных ресурсов (39, 49).
Многие из этих описанных свойств бактерий и механизмов их положительного
влияния на растения могут играть важную роль в защите последних от неблагоприятных условий среды и абиотических стрессов. Это обусловлено потенциальной направленностью
действия ризобактерий против негативных эффектов и последствий воздействия стрессоров
17
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
(50). Универсальным антистрессовым эффектом обладают бактерии, содержащие фермент 1аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазу, благодаря которому в растениях снижается содержание этилена — сигнальной молекулы в каскаде неспецифических стрессовых
реакций (51, 52). Бактерии колонизируют корни растений и используют АЦК в качестве
источника питания, что приводит к снижению ее содержания и, соответственно, интенсивности биосинтеза этилена в корнях (50, 52). В результате ингибирующий эффект стрессового этилена на рост растения подавляется. Участие АЦК деаминазы в стимуляции роста растений было доказано в экспериментах с «knock-out» мутантами (53) и при переносе гена
АЦК деаминазы в штаммы, не обладающие этим ферментом (54). В настоящее время
имеется ряд сообщений о защитном эффекте АЦК-утилизирующих ризобактерий в условиях токсического действия тяжелых металлов (55-57), дефицита (54, 58) или избытка (59)
почвенной влаги, а также осмотического стресса при засолении почвы (60, 61).
Способность ризобактерий подавлять развитие фитопатогенных микроорганизмов
изучают на протяжении многих лет (12, 62, 63). Известные механизмы биоконтроля могут
быть связаны с прямым влиянием ризобактерий на фитопатоген, а также с воздействием на
растение, направленным на повышение его устойчивости к заболеванию. К одной их группе относится конкурентная колонизация корней и конкуренция за общие пищевые субстраты (62, 64). В этом случае эффективной может быть инокуляция растений авирулентными фитопатогенными штаммами или близкородственными видами. Успешная конкуренция в результате экологической несовместимости видов (правило Гаузе) приводит к вытеснению фитопатогена из зоны воздействия на растения, как следствие, контакт с растением
и его инфицирование ограничиваются. Конкурентоспособность биоконтрольного штамма
существенно повышается при продуцировании антибиотиков и токсинов, особенно антигрибных метаболитов. Это другая группа механизмов прямого воздействия на фитопатоген,
приводящего к ингибированию его роста или гибели. Уже идентифицирован ряд таких
антибиотиков (62, 65), и их список постоянно пополняется. Еще одна группа распространенных механизмов — взаимодействие биоконтрольных бактерий с фитопатогенными грибами по типу паразитизма, что особенно характерно при обильном развитии фитопатогена, который может служить богатым источником питания для бактерий, продуцирующих
литические ферменты (хитиназы, целлюлазы, липазы, протеазы) (2).
К механизмам опосредованного растением биоконтрольного эффекта относится способность непатогенных бактерий индуцировать у растений защитные реакции,
направленные на повышение устойчивости к фитопатогенам (66, 67). Сигнальными молекулами, запускающими каскад защитных реакций, могут быть салициловая кислота,
бактериальные липополисахариды, сидерофоры и, вероятно, другие вещества не известной пока природы. Cпектр и интенсивность защитных реакций растения на биоконтрольный организм и фитопатоген может различаться, что, возможно, связано с отсутствием у непатогенных штаммов специфических сигнальных молекул (66).
К о л о н и з а ц и я к о р н е й р и з о б а к т е р и я м и. К необходимым
условиям эффективного взаимодействия интродуцируемых популяций ризобактерий с растениями относится способность интродуцента активно колонизировать корни и поддерживать экологически значимую численность популяции (12, 68). Колонизация корней
ризобактериями — сложный мультистадийный и энергоемкий процесс, за который ответственно большое число бактериальных и растительных генов (68). Он может быть разделен на несколько стадий: хемотаксис к корневым экзометаболитам, адсорбцию, формирование микроколоний в местах интенсивной экссудации корневых метаболитов, миграцию
вдоль корневой поверхности и конкуренцию с другими микроорганизмами (68). По данным сканирующей электронной микроскопии, микроколонии ризобактерий на поверхности корней покрыты слизеподобным слоем, предохраняющим клетки и колонию в
целом от неблагоприятных воздействий (69).
Для успешной колонизации корней важна способность бактерий утилизировать
основные компоненты корневых выделений, в особенности низкомолекулярные органические кислоты. Мутант Ps. fluorescens WCS365, не растущий на органических кислотах, плохо
колонизировал корни томата, а мутант, который не мог расти на сахарах, колонизировал
корни так же, как дикий тип (70). Кроме того, при утилизации органических кислот скорость роста, антифунгальная активность и интенсивность продукции ряда антибиотиков у
ризосферных псевдомонад, как правило, выше, чем при использовании сахаров (71, 72). В
ризосфере у диплоидных генотипов пшеницы с высоким относительным содержанием органических кислот в корневых выделениях численность ассоциативных азотфиксаторов и
других ризобактерий росла интенсивнее (73). Способность синтезировать аминокислоты и
витамин В1 также оказалась существенной для колонизации корней псевдомонадами (68).
Ауксотрофные по аминокислотам мутанты Ps. fluorescens WCS365 не росли на корнях томата без внесения в ризосферу дополнительного количества аминокислот (74).
Активная колонизация ризосферы и поверхности корней служит важным критерием
отбора полезных форм ризобактерий, предназначенных для инокуляции растений. К эффективным приемам селекции активных колонизаторов ризосферы относится модифицированный метод накопительных культур О.А. Берестецкого с соавт. (3, 12), основанный на заселении стерильных корней бактериями, проявляющими активный хемотаксис к корневым выделениям, с последующей оценкой конкурентоспособности изолятов при инокуляции совместно со стандартным штаммом, имеющим высокую колонизирующую активность. В результате
18
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
были выделены активные колонизаторы ризосферы рода Pseudomonas с биоконтрольными и
ростстимулирующими свойствами (3, 12). Оригинальный прием позже предложили I. Kuiper с
соавт. (75): сначала они выделяли консорциум ризосферных бактерий, затем инокулировали
им стерильные корни, после чего реизолировали наиболее активных колонизаторов. В результате нескольких циклов отбора удалось получить наиболее конкурентоспособные штаммы с
высокой скоростью утилизации основных компонентов корневых выделений (76). Этот метод
был также успешно использован при селекции биоконтрольных штаммов (77). Эффективным
оказалось применение принципа популяционного доминирования для селекции бактериальных сообществ из ризосферы прорастающих в нестерильной почве семян (78). Такой подход
учитывает высокую конкурентоспособность микроорганизмов при колонизации корней проростков в реальных условиях с учетом влияния комплекса биотических и абиотических факторов среды и генотипа растения. Впоследствии это дает возможность успешно интродуцировать популяцию примерно в ту экологическую нишу, из которой ее первоначально изолировали,
что повышает вероятность образования эффективной растительно-бактериальной ассоциации.
Э ф ф е к т и в н о с т ь и н о к у л я ц и и р а с т е н и й с м е ш а н н ы м и к у л ьт у р а м и р и з о б а к т е р и й. Совместное использование нескольких штаммов ризобактерий с неодинаковыми свойствами и механизмами взаимодействия с растением неоднократно рассматривалось как возможность улучшения эффективности инокуляции (23, 50,
79). Прием основан на расширении экологической пластичности и диапазона совместимости многокомпонентных бактериальных инокулятов с растением и использовании принципов аддитивности и синергизма при взаимодействии с растением нескольких ассоциантов.
Описаны успешные эксперименты по инокуляции смесями азотфиксирующих бактерий,
существенно повышающими урожай и накопление азота у различных растений (80-82). Повышенная эффективность совместной интродукции азотфиксаторов и фосфатмобилизаторов по сравнению с монокультурами описана относительно давно на бактериях рода Azotobacter (83, 84). Позднее на примере Azospirillum lipoferum и Agrobacterium radiobacter механизмы положительного действия таких ассоциаций на рост и минеральное питание растений изучили подробно (50, 85) и показали, что эти ризобактерии образуют ассоциацию в периодической культуре и при интродукции в ризосферу. Их аддитивный и синергический эффекты
обусловлены активизацией минерального питания растений и оптимизацией его баланса за
счет интенсивного поглощения азотных и фосфорных удобрений, а также повышенной азотфиксирующей активностью и приживаемостью Az. lipoferum на корнях (50, 85).
В условиях сосуществования в одной пространственной зоне и конкуренции за корневые экссудаты между активно взаимодействующими друг с другом ризобактериями образуются трофические и регуляторные связи (13, 86, 87). Например, способность фиксировать атмосферный азот делает диазотрофов чрезвычайно привлекательными партнерами для многих
микроорганизмов, усваивающих только минеральные формы азота. Показано, что бактерии
рода Azospirillum образуют ассоциации с целлюлозоразлагающими (Cellulomonas) (88), пектинолитическими (Bacillus) (89) и другими ризосферными (90, 91) бактериями. Такие ассоциации
основаны на свойстве азоспирилл использовать в качестве источника углерода продукты разложения полимеров бактериями-ассоциантами, снабжая последние фиксированным азотом.
Как следствие, ускоряется ассимиляция полимеров и стимулируется N2-фиксация. Описана
ассоциация азотфиксатора Phyllobacterium sp. и фосфатмобилизатора Bac. licheniformis, в которой бактерии лучше развивались, фиксировали N2 и растворяли фосфат кальция, а инокуляция побегов мангровых деревьев этой ассоциацией улучшала азотное питание растений (92).
Вероятно, образование описаной ассоциации обусловлено способностью Phyllobacterium sp.
снабжать бациллу азотом, а она, в свою очередь, обеспечивает потребности азотфиксатора в
фосфоре. В пободных ассоциациях интродуценты лучше адаптируются к условиям среды и
успешнее конкурируют с другими бактериями за питание. Ризобактерии также играют роль
«вспомогательных» агентов для активизации симбиотических отношений при инокуляции
растений клубеньковыми бактериями и микоризными грибами (18, 39, 87). Стимулирующее
действие может быть обусловлено как прямым, так и опосредованным влиянием ризобактерий на микросимбионты (в последнем случае — через положительный эффект на растение).
А с с о ц и а ц и и и н т р о д у ц и р у е м ы х р и з о б а к т е р и й с а б о р и г е нн о й м и к р о ф л о р о й. Попадая с семенами в почву, интродуценты вступают в тесный
контакт с аборигенной микрофлорой и должны занять экологическую нишу в корневой зоне
прорастающих семян, которая привлекает многих полезных и вредных для растений микроорганизмов. Как уже отмечалось, интродуцируемые ризобактерии легко вступают в ассоциации с разнообразными микроорганизмами. С одной стороны, аборигенные микроорганизмы могут повышать доступность дополнительных питательных ресурсов для интродуцента,
его выживаемость и активность в зоне корней. С другой стороны, в ризосфере в большой
степени развиты взаимодействия микробов по типу антагонизма и конкуренции за корневые выделения (68, 70, 71, 86, 93). В частности, бактерии рода Azospirillum проявляют
антагонистическое влияние на другие ризосферные бактерии и при интродукции могут
изменять состав ризосферного сообщества, что свидетельствует об активных взаимодействиях интродуцента с аборигенной микрофлорой (94). Однако сами азоспириллы чувствительны к антибиотикам (95), и их рост существенно ингибируется метаболитами
многих ризосферных микроорганизмов (96, 97). Это одна из причин слабой конкурентоспособности азоспирилл в ризосфере и снижения эффективности инокуляции (50, 98).
Интродуцируемые ризобактерии образуют ассоциации не только с полезными, но
19
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
и с вредными для растений ризосферными аборигенами. Такое взаимодействие описано для
Az. lipoferum и фитопатогенной бактерии Cytophaga jonsonae, стимулирующей нитрогеназную
активность азоспирилл и повышающей их выживаемость на корнях (97). Однако совместная инокуляция ячменя этими ризобактериями была неэффективной, так как C. johnsonae
ингибировала развитие растений. Было также обнаружено, что у ячменя биоконтрольный
штамм Flavobacterium sp. L30 в условиях in vitro полностью подавлял рост ризосферных
бактерий, усиливающих прорастание семян, а в вегетационном опыте снижал эффективность инокуляции бактериями-стимуляторами (97).
Таким образом, один из важных факторов выживания и активности интродуцируемых бактерий в ризосфере — взаимодействие с аборигенными микроорганизмами, в частности устойчивость к их влиянию. Слабая конкурентоспособность интродуцентов, а также образование ими ассоциации с вредной для растений микрофлорой или ингибирование
активности полезных форм микроорганизмов может влиять на эффективность инокуляции
и искажать ожидаемую реакцию растений на внесение ризобактерий в почву.
Итак, ризобактерии, как правило, обладают набором свойств, влияющих на рост и
питание растений. Это обусловливает широкую вариабельность реакций макроорганизма на
инокуляцию и затрудняет интерпретацию полученных результатов, но в то же время открывается возможность для сочетания многих полезных свойств в одном штамме, что делает интродуцента более эффективным и экологически пластичным. Расширяется спектр известных
механизмов растительно-ризобактериальных взаимодействий: относительно недавно описаны
антистрессовые бактериальные эффекты за счет активности 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат деаминазы (АЦК деаминазы) и специфические воздействия на системы потребления
элементов минерального питания. Особый интерес представляет вопрос, как растения влияют
на численность популяций интродуцируемых штаммов и их функциональную активность. Весьма перспективно создание инокулятов, состоящих из бактериальных ассоциаций с аддитивными
и синергическими эффектами на растения и повышающих устойчивость растительно-бактериальной системы. К настоящему времени информация о взаимодействии компонентов ризосферного сообщества с интродуцентами довольно ограничена. Часто этим затрудняется понимание реакции растений на инокуляцию и поведения популяции интродуцента в ризосфере.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
20
M o n t e s i n o s E. Development, registration and commercialization of microbial pesticides for plant protection. Int. Microbiol., 2003, 6: 245-252.
W h i p p s J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere. J. Exp. Bot., 2001, 52: 487-511.
К р а в ч е н к о Л.В., М а к а р о в а Н.М., А з а р о в а Т.С. и др. Выделение и фенотипическая
характеристика ростстимулирующих ризобактерий (PGPR), сочетающих высокую активность колонизации корней и ингибирования фитопатогенных грибов. Микробиология, 2002, 71(4): 521-525.
T h o m a s h o w L.S. Biological control of plant root pathogens. Curr. Opin. Biotechnol., 1996, 7: 343-347.
W e l l e r D.M., R a a i j m a k e r s J.M., M c S p a d d e n G a r d e n e r B.B. e.a. Microbial populations
responsible for specific soil suppressiveness to plant pathogens. Annu. Rev. Phytopathol., 2002, 40: 309-348.
B a s h a n Y., D e B a s h a n L.E. Protection of tomato seedlings against infection by Pseudomonas syringae pv. tomato by using the plant growth-promoting bacterium Azospirillum brasilense. Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68(6): 2637-2643.
P o l y a n s k a y a L.M., V e d i n a O.T., L y s a k L.V. e.a The growth-promotion effect of Beijerinckia mobilis and Clostridium sp. сultures on some agricultural crops. Microbiology, 2002, 71(1): 109-115.
H i l t n e r L. Uber neuere Erfahrungen und Problem auf dem Gebeit der Bodenbakteriologie und unter besonderer Berucksichtigung der Grundungung und Brache. Arb Dtsch. Landwirt. Ges., 1904, 98: 59-78.
K u i p e r I., L a g e n d i j k E.L., B l o e m b e r g G.V. e.a Rhizoremediation: a beneficial plantmicrobe interaction. MPMI, 2004, 17(1): 6-15.
L y n c h J.M. The rhizosphere. Chichester, England, J. Willey Ltd., 1990.
Plant roots. The hidden half /Y. Waisel, A. Eshel, U. Kafkafi (eds.). N.Y., Marcel Dekkers Inc., 1996.
К р а в ч е н к о Л.В. Роль корневых экзометаболитов в интеграции микроорганизмов с растениями.
Автореф. докт. дис. М., 2000.
B a i s H.P., W e i r T.L., P e r r y L.G. e.a The role of root exudates in rhizosphere interactions with
plants and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol., 2006, 57: 233-266.
PGPR: Biocontrol and biofertilization. V. XIII /Z.A. Siddiqui (ed.). Springer, Berlin Heidel-berg, N.Y., 2005.
Iron nutrition in plants and rhizospheric microorganisms. V. XVIII /L.L. Barton, J. Abadia (eds.). Springer,
Berlin, Heidelberg, N.Y., 2006.
Plant-associated bacteria. V. IX /S.S. Gnanamanickam (ed.). Springer, Berlin Heidelberg, N.Y., 2006.
Associative and endophytic nitrogen-fixing bacteria and cyanobacterial associations. Ser. Nit. Fix. V. 5. /C. Elmerich,
W.E. Newton (eds.). Springer, 2007.
V e s s e y J.K. Plant growth promoting rhizobacteria as biofertilizers. Plant and Soil, 2003, 255: 571-586.
К о ж е м я к о в А.П., Ч е б о т а р ь В.К. Биопрепараты для земледелия. В сб.: Биопрепараты в
сельском хозяйстве. М., 2005: 18-54.
З а в а л и н А.А. Биопрепараты, удобрения и урожай. М., 2005.
Ч е б о т а р ь В.К., З а в а л и н А.А., К и п р у ш к и н а Е.И. Эффективность применения биопрепарата экстрасол. М., 2007.
У м а р о в М.М. Ассоциативная азотфиксация. М., 1986.
B a s h a n Y., H o l g u i n G., D e B a s h a n L.E. Azospirillum-plant relationships: physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003). Can. J. Microbiol., 2004, 50: 521-577.
Genetics and regulation of nitrogen fixation in free-living bacteria /W. Klipp, B. Masepohl, J.R. Gallon e.a.
(eds.). Springer, Netherlands, 2005.
R o d r i g u e s E.P., R o d r i g u e s L.S., M a r t i n e z A.L. e.a Azospirillum amazonense inoculation:
effects on growth, yield and N2 fixation of rice (Oryza sativa L.). Plant and Soil, 2008, 302: 249-261.
F r a n k e n b e r g e r W.T., A r s h a d M. Phytohormones in soils: production and function. N.Y., 1995.
Ц а в к е л о в а Е.А., К л и м о в а С.Ю., Ч е р д ы н ц е в а Т.А. и др. Микробные продуценты стимуляторов роста растений и их практическое использование: обзор. Прикл. биохим. микробиол., 2006, 2: 133-143.
S p a e p e n S., V a n d e r l e y d e n J., R e m a n s R. Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling. FEMS Microbiol. Rev., 2007, 31: 425-448.
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
A r k h i p o v a T.N., V e s e l o v S.U., M e l e n t i e v A.I. e.a Ability of bacterium Bacillus subtilis to
proceed cytokinins and to influence the growth and endogenous hormone content of lettuce plants. Plant and
Soil, 2004, 272: 201-209.
L e v e a u J.H.J., L i n d o w S.E. Utilization of the plant hormone indole-3-acetic acid for growth by
Pseudomonas putida strain 1290. Appl. Environ. Microbiol., 2005, 71(5): 2365-2371.
D o d d I.C., Z i n o v k i n a N.Y., S a f r o n o v a V.I. e.a Rhizobacterial mediation of plant hormone
status. Ann. Appl. Biol., 2010, 157(3): 361-379.
К а р п у н и н а Л.В. Роль агглютинирующих белков ризобий и азотфиксирующих бацилл при
взаимодействии с растениями. В сб.: Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями. М., 2005: 98-117.
Н и к и т и н а В.Е., П о н о м а р е в а Е.Г., А л е н ь к и н а С.А. Лектины клеточной поверхности
азоспирилл и их роль в ассоциативных взаимоотношениях с растениями. В сб.: Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями. М., 2005: 70-97.
R y u C.-M., F a r a g M.A., H u C.-H. e.a. Bacterial volatiles promote growth in Arabidopsis. PNAS,
2003, 100: 4927-4932.
V e s p e r m a n n A., K a i M., P i e c h u l l a B. Rhizobacterial volatiles affect the growth of fungi
and Arabidopsis thaliana. Appl. Environ. Microbiol., 2007, 73: 5639-5641.
R o d r i g u e z H., F r a g a R. Phosphate solubilizing bacteria and their role in plant growth promotion.
Biotech. Adv., 1999, 17: 319-339.
First International meeting on microbial phosphate solubilization, Ser. Dev. (E. Velazquez, C. RodriguezBarrueco, eds.). Plant Soil Science, 2007, 102.
R o d r i g u e z H., F r a g a R., G o n z a l e z T. e.a Genetics of phosphate solubilization and its potential applications for improving plant growth-promoting bacteria. Plant and Soil, 2006, 287: 15-21.
D o b b e l a e r e S., V a n d e r l e y d e n J., O k o n Y. Plant growth-promoting effects of diazotrophs
in the rhizosphere. Crit. Rev. Plant Sci., 2003, 22: 107-149.
B o d d e y R.M., B a l d a n i V.L.D., B a l d a n i J.I. e.a Effect of inoculation of Azospirillum spp. on
the nitrogen accumulation of field grown wheat. Plant and Soil, 1986, 95: 109-121.
F e r r e i r a M.C.B., F e r n a n d e s M.S., D o b e r e i n e r J. Role of Azospirillum brasilense nitrate
reductase in nitrate assimilation by wheat plants. Biol. Fert. Soils, 1987, 4: 47-53.
M e y e r J.M., H a l l e F., H o h n a d e l D. e.a Siderophores of Pseudomonas — biological properties.
In: Iron transport in microbes, plants and animals. Weinheim, VCH Verlagsgesellschaft, 1987: 188-205.
N e i l a n d s J.B. Siderophores: structure and function of microbial iron transport compounds. J. Biol.
Chem., 1995, 45: 26723-26726.
B u d z i k i e w i c z H. Siderophores of fluorescent pseudomonads. Zeitschrift fьr Naturforschung, 1997, 52: 713-720.
B a r - N e s s E., C h e n Y., H a d a r Y. e.a Siderophores of Pseudomonas putida as an iron source for
dicot and monocot plants. Plant and Soil, 1991, 130: 231-241.
B e r t r a n d H., P l a s s a r d C., P i n o c h e t X. e.a. Stimulation of ionic transport system in Brassica napus
by a plant growth-promoting rhizobacterium (Achromobacter sp.). Can. J. Microbiol., 2000, 46: 229-236.
B e c k e r D., S t a n k e R., F e n d r i k I. e.a. Expression of the NH4+-transporter gene LEAMT1:2 is
induced in tomato roots upon association with N2-fixing bacteria. Planta, 2002, 215: 424-429.
Г у б а й д у л л и н а Т.С., С а м о с о в а С.М. Влияние бактерий-стимуляторов и бактерийингибиторов роста растений на ростовые процессы и фосфорный обмен листьев озимой пшеницы. В
сб.: Микроорганизмы и высшие растения. Казань, 1978: 55-65.
M a n t e l i n S., T o u r a i n e B. Plant growth-promoting bacteria and nitrate availability: impacts on
root development and nitrate uptake. J. Exp. Bot., 2004, 55: 27-34.
Б е л и м о в А.А. Взаимодействие ассоциативных бактерий и растений в зависимости от биотических и абиотических факторов. Автореф. докт. дис. СПб, 2008.
C z a r n y J.C., G r i c h k o V.P., G l i c k B.R. Genetic modulation of ethylene biosynthesis and signaling in plants. Biotech. Adv., 2006, 24: 410-419.
B e l i m o v A.A., H o n t z e a s N., S a f r o n o v a V.I. e.a. Cadmium-tolerant plant growth-promoting bacteria
associated with the roots of Indian mustard (Brassica juncea L. Czern.). Soil Biol. Biochem., 2005, 37: 241-250.
G l i c k B.R., J a c o b s o n C.B., S c h w a r z e M.M.K. e.a. 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid
deaminase mutants of the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2 do not stimulate canola root elongation. Can. J. Microbiol., 1994, 40: 911-915.
B e l i m o v A.A., D o d d I.C., H o n t z e a s N. e.a Rhizosphere bacteria containing ACC deaminase increase
yield of plants grown in drying soil via both local and systemic hormone signaling. New Phytol., 2009, 181: 413-423.
G l i c k B.R. Phytoremediation: synergistic use of plants and bacteria to clean up the environment. Biotech.
Adv., 2003, 21: 383-393.
S a f r o n o v a V.I., S t e p a n o k V.V., E n g q v i s t G.L. e.a Root-associated bacteria containing 1aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase improve growth and nutrient uptake by pea genotypes cultivated
in cadmium supplemented soil. Biol. Fertil. Soils, 2006, 42: 267-272.
B e l i m o v A.A., W e n z e l W.W. The role of rhizosphere microorganisms in heavy metal tolerance of
higher plants. Aspe. Appl. Biol., 2009, 98: 81-90.
B e l i m o v A.A., D o d d I.C., S a f r o n o v a V.I. e.a. ACC deaminase-containing rhizobacteria improve vegetative development and yield of potato plants grown under water-limited conditions. Aspe. Appl. Biol., 2009, 98: 163-169.
G r i c h k o V.P., G l i c k B.R. Amelioration of flooding stress by ACC deaminase-containing plant growthpromoting bacteria. Plant Physiol. Biochem., 2001, 39: 11-17.
M a y a k S., T i r o s h T., G l i c k B.R. Plant growth-promoting bacteria that confer resistance in tomato to salt stress. Plant Physiol. Biochem., 2004, 42: 565-572.
C h e n g Z., P a r k E., G l i c k B.R. 1-Aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase from Pseudomonas putida UW4 facilitates the growth of canola in the presence of salt. Can. J. Microbiol., 2007, 53: 912-918.
B l o e m b e r g G.V., L u g t e n b e r g B.J.J. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol
by rhizobacteria. Curr. Opin. Plant Biol., 2001, 4: 343-350.
P a u l i t z T.C., B й l a n g e r R.R. Biological control in greenhouse systems. Annu. Rev. Phytopathol.,
2001, 39: 103-133.
D u f f y B., K e e l C., D e f a g o G. Potential role of pathogen signaling in multitrophic plant-microbe
interactions involved in disease protection. Appl. Environ. Microbiol., 2004, 70: 1836-1842.
R a a i j m a k e r s J.M., V l a m i M., D e S o u z a J.T. Antibiotic production by bacterial biocontrol
agents. Antonie van Leeuwenhoek, 2002, 81(1-4): 537-547.
V a n L o o n L.C., B a k k e r P.A.H.M., P i e t e r s e C.M.J. Systemic resistance induced by
rhizosphere bacteria. Annu. Rev. Phytopathol., 1998, 36: 453-483.
K i r a l y L., B a r n a B., K i r б l y Z. Plant resistance to pathogen infection: forms and mechanisms of
innate and acquired resistance. J. Phytopathol., 2007, 155: 385-396.
L u g t e n b e r g B.J.J., D e k k e r s L., B l o e m b e r g G.V. Molecular determinants of the rhizosphere
colonization by pseudomonas. Annu. Rev. Phytopathol., 2001, 39: 461-490.
C h i n - a - W o e n g T.F.C., D e P r i e s t e r A.J., V a n d e r B i j W. e.a. Description of the olonization of a gnotobiotic tomato rhizosphere by Pseudomonas fluorescens biocontrol strain WCS365, using
21
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
scanning electron microscopy. MPMI, 1997, 10: 79-86.
L u g t e n b e r g B.J.J., K r a v c h e n k o L.V., S i m o n s M. Tomato seeds and root exudate sugars:
composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization. Environ. Microbiol., 1999, 1: 439-445.
К р а в ч е н к о Л.В., А з а р о в а Т.С., Л е о н о в а - Е р к о Е.И. и др. Корневые выделения томатов и
их влияние на рост и антифунгальную активность штаммов Pseudomonas. Микробиология, 2003, 72(1): 48-53.
Ш т а р к О.Ю., Ш а п о ш н и к о в А.И., К р а в ч е н к о Л.В. Продуцирование антифунгальных метаболитов Pseudomonas chlororaphis при росте на различных источниках питания. Микробиология, 2003, 72(5): 645-650.
К р а в ч е н к о Л.В., А з а р о в а Т.С., Д о с т а н к о О.Ю. Влияние корневых экзометаболитов пшеницы с различной плоидностью генома на рост Azospirillum brasilense. Микробиология, 1993, 62(5): 863-868.
S i m o n s M., P e r m e n t i e r H.J., D e W e g e r L.A. e.a Amino acid synthesis is necessary for tomato root colonization by Pseudomonas fluorescens strain WCS365. MPMI, 1997, 10: 102-106.
K u i p e r I., B l o e m b e r g G.V., L u g t e n b e r g J.J. Selection of a plant-bacterium pair as a novel tool for
rhizostimulation of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria. MPMI, 2001, 14: 1197-1205.
K u i p e r I., K r a v c h e n k o L.V., B l o e m b e r g C.V. e.a Pseudomonas putida strain PCL1444,
selected for efficient root colonization and naphthalene degradation, effectively utilizes root exudate components. MPMI, 2002, 15: 734-741.
K a m i l o v a F., V a l i d o v S., A z a r o v a T. e.a Enrichment for enhanced competitive plant root
tip colonizers selects for a new class of biocontrol bacteria. Environ. Microbiol., 2005, 7(11): 1809-1817.
Б е л и м о в А.А., И в а н ч и к о в А.Ю., Ю д к и н Л.Ю. и др. Характеристика и интродукция
новых штаммов ассоциативных ростстимулирующих бактерий, доминирующих в ризоплане проростков ячменя. Микробиология, 1999, 68(3): 392-397.
O k o n Y., L a b a n d e r a - G o n z a l e z C.A. Agronomic applications of Azospirillum: an evaluation of 20 years
worldwide field inoculation. Soil Biol. Biochem., 1994, 26: 1591-1601.
F a y e z M. Untraditional N2-fixing bacteria as biofertilizers for wheat and barley. Ann. Agri. Sci., 1989, 34: 731-740.
M a u d i n a s B., C h e m a r d i n M., Y o v a n o v i c h E. e.a Gnotobiotic cultures of rice plants up
to ear stage in the absence of combined nitrogen source but in the presence of free living nitrogen fixing bacteria Azotobacter vinelandii and Rhodopseudomonas capsulate. Plant and Soil, 1981, 60: 85-97.
R a i S.N., G a u r A.C. Characterization of Azotobacter spp. and effect of Azotobacter and Azospirillum as inoculant on
the yield and N-uptake of wheat crop. Plant and Soil, 1988, 109: 131-134.
K u n d u B.S., G a u r A.C. Rice response to inoculation with N2-fixing and P-solubilizing microorganisms.
Plant and Soil, 1984, 79: 227-234.
M o n i b M., H o s n y I., B e s a d a Y. Seed inoculation of castor oil plant (Ricinus communis) and effect on nutrient uptake. Soil Biol. Conserv. Biosphere, 1984, 2: 723-732.
B e l i m o v A.A., K o z h e m y a k o v A.P., C h u v a r l i y e v a G.V. Interaction between barley
and mixed cultures of nitrogen fixing and phosphate solubilizing bacteria. Plant and Soil, 1995, 173: 29-37.
К о в р о в Б.Г., Т и р р а н е н Л.С., Т и т о в а Г.Т. Метаболитические взаимодействия в микробных ценозах, образующиеся при культивировании пшеницы в фитотроне. Микробиология, 1981, 50: 700-704.
Б е л и м о в А.А., К о ж е м я к о в А.П. Смешанные культуры азотфиксирующих бактерий и перспективы их использования в земледелии. С.-х. биол., 1992, 5: 77-87.
H a l s a l l D.M., G i b s o n A.H. Nitrogenase activity of a range of diazotrophic bacteria on strow, strow
breakdown products and related compounds. Soil Biol. Biochem., 1989, 21: 291-298.
K h a m m a s K.M., K a i s e r P. Pectin decomposition and associated nitrogen fixation by mixed cultures of Azospirillum and Bacillus species. Can. J. Microbiol., 1992, 38: 794-797.
H o l g u i n G., B a s h a n Y. Nitrogen-fixation by Azospirillum brasilense Cd is promoted when co-cultured
with a mangrove rhisosphere bacterium (Staphylococcus sp.). Soil Biol. Biochem., 1996, 8: 1651-1660.
L e b s k y V.K., G o n z a l e z - B a s h a n L.E., B a s h a n Y. Ultrastructure of interaction in alginate beads
between the microalga Chlorella vulgaris with its natural associative bacterium Phyllobacterium myrsinacearum and
with the plant growth-promoting bacterium Azospirillum brasilense. Can. J. Microbiol., 2001, 47: 1-8.
R o j a s A., H o l g u i n G., G l i c k B.R. e.a. Synergism between Phyllobacterium sp. (N2-fixer) and Bacillus
licheniformis (P-solubilizer), both from a semiarid mangrove rhizosphere. FEMS Microbiol. Ecol., 2001, 35: 181-187.
S i m o n s M., B i j V.D., B r a n d I. e.a Gnotobiotic system for studying rhizosphere colonization by
plant growth-promoting Pseudomonas bacteria. MPMI, 1996, 9: 600-607.
C o r r e a O.S., R o m e r o A.M., M o n t e c c h i a M.S. e.a Tomato genotype and Azospirillum inoculation
modulate the changes in bacterial communities associated with roots and leaves. J. Appl. Microbiol., 2007, 102: 781-786.
L o p e z - R e y e s L., S o t o - U r z u a L., M a s c a r u a - E s p a r z a M.A. e.a Antibiotic
resistance and ?-lactamase activity in Azospirillum. Soil Biol. Biochem., 1989, 21: 651-655.
K u l i n s k a D., D r o z d o w i c z A. Occurrence of microorganisms antagonistic to Azospirillum spp.
Zentralblatt Мexa Mikrobiologie, 1983, 138: 585-594.
Б е л и м о в А.А., И в а н ч и к о в А.Ю., В о р о б ь е в Н.И. Роль доминирующей микрофлоры ризопланы
ячменя во взаимодействии интродуцируемых диазотрофов с растением. Микробиология, 1998, 67(3): 409-415.
F a l l i k E., O k o n Y. Growth response of maise roots to Azospirillum inoculation: effect of soil organic
matter content, number of rhizosphere bacteria and timing of inoculation. Soil Biol. Biochem., 1988, 20: 45-49.
1Всероссийский
НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: ai-shaposhnikov@mail.ru, belimov@rambler.ru, kravchenko@LK5659.spb.edu;
2Colorado
State University,
Fort Collins, CO 80523-1173, USA
e-mail: j.vivanco@colostate.edu
INTERACTION OF RHIZOSPHERE BACTERIA WITH PLANTS: MECHANISMS
OF FORMATION AND FACTORS OF EFFICIENCY IN ASSOCIATIVE SYMBIOSIS
(review)
A.I. Shaposhnikov1, A.A. Belimov1, L.V. Kravchenko1, J.M. Vivanco2
Summary
The mechanisms of positive influence of rhizospere bacteria on plans are discussed. Colonization of
rhizospere by the introduced strains is regarded as а necessary condition for formation of plant-bacterial association
and the key strategy for selection of effective rhizobactrtial strains. The role of some biotic factors, i.e. mixed rhizobzterial
cultures and the interactions of introducents with indigenous microflora, in the fuctioning of associative symbiosis
and plant response to inoculation with rhizobzcteria is examined.
22
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631.46:579.64:581.557:577.15
АЦК ДЕАМИНАЗА И РАСТИТЕЛЬНО-МИКРОБНЫЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ*
(обзор)
А.А. БЕЛИМОВ, В.И. САФРОНОВА
Приведены результаты изучения симбиотрофных бактерий, содержащих фермент 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазу, благодаря которому бактерии снижают образование фитогормона этилена и стимулируют рост растений. Обсуждаются механизмы действия АЦК-утилизирующих бактерий на растения, биоразнообразие АЦК-утилизирующих бактерий, а также характеристика фермента и генов АЦК деаминазы. Особое внимание уделено роли рассматриваемого растительно-микробного взаимодействия в устойчивости растений к абиотическим стрессам и образовании бобово-ризобиального симбиоза.
Ключевые слова: бактерии, биопрепараты, инокуляция, клубенькообразование, ризосфера, симбиоз,
стимуляция роста, стресс, фитогормоны, этилен.
Keywords: bacteria, biopreparations, inoculations, nodulation, rhizosphere, symbiosis, growth promotion,
stress, phytohormones, ethylene.
Продукция фитогормонов, витаминов и других биологически активных веществ —
один из важнейших механизмов воздействия ассоциативных бактерий на растения (1). Значительное внимание уделяется роли бактериальных ауксинов в стимуляции роста и питания
растений, накоплены данные о продукции бактериями цитокининов и гиббереллинов. Однако исследования изменений гормонального статуса растений под действием ростстимулирующих бактерий и их способности деградировать фитогормоны малочисленны (2).
Важным вкладом в изучение модуляции гормонального статуса растений при симбиозе с бактериями стало раскрытие механизма регуляции роста макросимбионта с участием бактериального фермента 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазы. У растений аминокислота АЦК окисляется АЦК оксидазой до этилена с образованием углекислого газа, циановой кислоты и воды, то есть служит непосредственным предшественником при биосинтезе фитогормона этилена. Этилен вовлечен во многие звенья процессов
роста и развития растений, включая прорастание семян, инициацию и удлинение тканей и
органов, цветение, созревание плодов, старение тканей и реакции на стрессовые факторы
(3). Активизация биосинтеза АЦК и этилена — неспецифическая реакция растений на
различные стрессы, в которых последний действует как негативный регулятор ростовых
процессов. Однако ингибирование роста растения этиленом часто происходит и в отсутствие стресса, например при аккумуляции этилена в зоне корня из-за замедленной диффузии, повышении его содержания в почве за счет микробного биосинтеза или высокой чувствительности к этилену некоторых видов растений.
Механизм действия АЦК-утилизирующих бактерий
н а р а с т е н и я. Способность ризосферных бактерий стимулировать рост корней благодаря наличию АЦК деаминазы впервые описали с использованием проростков рапса
и штамма Ps. putida GR12-2 (4). Доказательством служило отсутствие эффекта у дефектных
по этому ферменту мутантов (4, 5) и его восстановление при обработке аминоэтоксивинилглицином — химическим ингибитором растительной АЦК синтазы (6). В результате
была предложена модель этого растительно-бактериального взаимодействия (7) (рис. 1).
Известно, что аминокислота АЦК входит в состав корневых экссудатов и растение поддерживает ее баланс внутри и вне тканей (в ризосфере ее количество может достигать нескольких микромолей) (8). Симбиотрофные бактерии используют АЦК как источник азотного и углеродного питания. Для поддержания равновесия концентраций растение увеличивает отток АЦК из корней в ризосферу, что приводит к снижению интенсивности биосинтеза этилена в корнях и его ингибирующего действия на растение.
Фитогормон индолилуксусную кислоту (ИУК), усиливающую рост растения,
продуцируют многие АЦК-утилизирующие бактерии. Сообщается, что ИУК стимулирует
АЦК синтазу (9), но ингибирует АЦК оксидазу (10). Поэтому под действием бактериальной
ИУК растение синтезирует больше АЦК, используемой бактериями, которые таким образом обеспечивают себя уникальным источником питания в ризосфере и, возможно, повышают конкурентоспособность. Мутант Ps. putida GR12-2, не выделяющий ИУК, стимулировал рост корней рапса слабее, чем дикий тип (11), а суперпродуцент ИУК ингибировал рост (вероятно, за счет активации АЦК синтазы и усиления биосинтеза этилена) (12).
Анализ кинетики транспорта АЦК в ризосферу и конкуренции за субстрат между
бактериальной АЦК деаминазой и растительной АЦК оксидазой показал, что АЦК интенсивно потребляется бактериями при относительно высокой скорости переноса АЦК из
корня в ризосферу и быстрой индукции АЦК деаминазы у бактерий (1). Снижение коли*
Работа поддержана грантами РФФИ (06-04-49486-a и 09-04-01614-а) и Минобрнауки РФ (ГК № 16.512.11.2162).
23
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
чества АЦК в корнях регистрировали при инокуляции рапса штаммами Ps. putida GR12-2
и Enterobacter aerogenes CAL3, Ps. putida ATCC17399 со встроенным геном АЦК деаминазы
(11), Methylobacterium fujisawaense CBMB20 и CBMB110 (13), а также при инокуляции гороха штаммом V. paradoxus 5C-2 (14). Снижение продукции этилена у растений показано на
рапсе при инокуляции Serracia quinivorans SUD165 (15), Achromobacter
xylosoxidans Cm4 и Pseudomonas sp.
Dp2 (16), M. fujisawaense CBMB20 и
CBMB110 (13), а также на томатах,
инокулированных Ps. putida UW4,
Pseudomonas sp. CAL2 (17) и Achromobacter piechaudii ARV8 (18, 19). Недавно обнаружено, что при инокуляции
активность АЦК синтазы в корнях
повышается (видимо, благодаря эффекту бактериальной ИУК), а АЦК
оксидазы — снижается (вероятно, изза уменьшения концентрации субстрата) (13). Обработка ИУК ингиРис. 1. Схема взаимодействия растения с бактериями, содержащибировала АЦК оксидазу (10). При
ми 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминазу: ИУК —
изучении метаболизма АЦК у бактеиндолилуксусная кислота; ?-КВ — ?-кетобутират (цит. по
рий и участия АЦК в растительно7, изменения разрешены авторами).
бактериальном взаимодействии мы
установили способность V. paradoxus утилизировать не только аммоний, образующийся
из АЦК, но и ?-кетобутират как единственный источник С (20).
Роль АЦК деаминазы в стимуляции роста растений убедительно подтвердилась
при переносе гена АЦК деаминазы Ps. putida UW4 в лишенные этого фермента штаммы.
Трансформант штамма Ps. fluorescens CHA0 приобретал способность удлинять корни
проростков у рапса (21), а трансформант штамма Ps. asplenii AC в большей степени стимулировал прорастание семян у тростника (22). Инокуляция томатов трансформантом
Ps. putida ATCC17399 снижала продукцию этилена и улучшала рост растений (17), а экспрессия АЦК деаминазы в азотфиксаторе Azospirillum brasilense Cd повышала его стимулирующую активность в 2 раза (23).
Показано (24), что Ps. putida UW4, но не его мутант по АЦК деаминазе, усиливал
экспрессию генов некоторых позитивно-регуляторных белков, участвующих в растяжении и
делении клеток и индукции защитных реакций у растений рапса. Мы также установили,
что у фитопатогена Ps. brassicacearum Am3 АЦК деаминаза маскирует токсический эффект
бактерии, снижая биосинтез этилена (как известно, ключевой сигнальной молекулы в индукции системной устойчивости к фитопатогенам) (25). Интересно, что многие АЦКутилизирующие бактерии относятся к роду Pseudomonas, представители которого — типичные индукторы системной устойчивости у растений. Однако роль АЦК деаминазы в фитопатогенезе и вопрос о локальном (на корни) или системном действии бактерий на статус
АЦК и этилена в растении нуждаются в более детальном изучении (14).
Р а с п р о с т р а н е н и е А Ц К д е а м и н а з ы у м и к р о о р г а н и з м о в.
Впервые АЦК деаминазу выявили и изучили у Pseudomonas sp. ACP и дрожжей Hansenula
saturnus, которые расщепляли АЦК до аммония и ?-кетобутирата (26). Для выделения АЦКутилизирующих бактерий используют селективные среды с АЦК (20). Ген АЦК деаминазы
(acdS) эффективно обнаруживается с помощью ПЦР (27, 28), в частности он найден у некоторых представителей рода Azospirillum (28). Способность использовать АЦК как единственный источник азота показана у 60 из 87 штаммов биоконтрольных псевдомонад (21) и у
81 из 103 ризосферных штаммов коллекции ARC Infruitec (ЮАР) (29).
При выделении новых штаммов ассоциативных бактерий у них часто определяют
АЦК-деаминазную активность наряду с другими полезными для растений свойствами. Доля
ризосферных изолятов с АЦК-деаминазной активностью составила для дикой горчицы
25 % (30), для смеси различных злаков 45 % (3), для сои — 32 % (32), для ладанника — 7 %
(33), для китайской капусты — 50 % (34), для гороха — 28 % (35), для горчицы сарептской — 26 % (20). Эти результаты убедительно показывают, что АЦК-деаминазной активностью обладают многие ассоциативные бактерии, и их число быстро растет. Основная
часть идентифицированных в настоящее время штаммов с АЦК деаминазой (всего 111,
отнесены к 36 родам из различных таксономических групп) приведена в работе А.А. Белимова (36). Наибольшее видовое разнообразие наблюдалось у родов Pseudomonas, Burkholderia и Bacillus (соответственно 14, 8 и 6 видов). АЦК-утилизирующие бактерии были
обнаружены в почве и в ризосфере, филлосфере и эндосфере многих растений из разных регионов планеты. Эти бактерии могут относиться как к сапрофитным микроорганизмам, так и к патогенам растений, животных и человека. Возможен горизонтальный
транспорт acdS генов в природных условиях (27). На это косвенно указывает частая локализация гена на плазмидах (28) и его обнаружение у все новых штаммов и видов.
24
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Х а р а к т е р и с т и к а ф е р м е н т а и г е н о в А Ц К д е а м и н а з ы. Фермент
был впервые выделен и охарактеризован у штамма Pseudomonas sp. ACP (26), затем у
Pseudomonas sp. 6G5 (37), Ps. putida GR12-2 (38) и Ps. putida UW4 (24). Биохимические
характеристики и структура фермента и генов, а также механизм деаминирования АЦК детально изучены (39). Установлено, что АЦК деаминаза относится к обширной группе ферментов, которые нуждаются в пиридоксаль-5-фосфате (ПЛФ, одна из форм витамина В6) в
качестве кофактора. По пространственной структуре АЦК деаминаза принадлежит к типу
триптофансинтаз (TRPSb)
и представляет собой тример с молекулярной массой 105-112 кДа.
Предполагаемый
механизм реакции заключается в деаминировании
АЦК с разрывом циклоРис. 2. Схема деаминирования 1-аминоциклопропан-1-карбоксилата (АЦК)
пропанового кольца между
АЦК деаминазой: контурной стрелкой показано место разрыва циклопро?- и про-S-атомами С с
панового кольца (цит. по 7, изменения разрешены авторами).
образованием аммония и
сохранением карбоксильной группы на С-остатке (?-кетобутират) (рис. 2). Кроме АЦК,
субстратами для АЦК деаминазы служит аланин, норлейцин, серин, винил-АЦК, ацетил-D-серин, производные аминомасляной кислоты, а также 1-амино-2-метиленциклопропан-1-карбоновая кислота. Пик активности АЦК деаминазы наблюдается при рН 8,08,5 и 30 °С. При оптимальных условиях величина Km не превышает 1,5 ммоль АЦК, что
указывает на относительно низкое сродство фермента к этому субстрату. Ферментативная
активность зарегистрирована только в цитоплазме клеток.
Ген АЦК-деаминазы впервые клонировали у штамма Pseudomonas sp. ACP (40),
затем у ряда других бактерий. Нуклеотидные последовательности этих генов (1014 п.н.)
имели значительное сходство (85-95 %) и кодировали белок с молекулярной массой около
36,8 кДа. Известны последовательности acdS генов более чем у 50 штаммов из различных
таксономических групп (36, 28).
Антистрессовый эффект АЦК-утилизирующих бактерий
н а р а с т е н и я. Снижая биосинтез фитогормона этилена, АЦК-утилизирующие бактерии могут обладать универсальным антистрессовым эффектом на растения. Имеются сообщения о защитном действии таких бактерий при дефиците или избытке почвенной
влаги. Инокуляция штаммом Achromobacter piechaudii ARV8 существенно стимулировала
рост у перца и томатов и снижала содержание этилена, который интенсивно вырабатывался в растительных тканях в ответ на действие засухи (18). При возобновлении полива
рост у инокулированных растений восстанавливался быстрее, чем в контроле. Выращенные в условиях дефицита влаги растения гороха при инокуляции V. paradoxus 5C-2 превосходили контрольные по длине и массе корней, числу азотфиксирующих клубеньков,
массе семян и накоплению азота (14). Бактерии подавляли повышение концентрации
АЦК, но увеличивали концентрацию абсцизовой кислоты в ксилемном соке подверженных засухе растений, что указывало на системное действие V. paradoxus 5C-2 и регуляцию
транспорта сигнальных молекул из корня в побег (14). При этом растения формировали
дополнительные побеги, затеняющие почву вокруг растений и снижающие потерю почвенной влаги при испарении. В описанных экспериментах, а также на картофеле (41) и
томатах (36) бактерии повышали эффективность использования воды растениями, рассчитанную как отношение фитомассы к количеству транспирированной воды. В то же
время мутант V. paradoxus 5С-2M4 с низкой АЦК деаминазной активностью не повлиял
на рост, физиологию и водный статус растений (14). Было также установлено, что бактерии стимулируют удлинение корневых волосков (36), улучшающих водное питание.
Важно отметить, что АЦК-утилизирующие бактерии повышают адаптацию растений не
только к засухе, но и к переувлажнению: такой эффект был описан при инокуляции рапса штаммом Ps. putida UW4 (17).
При осмотическом стрессе на фоне высоких концентраций NaCl снижение биосинтеза этилена под действием A. piechaudii ARV8 сопровождалось повышением эффективности использования растениями воды, К и Р (19). Рост устойчивости к соли обнаружен у рапса при инокуляции Ps. putida UW4, но не его дефектным по АЦК деаминазе мутантом (42). При испытании флуоресцирующих псевдомонад в полевых условиях на засоленной почве повышение урожая арахиса получили только при инокуляции АЦК-утилизируюшими штаммами (43).
Знания о взаимодействии таких бактерий с растениями в зависимости от температуры среды фрагментарны. Показана способность Ps. putida GR12-2, но не дефектного
по АЦК деаминазе мутанта, повышать экспрессию генов теплового шока (24) и стимулировать рост растений при пониженных температурах (5).
Представляется перспективным применение содержащих АЦК деаминазу бактерий для снижения токсического эффекта тяжелых металлов (ТМ) и фиторемедиации загрязненных почв (5, 44, 45). Так, инокуляция штаммом Serratia quinivorans SUD165 уменьшала
25
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
токсичность Ni и образование стрессового этилена у рапса (15). Похожие результаты получены с устойчивым к Ni штаммом Ps. putida HS-2 (46). Стимуляцию роста и накопления
ТМ наблюдали при инокуляции томатов штаммами Methylobacterium orysae CBMB20 и
Burkholderia sp. CBMB40 (47), а также кукурузы и томатов штаммом Burkholderia sp. J62
(48), что хорошо согласуется с нашими данными по инокуляции рапса (35), гороха (49) и
некоторых пастбищных бобовых растений (50) АЦК-утилизирующими бактериями из различных таксономических групп. Как правило, на содержание ТМ в растениях бактерии существенно не влияли, но улучшали потребление элементов минерального питания, нарушенное ТМ. Однако эти эффекты могут быть связаны не с АЦК-деаминазной активностью, а с другими свойствами микроорганизмов (49).
Р о л ь А Ц К д е а м и н а з ы в о б р а з о в а н и и б о б о в о - р и з о б иа л ь н о г о с и м б и о з а. Поскольку повышение содержания этилена препятствует
образованию азотфиксирующего симбиоза бобовых с ризобиями (51), важное значение
имеет обнаружение АЦК деаминазы у клубеньковых бактерий Mesorhizobium loti (52),
Rhizobium sp. и Sinorhizobium sp. (53), а также R. leguminosarum bv. viciae и R. hedysari (54).
Методом ПЦР ген acdS был обнаружен у 35 из 49 штаммов R. leguminosarum bv. viciae,
S. meliloti и Mesorhizobium sp. из Всероссийской коллекции сельскохозяйственных микроорганизмов (г. Санкт-Петербург) (55). Более детальные исследования выявили у дефектных по АЦК деаминазе мутантов R. leguminosarum bv. viciae снижение способности образовывать клубеньки (56). Трансформация S. meliloti геном acdS ее повышала (57). Аналогичные результаты получены с дефектным по АЦК деаминазе мутантом M. loti MAFF303099
(58). Позднее эти наблюдения подтвердил перенос дополнительного acdS гена из Rhizobium sp. в АЦК-утилизирующий штамм Sinorhizobium sp., у которого при этом усилилось
клубенькообразование (53). О регуляции клубеньковыми бактериями содержания этилена
при инфицировании корней свидетельствуют также продукция ризобиотоксина (аналог
химического ингибитора АЦК синтазы аминоэтоксивинилглицина) штаммами Bradyrhizobium elkanii и их повышенная способность формировать клубеньки (59). Поэтому продукция ризобиотоксина и АЦК деаминазная активность у ризобий рассматриваются как элементы стратегии эффективной колонизации растения-хозяина (60). Экспрессия acdS гена
у M. loti MAFF303099 происходила только в зрелых клубеньках при участии регуляторного
гена азотфиксации nifA2, указывая на важную роль этого фермента не только в образовании, но и в функционировании клубенька (61).
Роль ассоциативных АЦК-утилизирующих бактерий в образовании бобово-ризобиального симбиоза изучена недостаточно, хотя неоднократно наблюдалось повышение эффективности клубенькообразования при совместной инокуляции ризобиями и ассоциативными бактериями, способность утилизировать АЦК у которых не изучалась. Впервые стимуляция клубенькообразования такими бактериями была описана в опытах с соей, однако
роль АЦК деаминазы осталась неизвестной из-за отсутствия эффекта у некоторых штаммов
(62). Затем появилось сообщение об увеличении числа клубеньков у арахиса при инокуляции АЦК-утилизирующими псевдомонадами (63), однако эффект, вероятно, был связан с
продуцированием ИУК и сидерофоров, мобилизацией фосфатов и антагонизмом к фитопатогенным грибам. Существенное повышение числа клубеньков, улучшение роста и питания
растений вызывала инокуляция мунго штаммами Ps. putida и Ps. fluorescens (64), а также пастбищных бобовых (Lotus edulis, L. ornithopodioides) штаммом V. paradoxus 5C-2 (50).
Таким образом, 1-аминоциклопропан-1-карбоксилат (АЦК) деаминаза широко
распространена у симбиотрофных бактерий. АЦК-утилизирующие бактерии снижают ингибирование роста растений этиленом, синтезируемым при абиотических и биотических
стрессах, часто присутствуют на корнях растений и могут быть важным элементом растительно-микробных систем, особенно в условиях стрессов. Поэтому их следует считать
перспективным компонентом нового типа бактериальных биопрепаратов со специфическим антистрессовым эффектом.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
26
F r a n k e n b e r g e r W.T., A r s h a d M. Phytohormones in soils: production and function. Marcel
Dekker, Inc. N.Y., 1995.
D o d d I.C., Z i n o v k i n a N.Y., S a f r o n o v a V.I. e.a. Rhizobacterial mediation of plant hormone
status. Ann. Appl. Biol., 2010, 157: 361-379.
A b e l e s F.B., M o r g a n P.W., S a l t v e i t M.E. Ethylene in plant biology. Academic Press. N.Y., 1992.
G l i c k B.R., J a c o b s o n C.B., S c h w a r z e M.M.K. e.a. 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid
deaminase mutants of the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2 do not stimulate canola root elongation. Canadian J. Microbiol., 1994, 40: 911-915.
G l i c k B.R., L i u C., G h o s h S. e.a.. Early development of canola seedlings in the presence of the
plant growth-promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2. Soil Biology and Biochemistry, 1997,
29: 1233-1239.
H a l l J.A., P e i r s o n D., G h o s h S. e.a. Root elongation in various agronomic crops by the plant
growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2. Isr. J. Plant Sci., 1996, 44, 37-42.
G l i c k B.R., P e n r o s e D.M., L i J. A model for the lowering of plant ethylene concentrations by plant
growth-promoting bacteria. J. Theor. Biol., 1998, 190: 63-68.
P e n r o s e D.M., G l i c k B.R. Levels of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) in exudates and
extracts of canola seeds treated with plant growth-promoting bacteria. Canadian J. Microbiol., 2001, 47: 368-372.
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
K e n d e H. Ethylene biosynthesis. Annu. Rev. Plant Physiol., 1993, 44: 283-307.
M a d h a i y a n M., P o o n g u z h a l i S., S a T. Characterization of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate
(ACC) deaminase containing Methylobacterium orysae and interactions with auxins and ACC regulation of ethylene
in canola (Brassica campestris). Planta, 2007, 226: 867-876.
P a t t e n C.L., G l i c k B.R. Role of Pseudomonas putida indoleacetic acid in development of the host
plant root system. Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68: 3795-3801.
X i e H., P a s t e r n a k J.J., G l i c k B.R. Isolation and characterization of mutants of the plant
growth promoting rhizobacterium Pseudomonas putida GR12-2 that overproduce indoleacetic acid. Curr. Microbiol., 1996, 32: 67-71.
M a d h a i y a n M., P o o n g u z h a l i S., R y u J. e.a. Regulation of ethylene levels in canola (Brassica campestris) by 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase-containing Methylobacterium fujisawaense.
Planta, 2006, 224: 268-278.
B e l i m o v A.A., D o d d I.C., H o n t z e a s N. e.a. Rhizosphere bacteria containing ACC deaminase
increase yield of plants grown in drying soil via both local and systemic hormone signalling. New Phytologist,
2009, 181: 413-423.
B u r d G.I., D i x o n D.G., G l i c k B.R. A plant growth promoting bacterium that decreases nickel toxicity in plant seedlings. Appl. Environ. Microbiol., 1998, 64: 3663-3668.
B e l i m o v A.A., S a f r o n o v a V.I., M i m u r a T. Response of spring rape to inoculation with plant
growth-promoting rhizobacteria containing 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase depends on nutrient status of the plant. Canadian J. Microbiol., 2002, 48: 189-199.
G r i c h k o V.P., G l i c k B.R. Amelioration of flooding stress by ACC deaminase-containing plant
growth-promoting bacteria. Plant Physiol. Biochem., 2001, 39: 11-17.
M a y a k S., T i r o s h T., G l i c k B.R. Plant growth-promotion bacteria that confer resistance to water stress in tomatoes and peppers. Plant Sci., 2004, 166: 525-530.
M a y a k S., T i r o s h T., G l i c k B.R. Plant growth-promoting bacteria that confer resistance in tomato to salt stress. Plant Physiol. Biochem., 2004, 42: 565-572.
B e l i m o v A.A., H o n t z e a s N., S a f r o n o v a V.I. e.a. Cadmium-tolerant plant growthpromoting bacteria associated with the roots of Indian mustard (Brassica juncea L. Czern.). Soil Biol. Biochem., 2005, 37: 241-250.
W a n g C., R a m e t t e A., P u n j a s a m a r n w o n g P. e.a. Cosmopolitan distribution of phlDcontaining dicotyledonous crop-associated biocontrol pseudomonads of worldwide origin. FEMS Microbiol.
Ecol., 2001, 37: 105-116.
R e e d M.L., W a r n e r B.G., G l i c k B.R. Plant growth-promoting bacteria facilitate the growth of
the common reed Phragmites australis in the presence of copper or polycyclic aromatic hydrocarbons. Curr.
Microbiol., 2005, 51: 425-429.
H o l g u i n G., G l i c k B.R. Transformation of Azospirillum brasilense Cd with an ACC deaminase gene
from Enterobacter cloacae UW4 fused to the Tetr gene promoter improves its fitness and plant growth promoting ability. Microbial Ecology, 2003, 4: 122-133.
H o n t z e a s N., S a l e h S.S., G l i c k B.R. Changes in gene expression in canola roots induced by
ACC-deaminase-containing plant-growth-promoting bacteria. MPMI, 2004, 17: 865-871.
B e l i m o v A.A., D o d d I.C., S a f r o n o v a V.I. e.a. Pseudomonas brassicacearum strain Am3 containing 1aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase can show both pathogenic and growth-promoting properties in
its interaction with tomato. J. Exp. Bot., 2007, 58: 1485-1495.
H o n m a M., S h i m o m u r a T. Metabolism of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid. Agric. Biol.
Chem., 1978, 42: 1825-1831.
H o n t z e a s N., R i c h a r d s o n A.O., B e l i m o v A.A. e.a. Evidence for horizontal transfer of 1aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase genes. Appl. Environ. Microbiol., 2005, 71: 7556-7558.
B l a h a D., P r i g e n t - C o m b a r e t C., M i z r a M.S. e.a. Phylogeny of the 1-aminocyclopropane-1carboxylic acid deaminase-encoding gene acdS in phytobeneficial and pathogenic Proteobacteria and relation
with strain biogeography. FEMS Microbiol. Ecol., 2006, 56: 455-470.
C a m p b e l l B.G., T h o m s o n J.A. 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase genes from Pseudomonas strains. FEMS Microbiol. Lett., 1996, 138: 207-210.
I d r i s M., M e m o n G.H., V i n t h e r F.P. Occurrence of Azospirillum and Azotobacter and potential
nitrogenase activity in danish agricultural soil under continuous barley cultivation. Acta Agrigulturae Scandinavica, 1981, 31: 433-437.
D e l l’ A m i c o E., C a v a l c a L., A n d r e o n i V. Analysis on rhizobacterial communities in perennial
Graminaceae from polluted water meadow soil, and screening of metal-resistant, potentially plant growthpromoting bacteia. FEMS Microbiol. Ecol., 2005, 52: 153-162.
M i n a m i R., U c h i y a m a K., M u r a k a m i T. e.a. Properties, sequence, and synthesis in Escherichia coli of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase from Hansenula saturnus. J. Biochem., 1998,
123: 1112-1118.
S o l a n o R.B., P e r e y r a d e l a I g l e s i a M.T., P r o b a n z a A. e.a. Sceeneng for PGPR to
improve growth of Cistus ladanifer seedlings for reforestation of degraded Mediterranean ecosystems. Plant
and Soil, 2006, 287: 59-68.
P o o n g u z h a l i S., M a d h a i y a n M., S a T. Cultivation-dependent characterization of rhizobacterial
communities from field grown Chinese cabbage Brassica campestris ssp pekinensis and screening of traits for
potential plant growth promotion. Plant and Soil, 2006, 286: 167-180.
B e l i m o v A.A., S a f r o n o v a V.I., S e r g e y e v a T.A. e.a. Characterisation of plant growthpromoting rhizobacteria isolated from polluted soils and containing 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase. Canadian J. Microbiol., 2001, 47: 642-652.
Б е л и м о в А.А. Взаимодействие ассоциативных бактерий и растений в зависимости от биотических и
абиотических факторов. Автореф. докт. дис. СПб, 2008.
K l e e H.J., H a y f o r d M.B., K r e t z m e r K.A. e.a. Control of ethylene synthesis by expression of a
bacterial enzyme in transgenic tomato plants. Plant Cell, 1991, 3: 1187-1193.
J a c o b s o n C.B., P a s t e r n a k J.J., G l i c k B.R. Partial purification and characterization of 1aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase from the plant growth promoting rhizobacterium Pseudomonas
putida GR12-2. Canadian J. Microbiol., 1994, 40: 1019-1025.
H o n t z e a s N., H o n t z e a s C.E., G l i c k B.R. Reaction mechanisms of the bacterial enzyme 1aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase. Biotechnol. Adv., 2006, 24: 420-426.
S h e e h y R.E., H o n m a M., Y a m a d a M. e.a. Isolation, sequence, and expression in Escherichia
coli of the Pseudomonas sp. strain ACP gene encoding 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase. J. Bacteriol., 1991, 173: 5260-5265.
B e l i m o v A.A., D o d d I.C., S a f r o n o v a V.I. e.a. ACC deaminase-containing rhizobacteria im-
27
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
prove vegetative development and yield of potato plants grown under water-limited conditions. Aspect Appl.
Biol., 2009, 98: 163-169.
C h e n g Z., P a r k E., G l i c k B.R. 1-Aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase from Pseudomonas
putida UW4 facilitates the growth of canola in the presence of salt. Canadian J. Microbiol., 2007, 53: 912-918.
S a r a v a n a k u m a r D., S a m i y a p p a n R. ACC deaminase from Pseudomonas fluorescens mediated saline in groundnut (Arachis hypogea) plants. J. Appl. Microbiol., 2007, 102: 1283-1292.
G l i c k B.R. Using soil bacteria for phytoremediation. Biotechnol. Adv., 2010, 28: 367-374.
A r s h a d M., H u s s a i n A., J a v e d M. e.a. Effect of soil applied L-methionine on growth, nodulation and chemical composition of Albizia lebbeck L. Plant and Soil, 1993, 148: 129-135.
F a r w e l l A.J., V e s e l y S., N e r o V. e.a. The use of transgenic canola (Brassica napus) and plant
growth-promoting bacteria to enhance plant biomass at a nickel-contaminated field site. Plant and Soil,
2006, 288: 309-318.
M a d h a i y a n M., P o o n g u z h a l i S., S a T. Metal tolerating methylotrophic bacteria reduces
nickel and cadmium toxicity and promotes plant growth of tomato (Lycopersicon esculentum L.). Chemosphere, 2007, 69: 220-228.
J i a n g C., S h e n g X., Q i a n M. e.a. Burkholderia sp. from heavy metal-contaminated paddy field
soil and its potential in promoting plant growth and heavy metal accumulation in metal-polluted soil.
Chemosphere, 2008, 2: 157-164.
S a f r o n o v a V.I., S t e p a n o k V.V., E n g q v i s t G.L. e.a. Root-associated bacteria containing 1aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase improve growth and nutrient uptake by pea genotypes cultivated
in cadmium supplemented soil. Biol. Fertil. Soils, 2006, 42: 267-272.
B u l l i t t a S., S a f r o n o v a V., P i l u z z a G. e.a. Characterization of plant-microbe associations from a heavy metal polluted area in SW Sardinia in view of their use in phytoremediation. Abstr. Int.
Conf. «Phytotechnologies in the 21st century: Remediation—Energy—Health—Sustainability». Parma, Italy,
2010: 147.
G u i n e l F.C., G e i l R.D. A model for the development of the rhizobial and arbuscular mycorrhizal
symbioses in legumes and its use to understand the roles of ethylene in the establishment of these two symbioses. Canadian J. Bot., 2002, 80: 695-720.
K a n e k o T., N a k a m u r a Y., S a t o S. e.a. Complete genome structure of the nitrogen-fixing symbiotic bacterium Mesorhizobium loti. DNA Research, 2000, 7: 331-338.
T i t t a b u t r P., A w a y a J.D., L i Q.X. e.a. The cloned 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC)
deamnase gene from Sinorhizobium sp. strain BL3 in Rhizobium sp. strain TAL1145 promotes nodulation and
growth of Leucaena leucocephala. Syst. Appl. Microbiol., 2008, 31: 141-150.
M a W., S e b e s t i a n o v a S.B., S e b e s t i a n J. e.a. Prevalence of 1-aminocyclopropane-1carboxylate deaminase in Rhizobium spp. Anthony van Leeuwenhoek, 2003, 83: 285-291.
Z i n o v k i n a N.Y., S a f r o n o v a V.I., C h i z h e v s k a y a E.P. e.a. Occurrence of 1aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase genes (acdS) in symbiotic nodule bacteria. Abstr. Int. Symp.
«Adaptation to climate change in the Baltic Sea region: Contribution from plant and microbial biotechnology». Mikkeli, Finland, 2010: 52.
M a W., G u i n e l F.C., G l i c k B.R. Rhizobium leguminosarum biovar viciae 1-aminocyclo-propane-1carboxylate deaminase promotes nodulation of pea plants. Appl. Environ. Microbiol., 2003, 69: 4396-4402.
M a W., C h a r l e s T.C., G l i c k B.R. Expression of an exogenous 1-aminocyclopropane-1carboxylate deaminase gene in Sinorhizobium meliloti increases its ability to nodulate alfalfa. Appl. Environ.
Microbiol., 2004, 70: 5891-5897.
U c h i u m i T., O h w a d a T., I t a k u r a M. e.a. Expression islands clustered on the symbiosis island
of the Mesorhizobium loti genome. J. Bacteriol., 2004, 186: 2439-2448.
Y h a s h i K.I., I c h i k a w a N., E z u r a H. e.a. Rhizobitoxin production by Bradyrhizobium elkanii
enhances nodulation and competitiveness on Macroptilium artropurpureum. Appl. Environ. Microbiol., 2000,
66: 2658-2663.
O k a z a k i S., N u k u i N., S u g a w a r a M. e.a. Rhizobial strategies to enhance symbiotic interactions: rhizobiotoxine and 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase. Microbes and Environment, 2004,
19: 99-111.
N u k u i N., M i n a m i s a w a K., A y a b e S.I. e.a. Expression of the 1-aminocyclopropane-1carboxylic acid deaminase gene requires symbiotic nitrogen-fixing regulator gene nifA2 in Mesorhizobium loti
MAFF303099. Appl. Environ. Microbiol., 2006, 72: 4964-4969.
C a t t e l a n A.J., H a r t e l P.G., F u h r m a n n J.J. Screening for plant growth-promoting rhizobacteria to promote early soybean growth. Soil Science Society of America Journal, 1999, 63: 1670-1680.
D e y R., P a l K.K., B h a t t D.M., C h a u h a n S.M. Growth promotion and yield enhancement of
peanut (Arachis hypogaea L.) by application of plant growth-promoting rhizobacteria. Microbiol. Res., 2004,
159: 371-394.
S h a h a r o o n a B., A r s h a d M., Z a h i r Z.A. Effect of plant growth promoting rhizobacteria containing ACC-deaminase on maize (Zea mays L.) grown under axenic conditions and on nodulation in mung
bean (Vigna radiata L.). Lett. Appl. Microbiol., 2006, 42: 155-159.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: belimov@rambler.ru
ACC DEAMINASE AND PLANT—BACTERIA INTERACTIONS
(review)
A.A. Belimov, V.I. Safronova
Summary
The review presents results related to the study of symbiotrophic bacteria, containing enzyme 1aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase, through which the bacteria reduce the formation of phytohormone ethylene and stimulate growth of plants. Mechanisms of the effects of ACC-utilizing bacteria on plants,
biodiversity of ACC-utilizing bacteria and characteristics of the enzyme and ACC deaminase genes are discussed.
Particular attention is paid to the role of such plant-microbe interaction in plant tolerance to abiotic stresses and
formation of legume-Rhizobium symbiosis.
28
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631.46:581.557:575:576.6.71
РАСТИТЕЛЬНО-МИКРОБНЫЕ СИМБИОЗЫ КАК ЭВОЛЮЦИОННО
ЦЕЛОСТНЫЕ СИСТЕМЫ?
Н.А. ПРОВОРОВ, Н.И. ВОРОБЬЕВ
Структурно-функциональная целостность растительно-микробных симбиозов относится к их фундаментальным свойствам, проявляясь на организменном, клеточном, молекулярно-генетическом и популяционном
уровнях. С использованием математической модели эта целостность представлена как степень согласованности
адаптивных реакций (варьирования генотипических частот) партнеров на изменения внешних условий. Индекс целостности симбиоза, определяемый на основе анализа ковариации адаптивных реакций партнеров, коррелирует
с их репродуктивной активностью, отражающей экологическую эффективность симбиоза. Компьютерные эксперименты показали, что эффективность и целостность симбиоза координировано повышаются под действием отбора.
Предложенная модель может быть использована для определения генетической структуры симбиозов, обеспечивающей высокую продуктивность растений.
Ключевые слова: микробно-растительные взаимодействия, эволюция симбиоза, математическое моделирование, симбиотическая азотфиксация, клубеньковые бактерии, экологически устойчивое растениеводство, структуры симбиозов, обеспечивающие высокую продуктивность растений.
Keywords: microbe-plant interactions, evolution of symbiosis, mathematical simulation, symbiotic N2 fixation, nodule bacteria, ecologically sustainable agriculture, structures of symbioses ensuring high plant productivity.
Растительно-микробные симбиозы (РМС) ? удобные модели для разработки
фундаментальных аспектов симбиологии и симбиогенетики, так как растения вступают
в разнообразные симбиотические отношения с микроорганизмами, выполняющими трофические, защитные и регуляторные функции (1). Будучи неспособными к использованию многих источников питания и к активной защите от антагонистов (патогенов, животных-фитофагов), растения компенсируют это за счет биохимических возможностей
бактерий и грибов ? фиксации N2, растворения фосфатов, деструкции органических
полимеров, осмотрофности, синтеза токсинов и антибиотиков.
К фундаментальным свойствам симбиоза относится его целостность, которая поддерживается обратными связями, позволяющими партнерам согласованно реагировать на
внешние воздействия (2). Изучение азотфиксирующих клубеньков бобовых, арбускулярной
микоризы, эндофитных и ризосферных ассоциаций демонстрирует связь целостности
с морфофизиологической сложностью и экологической эффективностью симбиоза. Структурно-функциональная и генетическая целостность симбиоза формируется в процессе коэволюции партнеров и может быть изучена на уровне как структуры их популяций, так и
активности перекрестно регулируемых генов.
Цель нашей работы ? проанализировать эволюционные механизмы, определяющие целостность симбиозов, и на этой основе предложить генетические подходы
для улучшения растительно-микробных симбиозов, используемых в экологически устойчивых агросистемах.
М о р ф о ф и з и о л о г и ч е с к а я ц е л о с т н о с т ь с и м б и оз а. Симбиозы относят к биологическим системам с относительно низкой по сравнению
с унитарными организмами степенью целостности (2). Однако это свойство весьма лабильно: целостность симбиосистем может усиливаться в процессе эволюции, что позволяет анализировать соотношения между структурно-функциональной организованностью и
экологической эффективностью симбиоза.
Целостность симбиоза непосредственно связана с его морфологической сложностью и степенью зависимости партнеров друг от друга, но эти признаки не всегда коррелирует между собой. Среди РМС наиболее сложно организованы азотфиксирующие бобово-ризобиальные симбиозы с многостадийными программами развития, которое начинается с инфицирования бактериями корня и закладки примордиев в его кортексе, а завершается формированием сложно устроенных органов ? клубеньков (3). Сравнительно-морфологический анализ позволил проследить эволюционное возрастание целостности симбиоза: сначала от внеклеточного поддержания бактерий (в инфекционных нитях или в
межклетниках клубенька) к внутриклеточному симбиозу, образуемому в результате эндоцитоза, после которого бактерии формируют в растительных клетках стабильные симбиосомы, затем — от неспециализированных симбиосом, содержащих по несколько N2фиксирующих бактероидов, внешне не отличающихся от свободноживущих бактерий, к
специализированным симбиосомам с единичными структурно дифференцированными
бактероидами (рис. 1). Важным фактором повышения целостности клубенькового сим?
Работа поддержана РФФИ, грант 09-04-00907а, Научная школа 3440.2010.4 и 2010-1.1-141-042.
29
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
биоза служит усложнение механизмов инфицирования растений бактериями ? от проникновения через разрывы эпидермиса, возникающие при росте боковых корней, до
активного поглощения корневыми волосками, которое индуцируется бактериальными Nodфакторами, синтезируемыми под контролем nod-генов (4).
Рис. 1. Повышение целостности бобово-ризобиального симбиоза в
процессе макроэволюции (5): 1 ? бесклубеньковые симбиозы,
когда N2-фиксирующие бактерии поддерживаются в инфекционных нитях (ИН) и в межклеточных пространствах кортекса
корня (Gleditsia, Ceratonia, Cercis); 2 ? примитивные клубеньки, в
которых отсутствует эндоцитоз бактерий в растительные клетки и
N2-фиксация происходит в ИН (Cassia, Andira, Hymenolobium); 3 ?
эволюционно продвинутые клубеньки с неспециализированными
(мультибактериальными) внутриклеточными симбиосомами, содержащими слабо дифференцированные N2-фиксирующие бактероиды (большинство бобовых); 4 ? то же со специализированными (монобактериальными) симбиосомами, включающими глубоко
дифференцированные бактероиды (А ? Medicago, Б ? Pisum).
Ярким примером повышения биохимической целостности симбиоза служит переход от амидного к уреидному типу ассимиляции фиксированного
азота, характерному для бобовых из трибы Phaseoleae
(5). Включение азота в состав уреидов (аллантоин, аллантоиновая кислота), в которых соотношение N:С
составляет 1:1, резко снижает количество потребляемого клубеньками углерода (в амидах и аминокислотах это соотношение равно 1:2 или 1:3). Этот способ
ассимиляции азота сопряжен с дифференцировкой
растительных клеток центральной зоны клубенька ?
их разделением на N2-фиксирующие (инфицированные) и синтезирующие уреиды (не инфицированные) клетки. Системная регуляция также повышает целостность симбиоза. Она обеспечивает сопряжение симбиотрофного питания бобовых азотом
с «автотрофным» питанием (например, с усвоением
нитратов) и с фотосинтезом (рис. 2). Ключевыми факторами авторегуляции симбиоза выступают растительные гены CLAVATA, которые контролируют развитие клубеньковых меристем и не имеют гомологов в системах защиты
растений от патогенов. Принципиально важен факт синтеза сигналов, ограждающих растение от формирования избытка клубеньков, в листьях, что связано с зависимостью симбиоза от интенсивности фотосинтеза. При этом питание растений фиксированным азотом в гораздо меньшей степени зависит от системной регуляции: ассимиляция нитратов и
подавление ими образования клубеньков в основном определяются процессами, происходящими в корнях (см. рис. 2).
Таким образом, на примере клубенькообразования можно видеть, что целостность
симбиоза определяется метаболическими и сигнальными обратными связями, которые
складываются между партнерами на разных стадиях взаимодействия. На этапах узнавания и
проникновения бактерий в растение эти связи отрицательные: они обеспечивают хозяину
строгий контроль над численностью и размножением микросимбионтов, поэтому задействованные здесь механизмы похожи на защитные реакции растений против патогенов (6).
На поздних стадиях обратные связи приобретают положительный характер, обеспечивая
метаболическую интеграцию партнеров — эквивалентный обмен продуктами азотфиксации
и фотосинтеза (7, 8), характерный для мутуализма.
Ц е л о с т н о с т ь с и м б и о з а к а к о б ъ е к т д е й с т в и я
о т б о р а. Морфофизиологическая целостность симбиоза тесно связана с его генетической целостностью, основанной на поддержании в клубеньках сложно организованной
популяции бактерий, структура которой зависит от характера инфицирования корней.
При проникновении бактерий через разрывы эпидермиса клубеньки часто содержат смеси штаммов, в том числе способных и не способных к N2-фиксации, тогда как при проникновении через корневые волоски основная часть возникающих клубеньков содержит
клоны, формируемые при размножении единичных бактерий. Для эффективного симбиоза благоприятна клональная структура бактериальной популяции, которая способствует
формированию положительных обратных связей растения с N2-фиксирующими эндосимбионтами: хозяин поставляет продукты фотосинтеза преимущественно в те клубеньки,
из которых активно поступают азотные соединения. Против бактерий, находящихся в не
фиксирующих N2 клубеньках, могут быть применены защитные реакции (9), что усиливает
отбор в пользу N2-фиксирующих штаммов.
30
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Рис. 2. Системная регуляция бобово-ризобиального симбиоза (18): LysM RLKs — рецептор-подобная киназа с
доменами, связывающими олигохитиновые остатки; Q-CLE — сигнальные белки; LRR RLK — рецепторподобная киназа с лейцин-богатыми повторами (узнает сигнальные факторы белковой природы); NIN —
белок, активирующий развитие клубеньков при азотном голодании (гомологичен белку Mid Chlamydomonas,
активирующему гаметогенез на безазотной среде); NOD3 — нодулин (клубенек-специфичный белок), накапливающийся в паренхиме клубенька; ENOD40 — нодулин, регулирующий баланс ауксинов и цитокининов при развитии клубенька; ГК — гибберелловая кислота; БР — брассиностероиды; ИУК — индолилуксусная кислота; АФК — активные формы кислорода; ЖК — жасмоновая кислота; АБС — абсцизовая
кислота; СК — салициловая кислота; SDI — сигнальный фактор, синтезируемый в листьях и мигрирующий в корень, где он подавляет деление клеток, приводящее к образованию клубеньковых примордиев;
KAPP1, KAPP2 — фосфорилазы белков, связанные с киназами.
1. Коэффициенты корреляции индексов функциональной интегрированности симбиоза
(ФИС) с его адаптивно значимыми свойствами, полученные с использованием математической модели (10)
Индекс ФИС
ЭМС
Индекс полиморфизма (17)
растений
бактерий
Частота бактериальных генотипов
Р
М1 + М2 + М3
М3
InPM
+0,728
–0,818
–0,978
–0,887
+0,887
+0,959
InM
+0,708
–0,805
–0,973
–0,860
+0,860
+0,959
П р и м е ч а н и е. Моделируемая система состоит из диморфной популяции растений и низкополиморфной популяции бактерий — родительский штамм Р, который образует не фиксирующие N2 клубеньки с обоими растительными генотипами, и его мутанты, фиксирующие N2 только с одним (М1,
М2) или с обоими (М3) генотипами растений. Индексы ФИС вычислены на основании анализа ковариации частот генотипов партнеров при малых изменениях системных параметров модели для всей системы (InPM) или для бактериальной популяции (InM). Критическое значение коэффициента корреляции
(r ) составляет 0,575 (P0 < 0,01); для частот М1 и М2 корреляции недостоверны. Эффективность мутуалистического симбиоза (ЭМС) определяли на основании числа семян, сформированных растениями после колонизации клубеньков бактериями.
Исходя из того, что отбор на эффективность мутуализма, осуществляемый в эндосимбиотических популяциях ризобий, представляет собой результат действия положительных обратных связей партнеров, мы провели математическое моделирование микроэволюционных процессов, основанных на этом отборе (10). Анализ построенных моделей
31
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
позволил нам связать эффективность мутуализма с функциональной интегрированностью
симбиоза (ФИС), а также с генотипической специфичностью взаимодействия партнеров.
Для оценки ФИС мы предложили индексы, которые отражают согласованность адаптивных реакций партнеров ? ковариацию их генотипических частот при изменениях параметров модели. Высокие корреляции эффективности симбиоза и ФИС (табл. 1) объясняются отбором в пользу интегрированности симбиоза, которая достигается в ходе его эволюции на повышение азотфиксирующей активности.
2. Адаптивно значимые свойства бобово-ризобиального симбиоза при различных схемах его
развития, изученные с помощью математических моделей (10)
Набор штаммов, способных Доля генотипа Г1 в
Соотношение давлений
Схема развития
размножаться в клубеньках растительной попу(индекс ФИС)
отбора М3 ? Г1/М1 ?Г1
растений генотипа Г1
ляции, %
ЭМС
С0 (0,216)
Р, М1, М2, М3
50
+0,244
0,270
С1 (0,245)
М1, М2, М3
58
–0,007
0,324
М1, М3
68
–1,071
0,376
С2 (0,899)
П р и м е ч а н и е. Индексы функциональной интегрированности симбиоза (ФИС) варьируют от 1 (при
максимальной согласованности адаптивных реакций партнеров) до 0. Отбор, действующий на растительный генотип Г1 со стороны «специфичного» мутуалиста М1, всегда положителен, со стороны «неспецифичного» мутуалиста М3 ? по мере ограничения круга штаммов, способных размножаться в клубеньках
Г1 (С0 ? С1 ? С2), переходит от положительного к отрицательному, что отражает возрастание селективного преимущества М1 над М3. ЭМС ? эффективность мутуалистического симбиоза (см. табл. 1).
Анализ модели с точки зрения целостности симбиоза показал, что ФИС тесно
связана с симбиотической эффективностью, которая возрастает при ограниченном размножении неактивных азотфиксаторов в клубеньках. Оно определяется усложнением инфекционного процесса, приводящим к координированному повышению интегрированности, генотипической специфичности и эффективности симбиоза. Так, при ограниченном
размножении неактивных штаммов в клубеньках усиливается селективное преимущество
специфичных мутуалистов над неспецифичными (табл. 2), вследствие чего одновременно
повышается экологическая эффективность и генотипическая специфичность мутуализма (см. табл. 1). Эта связь ранее была выявлена экспериментально при изучении межвидового (11) и внутривидового (12) варьирования у бобовых. Важно отметить, что полной элиминации неспецифичных мутуалистов из системы не происходит, поскольку они
обеспечивают высокий уровень общей эффективности симбиоза (см. табл. 1).
Таким образом, ФИС можно рассматривать как экологически значимый показатель симбиоза, который повышается в процессе адаптивной эволюции. В то же время
связь ФИС со структурной и биохимической целостностью симбиоза, возрастающей в ходе
его макроэволюции, а также с генетической целостностью, которая выражается в формировании симбиогенома (1), требует специального изучения.
П р а к т и ч е с к и е а с п е к т ы. Изучение целостности симбиозов имеет
огромное практическое значение, поскольку позволяет формировать генетически обоснованную методологию их улучшения и использования в адаптивном земледелии. Анализ предложенной нами математической модели (10) предоставляет возможность наметить основные направления оптимизации генетической структуры симбиосистемы, в
первую очередь соотношения долей специфичных и неспецифичных мутуалистов, которое повышается при формировании клональной популяции ризобий. Эксперименты
показывают, что при выращивании бобовых в полевых условиях клоны ризобий содержатся только в части (40-95 %) клубеньков (13). Однако степень клональности внутриклубеньковой популяции ризобий может быть повышена, например за счет ускорения
инфекционного процесса, при котором корневые волоски захватывают клетки бактерий. В частности, такое ускорение достигается благодаря дефициту азота, повышающему скорость перестроек стенок корневого волоска, через которые происходит поглощение ризобий (14), или активной экскреции растением флавоноидов, активирующих
nod-гены (15, 16), что приводит к росту числа клубеньков.
Знания об эволюционных основах целостности симбиосистем могут использоваться в генетико-селекционных работах по их улучшению. Наибольшая эффективность
симбиоза обеспечивается при взаимодействии двух комплементарных друг другу (специально подобранных или сконструированных) генотипов растений и бактерий. Однако в
реальных симбиотических системах оба партнера генетически гетерогенны: у растений полиморфизм определяет экологическую пластичность сортов, у бактерий он обусловлен
нестабильностью генома, а также присутствием в почвах спонтанной микрофлоры, конкурирующей с производственными штаммами за инфицирование растений. Следовательно, важной для практики задачей служит формирование моделей (прототипов) эффективных систем ? построение их оптимальных популяционно-генетических структур, которое следует проводить в сочетании с конструированием индивидуальных генотипов растений и бактерий (8). Для решения этой задачи целесобразно использовать предложен-
32
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ную нами математическую модель (10), показавшую, что эффективность симбиоза максимальна при умеренном полиморфизме растительной популяции, которая в простейшем
случае состоит из доминирующего и минорного генотипов. Такая популяция развивает
наиболее эффективный симбиоз при взаимодействии с двумя штаммами ризобий, один
из которых специфичен к доминирующему генотипу растений, а другой взаимодействует
с обоими генотипами растений (неспецифичный симбионт) (5).
Итак, важнейшее условие успешного улучшения растительно-микробных симбиозов ? перенос знаний об их естественной эволюции в сферу селекции, генной инженерии и биотехнологии. Правомерность такого подхода определяется тем, что повышение
экологической эффективности симбиозов, необходимое для создания экологически устойчивых систем растениеводства, представляет собой магистральное направление их
естественной эволюции. В переносе знаний из фундаментальных областей биологии в
агробиологию огромную роль играют математические модели, которые могут быть использованы для построения прототипов эффективных симбиотических систем.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
Т и х о н о в и ч И.А., П р о в о р о в Н.А. Симбиозы растений и микроорганизмов: молекулярная
генетика агросистем будущего. СПб, 2009.
Ш а п о ш н и к о в Г.Х. Живые системы с малой степенью целостности. Журн. общ. биол., 1975,
36: 323-335.
B r e w i n N.J. Plant cell wall remodeling in the Rhizobium-legume symbiosis. Crit. Rev. Plant. Sci., 2004, 23: 1-24.
S p r e n t J.I. Evolving ideas of legume evolution and diversity: a taxonomic perspective on the ocurrence of
nodulation. New Phytologist, 2007, 174: 11-25.
P r o v o r o v N.A., V o r o b y o v N.I. Evolutionary genetics of plant-microbe symbioses /I.A. Tikhonovich (ed.). N.Y., 2010.
J o n e s K.M., K o b a y a s h i H., D a v i e s B.W. e.a. How rhizobial symbionts invade plants: the Sinorhizobium—Medicago model. Nature Review, 2007, 5: 619-633.
П р о в о р о в Н.А., В о р о б ь е в Н.И., А н д р о н о в Е.Е. Макро- и микроэволюция бактерий
в системах симбиоза. Генетика, 2008, 44: 12-28.
О н и щ у к О.П., В о р о б ь е в Н.И., П р о в о р о в Н.А. и др. Симбиотическая активность ризобий люцерны (Sinorhizobium meliloti) с генетическими модификациями системы транспорта дикарбоновых кислот. Экологическая генетика, 2009, 7: 3-10.
D e n i s o n R.F. Legume sanctions and the evolution of symbiotic cooperation by rhizobia. The American
Naturalist, 2000, 156: 567-576.
В о р о б ь е в Н.И., П р о в о р о в Н.А. Моделирование эволюции бобово-ризобиального симбиоза на повышение функциональной интегрированности партнеров и экологической эффективности их
взаимодействия. Экологическая генетика, 2010, 8(3): 16-26.
Д о р о с и н с к и й Л.М., Л а з а р е в а Н.М. О специфичности клубеньковых бактерий сои и
люпина. Микробиология, 1968, 37: 115-121.
П р о в о р о в Н.А., Т и х о н о в и ч И.А. Эколого-генетические принципы селекции растений на повышение эффективности взаимодействия с микроорганизмами. С.-х. биол., 2003, 3: 11-25.
K i e r s E.T., R o u s s e a u R.A., W e s t S.A. e.a. Host sanctions and the legume-Rhizobium mutualism. Nature, 2003, 425: 78-81.
Я к о в л е в а З.М. Бактероиды клубеньковых бактерий. Новосибирск, 1975.
K a p u l n i k J., J o s e p h C.M., P h i l l i p s D.A. Flavone limitation to root nodulation and symbiotic nitrogen fixation in alfalfa. Plant Physiol., 1987, 84: 1193-1196.
H e r n a n d e z G., R a m i r e z M., S a u r e z R. Root-exuded nod-gene inducing signals limit the
nodulation capacity of different alfalfa varieties with Rhizobium meliloti. Plant Cell Reports, 1995, 14: 626-629.
N e i M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals. Genetics, 1978, 89: 583-590.
F e r g u s s o n B.J., I n d r a s u m u n a r A., H a y s h i S. e.a. Molecular analysis of legume nodule
development and autoregulation. J. Integr. Plant Biol., 2010, 52: 61-76.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: provorov@newmail.ru
PLANT-MICROBE SYMBIOSES AS THE EVOLUTIONARY
INTEGRATED SYSTEMS
N.A. Provorov, N.I. Vorobyov
Summary
The structural and functional integrity of plant-microbe symbioses represents their fundamental property
expressed at the organismic, cellular, molecular-genetic and population levels. Using the mathematical model this
integrity is represented as a degree of concordance of adaptive reactions (alterations of the partners’ frequencies) for
the environmental changes. The indices of symbiosis integrity determined using the partners’ frequencies co-variation
correlate to the symbiosis efficiency determined as its impacts on the partners’ reproductive activities. The computer
experiments suggest that efficiency and integrity of symbiosis may increase in parallel under impacts of natural selection. The developed model may be used to create the symbioses genetic structures ensuring the high plant productivity.
33
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631.46:579.64:581.557:581.138.1:576.08
КЛЕТОЧНЫЕ МЕХАНИЗМЫ РАЗВИТИЯ СИМБИОТИЧЕСКИХ
КЛУБЕНЬКОВ У БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ*
(обзор)
А.В. ЦЫГАНОВА1, А.Б. КИТАЕВА1, Н.ДЖ. БРЕВИН2, В.Е. ЦЫГАНОВ1*
Рассмотрены некоторые клеточные механизмы, лежащие в основе развития симбиотического клубенька
на разных стадиях. Особое внимание уделено изменениям в организации элементов цитоскелета — тубулиновых
микротрубочек и актиновых микрофиламентов. Описана роль молекулярных взаимодействий гликоконъюгатов
клеточных поверхностей ризобий и растительных клеток в процессе роста инфекционной нити. Обсуждается участие перекиси водорода в развитии клубенька.
Ключевые слова: бобово-ризобиальный симбиоз, симбиотический клубенек, инфекционная нить, бактероид,
тубулиновые микротрубочки, актиновые микрофиламенты, арабиногалактанпротеины-экстензины, перекись водорода.
Keywords: legume-Rhizobium symbiosis, symbiotic nodule, infection thread, bacteroid, peroxide hydrogen,
tubulin microtubules, actin microfilaments, arabinogalactan protein-extensins.
Симбиотический клубенек на корнях бобовых представляет собой новый орган
растения. Здесь создаются оптимальные микроаэробные условия для интенсивно дышащих
бактероидов, что предохраняет от окисления ключевой фермент азотфиксации — нитрогеназу, крайне чувствительную к кислороду. Также в клубеньке происходит ассимиляция продуктов азотфиксации. Перечисленные функции определяют особенности развития и строения симбиотического клубенька. Рассмотрим клеточные механизмы, лежащие в основе
развития симбиотического клубенька, с привлечением результатов наших собственных исследований развития недетерминированного клубенька у гороха посевного — Pisum sativum L.
Ф о р м и р о в а н и е с и м б и о т и ч е с к о г о к л у б е н ь к а. Процесс инфекции специфичен для вида растения-хозяина и штамма клубеньковых бактерий. Специфичность в основном определяется продукцией ризобиальных сигнальных молекул — липохитоолигосахаридов, называемых Nod-факторами. Nod-факторы запускают программу развития клубенька (1). Со стороны растений во взаимодействии участвуют специфичные LysMрецепторподобные киназы, для которых характерно наличие внеклеточного LysM домена,
воспринимающего Nod-фактор, и внутриклеточного киназного домена, обеспечивающего
дальнейшую передачу сигнала (2). Наиболее изученный вид инфекции включает в себя
формирование инфекционной нити в скрученном корневом волоске, через которую ризобии передвигаются до клубенькового примордия в коре корня (3).
Различают два типа развития симбиотических клубеньков — детерминированный и
недетерминированный. Инициация недетерминированного (с постоянной меристематической активностью) клубенька включает две серии событий, происходящих одновременно.
Одна начинается в корневом эпидермисе с активации и скручивания корневого волоска,
инициации инфекционной нити, роста инфекционной нити, реактивации клеток наружных
слоев коры и вхождения их в клеточный цикл, в результате чего формируются прединфекционные нити, другая — в перицикле и клетках внутренних слоев коры в области напротив протоксилемных полюсов, где дедифференциация сопровождается клеточными делениями с формированием клубенькового примордия (4). В детерминированном клубеньке
клеточные деления инициируются в наружных слоях коры и меристема функционирует ограниченное время. Бактерии в основном распространяются в результате деления уже инфицированных клеток наружных слоев коры.
В недетерминированном клубеньке инфекционные нити могут расти как в межклетниках, так и проникать сквозь клетки (рис. 1, А). Достигнув клубенькового примордия,
нити инфицируют цитоплазму растительной клетки посредством эндоцитоза бактерий из
специфических выростов нити, лишенных клеточной стенки и называемых инфекционными каплями (5, 6) (см. рис. 1, Б). Эндоцитировавшиеся бактерии окружены мембраной, называемой перибактероидной, или симбиосомной (см. рис. 1, В). Происходит дифференциация бактерий в специализированные формы — бактероиды (7), которые отличаются от бактерий увеличением в размерах, уменьшением электронной плотности матрикса, а также характерной X- и Y-образной формой (см. рис. 1, В). Бактероид, окруженный симбиосомной
мембраной, называется симбиосомой (8), которая по сути представляет собой новую органеллу, выполняющую специфическую функцию фиксации атмосферного азота в аммоний
(9, 10). Инфицированные клетки увеличиваются в размерах (см. рис. 1, Е) и претерпевают
*
Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии сельскохозяйственных наук, Министерства образования и науки (государственные контракты № 02.740.11.0276, П290, П1301, П1699), гранта Президента РФ (НШ-3440.2010.4).
34
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
процесс эндоредупликации, в результате которого количество ДНК увеличивается до 64С (11).
Рис. 1. Развитие симбиотического клубенька у гороха: А —
рост инфекционной нити сквозь
клетку и в просвете межклеточного пространства, Б — эндоцитоз бактерий из инфекционной
капли, В — дифференцированные бактероиды, окруженные
симбиосомной мембраной, Г —
инфицированная клетка (А-Г —
трансмиссионная электронная
микроскопия); Д — фрагмент
зоны азотфиксации с инфицированными и неинфицированными клетками (световая микроскопия); Е — гистологические
зоны клубенька (дифференциальный интерференционный контраст); ИК — инфицированная
клетка, НИК — неинфицированная клетка, ИН — инфекционная нить, ИНК — инфекционная капля; б — бактерия,
эб — эндоцитируемая бактерия,
ба — бактероид, Вак — вакуоль,
КС — клеточная стенка, I-III —
соответственно меристема, зона
инфекции, зона азотфиксации.
Стрелки указывают на симбиосомную мембрану. Масштабная линейка: А-В — 500 нм, Г —
4 мкм, Д — 20 мкм, Е — 100 мкм.
Центральную часть
инфицированной клетки
занимает крупная вакуоль,
окруженная симбиосомами (см. рис. 1, Г). Не все
клетки в клубеньке инфицируются (см. рис. 1, Д). В
недетерминированном клубеньке меристематическая
активность сохраняется долгое время, при этом постоянно инфицируются новые клетки. В итоге формируется клубенек продолговатой формы, в котором можно выделить различные зоны: меристему, зону инфекции,
зону азотфиксации (см. рис. 1, Е), а позднее — зону старения.
С к р у ч и в а н и е к о р н е в о г о в о л о с к а. Как уже отмечалось, под воздействием Nod-факторов происходят деформации и скручивания корневых волосков, которые обеспечиваются активными изменениями в организации элементов актинового и тубулинового цитоскелета. Растущие корневые волоски содержат пучки актиновых микрофиламентов внутри тяжей цитоплазмы, расположенных вокруг центральной вакуоли и ориентированных от основания волоска к его кончику. Актиновый цитоскелет обеспечивает
движение цитоплазмы и локальный экзоцитоз везикул в кончике корневого волоска (1214). По мере приближения к кончику корневого волоска актиновые микрофиламенты
уменьшаются в диаметре, образуя сеть тонких филаментов (FB-актин) на самом кончике
корневого волоска, где наблюдается свободная от актиновых микрофиламентов зона (2-6
мкм) (12). В то же время есть данные, что на кончике корневого волоска имеется очень
динамичная система актиновых микрофиламентов (14, 15). Было показано, что через несколько минут после воздействия Nod-фактора здесь происходит деполимеризация актиновых микрофиламентов, однако через 30-60 мин актиновый цитоскелет восстанавливается, несмотря на продолжающееся действие Nod-фактора (16). Более поздние исследования продемонстрировали отсутствие нарушений в движении цитоплазмы, полностью
зависящем от наличия функционирующего актинового цитоскелета, под действием Nodфакторов (17), что поставило под сомнение дезинтеграцию актиновых микрофиламентов.
Еще одни авторы описали увеличение числа пучков актиновых микрофиламентов спустя
3-5 мин после добавления Nod-фактора. В формирующемся вздутии корневого волоска
пучки актиновых микрофиламентов располагаются в различных направлениях, что указывает на отсутствие полярного роста (12). В одном из участков вздутия происходит накопление актина, в дальнейшем здесь возобновляется рост корневого волоска, сохраняющий
свойственную для растущего волоска организацию актиновых микрофиламентов (12).
35
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
На всех стадиях в корневом волоске наблюдается густая сеть кортикальных микротрубочек, расположенных параллельно оси его роста. В процессе роста микротрубочки
не достигают кончика корневого волоска и сходятся в нем лишь после остановки роста
волоска (18). Эндоплазматические микротрубочки формируют сеть, соединяющую кончик
корневого волоска и ядро (19). В растущих корневых волосках Nod-факторы вызывают
укорочение сети эндоплазматических микротрубочек, которая восстанавливается через 10
мин, причем изменений в организации кортикальных микротрубочек не наблюдается. В
волосках с остановленным ростом после добавления Nod-фактора эндоплазматические
микротрубочки деполимеризуются и вновь полимеризуются спустя 20 мин, в то время как
кортикальные трубочки также остаются без изменений. Такие волоски в дальнейшем
формируют вздутия, из которого начинается новый рост корневого волоска под определенным углом к предыдущему вектору роста (19), то есть вызываемая Nod-фактором деполимеризация эндоплазматических микротрубочек коррелирует с потерей прежней полярности роста кончика корневого волоска, а их полимеризация — с появлением нового
направления роста.
Рис. 2. Развитие инфекционной
нити и дифференциация тканей
клубенька: А и Б — организация
микротрубочек в клетках соответственно из зоны инфицирования клубенька и из зоны азотфиксации (лазерная сканирующая конфокальная микроскопия,
3D-реконструкция 50 оптических
срезов); В — иммунная локализация антитела MAC265, распознающего арабиногалактанпротеин-экстензин, Г — цитохимическая локализация пергидроксида церия, выявляющего локализацию перекиси водорода (В
и Г — трансмиссионная электронная микроскопия симбиотических клубеньков гороха); Я —
ядро, ИК — инфицированная
клетка, ИН — инфекционная
нить, б — бактерия, ба — бактероид, КС — клеточная стенка,
О — отложения преципитатов
пергидроксида церия. Длинные стрелки указывают на инфекционную нить, стрелки средней длины — на микротрубочки, короткие стрелки — на локализацию антитела MAC265.
Масштабная линейка: А и Б —
10 мкм, В и Г — 500 нм.
Р а з в и т и е и нф е к ц и о н н о й н и т и.
Рост инфекционной нити начинается в корневом волоске, при этом микротрубочки, как
отмечалось, связывают кончик инфекционной нити с ядром. Инфекционная нить покрыта
сетью расположенных продольно микротрубочек (рис. 2, А). Предполагается, что эта сеть
обеспечивает полярный рост и служит шаблоном для формирования инфекционной нити
(20). Роль актиновых микрофиламентов в развитии инфекционной нити до сих пор не изучена (20). Рост нити связан с молекулярным взаимодействием гликоконъюгатов клеточных
поверхностей ризобий и растительных клеток (6, 9, 21). Со стороны бактериальных клеток
большую роль в поддержании роста инфекционной нити играют бактериальные экзо- и липополисахариды, капсулярные полисахариды, циклические глюканы (22). Мутанты по генам, кодирующим перечисленные ризобиальные компоненты, формируют псевдоклубеньки, характеризующиеся остановкой развития инфекционных нитей в корневых волосках,
или неэффективные клубеньки (22). В то же время бобовые растения синтезируют сложный
кополимер, называемый арабиногалактанпротеин-экстензином, который состоит из повторяющихся арабиногалактанпротеинов и экстензиновых мотивов (6, 23). Арабиногалактанпротеины составляют класс белков, богатых гидроксипролином, которые связаны с клеточной
поверхностью растений. Арабиногалактанпротеин-экстензин — один из основных компонентов матрикса инфекционной нити, секретируемый растительными клетками (6, 23, 24) (см.
рис. 2, В). Мы показали, что у неэффективных мутантов с нарушениями роста инфекционных
нитей арабиногалактанпротеин-экстензин присутствовал не только в матриксе инфекционных
нитей, но и в межклеточном матриксе, окружающем инфицированные клетки растенияхозяина. По-видимому, это свидетельствует о нарушении направленной секреции арабиногалактанпротеин-экстензина как результате аномального роста инфекционных нитей (24).
Активные формы кислорода, в частности перекись водорода, выявлялись в инфекционных нитях клубеньков люцерны, гороха и Sesbania rostrata (25-27). Причем у S. rostrata
Н2О2 вовлечена в сигнальный каскад, ведущий к формированию симбиотических клубеньков (26). Предполагается, что Н2О2, присутствующая в инфекционных нитях, может уча-
36
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ствовать в перекрестном связывании арабиногалактанпротеин-экстензинов, повышая плотность матрикса нити (6, 23). В симбиотических клубеньках гороха исходной линии SGE отложение преципитатов пергидроксида церия в зонах инфекции и азотфиксации наблюдалось в клеточных стенках инфицированных клеток и в стенках инфекционных нитей, а
также в матриксе зрелых нитей и инфекционных каплях (28) (см. рис. 2, Г).
Р а з в и т и е к л у б е н ь к о в о г о п р и м о р д и я. Одновременно с индукцией скручивания корневых волосков и ростом инфекционной нити в недетерминированном клубеньке индуцируется деление клеток перицикла и прилежащих внутренних слоев
коры, в детерминированном — ее внешних слоев. У Medicago truncatula первые изменения в
организации микротрубочек наблюдали в клетках перицикла через 16-18 ч после инокуляции (4). Эндоплазматические микротрубочки окружают расположенное в центре клетки ядро. В клетках внутренних слоев коры также отмечены изменения. Увеличивается число
микротрубочек вокруг ядра и формируются отходящие от него радиальные тяжи эндоплазматических микротрубочек. Кортикальные микротрубочки начинают располагаться случайным образом. Эти изменения приводят к изодиаметрической организации клеток, которые
в дальнейшем претерпевают сначала антиклинальные, а потом периклинальные деления,
формируя клубеньковый примордий (4).
Э н д о ц и т о з б а к т е р и й и д и ф ф е р е н ц и а ц и я с и м б и ос о м. Из инфекционной капли бактерии высвобождаются в цитоплазму растительной клетки
индивидуально, окруженные симбиосомной мембраной. Этот процесс описывают как сходный с эндоцитозом (29). Предполагается, что в формировании симбисомной мембраны задействованы четыре механизма транспорта белков (30). Белки могут синтезироваться на свободных рибосомах в цитоплазме и включаться в симбиосомную мембрану с помощью Nтерминальных сигнальных пептидов. Возможен также синтез в рибосомах, связанных с эндоплазматическим ретикулумом (ЭПР), и последующая модификация гликозилированием или
добавлением GPI якоря в ЭПР (продукты транспортируются в аппарат Гольджи и секретируются в симбиосомные мембраны посредством транспортных везикул с помощью синтаксинов). Кроме того, вероятен транспорт белков в симбиосомы прямо из мембран ЭПР. Наконец, часть белков может поступать из бактероидов. До сих пор не описаны изменения в организации элементов цитоскелета в процессе эндоцитоза бактерий (18). Недавно у M. truncatula
выявлен реморин SYMREM1, локализующийся в инфекционной нити, инфекционной капле
и симбиосомной мембране и осуществляющий функции адапторного белка, определяющего
пространственную организацию симбиотических сигнальных комплексов при эндоцитозе (32).
В последнее время описаны факторы растения, обусловливающие окончательную
дифференциацию бактерий в бактероиды, связанную с остановкой цитокинеза при продолжающемся синтезе ДНК, приводящем к увеличению размеров и полиплоидизации бактерий, а также к повышению проницаемости мембран (33, 34). У M. truncatula ими оказались клубенек-специфичные цистеин-богатые (NCR) пептиды. Было показано, что эти
пептиды проникают в цитоплазму бактероидов и связываются с бактероидной мембраной.
В клубеньках экспрессирующих NCR трансгенных растений Lotus japonicus, формирующих
детерминированные клубеньки, в бактероидах наблюдались морфологические изменения,
свойственные для окончательно дифференцированных бактероидов M. truncatula. Примечательно, что NCR пептиды напоминают антимикробные пептиды, что может свидетельствовать об адаптации исходной иммунной системы бобовых растений в процессе эволюции
симбиоза с клубеньковыми бактериями для контроля над ними. Вероятно, такая дифференциация бактерий позволяет избежать использования углерода растения-хозяина для создания его запасов в бактериях (33). Примечательно, что мутант гороха по гену sym40 с нарушениями дифференциации бактероидов характеризуется повышенным отложением крахмала (31). Кроме того, модификация мембраны, вызываемая NCR пептидами и ведущая к
увеличению ее проницаемости, может иметь адаптивный эффект при старении симбиотических клубеньков, облегчая их реутилизацию растением (33).
Д и ф ф е р е н ц и а ц и я т к а н е й к л у б е н ь к а. В клубеньках у M. truncatula и P. sativum наблюдаются масштабные перестройки тубулинового цитоскелета (активная
дезорганизация в зоне инфекции) (35, 36). В проксимальной части зоны формируется новый тубулиновый цитоскелет, в котором микротрубочки ориентированы радиально и перпендикулярно клеточной стенке инфицированных клеток и параллельно бактероидам (35).
Таким образом, изменения тубулинового цитоскелета специфичны для процесса формирования симбиотического клубенька и связаны с необходимостью пространственной организации бактероидов (35). В зоне азотфиксации микротрубочки ассоциированы с симбиосомами (35, 36) (см. рис. 2, Б). У бобовых Macroptilium atropurpureum (35) и сои (38) с детерминированными клубеньками в инфицированных клетках симбиосомы располагаются случайным образом, при этом цитоплазматические микротрубочки немногочисленны или отсутствуют. Описана реорганизация актиновых микрофиламентов при развитии клубеньков у
гороха (37). Показано, что в недавно инфицированных клетках актиновые микрофиламенты ассоциируются с ядром, располагаются вдоль тяжей цитоплазмы, вдоль вакуоли, а
также диффузно в кортикальном слое клетки. В зрелых инфицированных клетках сеть цитоплазматических актиновых микрофиламентов, ориентированных в разных направлениях,
является основной. Она хорошо развита во всех частях цитоплазмы клетки и может взаимодействовать с бактероидами и органеллами.
З а щ и т н ы е р е а к ц и и п р и н е э ф ф е к т и в н о м с и м б и о з е. Показа-
37
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
но, что даже при развитии клубеньков у растений дикого типа число инвазий значительно
превышает число формируемых клубеньков (39), что свидетельствует о строгой регуляции числа формируемых клубеньков с помощью защитных реакций растения (3). Растение-хозяин также постоянно контролирует эффективность формирования и функционирования симбиотических клубеньков. При неэффективном симбиозе со стороны
растения проявляются различные защитные реакции. Следует отметить, что большинство симбиотических мутантов гороха с неэффективными клубеньками характеризуются
увеличенным по сравнению с диким типом числом клубеньков (31, 40), что можно рассматривать как компенсаторный ответ растения на неэффективный симбиоз. Лишь в единичных случаях неэффективность симбиоза приводит к снижению числа клубеньков (31).
Рис. 3. Проявление защитных
реакций при формировании неэффективных симбиотических клубеньков у гороха: А — деградирующие инфицированные клетки у мутанта RisFixV (sym42), Б —
инфицированные клетки у мутанта RisFixV (sym42) с сильно
утолщенными клеточными стенками инфекционных нитей (А
и Б — световая микроскопия),
В — иммунная локализация антитела JIM5, распознающего
деэтерифицированный пектин,
в утолщенной клеточной стенке
инфекционной нити у мутанта
RisFixV (sym42), Г — утолщенная стенка инфекционной нити у мутанта SGEFix?-2 (sym33)
(В и Г — трансмиссионная электронная микроскопия), Д — инфекционная нить в единичной
клетке у мутанта SGEFix?-2
(sym33) (лазерная сканирующая
конфокальная микроскопия, 3Dреконструкция 41 оптического
среза), Е — отложение суберина вокруг клеток, отделяющих зону с клетками, заполненными инфекционной нитью (флуоресцентная микроскопия симбиотических клубеньков
гороха); ДИК — деградирующая инфицированная клетка,
ИК — инфицированная клетка,
ИН — инфекционная нить, б —
бактерия, Вак — вакуоль, КС —
клеточная стенка, О — отложение каллозы вокруг инфекционных нитей. Длинные стрелки
указывают на инфекционную
нить, стрелки средней длины —
на локализацию антитела JIM5,
короткие стрелки — на отложение суберина. Масштабная
линейка: А, Б — 20 мкм, В,
Г — 500 нм, Д — 200 мкм, Е —
100 мкм.
Одна из наиболее распространенных защитных реакций — преждевременная деградация симбиотических структур, или раннее
старение (рис. 3, А). В результате происходит разрушение гемовой части леггемоглобина,
что приводит к изменению цвета клубенька с розового на зеленый (41). Можно предположить, что, как и в случае возрастного старения клубенька, в результате активности ферментов катаболизма происходит высвобождение из деградировавших бактероидов и клеток клубенька питательных веществ и их дальнейших отток в растение (42, 43), хотя это еще требует изучения. У гороха подобная защитная реакция проявляется у мутантов по пяти генам —
sym13, sym25, sym26, sym27 и sym42 (44). У мутанта по гену sym42 наряду с преждевременной
деградацией симбиотических структур описан интенсивный синтез и отложение каллозы и
пектинов (45) вокруг стенок инфекционных нитей, которые в результате чрезвычайно
утолщаются (см. рис. 3, Б, В). Этот мутантный фенотип уникален для бобовых, поскольку
обычно отложения каллозы наблюдаются при проявлении защитной реакции на патогены
(46). Таким образом, в определенных условиях ризобии воспринимаются растением как патогены. У мутантов гороха по гену sym33 также происходило формирование утолщенных
стенок инфекционных нитей (31). Однако его механизм другой и не связан с интенсивным
синтезом каллозы (см. рис. 3, Г). Такие нити в основном не способны эндоцитировать ризо-
38
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
бии в цитоплазму растительной клетки, хотя у них и образуются инфекционные капли (47).
Характерная черта этих нитей — высокая степень скрученности, вследствие чего нить занимает значительный объем клетки (см. рис. 3, Д). Одновременно отмечается интенсивная суберинизация клеток клубенька, отделяющих зону с заполненными инфекционной нитью
клетками (см. рис. 3, Е). Еще одним проявлением защитных реакций в неэффективных
клубеньках служит окислительный стресс. У неэффективного мутанта гороха SGEFix?-1
(sym40), образующим аномальные гипертрофированные инфекционные нити и капли, мы
наблюдали отложение преципитатов пергидроксида церия на бактериальных мембранах
ювенильных бактероидов, недавно эндоцитированных в растительные клетки (28).
В целом следует отметить, что в последние годы достигнуты огромные успехи в выявлении молекулярно-генетических механизмов, лежащих в основе развития симбиотического
клубенька бобовых растений на ранних стадиях (48). В то же время о клеточных механизмах
симбиоза, несмотря на многолетние исследования, известно немногое. Только примерно 10
лет назад показано, что инициация клеточных делений в недетерминированном клубеньке
инициируется в перицикле (4). Совсем недавно продемонстрировано, что в недетерминированном клубеньке клетки, содержащие инфекционную нить, способны к пролиферации
(49). С использованием химерных генов AtCERK1 (кодирует рецептор хитина) и LjNFR1
(кодирует один из рецепторов Nod-фактора) обнаружено, что несколько аминокислотных
замен в киназном домене рецептора AtCERK1 запускают сигнальный каскад, приводящий к формированию симбиотических клубеньков у мутанта nfr1, что служит еще одним
доказательством вовлечения генов, контролирующих ответные реакции растения на атаку
патогенов, в эволюцию симбиоза бобовых растений с клубеньковыми бактериями (50).
Итак, к важным достижениям в изучении клеточных механизмов развития симбиотического клубенька следует отнести выявление роли реорганизации элементов цитоскелета в поддержании роста инфекционной нити и расположения симбиосом в инфицированной клетке, а также одного из механизмов этого роста, основанного на перекрестном
связывании арабиногалактанпротеин-экстензинов с помощью Н2О2. Исследования неэффективного симбиоза позволяют обнаружить факторы растения, которым должны противостоять бактерии, формирующие эффективные клубеньки. В связи с этим интерес представляют данные, указывающие, что растение может воспринимать ризобий как патогенов.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
D й n a r i й J., D e b e l l й F., P r o m e J.-C. Rhizobium lipo-chitooligosaccharide nodulation factors: Signaling
molecules mediating recognition and morphogenesis. Ann. Rev. Biochem., 1996, 65: 503-535.
G e u r t s R., F e d o r o v a E., B i s s e l i n g T. Nod factor signaling genes and their function in the early
stages of Rhizobium infection. Curr. Opin. Plant Biol., 2005, 8: 346-352.
G a g e D.J. Infection and invasion of roots by symbiotic, nitrogen-fixing rhizobia during nodulation of temperate
legumes. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2004, 68: 208-300.
T i m m e r s A.C.J., A u r i a c M.C., T r u c h e t G. Refined analysis of early symbiotic steps of the Rhizobium—
Medicago interaction in relationship with microtubular cytoskeleton rearrangements. Development, 1999, 126: 3617-3628.
N e w c o m b W. A correlated light and electron microscopic study of symbiotic growth and differentiation in
Pisum sativum root nodules. Can. J. Bot., 1976, 54: 2163-2186.
B r e w i n N.J. Plant cell wall remodelling in the Rhizobium-legume symbiosis. Crit. Rev. Plant Sci., 2004, 23: 1-24.
S u t t o n W.D., P a n k h u r s t C.E., C r a i g A.S. The Rhizobium bacteroid state. In: International review of
cytology (S. 13) /G.H. Bourne, J.F. Danielli (eds.). N.Y., 1981: 149-177.
R o t h L.T., S t a c e y G. Bacterium release into host cells of nitrogen-fixing soybean nodules: the symbiosome
membrane comes from three sources. Eur. J. Cell Biol., 1989, 49: 13-23.
B r e w i n N.J. Development of the legume root nodules. Ann. Rev. Cell Dev. Biol., 1991, 7: 191-226.
M y l o n a P., P a w l o w s k i K., B i s s e l i n g T. Symbiotic nitrogen fixation. Plant Cell, 1995, 7: 869-895.
K o n d o r o s i E., K o n d o r o s i A. Endoreduplication and activation of the anaphase-promoting complex
during symbiotic cell development. FEBS Lett., 2004, 567: 152-157.
M i l l e r D.D., D e R u i j t e r N.C.A., B i s s e l i n g T., E m o n s A.M.C. The role of actin in root hair
morphogenesis: studies with lipochitooligosaccharide as a growth stimulator and cytochalasin as an actin perturbing
drug. Plant J., 1999, 17: 141-154.
D e R u i j t e r N.C.A., B i s s e l i n g T., E m o n s A.M.C. Rhizobium Nod factors induce an increase in subapical
fine bundles of actin filaments in Vicia sativa root hairs within minutes. Mol. Plant-Microbe Interact., 1999, 12: 829-832.
V o i g t B., T i m m e r s A.C.J., S a m a j J. e.a. GFP-FABD2 fusion construct allows in vivo visualization of
the dynamic actin cytoskeleton in all cells of Arabidopsis seedlings. Eur. J. Cell Biol., 2005, 84: 595-608.
B a l u љ k a F., S a m a j J., M a t h u r J. e.a. Root hair formation: F-actin-dependent tip growth is initiated by local assembly of profilin supported F-actin meshworks accumulated within expansin-enriched bulges. Dev. Biol., 2000, 227: 618-632.
C б r d e n a s L., V i d a l i L., D o m н n g u e z J. e.a. Rearrangement of actin microfilaments in plant root
hairs responding to Rhizobium etli nodulation signals. Plant Physiol., 1998, 116: 871-877.
S i e b e r e r B., E m o n s A.M.C. Cytoarchitecture and pattern of cytoplasmic streaming in root hairs of Medicago truncatula during development and deformation by nodulation factors. Protoplasma, 2000, 214: 118-127.
T i m m e r s A.C.J., V a l l o t t o n P., H e y m C. e.a. Microtubule dynamics in root hairs of Medicago truncatula. Eur. J. Cell Biol., 2007, 86: 69-83.
S i e b e r e r B.J., T i m m e r s A.C.J., E m o n s A.M.C. Nod factors alter the microtubule cytoskeleton in
Medicago truncatula root hairs to allow root hair orientation. Mol. Plant-Microbe Interact., 2005, 18: 1195-1204.
T i m m e r s A.C.J. The role of the plant cytoskeleton in the interaction between legumes and rhizobia. J. Microsc.,
2008, 231: 247-256.
V a n d e n B o s c h K.A., B r a d l e y D.J., K n o x J.P. e.a. Common components of the infection thread
matrix and intercellular space identified by immunocytochemical analysis of pea nodules and uninfected roots.
EMBO J., 1989, 8: 335-342.
K r i s h n a n H.B., B e n n e t t J.O. Rhizobium-legume symbioses: molecular signals elaborated by rhizobia that
are important for nodulation. In: Plant associated bacteria /S.S. Gnanamanickamd (ed.). Springer-Verlag, Berlin
39
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
Heidelberg, 2006: 57-104.
R a t h b u n E.A., N a l d r e t t M.J., B r e w i n N.J. Identification of a family of extension-like glycoproteins in
the lumen of Rhizobium-induced infection threads in pea root nodules. Mol. Plant-Microbe Interact., 2002, 15: 350-359.
Ц ы г а н о в а А.В., Ц ы г а н о в В.Е., Ф и н д л и К.К. и др. Распределение арабиногалактанпротеинов-экстензинов в клубеньках мутантов гороха (Pisum sativum L.) с нарушениями в развитии инфекционной
нити. Цитология, 2009, 51(1): 53-62.
S a n t o s R., H e r o u a r t D., S i g a u d S. e.a. Oxidative burst in alfalfa—Sinorhizobium meliloti symbiotic
interaction. Mol. Plant-Microbe Interact., 2001, 14: 86-89.
D ’H a e z e W., D e R y c k e R., M a t h i s R. e.a. Reactive oxygen species and ethylene play a positive role
in lateral root base nodulation of a semiaquatic legume. PNAS, 2003, 100: 11789-11794.
R u b i o M.C., G o n z a l e z E.M., M i n c h i n F.R. e.a. Effects of water stress on antioxidant enzymes of
leaves and nodules of transgenic alfalfa overexpressing superoxide dismutases. Physiol. Plant., 2002, 115: 531-540.
Ц ы г а н о в а А.В., Ц ы г а н о в В.Е., Б о р и с о в А.Ю. и др. Сравнительный цитохимический анализ распределения перекиси водорода у неэффективного мутанта гороха SGEFix?-1 (sym40) и исходной линии SGE. Экологич. генетика, 2009, 7(3): 3-9.
P a r n i s k e M. Intracellular accommodation of microbes by plants: a common developmental program for
symbiosis and disease? Curr. Opin. Plant Biol., 2000, 3: 320-328.
C a t a l a n o C.M., L a n e W.S., S h e r r i e r D.J. Biochemical characterization of symbiosome membrane
proteins from Medicago truncatula root nodules. Electrophoresis, 2004, 25: 519-531.
T s y g a n o v V.E., M o r z h i n a E.V., S t e f a n o v S.Y. e.a. The pea (Pisum sativum L.) genes sym33 and
sym40 control infection thread formation and root nodule function. Mol. Gen. Genet., 1998, 256: 491-503.
L e f e b v r e B., T i m m e r s T., M b e n g u e M. e.a. A remorin protein interacts with symbiotic receptors
and regulates bacterial infection. PNAS, 2010, 107: 2343-2348.
V a n d e V e l d e W., Z e h i r o v G., S z a t m a r i A. e.a. Plant peptides govern terminal differentiation of
bacteria in symbiosis. Science, 2010, 327: 1122-1126.
W a n g D., G r i f f i t t s J., S t a r k e r C. e.a. A Nodule-specific protein secretory pathway required for nitrogen-fixing symbiosis. Science, 2010, 327: 1126-1129.
T i m m e r s A.C.J., A u r i a c M.-C., D e B i l l y F., T r u c h e t G. Nod factor internalization and microtubular
cytoskeleton changes occur concomitantly during nodule differentiation in alfalfa. Development, 1998, 125: 339-349.
D a v i d s o n A.L., N e w c o m b W. Organization of microtubules in developing pea root nodule cells. Can. J.
Bot., 2001, 79: 777-786.
D a v i d s o n A.L., N e w c o m b W. Changes in actin microfilament arrays in developing pea root nodule cells.
Can. J. Bot., 2001, 79: 767-776.
W h i t e h e a d L.F., D a y D.A., H a r d h a m A.R. Cytoskeleton arrays in the cells of soybean root nodules:
the role of actin microfilaments in the organisation of symbiosomes. Protoplasma, 1998, 203: 194-205.
V a s s e J., D e B i l l y F., T r u c h e t G. Abortion of infection during the Rhizobium meliloti—alfalfa symbiotic interactions is accompanied by a hypersensitive reaction. Plant J., 1993, 4: 555-566.
N o v б k K., Љ k r d l e t a V., N й m c o v б M., L i s б L. Symbiotic traits, growth, and classification of pea
nodulation mutants. Rostl. Vyroba, 1993, 39: 157-170.
S w a r a j K., B i s h n o i N.R. Physiological and biochemical basis of nodule senescence in legumes: a review.
Plant Physiol. Biochem., 1996, 23: 105-116.
P u p p o A., G r o t e n K., B a s t i a n F. e.a. Legume nodule senescence: roles for redox and hormone
signalling in the orchestration of the natural aging process. New Phytol., 2005, 165: 683-701.
V a n d e V e l d e W., P й r e z G u e r r a J.C., D e K e y s e r A. e.a. Aging of legume symbiosis. A
molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula. Plant Physiol., 2006, 141: 711-720.
Б о р и с о в А.Ю., В а с и л ь ч и к о в А.Г., В о р о ш и л о в а В.А. и др. Регуляторные гены гороха
посевного (Pisum sativum L.), контролирующие развитие азотфиксирующих клубеньков и арбускулярной
микоризы: фундаментальные и прикладные аспекты. Прикл. биохим. и микробиология, 2007, 43(3): 265-271.
B r e w i n N., K h o d o r e n k o A., T s y g a n o v V.E. e.a. Legume AGP-extensins in Rhizobium infection.
In: Biological nitrogen fixation: towards poverty allevation through sustainable agriculture /F.D. Dakora, S.B.M. Chimphango, A.J. Valentine e.a. (eds.). Springer Science + Business Media B.V., 2008: 185-187.
F l o r s V., T o n J., J a k a b G. e.a. Abscisic acid and callose: Team players in defence against pathogens? J.
Phytopath., 2005, 153: 377-383.
Ц ы г а н о в В.Е., С е л и в е р с т о в а Е.В., В о р о ш и л о в а В.А. и др. Анализ двойных мутантных
линий для определения последовательности функционирования генов гороха (Pisum sativum L.) Sym13,
Sym33 и Sym40 во время развития симбиотического клубенька. Экологич. генетика, 2010, 8(2): 3-8.
O l d r o y d G.E.D., D o w n i e J.A. Calcium, kinases and nodulation signalling in legumes. Mol. Cell
Biol., 2004, 5: 566-576.
V o r o s h i l o v a V.A., D e m c h e n k o K.N., B o r i s o v A.Y. e.a. Functioning of Pisum sativum genes
Sym33, Sym40 and Sym41 with respect to coordinated infection thread and meristem development in symbiotic root
nodules. New Phytol., 2009, 181: 913-923.
N a k a g a w a T., K a k u H., S h i m o d a Y. e.a. From defense to symbiosis: limited alterations in the kinase domain
of LysM receptor-like kinases are crucial for evolution of legume-Rhizobium symbiosis. Plant J., 2011, 65: 169-180.
1ГНУ
Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
25 февраля 2011 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: tsyganov@arriam.spb.ru;
2John
Innes Centre,
Norwich Research Park, Colney, Norwich NR4 7UH, UK
CELLULAR MECHANISMS OF NODULE DEVELOPMENT IN LEGUME PLANTS
A.V. Tsyganova1, A.B. Kitaeva1, N.J. Brewin2, V.E. Tsyganov1
Summary
In review some cell mechanisms underlying in the base of symbiotic nodule development at different stages are
considered. Special attention has been paid to rearrangements in organization of cytoskeleton elements: tubulin microtubules and actin microfilaments. The role of molecular interactions of glycoconjugates of cell surface of rhizobia and plant
cells during growth of infection thread is described. The role of peroxide hydrogen in nodule development is considered.
40
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631.52:582.736:581.557:579.64:[575+577.2
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БОБОВЫХ С ПОЛЕЗНЫМИ ПОЧВЕННЫМИ
МИКРООРГАНИЗМАМИ: ОТ ГЕНОВ РАСТЕНИЙ К СОРТАМ*
А.Ю. БОРИСОВ1, О.Ю. ШТАРК1, В.А. ЖУКОВ1, Т.А. НЕМАНКИН1, Т.С. НАУМКИНА2,
А.Г. ПИНАЕВ1, Г.А. АХТЕМОВА1, В.А. ВОРОШИЛОВА1, Е.С. ОВЧИННИКОВА1,
Т.С. РЫЧАГОВА 1 , В.Е. ЦЫГАНОВ 1 , А.И. ЖЕРНАКОВ 1 , Е.В. КУЗНЕЦОВА 1 ,
О.А. ГРИШИНА1, А.С. СУЛИМА1, Я.В. ФЕДОРИНА1, В.К. ЧЕБОТАРЬ1, Т. БИССЕЛИНГ3,
Ф. ЛЕМАНСО4, В. ДЖИАНИНАЗЗИ-ПИРСОН4, П. РАТЭ5, Х. САНХУАН6,
Й. СТОУГААРД7, Г. БЕРГ8, К. МАКФИ9, Н. ЭЛЛИС10, И.А. ТИХОНОВИЧ1
Обобщен многолетний опыт изучения азотфиксирующего симбиоза (АФС), арбускулярной микоризы (АМ)
и ассоциаций с полезными ризосферными бактериями. Дана фенотипическая классификация симбиотических мутантов на примере гороха посевного (Pisum sativum L.). Разработаны методы идентификации и клонирования симбиотических генов. Продемонстрирована возможность повышения продуктивности бобовых за счет инокуляции комплексом
полезных почвенных микроорганизмов. Согласно предложенной концепции генетическую систему бобовых, контролирующую взаимодействие с различными формами полезных микроорганизмов, следует рассматривать как универсальную и функционально целостную. Предложена методология селекции бобовых на повышение симбиотического потенциала для адаптивного растениеводства.
Ключевые слова: бобовые, арбускулярная микориза, азотфиксирующий симбиоз, бактерии, стимулирующие рост растений, симбиотические гены растений, селекция растений, адаптивное растениеводство.
Keywords: legumes, arbuscular mycorrhiza, nitrogen-fixing symbiosis, plant growth-promoting bacteria,
symbiotic plant genes, plant breeding, sustainable plant production.
Бобовые растения способны формировать мутуалистические симбиозы с необычайно
широким спектром почвенных микроорганизмов. Азотфиксирующий симбиоз (АФС) с клубеньковыми бактериями (ризобиями) уникален для бобовых, они также образуют арбускулярную микоризу (АМ) с почвенными грибами (Glomeromycota) и, кроме того, подобно многим
другим растениям вступают в ассоциативные симбиозы с ростстимулирующими ризосферными бактериями (plant growth-promoting rhizobacteria — PGPR): азоспириллами, бациллами, сапрофитными псевдомонадами, агробактериями, эрвиниями, ксантомонадами и др. АФС от
остальных симбиозов отличается высокой специфичностью: определенные виды/штаммы
клубеньковых бактерий образуют совместимые пары лишь с определенными родами/видами/генотипами бобовых, на корнях у которых формируются специализированные структуры — клубеньки, содержащие N2-фиксирующие бактерии (1). Благодаря этому бобовые
растения успешно растут в бедных азотом почвах, значительно обогащая их и внося решающий вклад в азотный баланс наземных экосистем и агроценозов (2). Арбускулярная
микориза — менее специфичный симбиоз, чем АФС, и ее способны формировать большинство видов наземных растений (80-90 %). Структурно-функциональная единица симбиоза, обеспечивающая обмен метаболитами между партнерами (арбускула), находится
внутри растительной клетки и представляет собой сильно разветвленный концевой участок гифы гриба АМ (3). АМ улучшает водный статус растения, снабжает необходимыми элементами минерального питания (преимущественно труднодоступным фосфором
и азотом), повышает устойчивость к фитопатогенам и тяжелым металлам (3, 4). Кроме
того, микоризные грибы участвуют в улучшении структуры и повышении плодородия
почвы (5, 6). АМ и АФС — эндосимбиозы, то есть микросимбионт проникает в ткани корня растения-хозяина. Для этих симбиозов характерна высокая степень генетической и метаболической интеграции партнеров (7, 8). Их развитие включает ряд четко взаимосвязанных
и скоординированных молекулярных и клеточных процессов у партнеров с постоянным
обменом сигналами между ними (3, 9-11).
Для ассоциативных симбиозов с PGPR характерна преимущественная локализация
микроорганизмов в ризосфере и ризоплане, специализированные симбиотические структуры
нетипичны, видо- или штаммоспецифичного взаимодействия не происходит. PGPR стимулируют развитие растений либо непосредственно (синтезируемые гормоны и улучшение минерального питания, в том числе при N2-фиксации), либо опосредованно — благодаря повышению устойчивости растений к стрессам и «биоконтроля» фитопатогенов (12, 13).
В настоящее время активно разрабатываются препараты на основе симбиотических
микроорганизмов для поддержания естественного плодородия почвы, биологического разнообразия в фитоценозах, уменьшения антропогенной нагрузки на среду и повышения качества
сельскохозяйственных продуктов (5, 14, 15). Бобовые, обладающие разнообразной симбиоти*
Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки (Государственные контракты № 02.740.11.0276,
16.512.11.2155 и П1304), грантов Президента РФ для поддержки ведущих научных школ (НШ-3440.2010.4), РФФИ
(09-04-13895-офи_ц, 09-04-91054-НЦНИ_а, 10-04-00961-а, 10-04-01146-а), NWO-047.117.2005.006 (Нидерланды).
41
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ческой активностью, представляются лучшими моделями для исследования процессов в ризосфере и их генетического контроля растением при симбиозе. Традиционным объектом служит,
в частности, горох посевной (Pisum sativum L.). Во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной
микробиологии (ВНИИСХМ) создана уникальная коллекция образцов гороха (свыше 300)
(http://www.arriam.spb.ru/eng/lab9/collections/). Здесь проблему изучают более 25 лет. Горох — одна из важнейших бобовых культур в мире (используется для производства пищевых продуктов,
кормов и в севооборотах различной сложности) (16, 17), поэтому исследования его симбиотических систем актуальны не только в фундаментальном, но и в прикладном аспекте
(развитие сбалансированных адаптивных систем земледелия и защита окружающей среды).
Г е н е т и ч е с к и е о с н о в ы р а з в и т и я э н д о с и м б и о з о в б об о в ы х. Для идентификации генов бобовых, вовлеченных в развитие и функционирование симбиозов, используют экспериментальный мутагенез (позволяет идентифицировать однокопийные регуляторные Sym-гены) и исследование дифференциальной экспрессии генов (как правило, выявляет семейства генов, кодирующих ферменты и структурные молекулы, составляющие «молекулярную машину» симбиоза).
С помощью экспериментального мутагенеза бобовых получают мутанты с нарушениями различных стадий симбиоза (чаще всего в АФС, поскольку такие растения достаточно легко обнаружить по неспособности расти в отсутствие связанного азота). Фенотипический и комплементационный анализ мутантов у различных бобовых растений уже
позволил идентифицировать более 100 генов, ответственных за развитие клубенька (7, 1820). С использованием этого подхода показано, что АФС у гороха (P. sativum) контролируют
около 40 регуляторных генов, причем 3 из них выявлены во ВНИИСХМ (20). На основе
собственных исследований фенотипических характеристик у мутантов гороха, а также анализа данных литературы (20-22) мы разделили процесс развития АФС на две подпрограммы
(рис. 1). Первая (развитие инфекции) включает скручивание корневого волоска (Hac), колонизацию кармана, образованного скрученным корневым волоском (Crh), инициацию роста
инфекционной нити (Iti), рост и развитие инфекционной нити в клетке корневого волоска
(Ith), рост и развитие инфекционной нити в ткани корня (Itr), рост и развитие инфекционной
нити в ткани молодого клубенька (Itn), дифференцировку «инфекционной капли» (эндоцитоз
бактерий и формирование симбиосом) (Idd), дифференцировку бактероидов (Bad) и структурно-функциональную стабилизацию клубеньков (Nop) (соответственно I-X стадии). Вторая
подпрограмма (органогенез клубенька) охватывает деление клеток внутренней коры корня
(Ccd), развитие клубенькового примордия (Npd), дифференцировку апикальной меристемы
клубенька (Anm), стабилизацию меристемы клубенька (Nmp) (соответственно I-IV стадии).
Рис. 1. Схема развития азотфиксирующего симбиоза (АФС) и арбускулярной микоризы (АМ): КБ — клубеньковая
бактерия, КВ — корневой волосок, СКВ — скручивание корневого волоска, ИН — инфекционная нить, КП —
клубеньковый примордий, КЛ — клубенек, СП — спора гриба АМ, ВГ — ветвление гифы, АП — аппрессорий,
ИГ — инфекционная (колонизирующая) гифа, ИМ — интрарадикальный мицелий, АР — арбускула; I и II —
соответственно первичная и вторичная рецепция Nod-фактора (описание см. в тексте).
Генетический анализ формирования АМ более трудоемкий из-за отсутствия селективных сред для отбора растительных мутантов с нарушениями ее развития. Грибы АМ как
экспериментальные объекты также сложны: у них отсутствует половой процесс, они гетеро-
42
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
кариотичны и являются облигатными биотрофами (3). Поэтому одним из наиболее продуктивных способов идентификации генов, участвующих в формировании АМ, служит анализ
растительных мутантов с нарушениями развития АФС (7), что позволяет выявить общие
для развития АФС и АМ гены (у гороха их обнаружено 8) (см. рис. 1). Описаны по крайней
мере три стадии развития АМ (20) (см. рис. 1): рост инфекционной (колонизирующей) гифы
из апрессория и проникновение в корень (Myc1 или Pen), развитие арбускул (Myc2 или Arb)
и динамика развития АМ (Rmd– и Rmd++). Недавно в результате прямого скрининга были
выявлены первые мутанты у бобового растения Medicago truncatula Gaertn., несущие мутации в двух не известных ранее генах, контролирующих развитие АМ, но не АФС, с нарушениями самых ранних стадий развития симбиоза (23, 24). Они интересны прежде всего
тем, что эти мутации, скорее всего, уникальны для АМ. С целью идентификации новых генов гороха, контролирующих развитие АМ, во ВНИИСХМ начат прямой скрининг мутантов с использованием инокуляционной системы на основе шнитт-лука (Allium schoenoprasum L.) как растения — донора грибов АМ (25), предварительно адаптированной к изучаемой культуре и местным условиям. В результате получены перспективные линии гороха
с предполагаемыми мутациями в генах, вовлеченных только в контроль развития АМ (26).
Ф и з и о л о г и ч е с к а я и б и о х и м и ч е с к а я р о л ь с и м б и о т ич е с к и х г е н о в г о р о х а. Идентифицированные в результате экспериментального
мутагенеза гены являются регуляторными, что было подтверждено методами молекулярной
генетики с использованием модельных бобовых лядвенца японского Lotus japonicus (Regel.)
K. Larsen и люцерны слабоусеченной Medicago truncatula Gaertn.
Во ВНИИСХМ разработана методология клонирования симбиотических генов гороха (рис. 2), основанная на гомологии генов у гороха, лядвенца и люцерны, а также на
макро- и микросинтении геномов (коллинеарное расположение генов на определенных
участках хромосом) у этих видов. Наиболее эффективно последовательности симбиотических генов гороха идентифицируются по гомологии с известными нуклеотидными последовательностями у модельных бобовых растений (см. рис. 2, А). Для генетического картирования в геноме гороха создан набор молекулярных CAPS маркеров (сleaved amplified
polymorphic sequence — расщепленные амплифицированные полиморфные последовательности), представляющих собой фрагменты последовательностей экспрессирующихся генов
(27). Особенность этих маркеров — амплификация фрагмента определенного гена и расщепление только одной из его аллелей специфичной эндонуклеазой (28). С применением
такого подхода авторами клонированы и секвенированы четыре симбиотических гена гороха. Гены Sym37 и K1, участвующие в сигнальных взаимодействиях с клубеньковыми бактериями, клонированы на основании их гомологии с геном NFR1 лядвенца японского (29),
гены Coch и Sym33, ответственные за органогенез клубенька и развитие поздних стадий
АФС, — благодаря гомологии с генами NOOT и IPD3 люцерны слабоусеченной (30, 31).
Рис. 2. Схема клонирования симбиотических генов гороха посевного с использованием двух методологических подходов — классической (А) и обратной (Б) генетики (описание см. в тексте).
Позиция многих генов гороха на генетической карте неизвестна, и не удается
сделать предположение об их возможной гомологии с известными генами модельных
бобовых. Для клонирования таких генов разработан альтернативный подход (см. рис. 2,
Б), исключающий этап картирования изучаемого гена, что существенно экономит вре-
43
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
мя, и основанный на анализе уровня экспрессии генов-кандидатов у мутантов и соответствующих линий гороха дикого типа.
В результате изучения последовательностей регуляторных симбиотических генов
гороха были определены их предполагаемые белковые продукты. Значительная часть этих
генов относится к общему симбиотическому сигнальному пути (сommon symbiotic pathway — CSP) (32) и регулирует развитие как АФС, так и АМ (8) (см. рис. 1). Возможно построение следующей обобщенной модели развития АФС у гороха (см. рис. 1): комплекс рецепторных киназ SYM10 + SYM37 (29) воспринимает структуру бактериальной сигнальной
молекулы (Nod-фактора) и активирует киназу SYM19 (33), что при участии катионного канала SYM8 (34) приводит к выбросу ионов кальция из внутриклеточных депо и генерации
так называемых кальциевых волн (35). Эти волны воспринимаются кальций/кальмодулинзависимой киназой SYM9 (36), которая совместно с белком SYM33 (37) активирует экспрессию последующих симбиотических генов, кодирующих транскрипционные факторы
SYM7 (37) и SYM35 (38). Действие последних приводит к изменениям в транскрипции генов в клетках корней гороха и формированию клубеньков, на активность меристем которых влияет анкирин-содержащий белковый регулятор COCH (30). Рецепторная киназа SYM29 (39), вовлеченная в системную регуляцию симбиоза, контролирует число образующихся клубеньков в зависимости от азотного статуса растения.
Молекулярные основы развития АМ изучены слабее: пока не идентифицированы
растительные рецепторы, распознающие сигнальные молекулы гриба. Однако известно, что
дальнейшая передача сигнала происходит через тот же общий симбиотический сигнальный
путь (CSP), что и в случае образования АФС (40). Интересно, что частота и амплитуда генерируемых кальциевых волн различаются в случае АФС или АМ, причем кальций/кальмодулин-зависимая киназа SYM9 распознает эти различия и активирует экспрессию генов,
соответствующих определенному типу симбиоза (40). Кроме того, упомянутая выше рецепторная киназа SYM29 также контролирует развитие АМ на системном уровне (39).
Новейшими методами транскриптомики обнаружены несколько сотен генов
M. truncatula — нодулинов (41) и микоризинов (42), активируемых на разных стадиях развития АФС и АМ (43). Индукция приблизительно 100 из них, названных симбиозинами
(43), наблюдалась при функционировании обоих симбиозов. Предполагается, что гены, индуцируемые совместно, могут быть связаны с различными функциями клетки, необходимыми для симбиотической эффективности, например с активным транспортом через перисимбиотические мембраны, окружающие бактероиды и арбускулы (43). С использованием
ряда симбиотических мутантов и клубеньковых бактерий, маркированных репортерными генами, было показано, что Sym-гены гороха регулируют экспрессию бактериальных симбиотических генов (44, 45). Также недавно продемонстрировано, что некоторые
из Sym-генов гороха регулируют экспрессию грибных генов при развитии АМ (46). Таким образом, геномы макро- и микросимбионта функционально интегрируются в надорганизменную систему, причем геном растения играет в ней ведущую роль.
Несмотря на отсутствие видимой анатомической дифференциации в ассоциациях растений с PGPR, в развитие таких ассоциаций вовлечен ряд молекулярных механизмов, характерных для АМ и АФС (7, 8, 12, 47). В частности, у люцерны (M. truncatula) при взаимодействии с псевдомонадами индуцируются гены микоризинов, и в этом
процессе задействован ген общего симбиотического пути DMI3 (48), гомологичный гену Sym9 гороха (36).
П е р с п е к т и в ы и с п о л ь з о в а н и я с и м б и о з о в б о б ов ы х в с е л ь с к о х о з я й с т в е н н о й п р а к т и к е. Обнаружение общих генов
и молекулярных продуктов, необходимых для формирования АФС и АМ (42, 43), привело к заключению, что бобовые обладают единой генетической системой, контролирующей развитие многостороннего симбиоза (бобовое растение + грибы АМ + полезные ризосферные/клубеньковые бактерии). Этот факт наряду с предположением, что
генетическая система растения, контролирующая развитие АФС, эволюционно базировалась на системе контроля формирования АМ (49), очень важен для использования
симбиотических систем бобовых в адаптивном сельском хозяйстве.
Вегетационные эксперименты и серии полевых испытаний с привлечением образцов из мировой коллекции гороха Всероссийского НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова (ВИР, г. Санкт-Петербург), а также коммерческих сортов и селекционных линий, созданных без учета симбиотического потенциала, продемонстрировали возможность использования симбиотического потенциала растений в сельскохозяйственном производстве с целью уменьшения доз минеральных удобрений и химических средств защиты растений. У
гороха была выявлена высокая степень генетического полиморфизма по симбиотической
эффективности и найдены генотипы с максимальной эффективностью. При эффективном
симбиозе комплексная инокуляция оказывала действие, эквивалентное применению полной дозы минеральных удобрений (50-52). Установлено, что у этой культуры симбиотическая эффективность — признак с высокой степенью наследуемости (53). В серии полевых
экспериментов доказана успешность применения препарата ассоциативных бактерий экстрасол (15) под бобовые, а также преимущества «тройной» инокуляции с экстрасолом перед
«двойной» инокуляцией только клубеньковыми бактериями и грибами АМ. Разработана
44
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
технология производства комплексного микробиологического препарата бисолбимикс, содержащего высокоэффективные штаммы и изоляты грибов АМ, клубеньковых бактерий
и полезных ризосферных бактерий из коллекции ВНИИСХМ (54). В полевых условиях
показана высокая эффективность этого препарата при применении под бобовые и небобовые культуры. Создан стационарный селекционный питомник для отбора растений, проявляющих высокую симбиотическую эффективность, организованный по принципу шестипольного севооборота во избежание размножения патогенной микрофлоры
(на базе Всероссийского НИИ зернобобовых и крупяных культур), где в течение по
крайней мере 5 лет в почву не вносили минеральные удобрения (для инокуляции применяется бисолбимикс). С использованием питомника и предложенного протокола селекции создан и в 2007 году передан на государственные сортоиспытания первый сорт гороха Триумф с повышенным симбиотическим потенциалом (7, 55). При традиционной технологии возделывания его продуктивность не ниже стандартов по Орловской области, а
при инокуляции препаратом бисолбимикс она возрастает на 10 %. В настоящее время с
привлечением образцов из коллекции ВИР в питомнике продолжается поиск генотипов
фасоли (Phaseolus vulgaris L.) и чечевицы (Lens culinaris Medik.) (56), высокоэффективных
в симбиозе с полезной почвенной микрофлорой.
Итак, изучение генетического контроля мутуалистических симбиозов, образуемых
бобовыми растениями с микроорганизмами (арбускулярная микориза, N2-фиксирующий
симбиоз и ассоциации с ростстимулирующими ризосферными бактериями), привело к
созданию системы знаний об их формировании и функционировании. Ее центральное
положение — факт существования общих генов, вовлеченных в развитие перечисленных
типов симбиозов. Значительный прогресс в молекулярной биологии, сравнительной генетике и геномике бобовых растений позволил перейти от изучения структуры и функций
генетической системы бобовых, контролирующей развитие мутуалистических симбиозов,
к их активному внедрению в практику сельского хозяйства. Авторами сформулирована
концепция инновационного подхода к селекции бобовых культур. Он основан на положении, что для управления процессами в агро- и природных фитоценозах необходимо рассматривать совокупность симбиозов бобовых как единую систему, где геном растения,
который изменяется медленнее, чем геномы микроорганизмов, играет организующую
роль. При этом генетическая система бобовых, контролирующая эти симбиозы, должна
рассматриваться как универсальная, функционально целостная и подвергаться селекции
по интегральному признаку «эффективность взаимодействия с полезными почвенными
микроорганизмами». Селекцию растений на повышение симбиотического потенциала
взаимодействия с полезной почвенной микрофлорой необходимо проводить на фоне ее
максимального генетического разнообразия, а главными селекционными признаками считать дополнительную биомассу растения, накопленную за счет образования взаимовыгодной растительно-микробной системы, и качество получаемой продукции, в первую очередь белка. Созданные при таком подходе сорта будут наиболее эффективно использовать
симбиотические взаимодействия. Разработка системы адаптивного растениеводства согласуется с данными экспертов Евросоюза (http://www.grainlegumes.com/aep/) о глобальной пользе применения бобовых (снижение потребления невозобновляемых ресурсов,
негативного влияния на окружающую среду, потребности в минеральных удобрениях и
химических средствах защиты растении, повышение биоразнообразия, плодородия почв,
качества продукции, обеспечение более стабильных доходов производителей).
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
S p r e n t J.I. Nodulation in legumes. Kew, UK, 2001.
V a n c e C.P. Symbiotic nitrogen fixation and phosphorous acquisition. Plant nutrition in the world of declining renewable resources. Plant Physiol., 2001, 127: 390-397.
S m i t h S.E., R e a d D.J. Mycorrhizal symbiosis.. London, UK, 2008.
H i l d e b r a n d t U., R e g v a r M., B o t h e H. Arbuscular mycorrhiza and heavy metal tolerance.
Phytochemistry, 2007, 68: 139-146.
C e l i k I., O r t a s I., K i l i c S. Effects of compost, mycorrhiza, manure and fertilizer on some physical properties of a Chromoxerert soil. Soil Tillage Research, 2004, 78(1): 59-67.
R i l l i g M.C. Arbuscular mycorrhizae, glomalin and soil aggregation. Can. J. Soil Sci., 2004, 84: 355-363.
P r o v o r o v N.A., S h t a r k O.Y., Z h u k o v V.A. e.a. Developmental genetics of plant-microbe
symbioses. N.Y., USA, 2010.
S h t a r k O.Y., B o r i s o v A.Y., Z h u k o v V.A. e.a. Intimate associations of beneficial soil microbes
with the host plants. In: Soil microbiology and sustainable crop production /G.R. Dixon, E.L. Tilston (eds.).
Dordrecht, The Netherlands, 2010: 119-196.
B r e w i n N.J. Plant cell wall remodeling in the Rhizobium-legume symbiosis. Crit. Rev. Plant. Sci., 2004, 23: 1-24.
J o n e s K.M., K o b a y a s h i H., D a v i e s B.W. e.a. How rhizobial symbionts invade plants: the Sinorhizobium-Medicago model. Nat. Rev. Microbiol., 2007, 5: 619-633.
G e n r e A., C h a b a u d M., F a c c i o A. e.a. Prepenetration apparatus assembly precedes and predicts the colonization patterns of arbuscular mycorrhizal fungi within the root cortex of both Medicago truncatula and Daucus carota. Plant Cell, 2008, 20: 1407-1420.
Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями /Под ред.
В.В. Игнатова. М., 2005.
B l o e m b e r g G.V., L u g t e n b e r g B.J.J. Molecular basis of plant growth promotion and biocontrol
by rhizobacteria. Curr. Opin. Plant Biol., 2001, 4: 343-350.
45
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
46
Г о р а л ь В.М., Л а п п а Н.В., Г о р а л ь С.В. и др. Инсектофунгицидный препарат гаупсин на основе штаммов Pseudomonas aureofaciens. Прикладная биохимия и микробиология, 1999, 35(5): 596-598.
Биопрепараты в сельском хозяйстве /Под ред. И.А. Тихоновича, Ю.В. Круглова. М., 2005.
G r a h a m P.H., V a n c e C.P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol., 2003,
131: 872-877.
Food and agriculture organization of the United Nations (FAO). FAOSTAT, 2008. http://faostat.fao.org.
M a o C., Q i u J., W a n g C. e.a. NodMutDB: a database for genes and mutants involved in symbiosis.
Bioinformatics, 2005, 21(12): 2927-2929.
S a n d a l N., P e t e r s e n T.R., M u r r a y J. e.a. Genetics of symbiosis in Lotus japonicus: recombinant inbred lines, comparative genetic maps, and map position of 35 symbiotic loci. Mol. Plant Microbe Interact., 2006, 19(1): 80-91.
Б о р и с о в А.Ю., В а с и л ь ч и к о в А.Г., В о р о ш и л о в а В.А. и др. Регуляторные гены гороха
посевного (Pisum sativum L.), контролирующие развитие азотфиксирующих клубеньков и арбускулярной микоризы: фундаментальные и прикладные аспекты. Прикладная биохимия и микробиология, 2007, 43(3): 265-271.
G u i n e l F.C., G e i l R.D. A model for the development of the rhizobial and arbuscular mycorrhizal symbioses in
legumes and its use to understand the roles of ethylene in the establishment of these two symbioses. Can. J. Bot., 2002,
80: 695-720.
V o r o s h i l o v a V.A., D e m c h e n k o K.N., B o r i s o v A.Y. e.a. Functioning of Pisum sativum genes Sym33,
Sym40 and Sym41 with respect to coordinated infection thread and meristem development in symbiotic root nodules.
New Phytol., 2009, 181(4): 913-923.
M a r s h J.F., S h u l t z e M., O l d r o y d G.E.F. Isolation and analysis of Medicago truncatula mutants defective
in the arbuscular mycorrhizal symbiosis. Handbook & Abstracts of 3rd Int. Conf. on legume genomics & genetics.
Brisbane, Australia, 2006: 52.
M a r s h J.F., G o b b a t o E., S c h u l t z e M. e.a. Ram1 and Ram2: signaling specificity in mycorrhizal symbiosis. Abstract Book of 8th European Nitrogen Fixation Conf. Gent, Belgium, 2008: 26.
R o s e w a r n e G., B a r k e r S.L., S m i t h S.E. Production of near synchronous colonisation in tomato for developmental and molecular analysis of mycorrhiza. Mycol. Res., 1997, 101: 966-970.
S h t a r k O.Y., O v c h i n n i k o v a E.S., Z h u k o v V.A. e.a. Isolation of pea (Pisum sativum) mutants impaired in arbuscular mycorrhiza development, using a direct screening. Pisum Genetics, 2007, 39: 26-27.
Ж у к о в В.А., Н е м а н к и н Т.А., О в ч и н н и к о в а Е.С. и др. Создание серии геноспецифичных молекулярных маркеров для сравнительного картирования геномов гороха посевного (Pisum
sativum L.) и диплоидной люцерны (Medicago truncatula Gaertn.). В сб.: Фактори експериментальної
еволюцii органiзмiв: зб. наук. пр. НАН України, АМН України, Укр. т-во генетикiв i селекционерiв
iм. М.I. Вавилова. T. 9 /Под ред. В.А. Кунах. Киев, 2010: 30-34.
K o n i e c z n y A., A u s u b e l F.M. A procedure for mapping Arabidopsis mutations using co-dominant
ecotype-specific PCR-based markers. Plant Journal, 1993, 4(2): 403-410.
Z h u k o v V.A., R a d u t o i u S., M a d s e n L.H. e.a. The pea Sym37 receptor kinase gene controls
infection thread initiation and nodule development. Mol. Plant Microbe Interact., 2008, 21(12): 1600-1608.
Ж у к о в В.А., Р ы ч а г о в а Т.С., С у л и м а А.С. и др. Ген Cochleata у Pisum sativum L. и его ортолог NOOT у Medicago truncatula Gaertn. контролируют судьбу меристемы азотфиксирующих клубеньков.
Тез. докл. 14-й Пущинской межд. школы-конференции молодых ученых «Биология — наука XXI века».
Пущино, 2010, 2: 135.
O v c h i n n i k o v a E., L i m p e n s E., B o r i s o v A. e.a. Intracellular accommodation of Rhizobium bacteria is controlled by the common symbiotic signaling pathway. Abstract book of the 9th European
Nitrogen Fixation Conf. Geneva, Switzerland, 2010: 214.
B a n b a M., G u t j a h r C., M i y a o A. e.a. Divergence of evolutionary ways among common sym
genes: CASTOR and CCaMK show functional conservation between two symbiosis systems and constitute the
root of a common signaling pathway. Plant Cell Physiol., 2008, 49: 1659-1671.
E n d r e G., K e r e s z t A., K e v e i Z. e.a. A receptor kinase gene regulating symbiotic nodule development. Nature, 2002, 417: 962-966.
E d w a r d s A., H e c k m a n n A.B., Y o u s a f z a i F. e.a. Structural implications of mutations in
the pea SYM8 symbiosis gene, the DMI1 ortholog, encoding a predicted ion channel. Mol. Plant Microbe Interact., 2007, 20: 1183-1191.
O l d r o y d G.E., D o w n i e J.A. Calcium, kinases and nodulation signalling in legumes. Nat. Rev. Mol.
Cell Biol., 2004, 5(7): 566-576.
L й v y J., B r e s C., G e u r t s R. e.a. A putative Ca2+ and calmodulin-dependent protein kinase required for bacterial and fungal symbioses. Science, 2004, 303(5662): 1361-1367.
K a l o P., G l e a s o n C., E d w a r d s A. e.a. Nodulation signaling in legumes requires NSP2, a member of the
GRAS family of transcriptional regulators. Science, 2005, 308(5729): 1786-1789.
B o r i s o v A.Y., M a d s e n L.H., T s y g a n o v V.E. e.a. The Sym35 gene required for root nodule
development in pea is an ortholog of Nin from Lotus japonicus. Plant Physiology, 2003, 131: 1009-1017.
K r u s e l l L., M a d s e n L.H., S a t o S. e.a. Shoot control of root development and nodulation is
mediated by a receptor-like kinase. Nature, 2002, 420(6914): 422-426.
O l d r o y d G.E., D o w n i e J.A. Coordinating nodule morphogenesis with rhizobial infection in legumes. Annu. Rev. Plant. Biol., 2008, 59: 519-546.
V a n K a m m e n A. Suggested nomenclature for plant genes involved in nodulation and symbiosis. Plant. Mol. Biol.
Rep., 1984, 2: 43-45.
G i a n i n a z z i - P e a r s o n V. Plant cell responses to arbuscular mycorrhizal fungi: getting to the roots of the
symbiosis. Plant Cell, 1996, 8: 1871-1883.
K ь s t e r H., V i e w e g M.F., M a n t h e y K. e.a. Identification and expression regulation of symbiotically
activated legume gene. Phytochemistry, 2007, 68: 8-18.
V o r o s h i l o v a V.A., B o e s t e n B., T s y g a n o v V.E. e.a. Effect of mutations in Pisum sativum L. genes
(sym13, sym31, sym33, sym40) blocking different stages of nodule development on the expression of late symbiotic genes
in Rhizobium leguminosarum bv. viciae. Mol. Plant-Microbe Interact., 2001, 14(4): 471-476.
T s y g a n o v V.E., V o r o s h i l o v a V.A., H e r r e r a - C e r v e r a J.A. e.a. Developmental down-regulation
of rhizobial genes as a function of symbiosome differentiation in symbiotic root nodules of Pisum sativum L. New
Phytol., 2003, 159: 521-530.
K u z n e t s o v a E., S e d d a s - D o z o l m e P.M., A r n o u l d C. e.a. Symbiosis-related pea genes modulate
fungal and plant gene expression during the arbuscule stage of mycorrhiza with Glomus intraradices. Mycorrhiza, 2010,
20(6): 427-443.
S a n c h e z L., W e i d m a n n S., A r n o u l d C. e.a. Pseudomonas fluorescens and Glomus mosseae trigger
DMI3-dependent activation of genes related to a signal transduction pathway in roots of Medicago truncatula. Plant
Physiol., 2005, 139: 1065-1077.
P a r n i s k e M. Arbuscular mycorrhiza: the mother of plant root endosymbioses. Nature Rev. Microbiol.,
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
2008, 6: 763-775.
Б о р и с о в А.Ю., Ц ы г а н о в В.Е., Ш т а р к О.Ю. и др. Каталог мировой коллекции ВИР. Вып. 728.
Горох (Симбиотическая эффективность) /Под ред. И.А. Тихоновича, М.А. Вишняковой. СПб, 2002.
Б о р и с о в А.Ю., Н а у м к и н а Т.С., Ш т а р к О.Ю. и др. Эффективность использования совместной
инокуляции гороха посевного (Pisum sativum L.) грибами арбускулярной микоризы и клубеньковыми
бактериями для повышения продуктивности растений в устойчивом экологически ориентированном
земледелии. Докл. РАСХН, 2004, 2: 12-14.
Ш т а р к О.Ю., Д а н и л о в а Т.Н., Н а у м к и н а Т.С. и др. Анализ исходного материала гороха
посевного (Pisum sativum L.) для селекции сортов с высоким симбиотическим потенциалом и выбор параметров для его оценки. Экологческая генетика, 2006, 4: 22-28.
Н а у м к и н а Т.С. Селекция гороха (Pisum sativum L.) на повышение эффективности симбиотической азотфиксации. Автореф. докт. дис. Орел, 2007.
Ч е б о т а р ь В.К., К а з а к о в А.Е., Е р о ф е е в С.В. и др. Способ получения комплексного
микробиологического удобрения. Патент РФ № 2318784, зарегистрирован 10 марта 2008 г. Приоритет
изобретения 30 марта 2006 г.
B o r i s o v A.Y., D a n i l o v a T.N., S h t a r k O.Y. e.a. Tripartite symbiotic system of pea (Pisum sativum L.):
applications in sustainable agriculture. Proc. 15th Int. Congr. on nitrogen fixation & 12th Int. Conf. of the African
Association for biological nitrogen fixation «Biological nitrogen fixation: towards poverty alleviation through
sustainable agriculture» /F.D. Dakora, B.M. Chimphango, A.J. Valentine e.a. (eds.). Berlin, Heidelberg, 2008: 15-17.
Ш т а р к О.Ю., Б о р и с о в А.Ю., Н а у м к и н а Т.С. и др. Биотехнология создания принципиально
новых коммерческих сортов бобовых с повышенной эффективностью взаимодействия с полезной почвенной
микрофлорой (09-04-13895-офи_ц). Мат. Всерос. науч. конф. «Ориентированные фундаментальные исследования и их реализация в АПК России». М., 2010: 43-47.
1ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
16 февраля 2011 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: alexey_borisov@arriam.spb.ru, ayborisov@yandex.ru;
2ГНУ
Всероссийский НИИ зернобобовых и крупяных культур
Россельхозакадемии,
302502 г. Орел, пос. Стрелецкое,
e-mail: naumkina1@yandex.ru;
3Laboratory
of Molecular Biology, Wageningen University,
Droevendaalsesteeg, 4, 6708 PB Wageningen, Building: 104, The Netherlands,
e-mail: ton.bisseling@wur.nl;
4Universitй de Bourgogne, Plante–Microbe–Environnement, INRA,
UMR 1088 INRA/5184 CNRS/Universitй de Bourgogne, Plante–Microbe–
Environnement, INRA-CMSE, BP 86510, 21065 Dijon Cedex, France,
e-mail: gianina@dijon.inra.fr;
5Institut des Sciences du Vйgйtal,
Bases molйculaires de l'interaction S. meliloti/M. truncatula, CNRS UPR2355,
1 Av. de la Terrasse, 91190 Gif-sur-Yvette, France,
e-mail: pascal.ratet@isv.cnrs-gif.fr;
6Estacion Experimental del Zaidin,
Dept. Microbiologia del Suelo y Sistemas Simbioticos, Estacion Experimental del
Zaidin, CSIC, Prof. Albareda 1, E-18008 Granada, Spain,
e-mail: sanjuan@eez.csic.es;
7Aarhus Universitet,
Gustav Wieds Vej 10C, DK-8000 Aarhus C, Denmark,
e-mail: stougaard@mb.au.dk;
8Department of Environmental Biotechnology, Graz
University of Technology,
Petersgasse 12, A-8010 Graz, Austria,
e-mail: gabriele.berg@tugraz.at;
9Department
of Plant Sciences,
Loftsgard Hall 370G, NDSU Dept 7670, PO Box 6050, Fargo, ND 58108-6050,
e-mail: Kevin.McPhee@ndsu.edu;
10Aberystwyth
University,
Old College, King Street, Aberystwyth, Ceredigion, SY23 2AX, UK,
e-mail: noe2@aber.ac.uk
INTERACTION OF LEGUMES WITH BENEFICIAL SOIL MICROORGANISMS:
FROM PLANT GENES TO VARIETIES
A.Yu. Borisov1, O.Yu. Shtark1, V.A. Zhukov1, T.A. Nemankin1, T.S. Naumkina2, A.G. Pinaev1, G.A. Akhtemova1,
V.A. Voroshilova1, E.S. Ovchinnikova1, T.S. Rychagova1, V.E. Tsyganov1, A.I. Zhernakov1, E.V. Kuznetsova1,
O.A. Grishina1, A.S. Sulima1, Ya.V. Fedorina1, V.K. Chebotar’1, T. Bisseling3, P. Lemanceau4, V. GianinazziPearson4, P. Ratet5, J. Sanjuan6, J. Stougaard7, G. Berg8, K. McPhee9, N. Ellis10, I.A. Tikhonovich1
Summary
Long-term experience of studying genetic system of Legumes controlling development of mutually beneficial symbioses (nitrogen fixation, arbuscular mycorrhiza and associations with beneficial rhizosphere bacteria) has
been summarized. With pea (Pisum sativum L.) as the object of research the phenotypic classification of pea symbiotic mutants has been given. The methods of identification and cloning of plant symbiotic genes have been developed. An opportunity to increase legume plant production by means of inoculation with the complex of beneficial
microbes has been demonstrated. A new concept to consider legume genetic system controlling interactions with
various beneficial microbes as universal and functionally integrated has been formulated. A methodology to breed
legumes to increase the potential of interactions with beneficial soil microbes for the use of new kind of varieties in
sustainable plant production has been proposed.
47
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 633.31:581.557:631.461.5:575
ПОЛИМОРФИЗМ bet-ГЕНОВ У ШТАММОВ Sinorhizobium meliloti
ИЗ ГЕНЦЕНТРОВ ЛЮЦЕРНЫ*
М.Л. РУМЯНЦЕВА, В.С. БЕЛОВА, О.П. ОНИЩУК, Е.Е. АНДРОНОВ,
О.Н. КУРЧАК, Е.П. ЧИЖЕВСКАЯ, Т.Б. РУМЯНЦЕВА, Б.В. СИМАРОВ
У 319 природных штаммов Sinorhizobium meliloti, выделенных из почв и клубеньков в 4 географически
удаленных центрах разнообразия люцерны, изучали структурный полиморфизм хромосомного гена betC и плазмидного
гена betT(S), которые ответственны за синтез и транспорт осмопротекторов. Показаны достоверные различия между
клубеньковыми и почвенными субпопуляциями S. meliloti по частоте аллелей генов betC и betT(S). Выделены четыре
преобладающих геномотипических bet-класса, частота которых в клубеньковых и почвенных субпопуляциях достоверно не различалась. Выявлен высокий уровень корреляции между солеустойчивостью и симбиотической эффективностью ризобий (r = 0,76). Полученные результаты указывают, что полиморфизм bet-генов у ризобий Северокавказского генцентра обусловлен преимущественно влиянием растения-хозяина, тогда как в Приаральском, подверженном
засолению, — процессами адаптации к воздействию абиотического стресс-фактора.
Ключевые слова: клубеньковые бактерии, субпопуляции, bet-гены, полиморфизм, солеустойчивость,
симбиоз, люцерна, генцентры.
Key words: rhizobia, subpopulations, bet-genes, polymorphism, salt tolerance, symbiosis, alfalfa, gene centers.
Клубеньковые бактерии (ризобии) Sinorhizobium meliloti фиксируют азот атмосферы
в симбиозе с люцерной, широко выращиваемой во всем мире. Люцерна — умеренный галофит, и это обусловливает перспективность ее возделывания на деградированных (например, засоленных) почвах (1, 2). Солеустойчивость люцерны повышается при инокуляции
штаммами-микросимбионтами, подобранными в результате селекции (3). Природные изоляты S. meliloti существенно различаются по солеустойчивости, чем объясняется интерес к
изучению генетического контроля этого признака.
Известно, что солеустойчивость ризобий зависит от их способности накапливать
легкорастворимые соединения-осмопротекторы, из которых у многих видов микроорганизмов и растений наиболее распространен глицин-бетаин (4-6). Клубеньковые бактерии люцерны увеличивают внутриклеточную концентрацию глицин-бетаина за счет синтеза или
экзогенного транспорта либо двух процессов одновременно (5). Ризобии вида S. meliloti используют глицин-бетаин в качестве источника углерода и азота, что не показано для других
видов бактерий (5, 7). Биосинтез глицин-бетаина у S. meliloti контролируется bet-опероном,
который расположен на хромосоме и выявлен у ряда солеустойчивых видов бактерий, а
также у Escherichia сoli (8). В состав оперона входит регуляторный ген betI, ген betB (NADзависимая бетаинальдегиддегидрогеназа) и ген betА (кислородзависимая холиндегидрогеназа). В отличие от ряда солеустойчивых бактерий у S. meliloti bet-оперон содержит еще один,
четвертый, ген — betC, кодирующий холинсульфатазу, ответственную за превращение холин-О-сульфата в холин (9). Накопление глицин-бетаина у клубеньковых бактерий люцерны происходит при участии продукта гена betS — мембранного белка BetS, относящегося к
транспортной системе BCCT-типа (betain-cholin-carnitin transport), обеспечивающей накопление бетаина, холина, карнитина (10). Это единственная система из описанных в литературе, которая ответственна за экспресс-ответ ризобий на солевой шок (мгновенное увеличение концентрации соли в среде) (11). Ген betS впервые выявлен и изучен у штамма S. meliloti
102F34 и аннотирован в геноме штамма Rm1021 под номером SMb20333 как ген betT (10).
Ген betT(S) локализован на высокомолекулярной симбиотической мегаплазмиде SMb (12).
В клетках S. meliloti этот ген экспрессируется конститутивно, однако при выращивании в
присутствии NaCl продукт гена — белок BetS претерпевает посттрансляционную модификацию. По мнению авторов, это позволяет бактериям быстро транспортировать глицинбетаин через мембрану из ризосферы или из почвы (10). Показано, что ген betS экспрессируется в инфекционных нитях и в бактероидах, что свидетельствует о важной роли мембранного белка BetS при формировании и функционировании симбиоза в условиях засоления (11). К гену betT(S) прилегают открытые рамки SMb20332 и SMb20334, функциональная значимость которых не установлена. Применение программы BLAST-N позволило установить, что последовательность SMb20332 гомологична последовательности гена, кодирующего арилсульфатазу (100 %), SMb20334 — последовательности гена, кодирующего неспецифичную серин/треонин киназу. Изучение генетических основ формирования солеустойчивости предполагает анализ структурного полиморфизма bet-генов, участвующих в
синтезе и транспорте осмопротекторов, у природных штаммов клубеньковых бактерий в
различных агроклиматических и географически удаленных регионах.
В связи с этим мы проанализировали структурный полиморфизм хромосомного гена betC и плазмидного гена betT(S) у природных штаммов Sinorhizobium meliloti,
*
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ-09-04-803 офи-ц и РФФИ 09-04-513 ИКа.
48
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
адаптированных к различным абиотическим стрессорам, во взаимосвязи с солеустойчивостью и симбиотической активностью в условиях засоления.
Методика. Коллекция природных штаммов S. meliloti собрана в очагах разнообразия бобовых растений-хозяев, относящихся к Кавказскому, Среднеазиатскому центрам разнообразия культурных растений (описаны Н.И. Вавиловым) (13), а также в ЕвропейскоСибирском генцентре (14, 15) и в центре современной интрогрессивной гибридизации люцерны (предгорье Мугоджар, Приаралье, Казахстан) (16). Почвенные образцы и части корней с клубеньками отбирали в различных сайтах генцентров (ГЦ), которые далее обозначены как Приаральский (ПАГ), Северо-Кавказский (СКГ), Европейско-Сибирский (ЕСГ) и
Среднеазиатский (САГ) (3, 17). Перечисленные ГЦ географически удалены, подвержены резким перепадам атмосферных и почвенных температур, испытывают недостаток влаги. В
Приаралье происходит интенсивное вторичное засоление (17). Популяции изолятов ризобий состоят из почвенных (П) и клубеньковых (К) субпопуляций (17). Штаммы бактерий
из клубеньков или из почвенных вытяжек выделяли по стандартным методикам (3). Всего
проанализировано 167 изолятов S. meliloti из ПАГ, 97 — из СКГ, 30 — из ЕСГ и 25 — из САГ.
Солеустойчивость штаммов определяли на основании измерения оптической
плотности (OD600) бактериальных культур после 4 сут роста в жидкой среде TY с 0,6 М
NaCl (3,5 %) (3). По результатам роста изоляты S. meliloti разделяли на солеустойчивые
и солечувствительные (3).
Режим ПЦР включал 30 циклов. Продолжительность денатурации ДНК в первом
цикле составляла 3 мин. Последующие циклы включали денатурацию (30 с при 94 °С),
отжиг (30 с при 55 °С) и элонгацию (1 мин при 72 °С).
При изучении последовательности гена betC использовали праймеры, с помощью которых амплифицировали последовательность гена betC, межгенную область и часть
гена betB: betCB_F — 3ґ-AACTACACCTCGTCGCCCCTGTGTG-5ґ и betCB_R — 3ґ-TCTCGACGATCCCAGGCGTT-5ґ. Локус betТ(S) изучали с тремя парами праймеров — на последовательности SMb20332 (BetS1_F: 3ґ-GCTTCTTCTTCCTGCCATCA-5ґ и BetS1_R 3ґCACCTTCTTTTCGGACGGTA-5ґ), SMb20333 (betS) (BetS2_F: 3ґ-TACCGTCCGAAAAGAAGGTG-5ґ, BetS2_R: 3ґ-CGATGCTATTTCTGGCGTTC-5ґ) и SMb20334 (BetS3_F: 3ґ-GATTGTAGCGGTAGCCGAAA-5ґ). Рестрикцию амплифицированных ДНК-фрагментов эндонуклеазами MspI, HaeIII, AluI («MBI Fermentas», Литва) выполняли по стандартной методике (18), электрофоретический анализ рестриктов проводили в 3 % агарозном геле (18). В результате для каждого штамма выявили присущий ему состав ДНК-фрагментов определенного размера — так называемый RFLP-тип. Каждому RFLP-типу присваивалось буквенное
обозначение (сходные составы фрагментов ДНК относили к одному RFLP-типу). RFLP-тип
а был всегда аналогичен RFLP-типу типового штамма Rm1021 S. meliloti (19). Если анализ
штамма проводили с применением двух и более эндонуклеаз, его RFLP-тип описывали как
комплексный (по буквенным обозначениям RFLP-типов для каждой эндонуклеазы).
ДНК-ДНК гибридизацию выполняли по методу Саузерна (18). Гибридизационными пробами служили DIG-меченные амплифицированные фрагменты ДНК, содержавшие
последовательности исследуемых генов.
Симбиотическую эффективность штаммов S. meliloti оценивали в условиях стерильных микровегетационных опытов по изменению сухой массы растений люцерны Medicago sativa L. (сорт Вега) или M. truncatula (сорт Jemalong) относительно варианта без инокуляции (3). Эффективными считались штаммы, при инокуляции которыми сухая масса у инокулированных растений на 75 % превышала таковую у растений в контроле (без инокуляции).
Статистическую обработку проводили с использованием программ Statistica 6.0 (корреляционный
анализ), Microsoft Excel 2000 (?2; ошибка доли, %) и
коэффициента гетерогенности Н (20).
Результаты. Расположение центров, в которых проводили сборы почвенных образцов и корней
люцерны с клубеньками, представлено на рисунке 1.
Структурный полиморфизм
х р о м о с о м н о г о г е н а betC в п о п у л я ц и я х
и с у б п о п у л я ц и я х р и з о б и й. П о п у л я ц и и.
Рис. 1. Генцентры культурных растений, в
которых проводился сбор образцов почвы и
RFLP-полиморфизм гена betC (1401 п.н.) и части
корней люцерны с клубеньками для выделегена betB (143 п.н.; рис. 2) изучили у 319 природных
ния природных штаммов бактерий Sinorhizoштаммов ризобий из четырех ГЦ. При использоваbium meliloti: СКГ — Северо-Кавказский,
нии эндонуклеазы MspI выявлено три RFLР-типа (а,
ПАГ — Приаральский, САГ — Среднеb и c), при использовании HaeIII — два (а, b) (см.
азиатский, ЕСГ — Европейско-Сибирский.
рис. 2, а, в). RFLP-типы, отличавшиеся от типа а,
присущего типовому штамму S. meliloti Rm1021, имели либо дополнительные MspI сайты
и/или меньшее число HaeIII сайтов преимущественно в центральной части гена betC
между 691 по 1120 нуклеотидами (см. рис. 2). При учете двух рестрикционных профилей, полученных для каждого изолята, определили пять комбинированных MspI-HaeIII
RFLP-типов — aa, ab, ba, bb и cb, которые рассматривали как аллели гена betC.
49
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
А
Б
Рис. 2. Рестрикционная карта гена betC штамма Rm1021 Sinorhizobium meliloti (А, звездочками отмечены сайты, в которых при рестрикционном анализе выявили структурные различия) и RFLP-типы (Б) природных изолятов S. meliloti: RFLP-типы (a, b, c), полученные при обработке ПЦР-ДНК-фрагментов эндонуклеазой
MspI (2, 3, 4, 5) или HaeIII (7, 8, 9); 1, 6 — ДНК-маркер (М100) (описание см. в разделе «Методика»).
Аллели аа и ab гена betC выявили у всех изолятов ПАГ, САГ и ЕСГ, при этом
аллель аа доминировал по частоте (средние значения для аллелей составили соответственно 0,61 и 0,32; рис. 3, А). Только у изолятов СКГ по обоим аллелям частота была сходной — соответственно 0,37 и 0,49. Остальные аллели (ba, bb, cb) идентифицировали у 1-3
изолятов САГ, ПАГ и СКГ и не выявили у изолятов ЕСГ. Частота этих аллелей составила
от 0,02 до 0,12 в зависимости от ГЦ, в связи с чем их рассматривали как редко встречающиеся или уникальные. Особо следует отметить, что последовательность гена betC не амплифицировалась с праймерами, подобранными на основе данных сиквенса генома Rm1021,
у 9 изолятов СКГ, 4 изолятов ПАГ и у 1 изолята СКГ. У ряда природных штаммов последовательности генов betC или betТ(S) (см. далее) не удалось амплифицировать с использованием праймеров, подобранных подобным образом, причем гибридизационный анализ общей
ДНК таких изолятов с
ДНК-пробами на соответствующие гены Rm1021
для части изолятов дал
положительный ответ, который у других не проявился. Отсутствие амплификата у изолятов с
положительным гибридизационным ответом
свидетельствовало в польРис. 3. Частота RFLP-типов betC у изолятов Sinorhizobium meliloti из раззу того, что последоваличных генцентров: А — частота встречаемости всех выявленных RFLPтельность изучаемого гетипов в популяциях, Б — частота встречаемости RFLP-типов aa и ab в
субпопуляциях; aa, ab, ba, bb, cb — RFLP-типы гена betC; n/a — отсутстна структурно изменевие амплификации гена betC; ПАГ, САГ, СКГ, ЕСГ — генцентры (описана (дивергентна). Если у
ние см. в разделе «Методика»); К — клубеньковые, П — почвенные изоляты.
штамма не получен амплификат и положительный ответ при ДНК-ДНК гибридизации, принято считать, что
соответствующий ген отсутствует в геноме изучаемого(ых) природного(ых) штамма(ов)
либо его последовательность дивергентна (21).
Таким образом, аллель аа, характерный для типового штамма Rm1021, доминирует
в очагах разнообразия культурных растений ПАГ и САГ, расположенных в Средней Азии, и
ЕСГ (вторичный центр разнообразия).
К л у б е н ь к о в ы е и п о ч в е н н ы е с у б п о п у л я ц и и. К- и Псубпопуляции ризобий из изучаемых ГЦ также были проанализированы по частотам пяти
аллелей гена betC. Аллели аа и аb преобладали, поскольку их выявили с частотой соответственно 0,51-0,58 и 0,42-0,33 у К- и П-изолятов (см. рис. 3, Б). Остальные типы аллелей гена
betC идентифицированы у 1-3 П- или К-изолятов. Вместе с тем при сравнении изолятов из
К-субпопуляций ПАГ и СКГ обнаружилось, что частоты аллелей аа и аb достоверно различались (?2 = 4,6, Р < 0,05; см. рис. 3, Б). Аллель аа преимущественно находили у К-изолятов
ПАГ (0,53), аллель аb — у К-изолятов СКГ (0,52; см. рис. 3, Б). Среди К-изолятов САГ доминантой оказался аллель аа (0,78). Таким образом, этот аллель преобладал в К-субпопуляциях
ПАГ и САГ, относящихся к Среднеазиатскому региону; у К-изолятов СКГ преобладал аллель
аb. Анализ П-субпопуляций показал, что аллель аа гена betC превалировал в ПАГ и ЕСГ (соответственно 0,70 и 0,63; см. рис. 3, Б). Частота аллеля аb в П-субпопуляциях всех изучаемых
ГЦ была сходной и составила в среднем 0,33. В П-субпопуляции СКГ аллели аа и ab встречались с равной частотой (0,39), в П-субпопуляции САГ — выявлялись с частотой соответ-
50
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ственно 0,36 и 0,27. Следовательно, аллель аа доминировал в трех из четырех исследованных П-субпопуляций клубеньковых бактерий люцерны S. meliloti (?2 = 11,8, Р < 0,001).
Поскольку аллели аа и ab гена betC обнаружили у клубеньковых и почвенных
изолятов из различных ГЦ, их распределение не зависело от географического происхождения штаммов. Вместе с тем преобладание штаммов, содержащих, например, аллель
ab в К-субпопуляции СКГ и аллеля аа у К- и П-изолятов ПАГ, могло быть обусловлено
селективным влиянием со стороны растения-хозяина и/или адаптацией к абиотическим
стресс-факторам.
Анализ встречаемости изолятов, у которых ген betC не был амплифицирован, не
выявил достоверных различий между К- и П-изолятами в СКГ и ПАГ (?2 = 0,36, Р > 0,1).
Следовательно, изоляты, у которых ген betC отсутствует или последовательность гена дивергентна, встречаются с равной вероятностью в клубеньковой и почвенной субпопуляциях.
При определении коэффициентов Н на основании частоты рассмотренных RFLPтипов betC (20) установили, что у изолятов САГ, ПАГ и СКГ гетерогенность была сходно высокой (Н соответственно 0,63; 0,60 и 0,65), тогда как для ЕСГ значение коэффициента было ниже (Н = 0,5). При сравнении субпопуляций оказалось, что П-изоляты
САГ и СКГ гетерогеннее К-изолятов из тех же ГЦ (соответственно 0,72 и 0,70; 0,55 и
0,61), тогда как в зоне экстремального засоления (ПАГ) у К-изолятов этот показатель
был выше, чем у П-изолятов (соответственно 0,64 и 0,56).
Рис. 4. Структурный полиморфизм локуса
SMb20332-SMb20334 у клубеньковых (К) и
почвенных (П) изолятов Sinorhizobium meliloti
из различных генцентров: А — SMb20333, Б —
SMb20332, В — SMb20334; aa, ba, bb, ab —
RFLP-типы соответствующего гена; n/a — отсутствие амплификации; i-xi — комбинированные MspI-HaeIII RFLP-типы SMb20332; ПАГ,
САГ, СКГ — генцентры (описание см. раздел
«Методика»).
С т р у к т у р н ы й п о л им о р ф и з м п л а з м и д н ы х л о к ус о в. Последовательность SMb20333
гена betТ(S) проанализировали в П- и
К-субпопуляциях из трех ГЦ — САГ,
ПАГ и СКГ. Выявили четыре типа аллелей гена betТ(S), из которых аллель
aa идентифицировался в среднем с частотой 0,73 у К- и 0,59 у П-изолятов (рис.
4, А). Дополнительное использование в RFLP-анализе мелкощепящей эндонуклеазы AluI
позволило выделить у MspI-HaeIII RFLP-типа аа два подтипа. Первый из них был также
аналогичен RFLP-типу Rm1021, второй идентифицировали у двух изолятов СКГ (0,11),
тогда как у изолятов из других ГЦ полиморфизм последовательности гена betТ(S) при использовании эндонуклеазы AluI не выявлен.
Изоляты, не содержавшие последовательность SMb20333 или имевшие дивергентную структуру этого гена (возможное обоснование причин обсуждалось выше), обнаружились во всех изучаемых ГЦ. У К- и П-субпопуляций СКГ частоты были сходными и
составили в среднем соответственно 0,37. У К- и П-субпопуляций САГ частоты также
были сходными и составили в среднем 0,12. Однако в районе экстремального засоления
(ПАГ) доля таких изолятов достоверно превалировала в П-субпопуляции (?2 = 8,4; Р < 0,01;
см. рис. 4, А). При ДНК-ДНК гибридизационном анализе 13 К- и П-изолятов СКГ и
ПАГ, у которых при использовании праймеров на ген betТ(S) амплификация не происходила, были получены результаты, позволяющие считать, что у 4 из них последователь-
51
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ность гена betТ(S) дивергентна, а в геномах остальных 9 она, по-видимому, отсутствует.
Изоляты, у которых последовательность гена betТ(S) дивергентна, оказались солечувствительными, не имевшие его — проявляли различную степень солеустойчивости. Полученные данные подтверждают мнение о том, что в транспорте осмопротекторов у S. meliloti
могут, помимо betТ(S), участвовать иные, не известные в настоящее время гены (10).
Последовательность SMb20332, прилегающая к гену betT(S), наиболее полно изучали у изолятов САГ и ПАГ. При использовании рестриктазы MspI выявили семь RFLPтипов, причем те из них, которые отличались от типа а (Rm1021), имели на 1-7 сайтов
рестрикции меньше (исключение — тип d, у которого обнаружен новый дополнительный
сайт; данные не приведены). Четыре из семи MspI RFLP-типов (a, c, f, g) были общими
для изолятов САГ и ПАГ, три остальных имелись у изолятов либо из ПАГ (e), либо из
САГ (b, d). При использовании эндонуклеазы HaeIII также идентифицировали семь RFLPтипов, из которых шесть (a, b, d, h, g и e) найдены в САГ и ПАГ и один (уникальный cтип) — у изолятов из САГ. Число комбинированных MspI-HaeIII RFLP-типов SMb20332
составило 11 (далее обозначали как i-xi, RFLP-типу штамма Rm1021 соответствует тип i)
(см. рис. 4, Б). При анализе К-субпопуляций САГ и ПАГ идентифицировали соответственно 5 и 9 из 11 этих MspI-HaeIII типов (см. рис. 4, Б). Четыре RFLP-типа (i, v, x и xi) преимущественно встречались у К-изолятов ПАГ (соответственно 0,12; 0,1; 0,18 и 0,27), тип i — у
К-изолятов САГ (0,57). При анализе П-субпопуляций ПАГ и САГ выявлено соответственно 5 и 6 из 11 идентифицированных MspI-HaeIII RFLP-типов. Среди П-изолятов из ПАГ
преобладали типы v, vii и ix (0,17, 0,15 и 0,32), из САГ — i и ii (по 0,27 для каждого).
Общими в К- и П-субпопуляциях были четыре RFLP-типа — i, v, vii и ix. Последний из перечисленных выявили у значительной части К- и П-изолятов ПАГ (частоты соответственно 0,27 и 0,32), в субпопуляциях САГ — только у единичных образцов. Типы v и vii
имелись преимущественно у К- и П-изолятов ПАГ (см. выше), тогда как в субпопуляциях
САГ их идентифицировали только дважды. Тип i (Rm1021) обнаружили с частотой соответственно 0,12 и 0,57 у К-изолятов из ПАГ и САГ и у единичных П-изолятов из обоих ГЦ.
Таким образом, RFLP-тип, характерный для Rm1021, выявлен преимущественно в Ксубпопуляции САГ (различия недостоверны; ?2 = 0,6; P > 01). Остальные 4 из 11 MspIHaeIII RFLP-типов, были идентифицированы у единичных К- и П-изолятов из ПАГ и САГ
(средняя частота соответственно 0,02 и 0,08).
Последовательность SMb20332 отсутствовала или была дивергентной с частотой
соответственно 0,12 и 0,23 у изолятов из САГ и ПАГ. Анализ 9 таких изолятов показал,
что у 3 из них указанная последовательность дивергентна, а у 6 отсутствует. Изоляты,
содержавшие дивергентную последовательность SMb20332, также имели дивергентную
структуру гена bet(Т)S и были солечувствительными, то есть у них нарушался механизм
формирования устойчивости к стресс-фактору.
Последовательность SMb20334, также прилегающую к гену bet(Т)S, изучали у 25
изолятов САГ и 66 изолятов ПАГ (см. рис. 4, В). Аллель аа доминировал у К- и П-изолятов
САГ и К-изолятов ПАГ (средняя частота по всем трем субпопуляциям 0,61), у П-изолятов
ПАГ был выявлен в 3 раза реже (0,19). Кроме того, у единичных К-изолятов САГ и ПАГ
имелись аллели ab и bb. Последовательность SMb20334 отсутствовала или была дивергентна
преимущественно у К-изолятов ПАГ (0,78) (у П-изолятов из этого же региона — 0,14). В
то же время в САГ аналогичные изоляты идентифицировали в основном среди П- (0,45), но
не К-изолятов (0,17). То есть в районе экстремального засоления П-изоляты преимущественно наследовали аллель аа, характерный для Rm1021, а в К-субпопуляции достоверно чаще
встречались изоляты, не содержавшие последовательность SMb20334 (?2 = 19,5; Р < 0,001).
Коэффициент гетерогенности (Н) определили для всех трех рамок считывания
(SMb20332-SMb20334). Высокий полиморфизм гена betТ(S) (SMb20333) выявили у К-изолятов ПАГ (0,63), тогда как у П-изолятов ПАГ и К- и П-изолятов САГ последовательность
гена консервативна (соответственно 0,30; 0,38 и 0,28). Коэффициент гетерогенности, определенный для SMb20332, указывал на высокий полиморфизм этой последовательности у
К- и П-изолятов САГ (соответственно 0,81 и 0,85) и ПАГ (0,70 и 0,77). Вторая прилегающая последовательность SMb20334 у К-изолятов САГ была гетерогеннее, чем у П-изолятов из того же региона (соответственно 0,70 и 0,51), тогда как в районе экстремального
засоления (ПАГ), наоборот, последовательность оказалась более гетерогенной у П-изолятов, чем у К-изолятов (соответственно 0,66 и 0,47).
Таким образом, высокий полиморфизм характерен для последовательности гена
betT(S) у К-изолятов и последовательности SMb20334 у П-изолятов ПАГ. У К- и П-изолятов
САГ выявлен низкий полиморфизм гена betT(S) и высокий — SMb20334. Исключение составила последовательность SMb20332, для которой полиморфизм оказался высоким у всех
изолятов ПАГ и САГ.
Частота изолятов S. meliloti, у которых все три последовательности локуса
SMb20332-SMb20334 дивергентны, составила 0,13. Изоляты, у которых отсутствовала
последовательность SMb20332 или SMb20333, встречались с равной частотой (0,30), не имеющие SMb20334 — значительно реже (0,09). Эти данные указывают, что последовательности SMb20332 и SMb20333 утрачивались в 3 раза чаще, чем SMb20334. Преимущественная делеция участка SMb20332-SMb20333 второй симбиотической мегаплазмиды S. meliloti
могла быть обусловлена присутствием элемента IS17 в межгенной области, расположенной перед SMb20332 (22).
Г е н о м о т и п и ч е с к и е к л а с с ы betC/betT(S) п р и р о д н ы х ш т а м-
52
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
м о в р и з о б и й. К- и П-изоляты ПАГ, САГ и СКГ объединили и распределили по
генотипическим классам согласно RFLP-типам генов betC и betT(S) (табл.). Из 12 выявленных классов 4 были доминирующими: к ним относились 232 из 319 изученных образцов (72 %). Частота генотипа А (присущ Rm1021) и В была сходной для К- и Пизолятов, однако и тот и другой генотип встречался у первых в 1,6 раза чаще, чем у
вторых (см. табл.). Интересно, что у П-изолятов, наследовавших аллель аа гена betC,
достоверно чаще наблюдалось отсутствие гена betT(S) (?2 = 6,99; Р < 0,01). При сравнении К- и П-субпопуляций из разных очагов разнообразия растений-хозяев оказалось,
что изоляты с генотипом А достоверно чаще встречались в К-субпопуляции ПАГ (?2 = 3,3;
Р < 0,1; данные не представлены), тогда как среди К- и П-изолятов из СКГ и САГ
преимущественного генотипа не выявили.
Распределение генотипов у природных штаммов Sinorhizobium meliloti по структурной
организации betC и betT(S) генов, солеустойчивости и симбиотической активности в
субпопуляциях клубеньковых (К) и почвенных (П) изолятов из ПАГ, СКГ и САГ
Доля, %
betГенотип
bet-RFLP-тип
betC
betT(S)
Частота генотипа
К
П
солеустойчивых
К
П
симбиотически
эффективных
К
П
A1
aa
aa
0,39
0,25
0,40
0,34
0,48***
0,17
B
ab
aa
0,35
0,22
0,42
0,34
0,24
0,44
С
аа
н/а
0,12
0,40**
0,14
0,23
0,16
0,11
D
ab
н/а
0,14
0,13
0,05
0,09
0,13
0,28
Всего изолятов
147
85
88
35
147
85
Доля изолятов, % (Х±х)
100
100
59,9±4,0
41,2±5,3
42,8±4,1
21,7±4,7
П р и м е ч а н и е. 1 — генотип, сходный с таковым у S. meliloti Rm1021; н/а — нет амплификата гена
betT(S); ПАГ, СКГ и САГ — генцентры (описание см. в разделе «Методика»).
** и *** Статистически достоверно (соответственно ?2 = 6,99; Р < 0,01 и ?2 = 19,38; Р < 0,01) (см. текст).
С о л е у с т о й ч и в о с т ь и с и м б и о т и ч е с к и е с в о й с т в а и з о л ятов ризобий с различной структурной организацией генов
betC и betT(S). Доля солеустойчивых среди К- и П-изолятов составила соответственно
59,9 и 41,2 % (см. табл.), однако эти различия недостоверны (?2 = 2,4; Р > 0,01), следовательно, выявление солеустойчивых изолятов в К- и П-субпопуляциях равновероятно. Солеустойчивые К- и П-изоляты преимущественно имели генотипы А и В, однако достоверных различий по их частоте между анализируемыми группами не обнаружили (?2 = 0,014; Р > 0,1). У солеустойчивых К- и П-изолятов также не наблюдалась
корреляция между наличием аллеля аа или ab гена betC и отсутствием гена betT(S).
Симбиотически эффективными были преимущественно солеустойчивые К-изоляты с генотипом А и П-изоляты с генотипом В (?2 = 5,7; Р < 0,02). Солечувствительные изоляты
достоверно чаще встречались в П-субпопуляции ПАГ (?2 = 9,25; Р < 0,01; данные не приведены). Оказалось, что солечувствительные П-изоляты преимущественно содержали аллель аа гена betC и не содержали гена betT(S) (?2 = 12,24; Р < 0,001) либо такие П-изоляты наследовали аллели генов betC и betT(S), отличные от описанных для типового
штамма Rm1021. Солечувствительные изоляты были преимущественно симбиотически
неэффективными. Следовательно, отсутствие гена betT(S) или структурные изменения в
последовательности гена приводили у ризобий к нарушениям в формировании устойчивости в ответ на воздействие солевого стресса.
Установлено, что эффективный симбиоз с люцерной посевной (Medicago sativa)
формировали около 42,8 % К- и не более 21,7 % П-изолятов. К-изоляты, преимущественно наследовавшие аллели генов betC и betT(S), характерные для Rm1021, образовывали
эффективный симбиоз с M. sativa и M. truncatula (соответственно ?2 = 5,35 и ?2=4,028;
Р < 0,05). Доля симбиотически неэффективных образцов была выше среди П-изолятов
(?2 = 10,29; P < 0,01). Достоверно чаще изоляты, несущие аллель ab гена betC, формировали неэффективный симбиоз либо c M. sativa (П-изоляты, ?2 = 11,97; P < 0,001), либо с
M. truncatula (К- и П-изоляты, соответственно ?2 = 12,1 при P <0,001 и ?2 = 4,4 при P < 0,05).
Корреляция между солеустойчивостью и симбиотической эффективностью была
выявлена только для К-изолятов (r = 0,76), у П-изолятов ее не обнаружили (r = 0,16).
Итак, впервые изучен полиморфизм bet-генов, вовлеченных в синтез и транспорт
осмопротекторов, в природных популяциях штаммов Sinorhizobium meliloti в очагах разнообразия люцерны, относящихся к четырем различным генцентрам культурных растений. Выявлены существенные различия между клубеньковыми и почвенными субпопуляциями ризобий люцерны по частоте аллелей bet-генов, локализованных на хромосоме и мегаплазмиде. В то же время по частоте bet-генотипов достоверных различий между субпопуляциями
не обнаружено. Впервые изучена взаимосвязь между bet-генотипом природных штаммов, их
солеустойчивостью и симбиотической эффективностью. Показано, что изоляты с betгенотипом, аналогичным таковому у типового штамма Rm1021, преобладали как в клубеньковой, так и в почвенной субпопуляциях ризобий, были солеустойчивыми и формировали эффективный симбиоз с люцерной посевной Medicago sativa и люцерной однолетней
M. truncatula. Изоляты S. meliloti, наследовавшие иные, чем у типового штамма Rm1021, аллели хромосомного гена betС, проявляли сниженную симбиотическую эффективность, а
имеющие дивергентную последовательность гена betT(S) или не содержавшие этот ген об-
53
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ладали измененной солеустойчивостью. Особо следует отметить, что самый высокий уровень полиморфизма выявлен в последовательностях bet-генов, локализованных на хромосоме и плазмиде, у изолятов СКГ (Северо-Кавказский генцентр). Географический район,
в котором собирали образцы, представляет собой часть первичного центра разнообразия
диплоидных форм люцерны, и здесь влияние растения-хозяина на генетическую стабильность микросимбионтов может иметь большее значение, чем эффект абиотических стрессфакторов. В пользу этого свидетельствует тот факт, что изменения обнаружены преимущественно у изолятов, выделенных из клубеньков. В районе, испытывающем вторичное
засоление (Приаралье), главную роль, очевидно, играют процессы адаптации к стрессфактору (засолению), что подтверждается выявлением структурных перестроек в bet-генах
преимущественно у почвенных изолятов S. meliloti.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
Ш а м с у т д и н ов З.Ш., С а в ч е н к о И.В., Ш а м с у т д и н о в Н.З. Галофиты России, их
экологическая оценка и использование. М., 2000.
Z a h r a n H.H. Rhizobium-legume symbiosis and nitrogen fixation under severe conditions and in an arid
climate. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1999, 63: 968-989.
И б р а г и м о в а М.В., Р у м я н ц е в а М.Л., О н и щ у к О.П. и др. Симбиоз клубеньковых бактерий
Sinorhizobium meliloti с люцерной Medicago sativa в условиях засоления. Микробиология, 2006, 75: 94-100.
M i l l e r K.J., W o o d J.M. Osmoadaptation by rhizosphere bacteria. Review. Annu. Rev. Microbiol.,
1996, 50: 101-136.
B o n c o m p a g n i E., О s t e r a s M., P o g g i M.C., L e R u d u l i e r D. Occurrence of choline
and glycine betaine uptake and metabolism in the family Rhizobiaceae and their roles in osmoprotection.
Appl. Environ. Microbiol., 1999, 65: 2072-2077.
H i n c h a D.K., H a g e m a n n M. Stabilization of model membranes during drying by compatible solutes involved in the stress tolerance of plants and microorganisms. Biochem. J., 2004, 383: 277-283.
S m i t h L.T., P o c a r d I.A., B e r n a r d T., L e R u d d i e r D. Osmotic control of glycine betaine biosynthesis and degradation in Rhizobium meliloti. J. Bacteriol., 1988, 170: 3142-3149.
L a m a r k T., K a a s e n I., E s h o o M. W., F a l k e n b e r g P., M c D o u g a l l J., S t r o m A.R. DNA sequence
and analysis of the bet genes encoding the osmoregulatory choline-glycine betaine pathway of Escherichia coli.
J. Mol. Microbiol., 1991, 5: 1049-1064.
O s t e r a s M., B o n c o m p a g n i E., V i n c e n t N. e.a. Presence of a gene encoding choline sulfatase in Sinorhizobium meliloti bet operon: choline-O-sulfate is metabolized into glycine betaine. PNAS, 1998, 95: 11394-11399.
B o s c a r i A., M a n d o n K., D u p o n t L. e.a. BetS is a major glycine betaine/proline betaine transporter required for early osmotic adjustment in Sinorhizobium meliloti. J. Bacteriol., 2002, 184: 2654-2663.
B o s c a r i A., V a n d e S y p e G., L e R u d u l i e r D., M a n d o n K. Overexpression of BetS,
a Sinorhizobium meliloti high-affinity betaine transporter, in bacteroids from Medicago sativa nodules sustains
nitrogen fixation during early salt stress adaptation. MPMI, 2006, 19: 896-903.
G a l i b e r t F., F i n a n T.M., L o n g S.R. e.a. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science, 2001, 293: 668-672.
В а в и л о в Н.И. Центры происхождения культурных растений. Тр. по прикл. бот. и сел., 1926, 16(2): 3-138.
Ж у к о в с к и й П.М. Мировой генофонд растений для селекции. В кн.: Вавилов и сельскохозяйственная наука. М., 1971: 120-202.
К о р о в и н а О.Н. Н.И. Вавилов о первичных центрах происхождения культурных растений. Ботанический журнал, 1987, 6: 721-731.
И в а н о в А.И. Люцерна. М., 1980.
Р у м я н ц е в а М.Л. Генетические ресурсы клубеньковых бактерий (обзор). Генетика, 2009, 45: 1-15.
М а н и а т и с Т., Ф р и ч Э., С э м б р у к Дж. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. М., 1984.
R o u m i a n t s e v a M.L., A n d r o n o v E.E., S h a r y p o v a L.A. e.a. Diversity of Sinorhizobium
meliloti from the Central Asian alfalfa gene center. Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68: 4694-4697.
N e i M. Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small sample of individuals. Genetics, 1978, 89: 583-590.
G i u n t i n i E., Me n g o n i A., D e F i l i p p o C. e.a. Large-scale genetic variation of the symbiosis-required megaplasmid pSymA revealed by comparative genomic analysis of Sinorhizobium meliloti natural
strains. BMC Genomics, 2005, 158, doi:10.1186/147-2164-6-158.
P i t s i k E.V., A n d r o n o v E.E., R o u m i a n t s e v a M.L., S i m a r o v B.V. The investigation
of the betS gene polymorphism of the SymB plasmid in nodule bacteria Sinorhizobium meliloti. Abstr. of
Postgraduate Course «Applied and fundamental aspects of responses, signaling and developmental process in
the root-microbe systems» and Meeting of the Research Consortium on Evolution of Plant-Microbe Interactions. St.-Petersburg, 2007: 42.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
16 февраля 2011 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: mroumiantseva@yandex.ru, genet@yandex.ru
POLYMORPHISM OF bet-GENES AMONG Sinorhizobium meliloti ISOLATES
NATIVE TO GENE CENTERS OF ALFALFA
M.L. Roumiantseva, V.S. Belova, O.P. Onishchouk, E.E. Andronov, O.N. Kurchak,
E.P. Chizhevskaya, T.B. Rumyantseva, B.V. Simarov
Summary
Polymorphism of chromosomal gene betC and plasmid localized loci betT(S) involved in osmoprotectants
synthesis and transport was studied among 319 native isolates of Sinorhizobium meliloti, recovered from nodules and soil
samples at four geographically distant gene centers of alfalfa. The significant difference between nodule and soil groups
of isolates was shown by allelic rate of betC and betT(S) genes. Four dominant genotyping bet-classes among native isolates have similar popularity among nodule and soil groups of S. meliloti isolates. The linear correlation between salt
tolerance of rhizobia and their symbiotic effectivity was revealed (r = 0,76). Proceeded data specified that bet-genes
polymorphism at the north of Caucus gene center of alfalfa have been caused mainly by host-plant influence, whereas
in salt affected area (Aral Sea region) the adaptation processes to abiotic stress factor have had a crucial role.
54
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 633.31:581.557:631.461.5:575:575.224.46
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕТОДА САЙТ-НАПРАВЛЕННОГО МУТАГЕНЕЗА
ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ФУНКЦИЙ ГЕНА SMb20332 У КЛУБЕНЬКОВЫХ
БАКТЕРИЙ Sinorhizobium meliloti
Е.П. ЧИЖЕВСКАЯ, О.П. ОНИЩУК, Е.Е. АНДРОНОВ, Б.В. СИМАРОВ
С использованием сайт-направленного мутагенеза у типового штамма 1021 клубеньковых бактерий люцерны Sinorhizobium meliloti получен мутант по гену SMb20332. Этот ген расположен на мегаплазмиде 2 и по результатам секвенирования предположительно кодирует арилсульфатазу. У полученного мутанта ACH-5 тестировали симбиотические свойства, солеустойчивость и способность к росту на диагностических средах. Обнаружено,
что арилсульфатазы клубеньковых бактерий, как и арилсульфатазы морских бактерий, способны десульфатировать агаропектин. Мутация по гену SMb20332 не оказывала существенного влияния на солеустойчивость штамма
1021 S. meliloti, а также на его эффективность и конкурентоспособность при симбиозе с Medicago sativa (сорт Вега). Впервые показано, что у штамма 1021 S. meliloti мутация по гену SMb20332 приводит к изменению поверхностных полисахаридов и утрате устойчивости к ингибитору дыхания бактерий — гербициду 2М-4ХМ.
Ключевые слова: Sinorhizobium meliloti, арилсульфатаза, продукция полисахаридов, устойчивость к
гербициду, солеустойчивость, конкурентоспособность, симбиотическая эффективность.
Keywords: Sinorhizobium meliloti, arylsulphatase, production of polysaccharides, herbicide resistance, salt
tolerance, competitiveness, symbiotic effectiveness.
Клубеньковые бактерии люцерны (Sinorhizobium meliloti) способны фиксировать молекулярный азот атмосферы в симбиозе с бобовыми растениями — люцерной, донником
и пажитником. Геном этого микроорганизма представлен хромосомой и двумя гигантскими мегаплазмидами, размер которых варьирует от 1100 до 1900 т.п.н. (1). Так, у типового штамма 1021 S. meliloti размер мегаплазмид 1 (pSymA) и 2 (pSymB) составляет соответственно 1354 т.п.н. и 1683 т.п.н. (2, 3). К настоящему времени геном штамма 1021
полностью секвенирован, однако функции многих генов остаются неизвестными (2-4).
Ген SMb20332 штамма 1021 S. meliloti расположен на мегаплазмиде 2 и по результатам секвенирования предположительно кодирует фермент арилсульфатазу (3). Выбор
указанного гена как объекта исследования был обусловлен следующими причинами. Рядом с геном SMb20332 расположен ген betT (SMb20333) (рис. 1, А), вовлеченный в транспорт осмопротектора глицин-бетаина (3, 5). Ген betT конститутивно экспрессируется как
у свободноживущих штаммов S. meliloti, так и в условиях симбиоза с растением-хозяином
(в инфекционных нитях и бактероидах) (5, 6). Функции второго смежного гена SMb20331
неизвестны, но показано, что он экспрессируется в условиях осмотического шока (7). Таким образом, изучаемый ген SMb20332 находится в окружении генов, связанных с контролем такого экологически важного признака как солеустойчивость, поэтому логично
было предположить участие арилсульфатазы в контроле солеустойчивости у S. meliloti.
Для проверки этой гипотезы и выявления функций гена SMb20332 с использованием сайт-направленного мутагенеза мы получили мутант по этому гену и охарактеризована его солеустойчивость, симбиотические и культурально-биохимические свойства.
Методика. Объектами исследования служили типовой штамм 1021 клубеньковых
бактерий люцерны S. meliloti (SmR, мутант природного штамма SU47) (8) и полученный на
его основе мутант по гену SMb20332, обозначенный нами как ACH-5. Также в работе использовали штаммы Eshchericha coli: DH5? [F-, recA1, endA1, gyrA96, hsdR17, deoR, ?(lacZYAargF)U169] (9) — для трансформации клеток плазмидами и S17-1 (SmR), содержащий
интегрированную в хромосому модифицированную плазмиду pRP4 (Tc::Mu, Km::Tn7)
(10), — в качестве мобилизующего штамма для конъюгационного переноса плазмид в
клетки S. meliloti. Использованные плазмиды: вектор для А/Т клонирования pTZ57R/T
(lacZ::M13mp, ApR) («MBI Fermentas», Литва), pK18mob (mob, lacZ::M13mp, ApR, KmR) (11),
pMP4655 (содержит ген gfp под контролем Plac в pME6010, TcR) (12).
Клубеньковые бактерии S. meliloti культивировали при 28 °С на среде TY (13).
При выращивании в жидкой среде проводили дополнительную аэрацию на лабораторной качалке в режиме 180 об/мин. В селективные среды добавляли антибиотики Sm и
Km (соответственно 800 и 200 мг/л). Штаммы E. coli выращивали при 37 °С на среде LB
(14) (в жидкой среде — с аэрацией 220 об/мин), в селективные среды добавляли антибиотики Ap, Sm, Km и Tc (соответственно 100, 100, 50 и 15 мг/л).
Солеустойчивость штаммов тестировали в жидкой и на агаризованной среде
TY, содержащей различные концентрации NaCl, по методике, приведенной ранее (15).
Для определения изменений в синтезе полисахаридов использовали среду 79 (16)
и среду 79, содержащую индикатор восстановительных эквивалентов хлорид трифенилтетразолия (TTХ, 0,01 %). Устойчивость к гербициду тестировали на среде 79 с добавлением 2-метил-4-хлорфеноксимасляной кислоты (2М-4ХМ, 0,1 %), ингибирующей дыхание бактерий (17). Также использовали стандартные среды: минимальную (18) — для
анализа слизеобразования, минимальную с добавлением красителя Конго красный
(0,02 %) — для оценки продукции липо- и экзополисахаридов (ЛПС и ЭПС) (19, 20),
минимальную c добавлением калькофлуора (0,02 %) — для анализа продукции ЭПС1
55
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
(сукциноглюкана) (19, 21). Рост штаммов в отсутствие неорганического сульфата анализировали в жидкой и на агаризованной минимальной среде без добавления MgSO4.
Геномную ДНК S. meliloti выделяли по стандартной методике (22), плазмидную из
клеток E. coli — общепринятым методом щелочного лизиса (14). Реакции рестрикции и лигирования, электрофорез в агарозном геле и выделение фрагментов ДНК из геля осуществляли с помощью стандартных приемов (14). Плазмиды вводили в штаммы E. coli методом
высокоэффективной трансформации (23). ПЦР-амплификацию фрагмента ДНК, содержащего ген SMb20332, проводили с использованием сконструированных нами праймеров betS1F (5ґ-GCTTCTTCTTCCTGCCATCA-3ґ) и betS1-R (5ґ-CACCTTCTTTTCGGACGGTA-3ґ).
При конъюгации ночные культуры мобилизующего штамма-донора S17-1 E. coli
и штамма-реципиента 1021 S. meliloti смешивали в соотношении 1:5 и переносили каплями на поверхность твердой среды TY. После впитывания капель конъюгационную
смесь инкубировали в течение 1 сут при 28 °С. Выросшие бактериальные клетки суспендировали в 1 мл стерильной воды, готовили 10- и 100-кратные разведения и высевали по 0,1 мл суспензии на среду 79, содержащую Km (200 мг/л). Отбор и анализ трансконъюгантов S. meliloti проводили на 4-5-е сут.
Симбиотические свойства штаммов изучали в условиях стерильного микровегетационного опыта (24), в качестве растения-хозяина использовали люцерну посевную Medicago sativa (сорт Вега). Инокуляцию проростков люцерны проводили 1 мл суспензии клеток
клубеньковых бактерий (105-106 кл/мл). Растения выращивали в теплице при температуре
20-22 °С, дополнительном освещении 20 000 лк и 16-часовом фотопериоде в течение 2830 сут, повторность опытов 6-кратная. Скорость клубенькообразования (25) определяли
при подсчете клубеньков на корнях
растений на 6-е, 14-е и 19-е сут
после инокуляции. Симбиотическую эффективность штаммов
оценивали по сухой массе надземных частей инокулированных
растений относительно контроля
без инокуляции на 30-е сут вегетации. Нодуляционную конкурентоспособность определяли по соотношению числа клубеньков,
образованных мутантом при совместной инокуляции с родительским штаммом 1021 S. meliloti.
Штаммы смешивали в растворе
микроэлементов при равной оптической плотности суспензий,
полученную смесь (?108 кл/мл)
использовали для инокуляции 2суточных проростков люцерны.
Через 30 сут после инокуляции
бактерии выделяли из клубеньков
и анализировали их рост на среде TY и среде TY с антибиотиками. Долю клубеньков, содержащих Kmr клоны (мутант), сопоставляли с долей Kmr клонов в исходном инокулюме, которую определяли после высева на среду
TY с антибиотиками (25, 26).
Для статистической обработки данных использовали tкритерий Стьюдента.
Результаты. П о л у ч ен и е м у т а н т а ACH-5. Для
мутагенеза гена SMb20332 был
Рис. 1. Этапы конструирования плазмиды pK18mob/gfp-332 (опиприменен широко известный месание см. в тексте): А — локус SMb20332 штамма 1021 Sinorhizoтод сайт-направленной интеграbium meliloti, Б — ПЦР-амплифицированный фрагмент ДНК, соции плазмиды pK18mob в геном
держащий ген SMb20332, В — ПЦР-амплифицированный фрагмент
родительского штамма 1021 S. meliДНК, содержащий ген SMb20332 и часть полилинкера вектора
pTZ57R/T, Г — SalI-фрагмент, содержащий первые 404 п.н. коloti. Плазмида pK18mob (размер
дирующей области гена SMb20332, Д — плазмида pK18mob/gfp-332,
3,8 т.п.н.) является мультикопийнесущая ген gfp и фрагмент гена SMb20332 в векторе pK18mob; сайным вектором для клонирования
ты рестрикции В, Е, Н, Р, S и Х — соответственно BamHI, EcoRI,
фрагментов ДНК, несет ген усHindIII, PstI, SalI и XbaI.
тойчивости к канамицину и содержит полилинкер плазмиды pUC18 (11). Плазмида pK18mob как мобилизуемый вектор
при конъюгации с использованием плазмиды-помощника или мобилизующего штамма может передаваться из клеток E. coli в широкий круг грамотрицательных и грамположительных бактерий (27). Однако pK18mob способна реплицироваться только в бактериях, отно-
56
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
сящихся к родам Escherichia, Salmonella и Serratia (так как имеет ориджин репликации
плазмиды pMB1) (28). Таким образом, сохранение вектора pK18mob в клетках клубеньковых бактерий может происходить лишь в результате его интеграции в геном. При
правильном подборе области гомологии можно добиться интеграции вектора в строго
определенную часть генома, в том числе в кодирующую область изучаемого гена, что
приведет к нарушению его функции.
Конструирование плазмиды pK18mob/gfp-332, содержащей область гомологии,
включало несколько этапов. Сначала был получен вариант вектора pK18mob, несущий
ген gfp (green fluorescent protein) под контролем промотора P(lac), что дало дополнительный маркер при наблюдениях за мутантным штаммом в вегетационных опытах. Для
этого BamHI-XbaI фрагмент (753 п.н.), несущий ген gfp, был вырезан из плазмиды
pMP4655 (12) и клонирован в соответствующие сайты полилинкера pK18mob. Далее с
помощью праймеров betS1-F и betS1-R был амплифицирован фрагмент генома штамма
1021 S. meliloti (1963 п.н.), содержащий ген SMb20332 (см. рис. 1, Б). ПЦР-фрагмент был
клонирован в векторе pTZ57R/T, затем из полученной плазмиды с использованием праймеров M13-rev (26) и betS1-R был реамплифицирован фрагмент с прилегающей частью полилинкера вектора pTZ57R/T (см. рис. 1, В). Из этого ПЦР-фрагмента был вырезан SalIфрагмент (1148 п.н.), содержащий первые 404 п.н. кодирующей области гена SMb20332 (см.
рис. 1, Г), и клонирован в SalI сайт полилинкера pK18mob-gfp. Далее при BamHI-рестрикционном анализе были отобраны плазмиды, несущие клонированный фрагмент ризобиальной ДНК в определенной ориентации относительно полилинкера pK18mob и гена gfp
(см. рис. 1, Д). Сконструированная плазмида (pK18mob/gfp-332) методом трансформации была перенесена в мобилизующий штамм S17-1 E. coli. Затем был проведен конъюгационный перенос pK18mob/gfp-332 из штамма S17-1 в штамм S. meliloti 1021 и отбор
KmRGFP+ трансконъюгантов. Появление KmRGFP+ клонов S. meliloti указывает на интеграцию pK18mob/gfp-332 в геном штамма 1021 по участку гомологии (рис. 2, А), что
нарушает целостность открытой рамки считывания гена SMb20332 (см. рис. 2, Б).
Рис. 2. Схема сайт-направленного мутагенеза гена SMb20332: А — гомологичная рекомбинация участка генома
штамма 1021 Sinorhizobium meliloti и фрагмента плазмиды pK18mob/gfp-332, Б — интеграция плазмиды
pK18mob/gfp-332 в ризобиальный геном по участку гомологии.
С о л е у с т о й ч и в о с т ь. Поскольку ген SMb20332 расположен в одном локусе с генами, участвующими в контроле солеустойчивости у штаммов S. meliloti, мы
изучили способность мутанта ACH-5 и его родительского штамма 1021 к росту в жидкой и на агаризованной среде TY с различным содержанием NaCl. В жидкой среде с
2,0 % NaCl у мутанта ACH-5 и штамма 1021 рост был нормальный, а при 4,5 % NaCl —
полностью отсутствовал. При содержании 3,5 % NaCl у штамма 1021 наблюдался нестабильный рост, а у мутанта ACH-5 — отсутствие роста. На агаризованной среде у мутанта и его родительского штамма рост не различался: при добавлении 2,0 % NaCl рост
был нормальным, а при 3,0 и 3,5 % NaCl — отсутствовал. Таким образом, мутация в
гене SMb20332 у штамма 1021 S. meliloti привела только к утрате его способности к неустойчивому росту в жидкой среде TY с 3,5 % NaCl.
С и н т е з п о л и с а х а р и д о в и у с т о й ч и в о с т ь к г е р б и ц и д у 2М4ХМ. При тестировании способности к слизеобразованию, а также росту и окрашиванию
клонов на диагностических средах, используемых для анализа состава поверхностных полисахаридов (табл. 1), оказалось, что по росту на минимальной среде мутант ACH-5 не отличался от своего родительского штамма. На минимальной среде c добавлением калькофлуора
у колоний, сформированных как мутантным, так и родительским штаммами, наблюдалось
характерное свечение в УФ-свете, указывающее на продукцию сукциноглюкана (ЭПС-1).
Однако при добавлении в минимальную среду красителя Конго красного было обнаружено
различие в интенсивности окраски: родительский штамм формировал колонии яркого
57
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
красно-розового цвета, а мутант ACH-5 — бледно-розового. Изменение окраски штаммов
на среде с Конго красным определяется главным образом адсорбционными свойствами их
клеточных стенок и указывает на различия в строении поверхностных полисахаридов (19).
Кроме того, полученный мутант характризовался сниженным слизеобразованием при росте на среде 79, что также указывает на изменение способности к синтезу полисахаридов. На среде 79 с TTХ колонии различались: штамм 1021 формировал яркокрасные колонии с узким белым ободком (окрашено около 90 % площади колонии), а
мутант ACH-5 — белые колонии с окрашенной центральной частью (менее 20 % площади). Окрашивание колоний на среде с ТТХ зависит от окислительно-восстановительного потенциала клеток и наиболее интенсивно проявляется при ограниченном доступе
кислорода (29). Родительский штамм 1021 продуцирует большое количество внеклеточных полисахаридов (слизи), в связи с чем его клетки находятся в микроаэробных условиях и интенсивно окрашиваются на среде с ТТХ. Мутант ACH-5 формирует малослизистые колонии, поэтому окрашивание наблюдается лишь внутри глубинной центральной части колоний, где клетки могут испытывать недостаток кислорода.
1. Показатели роста у родительского (1021) и полученного мутантного (АСН-5) штаммов Sinоrhizobium meliloti на диагностических средах
Штамм
без добавок
Минимальная среда
с калькос Конго
флуором
красным
Среда 79
без добавок
с ТТХ
с ТТХ и
2М-4ХМ
1021
Белые мало- Свечение в
Колонии красно- Нормальное Колонии красного Колонии беслизистые ко- УФ-свете
розового цвета
слизеобразо- цвета с узким белым лого цвета
лонии
вание
ободком, слизистые
ACH-5 Белые мало- Свечение в
Колонии розово- Сниженное Колонии белого цве-Нет роста
слизистые ко- УФ-свете
го цвета
слизеобта с красным центлонии
разование
ром, менее слизистые
П р и м е ч а н и е. TTХ — хлорид трифенилтетразолия, 2М-4ХМ — 2-метил-4-хлорфеноксимасляная кислота.
Родительский штамм 1021 был способен к росту на среде 79, содержащей ТТХ и
гербицид 2М-4ХМ, однако при этом его клетки утрачивали способность к окрашиванию.
Вероятно, гербицид 2М-4ХМ вызывает у штамма 1021 снижение активности функционирования дыхательной цепи транспорта электронов и, как следствие, изменение окислительно-восстановительного потенциала клеток. В отличие от родительского штамма у
мутанта ACH-5 наблюдалось полное подавление роста на среде с 2М-4ХМ (см. табл. 1).
Р о с т в о т с у т с т в и е н е о р г а н и ч е с к о г о с у л ь ф а т а. Известно,
что арилсульфатазы морских бактерий способны осуществлять гидролиз агаропектина
(компонента агара) с высвобождением сульфата (31-33). В связи с этим мы тестировали
аналогичные свойства изучаемых штаммов. В жидкой бессульфатной среде наблюдалось
полное отсутствие роста как родительского, так и мутантного штаммов. Однако на агаризованной бессульфатной среде рост отсутствовал только у мутанта ACH-5, а родительский штамм формировал нормальные колонии. Поскольку единственным источником сульфата в используемой среде был агар, мы сделали заключение, что продукт гена
SMb20332 способен десульфатировать агаропектин. Освобождающийся при этом сульфат полностью покрывал его дефицит в исходной среде, что позволяло штамму 1021
S. meliloti осуществлять нормальный рост в условиях сульфатного голодания.
Симбиотиче2. Динамика клубенькообразования и симбиотическая эфс
к
и
е
с
в о й с т в а у и з уфективность у исходного (1021) и полученного мутантч а е м ы х ш т а м м о в. По
ного (АСН-5) штаммов Sinоrhizobium meliloti на корнях
скорости клубенькообразолюцерны посевной Medicago sativa сорта Вега (Х±х)
вания и симбиотической эфЧисло клубеньков, шт.
Масса расфективности мутант ACH-5
Штамм
6-е сут 14-е сут 19-е сут тений, мг
и его родительский штамм
1021
0
0,5±0,3
1,7±0,3
15,4±2,0
достоверно не различались
ACH-5
0
0,5±0,3
1,3±0,6
14,0±2,0
(табл. 2). Также достоверно
Контроль (без инокуляции)
0
0
0
7,8±2,0
не различалась нодуляционная конкурентоспособность мутанта ACH-5 и его родительского штамма при совместной инокуляции (в соотношении близком 1:1). В исходном инокулюме доля клеток
ACH-5 и штамма 1021 составила соответственно 43,6±6,15 и 56,4±6,15 %, а из образовавшихся клубеньков изучаемые штаммы были выделены в соотношении соответственно 33,3±7,36 и 67,7±7,36 %.
Внесение в среду для выращивания растений повышенной концентрации NaCl
(0,3 %) не приводило к достоверному изменению конкурентоспособности штаммов: в
исходном инокулюме клетки мутанта ACH-5 составляли 56,8±7,50 %, в клубеньках —
58,1±5,12 %. Таким образом, результаты проведенных микровегетационных опытов показали, что мутация в гене SMb20332 не влияет на основные симбиотические свойства
штамма 1021 S. meliloti при симбиозе с M. sativa (сорт Вега).
Таким образом, мы представили анализ некоторых культурально-биохимических и симбиотических свойств у мутанта S. meliloti по гену SMb20332. Ген SMb20332
предположительно кодирует арилсульфатазу, однако его функции до конца не известны (3). Арилсульфатазы (арилсульфат-сульфогидролазы, EC 3.1.6.l) — ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз ароматических сульфокислот по связи О–S:
H2O + Aryl-O-SO3? ? Aryl-OH + SO42? + H+. Арилсульфатазы обнаружены во всех ос-
58
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
новных группах организмов (животные, растения, грибы, бактерии) и представляют собой
высококонсервативное семейство ферментов (34). Отсутствие некоторых арилсульфатаз
у человека вызывает тяжелое заболевание — метахроматическую лейкодистрофию. Среди
прокариотов арилсульфртазы наиболее изучены у патогенных и условно патогенных бактерий, например у Klebsiella pneumoniae (35), Salmonella typhimurium (36), Pseudomonas aeruginosa (37), E. coli (38). При этом показано, что арилсульфатазы могут играть важную роль
в преодолении гематоэнцефалического барьера и, как следствие, влиять на патогенность штаммов (38). При изучении арилсульфатаз у морских бактерий, таких как Alteromonas carrageenovora, A. atlantica, Sphingomonas sp. была обнаружена способность осуществлять десульфатирование агаропектина, представляющего собой составную часть агара —
структурного полисахарида клеточных стенок красных водорослей (31-33).
У почвенных бактерий арилсульфатазы почти не изучены, однако предполагают,
что в бедных почвах при недостатке неорганического сульфата этот фермент может принимать участие в снабжении клеток сульфатом, гидролизуя некоторые компоненты гуминовых кислот, например 2-гидрокси-5-нитрофенилсульфат и фенилсульфат (39). У клубеньковых бактерий арилсульфатазы не изучались, поэтому об их функциях (как у свободноживущих клеток, так и в условиях симбиоза с растениями) ничего не известно.
Однако при полном секвенировании геномов у некоторых представителей семейства
Rhizobiaceae, например S. meliloti (2-4), S. medicae, Rhizobium leguminosarum bv. viciae (40),
R. leguminosarum bv. trifolii, R. etli, Agrobacterium radiobacter (41), были обнаружены гены,
сходные с генами арилсульфатаз других бактерий.
Ген SMb20332 у штамма 1021 клубеньковых бактерий люцерны, предположительно
кодирующий арилсульфатазу, как уже отмечалось, расположен в окружении генов, участвующих в контроле солеустойчивости (3, 5-7). Кроме того, известно, что фермент из семейства сульфатаз — холинсульфатаза кодируется геном betC, который входит в состав betICBAоперона, ответственного за синтез глицин-бетаина и относящегося к одной из систем защиты клеток от осмотического шока (42). В связи с этим мы выдвинули предположение об
участии арилсульфатазы в контроле солеустойчивости у ризобиальных штаммов.
Однако мутация в гене SMb20332 существенно не повлияла на солеустойчивость штамма 1021 S. meliloti, а также на его основные симбиотические свойства — эффективность, скорость образования клубеньков и нодуляционную конкурентоспособность при симбиозе с M. sativa (сорт Вега).
Обнаруженная у родительского штамма 1021 способность к росту на агаризованной бессульфатной среде и ее утрата у мутанта по гену SMb20332 указывают на то,
что арилсульфатазы клубеньковых бактерий (как и арилсульфатазы морских бактерий)
способны осуществлять десульфатирование агаропектина.
У полученного мутанта ACH-5 выявлены особенности культурально-морфологических свойств, свидетельствующие об изменениях в синтезе поверхностных полисахаридов по сравнению с родительским штаммом. Также обнаружено, что мутация в гене SMb20332 приводит к утрате устойчивости штамма 1021 к гербициду 2М-4ХМ. Отметим, что механизм устойчивости штамма 1021 S. meliloti к этому гербициду неизвестен. Возможно, он связан со способностью продуцировать большое количество внеклеточных полисахаридов, адсорбирующих гербицид и тем самым ослабляющих его действие. В этом случае снижение количества синтезируемых полисахаридов и/или изменение их состава, которое наблюдалось у мутанта ACH-5, может опосредованно влиять на
устойчивость штамма к гербицидам.
Итак, нами получен мутант ACH-5, содержащий удобный маркер (ген gfp в составе интегрированной в геном плазмиды pK18mob), который может быть в дальнейшем
использован в экспериментах по изучению механизмов взаимодействия микроорганизмов в ризосфере и почве (43, 44). Впервые показано, что арилсульфатаза влияет на синтез внеклеточных полисахаридов клубеньковых бактерий люцерны, однако конкретный
механизм этого влияния требует дальнейшего изучения.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
G u o H., S u n S., E a r d l y B. e.a. Genome variation in the symbiotic nitrogen-fixing bacterium Sinorhizobium meliloti. Genome, 2009, 52(10): 862-75.
B a r n e t t M.J., F i s h e r R.F., J o n e s T. e.a. Nucleotide sequence and predicted functions of the entire Sinorhizobium meliloti pSymA megaplasmid. PNAS, 2001, 98(17): 9883-9888.
F i n a n T.M., W e i d n e r S., W o n g K. e.a. The complete sequence of the 1,683-kb pSymB megaplasmid
from the N2-fixing endosymbiont Sinorhizobium meliloti. PNAS, 2001, 98(17): 9889-9894.
C a p e l a D., B a r l o y - H u b l e r F., G o u z y J. e.a. Analysis of the chromosome sequence of the legume
symbiont Sinorhizobium meliloti strain 1021. PNAS, 2001, 98(17): 9877-9882.
B o s c a r i A., M a n d o n K., D u p o n t L. e.a. BetS is a major glycine betaine/proline betaine transporter
required for early osmotic adjustment in Sinorhizobium meliloti. J. Bacteriol., 2002, 184(10): 2654-2663.
B o s c a r i A., V a n d e S y p e G., L e R u d u l i e r D. e.a. Overexpression of BetS, a Sinorhizobium
meliloti high-affinity betaine transporter, in bacteroids from Medicago sativa nodules sustains nitrogen fixation during
early salt stress adaptation. Mol. Plant Microbe Interact., 2006, 19: 896-903.
D o m i n g u e z - F e r r e r a s A., P e t e r - A r n e d o R., B e c k e r A. e.a. Transcriptome profiling reveals the
importance of plasmid pSymB for osmoadaptation of Sinorhizobium meliloti. J. Bacteriol., 2006, 188(21): 7617-7625.
M e a d e H.M., L o n g S.R., R u v k u n G.B. e.a. Physical and genetic characterization of symbiotic and
auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon mutagenesis. J. Bacteriol., 1982, 149(1): 114-122.
G r a n t S.G.N., J e s s e e J., B l o o m F.R. e.a. Differential plasmid rescue from transgenic mouse DNAs
into Escherichia coli methylation-restriction mutant. PNAS, 1990, 87: 4645-4649.
S i m o n R., P r i e f e r U., P u h l e r A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engenering: Transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Biotechnology, 1983, 1(11): 784-791.
S c h a f e r A., T a u c h A., J a g e r W. e.a. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the
59
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
Escherichia coli plasmids pK18 and pK19 selection of defined deletions in the chromosome Corynebacterium glutamicum. Gene, 1994, 145: 69-73.
B l o e m b e r g G.V., W i j f j e s A.H.M., L a m e r s G.E.M. e.a. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. MPMI, 2000, 13(11): 1170-1176.
B e r i n g e r J.E. R1 transfer in Rhizobium leguminosarum. J. Gen. Microbiol., 1974, 84: 188-198.
М а н и а т и с Т., Ф р и ч Э., С э м б р у к Дж. Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование. М., 1984.
И б р а г и м о в а М.В., Р у м я н ц е в а М.Л., О н и щ у к О.П. и др. Симбиоз клубеньковых бактерий
Sinorhizobium meliloti с люцерной Medicago sativa в условиях засоления. Микробиология, 2006, 75(1): 94-100.
A l l e n O.N. Experiments in soil bacteriology. Burgess Publishing Co., Minneapolis, 1959: 54.
Ш а м ш у р и н А.А., К р и м е р М.З. Физико-химические свойства пестицидов: Справочник. М., 1976.
P o o l e P.S., S c h o f i e l d N.A., R e i d C.J. e.a. Identification of chromosomal genes located downstream of dctD that affect the requirement for calcium and the lipopolysaccharide layer of Rhizobium leguminosarum. Microbiology, 1994, 140(10): 2797-2809.
З а т о в с к а я Т.В., У ш а к о в К.В., Ю р г е л ь С.Н. и др. Получение Tn5-мутантов Rhizobium meliloti с
измененным составом липополисахаридов и анализ их симбиотических свойств. Генетика, 1998, 34(6): 742-748.
О н и щ у к О.П., Ш а р ы п о в а Л.А., К у р ч а к О.Н. и др. Выявление генов Sinorhizobium meliloti, влияющих на синтез поверхностных полисахаридов и конкурентоспособность. Генетика, 2005, 41(12): 1617-1623.
C l o v e r R.H., K i e b e r J., S i g n e r E.R. Lipopolysaccharide mutants of Rhizobium meliloti are not defective in symbiosis. J. Bacteriol., 1989, 171(7): 3961-3967.
M e a d e H.M., L o n g S.R., R u v k u n G.B. e.a. Physical and genetic characterization of symbiotic and
auxotrophic mutants of Rhizobium meliloti induced by transposon mutagenesis. J. Bacteriol., 1982, 149(1): 114-122.
H i r o a k i I., N o g i m a H., O k a y a m a H. High efficiency transformation of Escherichia coli with
plasmids. Gene, 1990, 96: 23-28.
Ф е д о р о в С.Н., С и м а р о в Б.В. Получение мутантов с измененными симбиотическими свойствами
у Rhizobium meliloti под действием УФ-лучей. С.-х. биол., 1987, 9: 44-49.
O n i s h c h u k O.P., S h a r y p o v a L.A., S i m a r o v B.V. Isolation and characterization of the Rhizobium
meliloti Tn5-mutants with impaired nodulation competitiveness. Plant and Soil, 1994, 167: 267-274.
О н и щ у к О.П., К у р ч а к О.Н., Ш а р ы п о в а Л.А. и др. Анализ различных типов конкурентоспособности у Tn5-мутантов клубеньковых бактерий люцерны (Sinorhizobium meliloti). Генетика, 2001, 37(11): 1507-1512.
N o r r a n d e r J., K e m p e T., M e s s i n g J. Construction of improved M13 vectors using oligonucleotidedirected mutagenesis. Gene, 1983, 26: 101-106.
S u t c l i f f e J.G. Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR322. Cold Spring Harbor
Symp. Quant. Biol., 1979, 43: 77-90.
Ю р г е л ь С.Н., Ш а р ы п о в а Л.А., С ы р ц о в а Л.А. и др. Дыхательная активность и симбиотическая эффективность у клубеньковых бактерий Rhizobium meliloti. Микробиология, 1996, 86(4): 517-521.
A k a g a w a - M a t s u s h i t a M., M a t s u o p M., K o g a Y. e.a. Alteromonas atlantica sp. nov. and Alteromonas carrageenovora sp. nov., bacteria that decompose algal polysaccharides. Int. J. Syst. Bacteriol., 1992, 42: 621-627.
B a r b e y r o n T., P o t i n P., R i c h a r d C. e.a. Arylsulfatase from Alteromonas carrageenovora. Microbiology, 1995, 141: 2897-2904.
K i m J.-H., B y u n D.-S., G o d b e r J.S. e.a. Purification and characterization of arylsulfatase from Sphingomonas sp. AS6330. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2004, 63: 553-559.
H a n s o n S.R., B e s t M.D., W o n g C.H. Sulfatases: structure, mechanism, biological activity, inhibition,
and synthetic utility. Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 2004, 43: 5736-5763.
M i e c h C., D i e r k s T., S e l m e r T. e.a. Arylsulfatase from Klebsiella pneumoniae carries a formylglycine
generated from a serine. J. Biol. Chem., 1998, 273: 4835-4837.
H e n d e r s o n M.J., M i l a z z o F.H. Arylsulfatase in Salmonella typhimurium: detection and influence of carbon source and tyramine on its synthesis. J. Bacteriol., 1979, 139: 80-87.
B e i l S., K e h r l i H., J a m e s P. e.a. Purification and characterization of the arylsulfatase synthesized by
Pseudomonas aerogenosa PAO during growth in sulfate-free medium and cloning of the arylsulfatase gene (atsA).
Eur. J. Biochem., 1995, 229: 385-394.
H o f f m a n J.A., B a d g e r J.L., Z h a n g Y. e.a. Escherichia coli K1 aslA contributes to invasion of brain
microvascular endothelial cells in vitro and in vivo. Infect. Immun., 2000, 68: 5062-5067.
F i t z g e r a l d J.W. Sulfate ester formation and hydrolysis: a potentially important yet often ignored aspect of the
sulfur cycle of aerobic soils. Bacteriol. Rev., 1976, 40: 698-721.
C r o s s m a n L.C., J o h n s t o n A.W., T h o m s o n N.R. e.a. The genome of Rhizobium leguminosarum has
recognizable core and accessory components. Genome Biol., 2006, 7(4): R34.
S l a t e r S.C., G o l d m a n B.S., G o o d n e r B. e.a. Genome sequences of three agrobacterium biovars help
elucidate the evolution of multichromosome genomes in bacteria. J. Bacteriol., 2009, 191(8): 2501-2511.
O s t e r a s M., B o n c o m p a g n i E., V i n c e n t N. e.a. Presence of a gene encoding choline sulfatase in
Sinorhizobium meliloti bet operon: choline-O-sulfate is metabolized into glycine betaine. PNAS, 1998, 95: 11394-11399.
П и щ и к В.Н., П р о в о р о в Н.А., В о р о б ь е в Н.И. и др. Взаимодействие растений с ассоциативными бактериями при загрязнении почвы тяжелыми металлами. Микробиология, 2009, 78(6): 826-835.
А н д р о н о в Е.Е., П е т р о в а С.Н., Ч и ж е в с к а я Е.П. и др. Влияние внесения генетически модифицированного штамма Sinorhizobium meliloti ACH-5 на структуру почвенного сообщества микроорганизмов. Микробиология, 2009, 78(4): 474-482.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: chizhevskaya@yandex.ru
Поступила в редакцию
25 февраля 2011 года
USE OF SITE-DIRECTED MUTAGENESIS TO STUDY THE FUNCTIONS
OF GENE SMb20332 IN THE NODULE BACTERIA Sinorhizobium meliloti
E.P. Chizhevskaya, O.P. Onishchuk, E.E. Andronov, B.V. Simarov
Summary
The mutant for gene SMb20332 derived from alfalfa nodule bacteria Sinorhizobium meliloti type strain
1021 has been constructed by the use of site-directed mutagenesis. This gene is located on the megaplasmid-2 and
possibly encodes for arylsulfatease according to the results of complete genome sequence of strain 1021 S. meliloti.
Symbiotic properties, salt resistance and growth on the diagnostic media for mutant ACH-5 have been tested. It
was shown that arylsulfatases from nodule bacteria resemble the arylsulfatases from marine bacteria which are able
for desulphation agaropectin. Mutation in gene SMb20332 does not effect significantly the salt resistance of strain
1021 S. meliloti as well as its efficiency and competitiveness in symbiosis with Medicago sativa (cv. Vega). It was
firstly shown that mutation in the gene SMb20332 of strain 1021 S. meliloti causes the change of surface polysaccharides and loose of resistance to the herbicide 2M-4HM (inhibitor of the bacterial respiratory activity).
60
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631.46:579.64:575:577.2
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОГО ПОЛОЖЕНИЯ
МИКРОСИМБИОНТОВ КОПЕЕЧНИКА (Hedysarum) И АСТРАГАЛА
(Astragalus) НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ГЕНОВ РИБОСОМАЛЬНЫХ РНК
В.И. САФРОНОВА, Е.П. ЧИЖЕВСКАЯ, А.А. БЕЛИМОВ, Е.А. ПАВЛОВА
У 22 штаммов ризобий (Всероссийская коллекция непатогенных микроорганизмов сельскохозяйственного
назначения Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии ? ВНИИСХМ) из корневых клубеньков у
Astragalus sp., А. frigidus, A. uliginosus, A. falcatus, A. cicer и Hedysarum alpinum определяли видовую принадлежность
методом секвенирования гена 16S-рРНК (rrs) и последовательности между 16S- и 23S-рДНК (ITS регион) и определяли их симбиотические свойства. Три штамма, изолированных из астрагала, отнесены к виду Mesorhizobium loti,
один идентифицирован как Rhizobium leguminosarum. Два микросимбионта A. cicer с высокой долей вероятности относятся к новому виду рода Mesorhizobium. Разделение клубеньковых бактерий на филогенетические кластеры не коррелировало с географическим происхождением штаммов и видом растения, из которого их выделили. Изоляты образуют
группу перекрестной инокуляции и отличаются широким спектром хозяйской специфичности, включающим бобовые
растения различных триб галегоидного комплекса (Galegeae, Hedysareae, Trifolieae, Loteae и Coronilleae).
Ключевые слова: клубеньковые бактерии, микросимбионты астрагала и копеечника, таксономия, секвенирование генов рибосомальных РНК.
Keywords: root nodule bacteria, Astragalus and Hedysarum microsymbionts, taxonomy, rrs and ITS sequencing.
Клубеньковые азотфиксирующие бактерии семейства Rhizobiaceae относятся к
наиболее обширной и важной таксономической группе почвенных микроорганизмов. У
многих видов бобовых клубеньковые бактерии не изучены или их исследование находится на начальном этапе. Так, мало изучены микросимбионты засухоустойчивых кормовых культур Astragalus и Hedysarum, обладающих высокой питательной ценностью и
перспективных для возделывания в условиях дефицита влаги (1-3).
Немногочисленные данные литературы, описывающие микросимбионтов астрагала, дают представление о большом разнообразии этих микроорганизмов, которые могут
принадлежать к разным родам семейства Rhizobiaceae — Rhizobium, Sinorhizobium, Bradyrhizobium и Mesorhizobium (4-6). Среди микросимбионтов копеечника описаны ризобиальные и
мезоризобиальные штаммы (7, 8). В настоящее время видовая принадлежность определена
только для клубеньковых бактерий у Hedysarum coronarium — R. sullae (9), а также у астрагалов китайского происхождения: A. scobwerrimus, A. complanatus, A. chrysopterus — R. loessense
(10), A. adsurgens — M. septentrionale и M. temperatum (11), A. sinicus — M. huakuii (12).
Цель работы состояла в определении таксономического положения ризобиальных
штаммов различного географического происхождения, выделенных у астрагала и копеечника.
Методика. Объектом исследования были 22 штамма, изолированные с помощью
традиционной методики (13) из корневых клубеньков нескольких видов астрагала (Astragalus
sp., А. frigidus, A. uliginosus, A. falcatus, A. cicer) и копеечника (Hedysarum alpinum). Симбиотические свойства изолятов изучали в условиях стерильного микровегетационного опыта в
пробирках с вермикулитом и средой Красильникова-Кореняко. Азотфиксирующую активность штаммов измеряли по редукции ацетилена на газовом хроматографе (13).
При первичном определении видовой принадлежности штаммов использовали
метод секвенирования гена 16S-рРНК (rrs), при уточнении таксономического положения бактерий — секвенирование более вариабельной области между 16S- и 23S-рДНК
(ITS регион). Для амплификации 16S-рДНК (около 1500 п.н.) применяли праймеры fD1
(5ґ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ґ) и rD1 (5ґ-AAGGAGGTGATCCAGCC-3ґ), для ITS
региона (800 п.н.) ? FGPS 1490-72 и FGPL-132 (соответственно 5ґ-TGCGGCTGGATCCCCTCCTT-3ґ и 5ґ-CCGGGTTTCCCCATTCGG-3ґ). Полученный ПЦР-продукт очищали
и клонировали в плазмиде pTZ57R/T с использованием PCR Product Cloning Kit («Fermentas», США) для последующего секвенирования. Поиск гомологичных последовательностей проводили с помощью базы данных GenBank (программа BLAST). Для конструирования филогенетического дерева применяли программу MEGA3 9 (метод NeighborJoining). Пары последовательностей сравнивали по числу различающихся нуклеотидов.
Результаты. Данные о происхождении исследованных нами штаммов приведены в таблице 1.
Как известно, метод секвенирования ITS региона более чувствителен и обладает большей разрешающей способностью при идентификации близкородственных штаммов, чем секвенирование гена 16S-рРНК (14). Анализ ITS последовательностей ризобиальных штаммов показал, что исследуемые изоляты формируют 7 достоверно различающихся групп (рис.).
Кластеры I, VI и VII включали соответственно типовые штаммы Mesorhizobium hua-
61
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
1. Штаммы клубеньковых бактерий, исследованные в работе
Штамм
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
CIAM
1403
1404
1405
1406
1409
1410
1414
1415
1418
0201
0202
0203
0204
0205
0206
0207
0208
0209
0211
0212
0217
0218
Растение-хозяин
Hedysarum alpinum
H. alpinum
H. alpinum
H. alpinum
H. alpinum
H. alpinum
H. alpinum
H. alpinum
H. alpinum
Astragalus sp.
A. frigidus
A. cicer
A. cicer
A. uliginosus
A. uliginosus
A. falcatus
A. cicer
A. cicer
A. uliginosus
A. falcatus
A. falcatus
A. uliginosus
Происхождение
Московская область
Московская область
Московская область
Московская область
Московская область
Московская область
Московская область
г. Москва
г. Москва
г. Новосибирск
г. Новосибирск
г. Минск (Белоруссия)
г. Минск (Белоруссия)
г. Воркута
г. Воркута
г. Ставрополь
г. Полтава (Украина)
г. Полтава (Украина)
Алтай
Алтай
Алтай
Алтай
kuii, M. loti и Rhizobium leguminosarum. Все штаммы, выделенные из
копеечника, формировали одну ITSгруппу (I кластер, см. рис.), гомологичную виду M. huakuii, описанному для микросимбионтов растения
Astragalus sinicus (12). Показано, что
исследуемые изоляты копеечника действительно способны вступать в симбиоз с астрагалами (A. cicer) (табл. 2).
Однако принадлежность микросимбионтов копеечника к виду M. huakuii представляется сомнительной,
поскольку степень гомологии между
представителями этих групп по гену
rrs составила 96,0 %, что для этого
высококонсервативного локуса считается низким значением. Известно, что представители рода Mesorhizobium образуют гомогенную группу
при анализе последовательности 16SрДНК. К примеру, гомология между типовыми штаммами M. plurifa-
rium и M. amorphae равняется 99,5 % (15).
На основании результатов
секвенирования гена rrs, а также
анализа последовательности ITS
региона штаммы-микросимбионты
астрагала CIAM 0205, CIAM 0206 и
CIAM 0212 (VI ITS-кластер) были
идентифицированы как M. loti (стеКластер,
пень гомологии с типовым штамштамм
мом ATCC33669 — 99,1 и 96,7 % соответственно по 16S-рДНК и ITS региону). Следует отметить, что предИзоляты копеечника
ставители вида M. loti нодулируют
I ITS-кластер:
широкий спектр бобовых растений,
CIAM 1406
Fix
Nod
0
Fix
0
Fix
Fix
CIAM 1410
Fix
Nod
0
Nod
0
Fix
Fix
которые относятся к различным триCIAM 1414
Fix
Fix
0
Fix
Fix
Fix
Fix
бам семейства Fabaceae. Например,
CIAM 1415
Fix
Nod
0
Fix
0
Fix
Fix
штаммы M. loti CIAM 1801, CIAM
Изоляты астрагала
1802 и CIAM 1804 из коллекции
II ITS-кластер:
ВНИИСХМ вступали в азотфиксиCIAM 0201
Fix
Fix
0
Fix
0
Fix
Fix
CIAM 0202
Fix
Fix
0
Fix
0
Fix
0
рующий симбиоз с растениями астCIAM 0218
Fix
Fix
0
Fix
0
Fix
Nod
рагала (A. cicer) и остролодочника
III ITS-кластер:
(Oxytropis campestris), а также обраCIAM 0208
0
Fix
0
Fix
0
0
0
зовывали неактивные клубеньки на
CIAM 0209
Nod Fix
0
Fix
0
0
Fix
солодке (Glycyrrhiza uralensis). ИзоляIV ITS-кластер:
CIAM 0211
Fix
Fix
0
Nod Fix
Fix
Fix
ты астрагала из VI кластера не нодуCIAM 0217
Fix
Fix
0
Nod Fix
Fix
Fix
лировали растения лядвенца (Lotus
V ITS-кластер:
corniculatus) в стерильных микровеге0
0
Fix
CIAM 0203
Fix
Fix
0
Fix
тационных опытах, однако вступали
Fix
0
0
Fix
CIAM 0204
Nod Fix
0
VI ITS-кластер:
в азотфиксирующий симбиоз с коCIAM 0205
Fix
Fix
0
Fix
Nod Nod Fix
пеечником (H. alpinum), а также обраCIAM 0206
Fix
Fix
0
Nod Nod Nod
0
зовывали клубеньки (в ряде случаев
CIAM 0212
Fix
Fix
0
Nod Nod Fix
Fix
активные) на корнях солодки (GlyVII ITS-кластер:
cyrrhiza uralensis), эспарцета (Onobrychis
CIAM 0207
0
Fix
0
Nod Nod Nod
0
Mesorhizobium loti:
viciifolia), стальника (Ononis arvensis) и
CIAM 1801
0
Fix
Fix
0
0
Fix
0
остролодочника (Oxytropis campestris)
CIAM 1802
0
Fix
Fix
Nod
0
Fix
0
(табл. 2). Наиболее близкими к укаCIAM 1804
0
Fix
Fix
Nod
0
Fix
0
занным изолятам (с разницей 1-2 нуП р и м е ч а н и е. 0 — клубеньки отсутствуют, Nod —
клеотида в последовательности ITS)
неактивные клубеньки, Fix — азотфиксирующие клубеньки.
были три штамма, изолированные из
растения Gueldenstaedtia himalaica, которое является родственником астрагала и также принадлежит к трибе Galegeae. Единственный из исследованных быстрорастущий штамм
CIAM 0207 (VII ITS-кластер) был отнесен к виду R. leguminosarum (гомология с типовым
штаммом LMG 14904 — 99,3 % по гену rrs и 96,0 % по ITS региону). Быстрорастущий
штамм CIAM 0207 обладал более узким спектром хозяйской специфичности и не образовывал клубеньки ни на копеечнике, ни на остролодочнике.
62
Oxytropis
campestris
Ononis
arvensis
Onobrychis
viciifolia
Glycyrrhiza
uralensis
Lotus
corniculatus
A. cicer
H. alpinum
2. Симбиотические свойства исследуемых изолятов ризобий копеечника (Hedysarum
alpinum) и астрагала (Astragalus) при инокуляции различных видов растений
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ITS-филограмма, отражающая таксономическое положение исследуемых изолятов копеечника (Hedysarum alpinum) и
астрагала (Astragalus): I-VII — статистически достоверные кластеры. В скобках указан вид растения-хозяина.
Степень гомологии между 16S-рДНК типового штамма A-1BS M. tianshanense и
штаммов CIAM 0201, CIAM 0202, CIAM 0218 (II ITS-кластер), CIAM 0208, CIAM 0209
(III ITS-кластер) и CIAM 0211, CIAM 0217 (IV ITS-кластер) составляла 99,5-99,7 %. Однако последовательность ITS региона у этих трех групп изолятов существенно отличалась
от таковой у референтных штаммов M. tianshanense (максимально 93,6 % гомологии).
Этот факт затрудняет отнесение перечисленных выше микросимбионтов астрагала к виду
M. tianshanense, поскольку считается, что штаммы клубеньковых бактерий одного вида не
могут иметь меньше 95 % гомологии по ITS (16, 17). Эти результаты позволяют сделать
вывод об отсутствии в базе данных GenBank штаммов, близкородственных CIAM 0203 и
63
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
CIAM 0204 (V ITS-кластер), изолированным из клубеньков астрагала нутового (A. cicer):
наибольшая степень гомологии с типовыми штаммами M. loti и M. ciceri составляла 98,9 %
по гену rrs и 91,2 % по ITS региону.
Спектры хозяйской специфичности изолятов астрагала II-VII ITS-кластеров оказались уникальны для каждой группы (см. табл. 2). Однако однозначной корреляции между
хозяйской специфичностью и филогенией штаммов выявлено не было. В целом можно отметить, что эти изоляты образуют группу перекрестной инокуляции и характеризуются широким спектром хозяйской специфичности, включающим бобовые растения различных
триб галегоидного комплекса (Galegeae, Hedysareae, Trifolieae, Loteae и Coronilleae).
Таким образом, три микросимбионта астрагала отнесены к виду Mesorhizobium loti,
один — к Rhizobium leguminosarum. Два штамма из Astragalus cicer (V ITS-кластер) с высокой
долей вероятности относятся к новому виду рода Mesorhizobium. Таксономическое положение мезоризобиальных изолятов астрагала и копеечника, сформировавших I-IV кластеры,
неясно, поскольку результаты секвенирования ITS региона и гена rrs не подтверждают друг
друга. Распределение клубеньковых бактерий астрагала на кластеры не коррелировало с географическим происхождением штаммов и видом растения, из которого их выделили.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
А н д р е е в Н.Г. Луговое и полевое кормопроизводство. М., 1989.
Ю н у с б а е в У.Б. Оптимизация нагрузки на естественные пастбища: Метод. пос. Саратов, 2001.
S t r u f f i P., C o r i c h V. Metabolic properties, stress tolerance and macromolecular profiles of rhizobia nodulating
Hedysarum coronarium. J. Appl. Microbiol., 1998, 84(1): 81-89.
G a o J., T e r e f e w o r k Z., C h e n W. e.a. Genetic diversity of rhizobia isolated from Astragalus adsurgens growing in different geographical regions of China. J. Biotechnol., 2001, 91: 155-168.
L a g u e r r e G., V a n B e r k u m P., A m a r g e r N. e.a. Genetic diversity of rhizobial symbionts isolated from legume species within the genera Astragalus, Oxytropis, and Onobrychis. Appl. Environ. Microbiol., 1997, 63(12): 4748-4758.
W d o w i a k S., M a l e k W. Numerical analysis of Astragalus cicer microsymbionts. Curr. Microbiol., 2000, 41: 142-148.
K i s h i n e v s k y B.D., N a n d a s e n a K.G., Y a t e s R.J. e.a. Phenotypic and genetic diversity
among rhizobia isolated from three Hedysarum species: H. spinosissimum, H. coronarium and H. flexuosum.
Plant and Soil, 2002, 251: 143-153.
S a f r o n o v a V.I., P i l u z z a G., B e l i m o v A.A. e.a. Phenotypic and genotypic analysis of rhizobia isolated from pasture legumes native of Sardinia and Asinara Island. Antonie Van Leeuwenhoek, 2004, 85: 115-127.
S q u a r t i n i A., S t r u f f i P., D o r i n g H. e.a. Rhizobium sullae sp. nov. (formerly Rhizobium hedysari),
the root-nodule microsymbiont of Hedysarum coronarium L. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2002, 52: 1267-1276.
W e i G.H., T a n Z.Y., Z h u M.E. e.a. Characterization of rhizobia isolated from legume species within
the genera Astragalus and Lespedeza grown in the Loess Plateau of China and description of Rhizobium
loessense sp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2003, 53: 1575-1583.
G a o J.L., T u r n e r S.L., K a n F.L. e.a. Mesorhizobium septentrionale sp. nov. and Mesorhizobium temperatum sp. nov., isolated from Astragalus adsurgens growing in the northernregions of China. Int. J. Syst.
Evol. Microbiol., 2004, 54: 2003-2012.
C h e n W.X., L i G.S., Q i Y.L. e.a. Rhizobium huakuii sp. nov. isolated from the root nodules of Astragalus sinicus. Int. J. Syst. Вacteriol., 1991, 41: 275-280.
N o v i k o v a N., S a f r o n o v a V. Transconjugants of Agrobacterium radiobacter harbouring sym genes of
Rhizobium galegae can form an effective symbiosis with Medicago sativa. FEMS Microbiol. Lett., 1992, 93: 261-268.
V i n u e s a P., L e o n - B a r r i o s M., S i l v a C. e.a. Bradyrhizobium canariense sp. nov., an acidtolerant endosymbiont that nodulates endemic genistoid legumes (Papilionoideae: Genisteae) from the Canary
Islands, along with Bradyrhizobium japonicum bv. genistearum, Bradyrhizobium genospecies alpha and Bradyrhizobium genospecies beta. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2005, 55: 569-575.
W a n g E.T., V a n B e r k u m P., S u i X.H. e.a. Diversity of rhizobia associated with Amorpha fruticosa isolated from Chinese soils and description of Mesorhizobium amorphae sp. nov. Int. J. Syst. Вacteriol., 1999, 49: 51-65.
R i v a s R., W i l l e m s A., P a l o m o J.L. e.a. Bradyrhizobium betae sp. nov., isolated from roots of
Beta vulgaris affected by tumour-like deformations. Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2004, 54: 1271-1275.
W i l l e m s A., M u n i v e A., D e L a j u d i e P. e.a. In most Bradyrhizobium groups sequence comparison of 16S-23S rDNA internal transcribed spacer regions corroborates DNA-DNA hybridizations. Syst.
Appl. Microbiol., 2003, 26: 203-210.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: v.safronova@rambler.ru
TAXONOMY OF MICROSYMBIONTS OF Hedysarum AND Astragalus
BASING ON RIBOSOMAL RNA GENES SEQUENCING
V.I. Safronova, E.P. Chizhevskaya, A.A. Belimov, E.A. Pavlova
Summary
The study of taxonomic positionn and symbiotic properties of 22 rhizobial strains from All-Russian collection of nonpathogenic microorganisms for agricultural purposes, which were isolated from root nodules of Astragalus
sp., A. frigidus, A. uliginosus, A. falcatus, A. cicer and Hedysarum alpinum, was conducted. For identification the method
of 16S rRNA gene (rrs) and 16S-23S rDNA (ITS region) sequencing was used. Three strains from Astragalus belonged
to Mesorhizobium loti, one isolate was identified as Rhizobium leguminosarum. Two isolates from A. cicer most probably
belong to new species within Mesorhizobium. Taxonomic position of Hedysarum microsymbionts and other isolates
from Astragalus remains not clear, as the results of ITS and rrs sequencing do not confirm each other. Division of
rhizobial isolates into phylogenetic clusters correlated neither with geographical origin of strains nor with species of
plant which they were isolated from. There was not also a significant correlation between plant host range and taxonomic relationship of strains. These isolates form the wide cross inoculation group, including the leguminous plants
from different tribes within the Galegoid complex (Galegeae, Hedysareae, Trifolieae, Loteae and Coronilleae).
64
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 633.31:575.174.015.3:581.557:631.466.12
ПОЛИМОРФИЗМ ПОПУЛЯЦИИ ПАВЛОВСКАЯ
ЛЮЦЕРНЫ ХМЕЛЕВИДНОЙ ПО ПОКАЗАТЕЛЯМ ПРОДУКТИВНОСТИ,
МИКОРИЗАЦИИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ СИМБИОЗА С Glomus intraradices
А.П. ЮРКОВ1, Л.М. ЯКОБИ1, Н.И. ДЗЮБЕНКО2, М.Ф. ШИШОВА3,
Н.А. ПРОВОРОВ1, А.П. КОЖЕМЯКОВ1, А.А. ЗАВАЛИН4
В вегетационных опытах у растений люцерны хмелевидной (Medicago lupulina, популяция Павловская), выращенных на дерново-подзолистой почве с низким содержанием фосфора, оценивали эффективность
симбиоза со штаммом CIAM8 гриба арбускулярной микоризы (АМ) Glomus intraradices. Из наиболее распространенного и полиморфного морфотипического класса АКС отбирали линии, контрастные по эффективности
АМ. Показан высокий полиморфизм по этому признаку у 45 линий люцерны хмелевидной. Микориза оптимизировала фосфатное питание растений, но снижала содержание в них азота. Это свидетельствует о необходимости подбора специальных условий применения тройной симбиотической системы АМ-гриб + растение-хозяин + ризобии.
Ключевые слова: арбускулярная микориза, люцерна хмелевидная, Glomus intraradices, симбиотическая эффективность, внутрипопуляционный полиморфизм.
Keywords: arbuscular mycorrhiza, black medic, Glomus intraradices, symbiotic efficiency, intrapopulation
polymorphism.
Арбускулярная микориза (АМ) — наиболее распространенный растительномикробный симбиоз, который образует большинство (80-90 %) видов наземных растений с эндомикоризными грибами отдела Glomeromycota. Она обеспечивает поступление
из почвы в растение всего комплекса макро- и микроэлементов, в первую очередь фосфора, а также оказывает стимулирующее влияние на растения, синтезируя фитогормоны, повышая устойчивость растений к корневым патогенам и способствуя усилению
взаимодействия растений с азотфиксирующими микроорганизмами (1). Несмотря на
интенсивные исследования АМ, до сих пор остаются неясными многие механизмы ее
развития, поскольку у сортов, используемых в экспериментах, часто ослаблена способность к микотрофному питанию (2). Как результат, эти сорта менее отзывчивы и
менее вариабельны при инокуляции АМ-грибами, чем дикорастущие популяции (3-4).
Низкая симбиотическая эффективность коммерческих сортов (отсутствие ростового отклика на инокуляцию АМ-грибами) не позволяет осуществлять селекцию линий с повышенным симбиотическим потенциалом (2). Ранее проводился анализ структуры природных популяций люцерны по интенсивности азотфиксации в бобово-ризобиальном симбиозе (5). В отношении АМ аналогичные данные отсутствуют.
Нашей целью была оценка полиморфизма по эффективности симбиоза с АМгрибом у дикорастущей люцерны хмелевидной и отбор линий с контрастной отзывчивостью на инокуляцию.
Методика. Объектом исследования служила озимая дикорастущая популяция Павловская люцерны хмелевидной (Medicago lupulina L., сем. Fabaceae) из Ленинградской области (45 линий; семена получены из коллекции Всероссийского НИИ растениеводства
им. Н.И. Вавилова, масса 1000 семян — 1,93 г). Для микоризации использовали штамм CIAM8
Glomus intraradices Shenck & Smith, выделенный из дерново-подзолистой почвы в Ленинградской области (коллекция Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии).
Методика определения эффективности АМ-симбиоза в отсутствие инокуляции
ризобиями описана ранее (6). В вегетационные сосуды с 210 г почвы высаживали 3суточные проростки люцерны (по 2 шт. на сосуд). Растения инокулировали АМ-грибом
с помощью свежих микоризованных корней плектрантуса Plectranthus australis L., которые
вносили в почву при посадке люцерны из расчета 100 мг на один проросток (контроль —
немикоризованные корни). В каждом варианте использовали 4 сосуда, биологическая
повторность опыта 8-кратная. Агрохимическая характеристика почвы: содержание органического вещества — 3 %, доступного азота, фосфора и калия — соответственно 78,0;
1,7 и 2,9 мг/100 г; pHKCl — 6,1; гидролитическая кислотность — 3,3 мг/100 г, сумма подвижных оснований — 9,8 мг-экв/100 г.
Показатели продуктивности и микоризации учитывали на 61-е сут после посадки. Содержание N в растениях определяли по Кьельдалю на автоматической установке Kjelteck-AUTO (Швеция), количество P — колориметрически методом ТруогаМейера при ? = 670 нм (7). На основании показателей продуктивности растений (прибавка сухой массы, а также содержания N и P) оценивали симбиотическую эффективность (8). Для количественного описания развития АМ корни мацерировали, окрашивали
(9) и проводили световую микроскопию (10), результаты которой обрабатывали с помо-
65
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
щью компьютерной программы Mycorrhiza 1.0 (автор — А.П. Юрков) (6). Определяли
встречаемость АМ (F, %), обилие арбускул и везикул (соответственно a и b, %). Фенотипическое разнообразие популяции изучали, применяя разработанный нами способ учета качественных и количественных признаков у куста и стеблей индивидуального растения (11).
Статистический и корреляционный анализ проводили по Ф. Хедрику (12). Для
характеристики изменчивости рассчитывали коэффициенты вариации (Cv), асимметрии
(As) и эксцесса (Ex). Достоверность различий между средними значениями исследуемых
показателей оценивали с помощью t-критерия Стьюдента (13).
Результаты. Люцерна хмелевидная Medicago lupulina L. — широко распространенный в России вид бобовых. Она представлена мезофитными и ксерофитными экотипами, яровыми и озимыми формами, одно- и малолетниками (14). Это самоопылитель, диплоид (2n = 16), обладает высокой семенной продуктивностью (500-800 семян с 1 растения)
и хорошими кормовыми качествами. Использованный нами штамм CIAM8 АМ-гриба
Glomus intraradices как микросимбионт высокоэффективен со многими сельскохозяйственными растениями (4, 15).
Рис. 1. Схематические изображения морфотипов озимой люцерны хмелевидной (вверху), выделенных на основе фенотипа побегов в фазу плодоношения: а — основной фенотип A, или «раннее цветение», скороспелый, на 2/3 стебля имеются мелкие сидячие листья с коротким черешком; б — основной фенотип B, или «позднее цветение», стебли хорошо
облиственные, листья с черешком располагаются примерно до 2/3 высоты стебля, затем идут сидячие листья, выражено боковое ветвление; в —
сопутствующий фенотип K, или «вторичное кущение» (первичное характерно для всех растений, поэтому в отдельный фенотип его не выделяли), имеет стебли высотой 20-40 см, сопутствующие фенотипу A либо
B, листья с черешком, стебли без пазушного ветвления; г — сопутствующий фенотип С, или «третичное кущение», со стеблями высотой до
15 см, сопутствующими фенотипу A либо B, не несет соцветий. Масштаб (линии слева) — 10 см.
Морфотипический анализ популяции показал
наличие 6 классов (рис. 1) при наибольшем распространении классов АС (11 линий) и АКС (24 линии) — соответственно 24 и 54 % от общего числа растений (табл. 1). Между изученными морфотипами не было выявлено достоверных различий по абсолютным значениям средних показателей как продуктивности и эффективности АМ, так и микоризации. Варьирование
этих показателей также было одинаковым. Однако полиморфизм показателей симбиотической эффективности, рассчитанной по величине сухой массы и содержанию N, у растений с морфотипом АКС был намного выше, чем у имеющих морфотип АС (табл. 2).
У 45 изученных линий люцерны эффективность инокуляции АМ-грибом, рассчи-
66
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
танная по показателям продуктивности, варьировала в широких пределах: по сухой надземной массе, а также массе корней — на 2 порядка, по содержанию в надземной массе P и N —
на порядок. О значительной генетической гетерогенности популяции Павловская свидетельствует также достоверная левосторонняя асимметрия (As > 0) по симбиотической
эффективности, рассчитанной по биомассе корней и надземных частей, а также правосторонняя асимметрия — по прибавке содержания N (As < 0, см. табл. 1). Варьирование
показателей микоризации, а также абсолютных значений биомассы было значительно ниже, чем показателей эффективности. Почти для всех линий прибавки по содержанию Р
1. Показатели продуктивности, симбиотической эффективности, микоризации и морфотипы
у линий люцерны хмелевидной из популяции Павловская (вегетационные опыты)
Л
М
Сухая масса, мг
Симбиотическая эффективность, %
НЧ
К
по массе
по содержанию в НЧ F, % а, % b, %
К
N
P2O5
?АМ +АМ ?АМ +АМ НЧ
Pav06
A
117,4
307,6 119,1
212,8 162,1
78,6
77,2
89,4 23,1 42,2
?91,3
Pav37
AC
108,4
272,6 107,9
182,0 151,6
68,8
?65,5
58,1
84,7 25,9 43,0
Pav21
AC
95,0
257,3
80,7
163,2 171,0 102,3
?74,1
127,5
66,1 29,0 28,2
Pav31
AC
81,2
227,8
64,1
138,8 180,4 116,7
?107,9
119,3
78,5 43,3 26,8
Pav16
AC
74,0
215,2
61,5
136,6 191,1 122,1
?77,8
198,8
80,1 55,5 36,1
Pav40
AC
105,0
315,8
96,5
259,8 200,7 169,4
?100,2
105,6
86,5 27,8 38,8
Pav30
AC
86,9
275,5
70,4
188,7 216,9 167,8
?135,7
153,5
81,4 29,3 32,9
Pav39
AC
108,8
361,5 105,3
277,9 232,3 163,9
?95,2
50,8
89,2 33,0 40,5
Pav20
AC
64,6
239,4
60,1
157,8 270,8 162,4
?118,1
89,7
79,2 42,2 33,6
Pav29
AC
60,6
243,3
67,8
151,9 301,3 124,0
?66,0
141,3
70,2 38,3 34,8
Pav32
AC
41,9
214,0
48,8
147,3 411,1 202,0
?152,0
138,2
67,8 42,0 37,5
Pav45
AC
47,8
271,7
45,2
185,6 468,8 310,9
?160,4
116,5
85,0 19,6 43,7
Pav26
AK
148,9
246,5 139,4
162,2
65,6
16,3
?70,9
151,9
71,2 33,6 41,2
Pav08
AK
95,8
212,8
96,5
159,6 122,3
65,4
?74,7
151,9
76,9 42,4 40,0
Pav28
AK
103,6
294,6 112,7
235,3 184,3 108,7
?85,2
138,8
86,7 26,9 42,0
Pav02
AKC
87,9
139,0
86,1
79,8
58,2
?7,4
?23,6
156,4
56,5 67,9 17,6
Pav17
AKC
109,2
198,7
92,2
114,5
81,9
24,3
?22,0
134,6
74,4 49,6 32,4
Pav44
AKC
99,3
227,6
91,6
150,5 129,2
64,3
?48,1
100,6
86,0 55,1 31,7
Pav01
AKC
74,1
170,1
70,1
101,1 129,6
44,3
?51,0
122,7
66,6 49,9 34,4
Pav19
AKC
98,8
246,0
88,4
147,4 148,9
66,8
?69,6
147,0
76,8 41,0 37,2
Pav07
AKC
68,4
175,9
70,9
92,5 157,1
30,5
?40,9
166,2
77,5 49,1 37,5
Pav13
AKC
83,2
224,4
67,1
141,6 169,6 110,9
?60,1
174,5
79,9 52,9 34,4
Pav22
AKC
76,2
208,7
75,8
123,8 173,9
63,4
?51,4
125,0
77,6 54,3 28,5
Pav12
AKC
64,8
196,6
64,5
134,2 203,6 108,1
?67,7
154,4
63,5 67,3 33,8
Pav42
AKC
62,6
202,8
58,8
113,1 224,0
92,4
?73,0
135,1
63,8 57,5 38,7
Pav35
AKC
59,5
199,2
65,4
156,1 234,9 138,7
?76,5
199,9
83,3 30,2 36,0
Pav43
AKC
81,3
273,1
81,9
216,9 235,9 165,0
?98,0
162,8
81,5 33,9 36,3
Pav09
AKC
80,3
280,3
75,4
228,9 249,1 203,7
?66,1
31,51
90,2 30,7 40,1
Pav36
AKC
67,8
249,3
61,7
131,6 267,6 113,3
?59,8
181,8
77,2 39,7 37,8
Pav33
AKC
54,6
218,1
50,3
122,0 299,6 142,7
?84,5
211,7
81,7 29,7 26,5
Pav25
AKC
47,4
189,8
52,4
115,1 300,4 119,7
?69,5
150,0
78,5 48,2 24,2
Pav41
AKC
65,6
272,8
71,1
165,3 316,1 132,6
?63,0
167,8
77,8 47,5 41,6
Pav14
AKC
60,3
263,0
66,5
160,2 336,2 141,0
?125,0
140,9
69,1 53,8 33,5
Pav10
AKC
75,5
342,8
66,9
223,9 354,3 234,5
?181,4
132,1
84,0 23,9 50,3
Pav38
AKC
67,3
310,9
69,2
196,1 362,2 183,6
?149,4
188,4
88,4 38,1 40,4
Pav03
AKC
49,5
249,5
53,6
146,7 404,2 173,8
?101,4
137,2
69,1 49,1 43,2
Pav34
AKC
57,9
333,7
53,0
231,2 476,8 336,5
?192,7
167,0
81,0 30,7 47,8
Pav18
AKC
49,7
292,3
52,7
231,8 487,7 339,6
?107,8
86,3
81,9 34,4 44,4
Pav05
AKC
19,51 261,8
24,81 190,9 1241,41 670,11 ?128,6
170,9
73,4 34,2 38,3
Pav27
BC
90,0
196,9
91,8
100,3 118,8
9,3
?46,8
191,7
69,9 58,2 31,9
Pav23
BC
95,9
307,7
84,8
194,7 221,0 129,7
?123,5
78,8
74,0 36,9 29,1
Pav24
BC
57,0
235,9
54,2
136,6 314,1 152,0
?61,5
376,3
72,9 48,5 36,4
Pav04
BKC
80,5
204,0
74,6
118,6 153,4
58,9
?51,2
142,7
69,1 58,5 24,8
Pav11
BKC
123,5
342,9 126,4
266,9 177,6 111,1
?128,0
67,6
84,5 25,3 46,9
Pav15
BKC
65,0
266,7
58,3
158,0 310,4 170,9
?65,3
203,6
77,6 50,9 40,9
Среднее значение 78,0
249,7
75,0
165,5 259,3 140,1
?88,0
142,8
77,3 41,3 36,4
Сv, %
31,7
20,1
30,7
29,2
70,9
79,8
44,8
38,6
10,2 29,8 18,4
As, %
0,41
0,24
0,752
0,54
0,662 0,892
?0,822
?0,53
?0,46 0,25 ?0,46
AsАКС, % 0,65
0,25
0,36
0,42
0,38
0,922
?1,062
?0,19
?0,69 0,18 ?0,46
Ex, %
0,54 ?0,34
0,70
?0,35 ?0,08
1,303
0,30
?0,04
?0,24 ?0,82 0,40
ExАКС, % ?0,07 ?0,40 ?0,69
?0,923 ?0,42
0,973
0,73
0,19
0,16 ?0,73 0,903
П р и м е ч а н и е. Л и М — соответственно линия и морфотип; НЧ и К — надземная часть и корни;
АМ — арбускулярная микориза («?» и «+» — отсутствие и наличие инокуляции); F — встречаемость АМ; а,
b — обилие соответственно арбускул и везикул. Низкоэффективные линии — Pav02, Pav17, Pav44, высокоэффективные — Pav34, Pav18, Pav05. 19,51 — отмечены экстремальные значения, не принадлежащие выборке класса
АКС при P < 0,05; 0,752 и 1,303 — соответственно асимметрия и эксцесс статистически значимы при Р < 0,05.
составляли > 100 %, в среднем для популяции содержание Р у микоризованных растений по
сравнению с таковым без АМ было в 2,2 раза выше. Это согласуется с данными F.E. Sanders с соавт. (16), показавшими, что у различных видов количество Р в корнях у микоризованных растений в 2-5 раз выше, чем у немикоризованных. В то же время наши резуль-
67
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
таты свидетельствуют о более низкой вариабельности содержания Р в надземной массе (и
корнях) у микоризованных растений по сравнению с немикоризованными. Например,
значения Cv для содержания Р в надземных частях и корнях у растений без АМ были в
1,5-2,0 раза выше, чем в варианте с АМ. Значит, арбускулярная микориза способна оптимизировать фосфорное питание как у низкоэффективных, так и у высокоэффективных линий люцерны.
2. Средние значения и коэффициенты вариации показателей продуктивности, симбиотической эффективности и микоризации у морфотипов АС и АКС люцерны хмелевидной из популяции Павловская (вегетационные опыты)
Показатель
М
Сухая масса, мг
Симбиотическая эффективность, %
НЧ
К
по массе по содержанию в НЧ F, %
К
N
P2O5
?АМ +АМ ?АМ +АМ НЧ
а, %
b, %
АС
79,5 263,1 73,5 180,9 254,2 155,5
?104,8
118,1
79,0
35,1
АКС 69,2 238,6 67,1 154,8 293,4 153,8
?83,8
147,7
76,7
44,5
АС
30,0
16,9
29,3
26,1
40,3* 41,1*
32,1*
35,8
9,8
29,1
АКС 28,0
21,8
22,9
30,0
79,1* 90,9*
53,3*
25,9
10,9
27,1
П р и м е ч а н и е. Буквенные обозначения те же, что в таблице 1.
* Значения Cv достоверно (P < 0,05) выше для морфотипа АКС по сравнению с морфотипом АС.
36,0
36,1
15,2
20,2
Среднее
значение
Сv, %
3. Коэффициенты корреляции (r) между продуктивностью растений, симбиотической
эффективностью и показателями микоризации у изученных линий люцерны хмелевидной из популяции Павловская (вегетационные опыты)
Показатель
микоризации
Продуктивность (+АМ)
по массе
по содержанию в НЧ
НЧ
К
N
P2O5
Симбиотическая эффективность
по массе
по содержанию в НЧ
НЧ
К
N
P2O5
0,19
F
0,64*
0,68
?0,58
?0,38
a
?0,71
?0,73
0,73
0,30
?0,29
0,43
b
0,66
0,64
?0,50
?0,18
П р и м е ч а н и е. Буквенные обозначения те же, что в таблице 1.
* При r ? 0,29 корреляция статистически значима.
0,40
?0,48
0,51
?0,34
0,56
?0,50
?0,22
0,30
?0,14
Выявлены существенные положительные корреляции между сухой массой растений, а также прибавкой по данному показателю и показателями микоризации F и b
(табл. 3). Отрицательные корреляции обнаружили между теми же показателями продуктивности и эффективности и обилием арбускул в микоризованных корнях. Аналогичные
взаимосвязи обнаружены нами ранее на яровой люцерне хмелевидной — сортопопуляции
ВИК32, в которой растения с высокой продуктивностью характеризовались слабым образованием арбускул (11). То есть чем более зрелой является арбускулярная микориза (ниже
обилие арбускул и выше — везикул), тем больше эффективность симбиоза и масса растений. В то же время содержание N и P в растениях отрицательно коррелировало с F и b
(см. табл. 3). Это может означать, что развитие мицелия и спор гриба требует значительных затрат макроэлементов и их поступление в растения снижается. Положительная связь
содержания N и P с обилием арбускул (а), вероятно, определяется тем, что, согласно
общепризнанной гипотезе, именно через арбускулы указанные макроэлементы поступают в растения (1). В соответствии с гипотезой M.E. Brown с соавт. (17), зрелые арбускулы разрушаются растением, после чего оно поглощает фосфаты, накопленные грибом. Можно предположить, что растения люцерны, обладающие более низкой биомассой, получают питательные вещества из интактных арбускул (биотрофно), а обладающие
высокой — посредством разрушения арбускул (некротрофно). Наши результаты продемонстрировали низкую, хотя и достоверную корреляцию обилия арбускул (а) с содержанием Р и его прибавкой (см. табл. 3). Корреляции обилия арбускул с содержанием N и
его прибавкой были значительно выше, чем с содержанием Р и его прибавкой.
Количество N в растениях с АМ оказалось значительно ниже, чем в вариантах
без АМ (см. табл. 2). Обнаруженная закономерность наблюдалась в исследованиях симбиоза
сои Glycine max с Glomus mosseae при добавлении в почву фосфорного удобрения — 1 г
KH2PO4 на 1 кг почвы (18). Аналогичные результаты были получены при изучении АМ у
ананаса Ananas comosus (19) и гороха Pisum sativum (3, 4). Опыты A. Martennson с соавт. (3)
на 16 коммерческих сортах гороха продемонстрировали уменьшение количества N в
среднем на 6,5 %. В экспериментах Л.М. Якоби с соавт. (4) на 99 дикорастущих популяциях гороха посевного в аналогичных условиях уменьшение количества N составило
в среднем 18,1 %. Одной из причин отрицательной АМ-эффективности по содержанию
N может быть то, что в полевых условиях бобовые растения всегда формируют как микоризный, так и бобово-ризобиальный симбиоз, поскольку АМ-грибы и ризобии находятся в свободном состоянии практически во всех почвах. Однако в случае отсутствия
специфичных ризобий растение способно ограничить свои потребности в азоте, происходит распределение энергии в пользу симбиотрофного фосфатного питания и накопления в растении веществ, богатых фосфором. Ранее нами было показано, что растение
компенсирует затраты энергии на микоризацию, развивая фотосинтетический аппарат,
68
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
а увеличение ассимиляционной поверхности у листьев люцерны напрямую определяется усилением фосфатного питания растений при микоризации (20).
Рис. 2. Симбиотическая эффективность арбускулярной микоризы (АМ), рассчитанная по сухой массе корней (А) и надземных частей (Б), по кустистости (В) и высоте главного стебля (Г) у растений популяции
Павловская: а, б — соответственно низко- и высокоэффективные линии (вегетационные опыты).
В задачи настоящей работы входил отбор линий, контрастных по симбиотической эффективности АМ, рассчитанной по сухой массе надземных частей растений как
наиболее хозяйственно ценному признаку. Среди растений морфотипа АКС по этим
показателям от остальных отличалась линия Pav05 (см. табл. 1). С большой долей вероятности высокая симбиотическая эффективность этой линии может считаться генетически детерминированным признаком, поскольку только указанная линия статистически достоверно (P < 0,01) выделяется из всего объема выборки значений симбиотической эффективности при оценке сомнительных вариант по показателям продуктивности
без АМ. Поэтому линию Pav05 можно считать облигатным микотрофом, развитие которого резко ограничено в условиях низкого содержания фосфора в почве и отсутствия
АМ-гриба. В связи с высоким полиморфизмом по симбиотической эффективности линий
морфотипического класса АКС мы отобрали из него контрастные генотипы — низкоэффективные Pav02, Pav17, Pav44 и высокоэффективные Pav34, Pav18, Pav05 (рис. 2).
Таким образом, нами впервые описан полиморфизм люцерны хмелевидной по
эффективности симбиоза с эндомикоризным грибом. Показано, что арбускулярная микориза (АМ) оптимизирует фосфатное питание растений, но содержание N в растениях
с АМ значительно ниже, чем в растениях без АМ. Эти данные свидетельствуют о необходимости подбора специальных условий для применения тройной симбиотической
системы АМ-гриб + растение-хозяин + ризобии, которая обеспечит одновременное
улучшение N- и P-питания. Высокоэффективные линии Pav05, Pav18 и Pav34 могут
быть рекомендованы для селекции сортов с повышенной активностью симбиотрофного
питания. Результаты морфотипического анализа популяции Павловская люцерны хмелевидной могут быть использованы для составления генетической коллекции люцерны
хмелевидной и ее внутривидовой классификации.
69
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Mycorrhizal symbiosis /S.E. Smith, D.J. Read (eds.). Cambridge, 2008.
П р о в о р о в Н.А. Соотношение симбиотрофного и автотрофного питания азотом у бобовых растений: генетико-селекционные аспекты. Физиол. раст., 1996, 43: 127-135.
M a r t e n n s o n A., R y d b e r g I. Variability among pea varieties for infection with arbuscular mycorrhizal fungi. Swedish J. Agric. Res., 1994, 24: 13-19.
Я к о б и Л.М., К у к а л е в А.С., У ш а к о в К.В. и др. Полиморфизм форм гороха посевного по эффективности симбиоза с эндомикоризным грибом Glomus sp. в условиях инокуляции ризобиями. С.-х.
биол., 2000, 3: 94-102.
С м е т а н и н В.И., Ш у м н ы й В.К. Структура популяций люцерны (Medicago sativa L.) по уровню азотфиксации. Сиб. вестн. с.-х. науки, 1982, 6(70): 38-43.
Ю р к о в А.П., Я к о б и Л.М., С т е п а н о в а Г.В. и др. Эффективность инокуляции форм люцерны хмелевидной грибом арбускулярной микоризы Glomus intraradices и внутрипопуляционная изменчивость растений по показателям продуктивности и микоризообразования. С.-х. биол., 2007, 5:
67-74.
С о к о л о в А.В. Агрохимические методы исследования почв. М., 1975.
О д у м Ю. Основы экологии /Под ред. Н.П. Наумова. М., 1975.
P h i l l i p s J.M., H a y m a n D.S. Improved procedures for clearing roots and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transact. British Mycor. Soc., 1970,
55: 158-161.
T r o u v e l o t A., K o u g h J.L., G i a n i n a z z i - P e a r s o n V. Mesure du taux de mycorhization VA
d’un systeme radiculaire. Recherche de methodes d’estimation ayant une signification fonctionnelle. In: Physiological
and genetical aspects of mycorrhizae. /V. Gianinazzi-Pearson, S. Gianinazzi (eds.). Paris, 1986: 217-221.
Ю р к о в А.П., Ш и ш о в а М.Ф., С е м е н о в Д.Г. Особенности развития люцерны хмелевидной с эндомикоризным грибом. Saarbrьcken, 2010.
Х е д р и к Ф. Генетика популяций. М., 2003.
Л а к и н Г.Ф. Биометрия. М., 1990.
С т е п а н о в а Г.В. Хозяйственное использование люцерны хмелевидной. Селекция и семеноводство,
1998, 3: 18-20.
М а р ш у н о в а Г.Н., Я к о б и Л.М. Принципы отбора эффективных культур эндомикоризных грибов. В кн.: Микроорганизмы в сельском хозяйстве /Под ред. Г.С. Муромцева. Кишинев, 1988: 166-168.
S a n d e r s F.E., S h e i k h N.A. The development of vesicular-arbuscular mycorrhizal infection in plant
root systems. Plant and Soil, 1983, 71: 223-246.
B r o w n M.E., K i n g F.J. Electron microscopy of mycorrhiza. Meth. Princip. Mycorrhizal Res., 1982, 11: 201-207.
A s i m i S., G i a n i n a z z i - P e a r s o n V., G i a n i n a z z i S. Influence of increasing soil phosphorus levels
on interactions between vesicular-arbuscular mycorrhizae and Rhizobium in soybeans. Can. J. Bot., 1980, 58: 2200-2205.
G u i l l e m i n J.-P., G i a n i n a z z i S., G i a n i n a z z i - P e a r s o n V. e.a. Contribution of arbuscular mycorrhizas to biological protection of micropropagated pineapple [Ananas comosus (L.) Merr]
against Phytophthora cinnamomi Rands. Agr. Sci. Finland, 1994, 3: 241-251.
Ю р к о в А.П., Я к о б и Л.М., С т е п а н о в а Г.В. и др. Влияние арбускулярной микоризы на
рост и развитие люцерны хмелевидной в условиях среднего содержания доступного для растений
фосфора в почве. Ест. тех. науки, 2010, 6(50): 117-123.
1ГНУ
Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: yurkovandrey@yandex.ru, lidija-jacobi@yandex.ru, provorov@newmail.ru,
kojemyakov@rambler.ru;
2ГНУ
Всероссийский институт растениеводства
им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии,
190000 г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 42, 44,
e-mail: vir@vir.nw.ru;
3ФГОУ
ВПО Санкт-Петербургский государственный университет,
199034 г. Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9,
e-mail: mshishova@mail.ru;
4ГНУ
Всероссийский НИИ агрохимии
им. Д.Н. Прянишникова Россельхозакадемии,
127550 г. Москва, ул. Прянишникова, 31а,
e-mail: otdzem@mail.ru
BLACK MEDIC PAVLOVSKAYA POPULATION IS POLYMORPHIC FOR
PRODUCTIVITY, MYCORRHIZATION AND SYMBIOTIC EFFICIENCY
WITH Glomus intraradices
A.P. Yurkov1, L.M. Jacobi1, N.I. Dzyubenko2, M.F. Shishova3, N.A. Provorov1,
A.P. Kojemyakov1, A.A. Zavalin4
Summary
High polymorphism of 45 lines of black medic (Medicago lupulina) Pavlovskaya population for symbiotic efficiency with arbuscular mycorrhiza (AM) strain CIAM8 Glomus intraradices was demonstrated. The plants were grown in
sod-podsol soil under low phosphorus level. In wide-spread and very polymorphic morphotype AKC we isolated the lines
contrasting in AM-efficiency. Mycorrhiza optimized the phosphorus nutrition, but decreased the nitrogen content in plants.
The special conditions should be identified for application of triple symbiotic system AM-fungus + host plant + rhizobium.
70
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631:579.64:581.1.[132.8+135]:
ВИДОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ СОСТАВА КОРНЕВЫХ ВЫДЕЛЕНИЙ
РАСТЕНИЙ И ЕГО ИЗМЕНЕНИЕ В РИЗОСФЕРЕ ПОД ВЛИЯНИЕМ
ПОЧВЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ?
Л.В. КРАВЧЕНКО, А.И. ШАПОШНИКОВ, Н.М. МАКАРОВА, Т.С. АЗАРОВА,
К.А. ЛЬВОВА, И.И. КОСТЮК, И.А. ТИХОНОВИЧ
Исследовали качественный состав и количество корневых выделений — органических кислот и сахаров
в ризосфере растений томата, огурца и различных генотипов пшеницы. Показано сохранение их высокого содержания у овощных культур при инокуляции штаммом Pseudomonas chlororaphis SPB1217. Обсуждается значение
ризосферных микроорганизмов в физиологии растений и возможности селекции последних по составу корневых
выделений для повышения продуктивности агроценозов.
Ключевые слова: корневые выделения, экссудация, ризобактерии, ризосфера.
Keywords: root exudates, exudation, rhizobacteria, rhizosphere.
Важность выделительной функции корней одним из первых оценил известный
отечественный ученый С.П. Костычев, еще в 1926 году предсказавший возможность активизации азотфиксации в прикорневой зоне у небобовых. Он писал о целесообразности изучения корневых выделений и их роли в жизнедеятельности почвенных микроорганизмов
«во взаимной связи» и создания нового направления в физиологии растений под названием
«выделение веществ» (1). Вскоре в работах Д.А. Сабинина, Н.Г. Потапова, А.Л. Курсанова,
И.И. Колосова была выявлена высокая метаболическая активность корней, а И.И. Колосов
также обнаружил, что бактерии, находящиеся на поверхности корня, значительно усиливают его синтетическую активность (2). В последующие годы представления о том, что выделение веществ клетками корней — нормальное проявление процессов жизнедеятельности
(3), подтвердились. Применение изотопной метки 14C позволило оценить размеры корневой экссудации: у растений пшеницы в течение вегетации приблизительно 45 % углерода,
поступившего в корни, выделялось в почву (4), у различных видов трав за 90-суточный период вегетации в нестерильных условиях — 8-15 % фиксированного углерода (5).
Сведения о корневых выделениях пополнились в результате изучения их качественного состава (6-9). Большая серия работ была проведена V. Van?ura с соавт. (10-12),
продемонстрировавшими специфичность набора экссудатов в ризосфере у разных видов
растений. Состав корневых выделений зависит также от стадии развития растения (11,
13), условий роста, физико-химических свойств среды, в которой развивается корневая
система (3). Корневые экзометаболиты проявляют неодинаковые физиологические свойства и представлены спектром органических соединений из разных классов. Это водорастворимые вещества, поступающие из корней в почву; высокомолекулярные полисахариды
(муцигель), образующие тонкие слои на поверхности корней; отслаивающиеся клетки корневого чехлика, которые частично остаются в корневой зоне; отмирающие клетки эпидермиса; летучие и газообразные метаболиты прорастающих семян и корней.
Корневые выделения оказывают значительный эффект на рост и активность
почвенных микроорганизмов. Благодаря использованию современных методов исследования появилось множество экспериментальных доказательств изменения структуры
микробных сообществ ризосферы в зависимости от состава корневых экзометаболитов
(13-15). Хорошо изученным примером взаимного влияния растений и микроорганизмов
служит бобово-ризобиальный симбиоз. На ранней стадии его формирования состав и
количество сигнальных молекул (флавоноидов) в корневых выделениях определяет специфичность и интенсивность взаимодействия растения с определенными видами клубеньковых бактерий, активность которых в ризосфере, в свою очередь, изменяет экссудацию сигнальных молекул растением (16). Похожий механизм выявлен и у арбускулярной микоризы (16).
Не только симбиотические, но и другие ризосферные микроорганизмы воздействуют на корневую экссудацию (17). Ее усиление может происходить за счет дополнительного градиента концентрации органических соединений, направленного от поверхности корня и вызванного трофической активностью микроорганизмов (18), а также
влияния микробных экзометаболитов (19, 20). Обнаружение в корневых выделениях
веществ, аналогичных по механизму действия бактериальным сигналам кворум-сенсинга (QS signal mimics) (15), приводит к выводу о способности растения регулировать рост
и активность популяций ассоциативных ризобактерий в ризосфере. Основываясь на
?
Работа поддержана грантами РФФИ (09-04-13648-офи_ц, 10-04-90009-Бел_а).
71
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
полученных данных о роли микроорганизмов в физиологических процессах у растений,
современная почвенная экология рассматривает ризосферу как систему с обратными
связями, в которой трансформация биогенных элементов, сигнальных молекул и энергии определяется степенью интеграции метаболических процессов и физико-химическим состоянием партнеров (21).
Используемые ранее селекционные программы привели к созданию сортов с пониженным количеством корневых выделений. Возможность генетической модификации
растений с целью изменения состава и количества корневых экзометаболитов, о чем писал С.П. Костычев (22), открывает перспективы для формирования микробно-растительных
систем с улучшенной способностью к адаптации в стрессовых условиях и высокой продуктивностью (23), на что и ориентирована современная селекция (23). Это позволит
приблизить метаболическую активность растений к уровню у исходных генотипов (23).
Известна способность ростстимулирующих ризобактерий повышать интенсивность фотосинтеза (24, 25), что может усиливать приток фотосинтатов в корни и экссудацию. Интерес
также представляет повышение содержания в корневых выделениях органических кислот.
Они играют важную роль в ассоциативной азотфиксации (26) и конкурентной колонизации
корней ризобактериями (27), повышают антифунгальную активность штаммов — антагонистов фитопатогенных грибов (28, 29). Селекция подобных генотипов требует глубокого изучения корневых выделений у сельскохозяйственных культур и их метаболизма в ризосфере,
поскольку необходимо четко определить процедуры проверки результатов отбора.
Наша цель заключалась в анализе состава органических кислот и сахаров в корневых выделениях у различных сельскохозяйственных культур и оценке влияния ризобактерий на содержание питательных субстратов в ризосфере.
Методика. Объектом исследования служили растения томата Lycopersicon esculentum L. (сорт Kapмeлло), огурца Cucumis sativus L. (сорт Грендель), сладкого перца Capsicum
annum L. (сорт Spitfire), диплоидной пшеницы Triticum monococcum (номер по каталогу Всероссийского НИИ растениеводства к-46750) и T. boeoticum (к-40117), гексаплоидной пшеницы сортов Обелиск (к-62032), Безостая 1, Buchanan и Finley. Для инокуляции использовали ризосферный антифунгальный и ростстимулирующий штамм Pseudomonas chlororaphis
SPB1217. Семена томата, огурца и перца стерилизовали 5,0 % раствором гипохлорита натрия в течение 3 мин, семена гексаплоидной пшеницы — 0,1 % раствором сулемы в течение 6 мин, диплоидной пшеницы —4,5 % раствором гипохлорита натрия в течение 1,5 ч.
Растения выращивали 14 сут в фитотроне при 21 °С, освещенности 10 000 лк и фотопериоде 16 ч/8 ч (день/ночь) в стеклянных сосудах объемом 800 мл (томат, огурец, перец) и
стеклянных трубках, с одного конца закрытых марлей и закрепленных в плоскодонных
колбах объемом 250 мл (пшеница), с раствором PNS, содержащим Ca(NO3)2?4H2O — 972;
MgSO4?7H2O — 616; NaNO3 — 140; KH2PO4 — 170; NH4NO3 — 55; Fe-EDTA — 20;
ZnSO4?7H2O — 1,7; B4Na2O7?7H2O — 3,35; CuSO4?5H2O — 0,25 и Na2MoO4?2H2O —
0,12 мг/л (раствор разбавляли в 2 раза). Для инокуляции готовили суспензию клеток P. chlororaphis SPB1217 с титром 105 КОЕ/мл. Бактерии также выращивали 3 сут в среде PNS с
добавлением стерильных корневых выделений от 14-суточных растений для оценки интенсивности потребления этих выделений микроорганизмами (контроль).
Состав органических кислот, углеводов и аминокислот в корневых экссудатах
определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в системе
JASCO LC-900 («Jasco International Co., Ltd.», Япония). Органические кислоты разделяли
на ионообменной хроматографической колонке SUPELCOGEL C-610H («Supelco Gland»,
Швейцария) с ультрафиолетовым детектором (? = 220 нм). В качестве подвижной фазы
применяли раствор 10,0 мМ H3PO4. Сахара фракционировали на хроматографической колонке SUPELCOSIL LC-NH2 («Supelco Gland», Швейцария). В качестве подвижной фазы
использовали смесь ацетонитрил:вода (85:15 по объему). Редуцирующие сахара после
фракционирования выявляли при помощи колориметрической реакции (окрашивающим
реактивом служил раствор хлористого 2,3,5-трифенилтетразолия). Поглощение окрашенного комплекса измеряли на ультрафиолетовом детекторе при ? = 487 нм. Аминокислоты
идентифицировали высокочувствительным методом AccQ-Tag («Waters», США), который
основан на анализе их специфичных флуоресцирующих производных. Для анализа использовали стандартный набор реактивов AccQ-Fluor Reagent Kit («Waters», США).
Все эксперименты проводили в 3-кратной повторности. Статистическую обработку выполняли с помощью программы STATISTICA V-5. Представлены средние арифметические значения со стандартным отклонением.
Результаты. Основными органическими кислотами корневых выделений у томата были лимонная (79,0 % от суммарного количества) и янтарная (14,0 %), у огурца —
яблочная (38,4 %) и янтарная (41,4 %), у сладкого перца — лимонная (45,3 %), яблочная
(30,6 %) и янтарная (23,5 %), у гексаплоидной пшеницы — яблочная и янтарная (соответственно 55,3 и 27,2 % — у сорта Обелиск, 39,7 и 56,8 % — у сорта Buchanan, 21,7 и 74,4 % —
у сорта Finley). В корневых выделениях у сорта Безостая 1 яблочная кислота составляла
72
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
более 90 % от суммарного количества органических кислот. Особенностью растений сорта
Обелиск оказалась достаточно высокая доля лимонной кислоты — 11,0 %. Диплоидные генотипы пшеницы характеризовались высоким содержанием янтарной кислоты (до 90 % от
общего количества). В составе сахаров в корневых выделениях у томата преобладали фруктоза (54,0 %) и глюкоза (29,0 %), у огурца — глюкоза (70,5 %), у сладкого перца — глюкоза
(52,6 %) и фруктоза (43,3 %). Особенностью гексаплоидной пшеницы было повышенное
содержание мальтозы и мелибиозы: соответственно от 19,5 % у сорта Безостая 1 до 61,0 % у
сорта Обелиск и от 8,0 % у сорта Обе1. Суммарное количество органических килиск до 66,5 % у сорта Безостая 1. Больслот и сахаров (мкг/растение) в коршую часть остальных сахаров составляневых выделениях при выращивании в
ли фруктоза и глюкоза. У диплоидных
жидкой среде PNS (M±m)
генотипов T. monococcum и T. boeoticum
Культура, сорт, обраОрганические
Сахара
доля мальтозы равнялась соответственно
зец по каталогу ВИР
кислоты
66,0 и 63,5 %, фруктозы — 17,4 и 11,7 %,
Овощные культуры
глюкозы — 7,7 и 10,0 %.
Томат, сорт Кармелло
53,5±5,8
2,6±0,4
Огурец, сорт Грендель
23,0±3,0
7,0±0,9
Наибольшее суммарное количеСладкий перец, сорт Spitfire
48,3±5,2
6,5±0,8
ство
органических
кислот в расчете на одГексаплоидная пшеница
но растение отмечали у пшеницы сорта
Triticum aestivum
Сорт Безостая 1
79,4±8,2
253,0±27,1
Безостая 1 и томата (соответственно 79,4 и
Сорт Обелиск
19,7±2,4
249,3±26,1
53,5 мкг/растение), наибольшее количестСорт Buchanan
49,1±5,4
158,9±17,0
во сахаров — у всех сортов гексаплоидСорт Finley
22,6±3,0
209,3±21,4
Диплоидная пшеница
ной пшеницы (табл. 1). За 14 сут суммарT. boeoticum (к-40117)
28,3±3,2
55,5±5,8
ная экссудация органических кислот и
T. monococcum (к-46750)
17,1±1,9
28,1±3,1
сахаров составляла 0,1-1,3 % от величины
П р и м е ч а н и е. PNS — состав среды см. в раздесухой биомассы растений. Минимальные
ле «Методика». ВИР — Всероссийский НИИ растениеводства (г. Санкт-Петербург).
значения отмечали у огурца и T. monococcum (соответственно 0,1 и 0,2 %), наибольшие — у гексаплоидных сортов пшеницы (1,0-1,2 %) и томата (1,3 %).
Молярное соотношение органических кислот и сахаров в корневых выделениях овощных культур (А) и пшеницы
(Б) при выращивании в жидкой среде PNS: 1, 2 и 3 — соответственно томат (сорт Кармелло), огурец (сорт
Грендель) и сладкий перец (сорт Spitfire); 4 и 5 — диплоидная пшеница Triticum monococcum и T. boeoticum,
образцы по каталогу ВИР (Всероссийский НИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова, г. Санкт-Петербург)
соответственно к-46750 и к-40117; 6-9 — гексаплоидная пшеница T. aestivum, соответственно сорта Безостая 1, Buchanan, Finley и Обелиск. PNS — состав среды см. в разделе «Методика».
У исследуемых видов растений корневые выделения заметно различались по
соотношению органических кислот и сахаров — основных питательных субстратов для
ризосферных микроорганизмов. У овощных культур в экссудатах доминировали органические кислоты (их суммарное количество было в 4,7-11,1 раза больше, чем количество сахаров) (рис., А). Значительные различия по этому показателю были выявлены у
генотипов пшеницы (см. рис., Б). Небольшое преобладание органических кислот отмечали в корневых выделениях у диплоидов T. monococcum и T. boeoticum, сахаров — у
всех гексаплоидных сортов. Только у сорта Безостая 1 доля органических кислот в экссудатах была сравнительно высока и достигала 0,76 (см. рис., Б).
Для оценки влияния инокуляции штаммом P. chlororaphis SPB1217 на количество
корневых выделений отобрали культуры, различающиеся по относительному содержанию
органических кислот, — томат, огурец и гексаплоидную пшеницу сортов Безостая 1 и Обелиск. В ризосфере растений и при культивировании бактерий in vitro на среде со стерильными корневыми выделениями (без растений) штамм P. chlororaphis SPB1217 активно рос,
73
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
достигая во всех анализируемых вариантах примерно одинаковой численности (соответственно около 107, 106 и 108 КОЕ/растение, КОЕ/мл PNS). При этом in vitro ризобактерии потребляли не менее 90 % органических кислот и сахаров корневых выделений. В опытах с инокуляцией общее количество органических кислот в выделениях у томата было в 1,7 раза, у
огурца — в 1,4 раза выше, чем у стерильных растений, общее количество сахаров также возрастало (табл. 2). В ризосфере сохранялось высокое содержание активно утилизируемых субстратов (лимонная, яблочная и янтарная кислоты, глюкоза, фруктоза), которые практически
полностью потреблялись in vitro. В корневых выделениях пшеницы в этих условиях количество органические кислот значительно снижалось (см. табл. 2), особенно у сорта Обелиск,
для которого были характерны наименьшие показатели их экссудации (см. табл. 1) и доли
по сравнению с сахарами (см. рис., Б). Существенно меньше снижалась концентрация сахаров (см. табл. 2), но оставшуюся их часть составляли в основном мальтоза и мелибиоза.
Сохранение достаточного
2. Суммарное количество органических кислот и
количества питательных субстрасахаров в корневых выделениях растений при
тов в ризосферной зоне способно
инокуляции штаммом Pseudomonas chlororaphis
SPB1217 (M±m)
служить одним из факторов успешного взаимодействия растений и поОрганические кислоты
Сахара
лезных ризобактерий. Можно предВариант
к контрок контромкг/растение
мкг/растение
лю, %
лю, %
положить наличие разных стратеТ о м а т, с о р т К а р м е л л о
гий подавления фитопатогенной
Контроль
53,5±5,8
2,6±0,4
инфекции у растений, в корневых
Опыт
93,0±10,3
173,8
2,9±0,3
111,5
О г у р е ц, с о р т Г р е н д е л ь
выделениях которых преобладают
Контроль
23,0±3,0
7,0±0,9
органические кислоты (овощные
Опыт
31,3±3,7
136,1
11,5±1,3
164,3
культуры) и сахара (пшеница). ОбоГексаплоидная пшеница
Triticum aestivum
гащение прикорневой зоны органиСорт Обелиск
ческими кислотами будет способстКонтроль
19,7±2,4
249,3±26,1
вовать активной колонизации корОпыт
1,8±0,4
9,1
139,3±14,3
55,9
Сорт Безостая 1
ней микроорганизмами, биосинтезу
Контроль
79,4±8,2
253,0±27,1
антифунгальных метаболитов и инОпыт
22,3±2,9
28,1
183,6±20,5
72,6
дукции реакций системной устойП р и м е ч а н и е. Контроль — стерильные растения, опыт —
инокулированные растения.
чивости у растения, а стимуляция
экссудации даст ризобактериям дополнительное конкурентное преимущество. Данные о том, что псевдомонады продуцируют экзометаболиты, которые значительно усиливают корневую экссудацию, получены
для растений люцерны, кукурузы и пшеницы (20). В состав соединений, оказывающих
влияние на экссудацию, входили феназины, выделяемые штаммом P. chlororaphis SPB1217
(29), и 2,4-диацетилфлороглюцин (20). Повышение доли сахаров (мальтозы, мелибиозы) в
корневых выделениях может ослабить конкуренцию между ризобактериями и фитопатогенными грибами за источники питания. Снижение фитопатогенной нагрузки на растение в этом случае будет связано как с активностью ризобактерий-антагонистов, так и с
уменьшением агрессивности фитопатогена. Показано, что при наличии в ризосферной
почве доступного для гриба питания и меньшей конкуренции F. culmorum развивается как
сапротроф с минимальной колонизацией корней или ее замедлением (30).
Таким образом, при изучении количественного состава органических кислот и
сахаров в ризосфере растений томата, огурца и различных генотипов пшеницы выявлена
его специфичность. Высокое содержание этих растительных метаболитов в ризосфере сохранялось у овощных культур при инокуляции штаммом Pseudomonas chlororaphis SPB1217.
Современное развитие идей С.П. Костычева, предсказавшего важное значение корневых
выделений для почвенных микроорганизмов и нормальной жизнедеятельности растений,
показывает, что создание перспективных для устойчивого земледелия растительно-микробных систем требует селекции растений, способных обогащать ризосферу полезными
для себя микроорганизмами, которые, в свою очередь, будут формировать благоприятную
среду обитания за счет регулирования метаболической активности корневой системы. То
есть наиболее перспективной представляется тесная функциональная интеграция партнеров ассоциативных растительно-микробных симбиозов.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
74
К о с т ы ч ев С.П. Физиология растений. Ч. 2. М.-Л., 1933.
Г е н к е л ь П.А. Физиология растений с основами микробиологии. М., 1962.
С м и р н о в А.М. Рост и метаболизм изолированных корней в стерильной культуре. М., 1970.
M a r t e n s R. Contribution of rhizodeposits to the maintenance and growth of soil microbial biomass. Soil
Biol. Biochem., 1990, 22: 141-147.
B i o n d i n i M., K l e i n D.A., R e d e n t e E.F. Carbon nitrogen losses through root exudation Agropy-
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
ron cristatum, A. smithii and Bouteloua gracilis. Soil Biol. Biochem., 1988, 20: 477-482.
И в а н о в В.П. Растительные выделения и их значение в жизни фитоценозов М., 1973.
R o v i r a A.D. Plant root exudates. Bot. Rev., 1969, 35: 35-57.
H a l e M.G., M o o r e L.D., G r i f f i n G.J. Root exudates and exudation. In: Interaction between nonpathogenic soil microorganisms and plants /Y.R. Dommergues, S.V. Krupa (eds.). Amsterdam, 1978: 163-203.
L y n c h J.M., W h i p p s J.M. Substrate flow in rhizosphere. Plant and Soil, 1990, 129: 1-10.
V a n ? u r a V., H o v a d i k A. Root exudates of plants. II. Composition of root exudates of some vegetables.
Plant and Soil, 1965, 22: 21-32.
V a n ? u r a V., H a n z l i k o v a A. Root exudates of plants. IV. Differences in chemical composition of
seed and seedlings exudates. Plant and Soil, 1972, 36: 271-282.
V a n ? u r a V., S t o t z k y G. Gaseous and volatile exudates from germinating seeds and seedlings. Canad.
J. Bot., 1976, 54: 518-532.
F o l m a n L.B., P o s t m a J., V a n V e e n J.A. Ecophysiological characterization of rhizosphere bacterial communities at different root locations and plant developmental stages of cucumber grown on rockwool. Microbiol. Ecol., 2001, 42: 586-597.
B r o e c k l i n g C., B r o z A., B e r g e l s o n J. e.a. Root exudates regulate soil fungal community composition and diversity. App. Environ. Microbiol., 2008, 74(3): 738-744.
B a i s H.P., W e i r T.L., P e r r y L.G. e.a. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants
and other organisms. Annu. Rev. Plant Biol., 2006, 57: 233-266.
Т и х о н о в и ч И.А., П р о в о р о в Н.А. Симбиозы растений и микроорганизмов: молекулярная
генетика агросистем будущего. СПб, 2009.
V a n c u r a V., P r i c r y l Z., K a l a c h o v a L. e.a. Some quantitative aspects on root exudation: Soil
organisms as components of ecosystems. Ecological Bulletins (Stockholm), 1977, 25: 381-386.
B o w e n G.D. Misconceptions, concepts and approaches in rhizosphere biology. In: Contemporary microbial ecology /D.C. Ellwood, J.N. Hedger e.a. (eds.). London, 1980: 283-304.
M e h a r g A.A., K i l l h a m K. Loss of exudates from the roots of perennial ryegrass inoculated with a range
of microorganisms. Plant and Soil, 1995, 170: 345-349.
P h i l l i p s D.A., F o x C.T., K i n g M.D., B h u v a n e s w a r i T.V., T e u b e r L.R. Microbial products
trigger amino acid exudation from plant roots. Plant Physiol., 2004, 136: 2887-2894.
M o o r e J.C., M c C a n n K., S e t д l д H. e.a. Top-down is bottom-up: does predation in the rhizosphere
regulate aboveground dynamics? Ecology, 84: 846-857.
К о с т ы ч е в С.П. Избранные труды по физиологии и биохимии микроорганизмов. Т. II. М., 1956: 384.
R e n g e l Z. Genetic control of root exudation. Plant and Soil, 2002, 245: 59-70.
Z h a n g F., D a s h t i N., H y n e s R.K. e.a. Plant growth-promoting rhizobacteria and soybean [(Glycine max (L.) Merr.] growth and physiology at suboptimal root zone temperatures. Ann. Bot., 1997, 79: 243-249.
B a s e t M i a M.A., S h a m s u d d i n Z.H., W a h a b Z. e.a.. The effect of rhizobacterial inoculation
on growth and nutrient accumulation of tissue-cultured banana plantlets under low N-fertilizer regime. African J.
Biotechnol., 2009, 8(21): 5855-5866.
К р а в ч е н к о Л.В., А з а р о в а Т.С., Д о с т а н к о О.Ю. Влияние корневых экзометаболитов пшеницы с различной плоидностью генома на рост Azospirillum brasilense. Микробиология, 1993, 62(5): 863-868.
L u g t e n b e r g B.J.J., K r a v c h e n k o L.V., S i m o n s M. Tomato seeds and root exudate sugars:
composition, utilization by Pseudomonas biocontrol strains and role in rhizosphere colonization. Environ. Microbiol., 1999, 1: 439-445.
К р а в ч е н к о Л.В., А з а р о в а Т.С., Л е о н о в а - Е р к о Е.И. и др. Корневые выделения томатов и их влияние на рост и антифунгальную активность штаммов Pseudomonas. Микробиология, 2003,
72(1): 48-53.
Ш т а р к О.Ю., Ш а п о ш н и к о в А.И., К р а в ч е н к о Л.В. Продуцирование антифунгальных
метаболитов Pseudomonas chlororaphis при росте на различных источниках питания. Микробиология,
2003, 72(5): 645-650.
С т р у н н и к о в а О.К., В и ш н е в с к а я Н.А., Б о р о д и н а Е.В. и др. Влияние целлюлозы на
развитие Fusarium culmorum в ризосфере и ризоплане ячменя и интенсивность проявления корневой гнили.
Микология и фитопатология, 2008, 42(6): 68-74.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: kravchenko@LK5659.spb.edu, ai-shaposhnikov@mail.ru,
nm_makarova@yahoo.com, ts_azarova@yahoo.com,
ograrnik@mail.ru, taustob@rambler.ru,
contact@arriam.spb.ru
CHARACTERIZATION OF THE ROOT EXSUDATES IN PLANT SPECIES AND ITS
CHANGES IN RHIZOSPHERE UNDER THE INFLUENCE OF SOIL
MICROORGANISMS
L.V. Kravchenko, A.I. Shaposhnikov, N.M. Makarova, T.S. Azarova, K.A. L’vova,
I.I. Kostyuk, I.A. Tikhonovich
Summary
Composition and quantitative characteristics of root exudates, i.e. organic acids and sugars, were estimated in rhizoshpere of tomato and cucumber plants, and different wheat genotypes. It is shown that the content
of these compounds is stably high in vegetables inoculated with Pseudomonas chlororaphis strain SPB1217. The role
of rhizosphere microorganisms in plant physiology is discussed, and breeding the plants with the specified composition of root exudates to increase the productivity of agrocenosis is considered.
75
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
Микробиология почвы
УДК 631.46:579.64:[632.954+631.45
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВЫ,
ЗАГРЯЗНЕННОЙ ГЕРБИЦИДОМ ПРОМЕТРИНОМ
Ю.В. КРУГЛОВ, Л.Н. ПАРОМЕНСКАЯ
В модельных опытах оценили влияние различных растительных остатков, торфяного биологически активного грунта и органических веществ на скорость разложения прометрина. Установлено, что формируемый при компостировании дерново-подзолистой почвы и торфа с соломой овса консорциум почвенных бактерий, включающий
Sporocytophaga sp., Xanthomonas sp., Pseudomonas sp., разлагает прометрин, используя целлюлозу и гемицеллюлозу, а
также продукты их гидролиза (глюкозу, галактозу, ксилозу, арабинозу и маннозу) как энергетический материал и косубстраты. Установлена высокая эффективность биологически активного субстрата, полученного на основе такого
консорциума, при биоремедиации загрязненной прометрином почвы.
Ключевые слова: прометрин, деградация, микроорганизмы, биоремедиация почвы.
Keywords: prometryne, degradation, microorganisms, soil bioremediation.
Прометрин, или 2-метилтио-4,6-бис-(изопропиламино)-сим-триазин, рекомендован для использования против большого числа сорняков на посевах хлопчатника,
сои, люпина, картофеля, моркови, многих овощных и зеленных культур (1, 2). В зависимости от климатических условий, агротехнических мероприятий и типа почвы его персистентность обычно составляет 3-6 мес, но известны случаи, когда фитотоксичность проявлялась более года после внесения препарата (3, 4). Длительное присутствие прометрина
и продуктов его трансформации в почве может вызывать снижение урожая у чувствительных к гербициду сельскохозяйственных культур, включаемых в дальнейшем в севооборот.
Одним из основных факторов трансформации и детоксикации ксенобиотиков в
окружающей среде являются почвенные микроорганизмы. Из почвы выделены различные виды бактерий и микромицетов, способные разлагать прометрин. Некоторые из
них при выращивании на минеральных питательных средах используют его в качестве
источника углерода (5), азота (6, 7) и серы (8). Однако достаточно высокая персистентность прометрина в природных условиях приводит к выводу, что в почве в силу ряда
причин складываются неблагоприятные условия для реализации детоксикационных
возможностей микроорганизмов (9-11). Одна из них — недостаток лабильного органического вещества, необходимого для осуществления процессов кометаболизма ксенобиотиков. В связи с этим для ускорения микробной деградации пестицидов предпринимались
попытки введения в почву дополнительного органического вещества в виде навоза, компостов, растительных остатков и т.д. Однако результаты оказались неоднозначными: наблюдался как положительный эффект, так и торможение процессов разложения (12-17). Такая
вариабельность не получила достаточно четкого объяснения. Вместе с тем понимание взаимоотношений в системе органическое вещество—пестициды—микроорганизмы исключительно важно для развития эффективных методов биоремедиации загрязненной почвы.
Цель настоящей работы — оценить влияние различных органических субстратов на формирование микрофлоры почвы и роль последней в деградации гербицида
прометрина.
Методика. В модельных опытах использовали легкосуглинистую дерново-подзолистую почву с рН 6,4, содержанием гумуса 2,0 % и полной влагоемкостью (ПВ) 30 %.
Почвенные образцы отбирали в поле с глубины 0-15 см, просеивали через сито (размер
ячеек 3 мм) и увлажняли до 60 % от ПВ. По 0,5 кг почвы помещали в пластмассовые
сосуды и в соответствии с вариантом опыта вносили водную суспензию гербицида прометрина [2-метилтио-4,6-бис-(изопропиламино)-сим-триазин] в дозе 0,5-1,0 мг/кг и органические субстраты в количестве 5 % от массы почвы. Этими субстратами служили
солома овса, зеленая масса кукурузы и люпина, скошенная через 1 мес после всходов,
биологически активный торфяной грунт (БАГ), а также крахмал, пептон, целлюлоза.
Сосуды с почвой инкубировали в термостате при 26 °С, периодически отбирая пробы
для химических и микробиологических анализов. Прометрин экстрагировали ацетоном,
определяя его количество методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) (18). Время
разложения гербицида вычисляли на основании графиков его деградации в течение 4 мес.
Микробиологические анализы почвы проводили общепринятыми методами, высевая
разведения почвенной суспензии на агаризованные питательные среды (19, 20). Численность гетеротрофных эубактерий учитывали на глюкозо-пептонной среде, актинобактерий — на крахмало-аммиачном агаре, грибов — на среде Чапека. Микроорганиз-
76
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
мы выделяли традиционными методами на агаризованной питательной среде Гетчинсона
(целлюлозоразлагающие бактерии) и глюкозо-пептонном агаре (20). Бактерии идентифицировали до рода на основании морфологических и физиолого-биохимических признаков (21). Активность фермента целлюлазы определяли по скорости накопления глюкозы при гидролизе карбоксиметилцеллюлозы в субстрате (20).
Для приготовления торфо-соломистого компоста использовали верховой пушице-сфагновый торф (пос. Форносово, Ленинградская обл.), степень разложенности 15 %,
исходное значение рН — 3,2, в который добавляли 10 % соломы овса, 5 % мела
(CaCO3), а также NH4NO3, суперфосфат и K2SO4 (соответственно 1,0; 2,0 и 0,5 г на 1 кг
торфа). Смесь расфасовывали в полиэтиленовые пакеты вместимостью 2 л, время и температура компостирования — 2 мес при 26 °С, конечное значение рН компоста 6,6-6,8.
Целлюлозоразлагающую активность определяли по скорости разложения субстрата на
почвенных пластинках (22). Численность гетеротрофных микроорганизмов оценивали методом предельных разведений на агаризованной минеральной питательной среде Александера следующего состава (г/л): K2HPO4 — 1,6; KH2PO4 — 0,4; NH4NO3 — 0,5; MgSO4 —
0,2; CaCl2 — 0,02, FeCl2 — 0,03, дрожжевой экстракт — 0,2 и агар-агар — 15. В качестве источника углерода в среду вносили 1 % целлюлозы, гемицеллюлозы, глюкозы, галактозы,
ксилозы, арабинозы или маннозы (в зависимости от варианта опыта). Способность микрофлоры компоста разлагать гербицид изучали в модельном опыте: к промытому речному
песку, помещенному в чашки Петри, добавляли жидкую минеральную среду Александера с
различными источниками углерода, а также прометрин (100 мг/кг). Для инокуляции использовали водную суспензию компоста, которую вносили в чашки Петри, тщательно перемешивая песок в стерильных условиях (контроль — варианты без инокуляции). Содержание прометрина определяли через 3 нед инкубации при температуре 26 °С.
Эффективность применения торфо-соломистого компоста (биологически активного субстрата — БАГС) для разложения прометрина оценивали в лабораторных опытах:
в почву с прометрином вносили 5 % компоста и инкубировали при температуре 26 °С.
Содержание гербицида в почве определяли через 3 нед методом ГЖХ (18).
Математическую обработку результатов выполняли по Н.А. Плохинскому (23)
(приведены средние арифметические и их ошибки для 3-5 повторностей).
Результаты. Внесение органических субстратов неодинаково влияло на скорость
деградации прометрина в почве: зеленая масса кукурузы и люпина замедляла, а солома и
биологически активный торфяной грунт (БАГ) ускоряли этот процесс (табл. 1).
Использованные органи1. Оценка скорости разложения гербицида проческие субстраты имеют сложный
метрина при внесении в почву различных оргахимический состав и качественно
нических субстратов (лабораторный опыт)
различаются: в зеленой массе люВремя разложения, сут
пина и кукурузы содержится знаОрганический субстрат
на 50 %
на 90 %
чительное количество легкоподвижР а с т и т е л ь н ы е о с т а т к и, б и о л о г и ч е с к и
ных органических соединений, вклюа
а к т и в н ы й т о р ф я н о й г р у н т (Б А Г)
чая белки, аминокислоты и сахара,
Контроль
25
90
в соломе овса и в торфяном грунте
Зеленая масса люпина
95
> 120
углерод находится преимущественЗеленая масса кукурузы
40
85
но в составе полисахаридов — целСолома овса
13
35
БАГ
10
30
люлозы, гемицеллюлоз, а также
О р г а н и ч е с к и е с о е д и н е н и яб
лигнина (24). Результаты модельКонтроль
22
60
ных опытов показали, что органиКрахмал
12
19
ческие соединения действительно
Целлюлоза
12
17
оказывают на деградацию прометПептон
60
> 120
П р и м е ч а н и е. Исходное содержание прометрина в
рина неодинаковое действие. Разпочве 0,50 мг/кг (а) или 0,85 мг/кг (б).
ложение гербицида ускорялось в
почве с крахмалом и целлюлозой
и замедлялось при внесении пептона (см. табл. 1).
2. Динамика содержания микроорганизмов (КОЕ/г почвы) после внесения органических субстратов (лабораторный опыт)
Вариант
Контроль
Крахмал
Целлюлоза
Пептон
Эубактерии, Ѕ105
5-е сут
10-е сут 35-е сут
130±20
270±55
630±110
2400±360
60±13
70±12
110±25
1730±320
70±11
170±39
160±30
3300±264
Грибы, Ѕ103
5-е сут 10-е сут 35-е сут
Актинобактерии, Ѕ104
5-е сут 10-е сут 35-е сут
110±25
200±38
170±40
120±30
480±73
160±30
40±13
50±11
190±23
320±29
280±44
210±31
270±41
110±26
270±47
270±31
200±18
180±39
130±21
40±11
190±23
90±16
130±30
300±45
Вместе с тем следует отметить, что внесение любого из используемых в опыте органических субстратов приводило к существенному росту численности аэробных гетеро-
77
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
трофных эубактерий, некоторому увеличению количества грибов и снижению численности актинобактерий (табл. 2). Таким образом, при добавлении органического вещества наблюдалось интенсивное размножение микроорганизмов и перестройка микробного сообщества. Доминирующее по численности положение в нем занимали эубактерии. При сопоставлении скорости разложения гербицида с результатами микробиологического анализа (см. табл. 1, 2) оказалось, что деградация не связана напрямую с количеством гетеротрофных микроорганизмов в почве. Так, численность эубактерий в присутствии пептона была в десятки раз выше, а скорость разложения гербицида — существенно ниже, чем
в других вариантах опыта.
Из органических суб3. Численность микроорганизмов, утилизирующих
стратов,
используемых
в опыте,
3
различные моносахара (Ѕ10 КОЕ/г почвы), при
наибольший интерес представвнесении в почву соломы и компоста (лабораторляют растительные полисахариный опыт)
ды, прежде всего целлюлоза, коВариант
Глюкоза Галактоза
Арабиноза Манноза
торая составляет основную массу
П
350
250
170
2500
растительных остатков, поступаПС
11 000
20 000
3000
33 000
ющих в почву после уборки уроТСК
50 000
–
50 000
35 000
жая. Возникает вопрос: какова
П р и м е ч а н и е. П, ПС и ТСК — соответственно почва,
почва + солома и торфо-соломистый компост. Прочерк ознасвязь между скоростью разложечает, что анализ не проводили.
ния гербицида и содержанием
соломы в почве?
Результаты анализа целлюлазной активности показали, что уже через 1 нед после внесения соломы в почву скорость накопления глюкозы возрастала более чем в 2 раза
(79 против 33 мг?100 г-1?24 ч-1 в контроле), при этом разница сохранялась в течение
всего опыта (через 2 нед — соответственно 80±4,0 и 32±2,8, через 3 нед — 75±4,5 и
30±3,5 мг ?100 г-1?24 ч-1). В то же время через 3 нед компостирования почвы с соломой
в ней увеличивалась численность бактерий, учитываемых на средах с глюкозой, галактозой, маннозой и арабинозой; то же наблюдали при компостировании соломы с торфом
(табл. 3). Такой рост численности мог произойти только в результате поступления моносахаров в почву в процессе ферментативного гидролиза целлюлозы и гемицеллюлоз соломы микроорганизмами. Следовательно, в почве, компостируемой с соломой, формируется
и занимает доминирующее положение микробное сообщество, в котором ключевая роль
принадлежит микроорганизмам, гидролизующим целлюлозу и гемицеллюлозу.
При оценке способно4. Эффективность разложения гербицида прометсти представителей этого сообщерина консорциумом микроорганизмов, сформиства разлагать гербицид на искусровавшимся в торфо-соломистом компосте, на
ственных питательных средах,
минеральной питательной среде с добавлением
инокулированных суспензией торразличных источников углерода (лабораторный
фо-соломистого компоста (табл.
опыт)
4), мы показали, что наиболее
Разложено прометрина
интенсивная деградация происИсточник углерода
мг/л, M±m
%
ходила на средах с маннозой, гаБез углерода
6,0±1,2
7,9
лактозой и арабинозой. Почти
Целлюлоза
45,5±2,3
59,0
такую же активность разложеГемицеллюлоза
49,6±1,5
65,2
Сахароза
49,3±1,7
64,8
ния прометрина отмечали в приГлюкоза
26,8±2,1
35,3
сутствии целлюлозы и гемицелГалактоза
44,9±2,2
59,1
люлозы. В то же время на среАрабиноза
50,6±1,5
66,5
де без углерода гербицид пракМанноза
54,4±1,7
71,6
тически не разлагался. Иными
П р и м е ч а н и е. Исходная концентрация прометрина 76,9 мг/л.
словами, некоторые представители микробного консорциума, формирующегося при гидролизе соломы, способны эффективно разлагать прометрин, используя полисахариды целлюлозу и гемицеллюлозу, а
также продукты их гидролиза в качестве энергетического материала.
Для выявления состава такого консорциума из почвы получили накопительную
культуру микроорганизмов, утилизирующую целлюлозу. После нескольких пассажей из нее
были выделены чистые культуры бактерий, идентифицированные как Sporocytophaga sp.,
Xanthomonas sp., Pseudomonas sp.
На минеральной среде Гетчинсона консорциум микроорганизмов (Sporocytophaga sp.,
Xanthomonas sp., Pseudomonas sp. и др.) активно разлагал прометрин, причем скорость разложения зависела от источника углерода: в присутствии целлюлозы за 1 мес — 11,0 мг
гербицида, глюкозы — 20,0 мг, арабинозы — 45,4 мг, или более 90 % (рис.). Чистая
культура Sporocytophaga sp. достаточно хорошо росла на среде с целлюлозой или глюкозой,
но не разлагала прометрин. Xanthomonas sp. и Pseudomonas sp. не усваивали целлюлозу в ка-
78
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
честве источника углерода, соответственно, не росли и не разлагали гербицид, но эффективно деградировали его на среде с глюкозой. Иными словами, целлюлозоразлагающие
бактерии Sporocytophaga sp. успешно деградируют гербицид не в чистой культуре, а в составе ассоциации с бактериями-спутниками, которые используют глюкозу, образующуюся при гидролизе целлюлозы. Этим и объясняется положительный эффект соломы
на деградацию гербицида в почве.
Эффективность разложения гербицида прометрина
консорциумом утилизирующих целлюлозу бактерий на минеральной питательной среде с добавлением различных источников углерода: 1-3 — консорциум микроорганизмов, утилизирующих целлюлозу (Sporocytophaga sp., Xanthomonas sp., Pseudomonas sp. и др.), в присутствии соответственно целлюлозы, глюкозы и арабинозы; 4, 5 — Sporocytophaga sp. соответственно в присутствии целлюлозы и глюкозы; 6, 7 — соответственно Xanthomonas sp. и Pseudomonas sp. на среде с целлюлозой;
8, 9 — соответственно Xanthomonas sp. и Pseudomonas sp. на среде с глюкозой (лабораторный опыт;
исходная концентрация прометрина — 50 мг/л).
Практический вывод о возможности направленно формировать микробное сообщество, способное разлагать пестициды, посредством внесения растительных остатков
с высоким содержанием полисахаридов, был реализован в подходе, заключавшемся во
введении в загрязненную прометрином почву биологически активного торфяного субстрата (БАГС) со сформированным консорциумом микроорганизмов, разлагающим гербицид. При испытании эффективности применения такого субстрата для деградации прометрина в дерново-подзолистой почве в трех независимых опытах установлено, что введение компоста значительно повышает скорость разложения гербицида. Так, в контроле (без БАГС) при исходном содержании прометрина в 1-м, 2-м и 3-м опыте соответственно 6,5; 10,8 и 10,3 мг/кг разложилось соответственно 1,7; 3,6 и 3,4 мг/кг (или 26, 33
и 33 % гербицида). В вариантах с добавлением БАГС исходное содержание составило
соответственно 6,8; 10,3 и 9,0 мг/кг, количество деградированного гербицида — 6,1; 8,2
и 7,0 мг/кг (или 89, 80 и 79 %). Полученные результаты указывают на перспективность
такого подхода при биоремедиации почв.
Известно, что полисахариды целлюлоза и гемицеллюлоза, на которые приходится около 50 % органического углерода, поступающего в почву с растительным опадом, играют ведущую роль в формировании и функционировании микробного комплекса почвы (25). Скорость разложения растительного опада служит показателем биологической активности и плодородия почвы. При ферментативном гидролизе целлюлозы и гемицеллюлоз образуются моносахара, используемые сопутствующей микрофлорой в
качестве источника углеродного питания и энергии. В почве формируется консорциум, в
котором ключевую роль играют микроорганизмы, продуцирующие ферменты гидролиза
растительных полисахаридов. Наши исследования показали, что при компостировании
почвы с соломой, содержащей в сумме до 70 % целлюлозы и гемицеллюлозы, скорость
разложения прометрина возрастает в 2-3 раза, что коррелирует с повышением активности фермента целлюлазы. При этом существенно увеличивается число микроорганизмов, использующих образующиеся моносахара в качестве энергетического материала,
которые разлагают прометрин. Доминирующие формы этого консорциума в торфосоломистом компосте — бактерии рода Sporocytophaga sp., Xanthomonas sp. и Pseudomonas sp. (две последние разлагают прометрин, используя в качестве источника углерода
глюкозу). Возможно, механизм деградации гербицида связан с его использованием
микроорганизмами в качестве источника азота или процесс идет по типу кометаболизма, когда сахара, образующиеся при гидролизе полисахаридов, используются сопутствующей микрофлорой в качестве косубстратов. Из полученных результатов следует, что
консорциум микроорганизмов, формирующийся при разложении растительных полисахаридов, служит важнейшим фактором самоочищения почв от пестицидов и других органических ксенобиотиков. Этот вывод представляет интерес для оценки и прогнозирования биодеградабельности ксенобиотиков в почве, с одной стороны, и развития методов биоремедиации техногенно загрязненных почв — с другой.
Ранее М.С. Соколов и соавт. (26) показали, что в разных природно-климатических
зонах при повышении скорости разложения растительного опада персистентность пестицидов снижалась (то есть их деградация происходила быстрее). На основании этого был
предложен метод классификации зональной биодеградабельности пестицидов, что следует учитывать при разработке экологически безопасных технологий применения химических средств защиты растений. Их наблюдения и выводы подтверждают, что растительный опад, включающий в качестве основного компонента целлюлозу и гемицеллюлозу,
79
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
имеет решающее значение в микробиологических процессах деградации пестицидов.
Итак, внесение в почву растительных остатков, богатых полисахаридами, или
специальных биологически активных торфо-соломистых субстратов, включающих отселектированный консорциум микроорганизмов, утилизирующих целлюлозу, — простой
и доступный агротехнический прием, открывающий большие перспективы для эффективного управления процессом биоремедиации почв, загрязненных пестицидами.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
М е л ь н и к о в Н.Н., Н о в о ж и л о в К.В., Б е л а н С.Р., П ы л о в а Т.Н. Справочник по
пестицидам. М., 1985.
Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории
Российской Федерации. М., 2003.
М е л ь н и к о в Н.Н., В о л к о в а А.И., К о р о т к о в а О.А. Пестициды и окружающая среда. М., 1977.
K h a n S.U. Studies on bound 14C-prometryne residues in soil and plants. Chemosphere, 1982, 11(8): 771-795.
И г н а т о в е т с О.С., Л е о н т ь е в В.Н. Механизм разложения прометрина бактериями рода
Pseudomonas. Докл. НАН Беларуси, 2008, 3: 82-86.
M y s k o w W., L a s k o t e T., S t a c h y r a A. Cyanuric acids-triazine derivate as a nitrogen source
for some soil microorganisms. Acta Microbiol. Pol., 1983, 32(2): 80-85.
C o o k A.M., H u t t e r R. Triazines as nitrogen sources for bacteria. J. Agric. Food Chem., 1981, 29:
1135-1143.
C o o k A.M., H u t t e r R. Ametryne and prometryne as sulfur sources for bacteria. Appl. Environ. Microbiol., 1982, 43(4): 781-786.
S i m s J.L., S i m s R.S., M a t t h e w s J.E. Approach to bioremediation of contaminated soil. Hazard.
Waste Hazard. Mater., 1990, 7(2): 117-149.
К р у г л о в Ю.В. Микрофлора почвы и пестициды. М., 1991.
S k l a d n y G.J., M e t t i n g F.B. Bioremediation of contaminated soil. In: Soil microbial ecology (Application in agricultural and environmental management) /F.B. Metting (ed.). N.Y., Basel, Hong-Kong, Marcel
Deccer Inc., 1993: 483-513.
B e i l i n c k C. Influence de quelques amendementssur la mineralisation de la atrazine 14C dans un sol
frais de prairie et la immobilization des residues. Rev. Ecol. Biol. Sol., 1983, 20(4): 435-444.
Г о л о в л ё в а Л.А., Ф и н к е л ь ш т е й н З.И., Ш у р у х и н Ю.В., Б а р ы ш н и к о в а Л.М.
Биоремедиация почв, загрязненных симазином. Агрохимия, 1993, 12: 57-61.
H o u t S., B a r i u s s o E., B e r g h e a u n d V. Modification to atrazine degradation pathways in a
loamy soil after addition of organic amendments. Soil Biol. Biochem., 1998, 30(40): 2147-2157.
R o u c h a u d J., G u s t i n F., V a n H i m m e M. e.a. Influence of the organic fertilizers treatments
on the soil persistence of the imazamethalenz and izoxabene herbicides in winter wheat crops. Mededelingen
Faculteit Landbouwwetenschappen, 1992, 57(3b): 1185-1191.
S a t o K. Effect of nutrients on interaction between pesticide pentachlorophenol and microorganisms in soil.
In: Bioremediation through rizosphere technology /T.A. Anderson, Y.K. Coats (eds.). ACS Symp. Series, v. 563.
Am. Chem. Soc., Washington, DC, 1994: 43-55.
A s s a f N.F., T u r c o R.F. Influence of carbon and nitrogen application on atrazine degradation in soil.
Amer. Soc. Agron. Ann. Meeting. Minneapolis, 1992: 248-249.
Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде
/Под ред. М.А. Клисенко. М., 1983.
С е г и Ж. Методы почвенной микробиологии. М., 1983.
А с е е в а И.В., Б а б ь е в а И.П., Б ы з о в Б.А. и др. Методы почвенной микробиологии и биохимии /Под ред. Д.Г. Звягинцева. М., 1991.
Определитель бактерий Берджи /Под ред. Дж. Хоулт, Н. Криг, П. Снит и др. Т. 1-2. М., 1997.
К р у г л о в Ю.В., П а р о м е н с к а я Л.Н. Микробиологические методы оценки экологической
опасности применения пестицидов. М., 1991.
П л о х и н с к и й Н.А. Биометрия. М., 1970.
А л е к с а н д р о в а Л.А. Органическое вещество почвы и процессы его трансформации. Л., 1980.
Г у з е в В.С., И в а н о в Л.И. Концептуальная модель микробного сообщества почвы. В сб.: Биотехнология микроорганизмов в сельском хозяйстве. М., 1989: 78-89.
С о к о л о в М.С., С т р е к о з о в Б.П., Э ч к а л о в А.П. и др. Схематическая карта использования и детоксикации пестицидов СССР. В сб.: Почвоведение и агрохимия. Пущино, 1977: 128-135.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: kruglov@arriam.spb.ru
MICROBIOLOGICAL FACTORS OF SELF-PURIFICATION AND
BIOREMEDIATION OF SOIL POLLUTED BY HERBICIDE PROMETRYNE
Yu.V. Kruglov, L.N. Paromenskaya
Summary
Composting of soddy-podzolic soil and peat with oats straw amplifies cellulose decomposing capacity and increases number of the microorganisms, which use products of polysaccharides cellulose and hemicellulose hydrolysis. Thus
the consortium in which cellulose decomposing microorganisms play a key role is formed. The culture of such consortium
decomposes prometryne, using cellulose and hemicellulose, and also products of their hydrolysis (glucose, galactose, xylose,
arabinose and mannose) as an energetic material and co-substrates. High efficiency of peat-straw compost with consortium of microorganisms for bioremediation of the soil polluted by herbicide prometryne is demonstrated.
80
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 632.954:636.46:574.34:575:577.2
АНАЛИЗ ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИН РЕСТРИКЦИОННЫХ ФРАГМЕНТОВ
ДНК ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ДИНАМИКИ ПОЧВЕННЫХ МИКРОБНЫХ
СООБЩЕСТВ В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ КСЕНОБИОТИКОВ*
Е.В. ПЕРШИНА, Е.Е. АНДРОНОВ, А.Г. ПИНАЕВ, Г.А. АХТЕМОВА,
В.А. ДУМОВА, Н.А. ПРОВОРОВ
Изучали возможность совместного использования методов ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных
фрагментов) и АГК (анализ главных компонентов) для количественной оценки изменений в почвенном микробном сообществе, состоящем из бактерий, грибов и архей, при внесении ацетона и 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4Д). Вычисление индекса Шеннона показало, что при внесении ксенобиотиков разнообразие грибов возрастает, архей — незначительно снижается, бактерий — не изменяется. Впервые продемонстрировано, что применение метода АГК позволяет определить относительные скорости сукцессии в микробном сообществе, максимальные значения которых наблюдали для грибов.
Ключевые слова: микробное сообщество, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), анализ главных компонентов (АГК), скорость сукцессии, ксенобиотики.
Keywords: microbial community, T-RFLP, PCA, succession rate, xenobiotics.
Почвенные микробные сообщества имеют сложную генетическую и пространственную организацию и относятся к одним из наиболее богатых по биоразнообразию. Их
детальный анализ, который в настоящее время возможен в основном с использованием
метода секвенирования генетических библиотек, представляет собой крайне трудоемкую
задачу. Однако на практике часто требуется своевременно и четко выяснить, будет ли изменяться структура микробного сообщества в тех или иных условиях и какой характер
носят эти изменения. В этом случае применяют экспресс-методы оценки биоразнообразия, в частности ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов — terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP) (1). Метод позволяет получить ДНКпрофили фрагментов гена 16S-рРНК бактерий (или ITS-фрагментов для грибов), в которых структура микробного сообщества описывается с помощью двух параметров — длины
терминального рестрикционного фрагмента маркерного гена (положение определенного
пика на ПДРФ профиле) и доли этого фрагмента в суммарной ДНК (площадь под пиком). ПДРФ — один из немногих методов молекулярно-гене-тического анализа, которые
могут быть использованы в широкомасштабных мониторинговых исследованиях. Не будучи трудоемким, он позволяет проводить комплексное изучение почвенной микробиоты
с рассмотрением трех основных групп — бактерий, архей и грибов. Это крайне важно,
поскольку такие основные характеристики почвы, как плодородие и «здоровье», не
столько зависят от какого-то одного компонента сообщества, сколько представляют собой результат взаимодействия различных групп микроорганизмов. Несмотря на то, что
метод ПДРФ уже давно используется для анализа микробного разнообразия, до сих пор
нет единых подходов для обработки и интерпретации получаемых данных (2, 3). Так, открытым остается вопрос об определении таксономического положения микроорганизмов
по результатам ПДРФ, поскольку разные виды могут иметь одинаковую локализацию
сайтов рестрикции (4). Дополнительные трудности вносят некоторые технические особенности метода, в частности различная подвижность терминальных фрагментов ДНК в
геле, связанная с соотношением в них пуриновых и пиримидиновых оснований (5).
Возможность использовать ПДРФ без присвоения пикам точных таксономических характеристик очень актуальна при изучении почвенной микробиоты, где число
видов на 1 г почвы может достигать многих сотен (6). Для оценки данных необходимо
применять методы многофакторного анализа, среди которых наибольшее распространение получил АГК (анализ главных компонентов) (7).
В настоящее время в сельскохозяйственной практике остро стоит проблема
биоремедиации, связанная с загрязнением почв ксенобиотиками. Долгое время при ее
решении размер и состав микробной популяции оценивали классическими методами
культивирования микроорганизмов на питательных средах. При этом неоднократно подчеркивалось (8), что выявляемая таким образом численность микроорганизмов как минимум на порядок меньше определяемой при анализе почвенной ДНК.
Мы изучили возможность применения метода ПДРФ для оценки ксенобиотического воздействия на почвенное микробное сообщество на примере внесения в почву
ацетона и гербицида 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д), сопоставив результаты
обработки полученных данных с использованием традиционных (индексы разнообразия)
и многофакторных (АГК) подходов. Отличительная особенность предпринятого исследо*
Работа поддержана грантом РФФИ 09-04-00386a и государственным контрактом Минобрнауки РФ № 16.512.11.2132.
81
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
вания — его комплексность, а именно учет всех трех компонентов сообщества (бактерии, археи, грибы), что позволяет получить его полную характеристику.
Методика. Модельный опыт проводили на образцах дерново-подзолистой почвы
лесной зоны (Ленинградская обл.). Почву отбирали из горизонта А1 на площади 10 м2 в
5 равноудаленных точках и просеивали через сито (3 мм) до однородной структуры. Опыт
выполняли в 4 сосудах, содержащих по 2 кг почвы, влажность которой (60 % от полной
влагоемкости) поддерживали в лабораторных условиях регулярным поливом. Контроль
(1-й сосуд) содержал необработанную почву, 2-й сосуд — ту же почву с добавлением ацетона (2,5 мл на 1 кг влажной почвы), 3-й и 4-й — почву с внесенной 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислотой (2,4-Д), растворенной в ацетоне (2,5 мл на 1 кг почвы), в количестве
соответственно 50 и 250 мг/кг. Перед загрузкой почву перемешивали с вносимыми веществами в течение 10 мин. Сосуды закрывали бумагой и инкубировали при 20 °С в течение
2 мес. Пробы массой 1 г (по 3 независимые) отбирали из верхнего слоя (3-5 см) на равном
расстоянии друг от друга и от стенок сосуда на 4-е, 7-е, 14-е, 21-е, 28-е и 60-е сут (следующие сутки после полива). Всего получили 72 образца, которые хранили при ?70 °С.
ДНК выделяли независимо из 3 проб почвы (по 0,33 г каждая) в соответствии со
стандартной методикой (9).
При получении библиотеки гена 16S-рРНК бактерий для ПЦР использовали 3 пары праймеров — fD1/rD1: 27f 5ґ-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3ґ, 1525r 5ґ-AAGGAGGTGATCCAGCC-3ґ (10); fBD1/rBD1: 642f 5ґ-HAATHYGTGCCAGCAGC-3ґ, 1445r 5ґGTCRTCCYDCCTCCTC-3ґ (11); Eu3*: 63f (WellRed) 5ґ-AGGCCTAACACATGCAAGTC-3ґ,
1494r 5ґ-TACGGYTACCTTGTTACGAC-3ґ (12). ПЦР проводили по стандартной методике (9). ПЦР-фрагменты клонировали в векторе pAL-TA, полученными конструкциями
трансформировали компетентные клетки Escherichia coli (штамм DH10B). Нуклеотидную
последовательность гена 16S-рРНК определяли с применением интернального праймера FGPS(485-292) 5ґ-CAGCAGCCGCGGTAA-3ґ (13) в автоматическом секвенаторе SEQ8000
с использованием набора реагентов и прилагаемой к нему инструкции фирмы-производителя «Beckman Coulter» (США). Микроорганизмы идентифицировали, применив приложение Naпve Classifier базы данных RDPII (http://rdp.cme.msu.edu/classifier/classifier.jsp).
Количественную ПЦР выполняли для трех групп исследуемых микроорганизмов (бактерий, архей и грибов) по стандартной методике (9). Для оценки динамики
численности микроорганизмов осуществляли линейную аппроксимацию экспериментальных данных.
При анализе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) использовали флуоресцентно меченные праймеры: для бактерий — Eu3*; для архей — Ar3f* 5ґTTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3ґ, AR927r 5ґ-CCCGCCAATTCCTTTAAGTTTC-3ґ; для
грибов — ITS1f* (WellRed) 5ґ-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3ґ, ITS4r 5ґ-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3ґ. Амплифицированный фрагмент (100-200 нг) обрабатывали эндонуклеазой HaeIII (амплификат контрольного почвенного образца разделяли на 4 части и обрабатывали эндонуклеазами HaeIII, RsaI, HpaII и MboI). Для разделения и анализа фрагментов ДНК использовали оборудование и реактивы фирмы «Beckman Coulter» (США).
Пики, составляющие менее 1 % от их суммарной площади, не учитывали. Оставшиеся пики объединяли в типы с принятой в исследовании погрешностью (1,5 нуклеотида). Данные анализировали в программе PAST с помощью метода АГК. Для расчета площадей
эллипсов пользовались формулой S = ?AB, где А и В — длины полуосей. Площадь каждого
эллипса на графиках представляли в единицах условного масштаба, затем вычисляли
значения относительной площади по сравнению с контролем. ПДРФ-профили для эндонуклеаз HaeIII, RsaI, HpaII и MboI анализировали на соответствие полученных пиков
предполагаемым таксономическим кандидатурам с помощью программы Fragment Sorter
(FRAGSORT) (http://www.oardc.ohio-state.edu/trflpfragsort/index.php).
Для расчета индекса биоразнообразия Шеннона использовали следующую формулу: H = ? ? (ni/N) ln(ni/N), где ni — доля вида в сообществе, N — общее число видов.
Результаты. О п р е д е л е н и е о б щ е й ч и с л е н н о с т и м и к р о о р г ан и з м о в. Численность трех групп микроорганизмов как в контрольных, так и в опытных
образцах не претерпевала существенных изменений в течение всего эксперимента. Основную долю в микробном сообществе, выраженную через число рибосомных оперонов
на 1 г почвы (9), составляли бактерии (7,1Ѕ108), далее следовали археи (9,9Ѕ107), затем
грибы (6,0Ѕ106). У архей разброс значений численности по повторностям опыта был
больше, чем у бактерий и грибов.
П Д Р Ф - а н а л и з к о н т р о л ь н о г о о б р а з ц а д е р н о в о - п о дз о л и с т о й п о ч в ы. После секвенирования последовательностей гена 16S-рРНК
бактерий из контрольного образца почвы их депонировали в базу данных GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) (всего 105 последовательностей, HQ412669-HQ412763).
По результатам идентификации исследуемые нуклеотидные последовательности были
отнесены к бактериальным филам Proteobacteria (32 %), Acidobacteria (26 %), Verrucomicrobia (7 %), Actinobacteria (4 %), Bacteroidetes (3 %), Planctomycetes (3 %), Chlamydiae (3 %)
и Firmicutes (2 %). Известно, что увеличение числа используемых эндонуклеаз рестрик-
82
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ции повышает точность определения таксономической характеристики пиков в ПДРФпрофиле (14). В работах по изучению почвенных сообществ для идентификации микроорганизмов авторы рекомендуют использовать не менее трех частощепящих рестриктаз.
Мы провели ПДРФ-анализ контрольного образца с использованием четырех эндонуклеаз (HaeIII, RsaI, HpaII и MboI), но при этом наличие большого числа таксономических кандидатур сохранялось практически у всех пиков в профиле. Так, при анализе
одного из ПДРФ-профилей (получен с помощью эндонуклеазы HaeIII) (рис. 1) каждому пику оказались присвоены несколько предполагаемых таксономических кандидатур,
в некоторых случаях исчисляемых десятками. Достаточно часто пику соответствовал
набор кандидатур из неродственных бактериальных таксонов различного ранга. Например, для пиков 201 п.н. и 220 п.н. среди кандидатур встречались представители как филы Firmicutes, так и филы Actinobacteria (см. рис. 1). Необходимо отметить, что подобное
характерно именно для почвенного сообщества, поскольку оно лидирует по числу видов микроорганизмов.
Рис. 1. ПДРФ-профиль, полученный с помощью эндонуклеазы HaeIII для микробного сообщества в образце
почвы без ксенобиотиков. Предполагаемые таксономические кандидатуры для каждого пика объединены в
группы; отмечены таксономические группы, которые были обнаружены при анализе библиотек гена 16SрРНК (модельный опыт, описание см. в разделе «Методика»); НБ — некультивируемые бактерии.
Сравнение ПДРФ-профиля с данными по секвенированию и идентификации
клонированных последовательностей 16S-рРНК показало, что как среди кандидатур пиков, так и в составе генетических библиотек обнаруживаются последовательности представителей трех наиболее крупных бактериальных фил — Proteobacteria, Actinobacteria и
Firmicutes. В библиотеке гена 16S-рРНК явно превалировали последовательности представителей порядка Rhizobiales, в том числе относящихся к роду Rhodoplanes. Кандидатуры этих микроорганизмов также присвоены доминантному пику на ПДРФ-профиле
(см. рис. 1), а значит, именно они преобладают в анализируемом сообществе.
П Д Р Ф - а н а л и з д и н а м и к и п о ч в е н н о г о с о о б щ е с т в а.
При суммарном анализе всех профилей ПДРФ было выделено 223 типа пиков, из которых 39 принадлежали бактериальному, 119 — грибному и 65 — археотному компонентам сообщества (приведены примеры их ПДРФ-профилей через 60 сут после начала
эксперимента) (рис. 2).
Для бактериального сообщества профили ПДРФ в шести временных промежутках
в контрольном образце оказались идентичными, в том числе по прошествии 2 мес опыта.
Внесение в почву ацетона и 2,4-Д оказало минимальное воздействие на сообщество,
что выражалось в появлении незначительного числа (не более 2 %) минорных пиков
(см. рис. 2). В сообществе архей в контрольном образце через 1 нед после начала опыта
из ПДРФ-профилей исчезла значительная часть пиков, но появились новые — 119,5 и
137,0 п.н. Доля первого оставалась постоянной, второго — постепенно увеличивалась и
достигла максимума (11,88 %) через 2 мес. Кроме описанных качественных характеристик, изменялись и количественные. Так, на 4-е сут наибольшую долю в ПДРФ-про-
83
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
филях (28,82 %) занимал пик с размером терминального фрагмента 269,5 п.н., спустя неделю после начала эксперимента его сменил пик 192,5 п.н., доля которого в профилях при
этом возросла с 5,79 до 27,87 %. На 2-ю и 3-ю нед соотношение этих пиков на ПДРФпрофилях выравнялось и в среднем составило 23 % от общей площади пиков. В течение последующих 2 нед произошла еще одна смена доминирующих пиков, в частности
пик размером 213,5 п.н. начал увеличиваться с 1-х сут и на 5-ю нед стал занимать лидирующее положение (25,80 %), и это соотношение трех доминирующих пиков сохранилось до окончания наблюдения. Сходные тенденции в изменении площадей трех доминирующих пиков отмечали и в остальных вариантах опыта. Как и для бактерий, для
архей было характерно появление ряда минорных пиков на профилях ПДРФ, характеризующих влияние на сообщество ацетона и 2,4-Д.
А
Б
В
Рис 2. ПДРФ-профили компонентов микробного сообщества почвы — бактерий (А), грибов (Б) и архей (В) в
контроле (без ксенобиотиков, верхний ряд), при добавлении в почву ацетона (средний ряд) и ацетона с 2,4дихлорфеноксиуксусной кислотой (250 мг/кг, нижний ряд) (60-е сут, модельный опыт, описание см. в разделе «Методика»). По оси абсцисс — размер фрагмента ДНК (п.н.), по оси ординат — интенсивность флуоресценции (усл. ед.).
Наибольший эффект ксенобиотики оказали на грибной компонент сообщества.
В контроле через 2 нед на ПДРФ-профилях наблюдалась смена пиков, в частности
практически полностью исчезла группа с длинами терминальных фрагментов ДНК 50,5122,5 п.н. и пик 512,5 п.н., однако через 2 мес исходный профиль восстановился. Воздействие ацетона, как и в предыдущих случаях, приводило к появлению пиков, доля которых не превышала 2,5 %. В ответ на внесение 2,4-Д, помимо изменений в составе профилей, значительно колебалось процентное соотношение между пиками. С начала эксперимента наблюдалось уменьшение доли абсолютного доминанта (460,5 п.н.) на фоне
увеличивающегося количества фрагментов 474,5 и 476,5 п.н. Постепенно состав доминирующих групп пиков полностью сменился: если на 3-й нед эксперимента на них
приходилось 15,17; 16,88 и 25,97 %, то к окончанию эксперимента значения изменились, составив соответственно 2,84; 13,80 и 39,75 %.
Таким образом, анализ ПДРФ-профилей показал, что реакция каждой группы
микроорганизмов индивидуальна. У бактерий и архей внесение ацетона и его сочетание
с 2,4-Д оказали сравнимое (в случае бактерий даже большее) воздействие на структуру
микробного сообщества. Возможно, в этих сообществах есть группы, способные использовать ацетон в качестве субстрата, поскольку на фоне угнетения доминирующих
форм временное преимущество получают минорные группы микроорганизмов. Интересен и тот факт, что наибольшие изменения в структуре бактериального сообщества вызвало не совместное действие двух абиотических факторов (ацетон и 2,4-Д), а наличие
только ацетона. Известно, что многие почвенные бактерии способны разлагать 2,4-Д
(15, 16). По-видимому, гербицид в исследуемой модельной системе утилизировался на-
84
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
равне с другими доступными субстратами при одновременном участии многих микроорганизмов и не вызвал существенных изменений в структуре сообщества. Тем не менее, даже таких малых изменений было достаточно для повышения устойчивости сообщества к ацетону. Самые сильные изменения происходили в структуре грибного сообщества. Причем (в отличие от бактерий и архей) на грибы основной эффект оказала
совместная обработка почвы ацетоном и 2,4-Д, которая вызвала полную смену доминирующей группы. Столь существенные изменения могут быть обусловлены, с одной стороны, угнетающим действием 2,4-Д в отношении некоторых видов грибов, с другой —
размножением микроорганизмов, способных к деградации ксенобиотика.
М а т е м а т и ч е с к о е о п и с а н и е с у к ц е с с и и м и к р о б н о г о с оо б щ е с т в а. Анализ общего разнообразия (индекс Шеннона, рис. 3) для всех исследуемых сообществ, а также результаты оценки общей численности микроорганизмов, полученные в количественной ПЦР, свидетельствуют об отсутствии существенных изменений в
уровене биоразнообразия в бактериальном сообществе. Для грибного сообщества наблюдалось заметное повышение
биоразнообразия при ксенобиотическом воздействии по сравнению с контрольным образцом (см. рис. 3). Противоположную закономерность отмечали для сообщества архей, где внесение
ксенобиотиков вызывало некоторое понижение индекса Шеннона. Анализ данных количественной ПЦР и индексов
общего биоразнообразия позволяет предположить, что выраженные изменения
в структуре грибного и археотного сообществ в сравнении с бактериальным
сообществом связаны с их меньшей
относительной численностью.
При использовании метода АГК
(6, 17) для определения относительной
скорости сукцессии бактериального, археотного и грибного сообществ матрицей служил список выявленных пиков
и их долей в ПДРФ-профиле. На графиках АГК (рис. 4) можно наблюдать
за развитием каждого из трех компонентов микробного сообщества как единой
системы, последовательно меняющей
координаты в математическом пространстве по точкам временной шкалы (на
4-е, 7-е, 14-е, 21-е, 28-е и 60-е сут
эксперимента). Мы представляем (см.
рис. 4) одну из двумерных проекций
Рис. 3. Величины индекса Шеннона (Н) для трех исследуемых компонентов почвенного сообщества микроорганизмов: А,
совокупности из 6 таких точек для трех
Б, В — соответственно бактерии, грибы, археи; а, б, в, г —
исследуемых сообществ. Эллипсы отконтроль, внесение ацетона, внесение 2,4-дихлорфенокражают размах варьирования данных при
сиуксусной кислоты (2,4-Д) в количестве 50 и 250 мг/кг
5 % уровне значимости. Площади элпочвы (модельный опыт).
липсов, характеризующих воздействие
ацетона и 2,4-Д, соответствуют скорости сукцессии в исследуемых сообществах в ответ
на стресс. В таблице приведены значения площади эллипсов, рассчитанные относительно величины для контрольных почвенных образцов.
Для сравнения скорости сукОтносительная площадь эллипсов, характерицессии в трех исследуемых сообществах
зующих степень воздействия ксенобиотиков на
в течение опыта произвели расчет отнотри компонента микробного сообщества
сительных площадей эллипсов, вклюКомпонент
Фактор воздействия
чающих все экспериментальные точки
сообщества 1
2
3
4
1+2+3+4
(см. рис. 4, г., табл.). При этом за едиА
1,0 9,8 0,7 2,5
1,0
ницу принимали площадь наименьшего
Б
1,0 2,7 0,4 2,2
4,6
из эллипсов.
В
1,0 0,9 2,7 10,6
367,5
Анализируя эти данные (см.
A + Б + В 1,0 1,4 1,4 3,6
Не вычисляли
табл., рис. 4), можно сделать вывод, что
П р и м е ч а н и е. Изображение и описание эллипсов
наибольшим изменениям подверглась
см. на рисунке 4. A — бактерии, Б — археи, В — грибы;
1 — контроль, 2 — внесение ацетона, 3 — ацетон + 2,4-Д
структура грибного сообщества, причем
(2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота, 50 мг/кг), 4 — ацеосновной вклад в изменения внес ответ
тон + 2,4-Д (250 мг/кг).
грибного сообщества на добавление в
85
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
почву ацетона и высокой дозы 2,4-Д. Изменения в структуре бактериального и археотного
сообществ были выражены намного слабее. Показатели для бактериального сообщества
(см. табл.) хорошо согласуются с результатами анализа ПДРФ-профилей и подтверждают, что скорость сукцессии сообщества при совместном внесении ксенобиотиков
ниже таковой в случае избирательного действия ацетона. При этом она возрастает с
увеличением количества доступного бактериям 2,4-Д. Для сообщества архей скорости
сукцессии при внесении ацетона и ацетона совместно с высокой дозой 2,4-Д близки и
значительно превышают значения для варианта с низкой дозой 2,4-Д. Интересно, что в
этом случае имеет место компенсаторный эффект стрессовых факторов, то есть влияние ацетона может быть снижено внесением определенного количества 2,4-Д. Необходимо отметить, что приведенные результаты согласуются с изменениями индекса биоразнообразия Шеннона (см. рис. 3), то есть метод АГК может применяться в исследованиях по экологическому мониторингу.
А
Б
В
Г
Д
Рис. 4. Графическое представление данных анализа
главных компонентов (АГК) для трех компонентов микробного сообщества: А — бактерии, Б — археи, В —
грибы, Г — совокупное действие стрессовых факторов
на бактериальное (а), археотное (б) и грибное (в) сообщество; 1 — контроль, 2 — внесение ацетона, 3 —
ацетон + 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота,
50 мг/кг), 4 — ацетон + 2,4-Д (250 мг/кг). Сукцессия
обозначается шестью точками, которые соответствуют
структуре сообщества на 4-е, 7-е, 14-е, 21-е, 28-е и
60-е сут эксперимента и находятся внутри эллипсов.
Итак, использование метода ПДРФ
(полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) совместно с АГК (анализ главных
компонентов) позволяет проводить комплексные мониторинговые исследования сообществ микроорганизмов. Изучение динамики разных микробных сообществ в едином многомерном математическом пространстве дает возможность ранжировать их по отношению к определенному абиотическому или биотическому агенту. В настоящей работе
86
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
мы впервые показали, что в отличие от классического анализа с использованием индексов
общего биоразнообразия метод АГК дает количественную оценку скорости сукцессии сообщества (по значениям относительной площади эллипсов, характеризующих размах варьирования экспериментальных данных). Особого внимания заслуживает неодинаковая степень воздействия абиотических факторов на исследуемые сообщества. Таким образом, молекулярная экология становится актуальным подходом для решения не только фундаментальных, но и сугубо практических задач.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
L u k o w T., D u n f i e l d P.F., L i e s a c k W. Use of the T-RFLP technique to assess spatial and
temporal changes in the bacterial community structure within an agricultural soil planted with transgenic and
non-transgenic potato plants. FEMS Microbiol. Ecol., 2000, 32: 241-247.
O s b o r n A.M., M o o r e E.R., T i m m i s K.N. An evaluation of terminal-restriction fragment length
polymorphism (T-RFLP) analysis for the study of microbial community structure and dynamics. Environ.
Microbiol., 2000, 2: 39-50.
F o r n e y L.J., Z h o u X., B r o w n C.J. Molecular microbial ecology: land of the one-eyed king.
Curr. Opinion Microbiol., 2004, 7: 210-220.
D u n b a r J., T i c k n o r L.O., K u s k e C.R. Phylogenetic specificity and reproducibility and new
method for analysis of terminal restriction fragment profiles of 16S rRNA genes from bacterial communities.
Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67: 190-197.
K a p l a n C., K i t t s C. Variation between observed and true Terminal Restriction Fragment length is
dependent on true TRF length and purine content. J. Microbiol. Methods, 2003, 54: 121-125.
S c h l o s s P.D., H a n d e l s m a n J. Toward a census of bacteria in soil. PLOS Computational
Biologу, 2006, 2: 786-793.
D o l l h o p f S.L., H a s h s h a m S.A., T i e d j e J. Interpreting 16S rDNA T-RFLP data: application
of self-organizing maps and principal component analysis to describe community dynamics and convergence.
Microb. Ecol., 2001, 42: 495-505.
E l l i s R.J., M o r g a n Ph., W e i g h t m a n A.J. e.a. Cultivation-dependent and -independent approaches for determining bacterial diversity in heavy-metal-contaminated soil. Appl. Environ. Microbiol.,
2003, 69(6): 3223-3230.
А н д р о н о в Е.Е., П е т р о в а С.Н., Ч и ж е в с к а я Е.П. и др. Влияние генетически модифицированного штамма Sinorhizobium meliloti ACH-5 на структуру почвенного сообщества микроорганизмов. Микробиология, 2009, 78(4): 1-10.
W e i s b u r g W.G., B a r n s S.M., P e l l e t i e r D.A. e.a. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study. J. Bacteriol., 1991, 173(2): 697-703.
К о р о с т и к Е.В., П и н а е в А.Г., А х т е м о в а Г.А. и др. Универсальные 16S rRNA праймеры для описания генетического разнообразия сообщества почвенных прокариот. Экологическая генетика, 2006, 4(4): 33-38.
S i n g h B., N a z a r i e s L., M u n r o S. e.a. Use of multiplex terminal restriction fragment length
polymorphism for rapid and simultaneous analysis of different components of the soil microbial community.
Appl. Environ. Microbiol., 2006, 72: 7278-7285.
N o r m a n d P., O r s o S., C o u r n o y e r B. Molecular phylogeny of the genus Frankia and related genera
and emendation of the family Frankiaceae. J. Syst. Bacteriol., 1996, 46: 1-9.
D u n b a r J., T i c k n o r L.O., K u s k e C.R. Assessment of microbial diversity in four United States
soils by 16S rRNA gene terminal restriction fragment analysis. Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66(7):
2943-2950.
G o n o d L.V., M a r t i n - L a u r e n t F., C h e n u C. 2,4-D impact on bacterial communities, and
the activity and genetic potential of 2,4-D degrading communities in soil. FEMS Microbiol. Ecol., 2006, 58:
529-537.
M a c u r R., W h e e l e r J., B u r r M. e.a. Impacts of 2,4-D application on soil microbial community
structure and on populations associated with 2,4-D degradation. Microbiol. Res., 2006, 162: 37-45.
C u l m a n S.W., G a u c h H.G., B l a c k w o o d C.B. e.a. Analysis of T-RFLP data using analysis of
variance and ordination methods: A comparative study. J. Microbiol. Meth., 2008, 75(1): 55-63.
F i e r e r N., J a c k s o n R.B. The diversity and biogeography of soil bacterial communities. PNAS,
2006, 103(3): 626-631.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
16 февраля 2011 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: pershina.elizaveta@yandex.ru
THE USE OF T-RFLP METHOD FOR STUDYING THE DYNAMICS OF SOIL
MICROBIAL COMMUNITIES UNDER XENOBIOTICS TREATMENT
E.V. Pershina, E.E. Andronov, A.G. Pinaev, G.A. Akhtemova, V.A. Doumova, N.A. Provorov
Summary
The possibility of using T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) and PCA (Principal
Component Analysis) to quantify changes in soil microbial community composed of bacteria, fungi and archaea after
acetone and 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) treatment was investigated. The Shannon index calculation showed
that diversity in fungi community increases after xenobiotics treatment, archaeal community has slightly decreasing indexes
while indexes values for bacterial community remain constant. For the first time it was shown that PCA can be
successfully used for investigation of the rate of succession for three components of the microbial community, maximum
rates of succession speed were observed for fungi community.
87
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631.427.22:578.69
ГРАФ-АНАЛИЗ ГЕННО-МЕТАБОЛИЧЕСКИХ СЕТЕЙ ПОЧВЕННЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ РАСТИТЕЛЬНЫЕ
ОСТАТКИ В ГУМУСОВЫЕ ВЕЩЕСТВА
Н.И. ВОРОБЬЕВ1, О.В. СВИРИДОВА1, А.А. ПОПОВ1, И.В. РУСАКОВА2,
В.Б. ПЕТРОВ1
С использованием дисперсионного, корреляционного, кластерного, факторного и граф-анализа оценили результаты эксперимента по микробиологической трансформации лигнинсодержащих растительных остатков с последующим выращиванием ячменя (сорт Северянин, вегетационные опыты). С помощью фрактальной модели и графанализа показано, что при трансформации растительных остатков в почве образуются две генно-метаболические сети
микроорганизмов. Первый этап деструкции в гумусообразовательных сетях осуществляют бактерии Pseudomonas fluorescens и микромицеты Penicillium chrysogenum Thom. 1910. Активно участвуют в синтезе гумусовых веществ амилолитические и протеолитические бактерии.
Ключевые слова: генно-метаболическая сеть микроорганизмов, Pseudomonas fluorescens, Penicillium
chrysogenum, граф-анализ микробиологических и физико-химических данных, фрактальная модель микробиологической трансформации органических веществ.
Keywords: gene-methabolic network of microorganisms, Pseudomonas fluorescens, Penicillium chrsogenum,
graph-analysis for microbiological and physical-chemical data, fractal model of microbiological transformation of organic substances.
Микробиологическая
трансформация органического
вещества в гумусовые формы —
главный процесс в обеспечении
почвенного плодородия (1, 2).
Первичное органическое вещество (растительные остатки и корневые экссудаты) трансформируется в гумус не всегда (3), а
только при определенных физикохимических условиях, когда микробиота перестраивается в соответствующую генно-метаболическую сеть (ГМС) (4, 5) (рис. 1) —
организованное сообщество, возникающее вследствие межорганизменного сигналинга и последовательной экспрессии генов, входящих в метагеном этого
сообщества. ГМС образуются для
осуществления многоэтапных биРис. 1. Схема биохимических процессов при трансформации растиохимических процессов, в кототельных остатков в почве: стрелки 1, 2 и 3 — соответственно базовый
рых в определенном порядке чепроцесс полной минерализации органических субстратов в почве,
редуются этапы деструкции и
синтез гумусовых веществ при специальных условиях в почве и деструкция гумусовых веществ при недостатке органического вещества.
синтеза сложных органических
молекул. Например, при гумусообразовании в ГМС одновременно может происходить деструкция растительных остатков до
мономерных растворимых и газообразных минеральных соединений, синтез из продуктов
деструкции гумусовых веществ и деструкция гумусовых веществ (см. рис. 1, стрелки 1, 2, 3).
Гумусовые вещества — эффективное средство закрепления биогенных элементов в почве.
Синтез гумусовых веществ служит альтернативой полной минерализации исходных субстратов до СО2, воды и других элементарных соединений углерода, азота и фосфора. Чем больше образуется гумусовых веществ в почве, тем больше биогенных элементов удается
предохранить от вымывания и выветривания. Гумусообразование инициируется на заключительных этапах деструкции первичного органического вещества при появлении
низкомолекулярных, в том числе ароматических, мономеров (6). От схемы ГМС и разнообразия образующихся мономеров зависит качество гумусовых веществ, которое характеризуется соотношением гуминовых кислот и фульвокислот в финальном продукте (7).
Скорость гумусобразования определяется соотношением скоростей микробиологической
деструкции растительных остатков и синтеза гумусовых веществ из мономерных полифенольных соединений, аминокислот, сахаров и пептидов (8). Ограничение поступлений органических соединений углерода в почву вызывает разрушение гумусовых веществ и приостановку синтетических процессов. Таким образом, плодородие и адаптационный потенциал почв
в первую очередь зависят от баланса синтеза и деструкции гумусовых веществ (7, 9).
88
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Структура ГМС подвергается пространственно-матричной фиксации в биопленках,
образующихся на поверхности минеральных микроконгломератов почвы и растительных остатков (10-13). Функциональная структура ГМС также предопределена и отражает схему
распределения между микроорганизмами биохимических реакций в соответствии с этапами
трансформации веществ. Биохимические процессы закрепляются за микроорганизмами при
образовании ГМС посредством межорганизменного сигналинга, который координированно
инициирует экспрессию определенных генов в индивидуальных геномах микробного сообщества. Таким образом, первичная информация о функциональной структуре ГМС присутствует
в закодированной форме в метагеноме сообщества микроорганизмов. Совокупность генов,
определяющих структуру ГМС, составляет ее функциональную матрицу (ФМ). ФМ распределена по геномам всех клеток культивируемых и некультивируемых почвенных микроорганизмов (14), входящих в ГМС, контролируя продуктивность и качество трансформаций.
В подстилке лесных климаксных экосистем в значительном количестве встречаются трудноразлагаемые лигноцеллюлозные субстраты (например, остатки хвойных деревьев). Учитывая большой возраст этих экосистем, с высокой долей вероятности можно предположить, что в лесной подстилке грибы и бактерии сформировали оптимальную ГМС. Оптимальная ГМС должна характеризоваться высокой скоростью преобразования лигнинсодержащих субстратов в гумусовые вещества и отсутствием побочных токсических веществ (15,
16). Нам удалось выделить из лесной подстилки микроорганизмы, образующие ГМС при разложении коры хвойных деревьев, и создать биопрепаратную ФМ — биопрепарат баркон, содержащий комплекс из 4 видов бактерий и 2 — микромицетов (17, 18). Мы полагаем, что в
результате межорганизменного сигналинга микроорганизмы биопрепаратной ФМ способны
инициировать требуемую схему деструкции/синтеза в новой среде, задействовав имеющиеся в
ней фитопатогенные и непатогенные, культивируемые и некультивируемые микроорганизмы.
Цель исследований — минимизация числа видов микроорганизмов биопрепаратной функциональной матрицы (ФМ) и математический анализ последствий работы почвенной генно-метаболической сети, инициированной этой ФМ.
Методика. Для изучения самоорганизации микроорганизмов в ГМС использовали
ФМ биопрепарата баркон (17, 18), содержащего комплекс бактерий и микромицетов, способных инициировать в почве гумусообразующую ГМС. В межвегетационный период
(осень—весна 2009-2010 годов) растительные остатки подвергались разложению в сосудах с
дерново-подзолистой суглинистой почвой (3,5 кг/сосуд). Для этого в почву в различной комбинации (по вариантам опыта) закладывали солому ячменя, зеленую массу козлятника, опилки хвойных деревьев и отходы химической переработки хвои. Варианты были выравнены по
С вносимых в почву субстратов (по 10 г/сосуд). При добавлении козлятника (по 5 г/сосуд)
количество растительных остатков уменьшали до 5 г/сосуд. В вариантах с барконом растительные остатки обрабатывали перед закладкой в почву (1 мл биопрепарата на 10 г сухого
субстрата). В сентябре 2009 года, мае и сентябре 2010 года отбирали почвенные образцы, в
которых определяли микробиологические и физико-химические показатели стандартными
методами. В июне 2010 года в вегетационные сосуды был посажен ячмень сорта Северянин
(по 30 семян); всхожесть и биомассу растений учитывали в сентябре 2010 года. Подкормок
растений в вегетационный период не проводили.
Численность основных групп микроорганизмов определяли методом предельных разведений (19) с высевом на соответствующие среды (20). Для видовой идентификации бактерий просеквенировали участок гена 16S-рРНК, микромицетов — участок ITS.
Содержание общего азота определяли мокрым озолением по Кьельдалю, гумуса — окислением с бихроматом калия (21-23).
Граф-анализ (24, 25) структуры почвенной ГМС проводили на основании данных
о частоте встречаемости почвенных групп микроорганизмов по вариантам опыта в мае 2010
года, используя методы многофакторной математической статистики: дисперсионного (26),
корреляционного (26), кластерного (27, 28) и факторного (29) анализов. С помощью графанализа определяли качественные и количественные характеристики ГМС (строили дендрограмму сходства вариантов опыта, граф ГМС и др.). При корреляционном анализе расстояние
между вариантами рассчитывали, исходя из значений квадратных корней из показателя частоты встречаемости, как описано (30). Учитывая, что скорость размножения микроорганизмов в
фазу экспоненциального роста пропорциональна логарифму этой частоты, корреляцию между
скоростью роста популяций в вариантах опыта определяли, используя логарифмированные
значения частот встречаемости (мы считаем, что это точнее отражает метаболические связи в
ГМС, чем корреляции по абсолютным значениям).
Для анализа структуры почвенной ГМС используется фрактальная модель трансформации органических веществ (рис. 2), согласующаяся со схемой гумусообразования (см.
рис. 1). Во фрактальной модели задается линейная связь частот встречаемости микроорганизмов групп АД, БД и ВД с числом фрагментов деструкции и экспоненциальная связь с
номером этапа деструкции. На 4-м, 5-м и 6-м этапах синтеза гумуса в модели задается постоянство частот встречаемости микроорганизмов групп АС, БС и ВС. Предполагается, что
на заключительных этапах отщепляются алифатические части молекул и синтезируют из
них гумусовые вещества, не изменяя числа фрагментов молекул. Поэтому этапы синтеза
89
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Рис. 2. Фрактальная модель поэтапной микробиологической
трансформации органических веществ: микроорганизмы групп
АД, БД, ВД осуществляют деструкцию полимерных молекул
растительных остатков до олигомерных и мономерных форм
на первых этапах; микроорганизмы групп АС, БС, ВС синтезируют гумусовые вещества из продуктов этой деструкции
на заключительных этапах.
обеспечиваются группами микроорганизмов одинаковой численности, а этапы деструкции — группами, численность
которых возрастает экспоненциально. В
этой части модель микробиологической
трансформации веществ попадает под определение математического фрактала (31).
Во фрактальной модели ГМС допускается различное соотношение числа этапов
деструкции и синтеза веществ. Мы использовали фрактальную модель ГМС
для определения принадлежности 7 групп
микроорганизмов к этапам деструкции/синтеза органических веществ. Для
этого группы расставляли в порядке возрастания частоты встречаемости. Первые
члены полученного ряда, у которых частота встречаемости увеличивается экспоненциально, относили к деструктивным этапам, остальные — к этапам синтеза гумуса.
Результаты. Граф-анализ основывался на следующих экспериментальных данных (табл. 1).
1. Частота встречаемости микроорганизмов, агрохимические показатели почвы и характеристика растений в опыте по гумификации лигнинсодержащих растительных остатков и последующему выращиванию ячменя сорта Северянин
Обозначение/показатель
1-й
2-й
3-й
Вариант опыта
4-й
5-й
6-й
7-й
8-й
ДИ
Ча
ЦЕЛЛ (целлюлозолитики)
МИКРМ (микромицеты)
АКТМ (актиномицеты)
ЛГНД (лигниндеструкторы)
АЗОТФ (азотфиксаторы)
ПРОТ (протеолитики)
АМИЛ (амилолитики)
с т о т а в с т р е ч а е м о с т и (м а й 2010 г о д а)
1,06Ч10-4 2,10Ч10-4 2,30Ч10-4 4,50Ч10-4 6,04Ч10-4 13,10Ч10-4 8,30Ч10-4 9,50Ч10-4 ±4Ч10-5
1,62Ч10-3 2,06Ч10-3 1,62Ч10-3 2,09Ч10-3 1,42Ч10-3 2,74Ч10-3 0,86Ч10-3 2,28Ч10-3 ±7Ч10-5
0,94Ч10-2 2,00Ч10-2 4,49Ч10-2 4,41Ч10-2 4,20Ч10-2 4,17Ч10-2 9,46Ч10-2 4,64Ч10-2 ±6Ч10-4
0,160
0,190
0,190
0,132
0,098
0,109
0,047
0,103 ±3Ч10-3
0,174
0,160
0,204
0,161
0,154
0,241
0,195
0,329 ±8Ч10-3
0,287
0,277
0,272
0,355
0,324
0,296
0,168
0,299 ±12Ч10-3
0,367
0,351
0,287
0,306
0,380
0,308
0,494
0,219 ±15Ч10-3
Агрохимические показатели
N/Nобщий, %
0,177
0,186
0,188
0,18
0,175
0,184
0,183
0,194 ±0,045
C1/гумус (сентябрь, 2009), % 4,12
3,48
4,33
3,79
4,21
3,79
3,57
3,91
±0,15
C2/гумус (май, 2010), %
7,62
8,03
7,59
7,67
7,71
7,64
6,76
7,53
±0,16
C3/гумус (сентябрь, 2010), %
3,86
4,09
4,12
4,31
4,38
3,97
4,12
4,12
±0,11
Характеристика растений и дозы козлятника
mP/масса растений, г/сосуд
5,93
5,70
6,76
5,39
5,49
6,36
3,78
5,91
±0,55
nP/доля проросших семян , % 88,3
88,3
95,8
81,7
85,0
95,0
73,3
87,5
±1,5
К/доза ЗМ козлятника, г/сосуд
0
0
5
0
0
5
0
5
–
П р и м е ч а н и е. Варианты различаются видом растительных остатков и применением биопрепарата
баркон (Б): 1-8-й — соответственно солома ячменя (СЯ), СЯ + Б, СЯ + козлятник + Б; отходы хвои (ОХ),
ОХ + Б; ОХ + козлятник + Б; опилки хвойных (ОпХ) + Б, ОпХ + козлятник + Б. ДИ — доверительный интервал, ЗМ — зеленая масса. Прочерк означает, что ДИ не вычисляли.
Проведенный анализ (рис. 3) продемонстрировал объединение вариантов в три
кластера (на уровне сходства 0,55): I кластер —
1-й и 4-й, II — 2-й и 5-й, III — 3-й, 6-й и 8-й
варианты; 7-й вариант не вошел ни в один
кластер, то есть в этом варианте микробиологические процессы существенно отличались от происходящих в остальных. В вариантах из I кластера, где биопрепарат не
применяли, коэффициент потребленного
гумуса был наименьшим (табл. 2). По-виРис. 3. Дендрограмма сходства вариантов опыта: 18-й — соответственно СЯ, СЯ + Б, СЯ + К + Б;
димому, почвенные микробиологические
ОХ, ОХ + Б; ОХ + К + Б; ОпХ + Б, ОпХ + К + Б
процессы в 1-м и 4-м вариантах были близки
(обозначения см. в таблице 1).
к базовому минерализационному процессу
(см. рис. 1, стрелка 1). В остальных вариантах опыта наблюдалось заметное влияние биопрепаратной ФМ на почвенное микробное сообщество, которое подтверждается объединением соответствующих вариантов опыта в отдельные кластеры, как мы считаем, вследствие
образования ГМС. Объединение вариантов в III кластер указывает на то, что добавка зеленой массы козлятника изменяет условия функционирования ГМС в 3-м, 6-м и 8-м вари-
90
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
антах по сравнению с другими. Учитывая, что наибольшее накопление азота в почве,
доля проросших семян и масса растений в сосудах характерны для этого кластера,
можно утверждать, что биомасса козлятника используется микроорганизмами как источник минерального азота, который в дальнейшем включается в биомассу растений.
Наибольшее накопление и потребление гумуса отмечали во II кластере, а наименьшие
значения биомассы растений и наибольший коэффициент потребления гумуса — в 7-м
варианте. По-видимому, здесь применение биопрепаратной ФМ не привело к организации эффективной гумусообразующей ГМС.
2. Средние значения некоторых показателей в почвенных образцах и у растений ячменя
сорта Северянин (по кластерам и в 7-м варианте опыта)
Обозначение/показатель
I кластер II кластер III кластер 7-й вариант
N/Nобщий, %
C2 ? C1/накопление гумуса за сентябрь 2009—май 2010
годов, %
C2 ? C3/потребление гумуса за май—сентябрь 2010 года, %
(C2 ? C3):C2/коэффициент потребленного гумуса
mP/масса растений, г/сосуд
nP/доля проросших семян, %
П р и м е ч а н и е. Обозначения и их описание см.
0,1785
0,1805
3,69
4,03
3,56
3,62
0,52
0,54
5,66
5,59
85,0
86,7
в таблице 1.
0,1883
3,58
3,52
0,54
6,34
92,8
0,1830
3,19
2,64
0,61
3,78
73,3
ДИ
±0,045
±0,22
±0,19
±0,03
±0,55
±1,5
При корреляционном анализе, изменяя условия по вариантам опыта
(исключая 1-й и 4-й, где
биопрепарат не применяли),
для признаков (см. табл. 1)
выявили значения r > 0,5.
Выбранные коэффициенты
корреляции позволяют построить схему связей признаков (граф ГМС, рис. 4;
см. табл. 1). Дополнительно при построении графа
Рис. 4. Граф корреляционных связей между измеряемыми показателями в опыте:
ГМС использовали фраксплошная линия — связь с положительным коэффициентом корреляции,
тальную модель ГМС, попунктирная — с отрицательным. ЦЕЛЛ-ГМС и МИКРМ-ГМС — генно-мезволившую отнести к десттаболические сети; цифры около линий — коэффициенты корреляции меруктивным этапам группы
жду соответствующими парами признаков (обозначения см. в таблицах 1, 2).
ЦЕЛЛ, МИКРМ, АКТМ,
ЛГНД, к синтетическим — АЗОТФ, ПРОТ, АМИЛ. Учитывая это, на графе ГМС микроорганизмы с большим номером этапа деструкции располагали правее. После расстановки
микроорганизмов продукты ГМС и связанные с ними характеристики растения размещали в правой части графа.
Полученный граф ГМС сообщества почвенных микроорганизмов демонстрирует
образование двух ГМС с целлюлозолитиками и микромицетами на первом этапе деструкции: ЦЕЛЛ-ГМС = ЦЕЛЛ > АКТМ > ЛГНД > АЗОТФ > ПРОТ > АМИЛ и МИКРМГМС = МИКРМ > АКТМ > ЛГНД > ПРОТ > АМИЛ. Амилолитики и протеолитики,
общие для этих ГМС, осуществляют синтез гумуса на заключительных этапах трансформации. Граф ГМС показывает сильную положительную корреляцию между массой
растений в сосуде и числом проросших семян ячменя (mP, nP: r = 0,99). Следовательно,
растения в опыте были однородны по массе, а различия в вариантах опыта в основном определялись неодинаковой долей проросших семян. Достоверную корреляцию наблюдали
между приростом количества гумуса за осенне-весенний период и убылью за вегетационный (С2 ? С1, С2 ? С3: r = 0,80). Также отметили корреляцию между убылью гумуса и массой растений (С2 ? С3, mP: r = 0,77). То есть в межвегетационный период микроорганизмы
трансформируют растительные остатки и накапливают энергетические и питательные ресурсы, которые в последующий вегетационный период активно используются микроорганизмами и растениями. Из графа видно, что растения потребляют продукцию двух ГМС и
непосредственно не связаны с микроорганизмами. Это означает, что урожай и качество
растений в первую очередь зависят от продуктивности ГМС в межвегетационный период.
Включение азотфиксирующих бактерий в состав ЦЕЛЛ-ГМС указывало на фиксацию газообразного азота этими микроорганизмами, необходимую в условиях отсутствия азотного питания. Это же подтвердила положительная связь между их частотой встречаемости и
общим количеством азота, накопленным в почве (АЗОТФ, N: r = 0,75). Положительные корреляции дозы ЗМ козлятника с частотой амилолитиков и микромицетов (АМИЛ, К: r = 0,81;
МИКРМ, К: r = 0,62) означали, что козлятник стимулирует развитие этих микроорганизмов.
Продукты разложения зеленой массы козлятника также привели к росту массы ячменя (К,
mP: r = 0,72). Возможно, растение использовало продукты разложения козлятника в качестве источника азота, так как в опыте минеральные удобрения не применялись. Отрицатель-
91
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ные корреляции (АМИЛ, N: r = ?0,70; АКТМ, С2 ? С3: r = ?0,94) указывали на потребление
азота и гумуса этими микроорганизмами, положительные (ЛГНД, С2 ? С3: r = 0,87; МИКРМ,
С2 ? С3: r = 0,85; ПРОТ, С2 ? С3: r = 0,76; АЗОТФ, N: r = 0,75) свидетельствовали о соответствующей продукции веществ этими микроорганизмами. Отрицательные коэффициенты
корреляции между частотами встречаемости микроорганизмов (ЦЕЛЛ, ЛГНД: r = ?0,71;
АКТМ, ЛГНД: r = ?0,84; АКТМ, ПРОТ: r = ?0,67; МИКРМ, АКТМ: r = ?0,66; МИКРМ,
АМИЛ: r = ?0,77) отражали их конкуренцию за источник питания, положительные
(ЦЕЛЛ, АКТМ: r = 0,54; ЦЕЛЛ, АЗОТФ: r = 0,84; МИКРМ, ПРОТ: r = 0,76; ЛГНД,
ПРОТ: r = 0,65) — потребление одними микроорганизмами продуктов метаболизма других.
При факторном анализе выявили коэффициенты множественной регрессии частот
встречаемости микроорганизмов из деструктивных групп по отношению к продуктивности
ГМС. Для этого в многомерном пространстве измеренных признаков определяли направление координатной оси (MIN-фактора) с минимальной дисперсией проекций данных (29).
По значениям направляющих косинусов MIN-фактора удается определить величину коэффициентов множественной регрессии (bj). Подставляя их в уравнение регрессии, можно
по частотам встречаемости нескольких групп микроорганизмов вычислить их совместное
влияние на накопление гумуса, азота в почве и массу растений. Например, уравнение множественной регрессии для оценки совместного влияния четырех деструктивных групп микроорганизмов на массу растений ячменя (mP) записывается формулой:
ln ( Fi. j ) ? M N . j
mPi ? M mP j =4
? ? bmP, j ?
= ? MIN ,
SmP
SN . j
j =1
где
M mP =
1
1 i=L
? ? mPi , M N . j = ?
L
L i =1
i=L
? ln ( F ),
i =1
i. j
i= L
i=L
i =1
i =1
2
S mP = ? ( mPi ? M mP ) , S N . j = ? ??ln ( Fi . j ) ? M N . j ?? ,
2
mPi — масса растений в i-м варианте опыта; Fi.j — частота встречаемости j-й группы микроорганизмов в i-м варианте опыта; L — число вариантов опыта; ?MIN — доля общей дисперсии,
приходящейся на MIN-фактор; bmP,j — коэффициенты множественной регрессии для j-й
группы микроорганизмов по отношению к массе растений.
3. Значения коэффициентов множественной регрессии для частот встречаемости деструктивных групп микроорганизмов по отношению к содержанию гумуса, азота и массе
растений у ячменя сорта Северянин
Коэффициент
множественной
регрессии
Гумус
накопление за сентябрь 2009—
май 2010 годов (С2 ? С1)
убыль за май—сентябрь
2010 года (С2 ? С3)
bЦЕЛЛ
?1,42
+0,16
bМИКРМ
+1,81
+0,23
bАКТМ
?1,00
?0,57
?2,19
+0,36
bЛГНД
ДИ
±0,05
±0,05
П р и м е ч а н и е. Обозначения и условия опыта см. в таблице 1.
Nобщий
(N)
Масса растений (mP)
?4,41
+4,62
+1,99
?4,01
±0,08
+1,23
?0,56
+0,38
+2,39
±0,06
Положительный знак коэффициента регрессии (табл. 3) свидетельствует о синтетическом характере влияния соответствующей группы микроорганизмов на накопление гумуса, азота, отрицательный — на их потребление. Чем больше абсолютное значение коэффициента регрессии, тем сильнее проявляются синтетические или деструктивные свойства
микроорганизмов. Исходя из этого, считаем, что на накопление азота и гумуса наибольшее
влияние оказывают микромицеты (bМИКРМ.N = +4,62, bМИКРМ.С2 ? С1 = +1,81), а на величину
потребляемой части гумуса и массу растений — лигниндеструкторы (bЛГНД.С2 ? С3 = +0,36,
bЛГНД.mP = +2,39). Таким образом, от эффективности деструкции растительных остатков
этими двумя группами микроорганизмов в первую очередь зависит количество и качество образующихся гумусовых веществ.
Основываясь на результатах граф-анализа, мы выделили из группы лигниндеструкторов культуру Pseudomonas fluorescens, из микромицетов — Penicillium chrysogenum
Thom. 1910, которые послужили основой для создания усовершенствованной формы биопрепарата баркон. Для паспортизации этих микроорганизмов провели их генетическую идентификацию и депонирование в коллекции ВНИИСХМ (http://www.arriam.spb.ru/RUS/lab10/).
Итак, по данным граф-анализа, применение биопрепарата баркон для гумификации растительных остатков в межвегетационный период способствует повышению почвенного плодородия и формированию экологических условий для получения высокого и
качественного урожая растений. Одним из перспективных способов управления гумусообразованием является применение биопрепаратных функциональных матриц (ФМ),
вносимых в почву с комплексом микромицетов и бактерий в составе генно-метаболических сетей (ГМС). При этом структура ГМС и эффективность поддерживаемых ею
трансформационных процессов в первую очередь зависит от информации, записанной в
92
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
метагеноме лигниндеструкторов и целлюлозолитиков. Синтез гумусовых веществ осуществляется амилолитиками и протеолитиками на заключительных этапах трансформации органических молекул. Эти микроорганизмы в достаточном количестве присутствуют в
почве и включаются в ГМС только при появлении мономерных продуктов деструкции.
Следовательно, включать их в биопрепараты нет необходимости и рекомендуется создавать биопрепаратную ФМ на основе лигниндеструкторов и микромицетов.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
М и ш у с т и н Е.Н., Е м ц е в В.Т. Микробиология. М, 1987.
З а в а р з и н Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии. М., 2004.
К о н о н о в а М.М. Органическое вещество почвы, его природа, свойства и методы изучения. М., 1963.
К о л ч а н о в Н.А., А н а н ь к о Е.А., К о л п а к о в Ф.А. и др. Генные сети. Молекулярная
биология, 2000, 34(4): 533-544.
Л и х о ш в а й В.А., М а т у ш к и н Ю.Г., Ф а д е е в С.И. О связи графа генной сети с качественными режимами ее функционирования. Молекулярная биология, 2001, 35(6): 1080-1087.
Л ы к о в А.М., Е с ь к о в А.И., Н о в и к о в М.Н. Органическое вещество пахотных почв Нечерноземья (актуальность и состояние проблемы, рабочие гипотезы исследований, сопряженность агрономических и экологических функций, динамика в агроценозах, принципы моделирования и технологии воспроизводства). М., 2004.
Т у е в Н.А. Микробиологические процессы гумусообразования. М., 1989.
О р л о в Д.С. Гумусовые кислоты почв и общая теория гумификации. М., 1990.
З в я г и н ц е в Д.Г., Б а б ь е в а И.П., З е н о в а Г.М. Биология почв. М., 2005.
Ш у б Г.М., Ш в и д е н к о И.Г., П р о н и н а Е.А. и др. Материалы к элективному курсу
«Микробные сообщества». Саратовский научно-медицинский журнал, 2010, 6(2): 245-247.
З у б к о в а Т.А., К а р п а ч е в с к и й Л.О. Матричная организация почв. М., 2001.
З у б к о в а Т.А., К а р п а ч е в с к и й Л.О. Почвенная матрица и экологические функции почвы.
Вестник Московского университета, сер. Почвоведение, 2004, 1: 30-36.
З в я г и н ц е в Д. Г. Основные принципы функционирования комплексов почвенных микроорганизмов. Проблемы почвоведения, 1978: 97-102.
H a n d e l s m a n J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol.
Mol. Biol. Rev., 2004, 68: 669-685.
М и р ч и н к Т.Г. Почвенная микология. М., 1988.
Т е р е х о в а В.А. Микромицеты в экологической оценке водных и наземных экосистем. М., 2007.
С в и р и д о в а О.В. и др. Способ разложения древесины. Авт. свид. № 1792974 от 8 октября 1992
года. Бюл. изобр., 1993, № 5.
Р у с а к о в а И.В., В о р о б ь е в Н.И. Способ эффективного использования соломы в качестве
удобрения с применением биопрепарата Баркон. Владимир, 2010.
Некоторые новые методы количественного учета почвенных микроорганизмов и изучение их свойств:
Методические рекомендации ВНИИСХМ. Л., 1987.
Т е п п е р Е.З., Ш и л ь н и к о в а В.К., П е р е в е р з е в а Г.И. Практикум по микробиологии. М., 1987.
Агрохимические методы исследования почв /Под ред. А.В. Петербургского. М., 1975.
О р л о в Д.С. Гумусовые кислоты почв. М., 1974.
Химический анализ почв: Уч. пос. каф. почв. и экол. СПбГУ. СПб, 1995: 87-94.
В о р о б ь е в Н.И., С в и р и д о в а О.В., К у т у з о в а Р.С. Методические рекомендации по использованию граф-анализа в исследованиях систем, состоящих из биотических и абиотических компонентов. СПб,
2006 (http://www.arriam.spb.ru/rus/GIMM/gimmr.html).
В о р о б ь е в Н.И., С в и р и д о в а О.В. Граф биотрансформации C и N соединений системой почвенных микроорганизмов. Избр. лекции 10-й Всерос. школы «Экология и почвы». Пущино, 2001, IV: 289-297.
Л а к и н Г.Ф. Биометрия. М., 1990.
Д ю р а н Б., О д е л л П. Кластерный анализ. М., 1977.
Классификация и кластер /Под ред. Дж. Вэн Райзина. М., 1980.
К у л а и ч е в А.П. Методы и средства комплексного анализа данных. М., 2006.
W e i r B.S. Genetic data analysis II. Methods for discrete population genetic data. Sunderland, Massachusetts, USA, 1996.
К р о н о в е р Р. Фракталы и хаос в динамических системах. М., 2006.
1ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
25 февраля 2011 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: vorobyov@arriam.spb.ru;
2ГНУ Всероссийский
научно-исследовательский, конструкторский
и проектно-технологический институт органических удобрений
и торфа Россельхозакадемии,
601390 Владимирская обл., Судогодский р-н, пос. Вяткино
GRAPH-ANALYSIS IN GENE-METABOLIC NETWORKS OF SOIL MICROORGANISMS
WHICH TRANSFORMED PLANT RESIDUES TO HUMUS SUBSTANCES
N.I. Vorobyov1, O.V. Sviridova1, A.A. Popov1, I.V. Rusakova2, V.B. Petrov1
Summary
The graph-analysis of experimental data on microbiological transformation a lignin-contained vegetative rests
and the subsequent cultivation of barley (Severyanin variety) was carried out, including the procedures of dispersive, correlation, cluster and component analyses. The fractal model and graph-analysis showed that two gene-metabolic networks
of microorganisms are formed which transform the vegetative rests in soil. It is revealed that the first step of destruction
into humic networks is curried out by bacterium Pseudomonas fluorescens and micromycets Penicillium chrysogenum
Thom. 1910. It is shown that amylolitic and proteolitic bacteria participate actively in formation of humus substances.
93
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631.46:631.45:631.8
ПОВЫШЕНИЕ ПЛОДОРОДИЯ ПОЧВ ПРИ АКТИВИЗАЦИИ
ПОЧВЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ, РЕГУЛИРУЕМОЙ БИОУДОБРЕНИЯМИ
О.В. ОРЛОВА
В полевых и вегетационных опытах при внесении биоудобрений бамил и омуг выявили увеличение интенсивности дыхания почвы, доли активной от общей микробной биомассы, возрастание потоков N и C через
микробную биомассу, уменьшение доли грибной биомассы от суммарной (грибная + бактериальная). По сравнению с влажными порошкообразными формами биоудобрений гранулированные оказывают положительный эффект
на сохранение гумуса благодаря пролонгированному поступлению питательных веществ и более длительному периоду повышенной активности в микробоценозе. Биоудобрения при использовании в дозах 1-6 т/га увеличивали
урожай кабачков, картофеля, лука, моркови, свеклы, злаковых трав, ячменя на 12-284 % относительно контроля.
Ключевые слова: биологическая активность и плодородие почвы, биоудобрения, гумус, микробная биомасса.
Keywords: soil biological activity, biofertilizers, humus, microbial biomass, soil fertility.
Для более плодородных почв обычно характерна высокая биологическая активность.
Наблюдаемое в России снижение почвенного плодородия во многом связано с дефицитом
органических удобрений, который может быть восполнен за счет широкого использования
биоудобрений, получаемых на основе микробиологической переработки отходов животноводства. От традиционных органических удобрений (навоз, компосты) биоудобрения, сочетающие свойства минеральных и органических удобрений, отличаются большим содержанием питательных элементов, относительно низкими дозами внесения, отсутствием
семян сорняков, возбудителей болезней, наличием биоконтрольных свойств (1).
Целью работы было изучение повышения плодородия почв при внесении биоудобрений как функции микробиологической активности.
Методика. Объектами исследования были биоудобрения омуг и бамил. Омуг получают при аэробной ферментации подстилочного помета (2). Влажность порошкообразной
формы — 36,5-56,9 %, гранулированной — 10,0-15,2 %. Характеристика (в расчете на абсолютно сухое вещество — а.с.в.): зольность — 27,7-39,3 %, рН 7,8-8,2, содержание общего N, Р
и К — соответственно 2,35-3,04; 2,0-2,7 и 2,5-3,9 %. Бамил — гранулированное биоудобрение,
производится на основе микробной ассоциации, выращиваемой на стоках свинокомплексов
(3), содержание (на а.с.в.) общего N, Р, С и К — соответственно 5,0; 1,8; 40,0 и 0,8 %.
Полевые эксперименты проводили на опытном поле Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. С.-Петербург—Пушкин) на легкой дерново-подзолистой почве (содержание гумуса Сгум. — 2,19-2,96 %, Nобщий — 0,160-0,210 %, подвижный
фосфор — 31,0-37,0 мг/100 г; обменный калий — 6,1-12,0 мг/100 г, рНKCl 6,34-6,52). Площадь делянок под морковью и ячменем (сорта соответственно Тушон и Балтика) — 1 м2,
повторность 4-кратная; под картофелем (сорт Невский) — 0,25 га, повторность 3-кратная.
Вегетационный опыт с райграсом (сорт Сакини) во вкопанных сосудах объемом 7,5 л закладывали на дерново-подзолистой легкосуглинистой почве (Сгум. — 1,84 %, Nобщий —
0,130 %, рНKCl 5,00) по схеме: 1-й вариант — РК; 2-й — РК+Nаа (азот аммиачной селитры); 3-й — РК + бамил; 4-й — РК + омуг; 5-й — РК + пудрет; повторность 4-кратная.
Все удобрения вносили из расчета 100 мг азота на 1 кг почвы. В вегетационном опыте с
люцерной хмелевидной озимой (Medicago lupulina P2M5, популяция Павловская, семена
предоставлены Л.М. Якоби) (4) использовали нейтрализованный торф, обогащенный минеральным удобрением PG-Mix (Nu3 B.V., Нидерланды) (соотношение N:P:K — 12:14:24)
в количестве 1,2 кг/м3 (ТПС 399, торфопредприятие «Пельгорское-М»), с зольностью
6,61 %, содержанием минерального азота (N-NH4 + N-NO3) 159 мг/л; подвижного P и К —
соответственно 71 и 225 мг/л. Схема опыта: 1-й вариант — контроль без удобрений; 2-й и
3-й — сплошное и локальное внесение омуга. Использовали сосуды объемом 600 мл, доза
омуга — из расчета 200 мг N/дм3 торфа; повторность 9-кратная.
Анализы биоудобрений, торфа и почвы проводили соответствующими общепринятыми методами (5, 6). Лабильные гумусовые соединения (новообразованный гумус)
выделяли из почв 0,1 н. пирофосфатом Na (рН 7,0) (7). Содержание углерода в вытяжках определяли на спектрофотометре Ultraspec (LKB, Швеция; ? = 340 нм) (8). Дыхание
почвы измеряли на газовом хроматографе Цвет (Россия); детектор — катарометр, газноситель — гелий. Активную микробную биомассу в почве учитывали методом субстрат-индуцированного дыхания, определяя суммарную активную биомассу (9) и грибную
биомассу (обработка стрептомицином и рифампицином, 16 мг антибиотика на 1 г почвы). Общую микробную биомассу (активная и пассивная) устанавливали регидратационным прямым (углерод) и инкубационным (азот) методами (10). Потоки С и N через
микробную биомассу и время ее удвоения рассчитывали по С.А. Благодатскому (11).
Статистическую обработку данных выполняли с использованием методов дисперсионного и корреляционного анализа.
94
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Результаты. Биоудобрения бамил и омуг, внесенные в почву из расчета 60-100 кг
N/га (1-6 т/га), обеспечивали у различных культур (кабачки, картофель, кольраби, морковь, свекла, ячмень) прибавку урожая в полевых опытах на 12-284 % относительно
контроля, при росте дозы биоудобрений урожай увеличивался. Наилучшие результаты
для всех исследованных культур были получены с бамилом (прибавка урожая 70-284 %).
Эффективность омуга зависела от культуры: для картофеля, кабачков, кольраби и злаковых трав прибавка составляла 30-155 %, для ячменя, свеклы — 3,7-17,5 %, морковь
занимала промежуточное положение — прибавка 15,0-68,6 %.
Известно, что в пахотных почвах значительная часть микроорганизмов пассивна, то есть не участвует в почвенных процессах. Биоудобрения увеличивали долю активных организмов от общей массы почвенной микробиоты до 67-84 %, тогда как при внесении компостов она не превышала 25 %. В качестве типичного примера влияния биоудобрений на активность почвенной микрофлоры можно привести данные полевого опыта с внесением омуга под морковь (табл. 1): рост интенсивности микробиологических
процессов отражался в сокращении времени удвоения биомассы микробоценоза и усилении потоков С и N через микробную биомассу (см. табл. 1). Дыхание и содержание активной микробной биомассы в удобренной почве увеличивалось на 15-24 %.
1. Показатели активности микроорганизмов и урожай моркови сорта Тушон под влиянием биоудобрения омуг (Х±х; полевой опыт, Ленинградская обл., 2007 год)
Вариант
Время удвоения биомассы
микробоценоза, сут
Контроль (без удобрений)
Омуг в дозе 60 кг N/га
Омуг в дозе 100 кг N/га
П р и м е ч а н и е. Потоки С и N
Поток через микробную
биомассу, мг/кг почвы
С
N
30,0±0,41
405±18
55±5
18,5±0,22
688±36
95±6
16,3±0,19
726±27
107±11
рассчитаны за период вегетации моркови (102 сут).
Урожайность
моркови, кг/м2
2,24±0,9
3,16±0,9
3,28±0,9
Известную, но не всегда обнаруживаемую прямую зависимость между биологической активностью и продуктивностью растений (12) подтвердили и наши опыты. Увеличение активности микроорганизмов прямо коррелировало с урожаем моркови, который возрастал на 41-46 % (коэффициент корреляции для потоков С и N через биомассу — 0,6570,659, для активной биомассы — 0,794). Причем связь урожая с этими биологическими показателями оказалась выше, чем с содержанием в почве гумуса (r = 0,082), а также общего
(r = 0,024) и минерального (r = 0,337-0,440) азота. Подобные зависимости наблюдали и в
других полевых опытах (картофель, ячмень).
Помимо активности почвенных
микроорганизмов, при внесении биоудобрений изменяется состав микробного сообщества почвы. Известно, что
качество субстрата влияет на состав и
результаты деятельности микробного
сообщества. Например, состав микрофлоры ризосферы и наличие фитопатогенных грибов в значительной степени
определяются качеством корневых выделений (13). Соответственно, органические соединения внесенных удобрений окажут эффект на численность
микроорганизмов, их состав, активность и (через деятельность микробоценоза) на растения (урожай) и плодородие почвы. Для бамила и омуга хаРис. 1. Доля грибной биомассы в торфе при разных спорактерен узкий диапазон соотношения
собах внесения омуга: а, б, в — соответственно контроль
(без удобрений), сплошное и локальное внесение (вегеС:N (от 7:1 до 10:1). Следовательно, ортационный опыт с люцерной хмелевидной, 2009 год).
ганическое вещество биоудобрений более благоприятно для развития бактерий с соотношением С:N в биомассе 4:1-5:1, а не грибов с соотношением С : N 11:1-15:1
(14). Снижение доли грибной биомассы при внесении бамила и омуга с 41-43 до 15-18 %
относительно вариантов с компостами (вермикомпост и компост из бытовых отходов)
отмечали в вегетационном опыте с райграсом.
При внесении омуга в верховой нейтрализованный торф (вегетационный опыт с
люцерной), который беден органическим веществом, доступным для бактерий, доля грибов
была ниже, чем в контроле, на протяжении всего опыта (рис. 1). Важная роль количества внесенного органического вещества следует из того, что в варианте с локальным внесением омуга, где содержание органических веществ в субстрате ниже, доля активной грибной биомассы
в микробоценозе уменьшалась не столь выраженно, как при сплошном внесении. В почве с
разнокачественным органическим веществом, множеством экологических ниш и разнообразием микроорганизмов введение биоудобрений не обеспечивало преимущества бактерий над
грибами в течение всего срока наблюдений, хотя оно и имело место в отдельные периоды.
95
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
2. Урожай райграса сорта Сакини и содержание гумуса в почве под влиянием био- и
минеральных удобрений (Х±х; вегетационный опыт с вкопанными сосудами, Ленинградская обл., 2001-2002 годы)
Вариант
Урожай,
г/сосуд
Содержание
лабильного гумуса
на 45-е сут, мг/кг
Изменение содержания гумуса
лабильного с 45-х по
общего за 1 год,
86-е сут, мг/кг
% от исходного
Контроль
10,7±0,7
382±54
+40
?11,2*
N150РК
25,3±1,4
356±43
?117
?9,0*
Бамил
18,4±1,7
560±30
?337
?1,9
Омуг
16,8±0,7
518±53
?126
?7,0*
П р и м е ч а н и е. Исходное содержание гумуса (Сгум.) до закладки опыта равно 1,87±0,04 %.
* Убыль существенна при уровне различий 0,05 %.
Положительный эффект от внесения биоудобрений на потенциальное плодородие, в
частности баланс гумуса, наблюдали не всегда. В полевых и вегетационных опытах было показано, что бамил способствует сохранению и даже накоплению гумуса в почве, тогда как
омуг часто этого эффекта не имеет. Так, в вегетационном опыте с райграсом в варианте с
бамилом количество гумуса в почве за год изменялось несущественно, с омугом — оно падало, хотя и меньше, чем в контроле (табл. 2). Внесение бамила и омуга усиливало процессы гумификации: количество лабильного новообразованного гумуса, экстрагируемого 0,1 н.
Na-пирофосфатом, в начальный период было значительно выше, чем в контроле и при использовании минеральных удобрений. Лабильный гумус активно разлагается микроорганизмами и служит «буфером», защищающим основную часть гумуса. Наибольшая убыль
лабильного гумуса происходила в варианте с бамилом, и здесь потери гумуса оказались наименьшими (см. табл. 2). При внесении биоудобрений происходит не только усиление образования лабильных гумусовых соединений, но и изменяется их доступность для микроорганизмов. При минеральной системе удобрений (NРК) количество лабильного гумуса и его
доступность ниже, чем при применении бамила и омуга (соответственно 5,3; 10,8 и 7,8 %).
Бамил положительно влиял на баланс гумуса даже в опытах с пропашными культурами (картофель): Сгум. увеличивалось на 0,04 %, убыль в контроле и при внесении минеральных удобрений составляла ?0,12 % от массы почвы. В варианте с бамилом в этом опыте произошла также наибольшая убыль количества лабильного гумуса (на 109 мг/кг против 443 мг/кг в контроле) (12). Влияние омуга на баланс гумуса зависело от возделываемой культуры. Под ячменем в отсутствие минеральных удобрений омуг увеличивал содержание гумуса
при любой дозе. Под корнеплодами (свекла и морковь) бездефицитный баланс гумуса наблюдали только при дозе 4 т/га или при смешанной системе удобрений (рис. 2). Падение
содержания гумуса при внесении омуга не связано с увеличением интенсивности микробиологических процессов в почве. Коэффициенты корреляции, рассчитанные в опыте с ячменем
(баланс гумуса положительный), показали, что усиление микробиологической деятельности
вело, напротив, к нарастанию синтеза гумуса: его содержание положительно зависело от количества С и N микробной биомассы (r = 0,942 и r = 0,781), активности дыхания (r = 0,592).
Причиной неодинакового влияния бамила и омуга на баланс гумуса,
по нашему мнению, стала форма биоудобрений (у первого — сухие гранулы, у второго — влажный порошок).
Действительно, гранулированный омуг
увеличивал урожай культур в среднем
на 18,6-34,4 % на фоне снижения потерь гумуса, содержание которого в
почве в среднем по опытам с морковью, луком и кабачками возросло на 6,519,6 %, а дозы биоудобрения при этом
Рис. 2. Влияние дозы омуга на содержание гумуса (Сгум.) в дерно- снизились и стали такими же, как для
во-подзолистой почве под морковью сорта Тушон (а), свеклой бамила, — 1-3 т/га. При внесении двух
сорта Бордо (б) и ячменем сорта Балтика (в) в зависимости
от дозы биопрепарата: 1; 2 и 3; 4 — соответственно контроль; форм омуга под морковь в варианте с
дозы препарата 4 и 6 т/га; вариант омуг (4 т/га) + 1/2N (по- гранулированным препаратом уроловина дозы омуга по N) (полевые опыты, Ленинградская жай, содержание гумуса и его лабильобл., 2003-2004 годы).
ной фракции в почве были выше, период повышенной биологической активности — продолжительнее (табл. 3). Рост количества гумуса при применении гранулированного омуга мы связываем с пролонгированностью действия биоудобрения: из порошкообразной формы за 1 ч извлекается в 4-5 раз больше веществ, чем из гранулированной; продлевалось и время активизации микробоценоза (см. табл. 3). В результате в течение всего
сезона происходит усиление микробиологической активности, улучшение условий питания растений, ведущее к прибавке урожая, и увеличивается синтез подвижных гумусовых
соединений (см. табл. 3).
Механизм действия биоудобрения на потенциальное и актуальное почвенное плодородие связан не только с внесением элементов питания (как у минеральных удобрений),
но и с деятельностью микроорганизмов (как почвенных, так и поступающих с удобрением).
96
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Традиционные органические удобрения (подстилочный навоз, компосты), вносимые в дозах
30-40 т/га, за счет большого количества свежего органического вещества прямо влияют на физические свойства почвы, повышают энергообеспеченность микробиоты и усиливают процессы минерализации, обеспечивающие восстановление гомеостаза почвенной экосистемы.
Биоудобрения, дозы которых относительно невелики (1-6 т/га), значительного нарушения гомеостаза почвы не вызывают, хотя и повышают активность почвенной микрофлоры.
3. Урожай моркови сорта Тушон и содержание гумуса в почве под влиянием разных товарных форм биоудобрения омуг (Х±х; полевой опыт, Ленинградская обл., 2007 год)
Вариант
Содержание гумуса
Период усиления активУрожай
ности микробиоты отноморкови, % общего, % лабильного (среднее за сезон), мг/кг сительно контроля, сут
Контроль
Омуг порошкообразный (W = 40 %)
Омуг гранулированный (W = 14 %)
П р и м е ч а н и е. W — влажность
100
2,88±0,03
120,5
2,61±0,02
142,9
2,83±0,04
удобрения.
Нет данных
748±59
848±71
1-14
7-40
Итак, внесением биоудобрений можно регулировать активность и состав микробного сообщества почвы и этим оказывать воздействие на урожай и на плодородие почв.
Биоудобрения обеспечивают накопление почвенного гумуса за счет роста поступления органического вещества растений (в том числе увеличения количества прижизненных выделений и отмерших остатков); пролонгированности перехода в почву и низких доз органического
вещества биоудобрения, что способствует усилению синтеза лабильных гумусовых веществ,
которые либо накапливаются (положительный баланс гумуса), либо служат буфером, защищающим основную часть гумуса от разложения (бездефицитный баланс); большей доступности для микроорганизмов новообразованных гумусовые соединения; стимулирования гумусообразующих микроорганизмов органическим веществом биоудобрений, которое находится на поздних стадиях разложения, что изменяет состав микробного сообщества почвы.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
А р х и п ч е н к о И.А., Б а р б о л и н а И.И., Д е р и к с П. Новая стратегия переработки отходов животноводства для получения биоудобрений. Докл. Россельхозакадемии, 1998, 6: 18-19.
О р л о в а О.В., А р х и п ч е н к о И.А. Влияние биоудобрения омуг на содержание питательных
элементов в легких дерново-подзолистых почвах. В сб.: Основные итоги и приоритеты научного обеспечения ПАК Евро-Северо-Востока. Вып. 1. Киров, 2005: 259-264.
А р х и п ч е н к о И.А. Производство и применение микробного гранулированного удобрения бамил. Докл. РАСХН, 1996, 2: 32-33.
Ю р к о в А.П., Я к о б и Л.М., С т е п а н о в а Г.В. и др. Эффективность инокуляции форм люцерны хмелевидной грибом арбускулярной микоризы Glomus intraradians и внутрипопуляционная изменчивость растений по показателям продуктивности и микоризообразования. С.-х. биол., 2007, 5: 67-74.
Агрохимические методы исследования почв /Под ред. А.В. Соколова. М., 1975.
Справочник по анализу органических удобрений. М., 2000.
Л ы к о в А.М., Ч е р н и к о в В.А., Б о и н ч а н Б.П. Оценка гумуса почв по характеристике его
лабильной части. Изв. ТСХА, 1981, 5: 65-70.
П а н и к о в Н.С., Г о р б е н к о А.Ю., С в е т л о в С.В. Способ определения суммарного содержания
водорастворимых органических веществ в почве. А.с. № 3949440/30-15. Бюл. изобр. 1987, № 23.
W e s t A.W., S p a r l i n g G.P. Modification to the substrate-induced respiration method to permit
measurement of microbial biomass in soils of different water contents. J. Microbiol. Meth., 1986, 5: 177-189.
Б л а г о д а т с к и й С.А., Б л а г о д а т с к а я Е.В., Г о р б е н к о А.Ю. и др. Регидратационный метод определения биомассы микроорганизмов в почве. Почвоведение, 1987, 4: 64-72.
Б л а г о д а т с к и й С.А. Микробиологическая иммобилизация азота в серой лесной почве в зависимости от агротехнических приемов. Автореф. канд. дис. М., 1987.
К у т у з о в а Р.С., С и р о т а Л.Б., О р л о в а О.В. и др. Особенности почвенно-микробиологических процессов при внесении бамила в дерново-подзолистую почву. Агрохимия, 2002, 5: 22-32.
К р а в ч е н к о Л.В. Роль корневых экзометаболитов в интеграции микроорганизмов с растениями.
Автореф. докт. дис. М., 2000.
S t e r n e r R.W., E l s e r J.J. Ecological stoichiometry: the biology of elements from molecules to the
biosphere. Princeton, 2002.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
25 февраля 2011 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: falenki@hotmail.com
REGULATION OF THE ACTIVITY OF SOIL MICROFLORA BY APPLICATING
BIOFERTILIZERS AIMED TO IMPROVE THE SOIL FERTILITY
O.V. Orlova
Summary
Under application of biofertilizers, Bamil and Omug, in doses of 1-6 t/ha the yield of egg-plants, potatoes, onion, carrot, beetroot, grasses, barley is increased by 12-284 %. At introducing biofertilizers the soil respiration and active
microbial biomass fraction of total biomass were increased, flows of carbon and nitrogen through the microbial biomass
were improved; the proportion of fungi in the overall (fungi + bacteria) biomass was decreased. The use of granulated form
of biofertilizers as compared to the moist powdery form effects positively the humus conservation because of prolonged release of nutrients and extended period of the excessive activity of soil microbocenosis.
97
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631.46:579.64:582.288.45:582.14
ИЗУЧЕНИЕ ПОЧВЕННОЙ СТАДИИ РАЗВИТИЯ Fusarium culmorum
ДЛЯ РАЗРАБОТКИ МЕР ЗАЩИТЫ ЯЧМЕНЯ ОТ ГНИЛИ?
О.К. СТРУННИКОВА
Макроконидии Fusarium culmorum вносили в почву на поверхности мембранных фильтров. Для
идентификации грибных структур на фильтрах, инкубировавшихся в почве, и на корнях использовали иммунофлуоресцентное окрашивание. Развитие гриба оценили в почвенных условиях, приводящих к разной интенсивности корневой гнили ячменя. Связь между формированием грибом определенных структур и его патогенной активностью не выявлена. Установлено, что естественные антагонисты F. culmorum — почвенные бактерии. В почвах с
высокой аборигенной микробиологической активностью, а также при интродукции штамма антагонистической бактерии плотность популяции F. culmorum существенно снижалась и интенсивность проявления болезни уменьшалась.
Внесение в почву целлюлозы приводило к увеличению плотности почвенной популяции гриба, однако заболеваемость
оставалась низкой. Внесение в почву целлюлозосодержащих материалов может быть приемом, способствующим переходу факультативного фитопатогена F. culmorum на сапротрофный тип питания.
Ключевые слова: развитие Fusarium culmorum в почве, почвенные условия, плотность популяции,
корневая гниль.
Keywords: growth of Fusarium culmorum in soil, soil conditions, population density, root rot.
Микромицет Fusarium culmorum (Wm. G. Sm.) Sacc. встречается в гумидных и полугумидных (1, 2), а также полуаридных (3) зонах выращивания зерновых. Вызывая болезни
нескольких экономически важных культур (4), именно на зерновых он особенно опасен,
так как не только снижает урожай, но и загрязняет зерно микотоксинами (5). Фунгициды
не эффективны против почвообитающих фитопатогенов и из-за отсутствия избирательного
действия могут навредить полезной микофлоре. Кроме того, фумиганты селектируют устойчивые к ним расы гриба, что было показано нами на примере Verticillium dahliae (6). Севооборот малоэффективен, поскольку не приводит к снижению численности F. culmorum в
почве из-за способности гриба одинаково хорошо выживать и размножаться под различными (в том числе непоражаемыми) культурами (7).
В то же время для F. culmorum паразитизм на растениях не служит обязательным условием существования. Было показано, что гриб обладает высокой конкурентной способностью в почве (8) и может формировать вегетативные структуры в течение
длительного времени (9). На основании данных о поведении гриба в разных условиях
F. culmorum относят к факультативным фитопатогенам, способным в одних условиях
развиваться в почве, осуществляя сапротрофный тип питания, в других — паразитировать на растениях как некротроф. Учитывая, что F. culmorum может в процессе развития
формировать различные структуры, представляет интерес оценить связь между существованием гриба в виде определенных структур и его патогенностью.
Нашей целью было изучение почвенной стадии развития Fusarium culmorum в
условиях, приводящих к разной заболеваемости растений, для поиска мер защиты ячменя от гнилей.
Методика. Развитие F. culmorum в почве и на корнях оценивали в условиях
разной влажности и гранулометрического состава почвы, с различными источниками
внесенного углерода и формами минерального азота, при интродукции штамма антагонистической бактерии Pseudomonas fluorescens. Развитие гриба учитывали в вегетационных и полевых опытах (Агрофизический институт, дер. Меньково, Ленинградская обл.,
Биологический институт СПбГУ, г. Петергоф, Ленинградская обл.) с использованием
ячменя сортов Детскосельский и Инари. Макроконидии F. culmorum вносили в почву
на поверхности мембранных фильтров («Millipore», США). Гриб инкубировали в почве
от нескольких суток до нескольких месяцев (в зависимости от целей исследования).
Мембранные фильтры в течение каждого эксперимента извлекали несколько раз, в эти
же сроки отбирали растения ячменя для оценки колонизации корней грибом и учета
симптомов гнили общепринятыми методами. Гриб на фильтрах и на корнях окрашивали
с использованием метода флуоресцирующих антител (10, 11). Фильтры с грибом, инкубировавшиеся в почве, и образцы корней после иммунофлуоресцентного окрашивания просматривали под люминесцентным микроскопом Imager A 1 («Carl Zeiss», Германия) при
увеличении Ѕ400. На фильтрах плотность мицелия (по длине) учитывали согласно 5балльной шкале: 1 балл — < 1,0; 2 балла — 1,0-2,3; 3 — 2,3-3,6; 4 — 3,6-5,5; 5 — > 5,5 м
на 1 см2 поверхности фильтра. Интенсивность колонизации корней оценивали по числу
микроколоний гриба в поле зрения микроскопа. Формируемые макроконидии и хламидоспоры на фильтрах и на корнях подсчитывали поштучно.
?
Исследования поддержаны грантами РФФИ 96-04-50364-а, 00-04-49473-а, 06-04-48788-а, 08-04-00356-а.
98
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Результаты. Проводимое микроскопирование позволило наблюдать не только
развитие F. culmorum, но и микробные ценозы, формируемые на фильтрах вблизи гриба.
При этом благодаря использованию видоспецифичных к исследуемому грибу антител
удалось надежно отличать его от другой почвенной микобиоты.
Для определения адекватности предложенного метода провели сравнительную
оценку развития F. culmorum непосредственно в почве и на находящихся в ней мембранных фильтрах. Полученные высокие коэффициенты корреляции свидетельствовали
о выравненности условий на фильтрах и в почве, об адекватности метода и возможности его использования для изучения почвенной стадии развития гриба (10).
Оценка состояния F. culmorum, начиная с прорастания макроконидий в почве
до колонизации и развития на корнях, с одновременным учетом проявления симптомов
гнили в разных условиях позволила составить представление о почвенной стадии развития гриба. Были установлены некоторые общие для всех почвенных условий закономерности. Так, внесенные на мембранных фильтрах в почву макроконидии F. culmorum
всегда прорастали. Распространенное понятие, что с помощью фунгистазиса можно регулировать рост популяции фитопатогенного гриба в почве, как оказалось, не относится к F. culmorum: макроконидии F. culmorum подвержены фунгистазису, однако через 612 ч инкубации в почве обычно преодолевают его (10). Прорастающая макроконидия
независимо от условий формировала мицелий, на мицелии образовывались новые макроконидии и хламидоспоры мицелиального либо макроконидиального типа. Прорастание
грибных спор не обязательно было сопряжено с наличием корневых выделений.
В то же время почвенные условия влияли на число формируемых грибом
структур. Так, в более тяжелых глинистых почвах в популяции гриба увеличивалась доля макроконидий (12, 13). В почвах с высокой микробиологической активностью и при
интродукции штамма антагонистической бактерии возрастало число хламидоспор (11,
14). Количество мицелия, образуемое грибом в почве, также зависело от условий (9).
Тем не менее, практически во всех из них гриб был обязательно представлен мицелием,
доминирующим по биомассе среди других структур (9). Мицелий мог быть и единственной структурой, формируемой на протяжении длительного времени (7). Установленный факт, что F. culmorum практически во всех исследуемых условиях представлен
мицелием, — очень важное доказательство сапротрофного существования гриба в почве.
Оценка состояния F. culmorum в разных почвенных условиях показала, что процесс развития гриба идет постоянно, осуществляясь за счет прорастания образованных в почве макроконидий и роста мицелия. Интенсивность развития F. culmorum, прежде всего мицелия,
определяется доступностью элементов питания: в ризосфере гриб был способен поддерживать высокую плотность структур в течение всей вегетации (9).
Начиная с 3-х сут, наряду с ростом отмечали лизис грибных структур. Было установлено, что лизису подвержен не только мицелий, но и макроконидии, и даже хламидоспоры. Просмотр фильтров с грибом, инкубировавшихся в почве, показал, что естественные антагонисты F. culmorum — не почвенные грибы, а бактерии. Бактерии, попадая
на фильтр из почвы, колонизируют грибные структуры и лизируют их, причем интенсивность колонизации и лизиса определяется почвенными условиями. При микроскопировании можно было видеть также почвенные грибы, колонизирующие фильтр, однако ни
в одном случае мы не наблюдали какого-либо их действия на F. culmorum.
Постоянно происходящие процессы лизиса и роста F. culmorum могут быть
уравновешенными или сдвинутыми в ту или иную сторону в зависимости от почвенных
условий. На фоне высокой аборигенной микробиологической активности (например, в
глинистых почвах с большим содержанием органического вещества) процесс лизиса
преобладал над процессом роста, что привело к снижению плотности F. culmorum в ризосферной почве (9). Наиболее активный лизис мицелия и макроконидий отмечался
при внесении в почву штамма антагонистической бактерии Pseudomonas fluorescens 2137,
что привело к существенному снижению численности этих грибных структур (11, 14).
Однако ни в одном из экспериментов мы не наблюдали, чтобы все грибные структуры
были лизированы полностью. Даже при интродукции P. fluorescens, когда плотность мицелия и число макроконидий были очень существенно снижены, F. culmorum формировал значительное число хламидоспор, что свидетельствует о гибкой стратегии выживания фитопатогена (11, 14).
В условиях, когда жизнедеятельность почвенных бактерий снижена (например,
при влажности почвы 20-30 %), лизис грибных структур происходил крайне редко, что
приводило к очень существенному увеличению плотности гриба в почве (15). Значительное повышение плотности фитопатогена, неконтролируемое естественными антагонистами, привело к появлению корневой и стеблевой гнили ячменя именно при пониженной
почвенной влажности.
Увеличение плотности мицелия и числа макроконидий F. culmorum наблюдали
99
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
также при внесении глюкозы и целлюлозы в нестерильную почву без растений. Факт
увеличения плотности популяции F. culmorum в присутствии аборигенной микрофлоры
свидетельствует о способности гриба конкурировать в естественной почве за углерод
(14). Полученные данные послужили основанием для предположения, что введение дополнительного источника углерода (целлюлозы), доступного для F. culmorum и ограниченного числа представителей почвенной микрофлоры, индуцирует сапротрофное развитие гриба. Действительно, внесение в почву целлюлозы вызывало увеличение плотности почвенной популяции патогена, однако при этом гриб не заселял корни растений ячменя (рис.). Таким образом, при наличии доступного углерода в почве F. culmorum не колонизирует корни в поисках ниши и питания (16). Внесение соломы зерновых в количестве, соответствующем 2; 5 и 10 т/га, не только привело к снижению заболеваемости ячменя гнилью, но и способствовало лучшему развитию растений по сравнению с вариантом без заделки соломы в почву.
Влияние внесенной в почву целлюлозы на развитие Fusarium culmorum в почве под ячменем сорта Инари (А),
колонизацию грибом корней растений (Б) и интенсивность проявления на них симптомов гнили (В): а, б —
соответственно внесен только F. culmorum (контроль) и F. culmorum + 1 % целлюлозы (данные вегетационных опытов).
Оценка развития F. culmorum в почвенных условиях, приводящих к разной заболеваемости ячменя гнилью, не выявила какой-либо зависимости между формированием определенных структур гриба и его патогенной активностью. Образование тех или
иных структур скорее определялось почвенными условиями. Плотность мицелия прямо
зависела от количества почвенного углерода и отсутствия антагонистической микрофлоры. Это полностью согласуется с абсорбционным типом питания гриба и наибольшей уязвимостью именно мицелия по сравнению с другими структурами. При микроскопировании мы отмечали в основном мицелий двух типов — прямой, малоразветвленный и очень сильно ветвящийся, извитой. Однако такой характер гиф можно было
наблюдать даже на одном фильтре в пределах варианта, что, по всей видимости, связано с микрозональностью почвы.
Механизм и причины активного образования макроконидий, особенно наблюдаемого в почвах с повышенным содержанием глин (более богатых углеродом, чем песчаные), до конца не ясны. Прорастание макроконидий, сформированных в почве, наблюдалось чаще, чем их лизис. В то же время число образовавшихся макроконидий прямо
соответствовало плотности мицелия. Вполне возможно, что повышенное образование
макроконидий — это своего рода «запас» гриба, необходимый для обеспечения будущего роста и экспансии. Обильное формирование хламидоспор сопровождалось активным
лизисом вегетирующих структур и было защитной реакцией гриба при действии либо
аборигенных бактерий, либо интродуцированного штамма P. fluorescens.
Итак, оценка развития Fusarium culmorum в разных почвенных условиях, его
сопоставление с интенсивностью колонизации корней и проявлением болезни на ячмене выявили возможных способов регулирования плотности почвенной популяции гриба
и меры защиты растений от гнили. Учитывая, что естественными антагонистами F. culmorum являются почвенные бактерии, создание и поддержание условий, приводящих к высокой биологической активности почв, будет способствовать обеспечению высокой численности антагонистической микрофлоры, сдерживающей развитие фитопатогена как в
почве, так и на корнях, что в конечном итоге приведет к снижению заболеваемости.
Интродукция штамма антагонистической бактерии в почву также может ограничивать
развитие фитопатогена в почве и на корнях. Однако следует знать условия, при которых антагонистический эффект интродуцента окажется максимальным. Создание почвенного режима, благоприятствующего сапротрофному развитию факультативного фи-
100
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
топатогена, — еще один способ снижения интенсивности развития корневой гнили,
вызываемой F. culmorum. Соответствующий прием — заделывание в почву целлюлозосодержащих материалов, например соломы зерновых. Наличие в почве доступного источника углерода увеличивает сапротрофную активность F. culmorum и предохраняет
корни от колонизации фитопатогеном, что приводит к уменьшению поражения корневой гнилью. Здесь следует напомнить, что сапротрофный тип питания позволяет грибу
принимать участие в процессах оструктуривания почвы, то есть осуществлять полезную
почвообразовательную деятельность.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
C o o k R.J. Fusarium diseases of wheat and other small grains in North America. In: Fusarium: diseases, biology and taxonomy /P.E. Nelson, T.A. Toussoun, R.J. Cook (eds.). Pensylvania, USA, 1981: 39-52.
M c m u l l e n M., J o n e s R., G a l l e n b e r g D. Scab of wheat and barley: a reemerging disease of
devestating impact. Plant Disease, 1997, 81: 1340-1348.
S m i l e y R.W., P a t t e r s o n L.M. Pathogenic fungi associated with Fusarium foot rot of winter wheat
in the semiarid Pacific Northwest. Plant Disease, 1996, 80: 944-949.
W a g a c h a J.M., M u t h o m i J.W. Fusarium culmorum: infection process, mechanisms of mycotoxin
production and their role in pathogenesis in wheat. Crop Protection, 2007, 26: 877-885.
P o m e r a n z Y., B e c h t e r D.B., S a u e r D.B. e.a. Fusarium head blight (scab) in cereal grains.
In: Advances in cereal science and technology /Y. Pomeranz (ed.). St. Paul, USA, 1990: 373-433.
S t r u n n i k o v a O.K., V i s h n e v s k a y a N.A., L a b u t o v a N.M. Effect of tricyclazole on development of phytopathogenic fungus Verticillium dahliae. Proc. 12th Int. Symp. «Modern fungicides and antifungal compouds». Friedrichroda, Germany, 1998: 27.
Ш а х н а з а р о в а В.Ю. Развитие интродуцированной популяции Fusarium culmorum (Wm.G. Sm.)
Sacc. в различных почвенных условиях. Автореф. канд. дис. СПб, 2002.
B u r g e s s L.W., G r i f f i n D.M. Competitive saprophytic colonization of wheat straw. Ann. Appl. Biol., 1967, 60: 137-142.
Ш а х н а з а р о в а В.Ю., С т р у н н и к о в а О.К., В и ш н е в с к а я Н.А. Развитие внесенной
популяции Fusarium culmorum в почве: особенности формирования и лизиса различных структур гриба. Микология и фитопатология, 2004, 38(2): 79-87.
С т р у н н и к о в а О.К., Ш а х н а з а р о в а В.Ю., В и ш н е в с к а я Н.А. и др. Применение
мембранных фильтров и иммунофлуоресцентного окрашивания для наблюдения за развитием почвообитающих микромицетов. Микология и фитопатология, 1998, 32(2): 65-72.
С т р у н н и к о в а O.K., Ш а х н а з а р о в а В.Ю., В и ш н е в с к а я Н.А. и др. Взаимоотношения Fusarium culmorum и Pseudomonas fluorescens в ризосфере и ризоплане ячменя. Микология и
фитопатология, 2008, 42(1): 68-75.
Ш а х н а з а р о в а В.Ю., С т р у н н и к о в а O.K., В и ш н е в с к а я Н.А. и др. Структура и
динамика популяции Fusarium culmorum в почвах разного гранулометрического состава. Почвоведение, 2000, 1: 86-91.
Ш а х н а з а р о в а В.Ю., С т р у н н и к о в а О.К., В и ш н е в с к а я Н.А. Динамика и структура популяции микромицетов в стерильных почвенных смесях разного гранулометрического состава.
Почвоведение, 2003, 2: 195-201.
С т р у н н и к о в а O.K., Ш а х н а з а р о в а В.Ю., В и ш н е в с к а я Н.А. и др. Развитие и
взаимоотношения Fusarium culmorum и Pseudomonas fluorescens в почве. Микробиология, 2007, 76(5):
675-681.
Ш а х н а з а р о в а В.Ю., С т р у н н и к о в а О.К., В и ш н е в с к а я Н.А. Влияние влажности
на развитие Fusarium culmorum в почве. Микология и фитопатология, 1999, 33(1): 53-59.
С т р у н н и к о в а О.К., В и ш н е в с к а я Н.А., Б о р о д и н а Е.В. и др. Влияние целлюлозы
на развитие Fusarium culmorum в ризосфере и ризоплане ячменя и интенсивность проявления корневой гнили. Микология и фитопатология, 2008, 42(6): 572-579.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: olgastrunnikova@rambler.ru
STUDY OF Fusarium culmorum DEVELOPMENT IN SOIL FOR SEARCH
OF PROTECTIVE ACTIONS AGAINST BARLEY ROOT ROT
O.K. Strunnikova
Summary
Fusarium culmorum macroconidia were introduced into soil on surface of the membrane filters. Immunofluorescent staining was used for identification of fungus structures on the filters and on barley roots. Fungus
development was evaluated under different soil conditions leading to different disease incidence. The relation between formation of particular structures by fungus and its pathogenic activity was not established. It was shown that
soil bacteria are the natural antagonists of F. culmorum. Population of F. culmorum soil and intensity of root rot decreased in soil with high native microbial activity and in soil with introduced strain of antagonist bacterium. On the
contrary, cellulose introduced into soil has led to increase of fungus soil population but disease intensity decreased.
Soil amendments with cellulose may be the way which will promote transition facultative phytopathogen F. culmorum to saprotrophism.
101
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631.461.74:579.23
ПОЛИМОРФНЫЙ МИКРООРГАНИЗМ, СПОСОБНЫЙ ОСАЖДАТЬ
АЛЮМИНИЙ НА КЛЕТОЧНОЙ ПОВЕРХНОСТИ
Р.С. КУТУЗОВА
Разработана методика выявления (с использованием световой микроскопии) полиморфного микроорганизма, широко распространенного в современном вулканическом материале и дерново-подзолистых почвах,
который способен осаждать на поверхности клеток алюминий, железо и марганец. По морфологическим (полиморфизм) и функциональным (осаждение алюминия, железа, марганца) признакам он близок к железомарганцевому микроорганизму Metallogenium.
Ключевые слова: полиморфный микроорганизм, осаждение алюминия, железа и марганца, дерновоподзолистые почвы, вулканический материал.
Keywords: polymorphous microorganism, precipitation of aluminium, iron and manganese, sod-podzolic
soils, volcanic material.
Большинство микроорганизмов так или иначе причастны к трансформации минеральной составляющей почв (1) или изверженной вулканической породы, которую они быстро осваивают, участвуя в первичном почвообразовательном процессе (2), но лишь немногие сохраняют жизнеспособность после аккумуляции на клеточной поверхности соединений, образованных высвобожденными ионами металла. К их числу относится железо- и
марганецосаждающий микроорганизм Metallogenium, первоначально обнаруженный в озерных илах как активный рудообразователь (3). В дерново-подзолистых почвах Metallogenium
представлен достаточно широко (1, 4-6).
Хотя алюминий — очень значимая составляющая выветриваемых минералов, его
осаждение микроорганизмами изучено недостаточно. Он относится к основным типоморфным элементам почв подзолистой зоны. При подзолообразовании соединения Al подвергаются растворению, миграции, трансформации и аккумуляции (7). В почвенном растворе Al
присутствует в составе алюмоорганических комплексов (вынос алюминия с ними — обязательное условие процесса подзолообразования) (8), а также в ионной форме Al3+, высокое
содержание которой служит причиной алюминиевой токсичности кислых подзолистых почв
(9, 10). Алюминий токсичен для растений, неблагоприятно воздействует на клубеньковые и
ассоциативные ростстимулирующие бактерии (11, 12), однако Al3+ токсичен и для многих
других бактерий (13, 14). В конце XX столетия в дерново-подзолистых почвах у своеобразных и пока малоизученных микроорганизмов, отнесенных к группе Metallogenium, —
Siderooccus выявили способность аккумулировать на клеточной поверхности не только железо, но и алюминий (1, 7, 15). Масштабность процесса подвергалась сомнениям, и только в
начале XXI столетия при электронно-микроскопическом изучении бокситов разного возраста и происхождения показана существенная роль микроорганизмов в бокситообразовании, предполагаемая как рудоотложение по биологической матрице (16). В биоценозе, сопутствующем современным вулканогенным алюминиевым новообразованиям, мы впервые
обнаружили микроорганизм, на структурах которого имелись отложения железа или алюминия, что, видимо, предопределялось спецификой среды обитания. По предварительным
данным, его условно отнесли к группе Metallogenium-Siderocoocus (17, 18). Позднее алюмоосаждающий микроорганизм был выявлен нами в дерново-подзолистых почвах многолетних опытов (19, 20).
Цель нашей работы — изучение морфологических особенностей алюмоосаждающих микроорганизмов из современного изверженного материала и дерново-подзолистых
почв многолетних опытов, а также сравнение их с обрастаниями Metallogenium, полученными Б.В. Перфильевым и Д.Р. Габе на щелевых пелоскопах во вторичном диагенетическом
профиле озерного ила (3).
Методика. Вулканический материал был представлен образцами с рН 1 и 4,
содержащими лесюкит — новообразованную минеральную фазу высокой степени дисперсности (13-40 % Al2O3) с примесью частиц пирокластики и железа (7-18 % Fe2O3), а
также ральстонит (20-24 % Al2O3) с незначительными примесями железа (менее 0,7 %)
(17, 18). Образцы дерново-позолистых почв отобрали из разных вариантов многолетних
полевых опытов. Опыт в Ленинградском НИИ сельского хозяйства (пос. Белогорка) по известкованию почв был заложен в 1957 году на подзолистых почвах, супесчаных по гранулометрическому составу, близких к легким суглинкам; также использовали почву с территории прилегающего лесного массива ельника-зеленомошника. Еще один опыт (стационарный) заложили в 1912 году (кафедра земледелия Московской сельскохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева). Почва дерново-среднеподзодистая и слабоподзолистая, кислая,
заплывающая (19, 20).
Для выявления алюмоосаждающего микроорганизма микроскопированием ис-
102
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
пользовали препараты, приготовленные на основе как пылевидной фракции вулканического материала, так и накопительных культур, полученных при посеве вулканического и
почвенного материала на жидкие синтетические питательные среды с алюминием — Александера (без глюкозы, K2HPO4, KH2PO4, NH4NO3, MgSO4, CaCl2, FeCl3 и дрожжевой
экстракт — соответственно 1,6; 0,4; 0,5; 0,2; 0,02; 0,03 и 0,2 г/л) и Аристовской (с низким содержанием солей), на которой этим автором в дерново-подзолистой почве был выявлен алюмоосаждающий микроорганизм, охарактеризованный как возможный представитель группы Metallogenium-Siderococcus (1). В среды вносили алюминий молочнокислый (0,1
и 1,0 г/л; Al3+ — 8,7 и 86,5 мг/л) или сернокислый (0,1 и 0,5 г/л; Al3+ — 8,1 и 40,5 мг/л).
Поддерживали рН 3,5-4,0 для предотвращения химического осаждения Al на клетках микроорганизмов, так как повышение рН от 4,0 к 5,2 в стандартных условиях ведет к изменениям
Al3+ ? Al(ОН)2+ ? Al(ОН)2+ ? Al(ОН)3 (21). Для подавления развития грамположительных
и грамотрицательных бактерий добавляли соответственно ампициллин (100 мг/л) и ацетат
таллия (30 мг/100 мл) (22, 23). На заключительном этапе исследований по фону указанных антисептиков вносили сыворотку лошадиной крови (1 г/л), используемую в средах
для микоплазм. При изучении вулканического материала первоначально внимание уделялось возможной железоосаждающей способности микроорганизмов, поскольку сведений о микробной способности осаждать алюминий было недостаточно (17, 18). Лесюкит
высевали на среду Сильвермана и Люндгрена 9К для Thiobacillus ferrooxidans (Acidotiobacillus
ferrooxidans) с сернокислым железом в виде соли Мора (63 г/л; Fe2+ — 9 г/л, рН 3,5) (24), а
также на среду Александера с солью Мора (Fe2+ — 0,3 г/л). Замену алюминия на уксуснокислый марганец (0,1 г/л; Mn2+ — 26 мг/л) в среде Аристовской использовали для выяснения присутствия в посевном материале микроорганизма, способного осаждать марганец.
Среды разливали в колбы по 100-200 мл, засевали 1 мл десятикратного разведения
изучаемых образцов, культивировали при комнатной температуре, периодически отбирали
пробы для микроскопирования. Для выявления алюмоосаждающего микроорганизма использовали световой микроскоп и впервые предложенный нами метод, включающий приготовление препаратов накопительной культуры на предметных стеклах, удаление алюминия, окрашивание его остаточного количества и негативное контрастирование тушью. Аналогичные приемы применяли для выявления Fe- и Mn-осаждающих микроорганизмов. Излишки алюминия на препаратах 1-2-месячных культур удаляли обработкой 3 %, более старых — 20 % уксусной кислотой, излишки железа — 1 % роданистым калием в подкисленной среде, марганца — 3 % H2O2 в подкисленной среде.
Использовали качественную реакцию на Al3+, основанную на взаимодействии с
алюминоном (обработка препарата 0,1 % раствором в присутствии 3 % уксусной кислоты
с образованием ярко-красного лака), и на Fe3+ — с желтой кровяной солью (1 % раствор
по фону слабого раствора HCl — синее окрашивание) или с роданистым калием (1 %
раствор в подкисленной среде — кроваво-красный цвет) (25). Остаточные количества
желто-коричневатых марганцевых соединений хорошо оттеняют морфологические структуры микроорганизма, а в случае образования перманганатного иона при излишках перекиси водорода придают им фиолетово-розовые оттенки. Негативное контрастирование
тушью, заполняющей пространство между клетками, предварительно освобожденными от
алюминия, применяли для выявления бесцветного ореола вокруг центральной части микроорганизмов, без чего они, как правило, выглядят как скопление мелких частиц непонятной природы.
Препараты документировали с помощью цифрового фотоаппарата и фотокамеры (микроскопы Axiolab-Zeiss и Axiostar plus-Zeiss, Германия, с программным обеспечением). Основное рабочее увеличение 100Ѕ10, общий план — 40Ѕ10, крупные орудненные колонии — 20Ѕ10, реже 10Ѕ10.
Результаты. Ампициллин и ацетат таллия, применяемые при культивировании
микоплазм, кислая среда, наличие Al3+, токсичного для многих микроорганизмов, низкое содержание органического вещества должны способствовать созданию элективных
условий для организма, уступающего по скорости развития обычной сапрофитной микрофлоре. Многолетние наблюдения и сравнение морфологии микроорганизмов из вулканического материала и почвенных образцов, выявляемых на средах с алюминием и при
замене алюминия на Fe и Mn, позволяют предположить существенную близость этих организмов и дать общее представление об их размерах и морфологических структурах.
На начальных стадиях развития накопительной культуры (1,0-1,5 мес) алюмоосаждающий микроорганизм был представлен овальными образованиями красного
цвета, свободно лежащими (рис. 1, а) или заключенными в подтеки ярко-красного лака
на предметном стекле. Доминирующую форму микроорганизмов, освобожденных от
отложений, представляли мелкие овальные тела диаметром до 1-3 мкм с более плотной
центральной частью, как правило, сохраняющей красный цвет прокрашенного Al, и
прозрачным ореолом (подобным слизистой капсуле), хорошо видимым только на темном фоне туши (см. рис. 1, б). Центральная часть обычно составляла примерно 1/3 от
общего размера объекта. Одновременно в препарате присутствовали организмы значи-
103
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
тельно меньшего размера — 0,1-0,2 мкм (17, 18). При фазово-контрастной микроскопии на
примере достаточно крупных объектов наблюдали
результат не только бинарного деления клеток,
но и почкования с образованием комочков из формирующихся клеток, образование нитчатых выростов
с возможной последующей
сегментацией и появлением
цепочек клеток, о чем можно судить по присутствию
цепочки тел, уменьшающихся в размере и плотно
примыкающих друг к другу
(см. рис. 1, в). Иногда активное деление в одном направлении наряду с менее активным почкованием и образованием выростов у отпочковывающихся клеток
вело к появлению объектов
в виде «мохнатых гусениц».
Подобное возможно, когда репликация предшествует, но необязательно синхронизирована с цитоплазматическим делением, что
обусловливает полиморфизм организма (23, 26).
Кроме того, у наиболее
крупных представителей
(см. рис. 1, в) предполагаемая капсула структурирована радиальными бороздками, которые пересекаются 2-3 кольцами мельчайших клеточек. В дальнейшем эти овальные микроколонии покрываются
алюминием (см. рис. 1, а)
Рис. 1. Алюмоосаждающий микроорганизм на средах Александера и Аристовлибо радиальные бороздской с солями алюминия: а — овальные формы, покрытые отложениями
ки превращаются в разрасалюминия; б — «капсулированные» формы, освобожденные от отложений;
в — «слизистая капсула», размножение микроорганизма (фазовый контания нитей, постепенно
траст); г — трихосферическая микроколония; д — прорастание овальных
преобразующихся в цепочтел с образованием трихосферических микроколоний.
ки клеточек (см. рис. 1, г).
В центральной части разрастания зачастую имеет место скопление клеток. Фактически
это микроколонии (трихосферические или зооглейные), аналогичные колониям Metallogenium, названным так его первооткрывателями (3). Радиальные нити могут отделяться
от микроколонии, распадаться на овальные тела, прорастающие 1-3 тонкими нитями,
давая начало следующему циклу развития (см. рис. 1, д).
При обработке препаратов накопительной культуры (посев лесюкита на среду
Александера с солью Мора) желтой кровяной солью или роданистым калием выявили
те же формы, что и на средах с алюминием, — множество мелких овальных тел (рис. 2,
а) и трихосферические колонии (см. рис. 2, б). Скопление мелких клеток в центральной части превращает колонию в «лепешку», состоящую из нескольких мутовчатых
кругов (см. рис. 2, в). После внесения одной капли накопительной культуры (железистый осадок на среде Сильвермана и Люндгрена, где он в течение года сохранялся при
рН 1-2) в среду Аристовской с молочнокислым алюминием (1 г/л) уже к концу 1-го мес
культивирования обнаружили морфологические формы, описанные выше у алюмоосаждающего микроорганизма (см. рис. 2, г, д). Недостаточное удаление отложений алюминия с поверхности микроорганизмов на препаратах приводило к красному окрашиванию колоний алюминоном (см. рис. 2, д). Представленный материал подтвердил высказанное ранее предположение о способности одного и того же организма осаждать Fe
или Al в зависимости от их наличия в среде (17, 18).
104
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Замена в среде Аристовской алюминия на уксуснокислый марганец приводила
к выявлению тех же морфологических структур — множества овальных форм, варьирующих от крупных (рис. 3, а)
до очень мелких, и трихосферических микроколоний, вначале
с несептированными радиальными нитями (см. рис. 3, б, в).
Этот опыт побудил исследовать иловые обрастания
Metallogenium на тонких стеклянных полосках щелевых пелоскопов. После удаления с
обрастания плотных марганцевых отложений черного цвета
на стекле не только выявили
характерные для Metallogenium
«паучки» (см. рис. 3, г), но и обнаружили как мелкие овальные
формы со светлым валиком вокруг центра, так и очень нежные трихосферические колонии
диаметром от 5-10 до 50-70 мкм,
состоящие из нескольких мутовчатых ярусов, радиальные нити которых были представлены
цепочками чрезвычайно мелких
овальных клеточек (см. рис. 3,
д, е). Эти разросшиеся на стеклянных пластинках пелоскопа
колонии Metallogenium так плотРис. 2. Железоосаждающий микроорганизм на среде Александера с
но прикреплялись к стеклу, что
железом (а, б, в) и при высеве из среды Сильвермана-Люндгрена с
железом на среду Аристовской с алюминием (г, д): а — овальные форне подверглись каким-либо демы, покрытые отложениями железа; б — трихосферические микроформациям при многочисленколонии; в — образование микроколониями бляшек; г — прорастаных обработках препарата.
ние овальных форм; д — отложение на микроколонии алюминия, окрашенного алюминоном в красный цвет.
Ранее при электронной микроскопии (Hitachi H300, Япония) мы показали, что изучаемый Al-Fe-осаждающий микроорганизм, освобожденный от отложений, представлен наноформами (0,1-0,2 мкм), овальными или неправильно овальными, без резко очерченной границы, с рыхлой связью. Имелись также
нитеобразные структуры с неоформленными клетками по длине (17, 18). Еще раньше
при электронной микроскопии обрастаний Metallogenium мы также выявляли наноформы (27, 28).
Вулканический материал по сравнению с почвами значительно обогащен интересующим нас микроорганизмом — его морфологические структуры обнаруживались уже
при непосредственном микроскопировании пылевидной фракции (17, 18), а также после
1 мес культивирования посевов на жидких средах (для почвенных образцов получение
накопительной культуры занимало 3-4 мес). Метод предельных разведений оказался несостоятельным из-за отсутствия помутнения или окрашивания жидкой среды (лишь слабая опалесценция). Метод учета колоний при высеве на поверхность агаризованной среды не дал положительных результатов из-за микроскопических размеров колоний, хорошо видимых лишь при Ѕ100 и Ѕ40, реже при Ѕ20 и Ѕ10 (особенно вдоль бороздки почвы
или вулканического материала, нанесенного на агар) (17, 18). К тому же трихосферические колонии, постепенно превращаясь в зооглейные, могут состоять из нескольких мутовчатых ярусов, напоминать колонии «яичница-глазунья» и овальные «лепешки», смыкаться в сплошную пленку. Для определения численности бактерий, имеющих наноформы, применяется современный метод молекулярной экологии, не требующий культивирования изучаемого объекта, — FISH (fluorescent in situ hybridization) (29, 30).
Сопоставление выявленного нами алюмоосаждающего микроорганизма с Metallogenium, описание которого приведено в «Определителе бактерий Берджи» (1997), указывает на их функциональное (осаждение не только Al, но Fe и Mn) и морфологическое (31)
сходство, а также подобие с микоплазмами (26). Metallogenium был охарактеризован как свободноживущий микоплазмаподобный микроорганизм (32, 33). С этим корреспондируются
105
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
многие свойства выявленного
нами алюмоосаждающего микроорганизма — устойчивость к
ампициллину и ацетату таллия,
положительная реакция на лошадиную сыворотку в среде, наличие наноформ, характер размножения, микроскопические
колонии («яичница-глазунья») на
плотных средах, наличие капсулоподобных структур. Вместе с
тем высказываются сомнения в
существовании Metallogenium,
предлагается рассматривать их
омарганцованные структуры как
химический продукт жизнедеятельности иных бактерий (31, 34),
что в значительной степени связано с трудностями удаления с
поверхности Metallogenium и подобных микроорганизмов соединений Mn, Fe, Al. Микоорганизмы без минеральных отложений становятся невидимыми,
что требует дополнительной обработки: подкрашивания оставшихся на поверхности отложений, негативного контрастирования и, как правило, дополнительного компьютерного увеличения. Мы полагаем, что представленные данные дают основание считать реально существующими как обнаруженный алюмоосаждающий микроорганизм,
так и Metallogenium, выявляеРис. 3. Марганецосаждающий микроорганизм на среде Аристовмый с использованием нашей
ской с уксуснокислым марганцем (а, б, в) и в обрастаниях на пелометодики.
скопе (г, д, е): а — овальные формы; б, в — трихосферические микАлюминиевые отложероколонии; г — типичные «паучки» обрастаний пелоскопов; д,
е — трихосферические микроколонии без отложений марганца.
ния на поверхности клеток (мелких, чрезвычайно нежных и, по
всей видимости, лишенных клеточной стенки) выполняют структурную функцию. Кроме
того, при обитании (подобно Metallogenium) в условиях, когда концентрации ионов Al,
Fe и Mn могут повышаться до токсических, их выведение из раствора и осаждение на
клетках обеспечивает защитную функцию, делая возможным существование в такой среде (1). Механизм осаждения алюминия на поверхности микроорганизмов пока неясен и,
вероятно, не всегда однотипен. В одних случаях может быть достаточно повышения рН на
границе раздела поверхности клетки и питательного раствора. При описанных выше превращениях Al3+ до Al(ОН)3 можно ожидать сорбцию Al3+ и других положительных ионов алюминия отрицательно заряженными функциональными группами на клеточной поверхности.
Осаждение коллоидных мицелл Al(ОН)3, образующихся в растворе в результате гидролиза
солей Al3+, может идти на мельчайших клетках и их нитевидных цепочках как на центрах
конденсации с последующим переходом от аморфного состояния к кристаллизации (35).
Итак, выявленный нами алюмоосаждающий микроорганизм широко распространен в изверженной породе и дерново-подзолистых почвах, растет на жидких средах в присутствии солей Al, а также Fe и Mn (перекрестный посев подтверждает способность осаждать любой элемент при его наличии в среде). Количественная оценка и изучение алюмоосаждающих микроорганизмов молекулярно-генетическими методами позволит перейти к
разработке способов осаждения и детоксикации подвижных форм алюминия в корневой
зоне растений как приема повышения продуктивности на кислых подзолистых почвах.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
106
А р и с т о в с к а я Т.В. Микробиология процессов почвообразования. Л., 1980.
К у з я к и н а Т.И. Экология и геохимическая деятельность микроорганизмов на активных вулканах
и в гидротермах. Владивосток, 2004.
П е р ф и л ь е в Б.В., Г а б е Д.Р. Изучение методом микробного пейзажа бактерий, накопляющих
марганец и железо в донных отложениях. В сб.: Роль микроорганизмов в образовании железомарганцевых озерных руд. М.-Л., 1964: 16-53.
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
Б о л о т и н а И.Н. Экология почвенных марганецокисляющих микроорганизмов рода Metallogenium. Автореф. канд. дис. М., 1975.
М и р ч и н к Т.Г., З а п р о м е т о в а К.М., З в я г и н ц е в Д.Г. Грибы-спутники бактерий,
окисляющих марганец. Микробиология, 1970, 39(2): 379-383.
Б о л о т и н а И.Н., М и р ч и н к Т.Г., Н и к и т и н Д.И. О природе и распространении марганецокисляющих микроорганизмов-спутников грибов. Почвоведение, 1973, 9: 75-81.
А р и с т о в с к а я Т.В., З ы к и н а Л.В. Биологические факторы миграции и аккумуляции алюминия в
почвах и коре выветривания. В сб.: Проблемы почвоведения, М., 1978: 102-107.
Т о л п е ш т а И.И., С о к о л о в а Т.А. Соединения алюминия в почвенных растворах и его миграция в
подзолистых почвах на двучленных отложениях. Почвоведение, 2009, 1: 29-41.
Л и с и ц ы н Е.М. Химизм растворов и оценка потенциала алюмоустойчивости растений (вопросы
методики). Агрохимия, 2007, 1: 81-91.
П у х а л ь с к а я Н.В. Проблемные вопросы алюминиевой токсичности. Агрохимия, 2005, 8: 70-82.
Ш и р о к и х А.А., Ш и р о к и х И.Г. Влияние кислотности и алюминия на рост культуры Agrobacterium radiobacter. Агрохимия, 2004, 12: 41-46.
И л л м е р П., Э р л е б а х К. Фосфор смягчает влияние, оказываемое алюминием на клетки Arthrobacter. Микробиология, 2005, 74(6): 852-855.
W o o d M. A mechanism of aluminium toxicity to soil bacteria and possible ecological implications. Plant
and Soil, 1995, 171: 63-69.
I l l m e r P., S c h i n n e r F. Influence of nutrient solution on Al-tolerance of Pseudomonas sp. FEMS
Microbiol. Lett., 1999, 170: 135-190.
А р и с т о в с к а я Т.В., З ы к и н а Л.В., С о к о л о в а Т.А. О возможности биогенного образования
минералов гидроокиси алюминия в почвах. Почвоведение, 1983, 9: 67-73.
Ш к о л ь н и к Э.Л., Ж е г а л л о Е.А., Б о г а т ы р е в Б.А. и др. Биоморфные структуры в бокситах
(по результатам электронно-микроскопического изучения). М., 2004.
К у т у з о в а Р.С., В е р г а с о в а Л.П., Ф и л а т о в С.К. Преобразование изверженных пород
при участии микробного биоценоза на Первом шлаковом конусе Большого трещинного Толбачинского извержения. Вулканология и сейсмология, 2004, 1: 46-54.
К у т у з о в а Р.С., В е р г а с о в а Л.П., Ф и л а т о в С.К. Участие бактерий Metallogenium-Siderococcus
в поствулканических преобразованиях изверженного материала (Камчатка). Почвоведение, 2006, 3: 334-343.
К у т у з о в а Р.С., В е р г а с о в а Л.П., Ф и л а т о в С.К. и др. Алюминий- и железоосаждающий
микроорганизм современной изверженной породы и дерново-подзолистой почвы. Мат. Межд. науч.
конф. «Микроорганизмы и биосфера». М., 2007: 75-76.
К у т у з о в а Р.С., К р у г л о в Ю.В. Осаждающие алюминий микроорганизмы дерново-подзолистых
почв и современной изверженной породы. Мат. Всерос. конф. «Продукционный процесс растений:
теория и практика эффективного и ресурсосберегающего управления». СПб, 2009: 257-258.
С а ф о н о в а О.Ф., Ф у р м а к о в а Л.Н., Б р о н е в о й В.А. и др. Изучение систем с участием алюминия в стандартных условиях. В сб.: Проблемы генезиса бокситов. М., 1975: 280-288.
Г у л и й О.И., М а р к и н а Л.Н., И г н а т о в О.В. и др. Влияние ампициллина на электрофизические свойства клеток Escherichia coli. Микробиология, 2005, 74(1): 126-131.
Б о р х с е н и у с С.Н., Ч е р н о в а О.А., Ч е р н о в В.М. и др. Микоплазмы. СПб, 2002.
К а р а в а й к о Г.И., К у з н е ц о в С.И., Г о л о м з и к А.И. Роль микроорганизмов в выщелачивании металлов из руд. М., 1972.
В а с и л ь е в В.В., Г р и г о р ь е в Н.Н. Практическое руководство по качественному химическому полумикроанализу. Л., 1966.
Микоплазмы (или молликуты): бактерии без клеточной стенки. Определитель бактерий Берджи. Т. 2.
М., 1997: 710-720.
К у т у з о в а Р.С. Электронно-микроскопическое изучение иловых обрастаний железоокисляющего кокка,
близкого Siderococcus limoniticus Dorff. Микробиология, 1974, 43(2): 285-288.
К у т у з о в а Р.С., Г а б е Д.Р., К р а в к и н а И.М. Электронно-микроскопическое изучение обрастаний железомарганцевых микроорганизмов ила. Микробиология, 1972, 41(6): 1099-1102.
П а н к р а т о в Т.А., Б е л о в а С.Э., Д е д ы ш С.Н. Оценка филогенетического разнообразия
прокариотных микроорганизмов в cфагновых болотах с использованием метода FISH. Микробиология, 2005, 74(6): 811-837.
Д о б р о в о л ь с к а я Т.Г., Г о л о в ч е н к о А.В., П а н к р а т о в Т.А. и др. Оценка бактериального разнообразия почв: эволюция подходов и методов. Почвоведение, 2009, 10: 1222-1232.
Железо- и марганецокисляющие и/или осаждающие бактерии. Определитель бактерий Берджи. Т. 2.
М., 1997: 448-457.
D u b i n i n a G.A. Untersuchungen uber die Morphologie von Metallogenium und die Beziehungen zu Mycoplasma. Zeitschrift fur Allg. Mikrobiologie, 1970, 10(5): 309-320.
Б а л а ш о в а В.В. Микоплазмы и железобактерии. М., 1974.
П и н е в и ч А.В. Микробиология железа и марганца. СПб, 2005.
П а с ы н с к и й А.Г. Коллоидная химия. М., 1963.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: kutuzova_rs@mail.ru
POLYMORPHOUS MICROORGANISM WHICH PRECIPITATES
ALUMINUM ON THE CELL SURFACE
R.S. Kutuzova
Summary
Polymorphous microorganism is revealed, widespread in the contemporary volcanic material and the
sod-podzolic soils, which is capable to precipitate aluminum, and also iron and manganese on the cell surface.
New method was developed for identification of this microorganism by means of light microscopy. In the morphological signs (polymorphous) and functional (precipitatiоn of aluminum, iron, manganese) it is close to iron manganese microorganism Metallogenium.
107
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 636:628.54:579.64:576
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПЕРЕРАБОТКИ
ОТХОДОВ ЖИВОТНОВОДСТВА
И.А. АРХИПЧЕНКО
Описан биоценоз активного ила аэротенков очистных сооружений свинооткормочных комплексов, который представлен бактериальной флорой и фауной простейших. Из бактерий доминирующее положение занимают нокардиоформы (50-80 % выделенных штаммов). Инфузории в основном представлены родами Opercularia, Vorticella, Epistylis, жгутиконосцы — родами Bodo, Monas, Oicomonas. Изученный биоценоз представляет собой экологическую систему, которая при нормальном режиме работы сооружений не зависит от колебаний природных факторов.
Ключевые слова: бактерии, микроорганизмы, инфузория, активный ил, сточные воды, аэротенки.
Keywords: bacteria, microorganisms, infusoria, active sludge, sewage water, aerotanks.
Биологическая очистка сточных вод свинооткормочных комплексов происходит в
системе аэротенков очистных сооружений. Эффективность процесса определяется активностью микроорганизмов, спонтанно развивающихся на сточных водах и участвующих в
окислении сточной жидкости (СЖ). Эта ассоциация микроорганизмов носит название активный ил. Характерная особенность сточных вод свинокомплексов — высокая концентрация
органических веществ (до 8000 мг/л по химическому потреблению кислорода — ХПК). В хозяйственно-бытовых сточных водах этот показатель составляет 250-500 мг/л по ХПК, в
сточных водах пищевой промышленности — 150-400 мг/л. Химическим составом стока определяется специфический набор микроорганизмов и структура биоценоза активного ила.
Однако до настоящего времени нет работ по его комплексному исследованию, хотя в литературе имеются сведения о микрофауне активного ила (1, 2). Данные по составу и численности прокариотических микроорганизмов ограничены: в основном исследовали микрофлору навоза, систем анаэробной переработки жидких отходов или сточные воды (3, 4).
При изучении микробиологических процессов в активных илах свиноферм идентификацию
бактериального состава не проводили. В то же время очевидно, что только знание особенностей биологии микроорганизмов активного ила, видового состава и структуры микробных сообществ, складывающихся в аэротенках, позволит экологически грамотно осуществлять строительство и эксплуатацию очистных сооружений.
Биомассу активного ила, богатую азотом, фосфором, калием, микроэлементами,
микробным белком, ферментами, можно использовать как сырье для производства удобрений и биологически активных веществ. Для этого необходимы сведения о составе компонентов активного ила и их стабильности. Изучение активного ила важно и с позиций фундаментальной микробиологии: все чаще в промышленных системах используются не чистые культуры, а ассоциации микроорганизмов, однако экология промышленных микробов
изучена недостаточно, неясно и то, как складываются взаимоотношения между видами в
условиях техногенной нагрузки, насколько изменяются свойства организмов.
Цель настоящего исследования — выявление и идентификация основных организмов, формирующих биоценоз активного ила аэротенков свинокомплексов в системе
аэробной очистки.
Методика. Объектом изучения служил активный ил из промышленных аэротенков (объем 1600 м3) очистных сооружений на свинооткормочном комплексе «Восточный»
(Ленинградская обл.). СЖ поступала в аэротенки со скоростью 25 м3/ч. Объем возвращаемого ила составлял 37 м3/ч, коэффициент его рециркуляции — 1,5, содержание биомассы микроорганизмов в аэротенках — 5-6 г/л. Пробы активного ила для количественной оценки микрофлоры и исследования таксономического состава отбирали ежеквартально в течение 4 лет. Взвесь активного ила (10 мл) центрифугировали, дважды промывали стерильной водой, суспендировали и обрабатывали в ручном поршневом гомогенизаторе (3,5 тыс. об/мин). Из полученной суспензии готовили серийные разведения. Чистые культуры выделяли стандартными методами на триптон-соевом агаре. После отбора и
выделения доминирующих культур их идентифицировали по составу клеточных жирных
кислот. В некоторых случаях использовали мясопептонный агар (МПА), на котором оценивали рост чистых культур в присутствии сточной жидкости. Микрофауну изучали методом световой микроскопии (МБИ-15, «ЛОМО», СССР) при увеличении Ѕ600-800.
Результаты. Закономерности формирования биоценоза активного ила в открытых промышленных системах мы проанализировали на основе эколого-физиологической
характеристики идентифицированной микрофауны. В биоценозе ила были выявлены
представители не менее 14 родов бактерий. Их численность колебалась от 1,0Ѕ108 до
2,5Ѕ1010 КОЕ/мл. В основном это аэробные бактерии с окислительным типом метабо-
108
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
лизма — аэробы и микроаэрофилы (только Streptococcus и Enterobacter обладают бродильным метаболизмом). Среди исследованных штаммов превалировали грамположительные
бактерии, однако численность бацилл оказалась на три-четыре порядка ниже, чем у других бактерий. Доминирующее положение занимали нокардиоподобные микроорганизмы
(50-80 % всех выделенных штаммов) (табл. 1).
1. Бактериальная флора в активном иле свинокомплекса «Восточный» по сезонам года
(Ленинградская обл.)
Группа микроорганизмов
зима
Число культур
весна
лето
Нокардиоформы (Arthrobacter, Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus)
36
33
Грамотрицательные кокки (Neisseria)
–
1
Грамположительные кокки (Micrococcus, Streptococcus)
5
7
Грамотрицательные палочки с бродильным типом метаболизма
(Proteus, Enterobacter)
–
3
Грамотрицательные палочки с окислительным типом метаболизма
1
(Alcaligenes, Pseudomonas)
–
1
Простекобактерии (Caulobacter, Hyphomicrobium)
–
Споровые (Baсillus)
5
3
П р и м е ч а н и е. Прочерки означают, что вид микроорганизма не выявлен.
осень
60
–
1
22
1
2
1
–
1
–
4
4
12
8
Согласно определителю Берджи (6), к нокардиоподобным относят микроорганизмы порядка Actinomycetales, образующие типичный мицелий и размножающиеся с помощью
его фрагментов. Постоянная фрагментация первичного мицелия на неравномерные палочковидные и кокковидные элементы — главный признак, объединяющий эти организмы в
одну группу. Как показали Н.С. Паников с соавт. (7), их точный состав не установлен,
группа нокардиоформ сложна в систематическом отношении. Для решения вопросов таксономии этих микроорганизмов наиболее надежны хемо- и генотаксономические признаки.
Из числа аэробных грамотрицательных палочек в незначительном количестве были
обнаружены представители родов Pseudomonas, Alcaligenes, Proteus, Enterobacter. По сравнению с микрофлорой очистных сооружений органических производств, где эти виды составляют 60-70 % общего числа бактериальной флоры, доминируют нокардиоформы, а псевдомонады присутствуют в единичных экземплярах. Анализ роста чистых культур Serratia
marcescens и Ps. aeruginosa на среде МПА с включением сегментов агаризованного стока
показал, что сточная жидкость свинокомплексов содержит соединения, ингибирующие
рост этих микроорганизмов, особенно Ps. aeruginosa, когда агаризованный столбик содержал 75 % СЖ. Снижение концентрации СЖ в агаризованных столбиках до 50 и 25 %
уменьшало ингибирующее воздействие на рост опытных культур. В том случае, когда СЖ
стерилизовали, ингибирования роста не наблюдали, что свидетельствует о летучей природе
ингибирующих соединений. Согласно данным канадских исследователей, изучавших химический состав стоков свиноферм, такими соединениями могут быть фенолы, П-крезолы,
летучие жирные кислоты, индолы, скатолы. Таким образом, присутствие этих компонентов
обусловливает жесткий естественный отбор в биоценозе ила наиболее устойчивых бактериальных видов, большая часть которых относится к нокардиоформам. Особенность их влияния заключается в наличии мощных ферментных систем, что имеет особое значение для
разложения трудноокисляемых органических соединений сточной жидкости в аэротенках.
Кроме того, нокардии способны выделять ростовые вещества типа гиббереллинов или ауксинов и эффективно стимулировать рост многих растений (7). Последнее свойство существенно повышает ценность активного ила при использовании его в качестве удобрений.
Наибольшее разнообразие видов отмечали в переходные сезоны — весной и осенью, когда доля нокардиоформ снижалась до 50-60 % и в биоценозе появлялись роды Caulobacter, Alcaligenes, Neisseria (зимой и летом их не выявляли). В течение всего года стабильно
присутствовали грамположительные кокки родов Micrococcus, Streptococcus и споровые бактерии рода Bacillus. Грамотрицательные палочки — псевдомонады, протеи и энтеробактерии, активно развивающиеся в большинстве илов органических производств и представляющие собой доминирующую группу, в биоценозе активного ила свинокомплексов встречались в единичных экземплярах, так как их ингибировали летучие компоненты СЖ.
Изученный микробоценоз характеризуется постоянством таксономического состава: даже изменение такого физиологически важного фактора, как содержание растворенного кислорода в иловой смеси, на него существенно не влияло. Сообщество включало значительное число активных микроорганизмов, биомассу которых можно использовать в биотехнологической промышленности для создания удобрений и биодобавок. При достаточном постоянстве микробоценоза условия среды обитания, складывающиеся в аэротенках
обусловливают наибольшую конкурентоспособность нокардиоподобных бактерий. Подобную структуру микробного сообщества следует ожидать в активных илах свинокомплексов
на территории не только северо-запада России, но и, возможно, всего умеренного пояса.
109
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Косвенно это подтверждают данные по микрофауне. В активном иле аэротенков выявлено более 30 видов простейших — инфузорий, жгутиконосцев и саркодовых
(табл. 2). Их таксономический состав и численность зависели от количества и консистенции иловой массы, которые, в свою очередь, связаны с составом и концентрацией
органических веществ в стоке. Среда аэротенков наиболее благоприятна для развития
инфузорий и ряда жгутиконосцев: она обеспечивает практически неограниченное количество пищи, а многие определяющие экологические факторы (концентрация кислорода, кислотность, температура) постоянны и поддерживаются на оптимальном уровне.
2. Фауна простейших в активном иле свинокомплекса «Восточный» по сезонам года
(Ленинградская обл.)
Микроорганизм
зима
Численность
весна
лето
осень
Инфузории
Opercularia coarctata, число колоний
16,0Ѕ102 (3,7)
9,0Ѕ102 (1,3)
29,0Ѕ102 (2,5)
(среднее число особей на 1 колонию)
90,0Ѕ102 (3,4)
Vorticella microstoma (цисты)
4,2Ѕ102 (8,5Ѕ102) 112,0Ѕ102 (1,7Ѕ102)
– (–)
– (–)
30,0Ѕ102 (4,0Ѕ102) 390,0Ѕ102 (–) 80,0Ѕ102 (49,0Ѕ102)
Pseudoglaucoma muscorum (цисты)
555,0Ѕ102 (–)
2
2
1,7Ѕ10
–
2,3Ѕ102
Spathidium sp.
3,4Ѕ10
2,7Ѕ102
–
–
Epistylis plicatilis, число колоний
–
Epistylis bimaeginata, число колоний
–
11,0Ѕ102
–
–
2
–
5,1Ѕ10
–
Opercularia curvicaula, число колоний
–
51,0Ѕ102
–
–
Vorticella nutans
–
57,0Ѕ102
–
–
Aspidisca coastata
104,0Ѕ102
Asp. turrita
–
8,5Ѕ102
–
–
19,0Ѕ102
–
–
Anophrys sarcopha
27,0Ѕ102
–
–
–
Chilodonella uncinata
1,7Ѕ102
Podophrya fixa
15,0Ѕ102
–
–
–
Жгутиконосцы
304,0Ѕ102
127,0Ѕ102
Bodo sp.
Единичные
351,0Ѕ102
Monas sp.
–
45,0Ѕ102
34,0Ѕ102
12,0Ѕ102
Oicomonas socialis
–
46,0Ѕ102
252,0Ѕ102
53,0Ѕ102
Pleuromonas jaculan
–
–
–
24,0Ѕ102
Саркодовые
–
–
Gromia neglecta
–
24,0Ѕ102
Arcella vulgaris
–
8,0Ѕ102
–
–
–
–
Difflugia sp.
–
1,7Ѕ102
Centropyxis sp.
–
–
–
0,8Ѕ102
Амебы группы «лимакс»
–
–
–
5,0Ѕ102
П р и м е ч а н и е. Число экземпляров или колоний приведено в расчете на 1 мл иловой смеси. Прочерки означают, что вид микроорганизма не выявлен.
Простейшие микрофауны подразделялись на две группы — встречающиеся почти
регулярно круглый год и сопутствующие виды, которые появляются спорадически, некоторое время задерживаются в аэротенке и затем исчезают. Постоянно присутствовали в активном иле инфузории Opercularia coarctata (сидячие колониальные формы), Pseudoglaucoma
muscorum, Spathidium sp. (неприкрепленные одиночные формы) и жгутиконосцы Bodo sp.,
Monas sp. Их наличие не зависело от сезона, причем период усиленного размножения двух
наиболее постоянных членов биоценоза (Opercularia coarctata, Pseudoglaucoma muscorum) приходился не на весну, что характерно для естественных мест обитания, а на декабрь—январь,
то есть период наиболее стабильной работы аэротенков. Встречающиеся спорадически виды
инфузорий появлялись в пробах главным образом в марте, апреле, мае. Это Anophrys sarcopgada, прикрепленные формы Opercularia curvicaula, Opercularia sp., Epistylis dimargimata, Epistylis plicatilis, Vorticella nutans и свободноплавающие Aspidisca costata, Aspidisca turrita, Strombidium sp. Богатство видового состава инфузорий весной связано, вероятно, с оживлением
фауны природных водоемов, то есть представляет собой результат воздействия сезонных
факторов. Подобная динамика наблюдалась в очистных сооружениях бытовых стоков (2, 3).
Определение видового состава жгутиконосцев при общем анализе микрофауны иловой смеси затруднено из-за их мелких размеров, быстрого движения и значительной внутривидовой
изменчивости. Преобладали представители родов Bodo и Monas, присутствующие постоянно
и в значительном количестве. Кроме того, с мая по октябрь отмечены Oicomonas socialis и в
ноябре — Pleuromonas jaculans (см. табл. 2). Между численностью жгутиконосцев и доминирующих в активном иле видов инфузорий имелась обратная корреляция.
Следует отметить чуткую реакцию биоценоза простейших на условия обитания,
а именно на большее влияние технологического режима аэротенков свинокомплексов,
чем очищающих бытовые и смешанные стоки. В последних ясно прослеживаются пики
разнообразия и численности микрофауны весной и осенью, связанные с природным
оживлением фауны. В исследованных аэротенках обогащения фауны осенью не наблюдалось, а весенний пик был значительно сглажен, что обусловлено более жестким технологическим режимом, оказывающим элиминирующее воздействие на микрофауну.
110
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Ресничная инфузория рода Oxytrichia (а), прикрепленная инфузория рода Opercularia coarctata и зооглейные скопления (б) в активном иле свинокомплекса «Восточный» (Ленинградская обл.). Увеличение Ѕ600.
Основу структуры любой экологической системы составляют трофические
связи. Активный ил аэротенков свинокомплексов представляет собой устойчивую
экосистему, которая характеризуется наличием двух основных трофических звеньев.
Первое представлено бактериями и жгутиконосцами родов Bodo, Monas, для которых свойствен сапрозойный тип питания. Второе составляют инфузории (бактериофаги) — как свободноплавающие из рода Pseudoglaucoma, так и прикрепленные, среди которых доминируют роды Opercularia (рис.) и Vorticella, характеризующиеся голозойным типом питания.
В биоценозе активного ила свинокомплексов в отличие от природных экосистем и активных илов, очищающих бытовые и смешанные стоки, отсутствуют организмы с автотрофным типом питания (фотосинтезирующие виды) и хищники. Хищники
обычно представлены сосущими инфузориями (Suctoria) и фауной многоклеточных (Rotatoria, Oligochaeta, Nematoda).
Итак, в аэротенках очистных сооружений свинокомплексов формируется новый
тип микробного сообщества. Выявленное нами постоянство состава микрофлоры и микрофауны в биоценозе ила, а также доминирование в нем нокардиоформ и коринебактерий, среди которых много стимуляторов роста растений, подтверждает целесообразность
использования биомассы ила в качестве микробного удобрения.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
А р х и п ч е н к о И.А., Б а н и н а Н.Н. Биоценоз активного ила свинооткормочных комплексов.
Изв. РАН, сер. биол., 1995, 1: 97-104.
Б а н и н а Н.Н. Экология инфузорий активного ила. В сб.: Экология свободнодвижущихся морских и
пресноводных простейших. Л., 1990: 143-153.
Б а л ы к и н А.В. Микроорганизмы в загрязненной среде. Фрунзе, 1990.
K a k i i c h i N., I s h i z a k i Y., T o m i t a S. e.a. Denitrifying bacterial isolation from activated
sludge of swine waste water treatment and sourse temperature demanded for denitrification. Animal Sci.
Technol., 1992, 63(1): 38-46.
M a e k a v a T., L i a o C.M., F e n g X.D. Nitrogen and phosphorus removal for swine wasterwater using intermittent aeration bach reactor followed by ammonium crystallization process. Water Res., 1995, 29(12): 2643-2650.
Bergey’s manual of determinative bacteriology. 9th ed. Baltimore, 1986.
П а н и к о в Н.С., Д о б р о в о л ь с к а я Т.Г., Л ы с а к Л.В. Экология коринеподобных бактерий.
В сб.: Успехи микробиологии. Т. 23. М., 1989: 51-91.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
25 февраля 2011 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: arkhipchenko@bamil.ru
MICROBIOLOGICAL ASPECTS OF PROCESSING THE LIVESTOCK WASTES
I.A. Arkhipchenko
Summary
The aeration tank sludge biocenosis of the pig-farm sewage disposal system is desсribed. This biocenosis is
composed of bacterial flora and protozoan fauna. The bacterial fraction of the active sludge biocenosis is dominated by nocardioforms, which make up 50-80 % of all isolates. Infusoria are represented mainly by the genera Opercularia, Vorticella,
and Epistylis; flagellula are represented by the genera Bodo, Monas and Oicomonas. The described biocenosis is a harmonious ecological complex, which is almost independent of the external environment under the normal functioning conditions
of the sewage disposal system.
111
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
Микробиологические препараты для АПК
УДК 631.8:579.64
СОЗДАНИЕ И АНАЛИЗ БАЗЫ ДАННЫХ ПО ЭФФЕКТИВНОСТИ
МИКРОБНЫХ БИОПРЕПАРАТОВ КОМПЛЕКСНОГО ДЕЙСТВИЯ
А.П. КОЖЕМЯКОВ, С.Н. БЕЛОБРОВА, А.Г. ОРЛОВА
С использованием данных Географической сети на основе более чем 3000 полевых опытов с землеудобрительными биопрепаратами создана база данных их эффективности по регионам России. Установлено, что биопрепараты существенно (на 10-40 %) повышают урожайность различных культур на фоне снижения негативного эффекта
экстремальных экологических условий.
Ключевые слова: биопрепарат, клубеньковые бактерии, ассоциативные ризобактерии, база данных
по эффективности биопрепаратов.
Keywords: database efficacy of biopreparations, nodule bacteria, associative rhizobacteria.
Перспективы регулирования микробиологических процессов в почве при инокуляции растений микроорганизмами связывают со способностью последних осуществлять ряд
функций — улучшать минеральное питание, стимулировать рост растений и повышать их
устойчивость к стрессам, фиксировать атмосферный азот, подавлять фитопатогенную микрофлору (1-4). Особое значение приобретает экологизация агропроизводства на фоне глобальных нарушений круговорота основных биогенных элементов в искусственных агроценозах (5-9), значение которой в том числе состоит в реализации потенциальной продуктивности у растений за счет проявления новых адаптивных свойств.
Задачами нашего исследования были сравнительная оценка эффективности биопрепаратов на основе перспективных штаммов в зависимости от культуры (бобовые,
зерновые, кормовые, овощные), от технологий применения (способы внесения, формы)
и возделывания растений (дозы минеральных удобрений, смешанные посевы), а также
изучение специфичности реакции генотипов растений на внесение биопрепаратов.
Методика. Исследования проводились на базе учреждений Географической сети опытов с землеудобрительными биопрепаратами (на широком спектре культур) в
различных почвенно-климатических зонах (ежегодно на базе 35-40 стационаров). За 40
лет работы в рамках Географической сети выполнено более 3000 опытов практически со
всеми важнейшими сельскохозяйственными культурами, возделываемыми в странах СНГ.
В экспериментах использовали производственные и перспективные штаммы клубеньковых бактерий из Национальной коллекции Rhizobium (10), выделенные из почв и клубеньков растений различных регионов мира (11), а также ассоциативные азотфиксирующие бактерии, изолированные из различных почв и ризосферы растений (1, 12). Биопрепараты готовили в соответствии с технологиями, разработанными во Всероссийском НИИ сельскохозяйственной микробиологии (ВНИИСХМ) (13).
Полученные результаты обрабатывали с использованием дисперсионного и многофакторного анализа (14).
Результаты. Обширная база данных ВНИИСХМ позволяет оценить возможность использования микроорганизмов для создания биопрепаратов, эффективных в
различных регионах и на разных культурах (15-18).
1. Эффективность биопрепаратов на разных культурах по регионам России (среднее
для лучшего биопрепарата или штамма)
Культура
Картофель
Капуста
Озимая рожь
Козлятник
Люцерна
Козлятник
Ячмень
Люцерна
Озимая пшеница
Нут
Рис
Горох
Препарат (вид бактерий)
Урожайность в
контроле, т/га
Северо-Западный федеральный округ
Флавобактерин (Flavobacterium)
26,1
Мобилин (Klebsiella mobilis)
76,5
Азоризин 8 (Azospirillum brazilense)
5,4
Ризоторфин (Rhizobium galegae)
8,8
Ризоторфин (Sinorhizobium meliloti)
8,3
Центральный федеральный округ
Ризоторфин (R. galegae)
5,5
Мизорин (Arthrobacter mysorens)
2,3
Ризоторфин (S. meliloti)
4,9
Южный федеральный округ
Флавобактерин (Flavobacterium)
6,7
Ризоторфин (R. ciceri)
2,3
Азоризин-8 (A. brazilense)
5,9
Уральский федеральный округ
Ризоторфин (R. leguminozarum)
3,1
Прибавка
т/га
%
6,7
27,0
2,6
1,6
1,4
25,5
35,3
48,1
18,3
20,9
1,6
0,5
1,9
29,0
20,7
39,4
0,9
0,8
0,7
14,0
33,3
11,4
0,9
26,7
Главная научная и практическая задача при создании базы данных — оценка
112
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
эффективности биопрепаратов для разных культур в зависимости от региональных агроэкологических условий. Анализ выборки выявил особенности действия биопрепаратов на культуры (табл. 1). Так, азоризин обеспечивал максимальную прибавку на озимой ржи и рисе, мизорин — на ячмене, флавобактерин — на озимой пшенице, картофеле и большинстве овощных культур. Специфичность действия биопрепаратов также
варьировала в зависимости от сорта растений. Поэтому биопрепараты можно подобрать
для наиболее распространенных или перспективных сортов практически у всех изученных сельскохозяйственных культур. При этом прибавка урожая у зерновых составляла в
среднем 15-20, у овощных культур — 20-30 % (см. табл. 1).
Основным практическим приемом увеличения урожая бобовых и размеров азотфиксации остается инокуляция штаммами клубеньковых бактерий, повышающая продуктивность бобовых на 20-50 % (табл. 2). Прибавка зависит от особенностей культуры, почвенно-микробиологических и погодных условий (4, 15, 16). Так, в разных климатических
условиях ризоторфин имеет высокую эффективность на широком спектре бобовых культур,
которая зависит также от вида культуры. Среди зернобобовых наиболее отзывчивыми на
инокуляцию оказались чечевица и нут в Ростовской области (прибавка — 50 %) (см. табл. 2).
2. Эффективность применения биопрепаратов на зернобобовых культурах
Культура, регион
Сорт
Фасоль, Орловская область
Кормовые бобы, Мордовия
Чечевица, Ростовская область
Чина, Ростовская область
Нут, Ростовская область
Гелийда
Янтарный
Л 68-03
Степная 21
Краснокутский 36
Урожайность зерна, ц/га
контроль
ризоторфин
13,7
23,3
7,1
13,2
21,3
16,3
28,4
10,7
18,1
32,4
Прибавка
ц/га
%
2,6
5,1
3,6
4,9
11,1
19,0
21,9
50,7
37,1
52,1
Показателем продуктивности азотфиксации служит не только прибавка урожая,
но и накопление в нем белка (19-21). Например, в урожае инокулированных зернобобовых культур в Республике Татарстан содержание белка повышалось на 20-38 %, сбор
составил 6,0-8,9 ц/га.
3. Эффективность применения ризоторфина на сое в различных регионах России
Учреждение
Сорт
Урожайность зерна, ц/га Прибавка
контроль ризоторфин ц/га
%
Северо-Западный федеральный округ
Ленинградский НИИ сельского хозяйства (НИИСХ),
пос. Белогорка, Ленинградская обл.
СибНИИК 315
3,6
9,6
Новгородский государственный университет
им. Ярослава Мудрого, г. В. Новгород
СибНИИК 315
33,0
65,0
Закат
24,0
57,0
Центральный федеральный округ
Курская государственная сельскохозяйственная
академия (ГСХА)
ВНИИС 2
13,8
17,5
Всероссийский научно-исследовательский и про10,0
16,0
ектно-технологический институт рапса, г. Липецк ВНИИС 2
Белгородская ГСХА
Белгородская 143
24,3
32,8
Южный федеральный округ
Донской государственный аграрный университет
(ГАУ), г. Ростов
Дон 21
17,9
21,8
Зерноградка 2
16,4
22,2
Всероссийский НИИ орошаемого земледелия,
ВНИИОЗ 40
17,0
23,0
г. Волгоград
ВНИИОЗ 31
19,0
25,0
Ставропольский НИИСХ
Ходсон
16,7
21,4
Кубанский государственный аграрный университет,
г. Краснодар
Ходсон
21,6
31,1
Ставропольский НИИ гидротехники и мелиорации
Букурия
19,7
26,3
Приволжский федеральный округ
Башкирский ГАУ, г. Уфа
СибНИИК 315
8,4
12,5
Омская 4
7,4
17,8
Ульяновская ГСХА
УСХИ 6
19,7
31,7
Юг 30
10,4
15,5
Сибирский федеральный округ
Красноярский НИИСХ
ВНИИС 1
42,7
50,8
НПО «Енисей», г. Красноярск
СибНИИК 315
26,2
37,7
Сибирский НИИСХ, г. Омск
СибНИИК 315
15,0
22,8
Алтайский НИИСХ, г. Барнаул
Алтом
27,2
48,5
Всероссийский НИИ сои, г. Благовещенск
Октябрь 70
30,5
32,5
ВНИИС 1
20,0
23,4
Дальневосточный НИИ защиты растений, г. Приморск Приморская 13
26
45
6,0
167,0
32,0
33,0
97,0
137,5
3,7
26,8
6,0
8,5
60,0
35,0
3,9
5,8
21,8
35,4
6,0
6,0
4,7
35,3
31,7
28,1
9,5
6,6
44,0
33,5
4,1
10,4
12,0
5,1
48,8
140,5
60,9
49,0
8,1
11,5
7,8
21,3
2,0
3,4
19
19,0
43,9
52,0
78,2
6,7
17,0
73,1
К числу наиболее перспективных для юга России зернобобовых культур относится
соя. Для нее инокуляция клубеньковыми бактериями как агроприем крайне важна, потому
что в почвах большинства регионов не содержится специфичных для сои симбиотических
клубеньковых бактерий, а высокие дозы азотных удобрений не могут полностью компенсировать отсутствие азотфиксации. Инокуляция, как правило, дает прибавку 2-4 ц/га на сое и
до 5 ц/га на следующей после нее зерновой культуре. В Северо-Западном федеральном округе наиболее продуктивными по урожаю зерна были сорта Закат, Салют 216 и Nordic.
113
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Сорт СибНИИК 315 оказался высокоотзывчивым на инокуляцию и давал устойчивое увеличение урожая на 25,6-137,0 % (табл. 3). Таким образом, использование биопрепаратов на
основе клубеньковых бактерий может существенно помочь продвижению сои в северные
регионы. В Центральном федеральном округе при изучении эффекта инокуляции ризоторфином сои на 10 сортах (приведены результаты по двум сортам, которые изучали более 3 лет)
показано, что в годы с невысокой температурой и большим количеством осадков в начале вегетации прибавки от инокуляции достигали 11,2 ц/га, или 55 %. В Курской и Липецкой областях были получены хорошие результаты на сорте ВНИИС 2. В условиях недостатка тепла и
влаги урожай инокулированных растений возрастал на 30-60 % (см. табл. 3). В других регионах России обработка ризоторфином также положительно влияла на продуктивность сои.
В Южном регионе прибавка от инокуляции составила 22-36 %, в Приволжском — 49-141 %, в
Сибирском — 19-78 %, в Дальневосточном — 7-73 % в зависимости от сорта (см. табл. 3).
4. Эффективность применения бактериальных препаратов на зерновых культурах
Культура, регион
Препарат
Озимая пшеница, Краснодарский край
Флавобактерин
Ризоагрин
Ризоагрин
Азоризин 8
Мобилин
Мизорин
Флавобактерин
Мобилин
Агрофил
Озимая рожь, Новгородская область
Овес, Брянская область
Ячмень, Брянская область
Рис, Краснодарский край
Урожайность зерна, ц/га
контроль
ризоторфин
67,3
67,3
32,8
54,5
27,7
22,7
22,7
59,4
44,2
76,7
74,9
38,9
80,7
32,1
27,4
26,6
68,4
50,2
Прибавка
ц/га
%
9,4
7,6
6,1
26,2
4,4
4,7
3,9
9,0
6,0
14,0
11,3
18,6
48,1
15,9
20,7
17,2
15,2
13,6
Применение некоторых препаратов обеспечивает такую же урожайность зерновых
культур, как внесение азотного удобрения в дозе 30-45 кг/га (6, 7, 22). Так, флавобактерин
увеличил урожайность озимой пшеницы в Краснодарском крае на 14 % и овса на 16 %, ячменя в Брянской области — на 20 %. Наиболее отзывчивой оказалась озимая рожь в Новгородской области, где прибавка урожая зерна составила 48 % (табл. 4).
5. Урожайность картофеля по регионам РФ на фоне применения бактериальных препаратов
Регион, область,
республика
Северо-Западный:
Архангельская
Сорт
Препарат
Урожайность в
контроле, т/га
Прибавка
т/га
%
Рождественский
Броницкий
Невский
Розамунда
Флавобактерин
Мизорин
Мобилин
Флавобактерин
21,6
30,4
27,7
24,3
10,7
9,8
5,3
4,6
49,5
32,2
19,1
18,9
Сибирский:
Томская
Тимо
Невский
Флавобактерин
Агрофил
20,7
25,3
9,3
9,5
44,9
37,5
Накра
Омская
Алена
Флавобактерин
Азоризин 6
Флавобактерин
Мизорин
26,0
26,0
20,8
20,8
5,4
6,2
8,0
6,2
20,8
23,8
38,5
29,8
Агрофил
14,0
4,6
33,1
Калининградская
Ленинградская
Приволжский:
Татарстан
Дальневосточный:
Амурская
Невский
6. Урожайность (т/га) сухой массы у сортов люцерны изменчивой при применении биопрепаратов на основе различных штаммов клубеньковых бактерий (2008-2010 годы)
Сорт
Селена
Агния
Якутская
Пастбищная 88
Контроль
5,1
6,0
6,2
3,0
425а
4,9 (?0,2)
7,6 (+1,6)
6,7 (+0,5)
3,3 (+0,3)
Опыт (отклонение от контроля, т/га)
415б
А-3
5,9 (+0,8)
7,5 (+1,5)
3,8 (?2,4)
2,8 (?0,2)
14,9 (+9,8)
6,7 (+0,7)
9,0 (+2,8)
2,4 (?0,6)
А-4
4,5
8,7
5,4
5,6
(?0,6)
(+2,7)
(?0,8)
(+2,6)
В Северной Осетии при обработке биопрепаратами отмечали увеличение не только
урожая картофеля, но и числа товарных клубней на растение (на 30-50 % по отношению к
контролю). Препараты мобилин и мизорин подавляли заболевание растений антракнозом, а
агрофил — альтернариозом (степень поражения снижалась в 1,5-3,0 раза) (табл. 5). При эффективном использовании биопрепаратов важным и часто определяющим фактором оказывается взаимодействие генотипов растений и микроорганизмов (11, 23, 24). Исследования
показали перспективность координированной селекции растений и микроорганизмов на
подбор комбинаций сорт—штамм со специфичностью взаимодействия (табл. 6). Полученные результаты свидетельствуют о высокой сортовой специфичности растений люцерны по
отношению к штаммам клубеньковых бактерий: сорт Селена положительно реагировал
только на инокуляцию штаммом А-3 (прибавка урожая 190 %), сорта Агния и Якутская на
фоне применения штаммов А-4 и А-3 увеличивали продуктивность на 40 %.
Итак, на основе оценки, проводимой в учреждениях Географической сети опытов
с биопрепаратами, создана база данных по их эффективности на широком круге сельскохозяйственных культур. Максимальные прибавки от инокуляции составили: для зернобобо-
114
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
вых — 50-160 % (нут, чечевица и соя в новых районах ее возделывания), для многолетних
бобовых трав — 30-200 % (люцерна с комплементарными штаммами), для зерновых — 2048 %, для картофеля — 30-50 % и для остальных овощных — 25-38 % (по отношению к
контролю). Наиболее эффективны биопрепараты для бобовых в новых регионах их возделывания. В России к таким культурам относятся в первую очередь соя и козлятник (в ряде
случаев люпин, люцерна). Как правило, сочетание препаратов с невысокими дозами минеральных удобрений более эффективно. При этом для небобовых культур использование
биопрепаратов заменяет 20-50 кг (по д.в.) минеральных удобрений. Факторный анализ полученных данных показал, что эффективность биопрепаратов определяется главным образом агроклиматическими факторами, генотипом используемого микроорганизма и генотипом растения, а также взаимодействием генотипов растения и микроорганизмов (сорт, вид).
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
В а с ю к Л.Ф. Азотфиксирующие микроорганизмы на корнях небобовых растений и их практическое использование. В сб.: Биологический азот в сельском хозяйстве СССР. М., 1989: 88-89.
К о ж е м я к о в А.П., Х о т я н о в и ч А.В. Перспективы применения биопрепаратов ассоциативных азотфиксирующих микроорганизмов в сельском хозяйстве. Бюл. ВИУА (М.), 1997, 110: 4-5.
B a s h a n Y., L e v a n o n y H. Current status of Azospirillum inoculation technology: Azospirillum as a challenge
for agriculture. Canad. J. Microbiol., 1990, 36(9): 591-608.
К о ж е м я к о в А.П., Т и х о н о в и ч И.А. Использование инокулянтов бобовых и биопрепаратов
комплексного действия в сельском хозяйстве Докл. РАСХН, 1998, 6: 7-10.
T i k h o n o v i c h I.A., K o j e m y a k o v A.P., T c h e b o t e r V.K. Prospects for utilization of the
root diazotrophs in agriculture. In: Biological nitrogen fixation for 21st century /C. Elmerich, A. Kondorosi,
W. Newton (eds.). The Netherlands, Kluver Academic Publishers, 1997: 613-614.
З а в а л и н А.А. Биопрепараты, удобрения и урожай. М., 2005.
З а в а л и н А.А., А л м е т о в Н.С. Применение биопрепаратов и биологический азот в земледелии Нечерноземья. М., 2009.
К о ж е м я к о в А.П. Продуктивность азотфиксации в агроценозах. Микробиол. журн., 1997, 59(4): 22-28.
З а в а л и н А.А., Б л а г о в е щ е н с к а я Г.Г., К о ж е м я к о в А.П. Вклад биологического
азота бобовых культур в азотный баланс земледелия России. М., 2007.
Н о в и к о в а А.Т., К н я з е в а В.Л., О р и щ е н к о Н.Г. Всесоюзная коллекция Rhizobium — главный
генофонд симбиотических азотфиксаторов. Тр. ВНИИСХМ (Л.), 1989, 59: 13-22.
T i k h o n o v i c h I.A., K o z h e m y a k o v A.P., P r o v o r o v N.A. Genetic potential of plants for improving the beneficial microbe interactions. NATO ASI series. In: Biological fixation of nitrogen for ecology
and sustainable agriculture /A. Legocki, H.Bothe, A. Puhler (eds.). Berlin, 1997: 191-194.
П у х а е в А.Р., П о п о в а Т.А., К о ж е м я к о в А.П. Поиск и изучение перспективных ассоциативных ризобактерий из разных природных зон РСО-А для инокуляции сельскохозяйственных
культур. Владикавказ, 2005: 29-30.
Х о т я н о в и ч А.В. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и
применения препаратов на их основе (метод. реком.). Л., 1991.
Б е л и м о в А.А., В о р о б ь ё в Н.И., К о ж е м я к о в А.П. Применение дисперсионного анализа в изучении механизмов взаимодействия растений и корневых диазотрофов. Бюл. ВНИИСХМ (Л.), 1989, 52: 6-12.
Б е л и м о в А.А., К о ж е м я к о в А.П., П о с т а в с к а я С.М. Приживаемость и эффективность корневых диазотрофов при инокуляции ячменя в зависимости от температуры и влажности почвы. Микробиология, 1994, 5: 900-908.
К о ж е м я к о в А.П. Приемы повышения продуктивности азотфиксации и урожая бобовых культур. В сб.: Биологический азот в сельском хозяйстве СССР. М., 1989: 15-27.
К о ж е м я к о в А.П., Д о р о с и н с к и й Л.М. Эффективность использования препаратов азотфиксирующих микроорганизмов в сельском хозяйстве. Тр. ВНИИСХМ (Л.), 1989, 59: 5-13.
Т и х о н о в и ч И.А., А р х и п ч е н к о И.А., Б о р и с о в А.Ю. и др. Генетические ресурсы
микроорганизмов и систем сельскохозяйственного назначения. В сб.: Роль и место сельскохозяйственной науки в АПК России. М., 2005: 181-206.
А н т и п ч у к А.Ф., К а н ц е л я р у к Р.М., Р а н г е л о в а В.Н. и др. Связь между симбиотической азотфиксацией и урожаем бобовых растений. Микробиология, 1989, 4: 649-652.
К о ж е м я к о в А.П., А ф а н а с ь е в а Л.М. Влияние производственных штаммов клубеньковых
бактерий на белковую продуктивность бобовых культур. Бюл. ВНИИСХМ (Л.), 1986, 43: 15-18.
К у р ч а к О.Н., П р о в о р о в Н.А., С и м а р о в Б.В. Отзывчивость различных видов вики на инокуляцию высокоактивными штаммами R. leguminosarum bv. viceae. Сб. науч. тр. по ген. и сел. (Л.), 1993, 151: 59-62.
З а в а л и н А.А., Ч и с т о т и н М.В., К о ж е м я к о в А.П. и др. Эффективность инокуляции
зерновых культур Agrobacterium radiobacter в зависимости от азотного удобрения, почвенных и метеорологических условий. Агрохимия, 2001, 2: 31-35.
K o z h e m y a k o v A.P., P r o v o r o v N.A., T i k h o n o v i c h I.A. Breeding for high effiency in Pisum
sativum/Rhizobium leguminosarum symbiosis. Pisum Genetics, 1999, 31: 54-55.
К о ж е м я к о в А.П., П р о в о р о в Н.А., З а в а л и н А.А. и др. Оценка взаимодействия сортов ячменя и пшеницы с ризосферными бактериями на различном азотном фоне. Агрохимия, 2004, 3: 1-8.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: kojemyakov@rambler.ru
Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года
CREATING AND ANALYZING A DATABASE ON THE EFFICIENCY
OF MICROBIAL PREPARATIONS OF COMPLEX ACTION
A.P. Kozhemyakov, S.N. Belobrova, A.G. Orlova
Summary
A data-base on the effectiveness of biopreparation in various regions of Russia (more than 3000 field experiments considered) has been created. All biopreparations were shown to increase significantly the yield of various
crops (by 10-40 %). The use of biopreparations reduces the negative impact of extreme environmental conditions.
115
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631.559.2:631.847.21:579.64
СОЗДАНИЕ СТАБИЛЬНОЙ ФОРМЫ РОСТСТИМУЛИРУЮЩИХ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ И ИХ ЭФФЕКТИВНОСТЬ
Ю.В. ЛАКТИОНОВ, Т.А. ПОПОВА, О.А. АНДРЕЕВ, Р.П. ИБАТУЛЛИНА,
А.П. КОЖЕМЯКОВ
Выполнено комплексное изучение свойств вермикулита как перспективного носителя для препаратов эндосимбиотических и ассоциативных бактерий. Оптимизированы сочетания стабилизирующих, питательных и защитных
субстратов, обеспечивающих длительное хранение и высокую эффективность биопрепаратов. Изготовление препаратов на основе вермикулита технологичнее и экономичнее, полученные биопрепараты высокоэффективны. Усовершенствованный состав жидкой препаративной формы увеличил срок хранения.
Ключевые слова: биопрепарат, клубеньковые бактерии, урожайность, носитель, вермикулит.
Keywords: biopreparation, nodule bacteria, yield, carrier, vermikulit.
В настоящее время усилился интерес к экологически безопасным и экономичным агротехнологиям, повышающим продуктивность за счет применения биопрепаратов
на основе эндосимбиотических и ассоциативных микроорганизмов (1-5) с комплексом
положительных эффектов на растения (5-7), которые хорошо приживаются в ризосфере
или на корнях. Для каждого вида бобовых препараты (нитрагины) изготавливаются с использованием специфических штаммов клубеньковых бактерий (для сои — Bradyrhizobium
japonicum, козлятника — Rhizobium galegae и т.д.). Препараты для других видов растений готовятся на основе ассоциативных бактерий (мизорин — Arthrobacter mysorens, азоризин —
Azospirillum brasilense, ризоагрин — Agrobacterium radiobacter). Такие препараты существенно
улучшают почвенное плодородие и совершенно безопасны для человека, животных и других компонентов биоценозов (4-8). В России долгое время наиболее распространенным
твердым носителем для клубеньковых бактерий оставался торф, но его недостатки — ограниченность ресурсов, отвечающих технологическим требованиям, вариабельность биохимических характеристик, необходимость дорогостоящей ?-стерилизации и множества предварительных операций (сушка, нейтрализация, размол и др.) (9). В связи с этим практикой был востребован поиск экологичного и технологичного носителя, способного обеспечивать длительную сохранность микроорганизмов в препарате.
Цель нашей работы — создание технологичных форм биопрепаратов высокого
качества для основных сельскохозяйственных культур.
Методика. Использовали клубеньковые бактерии козлятника (Rhizobium galegae) и
сои (Bradyrhizobium japonicum), в качестве носителей — вспученный вермикулит или торф
(влагоемкость вермикулита — 500 %). Примененные стабилизирующие и питательные добавки: дарина (комплексный препарат на основе сапропеля с добавками питательных макроэлементов и микроэлементов), меласса, калиевые гуматы (группа природных высокомолекулярных веществ с высокой физиологической активностью), глицерин (распространенный криопротектор) (10), глюкозу, сорбат калия (природный консервант, применяется при
пищевом консервировании) карбоксиметилцеллюлозу (КМЦ, продукт взаимодействия целлюлозы с монохлоруксусной кислотой, используется как стабилизатор консистенции, загуститель, средство для капсулирования) (перед внесением добавки стерилизовали). Для определения жизнеспособности и титра бактерий использовали метод серийных предельных разведений (11-13). Быстрорастущие бактерии культивировали на бобовой среде следующего состава: горох, сахароза, КН2Р04, К2НР04, MgSО4?7H20, (NH4)2SO4, дрожжевой экстракт и
СаСО3 — соответственно 70; 10; 0,5; 0,5; 0,2; 1; 1 и 1 г/л. Среда для медленнорастущих бактерий содержала те же компоненты, но меньше сахарозы (2,5 г/л) и дополнительно глюкозу
(10 г/л). Полевые опыты проводили в условиях лесостепной зоны Алтайского Приобья.
Почва участка — чернозем обыкновенный маломощный малогумусный среднесуглинистый.
Характеризуется нейтральной реакцией почвенного раствора (рН 6,9), средней обеспеченностью подвижным P и высокой — обменным К. Повторность опыта — 4-кратная.
Для подтверждения достоверности различий между вариантами определяли наименьшую существенную разницу (НСР).
Результаты. Вермикулит имеет постоянный химический состав, благодаря чему
исключается необходимость проверки каждой партии носителя. При использовании технологии, разработанной для получения биопрепаратов на основе торфа, титры препаратов на
основе вермикулита спустя 6 мес хранения составляли 5Ѕ106-1,8Ѕ108 КОЕ/г. Эти значения
недопустимы, так как по ГОСТУ и ТУ биопрепараты на основе клубеньковых бактерий
считаются качественными, если через 6 мес хранения имеют титр не менее 1Ѕ109 КОЕ/г.
Оценка эффекта питательных и стабилизирующих добавок на повышение сохранности микроорганизмов (табл. 1) показала, что через 17 сут титры во всех вариантах были высокими и варьировали от 1,5Ѕ109 до 34,1Ѕ109 КОЕ/г. Минимальный титр получили при
добавлении в вермикулит 1 % глюкозы и 2 % мелассы, но через 1 мес он возрос до
15,6Ѕ109 КОЕ/г. В 2 раза увеличился титр бактерий при внесении в вермикулит 1 %
116
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
глюкозы и 1 % гуматов. Спустя 6 мес наибольшим был титр в варианте с добавлением в
вермикулит 0,5 % мелассы, 1 % глицерина и 0,5 % гуматов. По-видимому, это связано с
разной динамикой использования указанных компонентов, что способствовало поддержанию достаточного питания клеток на протяжении всего срока хранения.
1. Динамика титра (Ѕ109 КОЕ/г) клубеньковых бактерий сои Bradyrhizobium japonicum (штамм
634б) в процессе хранения при внесении оптимизирующих добавок в вермикулит (X±x)
Добавка в вермикулит
0 сут
17 сут
1 мес
Глюкоза 1 %
4,0±0,2
16,5±0,2
14,0±0,2
Глюкоза 1 % + дарина 1 %
4,0±0,2
27,6±0,3
40,0±0,2
Глюкоза 1 % + глицерин 1 %
4,0±0,2
27,1±0,2
12,7±0,2
Глюкоза 1 % + гуматы 0,5 %
4,0±0,2
33,5±0,2
24,5±0,3
Глюкоза 1 % + гуматы 1 %
4,0±0,2
8,8±0,3
17,1±0,2
Глюкоза 1 % + меласса 2 %
4,0±0,2
1,5±0,2
15,6±0,4
Меласса 1 % + дарина 1 %
4,0±0,2
15,0±0,2
16,1±0,2
Меласса 2 % + глицерин 1 % + дарина 2 %
4,0±0,2
3,8±0,2
6,6±0,2
Меласса 0,5 % + глицерин 1 % + гуматы 0,5 %
4,0±0,2
34,1±0,2
26,0±0,3
П р и м е ч а н и е. В питательной среде дополнительно содержится 1 % глицерина.
6 мес
1,1±0,2
3,2±0,1
4,0±0,3
4,1±0,2
3,3±0,2
1,2±0,3
2,0±0,2
1,8±0,3
6,1±0,1
При оценке эффекта
различных добавок на сохранность быстрорастущих клубеньковых бактерий козлятника в
Добавка в вермикулит (добавка в среду)
1 мес 2 мес
препарате (табл. 2) основным
Ш т а м м 912
Сахароза 1 % + гуматы 0,5 % + глицерин (–)
54,0±0,3 16,2±0,3
источником углерода служила
Сахароза 1 % + гуматы 0,5 % + глицерин (дарина 1 %) 96,1±0,2 18,9±0,1
сахароза (доступный и дешеСахароза 1 % (–)
12,0±0,3 10,1±0,3
вый ингредиент). Полученные
Сахароза 1 % (дарина 1 %)
18,2±0,1 8,2±0,4
Ш т а м м 913
результаты свидетельствуют о
Сахароза 1% + гуматы 0,5 % (–)
38,1±0,2 13,0±0,2
возможности подобрать опти– (–)
7,6±0,4 6,8±0,2
мальные сочетания компоненСахароза 1 % + глицерин (–)
12,0±0,2 10,1±0,2
Сахароза 1 % + меласса 2 % (–)
10,4±0,2 4,7±0,1
тов для производства качестСахароза 1 % + меласса 2 % + глицерин (–)
12,8±0,3 8,2±0,1
венных биопрепаратов, испольСахароза 1 % + меласса 5 % (–)
25,3±0,2 16,3±0,2
зуя вермикулит как носитель.
П р и м е ч а н и е. Прочерки означают, что добавки не вносили.
Наиболее экономична и технологична жидкая форма препарата, представляющая собой ферментационную
среду, инокулированную ризобиями, однако ее недостаток — короткий срок хранения:
титр бактерий начинает резко снижаться уже через 10-15 сут. В наших опытах численность B. japonicum при выращивании на бобовой среде без добавок служила контролем.
Через 3 нед после приготовления препарата титр ризобий по вариантам менялся незначительно и находился в пределах 2,8Ѕ109-6,4Ѕ109 КОЕ/мл (табл. 3). Через 7 нед различия в
титрах стали более выраженными. Так, в контроле титр снизился в 2 раза и составил
2,2Ѕ109 КОЕ/мл, в варианте с добавлением 1 % сорбата калия — был немного выше
(2,9Ѕ109 КОЕ/мл). После 3 мес хранения наименьший титр отмечали в варианте с добавлением в препарат 2 % сорбата калия (ниже контроля). Видимо, продолжительное воздействие повышенной концентрации сорбата калия негативно сказывалось на выживаемости клубеньковых бактерий сои.
Введение глицерина
3. Динамика титра (Ѕ109 КОЕ/мл) у клубеньковых бакприводило к увеличению титтерий сои Bradyrhizobium japonicum в зависимости от
ра в первые 3 нед хранения
срока хранения при внесении в жидкий препарат пита(бактерии способны испольтельных и стабилизирующих добавок (X±x)
зовать глицерин в качестве
Вариант
0 сут
3 нед
7 нед
3 мес
источника углеводов) (14),
Контроль
4,3±0,2 4,3±0,3 2,2±0,3 0,900±0,030
однако затем снижение титра
Сорбат калия 1 %
4,3±0,2 3,8±0,3 2,9±0,2 1,900±0,200
происходило даже быстрее,
Сорбат калия 2 %
4,3±0,2 4,2±0,2 2,1±0,3 0,050±0,010
КМЦ 1 %
4,3±0,2 4,2±0,3 6,3±0,4 1,300±0,200
чем в контроле. Добавление
КМЦ 2 %
4,3±0,2 4,5±0,2 4,8±0,3 2,400±0,300
КМЦ вызывало появление
Сорбат калия + КМЦ (по 1 %) 4,3±0,2 3,5±0,2 4,5±0,3 1,100±0,200
пиков численности бактеГлицерин 1 %
4,3±0,2 5,5±0,3 5,1±0,2 0,470±0,030
Глицерин 2 %
4,3±0,2 5,2±0,2 3,1±0,2 0,410±0,020
рий, причем концентрация
Глицерин 5 %
4,3±0,2 4,9±0,2 2,1±0,3 0,370±0,050
КМЦ влияла на время их наГлицерин + КМЦ (по 1 %) 4,3±0,2 6,4±0,4 3,9±0,2 1,400±0,200
ступления. Через 3 нед значиГлицерин + гуматы (по 1 %) 4,3±0,2 2,8±0,2 2,4±0,2 0,040±0,002
тельное увеличение титра наП р и м е ч а н и е. КМЦ — карбоксиметилцеллюлоза.
блюдали при внесении 1 %
глицерина и 1 % КМЦ (6,4Ѕ109 КОЕ/мл). Наилучший результат получили в вариантах с 2 %
КМЦ и 1 % сорбата калия (титры соответственно 2,4Ѕ109 и 1,9Ѕ109 КОЕ/мл). Эти компоненты тормозят метаболизм микроорганизмов, в результате чего те длительное время
сохраняют жизнеспособность в препарате.
В полевых опытах с соей в различных регионах России показано, что использование биопрепарата на основе вермикулита увеличивало число бобов на растении по
сравнению с контролем на 45 %, с биопрепаратом на основе торфа — на 16 % (здесь
приведены результаты оценки эффективности разных форм препаратов клубеньковых
бактерий на территории Алтайского края) (табл. 4).
2. Динамика титра (Ѕ109 КОЕ/г) клубеньковых бактерий козлятника Rhizobium galegae в процессе хранения при внесении добавок в питательную среду и в вермикулит (X±x)
117
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
4. Элементы структуры урожая у сои сорта Алтом под влиянием бактериальных и минеральных удобрений (Алтайский край, 2008-2009 годы)
Вариант
Биомасса
На 1 растение
Урожайнадземная, число
сырая масса
азотфиксация, ность, ц/га
2
г/м
бобов, шт. клубеньков, г мкг N2/ч
Контроль
450
13,1
1,6
140
19,0
Нитрагин (на торфе)
469
16,3а
2,2а
182а
20,5
19,0б
2,2а
210б
23,1б
Нитрагин (на вермикулите)
497б
534а
19,6а
1,2
186а
22,2
N30
N30 + нитрагин (на торфе)
529
19,7а
1,8а
287а
22,8
564б
19,0а
2,0а
298а
25,1б
N30 + нитрагин (на вермикулите)
21
1,4
0,2
12
2,2
НСР05
П р и м е ч а н и е. N30 — внесение азотных удобрений в дозе 30 кг/га; а, б — достоверная прибавка соответственно к контролю без инокуляции и к варианту с инокуляцией торфяным препаратом. Почва — чернозем
обыкновенный.
Биопрепараты на основе торфа были менее эффективными, чем приготовленные
на вермикулите. Возможная причина в том, что опыты закладывали на черноземе, содержащем значительное количество азотных соединений. При обработке семян торфяными
биопрепаратами все бактерии довольно быстро «уходят» с носителя и не оказывают должного эффекта. У вермикулитных препаратов переход бактерий с носителя в почву пролонгирован, поскольку частицы вермикулита обладают пористым строением и общая
площадь поверхности у них очень высока. Вероятно, через какое-то время при наступлении дефицита элементов питания у растения переход бактерий может ускориться, что положительно скажется на развитии растения. Применение биопрепарата на основе вермикулита увеличивало урожайность семян сои на 21 % по сравнению с контролем. В варианте с дополнительной фоновой дозой азота урожайность была на 32 % выше контрольной. Использование торфяной формы повышало урожайность соответственно на 8 и 20 %
по сравнению с вариантом без обработки (то есть наибольшая эффективность биопрепаратов достигается со стартовой дозой N).
Таким образом, изготовление препаратов на основе вермикулита технологичнее
и проще (не требует ?-стерилизации и проверки качества каждой партии торфа), а полученные формы более стандартизированы и лучше сохраняются. Прибавка урожая при
применении этих форм биопрепаратов — 15-40 % от контроля. Они высокоэффективны, благоприятно влияют на почвенное плодородие и экологическую обстановку.
ЛИТЕРАТУРА
1.
Б е р е с т е ц к и й О.А., Д о р о с и н с к и й Л.М., К о ж е м я к о в А.П. Эффективность препаратов
клубеньковых бактерий в Географической сети опытов. Известия АН СССР, сер. биол., 1987, 5: 670-679.
К о ж е м я к о в А.П., Х о т я н о в и ч А.В. Перспективы применения биопрепаратов ассоциативных азотфиксирующих микроорганизмов в сельском хозяйстве. Бюл. ВИУА (М.), 1997, вып. 110: 4-5.
К о ж е м я к о в А.П., Т и х о н о в и ч И.А. Использование инокулянтов бобовых и биопрепаратов комплексного действия в сельском хозяйстве. Докл. РАСХН, 1998, 6: 7-10.
З а в а л и н А.А. Биопрепараты, удобрения и урожай. М., 2005.
З а в а л и н А.А., А л м е т о в Н.С. Применение биопрепаратов и биологический азот в земледелии Нечерноземья. М., 2009.
К о ж е м я к о в А.П. Продуктивность азотфиксации в агроценозах. Микробиол. журн., 1997, 59(4): 22-28.
Т и х о н о в и ч И.А., К о ж е м я к о в А.П., Ч е б о т а р ь В.К. Биопрепараты в сельском хозяйстве. М., 2005.
З а в а л и н А.А., Б л а г о в е щ е н с к а я Г.Г., К о ж е м я к о в А.П. Вклад биологического
азота бобовых культур в азотный баланс земледелия России. М., 2007.
Х о т я н о в и ч А.В. Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, способы получения и
применение препаратов на их основе (метод. реком.). Л., 1991.
Y o o n Y.H., P o p e J., W o l f e J. Freezing stresses and hydration of isolated cell walls. Cryobiology, 2003, 46: 271-276.
Герхард Ф.-М. Методы общей бактериологии. М., 1983.
Ф р о б и ш е р М. Основы микробиологии. М., 1965.
А ш м а р и н И.П., В а с и л ь е в Н.Н., А м б р о с о в В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов. Л., 1971.
Bergey's Manual of systematic bacteriology /D.R. Boone, R.W. Castenholz, D.J. Brenner е.a. (eds.). N.Y., 2005.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: Laktionov@pop3.ru, Kojemyakov@rambler.ru
CREATING NEW FORMS OF GROWTH-STIMULATING MICROBIAL
PREPARATIONS AND THEIR PERFORMANCE ON VARIOUS CULTURES
Yu.V. Laktionov, T.A. Popova, О.А. Andreev, R.P. Ibatullina, A.P. Kozhemyakov
Summary
Complex studies were performed on the properties of a promising carrier, vermiculite, to create preparation
of associative and endosymbiotic bacteria. The optimal combinations of stabilizing, nutritive and protective substrates, providing long-term storage and high efficiency of biopreparation, were dedicated. Improved composition of the liquid form of
the product, allowing increased duration of its storage was developed. Preparation manufacturing based on vermiculite is
significantly easier than on the basis of peat. The technology is more economical, and the products are highly effective.
118
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631.46:579.64:631.8:579.22
БИОХИМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ АГРОНОМИЧЕСКИ
ЗНАЧИМЫХ СВОЙСТВ БАЦИЛЛ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ПРИ
СОЗДАНИИ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ
В.К. ЧЕБОТАРЬ, В.Б. ПЕТРОВ, А.И. ШАПОШНИКОВ, Л.В. КРАВЧЕНКО
На примере штамма Bacillus subtilis Ч-13 (продуцент микробиологического препарата экстрасол)
изучили возможность контролировать антагонистическую и фитостимулирующую активность у штаммов эндофитных и ризобактерий с помощью биохимических маркеров — антифунгальных метаболитов и ауксинов, выявляемых методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Такие маркеры штамма позволяют провести его
аналитико-биохимическую паспортизацию, поддерживать стабильность физиолого-биохимических свойств, осуществлять экспресс-оценку накопления действующих агентов в партиях биопрепарата.
Ключевые слова: бациллы, эндофитные и ризобактерии, микробиологические препараты, антифунгальные метаболиты и ауксины, высокоэффективная жидкостная хроматография.
Keywords: bacilli, endophytic and rhizobacteria, microbial preparation, agronomically valuable properties,
antifungal metabolites and auxins, method HPLC.
В заметной степени мировую тенденцию сокращения доз минеральных удобрений
и химических пестицидов может обеспечить внедрение высокоэффективных микробиологических препаратов (МБП) (1-5), в том числе на основе полезных эндофитных и ризосферных бактерий (ПЭРБ) (6-8). Основой микробных препаратов обычно служат представители родов Pseudomonas, Arthrobacter, Flavobacterium, Bacillus, Achromobacter, продуцирующие различные вторичные метаболиты (9, 10). По сумме полезных свойств особенный интерес представляют бациллы, составляющие в зависимости от группы природных и хозяйственных факторов от 30 до 36 % микробной ризосферной и эндофитной популяции
агроценоза (11, 12). К полезным свойствам относится биологическая азотфиксация, которая осуществляется бактериями на поверхности и в тканях высшего растения без образования морфологически выраженных структур (8). К активным диазотрофам относятся бациллы, причем некоторые, в частности Вacillus polymyxa, могут интенсивно фиксировать
азот в анаэробных условиях, характерных для эндофитных экологических ниш (13, 14).
Многие ПЭРБ способны синтезировать фитогормоны — ауксины, гиббереллины, цитокинины, этилен и др. (15, 16), а также необходимые для развития растений витамины (фолиевая кислота, фенилаланин, биотин, тиамин, никотиновая кислота, В6, В12) (17, 18).
Бактерии продуцируют и выделяют во внешнюю среду функционально различающиеся
группы ферментов, лизирующие клеточные стенки фитопатогенных грибов: протеазы,
манназы, целлюлазы и гемицеллюлазы, глюканазы, хитиназы (19). У Bас. subtilis обнаружена способность лизировать клетки других бактерий и грибов. Литические ферменты
бацилл обладают различной субстратной специфичностью. При лизисе может высвобождаться содержимое гиф, которое служит дополнительным источником питания и энергии
для бацилл (20). Многие ПЭРБ продуцируют антибиотики различной природы, угнетающие жизнедеятельность фитопатогенных грибов и бактерий (21-28). Наиболее активно синтез протекает в начале стационарной стадии роста (10, 29), что повышает достоверность данных экспресс-диагностики антифунгальной эффективности штаммов. Еще
один из распространенных механизмов биоконтроля — индуцированный иммунитет (способность микроорганизмов вызывать устойчивость к болезням и вредителям при стимуляции системных защитных реакций растения) (30). Его выделяют в самостоятельное
перспективное направление использования ПЭРБ в растениеводстве (31-32).
Из выявленного потенциально полезного биоразнообразия в России в виде биопрепаратов используется не более 20 штаммов ПЭРБ (33) (во многом потому, что создание
МБП традиционно сопряжено с длительными трудоемкими процедурами скрининга и тестирования свойств, в которых современные биохимические методы, позволяющие в целом
ускорить процесс и повысить объективность оценки, используются недостаточно).
Цель настоящей работы — показать возможности использования методов лабораторного исследования для выявления и изучения хозяйственно ценных качеств полезных эндофитных и ризосферных бактерий на примере апробированного в производственных условиях бациллярного препарата комплексного действия экстрасол.
Методика. Объектом исследования служил продуцент экстрасола (биопрепарат
комплексного действия, № государственной регистрации 0680-07-208-216-0-0-0-1) — Bacillus subtilis Ч-13, изолированный из чернозема в Республике Молдова (34). Анализ антифунгальной активности живой бактериальной культуры против фитопатогенных грибов и бактерий проводили стандартным методом колодцев (35, 36). Для лабораторного изучения продукции антибиотиков бактерии выращивали стационарно на картофельной среде, для анализа ауксинов — на минимальной минеральной среде с содержанием L-триптофана 10 мг/л
(среда-стандарт) на качалке при 28 °С в течение 4 сут. Бактериальные клетки осаждали цен-
119
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
трифугированием, культуральные жидкости (КЖ) обрабатывали этилацетатом, экстракт выпаривали под вакуумом (36). Антифунгальную активность экстрактов также определяли методом колодцев. Полученные пробы анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Антифунгальные метаболиты и ауксины разделяли на колонке
с обращенной фазой µBondapak C18 («Waters», США), содержание антифунгальных веществ
и ауксинов во фракциях обнаруживали по поглощению при ? = 280 нм (выявленная ранее
для аналогичных целей эффективная длина волны) (36). Индивидуальные пики в пробах
метаболитов после хроматографического разделения экстракта культуральной жидкости собирали, концентрировали на роторном испарителе и анализировали на активность против
гриба Fusarium graminearum. Идентификацию ауксинов проводили сравнением времен удержания и УФ-спектров поглощения соответствующих веществ в пробах и в стандартной смеси. Количество ауксинов определяли сопоставлением площади пиков в пробах и стандартной смеси заданной концентрации. Анализ ауксинов в пробах проводили на системе серии
JASCO LC-900 HPLC («Jasco», Япония). Для идентификации ауксинов использовали
комбинированный анализ с использованием УФ-детектора UV-975 (Ltd.Untest-B, США)
и флуоресцентного детектора FP-920 (Ltd.Untest-B, США). Для оценки способности живой
культуры бацилл к фитостимуляции проводили биотест с хлореллой Chlorella vulgaris (штамм
157) методом колодцев на агаризованной среде Хата. Наличие стимулирующего эффекта
вокруг лунок с бактериальной суспензией устанавливали по усилению роста хлореллы.
Данные обрабатывали статистически с помощью программы STATISTICA V-5
(StatSoft, Inc., США). Представлены средние арифметические значения со стандартным
отклонением.
Результаты. Анализ
1. Показатели ингибирования гриба Fusarium gramineaантифунгальной
активности Bас.
rum культурой штамма-продуцента Bacillus subtilis
subtilis Ч-13 показал, что наиЧ-13 на агаризованной среде
большую ингибирующую активЗона ингибирования
ность проявляет живая бактериВариант
Разведение диаметр,
описание
альная культура (табл. 1). Антимм
активности
фунгальная активность кульКонтроль (стерильная
туральной жидкости после откартофельная среда)
Нет
0
деления бактериальных клеток
Живая культура
Нет
31±4,0 Четкая
Культуральная жидкость
Нет
12±2,0 Слабая
и суммарной фракции экстраЭкстракт метаболитов
1:10
14±2,0 Средняя при всех
гированных метаболитов была
разведениях
1:100
15±2,0
соответственно в 2,0 и 2,5 раза
1:1000
15±2,0
ниже, чем у живой культуры.
Следовательно, значительный вклад в антагонистическую активность вносят экзоферменты, продуцируемые живым штаммом Ч-13 и/или его антифунгальные метаболиты in
vivo нестабильны.
Хроматографический анализ этилацетатного экстракта КЖ выявил наличие группы
пиков со временем выхода 33,86-50,97 мин (рис.
1). Девять наиболее активных фракций были собраны для дальнейшего анализа. Максимальную
OD280 имело соединение, соответствующее пику
41,81 мин (пик № 5). Наиболее выраженную антифунгальную активность выявили у этой фракции. Соответствующее пику вещество в растворе
имело желто-зеленое окрашивание. Компоненты со временем выхода 36,63 мин (пик № 3) и
38,82 мин (пик № 4) проявляли слабую, нечеткую активность, остальные шесть фракций были
неактивны. Пики с антифунгальным действием
Высокоэффективная жидкостная хроматоимели сильное поглощение, что характерно для
графия метаболитов штамма Bacillus subtilis
сложных органических молекул с фенольными
Ч-13 (1-9). Пики № 3 и № 5 соответствуют
кольцами и гетероциклическими группами.
метаболитам с выраженной антифунгальСуммарная антифунгальная активность
ной активностью.
содержащихся в КЖ водорастворимых метаболитов
составляла примерно 50 % от суммарной активности живой культуры. Характерно, что концентрированный этилацетатный экстракт был активен даже при разведении 1:1000 (см.
табл. 1). При тестировании штамм обладал широким спектром действия против различных возбудителей болезней растений. Характерные зоны ингибирования роста бактерий
и грибов составляли (мм) для Erwinia carotovora — 28,4±2,0; Pseudomonas syringiae 8300 —
32,0±2,6; Pseudomonas syringiae 2314 — 48,0±3,3; Erwinia carotovora 3391 — 49,5±4,1; Clavibacter michiganense 17-1 — 36,0±2,7; Phytophthora capsici — 48,1±3,2; Rhizoctonia solani —
29,6±1,9; Fusarium culmorum — 33,0±2,4; F. solani — 23,8±1,9; F. graminearum — 31,0±2,0 и
Pythium spp. — 38,1±2,9.
Эффективность действия антагонистических механизмов продуцента экстрасола, ис-
120
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
пользуемого в качестве протравителя семян, подтвердили в производственных опытах на
яровой пшенице (табл. 2), при этом биологическая эффективность экстрасола и химических
фунгицидов против корневых гнилей оказалась сопоставимой (34), а экономическая — выше.
Многие штаммы ПЭРБ выделяют в ризосферу индолилуксусную кислоту (ИУК), метаболическим предшественником которой служит L-триптофан (26). Корневые выделения
растений могут содержать количества L-триптофана, достаточные для синтеза ауксинов ризобактериями. Зная состав корне2. Средние показатели биологической эффективности
вых выделений и эффективность
химических и микробиологических препаратов, исбактериального биосинтеза аукпользуемых в качестве протравителей семян яровой
пшеницы сорта Саратовская 36 (производственный синов, можно подбирать пары,
в которых фитостимулирующий
опыт, Республика Татарстан, 2001 год)
потенциал ризобактерий будет
Корневая гниль, % Биологичераскрыт наиболее полно (37).
ская эффекПрепарат
распроВЭЖХ-анализ ауксинов
развитие
тивность, %
странение
в КЖ Bас. subtilis Ч-13 (табл. 3)
Контроль
44
10,9
выявил продукцию индолил-3Премис 200а
5
1,2
89
молочной кислоты (ИМК), индоа
Феразим
8
2,1
81
лил-3-карбоновой кислоты (ИКК),
Колфуго дуплета
10
2,5
77
Экстрасолб (Bacillus subtilis Ч-13)
9
2,3
79
индолил-альдегида (ИА) и ИУК.
б
Фитоспорин (Bacillus subtilis
Наиболее интенсивно продуци26D, ВНИИСХМ 128)
15
3,7
66
ровался ИА, доля ИМК, ИКК и
б
Планриз
17
4,2
62
П р и м е ч а н и е. а — химические, б — микробиологические ИУК составляла соответственно
препараты (в скобках приведены штаммы, на основании которых 18,4; 6,7 и 7,8 % от общего коони изготовлены).
личества синтезируемых ауксинов. Следовательно, штамм Bас.
subtilis Ч-13 значительно более активно продуцирует не основной фитогормон, определяющий фитостимуляцию (ИУК), а другие производные. Суммарная степень использования L-триптофана для биосинтеза ауксинов достигала 5,3 %. Таким образом, фитостимулирующая активность штамма Ч-13 может проявляться при благоприятных условиях роста бациллы как в ризосфере, так и за счет накопления фитогормонов в культуральных средах биопрепаратов (34, 36).
Биотест на хлорелле
3. Биосинтез ауксинов штаммом Bacillus subtilis Ч-13
выявил стимулирующую акпри росте на среде с L-триптофаном
тивность только в варианте с
Концентрация, Использование
живой культурой штамма Ч-13.
Ауксин
нмоль/мл (Х±х) L-триптофана, %
Интересно, что при этом веИндолил-3-молочная кислота
0,68±0,08
1,0
щества, определяющие стимулиИндолил-3-карбоновая кислота
0,25±0,04
0,4
рующую активность изучаемого
Индолил-альдегид
2,48±0,35
3,5
штамма, не являются ауксинаИндолил-3-уксусная кислота
0,29±0,05
0,4
Суммарное содержание
3,70
5,3
ми и цитокининами, так как
аналогичный биотест с внесением ИУК и зеатина в концентрациях от 20 до 10-3 мкг/мл не стимулировал рост хлореллы.
Итак, фитостимулирующая и биоконтрольная эффективность бациллярного
препарата экстрасол, установленная в процессе многолетних производственных испытаний, подтверждена объективной оценкой соответствующей активности штамма-продуцента Bacillus subtilis Ч-13 при помощи лабораторных биотестов и анализа его метаболитов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ): штамм синтезирует антифунгальные вещества, а при росте на минеральной среде с L-триптофаном
продуцирует ауксины. Поскольку синтез антифунгальных и фитостимулирующих агентов исходит одновременно, можно предположить возникновение фитостимулирующего
синергетического эффекта практически сразу после введения бациллярных препаратов
в агрофитоценоз. Использование выявленных антифунгальных метаболитов и ауксинов
в качестве биохимических маркеров штамма позволяет провести его аналитико-биохимическую паспортизацию, контролировать стабильность физиолого-биохимических
свойств, осуществлять экспресс-оценку накопления действующих агентов в партиях
биопрепарата методом ВЭЖХ.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Биопрепараты в сельском хозяйстве (Методология и практика применения микроорганизмов в
растениеводстве и кормопроизводстве). М., 2005.
П е т р о в В.Б., Ч е б о т а р ь В.К., К а з а к о в А.Е. Микробиологические препараты в
биологизации земледелия России. Достижения науки и техники АПК, 2002, 10: 16-20.
C o m p a n t S., D u f f y B., N o w a k J. e.a. Use of PGPR for biological control of plant diseases:
principles, mechanisms of action and future prospects. Appl. Environ. Microbiol., 2005, 9: 4951-4959.
K l o e p p e r J.W. Plant growth-promoting rhizobacteria as biological control agents. In: Soil microbial
ecology /F.B. Metting, Jr. (ed.). Marcel Dekker, N.Y., 1993: 255-274.
O k o n Y., L a b a n d e r a - G o n z a l e z C. Agronomic applications of Azospirillum: an evaluation of
20 years worldwide field inoculation experiments. Soil Biol. Biochem., 1994, 26: 1591-1601.
W h i p p s J.M. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere. J. Exp. Bot., 2001, 52: 487-511.
121
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
7.
M o n t e s i n o s E. Development, registration and commercialization of microbial pesticides for plant
protection. International Microbiology, 2003, 6: 245-252.
Т и х о н о в и ч И.А., П р о в о р о в Н.А. Кооперация растений и микроорганизмов: новые подходы к конструированию экологически устойчивых агросистем. Усп. cовр. биол., 2007, 4: 339-357.
H a n d e l s m a n J., S t a b b E.V. Biocontrol of soilborne plant pathogens. Plant Cell, 1996, 8: 1855-1869.
R a a i j m a k e r s J.M., V l a m i M., D e S o u z a J.T. Antibiotic production by bacterial biocontrol
agents. Antonie van Leeuwenhoek, 2002, 1-4: 537-547.
L y n c h J.M. The rhizosphere. John Wiley and Sons, Chichester, England, 1990.
D a r b y s h i r e J.F., G r a v e s M.P. Bacteria and protozoa in the rhizosphere. Pestic. Sci., 1973, 4: 349-360.
W i t z D.B., D e t r o y R.W., W i l s o n P.W. Nitrogen fixation by growing cells and cell-free extracts
of the Bacillaciae. Arch. Microbiol., 1967, 4: 369-381.
К а р п у н и н а Л.В. Роль агглютинирующих белков ризобий и азотфиксирующих бацилл при
взаимодействии с растением /Под ред. В.В. Игнатова. М., 2005.
F r a n k e n b e r g e r W.T., A r s h a d M. Phytohormones in soil: microbial production and function. N.Y., 1995.
T i m m u s k S., N i c a n d e r B., G r a n h a l l U., T i l l b e r g E. Cytokinin production by
Paenibacillus polymyxa. Soil Biol. Biochem., 1999, 31: 847-1852.
N u r m i k k o V., S o i n i J., A a e r i m a a O. Formation of folate enzymes during the growth cycle
of bacteria. 3. Changes in tetrahydrofolate dehydrogenase activity during the active growth phases of
Streptococcus thermophilus and Lactobacillus arabinosus. Acta Chemica Scandinavica, 1965, 19: 129-134.
Y o u h H.H., S t o n e E.E., W a t s o n L. Taxonomic variation in the subunit amino acid compositions
of R and BP carboxylases from grasses. Phytochemistry, 1982, 21: 71-80.
K a p u l n i k Y. Plant growth promotion by rhizosphere bacteria. In: Plant root: the hidden half /Y. Waisel, A. Eshel,
U. Kafkafi (eds.). N.Y., Basel, Hong Kong, 1996: 769-780.
N i e l s e n P., S o r e n s e n J. Multi-target and medium-independent fungal antagonism by hydrolytic enzymes in
Paenibacillus polymyxa and Bacillus pumilus strains from barley rhizosphere. FEMS Microbiol. Ecol., 1997, 22: 183-192.
С м и р н о в В.В., Р е з н и к С.Р., В а с и л е в с к а я И.А. Спорообразующие аэробные
бактерии — продуценты биологически активных веществ. Киев, 1982.
K o u m o u t s i A., C h e n X.-H., H e n n e A. e.a. Structural and functional characterization of gene clusters
directing nonribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42. J.
Bacteriol., 2004, 4: 1084-1096.
M i l n e r J.L., S i l o - S u h L., L e e J.C. Production of kanosamine by Bacillus cereus UW85. Appl.
Environ. Microbiol., 1996, 8: 1267-1271.
S i l o - S u h L.A., S t a b b E.V., R a f f e l S.J. e.a.Biological activities of two fungistatic antibiotics produced by
Bacillus cereus UW85. Appl. Environ. Microbiol., 1994, 6: 2023-2030.
G r o o m e P.C., T a t t a r T.A., M o u n t M.S. Bacillus megaterium: A possible biocontrol organism
against Cryphonectria parasitica on American chestnut. Phytopathology, 1999, 89: 100.
L e i f e r t C., L i H., C h i d b u r e e S. e.a. Antibiotic production and biocontrol activity by Bacillus
subtilis CL27 and Bacillus pumilus CL45. J. Appl. Bacteriol., 1995, 78: 97-108.
D u i t m a n E.H., H a m o e n L.W., R e m b o l d M. The mycosubtilin synthetase of Bacillus subtilis
ATCC6633: A multifunctional hybrid between a peptide synthetase, an amino transferase, and a fatty acid
synthase. Genetics, 1999, 23: 13294-13299.
S c h i s l e r D.A., S l i n i n g e r P.J., B e h l e R.W. The nature and application of biocontrol
microbes: Bacillus spp. — formulation of Bacillus spp. for biological control of plant diseases. Phytopatology,
2004, 94: 1267-1271.
H a a s W., S h e p a r d B.D., G i l m o r e M.S. Two-component regulator of Enterococcus faecalis cytolysin
responds to quorum-sensing autoinduction. Nature, 2002, 415(6867): 84-87.
V a n L o o n L.C., B a k k e r P.A.H.M., P i e t e r s e C.M.J. Systemic resistance induced by
rhizosphere bacteria. Annu. Rev. Phytopathol., 1998, 36: 453-483.
B a c k m a n P.A., W i l s o n M., M u r p h y J.F. Bacteria for biological control of plant diseases. In: Environmentally safe approaches to crop disease control /N.A. Rechcigl, J.E. Rechcigl (eds.). Boca Raton, Florida, 1997: 95-109.
B r o a d b e n t P., B a k e r K.F., F r a n k s N., H o l l a n d J. Effect of Bacillus spp. on increased growth
of seedlings in steamed and untreated soil. Phytopathology, 1997, 67: 1027-1031.
П е т р о в В.Б., Ч е б о т а р ь В.К. Микробиологические препараты в практическом растениеводстве
России: функции, эффективность, перспективы. Рынок АПК, 2009, 7: 16-18.
Ч е б о т а р ь В.К., З а в а л и н А.А., К и п р у ш к и н а Е.И. Эффективность применения биопрепарата экстрасол. М., 2007.
К р а в ч е н к о Л.В., М а к а р о в а Н.М., А з а р о в а Т.С. и др. Выделение и фенотипическая
характеристика ростстимулирующих ризобактерий (PGPR), сочетающих высокую активность колонизации корней и ингибирования фитопатогенных грибов. Микробиология, 2002. 4: 521-525.
C h e b o t a r’ V.K., M a k a r o v a N.M., S h a p o s h n i k o v A.I. e.a. Antifungal and phytostimulating
characteristics of Bacillus subtilis Ch-13 rhizospheric strain, producer of bioprepations. Appl. Biochem.
Microbiol., 2009, 4: 419-423.
К р а в ч е н к о Л.В., А з а р о в а Т.С., М а к а р о в а Н.М. и др. Роль триптофана в корневых
экзометаболитах для фитостимулирующей активности ризобактерий. Микробиология, 2004, 2: 195-198.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
25 февраля 2011 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: petrogard@mail.ru
BIOCHEMICAL CRITERIA FOR ESTIMATION OF AGRONOMIC VALUABLE
PROPERTIES OF BACILLI USED FOR DEVELOPMENT OF MICROBIAL
PREPARATIONS
V.К. Chebotar’, V.B. Petrov, A.I. Shaposhnikov, L.V. Kravchenko
Summary
Studying strain Bacillus subtilis Ch-13, which is used as a producer of microbial preparation extrasol, the
agronomical valuable properties of endophytic and rhizobacteria was shown to be revealed and controlled by modern biochemical markers. Antifungal metabolites and auxins synthesized by living culture of B. subtilis Ch-13 make
the significant contribution in antagonistic and phytostimulation activity of extrasol. Using these metabolites as
biochemical markers allows to provide analytical and biochemical certification, to monitor the stability of
physiological and biochemical properties of the strain, to carry out a rapid assessment of the accumulation of active
agents in batch of biological preparation.
122
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
УДК 631.46:579.64:632.937.15:[632.7+632.4
ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ Bacillus thuringiensis Berliner
О.В. СМИРНОВ, С.Д. ГРИШЕЧКИНА
У Bacillus thuringiensis (Bt), широко используемой в качестве основы биоинсектицидов, обнаружен антифунгальный и ростстимулирующие эффекты. Изучен спектр антифунгальной активности Bt против ряда фитопатогенных грибов и ее возможные механизмы. В вегетационных и полевых опытах проведена оценка антифунгальной активности в отношении Botrytis cinerea Pers., Fusarium oxysporum (Schlecht.), Snyd. et Hans. и Bipolaris sorokiniana
(Sacc.) Shoemaker. Обсуждаются перспективы разработки биопрепаратов с полифункциональным действием.
Ключевые слова: антифунгальная активность, полифункциональное действие, Bacillus thuringiensis,
грибы-фитопатогены.
Keywords: antifungal activity, polyfunctional activity, Bacillus thuringiensis, phytophathogenic fungi.
У микробиологических средств биоконтроля вредителей сельскохозяйственных
культур ассортимент и объемы применения значительно меньше, чем у экологически опасных химических пестицидов. При этом биопрепараты против фитопатогенов намного уступают микробным средствам, рекомендованным против насекомых-фитофагов. В настоящее
время появляются данные об антифунгальном эффекте различных бактерий (1-3). Среди
микробиологических средств защиты растений наиболее широко используются биопрепараты на основе энтомопатогенной бактерии Bacillus thuringiensis (Вt). Установлено антифунгальное действие энтомопатогенной Bас. thuringiensis Berliner (4, 5). Подобно другим бациллам Вt обладает множественностью физиологических и биохимических функций, обеспечивающих усвоение питательных субстратов, а также антибиоз в отношении партнеров по
биоценозу, что позволяет разрабатывать полифункциональные биосредства одновременно
против вредных насекомых и фитопатогенных грибов.
Мы изучали антифунгальное действие Bacillus thuringiensis в отношении возбудителей опасных болезней и ростстимулирующий эффект на растения.
Методика. В исследованиях использовали биопрепарат инсектицидного действия
бацикол (на основе ВtН10) в виде сухого порошка (титр спор 50Ѕ109/г) и жидкой формы
(титр 3,5Ѕ109/мл). Антифунгальную активность ВtН10 определяли методом агаровых блоков в чашках Петри (6, 7). Препараты ВtН10 (сухой порошок и жидкая форма) в различных концентрациях вносили в расплавленную и охлажденную до 40 °С среду Чапека. На поверхность застывшего агара помещали блоки, вырезанные из 10-суточной культуры испытуемых грибов. Контролем служила среда без добавления препарата. Диаметр
колоний гриба измеряли через 3 и 10 сут. Ингибирующую активность ВtН10 рассчитывали по формуле Аббота (8):
?? ? ??
Ѕ 100,
Степень ингибирования роста колоний гриба =
??
где Дк и До — диаметр колонии гриба соответственно в контроле и опыте, см.
Для выявления фракции ВtН10, ответственной за антифунгальный эффект, жидкую форму препарата разделяли центрифугированием на спорокристаллический комплекс и надосадочную жидкость. При оценке действия бацикола на Fusarium oxysporum
и Bipolaris sorokiniana в вегетационных условиях создавали искусственный инфекционный фон согласно методическим указаниям (9, 10). Против фузариозного увядания томатов почву, инфицированную F. oxysporum, проливали бациколом или его компонентами (100 мл на 1 кг почвы). Через 7 сут высаживали рассаду (сорт Грибовский) в фазе 1-го
листа. Продолжительность опыта 7 нед. Для борьбы с гельминтоспориозной корневой
гнилью семена ячменя сорта Луч, предварительно простерилизованные в растворе AgNO3,
замачивали на 16 ч в жидком бациколе или его компонентах (надосадочная жидкость,
спорокристаллический комплекс). Обработанные семена высевали в инфицированную
почву через 7 сут после инокуляции Вipolaris sorokiniana. Длительность опыта 30 сут. При
опрыскивании растений земляники сорта Царскосельская против серой гнили учитывали
пораженность растений на 20-е и 30-е сут.
Распространение (Р) и развитие (R) болезни оценивали по общеизвестным формулам (11): Р = А Ѕ 100/N, где Р — доля больных растений, %; А — число больных растений;
N — общее число растений в пробах; R = ? (а Ѕ в)/N Ѕ K, где R — степень развития болезни; ? (а Ѕ в) — сумма произведений числа пораженных растений (а) на соответствующий
балл (в); N — общее число учтенных растений; К — высший балл поражения по шкале.
Результаты. При изучении действия ВtН10 на землянично-малинного долгоно-
123
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
сика Anthonomus rubi Hbst. в полевых опытах установили заметное снижение не только
численности целевого объекта (насекомого-вредителя), но и распространения серой
гнили, вызываемой Botrytis cinerea (рис. 1). Наряду с энтомоцидным и антифунальным
отмечали стимулирующий эффект препарата в отношении растений (увеличение числа
соцветий на 10 %). Это побудило к оценке антифунгальной активности различных подвидов Bас. thuringiensis на более широком круге фитопатогенных грибов.
Ранее мы провели сравнительное изучение эффекта
различных подвидов Bас. thuringiensis на Botrytis cinerea в качестве модельного объекта (5)
с использованием энтомоцидных биопрепаратов бацикол
(Н10), битоксибациллин (Н1) и
ларвицидного средства бактокулицид (Н14) (табл. 1).
Даже при минимальРис. 1. Комплексное защитное действие Bacillus turingiensis H10 на земном содержании (0,1 %) бацилянике сорта Царскосельская в полевом опыте: А и Б — поражение соответственно землянично-малинным долгоносиком и серой гнилью,
кол (сухой порошок) проявлял
%; а, б — соответственно опыт и контроль (опытное поле Всероссийантифунгальный эффект. Увеского НИИ сельскохозяйственной микробиологии, 2001 год).
личение концентрации препарата (до 2 % и более) вызывало полное подавление роста гриба уже через 3 сут. У других
препаратов Bас. thuringiensis антифунгальное действие на Botrytis cinerea проявлялось слабее.
Для выявления фрак1. Влияние биопрепаратов на основе Bacillus thuringienции биопрепаратов Bас. thursis на рост гриба Botrytis cinerea in vitro
ingiensis, ответственной за антифунгальный эффект, были
Содержание сухого Подавление роста, %
Биопрепарат
препарата в среде, % на 3-и сут на 10-е сут
испытаны различные компоБацикол (ВtН10)
0,1
31,8
41,0
ненты жидкой формы биопре1,0
54,5
61,9
парата на основе ВtН10. Надо2,0
100,0
100,0
садочная жидкость оказалась
Битоксибациллин (ВtН1)
2,0
49,4
79,6
малоэффективной даже в кон3,0
49,4
79,6
центрации 4 %, а спорокри4,0
54,0
100,0
сталлический комплекс проя2,0
49,4
52,2
Бактокулицид (ВtН14)
3,0
49,4
55,9
вил антифунгальную активность
4,0
51,0
70,0
уже в концентрации 0,1 %.
П р и м е ч а н и е. Использована среда Чапека. Подавление
В лабораторных эксроста рассчитывали по формуле Аббота.
периментах было обнаружено
антифунгальное действие биопрепарата на основе ВtН10 на ряд фитопатогенных грибов
(табл. 2), однако эффективность отмечали не во всех случаях (она не проявилась против Scl. sclerotiorum, F. culmorum, F. graminearum).
В полевых опытах
2. Антифунгальная активность Bacillus thuringiensis Н10
по оценке эффекта компонентов жидкой формы биопрепаИнгибирование роста
Вид фитопатогенного гриба
через 3 сут, %
рата максимальную антифунBotrytis cinerea Pers.
100
гальную активность отмечали в
Pythium spp.
80
варианте со спорокристаллиBipolaris sorokiniana (Sacc.) Shoemaker
70
ческим комплексом Bас. thurinVerticillium dahliae Kleb.
52
giensis. Увеличение нормы расRhizoctonia solani Kuhn
43
хода приводило к соответстAlternaria alternatа (Fries), Keissl.
36
вующему усилению антифунSclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary
0
гального действия независимо
Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc.
51
F. oxysporum (Schlecht.), Snyd. et Hans.
43
от кратности обработки. В веF. solani App. et Wr.
26
гетационных опытах на томаF. culmorum (W. G. Sm.) Sacc.
0
тах (сорт Грибовский) устаноF. graminearum Schwabe
0
вили антифунгальный эффект
ВtН10 в отношении F. oхysporum. На искусственном инфекционном фоне к концу опыта распространение патогена
в почве достигло 100 % при показателе развития болезни 41,6 %. Наибольшую антифунгальную активность регистрировали в варианте с проливом почвы спорокристаллическим комплексом Bас. thuringiensis (поражение растений — 10 %, развитие болезни —
5 %). Аналогичная тенденция прослеживалась при проливе инфицированной почвы
жидким препаратом (соответственно 30 и 10 %). Важный аспект в этих наблюдениях
также составляло обнаруженное ростстимулирующее действие биопрепарата ВtН10: на
неинфицированной почве без обработки этим средством по сравнению с вариантом,
124
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
где почву обработали ВtН10, растения отставали в росте на 13 %.
В опытах с предпосевной обработкой семян ячменя компонентами биопрепарата
ВtН10 антифунгальный эффект отмечали при обработке семян спорокристаллическим комплексом ВtН10, а также нефракционированной жидкой формой биопрепарата. В первом варианте распространение болезни составило 26,0 % при степени развития болезни 8,5 % (соответствующие показатели в контроле без обработки семян — 64,0 и 29,5 %), нефракционированный биопрепарат снизил распространение болезни до 30,0 %, развитие — до 10,0 %.
Таким образом, представленные данные свидетельствуют о наличии у энтомопатогенной бактерии Bас. thuringiensis выраженных антифунгальных свойств. Наиболее
сильно они проявились у представителя 10-го серотипа — продуцента биопрепарата бацикол, эффективного в отношении опасных массовых вредителей. В частности, помимо
действия на землянично-малинного долгоносика, установлена энтомоцидная активность
ВtН10 в отношении ряда вредителей-фитофагов из отряда жесткокрылых (Coleoptera) —
восточного горчичного листоеда (Colaphellus hofti Men.), колорадского жука (Leptinotarsa
desemlineata Say.), крестоцветных блошек, комплекса видов из рода Phyllotreta, хлебной
полосатой блошки (P. vittula Redt.), злаковой пьявицы (Oulema melanopus L.), рапсового
цветоеда (Meligethes aeneus F.), капустного листоеда (Phaedon coclileariae F.), ильмового
листоеда (Xanthogaleruca luteola Midler.).
Спектр действия ВtН10 в отношении фитопатогенных грибов также охватывает
представителей различных групп возбудителей опасных заболеваний многих культурных
растений (см. табл. 2). Мы показали, что антифунгальная активность ВtН10 в отношении разных видов грибов неодинакова. Кроме того, степень антифунгального эффекта
у ВtН1, ВtН10 и ВtН14 (5) применительно к одному модельному виду (Botrytis cinerea)
также варьировала. Это служит иллюстрацией селективности биофунгицидного действия
представителей Bас. thuringiensis, которая представляет собой фундаментальное преимущество биоагентов по сравнению с химическими пестицидами.
Один из возможных механизмов антифунгального действия Bас. thuringiensis (а
также других бацилл) связывают с их ферментативной активностью. Нами была установлена протеазная и хитиназная активность этой бациллы (12), что согласуется с данными литературы о способности микроорганизмов, в том числе бацилл, утилизировать
мицелий и клеточные стенки грибов за счет хитиназ и протеаз — внеклеточных литических ферментов (13-15). Полученные результаты также согласуются с сообщением
В.К. Чеботаря с соавт. (1) о том, что в антифунгальную активность штамма Ч-13 Bac. subtilis вносят вклад экзоферменты. Важно отметить, что многочисленные штаммы Bac. subtilis, характеризующиеся проявлением антифунгальной активности, не образуют ни термостабильного экзотоксина, ни кристаллов эндотоксина, как это имеет место у Bас. thuringiensis. Следовательно, антифунгальная активность Bac. subtilis связана с экзоферментами
спор, что наблюдается и у Bac. thuringiensis. А.М. Асатурова (2) интерпретирует антифунгальный эффект Bac. subtilis на F. oxysporum совместным действием антибиотических
веществ и миколитических ферментов. Л.К. Каменек с соавт. (16) усматривают связь
антифунгального действия Bас. thuringiensis с активностью некоторых ?-эндотоксинов.
Несомненно, что специфика взаимоотношений в каждой конкретной паре гриб—
Bас. thuringiensis будет своя в соответствии с
особенностями жизненной стратегии грибов,
что и определит технологические подходы для
применения биопрепарата в каждом конкретном случае. Синергетический эффект различных антифунгальных факторов Bас. thuringiensis
может иметь аналогию с синергизмом энтомоРис. 2. Ростстимулирующий эффект Bacillus thurпатогенных факторов той же бактерии в отноingiensis H10 на различных культурах (лабораторшении насекомых.
ные опыты).
В отношении еще одного заслуживающего внимания аспекта полифункциональной активности Bас. thuringiensis — способности стимулировать рост растений отметим, что в серии лабораторных опытов по замачиванию семян ряда сельскохозяйственных культур (капуста, кабачок, салат, томат, ячмень) и последующему проращиванию их в рулонах фильтровальной бумаги мы отмечали
достоверное увеличение длины проростков по сравнению с контролем (варианты без обработки) (рис. 2). Полученные результаты хорошо согласуются с данными о комбинированном (антифунгальном и ростстимулирующем) действии биопрепарата аурина, разработанного на основе Pseudomonas aurantiaca (16).
Совокупность данных по антифунгальному эффекту ВtН10 и некоторых других
разновидностей Bас. thuringiensis представляет значительный теоретический и практический интерес. Изучение биохимии и генетики Bас. thuringiensis позволит выявить и идентифицировать ее метаболиты, ответственные за различные стороны полифункциональ-
125
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ной активности этой бациллы.
Результаты изучения антифунгального действия Bас. thuringiensis позволили ранее обосновать новый патотип этой бациллы — F (fungi — грибы) (4). Тогда каждый
конкретный штамм Bас. thuringiensis, отнесенный к определенному патотипу с учетом его
энтомоцидного действия, будет также принадлежать (или не принадлежать) к патотипу F.
Актуальность создания препаратов с комплексным действием обусловлена узким
ассортиментом биологических средств вообще и биопрепаратов против фитопатогенов в
особенности. Перечень немногочисленных видов бактерий с фунгицидным действием
включает Bac. subtilis (бактофит, алирин-Б, гамаир, бисолбисан, фитоспорин, баксис); Bac.
nigrum (бактрил); Pseudomonas fluorescens (бинорам, планриз); Ps. aerofaciens (псевдобактерин2). В соответствии с приведенными результатами исследований к нему также могут быть
отнесены вид Bас. thuringiensis и энтомоцидный биопрепарат бацикол на основе ВtН10, проявивший достоверный антифунгальный эффект в отношении ряда фитопатогенных грибов.
Итак, совокупность экспериментальных данных характеризует Bacillus thuringiensis
как перспективный продуцент полифункционального биопрепарата, сочетающего антифунгальный и энтомоцидный эффекты с ростстимулирующим действием на растения. При
уточнении селекционных критериев для штаммов-продуцентов при отборе на антифунгальную активность (в качестве таковых может выступать эффективность хитиназ и других экзоферментов, продуцируемых тем или иным штаммом) задача разработки подобного препарата представляется вполне осуществимой.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Ч е б о т а р ь В.К., З а в а л и н А.А., К и п р у ш к и н а Е.М. Эффективность применения препарата экстрасол. М., 2007.
А с а т у р о в а А.М. Перспективные штаммы бактерий — продуценты микробиопрепаратов для
снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике. Автореф. канд. дис. СПб—Пушкин, 2009.
Б о р о н и н А.М., К о ч е т к о в В.В. Биологические препараты на основе псевдомонад. Агро
ХХI, 2000, 3: 3-5.
С м и р н о в О.В. Патотипы Bacillus thuringiensis и экологические основы их использования в защите
растений. Автореф. докт. дис. СПб—Пушкин, 2000.
Г р и ш е ч к и н а С.Д., С м и р н о в О.В., К а н д ы б и н Н.В. Фунгистатическая активность
различных подвидов Bacillus thuringiensis. Микология и фитопатология, 2002, 36(1): 58-62.
Методы экспериментальной микологии /Под ред. В.И. Билай. Киев, 1982.
С о к о л о в а М.В. Хитинолитическая и антигрибная активность трех штаммов бактерий рода Serratia. В сб. науч. тр. ВИЗР: Современная биотехнология в решениях проблем. СПб, 1995: 214-224.
Х о х р я к о в М.К., П о т л а й ч у к В.И., С е м е н о в А.Я. Определитель болезней сельскохозяйственных культур. М., 1984.
С и д о р о в а С.Ф., П о п о в В.И. Методические указания по изучению вертициллезного и фузариозного увядания однолетних сельскохозяйственных растений. Л.—Пушкин, 1980.
К о т о в а В.В. Методические указания по изучению вредоносности корневой гнили яровой пшеницы и ячменя и методы расчета потерь от болезней. Л., 1979.
В л а с о в Ю.И., Г а в р и л о в а Е.А., М и н к е в и ч И.И., Ч у м а к о в А.Е. Основные методы фитопатологических исследований. М., 1974.
С м и р н о в О.В., Г р и ш е ч к и н а С.Д. Изучение действия биопрепаратов на основе Bacillus
thuringiensis на фитопатогенные грибы. Вест. защиты растений, 2010, 1: 27-35.
Т р а ч у к Л.А., Ш е м я к и н а Т.Г., Ч е с т у х и н а Г.Г. и др. Хитиназы Bacillus cereus: выделение и характеристика. Биохимия, 1996, 61(2): 357-368.
R e y e s - R a m i r e z B.I., E s c u d e r o - A b a r c a G., A g u i l a r - U s c a n g a P.M. e.a. Antifungal activity of Bacillus thuringiensis chitinase and its potential for the biocontrol of phytopathogenic fungi in soybean seeds. J. Food Sci., 2006, 69(5): М131-М134.
Т а т а р и н о в а Н.Ю., Г р и н ч е н к о О.С., В а р л а м о в В.П. и др. Хитинолитический комплекс
ферментов Streptomices kurssanovii и его использование против возбудителя фузариоза пшеницы Fusarium culmorum. Прикладная биохимия и микробиология, 1996, 32(2): 242-246.
К а м е н е к Л.К., К а м е н е к В.М., К а м е н е к Д.В. Перспектива применения препаратов на основе дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis в сельском хозяйстве. Мат. VII Межд. конф. «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Минск, 2010: 447-448.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
микробиологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
20 декабря 2010 года
196608 г. Санкт-Петербург—Пушкин, ш. Подбельского, 3,
e-mail: сontact@arriam.spb.ru
POLYFUNCTIONAL ACTIVITY OF Bacillus thuringiensis Berliner
O.V. Smirnov, S.D. Grishechkina
Summary
The results of polyfunctional activity studies of the entomopathogenic bacteria Bacillus thuringiensis which
are widely used as the basis for bioinsecticides development are presented. The antifungal and phytostimulatory activity
of Bас. thuringiensis Berliner is demonstrated. The spectrum of antifungal activity of Bас. thuringiensis includes Botrytis
cinerea, Bipolaris sorokiniana, Fusarium oxysporum etc. The tendencies of creating ecologically safe biopreparations with
complex activity based on Bас. thuringiensis are viewed.
126
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, № 3
Специальный выпуск, посвященный 80-летию создания
Всероссийского НИИ сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии
и 120-летию организации Бактериологической лаборатории при
Департаменте земледелия и государственных имуществ России
СОДЕРЖАНИЕ
ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РАСТИТЕЛЬНО-МИКРОБНОГО
СИМБИОЗА
Тихонович И.А., Проворов Н.А. Сельскохозяйственная микробиология как основа экологически устойчивого агропроизводства: фундаментальные и прикладные аспекты . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Белимов А.А., Тихонович И.А. Микробиологические аспекты устойчивости и аккумуляции тяжелых металлов у растений (обзор) . . . . . . . . . .
Шапошников А.И., Белимов А.А., Кравченко Л.В. и др. Взаимодействие ризосферных бактерий с растениями: механизмы образования и факторы эффективности ассоциативных симбиозов (обзор) . . . . . . . . . .
Белимов А.А., Сафронова В.И. АЦК деаминаза и растительно-микробные взаимодействия (обзор) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Проворов Н.А., Воробьев Н.И. Растительно-микробные симбиозы как эволюционно целостные системы . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Цыганова А.В., Китаева А.Б., Бревин Н.Дж. и др. Клеточные механизмы развития
симбиотических клубеньков у бобовых растений (обзор) . . . . . . .
Борисов А.Ю., Штарк О.Ю., Жуков В.А. и др. Взаимодействие бобовых с полезными почвенными микроорганизмами: от генов растений к сортам . . .
Румянцева М.Л., Белова В.С., Онищук О.П. и др. Полиморфизм bet-генов у
штаммов Sinorhizobium meliloti из генцентров люцерны . . . . . . . .
Чижевская Е.П., Онищук О.П., Андронов Е.Е. и др. Использование метода сайтнаправленного мутагенеза для изучения функций гена SMb20332 у клубеньковых бактерий Sinorhizobium meliloti . . . . . . . . . . . . . .
Сафронова В.И., Чижевская Е.П., Белимов А.А. и др. Определение таксономического положения микросимбионтов копеечника (Hedysarum) и астрагала
(Astragalus) на основе анализа генов рибосомальных РНК . . . . . . .
Юрков А.П., Якоби Л.М., Дзюбенко Н.И. и др. Полиморфизм популяции Павловская люцерны хмелевидной по показателям продуктивности, микоризации
и эффективности симбиоза с Glomus intraradices . . . . . . . . . .
Кравченко Л.В., Шапошников А.И., Макарова Н.М. и др. Видовые особенности
состава корневых выделений растений и его изменение в ризосфере под
влиянием почвенной микрофлоры . . . . . . . . . . . . . . .
3
10
16
23
29
34
41
48
55
61
65
71
МИКРОБИОЛОГИЯ ПОЧВЫ
Круглов Ю.В., Пароменская Л.Н. Микробиологические факторы биоремедиации
почвы, загрязненной гербицидом прометрином . . . . . . . . . .
Першина Е.В., Андронов Е.Е., Пинаев А.Г. и др. Анализ полиморфизма длин
рестрикционных фрагментов ДНК для изучения динамики почвенных микробных сообществ в условиях воздействия ксенобиотиков . . . . . .
Воробьев Н.И., Свиридова О.В., Попов А.А. и др. Граф-анализ генно-метаболических сетей почвенных микроорганизмов, трансформирующих растительные остатки в гумусовые вещества . . . . . . . . . . . . . . .
Орлова О.В. Повышение плодородия почв при активизации почвенной микрофлоры, регулируемой биоудобрениями . . . . . . . . . . . . .
Струнникова О.К. Изучение почвенной стадии развития Fusarium culmorum для
разработки мер защиты ячменя от гнили . . . . . . . . . . . .
Кутузова Р.С. Полиморфный микроорганизм, способный осаждать алюминий на
клеточной поверхности . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Архипченко И.А. Микробиологические аспекты переработки отходов животноводства . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
76
81
88
94
98
102
108
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ ДЛЯ АПК
Кожемяков А.П., Белоброва С.Н., Орлова А.Г. Создание и анализ базы данных
по эффективности микробных биопрепаратов комплексного действия . .
Лактионов Ю.В., Попова Т.А., Андреев О.А. и др. Создание стабильной формы ростстимулирующих микробиологических препаратов и их эффективность . .
Чеботарь В.К., Петров В.Б., Шапошников А.И. и др. Биохимические критерии
оценки агрономически значимых свойств бацилл, используемых при создании микробиологических препаратов . . . . . . . . . . . . . .
Смирнов О.В., Гришечкина С.Д. Полифункциональная активность Bacillus thuringiensis Berliner . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
112
116
119
123
127
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
AGRICUTURAL BIOLOGY, 2011, № 3
CONTENTS
Tikhonovich I.A., Provorov N.A. Agricultural microbiology as the basis of ecologically
sustainable agriculture: fundamental and applied aspects . . . . . . . . .
Belimov A.A., Tikhonovich I.A. Microbiological aspects of resistance and accumulation
of heavy metals by plants . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Shaposhnikov A.I., Belimov A.A., Kravchenko L.V. e.a. Interaction of rhizosphere bacteria
with plants: mechanisms of formation and factors of efficiency in associative
symbiosis (review) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Belimov A.A., Safronova V.I. AСС deaminase and plant—bacteria interactions (review) .
Provorov N.A., Vorobyov N.I. Plant-microbe symbioses as the evolutionary integrated
systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Tsyganova A.V., Kitaeva A.B., Brewin N.J. e.a. Cellular mechanisms of nodule development
in legume plants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Borisov A.Yu., Shtark O.Yu., Zhukov V.A. e.a. Interaction of legumes with beneficial soil
microorganisms: from plant genes to varieties . . . . . . . . . . . .
Roumiantseva M.L., Belova V.S., Onishchouk O.P. e.a. Polymorphism of bet-genes
among Sinorhizobium meliloti isolates native to gene centers of alfalfa . . . .
Chizhevskaya E.P., Onishchuk O.P., Andronov E.E. e.a. Use of site-directed mutagenesis
to study the functions of gene SMb20332 in the nodule bacteria Sinorhizobium
meliloti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Safronova V.I., Chizhevskaya E.P., Belimov A.A. e.a. Taxonomy of microsymbionts of
Hedysarum and Astragalus basing on ribosomal RNA genes sequencing . . . .
Yurkov A.P., Jacobi L.M., Dzyubenko N.I. e.a. Black medic pavlovskaya population is
polymorphic for productivity, mycorrhization and symbiotic efficiency with Glomus intraradices . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kravchenko L.V., Shaposhnikov A.I., Makarova N.M. e.a. Characterization of the root
exsudates in plant species and its changes in rhizosphere under the influence of soil
microorganisms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kruglov Yu.V., Paromenskaya L.N. Microbiological factors of self-purification and bioremediation of soil polluted by herbicide prometryne . . . . . . . . . .
Pershina E.V., Andronov E.E., Pinaev A.G. e.a. The use of T-RFLP method for studying
the dynamics of soil microbial communities under xenobiotics treatment . . . .
Vorobyov N.I., Sviridova O.V., Popov A.A. e.a. Graph-analysis in gene-metabolic networks of soil microorganisms which transformed plant residues to humus substances .
Orlova O.V. Regulation of the activity of soil microflora by applicating biofertilizers aimed
to improve the soil fertility . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Strunnikova O.K. Study of Fusarium culmorum development in soil for search of protective actions against barley root rot . . . . . . . . . . . . . .
Kutuzova R.S. Polymorphous microorganism which precipitates aluminum on the cell surface
Arkhipchenko I.A. Microbiological aspects of processing the livestock wastes . . . .
Kozhemyakov A.P., Belobrova S.N., Orlova A.G. Creating and analyzing a database on
the efficiency of microbial preparations of complex action . . . . . . . .
Laktionov Yu.V., Popova T.A., Andreev О.А. e.a. Creating new forms of growth-stimulating microbial preparations and their performance on various cultures . . . .
Chebotar’ V.К., Petrov V.B., Shaposhnikov A.I. e.a. Biochemical criteria for estimation
of agronomic valuable properties of bacilli used for development of microbial
preparations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Smirnov O.V., Grishechkina S.D. Polyfunctional activity of Bacillus thuringiensis Berliner
3
10
16
23
29
34
41
48
55
61
65
71
76
81
88
94
98
102
108
112
116
119
123
Редакция журнала «Сельскохозяйственная биология»
выполняет рассылку электронных оттисков опубликованных статей
Для получения электронного оттиска Вам необходимо:
?
?
?
отослать точное описание заказа (авторы и название статьи, год, номер журнала, страницы) по адресу
agrobiol@mail.ru, указав Ваши фамилию, имя, отчество (полностью), город, где проживаете, контактные e-mail и телефон;
получить из редакции по своему контактному e-mail подтверждение заказа (с присвоенным ему номером);
оплатить услугу, указав в платежном документе в графе «Назначение платежа» присвоенный заказу номер и Ваши фамилию, имя, отчество.
Оттиски высылаются на Ваш контактный e-mail после зачисления оплаты на счет редакции.
Банковские реквизиты редакции:
Получатель:
Банк получателя:
Сбербанк России ОАО г. Москва,
ИНН 7708051012 Редакция журнала «Сельскохозяйственная
БИК 044525225,
биология», Марьинорощинское ОСБ 7981, г. Москва,
к/с 30101810400000000225
р/с 40703810638050100603
В назначении платежа укажите номер заказа, Ваши фамилию, имя, отчество.
Стоимость услуги:
один оттиск — 120 р., не более шести оттисков (абонемент) — 360 р., не более двенадцати оттисков (абонемент) — 700 р. Цены приведены с учетом НДС 10 %. Абонементное обслуживание предполагает предоставление указанного числа оттисков за период не более каждого текущего года по предоплате.
E-mail для заказа электронных оттисков — agrobiol@mail.ru
© Электронные оттиски являются интеллектуальной собственностью редакции журнала «Сельскохозяйственная
биология». Внесение в них каких бы то ни было изменений и дополнений не допускается. Перепечатка, тиражирование, размещение в средствах информации, в том числе электронных и сети Интернет, а также
коммерческое распространение возможны только с разрешения редакции.
128
Документ
Категория
Журналы и газеты
Просмотров
1 648
Размер файла
10 559 Кб
Теги
сельскохозяйственных, биологии, 2011
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа