close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Метод определения лизоцимной активности крови у сельскохозяйственных животных.

код для вставкиСкачать
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, № 2
Методика
УДК 636:619:591.111:57.08
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИЗОЦИМНОЙ АКТИВНОСТИ КРОВИ
У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
В.Я. САРУХАНОВ, Н.Н. ИСАМОВ, И.М. КОЛГАНОВ
Предложена методика определения лизоцимной активности сыворотки крови у сельскохозяйственных животных и человека. У крупного рогатого скота, овец и коз смесь нативной
сыворотки и тест-культуры необходимо инкубировать в течение 180 мин. Сыворотку крови лошадей и человека следует инактивировать и затем инкубировать с тест-культурой в течение 180
мин. Использование фосфатного буфера в качестве жидкой фазы в суспензии тест-культуры
приводит к осаждению ее частиц, вследствие чего возможно искажение результатов исследований. Этого не наблюдается при использовании 0,75 М раствора сахарозы.
Ключевые слова: естественная резистентность, сельскохозяйственные животные, кровь, лизоцимная активность.
Keywords: nature resistance, agriculture animals, blood, lysozyme activities.
В антиинфекционной защите организма участвуют как высокоспецифичная иммунная система, так и система факторов естественной резистентности, включающая бактериолизины, которые действуют на грампозитивную (лизоцим, ?-лизины) и грамнегативную (система комплемента)
микрофлору. Защитное действие комплемента, лизоцима, ?-лизинов и антител изучено достаточно подробно (1-3). Лизоцим ? фермент мурамидаза, гидролизующий мукополисахариды клеточной стенки бактерий. Его
количество снижается при интоксикации солями тяжелых металлов (хром,
свинец, цинк) (4, 5). Облучение в сублетальных дозах приводит к повышению активности лизоцима крови, в летальных дозах ? к снижению этого
показателя (6). При остром периоде пневмонии титр лизоцима уменьшается, тогда как выздоровление сопровождается его нормализацией (7).
Методы определения лизоцимной активности крови можно разделить на чашечные и нефелометрические. Первые основаны на диффузии
лизоцима сыворотки крови в агаровом геле с культурой Micrococcus lysodecticus, вторые ? на изменении светопропускания микробной взвеси
M. lysodecticus под действием лизоцима сыворотки крови. Надо отметить,
что на тест-культуру M. lysodecticus, помимо лизоцима сыворотки крови,
влияет система комплемента: добавление к тест-культуре даже 0,03 мл
сыворотки крови может изменить ее оптические свойства, что приведет к
искажению результатов исследования. Следовательно, перед определением
лизоцимной активности крови комплемент сыворотки следует инактивировать нагреванием, а реакцию учитывать по выраженной в процентах разнице оптической плотности смеси сыворотки крови с тест-культурой до и
после инкубации (оптические измерения в образце осуществляются против соответствующей кюветы со смесью сыворотки крови и жидкой фазы
суспензии тест-культуры, что исключает вклад дополнительных факторов
в конечный результат) (3). Для исключения ошибки измерения оптическая
плотность должна лежать в диапазоне от 0,10 до 1,00. При значении < 0,10
высокая погрешность измерения связана с малой интенсивностью луча,
тогда как при > 1,00 ? с близкими значениями, получаемыми при его
прохождении через пробу и контрольную кювету (8).
Целью настоящей работы была оптимизация параметров методики
определения лизоцимной активности сыворотки крови у сельскохозяйст119
венных животных и человека.
Описание методики. Объектом исследования служила сыворотка
крови животных-аналогов: коров черно-пестрой породы (n = 20), беспородных лошадей (n = 10), овец романовской породы (n = 10), беспородных
коз (n = 10) и клинически здоровых людей (n = 10). Кровь у животных отбирали из яремной вены утром натощак. Сыворотку получали общепринятым методом. В реакции использовали ацетоновый порошок M. lysodecticus. Активность лизоцима определяли как стандартным, так и модифицированным методом (6). Сыворотку крови инактивировали нагреванием в
водяной бане при 56 °С в течение 20 мин. Светопропускание и оптическую
плотность определяли на фотоэлектроколориметре КФК-ХЛ4,2 (Россия).
В соответствии со стандартной методикой определения лизоцимной активности нефелометрическим методом готовили микробную суспензию тест-культуры в фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) со светопропусканием взвеси 20 %, что соответствовало оптической плотности 0,70 (зеленый светофильтр, ? = 540 нм). К 1,47 мл тест-культуры добавляли 0,03 мл
сыворотки крови и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 °С. Лизоцимную активность определяли по разнице светопропускания тест-культуры и ее смеси с сывороткой крови после инкубации (7).
В соответствии с модифицированным методом, который применяли для определения активности лизоцима крови у сельскохозяйственных
животных и человека, в три пробирки (№№ 1, 2, 3) разливали по 0,2 мл
сыворотки или плазмы крови. Перед постановкой реакции сыворотку крови лошадей и человека инактивировали нагреванием на водяной бане при
56 °С в течение 30 мин. Для приготовления суспензии тест-культуры ацетоновый порошок M. lysodecticus растирали в ступке с небольшим количеством 0,75 М раствора сахарозы и фильтровали через неплотный слой ваты. Затем оптическую плотность суспензии доводили раствором сахарозы
до 0,70 (зеленый светофильтр; кювета с длиной оптического пути 3 мм). В
пробирки №№ 2 и 3 добавляли по 1,2 мл тест-культуры. Пробирки № 1 и
№ 2 помещали в холодильник, пробирку № 3 ? в термостат при температуре 37,5 °С на 180 мин. В пробирку № 1 добавляли 1,2 мл 0,75 М раствора сахарозы и определяли оптическую плотность содержимого пробирок
№№ 2 и 3 против смеси сыворотки крови и 0,75 М раствора сахарозы
(пробирка № 1).
Активность лизоцима рассчитывали по разнице оптической плотности контрольных и опытных образцов, выраженной в процентах, по
формуле:
ЛА = [(ОDк ? ОDо)/ОDк] Ѕ 100,
где ЛА ? лизоцимная активность крови, %; ОDк ? оптическая плотность
контрольных образцов (смесь сыворотки крови и тест-культуры без инкубации); ОDо ? оптическая плотность опытных образцов (смесь сыворотки
крови и тест-культуры после инкубации).
Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы Microsoft Excel.
При использовании стандартной процедуры определения добавление
к 1,47 мл тест культуры 0,03 мл сыворотки крови крупного рогатого скота
привело к увеличению светопропускания с 20 до 23-28 %. После инкубации в течение 60 мин этот показатель увеличился до 25-30 %. Следовательно, показатели активности лизоцима были близки к нулевым значениям.
В варианте с использованием фосфатного буфера в качестве жидкой фазы суспензии частицы тест-культуры осаждались после инкубации,
что могло привести к искажению результатов исследований. Осаждения не
120
наблюдалось в 0,75 М растворе сахарозы. При увеличении объема сыворотки крови в параллельных пробах до 0,2 мл и соответствующего уменьшения объема тест-культуры до 1,2 мл оптическая плотность их смеси до
и после инкубации при 37,5 °С в течение 120 мин составила соответственно 0,51 и 0,33-0,38, а лизоцимная активность крови колебалась от 25,5 до
33,3 % (табл. 1). В сыворотке крови овец, коз и лошадей лизоцимная активность составила соответственно 25,5±1,1; 30,2±1,2 и 46,8±3,4 %.
1. Лизоцимная активность сыворотки крови у коров черно-пестрой породы в
параллельных пробах при определении модифицированным методом
Оптическая плотность образцов
ОDк
ОDо
Лизоцимная активность, %
0,51
0,34
33,3
0,51
0,34
33,3
0,51
0,38
25,5
0,51
0,33
35,3
0,51
0,34
33,3
0,51
0,34
33,3
0,51
0,34
33,3
0,51
0,34
25,5
П р и м е ч а н и е. Для приготовления суспензии тест-культуры используется 0,75 М раствор сахарозы.
ОDк ? оптическая плотность контрольных образцов; ОDо ? оптическая плотность опытных образцов.
Для повышения чувствительности определения продолжительность
инкубации была увеличена со 120 до 180 мин (модифицированный метод).
При этом показатели лизоцимной активности крови у крупного рогатого
скота, овец, коз и лошадей повысились до 39,5±1,5; 37,8±2,1; 39,6±2,5 и
65,9±3,2 % (табл. 2). Оптическая плотность опытных и контрольных образцов колебалась от 0,20 до 0,50.
2. Лизоцимная активность сыворотки крови (%) у сельскохозяйственных животных в зависимости от продолжительности инкубации при определении
модифицированным методом (Х±х)
Продолжительность инкубации, мин
120
180
Вариант
Крупный рогатый скот
Овцы
Козы
Лошади
32,2±2,2
25,5±1,1
30,2±1,2
46,8±3,4
39,5±1,5
37,8±2,1
39,6±2,5
65,9±3,2
Инактивация комплемента сыворотки крови не привела к значительному изменению показателей лизоцимной активности у жвачных животных (значения понизились только на 11,1-16,2 %). При использовании
сыворотки крови лошадей и человека этот показатель снижался почти на
50 %. Однако лизоцимная активность оставалась высокой и составила соответственно 30,7±1,5 и 40,1±3,5 % (табл. 3).
3. Лизоцимная активность (ЛА, %) в нативных и инактивированных образцах сыворотки крови у сельскохозяйственных животных и человека при
определении модифицированным методом
Вариант
Крупный рогатый скот
Овцы
Козы
Лошади
Человек
Сыворотка крови (Х±х)
нативная
инактивированная
40,5±2,2
37,6±2,6
39,6±2,1
65,9±3,2
79,3±8,7
35,2±2,1
31,5±1,2
35,2±1,5
30,7±1,5
40,1±3,5
Снижение ЛА в инактивированной сыворотке крови, %
13,1
16,2
11,1
46,9
49,4
Лизоцимная активность при исследовании параллельных проб сыворотки крови коров достоверно не различалась и составила соответственно 46,6±2,5 и 45,9±1,5 %. Аналогичная закономерность наблюдалась при
использовании сыворотки крови овец, коз, лошадей и человека.
121
Таким образом, использование фосфатного буфера в качестве жидкой фазы суспензии тест-культуры вызывает осаждение ее частиц во время инкубации, что может привести к искажению результатов исследований. Этого не наблюдалось при использовании 0,75 М раствора сахарозы.
При определении активности лизоцима в крови у всех видов сельскохозяйственных животных смесь сыворотки и тест-культуры необходимо инкубировать в течение 180 мин. Для исключения действия на тест-культуру
системы комплемента сыворотку крови лошадей и человека следует подвергать инактивации. Предложенный метод позволяет эксплуатировать фотоэлектроколориметр в оптимальном режиме ? оптическая плотность измеряемых образцов лежит в диапазоне от 0,10 до 1,00.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
К о л я к о в Я.Е. Ветеринарная иммунология. М., 1986.
Б а ш м а к о в Г.А. Факторы естественной резистентности и методы их изучения. Военно-медицинский журнал, 1982, 6: 38-40.
Б у х а р и н О.В., В а с и л ь е в Н.В. Система бета-лизина и ее роль в клинической и
экспериментальной медицине. Томск, 1977.
Б у х а р и н О.В., В а с и л ь е в Н.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине.
Томск, 1974.
Ш к у р а т о в а И.А. Состояние здоровья животных в условиях экологического неблагополучия и способы снижения техногенных воздействий. Мат. межд. науч.
конф. ветеринарных терапевтов и диагностиков, посвященной 70-летию Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова. Улан-Удэ, 2001: 126-129.
К а р т а ш о в П.А., К и р ш и н В.А., И л ь и н В.Г. и др. Лучевая болезнь сельскохозяйственных животных. М., 1978.
Д о р о ф е й ч у к В.Г. Определение активности лизоцима нефелометрическим методом. Лабораторное дело, 1968, 1: 28-30.
Б у л а т о в М.И., К а л и н к и н И.П. Практическое руководство по фотометрическим методам исследования. М., 1986.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
радиологии и агроэкологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
31 января 2011 года
249030 Калужская обл., г. Обнинск, Киевское ш., 109 км,
e-mail: riarae@riar.obninsk.org
METHOD FOR DETECTION OF BLOOD LYSOZYME ACTIVITY
IN AGRICULTURAL ANIMALS
V.Ya. Sarukhanov, N.N. Isamov, I.M. Kolganov
Summary
The method was presented for detection of lysozyme activity of blood serum in agricultural
animals and human. For cattle, sheep and goat the mixture of native serum and test-culture must be
incubate during 180 min. The serum of horse and human must be inactivate and after that to incubate with test-culture during 180 min. The use of phosphate buffer as liquid phase in suspension of
test-culture causes the precipitation of its units, which can distorts the results of investigations. It is
not observed at the use of 0.75 M sucrose.
Новые книги
К а м к и н А.Г., К и с е л е в а И.С. Физиология и молекулярная биология мембран
клеток. М.: изд-во «Академия», 2008, 592 с.
Изложены современные представления об электрофизиологии и молекулярной биологии мембран клеток. Освещены вопросы молекулярной организации биологических мембран, пассивных электрических свойств мембран, путей перемещения ионов через мембраны клеток. Даны общие представления о струк-
122
туре и функциях ионных каналов. Описан пассивный ионный транспорт, рассматриваются
потенциалы клеток и их связь с ионными токами. Приведены молекулярная организация
и функции потенциалуправляемых натриевых, кальциевых и калиевых каналов, обсуждаются отдельные аспекты лигандуправляемых каналов, подробно рассмотрена работа
механосенситивных каналов. Представлена новая классификация каналов.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
18
Размер файла
127 Кб
Теги
животные, кровь, сельскохозяйственных, метод, активности, определение, лизоцимной
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа