close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

19.Основы биотехнологии

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное агентство по образованию
Казанский государственный технологический университет
Л.Э.Ржечицкая, М.А.Сысоева, М.Е.Зиновьева
ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Лабораторный практикум
Казань 2004
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
УДК 577.1(075.8)
Основы биотехнологии: Лабораторный практикум/ Л.Э.Ржечицкая,
М.А.Сысоева, М.Е.Зиновьева; Казан. гос. технол. ун-т. Казань, 2004,
90 с.
Содержит задания к практической части дисциплины «Основы биотехнологии», состоящей из трех частей: биохимия, микробиология и биотехнология. Приведен необходимый теоретический материал для проведения лабораторных работ.
Практикум предназначен для студентов, изучающих указанную дисциплину в соответствии с учебными планами по направлению 240000 – Химическая и биотехнологии, специальностям: 250100
– Химическая технология органических веществ, 250400 – Химическая технология природных энергоносителей и углеродных материалов и 251800 – Основные процессы химических производств и химическая кибернетика.
Табл. 6. Рис. 8. Библиогр.: 12 назв.
Печатается по решению редакционно-издательского совета
Казанского государственного технологического университета.
Подготовлен на кафедре пищевой биотехнологии факультета
пищевой инженерии КГТУ.
Рецензенты:
Доцент кафедры пищевой технологии
Иркутского государственного технологического университета,
к.б.н., Верхотуров В.В.
с.н.с. кафедры микробиологии
КГУ, к.х.н. Калачева Н.В.
©Казанский государственный технологический университет
2
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Введение
Как отрасль промышленности биотехнология приобретает все
большее значение, она базируется на применении микроорганизмов –
продуцентов множества полезных веществ: ферментов, антибиотиков, стероидных препаратов, аминокислот, витаминов и кормового
белка.
Возможности микробиологического синтеза очень велики.
Большое значение имеет разработка способов использования биохимической активности микроорганизмов для повышения плодородия
почв, добычи полезных ископаемых, восполнения энергетических
ресурсов и очистки окружающей среды от многих загрязнений. Вместе с тем необходимо изыскание эффективных способов борьбы с
некоторыми микроорганизмами, вызывающими заболевания человека, животных и растений, а также порчу промышленных изделий и
нежелательные изменения в окружающей среде. Многие из этих проблем могут быть решены только усилием специалистов из разных
областей науки и техники.
Лабораторный практикум рассчитан на студентов технологического профиля, не изучавших биоорганической химии и микробиологии, но владеющих достаточным запасом знаниями в области органической, аналитической и коллоидной химии, необходимым для освоения предлагаемого курса.
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Часть I. Биохимический практикум
Тема 1. БЕЛКИ. ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА БЕЛКОВ
Белки или протеины (от греч. protos – первый, важнейший) –
это высокомолекулярные полимерные соединения, образующие при
гидролизе α-аминокислоты L-ряда. Белки составляют значительную
часть тканей живого организма – до 45-50% сухой массы.
В молекуле белка аминокислоты соединяются друг с другом
за счет ковалентной пептидной связи, формируя полипептидные цепи.
R2
O
H 2NCHCOOH + H 2NCHCOOH
H 2N-CH-C-N-CHCOOH
R2
R1
R1
H
Образованные аминокислотами полимеры называются пептидами или белками, в зависимости от числа входящих в их состав
аминокислот: пептиды содержат до 50 аминокислот, белки – более
50 аминокислот. В природе встречается около 300 аминокислот, в
состав белков входят только 20, называемых протеиногенными. Формулы протеиногенных аминокислот и их изоэлектрические точки
приведены в табл. 1.
Таблица 1. Характеристики протеиногенных аминокислот
Название
Обзначение
Формула
Изоэлектрическая точка
1
2
3
4
gly,
гли
CH2 COOH
5,97
1. Глицин
NH2
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Продолжение таблицы 1
1
2. Аланин
2
3
ala,
CH3
ала
3. Валин
4. Лейцин
5. Изолейцин
ile,
иле
6. Аспарагиновая
кислота
asp,
асп
7. Аспарагин
asn,
асн
8. Глутаминовая
кислота
9. Глутамин
glu,
глу
gln,
глн
10. Серин
ser,
сер
11. Треонин
thr,
тре
CH COOH
6,02
NH2
val,
вал
leu,
лей
4
CH3 CH CH COOH
5,97
CH3 NH2
CH CH2 CH COOH
CH3
NH2
CH3
CH3
5,98
CH2 CH CH COOH
6,02
CH3 NH2
HOOC CH2
CH COOH
2,87
NH2
5,41
O
H2N
C CH2
CH COOH
NH2
3,22
O
C C H2
HO
CH2
CH C OOH
NH2
5,65
O
H2N
C CH2 CH2 CH COOH
NH2
HO CH2
CH COOH
5,68
NH2
CH3
5
CH
CH COOH
OH
NH2
6,53
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Продолжение таблицы 1
1
12. Цистеин
2
cySH,
цис
13. Метионин
met,
HS CH2
3
4
CH COOH
5,02
NH2
C H3 S CH2 CH2 CH CO O H
мет
14. Аргинин
15. Лизин
arg,
арг
lys,
лиз
16. Фенилаланин
5,75
NH2
NH2
(CH2)3 C H C OO H
C NH
NH
10,76
N H2
H 2N (C H 2 ) 4 CH
CO O H
9,74
N H2
phe,
5,88
CH 2 CH COOH
фен
NH2
17. Тирозин
tyr,
тир
HO
CH 2 CH CO O H
5,65
N H2
18. Пролин
19. Гистидин
pro,
про
his,
гис
6,10
COOH
NH
N
CH 2
tru,
C H2
три
NH
6
7,58
NH2
NH
20. Триптофан
C H COOH
CH C OOH
NH2
5,88
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Выделяются следующие четыре уровня структурной организации белков: первичная, вторичная, третичная и для отдельных белков четвертичная. Под первичной структурой организации белков
понимают последовательность аминокислот в полипептидной цепи
(или цепях).
Вторичная структура белка подразумевает определенный
способ укладки полипептидной цепи в упорядоченную структуру.
Она формируется благодаря водородным связям между пептидными
группами одной или разных полипептидных цепей, а также внутрии межмолкулярными дисульфидным мостикам. Вторичная структура
молекулы белка представлена в основном такими регулярными
структурами, как α-спираль и складчатые слои (β-структура). Белковая молекула, не имеющая упорядочной вторичной структуры, называется динамической глобулой.
Третичная структура белка – это пространственное расположение полипептидной цепи за счет взаимодействия боковых радикалов аминокислот между собой и с растворителем. В результате такого взаимодействия полипептидная цепь свертывается очень сложным образом, приобретая пространственную конфигурацию характерную для каждой белковой молекулы.
Четвертичная структура (ее имеют белки, состоящие из нескольких полипептидных цепей) – это организация нескольких полипептидных цепей с третичной структурой в единую межмолекулярную систему.
Все природные белки подразделяются на простые и сложные.
Простые белки гидролизуются кислотами и щелочами только на
аминокислоты. Классификация простых белков основана на растворимости в водной среде.
7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В слабых растворах кислот растворяются такие белки как
гистоны и протамины. Это наиболее простые белки (с наименьшей
молекулярной массой), они проявляют основные свойства и выступают как регуляторные белки.
Альбумины – белки, которые растворяются в воде. К ним относятся белок куриного яйца, сывороточные белки молока, белки зародыша семян злаковых и др. Глобулины – белки, растворимые в растворах солей. Обычно их экстрагируют 10%-ным раствором хлорида
натрия. Многие альбумины и глобулины обладают ферментными
свойствами.
Проламины – белки, растворимые в 60-80%-ном растворе
этилового спирта. Глютелины – белки, которые экстрагируются разбавленными растворами щелочей. Проламины и глютелины являются растительными белками.
Структурные (фибриллярные) белки не растворимы в воде.
При расщеплении сложных белков образуются не только
аминокислоты, но и другие органические и неорганические молекулы. В зависимости от природы небелковой группы белка различают
следующие сложные белки: гликопротеины, липопротеины, нуклеопротеины, металлопротеины и фосфопротеины т.д.
Современная классификация белков основана на свойствах,
связанных с их функциональным разнообразием. По функциям, выполняемым в организме, белки делят на строительные, каталитические, двигательные, транспортные, защитные, гормональные, запасные, рецепторные и др.
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Лабораторная работа 1
Качественное определение белков. Цветные реакции
Цель работы: Освоить методы качественного анализа белков различной природы.
Присутствие белка в исследуемом материале можно обнаружить с помощью цветных реакций на структурные компоненты белка
и его функциональные группы. Все известные цветные реакции на
белки делят на три типа:
• реакция на пептидную группу (биуретовая);
• реакция на концевые
α-аминогруппы (нингидриновая) и α-
карбоксильные группы;
• реакции на отдельные аминокислоты в молекуле белка (ксантопротеиновая, Адамкевича, Фоля и др.).
Некоторые цветные реакции присущи не только белкам, но и
другим веществам, поэтому для установления наличия белка недостаточно проводить только одну реакцию. На основании отдельных
цветных реакций разработаны методы количественного анализа белков, которые широко используются в биохимической практике.
1.1. Биуретовая реакция (реакция Пиотровского)
Метод основан на способности пептидной группы
белков и полипептидов образовывать в щелочной среде с ионами меди (II) комплексное соединение фиолетового цвета с красным или
синим оттенком в зависимости от количества пептидных связей.
Положительную биуретовую реакцию дают белки и пептиды,
имеющие не менее двух пептидных связей. Некоторые небелковые
вещества, содержащие не менее двух пептидных групп, также дают
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
положительную реакцию с биуретовым реактивом. Например, производное мочевины – биурет, давший название этой реакции.
to
2 (NH 2)2CO
H 2N-C-NH-C-NH 2
O
O
мочевина
биурет
Группа, образующая пептидную связь (−СО−NH−), в щелочной среде присутствует в своей таутомерной енольной форме:
C
C N
N
+
C
OH
O
O H
резонансная
форма
кето-форма
N
енольная
форма
В щелочной среде белки образуют комплексные соединения
с ионами меди (II). В образовании координационных связей принимают участие вакантные d-орбитали ионов меди (II) и свободные
электронные пары азота и с кислородом полипептидной цепи. Схематично реакцию можно представить следующим образом:
O
O
O
O
+NaOH
... NH CH C NH CH C NH CH C NH CH C ...
R1
R2
R3
R4
OH
OH
OH
OH
... NH CH C N CH C N CH C N CH C ...
R1
R2
R3
10
R4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
OH
R2
OH
R3
OH
... NH CH C N CH C N CH C N CH C ...
O
R1
R4
Cu+2
O
OH
OH
... NH CH C N CH C N CH C N CH C ...
R1
R2 OH
R3
R4
биуретовый комплекс
Свободные аминокислоты обычно дают отрицательную реакцию с биуретовым реактивом. Исключение составляют такие аминокислоты как гистидин, серин, треонин, аспарагин, которые при
больших концентрациях в растворе могут образовывать биуретовый
комплекс с медью (II).
Ход работы:
В первую пробирку наливают 5 капель 1% раствора яичного
белка, во вторую – 5 капель 1% раствора желатины. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 10% раствора едкого натра и по 1 капли 1% раствора сульфата меди. При взбалтывании в обеих пробирках
появляется фиолетовое окрашивание. В третьей пробирке повторяют
первый опыт с яичным белком, заменяя раствор едкого натра водой.
1.2. Нингидриновая реакция
Белки, полипептиды, а также свободные α-аминокислоты дают
синее или фиолетовое окрашивание с нингидрином. Реакция обусловлена наличием α-аминокислот в молекуле белка и характерна
для аминогрупп, расположенных в α-положении.
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
При нагревании раствора белка с нингидрином концевые
группы входящих в состав белка α-аминокислот окисляются, образуя
двуокись углерода, аммиак и соответствующий альдегид:
O
О
O
OH
OH
NH2
O
OH
+
R-CH-C
R-C
CO2 , NH3
OH
+
H
H
O нингидрин
α -аминокислота
O
Восстановленная форма нингидрина конденсируется с аммиаком и окисленной формой нингидрина с образованием окрашенного соединения фиолетово-синего цвета.
О
O
OH
OH
O
+ NH 3
HО
+
O
O
H
N
H
- H2O
O
O
O
продукт конденсации
(фиолетово-синего цвета)
Ход работы:
В первую пробирку наливают 5 капель 1% раствора яичного
белка, во вторую – 5 капель 1% раствора желатины, в третью – 2%
раствор аланина (или любой α-аминокислоты). Во все пробирки добавляют по 5 капель 0,1% водного раствора нингидрина и нагревают
на кипящей водяной бане 1-2 минуты. Наблюдают появление розовофиолетового или сине-фиолетового окрашивания.
12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1.3. Ксантопротеиновая реакция (реакция Мульдера)
Реакция основана на способности присутствующих в молекуле белка ароматических аминокислот (тирозина, триптофана и фенилаланина) образовывать с концентрированной азотной кислотой при
нагревании динитропроизводные соединения желтого цвета. В щелочной среде они переходят в хиноидные соединения, имеющие
оранжевый цвет. Например, в реакции с тирозином образуется динитротирозин, добавление гидроксида натрия приводит к образованию натриевой соли динитротирозина.
OH
OH
+ HNO
O
3
O
-H 2 O
N
CH 2 -CH-COOH
N
O
O
CH 2 -CH-COOH
NH 2
NH 2
тирозин
динитротирозин
O
+ NaOH
O
O
N
N
O
ONa
-H 2 O
натриевая соль
(оранжевого цвета)
CH 2-CH-COOH
NH 2
Аналогично протекает реакция нитрования фенилаланина и
триптофана. Данная реакция обусловливает появление желтого окрашивания при попадании на кожу и ногти концентрированной азотной кислоты.
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Подобную реакцию дают многие ароматические соединения,
например, фенолы. Желатина даёт отрицательную реакцию с азотной
кислотой, так как в ней отсутствуют ароматические аминокислоты.
Ход работы:
В первую пробирку наливают 5 капель 1% раствора яичного
белка, во вторую пробирку – 5 капель 1% раствора желатины, в третью – 5 капель 2% раствора тирозина. Во все три пробирки добавляют по 3-4 капли концентрированной азотной кислоты. При этом выпадает осадок, который при осторожном нагревании приобретает
желтую окраску. В первой и третьей пробирках раствор окрашивается в лимонно-желтый цвет, а во второй пробирке – остается бесцветным, так как желатина почти не содержит ароматических аминокислот. После охлаждения в пробирки добавляют по 10 капель 10% раствор гидроксида натрия до появления в первой и третьей пробирках
оранжевого окрашивания. Во второй пробирке цвет раствора желатины не изменяется.
1.4. Реакция Адамкевича (на триптофан)
Метод основан на способности триптофана в кислой среде в
присутствии ионов железа (II) или меди (II) реагировать с глиоксиловой кислотой с образованием соединения фиолетового цвета. Эта
реакция связана с присутствием в молекуле белка аминокислоты
триптофана.
При нагревании две молекулы триптофана взаимодействуют с
глиоксиловой кислотой с образованием окрашенного соединения.
Для проведения реакции используют ледяную уксусную кислоту, в
которой в качестве примеси присутствует глиоксиловая кислота.
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
NH
O
+
H2C
H 2N CH
H
C C
O
N
OH -Н 2 О
H 2C
H 2N CH
COOH
COOH
триптофан
N
COOH
H2C
глиоксиловая
кислота
CH
H 2N CH
COOH
продукт конденсации
(фиолетового цвета)
В качестве водоотнимающего средства в реакции используют
концентрированную серную кислоту.
Ход работы:
В первую пробирку наливают 5 капель 1% раствора яичного
бела, во вторую пробирку – 5 капель 1% раствора желатины, в третью – 5 капель 2% раствора триптофана. В каждую пробирку приливают по 5 капель ледяной уксусной кислоты и по 1 капле 1% раствора сульфата меди, перемешивают и осторожно нагревают до растворения выпавшего осадка. Содержимое пробирок охлаждают и очень
осторожно, по стенке, наклонив пробирку, прибавляют 5 капель
концентрированной серной кислоты (следя за тем, чтобы жидкости
не смешивались). На границе двух слоев появляется краснофиолетового цвета кольцо, которое постепенно распространяется на
весь раствор. Появление окраски можно ускорить, поместив пробирку в кипящую водяную баню. Во второй пробирке с раствором желатины окрашивания не происходит, так как желатина не содержит
триптофан.
1.5. Реакция Фоля
Метод основан на способности белков, в состав которых входят серосодержащие аминокислоты (цистеин, цистин), в щелочной
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
среде взаимодействовать с уксуснокислым свинцом. При нагревании
выпадает черный или бурый осадок сульфида свинца.
C H2O H
C H 2S H
CHNH 2
+ NaOH
+ Na 2 S + H 2 O
CHNH 2
COOH
COOH
цистеин
серин
Pb(CH3COOH)2 + 2NaOH → Pb(ONa)2 + 2CH3COOH
Pb(ONa)2 + Na2S + 2H2O → PbS↓ + 4NaOH
черный осадок
Ход работы:
В первую пробирку наливают 5 капель 1% раствора яичного
белка, во вторую пробирку – 5 капель 1% раствора желатины, в третью – 5 капель 2% раствора цистеина. В каждую пробирку добавляют
по 5 капель 30% раствора едкого натра и по 1 капле 5% раствора уксуснокислого свинца. При нагревании на кипящей водяной бане
жидкости в первой и третьей пробирках темнеют, образуя черный
осадок сульфида свинца. Во второй пробирке с желатиной осадок не
образуется, так как желатина почти не содержит серосодержащих
аминокислот. Полученные результаты оформляют в виде табл. 2.
Таблица 2. Качественные реакции на белки
Название
реакции
Реагент
Реактив
Биуретовая
реакция
Яичный
белок
Биуретовый
реактив
16
Цвет
Причина
Фиолетовый
Образование комплекса
белка и соли меди (II)
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тема 2. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКА
Для количественного определения белков применяют физикохимические, химические и биологические методы. Наибольшее распространение из физических методов получили рефрактометрический, спектрофотометрический и полярографический.
Самым распространенным из физико-химических методов
определения белков является колориметрический метод. Он основан
на изменении интенсивности окрашивания цветной реакции, развивающейся при взаимодействии белков со специфическим реагентом,
в зависимости от концентрации белка. Среди колориметрических методов, основанных на известных цветных реакциях на белок, широкое распространение получил наиболее чувствительный метод Лоури. Несмотря на высокую чувствительность, он имеет определенные
недостатки, т.к. используемый в этом методе реактив Фолина дает
положительную реакцию и на некоторые другие вещества, например, вещества фенольной природы, которые содержатся в большом
количестве в некоторых объектах, особенно в растительных белках.
Более надежные и воспроизводимые результаты получаются
при использовании биуретового метода. Этот метод уступает по чувствительности методу Лоури, но не дает побочных реакций с отличающимися от белка веществами. В его основе лежит явление образования фиолетового окрашивания при добавлении щелочного раствора меди (II) к белку. Окрашивание вызывается наличием в белке
пептидных связей, что обеспечивает специфичность реакции.
Лабораторная работа 2
Биуретовый метод определения содержания белка в растворе
Цель работы: Освоить метод количественного анализа белков.
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Метод основан на способности пептидных связей белков и
полипептидов образовывать комплексные соединения фиолетового
цвета с ионами Cu (II) в щелочной среде, интенсивность окраски которых пропорциональна содержанию белка в среде.
Ход работы:
Для определения содержания белка в растворе строят калибровочный график. Пользуясь калибровочным графиком, определяют
неизвестную концентрацию раствора белка. Для этого к 1 мл исследуемого раствора белка неизвестной концентрации добавляют 4 мл
биуретового реактива. Через 30 минут определяют оптическую плотность исследуемого раствора в кювете толщиной 1 см (длина волны
540-560 нм) относительно контрольного раствором. Контрольный
раствор готовят из 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия и 4 мл биуретового реактива. Если оптическая плотность исследуемого раствора
больше единицы, то его разбавляют 0,9% раствором хлорида натрия
и повторяют определение. Полученную по калибровочному графику
концентрацию белка при этом умножают на коэффициент разбавления.
Построение калибровочного графика
Для построения калибровочного графика из 1% исходного
раствора белка известной концентрации, приготовленного на 0,9%
растворе хлорида натрия, готовят растворы с уменьшающейся концентрацией по схеме:
1. Исходный раствор 10 мл (10 мг/мл)
6. 5 мл (5) + 1 мл воды
2. 9 мл (1) + 1 мл воды
7. 4 мл (6) + 1 мл воды
8. 3 мл (7) + 1 мл воды
3. 8 мл (2) + 1 мл воды
4. 7 мл (3) + 1 мл воды
9. 2 мл (8) + 2 мл воды
5. 6 мл (4) + 1 мл воды
10. 2 мл (9) + 2 мл воды
18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Содержимое пробирок перемешивают и проводят биуретовую
реакцию. Для этого из всех пробирок отбирают по 1 мл испытуемых
растворов, переносят в отдельные пробирки. В каждую пробирку добавляют по 4 мл биуретового реактива и оставляют в темном месте
на 30 минут. Затем измеряют оптическую плотность каждой пробы
на фотоэлектроколориметре относительно контрольного раствора в
кювете толщиной 1 см (длина волны 540-560 нм, светофильтр зеленый). По полученным данным строят калибровочный график (рис.1),
откладывая на оси ординат значения оптической плотности (экстинкцию), на оси абсцисс – известные концентрации белка.
Оптическая плотность, нм
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
2
4
6
8
Концентрация белка, мг/мл
Рис. 1. Калибровочный график
19
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тема 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
БЕЛКА. ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ ТОЧКА БЕЛКА
Вода в живом организме заполняет все пространство клеток и
тканей, составляя внутреннюю среду, белки находятся в ней и образуют растворы с особыми свойствами.
Вещество, равномерно распределенное в другом веществе
(например, в воде), образует дисперсную систему. Дисперсные системы в зависимости от раздробленности частиц могут быть: грубодисперсными взвесями (частицы больше 0,1 мкм), коллоидными растворами (частицы от 0,001 до 0,1 мкм), ионно-молекулярными растворами (частицы меньше 0,001 мкм).
Растворы белков в живом организме приближаются к коллоидным растворам – их называют «молекулярными коллоидами». По
современным представлениям растворы белка проявляют двойственный характер. По существу это истинные растворы, так как частицы
белка – отдельные молекулы (размер молекул 0,1-0,001 мкм). По
свойствам это коллоидные растворы, так как обладают свойствами
коллоидных растворов.
Коллоидные растворы белка достаточно устойчивы. Такая
стабильность белковых растворов обусловлена двумя основными
факторами. Во-первых, вокруг белка молекулы образуется плотная
гидратная оболочка и, во-вторых, белковая частица несет электрический заряд, что препятствует коагуляции (объединению) белковых
молекул и выпадению их в осадок.
Присутствие гидратной оболочки объясняется наличием на
поверхности белковых молекул большого количества гидрофильных
полярных групп, связывающих частицы воды. Наличие электрического заряда обусловлено способностью белковых молекул диссоциировать в водных растворах и образовывать ионы.
20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Белки, как и их структурные элементы – аминокислоты, благодаря присутствию способных к ионизации карбоксильных и
аминогруппы, присутствующих на концах белковой молекулы и в
боковых радикалах аминокислот, обладают электрическим зарядом –
положительным или отрицательным. Они проявляют свойства амфотерных электролитов, поэтому в кислой среде белки проявляют основные свойства и имеют суммарный положительный заряд; в щелочной среде белки проявляют кислотные свойства и несут отрицательный заряд.
+
H3 N
+H+
R
СООН
pH <7
+
H3 N
-H+
R
NH2
COO
R
COO
pH >7
Поскольку белки имеют различный аминокислотный состав,
то в зависимости от преобладания в молекуле белка дикарбоновых
аминокислот (глутаминовой, аспаргиновой) или диаминомонокарбоновых аминокислот (лизин, аргинин) водные растворы белков проявляют свойства слабых кислот или слабых оснований. Основная масса
природных белков (альбумины, глобулины) имеют кислый характер.
Схематично это можно изобразить следующим образом:
H3 N+
СОО
R
H3
N+
H 3N +
СОО
R
СОО
H 3N +
СОО
кислый белок
СОО
+
NH 3
основной белок
При добавлении кислоты к водному раствору белка его кислотная диссоциация понижается, основная же диссоциация повы21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
шается, наступает такой момент, когда кислотная диссоциация становиться равной основной. В этот момент общий заряд белковой молекулы становиться наименьшим, положительные и отрицательные
заряды уравнивают друг друга. При дальнейшем добавлении кислоты
кислотная диссоциация еще больше подавляется, и белок приобретает положительный заряд. Таким образом, происходит перезарядка
коллоидных частиц. При действии щелочей на раствор белка понижается основная и повышается кислотная диссоциация, белок заряжается отрицательно.
Такое значение рН, при котором частицы белка несут равное
количество положительных и отрицательных зарядов, а суммарный
заряд равен нулю (белок находится в изоэлектрическом состоянии),
называется изоэлектрической точкой (ИЭТ).
Заряженность молекулы белка является одним из факторов
его устойчивости в растворах, так как мешает слипанию белковых
частиц и выпадению их в осадок. В ИЭТ растворы белков неустойчивы, и белки легко выпадают в осадок, особенно в присутствии водоотнимающих веществ, которые оттягивают на себя гидратную оболочку.
Лабораторная работа 3
Определение изоэлектрической точки белка
Цель работы: Определить изоэлектрическую точку индивидуального белка.
Метод определения ИЭТ белка основан на способности растворенного белка (яичного альбумина или казеина) в ИЭТ переходить в неустойчивое состояние и выпадать в осадок, что проявляется
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
в помутнении раствора. При добавлении этилового спирта (водоотнимающего средства) процесс осаждения белка ускоряется.
Ход работы:
Для определения ИЭТ исследуемого белка в шести сухих
пронумерованных пробирках готовят буферные смеси с разным значением рН, нужные количества реактивов приведены в табл. 3.
Таблица 3. Изменение мутности раствора белка в зависимости от
значения рН среды
Состав буферной смеси (мл)
рН
Степень помутнения
без спирта
0,2М CH3COOH
0,2М CH3COONa
1,9
0,1
3,4
1,8
0,2
3,8
1,4
0,6
4,4
1,0
1,0
4,7
0,6
1,4
5,1
0,2
1,8
5,7
со спиртом
При смешении растворов в каждой пробирке устанавливается
определенное значение рН. В каждую пробирку добавляют по 20 капель 1% раствора белка (казеина или яичного альбумина). Смесь перемешивают и отмечают степень помутнения. В каждую пробирку
добавляют по 20 капель этилового спирта. Через 5 минут во всех
пробирках появляется осадок (помутнение), вновь оценивают степень
помутнения. Наибольшее количество осадка наблюдается в той пробирке, рН которой соответствует изоэлектрической точке данного
белка.
Результаты эксперимента вносят в табл. 3, отмечая степень
мутности раствора до и после добавления спирта по пятибалльной
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
шкале: 1 – отсутствие помутнения, 2 – слабое, 3 – умеренное, 4 –
сильное, 5 – очень сильное. По результатам таблицы строят график
зависимости изменения степени мутности раствора белка от рН среды, находят ИЭТ исследуемого белка и сравнивают полученный результат с литературными данными.
Тема 4 . УГЛЕВОДЫ. МОНОСАХАРИДЫ
Углеводами называют альдегиды и кетоны многоатомных
спиртов и полимерные молекулы на их основе. Углеводы составляют
три четверти биологического мира и являются основным компонентом клеточной стенки растений и микроорганизмов.
Первичный синтез углеводов осуществляется растениями из
углекислого газа и воды в процессе фотосинтеза. В растительном мире на их долю приходится 70-80% из расчета на сухое вещество, в
микробной клетке – около 60%.
Углеводы, являясь необходимой составной частью живой
клетки, выполняют важные функции – энергетическую, пластическую, опорную и др. Расщепление полисахаридов до моносахаридов
и дальнейшее их окисление в клетке выступает основным источником внутриклеточной энергии, необходимым для осуществления разнообразных физиологических функций живых организмов. В зависимости от сложности состава углеводы классифицируются на простые (моносахариды) и сложные (полисахариды).
Моносахариды – углеводы, которые не могут быть гидролизованы до более простых форм. Их подразделяют в зависимости от
числа атомов углерода в молекуле на: триозы (С3), тетрозы (С4), пентозы (С5), гексозы (С6) и т.д. В зависимости от присутствия альдегид-
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ной или кетонной группы моносахариды делят на альдозы и кетозы,
например:
моносахарид
альдоза
кетоза
С5
пентозы
рибоза
рибулоза
С6
гексозы
глюкоза
фруктоза
Структурно углеводы изображают тремя видами формул:
Фишера, Колли-Толленса и Хеуорса:
O
С H
H-C-OH
HO-C-H
H-C-OH
H-C-OH
CH 2 OH
α -D-глюкоза
(по Фишеру)
H
С
OH
СH 2 OH
H-C-OH
HO-C-H
O
O
OH
H-C-OH
H-C
CH 2 OH
OH
HO
HO
α -D-глюкоза
(по Колли-Толленсу)
α -D-глюкопираноза
(по Хеуорсу)
Моносахариды содержат асимметрические углеродные атомы. Многообразие моносахаридов в природе обусловлено наличием
оптических и стереоизомеров. Стереоизомерия углеводов, т.е. принадлежность к D- или L-ряду, определяется ориентацией гидроксильной группы при наиболее удаленным от карбонильной группы
асимметрическом углеродном атоме. В природе встречаются в основном изомеры D-ряда.
При замыкании молекулы моносахарида в кольцо (формула
Хеуорса) возникает дополнительный асимметрический центр и образуются два новых оптических изомера, α- и β-аномеры.
25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
H
С
H-C-OH
HO-C-H
H-C-OH
HO
H
OH
С
H-C-OH
HO-C-H
O
H-C-OH
H-C
СH 2OH
O
OH
OH
HO
O
H-C
HO
CH2 OH
СH 2OH
O OH
OH
HO
CH2 OH
HO
β−D-глюкоза
β−
α−D-глюкоза
α−
Гидроксил при вновь образовавшемся асимметрическом атоме углерода называют гликозидным, связь по гликозидному гидроксилу называется гликозидной. В случае если гликозидный гидроксил
расположен под плоскостью пиранового цикла, то данный изомер
называют α-аномером, если расположен над плоскость цикла, то βаномером.
Лабораторная работа 4
Качественные реакции на моносахариды
Цель работы: Освоить методы качественного анализа моносахаридов, доказать наличие фуранового или пиранового
цикла и восстанавливающих свойств моносахаридов.
4.1. Реакции на наличие фуранового или пиранового циклов.
4.1.1. Реакция Молиша с α-нафтолом
При взаимодействии пентоз и гексоз с концентрированной
серной кислотой образуются соответственно фурфурол или оксиметилфурфурол, которые с α- нафтолом дают бесцветное лейкосоеди-
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нение. Это лейкосоединение окисляется серной кислотой в окрашенное хиноидное соединение:
+H2 SO4
пентозы
O
С
O
-H 2 O
+H2SO4
гексозы
O
HO2HC
-H 2 O
O
С
OH
2
фурфурол
H
оксиметифурфурол
H
OH
HO
O H2SO4
С
+
[O]
H
O
-H 2 O
СН
α− нафтол
лейкосоединение
(бесцветное)
HO
O
O
хиноидное соединение
(красно-фиолетового цвета)
С
O
Ход работы:
В первую пробирку наливают 10 капель 1% раствора глюкозы, во вторую пробирку – 10 капель 1% раствор рибозы (или любой другой пентозы). В обе пробирки добавляют по 2 капли 10%
спиртового раствора α-нафтола и по стенке пробирки приливают 5
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
капель концентрированной серной кислоты. Серная кислота опускается на дно пробирки, и на границе двух жидкостей образуется кольцо красно-фиолетового цвета.
4.1.2. Реакция Селиванова (на кетогексозы)
При нагревании с соляной кислотой кетогексозы превращаются в оксиметилфурфурол, который с резорцином образует соединения красного цвета. С альдогексозами эта реакция протекает очень
медленно, что обусловливает специфичность реакции Селиванова на
кетогексозы.
OH
2
OН
HO
O
+
OH
С
H
O
HO
резорцин
HO
OH
СН
O
O
[O]
-H 2 O
HO
лейкосоединение
(бесцветное)
OH
СН
O
хиноидное соединение
(красного цвета)
Ход работы:
В две пробирки наливают по 20 капель реактива Селиванова
(раствор резорцина в соляной кислоте), в первую пробирку прибавляют 2 капли 1% раствора фруктозы, во вторую пробирку – 2 капли
1% раствора глюкозы, обе пробирки нагревают на кипящей водяной
28
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
бане. В первой пробирке с фруктозой появляется красное окрашивание, обусловленное образованием окрашенного хиноидного соединения. Во второй пробирке с глюкозой красного окрашивания не образуется.
4.2. Реакции на восстанавливающие свойства моносахаридов
Все моносахариды, имеющие свободную карбонильную
группу (альдо- или кето-группу), обладают способностью в щелочной среде при нагревании восстанавливать окисные формы металлов
в закисные или даже до свободного состояния. Моносахариды при
этом образуют соответствующие альдоновые кислоты.
4.2.1. Реакция Фелинга
Данная реакция наиболее часто используется для доказательства восстанавливающих свойств сахаров, она заключается в восстановлении моносахаридами гидроксида меди (II) в закись меди (I).
При проведении реакции используется реактив Фелинга, представляющий собой смесь сульфата меди с сегнетовой солью (калий, натрий виннокислый) в щелочной среде. При смешивании сульфата меди со щелочью происходит реакция.
CuSO4 + 2NaOH → Cu(OH)2 ↓ + Na2SO4
В присутствии сегнетовой соли выделившийся гидроксид меди (II) не выпадает в осадок благодаря комплексообразования с последней. Ионы меди (II) восстанавливаются в присутствии моносахаридов с образованием закисной меди (I). При этом альдегидная или
кето-группа моносахарида окисляется до карбоксильной группы.
29
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
O
С OH
H-C-OH
O
С H
H-C-OH
HO-C-H
+
H-C-OH
H-C-OH
CH 2 OH
COOK
COOK
+2H 2O
CHO
HO-C-H + H-C-OH + Cu 2O
Cu
CHO
H-C-OH H-C-OH
COONa
H-C-OH
COONa
CH 2 OH
глюкоза
глюконовая кислота
Ход работы:
В первую пробирку наливают 10 капель 1% раствора глюкозы, во вторую пробирку – 10 капель 1% раствора сахарозы. В обе
пробирки приливают равный объем реактива Фелинга (смесь растворов Фелинг I и Фелинг II), и нагревают на кипящей водяной бане. По
образовавшемуся оранжевому осадку в первой пробирке судят о присутствии свободной альдегидной группы в глюкозе. Во второй пробирке оранжевый осадок не выпадает, так как сахароза (дисахарид)
не содержит свободной альдегидной группы.
4.2.2. Реакция Мульдера (на восстановление индиго)
Качественная реакция Мульдера основана на способности
моносахаридов восстанавливать (обесцвечивать) индиго синее.
O
С H
H-C-OH
HO-C-H
O
С OH
H-C-OH
O O
HO-C-H
++
H-C-OH
H-C-OH
CH 2OH
N
H
+
H-C-OH
N
H
H-C-OH
CH 2OH
индиго синее
30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
O O
HO OH
[O]
+
+
N
H
N
H
N
H
индиго бесцветное
N
H
индиго синее
Ход работы:
В пробирку наливают 2 мл 1% раствора глюкозы, прибавляют
4-5 капель раствора питьевой соды, 2 капли раствора индиго синего и
нагревают, при этом происходит восстановление индиго синего и образуется индиго бесцветное. Если жидкость охладить и взболтать, то
вновь появляется синее окрашивание, так как индиго бесцветное
окисляется кислородом воздуха.
Тема 5. ОЛИГОСАХАРИДЫ. ПОЛИСАХАРИДЫ
Сложные углеводы или полисахариды подразделяются на
низкомолекулярные – сахароподобные или олигосахариды, и высокомолекулярные – несахароподобные.
Углеводы
Моносахариды
Полисахариды
Дисахариды
C12H22O11
Олигосахариды
Cx(H2O)y
Запасные полисахариды
Несахароподобные углеводы
Cx(H2O)y
Структурные полисахариды
крахмал
целлюлоза, гемицеллоза, пектин
хитин, муреин
гликоген
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Олигосахариды (от греч. «олигос» – немногий) – вещества,
образованные из нескольких остатков молекул моносахаридов (от 2
до 10). В зависимости от числа моносахаридов, входящих в молекулы олигосахаридов, последние делят на дисахариды, трисахариды и
т.д. Широко распространенной группой являются дисахариды, которые состоят из остатков двух моносахаридов, соединенных между
собой гликозидной связью, т.е. по гликозидному гидроксилу.
Вторая молекула моносахарида участвует в образовании связи двумя путями: 1) по спиртовому гидроксилу. В этом случае гликозидный гидроксил (на схеме он подчеркнут) в молекуле дисахарида
остается свободным, благодаря чему эти дисахариды обладают восстанавливающими свойствами (мальтоза, целлобиоза).
СH2OH
O
OH
HO
СH2OH
O
О
OH
OH
О
HO
OH
HO
HO
HO
HO
СH2OH
O OH
СH2OH
O
OH
мальтоза
целлобиоза
2) по гликозидному гидроксилу. В этом случае в молекуле дисахарида нет свободного гликозидного гидроксила, вследствие чего
он лишен восстанавливающих свойств (сахароза, трегалоза) и не может восстанавливать в щелочной среде окисные формы металлов в
закисные.
СH2OH
O
OH
HO
HO
СH2OH
O
CH2OH
O
HO
O
CH2OH
OH
HOCH2
O
О
HO
HO
HO
трегалоза
сахароза
32
HO
OH
OH
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Лабораторная работа 5
Дисахариды
Цель работы: Определить с помощью реакции Фелинга наличие
или отсутствие восстанавливающих свойств дисахаридов.
Мальтоза содержит свободный гликозидный гидроксил и обладает восстанавливающими свойствами, сахароза не содержит свободного гликозидного гидроксила и не обладает восстанавливающими свойствами.
Ход работы:
В первую пробирку наливают 20 капель 2% раствора сахарозы, во вторую пробирку – 20 капель 2% раствора мальтозы. В обе
пробирки в равных объёмах добавляют реактив Фелинга (смесь растворов Фелинг I и II) и нагревают смесь на кипящей водяной бане. В
первой пробирке с сахарозой не наблюдается восстановление гидроокиси меди (II) в закись меди (I), во второй пробирке с мальтозой,
обладающей восстанавливающими свойствами, наблюдается образование закиси меди (осадок оранжевого цвета).
Лабораторная работа 6
Кислотный гидролиз крахмала
Несахароподобные полисахариды подразделяются на запасные полисахариды (крахмал, гликоген) и структурные полисахариды
(целлюлоза, гемицеллюлоза, пектины). Молекулярная масса полисахаридов велика, в их состав входят остатки сотен и тысяч моносахаридов. Полисахариды содержат один свободный гликозидный гидро-
33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ксил на большое число связанных молекул моносахарида, поэтому
практически не проявляют восстанавливающих свойств.
Крахмал – химически неоднородное вещество. Его образуют молекулы двух типов: амилоза и амилопектин. Амилоза представляет собой неразветвленный полимер, который состоит из остатков α-D-глюкопиранозы (от 1000 до 4000), соединенных α(1→4)гликозидными связями.
Амилопектин – разветвленный полимер, который также состоит из остатков α-D-глюкопиранозы.
СH 2OH
O
OH
... O
связь α (1-6)
HO
О
СН 2
НОСH 2
OH
О
... O
HO
СH 2OH
O
O
O
OH
OH
O
HO
n
O ...
HO
амилопектин
В пределах каждой цепи гликозидные остатки соединены
α(1→4)-гликозидными связями; между собой углеводные цепи соединены посредством α (1→6)-гликозидных связей.
В воде крахмал растворяется с трудом, раствором йода окрашивается в фиолетовый цвет в результате образования комплексных
и адсорбционных соединений. Под действием фермента амилазы
крахмал расщепляется с образованием, в конечном счете, дисахарида
34
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
– мальтозы. При кипячении с кислотами крахмал гидролизуется до
моносахарида – глюкозы.
При гидролизе крахмала в качестве промежуточных продуктов образуются полисахариды разной молекулярной массы.
Крахмал
(с йодом окрашивание темно-синее)
Амилодекстрины
(с йодом окрашивание синее)
Эритродекстрины
(с йодом окрашивание красно-бурое)
Флаводекстрины
(с йодом окрашивание желтое)
Мальтодекстрины
(с йодом окрашивания не дает, цвет раствора йода)
Мальтоза
Глюкоза
(дает положительную реакцию с раствором Фелинга)
(дает положительную реакцию с раствором Фелинга)
На первых стадиях гидролиза получаются декстрины, мало
отличающиеся от крахмала по размерам молекулы и по свойствам. С
раствором йода они дают темно-синюю окраску (амилодекстрины).
По мере дальнейшего гидролиза молекулярная масса декстринов понижается, с раствором йода они окрашиваются в красно-бурый цвет
(эритродекстрины), желтый (флаводекстрины) и, наконец, перестают
давать реакцию с йодом (ахродекстрины и мальтодекстрины).
Схему гидролитического расщепления крахмала и изменение
окраски йодной пробы при этом можно представить следующим образом:
35
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Цель работы: Провести кислотный гидролиз крахмала и проанализировать продукты гидролиза.
Ход работы:
В большую пробирку наливают 5 мл 1% крахмального клейстера, прибавляют 2-3 мл 40% раствора серной кислоты, смесь перемешивают и ставят на кипящую водяную баню. Через каждые 2 мин
отбирают из пробирки по 10 капель гидролизата, переносят в чистые
пробирки и прибавляют в каждую малыми порциями сухой бикарбонат натрия для нейтрализации серной кислоты (до прекращения
выделения пузырьков). К нейтрализованным пробам добавляют по
несколько капель раствора йода. Пробы гидролизата отбирают до тех
пор, пока желтая окраска йода будет изменяться. Пробирки в порядке
взятых проб сохраняют в штативе.
По окончании гидролиза проводят реакцию с раствором Фелинга для обнаружения продуктов гидролиза – восстанавливающих
сахаров (глюкозы, мальтозы). Для этого оставшийся гидролизат
(около 10 капель) нейтрализуют бикарбонатом натрия, добавляют
равный объём реактива Фелинга и нагревают раствор на кипящей водяной бане. Йодную пробу проводят также с негидролизованным
крахмалом. Записывают полученные наблюдения и делают выводы о
характере продуктов кислотного гидролиза.
Тема 6. ФЕРМЕНТЫ
Ферментами называются биологические катализаторы белковой природы, ускоряющие течение химических реакций обмена ве36
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ществ в организме и синтезирующиеся клетками организма. По своей
природе ферменты являются простыми или сложными белками.
Сложные ферменты состоят из белковой части, называемой апоферментом, и низкомолекулярного (небелкового) компонента, который
называется простетической группой или коферментом. Ни кофермент, ни белковая часть в отдельности не активны. Ферментативное
действие оказывает только фермент в целом. Многие коферменты
являются производными витаминов и участвуют в формировании
«активного центра» фермента, который определяет каталитическую
активность фермента.
Как белковые вещества, ферменты теряют активность при
температурах денатурация белка. Для каждого фермента существует
оптимальная область значений рН, в которой он наиболее активен.
Важным свойством ферментов является специфичность действия,
они способны катализировать строго определенные реакции. Действие ферментов может усиливаться веществами, которые называются
активаторами (соли, ионы некоторых металлов и др.); и тормозится
ингибиторами.
Все ферменты подразделяются по типам катализируемых реакций на 6 классов:
1) оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции;
2) трансферазы – осуществляют межмолекулярный перенос различных функциональных групп;
3) гидролазы – расщепляют внутримолекулярные связи гидролитическим путем;
4) лиазы (синтазы) – катализируют реакции негидролитического
распада веществ или присоединения групп по двойным связям и отщепления групп по двойным связям;
37
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5) изомеразы – участвуют в реакциях изомеризации;
6) лигазы (синтетазы) – ускоряют реакции синтеза, сопряженного с
расходованием АТФ.
Каждый из названных классов, в свою очередь, делится на
подклассы и подподклассы, которые детализируют природу реакции.
Поэтому каждому ферменту соответствует свой шифр.
Наряду с вышеназванной номенклатурой существует номенклатура, по которой название ферментов слагается из названия субстрата, названия катализируемой реакции и окончания «аза». Например, фермент катализирующий гидролиз амилозы называется амилазой, мальтозы – мальтазой. Часто используются и тривиальные названия ферментов.
Лабораторная работа 7
Влияние температуры на активность β -фруктофуранозидазы
Любая химическая реакция зависит от температуры. С повышением температуры на 100С скорость реакции возрастает в 2-3 раза.
Для ферментативных реакций такое увеличение скорости характерно
лишь в узком температурном интервале. Температура, при которой
наблюдается максимальная скорость реакции, называется оптимальной. Низкая температура снижает активность, а высокая температура
увеличивает активность ферментов от минимальной до оптимальной.
Чаще всего оптимальная температура лежит в области 37-400С. Высокие температуры (для большинства ферментов выше 500С) ингибируют ферменты, вызывая денатурацию белковой молекулы.
Цель работы: Определить оптимальную температуру действия фермента β-фруктофуранозидазы (КФ 3.2.1.26; сахараза,
инвертаза) на сахарозу.
38
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Фермент β-фруктофуранозидаза вызывает гидролитическое
расщепление сахарозы (дисахарида) на глюкозу и фруктозу по уравнению:
C12H22O11 + H2O → 2C6H12O6
СH2OH
O
CH2OH
O
OH
O
HO
OH
HO
СH2OH
O
+H2O
OH
HO
OH
сахароза
O
HO
+
OH
HO
CH2OH
HOH2C
α−D
α− глюкоза
HO
CH2OH
OH
β−D
β− -фруктоза
Ход работы:
Фермент β-фрукутофуранозидазу обычно получают из дрожжей или плесневых грибов.
Приготовление ферментного препарата. 2 г прессованных
пекарских дрожжей растирают в течение 20 минут с кварцевым песком или толченым стеклом и 5 мл фосфатного буфера (рН 6,98). Добавляют 20 мл фосфатного буфера, нагретого до 600С, сахараза переходит при этом в раствор. Спустя 30 минут раствор с ферментным
препаратом фильтруют через складчатый бумажный фильтр.
Определение активности β-фруктофуранозидазы. В четыре
пронумерованные пробирки наливают по 10 капель сахаразы. Первую пробирку с ферментным препаратом ставят в сосуд со снегом
или толченым льдом, вторую пробирку оставляют при комнатной
температуре, третью пробирку ставят в водяную баню, нагретую до
+350С, четвертую пробирку выдерживают на кипящей водяной бане.
Через 10 минут во все пробирки при соблюдении заданных
температурных режимах добавляют по 20 капель 1% раствора саха39
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
розы и перемешивают. Спустя 15 минут во все пробирки приливают
по 1 мл Фелинговой жидкости и все четыре пробирки помещают в
кипящую водяную баню на 5 минут. По количеству выпавшего
оранжево-красного осадка закиси меди судят о влиянии температуры
на активность β-фруктофуранозидазы. Активность оценивают в баллах и определяют оптимальную температуру данного ферментного
препарата.
Лабораторная работа 8
Влияние активаторов и ингибиторов на активность α-амилазы
слюны (КФ 3.2.1.1.)
Большое влияние на активность ферментов оказывают активаторы и ингибиторы – ионы металлов или органические вещества,
иногда довольно сложного состава. В роли активаторов ферментов
часто выступают различные микроэлементы и водорастворимые витамины – незаменимые факторы питания.
Различают обратимое и необратимое ингибирование ферментов. Многие ингибиторы необратимо связываются с ферментами,
изменяя их структуру. Этим объясняется токсичное действие ионов
металлов: Нg+2, Ag+ , Pb+2.
Обратимое ингибирование может быть конкурентным и неконкурентным. Конкурентное ингибирование наблюдается, когда
ингибитор и субстрат имеют сходные структуры и конкурируют за
активный центр фермента. Увеличение концентрации субстрата устраняет действие конкурентного ингибитора. Неконкурентные ингибиторы не имеют структурного сходства с субстратом. Они оказывают ингибирующее действие, присоединяясь по отличному от актив-
40
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ного центра месту. Действие неконкурентных ингибиторов нельзя
устранить путем увеличения концентрации субстрата.
Так, например, сульфамидные препараты являются конкурентными ингибиторами. В качестве неконкурентных ингибиторов
ферментов выступают такие соединения, как соли синильной кислоты, пенициллиновые препараты, гербициды, инсектициды и др.
Цель работы: Определить действие хлорида натрия и сульфата меди
на активность фермента α-амилазы.
Ферментативный гидролиз протекает значительно быстрее в
сравнении с гидролизом под действием кислот или щелочей.
Ход работы:
Получение ферментного препарата амилазы слюны. Ополаскивают рот водой, затем набирают 10-20 мл дистиллированной воды,
выдерживают во рту 2-3 мин, сливают в стакан.
В первую пробирку наливают 2 капли 1% раствора хлорида
натрия, во вторую пробирку – 2 капли 1% раствора сульфата меди, в
третью пробирку – 2 капли воды. Во все три пробирки добавляют по
10 капель
раствора α-амилазы слюны. Затем в каждую пробирку
приливают по 5 капель 0,5% раствора крахмала, перемешивают и
оставляют пробирки в штативе при комнатной температуре.
Из всех пробирок отбирают пробы гидролизата через каждые
30 секунд по 1 капле и наносят на предметное стекло. К капле гидролизата добавляют по 1 капле раствора йода и наблюдают изменение
окраски раствора йода в зависимости от степени гидролиза крахмала. Отбор проб повторяют до тех пор, пока цвет пробы из третьей
пробирки не будет иметь цвет раствора йода.
41
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Проба из первой пробирки, где ионы хлора играют роль активатора фермента, достаточно быстро становится желтого цвета (цвета
йода). Изменение цвета пробы в третьей пробирке протекает медленнее в сравнении с первой. Проба из второй пробирки, где ионы
меди оказывают ингибирующее действие, остается фиолетового цвета.
Полученные наблюдения записывают и делают выводы о характере влияния хлорида натрия и сульфата меди на активность ферментного препарата α-амилазы.
42
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Часть II. Микробиологический практикум
Тема 7. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Биологические микроскопы применяются для рассмотрения
прозрачных препаратов в проходящем свете при увеличении от 56 до
1350 раз. Наиболее распространенными являются микроскопы МБР,
МБИ «Биолам» (рис. 2). Микроскоп состоит из оптической и механической части.
Рис. 2. Биологический микроскоп МБР-1:
1 – зеркало;
2 – конденсор;
3 – предметный столик;
4 – объектив;
5 –револьвер;
6 – окуляр;
7 – тубус;
8 – тубусодержатель;
9 – винт перемещения предметного столика;
10 – макрометрический винт;
11 – микрометрический винт;
12 – основание штатива .
Механическая часть микроскопа включает штатив, предметный столик, тубус с револьверной головкой, макро- и микрометрические винты. Нижняя часть штатива является опорой микроскопа,
верхняя – тубусодержателем. В верхней части тубусодержателя находится вращающийся вокруг своей оси револьвер, в который ввин43
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
чиваются 3-4 объектива. При вращении револьверной системы любой
объектив можно подвести под тубус. Центровка объектива фиксируется защелкивающейся пружиной.
Тубусодержатель вместе с тубусом можно перемещать по
вертикали с помощью макро- и микрометрических винтов. Макрометрический винт используют для грубой фокусировки, один его
оборот перемещает тубус на 20 мм. Микрометрический винт предназначен для тонкой фокусировки, полный оборот его перемещает тубус на 0,1 мм.
Предметный столик имеет в центре отверстие для прохождения
лучей света, освещающих препарат.
Оптическая часть включает осветительный аппарат, объектив и окуляр. Осветительный аппарат предназначен для равномерного освещения поля зрения и состоит из зеркала и конденсора с ирисовой диафрагмой. Двустороннее зеркало (вогнутое с одной и плоское
с другой стороны) устанавливается в любой плоскости. Оно направляет пучок параллельных лучей, идущих от осветителя, в конденсор.
Вогнутой стороной зеркала пользуются при работе без конденсора
(она фокусирует лучи), с низкоапертурным объективом при искусственном освещении. При работе с конденсором пользуются плоской
стороной зеркала.
Над зеркалом расположен конденсор, он концентрирует параллельные лучи, идущие от источника света, и отраженные зеркалом, в одной точке, фокусе, которой должен находиться в плоскости
препарата. Конденсор представляет собой оптическую систему линз.
44
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ход лучей от источника света через линзы конденсора к исследуемому объекту представлен на рис. 3.
Рис. 3. Ход лучей от источника света к объекту:
1 – лучи света;
2 – зеркало;
3 – конденсор;
4 – предметный столик;
5 – предметное стекло;
6 – объект
Линзы конденсора вместе с ирисовой диафрагмой вмонтированы в цилиндрическую оправу. Ирисовая диафрагма помещается
под нижней линзой и состоит из ряда подвижных серповидных пластин. Расширяя и сужая диафрагмы, задерживают излишние лучи
света и улучшают контрастность изображения. Прикрывают ирисовую диафрагму при работе с неокрашенными препаратами.
Объектив является наиболее важной частью микроскопа, он
определяет разрешающую способность и качество изображения. Он
дает действительное увеличенное и обратное изображение изучаемого объекта. Объектив состоит из системы линз, самая главная из них
– наружная (фронтальная), обращенная к препарату. Это основная и
единственная линза в объективе, дающая увеличение. Чем больше
кривизна фронтальной линзы, тем короче фокусное расстояние и тем
45
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
больше увеличение объектива и, следовательно, тем ниже необходимо опускать объектив над поверхностью препарата. Увеличение объектива обозначено на его оправе. Микроскоп «Биолам» имеет три
объектива, увеличивающие в 8, 40 (сухие) и 90 (иммерсионный) раз.
Выше фронтальной линзы в объективе расположены коррекционные линзы. Коррекционные линзы предназначены для устранения погрешностей и получения более четкого изображения.
Окуляр микроскопа состоит из двух линз: глазной (верхней) и
собирательной (нижней). Назначение окуляра состоит в увеличении
того изображения, которое дает объектив. Увеличение окуляра указано на оправе, например, 15× или 10×.
Основные характеристики микроскопа
Увеличение и разрешающая способность. Общее увеличение,
которое дает микроскоп, определяется произведением увеличения
объектива на увеличение окуляра. Однако увеличение не характеризует четкость получаемого изображения. Четкость получаемого изображения характеризуется разрешающей способностью микроскопа
(D). Разрешающая способность микроскопа определяется как минимальное (разрешающее) расстояние (d) между двумя точками (или
тончайшими штрихами), видимыми раздельно, и вычисляется по
формуле
D = 1/d ;
d = λ /(A1+ A2),
где d – минимальное (разрешающее) расстояние между двумя точками;
λ – длина волны используемого света;
А1 и А2 – числовая апертура, соответственно объектива и конденсора.
46
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Числовая апертура («охват линзы») определяется по формуле
А = n · sin u,
где u – половина отверстного угла α-лучей, входящих в объектив
(рис. 4);
n – показатель преломления среды, граничащей с линзой.
Рис. 4. Схема хода лучей при
разрешающей величине
угла u:
А – объект;
О – объектив;
α – отверстный угол;
u – половина отверстного угла.
Разрешающая способность микроскопа – величина,
обратная разрешающему расстоянию. Чем меньше абсолютная величина d, тем меньшей величины объект можно увидеть, тем выше разрешающая способность микроскопа D. Световой микроскоп при освещении видимым светом имеет разрешающую способность около
0,2 мкм. Увеличить разрешающую способность (т.е. уменьшить абсолютную величину d) можно следующим образом: освещать объект
светом с более короткой длиной волны λ, например, ультрафиолетовым, использовать объективы с большей апертурой А1 или повышать
апертуру конденсора А2.
Числовая апертура любой линзы, граничащей с воздухом (т.е.
«сухой системы»), не может превысить 1, так как показатель пре-
47
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ломления воздуха равен 1, а угол u не может быть более 900, поэтому
sin u ≤1 (рис 5).
Рис. 5. Ход лучей в сухой и иммерсионной система:
I-V – лучи света
Числовую апертуру можно повысить, если увеличить показатель преломления среды, находящейся между фронтальной линзой
объектива и предметным стеклом, приблизив его к показателю преломления стекла (n =1,5). Для этого между фронтальной линзой объектива и исследуемым объектом помещают каплю жидкости с показателем преломления большим, чем показатель преломления воздуха, например, каплю воды (n=1,3), глицерина (n=1,4) или иммерсионного масла (n~1,5). Числовое значение апертуры объектива указано
на его оправе. Объективы микроскопа 8× и 40× имеют апертуру соответственно 0,20 и 0,65. У масляного (иммерсионного объектива) с
увеличением 90× апертура – 1,25.
Числовая апертура конденсора должна соответствовать числовой апертуре объектива. Когда она меньше апертуры объектива,
последняя будет использована не полностью, и разрешающая способность снизится. Если апертура конденсора больше апертуры объ48
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ектива, что, в частности, бывает при работе с сухими системами, то
необходимо несколько прикрыть ирисовую диафрагму конденсора.
Это приведет к устранению рассеивания света и позволит достичь
нужной контрастности изображения.
Лабораторная работа 9
Светопольный микроскоп и правила работы с ним
Цель работы: Ознакомиться с устройством светопольного микроскопа и правилами работы с ним. Настроить микроскоп
по Кёлеру. Просмотреть демонстрационные препараты различных микробных культур с сухими объективами 8×, 40× и объективом 90× в иммерсионной системе. Зарисовать микрокартину.
Ход работы:
Установка света по Кёлеру.
1. Поднять тубус с помощью макрометрического винта вверх.
2. Установить объектив 8×.
3. Поднять конденсор вверх до упора.
4. Открыть полностью диафрагму конденсора и отодвинуть матовое
стекло, расположенное под конденсором.
5. Поставить плоское зеркало.
6. Включить осветитель, и поймать с помощью плоского зеркала зайчик, глядя в окуляр.
7. Глядя на световое пятно на листе бумаги, расположенном на
предметном столике, добиться изображения четких краев светового пятна, поднимая или опуская конденсор.
8. Приступить к микроскопированию.
49
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Правила работы с сухими объективами
Приготовленный препарат помещают на предметный столик,
при этом нужный для исследования участок препарата устанавливают в центре поля зрения. Объектив 8× опускают с помощью макрометрического винта так, чтобы расстояние до препарата было около
8 мм. Глядя в окуляр, медленно вращая макрометрический винт,
поднимают тубус до появления контуров препарата. Осторожно вращая микрометрический винт, осуществляют тонкую фокусировку
изображения. Просматривают несколько полей зрения.
Затем поднимают тубус и, вращая револьвер, заменяют объектив с увеличением 8× на 40×. Наблюдая сбоку, с помощью макрометрического винта опускают тубус с объективом почти до соприкосновения с препаратом. Глядя в окуляр, медленно поднимают тубус до появления контуров препарата, а микрометрическим винтом
уточняют фокус.
Правила работы с иммерсионным объективом
Поднимают тубус микроскопа вверх, поворачивают револьвер и устанавливают объектив с увеличением 90×. На сухой фиксированный препарат наносят каплю иммерсионного масла. Глядя сбоку, осторожно опускают с помощью макрометрического винта объектив в масло до полного погружения. Это нужно делать осторожно,
чтобы фронтальная линза не сместилась и не получила повреждений.
Смотрят в окуляр, очень медленно вращают макрометрический винт
на себя, не отрывая объектив от масла, приподнимают тубус микроскопа до появления контуров объекта. Точную фокусировку производят микрометрическим винтом.
По окончании работы с иммерсионным объективом поднимают тубус, снимают препарат и осторожно протирают фронтальную
50
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
линзу объектива сначала сухой салфеткой, затем салфеткой, слегка
смоченной в толуоле.
Тема 8. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
Для просмотра микроорганизмов в оптических микроскопах
готовят препараты живых и фиксированных (убитых) клеток. Препараты готовят на предметных стеклах толщиной не более 1,2-1,4 мм.
Более толстые стекла нарушают фокусировку конденсора и снижают
четкость изображения. Покровные стекла имеют толщину не более
0,15-0,17 мм. Покровные стекла с большей толщиной ухудшают качество изображения. Предметные и покровные стекла должны быть
чистыми и тщательно обезжиренными, что особенно важно при приготовлении фиксированных препаратов. Для проверки чистоты на
поверхность стекла наносится капля вода, она должна равномерно
расплываться по стеклу и не собираться в выпуклые, медленно высыхающие пузырьки. Наиболее надежный способ обезжиривания –
обработка стекол хромовой смесью с последующим ополаскиванием
водой и спиртом. В повседневной работе для удаления жира предметные стекла натирают кусочком сухого мыла, после чего вытирают
чистой хлопчатобумажной салфеткой. Хранят чистые предметные
стекла в жидкости Никифорова (спиртово-эфирная смесь 1:1). Покровные стекла также должны быть хорошо вымыты и высушены.
Отбор культур для исследования
Микроорганизмы в лабораторных условиях выращивают в
пробирках, колбах, чашках Петри на плотных и жидких питательных
средах. Для отбора клеток из жидкой среды используют стерильные
51
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
бактериологические петли или пипетки. Микроорганизмы, выросшие
на плотной среде, извлекают бактериологическими петлями.
При отборе следуют соблюдать следующие правила, предохраняющие культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами:
1. Зажигают спиртовку.
2. Пробирку с исходной культурой помещают в левую руку и держат
в наклоненном состоянии между большим и указательным пальцами. Если культура выращена на плотной среде, поверхность с
налетом микроорганизмов должна быть обращена вверх и хорошо
видна.
3. Бактериологическую петлю держат вертикально в пламени спиртовки и прокаливают докрасна, затем наклоняют и обжигают
часть держателя.
4. Мизинцем и безымянным пальцем левой руки прижимают к ладони наружную часть ватной пробки, вынимают ее из пробирки и
держат в таком положении, не касаясь окружающих предметов.
5. Края открытой пробирки обжигают в пламени спиртовки.
6. Осторожно вводят стерильную петлю в пробирку с культурой.
Чтобы не повредить клетки на плотной среде, петлю вначале охлаждают, прикоснувшись к внутренней поверхности пробирки.
Легким скользящим движением отбирают небольшое количество
микробной массы или каплю жидкости с клетками. Осторожно
вынимают петлю, не касаясь стенок или краев пробирки.
7. Вновь обжигают края пробирки и внутренний конец ватной пробки в пламени спиртовки и закрывают пробирку.
8. Пробирку ставят в штатив, а извлеченный материал используют
для приготовления препарата.
52
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
9. Клетки микроорганизмов, оставшиеся на бактериологической петле, сжигают в пламени спиртовки.
Лабораторная работа 10
Приготовление препаратов живых и фиксированных микроорганизмов
Цель работы: Приготовить препараты живых клеток микроорганизмов «висячая капля» и «раздавленная капля». Просмотреть их в разных полях зрения (с сухими объективами 8×, 40×) и зарисовать.
Приготовить фиксированные препараты микроорганизмов,
окрасить препараты фуксином или метиленовым синим. Просмотреть
препарат с применением иммерсионной системы (объектив на 90×).
Ход работы:
Препараты живых клеток
Микроорганизмы в живом состоянии рассматривают в препаратах «раздавленная капля», «висячая капля» и «отпечаток», применяя сухие системы объективов микроскопа. Препарат «раздавленная капля» используют для установления формы клеток микроорганизмов, их размеров и взаимного расположения, способа спорообразования.
Приготовление препарата «раздавленная капля»
На сухое обезжиренной стекло наносят небольшую каплю воды, бульона или физиологического раствора (0,9 % раствора хлорида
натрия). В нее вносят петлей культуру, отобранную с плотной среды,
или другой исследуемый материал (дрожжи, диффузионный сок),
53
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
размешивают до получения слабо мутной суспензии. Покровное
стекло ставят на ребро у края капли с микроорганизмами и постепенно опускают, стараясь, чтобы между стеклами не образовались пузырьки воздуха, мешающие микроскопированию. Стеклянным концом бактериологической петли прижимают покровное стекло к
предметному. Излишек жидкости, выступающий за края покровного
стекла, удаляют полоской фильтровальной бумаги. Приготовленный
препарат сразу же исследуют, так как жидкость быстро высыхает, что
затрудняет микроскопирование.
Окрашивание живых клеток
Для выявления некоторых функциональных особенностей и
дифференциации включений живых клеток применяют прижизненную окраску микроорганизмов. Ввиду токсичности красителей живые клетки окрашивают нейтральным красным, нейтральным фиолетовым, метиленовым синим, фуксином и др. в очень небольших концентрациях (0,001- 0,0001%). При приготовлении препарата «раздавленная капля» на предметном стекле каплю исследуемых микроорганизмов смешивают с каплей красителя, накрывают покровным стеклом и через 3 минуты микроскопируют.
Препарат «висячая капля» используется для выявления подвижности микроорганизмов, для наблюдения за размножением, образованием, прорастанием спор и выявления воздействия химических
веществ на жизнедеятельность микроорганизмов.
Приготовление препарата «висячая капля»
Для приготовления препарата используют предметные стекла
с круглым отшлифованным углублением – лункой. Края лунки смазывают вазелином. На середину обезжиренного покровного стекла
наносят маленькую каплю суспензии микроорганизмов, переворачи54
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
вают его каплей вниз и осторожно прижимают к вазелиновому кольцу. Капля должна располагаться в центре лунки, не касаться ее краев
и дна. В таком препарате капля подвешена к внутренней поверхности
покровного стекла и находится в герметически закрытой камере. Это
позволяет ее в течение нескольких дней изучать, наблюдать рост и
размножение микроорганизмов.
Препарат «отпечаток» готовят для изучения естественного
расположения в колонии клеток мицелиальных грибов.
Препараты фиксированных клеток
Фиксированные окрашенные препараты используются для
выявления ряда морфологических особенностей, количественного
учета микроорганизмов, а также для проверки чистоты культуры.
Эти препараты удобны и тем, что могут храниться долгое время.
Приготовление окрашенных фиксированных препаратов состоит из
следующих этапов: приготовление мазка, высушивание, фиксация и
окраска мазка.
Приготовление мазка. На обезжиренное предметное стекло
наносят исследуемый материал, как для препарата «раздавленная капля» и равномерно распределяют его петлей или краем другого пришлифованного предметного стекла на площадь 1-2 см2 в виде тонкого ровного слоя.
Высушивание мазка. Препарат высушивают при комнатной
температуре. Тонкий мазок сохнет очень быстро. Если высушивание
протекает медленно, препарат мазком вверх высоко поднимают над
пламенем спиртовки и осторожно сушат в теплом восходящем потоке воздухе без перегрева стекла, иначе клетки могут деформироваться.
55
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Фиксация преследует несколько целей: умертвить клетки
микроорганизмов и сделать их более безопасными, что особенно
важно при работе с патогенными культурами; плотно прикрепить
клетки к стеклу и тем самым предохранить препарат от смывания;
сделать мазок более восприимчивым к окраске, поскольку мертвые
клетки более проницаемы для красителей.
Наиболее распространенный способ фиксации является термическая обработка. Для этого препарат мазком вверх 3-4 раз проводят через наиболее горячую часть пламени спиртовки. Более длительная термическая фиксация может изменить структуру микробных клеток и их форму. Недостаточно хорошо зафиксированный мазок смывается со стекла при последующей обработки мазка. Можно
фиксировать мазок с помощью химических веществ, например, 96%
этилового спирта. Фиксатор наливают непосредственно на мазок,
выдерживают 15-20 минут и осторожно промывают водой.
Окрашивание. Различают простые, сложные и дифференциальные способы окрашивания микроорганизмов. При простой окраске чаще используют один краситель и прокрашивают всю клетку.
Это дает возможность четко определить формы и размеры клеток.
Сложное окрашивание предусматривает применение двух или нескольких красителей, например диагностическое определение прокариотических микроорганизмов к окраске по Граму. Дифференциальное окрашивание основано на индивидуальном отношении биологических культур к различным красителям (окраска спор, оболочек, ядра).
Отмытый от фиксатора мазок устанавливают на край ванночки и наливают на него раствор красителя. Длительность окрашивания
различна: для фуксина – 1-2 минуты, метиленового синего – 3-5 минут. По окончании окрашивания препарат промывают до тех пор, по56
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ка стекающая вода не станет почти неокрашенной. Препарат высушивают на воздухе. Микроскопируют окрашенный мазок с применением иммерсионного объектива 90×. В тщательно приготовленном и
правильно окрашенном препарате поле зрения остается неокрашенным, окрашиваются только клетки микроорганизмов.
Тема 9. ОКРАШИВАНИЕ МИКРОБОВ ПО ГРАМУ
В основе деления микробов на грамположительные (Грам+)
и грамотрицательные (Грам -) лежат различия в химическом составе
и строении клеточной стенки. Такое деление прокариотических микроорганизмов имеет большое значение для их классификации и является важным таксономическим признаком, с которым коррелируют
многие свойства микробов. Датским ученым. К.Грамом в 1884 г. был
предложен специальный способ окраски с помощью комплексного
красителя – основного красителя (генцианового фиолетового) и йода
(раствора Люголя), с последующим его обесцвечиванием спиртом. К
грамположительным микроорганизмам относятся микроорганизмы,
дающие положительную окраску по Граму, т.е. в цвет основного красителя (фиолетовый, синий). Клетки грамотрицательных микробов,
дающих отрицательную окраску по Граму, окрашиваются в красный
(цвет дополнительного красителя – фуксина).
Основным структурным компонентом клеточной стенки
прокариот является пептидогликан – муреин. Он относится к гетерополимерам и построен из цепочек, в которых чередуются остатки Nацетил-глюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты. Неразветвленные полимерные цепи сшиты между собой пептидными мостиками,
образуя мешкообразную гигантскую молекулу – муреиновый мешок.
57
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Пептидогликан нерастворим в воде и обуславливает жесткость и механическую упругость клеточной стенки.
У грамположительных микробов клеточная стенка толщиной
15-80 нм и состоит на 60-90% из муреина, расположенного в несколько слоев, плотно прилегающих к цитоплазматической мембране, тейхоевых кислот (teichos – стенка), белков около 1% (рис. 6).
Наружняя мембрана
Рис. 6.
Схема строения клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Цитоплазматическая
мембрана
Способность удерживать краситель генциановый фиолетовый
при окрашивании по Граму в значительной степени определяется
большим содержанием пептидогликана в клетке. Выделенный в чистом виде пептидогликан образует темно-фиолетового цвета комплекс
с генциановым фиолетовым и йодом, который обесцвечивается спиртом и ацетоном. Краситель удерживается в клетке также из-за присутствия в клеточной стенке тейхоевых кислот, свойственных только
грамположительным микробам, а также от особой структуры каркаса
стенки, в которой поры после обработки спиртом сужаются.
Клеточная стенка грамотрицательных микробов толщиной
10-15 нм, значительно тоньше и сложнее. Пептидогликан составляет
только внутренний одинарный слой, неплотно прилегающий к цитоплазматической мембране. К внутреннему слою пептидогликана
прилегает наружная мембрана, состоящая из липопротеинов и липо58
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
полисахаридов. Наружная мембрана стабилизирована ионами кальция.
Тейхоевые кислоты в клеточной стенке грамотрицательных
микроорганизмов отсутствуют. Из-за большого содержания липидов
клеточная стенка грамотрицательных микробов менее проницаема, а
поры в ней после обработки спиртом остаются достаточно широкими, что приводит к удалению комплекса генциановый фиолетовый –
йод при окраске по Граму. Сравнительный состав клеточной стенки
эукариотической и прокариотической клеток приведен в табл. 4.
Таблица 4 – Полимеры клеточной стенки эукариотческих и прокариотических микроорганизмов.
Полимеры
Эукариотическая
Прокариотическая клетка
клетка
Грам +
Грам -
Пептидогликан
−
+++
+
Тейхоевые кислоты
−
+
−
Липополисахариды
−
+
Липопротеины
−
+
−
+
Белки
+
±
+
Полисахариды
+
−
+
Способность прокариот окрашиваться по Граму зависит от возраста микробов и характерна для активно размножающейся микробной культуры. Так, прорастающие споры Bacillus subtilis и первые
генерации клеток после прорастания спор ведут себя как грамотрицательные организмы. Лишь позднее они становятся грамположительными. Поэтому при идентификации микробов по Граму используют
суточную микробную культуру. Все вышесказанное еще раз подтверждает, что окрашивающий комплекс находится в протопласте
или на его поверхности и что у грамположительных микробов его
59
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
удерживает главным образом клеточная стенка, которая препятствует
его экстрагированию.
Лабораторная работа 11
Дифференциальное окрашивание. Окраска по Граму
Цель работы: Приготовить фиксированные препараты микробных
культур Bacillus subtilis (сенная палочка), Escherichia
coli (кишечная палочка), Sarcina. Провести дифференциальную окраску по Граму. Визуально исследовать, зарисовать и классифицировать рассматриваемые микроорганизмы на грамположительные и грамотрицательные.
Ход работы:
Окраска по Граму служит примером дифференциального способа окрашивания микробов. Для окраски по Граму используют молодые суточные культуры микроорганизмов.
Окраску по Граму ведут следующим образом:
На обезжиренных предметных стеклах готовят два мазка исследуемых микробных культур для сравнения (один грамотрицательной, а другой грамположительной). Мазки одновременно высушивают и фиксируют в пламени спиртовки. Затем мазки (желательно одновременно) окрашивают основным красителем – генциановым
фиолетовым (2 мин). Препарат не промывают и добавляют раствор
Люголя, при этом окраска изменяется из фиолетового в черный цвет.
Йод образует с генциановым фиолетовым нерастворимый в воде и
плохо растворимый в спирте и ацетоне комплекс. Спустя 2 минуты,
раствор сливают с предметного стекла, а мазок обесцвечивают эти-
60
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ловым спиртом (96%) в течение 30 секунд. Препарат промывают водой и дополнительно окрашивают фуксином в течение 2-3 минут.
По окончании окрашивания предметное стекло берут за конец,
держат в наклонном положении и смывают краситель, направляя
струю воды на ребро предметного стекла. Промывают до тех пор,
пока стекающая вода не перестанет окрашиваться. Препарат высушивают на воздухе. Микроскопируют окрашенные мазки, применяя
иммерсионный объектив 90×.
Грамположительные микробы окрашиваются в цвет основного
красителя генцианового фиолетового (фиолетовый, синий), а грамотрицательные – обесцвечиваются, поэтому они имеют цвет дополнительного красителя – фуксина (красный, розовый).
Тема 10. ПРОЦЕССЫ БРОЖЕНИЯ
Существуют три способа получения энергии: брожение, дыхание и фотосинтез.
Брожение – это процесс анаэробного окисления сложных органических субстратов для получения энергии. Конечным акцептором протонов и, соответствующих им электронов при брожении служат органические вещества, которые образуются в ходе распада исходного субстрата. При брожении выделяется 1-4 молекулы аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) на 1 моль глюкозы.
Брожение протекает в две стадии (окислительная и восстановительная). Первая стадия – окисление глюкозы в пировиноградную
кислоту, сопровождающееся отщеплением двух атомов водорода.
С6Н12О6 → СН3С(О)-СООН + 2[Н]
глюкоза
пировиноградная кислота
61
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Вторая стадия - восстановление пировиноградной кислоты
(присоединение двух атомов водорода) или других промежуточных
метаболитов.
2СН3С(О)-СООН + 2[Н] → 2 СН3СН(ОН)-СООН
молочная кислота
В зависимости от вида брожения получаются различные продукты. В случае молочнокислого брожения пировиноградная кислота восстанавливается до молочной кислоты.
Другие виды брожения протекают также с неполным окислением глюкозы и делятся по типу конечного продукта на спиртовое,
уксуснокислое, маслянокислое и др.
1. Спиртовое брожение
Основные возбудители спиртового брожения – дрожжи (Saccharomyces cerevisiae) и некоторые бактерии (Zimomonas mobilis). В
аэробных условиях дрожжи получают энергию путем полного окисления моно- и дисахаридов до углекислого газа и воды, т.е. путем
аэробного дыхания. В анаэробных условиях необходимую для жизнедеятельности энергию дрожжи получают путем сбраживания монои дисахаридов по следующей схеме:
С6Н12О6 → 2СН3СН2ОН + 2СО2
Сырьем для производства пищевого этилового спирта служат
углеводы растительного сырья (картофель, злаковые, сахарная свекла) и отходы свеклосахарного производства (меласса). Для получения
технического спирта используются отходы целлюлозно-бумажной
промышленности (сульфитный щёлок), гидролизаты древесины, нормальные парафины и сельскохозяйственные отходы. Спиртовое брожение протекает в кислой среде (рН 4-4,5). При подщелачивании
62
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
среды до рН 8 дрожжи в качестве основного продукта брожения накапливают не спирт, а глицерин (до 40% по отношению к сброженному сахару). Этот процесс используется для промышленного получения глицерина по следующей реакции.
2С6Н12О6 + Н2О → 2 СН2(ОН)-СН(ОН)-СН2ОН + 2СО2 + С2Н5ОН +
+ СН3СООН
2. Пропионовокислое брожение
Оно вызывается пропионовокислыми бактериями, относящимися к роду Propionibacterium. Единственным источником энергии
для них является процесс сбраживания разнообразных веществ – моносахаридов (пентоз и гексоз), молочной или яблочной кислот, глицерина в пропионовую и уксусную кислоты, углекислый газ и воду:
3 С6Н12О6 → 4 СН3СН2СООН + 2СН3СООН + 2СО2 + Н2О
пропионовая кислота
Пропионовокислые бактерии родственны по ряду свойств с
гетероферментативными молочнокислым бактериям и часто развиваются совместно с ними. Это неподвижные палочки, слегка искривленные, не образующие спор, грамположительные, факультативные
анаэробы, обитают в основном в тракте жвачных животных и молоке.
В пищевой промышленности пропионовокислые бактерии используются при производстве сыров и некоторых видов молочнокислых
продуктов. Пропионовокислые бактерии обладают способностью
синтезировать витамин В12, который накапливается внутри клетки.
Эта их особенность используется для промышленного получения витамина В12 на отходах пищевых производств – молочной сыворотке и
др. с добавлением кукурузного экстракта в виде источника витаминов.
63
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3. Маслянокислое брожение
В отличие от рассмотренных видов брожения, маслянокислое
вызывается строгими анаэробами, относящимися к роду Clostridium.
Для них молекулярный кислород – яд. Маслянокислые бактерии довольно крупные, грамположительные, подвижные палочки с перитрихиально расположенными жгутиками, образующие очень устойчивые споры, что способствует повсеместному их распространению.
Единственным источником энергии для маслянокислых бактерий является процесс брожения:
4 С6Н12О6 → 3 СН3(СН2)2СООН + 2 СН3СООН + 8 Н2О + 8 СО2
масляная кислота
Возбудителями маслянокислого брожения являются Clostridium butyricum. Отдельные представители маслянокислых бактерий
вызывают несколько разновидностей маслянокислого брожения,
общим признаком которых является большее или меньшее накопление масляной, уксусной и других видов органических кислот, а также
бутилового спирта, ацетона и некоторых газообразных продуктов –
водорода, углекислого газа, метана. Маслянокислое брожение применяют для промышленного получения масляной кислоты, т.к. её
эфиры обладают приятным запахом и используются в кондитерской
и парфюмерной промышленности.
Ацетонобутиловое брожение вызывается бактериями Clostridium acetobutylicum. В результате брожения получают бутиловый и
этиловый спирты, уксусную и масляную кислоты. Этот процесс применяется в промышленном производстве бутилового спирта из крахмалистого сырья по реакции:
3 С6Н12О6 → СН3(СН2)3ОН + СН3(СН2)2СООН + СН3СОСН3 +
+ СН3СН2ОН + СН3СН(ОН)СН3 + Н2 + СН3СООН + СО2
64
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4. Молочнокислое брожение
Молочнокислое брожение – это процесс превращения молочнокислыми бактериями углеводов молока в молочную кислоту, которая закисляет среду, подавляя тем самым рост гнилостных бактерий.
Для молочнокислых бактерий – брожение единственный источник
энергии.
Молочнокислые бактерии по конечным продуктам брожения
подразделяют на две группы: гомоферментативные и гетерофементативные, и соответственно вызывают гомо- и гетероферментативное
молочнокислое брожение.
Гомоферментативным молочнокислые бактерии образуют
из сахаров в основном молочную кислоту:
С6Н12О6 → 2 СН3СН(ОН)СООН
Гетероферментативные молочнокислые бактерии, благодаря разнообразию имеющихся у них ферментов, из сахаров помимо
молочной кислоты образуют и другие продукты брожения – уксусную кислоту, этиловый спирт, углекислый газ, некоторые виды образуют еще янтарную кислоту и водород.
К гетероферментативным молочнокислым бактериям относятся и ароматобразующие виды микроорганизмов, которые синтезируют специфические вещества. Это летучие кислоты, диацетил, ацетоин, диоксид углерода и др., придающие своеобразный вкус и аромат молочнокислым продуктам
2С6Н12О6 → СН3СН(ОН)СООН + СН3СООН + СООН(СН2)2СООН +
янтарная кислота
+ Н2 + СО2 + СН3СН2ОН
65
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Конечные продукты, образующиеся при гетероферментативном молочнокислом брожении, накапливаются в среде в различных
соотношениях, что зависит от вида бактерий, питательной среды и
внешних условий.
Молочнокислые бактерии используются при изготовлении
молочнокислых продуктов, сливочного масла и маргарина, в хлебопечении, при квашении овощей, силосовании кормов и в производстве молочной кислоты. Они сбраживают глюкозу, галактозу, фруктозу. Из дисахаридов молочнокислые бактерии сбраживают лактозу
(молочный сахар), мальтозу, сахарозу. Молочнокислые бактерии относятся в основном к родам Streptococcus (шаровидная клетка, образующая цепочки) и Lactobacterium (неподвижные и не образующие
спор палочки одиночные или в виде цепочек). Все молочнокислые
бактерии грамположительные, факультативные анаэробы, имеются и
микроаэрофилы. От других бактерий молочнокислые отличаются высокой требовательностью к составу питательной среды.
4.1. Микрофлора молочнокислых продуктов
Молочнокислые продукты делятся на две группы в зависимости от типа брожения: продукты молочнокислого брожения (простокваша, ацидофилин, йогурт, ряженка) и продукты комбинированного брожения – молочнокислого и спиртового брожения (кефир, кумыс, катык).
Продукты молочнокислого брожения
Простокваша содержит в большом количестве молочнокислые стрептококки и молочнокислые палочки – естественную микрофлору вымени коровы. Заводская простокваша готовится из пастеризованного молока путем внесения закваски, состоящей из чистой
культуры молочнокислых бактерий (Streptococcus lactis), при темпе66
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ратуре 360С в течение 6 часов. Наличие плесени (Penicillium) и
дрожжей разных видов, сбраживающих и не сбраживающих молочный сахар, указывает на нарушение технологии приготовления. Молочнокислый стрептококк выделяет молочную кислоту и обладает
антимикробным действием, образует полипептидный антибиотик –
низин, устойчивый к высоким температурам и задерживающий рост
многих грамположительных микробов.
Йогурт получают из пастеризованного гомогенизированного
цельного молока, инокулированного Streptococcus thermophilus, Lactobacterium bulgaricum. После внесения закваски молоко выдерживается при 43-450С в течение 2-3 часов. Болгарская палочка образует
молочную кислоту, которая является антагонистом гнилостной микрофлоры. Гнилостные микробы разлагают белки, образуют ядовитые
газы: скатол, индол, аммиак, отравляющие организм человека.
Ацидофилин готовится из пастеризованного молока при 360С
с помощью закваски, состоящей из чистой культуры ацидофильных
палочек (Lactobacterium acidophilum) и молочнокислых стрептококков (Streptococcus lactis). Не допускается наличие дрожжей и плесени. Ацидофильная палочка образует больше молочной кислоты, чем
болгарская, и быстрее нейтрализует ядовитые продукты жизнедеятельности гнилостных бактерий (аммонификаторов).
Бифидок получают из топленого молока инокулированного
актиномицетами рода Bifidobacterium. Они представляют собой V-образные палочковидные формы микроорганизмов Bifidobacterium bifidum и др. и преобладают в желудочно-кишечном тракте молодняка
сельскохозяйственных животных и детей. Бифидобактерии сбраживают сахара с образованием молочной, уксусной кислот, а также
биологически активных веществ, которые подавляют рост гнилостной и патогенной микрофлоры.
67
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Продукты комбинированного брожения
Образуются за счет двух параллельно идущих процессов: молочнокислого брожения, вызванного молочнокислыми бактериями, и
спиртового брожения, вызванного дрожжами.
Кефир получают из молока. Закваску готовят на так называемых кефирных зёрнах, которые представляют собой плотные комочки казеина, населенные еще полностью не изученным сообществом
микробов. Оно представляет собой симбиоз лактострептококков,
микрококков, бактерий и дрожжей. Процесс сбраживания ведут при
температуре 15-220С в течение 22 часов.
Кумыс готовят из пастеризованного молока кобылы, в который вносят болгарскую палочку (Lactobacterium bulgaricum) и дрожжи рода Torulla. В отличие от коровьего молока в кобыльем молоке
содержится до 6% сахара, поэтому спиртовое брожение протекает
особенно интенсивно. В крепком кумысе содержится до 2,5% спирта.
Лабораторная работа 12
Микроскопирование молочнокислых продуктов
Цель работы: Микроскопировать продукты молочнокислого и комбинированного брожения.
Ход работы:
Приготовить фиксированные препараты молочнокислых продуктов. Визуально исследовать, описать форму, размер клеток микробных культур и зарисовать.
Микробный анализ молочнокислых продуктов (кефир, простокваша, ацидофилин, йогурт и т.д.) начинают с микроскопического
исследования препаратов, окрашенных фуксином. В препаратах
68
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
обычно обнаруживается специфическая молочнокислая микрофлора
(Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetilactis,
Streptococcus thermophilus, Lactobacterium bulgaricum) в виде диплококков, цепочек и палочек. Каждый молочнокислый продукт имеет
свой микробный пейзаж с определенным составом и количественным
соотношением микроорганизмов.
69
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Часть III. Биотехнологический практикум
Тема 11. ПРОИЗВОДСТВО КОРМОВОГО БЕЛКА
Биотехнология представляет собой современную промышленную технологию, использующую биологические объекты и биохимические процессы. В качестве биологических объектов используют микроорганизмы, вирусы, клетки животных и растений. В биотехнологии используются как целые клетки живых организмов, так и
клеточные структуры. Использование живых организмов подразумевает обязательное применение асептических (стерильных) условий
при ведении технологического процесса.
Основными направлениями биотехнологии являются производства биологически активных веществ и лекарственных препаратов, микробиологических средств защиты растений, кормовых добавок и пищевая промышленность. Продукты биотехнологической
промышленности можно условно разделить по объему производства
на крупнотоннажные (этанол, кормовые дрожжи, органические кислоты, продукты пищевой промышленности) и малотоннажные (медикаменты, аминокислоты, гормоны и другие продукты тонкого
микробного синтеза).
Производство кормовых дрожжей (белка) играет важную
роль в развитии животноводства. Растительные корма, являющиеся
основным источником питания, не содержат достаточного количества белка и некоторые незаменимые аминокислоты, такие как лизин,
метионин, триптофан, треонин. Использование в качестве белковой
добавки к растительному сырью рыбной муки и сои не решает этой
проблемы.
Перспективным решением все возрастающей потребности в
кормовом белке можно решить путем использования микробиологи70
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ческого белкового концентрата. В настоящее время для получения
биомассы используют ряд углеродсодержащих субстратов: гидролизат древесины, меласса, нормальные парафины. Большой интерес
представляет для промышленности процесс получения биомассы на
этаноле и метаноле, а также непосредственное использование природного газа – метана.
1. Основные этапы выращивания микроорганизмов
• Приготовление питательной среды, посуды, оборудования и инструментов.
• Стерилизация питательной среды.
• Выращивание микроорганизмов (получение инокулята) на жидкой
питательной среде.
• Выращивание посевного материала на плотной питательной среде
(внесение инокулята на питательную среду).
• Выращивание микроорганизмов в ферментаторе.
• Получение готового продукта – белково-витаминного концентрата.
К наиболее важным технологическим факторам биотехнологического производства относятся конверсия сырья, производительность производства и концентрация получаемого продукта. В любом
микробиологическом процессе ключевую роль играет культура используемых микроорганизмов. В биотехнологии широко применяются плесневые грибы, дрожжи, актиномицеты, бактерии и водоросли в
виде чистых или смешанных культур. В традиционных процессах
ферментации предпочтение обычно отдается смешанным культурам,
а в большинстве современных ферментационных процессов – монокультурам, выращиваемым в асептических условиях.
71
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
При подборе культуры микроорганизмов для промышленного
производства наиболее важными являются следующие микробиологические факторы:
• способность синтезировать целевой продуктов (экономический коэффициент выхода продукта или продуктов);
• высокая скорость роста и/или скорость получения конечного продукта;
• сродство культуры-продуцента к углеродным и энергетическим
субстратам;
• стабильность и неприхотливость культуры продуцента (устойчивость к заражению посторонней микрофлорой).
Для выращивания любой культуры необходимы: жизнеспособный посевной материал, источники энергии и углерода, питательные вещества для синтеза биомассы, отсутствие ингибиторов роста и
соответствующие физико-химические условия.
При получении жизнеспособного посевного материала, прежде всего, необходим подбор питательной среды. Питательная среда
предназначена для накопления, выделения и сохранения микроорганизмов, а так же для получения биомассы и/или ценных продуктов
метаболизма.
В состав питательной среды должны входить органогенные
элементы (углерод, водород, кислород, азот), зольные макроэлементы (фосфор, сера, железо, калий, кальций, магний) и микроэлементы
(марганец, хлор, натрий, медь, бор и т.п.). Все перечисленные элементы должны входить в среду в легкоусвояемом для микроорганизмов виде.
Источниками углерода для гетеротрофных микроорганизмов
могут быть углеводы (моносахариды и полисахариды), спирты, органические кислоты, углеводороды и другие соединения природного
72
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
происхождения. Источниками азота в питательной среде могут быть
белки, аминокислоты, соли аммония, нитраты и нитриты, а также атмосферный азот. В качестве источника кислорода могут выступать
различные соединения, но многие микроорганизмы нуждаются в атмосферном кислороде и могут расти только в его присутствии. Остальные элементы вносятся в среду в виде водорастворимых солей.
При выборе сырья для промышленного применения необходимо учитывать не только содержание основных элементов в нем, но и его
себестоимость.
Обязательным условием ведения биотехнологических процессов является работа в асептических условиях, поэтому стерилизация среды имеет решающее значение, а в случае аэробных процессов
– и воздуха. Стерилизация (обеспложивание) – полное уничтожение
в стерилизуемом материале как вегетативных, так и покоящихся
форм микроорганизмов. Стерильность обеспечивают, обрабатывая
стерилизуемый объект физическими (температура, облучение, фильтрация) или химическими средствами.
В качестве физических средств на практике чаще всего используют влажную и сухую стерилизацию жаром, а так же стерилизацию фильтрованием. Влажной стерилизации подвергают среды и
посуду, сухой – посуду и инструменты, стерилизации фильтрованием
– воздух и лабильные (не стабильные) среды. Сухая стерилизация
менее эффективна, чем влажная. Стерилизацию облучением (УФ
свет) используют для стерилизации воздуха помещений и поверхностей.
Асептические условия можно поддерживать с помощью химических средств, которые используют при стерилизации основного
и вспомогательного оборудования. Гибель микроорганизмов способны вызвать химические вещества, которые специфически или неспе73
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
цифически связываются с белками, инактивируя определенные группы активных ферментов. К таким неспецифическим веществам относятся хлор, йод, формалин, фенол, к специфическим веществам – антибиотики, сульфамидные препараты и т.д.
При внесении в стерильную подходящую среду небольшого
количества культуры микроорганизмов они начинают интенсивно
расти и размножаться. В результате роста и размножения клеток
микроорганизмов в питательной среде увеличивается биомасса. Ее
количество можно охарактеризовать по сухой массе клеток на единицу объема (мг/л, г/л), а если клетки имеют примерно одинаковые
размеры, то и по числу клеток в единице объема (млн./мл, млрд./мл).
2. Методы контроля микробиологического процесса
Рост и размножение культуры можно определить различными методами:
• центрифугируя или фильтруя культуральную жидкость через
мембранный фильтр и высушивая полученную пасту до постоянной массы;
•
нефелометрически, измеряя светопоглощение клеточной суспензии;
• определяя содержание азота в биомассе, полученной из определенного объема питательной среды;
• по интенсивности выделения какого-либо вещества (газа, кислоты
и т.п.).
Число клеток в культуральной жидкости определяют:
• микроскопически, прямым подсчетом клеток, используя специальные камеры Горяева, Тома и др.;
• по подсчету выросших колоний в чашках Петри.
74
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3. Рост микроорганизмов и его математическое описание
Существует два основных способа культивирования микроорганизмов: периодический и непрерывный. При производстве кормовых дрожжей периодический способ используется на начальной стадии для получения чистой культуры засевных дрожжей; крупномасштабное производство ведется непрерывным способом.
Рост периодической культуры характеризуется прохождением
последовательных фаз роста (рис. 7).
8
Рис. 7. Фазы роста культуры микроорганизмов.
АСБ, г/л
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
Время, час
Рис. 7. Кривая роста периодической культуры
Посевной материал, попав в свежую полноценную среду, не
сразу начинает размножаться. Сразу после засева наблюдается лагфаза. В этот период активируются ферменты, а также, если это необходимо, синтезируются новые ферментные системы, клетка приспосабливается к среде и окружающим условиям.
После окончания лаг-фазы скорость роста клеток микроорганизмов возрастает. Эта фаза носит название – фаза ускорения роста.
В этот период приспособившиеся клетки начинают размножаться с
75
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
максимальной для данной культуры скоростью. Наступает логарифмическая или экспоненциальная фаза. Вследствие интенсивного
размножения клеток в этой фазе и, соответственно, интенсивного потребления питательных веществ их концентрация в среде уменьшается, кроме того, происходит накопление различных продуктов обмена
веществ.
Иногда в питательной среде накапливается так много клеток,
что им не хватает пространства. Постепенно негативное влияние лимитирующих факторов увеличивается и в результате скорость роста
уменьшается, наступает фаза замедленного роста. При дальнейшем
ухудшении условий существования наступает стационарная фаза,
когда концентрация биомассы не меняется во времени, число отмерших клеток соответствует числу образовавшихся. Затем наступает
период, когда число отмерших и автолизированных клеток превышает прирост, количество биомассы уменьшается, преобладают деструктивные процессы - наступает фаза отмирания.
При получении целевых продуктов целесообразно вести процесс до начала стационарной фазы, т.е до момента накопления максимальной биомассы. Дальнейшее культивирование приводит к ненужному расходу питательных веществ и снижения количества белка. Поэтому важно определить динамику накопления биомассы.
Для характеристики динамики биотехнологического процесса
используют кинетические и стехиометрические параметры.
Кинетические параметры характеризуют изменение процесса во времени. К ним относятся такие параметры как удельная скорость роста (µ
µ) и метаболический коэффициент (q). Для характеристики развития культуры микроорганизмов используют скорость
роста культуры V (изменение количества биомассы в единицу времени):
76
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
V =
dX
dt .
Чтобы определить, с какой скоростью идет прирост биомассы
от исходного ее количества за определенный промежуток времени
используют среднюю скорость роста Vср:
Vср=
X1 - X2
t1 - t о
Если прирост биомассы в единицу времени отнести к одной
единице активной биомассы, то удельную скорость роста µ, можно
вычислить по формуле
dX . 1
X
dt
µ =
Среднюю удельную скорость роста за период t2-t1 при увеличении биомассы на X2 и X1 определяют по формуле
µ ср =
1
.
Хср
X2 - Х1
t2 - t1
.
Скорость потребления определенного субстрата растущими
культурами часто описывает метаболический коэффициент q.
qqср =
1
.
S ср
S 2 -S1
t2 - t1
,
где S2 и S1 – концентрация субстрата в среде в начале и в конце культивирования.
В общем случае метаболический коэффициент характеризует
долю субстрата, используемого для роста определенного количества
биомассы за определенный промежуток времени.
Кинетические параметры не дают целостной картины без учета стехиометрических коэффициентов.
77
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Стехиометрические коэффициенты характеризуют соотношение между исходными и конечными продуктами. При любой количественной оценке роста микроорганизмов и/или синтеза конечного продукта необходимо связать образование микробной биомассы и
продуктов (конечного продукта) с расходованием субстратов (начального продукта) и питательных веществ. Если количество полученной биомассы обозначить X, а внесенного посевного материала S,
то экономический коэффициент (урожай), определяют по формуле
Yx/s =
X2 - X1
,
S1 - S2
Экономический коэффициент YX/S, который иногда называют выходом биомассы, имеет большое значение как для характеристики физиологических свойств культуры, так и в практическом плане при получении биомассы или синтезе какого-либо продукта. Он
позволяет связать стехиометрические коэффициенты с кинетическими коэффициентами.
µ
q=
Yx/s
Такой показатель, как выход по массе, имеет существенный
недостаток, так как не характеризует энергосодержание субстрата.
Так, процессы роста микроорганизмов на глюкозе и этаноле могут
иметь одинаковые экономические коэффициенты, но разные энергетические.
Энергетический выход η характеризует долю энергии субстрата, перешедшую к биомассе. Органические вещества, используемые микроорганизмами в качестве субстрата, различны по количеству заключенной в них энергии. Чем выше степень восстановленности субстрата, тем больше количество энергии может быть полу78
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
чено микроорганизмами при его ассимиляции. Количественно степень восстановленности органических веществ – это число электронэквивалентов, передаваемых окислителю при полном окислении веществ общей формулы CHpOnNq , в расчете на один грамм-атом углерода
γ = 4+p-2n-3q .
Связь между энергетическим выходом и выходом по массе
находят по уравнению:
σ x γx / σs γs) ⋅ Yx/s ,
η= (σ
где σ x , σs – весовая доля углерода в биомассе и субстрате, соответственно;
γx , γs – степень восстановленности биомассы и субстрата, соответственно;
Yx/s – выход по массе.
Для написания стехиометрического уравнения получения
биомассы на этаноле аналитическим путем определяют элементный
состав биомассы. На основе усредненных аналитических данных органическое вещество микробной клетки дрожжей (состав биомассы
зависит от вида микроорганизмов) можно представить суммарной
формулой, отражающей элементарный состав:
СН1,77О0,49N0,16 (М.м.= 24,28 у.е).
Остальные элементы, присутствующие в биомассе, составляют менее 10% и их относят к зольному остатку. Зная выход по массе,
можно рассчитать стехиометрические коэффициенты уравнения.
С2H6O + a NH3 + b O 2
→ c CH1,77 O0,49N 0,16 + d CO2 + f H2О
79
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Лабораторная работа 13
Получение микробной биомассы на основе этилового спирта
Цель работы: Провести периодический процесс культивирования
дрожжей Candida valida на синтетической среде с
использованием этанола в качестве источника углерода и энергии. По результатам анализа вычислить
показатели, характеризующие материальный баланс
и кинетику процесса.
В качестве основного субстрата для получения микробной
биомассы выбран этиловый спирт. Это субстрат высокой степени
чистоты и стабильного качества. Он полностью растворим в воде, что
уменьшает число фаз подготовки ферментационной среды и устраняет ряд недостатков, присущих процессам культивирования микроорганизмов на труднорастворимых субстратах, таких как н-парафины.
В сравнении с глюкозой содержание углерода в этиловом спирте в
1,75 раз выше, что обеспечивает более высокий выход биомассы на
единицу потребленного субстрата. В то же время расход кислорода и
тепловыделение, вследствие более высокой степени окисления этанола, существенно ниже, чем при использовании углеводородов.
Этанол менее токсичен, что (в отличие от метанола) значительно упрощает работу с этим видом сырья в промышленных условиях. Он
может служить субстратом в процессах получения и других микробиологических продуктах (органических кислот и витаминов). Применение этанола в производстве микробного белка обеспечивает получение продукта с высоким качеством и пищевым достоинством.
80
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Схема установки по производству микробной биомассы на
этаноле на качалках приведена на рис. 8.
Рис. 8. Схема установки периодического процесса
культивирования дрожжей.
1 – качалка;
2 – качалочные колбы с посевным материалом;
3 – косяки с чистой
культурой;
4 – ферментатор.
Питательная
среда
4
Питательная среда
4
Ход работы:
1. Построение калибровочной прямой для определения абсолютно сухой биомассы и количества клеток микроорганизмов.
Для построения калибровочной прямой готовят 6 суспензий
дрожжей разной концентрации. Светорассеяние суспензий измеряют
на фотоэлектроколориметре в кювете с длиной светового пути 0,5 см
при длине волны 490 нм. В каждой из 6 суспензии определяют количество клеток дрожжей в счетной камере Горяева-Тома и абсолютно
сухой биомассы (АСБ), используя метод высушивания до постоянной
массы. Результаты измерений приведены в табл. 5.
81
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 5 – Количество клеток дрожжей в суспензиях, АСБ и соответствующие показания фотоэлектроколориметра (ФЭК)
Показатели
Суспензии дрожжей
1
2
3
4
5
6
Количество клеток, млн/мл
0
43
81
121
163
212
АСБ (г/л)
0
1,25
2,43
3,58
4,86
5,97
Показания ФЭК
0
0,21
0,4
0,59
0,8
1,02
2.Подготовка посевного материала
Дрожжи пересеваются с музейной культуры на свежий скошенный сусло-агар. Полученные косяки выдерживают в термостате
при температуре 360С в течение суток. Через сутки производят смыв
выросшей на косяках культуры в стерильных условиях стерильным
физиологическим раствором. Полученную таким образом суспензию
дрожжей (инокулят), используют для засева в качалочные колбы на
синтетическую среду заданного состава.
Состав питательной среды (г/л):
(NH4)2SO4
- 3,3
- 1,0
KH2PO4
MgSO4
- 0,7
K2HPO4
- 0,13
NaCl
- 0,5
Этанол
- 15
Дрожжевой автолизат
-1
Приготовленную на водопроводной воде питательную среду
разливают в качалочные колбы, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при 0,5 атм 30 минут.
82
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3. Культивирование дрожжей
В качалочные колбы со стерильной питательной средой стерильно вносят инокулят из расчета 10% от объема питательной среды
в колбе. Культивирование ведут на качалках. В процессе ферментации поддерживают следующие условия: температура 360С, число
оборотов качалки 200-220 об/мин, амплитуда 7. Длительность ферментации составляет 24 часа, отбор проб осуществляют каждые 3 часа. В каждой пробе определяют содержание АСБ, количество клеток,
концентрацию этанола.
Ход анализа:
Определение АСБ и количества клеток в исследуемой культуре
дрожжей
При тех же условиях, в которых измеряли светорассеяние в
суспензиях дрожжевых клеток при построении калибровочной кривой (длина волны света, толщина кюветы), измеряют светорассеяние
проб, отобранных в динамике развития исследуемой культуры дрожжей (каждые 3 часа в течение 24 часов), на фотоэлектроколориметре.
Подсчет клеток микроорганизмов в камере Горяева-Тома
Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками на части. Центральная часть стекла ниже
боковых на 0,1 мм, и на ней нанесена сетка. Площадь большого квадрата сетки равна 1/25 мм2, площадь малого 1/400 мм2. Каплю исследуемой суспензии наносят на сетку и покрывают шлифованным покровным стеклом. Затем покровное стекло притирают к сторонам камеры путем смещения его в противоположные стороны несколько
раз до появления радужных пятен на боковых гранях стекла. Посчитывают количество клеток в 8-10 больших квадратах сетки или в 20
малых. При подсчете учитывают все дрожжевые клетки, лежащие в
83
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
квадрате сетки, а также клетки дрожжей, пересекающие верхнюю и
правую сторону квадрата. При подсчете количество клеток микроорганизмов в больших квадратах не должно превышать 20, а в малых –
10, в противном случае исходную дрожжевую суспензию разводят
водопроводной водой.
Подсчет клеток рекомендуется начинать не раньше, чем через
3-5 минут после заполнения камеры, чтобы клетки осели и были видны в одной плоскости. Количество клеток в 1 мл исходной суспензии
вычисляют по формуле
M =
1000аn
,
Sh
где М – число клеток в 1 мл суспензии;
а – среднее число клеток в квадрате сетки;
n – коэффициент разведения суспензии;
S – площадь квадрата сетки, мм2;
h – глубина камеры (0,1 мм).
Определение содержания этанола в пробах
Для количественного определения этилового спирта используются два метода газохроматографический и оксидиметрический.
Оксидиметрический метод основан на окислении этилового
спирта до уксусной кислоты раствором бихромата калия в кислой
среде по реакции:
3C2H6O + 2 K2Cr2O7 + 8H2SO4→ 3CH3COOH + 2Cr2(SO4)3+2K2SO4 +
+ 11H2O
Для этого отбирают пробу культуральной жидкости и отгоняют из нее спирт в приемник с 1 н раствором бихромата калия в
присутствии серной кислоты.
Избыток бихромата определяют йодометрическим способом:
84
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
K2Cr2O7 + 6KI + 7 H2SO4 →
I2 + 2 Na2SO4
→
Cr2(SO4)3 + 4 K2SO4 + 3I2 + 7 H2O
Na 2S2O4 + 2 NaI
По количеству 0,1 н раствора бихромата, пошедшего на окисление этилового спирта до уксусной кислоты, определяют концентрацию этанола в растворе по формуле.
N = (10 ⋅2 – b ⋅1,15) /(V⋅0,789⋅1000⋅15⋅1,023 ) ,
где 10 – коэффициент пересчета;
2 – количество 1 н раствора бихромата калия, взятого для окисления спирта, мл;
b – количество 0,1 н раствора тиосульфата натрия, пошедшего на
титрование свободного йода, мл;
1,15 – объем спирта, окисляющегося 1 мл 0,1 н раствора бихромата калия, мл;
V – объем культуральной жидкости, взятой для анализа, мл;
0,789 – плотность спирта, г/см3;
1000 – коэффициент пересчета мг в граммы
15 – объем 10% раствора йодида калия, мл;
1,023 – плотность культуральной жидкости, г/см3.
Пользуясь калибровочной кривой (табл. 5), определяют количество клеток дрожжей (млн /мл) и АСБ в отобранных пробах. На
основе данных табл. 6 строят кривую роста культуры микроорганизмов. Рассчитывают удельную скорость роста µ, метаболический коэффициент q, выход по массе YX/S дрожжей, временную зависимость
представляют в виде графика удельной скорости роста дрожжей, метаболического коэффициента и урожая.
85
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Определение количество белка в биомассе
Метод основан на том, что спектрофотометрический максимум поглощения белков наблюдается при 280 нм. Он обусловлен
присутствием в белках ароматических аминокислот – тирозина и
триптофана.
При определении содержания белка в дрожжевых клетках
проводят гидролиз дрожжевой суспензии с последующей экстракцией содержащихся в ней белков. Для этого к 1 мл культуральной жидкости в мерной колбе на 50 мл добавляют 20 мл 0,5 н раствора едкого натра и нагревают мерную колбу на кипящей водяной бане. После
охлаждения объем мерной колбы доводят до 50 мл 0,5 н раствором
едкого натра. Пробу центрифугируют, отделяя оставшиеся клетки
дрожжей. В фугате на спектрофотометре определяют оптическую
плотность при 280 и 260 нм. Замеряют оптическую плотность и в
контрольном растворе, не содержащем дрожжевой суспензии.
Если соотношение А280/А260 ≤1,70, то концентрацию белка определяют по формуле
Б = 1,45А280 – 0,74 А260 ,
где А280, А260 – оптическая плотность при 280, 260 нм соответственно;
Б – содержание белка в биомассе, мг/мл.
86
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Полученные данные вносят в табл. 6.
Таблица 6 – Результаты культивирования дрожжей на этаноле
Время культивирования,
час
Показания
ФЭК
Количество
клеток,
млн /мл
0
3
6
9
12
15
18
21
24
87
Количество
АСБ, мг/мл
Содержание
этанола,
мг/мл
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Библиографический список
1. Ручай Н.С., Конев С.В. Биохимия и микробиология: Учебн. пособие для вузов. М.: Экология, 1992. – 240 с.
2. Получение микробной биомассы на основе этилового спирта: Метод. указ. к учебно-исслед. лабор. практикуму/ Под ред.
Ш.Г.Еникеева, Д.Г.Победимского; КХТИ. Казань, 1983. – 32с.
3. Шлегель Г. Общая микробиология Пер. с нем. М.: Мир, 1987. –
566с.
4. Биохимия растительного сырья: Учебники и учебн. пособия для
студентов высш. учебн. заведений, В.Г.Щербаков, В.Г.Лобанов,
Т.Н.Прудникова и др. М.: Колос, 1999. – 378 с.
микробного
синтеза/
М.Е.Бекер,
5. Биотехнология
М.Ж.Кристапсонс, У.Э.Виестур и др. Рига: Зинатне, 1980. – 350 с.
6. Слюсаренко Т.П. Лабораторный практикум по микробиологии
пищевых производств. М.: Легкая и пищевая промышленность,
1985. – 208 с.
7. Ассонов Н.Р. Микробиология, III изд. , М.: Колос. 1997. – 352 с.
8. Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии. Ростов-на-Дону: Феникс, 1999. – 544с.
9. Берри Д. Биология дрожжей. Пер. с англ. – М.: Мир, 1985. – 96 с.
10. Справочник биохимика / П. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот и др. –
М.: Мир, 1991. – 544 с.
11. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М.: Изд-во «Элевар», 2000. – 512 с.
12. Степаненко П.П. Микробиология молока и молочныхпродуктов:
Учебник для ВУЗов. – Сергиев Посад: ОО «Все для ВасПодмосковье», 1999. – 415 с.
88
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Содержание
Часть I. Биохимический практикум
Тема 1. БЕЛКИ. ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА БЕЛКА
4
4
Лабораторная работа 1
Качественное определение белков. Цветные реакции
9
Тема 2. МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
БЕЛКА
17
Лабораторная работа 2
Биуретовый метод определения содержания белка в растворе
17
Тема 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
БЕЛКА. ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ ТОЧКА БЕЛКА
20
Лабораторная работа 3
Определение изоэлектрической точки белка
22
Тема 4. УГЛЕВОДЫ. МОНОСАХАРИД
24
Лабораторная работа 4
Качественные реакции на моносахариды
26
Тема 5. ОЛИГОСАХАРИДЫ. ПОЛИСАХАРИДЫ.
31
Лабораторная работа 5
Дисахариды
33
Лабораторная работа 6
Кислотный гидролиз крахмала
34
Тема 6. ФЕРМЕНТЫ
37
Лабораторная работа 7
Влияние температуры на активность β-фруктофуранозидазы
89
38
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Лабораторная работа 8
Влияние активаторов и ингибиторов на активность
α-амилазы слюны
40
Часть II. Микробиологический практикум
Тема 7. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ
42
Лабораторная работа 9
Светопольный микроскоп и правила работы с ним
43
49
Тема 8. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ
МИКРООРГАНИЗМОВ
51
Лабораторная работа 10
Приготовление препаратов живых и фиксированных
микроорганизмов
53
Тема 9. ОКРАШИВАНИЕ МИКРОБОВ ПО ГРАМУ
57
Лабораторная работа 11
Дифференциальное окрашивание. Окраска по Граму
60
Тема 10. ПРОЦЕССЫ БРОЖЕНИЯ
61
Лабораторная работа 12
Микроскопирование молочнокислых продуктов
68
Часть III. Биотехнологический практикум
70
Тема 11. ПРОИЗВОДСТВО КОРМОВОГО БЕЛКА
70
Лабораторная работа 13
Получение микробной биомассы на основе этилового спирта
Библиографический список
Содержание
90
80
88
89
Документ
Категория
Химические науки
Просмотров
453
Размер файла
717 Кб
Теги
биотехнология, основы
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа