close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Сойфер ЭСЕ. 8 Молекулярные основы биологических процессов - 2000 OCR

код для вставкиСкачать
УДК 576.8 Б1Ж28.4 С 56 "ГХи 658-937 Библиотеки Конгресса США Редактор энциклопедии Ю.А. Пашковский Научные редакторы разделов тома О.О. Фаворова, Н.К. Наградова, Ю.А. Владимиров, В.И. Капелько Современное естествознание: Энциклопедия: В 10 т. - М.: Издательский Дом МАГИСТР-ПРЕСС, 2000. - Т. 8. - Молекулярные основы биологических процессов. - 408 с: ил. ISBN 5-89317-140-3 (т. 8) ISBN 5-893I7-132-2 Энциклопедия «Современное естествознание» подготовлена к печати Министерством образования Российской Федерации и Международной Соросовекой Программой Образования в Области Точных Наук. Энциклопедия знакомит читателей с достижениями в области математики, физики, химии, биологии и наук о Земле за последнюю четверть века. Статьи написаны выдающимися учеными и преподавателями высшей школы, большинство из которых—соросовские лауреаты. Энциклопедия рассчитана на преподавателей средних школ, учеников старших классов, студентов и аспирантов вузов, а также на широкий круг читателей, интересующихся естественными науками, и распространяется бесплатно по библиотекам средних школ и высших учебных заведений России. Издание осуществлено на средства Правительства Российской Федерации. Copyright under International Copyright Union All rights reserved under Universal Copyright Convention by International Soros Science Education Program Никакая часть данного издания не может быть воспроизведена или использована в любой форме и любыми средствами - электронными или печатными, включая фотокопирование, ксерокопирование, с помощью компьютерной записи и путем другого электронного воспроизведения, или любыми другими способами хранения и распространения информации - без письменного разрешения издателя. Налоговая льгота—общероссийский классификатор продукции ОК-005-93, том 5; 953000 — книги, брошюры Подписано в печать 01.05.2000 г. Формат 60x90/8. Печать офсетная. Усл. печ. л. 51,0. Уч.-изд. л. 35,85. Тираж 5500 экз. Заказ № 4772. ИД№01537 от 14.04.2000 г. 119034, Москва, ул. Остоженка, д. 7/15/12, офис 16. Оригинал-макет тома предоставлен издательством «Флинта». Отпечатано с готовых диапозитивов в АООТ «Тверской полиграфический комбинат» Д. Г. Кнорре ЧТО ИЗУЧАЕТ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ? Введение Нуклеиновые кислоты как один из ком­
понентов живой материи Выли открыты в J ЯНН г. швейцарски м ученым Иоганно м Мл-
шерим Однако бурное развитие химии и био­
химии нуклеиновых кислот началось в кон­
це 411-х—начале 50-х гг. XX в.. когда былп установлено, что один из двух главных ти­
ше нуклеиновых кислот — дезоксирибонук-
леиновая кислота (ДНК) является носителем наследственной информации. На протяжении второй половины XX в. нуклеиновые кисло­
ты были важнейшим объектом исследовании химии и биологии. Химики создали методы установления детальной химической струк­
туры нуклеиновых кислот, их искусственного синтеза, изучили их поведение при разных химических воздействиях. Биохимики напра­
вили свои усилия на выяснение многочислен­
ных аспектов функционирования нуклеино­
вых кислот в живых организмах (?'n vivo) или выделенных из них биохимических системах (in vitro). На основании этих исследований было впервые показано, что строение именно этих биополимеров специально приспособлено для выполнения некоторых основополагающих био­
логических функций, в первую очередь для хранения и воспроизведения генетической ин­
формации. Другие важнейшие биополимеры — белки — являются продуктом реализации за­
пасенной в нуклеиновых кислотах генетической информации и выполняют основные биоло­
гические функции в клетке. Важнейшей группой белков являютс я ферменты, которые катализируют в живых организмах разнообразные химические ре­
акции. Область биохимии, изучающая стро­
ение и поведение нуклеиновых кислот и бел­
ков в живых и модельных системах, а также механизмы воспроизведения и реализации генетической информации, обособилась в ав­
тономную область знания, получившую на­
звание молекулярная биология. Многие вопросы биохимии нуклеиновых кислот стали азбукой естествознания, вошли не только в университетские, но и в школь­
ные учебники. Между тем изучение нукле­
иновых кислот продолжае т оставатьс я од­
ной из самых горячих точек на переднем крае современной науки. ДНК- первичный носитель наследуемой информации Среди бесчисленного разнообразия хи­
мических веществ, из которых построены живые организмы, особое положение за­
нимают два типа биологических полимеров — белки и нуклеиновые кислоты. Как и лю­
бые другие полимеры, они построены из большого числа небольших органических молекул, jHOHOjvtepoe. в случае белков — из аминокислот, в случае нуклеиновых кис­
лот— из нуклеотидов. В образовании нук­
леиновых кислот могут участвовать две группы нуклеотидов —- рибонуклеотиды и дедоксирибонуклеотиды. Первые образуют рибонуклеиновые кислоты (РНК), вторые — ДНК, В отличие от всех других полимеров, как природных, так и синтетических (со­
зданных химиками), они построены из не­
скольких разнотипных мономеров — четы­
рех в случае нуклеиновых кислот и 20 в случае белков. При этом число остатков каждого мономера в полимерной цепи и порядок их расположения (последователь­
ность мономеров) имеют глубокий биологи­
ческий смысл. В зтой статье речь будет идти в основном о биологическом смысле после­
довательностей нуклеотидов В отдельных случаях замена одной мо­
номерной единицы в огромной последователь­
ности приводит к серьезным биологическим последствиям. Известно, например, что по­
вышенная чувствительност ь к алкоголю, характерна я для многих представителе й восточных народов, связана с заменой од­
ной аминокислоты (лизина на глутаминовую кислоту) из 487 расположенных последова­
тельно аминокислот в ферменте альдегид-
дегидрогеназе. Этот фермент отвечает за удаление из организма уксусного альдеги­
да, который накапливаетс я при окислении этилового спирта. В ТО лее время В некото­
рых случаях большое число замен не ли­
шает биополимер его главной функции. Для каждого живого организма харак­
терен свой набор белков с определенными последовательностям и аминокислот. Этот набор может быть достаточно большим. По грубым оценкам, в человеческом организ ­
ме содержатс я многие десятки тысяч ра з ­
ных белков. Это, однако, ничтожна я часть от практическ и неисчерпаемог о мыслимо­
го числа белков. Ведь из 20 аминокисло т можно построить 20- 2 0 = 400 разных ди-
меров (т. е. попарно соединенных амино­
кислот), 2 0 - 2 0 - 2 0 = 203 = 8000 триме -
ров, а с ра в нит е ль н о корот ки х бе лко в длиной всего в 100 аминокислотных остат ­
к о в — 20'°° = 101М, что горазд о больше, чем число атомных яде р во всей доступ­
ной наблюдению части Вселенной ( после -
A**f КШИИвитг я КПК 10*">. t>ГГpfЛ**."**НИы«г. хярнк)1-|Ч1Ы^ дли лвннмги прганипыа Л**л-
ки m- MHI > т шмниквть случайнл При i*fi-
рекк'it* нт и и в жнппм иргвнилм*» (Стнсннте-
-И'| А«|.пк<>п Jw-тжнд t yuj+»fTStJBaTi. нч * коти pa ft упрАйляя)щ^кг ( щтема, которая содержит (гнфпрмзминр " том. квкнг именно мосле-
Л'гпип-.чь ногти амннпкисчот нужно соАирать п данном г.рганипме Первичным иатериэль-
ны» н**снтел*»м такой информации является ДНК Главным свойством живых организмов является ре о множен не. т. е. впспроиэкце ~ НИ* - Cfftff ЛПДобныХ ЧТПГР Ы И.1 ОДНОЙ р о д и * тульской КЛРТК М обжаловались две одинако­
вы** дочерние, в с-сноьном идентичные родиге.чьской, делению дол иен о предшество­
вать удвоенье всех основных компонентов клетки, в том числе ее белков и нукл^шго-
вых кислит. И в первую очередь должна уд­
воиться ДНК. чтобы в ыбеих дочерних клетках оказались программы дли образования всех свойственным родительской клетке белков и нуклеиновых киелот. Способность ДНК к сампулвоению обеспечиваетс я ее строением. Она построена ил четырех дезежсирнбонук -
леотидов, которые по первым буква м их химических названий будут в дальнейше м обозначаться латинскими буквами dA, dGT dC и dT (префикс dd?* введен для того, что-
fiu отличить их от рибонуклеотидов). Заме­
чательным свойством этих нуклеотидов яв­
ляется то, что в составе полимерной цепи ДНК dA обладает способностью избирательно (селективно} связываться (образовывать ком­
плекс с dT, a dG — с dC- Любая последова­
тельность нуклеотидое имеет определенное направление, а следовательно, вся полимер-
мал цепь имеет два различных конца, В со­
ответствии с деталями химического строе­
ния нуклеотидов один из концов обозначают как л'-конец, а против<толо»еный — как 3"-ко-
нец, Б дальнейшем направление цепи либо будет указываться, либо просто будет под­
разумеваться, что слева находится 5'-конец. В соответствии со сказанным могут существо­
вать две такие последовательности нуклео-
ТИДОБ, которые могут расположиться так* что против каждого нуклеотида одной окажется селективно взаимодействующий с ней нук-
леотид другой Такие последовательности называния комплементарными. При этом для такого взаимодействия направления цепей должны быть противоположными (антипарал­
лельными). Примерами двух комплементар­
ных последовательносте й могут служить фрагменты ДНК (S'JdAdTdGdGdCdTdAtf') и (3')dTdAdCdCdGdAdT(5'). Принцип комплементарности был сфор­
мулирован и обоснован в 1953 г* американ­
ским ученым Джеймсом Уотсоном и англий­
ским ученым Френсисом Криком. Важное значение для формулирования этого прия> Чаргаффа. который я и м з * л' "" """"J р мн и « 6 и 1 ш,г т « к и » источник.» содержит £а»ное .п л - н е с т » ЦТ и dA и равно- « ™" !^"тво dC и dC. в то время «а « С ™Т В,"1 К -
„Й С Шл»-.в с т> этим пар бывает очень раз ­
личным для разных ДНК. Сан пр»»Ц"» явился одним иа основополагающи х звенье в в ус­
тановлении пространственно й структур ы ДНК. которая оказалас ь построенной иэ двух комплементарных цепей. Таку ю структур у принято называт ь дуплексов. Принцип ким-
плементарност н обеспечивае т дублировани е информации о последовательност и нуклеп-
тидов одной цепи в другой комплементар ­
ной цепи, поскольку межд у последователь ­
ностями нуклеотидо в в комплементарны х цепях существует взаимно однозначное со­
ответствие. Поэтому если две цепи исход­
ного (родительского) дуплекса разошлись, то каждая и^ них способна управлять пост­
роением из мономеров комплементарной (до­
черней) цепи, что в итоге приведет к вос­
созданию двух дуплексов, идентичных исходному. (5- )- • AtlTdraCxecK^X^lTdAdGcCdCoAd Ad ACWV-O1) I I I I II I II I II I II I II I 1 1 I I II I 11 1 11 1 I I 1 1 I I I I (Э')" dTc^eKMGoOKcfidAdTcCcedGdTtiTdTd T - (5') dCdGdCdCdTd AoGdCdCd Ad Ad Ad A- (3') /Ш I I II 111 111 111 II II II I! <5>dAoTdC (3><JCdGdGdA{JTdCaGdGaTdTdTdT-{ 5 ) II || IN Дочерняя нить (3)-dTdAdG dGdCdGdCct AdTdCdGdGdT dTdTdT - (51) 11 1 II I H I 1 1 I I I I I I (5- )-cX3cK*KdAdAoAdA- (3") Дочерня» ни1ь Вертикальными черточками на схеме обозначены так называемые водородные связи, скрепляющие комплементарные пары нуклеотидов, причем между dT и dA су­
ществуют две, а между dC и dG — три во­
дородные СЯЯЗИ. Утверждение о способности ДНК к са-
моудпоению требует некоторого уточнения в связи с понятием об информации. Для аналогии представим себе детальнейши й проект нового здания, совершенно доста­
точный для строителей, т. е. содержащи й всю информацию о будуще м здании. Одна­
ко из сколь угодно объемистог о проекта здания не получится. Нужны строительные материалы и с пе циалис ты— строители, которые могут воспользоватьс я этой инфор­
мацией. Нужны, наконец, различные ме ­
ханизмы, с помощью которых материал ы будут доставлятьс я строителям. Совершенно VTO HjrtAt I НУЛИЧГЛЯРЯЛЯ ШОЛОГИР? 1 ан»-'""'ичн0 обстоит дело и с воспроизве­
дением новых молекул ДНК, Последователь кость нуклеотидов в каждой ил цепей — это только чертеж для создания новых моле­
кул ДНК Сколько ми выдерживать моле­
кулу ДНК — никакие новые копии сами по cefie не получатся, Нужен строительный материал— достаточный запас молекул мономеров, подготовленных для сборки но­
вых полимерных цепей. И нужно специаль­
ное устройство, которое будет осуществ­
лять шаг за шагом присоединение мономеров к растущей новой полимерной цепи. Посколь­
ку присоединение каждой следующей мо­
лекулы мономера представляет собой хими­
ческую реакцию, для образования новых цепей ДНК необходимо участие большого числа специальных белков (ферментов и других белков), которые образуют сложную структуру, называемую полимеризационным комплексом Первоначально из этого ком­
плекса был выделен фермент, названный ЛИ К-полимерами, но затем, во-первых, нашли, что в любых клетках присутствует несколько типов ДНК-полимераэ, а во-вто­
рых, обнаружили, что вместе с по л и ме ра­
зами в поли мери за ционный (или ре п лика-
ционный) комплекс входит несколько десятков других белков. ДНК-полимераз ы относятся к категории наиболее сложных, так называемых матричных ферментов. Они не только способны катализироват ь реак­
цию роста новой цепи ДНК, но на каждом шаге выбирают из четырех мономеров тот, который комплементаре н звену управляю­
щей ДНК, как Сы стоящему в очереди на подачу команды на синтез. Процесс синте­
за комплементарной дочерней цепи ДНК на одной из родительских цепей называют реп­
ликацией (см. статью О. О. Фаворовой «Реп­
ликация ДНК»'). Резюмируя сказанное, еще раз подчер­
кнем, что говоря о любой информации, в том числе биологической, мы подразуме ­
ваем некоторый материальный носитель, на котором эта информация записана, безот­
носительно к тому, с помощью каких уст­
ройств и для каких целей эта информация может быть использована. Несколько слов о формах организации ДНК в живых организмах и о ее размерах. Все живые организмы разделяют на две группы — прокариот ы и эукариоты. У про­
кариот ДНК в основном представлена од­
ной двунитевои структурой, как правило кольцевой (таким образом, для каждой из двух комплементарных цепей нельз я ука­
зать начало или конец), которая практи­
чески не обособлена от остальной части ' Статьи, на которые ссылаются авторы {здесь и далее). — см. в настоящем томе. — Прим. ред. клетки. К прокариотам относятся разнооб­
разные бактерии, Эукариотами являются многие более сложно организованные од­
ноклеточные организмы, такие, как дрожжи и инфузории, и все без исключения мно­
гоклеточные, вплоть до человека. У эука-
риот в клетке имеется четко оформленное клеточное ядро, в котором сосредоточена подавляющая часть ДНК, При этом ДНК распределена по нескольким структурам, число которых зависит от природы живо­
го организма и которое называют 1рожо-
солажы. Пс-видимому, в пределах каждой хромосомы ДНК представлена одним непре­
рывным линейным дуплексом гигантского размера — каждая из нитей может содер­
жать сотни миллионов нуклеотидов. Клетки человека содержат 23 пары хро­
мосом, причем самые крупные хромосомы содержат ДНК, построенную из более чем 200 миллионов пар нуклеотидов. Огромные успехи, достигнутые в создании высокоэф­
фективных методов определения последо­
вательностей нуклеотидов, вдохновили уче­
ных на работу по полному секвенировахию (от англ. «sequence» — последовательность) всего набора ДНК человека (генома чело­
века). Программа «Геном человека» являет­
ся сегодня одним из основных приоритетов естествознания. Задача по масштабу гран­
диозная, так как речь идет об установле­
нии последовательности размером три мил­
лиарда пар нуклеотидов для одинарного набора. Чтобы записать такую последова­
тельность на обычных листах бумаги, вме­
щающих 2500 знаков, нужно более миллиона страниц, или более тысячи томов по 1000 страниц в каждом томе. Ин фо р ма ц и о н н о е с о д е р жа н и е ДНК Очень скоро после установления прин­
ципа строения ДНК было сформулировано представление о генетическом коде, т, е. о том, как на молекуле ДНК записаны ами­
нокислотные последовательности програм­
мируемых ею белков. Из очевидных ариф­
метических соображений американский физик русского происхождения Г. Гамов пришел к выводу, что минимум три нук-
леотида ДНК должны кодировать одну ами­
нокислоту. Из четырех нуклеотидов можно составить 64 сочетания по три нуклеоти-
да, что создает даже определенную избы­
точность возможностей, поскольку существу­
ет всего 20 аминокислот. За короткий срок весь генетический кпд был расшифрован. Приводить его в этой статье нецелесооб­
разно (см. статью С. Г. Инге-Вечтонова «Как читается генетический код: правила и ис­
ключения»), но важно сказать, что сбор­
кой белков иа аминокислот ДНК непосред-
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ено/югия гпм-нно HI - управляет Дли этого существу и I T посредники п вида* т и к у л РНК, которые гитч-лпрумтпг при непосредственном уча­
стии ДНК РНК гогтонт ия четырех рибонукяепти-
лов. которые аналогично тому, как .это Г.Ы.1И сделано для ДНК, можно обозначить пуквами A, G. С и U. По своей химичес­
кой природе они очень бли.эки к нуклео-
тидаи. составляющим ДНК, причем они со­
храняют способность к илбирательному взаимодействию г соответствующими парт­
нерами, например С с С Нуклеотид V по своим свойствам в этом смысле сходен с dT Синтез новых молекул РНК осуществ­
ляется с помощью специального матрич­
ного фермента— РНК-ппяимеразы {или Вол ее точно: с помощью комплекса белков, и которых важнейшую роль играет РНК-по-
лимерала). Присоединение каждого следу­
ющего мономера к растущей полимерной цепи РНК осуществляется с участием оче­
редного нуклеотида в программирующе й ДНК, который обеспечивает отбор комп­
лементарного рибонуклеотида. В качестве программирующей ДНК-матрицы выступает одна из двух нитей ДНК в участке, где они временно разделились Нужный кусок ДНК как бы переписывается в виде РНК, в связи с чем процесс получил название транс­
крипции (от англ. «transcribe»— перепи­
сывать) (см. статью В. А. Гвоздева «Транс­
крипция и механизмы регуляции активности генов*) Если пренебречь небольшими хи­
мическими различиями между U и dT. С и dC и т. д., то можно сказать, что по­
лученная при транскрипции цель РНК иден­
тична комплементарному матрице участ­
ку нити ДНК, который временно отделялся от программирующе й нити и не участво­
вал непосредственно в транскрипции (эту нить иногда называют нетранскрибируемой). Итак, участок ДНК, содержащий инфор­
мацию о структуре определенног о белка, переписывается в виде РНК, и последняя «отправляется» к месту, в котором происходит формирование новых молекул белка. Эта РНК называется информационной, или матрич­
ной, или сокращенно мРНК. Новые моле­
кулы белка собираются на довольно слож­
но устроенных частицах, называемых рибосомами. Они состоят из нескольких мо­
лекул РНК и нескольких десятков разных белков, которые соответственно называют рибосомными РНК (сокращенно рРНК) и рибосомными белками. Для работы рибосом очень важно, что их составляющие сгруп­
пированы в две легко отделяемые друг от друга частицы (субчастицы) разного раз ­
мера — большую и малую. Что делает в ри­
босоме огромное количество разных белков — еще далеко не полностью установлено, и их чаще всего просто обозначают номерами, следующими за Оуквами S (small ) или L, (large), в зависимости от того, какой субча­
стице (малой или большой соответственно) они принадлежат (например, белки S2, 1,3 и т. д.). Каждая из субчастиц содержит по одной большой молекуле РНК, которые ха­
рактеризуются цифрами, отражающими в оп­
ределенных единицах их молекулярную массу. Например, для рибосом из кишечной палоч­
ки —• любимого объекта молекулярных био­
логов (знаменитая Escherichi a coii) — малая и большая субчастицы содержат соответствен­
но 16S и 23S рРНК (буква S обозначает так называемую единицу Сведберга, характери­
зующую скорость перемещения частиц в центробежном поле центрифуги). Роль этих РНК совершенно отлична от роли мРНК и так же, как и в случае рибосомных белков, до конца еще не установлена. Существен­
но, однако, что ДНК должна содержат ь программы и для синтеза тех РНК, которые нужны сами по себе, а не только как про­
межуточные посыльные для программиро­
вания синтеза белков. Необходимо сказат ь и еще об одной группе РНК. так называемых транспорт ­
ных (тРНК) (см. статью О О Фаворовой «Строение транспортных РНК»), На заре становления молекулярной биологии было выяснено, что в биосинтез е белка на ри­
босомах участвуют не сами аминокислоты, а продукты их присоединения к сравнитель­
но небольшим специальным молекулам РНК. При этом каждой из двадцати аминокис­
лот соответствуе т своя тРНК. а иногда и несколько разных тРНК. Следовательно, в ДНК должны быть запрограммирован ы и все последовательности, соответствующи е необходимому для данного живого организ ­
ма набору транспортных РНК. Молекул а мРНК на каждой стадии удлинения созда­
ваемой на рибосоме белковой цепи непос­
редственно участвуе т не в отборе самой аминокислоты, а в отборе той тРНК. к ко­
торой аминокислота успела присоединитьс я перед поступление м на рибосому. Основные две функции каждой тРНК заключаютс я в их способности присоединит ь определен­
ную аминокислот у ( акцепторна я функция) (подробнее об акцепторной функции тРНК см. статью О. О. Фаворовой «Транспортные РНК на первом (предрибоеомном) этапе биосинтез а белков») и приспосабливат ь (адаптировать ) эту аминокислот у к соот­
ветствующему ко до ну (одаппгерноя функ­
ция). Теперь можно коротко резюмировать, что происходит при биосинтез е белка. Ри­
босома представляе т собой довольно про­
сто устроенную молекулярну ю машину, ко­
торая способна создават ь новые молекул ы белка. При этом не имеет существенног о зна­
чения, какие именно молекул ы белка пред-
I 410 ИЗУЧАЕТ HOniKrttff^MJW ЬНУЛОТИЯ* I стоит сплавать: все* рибосомы устроены од­
нотипно Для соллання белков необходимо сырь*ъ — аминокислоты, предварительно ярик>>еплеиные к определенным тРПК. Но ятого для аффективной работы рибосом не­
достаточно, нужна программа в виде мРНК. Каждая тройка нуклеотидов (ее часто на­
ливают кодоном) последовательно связы­
вается с соответствующе й данному кодону тРНК, К концу которой прикреплена коди­
руемая аминокислота. Например, тринук-
леотид UUU в составе мРНК отберет тРНК, на которую предварительно посажена ами­
нокислота фенилаланин. То ж* самое про­
изойдет и в случае кодов a UUC. Измене­
ние одного нуклеотида в колоне может привести к изменению аминокислоты в белке. Например, описанная выше замена в фер­
менте альдегиддегидрогеназ е аминокислоты лизина на глутаминовую кислоту происходит в результате замены в соответствующей мРНК кодона AAA, кодирующего лизин, на кодон GAA. кодирующий глутаминовую кислоту. Су­
щественное изменение функции фермента происходит всего-навсего в результате за­
мены одного А на G. В отборе кодона так­
же участвуют комплементарные взаимодей­
ствия. В составе той тРНК, котора я присоединяет именно фенилаланин, имеется участок, часто называемый алтикоеЭомол, с последовательность ю (3')AAG(5'), строго комплементарный кодону WC и частично комплементарный UUU- Именно антикодон опознается и отбирается участком кодона, вошедшим в рибосому. Взаимодействие ко­
дона мРНК и антикодона тРНК являетс я ключевым информационным процессом, при котором происходит перевод информации, записанной в виде троек нуклеотидов, в со­
ответствующую последовательност ь амино­
кислот в синтезируемом белке. Поэтому син­
тез белка на рибосоме получил название трансляции (от англ. «translation» — пере­
вод). Следует уточнить, что фенилаланин, как и любая другая аминокислота, участву­
ющая в синтезе белка, присоединяетс я к соответствующе й тРНК вне рибосом с по­
мощью специальных ферментов, которые на­
зывают аминоацил-тРНК-сингпетазами (см. статью О. И. Лаврик «Специфический от­
бор аминокислот при биосинтезе белков»), поскольку фактически к тРНК присоединя­
ется не вся молекула аминокислоты, а ее часть, в которой вместо свойственной всем карбоновым кислотам карбоксильной груп­
пы СООН остается лишь фрагмент С=0. Та кие фрагменты карбоновых кислот назы­
вают ацилами. а аминокислот, соответствен­
но, аминоацилами. Аминоацил-тРНК-синте-
тазы существуют для каждой аминокислоты. Эти ферменты обладают уникальной изби­
рательностью: так, фенилаланил-тРНК-син-
гетаза из природных аминокислот способ-
I I на иметь Д4»ло только с феннлаланином, а из транспортных РНК — только с теми, ко­
торые существуют ллн переноса фенилала-
нина. Репликация, транскрипция и трансля­
ция — три основополагающих процесса жизнедеятельности. Информации о струк­
туре белков, свойственных каждому живому организму, и структуре РНК. программи­
рующих синтез этих белков, а также тех РНК, которые принимают участие в рас­
шифровке генетического кода, может рас­
сматриваться как главная в структуре ДНК. Участок ДНК, содержащий всю информа­
цию о программируемом белке, называют генолс для данного белка. Генами называют и участки ДНК, которые содержат всю не­
обходимую информацию о структуре моле­
кул РНК {таких, как рибосомные и транс­
портные). В действительности последовательнос­
тью кодирующих тринуклеотидов для син­
теза белков или последовательностью нук­
леотидов, кодирующих структуру тРНК или рРНК, содержаидаяся в ДНК информация не исчерпывается. Уже сегодня ясно, что она неизмеримо богаче. Имеются специфи­
ческие последовательности ДНК, предназ­
наченные для связывания белков, иници­
ирующих репликацию, запускающи х и останавливающих транскрипцию, вызыва­
ющих перестройки генетичрекогп матери­
ала клетки, а также, по-видимому, выпол­
няющих многие другие еще неизвестные функции по обеспечению сохранения, вос­
произведения и видоизменения генетичес­
кой информации. Новое неожиданное явление было об­
наружено в структуре генов эукариот. Ока­
залось, что смысловая последовательность, кодирующая определенную последователь ­
ность аминокислот в белке или определен­
ную последовательност ь нуклеотидов в РНК, не обязательно является непрерывной Она может содержат ь некоторые вставочные последовательности, которые получил и название инторонов. Кодирующие последо­
вательности, разделенные нитронами, на­
зывают экзонами. При транскрипции полу­
чаютс я РНК- предшественники, которые содержа т и нужные в конечной (зрелой) молекуле РНК фрагменты, и лишние, ко­
торые должны быть удалены (вырезаны) из зрелой молекулы. Каждое такое вырезание должно сопровождаться воссоединением концов последовательных экзонов, между которыми находился интрон. Этот процесс получил название сплайсинге (см статью В. А. Гвоздева «Регуляция активности ге­
нов при созревании клеточных РНК»). Сплай­
синг происходит с избирательностью, ха­
рактерной для процессов, катализируемых ферментами. До открытия сплайсинга счи-
м МОЛЕКУЛЯРНАЯ ОНОлогИя та лось общепринятым, что вер фгрмекты имеют белковую природу. Однако в ряде случаев никакие Грелки в сплайсинг е не участвуют, т е. РНК, содержаща я интро-
ны. может сама осуществлять селективную реакции», причем с довольно большой ско­
ростью В результате пришлось признать, что биологическими катализаторами могут служить не только белки, но и рибонук­
леиновые кислоты. По аналогии с энзима­
ми такие катализаторы получили название рибозимов. Открытие рибозимов послужило основой для нового представлени я о з арождени и жизни. Долгое время шли дискуссии на тему, с чего же началось становление жизни на земле — с белков или с нуклеиновых кис­
лот. Белки в отличие от нуклеиновых кис­
лот не могут самовоспроизводиться - Межд у тем, самовоспроизведени е биологически х структур — необходимое условие существо ­
вания живых существ и их эволюции А нук­
леиновые кислоты до открытия рибозимов считалис ь неспособными катализироват ь тонкие химические реакции, необходимые для практического осуществления самовос ­
произведения. Получалс я замкнутый круг. Открытие рибозимов, по крайней мере кон­
цептуально, разорвало этот замкнутый круг. Стало возможным допустить, что первона­
чально па Земле все нее появились нукле ­
иновые кислоты, которые одновре ме нн о могли служить ферментами, хотя и не очень совершенными. По мере эволюции рибози-
мы научились программироват ь и произво ­
дить новый класс биополимеро в — белки. Говоря об информационно м содержани и ДНК. нельз я не сказ ат ь о том, что оно може т изменитьс я как в результат е оши­
бок при репликации, так и при действии различных внешних факторов — облучения и обработки некоторыми химическими ре ­
агентами8. Изменения в структуре ДНК орга­
низма носят название мутаций. Мутаци я може т заключатьс я в том, что одна пара ' Важным фактором, обеспечивающим из ­
менчивость ДНК, являетс я также генетичес ­
кая рекомбинация (см. статьи В. М, Глааера «Го­
мологичная генетическа я рекомбинация » и «Генетическая рекомбинация без гомологии: про­
цессы, ведущие к перестройка м в геноме»). — Прим. ред. нуклеотидов в двух цепях превращаетс я в другую комплементарну ю пару. Это, есте­
ственно, происходят не одновременно. Сна­
чала происходит одна ошибка, например dC заменяетс я на dT При репликации dT от­
берет для введения в новую иепь dA, а не. dG, которое находилос ь в этом месте цепи у родительской ДНК. В итоге вместо пары dC - dG в дочерне й молекуле, а тем самым и во всех последующи х поколениях на зтом месте буде т находитьс я пара dT-dA Такие мутации получили название точечных му­
таций. Происходя т и более значительные по масштабу мутации. Часто, хотя далеко не всегда, мутации имеют серьезные био­
логические последствия. Известен, напри­
мер, ряд генов, которые отвечают за кон­
троль над размножение м клеток, стимулируя его до Определенног о предела и останав­
ливая в ну меной для организма фазе. Неко­
торые единичные изменения в таком гене приводят к тому, что способност ь к конт­
ролю за процессо м деления клеток теряет ­
ся и ген превращаетс я в онкогеи, т. е. ген, способствующи й неограниченному размно ­
жению клеток. В результат е этого клетки становятс я злокачественными и возникае т раковая опухоль. Заключение Таким образом, мы рассмотрел и в с жа ­
той форме основные положения, ставшие азбукой молекулярно й биологии — важней­
ше й области человеческог о знания, а так­
же основные принципы строения дву х клас ­
сов биополимеро в — белков и нуклеиновых кислот, э т и х но с ит е ле й нас ле дс т ве нно й информаци и в живых организмах. Литература 1. Кнорре Д. Г. Биохимия нуклеиновых кис-
лот//Сорос, образоват, журн., 1996, № 3, с.11. 2. Кнорре Д. Г., Мтлзина С. Д. Биологическая химия. М.: Высш. шк., 1992. В. И. Иванов А-ФОРМА ДНК Введение мплель двойной спирали ДНК Дж. Уотсона « Я и Ф- Крика (F. Crick) (так назы-
<Х Z^B-Форма ДНК) была построена в 1953 г. л «наглядно продемонстрировала, как ус-
ены гены и как они удваиваютс я при де-
ТР° и клетки. Так возникла новая область Лауки — молекулярная биология. Менее из -
ЯРСТНО что еще до открытия двойной спи-
али Р. Франклин (R. Franklin) из Лондонс­
кого королевског о колледжа получил а экспериментальные свидетельства существо­
вания весьма упорядоченно й структур ы в ориентированных вытягиванием и подсушен­
ных волокнах ДНК. Эта структура, простран­
ственное строение которой тогда еще не было установлено, получила название А-формы ДНК. Биологи мало интересовалис ь А- фор -
мой, считая, что она отличаетс я от В-ДНК, соответствующей модели Уотсона—Крика, только незначительным искажением. К тому же А-ДНК возникала при малой влажности, т. е. не при физиологических условиях — ведь в клетке воды много. Но если не ограничиватьс я теми пара ­
метрами А-ДНК, которые обычно даютс я в учебниках1, то по ряду свойств структу ­
ра А-ДНК существенно отличаетс я от уот-
сон—криковской В-ДНК. Дело в том, что пары оснований в А- форме очень сильно 1 11 пар на виток, наклон пары к оси спи­
рали 70°, диаметр спирали чуть больше 20 анг­
стрем (А), что действительно близко к В-ДНК: 10 пар на виток, наклон 90°, диаметр 20А. В-форма А-форма отодвинут ы от оси спирали к перифери и молекулы: почти на половину радиуса; сдвиг достигает 4—5 А. В В-ДНК он близок к нулю. Поэтому А-ДНК при взгляде сверху (вдоль оси спирали) выглядит как труба (рис. 1). Столь яркое различие В- и А-форм не по­
зволяет считат ь А- форму просто несколь­
ко искаженной В-формой и заставляе т за­
думатьс я о биологической роли А-ДНК. Между тем, кристаллографы выяснили молекулярну ю механику, ответственну ю за «дыру» в центре спирали А-формы. Оказа ­
лось, что пятиугольно е сахарно е кольцо дезоксирибоз ы имеет разные конфигурации в В- и А- ДНК и играет роль переключате ­
ля с двумя устойчивыми состояниями: С2-эн-
д о — у В-формы и СЗ- эндо — у А- формы (рис. 2). При переключени и из первого со­
стояния во второе пары оснований скачком отодвигаютс я от оси двойной спирали, по­
скольку сахарные кольца непосредственн о соединены с основаниями ДНК. А-семейство и В-семейство Дальнейшие исследования структур двой­
ной спирали в растворе, а также теорети­
ческие расчеты показали, что на самом деле существуют не просто две формы ДНК (А и В), но два обширных семейств а форм: А- семейств о и В-семейство. Структур ы в пределах каждог о из семейств в зависимо­
сти от условий (например, концентраци и СЗ-эндо, вид сбоку 3 N 2 С2-ЭНДО. вид сбоку С2-ЭНДО, вид сверху -О. Рис. 1. Схематические изображения А-формы и В-формы ДНК Синим цветом обозначены пары оснований. Слева — вид перпендикулярно оси спирали; справа— вид вдоль оси спирали. Обратите внимание на то, что в А-форме пары оснований отодвинуты от оси спира­
ли, образуя большое отверстие в центре Рис. 2. Две устойчивые конфигурации сахарного кольца ДНК Сахар СЗ-эндо встречается в А-форме, С2-эндо— в В-форме. Цифры— нумерация атомов сахарного кольца— пентозы. N— атом азота основания, соединенный гликозидной связью с сахаром— де-
зоксирибозой мотну/шгнлн Ш)/Ю(ия СОЛИ, ТОМПОрНТурЫ) МОГУТ ИМСТЬ рПЗМое ЧИГ.МП пар. приходящихся п« ниток спирали, pa;i ный наклон imp оснований к оси спирали и т.д. Mo все формы А-семейства характери­
зуются большим расстоянием пар оснований от оси спирали. Соотношение форм Л - и В-семейств лучше всего видно на так на­
зываемой «коиформационной карте», пред­
ставленной на рис 3. Карта для двойной спи ­
рали ДНК была впервые построена В. Б. Журкиным, К). I I. Лысовым и автором этой статьи с помощью компьютерног о тео­
ретического расчета возможных допустимых спиралей ДНК, т.е. таких, у которах атомы т 50V 45° -
40' 35е 30е 25е 0 D, А Рис. 3. Области существования форм В- и А-се-
мейств по результатам компьютерного моделирова­
ния По оси ординат— угол поворота между соседними парами оснований, т; по оси абсцисс— расстояние пар от оси спирали, D. В В-форме, у которой ось спи­
рали проходит в центре тяжести пары, величину D принимают равной нулю. Поэтому в зависимости от того, в какую сторону от оси спирали сдвинуты пары, величина D может быть либо положительной (напри­
мер, все формы А-семейства), либо отрицательной. Черта над буквами А и В на карте обозначает, что мы имеем дело со всем семейством А- или В-форм, а не с конкретной А- или В-формой. Линии овалов — границы областей равной энергии: синие —для форм В-семеЙства, красные —для форм А-семейства. Циф­
ры у линий— значения энергии (в ккал/моль) со­
гласно расчетам. Здесь существенна лишь их отно­
сительная величина. Точки внутри областей-оврагов соответствуют различным формам В- и А-семейств, обнаруженным при рентгеноструктурных исследова­
ниях ориентированных волокон ДНК и РНК. Обрати­
те внимание на левую вертикальную границу оврага А-форм. Она означает, что во всех формах А-семей­
ства пары оснований сдвинуты от оси спирали на значительное расстояние не -налезают» дру» и» Друга. Конфирмаци­
онная карта» аналогична рельефной reoipa* фической карте, только вместо параллелей у 1нч* будут величины углов полорота меж ДУ соседними парами оснований двойной спи­
рали, вместо меридианов расстояния пар оснований от оси спирали, а вместо уров­
ней равной высоты рельефа уровни рав­
ной энергии двойной спирали в расчете на одну миру оснований. На рисунке видны овальные области «овраги» "Северо-западный» овраг содержит энергетически допустимые формы 8-семей-
ства, «юго-восточный» —- формы А-семей­
ства. Внутренние овалы в каждом из овра­
гов охватывают формы, самые выгодные энергетически; внешние овалы включают формы менее выгодные, но все же допус­
тимые. Части карты вне оврагов - пусты; здесь спирали ДНК вообще не могут суще­
ствовать, так как имеют слишком невыгод­
ную анергию. Мы видим, что найденные в эксперименте формы (точки на карте) на­
ходятся либо на дне оврагов, либо побли­
зости. Классическая В-форма имеет угол поворота между нарами X = 36° (получает­
ся делением полного витка — 360° на 10 пар, приходящихся в В-форме на виток). Рас­
стояние пар от оси (D) в В-форме равно О А. На карте видно, что В-форма находится вблизи «южного» конца самой глубокой ча­
сти В-оврага. Наиболее тугозакрученные формы В-семейства с т = 45° расположены у «северного» края дна В-оврага. Что каса­
ется А-семейства, то его овраг заполнен известными А-спиралями лишь в «южной» части. Это означает, что могут быть открыты и новые, более закрученные формы А-се­
мейства. И действительно, такие участки А-спирали обнаружены в последние годы в кристаллах коротких (6—10 пар основа­
ний) образцов ДНК. Западная граница А-оврага строго вер­
тикальна и расположена вдоль линии со значением D = 2,5А. Поскольку, как уже говорилось, параметр D — это расстояние пар оснований от оси спирали, то не мо­
жет существовать никаких форм А-семей­
ства (в том числе еще не открытых в экс­
перименте) с парами в центре спирали, как, например, в В-форме. Все сказанное выше уместно рассмот­
реть с точки зрения общенаучной проблемы соотношения теории и эксперимента. Мы видим, как они взаимно дополняют друг друга. В самом деле, кристаллографический эксперимент открыл В- и А-формы ДНК. Теория (здесь это — компьютерный конфир­
мационный анализ) только утверждает, чего не может быть. В данном случае из-за того, что возникают недопустимо тесные контакты атомов ДНК друг с другом, не могут реаль­
но существовать двойные спирали с пара-
д-фОРМА ДИК метрами вне оврагов карты {D, т}. На пер­
вый взгляд может показаться, что это сви­
детельствует о примате эксперимент а над теорией, которая только что-то запрещает. Но вспомним: во всех обнаруженных в опытах формах А-семейства пары оснований силь­
но отодвинуты от оси. Сколько бы такого рода форм ни было обнаружено, всегда най­
дутся скептики, которые смогут сказать: «Кто знает, может быть в будущих экспе­
риментах мы найдем А-формы (т. е. с саха­
ром СЗ-эндо), пары оснований которых бу­
дут расположены вблиз и оси спирали?» Однако теория утверждает, что такого быть не может, так как «западная» граница форм А-семейства на карте {D, т} не приближа ­
ется к оси спирали ближе, чем на 2,5 А. Еще один аргумент в пользу большого значения теории. Расчеты показывают, что вдоль дна оврагов карт ы {D, т} энергия меняется слабо. Это означает, что даже небольшое воздействие может менять кон-
формацию спирали в пределах Б- и А-се-
мейств. В частности, даже тепловое дви­
жение при физиологических температура х приводит к флуктуация м угла закручива ­
ния двойной спирали т на 5°, что почти охватывает все протяжение дна оврага для В-семейства. Этот результат также подтвер­
ждается экспериментом. Такой вывод корен­
ным образом меняет представление о двой­
ной спирали ДНК как о жесткой структуре, содержащей 10 пар на виток в В-форме и 11 пар— в А-форме. Итак, вывод: теория и эксперимент, дополняя друг друга, позволяют нам иссле­
довать природу вещей. Как говорил Ломо­
носов, «согласие всех причин есть самый общий закон природы». А- фо рма начинае т инте ре с оват ь биолог о в Почти как всегда, открытие было не­
ожиданным. Занимаясь рутинной работой, кристаллографы начали интересоваться РНК. Хотя РНК, как правило, представляет со­
бой одну нить, эта нить, навиваясь сама на себя, может образовывать короткие уча­
стки двойной спирали. Стали исследовать Двуспиральную РНК. Оказалось, что двой­
ная спираль из цепей РНК имеет структу­
ру А-формы, и, что замечательно, даже при 100%-ной влажности, при которой ДНК — всегда в В-форме! Итак, спирали РНК — второй важней­
шей нуклеиновой кислоты — существуют в А-форме при физиологических условиях. Это Открытие сразу поставило А-конформаци ю в ряд биологически значимых. Почему же ДНК может принимать в за­
висимости от влажности и В- и А-форму, а РНК— только А-форму? Все дело в том, 15 что дополнительна я 2'ОН- групп а рибоз ы создает пространственные затруднения имен­
но в структуре В-, но не А-формы (рис. 4). Двуспиральные РНК— это А-форма, а какую форму имеет «гибрид» из одной нити РНК и одной нити ДНК? Вопрос не празд­
ный, он имее т и биологически й интерес. Известно, что репликация ДНК начинает ­
ся с синтеза короткой РНК (она потом уда­
ляется ) (об этом подробне е см. в стать е О. О. Фаворовой «Репликаци я ДНК»). Эта РНК образует гибридную двойную спираль с одной из расплетенных нитей ДНК. Како­
ва будет ее форма? Поскольку цепь ДНК может принимат ь обе формы, А и В, в то время как цепь Р НК— только А- форму, естественно ожидать, что РНК- ова я цепь заставит ДНК-овую также принять А-форму. РНК- ДНК- гибри д долже н возникат ь и в процессе транскрипции, т. е. считывания РНК по ДНК гена (см. статью В. А. Гвозде­
ва «Транскрипция и механизмы регуляции активност и генов»). Раз вива я эту идею, В. Л. Флорентье в и автор этой статьи про­
демонстрировали на молекулярных моделях, что «извлечение» оснований наружу из дву-
Рис. 4. Пространственная структура соседних зве­
ньев одной полинуклеотидной цепи в В- и А-формах Штрихпунктир слева— ось спирали. Прямоугольни­
ки — азотистые основания. Штрих в пятичленном са­
харном кольце— линия сгиба для С2-эндо (В-се-
мейство) и СЗ-эндо (А-семейство). Цифры — нуме рация атомов сахара. Отметим, что заместитель в положении 2, у которого размер больше чем v во дорода. не помещается в тесном пространстве vro" товленном для него в В-форме. В А-форме Этот 2" меститель -смотрит- наружу и тем самым н Г и м ^ т тесных контактов. Поэтому двойная спир^ ь Р Н к r V держащая в положении 2 группу о н ™ * °~ только в А-фосме 'РУппу ОН, может быть 16 МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ спиральной ДНК для спаривания с основа­
ниями растуще й цепи РНК осуществит ь легче, если прилежащий участок ДНК-мат ­
рицы находится в А-форме (рис. 5). А со­
всем недавно В. Б. Журкин предложил мо­
дифицироват ь эту модель, предположив, что основания растуще й цепи РНК взаимодей­
ствуют не с одной нитью ДНК, а сраз у с двумя, образуя так называемый «параллель­
ный триплекс » с А-подобной геометрие й нитей. Правда, следует сказать, что нали­
чие А-формы или подобной ей конформа -
ции при работе РНК- полимераз ы пока не доказано. Но зато это доказано в 1993 г. мето­
дом кристаллографи и для другого матрич­
ного фе рме нт а — обратной транскрипта -
зы вируса иммунодефицит а человека (ВИЧ), вызывающег о СПИД- Известно, что этот Рис. 5. Гипотетическая модель взаимного располо­
жения матрицы ДНК и гибридного участка РНК-ДНК при работе РНК-полимеразы Вертикальная (зеленая) спираль— участок матри­
цы ДНК в А-форме; короткая наклонная спираль справа от матрицы ДНК— гибрид ДНК-РНК. Белые цилиндры символизируют основания ДНК, черные — РНК. Поэтому цилиндры, состоящие из белых поло­
винок, соответствуют парам комплементарных ос­
нований ДНК, а цилиндры, состоящие из белой и черной половинок, относятся к гибриду ДНК-РНК. А-подобная спираль ДНК-РНК состоит их двух пар и продолжена за их пределы, чтобы показать вза­
имное расположение спиралей матрицы ДНК и гиб­
рида ДНК-РНК фермент синтезируе т не только нить ДНК по матрице РНК, но также и нить РНК по двуспирально й ДНК, т. е. может рабо­
тать как обычная РНК-полимераза. Сотруд­
ники Национальног о институт а здоровья (США) закристаллизовал и этот белок в ком­
плексе с участком его связывания на ДНК из 19 пар оснований. В расшифрованно й пространственно й структур е такого ком­
плекса четко видно, что одна половина ДНК находится в А-форме, а другая — в В-фор-
ме, так что между ними возникае т А/В граница. Это открытие показало, что био­
логическа я роль А-ДНК далее не может быть игнорирована. Еще раньше, в 1991г., А-ДНК была обнаружена в биологическом объекте, где ее присутствия никто не ожи­
дал даже теоретическ и (в отличие от рас­
смотренных выше процессов матричног о синтеза). Известно, что в неблагоприятных условия х некоторые бактерии превраща ­
ются в споры. В таком неактивном состоя­
нии они могут находитьс я сколь угодно долго, пока не появятс я подходящие ус­
ловия для размножения. В этом состоянии их ДНК окутана так называемыми споро­
выми белками. С. Mop (S. Mohr ) и его кол­
леги из Бостонског о университет а (США), используя оптические методы, убедительно показали, что ДНК при этом находится в А- форме. Спрашивается, зачем? (В биоло­
гии такой вопрос правомерен.) Оказывается, нез адолг о до этог о исследовани я было обнаружено, что ДНК в спора х гораздо более устойчива к поражающему действию ультрафиолета, чем та же ДНК в актив­
но размножающихс я бактериях. Почти в то же самое вре мя выяснили, что А-ДНК примерно в 10 раз устойчиве е к поража­
ющему дейст ви ю уль т ра фиоле т а, чем В-ДНК. Таким образом, становится ясным: споровые белки превращают ДНК бакте­
рии из В- формы в А-форму, чтобы защи­
тить ДНК. Это — один из немногих приме­
ров, когда биологическа я роль А-формы проступае т особенно явно. Есть и другие случаи, когда А-ДНК была найдена в био­
логических структура х или процессах. Их количеств о все возрастает. А-любивые и В-любивые участки ДНК Коль скоро А- ДНК биологически зна­
чима и ее роль вряд ли ограничиваетс я частными случаями, приведенными выше, закономере н вопрос: как способность ДНК превращатьс я из В- в А- форму зависит от последовательност и нуклеотидных пар в ее цепях? Конечно, этот вопрос можно задават ь независимо от того, имеет ли био­
логическое значение А-ДНК, но выясне­
ние, какие последовательност и способству-
А ФОРМА ДНК 17 ют, а какие — препятствуют В-А-переход у в ДНК, интересно прежд е всего именно для биологии. Конечная цель подобного под­
хода состоит в том, чтобы для любой з а ­
данной последовательност и пар оснований ДНК предсказат ь ее способност ь к В- А-
переходу. Несколько лет назад появился шанс ко­
личественно решит ь эту з а да чу — стало возможно синтезировать образцы ДНК нуж­
ной нам длины (10-20 пар оснований) и тре­
буемой нуклеотидной последовательности. Так как в А-форму переходит двойная спи­
раль ДНК, то нужно синтезироват ь две комплементарные друг другу нити задан­
ной длины и, смешав их, получит ь двой­
ную спираль (дуплекс). Принят о считать, что отдельная нить ДНК имеет направле ­
ние, которое обозначают стрелкой, смот­
рящей от 5' к 3' положению дезоксирибо -
зы. Таким образом, наши дуплекс ы можно представит ь схематическ и в следующе м виде: Ti. Здесь необходимо пояснить, как полу­
чают А-ДНК в растворе. Кристаллографы установили, что ДНК переходит в А-форму с понижение м относительно й влажности. Это можно сделать, добавля я в раствор неэлектролит, наприме р этанол, хорошо смешивающийс я с водой, и таким обра­
зом В-ДНК перевест и в А-форму. Для ре ­
гистрации такого перехода можно, напри­
мер, воспольз оватьс я тем, что А- ДНК вращает плоскость поляризаци и света в ближнем ультрафиолет е намного сильнее, чем В-форма, и, построив кривые В- А-
перехода, оцениват ь уве личе ни е доли А-ДНК по мере уменьшени я влажност и (рис. 6). Видно, что короткие фрагмент ы с разными нуклеотидными последователь ­
ностями сильно различаютс я по способ­
ности переходит ь в А-форму. Например, дуплекс 5'-CCCCCGGGGG-3' 3'-GGGGGCCCCC-5', записываемый как CCCCCGGGGG/ CCCCCGGGGG (здесь и далее косая черта разделяет комплементарные антипараллель ­
ные нити двойной спирали ДНК, где каж­
дая из нитей представлена в направлении 5'->3'), переходит в А-форму намного лег­
че, чем другие ДНК-дуплексы. Мы назва­
ли такие ДНК А-любивыми, в отличие от В-любивых. Десятеричный код В- А- переход а Какие же параметры, зависящи е от последовательност и пар оснований в ДНК-дуплексах, могли бы определять ту или иную способность к В-А-переходу? Рассмот­
рим сначала другой переход — давно и хо­
рошо изученный конформационный переход 0 1,0 0,5-
10 18 22 26 (100-а), % 34 Рис. 6. Профили В-А-переходов коротких двойных спиралей (10 пар оснований), построенные по изме­
нению оптической активности (круговой дихроизм) с ростом концентрации трифторэтанола По оси абсцисс вместо процентов трифторэтанола отложены соответствующие им значения (100 - а), где а— относительная влажность; по оси ординат— рост доли А-формы, 0. Синтетические фрагменты ДНК: 1 — CCCCCGGGGG, 2-ATACCGGTAT, 3 — GCTACGTAGC, 4 — CCAAGCTTGG (обозначена только одна нить в направ­
лении 5'->3'; на самом деле фрагменты — двойные спирали из антипараллельных нитей). Обратите вни­
мание, что легче всего переходит в А-форму образец 1 с максимальным количеством нуклеотидов, состав­
ляющих последовательность ССС... в ДНК, при котором нити двойной спирали разделяютс я (например, при повышении температуры). В этом случае параметрами являются температуры плавления (или со­
ответствующие им свободные энергии) AT и GC пар. АТ-богатые ДНК плавятся легче, чем GC-богатые. В процессе перехода из В- формы в А- форму пары оснований не разрываются. Они только смещаются друг относительно друга, как это видно на рис. 1. Поэтому естественно предположить, что положение кривой В-А-перехода будет оп­
ределяться той легкостью или трудностью, с какой данная пара смещается относитель­
но соседней. Сколько вариантов соседствующих пар имеется в ДНК? (Чтобы не путать терми­
ны «пара оснований» и «пара соседствую­
щих пар оснований», мы будем использо­
вать для обозначения последне й термин «контакт», т.е. примыкание соседних пар друг к другу.) Таких контактов 10 типов: АА/ТТ; AC/GT; AG/CT; AT/AT; CA/TG; CC/GG; CG/CG; GA/TC; GC/GC; ТА/ТА. Следовательно, простейшая реалистич­
ная модель В-А-перехода определяется де­
сятью параметрами — разностями свободных энергий А- и В-форм каждого из приведен­
ных контактов. Эти энергетические параметры можно определить из кривых В-А-перехо­
да, наподобие тех, что даны на рис. 6, имея достаточный набор разных ДНК-дуплексов. Мы получили следующие значения разно­
сти свободных энергий при физиологических условиях (100%-ной относительной влажно­
сти) А- и В-форм соответствующег о контакта (в ккал/моль): 18 МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ AC/GT 0,13 CA/TG 1.04 AT/AT 0,58 ТА/ТА 0,73 CC/GG 0,19 АА/ТТ 0,97 CG/CG 0,52 GC/GC 0,73 AG/CT 0,33 GA/TC 0,98 Это — «десятеричный код» соседствую­
щих пар оснований (контактов), управля ­
ющий В-А-переходом в ДНК. Контакты со­
браны в пять групп. Далее при обсуждении особенностей этого кода будет объяснено, почему такая группировка удобна. Обсудим закономерности данного кода контактов, уп­
равляющег о В-А-переходом: 1. Все 10 значений параметров — поло­
жительны. Это значит, что ДНК с какой угодно последовательность ю пар оснований при физиологически х условиях принадле ­
жит семейству В-форм. 2. Имеются два особых гомопурин/гомо-
пиримидиновых контакта CC/GG и АА/ТТ, которые главным образом определяют спо­
собность участка ДНК превращаться в А-фор-
му. В то время как разность свободных энергий А- и В-форм ДНК со случайной последова­
тельностью равна примерно 0,6 ккал/мол ь контактов, эта величина для контакта СС/ GG равна всего 0,2 ккал/моль, а для контакта АА/ТТ она в 5 раз больше, составляя при­
мерно 1 ккал/моль. Мы назвали данные кон­
такты «особыми», потому что лишь они спо­
собны образовывать протяженные А-любивые (серия контактов CC/GG, как, например, в дуплексе, приведенном выше) и В-любивые (серия контактов АА/ТТ) участки в ДНК. Хотя есть и другие А-любивые (например, АС/ GT) и В-любивые контакты (к примеру, GA/ ТС), из них невозможно соорудить протяжен­
ный участок (неважно, А-любивый или В-лю-
бивый), потому что они будут в основном ком­
пенсировать друг друга. 3. Для всех контактов приближенно вы­
полняется следующее эмпирическое правило: I ( CC+AA) =I ( AC+CA) =I ( AG+GA) =I ( AT + +TA)=£(CG+GC)=1,2 ккал/моль, где X— величина, полученна я сложением разностей свободных энергий А- и В-форм тех двух контактов, которые приведены в скобках. (Здесь и далее мы используем обо­
значение контакта только по одной нити ДНК в направлении 5'—>3'. Очевидно, что комп­
лементарна я нить определяется однозначно.) Основываясь на этом эмпирическом пра­
виле, мы и собрали контакты в пять групп. 4. Существует энергетическая комплемен-
тарность внутри приведенных пар контак­
тов: первый их них — А-любивый, второй — В-любивый. Из описанных свойств кода контактов следует, что А-любивые и В-любивые кон­
такты эффективно гасят друг друга, так что ДНК, вообще говоря, должна выглядет ь довольно гомогенной в отношении В-А-пе-
рехода, и это действительно так. Этот факт, однако, не относится к А-любивым контак­
там СС и В-любивым контактам АА, кото­
рые могут образовывать протяженные А-лю­
бивые и В-любивые участки в молекуле ДНК. Точка перехода (активность воды, %) 85 г 50 100 150 Порядковые номера нуклеотидной пары 200 Рис. 7. Линия раздела областей существования В- и А-формы вдоль фрагмента природного гена (для 5S РНК) Верхняя часть— область относительной влажности, где существует В-форма; нижняя часть— область, где су* ществует А-форма. Подробности— в тексте. Положения точек полуперехода из В- в А-форму с ростом отно­
сительной влажности взяты из статьи Бекера и Уонга. Сплошная линия — теоретическая кривая, построенная с использованием троичного кода контактов и следующих значений разности свободных энергий А- и В-форм (в ккал/моль): для АА— 1,09; для СС— 0,26; для остальных восьми контактов XY— усредненная величина 0,57. Расположение этих трех типов контактов вдоль фрагмента гена показано в нижней части рисунка. Обратите внимание на особенность у правого конца фрагмента, она обусловлена соседством достаточно длинных В- и А-любивых последовательностей (жирная более длинная полоска для последовательности СС... из 12 пар и более короткая для последовательности АА... из 8 пар) А.фОРМА ДНИ 19 Свойства десятеричног о кода контактов, охарактеризованные в пунктах 2-4, показы­
вают, что он с хорошим приближение м мо­
жет рассматриватьс я как квазитроичный, т. е. с тремя типами контактов: АА, СС и XY. В-А-переход на нуклеотидном уровне разрешения Теоретическая модель В-А-перехода, раз­
работанная нами, позволила описать кривые В-А-перехода не только протяженных ДНК, но и отдельных нуклеотидных пар в составе участка ДНК. В то же время казалось,чт о технически вряд ли возможен соответствую­
щий эксперимент по получению профиле й В-А-переходов индивидуальных пар ДНК в составе некоего фрагмента. И тем не менее такой эксперимент был выполнен в 1989 г. М. Бекером (М. Becker) и Ж. Уонгом (Zh. Wong) в Университете г. Питсбурга (США). Авторы исследовали В-А-переход на фрагменте гена одного из типов РНК (5S РНК) (о 5S РНК можно прочесть в статье А. А. Богданова «Био­
синтез белка на рибосоме — заключительный этап трансляции») длиной 270 пар. Квадраты на рис. 7 — полученные в эксперимент е Бе-
кера и Уонга положения точек полуперехода из В- в А-форму для индивидуальных звень­
ев (пар оснований) вдоль почти всей длины фрагмента ДНК. По горизонтали отложены по­
рядковые номера пар; по вертикали — точ­
ки середин переходов В-А для соответствую­
щих этим номерам звенье в (квадраты). В нижней части рисунка вдоль нуклеотидной пос­
ледовательности отмечены А-любивые СС-кон-
такты (сверху), В-любивые АА-контакты (сни­
зу) и остальные XY-контакт ы (посредине). Квадраты обозначают раздел между областью высокой влажности, где существует В-фор­
ма, и областью низкой влажности, где ста­
бильна А-форма. По существу — это своеоб­
разная фазовая диаграмма для В-А равновесия в зависимости от нуклеотидной последователь­
ности. Видно, что линия раздела «фаз» отнюдь не горизонтальна и содержит явные особен­
ности по краям фрагмента ДНК. Так, прова­
лы находятся там, где отмечены скопления В-любивых АА-контактов. Наиболее яркая осо­
бенность — у правого конца. Там вслед за сег­
ментом АААААААА с перерывом в две пары следует последовательность СССССССССССС. Эксперимент Бекера и Уонга впервые на при­
мере природной ДНК подтвердил В- и А-лю-
бивый характер этих контактов. Сравнение теории с экспериментом На рис. 7 наряду с экспериментальны­
ми точками видна сплошная линия, прове­
денная по точкам или близко от них. Мож­
но подумать, что это просто сглаживающа я кривая. Но это не так. Это — теоретичес ­
кая кривая, построенная на основе нашей модели для В-А-перехода. Модель исполь­
зует несколько энергетических параметров: уже упомянутый код контактов, причем в упрощенной квазитроичной форме; энергию границы (стыка) между участками молеку­
лы ДНК в А- и В-форме; наконец, статис-
тико-механическо е описание кооперативных переходов. Сказанное трудно понять неспе­
циалисту без детальног о разъяснения. Тем не менее обращаем внимание читателя на то, что линия, вьющаяс я около точек, те­
оретическ и рассчитана нами совершенно независимо от эксперимента Бекера и Уонга (хотя, конечно, для той же нуклеотидной последовательности). Видно, что она прак­
тически всюду ложится на эксперименталь ­
ные точки, включая «волны» в средней ча­
сти графика, воспринимавшиес я ранее как следствие неизбежных экспериментальных ошибок. Можно заметить, что отклонения вниз совпадают с появление м В-любивых контакто в или их групп, а отклонени я вверх — А-любивых. Заключение Биологическа я роль А-ДНК — часть об­
щей проблемы существования различных структурных форм этой молекулы, таких как левозакрученна я Z-форма и более слож­
ные пространственные конструкции. К пос­
ледним относится крестообразная структура, различног о рода тройные и даже четвер­
ные спирали. Такого рода конформаци и сейча с принят о наз ыват ь «необычными структурами» ДНК, т. е. альтернативными по отношению к ее В- форме. Все такие структуры, включая А-форму, имеют при физиологических условиях более высокую энергию, чем В-ДНК. В завершение можно провести аналогию между электронными состояниями низкомо­
лекулярных соединений в химии и конфор-
мационными состояниями макромолекул в биологии. Подобно тому, как химические ре­
акции не могут быть поняты без учета высо­
коэнергетических (возбужденных) электрон­
ных состояний, так и биологические функции ДНК не могут быть до конца поняты без уче­
та ее высокоэнергетических конформацион-
ных состояний (необычных структур). Литература 1. Иванов В. И. Метаморфозы двойной спи­
рали //Химия и жизнь, 1980, т. 2, с. 36. 2. Иванов В. И., МинченковаЛ.Е. А-форма ДНК: в поисках биологической роли//Молеку-
ляр. биология, 1994, т. 28, с. 1258. 3. Фаворова О. О. Сохранение ДНК в ряду по­
колений: репликация ДНК //Сорос, образоват журн., 1996, №4, с. 11. ^в*т. о. о. Оаворова СТРОЕНИЕ ТРАНСПОРТНЫХ РНК Вв е д е ни е Молекулы транспортной РНК ( тРНЮ играют главную роль в Биосинтезе белков, доставляя активированные остатки амино-
кислот н рибосомы и включал мх в соответ­
ствии с программой, записанной в матрич­
ное или информационной. РНК (мРНК), на законное место s растущей цепи белка. В соответствии с этой функцией в клетке су­
ществует семейство молекул тРНК, каж-
Рис* 1- Универсальная укладка полинуклеотидной цепи тРНК\ названная «клеверным лис том -
Каждому нуклеотилу присвоен свой номер; нумера­
ция идет от 5J- и Зг-концу. Жирно обведенными зе­
леными кружками показаны консервативные ил'и по-
луконсервативные нукЛеОТИДы. Прямыми Линиями обозначены формирующие двойную спираль водо­
родные связи между комплементарными нуклеотид-
ными остатками; их число постоянно во всея тРМК, Пунктиром обозначена непостоянная л бра. Нукл^о-
тидьг. входящие в антикодон, обозначены розовым цветом Желтыми овалами показаны нуклеотидыч отсутствующие в структуре многих тРНк; ДЛА еди­
ной нумерации иуклеотидов «клеверного листа» в различных гРНК этим «необязательным» нуклеоТи-
дам присвоены особые номера. Если тРНК короче 76 муклеотидов, то пропускается отсутствующий ну*> леотид (чаще всего 17-й или 47-й) да я из которых дол тки а ковалентно связы-* ватьс я с определенным аминокислотным остатком и в то we время имет ь в своем составе нуклеотидный триплет, комплемен­
тарный кодону мРНК для этой аминокис ­
лоты. Другими словами. т РНК выполняют функцию адаптеро в ( переходников ) между аминокислото й и соответствующи м ей Кп-
доном. Поскольк у аминокисло т 20, то и со­
ответствующи х им РНК- а да пт е ро в должно быть не меньше; в действительност и одной D-петля ®' &( 5' ©" ©-
©-
©-
©-
0 -
©-
®А ©с (j»\c (тз) - © -© Акцепторный /•~\. стебель -© -® -© -© -®v : ® Z0J I I I &2J О-стебепь Актиюдоиовый стебель ©• ^2к - ® ^® Т-петля О— W А^икодоновая петля t ipOiM*i гг'лт ппртныя rft* яиинтии'Л'РП' 'raiTO сшпнетг i пу н P«4«'I,I I,K'J различим* 'i J'l I K, if числи 1 шт н T H U K H одном i»|iifli<M.iMi- нрепыжает. чащр :ша'|И -
|[шк<'Л1.ку молекулы T I'I I K имеют (рТМ'Р-
cirpe 41.но пеГрольоте размеры, многие об-
щис закономерност и строения РН К омли раскрыты имснт» на н«лгнулал зтого тигг&. И 1'i HTI.r (П1ИГЙИМ иерНИЧНнЯ, НТОрНЧНЯЯ И li|iin'T|iai1rTWHii«H структурl.i молекул т ГНК. Первичная структура тРНК Впервые нуклеотидна я последонатель-
1п>гть молекулы т РН К - - дрожжевой алани-
гюной т РНК — Пыла расшифрована в 1чо5 г. н лаборатории I* Холли (R. Но||еу|. С тех пир СРЫЛ И опубликованы данные » нуклеотилкой последовательност и (называемой первичной гтрухтурнй) более чем 170)1 видов различ­
ных т РНК H:I организмов, принадлежащи х к парэствам прокариот, эукариот и архебак -
тсрий И я лтого числа только 500 последо­
вательностей определены непосредственным анализом ст рукт у р различных т Р НК, чт о связано в первую очередь с трудностью их выделения в чистом виде. Для остальных 1200 видов т РН К определяли нуклеотидные пос­
ле дователЬност и кодирующи х их генов, а затем ДНК-последовательности переписывали в форме кодируемых РНК В число расшиф­
рованных тРНК входит почти полный набор молекул этого типа из некоторых бактерий и из дрожжей. Из тРНК человека, которые кодируются примерно 1300 генами на гап­
лоидный геном, расшифрована пока только незначительная часть. Все тРНК имеют ряд общих черт как в их первичной структуре, так и в способе складывания полинуклеотиднОЙ цепи во вто­
ричную структур у за счет взаимодействий между основаниями нуклеотидных остатков. На рис. 1 представлены универсальные черты первичной и вторичной структур тРНК из прокариот и цитоплазмы эукариот. Помимо цитоплаэматически х тРНК, кодируемых ядерной ДНК, в эукариотических клетках имеются особые виды тРНК, кодируемые автономными геномами митохондрий и хло-
ропластов. Особенности строения таких тРНК будут описаны отдельно, тРНК — довольно небольшие молекулы; длина их цепей варьирует от 74 до 95 нук­
леотидных остатков. Все тРНК имеют оди­
наковый З'-конец, построенный из двух ос­
татков цитозина и одного — аденоэина (ССА-конец). Именно 3'-конце вой аденозин связывается с аминокислотным остатком при образовании аминоацил-тРНК. ССА-конец присоединяется ко многим тРНК с помощью специального фермента; в других случаях он считывается с кодирующего данную тРНК гена. Нуклеотидный триплет, комплементар-
11 ныи колину дли ииинокиглгрти (пмглыког^ок)t находится приблизительно в середине цепи т РНК В отдельных положениях Последова­
тельности Пр&К I ИЧеСКИ у ЬСеХ нИДин т РНК ветречннртея одни и те же {ко кг е рва тп ил -
нмеу нуклеотидные остатки В некоторых по­
ложениях могут находиться или только пу-
риновые. или тольк о пиримидиковые грснования 1нх называют полу консерватив­
ными остатками). Для всех молекул тРНК характерно присутствие большого числа |до 25^ всех остатков) разнообразных кодифицирован­
ных нуклеозидов, часто называемых ми­
норными Они образуются в различных местах молекул, во многих случаях чет­
ко определенных, в результате модифи­
кации обычных нуклеоэидных остатков с помощью специальных ферментов. Общий список выявленных в тРНК модифициро­
ванных нуклеозидов превышает 60 назва­
ний; среди них много метилированных про­
изводных, часто встречаются псевдоуридин (5-рибофуракозилурацил), 5,6-дигидроури-
дин, 4-тиоуридин, инозин и мн др Вторична я структур а т РНК Анализ ну клеотидной последовательности уже первой расшифрованной дрожжевой аланиноной тРНК ныянил возможность скла­
дывания цепи во вторичную структуру за счет взаимокомплемент арности участков цепи. На рис. 1 показано, что три фрагмента цепи оказываются комплементарными при складывании их на себя, образуя шпиль-
кообрааные структуры. Кроме того, 5'-ко-
нец комплементарен участку, близкому к З'-концу цепи, при их антипараллельно м расположении; они формируют так назы­
ваемый акцепторный стебель. В результате образуется структура, характеризующая ­
ся наличием четырех стеблей и трех пе­
тель, которая получила название «клевер­
ного листа». Стебель с петлей формируют ветвь. В нижней части рисунка расположена актикодонова л ветвь, содержаща я анти-
ко до новый триплет в составе своей петли. Слева и справа от нее расположены D- и T-eemau, соответственн о названные так из-за присутствия в их петлях необычных консервативных нуклеозидов дигидроури-
дина (D) и тимидина (Т). Самое удивитель ­
ное заключаетс я в том, что нуклеотидные последовательност и всех изученных тРНК могут быть сложены в аналогичные струк­
туры. В дополнение к трем петлям "клевер­
ного листа» в структуре тРНК выделяют также дополнительную, ИЛ И вариабельную, петлю (V-петлю). Ее размеры резко раз ­
личаются у разных тРНК, варьиру я от 4 до 21 нуклеотида, а по последним данным и до 24 нуклеотидов (рис. 1). 11 МОРСКУЛЯРНЛЯ БИОЛОГИЯ Двутяж*»вы* стебли, имеюшмр постоян­
нее чмслл спаренных нуклеотидов, лред-
гтавллют соблй двойную спираль. На виток Я7ЧЮ спирали прихпдится ] ] пар nytwufuTwl-
нык остатков; она близка tm параметрам к А-форир ДНК {си статью В. И. Иванова -А-фпрма ДНК») Неспаренные участки молекулы тРНК (петли и ССА-конец) так­
же имеют вторичную структуру: несколь­
ко расположенных друг за другом нуклео-
тидных остатков образуют однотяжевую спираль за счрт меж плоскостных взаимо­
действий их оснований (так называемый ст.чкин? основании), Пространственна я ( третичная ) структура тРНК Ияобрзжение тРНК в виде -клеверного листал на плоскости имеет такое же от­
ношение к реальной пространственно й структуре молекулы, как развертка куба. Изображенная на листе бумаги, — к трех­
мерному кубу Впервые трехмерная струк­
тура тРНК была установлена в лаборатории А Рича (A. Rich) в 1974 Т. для дрожже­
вой фенилаланиновой тРНК с помощью рен тге неструктурно го анализа ее кристаллов. С тех пор удалось закристаллизоват ь и расшифровать пространственную структу­
ру еще почти десятка тРНК из дрожжей и кишечной палочки. Общие принципы складывания цепей различных тРНК в компактную третичную структуру оказались универсальными. За счет взаимодействия элементов вторичной струк­
туры формируется третична я структура, которая получила название L-формы из-за сходства с латинской буквой L (рис. 2, б и 3). За счет стэкинга оснований акцепторный стебель и Т-стеоель -клеверного листа» об­
разуют одну непрерывную двойную спираль (одну из «палочек '-доменов' буквы L), а два других стебля — антикодоновый и D — Дру­
гую непрерывную двойную спираль (второй домен). При этом D- и Т-петли оказываются сближенными и скрепляются между собой путем образования дополнительных, часто необычных, пар оснований. В образовании этих пар, как правило, принимают участие консервативные или полуконсервативные остатки; в свете этого становится ясным, зачем они присутствуют в D- и Т-петлях. Ана­
логичные «третичные» взаимодействия скреп­
ляют и некоторые другие участки L-структуры. ССА-конец тРНК и ее анти­
кодоновый триплет находятся на максималь­
ном удалении один от другого (расстояние около в нм). причем основания антикодона обращены внутрь угла L-образной молеку­
лы Ход нуклеотидной цепи тРНК в трехмер­
ной структуре на рис. 3 можно проследить, основываясь на схематическом изображении, представленном на рис. 2, б. Индивидуальные различия в первичной структуре отдельных нидов тРНК проявля­
ют себя на уровне как вторичной, так и тре­
тичной структур. Известные структуры тРНК, специфичных для разных аминокислот, раз­
личаются величиной угла между доменами L-структуры и рядом других деталей. Изоакцепторные тРНК Как уже отмечалось, в каждой клетке присутствует более чем 20 видов индивиду­
альных тРНК, Так, в кишечной палочке име-
1 Домены — компактно уложенные комби­
нации элементов вторичной структуры биопо­
лимеров — белков или нуклеиновых кислот. Рис. 2. Схематическое изображение, показывающее, как структура •клевер­
ного листа- (а) укладывается в две дву-
слиральные области (домены), форми­
рующие L-форму тРНК (б) Пунктиром показаны участки структуры тРНК, длина которых варьирует. R, г— пу­
рины и У,у — пиримидины у веек (за­
главные буквы) и у большинства (строч­
ные буквы) тРНК. Красным цветом обо­
значен акцепторный стебель, розовым, зеленым и ааиггым- D-, Т- и антикодо-
новая ветви соответственно Акцепторный стебель О- стебель ЛнгжодомоеыА стебель Антнкодоновая петля Рис. 3. С*ема L-обраэной трехмерной структуры фенилалэниновои тРНК, на которой участки лолинук-
леотидной цепи представлены или в форме сверну­
той с}ранхевоЛ л^нгы, или н форме зеленого тнжа Двуспиральмая область стеблей формируется из двух явит, однонитевые петли изображены тяжами. Видно, что D- и Т-петли находятся в очень тесном контакте ется 45 видов тРНК, кодируемых различны­
ми генами. Это связано с тем, что несколько различных тРНК могут соединяться с одной и той же аминокислотой; такие тРНК назы­
ваются изоакцептарными. Разные изоакцеп-
торные тРНК могут узнавать разные кодоны для данной аминокислоты. Если {в соответствии с кодовым словарем) аминокислота кодируется четырьмя и более кодонами (см. статью С Г. Ин-
ге-Вечтомова «Как читается генетический код: правила и исключения»), то для нее обяза­
тельно существуют две или более изоакцеп-
торных тРНК с разными антикодонами С другой стороны, в некоторых случаях иэоакцептор-
ные тРНК, различающиес я по первичной структуре, могут иметь одинаковые или по­
хожие антикодоны и узнавать одни и те же кодоны. Для таких изоакцепторов не обнару­
жено функциональных различий, и их назна­
чение остается совершенно непонятным. На­
конец, известны и иэоакцепторные тРНК, кодируемые одним и тем же геном; в этом случае иэоакцепторы с различной первичной структурой возникают в результате химической модификации отдельных нуклеотидов у час­
ти молекул. Особенности строения тРНК оргаиелл Хлоропласты и митохондрии эукариоти-
ческих клеток содержа т автономно репли­
цирующиес я геномы и все компоненты, Н*|>бх'1ЛИКЬГ*' ДЛЯ транскрипции и трансля­
ции их генетической информации. Часть этих компонентов, в частн*к:тн тРНК. кодируется геномом (фганелл, а другие копируютс я ядерной ДНК и латеи поступает в органеллы. тРНК хлоропластов похожи по строению на эубактериальные тРНК, что считается следствием симбиотическог п происхождения хлоропластув- Все хлоропластные тРНК ук ­
ладываются в классическую структуру «кле­
верного листа* и, как правило, содержат консервативные и полуконсервативные ос­
нов а н и я. За исключением интохондриалъных тРНК растений, которые укладываются в обыч­
ный «клеверный лист», митохондрия л ьные тРНК имеют целую палитру необычных структурных свойств. У многих из них не обнаружено ряда консервативных нуклео-
тидов, вовлеченных в формирование вторич­
ной и третичной структур в * классических * тРНК. В митохондриальных тРНК животных в большей или меньшей степени укорочены Т- и D-петли. Особенно необычно строение митохондриальных тРНК паразитических червей нематод Они значительно короче, чем «классические» тРНК; их длина составляет от 54 до 65 нуклеотидов. Во вторичной струк­
туре этих тРНК отсутствует либо D-аетвь, либо одновременно Т-ветвь и вариабельная петля. Пространственная структура митохон­
дриальных тРНК не установлена. Заключение Молекулы тРНК —«первопроходцы» среди нуклеиновых кислот. Из-за своих небольших размеров они ранее других раскрывали ис­
следователям секреты своего строения. Так, дрожжевая аланинован тРНК стала вообше первой расшифрованной нуклеиновой кисло­
той. тРНК оказались также первыми предста­
вителями природных полирибокуклеотидов, которые удалось закристаллизоват ь и изучить методом рентгеноструктурног о анализа. По­
этому неудивительно, что современные пред­
ставлений о принципах организации вторич­
ной и третичной структур РНК практически полностью основаны на данных о структуре тРНК. Сказанное, конечно, не означает, что все РНК укладываются в структуры «клевер­
ного листа» и L-формы, но для всех них ха­
рактерно образование шпилъкообразных эле­
ментов вторичной структуры и контакты менаду последними, обеспечивающи е свертывани е молекулы в третичную структуру. Литература 1, Киселев Л, Л., Фаеорова О. 0., Лаврик О- И. Биосинтеэ белков от аминокислот до амино-
ацил-тРНК. М.: Наука, 19В4. 2, Спирин А, С. Молекулярна я биология. Структура рибосомы и биосинтеэ белка, М.: Высш. шк., 1886. РЕПЛИКАЦИЯ ДНК Введение Способность клеток поддерживат ь высо­
кую упорядоченност ь своей организации зависит от генетической информации, ко­
торая сохраняется в форме дезоксирибонук-
леиновой кислот ы (ДНК). Раз множени е живых организмов, передача наследствен­
ных свойств из поколения в поколение и развитие многоклеточног о организма воз ­
можны потому, что ДНК способна к само­
воспроизведению. На языке молекулярно й биологии процесс самовоспроизведения ДНК называется репликацией. Иногда используют синоним — редупликация. Представление о молекулах ДНК как о потенциально веч­
ных репликатора х привело к парадоксаль ­
ной идее, что живые организмы — лишь «машины для выживания», запрограммиро ­
ванные на сохранение «эгоистичных» моле­
кул, известных под названием генов. В этой статье будут описаны молекуляр­
ные механизмы, обеспечивающие реплика ­
цию ДНК. Мы увидим, что для репликации ДНК требуется участие множества белков. О Эти белки, как и все другие, закодирова­
ны в последовательност и ДНК. Таким обра­
зом, возникает важнейшая для жизни «петля обратной связи»: ДНК направляе т синтез белков, которые синтезируют (реплицируют) ДНК (см. статью Д. Г. Кнорре «Что изучает молекулярна я биология?»). Матричный синтез ДНК Как известно, генетическа я информация записана в цепи ДНК в виде последователь­
ности нуклеотидных остатков, содержащих одно из четыре х гетероциклически х осно­
ваний: аденин (А), гуанин (G), цитозин (С) и тимин (Т) (рис. 1). Предложенна я Дж. Уот-
соном и Ф. Криком в 1953 г. модель строе­
ния ДНК в форме регулярной двойной спи­
рали (рис. 2) сраз у же позволила понять принцип удвоения ДНК. Информационно е содержание обеих цепей ДНК идентично, так как кажда я из них содержит последо­
вательност ь нуклеотидов, строго соответ­
ствующую последовательност и другой цепи. Это соответстви е достигаетс я благодаря Рис. 1. Фрагмент полинуклеотидной цепи ДНК Пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G) и пи-
римидиновые основания тимин (Т) и цитозин (С) яв­
ляются боковыми группами, прикрепленными на оди­
наковом расстоянии друг от друга к полимерному остову, состоящему из чередующихся остатков фос­
фата и сахара дезоксирибозы; этот остов полярен, поскольку имеет неравноценные 5'- и З'-концы ЫПЛИКАЦИЯ ДНК 25 Малая бороздка 3,6 нм нм Рис. 2. Модель структуры ДНК по Уотсону и Крику, в дальнейшем получившей название В-формы ДНК Две спиральные полинуклеотидные цепи закручены вправо вокруг общей оси. Основания изображены красным цветом; против каждого остатка пуриново-
го основания (заштрихованы) одной цепи находится остаток пиримидиновог о основания другой цепи. На схеме показаны размеры спирали, наличие большой и малой бороздок и антипараллельность двух цепей ДНК. Исходно предполагалось, что на виток спирали приходится 10 пар оснований, или 3,4 нм. Последую­
щие измерения показали, что виток соответствует 10,5 пар оснований, или 3,6 нм наличию водородных связей между направ­
ленными навстречу друг другу основания­
ми двух цепей — попарно G и С или А и Т. Описывая это свойство двойной спирали, молекулярные биологи говорят, что цепи ДНК комплементарны за счет образования уотсон—криковских пар G-C и А-Т. Посколь­
ку две цепи имеют противоположную по­
лярность, их называют антипараллельны-
ми. Легко представить, что удвоение ДНК происходит вследствие того, что цепи рас­
ходятся, а потом каждая цепь служит мат­
рицей, на которой собирается комплемен­
тарная ей новая цепь ДНК. Б результат е образуются две дочерние, двуспиральные, не отличимые по строению от родительс­
кой ДНК молекулы. Каждая из них состоит из одной цепи исходной родительской мо­
лекулы ДНК и одной вновь синтезирован­
ной цепи. Такой механизм репликации ДНК, при котором от одного поколения к друго­
му передается одна из двух цепей, состав­
ляющих родительскую молекулу ДНК, по­
лучил название полуконсервативног о и был экспериментально доказан в 1958 г. М. Ме-
зельсоном и Ф. Сталь. ДНК-пол имеразы В 1957 г. А. Корнберг обнаружил у ки­
шечной палочки (E.coli) фермент, катали­
зирующий процесс полимеризации ДНК из нуклеотидов, названный ДНК-полимеразой. Затем ДНК-полимераз ы были выявлены и в других организмах. Субстратами всех этих ферментов служат дезоксирибонук -
леозидтрифосфат ы (дНТФ), полимеризу-
ющиеся на одноцепочечной ДНК-матрице. ДНК-полимераз ы последовательно нара­
щивают одноцепочечную цепь ДНК, шаг за шагом присоединяя к ней следующие звенья в направлении от 5"- к З'-концу, причем выбор очередного дНТФ диктуется матрицей (рис. 3). Все ДНК-полимераз ы работают на любых последовательностя х нуклеотидов матрицы, синтезируя ее точ­
ную копию. Присоединение каждого но­
вого нуклеотидног о остатка к З'-концу растущей цепи сопровождаетс я гидроли­
зом богатой энергией связи между первым и вторым фосфатными остатками в дНТФ и отщепление м пирофосфата, что делает реакцию в целом энергетически выгодной. В активный центр ДНК-полимера з входит ион Zn2+; он обеспечивае т правильну ю взаимную ориентацию реагирующих хими­
ческих групп. В зависимости от сложности выполняе­
мых ими функций и от того, какому орга­
низму они принадлежат, ДНК-полимераз ы могут быть построены из различного коли­
чества белковых цепей (субъединиц), от одной до десятков (см. статью Н. К. Наг-
радовой «Олигомерная структура фермен­
тов и ее функциональна я роль»). В каждой клетке обычно присутствуе т несколько типов ДНК-полимераз, выполняющих раз­
личные функции. Те из них, которые во­
влечены в синтез длинных цепей ДНК в про­
цессе ее репликации, стали называт ь •репликазами. Другие ДНК-полимеразы могут «заделывать » короткие одноцепочечные бреши в двуцепочечной ДНК или же рабо­
тать как экзонуклеазы, удаляя, например, дефектный участок одной из цепей ДНК. В последнем случае они катализируют гид­
ролитическое расщепление ДНК с одного из ее концов. Для выполнения именно та­
кой функции в бактериальной клетке пред­
назначен открытый А. Корнбергом фермент ДНК-полимераз а I. ДНК-полимераз ы явля­
ются ключевыми ферментами процессов, обеспечивающих сохранение ДНК в ряду поколений: не только репликации, но и репарации и рекомбинаци и (см. статьи 26 МОЛЕКУЛЯРНАЯ ВИОппгия ДНК-матрица 5' T C A A A C G T G T А G U U T G С Удлинение цепи 16 C A A A C G T G T A G U U T G С G ®U ОН он он он он + (РГР РНК-затравка Растущая цепь ДНК — ОН 1я Удлинение цепи Присоединяемый дНТФ 4 v ' Отщепленный В цепь ДНК вклю- Г|ирофосфат чился неправильно спаренный нуклеотид Вырезаниие "неправильного" нуклеотида Цепь ДНК удлинилась на 1 звено Отщепленный пирофосфат Цепь ДНК укоротилась на 1 звено ®\^ О Н Отщепленный нуклеотид Рис. 3. ДНК-полимераз ы катализируют при наличии РНК-затравки синтез ДНК из дезоксирибонуклеозидтри -
фосфатов (дНТФ), комплементарных нуклеотидам ДНК-матрицы, наращивая цепь по одному звену (стадия 1а). Они проверяют правильность подбора последней пары оснований и в случае присоединения неправильно спаренног о нуклеотида (стадия 16) вырезают его (стадия 2) РНК-затравка отличается от ДНК структурой сахарног о остатка (содержит вместо 2'-дезоксирибоз ы рибозу, что схематически отражено как наличие ОН-группы) и присутствием основания урацила (U) вместо тимина (Т) В. Н. Сойфера «Репараци я генетически х повреждений» и В.М. Глазера «Гомологич­
ная генетическа я рекомбинация»). Точность синтеза ДНК и механиз м коррекции Генетический материа л живых организ ­
мов имеет огромные размеры и реплици­
руется с высокой точностью. В среднем в процессе воспроизведения генома млекопи­
тающего, состоящего из ДНК длиной 3 млрд пар нуклеотидов, возникает не более трех ошибок. При этом ДНК синтезируетс я чрез ­
вычайно быстро (скорость ее полимериза ­
ции колеблетс я в пределах от 500 нуклео-
тидов/с у бактерий до 50 нуклеотидов/с у млекопитающих). Высокая точность репли­
кации, наряд у с ее высокой скоростью, обеспечиваетс я наличием специальных ме­
ханизмов, осуществляющих коррекцию^ т. е. устраняющих ошибки. Суть механизма коррекции заключается в том, что ДНК-полимераз ы дважды проверя­
ют соответствие каждого нуклеотида матри­
це: один раз перед включением его в состав растущей цепи и второй раз перед тем, как включить следующий нуклеотид (рис. 3). Оче­
редная фосфодиэфирна я связь синтезирует ­
ся лишь в том случае, если последний (З'-кон-
цевой) нуклеотид растущей цепи ДНК обра­
зовал правильную уотсон—криковскую пару с соответствующим нуклеотидом матрицы. Если же на предыдущей стадии реакции произошло ошибочное спаривание оснований, то даль­
нейшая полимеризация останавливается до тех пор, пока ошибка не будет исправлена. Для этого фермент перемещается в обратном на­
правлении и вырезает последнее добавленное звено, после чего его место может занять пра­
вильный нуклеотид-предшественник. Иными словами, многие (но не все) ДНК-полимера­
зы обладают, помимо 5'-3'-синтетической ак­
тивности, еще и 3'-гидролизующе й активно­
стью, которая обеспечивает удаление ошибочно спаренных с матрицей нуклеотидов. Основные принципы репликации Основные правила, в соответствии с которыми происходит репликация, были выяснены в опытах с бактериями, однако они справедлив ы также для высших орга­
низмов. Инициация цепей ДНК ДНК- полимераз ы не могут начинат ь синтеза ДНК на матрице, а способны толь­
ко добавлять новые дезоксирибонуклеотид -
РЕПЛИКАЦИЯ ДНК 27 ные звенья к З'-концу уже имеющейся по-
линуклеотидной цепи, называемой затрав­
кой. Короткую РНК- затравк у (рис. 3) син­
тезируе т из рибонуклеозидтрифосфато в фермент, не обладающий корректирующе й активностью и называемый ДИК-праймазой (от англ. «primer» — затравка). Праймазна я активность может принадлежат ь либо от­
дельному ферменту, либо одной из субъ­
единиц ДНК-полимеразы. Затравка, синте­
зированная этим «неточным» ферментом, не умеющим исправлят ь ошибки, отличаетс я от остальной новосинтезированно й цепи ДНК, поскольку состоит из рибонуклеоти-
дов, и в дальнейшем может быть удалена. Образовавшиес я бреши з астраиваютс я ДНК-полимеразо й с высокой точностью. Расплетание двойной спирали ДНК Поскольку синтез ДНК происходит на одноцепочечной матрице, ему должно пред­
шествовать обязательное разделение (хотя бы на время) двух цепей ДНК. Исследова­
ния, проведенные в начале 1960-х гг. на реплицирующихс я хромосомах, выявили особую четко ограниченную область репли­
кации, перемещающуюс я вдоль родительс­
кой спирали ДНК и характеризующуюс я местным расхождением двух ее цепей. Эта активная область из-за своей Y-образной формы была названа репликационной вил­
кой. Именно в ней ДНК-полимераз ы синте­
зируют дочерние молекулы ДНК. С помощью электронной микроскопии реплицирующей­
ся ДНК удалось установить, что область, которая уже реплицирована, имеет вид «глаз­
ка» внутри нереплицировавшейся ДНК. Важно отметить, что репликациопный глазок об­
разуется только в тех местах молекулы, где находятся специфические нуклеотидные последовательности. Эти последовательнос ­
ти, получившие название точек начала реп­
ликации, состоят приблизительно из 300 нуклеотидов. В зависимости от того, в од­
ном или в двух направлениях происходит репликация (а это зависит от природы орга­
низма), глазок содержит одну или две реп-
ликационные вилки (рис. 4). Последовательное движение репликационной вилки приводит к расширению глазка. Двойная спираль ДНК весьма стабиль­
на; для того, чтобы она раскрылась, не­
обходимы особые белки. Ферменты ДИК-
хеликазы «садятся» на ДНК с помощью специальных инициаторных белков, свя­
зывающихся с точками начала репликации, и раскрывают двойную спираль. Хеликаз ы способны быстро двигаться по одиночной Цепи ДНК, используя для своего переме­
щения энергию гидролиза АТФ. Встретив на своем пути участок двойной спирали, они разрывают водородные связи между осно­
ваниями, разделяют цепи и продвигают Точка начала репликации Родительская ДНК ^W Точка начала репликации Реплика ционный глазок с одной вилкой mmmrnmrnmimj • жм ч _, / Точка начала Релли^ционная Репликационный Репликации глазок м с двумя вилками ^ v Ж ' шшшшшшш// Репликационная вилка 4 Репликационная вилка Рис. 4. Образование репликационного глазка с од­
ной или двумя репликационными вилками (обведе­
ны овалом) Черные стрелки показывают направление, в котором расплетается родительская ДНК. Красным обозна­
чены новосинтезированные цепи дочерних молекул ДНК репликационну ю вилку. Вслед за этим с одиночными цепями ДНК, не позволяя им сомкнуться, связываются специальные де­
стабилизирующие спираль белки. При этом они не закрывают оснований ДНК, остав­
ляя их доступными для спаривания. Не следует забывать, что комплемен­
тарные цепи ДНК закручены одна вокруг другой в спираль. Следовательно, для того чтобы репликационная вилка могла продви­
гаться вперед, вся еще не удвоенная часть ДНК должна была бы очень быстро вращать­
ся. Эта топологическая проблема решается путем образования в спирали своего рода «шарниров», позволяющих цепям ДНК рас­
крутиться. Принадлежащие к особому классу белки, называемые ДНК-топоизомеразами, делают в цепях ДНК разрывы, позволяю­
щие цепям разделиться, а затем «зашива­
ют» эти разрывы. В зависимости от того, одно- или двухцепочечные временные раз­
рывы вносит в ДНК фермент, различают топоизомеразы I и П. Топоизомераза I «про­
тягивает» одну цепь через разрыв, сделан­
ный в другой цепи, а топоизомераз а II — двухцепочечную ДНК через разрыв во вто­
ром дуплексе. В зависимости от типа топо­
изомеразы разрывы производятся с обра-
28 МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ зованием 5'- Р и З'-ОН-концов или же З'- Р и 5*-ОН-концов ДНК, и для их последую­
щего замыкания не требуется дополнитель ­
ной энергии. Это достигается благодаря тому, что тирозиновый остаток фермент а кова-
лентно связываетс я с Р-концом разорван­
ной цепи ДНК, и тем самым энергия разор­
ванной фосфодиэфирно й связи сохраняется. Топоизомераз ы участвуют также в расцеп­
лении зацепленных двухцепочечных колец, образующихс я при репликации кольцевых двунитевых ДНК. С помощью этих важных ферментов двойная спираль ДНК в клетке может принимат ь «недокрученную» форму с меньшим числом витков; в такой ДНК легче происходит расхождение двух цепей ДНК в репликационно й вилке. Прерывистый синте з ДНК Легко вообразить, что репликация про­
исходит путем непрерывног о роста обеих новых цепей, нуклеотид за нуклеотидом, по мере перемещения репликационной вил­
ки. При этом, поскольку цепи в спирали ДНК антипараллельны, одна из дочерних цепей должна была бы расти в направлении 5'- 3', а другая в направлении 3'-5'. Однако ока­
залось, что дочерние цепи растут только в направлении 5*-3', т. е. всегда удлиняетс я З'-конец затравки, а матрица считываетс я ДНК-полимеразо й в направлении 3'-5'. На первый взгляд это кажетс я несовместимым с движением репликационно й вилки в од­
ном направлении и одновременным считы­
ванием двух антипараллельных нитей. Сек-" рет заключаетс я в том, что синтез ДНК происходит непрерывно только на одной из матричных цепей. На второй матричной цепи ДНК синтезируется сравнительно короткими фрагментами (длиной от 100 до 1000 нук-
леотидов, в зависимости от вида), назван­
ными по имени обнаружившег о их учено­
го фрагментами Оказаки (рис. 5). Таким 5*_ 3-
I I I I I I I I j, З'с. Ведущая цепь РНК-затравки Отстающая цепь ^ - 3* Рис. 5. Строение репликацион­
ной вилки Направление синтеза ДНК совпадает с направлени­
ем расплетания двойной спирали лишь для одной из новосинтезированных цепей (ведущей). Вторая цепь (отстающая) синтезируется прерывисто, в виде коротких фрагментов Оказаки, В результате обе до­
черние цепи растут в направлении от 5' к 3' образом, репликация матричных цепей ис­
ходной молекулы ДНК значительно разли­
чается. Вновь образованна я непрерывно синтезируема я цепь называетс я ведущей а другая, собираемая из фрагментов Ока­
заки, отстающей. Синтез каждого из этих фрагментов начинаетс я с РНК-затравки. Чере з некоторое время РНК-затравк и уда­
ляются, бреши застраиваютс я ДНК-поли­
меразой, и фрагмент ы сшиваются в одну непрерывную цепь ДНК специальным фер­
ментом — ДНК-лигазой. Кооперативное действие белков репликационной вилки До сих пор мы говорили об участии от­
дельных белков в репликации так, как будто они работают независимо друг от друга. Между тем в действительност и большая часть этих белков объединена в крупный комплекс, который быстро движется вдоль ДНК и согласованно с высокой точностью осуществляе т процесс репликации. Этот комплекс сравнивают с крошечной швейной машиной, «деталями» которой служат от­
дельные белки, а источником энергии — реакция гидролиза нуклеозидтрифосфатов. На рис. 6 изображена репликационна я вилка и показано, как работают отдельные части такой «репликационно й машины». Спираль расплетается ДНК-хеликазой. Этому процесс у помогают ДНК-топоизомераза, раскручивающа я цепи ДНК, и множество молекул дестабилизирующег о белка, свя­
зывающихс я с обеими одиночными цепями ДНК. В област и вилки действуют две ДНК-полимераз ы — на ведущей и отстаю­
щей цепях. На ведущей цепи ДНК-полиме-
раза работает непрерывно, а на отстающей фермент время от времени прерывает и вновь возобновляет свою работу, завершая один фрагмент Оказаки и переходя к синтезу следующего. В обоих случаях ДНК-полиме-
раза использует короткие РНК-затравки, синтезируемые ДНК-праймазой: одну-един-
ственную на ведущей цепи и по одной на каждый фрагмент Оказаки на отстающей цепи. Молекула ДНК-праймаз ы непосред­
ственно связана с ДНК-хеликазой, образуя структуру, называемую праймосомой. Прай-
мосома движется в направлении раскрыва­
ния репликационной вилки и по ходу свое­
го движения синтезирует РНК-затравку для фрагментов Оказаки. В этом же направле­
нии движетс я ДНК-полимераз а ведущей цепи и, хотя на первый взгляд это трудно представить, ДНК-полимераз а отстающей цепи. Для этого, как полагают, последняя складывает цепь ДНК, которая служит ей матрицей, саму на себя, что и обеспечи­
вает разворот ДНК-полимераз ы отстающей цепи на 180°. Согласованное движение двух РЕПЛИКАЦИЯ ДНК 29 Рис. 6. Схематическое располо­
жение в репликационной вилке ос­
новных белков, осуществляющих репликацию ДНК В действительности ДНК-хелика-
эа и ДНК-праймаза на отстающей цепи образуют комплекс, получив­
ший название праймосомы Матрица для синтеза ведущей цепи Новосинтезированная цепь ДНК-полимераза на ведущей цепи Топоизомераза Дестаб и л и зи рующий Праймаэа белок Матрица для синтеза отстающей цепи ДНК-полимераза, заканчивающая синтез фрагмента Оказаки на отстающей цепи ДНК- полимера з обеспечивае т координиро ­
ванную репликаци ю обеих нитей. Таким образом в репликационно й вилке одновре ­
менно работает множество разных белков (из которых мы назвали только часть), осу­
ществля я сложный, высокоупорядоченный и энергоемкий процесс. Исследования последнег о десятилети я показали, что у Ecoli синте з ведуще й и отстающей цепей в репликационно й вилке осуществляетс я единственно й молекуло й холофермента 1 ДНК-полимераз ы III, кото­
рая содержит две идентичные субъедини­
цы с ДНК-полимеразно й активностью. Хо-
лофермент ДНК-полимераз ы III состоит из 10 типов субъединиц, объединенных в че­
тыре различных функциональных компонен­
та (рис. 7): 1) так называемый минимальный фе р ­
мент, который содержит субъединицы, об­
ладающие ДНК-полимеразно й и корректи­
рующей З'-экзонуклеазно й активностями; 2) димер из (5-субъединиц (Р-димер), построенный как кольцо, з акрепляюще е холофермент на матрице; таким способом Р-димер обеспечивае т непрерывно е удли­
нение дочерне й цепи, за что и получил образное название «скользящег о зажима»; 3) у-комплекс, или «установщик з а жи ­
ма», который замыкае т кольцо (3-димера на ДНК, используя энергию расщепления АТФ; 4) связующий белок (т-димер), который связывает воедино два входящих в состав холофермент а минимальных фермент а и один у-комплекс. Двухстадийный процес с з акреплени я холофермента на комплексе ДНК-матрицы с РНК-затравко й схематически изображе н на рис. 7, а. На первой стадии у-комплекс Холофермент — полный каталитически ЛНт?ВНЫЙ Фе р м е н т в месте с коферментом (у ДНК-полимеразы отсутствует) или ионом металла \У ДНК-полимеразы — ион Zn2+). устанавливае т связанный с ним р-димер на двойной спирали ДНК- РНК и замыкае т его в непрерывное кольцо, центральна я полость которого достаточно велика, чтобы пропу­
стить через себя дуплекс. Далее у-комплекс, оставаясь в составе холофермент а ДНК-по­
лимераз ы III, диссоциируе т с двойной спи­
рали ДНК-РНК, а его место занимает «ми­
нимальный фермент». Связывание последнего с (3-димером обеспечивае т практически не­
ограниченную способность ДНК-полимераз ы на ра щива т ь шаг з а шагом от З'- конц а РНК-затравк и дочернюю цепь ДНК. И только когда минимальный фермент достигает конца матрицы или «упирается» в 5'-конец ранее синтезированног о фрагмент а Оказаки (см. рис. 5), он расстаетс я и с ДНК и со «сколь­
зящим зажимом». Присутствие Р-димера в составе ДНК-полимераз ы III являетс я аб­
солютно необходимым для эффективног о удвоения хромосомы E.coli: р2-зажим не толь­
ко закрепляе т фермент на матрице, но и обеспечивает увеличение скорости полиме­
ризации от ~20 до ~750 нуклеотидов в се­
кунду. Согласованный синтез ведущей и отста­
ющей цепей в репликационно й вилке мож­
но представит ь как результа т работы двух «минимальных ферментов» одного холофер­
мента ДНК-полимераз ы III (рис. 7, б). Бу­
дучи связанными в единое целое т-димером, одна ДНК-полимераз а синтезируе т ведущую цепь, другая — фрагмент Оказаки отстаю­
щей цепи, а у-комплекс в это время уста ­
навливае т Р2 - з ажим на З'- конц е новой РНК- затравки, синтезированно й праймосо-
мой, и тем самым подготавливае т условия для синтез а нового фрагмент а Оказ аки. Общее представлени е о работе «реплика ­
ционной машины» прокариот при таком рас­
смотрении становитс я намного более чет ­
ким. У эукариот синтез ведущей и отстающей нитей осуществляют две разные ДНК- по-
30 МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ лимеразы, для которых пока не выявлено физических контактов. Однако и у эукари-
от обнаружен кольцевой белок со свойства­
ми «скользящег о зажима», построенный не из двух, а из трех идентичных субъединиц. Согласованность процессов репликации ДНК и клеточного деления Независимо от того, содержит клетка только одну хромосому (как у прокариот ) или много хромосом (как у эукариот), за период времени, соответствующи й одному клеточному делению, весь геном, т. е. вся ДНК клетки, долже н быть реплицирова н только один раз. Сигналом к началу удвое­
ния служит связывание регуляторног о ини-
циаторного белка со специфической после­
довательность ю точки начала репликации ДНК; только после этого становится воз­
можным формировани е репликационно й вилки (см. рис. 4). Процесс репликации хромосомы бакте­
рий начинается, как уже говорилось выше, в одной единственной точке начала репли­
кации и продолжаетс я до тех пор, пока не удвоится вся ДНК хромосомы. Поэтому мож­
но сказать, что бактериальна я хромосома представляе т собой единицу репликации, получившу ю название репликон. Начало репликации неизбежно влечет за собой даль-
Минимальный фермент у-комплекс АДф Ведущая цепь Праймосома Отстающая цепь Рис. 7. Строение и функционирование холофермента ДНК-полимеразы III Холофермент состоит из четырех различных функциональных компонентов: минимального фермента (пред­
ставлен двумя копиями); р-димера, или «скользящего зажима»; у-комплекса, или «установщика зажима»; связу­
ющего белка (i-димера). ДНК-матрица изображена черной линией, РНК-затравка— зеленой, а — двухстадий-
ная сборка холофермента ДНК-полимеразы III на комплексе ДНК-матрицы и РНК-затравки, у-комплекс узнает матрицу с затравкой и использует энергию гидролиза АТФ для того, чтобы закрепить связанный с ним р-димер на ДНК. На второй стадии у-комплекс легко диссоциирует с ДНК и может приступить к установке р-димера на другую матрицу, а во взаимодействие с той же стороной кольца р-димера на комплексе матрицы с затравкой вступает минимальный фермент; б— предполагаемое действие холофермента ДНК-полимеразы в репликаци­
онной вилке. Два минимальных фермента на двух тяжах вилки схематично изображены в противоположной Ориентации. Чтобы холофермент мог перемещаться в направлении движения репликационной вилки (синяя стрелка), матрицу для отстающей цепи надо развернуть на 180° (не показано). Остальные разъяснения см. в тексте РЕПЛИКАЦИЯ ДНК 31 нейшее деление клетки, однако происхо ­
дит оно только после завершени я репли­
кации. Удвоенные геномы разделяютс я по одному в кажду ю дочернюю клетку. Эукариотическа я клетка перед каждым делением должна синтезироват ь копии всех своих хромосом. Репликаци я ДНК эукарио-
тической хромосомы осуществляетс я посред­
ством разделения хромосомы на множество отдельных репликонов. Такие репликоны активируютс я не все одновременно, одна­
ко клеточному делению должна предшество­
вать обязательна я однократна я репликация каждог о из них. Из сказанног о ясно, что по хромосоме эукариот в каждый момент времени может двигатьс я независимо друг от друга множество репликационных вилок. Остановка продвижения вилки происходит только при столкновении с другой вилкой, движущейс я в противоположно м направле ­
нии, или по достижении конца хромосомы. В результат е вся ДНК хромосомы оказы­
вается реплицированной. После сборки на молекуле ДНК хромосомных белков кажда я пара хромосом в процессе митоза упорядо­
чение разделяетс я по дочерним клеткам. Заключение Процесс репликации ДНК согласован с клеточным деление м и требует совместно­
го действия многих белков. В нем участву­
ют: 1) ДНК- хеликаз а и дестабилизирующи е белки; они расплетают двойную спираль родительской ДНК и формируют реплика -
ционную вилку; 2) ДНК- полимеразы, которые катали­
зируют синте з полинуклеотидных цепей ДНК всегда в направлении 5'- 3', копируя в репликационно й вилке ДНК- матриц у с высокой степенью точности. Поскольку две цепи двойной спирали ДНК антипараллель -
ны, непрерывно синтезируетс я лишь одна из двух цепей, ведущая; друга я цепь, от­
стающая, синтезируетс я в виде коротких фрагменто в Оказаки, которые затем сши­
ваются. Важную роль в полимеризации де-
зоксирибонуклеотидо в играет кольцевой бе­
лок со свойствами «скользящег о зажима», удерживающи й ДНК- полимераз у на мат­
рице. ДНК-полимераз ы способны к исправ­
лению собственных ошибок, но не могут самостоятельно начать синтез новой цепи; 3) ДНК-праймаза, которая катализируе т короткие молекулы РНК-затравки. Впослед­
ствии фрагмент ы РНК удаляются — их за­
меняет ДНК; 4) ДНК- топоиз омераз ы, помогающи е решить проблемы кручения и спутывания спирали ДНК; 5) инициаторные белки, связывающиес я в точке начала репликации и способствую­
щие образованию нового репликационног о глазка с одной или двумя вилками. В каж­
дой из вилок вслед за инициаторными бел­
ками к расплетенной ДНК сначала присое­
диняется белковый комплекс, состоящий из ДНК-хеликаз ы и ДНК-праймаз ы (праймосо-
ма). Затем к праймосоме добавляются дру­
гие белки и возникает «репликационная ма­
шина», которая и осуществляет синтез ДНК. Литература 1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. Пер. с англ. М.г Мир, 1994, т. 2, с. 287—301. 2. Докинз Р. Эгоистичный ген. Пер. с англ. М.: Мир, 1993. 3. Лъюин Б. Гены. Пер. с англ. М.: Мир, 1987, с. 396—431. 4. Молекулярная биология. Структура и био­
синтез нуклеиновых кислот /Под. ред. акад. А.С. Спирина. М.: Высш. шк., 1990, с. 44—73. В. И. Сойфер РЕПАРАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ Введение •"eiiajiiiumt i-i-iri-j M'U'CKH K повреждений -
смонгтно жннмх оргинипмов гекттанапливаТ!, |(<|||)н-жл1<|<111|. nii.ihrimijiii c и ЛИК п реаул!,-
РИЛ - Hip:p>ii'm-r»ml p-">iHoip6pa:"rl>ix мутнг^чгнмх ф:*кто[нш к:*к радиационной, так и кимичес-
КОЙ мрироДГ-Г Оно омло открыт о ОТНОСИ'М'ль-
Им Ш'Дапнр!, мепрч» Полувека на;}ад. Н 1Гн1г'|гш1црч- нргми опис-лно много реак­
ци й репарации. Одни боДрч1 прсн'тм И проис­
ходят немедленно ноеле мутаген Hon p шг щей -
П'вин. друг ие требуют индук ци и синтез а новых ферментом и поэтому растянуты во нремг-ни. Некоторые- реакции идут до того, как клетки иступят н новую фн,чу делении. Другие Могут ОСУЩЕСТВЛЯТЬСЯ И После ТОГО, как клетка itaкончила деление (при :»-тм часть повреждений в геноме сохраняемся неитре-
парироьанной). Есть совершенно удивитель­
ные реакции, когда клетки ^старанится* спасти свою жи:?нь пеной введения новых мутаций. Исследование процессов репарации идет пол­
ным ходом, новые и новые принципы, а не только отдельные детали уже известного «ко­
стяка > реакций появляются в печати каждый год. Опубликовано много книг, посвященных репарации и связи ее с мутагенезом. Сейчас стало очевидным, что от того, как клетк и справляются с повреждениями, зависит не прост» возникновение мутаций, но и такие кардинальные процессы, как появление на­
следственных болезней и раковых опухолей, старение. По-видимому, репарация сыграла ведущую роль в эволюции живых существ. Основные принципы различных реакций репарации Фот ореак т ив аци я и друг и е виды «прямой» репарации А. Фотореактиваци я В 1949 г. немецкий генетик Альберт Кель­
нер, бежавший из гитлеровской Германии в США, обнаружил, что в клетках бакте­
рий и грибов, таких, как стрептомицет ы и пенициллы, облученных ультрафиолетовым (УФ} светом, а затем перенесенных на ви­
димый свет, частот а мутаци й падает, а выживаемост ь резко возрастае т по срав ­
нению с клет ками, оставленным и после облучени я в темноте. Кельне р прише л к выводу, что на свет у проходя т реакци и восстановлени я и какие- т о поврежденные молекул ы или част и их воз вращаютс я к норме. Нужн о подчеркнуть, что в 1949 г. оолшнинстн о геиетикня и lite иг понимали ведущим (юли ДНК в наследственности, имели весьма <:мутные представлени и о структур е хромосом и даже не :*налв, что дрожж и и другие гриСы — нукариоты. Ц(,„ ;*тому ррб-ьяснение, данное Кельнерг»м BfK,_ становлению повреждений на свету. Пыл» по-нистпятему пионерским Макс Дельбрюк, другой эмигрант и:* Германии, будущий Нобелевский лауреат, подсказал Кельнеру название для описанног о им явления — фотореактивация. В том же 1Й49 г. сходный процесс Пыл найден у бактериальных ви­
русов и высших организмов — в яйцах мор­
ской лвелды. В кратком обзоре невозможно описать сколько-нибудь подробно историю того, кап открытие Кельнера обрастало новыми и новыми подробностями. Можно лишь ска­
зать, что к чести первооткрывателя фото-
реактивации он быстро пришел к выводу, что за процесс исправления ответственна простая реакция в наследственном аппарате. Этот вывод был сделан еще до знаменитой работы Дж. Уотсона и Ф. Крика, в которой они в 1953 г, постулировали существование ДНК в виде двойных спиралей и приписа­
ли ДНК функцию наследственных молекул. В 1958 г. был впервые выделен фермент, осуществляющий фотореактивацию, кото­
рый сейчас называют фотолиазой. В 1960 г. голландские ученые Р. Бьюкерс и У. Берендс изучили химию процесса повреждения нук­
леиновых кислот УФ-светом и выделили специфический продукт, который возникал только в том случае, если колебания ни­
тей ДНК сводили к минимуму путем замо­
раживания растворов. Оказалось, что двой­
ная связ ь между пятым и шестым атомами углерода в составе пиримидиновых основа­
ний (тимине и цитозине в ДНК и цитозине и урациле в РНК) под действием УФ-све-
та может рваться. Атомы остаются связан­
ными одиночной связью, а в результат е разрыва другой связ и образуются две сво­
бодные валентности. Обычно ДНК в клет­
ках находятс я в так называемой В-форме, когда плоскости оснований параллельны друг друг у и расстояни е между плоскостями равно примерно 3,4 А. Это расстояние ока­
з ыв а е т с я ка к ра з таким, чтобы освобо­
дившиес я при УФ-облучени и валентности между С5- С6 атомами пиримидиновых ос­
нований, расположенных рядом в цепи ДНК, могли замкнутьс я друг на друга и сформи­
ровать более сложное, так называемое цик-
лобутановое кольцо: яти РАЦИЯ гснстичиких повреждений И Тимин о н \ /2 3\_ Ъвмф-N 1 4Cs=0 / \6J{ Фосфат \ V/4 \ / 6 5V Caxap-Nl 4C=0 / >£# Тимин Тимин \ / \ / Caiap-N C=0 O+J ФОС' \ s н / </ Сахар-N / W Димер тимина (циклобутановый димер) Довольно часто употребляют и другой термин для его обозначения — димер пи-
римидиновых оснований. В зависимости от того, какие основания соединены в димер, их называют димерами тимина, димерами цитозина или тимин-цитоэиновыми димера­
ми- Если димеризация произошла в РНК, то могут возникнут ь димеры урацила и любого другого пиримидиновог о основания. Фотореактиьация заключается в том, что фермент фотолиз за расщепляе т вновь об­
разовавшиес я связи между соседними пи-
римидиновыми основаниями и восстанавли­
вает нативную структуру, В 1963 г, фотолиаза была выделена и очищена. В настояще е время выяснено, что в фотолиаз е есть уча­
сток, либо сам служащий светочувствитель ­
ным центром, который способен поглощать фотоны (в синей части спектра), либо свя­
зывающийся с кофакторами, поглощающими свет. Хотя тонкие реакции механизма по­
глощения света фотол пазами до сих пор до конца не поняты, ясно, что свет активи­
рует фотолиазу, которая затем распозна­
ет димеры в облученной ДНК, присоединя­
ется к ним и разрывае т возникшие между ииримидиновыми кольцами связи. После это­
го фотолиаз а отходит от ДНК. Прямое вос­
становление структуры ДНК на этом завер­
шено. Это единственна я пока найденна я ферментная реакция, в которой фактором активации служит не химическая энергия, а энергия видимого света. Все остальные типы репарации не требуют активации све­
том и потому первое время носили собира­
тельное название «темновая репарация». Сейчас этот термин практически не встре ­
чается Б, Репарация О6-алкилированног о гуа нина Советский генетик И. А. Рапопор т в 1944—1948 гг. нашел новый класс химичес ­
ких мутагенов — алкилирующи е агенты, способные добавлять к взаимодействующи м с ними молекулам алкильньге (метиловые, этиловые, пропило вые, бутиловые) боковые группы. Аналогичный результат вскоре был получен английским генетиком Шарлоттой Ауэрбах. В конце 60- х гг. стало ясно, что эти мутагены алкилируют пуриновые и пиримидиновые основания в ДНК. Один из наиболее мощных алкилирующих мутаге­
нов, метил-нитро-нитрозогуанидин, может алкилировать гуанин, присоединяя метиль-
ную группу к кислороду, связанному с ше­
стым атомом кольца: СНз О !Цн нг м-' ^ н Полученный продукт был назван 0*- ме -
тил-гуанином [или сокращенно 0*-меГ). В 1978—1979 гг. генетики и биохимики обна­
ружили, что мети льна я группа может от­
щепляться от гуанина и тогда происходит прямое восстановление структуры ДНК в этой точке. В 1982—1988 гг. было установ­
лено, что такой же механиз м функциони­
рует при репарации 0*-алкилтимина (СУ-алТ). Последующие исследования показали, что в клетках есть белки метилтран сферазы, которые могут захватывать ыетильные груп­
пы от модифицированног о гуанина и бла­
годаря этому восстанавливат ь исходну ю структуру ДНК. Интересно отметить, что метилтрансфераз а, захватив метильну ю группу, не может от нее освободиться. Тем самым в прямом смысле эти белки не фе р­
менты, так как последние не изменяютс я в ход е реакций. Если для каждог о акта прямой репарации О'-меГ или О'-злТ нужна новая молекула белка, клетка вынуждена запустит ь синте з новых его порций. Как правило, внутри клетки их накапливаетс я несколько тысяч, чтобы обеспечит ь нуж­
ды репарации: по одной молекуле уходит на одно повреждение. Бели процесс возник­
новения новых повреждени й в ДНК идет медленнее, чем синтез новых порций бел­
ков, то последних хватае т на захват всех метильных групп в гуанинах и мутации не возникают. Если же скорость внесения но­
вых повреждений превышае т скорость син­
теза белков, последние перестают справ­
ляться со всеми повреждениями и в клетках накапливаютс я мутации. За одну минуту в клетке Е.сой может синтезироватьс я порядка 100 молекул метилтрансфераз. Следователь­
но, мутации не возникнут, если скорость возникновения О'-меГ повреждени й буде т меньше 100 в минуту Для справки: кишеч­
ные палочки делятс я каждые 30 мин и. ПОЛ1К УЛЯРЦЛЯ БИППОГИВ Таблица I О с н о в н ы е т и п ы о б н а р у ж е н н ы х к н а с т о я щ е м у Фермент 1 'ra-ДМК- г липни л аш J f mil • Л \ \ К -г лико *илага ?-rtn - ДИК ч лнктнлаи) \lx -Jl\IK i л и к ) шла ia мис мл *ia Mut Y- ДНК ч лнкотлача 3- тА- ДНК- г ликот.ила м Г 3 т А Д Н К гликтила^а 1Г FaPy- Д Н К-глнкоэнлэг а 5_{| -НТ-ДНК-глнио1нла:м ( I K -
донухле» а I I I ) РО- ДНК- гликоэилаэ а Субстрат ДНК, содержащая урацил ЛНК. содержащая оксичетнлурацил ДНК. соаержлщал 5-нстилиитозии ДНК. солержзша* гилоксантнн /ШК, содержащая ошибочную пару ас-
нпваннй Г Т (1 -Т-киСмЭтЧ) ДНК. солсржаи(ая ошибочную пару ос­
нований ( А< Г А-чисч'*тч:} ДНК. содержащая 3-нгтнлалеинн ДНКЧ еслержаида 3-мстнладенин, 7-метнлгуанин или З-мстнлгуанин ДНК, содержащая остатки формамтщр-
пнримнлннов или Б-окснгуанин ДНК, солержлщая ЗгА-гидрятиропйнни с остатки тнмина Д Н К, содержащая димеры пнричидинов в р е м е н и г л и к о з и л а з" Продукт рсакимн "~ Урамил + АП-сайт Оксиметнлураинл + АП-саАт >-нстнлцкто1ин + АП-сайт Гнпоксантмн + АП-caft r Тнмин -•- АП- с* ит Аденнн +- АП- сайт 3-четнладеннн + АП-сайт 3-метнладеНнн, 7 метцлгуакин или 3-метнлгуанн н +- АП-сайт 2,6-лиамнно-4-оксн -
З- ^мггалформамндопцримндн н turn 8-оксигуанин + АП- сайт ^.б- днгидрокст^дротими н илИ 5,6-дигищкхгимн н Пиримццн новые ди меры с гндролизо-
вакными З^-глнхйзцдныни емпя-
мм + АЛ- сайт ы * HJ КН.. Pj-iedtier^, E., WalhrT, G., Siede, W. DNA Repair and Mutagenesis. Wash. (D.C.V ASM Press, 199b. Печатается с разрешения авторов. таким образом, клетка за один клеточный цикл может накопить не более 3000 метил-
тр а нефе раз. В. Репарация однонитевых разрывов ДНК Еще один тип реакций прямой репара­
ции был обнаружен для однонитевых раз­
рывов ДНК, индуцируемых, например, ионизирующим излучением. При этом с по­
мощью фермента ДНК иолинуклеотидлигазы {от лат. «ligo» —связываю) происходит пря­
мое воссоединение разорванных концов в молекуле ДНК. Г. Репарация АП-сайтов за счет прямой вставки пуринов Голландский ученый Т. Линдал в 1979 г. нашел, что при некоторых типах повреж­
дений пуриновых оснований ковалентная связь между основанием и сахаром (глико-
зидная связь) может рваться. Тогда в мо­
лекуле ДНК на месте этих оснований об­
разуется брешь, названная АП-сайтом. Термин приложим также к случаям, когда из ДНК выпадают пиримидиновые основа­
ния (термин АП-сайт, таким образом, объе­
диняет все случаи выщеплекия оснований с образованием и апуриновых и апирими-
диновых сайтов). Описаны ферменты, на­
званные инсертазами (от англ. «insert» — вставлять), которые могут вставлять в брешь такое же основание, какое было до пора­
жения, и соединять его с сахаром. Струк­
тура ДНК приобретает исходный неповреж­
денный вид. Эксцизионная репарация Существуют более сложные реакции восстановления, напоминающие хирургичес­
кие вмешательства в структуру ДНК, ког­
да поврежденные участки вырезаются из цепи ДНК (отсюда происходит и термин *эк-
сцизионная репарация», от лат. «excisio» — вырезание), а затем образовавшиеся бре­
ши заполняются неповрежденным матери­
алом. А. Вырезание поврежденных оснований гликоэилазами и застройка АП-сайтов К настоящему времени описано много типов ферментов-гликозилаз, каждый из которых узнает разнообразные поврежден­
ные основания (такие, как метилированные, окисленные, восстановленные, дезаминиро-
ванные основания, основании, связанные РЕПАРАЦИЙ генетически* повреждений и с фпрмамидными группировками, и т.п.. таГзл. I). Гликозилая ы прис ое диняе тс я к Нин. рвут гл и к обидные с в ля и между модифици­
рованным основанием и сахаром депокси-
риГжэой, яа счет чего образуются АП-сай-
ты. АП-сайт распинается теперь другим ф*фментом. АП-эндонуклеалой1. Последние найдены у бактерий, растений, животных, включая человека. Как только в нити ДНК возникает разрыв, в работу вступает еще один фермент— фосфодиэ стера за: он от­
щепляет от ДНК ту сахарофосфатную груп­
пу, к которой теперь не присоединено ос­
нование. Появляется брешь в одной цепи ДНК размером в один нуклеотид. Напротив бре­
ши в противоположной нити ДНК располо­
жен неповрежденный нуклеотид. и следу­
ющий фермент — ДНК-полимераэ а I вставляет в брешь комплементарный ему нуклеотид. присоединяя его к свободному З'ОН-концу. Чтобы соединить два свободных конца (З'ОН-конец вставленного нуклеоти-
да и 5'-конец, ранее образовавшийся при разрыве нити ДНК АП-эндонуклеазой), всту­
пает в действие еще один фермент — по­
ли нуклеотидлигаза. Теперь вся структура ДНК полностью восстановлена: неправиль­
ное основание удалено, сахарофосфат, к которому это основание было прикрепле­
но, вырезан из нити ДНК, брешь заполне­
на правильным нуклеотидом, и все одно-
нитевые разрывы залечены. Поскольку последовательност ь реакций запущена в действие путем расщепления гликозидной связи, этот вид репарации получил назва­
ние «вырезание оснований с помощью гли-
козилаз». Б. Вырезание нуклеотидов Другим типом эксцизионной репарации является более сложная и энергетически более дорогая реакция вырезания не про­
сто поврежденного основания, а значитель­
ного участка цепи ДНК перед и позади по­
вреждения (рис. 1). Эту реакцию в клетках E.cali выполняет мультиферментный комп­
лекс, содержащий эндонуклеазы, кодиру­
емые тр^ия генами: uvrA, uvr B и uvr C (на­
звания генов даны по первым буквам слов ultra violet repair). Комплекс получил на­
звание «эксинуклеаза». Процесс был обнаружен в клетках че­
ловека в лаборатории Р. Сетлоу в США и в России (В. Сойфер, Н. Яковлева-Сойфе р и А. Мустафина) в 1970 г. Поиск эксцизион­
ной репарации у растений оказался более 1 Нуклеаэани называют ферменты, способ­
ные расщеплять еахарофосфатную цепь. Они могут рвать эту цепь внутри полимерной моле­
кулы ДНК или РНК, и тогда их называют эн-
донуклеазами, или же с концов полимеров, и тогда их называют зкэонуклеазами. пежсу №т В - ДНК: G M * ^ в atn&ft 3 .иаш» з и 1Лт С fciocwr 5 -нзшре э вблиз и Л0ф£^ Д4** ™ с ^У 1 ^ £ > АТф ^ддф* ф Л 1 П 1 H.H.U- J 5* ОПНК-П замещае т Itmr в- бепск н цгуюс я бреш ь комппвмвм. ТВрЮ ЧХИйвОПОЛСИМО Й т j Hf и с 1""1" " " " " — а' Рис. 1. Репарация ДНК по механизму вырезания нуклеотидов [эксцизионная репарация нуклеоти­
дов) 1 — распознавание повреждений белками, кодиру­
емыми генами uurA и uvrB: 2— изгиб молекулы ДНК и изменение коиформации белка UvrB; 3 — внесение двух однонитевых разрезов ДНК с обеих сторон от повреждения с помощью белков UvrB и UvrC: A — расплетание ДНК в участке между двумя надрезами с помощью белка UvrD (хеликазы). от­
соединение содержащего дефект фрагмента дли­
ной 12 нуклеотидов (12-мер) с образованием бре­
ши: при этом расходуется энергия еще одной мо­
лекулы АТФ: 5— застройка образованной бреши с помощью ДНК-полимеразы: 6 — соединение сво­
бодных концов сахарофосфатного остова ДНК с помощью ДНК-лигаэы [рис. 1—3 воспроизведены с разрешения издательства из: Snustad, P., Simmons, М., Jenkins, J. Principles of Genetics. JotinWilley and Sons, inc., 1997; с изменениями] чалушппенАя ыу,я<х„ ТрулНММ ('||,,ЧН.Ч.1 ,lMl|>nni|||lt M ЛЖ Т|И11:К1> и • ) М.-|НР-ур MI- I-МРРР.ГР Л ,-,- Ppftiltip.vKH'l •> и в 1 '•*•?* 1 N7.4 гр налнилп. что пысшис рас-террия ЛМОРР ц<- j|{|,Tjy4 и т и р >(Р>Де ^ВОЛПЩИИ :*Г01 ПНЖНМН Mexjipppj.thp. ЛИГт в ходе ТР»И Же эво­
люции уп- рнлп ITU Однак о в 1W7-4—LM7S гг в -ч^Гроо^-р-рррни в И Сокфер;] ,->исцилионная penupai i i i H у puiTi'HHf i Г>ыла найдена, а та-
I'f'M и:)ут<'лы процессы повреждени я ДН К растений получение м и ал кил ированием. Кило шжа:1анр», что подавление репарации ведет к редкому увеличен икр числа мута ­
ции" хромр>сррм. замедлению роста и разви­
тия растении и к другим нр-желателъным Гки'лр-дгтлням В последние годи дксцИЗИ-
о н п у ю репараци ю инт енс ивн о исследовал и у ч е н ы е мног и х с т ра н мира - В ч а с т н о с т и, Оыло пок апано, чт о ч елов ек у т рсОует с я & с редне м в 4 раз а П^льпк* фермент о в репа ­
рации, чем бак т ерия м ( з к с ину к леаз а состои т по к р а й н е й мере из 17 Пелк ов. з ас т ройк а бр е ши иде т с у ч ас т ие м ДНК - п о л и ме р & э о" или г ), а в ырез аемы й иа п о в р е жде н н о й Д Н К к у с о к имее т д л и н у не 12, а 2у н у к л е о т и -
до в и т. Л-
Репа раци я нес па ре иных основани й Довольно часто (у E.cofi один раз на 10 тыс. пар нуклеотидов, у эукариот еще чаще) во время репликации ДНК происхо­
дят ошибки спаривания, в результате ко­
торых вместо комплементарной пары нук­
леотидов А + Т или Г + Ц (А + Т, G + С) в дочернюю цепь ДНК оказываются включен­
ными нуклеотиды, некомплементарные нук-
леотидам в материнской нити (их называют мисмэтчами — от англ- «mismatch»). Однако ДНК-полимераз ы обладают следующим свой­
ством: после подстановки очередного нук-
леотида в растущую нить ДНК (полимераз -
ный комплекс движется в направлении от 5'-конца синтезируемой нити к З'-ОН-концу) делать шаг назад (в направлении от 3' к 5') и вырезат ь последний нуклеотид, если он не комплементаре н нуклеотиду в матричной нити ДНК (см. статью О. О. Фаворовой «Реп­
ликация ДНК»). Этот процесс исправления ошибок спаривания, или коррекции, иног­
да не срабатывает, и тогда в ДНК по окон­
чании репликации остаются невырезанны-
ми некоторые неправильные пары, остаются мисмэтчи. Для их устранения клетки живых организмов обладают специально созданной Природой системой репарации. При неправильном спаривании, в отли­
чие от всех описанных выше случаев репа ­
рации модифицированных или поврежден­
ных оснований и нуклеотидов, в структур е ДНК не появляетс я необычных оснований, неправиле н лишь характе р спаривания. Как же клетка в таком случа е ухитряетс я рас­
познать неправильност ь и начать репарацию? Ясно, что неправильно е спаривание (ошибка репликации* может затронуть только лпч*-г,-
н*7кр piHjp. Д( [ К: маг рична я нить в прщи-,*,. репликации рхгтаетс-я неизменной |если матричной нити шрянилсрсь повреждении и р*н< оыло исправлен о с помищмо р*»па. рации, тер :>то и есть мутация, и г»на ^уд^.., воепроизводиться при репликации во всех последующих поколениях). Следовательно система репараци и миемзтче й дмлжни опе­
рироват ь на дочерне й нит и и производит ь замену некомплементарных «оснований т^льш в ней. К л е т к и при этом используют важное различи е в с т ру к т у р е матрично й и дочер­
ней нит ей, найденное в 70- х гт. Оказалось ч т о вс к ор е после о к о н ч а н и я репликаци и специальные фермент ы — метилаз ы присо­
единя ют мет ильны е г р у п п ы к адек к на и последовательностя х Г А Т Ц ( GATC). Поэто­
му во время следующег о раунда реплика­
ци и нит и Д Н К ок аз ывают с я различимыми -
мат еринс к а я нит ь Д Н К несет метилирован ­
ные а де н и н ы, а в дочерне й нит и до окон­
ч а н и я р е п ли к а ц и и аденин ы еще неметили-
рованы. И х мет илировани е начнетс я только по ок ончани и реплик ации - Пок а они остаются немет илиров анными, к л е т к и должн ы успеть от реп ариров ат ь мисмэт чи. В кишечной палочке этот процесс идет под контролем продуктов четырех генов: mut H, mutL, mut S и roulll (mutU, как было выяснено позже, есть не что иное, как ген uvrD, или ген хеликааы II) {рис. 2). Процесс начинается с того, что к некомплементарной паре мисмэтча присоединяется белок MutS. С ним тут же связываются белок MutL и две молекулы белков MutH. Каждый из бел­
ков MutH распознает участок ГАТЦ (GATC) и обладает эндонуклеазной активностью, с помощью которой ДНК в этой последователь­
ности может быть надрезана вблизи аденина в не метилирован ной нити. Надрезы иогут быть внесены как в 5"-, так и в З'-положе-
ние относительно аденина. Мультимолеку-
лярный комплекс, составленный из этих белков, массиве н и связывае т длинный фрагмент ДНК, Последний протягивается через комплекс до тех пор, пока два учас­
тка ГАТЦ, расположенные по обе сторо­
ны от мисмэтча, удерживаемог о белком Mut S, не окажутс я захваченными молеку­
лами белков MutH. Иногда расстояние между участками ГАТЦ может превышать несколь­
ко тысяч нуклеотидов. Белок Mut H распоз­
нает участок ГАТЦ и разрывае т дочернюю нить около неметилированных аденинов. Если такой надре з сделан с 5'-стороны от аденина (справа на рис. 2), к нему присое­
динитс я еще один белок — экзонуклеаза, которая расщепит нити ДНК в направлении 5' -» 3'. Этот белок начнет свою работу, раз­
рушит всю дочернюю нить ДНК до места неправильног о спаривания и даже пройдет несколько дальше. Если же первичный над-
РЕПАРАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ рис. 2. Репарация неправильно спаренног о участка (мисмэтча) у бактерий кишечных палочек {E.coli) Двойная спираль ДНК была только что отреплициро-
вана; матричная цепь несет уже метилированные ос­
нования, в то время как дочерняя нить еще неметили-
рована. Белки MutH разрезают в ходе описываемог о процесса репарации только неметилированные сай ­
ты ГАТЦ (GATC). Матричная цепь ДНК остается цело­
стной и служит матрицей для восстановления пра­
вильной последовательности в образовавшихся бре­
шах: 1 — белок MutS распознает неспаренныи участок и присоединяется к нему; 2— образование репара­
ционного комплекса за счет присоединения белков MutH и MutL к белку MutS; на осуществление этой реакции тратится одна молекула АТФ; 3 — разрезание ДНК в участках ГАТЦ, расположенных перед и позади сайта мисмэтча; 4— длинный участок ДНК, располо­
женный между двумя надрезами и несущий мисмэтч, прежде чем быть гидролизов энным экзонуклеазой, должен быть отсоединен от молекулы ДНК, в резуль­
тате чего возникает длинная однонитевая брешь; в рас­
плетании двунитевой ДНК принимают участие хелика-
зы и расходуются несколько молекул АТФ; 5— за­
стройк а длинной бреши ДНК- полимераз о й с использованием дезоксирибонуклеозидтрифосфа -
тов (dNTP); 6— соединение оставшихся после за­
вершения репликации однонитевых разрывов с по­
мощью ДНК-лигаз. В результате всей цепи реакций участок мисмэтча заменяется правильной (компле­
ментарной) парой рез будет сделан mutH-эндонуклеазой, рас­
положенной с 3'-стороны мисмэтча (слева на рис. 2), то потребуется другая экзонук-
леаза, двигающаяс я по ДНК в направле ­
нии 3' —• 5". Ее работа будет продолжатьс я до тех пор, пока не будет устранен учас­
ток мисмэтча. Затем как в случае с 5' —> 3'-, так и с 3' —> 5'-экзонуклеазо й бреши дол­
жны быть застроены ДНК-полимеразой, а концы воссоединены с помощью лигаз. Ра­
зумеется, для высвобождения концов ни­
тей после внесения первичных разрезов молекула ДНК должна быть расплетена (тре­
буется белок хеликаза), нужны также источники энергии в виде АТФ, а для за­
стройки брешей требуются дезоксирибонук-
леотидтрифосфаты. Процесс обнаружен в клетках человека, дрожже й и некоторых других организмов. Пострепликативная, или рекомбинационная, репарация В 1968 г. американцы У. Рапп и П. Хо-
вард-Фландерс исследовали облученные УФ-
светом бактерии, у которых были повреж­
дены гены, ответственные за синте з эксинуклеаз. В результате эксцизионная ре­
парация стала невозможной. Поскольку опы­
ты проводили в темноте, то и фотореакти­
вация не могла осуществиться. В этих клетках матричная ДНК содержала много невырезанных димеров тимина, и в момент, когда ДНК-полимераза, ведущая реплика­
цию, доходила до первого из них, она бук­
вально застывала на этой точке. Спустя 10 Матричная нить ~~~~— 5'-
- — • - 3'* Дочерняя нить £к Белок Mut S ^^ присоединяется к неспаренному участку (участку мисмэтча) 5'. 3-
I Белки Mut H и Mut L присоединяются к комплексу си си I I ЦТАГ Г — ЦТАГ. ГАТЦ^ — Т ^ Г А Т Ц • Ми',м j f 4 Метилирован а — 5' Неметилирован а I Белок Mut H делает надрез в левом или правом участке ГАТЦ в неме­
тил ировэнной цепи ДНК з-
5' Mut L сн | •:. .ЦТАГ. •ГАТЦ -
Г Mut H Г, т • сн. .ЦТАГ. •ГАТЦ • СН I • .ЦТАГ , -ГАТЦ i Л г, т-
Гидролиз участка ДНК с помощью экзонуклеаэы I СН. О
Вырезание требует Mut L, Mut S келиказь tl и АТФ _ Ц Т А Г, ГА СН, Г—ЦТАГ . ^ Г А Т Ц . СН ЦТАГ. АТЦ-
.ЦТАГ. •ГАТЦ • i Гидролиз участка ДНК С помошью экзонуклеазы Vfi Г —ЦТ А Г - f c. ТЦ СН( .ЦТАГ. -ГАТЦ • , Репаративным синтез требует участия ДНК-
полимеразы и dNTP сн г. ц-
•ЦТАГ, -ГАТЦ • СН I -• .ЦТАГ Г. .ГАТЦ — * ц-
О ДНК-лигаза соединяет разрезы сн ; он I э I ! .ЦТАГ _ _ Г—ЦТАГ . -ГАтц Ц—ГАТЦ . СН. v .ЦТАГ, -ГАТЦ -
Г. чл ­
ен. .ЦТАГ. • Г АТЦ-
сн _!_ • = .ЦТАГ . -ГАТЦ . Комплементарност ь восстановлена секунд ДНК-полимераз а ухитрялась каким-
то образом перебратьс я за димер тимина и возобновляла синтез позади дефекта, пока снова не «натыкалась» на димер. В резуль­
тате формировалас ь дочерняя ДНК с бре­
шами напротив повреждения. Сейчас мы знаем, что репликацию ДНК осуществля ­
ет не один лишь фермент ДНК-полимера ­
за III, но комплекс из нескольких десят­
ков белков. Как они могут перебираться через повреждение — не до конца разгаданна я загадка. Как тот же комплекс может возоб­
новлять реакцию репликации без помощи затравки (короткого участка РНК, без ко­
торого синтез ДНК невозможен; см. статью О. О. Фаворовой «Репликация ДНК») — так­
же неясно. Но обнаруженный Раппом и Ховардом-Фландерсо м факт задержки син­
теза никто не оспаривает. Сама же задер­
жка на 10 секунд весьма значительна, так 38 МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ как репликация у кишечной палочки идет со скоростью 1000 нуклеотидов в одну се­
кунду. Таким образом, участок дочерней нити, иногда длиний в несколько генов, оказывается неудвоенным при синтезе ДНК, причем в зоне напротив бреши (в матрич­
ной цепи) так и остается незалеченным де­
фект, и это может привести клетку к ги­
бели. Чтобы его залечить, клетка использует рекомбинацию (рис. 3). Из комплементарно й нити матричной ДНК (она была свободна от дефектов), на которой репликация ДНК уже 5'— 3'^ Пораженная двойная спираль . г -Ш - т Брешь ..Сестринская двойная спираль Присоединение нес А-белков" ее А-белки Рекомбинация: внесение двух разрезов в сестринскую нить с последующим переносом вырезанного фрагмента в брешь напротив димера тими на - n~N. т ом I шь 1 Ф ^Л Брешь в сестринской спирали ^ ^ репарируется с участием ДНК-
поли меразы I и лигазы I Двойная спираль с ре-
пар ирован ной брешью .^ ДИМ^Р тип и на Л~К т-- т Неизмененная сестринская спираль Репаративныи синтез Рис. 3. Пострепликативная репарация ДНК Если до начала репликации ДНК из нее не были ус­
транены все дефекты, то одна из нитей материнской молекулы будет нести повреждение (красным цве­
том выделен димер тимина), а комплементарная ей нить будет свободна от повреждений (нити материн­
ской молекулы показаны черным цветом). На повреж­
денной нити репликация завершится тем, что напро­
тив димера тимина в заново синтезированной нити (зеленого цвета) окажется брешь, в то время как се­
стринская двойная спираль не будет нести повреж­
дения. После этого может пройти пострепликатив­
ная репарация поврежденного участка. 1 — молеку­
лы белка RecA (синие) присоединяются к зоне бреши; 2—под контролем белков RecA произойдет рекомбинация — участок комплементарной цепи се­
стринской нити (черная) переносится в район бре­
ши; 3— брешь в сестринской ДНК застраивается в ходе репаративного синтеза (застроенный участок показан красным цветом); концы новой и старой нитей соединяются лигазой Ген rec A Ультрафиолетовый свет Индукция синтеза Вес А-белка Rec А ко-протеаза У?фоШМ LexA- u'muDC-оперон t % белок \ь (репрессор) Разрезанный Rec А ко-протеаэой LexA белок РНК- полимераза umuDC-оперон Транскрипция UmuC и UmuD-белки Присоединение UmuC, UmuD и Rec А-белков к ДНК-поли-
меразному комплексу т—1—г т—I—г Г А Т Ц Г Т Т А Ц Г Г Т Ц ЦТ А Г Ц - 1 I — I I L ДНК-поли-
мераза RecA-
белок UmuC U m u D ~i—i—г—i—i—i—••—i—i—i—i i T ^ Г А Т Ц Г Т - Т А Ц Г Г Т Ц * Ц Т А Г Ц Г T T Г Ц Ц А Г - i — i — i — i — J i i i i i i Реплицированная дн к с ошибками, вставленными напротив димера тимина Рис. 4. Индуцируемая УФ-светом SOS-репарация Большие дозы УФ-облучения приводят к возникно­
вению большого числа повреждений ДНК, часть ко­
торых остается нерепарированной к моменту начала репликации. В этих условиях активируется синтез ко-
протеазы RecA-белка, которая участвует в расщеп­
лении (протеолизе) многих белков. В частности, RecA ко-протеаза может узнать и разрезать другой белок— кодируемый геном 1ехА и являющийся репрессором почти 20 генов, в том числе оперона umuDC. Разру­
шение LexA-белков открывает возможность начать транскрипцию многих оперонов: РНК-полимераза связывается с их промоторами, и в частности с про­
мотором оперона umuDC, и начинает транскрипцию генов umuC и umuD. Около 5 лет тому назад боль­
шинство генетиков согласились с гипотезой, что вновь синтезированные белки UmuC и UmuD спо­
собны присоединиться к комплексу «ДНК-полиме-
раза 111—RecA белок», изменить его, после чего реп-
ликационный комплекс продолжит синтез дочерней нити ДНК на поврежденной матрице и подставит в участках напротив повреждений любые случайные нуклеотиды, только чтобы пройти эти участки. Реп­
ликация ДНК таким образом завершится, однако до­
черняя нить будет нести мутации напротив дефек­
тов в материнской нити. В настоящее время стало ясно, что даже эта довольно сложная схема нужда­
ется в значительном усложнении, например белок UmuD под действием RecA ко-протеазы расщепля­
ется на две части, и только одна из них ответственна за введение ошибок во вновь синтезированные до­
черние цепи ДНК [рисунок воспроизведен с разре­
шения издателя из: Weaver,F.,Hedrick,P.W. Principles of Genetics. 3 ed., 1993] завершена, с помощью белка RecA выреза­
ется участок ДНК, равный по длине учас­
тку бреши, и встраиваетс я в брешь. Затем лигазы соединяют концы вставленного фраг­
мента с концами нормально синтезирован­
ного участка дочерне й нити. После этого другие фермент ы репараци и устраняют дефект в исходно поврежденной нити и ДНК становитс я з алеченной. Одновременн о РЕПАРАЦИЯ генетических повреждений 39 брешь, оставшаяс я после вырезани я учас ­
тка из материнско й нити, з астраиваетс я ДНК-полимеразо й I и концы соединяютс я лигазой. SOS-репарация Что случится, если клетка подошла к моменту, когда нужно реплицироват ь ДНК, но в ней осталис ь повреждения, которые ни одна из описанных выше систем репа ­
рации не смогла устранить? Репликаци я застопорится на первом же неустраненно м поражении, и если их в ДНК много, клет ­
ка должна погибнуть. В этих условия х в клетках активируетс я еще один крайн е рискованный механиз м репарации, обнару­
женный впервые в 1974 г. югославским уче­
ным Мирославом Радианом, эмигрировав ­
шим во Францию. Радма н установил, что при этом индуцируетс я синтез белков, ко­
торые присоединяютс я к ДНК- полимераз -
ному комплексу, «загрубляют » его работу, и такой «подпорченный» комплекс становится способным строить дочернюю ДНК напро­
тив дефектных звеньев матричной нити, но, разумеется, в дочерне й нити теперь появ­
ляется довольно много ошибок, мутаций. Радман остроумно назва л этот механиз м «SOS-репарация» от международно признан­
ного сигнала бедствия SOS (спасите наши души). Принцип метода пояснен на рис.4. В результат е SOS-репараци и клетка спа­
сается от гибели на этом этапе: ее ДНК ока­
зывается удвоенной, хотя и с ошибками, и теперь может произойти клеточное деление, но если жизненно важные функции все-таки безнадежно испорчены, така я клетка все равно погибнет позже из- з а неспособност и правильно функционировать. Если же воз ­
никшие мутации не окажу т летальног о действия, клетка худо-бедно, но проживет и ее потомки будут нести уже теперь все­
гда наследственну ю память о пережитых некогда последствия х мутационной катас­
трофы. Конечный исход читатель может дорисовать в своем воображении сам, так же как легко может себе представить, чем обернетс я устойчивое загрязнение среды обитания для любых организмов, включая человека, если им придется все чаще и чаще прибегать к индуцированному загрязнени­
ями ответу типа SOS-репарации. Распространенность репарирующих систем в живом мире Фотореактивация, как мы уже знаем, была обнаружена одновременно у прокари­
от (бактерий и вирусов) и эукариот (дрож­
жей). Однако более сложные реакции сна­
чала не были найдены в клетка х млекопитающих, и в особенности у челове­
ка. Начался долгий процесс поиска методов биохимических исследований, которые помог­
ли бы найти разнообразные механизмы ре­
парации в мире живых существ. В табл. 2 дано сегодняшнее представление о распространен­
ности способов восстановления дефектов в ДНК у различных типов организмов. Надо подчер­
кнуть, что исследования в этой области идут интенсивно во всем мире. В 1994 г. редакция одного из самых авторитетных научных жур­
налов— «Science» («Наука»), по традиции посвящающа я каждый год предпоследний выпуск журнала самому важному событию в науке за этот год, посвятила его репарации Таблица 2 Ре па р ир у ющи е фе рме нт ы среди представителе й живог о мира Тип репарации Фотореактивация Репарация 06-гуанинов Эксцизионная репарация оснований Эксцизионная репарация нуклеотидов Мисмэтч-репарация Пострешшкативная репарация SOS-репарация Бактерии + + + + + + + Растения + + ? + 7 + ? Насекомые + + ? + ? 7 ? 1 — Животные + + + + + + + Человек + ? + + + + + Примечание. Довольно удивительным фактом стало отсутствие ментов репарации, хотя были найдены ферменты, осуществляющие г МИ Т О Х о н д Р и я х эукариот ф е р В одной из работ 1992 г. была описана митохондриальна я репапапия °"0 л о г и ч е с ку ю рекомбинацию ДНК, индуцируемых 4-нитрохинолиноксидом. ч внутри- и межнитеик^ **** сшивок 40 МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ Таблица 3 Примеры наследственных болезней человека, обязанных своим возникновением дефектам репарирующих ферментов Болезнь Что нарушено в системах репарации Затрону­
тые гены Симптомы и последствия заболевания Болезни, вызываемые преимущественно дефектами эксцизионной репарации Пигментная ксе­
родермия (ПК) Классическая ПК (ей соответствует 90% клинических случаев) Вариантная ПК (10% случаев) Трихотиодистро-
фия (ТТД) Синдром Кокэйна Анемия Фанкони Эксцизионная репарация нуклеотидов (нарушение вырезания, застройки бре­
шей и др.). Разнообразные дефекты ре­
парационных процессов, контролируе­
мых многими генами (так называемые варианты ХР-генов), активно изучаются в настоящее время Наряду с некоторыми дефектами, при­
сущими классической ПК, наблюдается изменение параметров репликации ДНК Повышенная фоточувствительность ДНК (примерно в 50% случаев заболе­
ваний), нарушение вырезания димеров тимина или недостаточная скорость за­
стройки брешей после вырезания нук­
леотидов, возможны нарушения транс­
крипции Дефекты репарирующих эндонуклеаз и дефектность репарации повреждений в транскрибируемых участках ДНК Дефекты репарации повреждений от хи­
мических мутагенов и канцерогенов (но не УФ-света), обусловленные дефектами эндонуклеаз, дефектами распознавания кросс-сшивок ДНК; пониженная способ­
ность к апоптозу после ионизирующего облучения; двукратное удлинение G -фазы клеточного цикла и др. ХРА ХРВ ХРС XPD ХРЕ XPF XPG (Так на­
зываемые варианты ХР-генов) XPD и, возмож­
но, дру­
гие гены CSA CSB ХРВ XPD? XPG? FAA FAB FAC Сверхчувствительность к УФ-свету, ведущая к появлению красных пятен на коже, переходящих в незаживающие коросты и нередко в рак кожи-
неврологические расстройства (синдром Де Санктиса-Качиони); поражения век, бровей и глаз. Распространение: 1 случай на 250000 чело­
век в Европе и США; 1:40000 в Японии Нехватка серы в белках волос и их луковиц, ведущая к ломкости волос, «тигровость» во­
лос (чередование светлых и темных полос по длине волоса, выявляемое под микроскопом); ихтиоз; часто умственная и физическая отста­
лость; дефекты полового развития; аномалии кожи и зубов; нередки раковые заболевания Карликовость, вызываемая задержкой роста и развития в младенческом и детском возрасте при нормальном уровне гормонов роста, глу­
хота, атрофия зрения, калъцификация костей черепа и др. Сверхчувствительность к химическим мутагенам и канцерогенам, уменьшение количества всех клеточных элементов крови, различные анома­
лии врожденных способностей, деформация пальцев и другие виды скелетных нарушений, урогениталъные нарушения, микроцефалия, мик-
рофталъмия, дефекты уха и потеря слуха, сердеч­
ные и гастроинтестинальные нарушения Болезни, вызываемые преимущественно дефектами репаративного синтеза и клеточного ответа на поражения ДНК Атаксия-телангиэк-
тазия (синдром Луи-
Бара) Дефекты репаративного синтеза ДНК, нарушения клеточного цикла, высокая частота спонтанных хромосомных ано­
малий, увеличенная чувствительность к ионизирующим излучениям и радио-
миметикам, к УФ-свету и агентам сход­
ного действия (таким, как 4-нитрохино-
линоксид) Синдром Блума Замедленная реакция ДНК и подавлен­
ный репаративный синтез, высокая час­
тота хромосомных аберраций, особенно сестринских хроматидных обменов, по-
видимому обусловленная низкой актив­
ностью лигаз (молекулярная причина дефекта пока неясна) Четыре группы компле­
ментации Появляется у одного из 40 тыс. новорожден­
ных, основные поражения отмечены в нерв­
ной и иммунной системах (мозжечковая атак­
сия, приводящая к нарушениям координации мышц, шатающейся походке и прогресси­
рующей умственной отсталости, кожным на­
рушениям, предрасположенности к раковым заболеваниям и др.) Резко уменьшенный вес новорожденных, задер­
жанный рост; при непродолжительном пребыва­
нии на солнечном свету на лице появляется ха­
рактерная красная пигментация, по форме напо­
минающая бабочку и вызванная расширением капилляров; повышенная чувствительность к ви­
русным инфекциям; резко повышенный риск ра­
ковых заболеваний Пр о до лже н и е т а б л и ц ы 3 Колешь J Чн'нпруинчш if сиси-чам реи; 'Затрону-
1 ИСГСНЫ Снмшоми н последствия таболсваиня Ь<»лс<нн. кьпыввемме |грснмув|сстнснни лефсктамн мисм'гтч-рспарапии Иислслсгкнный нсткышжпный рык Исследования 1^4 г. покатали, что иаи5о;гсе частч> оилечнь вьпывэлса де­
фектами мнемттч-рспараинн. В НаСТОЯ-
ЩСС ВрСМ* НССЛСЛОВВИИЯ В ЛЙННС1М ИЗ' првкленнк Аелутся во ммо| и* лаборато­
риях мнрв Аналоги баКТСрИ -
аЛЬНЫ* I CHDB mutS н nHllL Наиболее часто встречающаяся наследственная предрасположенность к раку (1,200 человек), требующая, как правило, каскада ПОСлеДОВа-
ТСЛЬИОТО МуТИрОВаНВЯ СП£14»фКЧССКНХ ЛоКуСОВ В нескольких хрочосоызА человека, приводящего к активации нескольких онкогенов ДНК. Этот выбор был связан с тем, что именно в т он г оду было ок ончательн о док азан о у в е ­
личени е ч ас т от ы рак ов ых з аболевани й о т подавлени я нис мэт ч- репарации. Дефекты репарационных систем и наследственные болезни В 1968 г, Д ж е й м с К л и в е р н а ше л п р и ­
ч и н у к о в а р н о й и н е и з л е ч и мо й болез н и ч е ­
ловек а — п и г ме н т н о й к с е р о д е р ми и. У н о ­
с ит еле й болез н и по д д е й с т в и е м о б ыч н о г о с олнеч ног о с вет а, в к о т о р о м всег д а п р и ­
с у т с т в у ю т У Ф - л у ч и, на к о ж е в о з н и к а ю т сначал а к рас ные п я т н а, к о т о р ые п о с т е п е н ­
но п е р е х о д я т в н е з а р а с т а ющу ю к о р о с т у, ч а ще всег о т р а н с фо р ми р у ющу юс я в р а к о ­
в ые о п у х о л и ( рис. 5). К л и в е р н а ше л, ч т о п е р в о п р и ч и н о й эт ог о з аболевани я с л у ж а т д е фе к т ы р а з н ы х р е п а р и р у ю щи х с и с т е м. Мн о г о ч и с л е н н ы е и с с л е д о в а н и я в ы я в и л и в а р и а н т ы бо ле з н и, обу с лов ленны е д е фе к ­
т а м и в с е в о з мо жн ы х с ис т е м р е п а р а ц и и. В н а с т о я ще е в р е м я и з в е с т н о, ч т о м н о г и е Рис. 5. Клинические проявления наследственных болезней, обусловленных дефектами генов, кодирующих белки Репарации ' — пигментная ксеродермия: а — у девочек выявлен дефект генов эксцизионно й репарации, обусловливаю­
щий развитие пигментной ксеродермии, поэтому они вынуждены всю жизнь избегать попадания ультрафиоле­
тового света на кожу и практическ и жить при искусственно м освещении: б — кожные изменения, возникающи е у ребенка, находящегос я на видимом свету; в— глубокие поражения кожи у взрослого, страдающег о пигмент ­
ной ксеродермией. 2 — атаксий телангиэктазия: а — этот 22-летний больной не может передвигатьс я самосто­
ятельно вследствие атаксии (расстройств а координаци и движений) и привязан к инвалидной коляске; б — расширение капилляров (телангиэктазия; в русском переводе принят термин -телеангиэктазия» ) е глазу у больного. 3— синдром Блума: характерная красная пигментация на лице больного, по форме напоминающа я очертание бабочки, которая возникает вследствие болезненног о поражения капилляров [ рисунок воспроизве ­
ден с разрешения авторов и издательства из: Friedberg, E., Walker. G., S/ede, W. DNA Repai r and Mut agenesi s Wash. (D.C.): ASM Press, 1995] 42 МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ другие наследственные болезни человека обязаны своим возникновением поврежде­
ниям отдельных этапов различных процес­
сов репарации. Список этих болезней, по­
полняемый все новыми примерами, приведен в табл. 3. Заключение Открытие и детальное изучение процес­
сов репарации ДНК стало одним из инте­
реснейших и важных достижений молеку­
лярной генетики второй половины XX в. Аргументом в пользу решающей роли про­
цессов репарации в эволюции жизни на Земле стали эксперименты американского ученого Артура Корнберга. Долгое время он, первооткрыватель ДНК-пол имераз, пытался осуществить в пробирке искусственный синтез ДНК, но это ему не удавалось. Вме­
сто линейных полимеров он получал раз­
ветвленные (и нежизнеспособные) молеку­
лы ДНК. И только когда в середине 70-х гг. он ввел в реакционную смесь ферменты репарации, то добился успеха: начали синте­
зироваться нормальные двунитевые моле­
кулы ДНК, без ветвящихся сахарофосфат -
ных нитей и других дефектов. После этого стали думать, что и в природе эволюция первых клеток без ферментов репарации произойти не могла. Так ли это было на самом деле, могут установить только спе­
циально спланированные опыты по воссоз­
данию жизни в условиях лаборатории, од­
нако пока это задача будущего. Автор выражает признательность всем ав­
торам и издательствам, любезно разрешившим использовать их иллюстрации. В. М. Гпаэер ГОМОЛОГИЧНАЯ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ Введение Генетическая рекомбинация (РК) — это перераспределение генетического материала (ДНЮ. приводящее к возникновению новых комбинации генов. РК может происходить пучем обмена клеточными ядрами, целы­
ми молекулами ДНК или частями молекул В то время как процессы репликации и ре­
парации ДНК (см. статью О. О. Фаворовой «Репликация ДНК» и статью В. Н. Сойфера «Репарация генетических повреждений") обеспечивают воспроизведение и сохране­
ние генетического матерка л а* РК приво­
дит к генетической изменчивости, Биоло­
гическое значение РК столь велико, что она получила развитие у всех живых орга­
низмов. Она может происходить у эукариот (как при образовании половых клеток — гамет, так и в соматических клетках), у бакте­
рий и даже при размножении вирусов, в том числе таких, генетический материал которых состоит из РНК. Перетасовка хро­
мосом в мейозе, приводящая к огромному разнообразию гамет, случайность слияния гамет при оплодотворении, обмен частями между гомологичными хромосомами — все это (и далеко не только это) относится к РК. Понятно, что из широкого круга ре-
комбинационных явлений интерес молеку­
лярных биологов в первую очередь вызы­
вает РК, заключающаяс я в обменах частями между молекулами ДНК, ведь здесь мож­
но применять весь арсенал методов гене­
тики и молекулярной биологии, и эти ис­
следования перекрываютс я с изучение м других важных генетических процессов, прежде всего репликации и репарации ДНК, Но даже в таком виде, суженном до обменов частями молекул ДНК, понятие РК включает большой набор совершенно раз ­
ных по своей природе явлений. При этом для всех рекомбинационных процессов об­
щим является этап, на котором молекулы ДНК вступают в контакт в участке, где произойдет обмен полинуклеотидными це­
пями. Этот этап получил название синоп­
сис. Однако механизм синапсиса при раз ­
ных типах РК принципиальн о различен. Более того, он являетс я одним из крите ­
риев при классификаци и рекомбинацион ­
ных явлений. Прежде чем перейти к их рассмотрению, напомним некоторые термины и понятия, •вторыми мы будем пользоваться, Молеку-
лл ДНК. представляет собой дуплекс — струк­
туру из двух закрученных в спираль поли-
нукяеотидных цепей. Последовательност ь нуклеотидов в цепях определяет специфич­
ность ДНК и несет генетическую информацию. Молекулы, имеющие общее происхождение и состоящие из одинаковых нуклеотидных пос­
ле яОыателЬнистей, называют гедксыигичнЫлШ-
О дна ко их идентичность нарушается из-за мутаций, накапливающихся в течение по­
колений. По большей части мутации приво­
дят к заменам единичных нуклеотидов, реже к выпадениям и вставкам отдельных нукле­
отидов. Поэтому нарушения гомологии в ре­
зультате мутаций не очень существенны по сравнению с основной массой идентичных нуклеотидов и можно говорить об общей гомологии молекул. Каждая новая мутация приводит к об­
разованию нового аллелл в том гене, где она возникла. Следовательно, новые алле­
ли обычно отличаются от исходной формы одним нуклеотидом. Если мутация приво­
дит к изменению какого-либо признака у исходной формы, то к ней можно приме­
нить термин генетический маркер. Две цепи, составляющие дуплекс ДНК, антипараллельны, т. е. имеют разную по­
лярность: одна цепь имеет направление 5'-3', другая 3'-5'. Цепи удерживаютс я вместе водородными связями между парами ком­
плементарных оснований А-Т и G-C. Поэтому обе цепи в дуплексе являются также ком­
плементарными. Процесс расхождения це­
пей в результате разрыва водородных связей есть денатурация, обратная реакция — ре-
натурация. Для дальнейшег о изложения существенно, что поскольку отдельные цепи ДНК, полученные от разных родите­
лей, гомологичны и, следовательно, ком­
плементарны, они могут ренатурировать, формируя новый дуплекс. Иными словами, гомологичные ДНК могут «узнавать» друг друга по комплементарност и их нуклеотид-
ной последовательности. Новый дуплекс, со­
стоящий из цепей от разных молекул, на­
зывается гетеродуплексом. Теперь можно дать классификацию ос­
новных типов РК. Все, что говорилось о го­
мологии ДНК и комплементарност и полинук-
леотидных цепей, относится к голюдогичиой, ИЛ И общей, РК (она же кроссикговер), ос­
нованной на спаривании комплементарных целей ДНК. От других типов рекомбинаци­
онных процессов ее отличают необходимость в общей (по всей длине молекул) гомологии между рекомСинирующими ДНК и участие большого набора специальных белков. Гомо-
А I* ,1 V-
11 15 У 1, :ь_ & -.- • * л is;-.-- — к I ^ J L fVc- 1- Схемы гомологичной рекомбинации (крое-
сингоеера) Все линии соответствуют дуплексам ДНК. Синий и красный цвет позволяет различать гомологич­
ные молекулы. Вертикальные черточки изображают центромеры. Кроссинговер обозначен знаком *Х>. а— кроссинговер в профазе 1-го деления мейоза, л дуплекса ДНК здесь соответствуют хроматидам. Сестринские хроматиды соединены центромерой, все хроматиды вместе составляют тетраду- В каж­
дом акте кроссимгоеера участвуют 2 хроматиды из четырех. 6 данном случае кроссинговер произо­
шел между двумя внутренними хромат идами. Про­
дукты кроссинговера— 2 рекомбинантные и 2 не-
рекомбинантные хроматиды; 6— кроссинговер в соматической клетке на стадии С1 клеточного цик­
ла (клетки прошли через митотическое деление, но у них не произошла репликация хромосом). По­
этому здесь дуплекс ДНК соответствует хромосо­
ме. Отметим, что кроссинговер в G1 клетках не вы­
является генетическими методами, но обнаружи­
вается физико-химическими методами: в — . кроссинговер в клетке кишечной палочки Escherichia colt. Одна из участвующих в РК клеток (реципиент), имеющая кольцевую хромосому (крас­
ная), получает от клетки-донора линейный фраг­
мент деуцелочечной ДНК (синий). Большая часть донорного фрагмента замещает гомологичный уча­
сток в рецилиентной хромосоме. Обращаем вни­
мание на то, что здесь кроссинговер происходит дважды, вблизи обоих концов фрагмента. Единич­
ный кроссинговер только на одном конце фраг­
мента привел бы к гибельному для реципиентной клетки разрыву хромосомы. Такая гипотетическая ситуация изображена на р и с е' логичная РК н!1чима1'и-и г ш|;о|ик№»н»'Нин к опл"М или оГтих дуплексах участкам ил оли-
|| II.IX Н*'1М'И ДНК, ШКГ'фЫИ :iaT4>M С Помо­
щью специальных Гч-лков находит к<|Мил*-1ч*'ч-
тарнме шк:Лр'>ловаГ1>'Л1,жк:ти R гомолгргичном луилексе И лГрралуил- г НИМ И г *-теро дуплекс — ключевой промежуточно й Продукт (интрр-
иедмат) ГК- Конечным результатом РК fpy-
дет обмен равными частями гомологичных молекул (рис. 1). Иа общей PK можно выделить как час­
тный случай так называемую .^ктоттчег -
кую РК. Ока заключается в обменах между отдельными участками гомологичной ДНК, разбросанными пп геному. К ним относят­
ся разнообразные подвижные элементы названные так за способность перемещаться по геному, гены транспортных и рибосом-
е j .3. Ь._Е" О' 1 _Ь с_ d е b с' tl' t , a b с d e b с d t a b с d e b'*C d" t а Ь с' d' f a b с d e b' с d e b' с' О' f Рис. 2. Схемы образования делеций и дупликаций хромосом в результате эктопической РК Повторяющиеся последовательности ДНК в прямой ориентации обозначены как bed и b'e'd". Осталь­
ные обозначения те же, что на рис. 1 а — внутримо­
лекулярная РК между прямыми повторами. Для их вхождения е с и нал си с дуплекс должен образовать петлю. Кроссинговер произошел на участке рутежду b И с. Продукты РК: J - линейный дуплекс с деле-
цией участка, содержащего одну копию повтора b'cd и всю расположенную между повторами последо­
вательность, 2— кольцевой дуплекс, состоящий из делегированного материала: б— РК между прямы­
ми повторами, расположенными в разных частях го­
мологичных хромосом или хроматид. Кроссинговер произошел на участке между b и с. Продукты РК: 1— дуплекс, получивший дополнительную копию повтора be d и расположенную между повторами последовательность, 2 — дуплекс, утративший пос­
ледовательность, вошедшую в первый дуплекс ГОМО/ЮГИЧНАЯ Г1Н£ ТИЧС СКЛЯ РСКОМБММЛЦИЯ ны* РНК. гистонпв и другие повторяющиеся последовательности, Такая локальная гомо-
логичная РК интересна прежде веет тем. что она может приводить к хромосомным перестройкам, хотя ее биологическая роль этим не исчерпывается. На рис-2 в каче­
стве примерз приведены схемы возникно­
вения утрат (делении) и удвоений (дупли­
каций) частей хромосом в результат е эктопической РК. Это только часть возмож­
ных перестроек хромосом. Другие их типы могут возникать от того, что повторы ДНК могут иметь противоположную ориентацию в хромосомах, и от того, что РК может про­
исходить между повторами 6нутри одной хромосомы или между негомологичными хромосомами. Несмотря на то, что обмены происходят между локальными участками гомологии, эктопическая РК осуществля­
ется в основном теми же белками, что и гомологичная. Принципиально иными являются три других типа РК, которые основаны не на взаимодействии комплементарных цепей ДНК, а на совершенно иных механизмах и На участии иных белков! Сайт1-специфическая РК происходит между специфическими последовательно­
стями ДНК в пределах коротких участков гомологии, обычно 15—26 пар нуклеоти-
дов (п.н.). Транспозиции. Этот тип РК заключает ­
ся в перемещениях по геному и из генома в геном уже упомянутых выше подвижных генетических элементов, имеющихся в ДНК практически всех живых организмов. Незаконная РК. РК между полностью негомологичными ДНК, не подходящая ни под один из перечисленных выше типов РК. Механизм этих типов РК рассмотрен в отдельной статье (см. статью В. М. Глазе-
ра «Генетическа я рекомбинация без гомо­
логии: процессы, ведущие к перестрой­
кам в геноме»). Модель Холлидея Рассмотрение гомологичной РК начнем с общей модели кроссинговера, опубликован­
ной в 1964 г. американским генетиком Р. Хол-
лидеем (R. Holliday). Холлидей предложил эту модель с очень конкретной целью, а именно для объяснения результатов, по­
лученных им и другими исследователями генетики грибов. Модель была формальной, без детализации молекулярных механизмов рекомбинациокных реакций, она не рассмат­
ривала белки, их осуществляющие, посколь­
ку в начале 60- х гг., иа ааре молекуляр ­
ной генетики, о большинстве из них не было известно. Новые экспериментальные резуль­
таты хорошо вписывались в модель Хол­
лидея. дополняя и уточняя ее. По существу история молекулярной генетики РК — это развитие модели Холлидея. В своем усо­
вершенствованной коллективными усили­
ями генетиков и молекулярных биологов виде модель представлена На рис 3-
Она разработана для мейотического крос-
синговера. На рисунке изображены дна го­
мологичных дуплекса, соответствующих хроматидан Для простоты изображены толь­
ко те две хроматиды из четырех, которые участвуют в кроссинговере. В принципе для того, чтобы гомологич­
ные молекулы ДНК поменялись своими ча­
стями, сначала должны произойти разры­
вы во всех цепях обоих дуплексов, а уже потом — обмен цепями и замыкание раз­
рывов. У Холлидея разрывы происходят не одновременно, а в два этапа. РК начинает­
ся с первичных одноцеппчечных разрывов фосфодиэфирных связей ДНК (их вносит фермент эндонуклеаза). Разрывы происхо­
дят в двух цепях одинаковой полярности (рис. 3, а). Холлидей также постулировал, что первичные разрывы возникают не в слу­
чайных, а в определенных сайтах ДНК. Впоследствии эта идея получила экспери­
ментальное подтверждение. Далее от точек первичных разрывов происходит обмен цепями между дуплек­
се ,. 1 • ч Х 'Сайт — некая точка или участок в молеку-
Рис, Э. Модел ь Холлиде я В отличи в от рис. 1 и 2 лини и соответствую! цели м ДНК две параллельны е линии - дуплекс у ДНК. Вер ­
тикальны е черточк и на рис. 3, а отмечаю т сайт ы пер ­
вичны х разрывов. Остальны е тюйсиеии я Дан ы в гике ш Рис. 4. Электронно -микроскопическая фотографин полукмадмы Холлидея Рекомбинантная молекула получена из двук гомо­
логичных кольцевых молекул ДНК— плазмид, пре­
вращенных в линейную форму с помощью специ­
ального фермента— рестриктаз ы [иэ: Potter. H., Dressier, D. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1976, vol 73, p. 30001 сами, который приводит к образованию кре­
стообразной структуры, получившей впос­
ледствии название «полухиазма Холлидея* (рис 3. б" и рис, 4). Такое название объяс­
няется тем. что в полухиазме в обмен вов­
лечены только две цепи ДНК из четырех, что отличает ее от полной хиазмы—• кре­
стообразного продукта завершенного мей-
отичеекого кроссинговера, давно известного биолога м-
Затем происходит очень важный про­
цесс — перемещение точки перекреста це­
пей в полухиазме вдоль рекомбинирующих дуплексов (рис. 3, в). Такое явление опи­
сано под названием «миграция ветвления». Оно заключается в следующем: от точки пе­
рекреста цепей происходит расплетание ис­
ходных дуплексов, и высвобождающиес я цепи тут же ренатурируют с комплемен­
тарными цепями из гомологичных дуплек­
сов, что приводит к образованию и после­
дующему удлинению гетер о дуплекса ( В/Ь на рис 3, в). Именно в удлинении гетеро-
дуплекс а и з аключаетс я биологически й смысл миграции ветвления. Ее осуществ ­
ляют специальные ферменты. Размеры ге-
теродуплекс а при мейотичееком кроссин­
гов ере колеблются от нескольких сотен до одной тысячи п.н„ при РК в соматических клетках он еще протяженнее. Гетеродуплекс сформирован. Образовав -
шаяс я сложна я разветвленна я структур а должна разделитьс я на гомологи. Зт о на­
зываетс я разрешение м полухиазмы. Для разрешени я необходимы еще два разрыв а цепей. Эти вторичные разрыв ы з аверша т обмен цепями- Но прежде чем это случит ­
ся, полухиазма должна претерпет ь еще одно превращени е — изомеризацию. Из о-
мериааиия заключается в изменении струк­
тура лолухиаямы да сч^т теплового дви­
жения молекул. На рис. 3 изображена схе­
ма изомеризации иолухиалмы. предложенная Поттером и Дреслером (Н. Potter, D. Dressier) в 1Э76 г. Структуры в и в' идентичны: вто­
рая изображена н крестообразном виде, что приближает ее к реальной. В структуре в' происходит одни поворот на 180й любой пары дуплексных сегментов (плеч), на рисунке это нижняя пара Образовав шаяся струК_ тура (рис, 3. г) может разрешаться двумя пэрами вторичных разрывов. Парные раа _ рывы цепей одинаковой полярности 1-1 или 2-2 приводят к двум типам рекомбинант-
ных хроматид. Хроматиды первого типа (рис. 3, в) содержат внутренний гетеродуп­
лекс В/b и в остальном не отличаются от исходных (нек рос северные хроматиды). Ре-
комбинантные хроматиды второго типа (рис. 3, е) — кроссоверные, они также со­
держат гетеродуплекс и обмениваются ча­
стями по обе стороны от него. Оба типа продуктов РК равновероятны, что соответ­
ствует генетическим данным, на которые Опирался Холлидей при создании своей модели. Здесь необходимо сделать небольшое отступление по поводу одного очень важ­
ного процесса, происходящего в гетеродуп-
лексе. Как уже указывалось, от исходных молекул в ре комбинационный гетеродуплекс могут войти разные аллели, и, следователь­
но, возникнут неспаренные основания, ко­
торые локально нарушангг структуру двой­
ной спирали ДНК. Эти нарушения узнаются специальными ферментными системами, ра­
ботающими по типу эксцизионной репара­
ции (см. статью В Н. Сойфера «Репарация ге­
нетических повреждений»). Они проводят коррекцию неспаренных оснований в гете-
родуплексе; удаляют неспаренное основа­
ние в одной цепи ДНК и застраивают об­
раз ующуюс я брешь по матрице другого аллеля в комплементарно й цепи, тем са­
мым превраща я (конвертируя) один аллель в другой. Это явление давно известно как конверсия гена. Схема конверсии гена на примере мейоза у дрожже й представлена на рис. 5. Из нее ясно, что если гетерози­
готная клетка А/а вступает в мейоз, то в норме среди продуктов мейоза оба аллеля гена А будут представлены в равном соот­
ношении: 2А:2а, Однако если в районе хро­
мосомы, где расположе н ген А, произой­
дет кроссинговер, то сформируетс я гетеродуплекс А/а с локально неспареннымк основаниями, что может привести к конвер­
сии гена А: расщепление аллелей гена среди продуктов мейоз а будет ЗА;1а или 1А:За. Расщепление по генам, расположенным вне участка кроссинговера (на рис. 5 не показа­
ны), с охра ни т нормально е соотношени е пмо/югнчнля гг*а ww f *ля pi КОМБИНАЦИЙ 47 Л H i •! 1Г.л,1,гЦгЦГ|| Г [].i l ii|P'4U i "" A A A * KfNUhCfH ИИ А А:л Рис. 5. Сокращенная схема конверсии гена на при­
мере дрожжей Линии соответствуют цепям ДНК, две параллельные линии — хроматиде. У дрожжей, как и у других гри­
бов-эосомицегга. продукты «аждого мейозэ какое-
то время сохраняются вместе е сумке-аске (заклю­
чены в окружность), что позволяет анализировать их отдельно от других мейозов. а— мейоз без крос-
синговера; б— мейотический кроссмнговер в учас­
тке гена А. Остальные пояснения даны в тексте аллелей 2:2. Мы видели при разборе моде­
ли Холлидея, что содержащие гетеродуп-
лекс продукты РК с кроссинговером и без кроссинговера по внешний генам равнове­
роятны, иными словами, конверсия гена в мейозе может одинаково часто сопровож­
даться и не сопровождатьс я обменом по внешним генам. Этот факт был основным среди упомянутых выше генетических данных, опираясь на которые Холлидей создал свою модель. Модель Холлидея симметрична: первич­
ные разрывы возникают одновременно в обоих гомологах, и обмен цепями происхо­
дит синхронно. Однако имеются генетичес­
кие данные, полученные, в частности, на дрожжах, об асимметричных обменах. В этих случаях первичный разрыв возникает только в одном дуплексе, затем от точки разрыва отделяется одна цепь ДНК, которая внедря­
ется в гомологичный дуплекс и в ходе пос­
ледующей миграции ветвления вытесняет из него цепь той же полярности. После этого обмен превращается в симметричный. При­
мер такой реакции, но применительн о к t.coii, будет рассмотрен ниже. Модель Холлиде я в ее современно м виде — общепризнанна и универсальна для прокариот и эукариот (и в половых, и в со­
матических клетках). Ее достоинством яв­
ляется тот факт, что она хорошо проверя­
ется генетическими данными и практичес ­
ки все ее яталы постепенно нашли экспе­
римента л ьнсде подтверждение. Лол у хиазмы Холлидея хорошо видны под электронным микроскопом. Обнаружены специальные эн-
донуклеааы (их называют резол вазами), ко­
торые осуществляют разрешение полухиаз ­
мы, как зто изображен о на рис.3, г. К настоящему времени такие резолвааы обна­
ружены у бактериофагов Т4 и Т7, Е.еой, дрож­
жей и человека, У E.coli выявлены также белки, осуществляющие миграцию ветвления полу-
хказмы. Именно на примере E.coli как наи ­
более изученног о в отношении РК объекта мы рассмотрим конкретные механизмы крос-
синговера. Рекомбинаци я у E.coli: генетически й контрол ь и молекулярный механиз м Клетки E.coli способны к обмену гене­
тической информацией с помощью двух процессов, заменяющих им половой, — конъ­
югации и трансдукции. При конъюгации клетки разных половых типов вступают в контакт, и из клетки донора в клетку ре­
ципиента передается одна из двух цепей кольцевой ДНК хромосомы. При этом конъ-
югирующие пары бактериальных клеток постепенно расходятся из-за непрочной связи между ними, и перенос ДНК сразу прекра­
щается. Поэтому реципиентные клетки ни­
когда не получают от донора полную од-
нонитевую кольцевую ДНК, а только ее часть, которая сразу достраивается до дву-
цепочечного фрагмента с так называемы­
ми тупыми концами (у них нет выступаю­
щих одноцепочечных концов— «хвостов»). Размеры перенесенных фрагментов варьи­
руют, чаще всего они достигают несколь­
ких сотен тысяч п.н. При трансдукции из клеток донора в клетку реципиента с по­
мощью бактериофаг а {бактериальног о ви­
руса) переносится двуцепочечный фрагмент бактериальной хромосомы, но в десятки раз меньшего размера, чем при конъюгации. Таким образом, с физической точки зре­
ния генетический материал, передаваемый рецепиентам при конъюгации и трансдук-
ции, отличается только размерами. Далее донорный фрагмент должен заменить гомо­
логичную часть хромосомы реципиента с по­
мощью парных кроссинговеров, проходящих вблизи концов фрагмента (см. рис. 1, в). Рассмотрим механизм самого кроссинго-
вера у E.coli. На начальной стадии исследо­
ваний в лаборатории А.Кларка (A.Clark) в США был выделен и изучен целый набор мутантов с нарушениями РК (у них была подавлена способность давать ре комби нан-
тное потомство при конъюгации и транс-
МСЛС1СУЛЯРЦЛЯ 6МОЛОГМ» лукции|. C помощью этих мутантов, названных -ГеС*. были установлены соответствующие гены, и латом выделены ре комбинационные белки, икнктипнрипанньн' у мутантов. Самый глапнми бе,ти< RecA — продукт гена гесА. Белок имеет небольшой размер (всего около '*Я кЛ> и проявляет разнообразные активности. Этот С^'лок участвует не тодь-
Кч в РК, но и в репарации ДНК. Мы рас­
смотрим только сто роль в РК В условиях i n ptrro для проявления всех активностей белка RecA требуются в качестве кофакто­
ров АТФ и одно цепочечная ДНК в лтбоИ форме, например дуплексная ДНК с конце­
выми (хвосты) или внутренними (бреши) ол-
ноцепочечными участками. Основное наз-
начение белка RecA— приводит ь во взаимодействие «дноце почечную ДНК с го­
мологичным дуплексом. В зависимости от структуры ДНК-субстратов Г>елок может про­
водить разные рекомбинационные реакции. Три №1 них показаны на рис. fi. Прежде чем Рис. В. Схемы трек ре комбинационных реакций, осуществляемых белком RecA E.coli in vitro (из: Smith, в. fi. Ann.Rew. Genet., 1987, vol. 21. p. 179-
£01; с изменениями] Линии соответствуют целям ДНК. Вертикальными черточками на этапах 2 изображены водородные связи. Они выделяют участок вновь образованного гетеродуплекса в D-петле. RecA-ДНК-фила мент на рисунке не показан, а— реакция между саерхспи-
рэлизованной кольцевой двуцепочечной ДНК и го­
мологичной одно цепочечной ДНК. Одноцепочеч-
ная ДНК внедряется в дуплекс в участке, гомоло­
гичном ее кониу, и образует D-петлю; б— реакция между кольцевой одн оцеп очечной ДНК и гомоло­
гичным линейным дуплексом. На этапе I показаны интермедиа! реакции с D-петлей и направление последующей миграции ветвления, которая приве­
дет к появлению продуктов РК: кольцевого дуп­
лекса с одноцепочечным разрывом и линейной сманоцепочечной ДНК (этап 3): а— РК между гомо­
логичными дуплексами, один из которых имеет од-
иоцвпочечный конец. Образование D-петли и за­
тем полухиазмы Холлидея (этап 2}, миграции полу­
хиазмы влево (этап 3) рассматривать пти реакции, отметим неко­
торые общие закономерности функциониро­
вания RecA-Оелка, Важнейшее свойство белка RecA опре­
деляется наличием у него двух сайтов свя­
зывания с ДНК. Первый сайт используется для первичного связывания с ДНК: в при­
сутствии АТФ белок всегда взаимодейству­
ет в этом сайте с одноцепочечной ДНК. Свя­
зывание белка носит кооперативный характер т. е. его молекулы собираются на ДНК но принципу «конец-в-конец», образуя вокруг ДНК правозакрученную белковую спираль (не надо путать ее со спиралью самой ДНК). В результате возникает нитевидное образова­
ние — RecA-ДНК-филамент. Если одноцепо-
чечная ДНК была в составе двуцепочечной молекулы (как хвост или брешь), то фор­
мирование филам сита распространяется на дуплекс, что сопровождаетс я гидролизом АТФ. В филаменте двуцепочечная ДНК из­
меняет свою конформацию. В отличие от обычной В-формы ДНК {где шаг спирали со­
ставляет L0.4 п.н.) на 1 виток спирали ДНК в филаменте приходятся 18,6 п.н., в резуль­
тате чего ДНК оказывается растянутой в 1,5 раза. Считается, что такое растяжение дуп ­
лекса необходимо для его последующего вза­
имодействия с гомологичной одноцепочечной ДНК. Формирование фила мента завершает подготовительную, преечнаптическую стадию кросс инговера. Реак ции, составляющи е следующую, синоптическу ю стадию кросен нговера, про­
исходят тольк о внутр и филаментов. При этом фила мен ты могут вступать в РК толь­
ко с «голой», не находящейс я в филамен­
те, ДНК. Два филамент а не вступают в РК друг с другом. Взаимодействи е фи л а мен­
та с голой Д Н К осуществляетс я за счет второг о сайта связывани я RecA. Связыва­
ние с Д Н К во втором сайте слабое. В силу этог о межд у филаменто м и голой ДНК имеют место лишь кратковременные кон ­
т ак т ы ( соударения). Эти контакт ы стано­
вятся прочными тольк о после встречи го­
молог ичных последовательностей. Нахождени е гомологии связано с фор­
мирование м г етеродуплекса. Обычно оно начинаетс я с образовани я с т ру к т у ры, в которой задействованы три цепи ДНК и которая называется D-петлей (от англ. «displacement l oop»— петля вытеснения). Это происходит следующим образок: од-
ноцепочечная ДНК внедряется в дуплекс (рис. 6, а) и образует двойную спираль (ге-
теродуплекс) с одной, комплементарной ей цепью дуплекса, одновременно вытесняя вторую цепь. D-петля может быть «закры­
той», если в дуплекс внедряется одиоце-
почечкый хвост (рис. 6, а), или «открытой», если она формируется на конце линейного дуплекса (рис. б, б и б, а). пжнхяууни* f£"i 7НЧ* L яля WOWWt f M На следующем этане — погтсннапгиг е — гетеродуплеис удлиняется путей миграции ветвления, которую in гчгго т акже может осуществлят ь Гн-лок Ret A В случае РК между одноцепочечной ДНК и дуплексам она происходит в направлении 5'- 3\ по-
лярно, как покапано на рис. 6, б. Миг ра ­
ция ветвления под действием RecA- пелк а сопровождаетс я гидролизом АТ Ф. но про­
исходит медленно, со скоростью несколь­
ко п. н./с. Та к и к образом, в условиях in vitro fie-
лок Нес А способен осуществлят ь (То иск го­
молог ии, формироват ь с ина пт иче с к у ю структур у на основе гетеродуплекс э и про­
изводить обмен цепями между гомолога ми-
Эти реакции стимулируютс я добавление м белка SSB. который выпрямляе т одноце­
почечную ДНК. Мы рассмотрели реакции, катализируе ­
мые белком RecA i n и-Tro. В условиях i n t-ii?o, т. е. в бактериально й клетке, где вместе с RecA задействованы другие белки, распре­
деление обязанносте й може т быть несколь­
ко иным. Например, в к лет к е белок Rec A не проводит миг раци ю ветвления. Это бо­
лее эффективн о делают друг ие специаль ­
ные белки. Надо отметить, что разнообра ­
зие белков, ра бот а ющи х вмест е с Re c A, отражае т разнообрази е путе й гомологичной РК. Еще в 1973 г. А, Клар к описал у E.coli три разных пу т и гомологично й РК, но ни один из них не функ ционируе т без RecA- белка. А теперь посмотрим, как осуществля­
ется основной путь РК у E.coli — ReeBCD. Главную роль здесь играет фермент RecBCD-
нуклеаза, еубъединицы которой кодируются генами гесВ. гесС и recD. Фермент прояв­
ляет несколько активностей только в при­
сутствии АТФ. ReeBCD может гидролизо-
вать одноцепочечную и двуцепочечную ДНК, притом с обоих концов, т.е. работать как экэонуклеаза. Он имеет также хеликазную активность, т. е. расплетает дуплекс ДНК, затрачивая на это анергию АТФ. Наконец, фермент работает как сайт-специфическая эндонуклеаза: расщепляет одноцепочечную ДНК около особой 8-нуклеотидной после­
довательности 5'-GCTGGTGG-3', называе­
мой Chi-сайтом. ReeBCD-ну к леа за — один из самых ран­
них белков РК. Она готовит субстрат для белка RecA. Напомним, что при конъюга­
ции и транедукции в реципиентной клет­
ке оказывается линейный дуплекс донор-
ной ДНК с тупыми концами. Именно такая ДНК необходима для РК с реципиентной хро­
мосомой с участием HecBCD. На рис. 7 при­
водится схема работы фермента, основан­
ная на экспериментальных данных и подтвержденная электронно-ми кроскопичес -
к ими наблюдениями. Фермент атакует ко­
нец дуплекса и начинает расплетать его 1рнс. 7, uV Реакция асимметрична, ЧТО про­
является в особой роли цепи ДНК с З'-концом. RecBCD удерживает его таким образом, что iHjpajyeTen оДПоцепочечная петля пример­
но в тысячу нуклеотндов длиной, тогда как V- цеПЬ выступает в виде свободного хво­
ста- Продолжа я расплетат ь дуплекс, HecBCD-нуклеаэ а сохраняет петлю в З'-цепи и продвигает ее вдоль дуплекса. Посколь­
ку после прохождения фермента компле­
ментарные цени ренатурируют («схлопы-
ваются»), в 5*-цепи автоматически возникает вторая петля (рис. 7, 6). Двойная петля про­
двигается вдоль дуплекса до тех пор. пока фермент не встретит Chi - Свйт в Зг - цепи. Фермент должен подойти к Chi - сайт у спра­
ва, с З'-стороны. На расстоянии 4- 6 нукле-
птидов до него ReeBCD разрывает З'-цепь (рис. 7, я) ( вспомнит е о постулированных Холлидее й особых последовательностя х Д Н К. в которых происходя т первичные разрывы цепей). Дальнейше е расплетание Дуплекса приводит к вытеснению рекомбк -
ногенног о одноцепочечног о З'- конца (рис. 7, е, д), который связываетс я с белком RecA, После этого происходит у же известная цепь событий. На З'- конце сначала формирует ­
ся филамент, затем образуется D- петля ( за­
крыт ая, так к а к возникае т в кольцевой хро-
Chi Chi 5' -а -
3-5" "5 * —3\ ^%г> -
DCi L X". Рис.7. Сокращенная схема РК с участием ReeBCD-нуклеазы e.cofi [из: Smifh, G, R. Ann,Rev. Genet., 1987, vol.21, p. 179—201; с изменениями] Дуплексы ДНК представпену параллельными ли­
ниями. Синие линии — фрагмент донориой ДНК, красные линии— часть кольцевой хромосомы ре­
ципиентной клетки. Желтый прямоугольник изоб* ражает молекулу HecBCD-нуклеазы. пунктир— ре* паративный синтез бреши с помощью ДНК-пол и-
меразы. Остальные пояснения даны в тексте (• мосоме) (рис V. с). Затем B-m-тля разре­
зается с гн»яг<|Г11ьн> одной из эндонуклеаз Ecfili. что прнНоДИт к гтлухнаэме Холлндея (риг. 7, Jtri. 5'-концевая часть разорванной цепи ДНК, вероятно, удаляется несколько рань­
ше (рис. 7, •) с помощью экзонуклеаэкой ак­
тивности RecBCD На атом участие белкоь RecA и RecBCD в РК, скорее всего, завер­
шается Далое ДНК-полимераз а и ДНК-ЛИ-
газа должны залечить брешь и разрывы в целях (рис. 7. ,?). В гингледние годы появились данные о том, что в определенных условиях нуклеаза RecBCD может функционировать несколько иначе, чей это было представлено на рис 7. Считается, что сначала RecBCD гидроли-
зует обе цепи ДНК от концов линейного дуп­
лекса, пока не подойдет к Chi-сайту. Chi-
сайт является элементом, модифицирующим фермент RecBCD. Модификация заключает­
ся в том, что субъединица RecD. ответствен­
ная за эк.эонуклеазную активность RecBCD, либо диссоциирует, либо инэктивируется, но модифицированный фермент сохраняет не­
обходимую для РК хеликазну» активность. После достижения Chi-сайта модифициро­
ванный фермент продолжает расплетать ос­
тавшийся дуплекс, но уже без деградации, выставляя рекомбиногенную З'-цепь с Chi-
сайтом на конце. Эти и последующие собы­
тия развиваются по той же схеме, что изоб­
ражена на рис. 7, но в ней, начиная с этапа б, будет удалена правая часть донорного дуплекса Последующие этапы, не представленные на рисунке, — миграцию ветвления и раз­
решение полухиазмы осуществляют другие белки; из них наиболее изучены RuvA, RuvB и RuvC. RuvA узнает крестообразную по­
лухиазму и нацеливает на нее RuvB, Пос­
ледний узнает комплекс RuvA-полухиазма и, используя энергию АТФ и работая как ДНК- хеликаза, осуществляе т миграцию полухиазмы в том же направлении, что и RecA-белок in vitro, но гораздо эффектив ­
нее. Где-то здесь в игру вступает белок RuvC: он узнает комплекс RuvB-полу хиазма, свя­
зывается с ним и в определенный момент разрешает полухиазму способом, описанным выше (рис. 3, г). На этом миграция полухи­
азмы прекращается. На рис. 7 инициация РК для простоты изображена только на одном конце фраг ­
мента донорной ДНК. В действительност и же вся описанная последовательност ь ре­
акций происходит одновременно с обоих концов донорного фрагмента, что обеспе­
чивает парность обменов при РК с хромо­
сомой реципиент а и исключае т ситуацию, изображенную на рис.1, в'. Перечисленные выше белки далеко не исчерпывают список участников кроссин-
говера у E.cali. Сюда входят также различ-
МОЛЕХУЛЯРНЛЯ ЫЮЛОГиЯ -5* -а-
1 Эндск-гуклеаЭа ! 5' - 3' - Экдонуклеааа Синзпсис • и репаратн&ный I JCT7Z Рис, 8. Схема мейотической РК по механизму ре­
парации двуцепочечнык разрывов ДНК у дрожжей Два гомологичны* дуплекса ДИК (хроматиоы) пред­
ставлены парами параллельных линий (а). Специ­
фическая эндонуклеазэ вводит разрывы в обе цепи Синего дуплекса (б). 5*-концы цепей в точках раз­
рывов гидролизуются 5-3'-экзонуклеаэой с обра­
зованием рекомбиногенных 3- цепей (в), которые внедряются в красный дуплекс (г), где происходят сепаративный синтез утраченных участков ДНК (пун­
ктир) и лигирование концов. Остальные поясне­
ния даны в тексте ные белки, помогающие RecA, белки, уча­
ствующие в альтернативных путях РК, и белки общего метаболизма ДНК: ДНК-ги-
раза, ДНК-полимераза, ДНК-лигаз а и груп­
па белков, осуществляющи х коррекцию не спаренных оснований в рекомбинацион-
ном гетеродуплексе. Модель рекомбинации на основе репарации двуцепочечных разрывов ДНК В последние годы получила развитие модель, предложенная еще в 1983 г. Жос-
таком (J, Szostak) и др. для репарации дву­
цепочечных повреждений ДНК у дрожжей. Интерес к ней резко возрос после обнару­
жения специфических двуцепочечных раз­
рывов в генах ARG4 и HIS4. возникающих в мейозе и совпадающих с сайтами иници-
ГОМОЛОГИЧНАЯ ГСНС ТМЧЕСЫЯ РСКОМ&ИНЛЦИЯ 51 ации РК. Разрывы сопровождались дегра­
дацией ft'-концевых цепей с каждой сторо­
ны разрыва, что приводило к образованию одноце почечных З'-хвостов длиной около 600 п-н. Модель представлена на рис. 8. В 1994 г. две группы исследователей из США выде­
лили из мейотических клеток дрожжей струк­
туры, состоящие из двух гомологичных дуп­
лексов, удерживаемых вместе двумя полухнаэмами Холлидея. Структуры точно соответствуют ннтермедиату модели, изоб­
раженному на рис. 8, г. В реакции in vitro они разрешаются с помощью резолвазы из Е.соИ на два дуплекса, либо кроссоверных, либо не кроссов ерных по внешним маркерам. Де­
тали этого механизма применительно к ус­
ловиям in vivo еще уточняются. Заключение Мы рассмотрели механизмы ГОМОЛОГИЧ ­
НО Й РК на примере двух хорошо изучен­
ных организмов — дрожже й и E.coli. В основных чертах описанные процессы, прежде всего те, что основаны на схеме Холлидея, характерны и для других орга­
низмов, в том числе высших эукариот. В пользу этого свидетельствуют участие структуры Холлидея и сходного набора бел­
ков в РК у представителе й всех система­
тических групп организмов и эволюцион­
ный консерватизм белка RecA. Его гомологи обнаружены у бактерий, грибов, растений и животных, включая человека. В то же время механизмы РК у разных организмов могут существенно различатьс я в деталях. Так, описанная выше RecBCD-нуклеаза, поставляюща я для РК одноцепочечну ю З'-концевую ДНК, обнаружена только у бактерий. У других организмов рекомби-
ногенная одно цепочечная ДНК образуется другими способами. Биологическое значение гомологичной РК огромно. Она вносит большой вклад в ле­
жащую в основе эволюции генетическую изменчивость. Эктопическая РК приводит к перестройка м хромосом, с которыми (прежде всего с дупликациями) связыва­
ют эволюцию генетического аппарата. Счи­
тается, что дупликации участков хромо­
сом обеспечили материал для дивергенции нуклеотидных последовательностей, при­
водящей к возникновению новых генов. Однако биологическое значение гомоло­
гичной и в том числе эктопической РК нельзя свести к их роли в эволюции. Большую роль они играют и в разнообразных онтогенети­
ческих перестройках генетического матери­
ала, участвующих в регуляции работы ге­
нов. Например, конверсия гена (коррекция гетеродуплекса), которая в мейотических клетках является одним из этапов общего процесса кроссинговера, в соматических клетках эукариот и в клетках бактерий может не сопровождаться кросс и н го верой по внешним генам и выступать как само­
стоятельное явление. Такая конверсия вы­
полняет важные функции в онтогенезе бак­
терий, дрожжей, животных- Известно много примеров, когда определенный ген распо­
ложен в локусе, где он имеет собственный промотор и может функционировать, в то время как в других локусах находятся пос­
ледовательности, в основном гомологичные этому гену, но заметно отличающиеся по нуклеотидному составу из-за накопивших­
ся в них мутаций. Они лишены промотора и не могут выполнять функции генов. Эти «молчащие» последовательности могут всту­
пать в синапсис с работающим геном и слу­
жить матрицей для его конверсии. Таким образом, работающий ген может менять свою нуклеотидную последовательность. Подобным способом клетки дрожжей меняют свой по­
ловой тип. У ряда патогенных микроорга­
низмов этот же механизм, позволяющий их клеткам менять свои поверхностные анти­
гены, участвует в ряде других процессов. Так, многие патогенные бактерии (спиро­
хета Borreii a bormsei, гонококки и др.) и простейшие (африканские трипаносомы). с одной стороны, и животные, в которых они паразитируют, с другой, используют в борь­
бе друг против друга в сущности сходные приемы. Животные продуцируют в огром­
ном ассортименте антитела, обеспечиваю­
щие им иммунитет, а патогенные микро­
организмы в ответ образуют на своей поверхности все новые и новые антигены, позволяющие им уходить от иммунного от­
вета хозяйского организма. В основе данных процессов лежат ре комбинационные пере­
стройки в локусах, где расположены гены антигенов или антител. Ре комби наци о иные перестройки включают одни и выключают другие гены либо создают новые гены. По­
мимо описанных процессов, у бактерий и низших эукариот известен ряд других ре-
комбинационных систем, участвующих в регуляции работы генов. В последние годы в генетике возникло целое направление, исследующее ре комбинационные перестрой­
ки генетического материала, закономерно происходящие в ходе индивидуальног о раз­
вития организмов. Литература 1. Ал бе рт е Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Мо­
лекулярная биология клетки. Пер. с англ. М.: Мир, 1В94, т. 1, ч. II, с.301—310 2. И-ше-Вечтомов С, Г. Введение в молекуляр­
ную генетику. М-: Высш. шк., 1903, с. 120—136. 3. Л моим Б. Гены. Пер. с англ. М.. Мир, 19ЕП, с. «3—453. В. М. Глазер ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ БЕЗ ГОМОЛОГИИ: ПРОЦЕССЫ, ВЕДУЩИЕ К ПЕРЕСТРОЙКАМ В ГЕНОМЕ Введение В ланной статье рассмотрены процессы рекомбинации (PKj. либо использующие "vt'iii. ограниченную гомологию между ре-
комбинирующими ДНК. либо вообще обхо­
дящиеся б«м нее. Эти системы внесли су­
щественный вклад в эволюцию генетического материала, но наиболее ярко их биологи­
ческое значение проявляется в онтогене­
тический перестройках ггиимоь, играющих важную роль в жизнедеятельности вирусов, бактерий и эукариот. Эти системы -— сайт-
специфическая РК (СРК). транспозиции и не.гах-оннйл РлГ— в корн*? отличаются от гомологичной РК по механизмам и по набо­
рам контролирующих их генов. Сайт- с пе цифиче с ка я ре комбинаци я СРК происходит между специфически­
ми последовательностями ДНК в пределах очень коротких участков гомологии, обыч­
но 15—30 пар нуклеотидов (п.н). СРК ши­
роко распространена у прокариот и низших эукариот. Она обеспечивает интеграцию (включение) ДНК умеренных фагов в хро­
мосомы бактерий, инверсию (изменение ориентации) отдельных участков ДНК в хромосомах бактерий и фагов и в так на­
зываемой 2-микронной плазмиде дрожжей, а также другие процессы, играющие важ­
ную роль в циклах развития фагов и бак­
терии. Единственный, но жизненно Важный случаи СРК у многоклеточных животных — перестройки у позвоночных в последователь­
ностях ДНК, кодирующих иммуноглобули­
ны — белковые молекулы, распознающие тот или иной антиген при иммунном отве­
те. Рассмотрим некоторые из самых извес­
тных примеров СРК, Наиболее изучена СРК у фага лямбда. После инфекции в клетку Е.соН линейная вирионная двуцепочечная ДНК фага (рис. 1, а) замыкаетс я в кольцо ( рис.1, 6) за счет имеющихся на ее концах комплементар ­
ных одноцепочечных последовательностей. Последующе е развитие фага может идти по пути интеграции в хромосому бакте ­
рии между генами gal и bio ( рис.1, в). Интеграция происходит путем РК между особыми at t (attachment)-cafiTaMH: a t t P в хромосоме фаг а и a t t B — в хромосоме бактерии. Интегрированный фа г называ ­
ется профагом- Он фланкирова н рекомби-
нантными сайтами at t L (левый) и at t R (пра­
вый). Вырезание (эксцияия) профага иэ хро­
мосомы происходит в обратной последова­
тельности событий. Запись реакций в обоб­
щенном виде представлена на рис. 1, е. Из нее видно, что в интегративной РК уча­
ствуют сайты at t P и at t B, продукт фаго­
вого гена in! ( интеграла ) и белок IHF (integration host factor) E.coli. Для эксци-
эии необходимы сайты at t L и attR, те же белки и еще продукт фагового гена xis. Сайты at t P и att B неравноценны. Пер­
вый устроен сложно. При размере около 270 п.н. он состоит из центральной части О и двух примыкающих к ней частей: Р и Р\ Внутри сайта at t P располагаются участки связывания с интегразой и белками IHF и XLs. Сайт att B устроен проще. Его размер всего 23 г н , гомология с at t P ограничена центральной частью иэ 15 п.н-, в которой имеются два сайта связывания с интегра­
зой. Интеграз а являетс я топоизомеразой AMP Реакция в общем виде: Int. IHF г PO P + BOB' > вор' • РОВ 1 Int. IHF, Xis Рис. 1. Схема сайт-специфической рекомбинации у Фага лямбда Линии соответствуют цепям ДНК, две параллельные линии— дуплексу. Синим иветом изображена ДНК фага, красным— часть кольцевой хромосомы E.coli. Р, Р' и В, В' — последовательности сайтов attP и attB соответственно, окружающие центральную часть (О). A, J. N и R —гены фага. Стрелки, идущие вниз, указы­
вают направление процесса интеграции фага; стрел­
ки, идущие вверх— направление вырезания (эксци-
эии) профага. а— линейная (вирионная) ДНК фага; б — ДНК фага после инфекции а клетку E.coli замы­
кается в кольцо, и находящийся в ней сайт attP всту­
пает в рекомбинацию с сайтом attB в хромосоме бактерии. Кроссинговер показан знаком -Х-; в — продукт РК— профаг в составе хромосомы бакте­
рии; г— запись процесса РК в общем виде. Осталь­
ные пояснения даны в тексте гжшткчгтл» гиготинлтгя brj гпмплргж ЛРОЩССУ. Ш1дицн1 пенни ТРОЙИЛМ в пионе S I тнпл \ <о г опонзомераза х ом tt статье О О Фяворопои Репликаци я Д Н К - ), но ТОЛЬКО СЛЙТ-сне11ИфичегкоЙ В результат е ибразонанил комплекс а инт ег раз ы е altP-сантом и белком I HF форкируется слож­
но уложенна я нуклеопротеидна я структу ­
ра, которая захватывае т сайт а(1В. В этой структур а последовательност и al l - сайто в удерживаетс я -та счет взаимодействий меж­
ду белками и затем польергаготся согласо­
ванному расщеплению. Интеграла относится к ферментам типа топои.юмеразы 1, она делает разрыв в одной цепи каждого дуплекса, и я месте разры­
ва образуются З'-Р- и б'-ОН-концы ДНК. Фермент ковалентно связывается с З'-Р-кок-
цом, благодаря чему энергия разорванной фосфодиэфирной связи сохраняется, и для последующего замыкания ра.зрыва, осу­
ществляемого тем же ферментом, не тре­
буется дополнительной энергии. При этом интеграаа может осуществлять РК между at t сайтами путем замыкания фосфоди-
эфирной связи с 5'-ОН-концом из другого дуплекса, т. е. путем обменов 5'-ОН-концами. Такая РК между дуплексами, не требую­
щая дополнительной энергии, называется консервативной-
На рис. 2 изображены только основные детали сложного молекулярног о процесса интегративной РК с участием интегразы. В упрощенном виде его можно представить следующим образом: сначала интеграз а а Г ЦТ Т Т Т Т Т А Т А ЦТ АД ЦГААДАДА Т АТГ.АТТ РИС. 2. Схема двух основных этапов интегративной рекомбинации у фага лямбда а— нуклеотидная последовательность att-сайтов в центральной части О. Вертикальные черточки ука­
зывают сайты разрывов, предшествующих обмену це­
лями между atlP и attB; 6— промежуточная структу­
ра, образовавшаяся после обмена менаду двумя це­
пями ДНК одинаковой полярности в att-сайтах. Физически она соответствует полухиазме Холлидвя; в— продукт завершенной РК. Остальные пояснения даны в тексте производит ofiMeH между двумя целями оди­
наковой полярности. При этом разрыв и воссоединение цепей происходят между строго определенными нуклеотндаии D цен­
тральной части ati-сайтов {рис. 2. «)- В ре­
зультате возникает структура, физически соответствующая пол у хиазме Холл идея (рис.2, б). Затем на расстоянии V о.н. про­
исходит вторая пара обменов между двумя цепями, не участвовавшими в первом об­
мене. Вторая пара обменов приводит к ии-
теграции фага (рис. 2, в); интегрированный профаг фланкирован рекомбинанткыми сай­
тами attL и attR, как это уже было пока­
зано на рис I, в. Предполагается, что для катализа этой реакции необходимы четы­
ре субъединкцы интегразы, связанные в atl-саитах. Важно отметить, что все изученные ферменты, непосредственно осуществляю­
щие СРК у фагов и бактерий, а также белок, катализирующий инверсию в 2-мик­
ронной плазмиде дрожжей, являются сайт-
специфическими топоизомеразами I. По уровню гомологии их аминокислотных пос­
ледовательностей и по механизму катали- , зируемых реакций их подразделяют на две 1 группы: представителями периой группы I являются уже рассмотренная нами интег- • раза фага лямбда, интеграэы других уме- 1 ренных фагов и белок, катализирующий СРК в плазмиде дрожжей, ко второй относят ихвертазы бактерий и фагов и некоторые другие ферменты СРК. СРК, катализируема я ферментами вто­
рой группы, происходит по более простой схеме, чем в случае интеграз. Рассмотрим ее на примере инвертаз бактерий и фагов (рис. 3, а). Эти белки проводят РК между особыми инвертированными {обращенны­
ми) повторами ДЛИНО Й ОКОЛО 30 п.н. Четы­
ре субъединицы фермента, по одной субъ­
единице на кажду ю цепь ДНК, делают разрывы в обеих цепях каждого рекомби-
национного сайта, те одновременно рас­
щепляют все четыре цепи, образуя 5'- Р-
и З'-ОН-концы. При этом разрывы цепей в каждом дуплексе происходят на расстоя­
нии 2 п,н„ так что З'-конец как бы высту­
пает. Фермент ковалентно связываетс я с 5'- Р- концами. Зате м одна часть первого дуплекса меняется местами с той же час­
тью второго дуплекса, после чего воеста-
навлинаютсн сросфоди эф ирные связи во всех четырех цепях. Большинств о из процессов, осуществ ­
ляемых инвертазами у бактерий кишечной группы и их фагов, вовлечено в особую систему сайт-специфически х инверсий ДНК, получившу ю на з ва ни е Din (от DNA inversions} и имеющую большое биологичес­
кое значение. Инверсии специальных сег­
ментов хромосом, ограниченных обращен-
ш*ОЛ1К¥ЛЙРНАЯ ЫЮ/югмя НММЛ М1>НТ1>|ШМИ Д НК ДЛИМОЙ <1КОЛ1» JO П.Н., пршиходн т г Hij(i>K(ii | т е п л о й путем СРК и ят и * тшнтЕфнл М^нля ориентаци ю лпре-
лс>л*'Шо>1х генов относительн о ик лромото-
ров. нлт ^ с - и н приводя т к вк лючени ю од­
ним П'НПВ И В^КЛЮЧРНИЮ ДРУГИХ ЭТО 1)ДММ H:I I'pi i Mi'p'tB рег уляци и работ ы генов путем '""•'цифнч^г к и я перестрое к ДНК. Сайт- гп*?-
цн М ифичг ские инверсии г>бнаружены у фаг ов "- и и 1*], оактерий E.cali. Salmonella typhtmurium. Citrobacter Jreundii Они им^ют npHcjifjcufiHifjibHot эначенир Например, у - £ j * U, (0+) , г лги и ГА г (G _) /1 р » ScSv С \ ••••: TT- u-'S/'W ,> (G- ) (G-> Sc Sv* U U Sv gi n' РИС. 3. Схема сайг-специфической инверсии сегмен­
та G s ДН* фага Ми а — механизм реакции обмена цепями ДНК. Две ли­
нии изображают дуплекс ДНК. Инвертируемый сег­
мент показан зелеными линиями, дев сайта в обра­
щенных повторах на концах сегмента G, между ко­
торыми происходит обмен, выделены красным и синим цветами. Показана только часть нуклеотид-
ной последовательности обращенных повторов, где происходит РК. Буквы А, Г. Ц и Т обозначают реаль­
ные нуклеотиды в сайте обмена. Сайты разрывов обозначены ступенчатыми пунктирными линиями. Для наглядности разрывы цепей ДНК показаны сплошными ступенчатыми линиями. Четыре субъ­
единицы инвертазы, осуществляющие РК, на рисун­
ке не показаны; б— переключение геное хвостово­
го отростка фага Ми в зависимости от ориентации сегмента G. Сегмент G изображен зелеными лини­
ями, треугольники представляют его концевые об­
ращенные повторы. Стрелки под изображением ДНК указывают направления транскрипции генов, а Р — положение промоторов. Остальные пояснения даны в тексте *S\*yphi 7Mi * r 1ИТП и н в е р с и и с е г ме нт а Н п*>р*_ клх'чают №НЫ Н) и Н2, колирующие раз­
ные типы белка, ия которого* построены жгутики (флагеллина^ что позволяет этой патогенной для мышей бактерии менять поверхногтныи антиген и тем самый ухо­
дить от действия иммунной системы хозя­
ина. У фагов инверсии переключают гены кодирующие разные белки хьостовых от­
ростков, что приводит к смене хозяев-бак­
терий, в которых может размножаться фаг В качестве примера рассмотрим систе­
му инверсий G-сегмента у фага Ми (рис. 3, б) Сегмент размером около 3 т.п.н. икеет на концах обращенные повторы и содержит четыре гена: U, TJ', Sv и Sv'. Два после­
дних представлены в сегменте только сво­
ими вариабельными частями, тогда как их общая постоянная часть Sc вместе с про­
мотором Р примыкает к сегменту слева Справа от сегмента G расположен ген ин­
вертазы gi n. При одной ориентации сегмента ( G+) транскрибируютс я гены Sv и U. при противоположной ориентации ( G-) функци­
онируют гены Sv' и U', В первой случае фаг размножаетс я на Е.соН В, E.coli K12 и S.ty phi murium, во вт ором— на Е.соН С, Citrobacter /r cundt i, Shi gel l a sonnt i и др. Следует особо отметить тот факт, что все работающие в системе Din инвертазы фагов и бактерий заменяют друг друга в РК in i>itro- Это обусловлено их общим про­
исхождением: инвертазы гомологичны меж­
ду собой на 60—70%, и их ре комбинаци­
онные сайты в обращенных повторах на концах инвертируемых сегментов также го­
мологичны. За ве ршая описание СРК, отметим ее принципиальные отличия от гомологичной РК. В случае последней молекулы ДНК уз­
нают друг друга путем прямого сопостав­
ления их последовательностей через посред­
ство рекомбиназ типа белка КесА, Для этого в ДНК вводятся специальные пресинапти-
че с кие по в р е жд е ния, высвобождающие одноцепочечные участки ДНК, что и лежит в основе узнавания гомологичных последо­
вательностей. Напротив, при СРК главную роль в синапсисе играет взаимное узнава­
ние белков, связанных с рекомбинационными сайтами. Эти сайты совсем короткие, и го­
мология между ними непосредственно для синапсиса не существенна. Она важна для связ ывания со специфическими белками и для обмена цепями ме жду сайтами. Транспозиции Рекомбинационные процессы еще одного типа —- т р а нс по з иции — л е жат в основе перемещений подвижных генетических эле­
ментов. Подвижные э ле ме нты — это осо­
бые пос ле дов а т е ль нос ти ДНК, способные пгргисшотьг н ил одного участка генома в другой или даже в клетки другого организмы Подвижны*' :>Л1'М*>нты. как нрннило. не су­
ществуют автономно, и для них хярактср-
ми нияожл^нт1 в счктиБ1 - хромосом или плаз-
мил В Гшлмиингтве своем подвижны* 1 яжиг ит ы прокариот и дукариот построены пи полному плану и состоят ил централь­
ной части, фланкированной концевыми об­
ращенными повторами (рис. 4). Транспозиции осуществляются особыми белками, гены (или ген) которых в основ­
ном локализованы в самих подвижных эле­
ментах, в их центральной части Главный белок транспозиции — т р и не ползла. РК меж­
ду подвижным элементом и ДНК, в которую он будет встраиваться (Р Р называют ДНК- JHU -
шенью), происходит на уровне дуплексов, ме имеющих, как и в случае СРК, преси-
наптических фиксированных повреждений. Поскольку РК происходит точно по концам подвижног о элемента, транспозиции мож­
но рассматривать как сайт-специфически й процесс в отношении самого элемента Но встраивание элементов в ДНК- мишен ь чаще всего происходит в случайные сайты. Важ­
но отметить, что сколько-нибудь заметная гомология между подвижным элементом и ДНК- мишень ю отсутствует. Некоторые подвижные элементы бакте­
рий содержат в центральной части также гены, не имеющие отношения к транспози­
ции, чаще всего ято факторы устойчивос­
ти к антибиотикам* лекарственным веществам или ядам. Такие элементы при их открытии получили название транспозоков (Тп); к ним относятся представленные на рис. 4 ТпЗ и Тп5. Позднее так стали называть все под­
вижные элементы. Подвижные элементы с короткими обращенными повторами (рис. i, а) характерны для бактерий, растений и дро­
зофилы. Элементы с длинными обращенны­
ми повторами (рис. 4, б) описаны у бакте­
рий. Эти длинные повторы в свою очередь представляют собой один из типов более просто устроенных подвижных элементов, называемых IS, В этих случаях центральная часть такого слояского тпранспозона содер­
жит только посторонние гены, а гены транс­
позиции находятся в IS-элементах, причем один из них инактивирован одной или бо­
лее мутациями. У эукариот (дрожжей, про­
стейших, насекомых, позвоночных, высших растений) распространены подвижные эле­
менты, получившие название ретпроторак-
спозонов (рис.4, в). Структура ретротранс­
позонов соответствует ДНК-копиям геномов ретровирусов позвоночных, которые также являются подвижными элементами. В транс­
позициях ретротранспозонов задействованы ферментобратная транскриптаэа и РНК-копия элемента в качестве интериедиата (см. ниже). Ретротранспозоны подразделяются на две группы. К первой относятся членен ты с- длин­
ным* прямыми повторами на концах. Вто­
рую группу nfipaiymT элементы, не имею­
щие по вторив на концах. Обращенные повторы абсолютно нгоб-
ходнны для транспозиции, поскольку именно tnpA tnpR bt* тпз- 41 I _ М • US NPTII Транспоэаза Тп5~ * -
IS5DL IS50R gag pot, PR INT нТ ЙН Ту I-
Рис* 4. Структурная организация некоторых подвиж­
ных элементе* Прямоугольники, ограниченные синими линиями, изображаю! центральные части элементов, красны­
ми— обращенные концевые повторы бактериаль­
ны! подвижных элементов или длинные прямые кон­
цевые повторы ретротранспоэона. Прямоугольни­
ки, ограниченные зелеными линиями,— прямые повторы ДНК-мишени, зеленые линии— часть ДНК-мишени, в которую встроен подвижный эле­
мент. Направление красных и зеленых треугольни­
ков указывает ориентацию соответствую щи» повто­
ров- Стрелки над подвижным элементом показыва­
ют направление транскрипции генов. Масштаб не соблюден, з — бактериальный транспозон ТпЗ. Раз­
мер около 5 т.п.н., обращенные концевые повторы по ЗВ п.н., прямые повторы ДНК-мишени по 5 п.н.. tnpA — ген транспозазы. tnpH — ген резолеазы. Уча­
стки начала транскрипции этих генов перекрыва­
ются в рекомбинаций ином сайте RS (сайте разре­
шения коинтегратов дли резолеазы), выделенном синий. Ыа — ген бета-лактамаэы. определяющий ус­
тойчивость к антибиотикам пен ицилл и нового ряда; 6— бактериальный транспозон Тп5, Размер около 5,6 т.п.н.. обращенные концевые повторы представ­
лены подвижным элементом ISS0 длиной 1531-1533 п.н. Левый повтор (1SS0L) инактивирован в резуль­
тате нонсенс-мутации, правый повтор {IS50R) коди­
рует транспоэаэу. NPTII — ген неомицинфосфртран-
сфераэы II обеспечивает устойчивость к антибио­
тику канамицину. Прямые повторы ДНК мишени по 9 п.н.; е— дрожжевой ретро транспозон Ту 1 Раз­
мер около 5,9 т.п.н., прямые концевые повторы по 330 п.н., прямые повторы ДНК-мишени по 5 п.н. С центральной части элемента, включая значительную часть его концевых повторов, считывввтея единый транскрит. Ген gag кодирует структурный РНК-свв-
зывавдщий белок. Ген pol кодирует общий белок, который содержит в качестве доменов интегразу (1NT). обратнуютранг.криптаэу (RT), РНКэзу H(RH) и протеаэу (PR). Последняя затем разрезает общий белок на отдельные ферменты. Остальные поясне­
ния даны п тексте мпптупяенля ctto/Кню ПК №1НПЫ СВЯЗЫВАЮТСЯ ТрниспОлало И И I W ним происходит 1'К У фага Ми, обладаю -
Шего всеми свойствами подвижног о Е*лемен-
ТА. It pi - 1 pr,| p^l t r t l l Cl i i HOb ГТ?рВ|>Й ГруПНЫ опрошенные повторы ct rt uHT нсего ил 2 п.н., но несколько лилыле от концов элементов имеются лонолнитсльиц* 1 обращенные по­
нтеры Все мобильные элементы, за некоторыми исключениями, на обоих концах содержат еще и прямые повторы IT,- J нескольких нук -
леотндон ДНК- мишени. Состав лтих нукле -
отидов варьирует, так как подвижны*? эле­
мент ы внедряютс я в случайные сайт ы ДНК- мишени, но их число постоянно для каждог о элемента. Чаще всего они равно Рис. 5. Общая схема рекомбинационных реакций при транспозициях Линии соответствуют цепям ДНК. Красные линии изображает подвижный элемент, черные линии — ДНК, окружающую подвижный элемент в сайте его первоначальной локализации, зеленые линии ДНК-мишень, Сплошные стрелки на рис. 5. а указы­
вают сайты обязательных разрывов цепей ДНК на концах подвижного элемента, пунктирные ст релк и -
сайты необязательных разрывов. Пунктир на рис. 5, г изображает реп арат и в ну ю репликацию в брешах ДНК-мишени, что приводит к образованию прямых повторов из нуклеотидов ДНК- мишен и по бокам встроенного элемента. На рис. 5, д эти повторы вы­
делены жирными линиями. Этапы а, б и в являются общими для всех реакций транспозиции, этапы г и д относятся к не консервативному механизму. Осталь­
ные пояснении даны'в тексте S или Ч Механиз м образования прямых и^,, второя будет ра.ч-ъяснен немного поезде Таковы общие представления о структур* подвижных элементов. Структур а подвижных элементов онр*~ делнрт механизмы их перемещений. Мож­
но выделить три основных механизма Рк. при транспозициях! репликатиана л транс­
позиция, н* репликативна я транспозиция и перемещени е ретротракспозонов. Они бу­
дут рассмотрены чуть позже. А сначала от­
метим, что хот я эти механизмы различа­
ются в деталях, имеетс я общий принцип реакций транспозици и (рис. 5). Процесс про­
исходит в нескольк о этапов. Сначала транс-
позаза ( у ретротранспозоно в ее называе т интег разои ) сводит вместе концы подвиж­
ного элемент а и делает разрывы точно до этим к онцам, либо в обеих цепях, как в случа е не ре плик а т ивно й транспозици и либо в одной из цепей, кар: ори реплика-
тивной транспозици и и при интеграции ДНК ретротранспозоно в ( рис. 5, а). Затем тракс-
позаз а сводит в к онт ак т концы элемент а и дуплек с ДНК - ми ше н и. Пр и этом она дела­
ет в обеих цепя х ДНК - ми ше и и ступенча ­
т ые раз рыв ы ( рис.5, б), отстоящи е друг от друг а на стольк о п.н., скольк о их обна­
руживает с я в прямом повторе ДНК- мишен и у данного элемента. Следующий этап обмен цепями, приводящий к РК между ДНК элемента и мишени. З'-ОН-концы эле­
мента соединяются с S'-P-концами мише­
ни, оставляя, за счет ступенчатости раз­
рывов, бреши между 5'-Р-концами элемента и З'-ОН-концами мишени (рис. 5, в). Ката­
лизируемое транспозазой расщепление и замыкание концов цепей ДНК происходит без потери энергии фосфодиэфирно й свя­
зи и не требует АТФ, что напоминает кон­
сервативную СРК. На последнем этапе про­
исходит репаративна я репликация ДНК в брешах (рис. 5, г). Этот процесс требует затрат энергии, как и лигирование остав­
шегося после него одноцепочечного разрыва. Заполнени е брешей, осуществляемо е по матрице ДНК-мишени, и формируе т пря­
мые повторы мишени на концах элемента ( рис.5, б). Таким образом, мы разобрали общую основу транспозиционно й РК. Теперь рассмотрим детали. Основные механизмы транспозици й изображены на рис. 6. Ре пл ик а т ив на я транспоз ици я (рис. 6, а) отличаетс я тем, что подвижный элемент, перемещаяс ь в другую молеку­
лу, оставляе т свою копию в исходной ДНК. Это може т произойт и только за счет уд­
воения ( репликации ) элемента. При этом кольцевые ДНК донора и мишени слива­
ются, образу я коинтеграт, в котором пос­
ледовательност и обеих молекул разделены двумя копиями элемента, расположенны­
ми в одной ориентации. Вслед за этим проис-
КОДНТ рн;фГМ1ННИ1* КИИНТег рПТ » 11.1 НСХоЛИЫе МПЛ*'КуЛЫ. КОЖАНА И;* Кит прыл (Ч1Д4'РЖИТ КО­
ПИЮ :.Л1'МГНТЯ l'1'ПКЦНН ПС у1Ц1'СТИЛН|'ЦИ 11Л M('Ki i l"i -i My Ol'K i|n |1М11|тпи рс.тлли.юи, к о­
торая входит в т у же г ру пп у сийт - соеци -
1{И1ЧГ<'КИХ Ti<ii(iH:ii>Hi'pi<;i. чти и инвертины, но от личает с я т г м. чт о провиди т РК по рг к имПпшщипнны м сайтам RS ( имеющим ­
ся внут р и элементов), к от орые нахидяг и н п одинаковой ориентаци и В предыдуще й ста­
тье у ж е ГОВОРИЛОСЬ П ТОМ, ЧТИ ГОМОЛОГИЧ­
НАЯ ]'К между повторами Д НК. расположен ­
н ыми в о дн о й о р и е н т а ц и и, п р и в о д и т к делеци н мат ериала. з ак люч енног о ме жд у повторами. Та к и здес ь СР К ме жд у дв у мя прямыми повт орами п одв ижног о элемент а приводи т к а к бы к делени и и:) к оинт ег рат а одной из плачмид, спета в ля ющи х к оин т ег -
рат, вмест е с одно й к о п и е й п о д в и жн о г о элемента. Эт о и ест ь раз решени е к оиит ег -
рата. Реплик ат ив на я т ранс п оз ици я — от нос и ­
тельно р е дк и й мех аниз м. Он о б н а р у же н у фаг а Ми и б а к т е р и а л ь н ы х т р а н с п о а о н о в семейств а Тп З с к о р о т к и м и о бр а ще н н ым и повторами. Неконсервативная транспозиция (рис. 6, б) заключается в вырезании элемента и его перемещении в новое место. Этот механизм характерен для большинства подвижных элементов бактерий и эукариотических эле­
ментов е короткими обращенными повторами. Как уже указывалось, у ретротранспо-
эонов с длинными концевыми повторами транспозиция происходит по схеме, вклю­
чающей РНК-интермедиат. В этом процессе участвуют специальные ферменты, коди­
руемые самими ретротранспозонами {см. рис.4, в). В их центральной части распо­
ложен ген pol, кодирующий несколько не­
обходимых для транспозиции белков: ин-
тегразу, обратную транскриптаз у и РНКазу Н, которые первоначально образуютс я в виде общего белка, а потом нарезаютс я на отдельные белки под действием специаль ­
ной протеазы, также кодируемой геном pol. Схема транспозиции дана на рис. 6, е. С ге­
номной ДНК элемент а транскрибируетс я РНК-копия, но уже с короткими концевы­
ми прямыми повторами, с нее путем обрат­
ной транскрипции синтезируетс я ДНК-копия с длинными повторами, которая встраива ­
ется в новое место с помощью интегразы. РК у ретроэлементов без концевых повто­
ров менее изучена, но она также осуще ­
ствляется через РНК-интермедиат. Незаконная рекомбинация Незаконная РК— это сборна я группа процессов, где РК происходит без гомоло­
гии между молекулами ДНК, и при этом без использования механизмов СРК и транспози-
о-осю .—ч ф трниптриПцИП С ""^ i Цитолпаэма I но-
Ингегрэидо -СИ Н Транскрипция о-о Рис* 6. Основные механизмы транспозиций а — схема реплика™ вной транс позиции. Окружнос­
ти .изображают кольцевую двуцепочечную ДНК. Под­
вижный элемент представлен в виде красного пря ­
моугольника, красная стрелка указывает ориентацию элемента. Черная окружность — ДНК с донорным элемен?ом, зеленая окружность — ДНК-мишень. Знак *Х- показывает сайт-специфический обмен между ре-
комбинационными сайтами подвижных элементов, осуществляемый реэолвазой; б ~ схема нерепяика-
тивной транспозиции.Условные обозначения те же, что на рис. а: в— упрощенная схема цикла транспо­
зиции у ретротранспоэонов. Синяя линия изобража­
ет РНК-копию ретротранспозон а с короткими пря ­
мыми концевыми повторами, представленными в виде прямоугольников. Красная линия — двуцепочеч-
ная ДНК- копия ретротранспозона, но с длинными прямыми концевыми повторами ( красные прямо­
угольники). Зепеиав линия— ДНК- мишен ь (хромо­
сома клетки хозяйског о организма). Зеленые пря ­
моугольники, примыкающие к ретротраиспозону,— прямые повторы ДНК- мишен и из 5 п и Масштаб не соблюден. Остальные пояснения даны в тексте ций. В качестве примеров можно привести захват ретровирусом некоторых клеточных генов при его эксцизии из хромосомы хо­
зяйской клетки, а также интеграцию фраг ­
ментов ДНК, вводимых в клетки позвоноч­
ных с помощью микроинъекций. Механизмы незаконной РК мало изучены. Общим для них являетс я соединение разорванных кон­
цов негомологичных молекул ДНК. Впервые механиз м одной из реакций незаконной РК был описан японским ис­
следователе м X. Икедой (Н, lkeda) c сотруд­
никами в 1982 г. В опыте in vitro они про-
SI МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ демонстрировали РК между полностью не­
гомологичными ДНК плазмиды pBR322 и фага лямбда, катализируемую высокоочи-
щенной топоизомеразой II (ДНК-гиразой) Е.соЬ Согласно модели, предложенной ав­
торами, две молекулы гиразы, каждая из которых состоит из двух пар субъединиц, разрывают в обеих молекулах обе цепи ДНК, удерживая их концы. Затем они об­
мениваются парами субъединиц вместе с удерживаемыми концами разных ДНК-пар­
тнеров и сшивают концы дуплексов. Ре­
акция консервативна, т. е. обходится без АТФ. Позднее Икеда показал такую РК и в клетках E.coli. К настоящему времени на­
коплены данные об участии топоизомераз обоих типов в незаконной РК у бактерий и эукариот. С другой стороны, в последнее деся­
тилетие у амфибий и млекопитающих об­
наружены ферменты, связывающие дву-
цепочечные концы ДНК независимо от их гомологии, природа которых до последнего времени оставалась неясной. Сенсационный прорыв в этой области возник в 1994— 1995 гг. в результате исследования мутантов грызунов, проявляющих повышенную, по сравнению с нормальными особями, чув­
ствительность к ионизирующим излучениям. Известно, что ионизирующие излучения вызывают двуцепочечные разрывы ДНК, т. е. разрывы хромосом, для залечивания которых в нормальной клетке существу­
ют специальные системы репарации. У мутантов они нарушены. Кроме того, у мутантов оказалась подавленной и интег­
рация в хромосомы фрагментов ДНК, ис­
кусственно введенных в клетки. Это неуди­
вительно, поскольку у млекопитающих в основе процессов как интеграции чужерод­
ной ДНК, так и репарации двуцепочечных разрывов лежит соединение концов разор­
ванных двуцепочечных ДНК, т. е. оба про­
цесса осуществляютс я по механизму не­
законной РК (в отличие от дрожже й и бактерий, у которых они основаны на го­
мологичной РК). Неожиданным оказалс я тот факт, что мутанты проявили неспо­
собность к рекомбинационным перестрой­
кам в кодирующих иммуноглобулины пос­
ледовательностя х ДНК, а это означает, что незаконна я РК играет важную роль и в этих перестройках. Таким образом, было выяснено, что в РК иммуноглобу -
линовых последовательносте й ДНК задей­
ствованы два разных механизма. Ранние этапы — образование сайт- специфичес ­
ких двуцепочечных разрывов происходя т по типу СРК, а поздние — воссоедине ­
ние концов ра з рыво в — по механиз му незаконной РК. Выявле н и фермент, от­
ветственный за незаконну ю РК. Указан­
ные выше радиочувствительны е мутан­
ты оказались дефектными по ДНК-зависи­
мой протпеинкиназе Этот фермент активи­
руется, связываясь со свободными конца­
ми ДНК независимо от их происхождения и соединяет эти концы. Нетрудно заметить, что незаконная РК, подобно СРК и транспозициям, мо­
жет приводить к хромосомным перестрой­
кам. В живой клетке разрывы хромосом являющиеся одним из источников незакон­
ной РК, могут спонтанно возникать в ходе репликации, транскрипции и репарации ДНК. С другой стороны, нельзя исключить возможность того, что произвольное ком­
бинирование разорванных концов эукари-
отической хромосомы может лимитировать­
ся структурной организацией хроматина фиксирующей эти концы. Заключе ние: рекомбинационные перестройк и геномо в Мы рассмотрели далеко не все при­
меры рекомбинационных систем, ведущих к перестройкам в генетическом материа­
ле. Их много, и их роль разнообразна. В последнее время внимание исследовате­
лей все больше и больше привлекают так называемые запрограммированные пере­
стройки генетическог о материала, зако­
номерно происходящие на определенных стадиях жизненног о цикла многих орга­
низмов и, как правило, являющиеся од­
ним из механизмов регуляции работы ге­
нов. В качестве примера можно назвать уже описанные выше сайт-специфичес ­
кие инверсии сегментов ДНК у фагов и бактерий, перемещени е генов поверх­
ностных антигенов у африканских три-
паносом — возбудителе й сонной болезни человека, удаление части высокоповторя-
ющейся (сателлитной) ДНК в онтогенезе аскариды, циклопа, кузнечика, полную перестройку генома в ходе формирования вегетативног о ядра у инфузорий, РК в иммуноглобулиновых районах ДНК у по­
звоночных. Разумеется, существуе т неко­
торая относительност ь понятия «законо­
мерные перестройки». Если для фага или патогенной бактерии сайт-специфически е инверсии являютс я закономерной частью их жизненног о цикла, то с точки зрения организма-хозяин а эти события случайны. Другое дело перестройк и при формирова­
нии генов иммуноглобулинов, проходящие последовательно, в несколько этапов, при­
чем каждый этап приуроче н к строго оп­
ределенной стадии дифференцировк и В-
и Т- лимфоцитов. С этих позиций можно говорить о возникновении в процессе эво­
люции специализированных рекомбинаци­
онных систем, играющих важную роль в дифференцировк е и онтогенезе. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ РЕКОМБИНАЦИЯ БЕЗ ГОМОЛОГИИ, nonne„L. Надо отметить, однако, что запрограм­
мированные геномные перестройк и широко распространен ы у одноклеточных организ ­
мов, а у многоклеточных крайне редки Для животных их список почти исчерпа н при­
веденными выше примерами, у растений они вообще неиз вестны. Если не считат ь процессо в у д а л е н и я с а т е ллит но й ДНК, единственным примеро м закономерных пе­
рестрое к я в л я е т с я все та же РК в имму-
ноглобулиновых ДНК. Но и она происхо­
дит в однокле т очны х предшественника х лимфоцит ов. Причин ы подобной уникаль ­
ности понятны. Ведь в ре з уль т а т е такой РК из ог ромног о мно же с т в а в ыжив а ют только редки е клетк и с удачной перестрой­
кой, соответствующе й условия м среды оби­
т а ния, а о с т а л ь ны е погибают. Ясно, что ра з в ит и е событи й по такому плану в плот­
ных т к а н я х мног окле т очны х организмо в ВЕДУЩИЕ К ПЕРЕСТРОЙКАМ В ГЕНОМЕ 59 создало бы неразрешимую проблему для их существования. Поэтому у многоклеточ­
ных запрограммированные геномные пе­
рестройк и сохранилис ь только в виде отдельных очень важных и очень специ­
альных систем, а в основном они исполь­
зуют менее рискованные способы регуля­
ции работы генов. Литература 1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Мо­
лекулярная биология клетки. Пер. с англ. М.: Мир, 1994, т. 1, ч. II, с. 310—313, 318—324. 2. Инге-Вечтомов С. Г. Генетика с основами селекции. М.:Высш. шк., 1989. С.336—346. 3. Льюин Б. Гены. Пер. с англ. М.: Мир, 1987, с. 453—476, 490—492. 4. Хесин Р. В. Непостоянство генома. М.: Мир, 1984, с. 9—52, 105—113, 228—236, 352, 376—378. ТРАНСКРИПЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ Введени е Участки ДНК, кодирующие белки, на­
зывают генами. Генетическая информация передается от ДНК к белкам через посред­
ство информационных, ИЛИ матричных, РНК (мРНК). Кроме того, ряд генов оп­
ределяет синтез других функционирующих в клетке РНК: РНК рибосом, транспорт­
ных РНК, специального класса РНК, уча­
ствующих в процессах секреции белков, и малых ядерных РНК, обеспечивающих созревание РНК. Процесс, в ходе которого нуклеотидная последовательность ДНК копируется в виде комплементарной ей последовательност и РНК, называетс я транскрипцией. При транскрипции ген должен быть доступен РНК-полимеразе — ферменту, осуществля­
ющему на ДНК как на матрице полимери­
зацию рибонуклеозидтрифосфато в (РНТФ) с образованием РНК: п молекул РНТФ —> РНК + п молекул пирофосфата. Синтезированная информационная РНК поступает в рибосомы, где согласно пра­
вилам генетическог о кода в результат е процесса трансляции (перевода генетичес­
кой информации с «языка» нуклеотидов на «язык» аминокислот) образуются белки. В статье изложены современные пред­
ставления о регуляции активности генов в процессе транскрипции. Отмечена роль из­
менчивости структуры спирали ДНК в ре-
гуляторных районах генов, рассматриваются закономерности взаимодействия белков-ре­
гуляторов с ДНК. Транскрипция генов в клетках бактерий Рассмотрим сначала процесс синтеза информационной РНК в клетках бактерий. Он осуществляетс я с помощью РНК-поли-
меразы, состоящей из нескольких отдель­
ных взаимодействующих друг с другом бел­
ков — полипептидных субъединиц. Одна из них катализируе т основную реакцию по­
лимеризации рибонуклеотидов, остальные помогают ей. РНК-полимераз а присоеди­
няется к определенному участку в нача­
ле гена, называемому промотором. В этом п!йпне начинается синтез РНК. Промото-
Г о в б к т е р и й имеют определенную пГслГе^вательнос Ть н ^ ^%%МаГи^прНедел:нныхРучастков ДНК ос-
новано на специфичном нековалентном взаимодействии аминокислотных остатков с нуклеотидами. Для успешного специфического взаимо­
действия РНК-полимераз ы с ДНК-матрицей необходима белковая субъединица сигма (о). Когда синтез РНК начинается, сигма-субъ-
единица уходит из комплекса (диссоцииру­
ет), она уже больше не нужна (рис. 1, а). Для того чтобы началась транскрипция не­
которых генов, может понадобиться особый вариант сигма-субъединицы. Поэтому бак­
терия имеет несколько генов, кодирующих разные сигма-субъединицы, которые пред­
назначены для узнавания «своих» бактери­
альных генов. Когда бактерии испытывают стресс (шок), например тепловой, необхо­
димо быстро синтезировать ряд защитны^ белков и, следовательно, транскрибировав** гены, кодирующие эти белки. Особый ва* риант сигма-белков необходим бактерии щщ образовании спор в условиях недостатка пищи или воды. Каждая из субъединиц сигиа> узнает определенную, характерную для тот или иного промотора бактериальных генов последовательность нуклеотидов, взаимодей­
ствуя в основном с большой бороздкой дву-
нитевой спирали ДНК. Сначала образуется «открытый» комплекс ДНК с РНК-полиме-
разой (рис. 1, а), когда двунитевая струк­
тура ДНК раскрываетс я («плавится») на участке, примерно соответствующем одному витку двойной спирали ДНК. Затем на од­
ной из нитей ДНК как на матрице (эту нить называют значащей) синтезируетс я РНК, последовательность нуклеотидов в которой комплементарна последовательности матрич­
ной нити ДНК. Движение РНК-полимера­
зы по матрице сопровождается расплета­
нием двойной спирали ДНК впереди нее и восстановлением — позади. Синтез РНК заканчивается в определенной точке в конце гена. Участок остановки транскрипции ча­
сто представлен такой нуклеотидной пос­
ледовательностью, где связь рибонуклео­
тидов с комплементарной матричной нитью ДНК ослаблена. Остановку синтеза РНК в определенной точке могут также осуществ­
лять специальные белки. Существуют белки, которые в клетках бактерий препятствуют синтезу РНК (вы­
ключают ген) или, наоборот, включают ген для его активной транскрипции РНК-поли-
меразой. Белки, выключающие гены, называют репрессорами, включающие ген акти­
ваторами. Механизм действия репрессоров jwcimmtm и HtXAHHiMb, p f f „ „,- Акттаности гIнов • t „й«-л...л™ и« спец„фИЧНЬ1 „ »МИМ<1Д(.ЙСТВИ. ,.„ с учмтк™ ЛНК, называемым onepamo-
,»и Оператор может находиться в разных „„.гтжгниях относительно промотора Иног-
ла „ператор перекрывается с область*, про­
стора, пн может также располагатьс я как „,.р..д пр<миот„р„„, т а к „ э а н и м М о л ль. рнпрессора. свнаанные с д н к л и 6 „ „*_ "'""м '.l ^""" Р Н К -"« » ^ р а ^,, либо, В3аи«„лейс™уч с полимерами и ДНК. пре­
пятствуют началу с и „ т е з а РНК (рис 1..). т2 Z'ZZ"a* ^У™*»" транскрипции. Г Я"»' ™»- «<*нру«>щ™ бел-
—:°:z b z B a ™ р-««™„ я и сб Р а -
,а м >, п „ * „.р о В р в "тсутствие этих са-
= Я еГл в ^ 0 г пр * с с о р( т - в « -
„,,„ „ „ „ „ -»>i/xniop — в данном случае Ж Г й ^ - аимодейетвуе т »™*™4t«to), после чего такой реп-
Облас'г ТрвнС|<Рипиив У бактерий С'ВчлиГ п р о м о т о Р° в выделены желтым цветом, вает с От к о д я ц в н о т области промотора, указы -
а _ гаРгавую точку и направление транскрипции. взаимодействие РНК-полимеразы с промото-
т р а н и начало синтеза РНК: б— сопряженный с ной С1Ц>ИПцмв и биосинтез белка на новообразован-
Репс* ' * И Г — ВЛИЯнИв н а синтез РНК белков-
Рессорой и белков-активаторов в комплексе с "•«Упорами рессор уже не способен связываться с ДНК и препятствоват ь взаимодействию промо­
торов с РНК-полимерааой (рис.1, я). Как следствие начинают работать гены, обес­
печивающие в конечном итоге расщепле­
ние Сахаров для сбраживания. Действитель­
но, если в клетке много Сахаров, то требуется их активное расщепление к сбра­
живание Наряду с такой негативной ре­
гуляцией транскрипции с помощью репрес-
соров наблюдается и позитивная регуляция, когда молекула-индукто р связываетс я с белком-активатором, изменяя его струк­
туру таким образом, что он приобретает свойство связываться с участком ДНК. от­
стоящим от промотора В этом случае в основе механизма активации лежит способ­
ность молекулы ДНК изгибаться, благодаря чему белок-активатор вступает в контакт с молекулой РНК-полимеразы, обеспечи­
вая эффективный синтез РНК (рис. 1, г). Отметим следующую особенность регу­
ляции транскрипции в клетках бактерий. Эти клетки не имеют оформленного ядра, отделенного от цитоплазмы. В клетках выс­
ших организмов в ядре, ограниченном мем­
бранами, сосредоточена ДНК и осуществ­
ляется синтез РНК, тогда как синтез белка происходит с участием рибосом в цито­
плазме. В клетках бактерий образующая ­
ся молекула мРНК может сразу же свя­
зываться с рибосомами и транслироватьс я с образованием белка (рис. 1, б). Успешная трансляция способствует транскрипции. Рибосомы, перемещаясь по длине ДНК, как бы подталкивают РНК-полимеразу. «Голая» РНК без рибосом беззащитна, и ее обра­
зование в отсутствие трансляции может быть приостановлено в результат е взаи­
модействия со специальным белком, кото­
рый «выдергивает» образующуюся РНК из комплекса с ДНК и РНК-полимеразой, Дей­
ствительно, зачем бактерии синтезироват ь информационную РНК, если нет условий для трансляции и образования кодируемого ею белка? В клетках, имеющих ядро, от­
деленное мембраной от цитоплазмы, про­
цессы синтеза РНК и белка разобщены. Поэтому способ регуляции транскрипции с участием рибосом, широко распространен­
ный у бактерий, здесь невозможен. Р о л ь пр о с т р а нс т в е нно й с труктур ы ( к о я фо р ма ц н и ) мо л е к у л ы ДНК в проце с с е транс крипци и Способ воздействия бел ка-активатора на РНК-полимераз у показывает, что молеку­
ла ДНК — не «жесткая» палка, а достаточно гибкая структура. Способность изгибаться в определенных участках может определять­
ся особенностями нуклеотидной последом-
I I НОЛЕНУЛЯРНЛЯ БИОЛОГИЯ тельности Так. например, если расстояние между Аликами следующих друг за другом пар оснований аленин-тимин составляет 10 нуклеотидных пар, появляется возможность самопроизвольног о изгиба ДНК, который можно наблюдать в электронный микроскоп. ДНК изгибается и при взаимодействии с ней регулят<фныл белков— репрессоров и ак­
тиваторов (рис. 2, о) Особую роль в обеспечении процесса транскрипции, равно как и репликации (см. статью О. О. Фаворовой «Репликация ДНК»), играет сверхспирализация ДНК. Бактери­
альная хромосома представляет собой кольцо двунитевой спирали ДНК, закрепленное в клеточной мембране (рис 2, б). Двойная спираль этого кольца может Сыть дополни­
тельно закручена в сверхспираль. Сверх-
спирализацию ДНК можно иллюстрировать на модели скрученной резиновой трубки (рис.2, в). ДНК обычно характеризуетс я сверхспирализацией, соответствующей «не-
докрученному» состоянию двойной спирали: Рис. 2. Подвижность пространственной структуры ДНК я—изгибы ДНК: f —участок молекулы ДНК со слу­
чайной нуклеотидной последовательностью. 2— са­
мопроизвольный изгиб ДНК, определяемый особен­
ностями нуелеотидной последовательности. 3,4 — изгибы; С — сверхспирализация ДНК кольцевой хро­
мосомы бактерий под действием топоиэомераэ: в — представление о сверкспиралимции на модели скру­
ченной резиновой трубки: г— петельная укладка ДНК • клеточном ядре эукариот при этом на один ее виток приходится мень­
ше пар оснований, чем в расслабленном (релаксированном) состоянии. Сверхспира­
ли эация создает напряжение, которое может быть сброшено за счет локального распле­
тания двойной спирали (рис. 2, б). Предпо­
лагается, что такое энергетически выгод­
ное частичное расплетание двойной спирали может облегчать взаимодействие образую­
щихся однонитевых участков с регулятор-
ными белками. Поэтому транскрипция более эффективно осуществляетс я на снерхспи-
ралиаованной ДНК. Перечисленные выше принципы регу­
ляции транскрипции (связывание репрес­
соров и в особенности активаторов, изги­
бы ДНК) действуют и в клетках высших организмов. Процесс еверхспирализаци и ДНК наблюдаетс я и здесь, хотя у много­
клеточных хромосомы не замкнуты в коль­
цо. Однако структура растянутой ДНК в неделящемс я ядре, где хромосом не видно, представлена отдельными петлями (доме-
нами), закрепленными в так называемом матриксе, прилегающе м к ядерной мем­
бране (рис. 2, в). Поэтому отдельные участки линейной хромосомы можно рас­
сматривать как кольцевые структуры, спо­
собные к еверхспирализации. Б клетках бактерий кольцева я хромосома также мо­
жет быть закреплена белками с образова­
нием отдельных доменов. Сверхспирализация, облегчая тран крипцию и репликацию, играет важную роль в этих процессах. Сверхспирализаци я обеспечиваетс я специальными фермента­
ми — топоигомеразами, способными с о э д ^ вать еверхспирализаци ю ДНК или, нао№-
рот, уничтожат ь сверхвитки (рис. 2, О), результате образуются топоизомеры Д j содержащие большее или меньшее к°?а~ честно еверхвитков. Топоиэомеразы способны как разрезать ДНК, так и зашивать обра­
зующийся разрыв, В течение того време­
ни, пока разрыв существует, может пр -
исходить вращение концов цепе й ДН относительно друг друга, что приводит либо к уменьшению, либо к увеличению еверхспирализации. Таким образом, пространственна я струк­
тура ДНК достаточно подвижна, образуя изгибы, с верх витки, а также расплетенные участки. Образование этих динамичных, способных переходить одна в другую струк­
тур в значительной степени определяетс я удивительными свойствами самой ДНК, но сильно облегчается при взаимодействии со специфичными регуляторными белками-
Поэтому схемы, иллюстрирующи е на плос­
кости листа бумаги стадии транскрипции и ее регуляцию, на самом деле следовало бы представлять в виде трехмерных динамич­
ных моделей. ГРЛНСКРИПЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ Г£НОВ 6% днк Факторы транскрипции Усилитель" Рис. 3. Транскрипционные комплексы в ядрах клеток высших организмов РНК-полимеразэ обозначена зеленым цветом, факторы транскрипции—жел­
тым (за исключением рецептора сте­
роидного гормона, обозначенног о оранжевым). Ломаная красная стрел­
ка указывает стартовую точку и направ­
ление транскрипции. Ф — остаток фос­
форной кислоты, а— пространствен­
ные взаимодействия белков друг с другом и с ДНК. б— воздействие сте­
роидных гормонов на активность генов Транскрипция в клетках эукариот, имеющих оформленное ядро, отделенное оболочкой от цитоплазмы К эукариота м относятся не только все многоклеточные организмы, но и некото­
рые одноклеточные микроорганизмы, на­
пример дрожжи. Клетки этих организмов имеют сложную мембранную цитоплазмати­
ческую сеть и клеточные органеллы. В та­
ких клетках регуляция транскрипции услож­
нена по сравнению с бактериями. Велико число дополнительных белков, обеспечива ­
ющих работу РНК-полимераз. Так, РНК-по-
лимеразы эукариот сами по себе не спо­
собны узнать промотор, им помогают в этом другие белки — многочисленные факторы транскрипции. Один из них, обеспечиваю­
щий сборку транскрипционног о комплекса на ДНК, способен «оседлать» ДНК-спирал ь таким образом, что участки седла распо­
ложатся по малым бороздка м двунитевой опирали ДНК (рис. 3. а). Затем уже могут присоединиться другие факторы и, нако­
нец, сама FHK-полимераза. Самое начало транскрипции в значительной степени за­
висит от химической модификации отдель­
ных субъединиц полимеразы. Например, отмечено интенсивное фосфорилировани е одной из них с образованием эфирной свя­
зи между гидроксилом аминокислот ы и ос­
татком фосфорной кислоты. Только после появления в результат е фосфорилировани я дополнительных заряженных групп весь комплекс, включающий собственно РНК-по-
лимераэу и многочисленные дополнитель ­
ные факторы, способен обеспечить актив­
ную транскрипцию гена. Перед участком взаимодействия поли­
меразы с ДНК (собственно промотор) рас­
полагаются короткие нуклеотидные после­
довательности — «мотивы-, наприме р GGGCGG или ATTTGCAT (запись соответ­
ствует последовательност и оснований одной из комплементарных нитей, где G —гуанин, С— цитозин, Т— танин и А— аденин), узнаваемые факторами транскрипции. Не­
которые факторы представляют собой белки составленные из двух идентичных или до­
статочно сходных субъединиц. Такой прин­
цип узнавания широко распространен и у бактерий. Его преимущество состоит в том, что небольшая молекула индуктора, при­
соединяясь к одной белковой субъединице. 14 МСЛекМЯРНАЯ бИОЛогна резко ускоряет присоединение второй мо­
лекулы к другой субъединице, способствуя тем самым быстрому образованию биологи­
чески активного белкового комплекса в ответ на изменение концентрации индуктора в клетке. Другие важные следствия парной (димерной) структуры белков, взаимодей­
ствующих с ДНК. будут отмечены дальше. Короткие ^мотивы», узнаваемые факторами транскрипции, обычно разбросаны на уча­
стке длиной 300—400 нуклеотидных пар перед геном (рис 3, й). Кроме того, у эука-
риот нередко встречаются "усилители», также представляющие собой короткие участки ДНК, узнаваемые белками. Усили­
тели могут быть расположены достаточно далеко, на расстоянии 1000 нуклеотидных пар и более от старта транскрипции Их активирующее воздействие на транскрип­
цию гена можно представить, принимая во внимание, что ДНК может изгибаться, в результате чего усилитель и связанный с ним белок будут приближены к участку связывания РНК-полимераз ы с ДНК. Сход­
ным образом могут действовать и «глуши­
тели», подавляющие транскрипцию (рис. 3). Интересно, что усилитель может превра­
щаться в глушитель в зависимости от того, какие белки с ним будут взаимодейство­
вать в данной клетке. Клетки разных тка­
ней различаются по набору таких регуля-
торных белков. Благодаря этому при развитии организма происходит процесс дифференцировки, который приводит к об­
разованию разных типов тканей, различа­
ющихся наборами работающих генов. На­
личие тех или иных белковых факторов, взаимодействующих с промотором, усили­
телем или глушителем, будет проявлять­
ся в том, что данный ген либо будет ак­
тивно работать («экспрессироваться»), либо его активность будет подавлена («репрес­
сирована»). Итак, активная транскрипция гена ста­
новится возможной после того, как на ДНК соберется крупный белковый комплекс, включающий факторы транскрипции и РНК-полимеразу. Целый ряд факторов, присоединяясь к ДНК в области коротких нуклеотидных «мотивов», располагающих­
ся вблизи гена или удаленных от него, вза­
имодействует друг с другом или непосред­
ственно с РНК-полимеразой, обеспечивая транскрипцию. Пространственные структуры (конформация) белковых факторов должны быть хорошо «подогнаны» друг к другу, как это схематически представлено на рис. 3, обеспечивал тем самым либо работу гена, либо, наоборот, его выключение. Такой способ взаимодействия компонентов — бел­
ковых факторов транскрипции и РНК-по-
лимеразы— сравнивают со складыванием отдельных, достаточно причудливой фор­
мы кусочков детской мозаики, когда ребенку удается составить осмысленную картинку из отдельных фрагментов. В рамках этой модели можно представить себе, как дей­
ствуют, например, стероидные гормоны. Гормон проникает в клетку, где в цито­
плазме связывается с рецептором — бел-
ком, являющимся фактором транскрипции. В результате такого взаимодействия уча­
сток белковой молекулы-рецептора (домен), способный специфично связываться с ДНК, освобождается от других белков, скрывав­
ших его в отсутствие гормона (рис.3, 6). Комплекс гормона с рецептором перемеща­
ется в ядро и связывается с определенны­
ми нуклеотидными «мотивами» тех генов, которые регулируются гормонами. Напри­
мер, это могут быть гены, кодирующие белки, ответственные за регуляцию концен­
трации кальция в организме (такие, как остеокальцин} и определяющие образова­
ние костей. В результате неактивный транс­
крипционный комплекс превращается в ак­
тивный благодаря вытеснению из него белка, связанного с участком «глушителя» на ДНК Гормон-рецепторные комплексы могут не только активировать, но и подавлять ак­
тивность генов. В некоторых случаях раз­
ные гормон-рецепторные комплексы конку­
рируют между собой за участки связывания с ДНК. При увеличении концентрации ак­
тивирующего гормон-рецепторног о комплек­
са может быть вытеснен другой гормон-ре-
цепторный комплекс, репрессирующи й активность гена. Хроматин В клетках эукариот ДНК связана с бел­
ками значительно теснее, чем у бактерии. Такой комплекс белков с ДНК называют хроматином. ДНК в неделяЩемся ядре орга­
низована в нуклеосомы (рис.4), Нуклеосе-
КОМПЛИСС трэнС1ф*иЧ1*Ли№Л факторов Рис. 4. Организация ДНК в составе хроматина Пояснения см в тексте ма содержит В молекул ядерных белков-
гистонов, образующих глобулы, на которые навита ДНК. Между нуклеосомами находится участок ДНК (линкер), который может быть свободным от белков или связан с особым гистоном, определяющим более плотную упаковку хроматина. Перед делением клетки такая нуклеосомная структура сильно уп­
лотняется, делается более компактной бла-
ТРАНСКРИПЦИЯ И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ fit годаря сворачиванию в спираль. Б конеч­
ном счете образуется видимая в микроскоп в митозе хромосома, содержаща я плотно упакованную в спираль ДНК В неделящемс я ядре, где активно ра­
ботает ряд генов, нуклеосомы расположе ­
ны достаточно строго— в определенных участках для каждой промоторной облас­
ти Присутствие нуклеосом в области про­
мотора обычно подавляет активность генов, препятствуя присоединению факторов транс­
крипции. Это связано с тем, что белки нуклеосом •— гистоны конкурируют с фак­
торами транскрипции аа участки свободной от белков ДНК. Такие участки могут обра­
зовываться в клетке сразу после реплика­
ции ДНК. Если гистоны успеют образовать нуклеосомные структуры в условиях, ког­
да концентрация факторов транскрипции недостаточна, то ген оказываетс я репрес­
сированным. Наоборот, при достаточной концентрации факторов они успешно кон­
курируют с ги стон а ми и в области промо­
тора образуют специфичную нен у к лесе ом­
ну ю структуру, прилегая к РНК-полимеразе. В этом случае ген будет активно работать. В отдельных случаях, напротив, нуклеосом-
иая организация обеспечивае т особую про­
странственную трехмерную структуру хро­
матина, необходимую для транскрипции гена. В клетке могут работат ь механизмы, обеспечивающие при необходимости актив­
ное разрушение нуклеосошной структуры и активацию гена. Этот процесс «сдирания» гистонов нуклеосом с ДНК требует энерге­
тических затрат (расхода аденозинтрифос -
форной кислоты) и проходит достаточно эффективно. В результат е участки, ранее занятые нуклеосомами, связываются с фак­
торами транскрипции, обеспечивая актив­
ность гена. Образуетс я структура «актив­
ного хроматина», представленна я на рис. 4. Каким образом внешние факторы сигнализируют о необходимости активироват ь работу гена? Стероидные гормоны регулируют актив­
ность генов, легко проникая в клетку че­
рез липидную мембрану. А каким образом осуществляетс я влияние на работу генов внешних факторов, не проникающих в клет­
ку, например таких, как полипептидные гормоны (инсулин и др.) и многочисленные белковые факторы роста, управляющи е делением клеток? На поверхности клетки имеется ряд белковых молекул-ре цеп торов, пронизывающих мембрану. Эти рецепторы взаимодействуют с белками, находящими­
ся вне клетки. В результате такого взаи­
модействия активируются примембранные J- » ч ™л м у » „ 1 в т »,| осуществляющие •S фосфорилирование ряда других белков А, Б и др. (рис. 5). Уже отмечалась функ­
циональная роль фосфорных остатков в фосфорилированной субъединице РНК-по-
лимеразы. Фосфорилирование белка А пре­
вращает его в прптеннкинаэу, осуществля­
ющую в Свою очередь фосфорилирование белка Б и превращение последнего также в активную протеинкиназу, в свою очередь специфично фосфорилирующу ю ряд дру­
гих белков Возникает каскад реакций фос­
форилирования. В результате фосфорили-
руются факторы транскрипции, образующие семейство J ( Л, J2, J3 и т.д.). Эти белки как факторы транскрипции активны толь­
ко в состоянии пар— димеров, включаю­
щих идентичные (пары J1J1 или J2J2) или неидентичные субъединицы (пары J1J2 или J2J3). Очевидно, что способность образовы­
вать пары из неидентичных субъединиц (ге-
теродимеры) значительно увеличивает число возможных пар Если число вариантов J равно п, то число разнообразных пар (ди­
меров) будет равно w(n - 1)/2. Каждая из этих пар может обладать определенной специ­
фичностью при взаимодействии с промото­
рами разных генов, В результате реакций фосфорилирования, вызванных взаимодей­
ствием белкового фактора роста с рецеп­
тором клеточной поверхности, образуется большое разнообразие димерных факторов транскрипции, запускающих работу ряда генов, необходимых для клеточных делений. Этот пример свидетельствуе т о большой биологической роли фосфорилирования бел­
ков протеинкиназами. Клетка на определенных стадиях раз ­
вития организма выбирает одну из возмож­
ностей: либо она продолжае т делиться, либо дифференцируется, т.е. становится специализированной клеткой (клеткой нерв­
ной, почечной, костной и др. тканей). Кле­
точные деления поддерживае т каскад ре­
акций фосфорилировани я под действием факторов роста. Отметим, что механиз м запуска реакций фосфорилировани я рабо­
тает таким образом, что они сами собой затухают, если нет соответствующих вне­
шних «раздражителей», постоянно стиму­
лирующих размножение клеток и рост тка­
ней. Следовательно, чтобы поддерживат ь клеточный рост, необходимо постоянное присутствие внешних стимулятор и», В то же время активность фосфорилированных димерных факторов транскрипции может быть блокирована стероидными гормонами, проникающими в клетку и в ядро в соста­
ве гормон-рецепторных комплексов. Один из возможных механизмов блокирования транскрипции, вызываемой J- факторами, определяется белок-белковыми взаимодей­
ствиями между JJ-димером и гормон-ре-
цепторным комплексом (рис. 5). В резуль -
Наружная мембране клетки Фактор I роста I Щи|реов АТФ Белок А Л » ф Рецептор / Протеимкмназа / ^^Г" Г i i J-факторы транскрипции Рис, 5. восприятие (рецепция) «н»,,.^ сигналов, активирующих mna^nj^* Ф - остаток фосфорной кислоты. Облает промоторов выделены сиреневым цаегоь Стрелка, отходящая от области промг^. указывает стартовую точку и направлен» транскрипции, в— каскад реакций фос**,, рилирования в результате связывании ™ цептором белкового фавора роста; с~ блокирование транскрипции в результат удаления димерных транскрипционных ф^. торов под действием стероидного гормона в составе гормон-рецегпорного комплек, са. Предстаалеи связанный в промоторной области гетеродимер, состоящий из рази» J-факторое. Образование комплекса гоо-
мока с рецептором показано на рис. 3.6; в— нарушение контроля транскрипции вследствие мутации гена, кодирукхцегоовин из J-факторов. J-фактор. измененный в ре­
зультате мутации, не способен взаимодей­
ствовать с гормон-рецеторным комплек. сом. Изображен гомодимер из идентичных мугаиионно измененных J-факторов Комплекс гормона с Рецептором Ф**Ф I Мот°РНУюВо^ГстДьелнТ* " П ° КВДа е Т ПР °" юЩий клеточиi Й И Гек' о б е с п е ч и в а" & т о Же ере Р° ст, перестает работать. re"bi, необхопи ГорМо н активирует другие Ре»Цировки ДИМЬ1е Для клеточной диффе-
б °т а гена ' н а п р и м е Р активируется ра-
с^довате,л*одиРУ| °*Цего остеокальцин, м°н-.р е це пТ0 Н0, с пос"6 воздействий гор-
"Ыть двояким"*0"1 К0М11лекса на ген может и активирует г Г°МПЛеК С теятяется с ДНК е т с другие,/!*1' к о мп л е к с вэаимодейству-
блокиру.г ™ факто Рами транскрипции и ToliZ Тра"с«РйПцию гена. ДируютЛ г Р р ИПЦИ ° ННЬ,е Ф"™Р« типа J ко-
«ормальног к о т °Ры е необходимы для Однако есп°' "" регУлиРУем<«'о роста клеток. эультате чГгг Ге'У,С'Юрче н мУТВ1»,ей. в Ре" мене„и ь ш "° ° 6 Ра э *«с н J -*a KT°P с и э -
больщой ко„п^СТВа МИ КЛК в ч е п о ме Р"° Рост (Ы К0Н1<еитрации, то регулировать «« УдаетсГт Р' С ПОМ01ЧЬ« гориона) уже пш.и™ к* в Результате мутации ноже Т Ь С МЭ ь'в а н и я J-Фактора с ДНК ТЬ СИЛЬк о увеличена, а его взаи-
Действие с гормон-рецептор нъш комплек­
сом ослаблено. Рост клеток выходит иэ-под контроля, создается возможность для зло­
качественного роста. Клеточный ген, испор­
ченный мутацией и вызывающий опухоле­
вый рост, называют онкогеном. Нормальные клеточные гены, которые в результате мутаций могут быть превращены в онкоге­
ны, называют протпооккогекалш, Протоон-
когеном может быть ген, кодирующий фак­
тор транскрипции. Протоонкогенами могут выступать и другие гены, например те, которые кодируют белки, участвующие в восприятии и проведении внешних сигна­
лов (например, гены, кодирующие мемб­
ранные рецепторы). В этом случае также нарушается нормальная регуляция транс­
крипции генов за счет внешних сигналов, что сопровождается нерегулируемым, опу­
холевым ростом клеток. Заключение Рассмотрены процессы транскрипции и некоторые механизмы ее регуляции у бак­
терий и высших организмов. Следующие закономерности лежат в основе регуляции активности генов на этапе транскрипции. цш*л**Чч » шхмшзт! ttrytmpm лкгтностм тою» 1. Пространственная структура дьуни-
теаюй спирали ЛВК подвижна, спираль спо­
собна изгибаться, с верхе км реализоваться и расплетаться в отдельных участках, 2- В клетках высших организмов при­
сутствует большое количество белковых факторов, участвующих в регуляции траве-
жрмтшкк. Промоторы генов, с которыми эти белки взаимодействуют, сложно устрое­
ны. 3. Белки, осуществляющие травскрип-
шпо а регулирующие ее, «узнают» корот­
кие (около 10 нухлеотндвых пар) последо­
вательности ДНК и взаимодействуют с этими участками ДНК В результате определяет­
ся положение старта транскрипции в на­
чале гева и достигается высокая эффектив­
ность транскрипции. *- "егУ-'1яция транскрипции достигается также Благодаря высокоспецифичным вза­
имодействиям белковых молекул друг с другом. Тем самым обеспечивается образо­
вание активирующего комплекса белков вблизи старта транскрипции или, наоборот. создание структуры, препятствующей тран кркпции. Не следует забывать, что конечное пр явление активности гена— образован! кодируемого геном белка •— в особенности высших организмов определяется не тол ко транскрипцией. но зависит и от ря, химических превращений новообразованн< молекулы РНК на пути к зрелой ияформ циовной РНК. Способы регуляции активн ста гена на этапах химической модифик ции РНК после транскрипции рассмотри! в отдельной статье. Литература 1. Георгиев Г. П. Гены высших оргавиэмеи их экспрессия- М ; Наука, 1989. 2. Льюин В. Гены. Пер. с англ. М.: Мир, 19 3. Нейфах А. А„ Лозовская £. Р. Гены и р: витке организма. М.: Наука, 1984. 4. Пташке М. Переключение генов. Пер. с ai М.: Мир, 1988 5. Франк-Камепецкий М, Д. Самая главная: лекула. М.: Наука. 1983. В. А. Гвоздев РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ ПРИ СОЗРЕВАНИИ КЛЕТОЧНЫХ РНК Введение Транскрипция генов с образованием РНК у эукариот осуществляется в ядре (см. ста­
тью В. А. Гвоздева «Транскрипция и механиз­
мы регуляции активности генов»), после чего новообразованная РНК-предшественник пре­
терпевает сложные превращения, включа­
ющие химическую модификацию и укороче­
ние полинуклеотидной цепи. Эти процессы обеспечивают созревание молекул РНК. Со­
зревшие молекулы переходят в цитоплазму, где и функционируют: кодируют белки или, например, в составе рибосом осуществляют синтез белка. Регуляция активности генов может осуществляться не только за счет из­
менения интенсивности образования РНК (транскрипции генов), но и благодаря кон­
тролю за созреванием РНК (информацион­
ных, рибосомных,транспортных и других), претерпевающих в ядре сложные превра­
щения. Экзоны РНК-предшественник Интроны вырезаются, экзоны сшиваются ,, (сплайсинг) В этой статье мы рассмотрим механиз ­
мы созревания РНК. Увидим, каким образом на стадиях созревания РНК в ядре может осуществлятьс я регуляция работы генов. По­
кажем, что странная на первый взгляд пре­
рывистая структура генов не только обес­
печивает тонкую регуляцию их активности, но и способствует экономному, эффективному использованию информации, закодированной в нуклеотидной последовательност и ДНК. Созревание информационных, или матричных, РНК, кодирующих белки В 1977 г. была установлена прерывистость генов у эукариот. Оказалось, что кодирую­
щие белок последовательност и прерывают ­
ся вставками, которые не кодируют белок и удаляютс я из предшественник а РНК. Эти участки были названы интронами (рис. 1). ПЗ' Интроны 5'| 1 Г Незрелая мРНК 3 3' Модификация Ъ'- и З'-концов "Шапочка" Хвост из полиадениловой кислоты 5-Оа*ХХХХХХХХХХХХУХУХУ У Зрелая мРНК Ч?3* Транспорт в цитоплазму С мембр_ана Цитоплазма j - Трансляция(синтез белка) 5' фИ^ХХХХХХХХХХХХХХ! ""Ч 4-13' Рис. 1. Этапы созревания ин­
формационной РНК эукариот Зеленым цветом обозначены 5'-
и З'-концевые области гена и мРНК, которые не транслируют­
ся, т. е. не кодируют аминокис­
лотные последовательности бел­
ка, но могут играть роль в ре­
гуляции трансляции. Синяя стрелка на 5-конце гена указы­
вает начало и направление транскрипции,красная стрелка в начале транслируемой области мРНК— начало и направление трансляции РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ ПРИ СОЗРЕВАНИИ КЛЕТОЧНЫХ РНК 69 Участки РНК, ковалентно соединяющиес я друг с другом и сохраняющиес я в составе зрелой РНК, называют экзопами. Зрела я информационная, или матричная, РНК (мРНК), содержащая экзоны, транслируетс я в цитоплазме рибосомами с образование м белка. Оказалось, что у эукариот экзон-
интронная структура генов является скорее правилом, а гены без интронов — немного­
численными исключениями. В то же время гены бактерий обычно не содержат интро­
нов. Экзоны включают последовательност ь нуклеотидов, представляющу ю собой сле­
дующие друг за другом кодоны (нуклеотид-
ные триплеты), которые определяют поло­
жение аминокислот в белке (см. статью С. Г. Инге-Вечтомова «Как читается генети­
ческий код: правила и исключения»). Мо­
лекулы РНК, как и нити двойной спирали ДНК, полярны; различают 5'-и 3'-концы мо­
лекулы (см. статью О. О. Фаворовой «Реп­
ликация ДНК»). Участки экзонов или даже отдельные целые экзоны, располагающи ­
еся на 5'- и 3'-концах молекулы информаци­
онной РНК, могут не использоватьс я при трансляции, они не кодируют аминокис ­
лоты. Такие нетранслируемые участки, однако, необходимы для э ффе кт ивно й трансляции или стабилизации мРНК (рис. 1). Некодирующий участок на 3'-конце может определять локализацию мРНК как в клет­
ке, так и в пространственно ограниченном участке ткани развивающегос я эмбриона. По концам мРНК проходит химическая мо­
дификация: навешивание специальной нук-
леотидной структур ы — «шапочки» на 5'-конце и присоединение к 3'-концу мо­
лекулы «хвоста» из остатков адениловой кислоты (А). Такая модификация обеспе­
чивает стабильность мРНК и способность к трансляции в цитоплазме с участие м рибосом. Процесс удаления интронов и сшивания экзонов получил название сплайсинга (от англ. «splice» — соединять концы). РНК-пред­
шественник может содержать от одного до десятков интронов, размеры которых сильно варьируют (от 50 нуклеотидов до несколь­
ких тысяч). В результате удаления интро­
нов РНК укорачивается. Поэтому длина РНК-предшественник а (тысячи и десятки тысяч нуклеотидов) часто в несколько раз превосходит длину зрелой РНК. Сплайсинг РНК происходит в ядре по мере образо­
вания (транскрипции) РНК на ДНК-мат ­
рице. Сплайсинг должен осуществлятьс я точ­
но, поскольку ошибки при вырезании инт­
ронов и сшивании экзонов могут привести к нарушению кодирующей способности сши­
тых экзонов. В результате белок, закоди­
рованный в последовательност и РНК, не будет образовываться. Молекулярный меха­
низм сплайсинга представляе т собой после­
довательные этапы упорядоченных, следу­
ющих друг за другом взаимодействий от­
дельных компонентов машины сплайсинга с новосинтезированным РНК-предшествен ­
ником. В число компонентов, катализиру ­
ющих процесс сплайсинга, входят: так на­
зываемые малые ядерные РНК (мяРНК); белки, связанные с мяРНК в составе ри-
бонуклеопротеидных частиц; дополнитель ­
ные белки, которые не только определя ­
ют эффективност ь сплайсинга, но и, как будет видно, могут менять его характер. Молекулярные механизмы сплайсинг а РНК- предшественник а одинаковы у всех эукариот — от дрожже й до позвоночных. Компоненты машины сплайсинга, в том числе мяРНК, также очень сходны по своему стро­
ению и свойствам. Это свидетельствует о том, что сплайсинг возник в процессе эволюции достаточно давно. Экзон-интронна я струк­
тура генов также является древней. Было, например, выяснено, что ген глицеральде -
гид-3-фосфатдегидрогеназы, участвующей в метаболизме глюкозы, как в ядерной ДНК, так и в ДНК хлоропластов растений содер­
жит пять интронов в идентичных положе­
ниях. Считается, что хлоропласт ы возник­
ли в результат е эволюции из бактерий — симбионтов эукариотических клеток, имею­
щих обособленное ядро. Следовательно, эти интроны уже существовали у общего гена-
предка. РассмЪтрим, какую роль в сплайсинг е играют мяРНК, которые кодируются специ­
альными генами. мяРНК становятся активными только после того, как они побывают в ци­
топлазме, где происходит химическая моди­
фикация их 5'-концов (рис.2, а). Присоеди­
ненные химические группы, включающие метилированные остатки гуанина (G), узна­
ются белками. Эти белки содержат специфи­
ческие «ярлыки», представленные опреде­
ленными последовательностями аминокислот, которые диктуют переход в ядро комплекса «белок—мяРНК». Таким образом, цитоплаз ­
ма также участвует в созревании ядерных предшественников мяРНК и, следовательно, других типов клеточных РНК. мяРНК при­
соединяются к РНК-предшественник у и друг к другу посредством комплементарных вза­
имодействий, представленных в основном парами Уотсона-Крика (см. статью О. О. Фа­
воровой «Репликация ДНК»). В двойной спи­
рали РНК- РНК взаимодействуют G (гуанин) с С (цитозином) и А(аденин) с 1Т(урацилом), которому в ДНК соответствует тимин. Удаление интрона возможно лишь в том случае, если на границах с экзонами нахо­
дятся так называемые незаменимые «ка­
нонические» нуклеотиды— GU на одном конце и AG на другом. Замены этих нуклео­
тидов на другие (например, G на С) в ре-
70 МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ зультате точечных мутаций вызывают на­
рушение сплайсинга и как следствие пре­
кращение образования нормального белка, кодируемого геном. Подобные мутации об­
наружены, например, в генах глобинов у человека. Они являются причиной наслед­
ственной болезни, при которой вследствие недостаточности глобина (гемоглобина) раз­
вивается анемия. Замены канонически х нуклеотидо в в интроне нарушают комплементарные взаимодействи я РНК- предшественник а (пре-мРНК) с мяРНК 1 и 2 (рис.2). Еще одним важным элементом в нуклеотидной последовательност и интрона является А (аденин), который не образует пары с U и, следовательно,не входит в состав двой­
ной спирали в результат е взаимодействия с мяРНК2. Поэтому этот А обладает осо­
бой реакционной способностью. В резуль ­
тате при разрыве межнуклеотидно й свя­
зи на границе экзон 1— интрон образуется ковалентная эфирная связь между 2'-гид-
роксилом рибозы аденозина, не участву­
ющим в формировании 3'-5'-фосфодиэфир-
ных связей РНК, и фосфатной группой первого нуклеотида (G) интрона. Соответ­
ствующие структурные формулы можно найти в статье Д.Г. Кнорре (см. Литерату­
ру). Возникшая промежуточная структура на­
поминает лассо (рис. 2, а). Затем интрон от­
щепляетс я от экзона 2 и частично или полностью деградирует, а экзоны сшиваются с образованием фосфодиэфирной связи. В основном благодаря биохимическим исследованиям in vitro удалось выяснить что представляе т собой промежуточна я структура при сплайсинге экзонов, в со­
став которой входят по крайней мере три типа мяРНК: 2, 5 и 6 (рис. 2, б). мяРНК 5 содержит «шпильку»: петлю из неспарен-
ных нуклеотидов на «стебле», где нукле-
отиды образуют пары, создавая двойную РНК-спираль. Нуклеотиды петли, взаимо­
действуя за счет водородных связей с эк­
зонами, удерживают их вблизи друг от друга. мяРНК 2, сохраняя взаимодействие с интроном ( А- нуклеоти д не образует 5* * wwv w43' химическая модификация 5'-конца а Ядро Участие в сплайсинге Г -^С""Белок~^> Рибонуклеопротеиновая Ядерная \_) мембрана частица-компонент сплайсосомы N-R ~~н R-N МЯРНК2 3* 5" Экзон 1 тт GU Отщепление экзона 1 с образованием структуры лассо |Экзон 1 б интрон A G'— С мяРНК1 У*3' птт ^5* Белок Экзон 2 —3 * I О лассо i А Выщепление лассо-интрона и сшивание экзонов Экзон1 Экзон 2 Рис. 2. Механизм сплайсинга с уча­
стием малых ядерных РНК (мяРНК) G— гуанин, U— урацил, А— аденин. Взаимодействи я комплементарных нуклеотидных пар в двуспиральном участке РНК (водородные связи) по­
казаны отрезками, соединяющими две антипараллельные нити. Оранжевым обозначен интрон, выделен входящий в его состав нуклеотид А, участвую­
щий в формировании «точки ветвле­
ния» лассо. Петля лассо на рисунках а и б изображена в разных масшта­
бах, а— синтез, модификация и вов­
лечение мяРНК в сплайсинг экзонов; б— промежуточная структура сплай­
синга экзонов, предшествующая вы-
щеплению лассо-интрона и сшиванию экзонов. Представлены только фраг­
менты мяРНК. в случае мяРНК 5— ее консервативная шпилька. Водородны связи между петлей консервативной шпильки мяРНК5 и экзонами, а также между двумя G на концах интрона изображены пунктирными линиями; в — необычная пара оснований, образующаяся между двумя G, располо­
женными по краям интрона. Водородные связи изображены пунктирными линиями мяРНК 6 гтттг г 3" Крайние G-нуклеотиды с. интрона взаимодействуют, сближая экзоны РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ ПРИ СОЗРЕВАНИИ КЛЕТОЧНЫХ РНК 71 пары!), «спаривается » другим своим уча­
стком с мяРНК 6. На рис. 2, б и 2, в пока­
заны также так называемые «нестандарт ­
ные взаимодействия » двух G (гуанинов), находящихся по краям интрона. Эти вза­
имодействия помогают стягиват ь экзоны и осуществлят ь сплайсинг. Характе р во­
дородных связей, формирующи х пару ос­
нований G-G, отличается от классических, наблюдаемых в паре G-C Уотсона и Кри­
ка. Так, аминогруппа G, участвующа я в установлении комплементарных взаимодей­
ствий с С, здес ь остаетс я «вне игры» (рис. 2). Отметим, что мяРНК 6 только на определенном этапе сплайсинга становится способной к изображенным на рисунке вза­
имодействиям; перед этим мяРНК 6 на­
ходилась в прочном комплексе с мяРНК 4 (не показано на рис 2) за счет протя ­
женного участка комплементарных нуклео-
тидных пар. Другими словами, мяРНК 4 до поры до времени блокировала актив ­
ность мяРНК 6. Таким образом, сплайсинг протекает в несколько этапов: начинается с взаимодей­
ствия пре-РНК с мяРНК 1, затем образу­
ется лассо и сложная многокомпонентна я структура, представленна я на рис. 2, б. Пространственна я структура взаимодей­
ствующих участков молекул РНК обеспе­
чивает каталитические реакции разрыв а одних межнуклеотидных связей и возник­
новение новых. В основе катализ а лежит способность РНК образовыват ь описанные структуры, обеспечивающие высокую ре­
акционную способность совершенно опре­
деленных нуклеотидов, расположенных по длине молекул РНК. Возникновение таких структур обеспечивает точность сплайсинга. В ряде случаев, например в РНК- транс ­
криптах генов клеточных органелл (мито­
хондрий или хлоропластов), образование сложной трехмерной структуры в районе интрона обеспечивае т его вырезани е и сшивание экзонов без участия белков. Та­
кой процесс, не зависящий от белков, на­
зывают самосплайсингом. Способность молекул РНК катализиро­
вать собственные химические превращения или модификацию (созревание) других мо­
лекул РНК позволило назвать их рибози-
мами, по аналогии с ферментами (энзима­
ми) — хорошо изученными биологическими катализаторами. Первостепенную роль для успешного катализа реакции рибозимами играют комплементарные взаимодействия нуклеотидных пар в РНК-РНК-комплексе. Необходимо отметить, что активность ри-
бозимов сильно увеличивается, когда они связаны с белками. Так, белки ускоряют взаимодействия мяРНК с пре-мРНК. При­
сутствие белков показано на схеме (рис. 2, а) лишь в одном месте (вблизи AG нуклео­
тидов) ввиду того, что механизмы действия и районы связывания таких белков, способ­
ных специфически узнавать участки РНК, выявлены недостаточно. В сплайсинге принимают участие и бел­
ки, обладающие ферментативно й активно­
стью. Для сборки катализирующег о сплай­
синг комплекс а необходимо потребление энергии в виде расщепляемых молекул АТФ; соответственно, в его составе обна­
руживаютс я белки, обладающи е адено-
зинтрифосфатазно й активностью. Кроме того, здесь функционируют и РНК- хели-
казы — ферменты, способные расплетат ь при потреблении АТФ двойные спирали РНК- РНК. Эти ферменты подобны ДНК-хе-
ликазам, расплетающим двунитевую спираль ДНК при репликации молекулы ДНК (см. статью О. О. Фаворовой «Репликация ДНК»). Хеликазы обеспечивают ход сплайсинга; они вовремя разрушают одни РНК- РНК взаи­
модействия (например, мяРНК4~мяРНК6), способствуя тем самым возникновению но­
вых нековалентных связей молекул РНК. Таким образом, последовательност ь событий, ведущих к сплайсингу экзонов, достаточно жестко определена, причем каждая после­
дующая стадия (или реакция) обусловлена предыдущей. Реакции сплайсинга осуществ­
ляются в крупном рибонуклеопротеидном ком­
плексе — тельце, содержащем несколько мо­
лекул РНК и десятки белков, необходимых для эффективного сплайсинга. Эта структура получила название сплайсосомы. Многокомпонентность машины сплайсинга позволяет регулироват ь скорость процесса созревания РНК в зависимости от концен­
трации отдельных компонентов или их хи­
мической модификации. Например, наблю­
дали фосфорилирование белков сплайсинга, сопровождающеес я активацие й одних и инактивацией других белков. Альтернативный регулируемый сплайсинг Оказалось, что экзоны, если их несколь­
ко, могут сшиваться (сплайсироваться ) в разных комбинациях. Более того, нуклео-
тидная последовательность, выступающа я как экзон в одном случае, ведет себя как интрон в другом. Эти возможности выбора путей сплайсинга молекулы РНК-предше ­
ственника представлены на рис. 3. Напри­
мер, участок экзона 1а может вести себя как интрон. Другой случай демонстрируе т образование из одного предшественник а двух разных РНК, состоящих из участков, кодирующих белковые структуры разных типов. Так, если представить себе, что эк­
зон 2 кодирует в молекуле белка элементы а-спирали, а экзон 3 — так называемой Р-структуры, то РНК 1 будет кодировать 72 МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ белок, не содержащий [i -структуры, а РНК 2, напротив, служит матрицей для белка без участка а-спирали. В результа­
те образуются так называемые изоформы белка. Это наблюдаемое для многих генов явление выбора путей созревания мРНК по­
лучило название альтернативного сплай­
синга. Многие гены содержат десяток и бо­
лее экзонов. Поэтому число варианто в зрелых молекул мРНК, содержащих раз ­
ные экзоны, потенциально может быть до­
статочно большим, приближаясь к величине 2\ где п — число экзонов. Таким образом, экзон-интронна я структура оказываетс я чрезвычайно экономичной, обеспечива я большое разнообразие белков, кодируемых разными мРНК, которые, однако, произош­
ли из одного и того же РНК-предшествен ­
ника в результате транскрипции одного гена. Случаи альтернативног о сплайсинг а имеют место в мышечной ткани, приводя к образованию функционально различаю­
щихся, но во многом сходных (содержа т общие экзоны!) белков. Это же явление широко распространено в нервной ткани. Так, например, разнообразие белков обо­
лочки нервных волокон обусловлено аль­
тернативным сплайсингом. Альтернативный сплайсинг нередко используетс я при син­
тезе белков — факторов транскрипции (см. статью В. А. Гвоздева «Транскрипция и ме­
ханизмы регуляции активност и генов»), необходимых для включения (или выклю­
чения) гена и работы РНК- полимеразы. Наличие того или иного фактора транс ­
крипции может определять судьбу клетки, ее дифференцировк у в клетку специали­
зированной ткани — нервной, жировой, по­
чечной и т. д. Альтернативный сплайсинг выполняет свою роль и при образовании ва­
риантов белков клеточной адгезии, кото­
рые отвечают за передвижение клеток и структурирование тканей. Бактерии, обла­
дающие, как правило, генами без нитро­
нов, лишены этого способа регуляции ра­
боты (экспрессии) генов. Каким образом осуществляетс я выбор пути альтернативног о сплайсинга, явля­
ющегося важным механизмом регуляции ак­
тивности генов и клеточной дифференци-
ровки? Характе р сплайсинга регулируетс я белками, способными связыватьс я с моле­
кулой РНК в районах интронов или погра­
ничных участков экзон-интрон. Такие белки могут блокироват ь удаление одних интро­
нов, в то же время активируя вырезание других. Рис. 2 показывает, что РНК-пред­
шественник, взаимодейству я с другими компонентами сплайсосомы, складываетс я в сложную трехмерную структуру. Нетруд­
но представит ь себе, что при участии бел­
ков, регулирующих сплайсинг, происходят такие пространственные изменения струк­
туры РНК-предшественника, которые ис­
ключают возможност ь объединения одной пары интронов и, напротив, будут способ­
ствовать эффективному сшиванию другой пары. Направленная регуляция путей сплайсинга может иметь громадные биологические по­
следствия, например определять пол орга­
низма. Случай определения пола, основанный на регуляции сплайсинга, достаточно хоро­
шо изучен у плодовой мушки — дрозофилы. Успехи этих исследований основаны на ра­
ботах генетиков, изучавших мутации, нару­
шающие становление пола. Огромную роль здесь сыграли также работы, в которых в эксперимента х in vitro были использованы «клонированные гены» (рекомбинантные ДНК). Экзон1 §г л —тяг а-спираль р-структура Домены белка, кодируемые отдельными экзонами 2 4 а-спирапь в белке 1 3 4 Э-структура в белке РНК1 РНК 2 Рис.3. Разные пути сплайсинг а РНК-предшественник а (альтерна­
тивный сплайсинг ) приводят к об­
разованию информационной РНК, кодирующей белки с разными свой­
ствами Красные прямоугольники обознача­
ют экзоны, используемые при обо­
их путях альтернативног о сплай­
синг а; зеленые и синие прямо­
угольники— экзоны, которые при альтернативном сплайсинг е могут вырезаться и, следовательно, ведут себя как части интронов. Ломаные линии, соединяющие экзоны над прямоугольниками и под ними, ука­
зывают разные пути сплайсинга РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ ПРИ СОЗРЕВАНИИ КЛЕТОЧНЫХ РНК 73 Рис. 4. Регулируемый «каскад» следую­
щих друг за другом альтернативных путей сплайсинга определяет становление пола на самых ранних стадиях развития дрозо­
филы Зеленые и синие стрелки обозначают со­
ответственно положения инициирующег о и стоп-кодонов, т. е. начало и конец транс­
ляции. Экзоны, специфичные для самцов, выделены красным цветом. Остальные по­
яснения см. в тексте Самцы XY (одна Х-хромосома) Ген (("главный'*) РНК1 Самки XX (две Х-хромосомы) „ 1 4 5 6 7 8 РНК не образуется I Развитие эмбриона -
Белок 1 I 1 2 3 4 5 6 7 8 РНК 16 t. Белок 1 направляет дальнейший сплайсинг с образованием РНК 1а и блокирует образование РНК 16 • 1 2 4 5 6 7 8 Синтезируется короткий быстро распадающийся белковый фрагмент РНК1 Г а t Белок 2 Белок 2 направляет сплайсинг РНК1 по пути образования РНК 1а и влияет на сплайсинг РНК 2 Ген 2 1 2 3 \ РНК 2а Lt Синтезируется короткий неактивный белковый фрагмент 1 2Т3 РНК 2 [ Q ] t _ t Белок 3 Белок 3 направляет сплайсинг с образованием РНК 3 и блокирует образование РНК За Ген ЗСдвойной пол") РНК За 1Л t ( РНКЗ и 1 t Белок 5 Белок 5 исключает возможность развития самки Белок 4 Белок 4 исключает возможность развития самца Полученные результат ы суммированы на рис. 4. У дрозофил ы имеютс я две половые хромосомы (X и Y). Самки имеют две Х-хро­
мосомы (XX), тогда как с а мцы— Х- и Y-хромосомы. Ген 1 («главный»), который за­
ставляет включиться «нижележащие » гены, участвующие в определении пола, понача­
лу начинает работать (транскрибироваться ) только у самок. Это связано с тем, что в клетке срабатывает механизм, подсчитыва­
ющий число Х-хромосом. Он основан на том, что у самок (с двумя Х-хромосомами) обра­
зуется достаточное количество белкового фактора транскрипции, кодируемого распо­
ложенным на Х-хромосоме геном, чтобы ак­
тивировать промотор 1 главного гена и тем самым «запустить» его транскрипцию (см. статью В. А. Гвоздева «Транскрипция и ме­
ханизмы регуляции активности генов»). У самцов же (с одной Х-хромосомой) количе­
ство синтезируемого белка недостаточно для запуска главного гена. У самок в результа­
те транскрипции главного гена и последу­
ющего сплайсинга образуется РНК 1, содер­
жащая экзоны 1,4,5,6,7 и 8. Потенциальные экзоны 2 и 3 не входят в состав мРНК. Эти события происходят на самых ранних ста­
диях развития эмбриона. Немного позднее ген 1 начинает транскрибироватьс я как у самок, так и у самцов, с использованием дру­
гого промотора 2, лежащего ближе к 5'-кон­
цу гена. В этом случае 5'-конец РНК-пред­
шественника будет удлинен, в результат е чего экзон 1 сплайсируется иным путем и становится короче. Белок 1, образующийся при трансляции РНК 1 и отсутствующий у самцов, являетс я регуляторным белком сплайсинга. Этот белок направляет сплайсинг у самок с образованием зрелой РНК 1а, со­
держащей фрагмент экзона 1, к которому пришиваются последующие экзоны: 2-4-5-
6-7-8. Как ясно из сказанного выше, белок, определяющий такой характер альтернатив­
ного сплайсинга, отсутствует у самцов. В результате в ядрах клеток развивающего­
ся эмбриона самца предшественник РНК созревает с образованием РНК 16, вклю­
чающей экзон 3, которого нет в РНК 1а. Экзон 3 содержит «стоп-кодон», который останав-
74 МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛРГиа ливает рост полинептидной цепи белковой молекулы (см. статью С Г. Инге-Вечтомова «Как читается генетический код: правила и исключения»), В результат е синтез белка на РНК 16 если и начнется, то быстро оборвется с образованием очень короткого, распадаю­
щегося белкового фрагмента. Таким образом, «самцовый» тип сплайсинга приводит фак­
тически к инактивации гена, поскольку ген не кодирует образование функционирующе й белковой молекулы. Следовательно, резуль ­
татом альтернативног о сплайсинг а може т быть не только образование изоформ бел­
ков, кодируемых одним геном, но и инак­
тивация гена («главного» гена у самцов). Бе ­
лок 2, образующийс я у самок, постоянно направляет ход сплайсинга с образование м РНК 1а; кроме того, он регулируе т созре­
вание РНК 2, содержаще й экзоны 1-2-3. Эта РНК 2 образуется уже на другом гене, гене 2, входящем в систему генов определения пола у дрозофилы. У самцов в отсутствие белка 2 образуется несколько иной вариант РНК 2 — РНК 2а, включающа я несколько увеличенный экзон 2. Этот фрагмент экзона у самок узнается как интрон. «Самцовая» часть экзона 2 содержит стоп-кодон, останавли­
вающий трансляцию. У самок образуется ак­
тивный белок 3, который определяе т харак­
тер сплайсинга РНК 3, включающе й экзоны 1-2-3-4. С РНК 3 считываетс я белок 4. В от­
сутствие белка 3 РНК 3 в ядрах клеток самцов «сплайсируется» таким образом, что после­
довательность, соответствующа я экзону 4 самок, выглядит как интрон, а к экзону 3 пришиваются экзоны 5 и 6. На этот раз РНК За (экзоны 1-2-3-5-6) у самцов, кодируема я геном 3 («двойной пол»), не содержит вред­
ных стоп-кодонов, она кодирует функцио­
нальный белок 5. Мишенями действия регу-
ляторных белков 4 и 5, синтезированных на матричных РНК 3 и РНК За, являются гены, дальнейшая работа которых полностью ис­
ключает соответственно развитие самок или самцов (рис. 4). Отметим, что несмотря на вариации в характере сплайсинга, всегда по краям интронов располагаютс я вышеупомя ­
нутые канонические нуклеотидные после­
довательности, используемые при катали­
зе того или иного пути сплайсинга. Мы проследили «каскад» регулируемых событий альтернативного сплайсинга. У самцов он дважды приводил к образованию дефект­
ной мРНК, не способной кодировать доста­
точно длинный и функционально активный белок. У самок наблюдается последователь ­
ное, поэтапное образование матриц РНК для кодирования белка, регулирующег о транс­
крипцию и/или ход событий альтернативно­
го сплайсинга. Примеры альтернативног о сплайсинг а новообразованной РНК показывают, как в конечном счете окупаютс я затраты, в том числе энергетические, идущие на синтез «избыточных» участков РНК, которые затем удаляютс я и не используютс я для синтеза белка. Альтернативный сплайсинг обеспе­
чивает регуляцию работы гена, дифферен-
цировку тканей и развитие организма. Од­
нако биолог ическа я роль прерывисто й экзон-интронно й структур ы генов и роль интронных последовательносте й на этом не заканчивается. Недавно было обнаружено что вырезаемые интроны могут быть пред­
шественниками особых малых ядерных РНК (см. рис. 2), участвующих в созревании пред­
шественников РНК рибосом. Заканчива я рассмотрени е механизмов созревания РНК, необходимо сказать хотя бы несколько слов о процессах так называ­
емого редактирования РНК. В этих случаях может происходить химическая модификация азотистых оснований в нуклеозидах (напри­
мер, превращение аденозина в инозин), что приводит к изменению информационного зна­
чения кодонов, кодирующих данную амино­
кислоту. Кроме того, внутрь последователь­
ности мРНК могут вставлятьс я отдельные уридиновые (U) нуклеотиды. Формально этот процесс противоположе н сплайсингу, когда удаляются нуклеотидные последовательно­
сти интронов. В результат е подобных хими­
ческих модификаций предшественника РНК будут образовыватьс я белки, в которых по­
ложение отдельных аминокислот будет оп­
ределятьс я нуклеотидным триплетом РНК, отсутствующим в нуклеотидной последователь­
ности ДНК-матрицы (гена). Указанные спо­
собы модификации РНК-предшественник а получили название редактирования, по ана­
логии с работой редактора, который изме­
няя в тексте отдельные слова может нена­
роком исказить смысл сказанного. Роль интронов в регуляции экспрессии генов не ограничиваетс я участием в процес­
сах созревания РНК. Интроны, разделяющие экзоны гена, могут вести себя как регулятор-
ные участки ДНК, способные присоединять белки, активирующие или репрессирующие транскрипцию. Удаленность расположенного в интроне, например, усилителя транскрипции от старта транскрипции не является препят­
ствием для его функционировани я — ДНК может быть достаточно гибкой, чтобы бел­
ковый фактор, связанный с интроном, дотя­
нулся до района старта транскрипции (см. статью В. А. Гвоздева «Транскрипция и ме­
ханизмы регуляции активности генов»). Заключение 1. Процесс «созревания» клеточных РНК сопровождаетс я химическими модификаци­
ями РНК-предшественник а и укорочением его размеров. Созревание представляет собой регулируемый многостадийный путь, по РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ГЕНОВ ПРИ СОЗРЕВАНИИ КЛЕТОЧНЫХ РНК ходу которого осуществляетс я взаимодей­
ствие новообразованног о предшественник а РНК с белками и другими РНК, что обес­
печивает в конце концов образование фун­
кционально активной молекулы РНК. Регу­
ляция процесса созревани я РНК — это способ регуляции активности гена, кодиру­
ющего данную молекулу РНК. 2. При созревании информационной РНК имеет место каталитический процесс уда­
ления из РНК интронов и объединения эк-
зонов, кодирующих отдельные участки бел­
ка. Совокупность этих химических реакций носит название сплайсинга. Сплайсинг про­
ходит в специальной внутриядерной много­
компонентной структуре — сплайсосоме, включающей десятки белков и набор так называемых малых ядерных РНК, обеспе­
чивающих сплайсинг. 3. Молекулярный механизм сплайсинга осуществляется благодаря комплементарным взаимодействиям нуклеотидов РНК-предше­
ственника и малых ядерных РНК. Эти взаи­
модействия играют первостепенную роль в катализе сплайсинга. Образующиеся слож­
ные структуры определяют точность сплай­
синга. Кроме того, велика роль белков, спо­
собных специфично «узнавать» не только участки РНК, но и друг друга. Сплайсинг определяется последовательными упорядо­
ченными взаимодействиями компонентов машины сплайсинга с РНК-предшественни­
ками. Исследование молекулярных механиз­
мов сплайсинга показывает, что катализ, определяющий удаление интронов и объ­
единение экзонов, может иметь место и в отсутствие белков, т. е. определяться взаи­
модействиями участков РНК, приводящих как к разрыву, так и к воссоединению меж-
нуклеотидных связей. Нарушение точности сплайсинга при образовании информацион­
ных РНК, вызванное мутацией, может пре­
пятствовать трансляции и образованию белка. 4. Многокомпонентност ь машины сплай­
синга позволяет регулировать образование мРНК за счет изменения концентраций от­
дельных компонентов или же химической модификации, которая меняет биологичес­
кую активность молекул, определяющих сплайсинг. 5. Изменение характера сплайсинга эк­
зонов в разных тканях одного и того же РНК-предшественник а может приводить к образованию нескольких РНК, содержащих разные наборы экзонов (альтернативный сплайсинг). В результате РНК, транскри­
бируемые с одного гена, будут кодировать белки с разными свойствами. Выбор путей сплайсинга РНК-предшественник а — это способ регуляции активности генов в раз­
ных клетках и тканях организма. Литература 1. Георгиев Г. П. Гены высших организмов и их экспрессия. М.: Наука, 1989. 2. Льюин Б. Гены. Пер. с англ. М.: Мир, 1987. 3. Кнорре Д. Г. Биохимия нуклеиновых кис­
лот //Сорос, образоват. журн., 1996, №3, с. 11. С. Г. Ииге-Вечгоиов КАК ЧИТАЕТСЯ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД: ПРАВИЛА И ИСКЛЮЧЕНИЯ Введение После публикации Дж. Уотсоном и Ф. Кри­
ком в 1953 г. модели дезоксирибонуклеино -
вой кислоты (ДНК) прошло более 40 лет. Это открытие определило развитие биологии второй половины XX в. Постановка вопроса о том, что и как записано в ДНК, привела к расшифровке генетического кода — сво­
да правил перевода последовательност и нук-
леотидов в аминокислотну ю последова ­
тельность белков. Осознание того, что гены — это ДНК, универсальный носитель генети­
ческой информации, определило появление генной инженерии. Сегодня уже студенты университетов расшифровывают чередова­
ние нуклеотидов в ДНК, соединяют гены разных организмов, перенося т их между видами, родами и значительно более уда­
ленными таксонами. На базе генной инже ­
нерии возникла биотехнология, которую известный фантас т С. Лем определил как использование закономерносте й биогенеза в производстве. Сегодня мы очень многое знаем о том, как читается генетический код в ходе био­
синтеза белка, поняли, что в этом процес­
се участвует множество умных «молекуляр­
ных машин» и что у всех живых организмов этот процесс представляе т собой некоторые «вариации на заданную тему». Увлечение принципом биологической универсальност и породило в 70-х гг. своего рода эйфорию — казалось, все стало «понятно». Вскоре вы­
яснилось, что рано радоваться, и внима ­
ние исследователе й стали больше привле ­
кать «вариации», нежели «заданная тема», поскольку эти вариации, по-видимому, со­
ставляют существенные характеристик и биологическог о разнообразия. Стало ясно, что структура кода и способ его чтения оп­
ределяют не только последовательност ь аминокислотных остатков в синтезируемых полипептидах, но и точность его считыва ­
ния, а также характе р проявления возни­
кающих мутаций. Здесь мы рассмотрим об­
щую структуру и способ чтения генетического кода, а также изменчивост ь этого процес­
са и ее возможные причины. Один ген — один фермент Известно, что кроме атомов и молекул в клетке ничего нет. И подчиняетс я она тем же физически м закономерностям, что и неживые объекты, в чем смогли убедитьс я физики, устремившиес я в биологию в 40-х гг. именно в поисках каких-то принципиаль­
но новых, не известных физике, законов природы. Все реакции клеточного метабо­
лизма осуществляютс я под контролем био­
катализ аторо в — ферментов, структура которых записана в ДНК генов. Передаетс я эта запись в цепи переноса информации: ДНК - • РНК -» белок. Сначала информация, записанная в виде чередовани я дезоксирибонуклеотидо в на одной из двух комплементарных цепей ДНК гена, переписываетс я на одноцепочечную молекулу информационно й рибонуклеино­
вой кислоты — иРНК (она же матричная, мРНК). Это процесс транскрипции (см. ста­
тью В. А. Гвоздева «Транскрипция и меха­
низмы регуляции активност и генов»). На следующе м этапе по матрице мРНК строится последовательност ь аминокислот­
ных остатков полипептида. Тем самым со­
здаетс я первична я структура будущей мо­
лекулы белка. Это — процесс трансляции. Первична я структур а определяе т способ складывания молекулы белка и тем самым ее ферментативну ю или какую-либо иную, наприме р структурну ю или регуляторную, функцию. Эти представлени я зародились в нача­
ле 40- х гг., когда Дж. Бидл и Э. Тейтум выдвинули свой знаменитый принцип: «Один ген — один фермент». Научное сообщество разделилос ь на сторонников и противников гипотез ы о равенстве числа генов и числа ферментов в клетке. Тепер ь мы знаем, что один фермент может быть закодирова н в нескольких ге­
нах, если он состоит из разных субъеди­
ниц, т. е. из разных полипептидных цепей1. Знаем, что есть гены, которые вообще не кодируют полипептидов. Это — гены, коди­
рующи е транспортные РНК (тРНК) или рибосомные РНК (рРНК), участвующие в синтез е белка. 1 В более общей форме принцип «Один ген — один фермент» формулируется как «один ген — один белок». Сейчас известно, что один ген мо­
жет кодировать несколько родственных белков из-за существования процесса альтернативно­
го сплайсинга (см. статью Б. А. Гвоздева «Ре­
гуляция активности генов при созревании кле­
точных РНК»). В соответствии с этим ген определяют как последовательност ь ДНК, ко­
торая переписываетс я в РНК как отдельная единица и кодирует набор близкородственных белков. — Прим. ред. КАК ЧИТАЕТСЯ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД- ПРАВИЛА И ИСКЛЮЧЕНИЯ 77 Таблица 1 Аминокислоты, в ходя щи е в белки, их условные обозначени я ( трехбуквенные и однобуквенны е символы) и соответствующи е им кодоны «универсального » кода Алании Цистеин Аспарагиновая кислота Глугаминовая кислота Фенилаланин Глицин Гистидин Изолейцин Лизин Лейцин Метионин Аспарагин Пролин Глугамин Аргинин Серии Треонин Валин Триптофан Тирозин Ala Cys Asp Glu Phe Gly His He Lys Leu Met Asn Pro Gin Arg Ser Thr Val Trp Тут A С D E F G H I К L M N P Q R S T V w Y GCA UGC GAC GAA UUC GGA CAC AUA AAA UUA AUG AAC CCA CAA AGA AGC АСА GUA UGG UAC GCC UGU GAU GAG uuu GGC CAU AUC AAG UUG AAU ccc CAG AGG AGU АСС GUC UAU GCG • -
GGG AUU CUA CCG CGA UCA ACG GUG GCU GGU cue ecu CGC VCC ACU GUU CUG CGG UCG CUU CGU UCU В своей первоначальной форме принцип «Один ген— один фермент» представляе т скорее исторический интерес, однако за­
служивает памятника, поскольку он стиму­
лировал создание целой научной области — сравнительной молекулярной биологии гена, в которой гены — единицы наследственной информации — фигурируют как самостоя­
тельные предмет ы исследования. Кроме того, разработка многочисленных систем «ген— фермент» помогла сформулироват ь вопрос; «Что и как записано в генетичес­
ком коде?» Чт о и как з а пис а н о в г е не т иче с ко м ко д е На этот вопрос в общей форме ответил Ф- Крик со своими коллегами в 1961 г. Ока­
залось, что код триплетен, т. е. кажда я кодирующая единица — кодон состоит из трех нуклеотидов. В каждом гене трипле­
ты считываютс я с фиксированной точки, в одном направлении и «без з апятых», т. е. кодоны ничем не отделены друг от друга. Последовательност ь кодонов определяе т последовательност ь аминокислотных остат­
ков в полипептидах. Как известно, оснований, которые вхо­
дят в состав нуклеиновых кислот, всего четыре- Это — аденин (А), гуанин (G), ци-
тозин (С) и либо урацил (U) в РНК, либо тимин (Т) в ДНК2. Белки же состоят из 20 аминокислот (табл. 1). Следовательно, задача кодирования сводится к тому, что­
бы четырьмя основаниями записат ь двад-
2 Здесь для простоты не принимается в рас­
смотрение тот факт, что перечисленные осно­
вания в полинуклеотидной цепи могут подвер­
гаться химической модификации, вследствие чего в нуклеиновых кислотах (в первую очередь в тРНК) присутствуют дополнительные необыч­
ные основания. — Прим, ред. ^ ^ \с -
G \£__ 1 -1 U с ""ТгТгГ нп нп цать аминокислот. Отсюда следует, что код должен быть не менее чем триплет -
ным, поскольку количества оснований или же пар оснований (дуплетов ) (42=16) не ­
достаточно для кодировани я два дца т и аминокислот, тогда как число триплето в (43=64) превышае т 20. Сколько же трип-
летных кодонов из 64 имеют смысл, а какие бессмысленны? Соответствуе т ли каждой аминокислот е один или несколь ­
ко кодонов? Ответы на эти вопросы были получе ­
ны к 1965 г., когда генетический код был полностью расшифрован. Удобне е всего представит ь код в круговой форме (рис. 1). Буквы в центре круга — первые буквы ко­
донов РНК, вокруг расположен ы буквы, соответствующи е второму положени ю в кодоне и, наконец, третий круг — треть е положение в кодоне. Четверто е кольцо образуют кодируемые соответствующими триплетами аминокислотные остатки, для записи которых использованы общеприня ­
тые трехбуквенные сокращения (табл. 1). Во внешнем круге отмечены физико- хи ­
мические свойства аминокислот, а имен­
но: являютс я ли они полярными или не­
полярными. Мы сраз у видим, что каждой аминокислот е соответствуе т от одног о (Met, Trp) до шести (Leu, Arg, Ser ) ко­
донов, т. е. код обладае т свойством избы­
точности, или вырожденности. Кодон AUG (Met ) (здесь и далее в скоб­
ках указано, какую аминокислот у кодон кодирует ) одновременно служит иници­
атором— сигналом начала синтез а по-
Рмс. 1. Генетический код, записанный в круговой форме Внутренний круг— первая буква ко-
дона; второй круг — вторая буква ко-
дона; третий круг— третья буква ко-
дона; четвертый круг— кодируемые триплетом аминокислоты, инициация или терминация белковой цепи; на­
ружный круг— наличие или отсут­
ствие поляризации у аминокислот. Обозначения аминокислот даны в трехбуквенном сокращении (см. табл. 1); Start и Stop — инициирующие и терминирующие (нонсенс) кодоны, П и НП— полярные и неполярные аминокислоты. Остальные поясне­
ния см. в тексте липептида 3. Действительно, в дальнейшем, когда начали расшифровыват ь нуклеотид-
ные последовательност и генов, убедились, что первый же кодон AUG с 5'-конца мРНК эукариот задае т фаз у последующег о счи­
тывания триплетов, т. е. служит той самой фиксированно й точкой, с которой начина­
ется считывание матрицы в направлении к ее З'-концу. Любой последующий AUG просто кодируе т Met. Кодонов, не кодирующих аминокислот, оказ алос ь всего три: UAA, UAG, UGA. Поначалу их назвали бессмысленными ко-
донами, или нонсенсами (это название со­
хранилось в научном обиходе до сих пор), однако вскоре выяснилось, что они вовсе не бессмысленные, а представляют собой сигналы терминации синтеза белка4. В конце любого гена обязательно стоит UAA, UAG или UGA, а то и два нонсенса подряд. Знакомств о с таблице й генетическог о кода позволяе т заметить, что для кодиро­
вания многих аминокислот существенны два первых основания, а треть е может быть любым. Для кодирования всех без исклю­
чения аминокислот не имеет значения, какое 3 Кодон AUG является единственным ини­
циирующим кодоном у эукариот и наиболее ча­
сто используемым инициатором у прокариот. У последних в отдельных, достаточно редких слу­
чаях трансляция может начинаться с кодонов GUG (Val), UUG (Leu) и некоторых других. — Прим. ред. 4 Эти кодоны часто называют «стоп-кодона-
ми» — Прим. ред. КАК ЧНТАСТСВ Г£ЩТНч1^киИ код. ПРАВИЛА и ИСКЛЮЧЕНИЯ пи ркн иди новое основание (U или С) зани­
мает третье положение в кодонах, и для большинства не существенно, какое пури-
новое основание {Д или G) занимает это положение Следовательно, мутации, состо­
ящие в аачене основании в третьем поло­
жении кодонов, в большинстве случаев просто не будут проявляться. Кроме того, ограниченные возможност и проявления имеют и мутации, приводящие к замене полярного аминокислотного остатка на дру­
гой полярный или неполярного на нелпляр-
ный, поскольку они часто близки по сво­
им физико-химически м свойствам. Если такие нутации и проявляются, то прояв­
ляются нечетко, т.е. мутантный белок ут­
рачивает свою активность лишь частично. Так могли возникать в эволюции так назы­
ваемые полипептиды-синонимы, которые имеют одинаковую укладку и ферментатив­
ную активность, но разную первичную структуру. Получается, что генетический код обладает высоким уровнем «помехоустойчи­
вости- в отношении мутаций, изменяющих смысл кодонов, или миссенс-мутаций. Чаще всего проявляютс я те миссенс-мутации, которые приводят к заменам полярных ос­
татков на неполярные и наоборот. Принципиально иные возможности для проявления имеют мутации, превращающие значащие ко доны в терминирующие (нон-
еенеы), или нонсенс-мутации. Действитель­
но, если миссенс-мутации могут изменить, а могут и не изменить структуру и актив­
ность полипептида, кодируемого данным геном, то нонсенс-мутации, блокирующие дальнейшую трансляцию данной мРНК, будут приводить к появлению лишь коротких на­
чальных (N-концевых) фрагментов белка, как правило, не обладающих ферментативной активностью. Столь же высоки шансы на проявление у мутаций, которые возникают в результате вставки лишней комплементар­
ной пары нуклеотидов в ДНК гена или вы­
падения такой пары и приводят к сдвигу фазы считывания. В этом случае фиксированная точка инициации синтеза белка остается неизменной, но начиная с того места, где в мРНК произошла(о) вставка (выпадение) нуклеотида, смысл всех последующих кодонов вследствие сдвига рамки считывания будет изменен. Более того, рано или поздно сре­
ди этих новых кодонов встретится один из трех ноксенсов со всеми вытекающими от­
сюда последствиями. Таким образом, вследствие специфичес­
кой организации генетического кода кодо­
на м-нонсенсам принадлежит особая роль — терминаторов трансляции. Поэтому, возникая мутационным путем, они, как и мутации типа «сдвиг рамки считывания», проявля­
ются значительно чаще и четче, чем мис­
сенс-мутации, изменяющие смысл кодонов. п Нонсенсы и сдвиги рамки считывании часто встречаются в так называемых псев­
догенах, которые были открыты в начале 80-х гг в результате изучения нуклеотид-
нык последовательносте й в геномах выс­
ших эу кари от. Псевдогены очень похожи на обычные гены, но их проявление надеж­
но блокировано четко проявляющимися му­
тациями: сдвигами рамки считывания и нон-
сенсами. Псевдогены представляют собой резерв эволюционного процесса. Их фраг­
менты используются при возникновении новых генов. Как читается генетический код Синтез белка, или трансляция — это центральное событие в жизни клетки (рис. 2). Само представление о дискретных единицах генетической информации существует благо­
даря трансляции нуклеотидных последователь­
ностей мРНК, ограниченных кодоном-иници­
атором и кодоном-термикатором. Считывание таких последовательностей приводит к появ­
лению в клетке дискретных молекул белка. Кодоны мРНК узнают соответствующие им аминокислоты не путем прямого физического взаимодействия, а с использованием моле-
кул-адапторов, узнающих и аминокислоту, и триплет нуклеотидных оснований. Роль адап­
теров выполняют молекулы транспортных РНК (тРНК), специфичных для каждой из ами­
нокислот (подробнее о тРНК и их адаптор-
ных функциях см. в статьях О. О. Фаворовой «Строение транспортных РНК> и «Транспор­
тные РНК на первом (предрибосомном) эта­
пе биосинтеза белков»). Процесс трансляции происходит в клетке весьма сложно. В трансляции каждого гена участвуют несколько сот разных молекул белков и нуклеиновых кислот (подробнее о трансляции см. в статье А.А. Богданова «Биосинтез белка на рибосоме — заключи­
тельный этап трансляции»). Транспортные РНК. Каждая тРНК дли­
ной примерно 70 нуклеотидов имеет акцеп­
торный конец, к которому присоединяется аминокислотный остаток, и адапторный уча­
сток, несущий антикодон — триплет нук­
леотидов, комплементарных колону мРНК (рис. 2). Первый и второй нуклеотиды кодо-
на иРНК взаимодействуют с нуклеотидами антикодона тРНК строго по правилам ком­
племента рности (A-U, G-C), Спаривание же третьего нуклеотида кодона с первым нук-
леотидом антикодона может происходить с некоторой нестрогостью, или неоднозначно­
стью. Правила кодон-антикодоновог о спари­
вания были сформулированы Ф. Криком в гипотезе нестрогого соответствия» (табл. 2). В соответствии с гипотезой четыре кодона для одной аминокислоты, различающиес я только по третьему нуклеотиду (их налы-
МОлеКУЛЯРЧАЯ БИОЛОГИЯ вают семейством кодонов). могут .обслужи­
ваться» двумя тРНК с разными антккодона-
ми Последующие исследования показали, что в ряде случаев семейство кодонов мо­
жет узнаваться одной тРНК С учетом пра­
вил ^нестрогого соответствия» для считывания всей кодовой таблицы достаточно всего 31 тРНК В действительности ситуация оказа­
лась несколько более сложной, и уже у бак­
терий есть 45 рваных тРНК. Аминоацил-тРНК синтетаэ ы — фер­
менты, которые активируют аминокисло­
ты и нагружают ими тРНК, т. е. аминоаци-
лируют тРНК. Каждая синтетаза (их должно быть не меньше 20) узнает только "Свою» аминокислоту и «навешивает» ее на «свою (свои)» тРНК (подробнее об аминоацил-
тРНК-синтетаза х см. в статье О. И. Лаврик •Специфический отбор аминокислот при био­
синтезе белков» и в статье О. О. Фаворовой «Транспортные РНК на первом (предрибо-
Сомном) этапе биосинтеза белков»). Рибосома играет роль организующего цен­
тра в чтении генетической информации- Это — молекулярная машина, построенная по единой схеме, с некоторыми вариациями у различ­
ных организмов. Она состоит из двух рибо-
нуклеопротеидных субчастиц; малой и боль­
шой, В состав малой субчастицы, например у бактерий, входит молекула рибосомной РНК (рРНК) длиной -1500 нуклеотидов плюс еще одна небольшая молекула рРНК (110—120 нуклеотидов) и 21 разный белок. В состав большой субчастицы входит одна молекула рРНК длиной -2700 нуклеотидов плюс 32 разных белка. На рибосоме происходит вза­
имодействие иРНК с тРНК и синтезируется белок. При этом образование пептидных связей между аминокислотными остатками катали­
зирует сама рибосома. Инициация (F-1 Факторы^ tF-2 IF-3 Элонгации EF-Tu EF-Ts EF-G Терм и нация RF-1 Я М RF-3 Рибосома мРНК AUG AUG L A A c o < NUJt AX лЕНк i/c U4J G ^ fMet Lys Arg тРНК fMet M • // \ Факторы Бело» ) ^аь Рмс. 2. Общая схема процесса трансляции у бактерий Представлены участники процесса на стадиях инициации, элонгации и терминации полипептидной цепи (сла­
ва направо). Рибосома изображена в виде двух субчастиц. тРНК — в виде клеверного листа, аминокислоты — в виде кружков. Обозначения аминокислот даны в трехбуквенном сокращении (см. табл. 1). В инициации Ум­
ствует специальная тРНК. которая -нагружается- мети он ином, далее подвергающимся формилированию (fMet — остаток формилметионина). На стадии элонгации пунктирной стрелкой показано направление движения рибо­
сомы по мРНК, сопровождающееся последовательным считыванием кодонов и ростом пелипептидиой цепи-
Остальные пояснения см. в тексте кл* чмтлс rcsrtHlТИЧЕСКИИ код ПРАВИМ и исключения «1 Таблица 2 Правила нестрогог о соответстви я при спаривани и первог о (5') нуклеотил а антикодон а и третьег о (3'f нуклеотид а ко дон а HVpHhtH НуКЛСО!НЛ и с л о г ч> Третий нук.нготн,-] ксиына А <; с V < • и с А и G А Примечание. J {инозин), Ч? (псевдоуридин) — необычные основания, образующиеся при созре­
вании тРНК из аденияз и урацнла соответственно и встречают неся в антикодонах. Факторы -трансляции. Это понятие объединяет семейство белков, которые не входят в состав рибосомы постоянно, но вза­
имодействуют с ней на разных этапах транс­
ляции. Рассмотрим их на примере бактерий: — Диктор ы инициации (их три: IF-1. IF-2, IF-3), они обеспечивают начало все­
го процесса трансляции: способствуют объ­
единению рибосомы и мРНК, отвечают за взаимодействие ко до на AUG на рибосоме со специальной инициирующе й тРНК; — факторы элонгации (их тоже три: EF-Tu, EF-Ts, EF-G) обеспечивают связыва­
ние на рибосоме антикодонов аминоацили рованных тРНК с соответствующими коло­
нами мРНК и продвижение рибосомы вдоль матрицы — мРНК; — факторы терминации; считается, что не существует тРНК, специфичных для трех кодо нов-терминаторов UAA, UAG и UGA; их опознают и с ними взаимодействуют спе­
циальные белки (их опять же три: RF- 1, RF-2, RF-3); при этом RF-1 узнает UAA и UAG, a RF-2 — UAA и UGA; RF- 3 не имеет кодоновой Специфичности и взаимодействует с RF-1 и RF-2, делая процесс терминации более эффективным и зависимым от энер­
гии расщепления ГТФ. Аппарат трансляции у эукариот несколь­
ко сложнее: больше и белков в рибосоме, и факторов трансляции. Так. например, од­
них факторов инициации обнаружено бо­
лее десяти. Тем не менее общая схема стро­
ения эукариотическог о аппарата трансля­
ции принципиально та же. что и у бактерий. Синтез белка является самый сложным процессом в клетке, в котором участвуют продукты всех типов генов клетки: и тех. что кодируют белки-ферменты, и тех, что кодируют различные РНК— тРНК. рРНК Трансляционна я машина раньше или поз­
же синтезируе т все белковые продукты генов клетки. Ис к л юч е н и я из прави л Как видим, роли участников процесса трансляции расписаны четко (рис. 2), а пра­
вила их поведения диктует таблица гене­
тического кода (рис.1) и специфичност ь кодон- антикодоноеы х взаимодействи й (табл. 2) Одним из важнейших свойств ге­
нетического кода поначалу считалась его универсальность. Довольно скоро выясни­
лось, однако, что разные организмы -пред­
почитают» разные кодоны для одной и той же аминокислоты, если ее кодирует не­
сколько кодонов. По мере расширения круга изученных объектов обнаруживалис ь и ва­
риации в значении кодонов— стали извес­
тны исключения, свидетельствующи е о «квазиуниверсальности » кода (табл. 3). Наи­
большее число кодонов с необычными свой­
ствами обнаружено в геноме митохондрий. Еще один тип событий, приводящих к необычному прочтению кодонов, был выяв­
лен при изучении внутривидовой изменчи­
вости в считывании некоторых кодонов, прежде всего нонсенеов. Оказалось, что нонсенс- житант, т.е. мутант, у которого в результат е прямой мутации в каком-ли­
бо гене возник в «неположенном месте» нон-
сенс-кодон, обрывающий синтез нормаль­
ного белка, может вернутьс я к норме не за счет обратной мутации, а за счет суп-
рессорных мутаций. Супрессорными мута­
циями, или супрессорами, называют мута­
ции, которые подавляют фенотипичееко е проявление прямой мутации. При этом важ­
но, что исходная, прямая мутация сохра­
няется неизменной. Из всего разнообразия супрессоров, различающихс я по механиз ­
му действия, особый интерес представля ­
ют трансляционные, или информационные супрессоры, у которых происходят мутаци­
онные изменения в генах, кодирующи х различные компоненты аппарата трансля ­
ции. Су прессе рные мутации могут подавлять фенотипичеекое проявление не только нон­
сенс-, но и миссенс-мутаций. Как уже от­
мечалось, мутантные нон се не-кодоны чет­
ко проявляются; поэтому и восстановление нормы при нон сенс-супрессии исследовать значительно легче, чем при миссенс-суп-
•г МОЛЕКУЛЯРНАЯ МОЯОГИЯ рессии. Тем не менее о миссене-сулресси и тоже кое-что известно, а результат ы ис­
следования нонсенс-супресси и как модель­
ной системы представляют большую ценность для понимания генетическог о контроля ап­
парата трансляции. Как и е же известн ы трансляционны е гены-су прессоры? Гены, кодирующие тРНК. Уже в пери­
од расшифровки генетического кода С. Бен-
зер и С. Чеймп обнаружили, что мутации некоторых генов бактерии —кишечной па­
лочки Escherichi a colt могут приводить к «осмысливанию» нонсенсов. Например, одна такая супрессорная мутация подавляет про­
явление нонсенс-ко дона UAA. При этом, как выяснилос ь довольно скоро, в клетке в результате мутации одного из кодирующих ТРНК генов появляется тРНК с ант и ко до­
ном AUU, комплементарным нонсенсу UAA. Напомним, что в норме в клетке не дол­
жно быть таких тРНК, а появляются они аа счет изменения антикодона какой-либо тРНК. который отличается от антикодона AUU всего одним нуклеотидом, например: CUU(G)n) =» AUU, GUU(Gl u) =s AUU, AUA(Tyr) =* AUU и т.д. Все эти варианты легко «вычислить», пользуяс ь таблице й генетического кода. Таким же образом воз­
никают нонсенс- су «рессорные мутации для кодонов UAG и UGA. Мутантная тРНК, с новым для нее ан-
тикодоном, по-прежнему узнается и ами-
ноацилируется своей аминоацил-тРНК-син -
тетазой, но перестает узнавать свой кодон и узнает нонсенс, т.е. становится супрес-
сорной. Так, например, супрессорная глу-
таминил-тРНК с антикодоном AUU взаимо­
действует с нонсенс-кодоном UAA и вместо обрыва полипептидной цепи включает в белок остаток глутамина. К счастью, каждую тРНК обычно кодируют несколько генов, поэто­
му если один из них станет супреесорным, остальные продолжают выполнять прежние функции, и клетка не погибает. При такой нонсенс-супрессии, конечно, несколько на­
рушается нормальная терм и нация синтеза полипептидов, но и в этом случае суще­
ствует страховка от слишком большого вреда. Нуклеотидное окружение каждого нормаль­
ного нонсенса, т. е. терминатора трансля­
ции в конце гена, подобрано так, что оно предпочтительно взаимодействуе т с бел­
ком-фактором терм и нации, а не с мутан-
тной нонсене-супрессорно й тРНК, Гены, кодирующие белки рибосом. Как выяснил в середине 70-х гг. Л. Горини, в рибосоме существует специальный центр Ram, отвечающий за так называемую ри-
босомную неоднозначность (от англ. rtbosomal ambiguity). Если мутации затрагивают гены, кодирующие белки рибосомы, которые вхо­
дят в цент р неоднозначности, рибосома начинает ошибаться и читает нонсенсы как значащие кодоны, что и выражаетс я в нон­
сенс-супрессии. Гены, кодирующие рибосолиые РНК, В дальнейшем выяснилось, что и рРНК тоже вносит свой вклад в рибосом ну го неодно­
значность, Некоторые мутации в генах, ко­
дирующих эти гигантские молекулы РНК приводят к осмысливанию нонсенсов. Гены, кодирующие фактор элонгации EF-Tu у бактерий или его гомолог EF-l a у эукариот, наприме р у дрожжей, также могут играт ь роль нонсенс-супрессоров. Мутации в этих генах (как в бактериаль­
ном, так и в дрожжевом геномах имеется по два одинаковых гена для этого факто­
ра) приводят к супрессии. Гены, кодирующие факторы т е рл и на­
ции трансляции. Мутации в трех генах кодирующих известные белковые факто­
ры терминации, также могут приводить к нонсенс-супрессии. Это справедливо и для бактерий и для дрожжей. Еще более эк­
зотический пример нонсенс-супрессии мы обнаружили, когда усилили у дрожжей-
сахаромицето в экспрессию гена SUP35, кодирующег о фактор терминации eRF- 3 (аналог бактериальног о RF-3): усиленная эк­
спрессия этого нормального гена приводи­
ла к супрессии всех трех нонсенсов. (О гене SUP35 можно подробнее прочитать в Со­
росов с ком образовательно м журнале —см. Литературу.) О миссен С-Супрессии известно значитель­
но меньше. Твердо установлен факт мис-
сенс-супрессии вследствие мутационного изменения антикодона тРНК. когда мутан­
тная тРНК начинает узнавать чужой кодон. Другие механизмы практически не иссле­
дованы. Возвращаяс ь к нонсенс-супрессии, от­
метим, что механиз м супрессии, когда в клетке появляютс я тРНК с новыми анти-
кодонами, комплементарными нонсенсам, представляетс я вполне логичным. Все ос­
тальные механизмы понять не так просто, исходя из правил считывания кода. Дей­
ствительно, откуда же берутся тРНК с нуж­
ными антикодонами, если мутации затра­
гивают совсем другие компоненты аппарата трансляции: белки рибосом, рибосомные РНК, факторы элонгации и терминации. Этот вопрос в особенности справедлив для тех случаев, когда супрессорные мутации частично и на кт ив иру ют факторы термина­
ции. Казалось бы, это должно приводить к менее эффективному завершению син­
теза пол и пептида, но факт прочтения нон­
сенса как смыслового кодона отсюда вов­
се не следует. Кажущееся противоречие разрешилось, когда в геномах многих организмов, от бак-
ЧИТАЕТСЯ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД: ПРАВИМ И ИСКЛЮЧЕНИЙ М те рий ДО человека, начали обнаруживат ь гены и соответственно кодируемые ими тРНК. которые обусловливают нестандар­
тное чтение кодовой таблицы У бактерий, например, нашли тРНК, читающую кодон UUU(Pbe) как кодон для лейцина, у дрож­
жей нашли тРНК, читающие нонсенсы UAA и UAG как кодоны для глутаминовой кис­
лоты, причем антикодоны их вовсе не были комплементарны считываемым кодонам. Важно подчеркнуть, что это были совер­
шенно нормальные, немутантные клетки и организмы. Оказывается, природа предусмотрела возможность неоднозначной трансляции, которую в нормальной ситуации мы просто не замечаем благодаря способности рибо­
сомы удалять аминоацил-тРНК, прочитав­
шую не свой кодон (рибосомной коррекции) Если связать воедино все, что мы узнали о мутационной изменчивости трансляции, то. пожалуй, можно предположить, что именно таким путем возникли вариации в считывании кода, которые представлены в табл. 3. Более того, некоторые отличия в чте­
нии кода оказались узаконенными в норме. Так, нонсенс UGA у самых разных объек­
тов кодирует необычную аминокислоту — селеноцистеин, но только в том случае, если этот кодон оказывается в определенной точке гена. Известно, что частицы РНК-содержа -
щего бактериофага не проявляют инфек­
ционное™ по отношению к клеткам E.coli, если с частотой 3% не происходит прочте­
ния нонсенса в конце гена, кодирующего белок его оболочки. При трансляции гена, кодирующег о обратную транскриптазу, необходимую для репликации ДНК по мат­
рице РНК у вируса СПИДа и у ряда онко-
генных вирусов, происходит закономерный сдвиг рамки считывания: рибосома перепры­
гивает через один нуклеотид. В противном случае этот фермент не образуется, и реп-
Таблица 3 Отклонения от «универсального » генетическог о кода Геном Прокариоты Митохондрии эукнрнот Ядро зукариот Организм Миколлазма Позвоночные, дрозофила, дрожжи, плесневые грибы, трипаносомы Сахаромицеты Позвоночные, дрозофила, сахаромицеты Морская звезда Позвоночные Морская звезда, дрозофила Аскарида, нематода Нематода Млекопитающие Ресничные инфузории (Ciliata) Гриб Candida ciiindrica Кодон UGA UGA сии cue CUA CUG CGC AUA AAA AGA AGG AGA AGA* UUG AUU AUA AUU AUC AUA UAA CUG сеУ и нверсалькое» значение STOP STOP Leu Arg He Lys Arg Arg Leu lie He lie STOP Leu Необычное значение Trp Tip Thr Trp Met Asn STOP Ser START START START START GLn Ser Примечание: А* — модифицированный ад*нин •4 МОЛЕКУЛЯРНАЯ Биология лпкацмя вирусног о генома невозможна. Илвеотны и более далекие прыжки рибо­
сомы — в несколько десятков (а по пред­
варительным данным и в несколько сотен) нук.чеотидов Значение фенотипической супрессии Приведенные примеры показывают, что даже сами правила считывания генетичес ­
кого кода могут быть нарушены, если это нужно для оптимальной экспрессии генов. Наши знания о синтез е белка все еще не достаточны для окончательных суждений о том, как и для чего возникали и з акреп ­
лялись в эволюции вариации в считываний кода. В то же время известно, что многие неблагоприятны е воз де йс т ви я внешне й среды, наприме р слишком высока н кон­
центрация ионов двухвалентных металлов, понижени е т е мпе ра т уры, голодани е по аминокислота м и др., приводя т к повыше ­
нию неоднозначност и трансляции и тем са­
мым к супрессии нонсенсов. Подчеркне м при этом, что в данном случа е супрес -
сорные мутации не происходят, и при воз ­
вращении условий среды к норме супрес ­
сия ис че з а е т. Поэ тому т а к о е я в л е ни е получило название фе нот ипиче с ко й суп­
рессии в отличие от случае в г е нот ипи -
ческой супрессии, которые мы рассмат ­
ривали до сих пор. Явлени е фе нот ипиче с ко й с упре с с и и доказывает, что точность считывания кода подвержен а модификационно й из ме нчи ­
вости. Механиз мы этог о очень важног о явле ния, л е жа ще г о в основ е а д а п т и в ­
ных реакций организма, также следуе т ис­
кать и расшифровыват ь на молекулярно м уровне. Заключени е Итак, все существующи е организмы об­
ладают принципиальн о одинаковой систе­
мой записи наследственно й информации, в которой главную роль играет генетический код. Однако не следуе т забывать, что вез­
десущий мутационный процесс и не менее вездесуща я модификационна я изменчивость затрагивают любые гены и любые генные продукты, в том числе гены (и генные про­
дукты), контролирующи е считывани е ге­
нетического кода. Этот процесс, точность ко­
торого, каз алос ь бы, я вля е т с я условие м самого существовани я живых систем, тем не менее происходит кебеэошибочно. Мы хотели показать, что и сама неоднознач ­
ность генетическог о кодирования подчиня­
ется определенным правилам, и клетка не только умеет противостоят ь ошибкам Коди­
рования, но и може т из в ле ка т ь из них польз у в своем существовани и и эволюции. Литература 1. Адбертс Б., Брей Д., Лмоцс Дж. и др. Молеку­
лярная биология клетки. Пер. с англ. М: Мир, 199i, 2. Инге-Вечтолое С, Г. Цитогены и прионы: цктоплазматическа я наследственность без ДНК //Сорос, обраэоват. журн., 1996, Мэ 5, с. 11. 3. Мте-Вечтомое С, Г., Миронова Л. И., Тер-Ава-
меслм М. Д. Неоднозначность трансляции: версия зукариот? //Генетика, 1994, т. 30, №8, с. 1022. 4. Кри« Ф., Борметтип Л., Брекнер С, Уоттпс-
Гобин Р. В кн.: Молекулярная генетика. Пер. с англ. М.: ИЛ. 1963, с. 33—50. 5. Лауреаты нобелевской премии. Бидл Дж, ТейтумЭ. Л. Пер. с англ. М,: Прогресс. 1992, 6. Уопгсон Дж. Двойная спираль. Пер. с англ. М.: ИЛ, 1968. 7. Чернов Ю. О., ДеркочИ. Л., Дагкесаман-
скоя P. u др. //Докл. АН СССР, 19В8, т. 30, с. 1227. 8. Шредимгер Э. Что такое жизнь? С точки зрения физики. Пер. с англ. М.: Атомиздат, 1972. О. И. Лаорчк СПЕЦИФИЧЕСКИЙ ОТБОР АМИНОКИСЛОТ ПРИ БИОСИНТЕЗЕ БЕЛКОВ Введение Биосинтез белков стал центральной про­
блемой молекулярной биологии с середи­
ны ЭО-х гг., го времени формулирования проблемы генетического кода, адаптерной гипотезы белкового синтеза. открытия тРНК и аминоацил-тРНК-синтетаз. Первый этап белкового синтеза в клетке — это отбор специфических аминокислот и их при­
соединение к транспортным РНК (тРНК). Реакция аминоацилирования тРНК катали­
зируется ферментами еле клоп ц tut- то РНК -
сынтетаза/ии. Аминозцилирование тРНК определяет правильность включения нужной аминокислоты в белок на следующем, ри­
босом ном этапе биосинтеза белка. Аминоацил-тРНК является завершенным субстратом для биосинтеза белка на рибо­
сомах; далее в процессе белкового синте­
за идет узнавание только полимерной ча­
сти этой молекулы, а именно тРНК- Это было доказано классическими опытами Ф. Шапвилля (F. Chapeville), проведенными в лаборатории Ф. Липмана (F Lipmann) в 1962 г. тРНК, специфичная к серусодержа-
щей аминокислоте цистеину, была амино-
ацилирована цистеином. Затем остаток ци-
tтеина в составе цкстеинил- тРНК был восстановлен до аланина с помощью ката­
лизатора — никеля Рэнея. Результатом яви­
лось получение «неправильно* аминоацили-
рованной тРНК: тРНК, специфична я к цистеину (тРНК11"^, оказалась связанной с остатком аланина. Эта аланил-тРНК""" на­
правилась в рибосому, связанную с мРНК, распознала кодон цистеина, как это и дол­
жна была сделать цистеиновая тРНК, но включенный в белок оказался не цистеин, а аланин. Эксперименты доказывали, что ошибка на стадии аминоацилирования тРНК не исправляется на других этапах белко­
вого синтеза Следовательно, аминоацил-
тРНК-синтетаз ы должны катализироват ь практически безошибочное аминоацилиро-
вание тРНК. Причиной ошибок при биосинтезе бел­
ков может быть неправильный отбор ами-
ноацил-тРНК-синтетазо й или активируемой аминокислоты, или аминоацилируемой тРНК. В обоих случаях при попадании продукта реакции в рибосому произойдет включение в растущую белковую цепь «неправильной» аминокислоты. Данная статья посвящена механизмам специфическог о отбора амино­
кислот, обеспечивающег о «сверхспецифич ­
ность» аминоацил-тРНК-сийтета з (механизмы специфического отбора тРНК в реакциях, катализируемых аминоацил-тРНК-синтета -
ааии. рассматриваются в статье О. О. Фа-
воровой «Транспортные РНК на первом (предрибосомном) этапе биосинтеза белка»). Реакции аминоацилировани я тРНК А миноа ц и л- тР Н К - си нте тазы образуют самую многочисленную группу ферментов, участвующих в реализации генетической информации. Например, ДНК- и РНК-по-
лимеразы в каждом из биологических ви­
дов представлены всего несколькими раз­
ными белками, в то же время разных аминоацил-тРНК-синтета з в каждой клет­
ке не менее двадцати, по одной для каж­
дой аминокислоты. При единстве функций (активация аминокислот и их перенос на транспортные РНК) сиктетазы весьма раз ­
личаются по молекулярной массе (от 40 до примерно 300 тыс. дальтон) и могут состо­
ять из одной либо из нескольких полипеп­
тидных цепей. С функциональной точки зрения амино-
ацил-тРНК-синтетаз ы обладают исключи­
тельно высокой специфичностью в присое­
динении определенно й аминокислот ы к специфической тРНК. Это обеспечивается специальными механизмами и абсолютно необходимо для воспроизведения генетичес­
ки заданной структуры белка-
Реакция аминоацилирования тРНК про­
текает в два этапа. Первая стадия — акти­
вация аминокислоты— протекает с учас­
тием аденоаин-5"-трифосфат а (АТФ); она происходит в результат е гидролиза макро-
эргичесКой связи в АТФ и отщепления пи-
рофосфата: Е + АА + АТР <-> Е • АА - AMP + РР, где Е — аминоацил-тРНК-синтетаза, АА -— аминокислота, АТР — аденоэин-5'-трифос -
фат, AMP — аденоэин-5'-монофосфат, РР — пирофосфат, Е АА - AMP — комплекс фер­
мента с аминоациладекилатом. Завершается эта стадия формирование м связанного с ферментом аминоациладенилата, в котором аминокислота активирована путем образования смешанного ангидрида с АМФ. На второй стадии реакции активированный аминоацильный остаток аминоациладенила ­
та легко атакует одну из гидроксильных групп рибозного кольца З'-концевог о аденозина тРНК. Это приводит к образованию амино-
ацил-тРНК: Е АА- АМР + т РНК« *-»Е + АМР + АА -тРНК. где АА- тРНК — аминоацил-тРНК Аминоацильныя остаток в аминоацил-
тРНК присоединен к 2'- или З'-гидроксилу концевого адекоэина тРНК активированной сложнолфиркон связью, и энергии этой связи вполне достаточно для формирования пеп­
тидной свяли в процессе биосинтеза белка. Экспериментальные оценки частоты ошибок, происходящих при биосинтезе бел­
ков, приводят к величине 1-10-*. Эта вели­
чина включает в себя ошибки, возникаю­
щие на этапах как трансляции, так и транскрипции, т. е. предшествующей стадии переноса генетической информации, Что означает этот уровень ошибок в смысле синтеза дефектных молекул белка? Это означает, что среднестатистическ и одно ошибочное включение аминокислоты про­
изойдет на каждые 10000 актов включения аминокислотных остатков в белки. Поскольку в среднем белки состоят примерно из 500 остатков, из 10000 аминокислот можно со­
ставить 20 белков, а оки будут содержать единственную ошибочную аминокислоту в каком-либо положении цепи. Если около 10% всех ошибок серьезно сказываются на био­
логической функции белка, то из этого следует, что одна молекула белка из 200 синтезированных окажется бесполезной в клеточном метаболизме. Отбор аминокисло т на с тади и их активаци и Способность ам иноаци л -тР Н К- с и нтета э различать природные аминокислоты изучена очень подробно. Неприятие неспецифичес­
ких аминокислот, способных разместиться в активном центре фермента, в принципе обусловлено тем, что аминоацил-тРНК-син -
тетаза воспринимает небольшие различия, существующие между истинным субстратом и «чужой» аминокислотой. Отбор специфи­
ческой аминокислоты происходит на стадии ее связывания с активным центром и при дальнейшем каталитическом превращении. Были проведены обширные исследования по изучению вклада различных участков Спвцнфи*»ес*иА рщдмал а-эминогрулпа Рис. 1. Структурная формула фенилаланина молекул аминокислот во взаимодействие с зми ноа ци л -тРНК-с интетаэами. Ам инокислоты построены иэ специфическог о радикала, а-аминогруппы и карбоксильной группы; в качестве примера на рис. 1 представлена структурная формула аминокислоты фенил­
аланина. Вклад различных фрагментов мо­
лекулы аминокислоты исследовали с помо­
щью не при родных, синтетических аналогов аминокислот, в которых были изменены спе­
цифический радикал, аминогруппа или кар­
боксильная группа. Например, были удале­
ны либо замещены карбоксильные группу, введены заместители по ct-аминогруппам и специфическим радикалам. Было показано для различных аминоацил-тРНК-синтета з что необходимым элементом узнавания всех аминокислот является «-аминогруппа. Мо­
дификация этой группы приводит к резко­
му падению сродства аминокислоты к фер­
менту: следовательно, неспецифическа я группировка аминокислоты дает существен­
ный вклад в энергию связывания и опреде­
ляет последующее узнавание специфичес­
кого радикала аминокислот. Как принято считать, карбоксильная группа играет мень­
шую роль на стадии первичного связывания аминокислоты, однако безусловно важна на последующих каталитических этапах реак­
ции аминоацилирования. Специфическое распознавание аминокис­
лот аминоацил-тРНК-синтетазами осуществ­
ляется за счет взаимодействий со специ­
фическими радикалами аминокислот. Было установлено, что аминоацил-тРНК-синте -
тазы, специфичные к резко различным по структуре аминокислотам, легко осуществ­
ляют отбор нужной аминокислоты на ста­
дии связывания и последующей активации аминокислоты с образованием аминоацил-
аденилата. Например, цистеинил-тРНК-син-
тетаяа из кишечной палочки (E.cnli) и дрож­
жевая тирозил-тРНК-синтетаз а отбирают специфически й субстра т только за счет предпочтительной активации с такой высокой точностью. В то же время похожие по струк­
туре аминокислот ы могут быть узнаны «не своими» аминоацил-тРНК-синтетазам и и даже может происходит ь их активация с образованием аминоациладенилат а Весьма похожими, например, являются следующие аминокислоты: валин, изолейцин, треонин (рис, 2). Разберем подробнее два примера оши­
бочной активации этих похожих аминокис­
лот, которые привлекали особенное внима­
ние ввиду их з начени я для клетки. Изолейцил-тРНК-синтетаз а способна акти­
вировать валин, а валил-тРНК-синтетаэ а способна активировать изостерическую (рав­
ную по размеру) валину аминокислот у — треонин. Наличие разницы в энергии свя­
зывания не до конца обеспечивае т в этих • •„••(ШЧгаИМИД OrtOP АМИНОКИСЛОТ Г7РЦ SHQCMILJE StJIKOB Wt сн-сн-соон нэс ^сн-сн-ссюн NH, Велин СИ; ?сн-сн-ч;оон но V треонин рне, Й- Структурные формулы валина, иэолейцина и треонина случаях точность работы системы аиино-
ацитирования, тем более что концентрация валина в некоторых организмах в 5 раз и более превышает концентрацию иэолейци-
на. Если учитывать реальные соотношения в энергии связывания и скоростях превра­
щения этих аминокислот, а также концен­
трацию аминокислот в клетке, уровень ошибок должен быть достаточно высок. В частности, в связи с более высокой концентрацией ва­
лика реальная ошибка должна была бы воз­
никать примерно 1 на 20—40 актов вклю­
чения аминокислоты в белок. Но с другой стороны, по экспериментальным оценкам суммарная ошибка для валика, занявшего ошибочно в белке место изолейцина, состав­
ляет только 1 на 3000. Таким образом, ста­
ло очевидным, что некоторые аминоацил-
тРНК-синтетазы обладают дополнительными механизмами коррекции ошибок, которые позэоляют дискриминировать неспецифичес­
кие аминокислоты, структурно схожие с аминокислотой— субстратом. Механизмы коррекции после ошибочной активации аминокислот ы Еще в ранних опытах, проведенных в лаборатории американского ученого П. Берга (P. Berg), было замечено, что ошибочно сформиров энный иэолей цил-тРН К- си нтета -
зой валиладенилат гидролиэуетсл до валина и АМФ при добавлении транспортной РНК, специфичной к изолейцину. Иными слова­
ми, специфическа я тРНК стимулируе т гид­
ролиз «неправильного » промежуточног о продукта, в результат е чего не происхо­
дит ошибочного присоединени я валина к тРНК, специфичной к изо лейцину. Из это­
го следует, что синтетаэ а функционируе т как фермент, непроизводительн о гидроли-
зующий АТФ для разрушени я ошибочного продукта. Впоследствии была обнаружена еще одна гидролитическая функция аминоацил-тРНК-
синтетаз: эти фермент ы гидролизуют ами-
ноацил-тРНК не по пути обратной реакции с участием АМФ, а просто деацилируют свой продукт, т. е- АА - тРНК + Н,0 -* АА + тРНК. Было высказано предположение, что такой гидролиз может вносить свой вклад в корректирование. Однако для системы мэолейцик—.валин образования неправильной аминоадил-тГНК выявлено не было и. сле­
довательно, в атом случае такой меха­
низм не рабитает. В то же время при использовании ме­
тода выстрой кинетики английский ученый А. Фершт (A. Fersht) наблюдал образование неправильного продукта — соединения тре­
онина с тРИК. специфичной к валину. В присутствии валил-тРНК-синтетаэы. Этот продукт был выделен, и было показано, что скорость гидролиза «неправильной» амино-
ацил-тРНК, содержащей остаток треонина вместо остатка валина, выше в 2000 раз по сравнению с «правильной» валил-тРНК-
Было высказано предположение, что у этого фермента существует специальный центр, обеспечивающий гидролиз «непра­
вильной» аминоацил-тРНК. Как попадает аминоацильный остаток в предполагаемый гидролитический центр? Одна из гипотез состояла в том, что важную роль в этом процессе играет перенос аминоацильного остатка с одного гидроксила рибозы кон­
цевого аденозина тРНК на другой (2'<-*3' аминоацильный перенос). Как уже указы­
валось, аминоацилирование тРНК различ­
ных специфичностей осуществляется либо по 2'-, либо по З'-гИдрОксилу концевого аденозина тРНК. Было высказано предпо­
ложение, что гидролитический центр рас­
положен в районе соседнего неакцептиру-
ющего гидроксила. Следует полагать, что неспецифически и аминоацильный остаток обладает меньшим сродством к центру ак­
тивации аминокислоты и легко может под­
вергаться 2"«-»3' аминоацильному переносу. После попадания в «гидролитический центр» синтетазы происходит быстрое отщепление неправильног о аминоацильног о остатка от аминоацил-тРНК с участием молекулы воды. Возможно, что гидролитический центр ва­
лил-тРНК-синтетаз ы образует видиродную связь с гидроксильной группой треонина. Благодаря этому валин связываетс я с гид­
ролитическим центром гораздо слабее по сравнению с треонином, что приводит к менее эффективному гидролиз у правиль ­
ного продукта. Таким образом, природой создан специфический механиз м структур ­
ного распознавани я аминокислот, который реализуетс я в двух случаях: один раз для узнавания нужног о субстрат а на стадии биосинтеза, а другой р а з — для узнавания неправильног о субстрат а на стадии гидро­
лиза. Механиз м функционировани я валил -
тРНК- синтетаз ы был наглядно представле н МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ Феннпаланин Иэопфйцим i Глицин i_ * ТреОмин Валии ATP PP Е - А А - ^ ^ - Е А А 7 А МР -
Центр активации Глицин Треонин BEJUIHH + Валмн-тРНК Гидролитический центр Рис* Э. Механизм «двойного сита», демонстрирую-
щий функционирование валил-гРНК-смнтетаэ ы а — бсльшие по размеру аминокислоты не проходят с*воэь период *ситт>; б меньшие (или иэостери-
ческие) аминокислоты проходит сквозь второе «сито» А. Ферштом как механизм «двойного сита» Грис. 3). Предполагается, что на первом этапе природные аминокислоты, большие, чем специфический субстрат, «отсеиваются» с достаточной эффективностью за счет про­
стого етерического исключения, тогда как меньшие или изостерические аминокисло­
ты попадают в аминоацилирующий центр фермента и активируются. Отбраковка та­
ких аминокислот осуществляетс я за счет их отщепления от тРНК в гидролитическо м центре, поскольку этот процесс идет более эффективно для неспецифическог о амино-
ацильного остатка. Наряду с Этим для аминоацил-тРНК-
синтетаз был предложен другой специфи­
ческий химический механизм, который не предусматривае т наличия у этих фермен­
тов специальног о гидролитическог о цент­
ра. Гипотетический механиз м коррекции весьма прост. В его основе лежит предпо­
ложение о том, что нежелательные про­
межуточные соединения диффундируют в раствор, где подвергаютс я гидролизу, по­
скольку они нестабильны. Как уже указывалось, для аминоацил-
тРНК-синтета з промежуточным продуктом являются аминоациладенилат ы (ангидриды аминокисло т и аденоз инмонофосфорно й кислоты), которые очень нестабильн ы в водных раствора х и не будучи в форме комплекс а с аминоацил- тРНК- синтетазо й гидролизуютс я с высокими скоростями. Принцип действи я таког о механизма, получившег о название «кинетическое кор­
ректирование», можно проиллюстрироват ь схемой, представленно й на рис. 4. Образо­
вавшийся на первой стадии катализируемо й Е + ДА • I I -
- ДА - тРНК Н;0 Е +АА - A MP - —- А А + AMP рис. 4. Механизм исправления ошибок при амино-
ацилнровании тРМК. ископанный на нестабипы+ости промежуточног о продукта реакции Е - эминоацил-кРНК-синтетаэа; АА— аминокисло­
та, АТР — аденозин-Э'-трмфосФат; дд- AMf — амищ,-
ациладенилат (нестабильный промежуточный про _ пукт}; fclr fr., и *;. * s— константы диссоциации и ас­
социации аминокислоты ** аминоаци ладен плата; к — константа скорости образований аминоацил-тРНК аминоацил-тРНК-синтетазо й реакции ами-
ноациладенилат может либо реагировать с тРНК с образованием продуктов, либо диф­
фундирует из комплекса с ферментом в ра­
створ и гидролизуется. Если имеет место кинетическое корректирование, ошибочное промежуточное соединение {например, ва­
лила де ни лат, синтезированный изолёйшш-
тРНК-синтетазой) диффундируе т в раствор и гидролизуется быстрее, чем успевает про­
реагировать с образованием продуктов, т. е. к3 « fcr Для правильного промежуточного соединения к} > к^, и происходит образова­
ние продуктов. Следовательно, более эффек­
тивное связывание специфического субстрата используется дважды: первый раз при свя­
зывании субстрата с ферментом и второй — при связывании специфическог о промежу­
точного сое дине ния-
Аминоацил-тРНК-синтетаз ы в сравне­
нии, например, с такими ферментами ами­
нокислотного обмена, как протеазы, обла­
дают столь высокой специфичностью, что для обозначения этого феномена был вве­
ден т е р мин — сверхспецифичность. Это свойство синтета з с точки зрения молеку­
лярной энзимологии выглядит тем более уникальным, что задачу специфичност и эти фермент ы решают сначала на стадии акти­
вации аминокислот ы в процессе их специ­
фическог о отбора, а затем на стадии вза­
имодействия с полимерным субстратом — транспортно й РНК. Литература 1. Киселев Л. Л., ФаворовоО. О., ЛаврикО. И. Биосинтез белков от аминокислот до аминоацил-
тРНК. М.: Наука, 1984. 2. Лаврих О, И., Моор И. А. Взаимодействие аминоация-тРНК-синтета з с аминокислота*" // Молекуляр. биология, 1ЭЙ4, т. 18, с. 1208. 3. Ферштп А. Структура и механизм действия ферментов. Пер. с англ. М.: Мир, 1980. О. О. ФлшорошВ ТРАНСПОРТНЫЕ РНК НА ПЕРВОМ (ПРЕДРИбОСОМНОМ) ЭТАПЕ БИОСИНТЕЗА БЕЛКОВ Введени е Молекулы транспортной РНК (тРНК) (см. taKynf статью О. О. Фаворовой «-Строение транспортных РНК») играют центральную роль в .экспрессии генов, переведи инфор­
мацию, содержащуюся н матричных РНК в виде колонов, на язык аминокислотных остатков белковых цепей. Они переносят активированные остатки аминокислот в ри­
босому и включают их в синтезирующую­
ся белковую цель в соответствии с програм­
мой, записанной генетическим кодом в матричной, или информационной, РНК (мРНК), Удивительна история открытия тРНК. В начале 50-х гг. стало ясно, что инфор­
мация для аминокислотной последователь ­
ности белков закодирована в виде нукле-
отидной последовательност и мРНК. Хотя генетический код еще не был раскрыт, ученые пришли к заключению, что он должен быть триплетным, т.е. кажда я аминокислота должна кодироватьс я трой­
кой нуклеотидов матрицы. Между тем трип-
летный кодон мРНК не может непосред­
ственно уз на ва т ь боковые ра дика л ы аминокислот, поскольку между ними нет стерического соответствии. Исходя из это­
го, Ф, Крик в 1955 г. предположил, что дол­
жно существоват ь семейств о малых мо­
лекул РНК с двойной функцие й — кажда я из них должна ковалентно связыватьс я с определенный аминокислотным остатком и в то же время имет ь в своем составе нуклеотидный триплет, комплементарный кодон у для этой самой аминокислоты. Эти гипотетические РНК должны выполнят ь функцию адаптеро в ( переходников ) меж­
ду аминокислото й и соответствующи м ей кодовом, в связ и с чем гипотез а получи­
ла название адаптерной. Поскольк у ами­
нокислот 20, то и с оот ве т с т вующи х им РНК- адаптеро в должно быт ь не меньше; ф. Крик предположил, что их ковалент -
ное связывани е осущест вляют 20 специ­
альных ферментов, по одному на ка жду ю аминокислоту. Не прошл о и двух лет, ка к адаптерная гипотеза была доказана экс­
периментально: были открыты низко­
молекулярные тРНК и специфические ферменты, присоединяющие к ним ами­
нокислотные {правильнее — аминоациль-
ные) остатки. Далее было показано, что образующиеся аминоацил-тРНК способ­
ны переносить остатки аминокислот в ра­
стущую цепь белка. Стало ясно, что дей­
ствительно молекулы тРНК переводят ин­
формацию, заоисанную в мРНК в виде пос­
ледовательности кодонов, на язык амино­
кислотной последовательности белков и таким образок являются центральными молекулами процесса трансляции (пере­
вода) генетической информации Акцепторна я функция тРНК В соответствии с ролью тРНК разли­
чают две ее основные функции", акцептор­
ную — способность ко валентно связываться с аминоацильным остатком, превращаясь в аминоацил-тРНК, и адаптерпую — спо­
собность узнавать триплет генетического кода, соответствуюший транспортируемой аминокислоте, и обеспечивать поступле­
ние аминокислоты на законное место в ра­
стущей цепи белка. Некоторые тРНК вы­
полняют также ряд других функций в метаболизме клетки, в частности прини­
мая участие в биосинтезе клеточной стен­
ки, хлорофилла и тема и выступая в роли затравок при синтез е ДНК по матрице РНК ретровирусо в (в том числе вируса иммунодефицит а человека). В этой статье мы рассмотрим акцепторну ю функцию тРНК на предрибосомном этапе биосинтеза белков. Реакции аминоацилировани я тРНК, ка­
тализируемые а ми н оа ци л- т РН К- с интета -
зами (для краткости будем иногда назы­
вать их синтетазами), описаны ранее (см. статью О. И. Лаврик «Специфически й от­
бор аминокислот при биосинтез е белков»). На первой стадии этих однотипных реак­
ций происходит активация аминокислот ы с использование м энергии, запасенной в АТФ, а на второй — активированный ами-
ноацильный остаток переноситс я на одну из гидроксильных групп рибозног о коль ­
ца З'-концевог о аденозина, присутствую­
щего во всех т РНК (остаток 76, рис. 1), что приводи т к обра з ов а ни ю а мино -
ацил- тРНК. Оказалось, что выбор аминоацилиру -
емой ОН- групп ы концевог о аденозина оп­
ределяетс я природой аминоацил-тРНК-син -
тетазы. Эти фермент ы разделяютс я на два класса: синтетаз ы класс а I аминоацили ~ руют 2'- ОН- групп у рибоэ ы концевог о аде ­
нозина своих тРНК, а класса II — З'-группу (рис. 2). Для дальнейшего участия образо­
вавшейся аминоацил-тРНК в трансляции положение аминоацилирования тРНК не имеет особого значения, так как в вод-
НОЛ£КУЛЯРНЛЯ ВИОЛоли. Рис. 1.Положения нуклеотидов, определяющих ин­
дивидуальност ь каждой из тРНК. на схематическом изображении дщричной (а) и |ретичной {б) структу­
ры тРНК Оранжевым обозначены положения, наиболее часта узнаваемые аминаацил-тРНК-синТёТвэами, желтым—уз­
наваемые в отдельных случаях, а— жирно обведенны­
ми кружками показаны консервативные или полукон-
сервативные нуклеОплды Каждому нуклеОтиду присво­
ен свой номер, нумсраииа идет от 5'- х З'-концу. Пррмыми линиями обозначены формирующие двойную спираль водородные связи между комплементарными нуклеогидными остатками, их число постоянно во веек тРНК. Пунктиром обозначена непостоянная пара, б — черными точками отмечены положении нуклестицов, не участвующих в определении индивидуальност и тРНК [рис. 1,6— из: McCJafn.W.H.Nicnotos.H.B . Jr J.Md.Btol.. 1987. uol. 194, p. 635—€42: с изменениями] нои растворе происходит спонтанная миг­
рация аминоацильног о остатка между 2'-
и З'-гидроксилами ( чере з образовани е 2'-3'-циклическог о промежуточног о соеди­
нения, изображенног о на рис.2), и меж­
ду двумя формами устанавливаетс я рав­
новесие Отсутствие ошибок ври аминоацилиро-
вавии тРНК является непременным условием реализации генетического кода. Дело в том, что при биосинтезе белков в рибосомах вы­
бор аминокислоты, включающейс я в расту­
щую белковую цепь, зависит исключитель­
но от адаптерной молекулы тРНК, к кото­
рой она прикреплена. Если на предрибосомном этапе произошла ошибка и к тРНК присое­
динилась аминокислота, не соответствующа я специфичност и антикодона, то эта ошибка уже не может быть исправлена на после­
дующих этапах белкового синтеза. При этом не имеет значения, при отборе какого из субстратов реакции аминоацилировани я — тнслоргнш! ркк нл тяяон /пп^гмюсомном) ?чпг ыюсн*т* ыйкоа • 1 тРНК или аминокислоты — оншплагь пшт-
ветгтвуюшяя вминиянил-тРНК-гнмтг'галв. В лиЛ'м случае продукт ошибочной реакции Лудрт -минин замедленного действия», за­
ложенной иод гиктеяирующугос н в рибосо­
ме молекулу белка Неудивительно, что я ходе эволюции выработались специфически е механизмы o-rfWipa -правильных» субстратов для аяино-
яцил-тРНК-синтетаа. обеспечивающие без ­
ошибочное а киноа цитирование 1 РНК. В связи с особым значением лтих механизмов для реализации генетической информации их называют иногда «вторым генетический ко­
дом- Моле куля р мы*" механизмы, обеспечи­
вающие безошибочный отбор синтетазами «правильных- аминокислот, рассмотрены в предшествующей статье (см статью О. И. Лав-
рик «Специфический отбор аминокислот при биосинтез е белков»). Отбор •правильных" тРНК в этих реакциях зависит от узнава­
ния ферментом отдельных элементов L-об-
разной структуры молекул тРНК, и об этом пойдет речь нише Молекулярные основы узнавания тРНК а м нвоа цн л- тРН К - с и нте та зам и Каждая тРНК, сохраняя универсальную L-образную форму, должна иметь какие-
то отличительные признаки, безошибочно распознаваемые «своим» ферментом как «притягательные», а остальными 19 фер­
ментами — как «отталкивающие». Отметим, что такие признаки должны быть общими у изоакцепторных тРНК, специфичных для одной и той же аминокислоты. Вопрос о молекулярной основе высоко­
точного узнавания тГНК есвоей» и только «своей» синтетааой интересовал ученых со времени открытия этих макромолекул. Оче­
видно,что определенные нуклеотиды, за­
нимающие одно и то же положение в по­
ли ну клеотидной цепи всех или многих тРНК (консервативные или полуконсервативные нуклеотиды, соответственно), не могут быть теми элементами, которые распознает син-
тетаза. Довольно скоро стало ясно, что за несколькими исключениями модифициро­
ванные нуклеотиды также не являются та­
кими элементами. Значительный прогресс в лонимании принципов этого РНК-белко­
вого взаимодействия был достигнут в пос­
леднее десятилетие с появлением возмож­
ности направленно изменять строение белков и нуклеиновых кислот, с разработкой методов компьютерного моделирования их пространственных структур, а также кри­
сталлизации и рентгеноструктурног о ана­
лиза комплексов тРНК со «своей* сиыте-
та зой. П[ЮДУ*Т[ кятмчмргчиой С«Н1«Г«ЗйыИ KnKCtII Прщгуят , *£ Л. о он о I 1 1 НО ,0 РИС. 2. Спонтанная нитрация вмимоацильного остатка (обозначен зеленым) между 2'- и Эг-положениями рибоэы концнвого адвнозина тРНК чео*э образова­
ние короткоживушег о промежуточного соединения Остаток адвнина (А) в составе концевого аденоэи-
на обозначен красным. Многоточие— нуклеотиды 1-75 тРНК На сегодняшний день установлен, хотя бы в первом приближении, набор нуклес- j тидов, существенных для аминоацилирова-
ния «своих» тРНК каждой аминоацил-тРНК-
синтетазой из кишечной палочки и многими синтетазами иа дрожжей. Такой набор, ес­
тественно разный для разных пар тРНК-
синтетаза, включает нуклеотиды, занима­
ющие одни и те же положения в структуре большинства тРНК. Это следующие участ­
ки тРНК (рис.1): 1. Антикодон, т. е. нуклеотидный трип­
лет, комплементарный кодону (остатки 34— 36). Участие антикодона, определяющего на рибосоме включение аминокислоты в рас­
тущую цепь белка, к тому же и в отборе этой аминокислоты на стадии реакции амино-
ацилирования тРНК предполагалось еще в 60-е гг., исходя из уникальности этого эле­
мента в структуре молекулы. Данные пос­
ледних лет показывают, что в узнавании может участвовать один или более нуклео-
тидов антикодон а, однако это касается не всех тРНК. 2. Нуклеотид 73, предшествующий ССА-концу. Присутствие в этом положе­
нии того или другого пуринового нуклео-
тида (А или G) коррелирует с типом ами­
нокислот, присоединяемых к тРНК. Если в этом положении находится А, то тРНК акцептирует гидрофобные аминокислоты, а если G — то полярные. Поэтому нуклео­
тид в положении 73 часто называют диск­
риминатором. 3. Первые три пары нуклеотидов акцеп­
торного стебля (1-72, 2-71, 3-70). В различ­
ных случаях в узнавание синтетазой может вовлекаться от одной до трех пар нуклео­
тидов акцепторного стебля. ИОЛМУЛЯРНЛЯ **алог„я « ^экспериментальные данные свидетель­
ствуют о той, что аминоацил-тРНК-син -
тетаэы из других организмов уанают в ос­
новном те же участки тРНК. В отдельных случаях к элементам узнавания тРНК от­
носят также те или иные не консерватив­
ные нуклеотиды D- и Т-петель (в первую очередь в положении 20 D-петли), четвер­
тую пару акцепторног о стебля и некото­
рые другие. У каждой отдельной тРНК син-
Тетазами может узнаватьс я только часть перечисленных элементов Другими слова­
ми, число нуклеотидов, определяющих ин­
дивидуальност ь каждой тРНК (т. е, ее свой­
ство быт ь опоз нанно й всеми 20 аминоацил-тг'НК-синтетазам и таким обра­
зом, что *евоя* синтетааа присоединяе т к ней аминокислоту, а остальные 19 синте -
таз ее «отвергают»), невелико. Для каж­
дой отдельной пары тРНК- синтетаз а уз ­
навание определяетс я ограниченным числом элементо в структуры тРНК, перечислен ­
ных выше. По мнению некоторых авторов, в ряде случае в для узнавания бывае т до ­
с таточн о одног о какого- либ о э ле ме нт а структуры, наприме р одной нуклеотидно й пары в акцепторно м стебле, однако наи­
более часто встречающийс я случай — у з ­
навание тРНК по двум участкам. Контакт ы ме жд у тРНК и синтетаз о й высоко специфичны: константы стабильности комплексов со «своей» синтетазо й на 3—4 порядка величин выше, чем с «чужой», а модификация тРНК у же по одному из оп­
ределяющи х ее индивидуальност ь элемен­
тов приводит к резкому падению сродства со «своим р ферментом. Отчетлива я картина того, как синте -
таза узнае т на молекулярно м уровне «свою» тРНК, была получена с помощью рентге -
ноструктурног о анализ а для дву х комп­
лексов с инт е т а з а т РНК, которые удалос ь закристаллизовать: комплекс а гл у там иво ­
вой тРНК с глутаминил- тРНК- с инте таз о й из кишечно й палочки и комплекс а с пе ци ­
фичных для аспарагиново й кислот ы с ин-
т е т а з ы и т РНК и з д р о жже й. Впе рв ые с труктур а кристалл а комплекс а была у с ­
тановлена в 1989 г. для глутаминово й пары. На рис, 3 видно, как два домена тРНК по внутренне й стороне угла L- структур ы всту­
пают в протяженный контакт с ферментом, приче м отдельные функциональные груп­
пы антикодоново й петли и ССА-конца тРНК прямо- таки «обволакиваются » белковой мо­
лекулой. Исследовани я трехмерно й струк­
туры этого комплекс а с раз решение м 2.8 А, а з ате м 2,5 А позволил и установит ь конк­
ретные аминокислотные остатки белка, свя­
з ывающие с я с отдельными нуклеотидам и элементов узнавания — акцепторног о стебля и антик о дона. Для аспарагил- тРНК- синте -
тазы также наблюдали взаимодействие протяженной поверхностью «своейя тРНК от антикодона до З'-конца, имеющее ин­
дивидуальные отличия от глутаминовой пары. Существенно важным для достижения подобного структурного соответствия иеж_ ду ферментом и субстратом является взаим­
ная подгонка двух макромолекул, которая происходит в результате их конформацион-
пых изменении. Так, было установлено, что структуры глутаминовой тРНК в свободной состоянии и R комплексе со чсвоей» синтета­
зой существенно различаются, а Другие тРНК, если они и связываются с глутаии_ нил-тРНК-синтетазОй. не способны так точ­
но «подогнаться- к поверхности фермента Динамический процесс информационных из­
менении макромолекул является важной со­
ставной частью их взаимного узнавания и последующе й реакции аминоацилирования тРНК. Рне. 3. Комплекс глутаминил-тРНК-смнтегаэы с глу­
таминовой тРНК и с АТФ (по данным рснтгемоструи-
TypHOfO анализа) В молекуле тРНК красным изображен рибоэофос-
фатный скелет, желтым — основания. Фермент пред­
ставлен голубым, АТФ —зеленым. Область контакта между тРНК и ферментом простираете* вдоль Од­
ной стороны поверхности белка. ССА-коиеи и амти-
кодон тРНК, а также АТФ располагаются в углубле­
ниях на поверхности фермента. Белок проникает между 5"- и З'-коицами тРНК и разрушает первую пару оснований акцепторного стебля [из: fitouW, M.A. Регола. JJ.,$oil.D.,Stettz.TA. Science. 1989,vol, 246. p. 1135— И42] ТРАНСПОРТНЫЕ РНК НА ПЕРВОМ (ПРЕДРИБОСОМНОМ, ЭТАПЕ БИОСИНТЕЗА 93 Заключение Различные тРНК, распознаваемые 20 ами-
ноацил-тРНК-синтетазам и в соответствии со своей индивидуальность ю и безошибочно нагруженные кажда я своей аминокислотой на первом, предрибосомном, этапе белкового синтеза, готовы к выполнению своей адап-
терной функции в рибосомах. Теперь различ­
ные аминоацил- тРНК становятся равноправ­
ными субстратами для синтеза белка, и их отбор зависит только от того, какой колон мРНК считывае т рибосома в настоящий мо­
мент. Здесь, в рибосоме, используютс я пре­
имущества единого плана строения всех тРНК. Универсальна я L- форма молекул позволяет всем а миноа цил- т РН К равно эффективн о связываться с рибосомными субчастицами, а также со специальными белковыми факто­
рами, ответственными за начало (инициацию) синтеза белковой молекулы, за ее удлине­
ние и завершение, и шаг за шагом, амино­
кислота за аминокислотой, наращиват ь белковую цепь (см. статью А.А. Богданова «Био­
синтез белка на рибосоме — заключитель­
ный этап трансляции»). Литература 1. Киселев Л. Л., Фаеороеа О. О., Лаврик О. И. Биосинтез белков от аминокислот до аминоацил-
тРНК. М.: Наука, 1984. 2. Спирин А. С. Молекулярная биология. Структура рибосомы и биосинтез белка. М.: Высш. шк., 1986. БИОСИНТЕЗ БЕЛКА НА РИБОСОМЕ — ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЙ ЭТАП ТРАНСЛЯЦИИ Вве де ни е Трансляция — это перевод генетическо й информации, записанной в виде нуклеотид-
Нпй последовательност и информационной РНК (называемой также матричной PHKt мРНК), в аминокислотную последователь­
ность синтезируемой полипептидной цегти белка. Словарем для такого перевода слу­
жит аминокислотный генетический код (см. статью С Г. Инге-Вечтомова «Как читает­
ся генетический код: правила и исключе-
нияь)- В ходе трансляции транспортные РНК (тРНК), несущие специфичные для них ак­
тивированные аминокислотные остатки (см. статью О. О, Фаворовой «Транспортные РНК на первом (предрибосомном) этапе биосин­
теза белков»), узнают тринуклеотидные ко-
доны (триплеты) в мРНК. Этот процесс, называемый декодирование.*!, а также по­
следовательная сборка полипептидной цепи белка и сканирование полинуклеотидно й цепи мРНК осуществляютс я рибосомой. Строение рибосомы Рибосомы представляют собой сложные макромолекулярные комплексы, построен­
ные из РНК и белков. Таким образом, ри­
босомы относятся к классу рибонуклеолро-
теидов (РНП). Во всех клетках рибосомы локализова ­
ны в цитозоле (цитоплазматически е рибо­
сомы). В клетках эукариот рибосомы содер­
жатся также в матриксе митохондрий (ми-
тохондриальные рибосомы) и хлоропластом (хлоропластные рибосомы). У эукариот ци­
топлазматические рибосомы синтезируют­
ся в ядрышке (в чем к состоит предназна­
чение этих субклеточных структур), а затем транспортируются из ядра в цитоплазму. Состав и характеристики компонентов типичных прока риотической и эукариотичес-
кой рибосом приведены в таблице. Видно, что каждая рибосома построена из двух субча­
стиц — малой и большой. Субчастицы рибо­
сомы (так же. как и их РНК-компоненты) принято характеризовать с помощью коэф­
фициентов (в стандартных условиях — кон­
стант) седиментации, выражаемых в едини­
цах Сведберга, S. Напомним, что эта характеристика, определяемая по скорос­
ти осаждения макромолекулы или макромо-
лекулярного комплекса в ультра центрифу­
ге, зависит как от молекулярной массы, так и от формы объекта. Диссоциация 70S (80S) (здесь и далее сначала даются значения констант седиментации для прокариот, а затем (в скобках) для эукариот) рибосомы на 50S (60S) и 30S (40S) субчастицы проис­
ходит при понижении концентрации ионов магния в растворе. Этот процесс обратим, и если концентрация Mg2+ возрастает, то суб-
частицы строго специфически ассоциируют, вновь образуя исходную рибосому. Состав и характеристики компонентов рибосом Показатель Коэффициенты седиментации Молекулярная масса, кД РНК Число белков РНЮбелок. % Коэффициенты седиментации Молекулярная масса, кД РНК Число белков РНК/белок, % Рибосома 70S 2520 52 66/34 80S 4220 82 50/50 Малая субчастнца Большая субчастица Прокариоткческая рибосома (E.coli) 30S 930 16S, 1542 нуклеотида 21 60/40 50S 1590 23S, 2904 нуклеотида 5S, 120 нуклеотндов 31 70/30 Эукариотическа* рибосома (крыса) 40S 1400 18S, 1874 нуклеотида 33 45/55 60S 2820 28S, 4718 нуклеотндов 5.8S, 160 нуклеотндов 5S, 120 нуклеотцаов 49 55/45 6*tOCt*Nff* *£Л/гЛ МЛ PMBOCOttf — ХАМЛЮЧНТЩАЬМЫЙ Jf*n ГРА#£/!#ЦММ * * Нл макрофотографиях, получаемых с дние годы электронная микроскопия рибо-
поиошью электронного микроскопа. 70S- и сом совершила значительный прогресс, По-
SOS-рибосомы выглядят как частицин фор- этому на рис I приведены как традицион­
но которые приближаете* к сферической. ные модели 70S-рибосомы и ее субчастиц, Опннко субчасткцы рибосом весьма аскмМет- построенные на основании данных, получен-
ричны ^особенно мал a ft) и имеют характер- ных с разрешением 40—50 Л (4-5 ни), так и ные морфологические особенности. В после- современная модели 708-рибосомыт пост ро-
т е • Рис. 1- Модели структуры 70В-рибооомы Ecoti, построенные на основании данных электронной микроскопии Л— классическая модель В. Васильева {разрешение около 4 нм]. Малая (30S) субчастица — светлая, большая (60S) субчастица— темная. Хорошо видно подразделение малой субчастицы на -голову- и «тело- (а, б, в — различные проекции модели); Б— схема, показывающая взаимное расположение субчастиц рибосомы. Малая (30S) субчастица — желтая, большая субчастица (SOS) — красная. Вид со стороны малой субчастицы. Схема позволяет легко различить три выступа («протуберанца*) в 505-субчастице; в— современная модель М.Ван Хилла (M.van Heel), Р. Бримакомба (В. Brimacombe) и др. (разрешение около 2 нм). Малая субчастица — крас­
ная, большая субчастица — коричнево-сиреневая. Белым (в) показана молекула тРИК, выходящая иэ рибосомы. Многочисленные выступы на поверхности субчастиц соответствуют отдельным белкам рибосомы и отдельным элементам (спиралям) структуры рРНК. Рибосома показана в трех проекциях (а, б, в), примерно соответствую­
щих проекциям а, б, а на рис. \.А. НОЛСКУЯЯРНЛЯ с еннан на основании злентронно-миярископи-
ческого анализа с разрешением около 20 А (2 ян). С одной стороны, эти «одели имеют много общего. Например, хорошо видно, что 3OS-субчастица подразделяетс я на «голову» и "тело», а 5 OS-субчастица имеет три ха­
рактерны к выступа (протуберанца). С дру­
гой стороны, на поверхности 2-нм модели рибосомы (рис. 1, Л) видны боле* мелкие детали ее структуры, соответствующие от­
дельным злементам молекул риоосомнъгх РНК или отдельным белкам рибосомы. Такой уро­
вень разрешения позволяет также наблю-
дзть на поверхности рибосомы другие РНК (тРНК, например) и белки, принимающие участие в биосинтезе белка. Хотя по молекулярной массе рибосом-
ные частицы только примерно наполови­
ну состоят из РНК, рибосомная РНК (рРНК). вне всякого сомнения, главный струк ный и функциональный компонент рчс/^" мы. рРНК определяют форму и paaw4 0' субчастиц рибосомы, расположение а **** рибосомных белков (эти два свойства г,рм* называют их каркасной функцией), а т ^ ное — из нуклеотидных остатков шкт'*" лекул рРНК формируются все функции*"'" ные центры рибосомы. Рибосомны* сГЛь~ играют хотя и очень важную, но в с п ЛКи гательную роль, способствуя лРавильн°М°" исключительно компактной укладке ца°Й н молекул рРНК в рибосоме. "Р0-
Вторичная структура 5S. 16S ( 1BS) „ « -28S) рРНК, а именно чередование в тяжевых (спиральных) и однотящ»1""1 участков, достоверно установлена. Она *'""' залась поразительно консервативной (**" одинаково й во всех е е принципиаль В ню mm tevmrJQBD 1070 U« f ,,» ' (25 дну тяже 1980 ,"чА 1W0 Рис. 2. Обобщенная модель вторичной структуры рРНК малой субчагдицы ри босомы прокариот Г. Ноллера (И. Nollerl. К. Возе (С. Woese) и др. Каждый десятый муклеотидаый остаток пронумерован. Буквами показаны те нук-
пеотидные остатки, которые встречает­
ся в рРНК малой субчастицы рибосо» любого организма (т. е. неизменно со­
хранившиеся в процессе э в о п | ^ * ^ Короткие черточки показывают pstf^j ложение уотсон-криковских '*"4"^ Z l пар, точки— нестандартных (rt ej'OT™[ криковских) пар (UG, например) в спи­
ральных участках рРНК Bt*OCMHT£3 SEflKA H* PH&Oi. V*TE ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНАЯ ЗГАП ТРАНСЛЯЦИИ _ PHG, Э. Слвма, показывающей рас­
положение «а пра*.ариотичес*ой рибосоме ее функциональных цен­
тров Р- и А-участии рибосомы запоя нены гтрогидил-гРН^ (красная) и вднмоацнл-тРНК (зелеман) соот­
ветственно Е-участок предназна­
чен для временного связывания вЫкОДПЩвЙ ИЛ рм(Ну£С*АЫ Свобод-
иой грнк (см, тдкж$ *Элонтацирн-
ный цикл рибосомы» J Пеггтилилтрансфе-
разный центр •%z . Анттл годин SOS Акцепторный • JXTXH> •*— Остаток >Х гч-форммгметионина Аминокислотные остатки деталях) для всех живых организмов. В то же врем л нуклеотидные последовательно­
сти (первичные структуры) у однотипных рРНК из разных организмов сильно разли­
чаются. Неизменными в эволюции оказались лишь очень короткие последовательност и {или даже отдельные нуклеотиды) рРНК, как правило, входящие в функциональные центры рибосомы. На рис. 2 приведена уни­
версальная вторичная структура рРНК ма­
лой субчастицы рибосом прокариот. Третичная структура рРНК в рибосоме до сих пор не известна, Б то же время Де­
лаются попытки смоделировать ее с помощью компьютерных программ, используя как ос­
нову электронно-микроскопически е модели субчастиц рибосом и разнообразные химичес­
кие данные. Замечательное свойство субчастиц рибо­
сом — их способность к Самосборке из рРНК и белков m uitro. Если в пробирке смешать в правильной пропорции рРНК и белки боль­
шой или малой субчастицы рибосомы E.coli (при оптимальных концентрациях солей магния и аммония и температуре), то они самопро­
извольно ассоциируют в биологически актив­
ные рибосомные субчастицы. Самосборку рибосом широко используют при изучении их структуры и функций. Функционирование рибосомы Р' и А-участки рибосомы Как будет ясно из последующег о изло­
жения, для образования каждой новой пеп­
тидной связи в синтезирующейс я цепи бел­
ка необходимо, чтобы на рибосоме находилась одна молекула тРНК, связанная с растущим пептидом, и еще одна молекула тРНК, свя­
занная с аминокислотным остатком, который будет присоединен к растущей цепи. Для этого рибосома располагае т двумя участками — Р(для пептидил-тРНК) и А (для аминоа-
цил-тРНК). В каждом из этих участков мож­
но выделить две зоны: декодирующую, в второй происходит образование кодон-анти-
кодонового комплекса, когда тРНК узнает свой кодов в мРНК; я зону связывания акцептор­
ного конца тРНК, несущего присоединенный к нему пептидильный или аминоацильный остаток. В совокупности первые две зоны {из Р- и А-участков) образуют декодирующий центр рибосомы, расположенный на ее ма­
лой субчастице, а вторые две— пептидил-
транрферааный центр рибосомы, расположен­
ный на большой субчастице {рис 3). В настоящее время твердо установлено, что декодирующий центр рибосомы находится между л головой» и "телом» ЗОЭ-субчастицы, на той ее стороне, которая в 7OS-рибосоме обращена к SOS-субчастице. мРНК, связываясь с этим центром, образует несколько слабых, но весьма специфических контактов с нук-
леотидными остатками 16S (18S) рРНК Кроме того, гетероциклические основания в мРНК взаимодействуют также с нуклеотидными остатками рРНК малой субчастицы, находя­
щимися по-соседгтву с декодирующим цент­
ром (см- ниже). Всю зону связывания мРНК с малой субчастицей рибосомы (включая декодирующий центр) обычно называют мРНК-евязывающим центром рибосомы. Пептидилтрансферазный центр рибосо­
мы расположен в основании центрального протуберанца большой субчастицы, т. е. на­
против декодирующего центра малой суб­
частицы. Расстояние между этими центра­
ми в TOS-рибосоме составляет 70—80 А, что хорошо соответствует расстоянию между ан-
тикодоном и акцепторным концом в молекуле тРНК. Район 23S (25-28S) рРНК, составля­
ющий основу пептидилтрансферазног о цен­
тра, хорошо охарактеризован. В частности, в этом районе сосредоточено большинство нуклеотидных остатков 23S (25-28S) рРНК, замены которых на другие остатки (мута­
ции) либо ингибируют реакцию образования пептидной связи, либо, напротив, делают рибосому нечувствительной к антибиотикам — ингибиторам этой реакции Ивициация синтез а полипептидно й цепи Биосинтез белка на рибосоме начинается с образования комплекса между инициатор-
нын участко м мРНК, расположенным в К»МПЛпк<: Шяйн в -Да n*rf а р ю Иниция rOpmJM КОДОМ мРНК G U A A 4 A A Q Q Q U A U C G A C A A U Q A A A - — uui t u itjS p PH K С - AC U A U-
22™™™*^» ^ Рис. 4. Инициация 'ран^ляции „ _ риот v "Р ^. л комплекс Шййня-Лш^арн ) По* на примере одлой из мРНК. учисг^-Г** 1 & биосинтез» триптофана в « ле т ^ х ^ * * б— чидймв и&раэованмя инициат_^ Co'J-
70S-комплекса у прокариот ( t M п2?Г',<) ния а тексте) "^Си*. 30S ^ M S •——— — • +50S * GTP I F-t.I F- 2 IF-3 1 ^ И k_ , t . .Г* I I/ Формилметионил -гРН К IF-2. GTP 30S k^—\ ^ » ^ '- 4 ^ 7 IF-2 GTP мРНК-связывающе м центре, и специальной инициаторной аминоацил-тРНК, располага­
ющейся в Р-участке рибосомы.Механизмы этой стадии биосинтеза белка, называемой инициацией трансляции, у прокариот и эукариот достаточно сильно различаютс я и будут рассмотрены отдельно. Инициаторный участок прокариотических мРНК содержит инициаторный кодон (в по­
давляющем большинстве случаев им служит кодон AUG. реже GUG, еще реже UUG). Инициаторному кодону предшествуе т отде­
ленная от него тремя-восемью нуклеотида -
ми последовательност ь Шайна-Дальгарн о ( Shi ne- Dal gar no; SD-последовательность ) (рис. 4, а). Этот участок мРНК — его длина колеблется от 4 до 7 нуклеотидных остат­
ков — комплементаре н последовательности, расположенной на Зг-конце цепи 16S рРНК, с которой он образует специфический дуп­
лекс. Инициаторной тРНК у прокариот служит формилметионил-тРНК, которая имеет анти-
кодон CAU и приносит в рибосому остаток N-формилиетионин а (это обычная аминокис­
лота метионин, к аминогруппе которой при­
соединен формильный остаток; см. также рис. 6, б). В процессе инициации у прокари­
от участвуют также три фактора инициации (IF) — белки I F- 1, IF-2 и I F- 3. Факторы IF- 3 и IF- 1 функционируют вместе, способствуя инициаторному участку мРНК занять свое место на рибосоме. Фактор 1F-2 в комплек­
се с гуанозинтрифосфато м (ГТФ, или GTP) катализируе т связывание формилыетио-
нил-тРНК с Р-сайтом ЗОЗ-субчастицы; при этом ГТФ гидролизуетс я до ГДФ (GDP) и неорганического фосфата. Предполагается, что гидролиз ГТФ обеспечивает энергозави­
симое изменение структуры связанной с мРНК и формилметионил-тРНК ЗОБ-субчастицы, ко­
торое дает ей возможность ассоциировать с 5OS-субчастицей. При этом факторы иници­
ации покидают рибосому (рис. 4, 6). Таким образом, в образовавшемся 71Й-ини-
циаторном комплексе Р-участок занят фор-
ми лметион и л-тРНК, а А-участок свободен и доступен для связывания аминоацил-тРНК, соответствующе й второму (после иницииру­
ющего) кодону в мРНК. Аналогичный инициаторный комплекс образуется и в эукариотической клетке, с той лишь разницей, что у эукариот инициатор-
ная тРНК аминоацилирован а свободным ме-
тионином, а не его N-формильным произ­
водным. Однако сама цепь событий, которая приводит к образованию 805-инициаторног о комплекса у эукариот, существенно отлича­
ется от таковой у прокариот и протекает по гораздо более сложной схеме (рис. 5). Во-первых, в эукариотически х мРНК по соседству с инициаторнъш кодоноы AUG (един-
3rtQCttHT£* Jf ЛМ ffA fitfSOCOMf - ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНЫЙ ЗТлП ТРАНСЛЯЦИИ ственным инмциаторным кплином У эукари­
от) кет последовательности, которая была бы комплементарна IBS рРНК. С другой сторо­
ны, з'- кпнцы подавляющег о большинства эукариотических клеточных мРНК модифи­
цированы так называемой кэп-группой + а их 3'-кпгщы — полиаденилированы (рис, &т а). И наконец» процесс инициации трансляции у эукариот обслуживает гораздо большее число белковых факторов, многие из которых имеют сложную четвертичную структуру. Так. на­
пример, фактор инициации eI F~2 (буква *е» означает — эукариотический), аналог прска-
риотическог о фактора инициации YF-2, со­
стоит из трех разных субъединиц, фактор е 1р_3 — примерно из 10 субъединиц, а его молекулярна я масса превышает 500 кД Из сильно упрощенно й схемы инициа ­
ции трансляци и у эукариот, приведенно й на рис 5h б, отметим лишь следующи е мо-
ненты-
1. Связывани е инициаторнпй иетио-
нил-тРНК с 405-субчастицей рибосомы пред­
шествует связыванию с ней мРНК, т.е. оно происходит в отсутствие в Р-участке ри­
босомы AUG ко дона. 2. С копированным 5'-концом мРНК свя-
3btB«№Tcn, по-ьидимому* ф&кторы из груп­
пы t?JF-4, которые обеспечивают затем сея~ з ыва ни е « РНК с S- прединициаторны м 403-комплексом. 3. Последующие события приводят к тайну, что истинный иницивторный кодон (как пра­
вило, но не всегда, это ближайший к 5'-концу мРНК AUG-кодон) оказываетс я В Р-участке декодирующег о центра 40&-субчястицы и об­
разует там кодон-антикодоновый комплекс с инициаторно и метионил- тРНК. М. Козак (М. Kuziik) были высказано Предположение^ что прединициаторный 405-комплекс связы­
вается с б'-концом мРНК и находящимис я на нем кэп- у якающими белками и перемещает ­
ся V •Оис он он HjC О Основная цепьмРНК 0 р ОН in он он NH, ПолиА-"квост" (( = 20- 200 ДОЗ-субчаечица elF-3 eff-4C _ Инициггторный 1JBIF2:GT P j 405-кпмплекС e!F-2:GDP + + другие факторы инициации Рис.5. Инициация трансляции у эукариот а —строение эукариотических мРНК. 5'-конец несет кэп-группу. химическая структура которой представ­
лена на рисунке. З'-конец полиаденилирован (содер­
жит от 20 до 200 остатков А). X— A, U, G или С; 6— схема образовании инициаторного 80S-комплекса (см. пояснения в тексте) Инициаторный 80S-комплекс СИ» &-1UI,!- c-i Пептидил-тРНК Рис. 6. Элонгация трансляции н а— элонгационный цикл рибосомы, Показан на примере прокариотической рибосомы. Показаны также цикли­
ческие превращения факторов элонгации EF-To и EF-G. Ts— белковый фактор, функция которого состоит в связывании комплекса EF-Tu с GDP (ГДФ). после чего Tu-фактор теряет GDP и вновь приобретает способность связываться с GTP (ГТФ) и аминоацил-тРНК. «Пре» и "Пост» — претранслокационный и посттранслокэциои-
ный 70S-комплексы соответственно. Видно, что достигнув постгранслокационного состояния, рибосома входит в новый цикл элонгации (верхняя правая жирная стрелка). Два перекрывающихся изображения 7(К>-комплекса в посттранслокационном состоянии соответствуют рибосоме, входящей в элонгационный цикл (верхняя) и завершающей его (нижняя). Обратите внимание на то, что растущая полипептидная цепь а нижнем комплексе на один аминокислотный остаток длиннее, б— механизм реакции тракспептидации. катализируемый рибосо­
мой прокариот в болгг ойяпл к и к и ГТ Пестсна. К Хел-
« f fBeUeni. И Ша-гакя». с о г д с » м и щщ. £-.»гтр*вс-1НТ>тевм « м е т » «РНК под ш -
_BWPia фАжтороя TMMIi>nttt*ii **——миваптв ж „раетракткжит » структуру, педаодлщц а> дредя и к ш*Д ториовге 4Ф&-жомви1ексу сразч-
ивт п ямвиторвый л 1.47-колов. Этот те-
хаяялм оОьясяяет • частвостн, ш п к ш ввавЕвасагай «внутреявей* нйжщвцш травг-
дяяил. ва&хпхаеаюя1 4." м щу о и д ш веко-
торДО клеточных мРНК. не солераыщасх аде-ГРУ1111? • * 5'-концах. ПерестраЯха CTpj»tvjjbi д я р и щ ц ) д р -
аон в(РНК эиергиавясюа а v поэтому сопро­
вождается гидролизом ДТФ. 4. Далее происходят связывание иред-
ящщщтордою WS- nnmKi r a с большой суб-
частн^цеи 1С образ овани е инициаториог о ЯДО-хомплежса. Оно сопровождаетс я гидро­
лизом ГТФ и осаобояеденме м еП"-2 (в комп­
лексе с ГДФ) ж друттгх факторов яниива-
Супхествоваяэге столь сложного аппарата квипиацни трансляции у эукармот, весоинеяно. связано <: вяйходооюсть ю специфически кон троднровать и регулировать в клетках этого типа уровень синтеза отдельных белков (см. об этом подробне е в статье И. Н. Шатского «Регуляция биосинтез а белков»). Элоягацяонжыж цикл рмбосомы Б отличие от процесса нницхацкк транс­
ляции механиз м наращивания (элонгации) полипептидной цепи аа рибосоме у про- н эукариот практически универсален. Как видно из ряс. В, о, каждый элементарный акт элон­
гации трансляции, соответствующи й нара­
щиванию полипептидно й цепи Белка на один аминокислотный остаток, состоит из тре х стадий: кодои-зависимог о связывания аии -
ноацил-тРНК с А- участко и рибосомы; реак­
ции образ овани я ново й пе птидно й с вяз и ( транспептидацни), в ре з ультат е которо й пептидил- тРНК оказ ываетс я в А- участке; перемещени я пе птидил- тРНК из А- в Р -
участок, называемог о mpa-нслокацией. При транс локации происходя т е ще два важных события. Во- первых, мРНК перемещаетс я по рибосоме на один кдцон. Во- вторых, свободная тРНК, находящаяс я в Р- участке, покидае т этот участок. При этом она в е с раз у выхо­
дит в раствор, в вре ме нн о с вяз ывае тс я с Е- участким рибосомы ( Е от англ. «exi t » — выход). Поскольку эти стадии повторяютс я в том же порядк е при каждо м удлинени и пептидно й це пи на одмо з вено, их совокуп ­
ность наз ывают элонгационным циклом. Перва я стадия злонгвциониог о цикла ри ­
б о с о мы— с вяз ывани е а ми в о а ц и л - т РНК — -тРНК У ! как ИГ-Тц. а у л п л а л — »EF-: :»т"» фас-
тефы (вах в факторы ]-•—тт ГГ-1 a rtT-Si отвоелтеж ж болыпоагг сеж*-ж>ггтт G-^wATBrtB. Т р в ф м ф а ту ж фу!|КШК4Пйр>гк4Д1иК В ВАХТ Си з и х и т * ГТЧ> Врашкоп • струтгтур-
яож сяфестройжв ш WMt v » С~6елка. бла­
годаря штпррл оа ортпосает ц и м у ч ков-
форжаджжл. О-белвя— атофцяна ш ПФаам. В irpom-стт фу-яллтятрешмхшх <мп п п л -
аяруяхт гадрсиоо ГТФ (GTP1 до ГДФ tGOPl • вгоргаяяческого фосфата. Да л * ТДФ у*а-
ляятся an ramwuet * С-£а>ляом лжбп «а оч«т спонтанной я в г т г т т т » лмбп с тающая.* д р у г а белковых факторов. СквкбАхтпгжв-
ся G-белок слова моапг связать молекулу ГТФ. Таким образом, фувкцяоняровакв * G-белков сопровождаетс я цнкляческвим. изменениями яж конформацхв. Лучше всего эти изменения «вракт е -
рязонаяы в случае фактора EF-Тч. «яг*, рый удалось изучить рентгенметрутуриын анализом в свободном состояния я в комп­
лексах с ГТФ. с ГТФ к с амнноацил-тРНК. с ГДФ я с белком Ts. который, связываясь с EF- Tu, удаляе т из него ГДФ (см. цпкз ЕГ- Tu на ряс, 6, о). Белок EF-Tu способен связаться с рибо­
сомой только в 1сомпл«кс* с ГТФ. Он в* спе­
цифичен к вминовцял-тРНК. Иными СЛОВА -
ии, ов траяспортпруе г в А-умасток рябоечнсы любую аминовцид- тРНК Однако закрепля­
ется в этом участке лишь т» тРНК, »итм-
кодон которой соответствуе т коднну, нахо­
дящемус я в данный момент в А-участке, Образование правильного и только правиль­
ного кодон-антикодововог о комплекса явля­
ется сигналом, который каким-то порезом включает ГТФазную активность EF-Tu. После гидролиз а ГТФ структура белка перестра­
ивается, комплекс (EF-TuVGDP теряет срод­
ство к аминоацил- тРНК и ркбЧкоме и по­
кидает ее. Аминоацильный остаток при этом занимае т соответствующе е положение • пеп-
тидилтра нефе раз ном центре большой cyft-
частицы рибосомы (рис. в. о). Таким обра­
зом, на этой стадии элонганционног о цикла обеспечиваетс я не только доставка субстрата ( аминоацил- тРНК) в рибосому, но и высо­
кая точность процесс а трансляции. Анало ­
гичным образом функционируе т белок eEF- 1 в эукариотическо й клетке. Втора я стадии элопТационнот и цикла — т р а н с п е п т и й о ц и я, т. е. реакция перенос и пептидильиог о остатка иа пептидил- тГ'НК, находяще йс я » Р- участке, нв аминокислот ­
ный остаток, связ анный с тРНК н Л - у ш с тке. Эти остатки сориентирован ы в пе пс и -
"""""""w™ * ы— -
» Рис, 7. Пространственные структуры комплексов фактора элонгации EF-Tu с тРНК и ГТФ (а) и фактора элон­
гации EF-G с ГДФ {6) тРНК и подобная ей часть белковой молекулы EF-G показаны сиреневым цветом. Стрелками показаны молеку­
лы ГТФ и ГДФ, связанные с ГТФ-связывающими доменами (изображены красным цветом) EF-Tu и EF-G соот­
ветственно дилтра нефе разы ом центре таким образом, | что С-концевая карбонильная группа в пеп-
' тидил-тРНК может атаковать аминогруппу аминокислотног о остатка в аминоацил-тРНК (рис. 6, б). Образование пептидной связ и энерге ­
тически не выгодно. Тем не менее в пеп-
тидилтра нефе раз ном центре рибосомы ре­
а кци я т ра нс пе пт ида ци и прот е ка е т бе з дополнительных энергетических затрат, так как карбонильна я группа В пептидил- тРНК находитс я в активированно м состоянии (на ее образовани е уже была затрачен а мо­
лекула АТФ при аминоацилировани и тРНК). Если рассматриват ь рибосому как фе р ­
мент, главные субстрат ы которого — ами-
ноа цил - и пе пт идил - т РНК, то ре а к ци я транспептидаци и — единственный процесс, который рибосома катализ ируе т сама без всяких дополнительных факторов. В результат е пептидилтрансфераэно й ре­
акции пептидна я цепь увеличиваетс я на один аминокислотный остаток, тРНК в Р-участке свободна, а пептидил-тРНК находится в А-уча-
стке (рис. 6, а). Такое состояние функциони­
рующей рибосомы называют претранслокаци-
онным. Треть я стадия элонгационног о цикла рибосомы — транс локация. Она катализиру­
ется еще одним представителем семейства G-белков — элонгационкым фактором 2 (обо­
з начаемым как eEF- 2 у эукариот и как G-фактор — у прокариот). В комплексе с ГТФ элонгационный фактор G (или его эукари-
отический аналог eEF-2) обладает высоким сродством к рибосоме, но он может связаться с большой субчастице й только после того, как рибосому покинул фактор Tu (eEF-lV &"> связано с тем, что места присоединения обоих элонгационных факторов к SOS (60S) субчастице перекрываются, по крайней мере частично. Боле е того, рентгеноструктурный ана­
лиз фактора G показал, что он удивительно похож на комплекс Tu- фактор а с амино-
ацил- т РНК (Ниссе н [Nissen] и др.; рис, ')• SHQCItHrtJ ЫЛКЛ НА РМБСХОМ1 - JA*/HQ4HtlАЬНЪ/Я *ГЛП ТРАНСЛЯЦИИ Зто сжнлСтЬп — замечательный пример не-
давно пткрытгн явлгнмд РНК-белковой ми­
микрии, когда пространственная структура (включая характер распределения повер­
хностных зарядов) белка или какой-то части его макромолекулы подобны определенной молекуле РНК, что позволяет этому бел­
ку выполнять функции последней (и наобо­
рот) Связывание комплекса элпнгационногп фактора G (eEF-2)-GTP С рибосомой вклю­
чает его ГТФаэную активность- Реакция гидролиза ГТФ каким-то образом сопряжена с процессом перемещения (транслокации) пептидил-тРНК вместе с соответствующим ей кодоном мРНК из А-участка в Р-учас ­
ток рибосомы и обеспечивае т его анергией. При этом тРН К -подобна л часть макромо­
лекулы EF-G (eEF-2), по-видимому, способ­
ствует вытеснению пептидил-тРНК из А-уча-
етка. на какое-то время занимая ее место. Одновременно Свободная тРНК транслоци-
руется из Р- в Е-участок. Лишь после этого комплекс EF- G ( eEF- 2) - GDP покидает рибо­
сому, спонтанно диссоцииру я на свободный белок и ГДФ (EF-G-цикл на рис. 6, а). Во многих учебника х события, проис ­
ходящие на стадии транслокации, излага­
ются в ином порядке, поскольку приведен­
ный выше механиз м был установле н только недавно ( Винт е рмайе р [ Wi nt e r me y e r ] и сотр., 1997) с помощью методов, которые позволяют изучать процесс биосинтез а белка в миллисекун д ном временно м интервале. Последне е обс тояте льс тв о весьма с у ще ­
ственно, так как за I с рибосома соверша ­
ет в средне м 20 элонгационных циклов. Есть основание полагать, что при транс ­
локации первым в Р- участо к попадае т пе п-
тидильный остаток вмест е с акцепторным концом тРНК, в то время как е е антико -
доновая петля е ще находитс я в А- участк е (см. статью О. О. Фаворово й «Строение транс ­
портных РНК»). Дале е в Р- участо к пе ре ме ­
щаетс я антикодонова я часть тРНК, протя ­
гивая при этом цепь мРНК по поверхност и рибосомы на один ко дон. Механика процесс а транслокации, т.е. механиз м работ ы рибосомы как моле куляр ­
ной машины, д о с их по р ос тае тс я не из ве ­
стной. Это с ос тавляе т одн у из основных и наиболе е пр ив л е ка т е л ь ны х н е р е ше н н ы х пробле м моле кулярно й биологии. Те рммв а цн я с инт е з а б е лк а Из вестно, что три из 64 кодонов, а име н­
но UAA, UAG и UGA, не ко д иру ют ка ку ю-
либо из аминокис ло т в полипе птидно й це пи белка. Их наз ывают стоп- ко дона ми, посколь ­
ку по па д а ни е люб о г о и з э т и х ко д о но в в А- участо к рибосомы с л у жи т сигнало м окон­
чания ( те рминации ) т ранс ляции. Те рминаци и т ра нс ляци и у прокарио т и выкод синтезированной полипептидной цепи белка из рибосомы обеспечиваются тремя белковыми факторами: RF-1, RF-2 И RF-3 (R от англ. ureLease» — освобождать) Факторы RF-1 и RF-2, связываясь С ри­
босомой, узнают по два терминирующих кодона — UAA и L1AG или UAA и UGA со­
ответственно. Фактор RF-3 — G-оеЛОК. т. е. он функционируе т в комплексе с ГТФ и обладает ГТФаэной активностью, которая проявляется только при связывании RF-3 е рибосомой. У эукариот фактор термина­
ции, обозначаемый eRF-1, узнает все три стоп-кодона. Недавно у эукариот также удалось обнаружит ь ГТФ-связывающи й фактор (eRF-З), участвующий в термина­
ции трансляции (Л. Фролова и др.). Последовательност ь событий, по-види­
мому, такова. Как только после последне­
го акта транслокации терминирующий во­
дой оказался в А-участке декодирующег о центра, с ним связывается фактор RF-1 или RF- 2 (eRF-1), катализирующий гидролиз сложноэфирно й связи между С-концом по­
липептидной цепи белка и тРНК, находя­
щимися в Р- участке. Далее с рибосомой связываетс я комплекс RF- 3 (eRF-3)-GTP, что служит сигналом для диссоциации ком­
плекса RF- l/R.F- 2 (eRF-1} с рибосомой. Этот процесс каким-то образом сопряже н с гид­
ролизом ГТФ. В итоге все участники собы­
тий — синтез ированный белок, тРНК и факторы терминации — покидают рибосо­
му. Чтобы начать синтез новой полипептид­
ной цепи белка, рибосома должна диссоци­
ировать на субчастицы. Необходимо отметить, что на рибосоме образуетс я собственно полипептидна я цепь белка. И хотя аминокислотная последователь­
ность (первичная структура) белка содержит всю необходиму ю информацию о его про­
странственно й с труктуре, правильна я и быстрая укладка полипептидно й цепи мак­
ромолекулы белка катализируетс я в клет­
ке специальными белковыми факторами у же после завершени я трансляции (см. статью Н. К. Наградовой «Внутриклеточна я регуляция формировани я нативной пространственно й структуры белков»). Большо е значение для фу нкцио ниро ва ни я и внутрикле точног о транспорт а белков имеет, кроме того, пост­
трансляционна я модификация отдельных ами­
нокислотных остатков ( например, их глико-
з илировани е или фосфорилирование). Литература • 1 Инге-Вечтомов С. Г Введение в молеку­
лярную генетику. М: Высш. шк., 1983. 2. Кнорре Д. Г., Мызина С. Д. Биологическая химия. М: Высш. шк., 1998. 3. Спирин А. С. Молекулярна я биология. Структура рибосомы и биосинтез белка. М: Высш. шк, 1986. И. Н. Шатский РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА БЕЛКОВ Введение Отдельные белки нужны живой клетке или вирус у в различных количествах и в раз но е время. Структурные белки, как, например, белки, которые входят в состав рибосо-к или дгро-люсол, требуютс я в боль­
ших количествах, а белки-регуляторы, кон­
тролирующи е активность генов, нужны в очень малых дозах или на короткое время. Решение вопроса о том, синтезироват ь ли какой-нибуд ь определенный белок или нет, ре шае тс я, как правило, на уровне регуляции транскрипции, т.е. путем вклю­
чения или выключения синтеза соответству­
ющей информационно й РНК ( мРНК) (см. Статью В. А. Гвоздева «Транскрипция и ме­
ханиз мы ре гуляци и активност и генов»). Очевидно, однако, что управление процес ­
сом транскрипции не може т ничем помочь, когда мРНК у же синтезирована, а необхо ­
димость в соответствующе м белке отпада ­
ет и его дальнейше е производств о оказы­
вается ненужным или даже вредным. Такая с итуаци я част о воз никает, когда с ре да, окружающа я клетку, резко меняется, -что в свою очеред ь требуе т изменения спектра с инт е з ируе мых белко в для адаптаци и к новым условиям. У бактерий этот вопрос решаетс я про ­
сто: бактериальные мРНК являютс я корот -
коживущими и быстро распадаются. Ре г у ­
ляция с инте з а белка путе м ра з ру ше ни я мРНК с уще с твуе т и у эукариот 1. Однако ме ханиз м ре гуляци и т ра нс ля ­
ции с помощь ю де г радаци и с оотве тс тву ­
ющий мРНК играе т у э укарио т второс те -
1 Так, мРНК, кодирующие белки-регул вто­
ры, которые контролируют рост и деление клеток (некоторые факторы транскрипции), содержат на своем З'-конце особые нуклеотидные после­
довательности, обогащенные, как правило, аде-
ниловыми и уридиловыми остатками- Наличие этих последовательносте й реако понижает ус ­
тойчивость мРНК к клеточным специализиро ­
ванным рибонуклеазаы-
пенную роль. Связано это с тем, что в от­
личие от бактерий с их относительно про­
стым механизмо м синтез а мРНК образо­
вание мРНК у эукариот является сложный многостадийным процессо м и занимает значительно е время (см. статью В. А. Гвоз­
дева «Регуляци я активност и гено» при созревании клеточных РНК»). Большинство эукариотически х мРНК тарактериэущт е я высокой устойчивостью, слабо атакуют­
ся рибонуклеазами и используютс я в клет­
ке много раз. Фактор времени оказывается еще более существенным для трансляции в процессе раннего эмбриональног о развития эукариот Первые деления оплодотворенной яйцеклетки происходят очень быстро, и главной «забо­
той» эмбриона является быстрый синтез асе новых молекул ДНК для возникающих в ре­
зультате деления новых клеток, В этой си­
туации мРНК и рибосомы запасаются зара­
нее, еще во время созревания яйцеклетки. Во время деления и дифференцировки кле­
ток отдельные классы мРНК по очереди всту­
пают в игру, и этот процесс целиком регу­
лируе тс я тем, как рибосомы используют мРНК, а не деградацие й последних. Сказанно е не означает, что регуляция использовани я у же существующе й мРНК рибосомами, или регуляция на этапе ини­
циации трансляции, характерна только для эукариот. Историческ и основные принципы регуляции трансляции были открыты и изу­
чены именно на прокариотически х систе­
мах, главным образо м на РНК-содержащи х бактериофага м (вирусах, поражающих бак­
терии). Су ще с т в у ю т д в е основные причины широког о использовани я прокариотами ре­
гуляции на этапе инициации трансляции. Пе рва я состоит в том, что многие бакте­
риальные мРНК в отличие от эукариоти­
ческих мРНК являютс я полицистронными. т. е. состоят из нескольких цистрочов, каж­
дый из которых кодируе т отдельный белов ( рис. 1). Это з начит, что на одной молеку­
ле мРНК име е тс я несколько участков can­
s' AUG SI SD' RBS1 GUG SI SD' RBS2 AUG SI SO* HBS3 рис. 1. Схематическое изображение бактериальной лолицистронной мРНК Зеленым цветом обозначены три цистрона с их инициирующими кодонами (показаны оранжевым цветом)« участками связывания рибосом (RBS). SD— последовательность Шаина-Далгарно; S1 — анхансер, связываю­
щийся с рибосомным белком S1. 1—3— цистроны. Масштаб не соблюден Р1П/ЯЩЯ* SMOCHHTli* ЫЛКОЙ 1M ;,ыпввия рибосом, и с кнжлого «:i них мо­
жет начинаться синтез своего Г/елке Со-
птнопгеиио количеств равных белков, счи­
тываемых с одной цепи молициетронной мГИК, должно быть, тем не менее, стри­
ги определенным, таким, как ;*то требу­
ется байтериалькой клетке. Втирай причини лаключается в том, что между мРНК и продутом ее считывания, белком, во мно­
гих случаях существует обратили сыпь: если данный белок вдруг перестает исполь­
зоваться клеткой, то он должен немедленно передать сигнал своей собственной мРНК для прекращения ее использования рибо­
сомой- То же справедливо и для случая, когда бактериальный вирус переключает­
ся с синтеза одних белков на синтез дру­
гих по мере прохождения цикла своего вос­
производства, причем при этом требуется сохранность молекулы вирусний РНК в целом. Проблему таких тонких подстроек кевоЭ' можно решить с помощью одного грубого механизма деградации мРНК. Поэтому впол­
не логично. Что наиболее частым путем регуляции синтеза белка является регули­
рование частоты продуктивного использо­
вании мРНК рибосомой. Для клетки проще всего делать это путем регуляции частоты связывания рибосомы СО специальным рай­
оном мРНК, прилегающим к стартовому кодону того или иного цнстрока, от кото­
рого собственно и начинается считывание информации мРНК для синтеза белковой цепочки {рис. 1). Этот участок связывания рибосомы сокращенно называют RBS (от англ. Rtbosome Binding Site). Устройство участков связывания рибосомы (RBS) у бактериальных мРНК Обязательным элементом RBS бактери­
альных мРНК являетс я собственно стар­
товый кодон, которым в большинстве слу­
чаев является триплет AUG, кодирующий метионин (см. статью С. Г. Инге-Вечтомова °Как читается генетический код: правила и исключения»). Реже вместо AUG могут использоваться GUG, UUG и даже извес­
тен случай, когда стартовым кодоном яв­
ляется AUU. Во всех случаях первой ами­
нокислотой синтезируемог о белка является метионин, а первой тРНК, попадающей в рибосому, — инициаторна я метионинова я тРНК. Таким образом, ко дон-анти ко доко­
вые соответствия не могут полностью оп­
ределять выбора стартовой точки для транс­
ляции того или иного цистрона мРНК. р ещающа я роль в выборе стартовой точ-
к и принадлежит нуклеотидам, окружаю-
"«ии стартовый кодон. Другим характерным, хотя и не строго обязательным, элементом прокнриотических RBS является так называемая последова­
тельност ь Шайни-Далгарно (Л'В-поеледо-
вительиогтп!!). непременным мотивом ко­
торой является тетрянуклеотид QGAti. SD-последовательность расположена в сред­
нем на расстоянии 7—№ куклептидпв перед стартовым кодоном. С помощью згой после­
довательности мРНК способна спариваться по принципу комплементарности с Я'-уча-
стком IBS рибосомной РНК (рРНК), явля­
ющейся основным структурным и функцио­
нальным компонентом малой (30S) субчастицы бактериальной рибосомы Когда такое связы­
вание происходит, стартовый кодон считы­
ваемого цистрона мРНК сразу оказывается в непосредственной близости от Р-участка 4 OS-субчастицы рибосомы, где и происходит его связывание с инициаторной тРНК. По­
мимо стартового триплета (чаще всего AUG) и SD-последовательност и в пределах RBS предполагается существование и других сиг­
налов инициации, однако они пока достоверно не идентифицированы. Существенную роль в выборе места ини­
циации белковой цепи играют так называ­
емые усиливающие сигналы инициации (эн-
ханегры), которые обычно располагаются уже за пределами собственно RBS, ио мо­
гут играть важную роль на этапе первич­
ного, возможно предварительного, связы­
вания бактериально й мРНК рибосомой. Широко распространенным у гран -отри на­
тельных бактерий является экханеер, ко­
торый связывается рибосомным белком S1. обязательным компонентом ЗОБ-субчастицы рибосом. Последовательность нуклестидов SI энхансера, обычно расположенног о в 30 нуклеотидах перед инициирующим кодоном (рис, 1), не имеет определенног о мотива. Характерной ее особенностью является от­
сутствие гуаниловых остатков и наличие большого количества уридиловых остатков, иногда перемежаемых адениловыми остат­
ками. Имеются и другие энхансерные по­
следовательности, однако до сих пор не выяснено, какие компоненты рибосомы их связывают. Известно, что характерной особеннос­
тью од н еще почечной РНК является способ­
ность к образованию вторичной структуры — внутримолекулярному спариванию своих звеньев с образованием «шпилек». Ясно, что для того, чтобы эффективно работать, ини-
циаторные сигналы, особенно SD-после -
довательногть и инициаторный KOOV)H, не должны быть вовлечены ь такие внутримо­
лекулярные спаривания. Таким образом, инициаторный кодон, SD-последовательность, усиливающие сиг-
калы инициации, и элементы вторичной структуры являются тени составляющими Рис. 2. трансляционное сопряжение, контролируе­
мое вторичной структурой прокарнотической двуци-
стронной мРНК з — рибосома связывается с инмциаторной облас­
тью первого цистрона в районе его инициирующег о триплета AUG1. при этом последовательнот ь Шай-
на-Далгарно второго цистрона не доступна для свя ­
зывания рибосомы вследствие внутримолекулярно­
го спаривания: б— трансляция первог о цистрона нарушает внутримолеку/шрное спаривание и откры­
вает доступ рибосомы ко второму цнстрону бактериальных мРНК, которые использу­
ются для регуляции синтеза белков с раз­
ных мРНК или же с разных цистронов од­
ной и той же молекулы мРНК. Воздействуя на эти элементы, клетка использует спе­
циальные механизмы, позволяющие пони­
зить fpenpecct ^ или повысить {активация) уровни синтеза тех или иных белков. Механизмы регуляции инициации трансляции у бактерий Общие принципы регуляции инициации синтеза белка у бактерий Все известные примеры регуляции ини­
циации синтеза белка для отдельных цист­
ронов мРНК бактерий подчиняются одному общему принципу: регуляция осуществляется путем закрывания—открывани я доступа рибосомы к RBS и/или его энхансеру. За­
крывание доступа осуществляется специфи­
ческими для каждого цистрона макромоле­
кулами, или трансляционными репрессорами, которыми могут быть как белки, так и не­
большие РНК. Соответственно участок мРНК, который закрывается репрессором, называ­
ется трансляционным операторси. Опера, тор. как правило, частично перекрывается с RBS, так что связывание с ним репрессо­
ра полностью предотвращает связывание ри­
босомы с мРНК А. Репрессия белками Классическим примером репрессии бел­
ками является регуляторный механизм, используемый РНК-соде ржа щими фагами для того, чтобы подавить синтез своего фермента репликазы на поздних стадиях инфекции. В геномной РНК фагов R17. MS2 Q и т.д. имеется всего четыре гена (цист­
рона), три из которых кодируют последо­
вательно А-белок, белок оболочки вируса и репликазу. Четвертый ген, ген лизиса перекрывается с С-концом белка оболочки и N-концевой частью репликазы и находится в другой рамке считывания. В целой моле­
куле фаговой РНК, в том виде, как она проникает в клетку, все RBS, кроме RBS белка оболочки, недоступны для рибосомы вследствие внутримолекулярног о спарива­
ния с другими участками РНК. RBS цист­
рона белка оболочки полностью открыт для присоединения рибосомы: SD и энхансер у него не вовлечены ни в какие внутримо­
лекулярные взаимодействия, а инициатор-
ный кодок хотя и находится ъ пределах внутримолекулярно й шпильки, но она не­
прочна и легко раскрывается. Поэтому ри­
босома инициирует трансляцию только ци­
строна белка оболочки и затем, синтезируя его, продвигается в сторону цистрона реп­
ликазы. По мере движения рибосома нару­
шает вторичную структуру, образованную за счет внутримолекулярног о взаимодей­
ствия инициаторного района репликазы и С-концевой части гена белка оболочки, в результат е чего RBS репликаз ы «откры­
вается» и становится доступным для связы­
вания рибосомы. Это явление получило название трансляционног о сопряжения; оно схематически представлено для случая дву-
цистронной мРНК на рис. 2. В результате включается синтез молекулы репликазы, которая начинает размножение (реплика­
цию) вирусной РНК, Понятно, что для продукции фага, осо­
бенно на более поздних стадиях инфекции, когда РНК уже реплицировалас ь и долж­
на «одеваться» в белковую оболочку, фер­
мента репликаз ы требуется гораздо мень­
ше, чем белка оболочки. Эта проблема решается фагом очень просто (рис. 3, a) BBS гена репликазы образует несовершенную и потому не слишком стабильную шпильку. Эта шпилька являетс я участком связывания (трансляционным оператором) белка оболоч­
ки, который выполняет роль трансляционного репрессора гена репликазы. предотвращая связывание ЗОБ-рибосомы. В отсутствие беля* РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗ* БЕЛКОВ № оболочки или при его низкой концентрации шпилька легко переходит в открытую фор­
му, я RBS гена репликааы получает воз­
можность связывать 3 OS-ряб псом у. Таким образом, на начальных стадиях инфекции, когда происходит репликация РНК, а кон­
центрация белка оболочки мала, репрессии гена репликааы еще нет. По мере накоп­
ления белка оболочки он. связываясь с RBS репликазы. полностью блокирует доступ 30S-рибосомы к S D-noc ледова тел ьности и AUG-кодону гена. Часто у бактерий встречается ситуация, когда какой-либо белок регулирует актив­
ность своего собственного цистрока. Такая регуляция называется аутогенной. Так, ДНК-полимераза бактериофага Т4 контро­
лирует уровень собственного синтеза, свя­
зываясь с трансляционным оператором своей мРНК (рис. 3, б). В состав оператора вхо­
дят SD-noc ледова те льность и расположен­
ная в 5г-еторону от него шпилечная струк­
тура, которая вносит основной вклад в образование комплекса между репрессором и оператором. Репрессор в этом случае не закрывает ин и циа торного ко до на. Похожий случай расположения оператора и связанного с ним репрессора имеется у мРНК, кодирующей треонил-тРНК-синтетаз у Ее трансляционный оператор «поэаимство-
Белок оболочки (репрессор) ч RBS репликазы фагаЯ17 (оператор) Комплекс репрессора с оператором Комплекс ДНК- полимеразы с оператором собственной мРНК RBS ДНК-полимеразы фага Т4 "* • Э, Примеры предотвращения трансляции про-
эриотических мРНК белковыми репрессорами ~ Репрессия RBS репликазы фага R17 белком его Олочки; 6— ауторепрессия трансляции ДНК-по-
"имераэы фага Т4 вал* у субстрата треонил-тРНК-синтетазы, треониновой тРНК, форму важнейшего эле­
мента ее структуры — антикодоновой шпиль­
ки, обеспечивающей взаимодействие тРНК с синтетазон. (Треонил-тРНК-синтетаз а при­
надлежит к классу ферментов, катализиру­
ющих реакцию аминоацилирования тРНК-
Подроонее о взаимодействии этих фермен­
тов с тРНК см. в статье О. О. Фаворовой "Транспортные РНК на первом (предрибо-
сомном) этапе биосинтеза белков».) Вслед­
ствие этого треонил-тРНК-синтетаз а способ­
на специфически связываться с оператором, Служа аутогенным репрессором для своей собственной мРНК. Предполагается, что в норме вся или по­
чти вся треонил-тРНК-синтетаз а находится в комплексе с тРНК. При появлении избытка свободной синтетазы она начинает взаимодей­
ствовать с оператором сыией мРНК, стерически закрывая при этом SD-noc л едовате льность. Считывание матрицы рибосомой после этого прекращается, и мРНК деградирует под дей­
ствием эндо- и экзонуклеаз. Поскольку трео-
нил-тРНК-синтетаз а существует в виде ди-
мера из двух идентичных субъединиц, то и оператор содержит не один элемент, подоб­
ный антикодоновому стеблю сериновой тРНК, а два. Аутогенная регуляция синтеза трео-
нил-тРНК-синтетазы, основанная на струк­
турном подобии субстрата синтетазы (тРНК) и трансляционного оператора ее мРНК, яв­
ляется ярким примером .молекулярной ми­
микрии. Впервые молекулярная мимикрия мРНК, как и вообще аутогенная регуляция трансляции, была открыта американским ученым японского происхождения М. Ному-
рой (М. Nomura) на рубеже 70-х—80- х гг. на Примере регуляции синтеза структурных белков рибосом E.colt. Известно, что в состав бактериальной рибосомы входят 54 различных белка. Из­
быточного количества рибосомных белков в клетке фактически нет. Таким образом, не­
избежно возникает вопрос, каким образом обеспечивается неизбыточное производство одинакового числа каждой из нескольких десятков белковых молекул. Основным (хотя, вероятно, не единственным) механизмом, при помощи которого клетка решает задачу не­
избыточного синтез а рибосомных белков, является механизм аутогенной регуляции. Роль трансляционных репреесоров выпол­
няют некоторые рибосомные белки, те, ко­
торые являются ключевыми в сборке рибо­
сомных субчастиц и соответственно «умеют» связыватьс я со специфическими участками рРНК. К таким белкам относятся, например, белки под названием S4, S7, S8. S15 малой рибосомной субчастицы и белки L5. L11 боль­
шой субчастицы. Важно, что контролируют эти белки не только свой собственный сии-
тез, но и синтез других рибосомных белков. Это достигается тем, что мРНК для боль­
шинства рибосомных белков полицистронны. и их трансляция регулируется по механиз­
му трансляционного сопряжения, описанного выше для РНК-содержащих фагов (см. рис. 2). Если несколько цистронов полицистройной мРНК связаны друг с другим трансляцион­
ным сопряжением, то достаточно заблоки­
ровать доступ рибосомы к одному из них (чаще всего к первому), чтобы выключить синтез всех остальных белков. Именно та­
кая схема регуляции и используется рибо-
сомными белкам и. Б. Репрессия а нти Смысловы ми РНК Как уже указывалось, трансляционным репрессором могут быть не только белки, но и РНК, которые способны комплемен­
тарно спариваться с RBS и предотвращать таким образом их связывание с рибосома­
ми. Эти РНК, как правило, сами ничего не кодируют, а служат для чисто регулятор-
ных целей. Поскольку они содержат участ­
ки, комплементарные мРНК (их икициатор-
ным районам), т.е. последовательности как бы «противоположног о смысла», то они получили название антиСмысловых. Регу­
ляция с помощью а нти смысловых РНК иг­
рает важную роль при синтезе белков внеш­
ней мембраны E.coli в ответ на изменение осмотического давлении среды и при ляции синтеза транслозаэ. Тралстюз ^егУ~ ферменты, которые отвечают за п^3**^ вырезания из генома так называемы*1* бильных генетических элементов (у si М°~ рий они часто определяют их лекаоетП~ ную устойчивость) и их внедрение в л участок генома. "Иг щ Таким образом, характерной осел,, стьк> регуляторных механизмов у 6ак7= Н°" является существование целого ряда ных специфических репрессоров ко*1*3" лирующих трансляцию каких-либо конк ных генов или группы генов. Каким п^' происходят глобальные изменения бе лкт ^ синтеза, не совсем ясно. Скорее всеггГ*0 новную роль здесь играет согласован^ регуляция транскрипции мРНК nDv механизмы регуляции трансляции убак™' рий практически не известны. Ме ханиз мы регуляци и инициации транс ляци и у эукарио т Принципы регуляции трансляции у эукариот У эукариот, и в частности у млекопи­
тающих, известен лишь один случай транс­
ляционного репрессора и соответствующе­
го трансляционног о оператора. Зато для мРНК-свцзывающ»не белки Ч ^ ^ « "V4A \/\ЛГ*У Кодислшшая ofinarn, З'-НТР поли А поли А-свяэыеающие белки поли А-явост Рис. 4. Общее строение моноциетронной эукэрио-
тической мРНК (а) и структура кэпа на ее Б'-конце (б) а — в отличие от прокариотических эукариотические мРНК находятся в клетке в комплексе с белками. Инициирующий кодон обозначен розовым цветом. 5'-НТР и Э'-НТР— 5'- и 3' нетранслируемые районы эукариотических мРНК; б— 7-метилгуанин связан с первым (5') эвеном мРНК необычным 5'-5'-спосо­
бом. Первое основание мРНК обозначено как R Пун­
ктир обозначает продолжение цепи мРНК t _ Я/WMU" ЙИХ* И'( Л 6£ЛКОё ч1 ¥ кари,п - характерна глобальная рсгуляцин трансляции чер*>а изменение активност и инициирующих факторов трансляции. При ­
чина разных способов регуляции трансля­
ции про- и эукариотически х мРНК хриетсл в различии их строения и способа функци-
„ниримиия. Обидет 1-тригнш? ч Р Н К эукириотически х организмов Эукармотически е мР Н К в отличие от прокариотических моноцистроины, т. е. име­
ют только один участок начала трансляции и—ис 4, а). У большинства мРНК первый от 5'-конца AUG- к одо н оказываетс я иниции­
рующим. HBS у мРНК животных, если по­
нимать под ним. к а к и в случае бактерий, небольшой участ о к мР НК, вк лючающи й AUG- кодон, характеризуетс я неслучайным распределение м нуклеотидов, однак о зна­
чение этого факт а пока совершенно но ясно. Никаких SD- подобных последовательносте й он не содержит. Единственным общеприня ­
тым и универсальным сигналом инициаци и является так называема я нэп- структур а (от англ. *сар» — шапочка). Она представляе т собой метилированный г уанозин, связанный Через трифосфатну ю связь с 5'- концом мРН К (рис. 4. 6). Кэ п отделе н От инициирующег о кодона 5'- нетран с лирусмо й област ь», к о ­
торая може т насчитыват ь многие десят к и, а то и сотни нук леот идных остатков. На З'-конце вслед за кодирующей об­
ластью мРНК располагается 3*-кетрансли-
руемая область, У подавляющего большин­
ства эукариотических мРНК она включает длинный полнадениловый «хвост» (около 200 адениловых остатков). Предполагается, что за счет взаимодействия 3'- по ли А- хвоста (и связанных с ним белков) с 5'- нетранс лиру -
емой областью (в свою очередь связанной с факторами инициации) мРНК может замы­
каться в кольцо, что обеспечивает более эффективное перемещение рибосомы пос­
ле окончания синтеза предыдущей полипеп­
тидной цепи в участок инициации синтеза ее следующей копии. Механизм инициации синтеза белка у эукариот Различия в строении бактериальных и эукариотических мРНК, по-видимому, оп­
ределяют и различие в механизмах иници­
ации синтеза белка. Конкретно эти разли­
чия отражаются прежде всего в способах, с помощью которых малая рибосомная суб­
частица находит инициирующий кодов на «олекуле мРНК. Если у бактерий решающая роль в поиске инициирующего кодона при­
надлежит самой рибоеомной субчастице (ее 16S рРНК и белку S1), то у эукариот, от простейших до человека, главную работу в Этом поиске выполняют факторы инициации. У млекопитающих известно окмло десятка инициирующих факторов. Основную роль в поиске и закреплении малый |4nSl рибоеом­
ной субчастицы на инициирующем кодоне *при участии ннициаторной тРНК1 играют эукариотическне инициирующие факторы (обозначаются как a-elF-l 2, 3, 4А. 4В. 4Е, и 4G. eI F- 3 -— огромный белковый комплекс, который довольно прочно £вязывается с 405-субчастице й и служит как бы мостиком между ней и комплексом фякторпв 4 А, 4Е и 4G. Этот комплекс, носящий название фактор 4F, устроен так. как это показано на рис Ь, а. Маленький фактор 4Е связан с N-концевои частью 4С Он нужен для того, чтобы связывать кэп- етруктур у на конце мРНК и тем самым осуществлять первона­
чальную привязку матрицы к 40S-субчастице рибосомы- 4А — это хеликаза, которая свя ­
зана с С-концевой частью большого факто­
ра 4G. Хспикаэамн нвзиванугся белки, ко­
торые, затрачива я энергию расщеплени я АТ Ф, разворачивают двутяжеву ю ДН К или внутримолекулярны е шпильк и в Р Н К (о хеликаэах см. т акже в статье О. О.Фаворо-
вой «Репликаци я ДНК»), функци я хелика-
зы 4А состоит в том, чтобы разворачиват ь шпильк и в районе мРНК. предшествующе м и вк лючающе м ее RBS. дабы вторична я структур а не мешала взаимодействию эука-
риотическог о RBS с рибосомой. В этой ра­
боте ей помогает фактор 4Б, который, по-
видимому, т а к же имеет свое место посадки на eI F- З ( рис. 6). Наконец, сам фактор 4G иг рает множество ролей. Помимо того, что Место расщепления протеазами У вирусов полиомиелита и ящура Район Связывание связывания кэпа мРНК с фактором elF-3 и кэп-независимы ми мРНК фосф^ои*'*!"" звание киназой —*-
PKR о • , - Связывание инициаторной тРНК — Связывание ГТФ/ГДФ Рис.5. Факторы инициации трансляции, играющие ключевую роль при регуляции белкового синтеза у эукариот а - строение фактора elF-4F - комплекса факторов 4А, 4Е и 4G: 6 - строение фактора elF-2. состоящего из трех неидентичных сугледаниц о, & в ъ На рисун­
ке указаны функции каждой из субъеданиц. Поясне­
ния см. в тексте НОМНУЛНРНАЯ Z*2*x*. Рис. 6. Схема образования 405-инициируюшегО комплекса для кап-зависимой инициации Фактор e(F-4E связывается с кэпом эукариотичесной мРНК {стадия /) и обеспечивает присоединение мРНК к 40S рибосомной субчастице, содержащей метионил-тРНК в комплексе с фактором elF-2 и остальные факторы инициации (elF-З. -4А, -4В. -4G) (стадия 2). Хеликаэа (фактор elF-AA) разворачивает шпильки в мрМК и уклады­
вает ее на 40S-субчастицу, что приводит к взаимодействию AUG-кодона С антикодоном инициаторной метио-
ни новой тРНК (стадия 3) он держит кап-связывающий фактор 4Е и хеликазу 4А, он своей центральной частью крепится к eIF-З. Кроме того, и это очень важно, в центральной части 4G содержит­
ся участок, который может связывать спе­
цифические РНК-структуры. Эти специфи­
ческие структуры есть только у некоторых иРНК, в основном вирусного происхожде­
ния. Они расположены перед инициирующим А UG-кодоном и выполняют роль инициатор-
ных сигналов. Очевидно, что такие особые мРНК не нуждаются в кэпе и им не нужен фактор 4Е. Они могут привлекатьс я на 405-субчастицу при полном подавлении фун­
кции кэп-связывающег о фактора 4Е. Одновременно на 4OS рибосомной суб­
частице сидит фактор eIF-2 (рис. 5, б), ко­
торый при участии ГТФ удерживае т ини-
циаторную метиойил- тРНК. Последня я «дожидается» того момента, когда иници­
ирующий кодон (как правило, AUG) будет предоставлен ей для кодон-антикодоново -
со спаривания. У тройного комплекса, eI F- 2-
ГТФ- метионил- тРНК, есть свое независи­
мое место посадки на 408-субчастице, хотя фактор 3 весьма способствует такому свя­
зыванию (рис. 6). Инициация синтеза полипептида у эука-
риот начинаетс я с того, что свободный фактор 4Е «захватывает » мРНК эа кэп-ст-
руктуру и присоединяетс я вместе с мРНК к N-концу фактора 4G. Последний уже на­
ходится на 4 OS-субчастице рибосомы. Тем самым 5'-концевая негранелируемая область мРНК оказываетс я вблизи активных цент­
ров рибосомы. Далее происходит некое со­
вершенно непонятное в настоящее время действо с участием хеликазы 4А и ее вспо­
могательного фактора 4В, которое требу­
ет гидролиза АТФ. Предполагается, что при этом происходит разворачивание внутри­
молекулярных шпилек (вторичной структу­
ры) мРНК, включающих RBS и соседние с ним участки, в результат е чего RBS по­
лучает возможност ь уложиться в соответ­
ствующий активный центр 4OS-субчастицы. В этот же момент, по-видимому, инициа­
тор на я метионилова я тРНК «зацепляется» своим антикодоном за инициирующий ко­
дон мРНК, приводя к образованию проме­
жуточног о комплекс а 40Б-субчастиц ы с мРНК и метионил- тРНК. Далее остается присоединит ь к нему большую рибосомную субчастицу, что и происходит при участии епгллцмя ЁНОСМНТЕЗЛ ъёлнов 411 • факторе e] F- 5 Образование этого полнп^, I или 80S-инициирующег о комплекса сопро-
I нОЖДвРТСЯ УХОДОМ С pt l f f l l COMH ВСеН ИНИЦИ. I ируНТШИЯ фа к т о р о в И ГИДроЛИ.ТОМ Г Т Ф. СВЯ-
I данного с фактором eI F- 2 В результат е этой последней реакции инициирующая метионил- тРНК попадает в р-участок рибосомы, a eI P- 2 8 комплексе с ГДФ. образовавшимся после гидролиза ГТФ. покидает рибпсому. Л ля повторного исполь­
зования eI F- г должен опять связать ГТФ, только ппсл* этого он сможе т образоват ь тройной комплекс с мР Н К и иницнаторыой метионил- тРНК. Однак о заменит ь Г ДФ на ГТ Ф без посторонней помощи он не может, поскольку Г Т Ф связывается с фактором го­
раздо слабее, чем ГДФ. В этом пбмене ему помогает специальный обменивающи й фак ­
тор eI F- 2B. Это большой белок, состоящий из 5 разных суб-ьединиц. Факто р 2В перио­
дически связываетс я с eI F- 2, образуя ком ­
плекс, в котором Г ДФ связан гораздо сла­
бее. Это способствуе т замене Г Д Ф на Г Т Ф и связыванию т РНК. Регуляция активност и кш- гвяэывающег о белка 4Е Большинство известных случаев общей регуляции белкового синтеза у эукариот, в особенности у животных, связано с из­
менениями в активности кэп-свяэывающе -
го фактора 4Е и ме ти они л-тРН К-связыва­
ющего фактора eIF-2. Для того чтобы 4£ был активен в свя­
зывании кяна мРНК, он должен быть фос-
форилирован: его остаток серина в поло­
жении 209 должен нести фосфатную группу. Кроме того, в животных клетках существует специальный ре пресс о р для 4Е, который называется 4Е-ВР. Связываяс ь с 4Е, реп-
рессор выводит его из игры: в комплекс е с 4Е-ВР 4Е не способен связыватьс я ни с кэпом, ни с фактором инициации 4G. В про­
тивоположность ситуации с 4Е фосфорили -
рдвэние реп ре Ссора приводит к его обра­
тимой ина кт ива ции, т. е. он пе ре с т а е т связываться с 4Е, Активность киназ, фосфорилирующи х эти белки, прямо зависит от условий и фаз ы роста клеток. Например, при увеличении содержа ­
ния в среде гормонов (например, инсулина) или ростовых факторов уровень фосфорили-
рования фактора 4Е и его репрессора заметно возрастает. Как следствие обоих этих про­
цессов концентрация активного 4Е возрастае т и он снабжает 40Б-рибосомы большим чис ­
лом молекул мРНК, синтезированных клет ­
кой заранее, но не участвовавши х еще в синтезе белка. Отмечено, что в момент делени я ( ми­
тоза) животных клеток синтез подавляющег о числа белков рез к о снижается. За че м это нужно к л е т к е, не в полн е я с но, одна к о показано, что по крайней м*ре частично такой эффект обусловлен дефосфорилири-
аанием фактора 4Е. То же самое происхо­
дит, когда клетка попадает в условия стрес­
са, например испытывает тепловой шок. Актиьност ь 4Е при этом резко падает, а активность его репрессора 4Е- ВР — возра­
стает- Таким образом, состояние иниции­
рующег о фактора 4Е является одним из основных регуляторов использования мРНК в клетках животных. Если искусственно, с помощью увеличении в клетке дозы гена для 4Е. увеличить содержание этого фактора в клетке, то это приводит к злокачествен­
ной трансформации Объясняется это тем, что в клетк е повышаетс я концентраци я особых белков протоон ко генов, инициация транс­
ляции которых в норме проходит весьма неэффективно. Зависимостью клеточных мРНК от кэп-
связывающег о фактора весьма успешно пользуются некоторые животные вирусы. Ярким примером здесь могут быть малень­
кие РНК-содержащие вирусы, или тшкор-
Нйвиггьсы. Наиболее известные из них, та­
кие как вирус полиомиелита и гепатита А у человека и вирус ящура у домашнего скота, вызывают опасные заболевания- Ге- ^ ноиные РНК зтих вирусов одновременно ^Ш являются и вирусными мРНК, кодирующими ^ В вирусные белки. Эти РНК не имеют нэпа В на 5'-конце, и их инициация трансляции не V зависит от кэп-с в взывающего фактора 4Е. Ч Пи кор на вирусные РНК имеют в пределах своих 5г-нетранслируемых районов специ­
фические участки, которые связываются с центральной частью фактора eIF-4G 1рис. 5, а). Вследствие этого сам 4G, а не кэп-свя-
зывающий фактор 4Е. связывает пи корна-
вирусные РНК с 405-субчастицей. Более того, в РНК вирусов полиомиелита и ящу­
ра закодированы специальные протеаэы, ко­
торые отщепляют от 4G его N-концевую часть, к которой как раз и крепится 4Е. Тем самым трансляция собственых мРНК клет­
ки резко подавляется, рибосомы и иници­
ирующие факторы освобождаютс я и обслу­
живают уже только потребности вируса в синтезе белков. Относительной независимо­
стью от кэпа обладают и многие другие ви­
русные РНК, в частности мРНК вируса грип­
па и аденовирусов. Регуляци я активност и фактор а инициаци и 2 (e.IF-2) Чтобы воспрепятствоват ь размножени ю и распространени ю вируса, клетки живот ­
ных отвечают на многие инфекции синте­
зом белка интерферона, который способствует общему подавлению способности синтезиро­
вать белки, как свои, так и вирусные. Этот способ регуляци и част о связа н с изменением активности фактора инициации 2. t i l НОЯЕНУЛЯРНЛЯ 6ИОЛОГНЯ Фактор состоит из трех субъединиц ar [J и у (см. рис. 5, б>. у-Субъединица связывает ГТф, ина же вместе с р-субъединице й при­
нимает участие в связывании инициатор-
ной тРНК. а а-субт»единица играет регу-
ляторную роль. После каждого очередного раунда инициации eIF-2 должен поменять ГДФ на ГТФ с помощью фактора 2В (см. выше). Если он этого не сделает, то не сможет на­
чать нового раунда инициации. На этом об­
мене и основана регуляция активности фак­
тора eIF-2, а следовательно, и регуляция способности клетки к инициации синтеза белка а целом. Интерферон способствует синтезу специ­
альной кнназы — протеинкиназ ы R (PKR), которая исходно образуетс я в неактивном состоянии. При связывании с двуцепочечной РНК (дцРНК) эта кинааа становится способ­
ной к самофосфорилировани ю (аутофосфори-
лированию), В результате аутофосфорилиро -
вания киназа PKR превращаетс я в активный фермент, который начинает фосфорилироват ь а-субъединиц у фактора eI F- 2 по серино -
вому остатку 51. Это приводит к драма ­
тическим событиям: фактор eIF- 2 образуе т прочный, мало обратимый комплек с со своим обменным фактором 2В. Такой комп­
лекс не активен и не может обмениват ь ГДФ на ГТФ и связыват ь метионил-тРНК. Более того, поскольку фактора 2В в клетке в 3 раза меньше, чем eIF-2, то достаточно профос -
форилироват ь всего 1/3 молекул фактор а eIF-2 по его а-субъединице, чтобы вывести из строя весь обменный факто р 2В, имею­
щийся в клетке. Мы видим, что дцРНК запускае т каска д событий, связанных с активность ю киназ ы PKR. Откуда при инфекции берутся дцРНК? Для РНК-содержащи х вирусов ими могут быть промежуточные репликативные предшествен ­
ники вирусных РНК. Дл я ДНК- содержащи х вирусов, например для аденовирусов, они образуются в результате транскрипции од­
ного и того же участка ДНК в двух направ­
лениях. дцРНК не только активируют кина-
зу PKR, но и способствуют синтезу самого интерферона, тем самым замыкан Описыва­
емый регуляторный цикл. Вирусы в свою очередь изобрели свои методы борьбы с этим защитным клеточным механизмом. Как правило, они связаны с подавлением активност и киназы PKR или процесса ее активации аутофосфорилирова -
нием. Аденовирус для этой цели синтезиру­
ет специальные РНК небольшого размера VA I и VA И РНК. Эти РНК, связываясь с PKR, препятствуют ее взаимодействи ю с дцРНК, а следовательно, и активации ки­
назы путем аутофосфорилирования. Вирус гриппа действуе т по-другому; он включае т какой-т о механизм, который ак­
тивирует клеточный белковый реп рессор для PKR. Вирус осповакцины «выпускает » сра­
зу 2 специфически х вирусных белка, один из которых блокируе т непосредственно PKR, а другой «ловит» и блокируе т образующие ­
ся в клетке вирусные дцРНК, не давая им активироват ь киназу. Регуляци я трансляци и с помощью фос-
форилировани я а-субъединиц ы eIF- 2 наблю­
даетс я не только при вирусной инфекции, но и при стрессовых воздействия х на жи­
вотные клетки, а т а к же при включени и клеткой программы апоптоз а (программи­
рованно й клеточно й смерти). Наконец, у дрожже й тот же механиз м ле жи т в основе рег уляци и активност и генов, отвечающи х з а биосинте з аминокислот. Литература 1. Лъкшк Б. Гены. Пер. с англ. М.: Мир, 1987, с.71—130-
2. Спирин А. С. Молекулярна я биолотия-
Структура рибосомы и биосинтез белка. М/. Высш. шк., 1986. Н* К* Наградота ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФОРМИРОВАНИЯ НАТИВНОЙ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ В в е д е н и е Синтезируемы* рибосомами полипелтид-
ные цепи, образованные в результат е ЛУС -
ледлват?льног о соединения аминокислот ­
ных остатков, представляе т спйой к а к бы полшигтью развернутые Толковые молекулы. Для того чтобы оелок приоГфел присущи е сну функциональные свойства, цепь дол ­
жна определенным образч>м свернутьс я в пространстве, сформировав функциональн о активную («нативную»! структуру. Несмотря на громадное число теоретическ и возмож­
ных для отдельной аминокислотно й после­
довательност и пространственных структур, сворачивание к аждог о белк а приводит к образованию единственно й нативной к он -
формации Т а к и м образом, долже н суще ­
ствовать код* определяющи й взаимосвяз ь между аминокислотно й последовательнос ­
тью полипепт идно й цеп и и т ипо м про ­
странственно й структуры* котору ю она об-
раз ует. Выяснени е эт ой вз аимосвяз и — нерешенна я проблема, важност ь которо й трудно переоценить. Работы по изучению сворачивания бел­
ка были начаты около полувека назад. На­
копленная информация, которая была по­
лучена главным образом при исследовании pacThupuB отдельных ичищекных белков, позволила заключить, что образование пространственно й структур ы — процесс спонтанный, не требующи й ни дополни­
тельной информации, ни источник а энер­
гии. Предпилаталось, что эти выводы при ­
менимы т а к же и для сворачивания белков внут р и к ле т к и г Однак о, к а к это част о случаетс я в биологии, последующи е от ­
к рыт и я заставил и от казат ьс я от такой лог ик и; они показали, что процесс сво­
рачивания белка in vivo не может считать­
ся ни спонтанным, ни энергонрлависимым-
Благ одаря существующе й внутри к лет к и высоко координированно й системе рег у ­
ляции, полипептидна я цепочк а с самог о момент а своег о «рождения*, сходя с ри ­
босомы, попадае т под контроль факторов, которые, не изменяя специфическог о пут и сворачивания, определяемог о последова ­
тельностью аминокислотных остатков» или \ 2^- Элементы вторичной структуры Элементы супервторичной структуры Агрегат ^ "Расплавленная глобула" белка Нативная третичная структура белка Р- с. 1. С« м а « о р ^ - н и и развернутой лолипелтидно* цепи в наткнуто к о н фо р о к, белка, с о с т о й и. Остальные пояснения— в тексте 114 первичмай структурой белка, обеспечивают оптимальные условия для быстрог о и эффективног о образования его нативной пространственной структуры. Ст ади и образовани я пространственно й ст рук т ур ы белк я Как показали результаты рентгено-
структурного анализа белковых кристал­
лов, пространственная третичная) струк­
тура каждого белка характеризуетс я сочетанием элементов вторичной струк­
туры (а-спнралей. р-тяжей), а также гиб­
ких участков полипептидной цепи, назы­
ваемых петлями. Способность того или иного участка полипептидной цепи обра­
зовывать элемент вторичной структуры (на­
пример, свернуться в сс-спираль| зависит от характера аминокислотной последователь­
ности данного отрезка цепи- Таким образом, число и расположение а-спиралей, (J-тяжей и петель по ходу полипептидной цепи раз­
личны у разных белков и зависят от пер­
вичной структуры, определяемой последо­
вательностью колонов (кодовых «слов») мРНК. Согласно современным представлени­
ям, процесс сворачивания белковой моле­
кулы характеризуетс я иерархией событий (рис. 1). Вначале очень быстро (за милли-
еекунды) формируютс я элементы вторич­
ной структуры, служащие как бы «за­
травками» для образования более сложных архитектурных мотивов (стадия J). Второй стадией (также происходяще й очень бы-
стро) являетс я специфическа я ассоциация некоторых элементов вторичной структу­
ры с образованием супервторично м струк­
туры (это могут быть сочетания несколь­
ких ое пира ле й, нескольких р- тяже й либо смешанные ассоциаты данных элементов) (рис. 1. стадия 2), Следующий этап, играю­
щий важнейшую роль в формировании уни­
кальной «архитектуры» белка, — образо­
вание специфически х контакто в между участками, которые значительн о удале ­
ны один от другого в аминокислотно й пос­
ледовательности, но оказываютс я сближен­
ными в третичной структуре. Полагают, что контакт ы формируютс я главным об­
разом за счет гидрофобных взаимодей ­
ствий, обусловленных сближение м непо-
лярных групп и вытеснение м молеку л воды, расположенных межд у ними. Для формировани я уникальной пространствен ­
ной структур ы каждог о белка необходи­
мо, чтобы образовалос ь определенно е (оп­
тимальное в каждо м случае ) число таких специфических контактов. В ходе свора­
чивания возможны ошибки, образование МУПЬНУПЯРНАЙ Еиаисгт «неправильных» контактов; в этом случае происходит перебор разных вариантов структуры до тех пор, пока не будет до­
стигнут тот единственный вариант, кото­
рый соответствует функционально актив­
ному состоянию данного белка. На пути, ведущем от образования эле­
ментов супервторичной структуры к окон­
чательному сворачиванию цепи в компак­
тную глобулу, имеется промежуточная стадия (рис. 1, стадия 3), состоящая в фор­
мировании основных элементов третичной структуры (специфическог о сочетания а-спиралей, р-тяжей, соединяющих их пе­
тель) и образовании гидрофобного ядра молекулы Молекула приобретает простран­
ственную структуру, близкую к структу­
ре нативного белка. Вместе с тем ока еще не обладает присущей данному белку фун­
кциональной активностью. Это состояние, получившее название «расплавленная гло­
була*, отличается от нативного меньшей степенью упорядоченности структуры;на рис. 2 схематично показано, что неполяр­
ные группы, формирующие гидрофобное ядро молекулы, «упакованы» недостаточно плотно. Отсутствие ряда специфических взаимодействии приводит к изменению ори­
ентации подвижных петель, в целом мо­
лекула более лабильна и склонна к «сли­
панию» с другими такими же молекулами с образованием агрегатов. Такая неспеци­
фическая агрегация (стадии 5 на рис. \) может уменьшать число молекул белка, находящихся на правильном пути свора­
чивания (стадия 4 на рис. 1). т, е. снижать эффективност ь этого процесса. Как пока­
зали модельные эксперименты, проведен­
ные in vitro, образование «расплавленной глобулы» происходит значительно быстрее, чем ее переход в нативную структуру, ре-
Рис, 2. Схематическое изображение структур »рас-
плавленной глобулы- и нативного белка Элементы вторичной структуры представлены Дву­
мя спиральными участками (цилиндры). Заштрихо­
ванные участки изображают неполирные группы ами­
нокислотных остатков [из: Ptitsyn, О. В. In: Protein Folding. N.Y.: W.H.Freeman. 1992. p-2451 ы„,тнкмч>*»Ая тгпяций ЯЮРНМРПВАННВ платной перегоне татноя СГРИГГИ>Ы пиков _У* акция 4 (связанная с перебором ралных к,информации) являеп'я. таким nf.pa.soM, самой НРДЛГННИ * стадией сворачивании, ограничивающей скорость всего процесса Вероятность агрегации сильно возрас­
те т iipn повышении температуры и кон­
центрации белка, пи;*т(1иу эффективное ^тюнт;1ннн>е сворачивание полипептидной пени происходит в разбавленных раство­
рах и при нллкнх температурах. Обраща­
юсь к ситуации, имеющей мести in vtvn, мы должны признать, что условия, суще­
ствующие в клетке, сильно отличаются по этим параметрам. И вместе с тем в физио­
логических условиях вновь синтезируемые пол и пептидные цепи сворачиваются дос­
таточно быстро и эффективно. Следователь­
но, в клетке должны существовать специ­
альные механизмы регуляции процесса сворачивания Прежде чем перейти к рассмотрению этих механизмов, отметим, что изобра­
женная на рис. 1 с хе м описывает простей­
ший случай сворачивания полипептидной цепи, кодируемой непрерывным геном. Многие гены эукариот прерывисты, т.е. состоят из отдельных акзонов, кодирующих автономные элементы укладки полипептид-
ной цепи, и разделяющих их некодирую-
щих цитронов (см. статью В.А.Гвоздева "Регуляция активности генов при созрева­
нии клеточных РНК-). Участки полипеп­
тидных цепей таких белков, кодируемые разными экаонами, сворачиваютс я неза­
висимо друг от друга, по разным путям и с разными скоростями, образуя после сворачивания глобулярные структуры, называемые доменами- Экзоны могут со­
ответствовать участкам доменов или же отдельным белковым доменам, каждый из которых представляет собой функциональ ­
ный сегмент белковой молекулы, облада­
ющий определенной биологической функ­
цией. Формирование дативной структуры белков, состоящих из двух или более до­
менов, усложняетс я за счет дополнитель ­
ной стадии— установления специфичес ­
ких контактов между доменами. Ситуация еще более усложняется, когда функцио­
нально активна ол иг ожер но. я форма бел­
ка (т.е. форма, состояща я из нескольких полипептидных цепей, кажда я из которых после сворачивания образуе т так называ ­
емую субъединицу). В этих случаях добав­
ляется еще одна стадия — установление контактов между субъединицами, приво­
дящее к формировани ю четвертичной структуры белка. Хотя возникновени е междоменных и межсубъединичных контактов может ока­
зать определенное влияние на скорость и эффективност ь сворачивания поли пептид­
ной цепи, этот аспект проблемы мы рассмат­
риват ь не Пудем. сосредоточив внимание на простом случае сворачивания отдельного домена Механизмы регуляции процесса сворачивания полипептидно й цепи в клетке Согласно современным представлениям, клетка располагает по крайней мере дву­
мя типами таких механизмов. Механизмы первого типа основаны на повышении ско­
рости превращения «расплавленной глобу-
иы. в нативную структуру (стадия 4 на рис. 1), второго— обеспечивают защиту частично свернутого белка от неопецифи-
чеекой агрегации, обозначенной на рис 1 как стадия 5. Ферменты, ускоряющие процесс сворачивания Как уже отмечалось, установление «оп­
тимального набора» специфических взаи­
модействий, стабилизирующих нативную кпнформацию белка (рис. 1, стадия 4), про­
исходит относительно медленно, что оп­
ределяется невысокой скоростью необходи­
мых структурных перестроек. К их числу относится цис/тиране-изомеризаци я пеп­
тидной связи, предшествующе й остатку пролина (рис. 3, II). Поскольку тпранс-кон-
формация более стабильна, она преобла­
дает во вновь синтезированной полипеп­
тидной цепи. Однако для образования нативной структуры белка необходимо, чтобы около 7% связей, образованных ос­
татками пролина, изомеризовались в цис-
конформацию. Эта реакция, приводящая к повороту цепи на 180" вокруг C-N-связи, идет чрезвычайно медленно. In vivo она ускоряется благодаря действию специаль­
ного фермента — пептидилпролил- чис/ т р а не - изомера зы. Второй фермент, ускоряющий процесс сворачивания,катализируе т образование и изомеризацию дисульфидных связей. Он локализуетс я в просвете эндоплазмати -
ческого ретикулума и способствуе т сво­
рачиванию секретируемых клетками бел­
ков, содержащих дисульфидные мостики (например, инсулина, рибонуклеаэы, им­
муноглобулинов). Рис.3, I поясняет роль этого фермента в образовании дисульфид­
ных связей, стабилизирующи х нативную структуру белка, и в расщеплении «не­
правильных» S-S-мостиков. Характерная особенность обоих фермен­
тов состоит в том, что они не способны связыватьс я с нативными белками; их суб­
страты имеют частично развернутую струк­
туру, близкую к состоянию «расплавленной глобулы». Ускоряя стадии, лимитирующие SH HS V^ir снг c=o I H N -
ТРАНС Рис.3. Реакции, катализируемые ферментами, ускоряющими процесс сворачивания белка i V!^ A e"c t B ™ "Мтеиндисульфидиэомераэы ( р _ 6 e „ M i Е _ фв р ме н т ). д _ wl f C/,eHHe S H ^ дисульфидной группой активного центра фермента ( Г а - образование смешанного дисульфида а,- обоа-
эование дисульфидного мостика в молекуле белка и восстановленной формы ферменте) Б - изомеризация дисульфидной группы в молекуле белка [ И - образование смешанного дисульфида 26- образование но­
вого дисульфидного мостика в молекуле белка). II- реакция, катализируемая пелтидилпролил-иисЛтинс-
изомераэой ^ скорость сворачивания, ферменты способ­
ствуют приобретению белком нативной структуры, снижая риск протеолитической деградации и агрегации лабильных проме­
жуточных форм. Специальные белкн, увеличивающие эффективность сворачиваема полипептидной цепи в натнвиую конформацию В середине 80-х гг. началась новая эра в исследовании механизмов регуляции сво­
рачивания белков in vivo. Было обнаружено, что в «летке существует особая категория белков, основной функцией которых явля­
ется обеспечение правильного характера сворачивания полнпептидкых цепей в на-
тивную структуру. Эти белки, связываясь С развернутой или частично развернутой Конформацией полипептидной цепи, не дают ей «запутаться>>, образовать непра­
вильные структуры. Они удерживают ча­
стично развернутый полипептидный клу­
бок, способствуют его переносу в разные субклеточные образования, в также созда­
ют условия для его эффективного свора­
чивания. Эти белки получили название 'мо­
лекулярные шапероныв, образно отражаю­
щее их функцию (английское слово «cha-
регопе» близко по смыслу к слову «гувернантка»), К настоящему времени описано несколь­
ко классов шаперонов, различающихся по структуре и специфическим функциям. Все шапероны являются так называемыми «белками теплового шока*, синтез которых резко увеличивается в стрессовых для клет­
ки ситуациях. Поэтому сокращенное назва­
ние этих белков — hsp (heat shock proteins). Однако и в нормальных условиях каждая клетка содержит определенный набор ша­
перонов, необходимых для ее жизнедеятель­
ности. Классификация шаперонов основана на величине молекулярной массы состав­
ляющих их полипептидны* цепей (субъе­
диниц), которая варьирует от 10 кД (кидо-
дальтонов) (для белка hsplOl до 90 кД (для белка hsp90) и выше. По характеру выпол­
няемых этими белкам» функции их можно разделить на два больших семейства — шапероны, шли hsp70, и шамрокии". « которым относятся- hsp60 и hsp 10. амг ifmтТОЧНАЯ Pttvnmtf аюрмироалння нлгивно* прострднсгВЕНной СТРУКТУРЫ бейкой 117 Шапгроны. улерк инпщаг Бел км в развернутом тостпаими В.'щнмодейл'твие шаперонов с синтези­
руемым Or л ком начинается *чцг до схож­
дения Ш1ЛИПГПТИДНОЙ цепи с рибосомы, Свя-
,1ыняяг1> с' отдельными участками «опекаемой* Эмдоплазматический Митохондрия ретикулум Рис. 4. Схема, демонстрирующая участие шаперо­
нов и шаперонинов в сворачивании белков в клетке Эукариот Шапероны hsp70 цитоплазмы связаны со сходящей с рибосомы (f) и сошедшей с неё (2) пилипептид-
ной цепью, экранируя ее гидрофобные области и тем Самым предотвращая агрегацию- В цитоплазме белки передаются с шаперонов hsp70 на цитоплазматичес-
кий шаперонин (обозначен зелёным цветом), где и происходит сворачивание белка (3); 4— цитиплаэ-
матический шаперон hsp70 «подносит» развернутый Белок к внешней мембране митохондрии, а митохон-
дриальный шаперон hsp70, лрочно связываясь с пе­
ресекающим мембрану белком, способствует его •втягиванию- внутрь митохондрии и передаче на ми-
тохондриальный шалеронин. где и происходит сво­
рачивание: 5— цитоплаэматический шаперон hsp7Q и шаперон hsp70 просвета эндоплаэматического ре­
тикулума обеспечивают проникновение развернуто­
го белка через мембрану. В нижней части рисунка изображены молекулы белков, принявших нативную структуру в эндоплазматическом ретикулуме, цитоп­
лазме и митохондрии, соответственно. Детали про­
цесса сворачивания таких белков пока не выяснены |из: Becker. J.,Kraig.E. Eur.J.Biochern., 1994, vol. 219, P-18; с изменениями] ими пили пептидной цели, молекулы hsp70 обрадуют прочны? комплексы, удержива­
ющие цепь в развернутой состоянии. Вза­
имодействие не является специфическим (т. е, шапероны не различают белки по их аминокислотной последовательности) и в основном реализуется благодаря силам гид­
рофобного характера. Прочно фиксирован­
ная на шаперонах полилептидиая цепь не спогобна к сворачиванию в нативную струк-
ТУРУ Р так как не обладает необходимой для этого подвижностью- Главная функция hsp70 состоит в удержании вновь синтезируемых белков от неспецифической агрегации и в передаче их другому «белку-помощнику», шаперонину, роль которого — обеспечить оптимальные условия для эффективного свора чивания-
В клетках эукариот шапероны выполняют также важную роль в транспорте белков через мембраны митохондрий, ялороплас-
тов и эндоплаэматичеекого ретикулума- С помощью шаперонов транспортируются та­
кие белки клеточных органелл, которые синтезируются в цитоплазме, а окончательно сворачиваются в месте своей постоянной локализации. Роль hsp70, «подносящего» к мембране частично раз вернутый белок, становится понятной, если учесть, что раз­
ворачивание — обязательное условие про­
никновения белковой молекулы через мем­
брану. Интересно, что митохондриальный матрикс содержит собственные шапероны, «подхватывающие» пересекающий мембра­
ну белок и способствующие его «втягива­
нию» в митохондрию. Аналогичный механизм реализуется и при проникновении синтези­
рованных в цитоплазме белков в просвет эндоплазматического ретикулума. Описан­
ные функции шаперонов hsp70 иллюстри­
руются схемой на рис. 4. Возникает вопрос: от чего же зависит прочность связывания шаперона с полипеп­
тидной цепью? Каков механизм, позволя­
ющий развернутому белку освободиться от hsp70 и перейти на шаперонин? Деталь­
ные исследования, проведенные на систе­
мах белков, выделенных из клеток бакте­
рий, показ али, что ключевым свойством шаперона является его способность связы­
вать АТФ, в определенных условиях осу­
ществлять его гидролиз и в зависимости от природы связанного нуклеотида ( АТФ или АДФ) изменять прочность связывания с «опекаемой» им полипептидной цепью. Согласно пре дложе нной с хе ме ( которая, вероятно, применима и дли описания де й­
ствия шаперонов в цитоплазме эукариоти-
ческой клетки, а также в матриксе мито­
хондрий), происходит следующее. Шаперон, с оде ржащий связанный АТФ, присоединя­
ется {в присутствии специального "белка-
помощника') к развернутой поли пептидной **ОР£КУЛЯРНЛЯ 2*?"»» Рис. 5. Структура шаперонина hsp60 и его кофакто­
ра — tispIO Схематично показано проникновени е полипептидной цепи в центральный канал молекулы пзрбО, сопро­
вождающеес я присоединением nspID и закрывани ­
ем входа в канал цепи. Это сопровождается гидролизом АТФ и образованием гтрочного комплекса шапе­
рона (в связи с АДФ>, полипептидной цепи и «белка-помощника*, Для того чтобы про­
изошло освобождение развернутой цепи, не­
обходимо участие еще одного «белка-помощ­
ника», который вызывает отщепление АДФ. На место АДФ садится новая молекула АТФ, и поли пептидная цепь освобождается- Таким образом, фактором, обеспечивающим сопря­
женное функционирование шаперона hspTO и шаперонина. является обмен аденоаин-
нуклеотидов, зависящий от системы специ­
фических взаимодействий между hsp70 и «белками-помощниками» Шаперовнвы, обеспечивающие эффективное сворачивание, белков В отличие от довольно просто постро­
енных шаперонов (состоящих ид ОДнОЙ-ДВух полипептидных цепей — субъединиц) ша-
перонины представляют собой сложные олигомеркые структуры (рис. 5). Наиболее изученные hsp60 митохондрий, а также клеток Е. coli построены из 14 субъеди­
ниц, организованных в два семичленных кольца, лежащих одно под другим. В цен­
тре построенног о таким образом цилинд­
ра имеется полость — канал (диаметром 45 ангстрем), в котором и происходит сво­
рачивание полипептидно й цепи, перешед­
шей на шаперонин с шаперона hsp70. На рисунке также показана структур а hspl O, маленьког о белка, т а к же образ ующег о олигомерную структур у — кольцо из семи субъединиц, способное как «крышечка » прикрыват ь вход в канал молекулы ша­
перонина после того, как туда попадае т полипептидна я цепь. Сгмлнп швиерннины. природа нащла «,,. гантный способ пПеспечить еяора•нчц,^" Г>елка в условиях, исключающих его згь^ гацию с другими ОРЛКЭМ Н внутри кл^ти " Действительно, попадая в центральный нал молекулы шаперонина, единичная щ" липептидная цепь окалывается полностью изолированной и получает возможность цр ализовать медленные стадии сворачивания с очень высоким выходом нативного ое-лка Как и в случае hsp7H. связывание раэвер нутого белка с шаперонином и его освобож­
дение регулируются АТФаэной активностью шаперонина В связывании сворачивающе­
гося белка (находящегося в состоянии «рас­
плавленной глобулы*) принимают участие субъединицы одного из семичленных колеи олигомерной молекулы шаперонина. Количе­
ство мест связывания зависит от стадии сво­
рачивания: чем ближе структура к натив-
нойт тем меньше участков, распознаваемых шаперонином. Сворачивание происходит в полости, образуемой кольцом, связавшим белок; второе кольцо выполняет роль регу­
лятора, обеспечивающего периодическое открывание входа в полость, образуемую первым кольцом. На рис. б показан принцип функциони­
рования такой системы. Видно, что на сворачивание одной полипептидной цепи расходуется энергия гидролиза нескольких молекул АТФ. Данная модель дает лишь са­
мое общее представление о механизмах функционирования шаперонинов. Она ос­
нована на изучении этих белков, выделен-
ныл из митохондрии или бактериальных, клеток. Между тем недавно было выясне­
но, что цитоплааматически й шаттерпнин клеток э у кари от весьма существенно от­
личается по своим свойствам: он построен из неодинаковых субъединиц и не взаимо^ действует с ко-шаперонином. Вероятно, общие принципы функционирования, ус­
тановленные для hsp60, распространяют­
ся и на этот шаперонин, однако конкрет­
ные механизмы, вовлеченные в регуляцию эффективност и сворачивании белков в раз­
ных к ом партиен та х клетки, могут суще­
ственно различаться. З а кл юч е ни е В настоящее время достигнуты значи­
тельные успехи в выяснении общих прин­
ципов организации полипептидной цепи в уникальную пространственную структуру, а также внутриклеточных механизмов кон­
троля за процессом сворачивания белка. Главными проблемами, которые предсто­
ит решить, остаются понимание структур­
ных основ, определяющих путь сворачивания полипептидно й цепи, с одной стороны, и выяснение молекулярных механизмов ре-
Рис. 6. Модель сворачивания белка с участием шаперонинов Овальная фигура обозначает структурное состояние шаперонина hsp60 с сильным сродством к развернутому белку, прямоугольная фигура— состояние, в котором шаперонин такой белок не связывает. Вверху показам hsptO. который диссоциирует по Окончании сворачивания. I — белок в состоянии «расплавленной глобулы-
саязан с гидрофобными участками -стенок- центрального канала молекулы шаперонина. Это взаимодействие стимулирует присоединение АТФ, в результате которого структура шаперонина меняется (гидрофобные учас­
тки -стенок» экранируются) и белок освобождается, переходя в центральный канал (2). Спонтанное сворачива­
ние белка продолжается до тех пор, пока не произойдет гидролиз АТФ и переход шаперонина а состояние, способное связывать частично развернутый белок (3). Стадии ', Э и 5 различаются количеством -развернутых-
участков структуры белка, взаимодействующих со -стенками- центрального канала: стадия 6— белок продол­
жает сворачиваться в полости шаперонина: стадия 7— нативный белок, не способный связываться с шаперо-
нином, выходит наружу [иэ: Agard, D.A. Science. 1993. vol, 260. p. 1904; с изменениями! гуляции скорости и эффективност и этого процесса, — с другой. Накопленная информация позволяет за­
ключить, что определяющую роль в такой регуляции играют 6 елок-белковые взаимо­
действия. Они реализуются, во-первых, между выставленными на поверхность уча­
стками полипептидной цепи и специальны­
ми белками, выполняющими две функции: 1) предотвращат ь неспецифическую агрега­
цию вновь синтезируемых белков и 2) обес­
печивать транспорт некоторых из этик бел­
ков через мембраны в те внутриклеточные компартменты, где они постоянно локали­
зуются и функционируют. Такая «диспетчер-
свая» роль шаперонов дополняется их учас­
тием в проникновении белков через мембраны. Способность шаперонов (и шаперонинов ) распознавать ке-кативные участки структуры белков лежит также в основе элегантног о механизма, обеспечивающег о чрезвычайно высокую эффективност ь сворачивани я (см. рис. 6). Второй уровень белок-белковых взаи­
модействий, вовлеченных в регуляцию сво­
рачивания белка in vivo, — это взаимодей­
ствия между субъединицами в сложных молекулах шаперонинов, обеспечивающи е согласованное изменение их конформации в каждом цикле сворачивания. Эта очень интересная область интенсивно разрабаты­
вается. Не подлежит сомнению, что важнейшую роль в регуляции сворачивания белков in vivo играют белок-белковые взаимодействия третьего уровня, возникающие между от­
дельными белками-шаперонами. Скорее всего клетка располагает высокоорганизо­
ванными ансамблями белков, действующих согласованно. В состав таких ансамблей, вероятно образующихс я в цитозоле эука-
риотической клетки, входят, помимо hsp70, шапероны других типов (например, hspSO и связанные с ним низкомолекулярны е шапероны, не требующие АТФ для свое­
го функционирования), ферменты, ускоря­
ющие процесс сворачивания, а также ряд других белков, роль которых пока остает­
ся неясной. Расшифровк а молекулярных механизмов функционировании таких «ма­
шин сворачивания» — одна из актуальных проблем современной науки. Литература 1. Наградова Н. К., Муронщ В. И. Мультидимен-
ная организация ферментов Итоги науки и тех­
ники. Сер. Биологическая химия. М.: ВИНИТИ. 1991, т. 38. 2. Шульц Г., Ширмер Р. Принципы структур­
ной организации белков. Пер. с англ. М.: Мир. J9fi2. Н. Б. Гусев СОКРАТИТЕЛЬНЫЕ БЕЛКИ Введени е К группе сократительных белков Отно­
сят йелки, принимающие участие в осуще­
ствлении сократительной активности попе-
ре чнополисатых, сердечных и гладких мышц, а также белки, участвующие в различных формах ненышечной подвижности (амебоид­
ное движение фагоцитов, изменение фор­
мы тромбоцитов, перемещение хромосом в холе митоза, перемещение рецепторов на поверхности клетки и т, д.). Наиболее под­
робно исследованы сократительные белки поперечнополосатых мыши Современная история исследования сократительных белков начинается с откры­
тия, сделанног о В. А. Энгельгардто м и М. Н. Любимовой в 1939 г. Ими было обна­
ружено, что основной сократительный белок поперечнополосатых мышц, мио&ип1 спо­
собен гидролизовать АТФ. Таким образом, было впервые показано, что энергия, запасенная в форме АТФ, может исполь­
зоваться не только в ходе различных ферментативных реакций, но и при осуще­
ствлении механической работы. В 1942 г. вен­
герский биохимик Бруно Штрауб (В. Straub) обнаружил и выделил второй основной со­
кратительный белок поперечнополосатых мышц, который получил название актин. Такое название связано с тем, что актин ускоряет (активирует) реакцию гидролиза АТФ, катализируемую миозином. Наконец, в начале—середине 50-х гг. на основе дан­
ных электронной микроскопии, биохимичес­
ких и физиологических данных А. Хаксли (A. Huxley), X. Хаксли (Н. Huxley) и Дж. Хан-
сон (J. Hanson) сформулировал и гипотезу скользящих нитей, суть которой состояла в том, что сокращение мышцы осуществ­
ляется за счет взаимного перемещения друг относительно друга двух типов нитей, при этом нити одного типа содержат в своем составе миозин, а нити другого типа — актин. Гипотеза скользящих нитей получила много экспериментальных подтверждений и признается в настоящее время большин­
ством исследователей. В 1963 г. А-Хаксли был удостоен Нобелевской премии по фи­
зиологии Таким образом, к началу 60-х гг. была сформулирована простая механическая модель сокращения поперечнополосатых мышц, В то же время молекулярные ме­
ханизмы, обеспечивающи е перемещени е нитей миозина относительно нитей акти­
на, оставались необъясненньши. В послед­
ние годы появилис ь первые сведения о строении «молекулярного мотора»— части молекулы миозина, способной гидролизовать АТФ и за счет освобождающейся при этом энергии перемещатьс я по нити актина (И Раймент и соавт. (I. Rayment et a].), 1993), а также данные о структурной организа­
ции актина и строении актиновой нити, или актинового филамента (К. Холмс и соавт. (К. Holmes et a).], 1990). В данной статье мы проанализируем ультраструктуру попереч­
нополосатой мышцы, рассмотрим строение актина и миозина и сформулируем современ­
ные представления о молекулярных меха­
низмах генерации движения и способах его регуляции. Ультраструктур а поперечнополосатых мышц Скелетные мышцы имеют веретенообраз­
ную форму и с помощью сухожилий при­
крепляются к костям скелета (рис. 1). Мышца состоит из пучков мышечных волокон. Мы­
шечные волокна представляют собой силь­
но вытянутые многоялерные образования, возникающие при слиянии многих одноядер­
ных клеток-предшественников. В состав мышц входит много мышечных волокон, различающихся по длине, поперечному се­
чению, количеству ядер и митохондрий. Ос­
новной компонент мышечных волокон — сократительный аппарат, который заполняет практически весь объем клетки. Сократи­
тельный аппарат состоит из миофибрилл — особым образом ориентированных комплексов сократительных белков. Миофибриллы оп­
летены системой мембранных трубочек (по­
перечные трубочки, саркоплазматически й ретикулум). Поперечные трубочки являются выростами наружной мембраны. Они кон­
тактируют с системой внутренних мембран (саркоплазматически й ретикулум ом). Внут­
ри полостей саркоплазматическог о рсти-
кулума накапливаютс я ионы кальция. При электрической стимуляции ионы кальция выбрасываютс я из цистерн ретикулума внутрь цитоплазмы и инициируют мышеч­
ное сокращение. После сокращения ионы кальция удаляютс я из цитоплазмы и воз­
вращаются обратно внутрь цистерн рети­
кулума. Для миофибрилл скелетных мышц ха­
рактерна поперечная исчерченность. Менее оптически плотные зоны (так называемые изотропные диски, или I-зоны) чередуютс я с более оптически плотными зонами (ани­
зотропными дисками, или А-зонами; рис. 1). Мышца Сухйжмли Пучки мышечных волоки Миофибрилла Ретикулум Наружная мембрана 1 * • « » > И Рис. 1. Схема строения попе­
речнополосатой скелетной Скелетная мышца состоит из пучков мышечных волокон. Многоядерные мышечные во­
локна (ядра обозначены чер­
ными овалами) заполнены строго огранизованным комплексом специальных белков, которые формируют сократительный аппарат, основ­
ным компонентом которого являются миофибриллы. Миофибриллы оплетены системой внутриклеточных мемб­
ранных структур (поперечные трубочки и саркоплазматический ретикупум) Миофибриллы состоят из саркоме-
ров, в состав которых входят тонкие актиновые и толстые миозиновые нити (филаменты). Правильная упаковка толстых и тонких филаментов формирует характерную поперечную исчерченностъ миофибрилл. В ходе сокраще­
ния тонкие и толстые филаменты скользят относительно друг друга. Следствием этого скольжения является уменьшение длины саркомера и сближение ограничивающих его Z-дисков [из: Dawdson, V.L. SitVnan, DB Biochemistry. 3 rd ed. (The National Medical Series tor Independent Study), Harwa) Put*,, 19W: с .-змененияии] В середине Г-зоны рясполагаетсй Z-диск, представляющий собой сложный комплекс белков, часть иэ которых способна неко-
валентно скреплять между собой нити ак­
тина, В центральной части А-зоны находится менее оптически плотная Н-зпна. в цент­
ре которой видна оптически плотная М-ли-
вия. Участок миофибриллы между двумя Z-дисками называют саркомером Саркомер является минимальным сократительным элементом миофиВриллы, К Z-дискам при­
креплены тонкие нити актина. Область сар­
комера. где располагаютс я только нити актина, оптически менее плотная, соответ­
ствует l-зоне. В центре саркомера распо­
лагаются толстые нити, состоящие в ос­
новном иэ миозина. Эта область cap ком ера соответствует А-эоне. Высокая оптическая плотность А-зоны обусловлена структурой толстой нити (толстого филамента). В ниж­
ней части рис. 1 приведена Схема строения cap ко мера. Толстые и тонкие нити на оп­
ределенном протяжении перекрываютс я друг другой. Эта область обладает особен­
но высокой плотностью (два более темных участка на краях А-зоны). В центральной части саркомера располагаются только нити миозина. Эта область менее плотная, чем вся анизотропная зона, обозначается как Н-зонар. Согласно современным представлениям, в ходе сокращения ни тонкие (актиновые), ни толстые (миозиновые) нити не меняют своей длины. Однако две эти системы ни­
тей могут скользить друг относительно друга (си. нижнюю часть рис. 1). Как будет пока­
зано в коде дальнейшег о изложения, на поверхности миозиновых нитей располага­
ются своеобразные выросты («головки» мио­
зина), которые иогут как бы зацеплятьс я за нити актина и проталкиват ь (или стяги­
вать) их к центру саркомера. Таким обра­
зом, в основе мышечного сокращения ле ­
жит взаимное перемещени е двух систем нитей (нитей актина и нитей миозина) друг относительно друга. Под микроскопом та­
кое перемещени е буде т выг лядет ь как уменьшение ширины Н- и I-зон при неиз­
менности длины А-зоны. При сокращении уменьшается длина каждого саркомера и вследствие этого уменьшаетс я длина всей мышцы. Для того чтобы понять, какие ме­
ханизмы ле жа т в основе перемещени я двух систем нитей друг относительно дру­
га, рассмотрим строение и свойства акти­
на и миозина. 1 Длина саркомера колеблется от 2 до 3 мкм; Длина А- и I-зон — соответственно 1.6 и 1 мкм; толщина 2-диска составляет около 0,08 мкм (80 А). Толщина тонкой нити — актина — приблизитель­
но 0,008 мкм (80 А), а толстой— миозина — 0,012—0,015 мкм (120—ISO A). Актин и строение тонких фила ме нт о в В 1990 г. группе немецких биохимиков во главе с Кеннетом Холмсом (К. Holmes) удалось закристаллизовать актин и полу­
чить подробные сведения о структуре этого белка. Молекула актина имеет компактную сферическую (глобулярную) форму и состоит иэ дйух доменов (см. статью В К. Наградо-
вой «Внутриклеточная регуляция формиро­
вания нативной пространственной структуры белков*) — малого (включающего в свой со­
став субдомены 1 и 2; правая половина рис. 2, а) и большого (состоящего из субдо-
Мснов 3 и 4; левая сторона рис. 2, а). На по­
верхности актина много выступов, складок и щелей. В центре молекулы имеется щель, в глубине которой могут связываться мо­
лекулы АТФ (или АДФ) и ионы двухвалент­
ных металлов, а на поверхности распола­
гаются петли (например, участок между аминокислотными остатками ЗВ и 52 в суб-
домене 2 или участок между остатками 262 и 309 в субдомене 3). Наличие таких выс­
тупов и складок делает возможным взаи­
модействие двух мономеров актина друг с другом, при этом выступы одного мономе­
ра попадают в складки другого мономера. Нечто похожее происходит при собирании детских головоломок, когда два фрагмента произвольной формы точно соответствуют друг другу и плотно контактируют между собой. Таким образом, мономеры актина могут полимеризоваться, при этом образу­
ется своеобразная структура, похожая на две переплетенные между собой нитки бус. В такой структуре каждый мономер акти­
на взаимодействуе т не только с предыду­
щим и последующим мономерами в одной цепочке, но и с мономерами, расположен­
ными в соседней цепочке. Эти межнитевые взаимодействия обеспечиваются за счет того, что выступающие петли мономеров одной цепочки укладываются во впадины, распо­
ложенные на поверхности мономеров, при­
надлежащи х другой цепочке (в центре рис. 2, б хорошо видны такие петли). Внутри клетки процесс полимеризации актина тонко регулируется. Сначала из не­
скольких мономеров актина формируетс я короткий полимер-затравка, который при определенных условиях может увеличивать­
ся в размере за счет присоединения новых молекул мономерного актина Полимерный (фибриллярный) актин представляе т собой очень динамичную структуру, К полимер­
ному актину постоянно присоединяютс я новые и удаляютс я старые мономеры ак­
тина. Концы нити актина различаютс я по своей способности присоединят ь или отсо­
единять мономеры актина. На «оперенном», или «тупом», конце нити преобладает про-
мдиии,,,^,,. Сублимен э гТ*в IStc. 2. Схема строения глобулярного актина (а) и трех глобул актина, входящих в состав полимериэованног о нитевидного (фибриллярного) актина (б) На схеме (а) обозначено положение первого (N-концевого) и последнег о (С-концевого) аминокислотных ос­
татков, а также положение некоторых аминокислот (обозначены заглавными буквами латинского алфавита с соответствующими номерами). В центре молекулы н щели между субдоменами оасполагаются молекула АТФ (или АДФ) (изображена в виде ломаного многоугольника) и ионы кальция или магния (красный шарик), в вида лент и стрелок изображены характерные элементы укладки белковой цепи (а-спирали ир-складки) (из: Kabsfi, IV. el a) Nature, 1990, vol 347, p. 37—M]. На схеме строения фибриллярног о актина (б) показано, что мономеры актина полимериэуются, образуя как бы 2 нитки бус. Справа показаны 2 мономера, формирующие часть одной многочленной «нитки бус-, слева - один мономер, входящий в состав второй -нитки бус». На поверхмисти актина видны выступающие петли, обеспечивающие соединение мономеров, принадлежащих различным *нит-
кам бус», в полимерный комплекс (из: Pollard, Т.О. etal.. Annu. Rev Cel l Bi ol,, 1994. vol. 10. p. 207—2491 цесс полимеризации, а на противополож­
ном «заостренном» конце, наоборот, преоб­
ладает прочесе деполимеризации (рис. 3). Мономеры, присоединяющиес я на «оперен­
ном» конце нити актина, содержат, как правило, в своем составе АТФ, а мономе­
ры, диссоциирующие с «заостренного» конца нити актина, — АДФ. Можно сказать, что гидролиз АТФ способствует (хотя и не яв­
ляется необходимым условием) полимери­
зации актина. В настоящее время описано много белков, способных взаимодействоват ь как с мономер­
ным, так и с полимерным актином. Белки, взаимодействующие с мономерным актином, определяют его способность вступать в реак­
цию полимеризации. Белки, взаимодейству­
ющие с полимерным актином, могут распо­
лаг атьс я как на «оперенном», так и на «заостренном» конца х полимерног о а к ­
тина (рис. 3, а). В первом случае белки фор­
мируют своеобразную «шапочку» или «заглуш­
ку», препятствующу ю росту нити актина. Во втором случае белки препятствуют диссоци­
ации мономеров, т. е. предотвращают разборку и укорочение нити. Существуе т группа бел­
ков, располагающихс я на поверхност и нити актина. Некоторые из них ослабляют связ и между соседними мономерами актина и как бы «разрезают » нить актина на две части. Другие белки как бы свешиваются с нити актина и оказываются способными связывать нити актина между собой. При этом образу­
ются «сшитые» пучки нитей актина, кото­
рые используются в качестве строительных блоков для создания внутриклеточног о ске­
лета. Наконец, белки третьего типа укла­
дываютс я внутри канавки, образованной двумя нитями фибриллярног о актина (рис. 3, б), К таким белкам относится mponoMUomti. Вытянутые палочковидные молекулы тро-
помиозина взаимодействуют друг с другом по типу «голова-к-хвосту» и укладываются внутри канавки на протяжении всей длины нити актина. Таким образом, благодаря своей струк­
туре и свойствам мономеры актина могут упорядоченным образом взаимодействоват ь друг с другом и образовыват ь полимерные нити (микрофиламенты). Формирование этих нитей регулируетс я с помощью большого количества различных актин-связывающи х белков, которые могут «сшивать» и «разре­
зать» нити актина, могут способствовать или, наоборот, препятствоват ь процессу полиме­
ризации. Два конца нити актина различаются по своей способности к полимеризации, по­
этому в нити актина различают быстро ра­
стущий («.оперенный») и медленно растущий («заостренный» ) концы. Нити актина форми-
СОХМЧ<Т£.№НЫС. БСПКИ 127 ( ^ ^ J U D D Р D D D О "Оперенный" конец D D D D П фрагментация § Впзмгпкные _ участки связывании Рис- 3, Схема процесса полимеризации ак­
тина {а} и строения нити полимерного акти­
на [6} Полимеризация мономерного актина {изобра­
жен а виде ром0и«ов) начинается с форми­
рования затравки. Монсмерный актин содер­
жит в своем составе ДТФ (буква Т в центре ромба), мономерь> в составе полимера, нэк правило, содержат а своем составе АДФ (D в центре ромба): если точный состав нуклеоти-
да не определен, то в центре ромбэ стоит воп­
росительный знак. Процесс полимеризации на «заостренном*1 конце (тонкие стряпки) идет с меньшей скоростью, чем, на «опереином« конце нити актина (жирные стрелки). Возмож­
на '-стыковка- ранее сформированных нитей актина **ежд¥ собой, Актин-связывающие бел­
ки (изображены в виде разноцветных фигур произвольной формы) могут взаимодейство­
вать с концами нити актина либо располагать­
ся на ее поверхности [иэ: ФуптонА. Цитрске-
лет Архитектура *ч хореографии клетки М.; Мир. 1987 ® Fulton, A. The cytoskeleton. Cellular architecture агю" choreography, London, UK: Chapman and Hall Ltd., 1984]. Часть белков (например, тропомиоэин} может распола­
гаться о глубине канавки, образованном двумя нитями актина [б). Стрелками отмечены области контактов доук соседних молекул тропомиоэина. Такое расположение способствует укреплению структуры полимерного актина и может препятствовать присоединению других белков на поверхности актина [из: ЛеаиддогйДН и др. В кн.: Белки и пептиды, м,: наука, 1995. т. 1.] mti&m&xv&z^ руют своеобразные внутриклеточные «рель­
сы», по которым происходит перемещение «белков-локомотивов» ("белков-моторов»). При этом белки-моторы способны различать на­
правленность нити актина и могут переме­
щаться в строго определенном направлении (от ^заостренного» к «оперенному» концу нити актина). Рассмотрим строение и свойства миозина — основого белка-мотора попереч­
нополосатых мышц. Структура и свойства миозина Миозин поперечнополосатых мышц пред­
ставляет собой сложно орган из ованный ком­
плекс, состоящий из б отдельных белков (рис. i). В состав миозина входят 2 тяжелые и 4 легкие цепи. Молекулярная масса тя­
желых цепей миозина составляет 200— 250 кД, при этом в состав каждой тяжелой цепи входит около 2000 аминокислотных остатков. Легкие цепи миозина вполне со­
ответствуют своему названию, имеют мо­
лекулярную массу 16—24 кД и состоят из 150—260 аминокислотных остатков. Моле­
кула миозина асимметрична. На длинном па-
лочкооораяшш хвосте, образованном при­
близительно 1100 аминокислотными остатками, закреплены грушевидные «го­
ловки», которые прикреплены к хвосту с Рис. 4. Схема строения молекулы миозина (а) и способ упаковки молекул миозина в тол­
стый филам£п\ (б) а— две тяжелые цепи миозина взаимодей­
ствуют между собой, при этом образующие а-спираль С-концевые части двух молекул тя­
желых цепей миозина скручиваются друг от­
носительно друга наподобие каната (показа­
но на врезке) и образует асимметричный S^^*^.^£Z\~-~!^-ieL=>t?>c^r I \ \ "Хвост» Грушевидные толовки» миозина со-
> = и:> ^ З Р,0'0 0 0 < -'^ л -''\ j ^ ^ дерлйт в своем составе центры связывания ДТФ и актина (отмечены соответственно зе­
леным кружком и красным треугольником). В области «шейки», соединяющей «головки» миозина с асимметричным хвостом, распола­
гаются легкие цепи (го два овала около каж­
дой -головки") Обозначено положение N- и С-концов тяжелых цепей миозина; б— моле­
кулы миозина (изображены в виде ломакой линии с двумя черными -головками») могут взаимодействовать своими хвостами, образуя как параллельные, так и антипараллельные структуры Такие взаимодействия приводят к образованию биполярного филамента [из: Бэгшоу К. Мышечное сокращение. М.: Мир, 1985: с изменениями. © Sags/jaw, C.R. Muscle contraction, L; N,Y,: Chapman and Had. 1982] Головка помощью довольна подвижной кшейкн*. «Хвосты* двух тяжелых цепей представля­
ют соппй практически идеальную о>спираль. Хвостовые о>спиральные участки диух тя­
желых цепей перекручиваются друг отно­
сительно друга наподобие каната (см. врезку на рис.4, о) При этой образуется вытяну­
тая и довольно же^кал структура. В не­
которых местах такая идеальная канатооб-
разная структура нарушается и формируются своеобразные шарниры, обеспечивающие сравнительно свободное перемещение «шейки» относительно хвоста молекулы миозина. Две грушевидные «головки» миоаина содержат в своем составе специальные участки, обес­
печивающие связывание и гидролиз АТФ, а также участки взаимодействия о актином. Наличие двух «головок* позволяет молеку­
ле миозина взаимодействовать с двумя раз­
ными нитями актина, а также делает воз­
можным состояние, когда одна «головка» закреплена на нити актина, а другая, сво­
бодная, как бы ищет место нового закреп­
ления Вероятно, именно наличие двух «го­
ловок» позволяет миозину осуществлять как бы шагание по нити актина. Легкие цепи миозина располагаются в области «шейки» в районе прикрепления «головок*» миозина к стволу- Легкие цепи выполняют ряд важ­
ных вспомогательных функггии: они стаби­
лизируют на определенном протяжении структуру тяжелых цепей миозина, а так­
же участвуют в регуляции взаимодействия миозина с актином. Сложно устроенная молекула миозина, содержащая 6 полипептидны к цепей, дол­
жна быть способной выполнять как мини­
мум 2 функции- Во-первых, должна уметь образовывать еще Более сложно устроен­
ные надмолекулярные структуры и форми­
ровать толстые филаменты, видимые в виде анизотропных дисков на микрофотографи­
ях поперечнополосатых мышц. Во-вторых, молекула миозина должна уметь гидроли-
зовать АТФ и превращать химическую энер­
гию этого соединения в механическую ра­
боту. Хвостовая часть молекулы миозина обеспечивает упаковку миозина в толстые филаменты, а «головки» — перемещение толстых (миозиновых) фила ментов относи­
тельно тонких (актмновыл). В природе существует несколько раз­
нообразных способов упаковки молекул миозина в надмолекулярные образования. В поперечнополосатых мышцах реализует­
ся такой способ упаковки, когда хвосты молекул миозина взаимодействуют друг с другом и образуют своеобразный ствол тол­
стого фила мента, а закрепленные на под­
вижных «шейках» головки торчат на повер­
хности такого ствола. Молекулы миозина могут упаковываться как параллельно, так и антипараллельно (рис. 4, б). Вследствие итого образуется двухполюсный г. ный толстый филамент, в ч е н т„ И,"'ЛЯ(, есть так называемая «голая. £L?m<'tm>'> держащая «головок» миоаина, а « Нб Сь-
левой и правой половинок толстс. мента имеют противоположную на^ ^>Ил>-
ность (рис.4, 6). Толстый филанен1""41*11-
речногтолосатых мышц Гфедставл ^"е-
сложно устроенный комплекс мно** С°6<*' ков. В состав этого образования вход"* 6*J1~ 300 молекул миозина в комплексе t,' '""^ч кими миозин-связывающими белкам еСК11''ь" из которых обеспечивает правильна' *1Яг'ь ковку молекул миозина и стабили за ции/11*" структуры толстого фила мента. Мей Как же молекулы миозина, упакова в толстый фила мент. Осуществляют ""^ мещение тонких и толстых филаментоЕ"™'4" относительно друга? Анализ экслеримевта^' ных результатов, полученных за послед-"'' годы, позволяет высказать несколько imL** положений. В 1993 г, И. Райменту (I. FUynteti и соавт. удалось закристаллизовать «голи^ ки> миоаина и установить расположение актин- и АТФ-связываю-щиэс центров, «г ловка» миозина состоит как бы иа трех ос­
новных частей, связанных подвижными шарнирами. N-концевая часть -головки» имеющая молекулярную массу 25 кД (на рис. 5, а окрашенна в зеленый цвет), содер­
жит в своем составе центр связывания АТФ Средняя часть «головки» (молекулярная цасса 50 кД; на рис. 5, а окрашена в красный цвет| разделена глубокой щелью на две половин­
ки. Обе половинки этой ча*:ти молекулы ын-
оэина взаимодействуют с актином. Наконец. С-концевая часть головки миозина (молеку­
лярная масса 20 кД; на рис. 5, а окрашена в фиолетовый цвет) образует подвижную спи­
ральную «шейку», на которой закреплены 2 легкие цепи миозина (отмечены желтыми светло-фиолетовым цветом). На рис. Ь, а вид­
но, что АТФ- и актин-связывающие цент­
ры значительно удалены друг от друга, но при гидролизе АТФ в активном центре ви-
озина происходят существенные структур­
ные изменения, которые передаются на актин-связывающий центр и в конечном итоге преобразуются в изменение ориентации «шейки» миозина относительно вктинового фила мента. Если активный центр не заполнен АТФ (или АДФ), то две половинки актин-свЯ-
эывающего центра сближены между собой, и это способствует прочному взаимодействию миозина с актином (рис. 5, 6, I). В этом со­
стоянии яшейка» миозина ориентирована под углом 45° относительно нити актина. По0-
ле попадания АТФ в активный центр Две половинки актин-связывающего центра удаляются друг от друга, взаимодействие миозина с актином ослабевает и миозин диссоциирует от актина (рис. S, б, 2)- Гид-
СОКРАТИг£Ле>н&Е б£дкн У Закрытие щели активного центре Гедролыэ « выход АДФ Выход I v , фосфата | A~ t Развитие J^- ^ усилия J Промежуточное состояние Рис. S. Строение «головки* миозина (в) и гипотети­
ческий механизм перемещения головки миозина по поверхности актина (б) а— модель строения «головки» молекулы миози­
на. Модель ориентирована таким образом, что ак­
тин-связывающий центр расположен в правой ча­
сти. Ясно видна щель, разделяющая две половин­
ки актин-связывающег о центра. Подробности в тексте; б— схема одиночного «шага» головки мио­
зина по нити актина. Актин изображен в виде гир­
лянды шариков. В нижней части -головки- миози­
на изображена щель, разделяющая две части ак-
тин-связывзющег п центра. В верхней части •головки» изображен центр связывания АТФ. Аде-
нозин обозначен А, а фосфатные группы — е виде маленьких кружков. Между состояниями, обозна­
ченными цифрами 5 и |, схематически показана переориентация «шейки» миозина, происходящая при генерации тянущего усилия. Подробности— в тексте (из: Rayment, I. et al. Science, 1993, vol. 261, p. 56-65] релиз АТФ в активной центр? 1рис. ?>, б, 3) приводит к тому, что изменяется структу­
ра АТФ-свялываюшег о центра, «шейка» ииизинэ поворачивается н занимает поло-
жени» под углом 90е по отношению к нити актиив. При этом становится возможным слабое взаимодействие «головки» миозина с актином (рис.5. 5. 4). Присоединение к актину облегчает удаление продукта реакции (неорганическог о фосфата) из активного центра мипяинй, что присолит к измене­
нию ориентации ошейки» относительно нити актина и возникновению тянущего усилия, когда угол между нитью актина и «шейкой» миозина изменяется с 90 до 45* (рис. 5. б, 4 и 5)- в ходе описанной последовательност и событий головка миозина в начале цикла была связана со вторым сверху мономером актина, потом диссоциировала от него и повернулась на такой угол, что оказалась расположенно й против третьег о сверх у мономера актина, связалась с ним и про­
толкнула нить актина на шаг вперед (на рисунке — вверх) - При повторении этого цикла и гидролизе еще одной молекулы АТФ становится возможным дальнейше е поша­
говое перемещение нити актина относитель­
но ствола миозина, к которому прикреплена | рассматриваема я головка миозина. Таким способом головка миозина подобно акроба­
ту, лез ущему по канату, перехватывае т мономер за мономерок актина и обеспечи­
вает тянуще е или толкающе е усилие. Если вернуться к схеме строения сократительног о аппарата (рис. 1), то окажется, что «головки» миозина, расположенные в левой половин­
ке толстого фи.памента, тянут нити актина слева направо, т. е. к центру саркомера. Как с ле дуе т из геометрии упаковки толстог о филамент а (см. рис.4), «головки» миозина, расположенные в правой половине филамен­
та, тянут нить актина в противоположно м направлении, т. е. справа налево, и переме ­
щают нить актина к центру саркомера. Та­
ким образом, координированно е действи е головок миозина приводит к сближени ю ни­
тей актина и уменьшени ю длины саркоме ­
ра, т. е. к укориченик! мышечНО!ч> волокна. Совершенно очевидно, что мышца не может находиться все время в состоянии сокращения. Это означает, что должны существовать специальные механизмы, позволяющие регулировать процесс взаи­
модействия миозина с актином. Действитель­
но, в состоянии покоя, при низкой концен­
трации Саг+ в цитоплазме, головки миозина не создают тянущих усилий. В этих усло­
виях мышца находится в состоянии расслаб­
ления и можно легко, приложив небольшое усилие, изменить взаимную ориентацию тонких и толстых фила ментов. При стиму­
ляции происходит резкое увеличение кон­
центрации Са2+ в цитоплазме мышцы, «го-
че Ловки* миозина оковываются способными совершать опыснкны*' выше циклические движении и перемещать нить актина. В этпм пи- тоянии тонкие и толстые филаменг ы (исалывак^ся к а * *>ы сцепленными друг с другом, и нужно приложит ь большие уси ­
лия длн того, чтобы насильственно изме­
нить ориентацию филаментов друг относи­
тельно друга. Проанализируе м механизмы, обеспечивающие регуляцию совратительной активности. Р е г у л я ц и я с о к р а т и т е л ь н о й а к т и в н о с т и м ы ш ц Структуры, обеспечивающи е регуляцию взаимодействи я миозина с актином, могут располагатьс я как на нит и акт ина, так и на нити миозина, «Актиновый » т н п рег уля ­
ции характере н для поперечнополосатых и сердечных мышц, а «миоаиновый» прису щ гладким мышцам. В основе чактинового» типа регуляции лежит перемещение нити тропомиозина в канавке двойной спирали актина. Как пока­
зано на рис, 3, б, тропомиозин лежит в глу­
бине канавки нити актина. С тропомиозином связан специальный белковый комплекс, по­
лучивший название тропонин, Тропонин со­
стоит из трех белков и способен с пыткой специфичностью и высоким сродством свя­
зывать ионы Саг*. Связывание Са5* сопровож­
дается изменением структуры тропонина и передается на молекулу тропомиозина. В от­
сутствие Са2* тропонин выталкивает тропо­
миозин из канавки на поверхность актина (рис, 6), При этом одна вытянутая молекула тропомиозина контактирует с 7 мономерами актина и перекрывает на всех 7 мономерах актина определенные области, участвующие во взаимодействии актина с миозином. При таком «блокирующем» положении тропомио­
зина «головки» миозина могут присоединиться к актину, но не способны совершить тяну­
щее усилие и изменить свою ориентацию от­
носительно нити актина. Вследствие этого сокращение оказывается невозможным. При повышении концентрации Cai + в цитоплазме происходит насыщение Са-связывающих цен­
тров тропонина. Происходя т структурные изменения тропонина, и тропомиозин «зака­
тывается» в глубь канавки актина. В таком положении тропомиозин не мешает продук­
тивному взаимодействию миозина с актином, становится возможным циклическое присо­
единение «головок» миозина к актину и раз ­
витие сокращения ( рис 6). После удаления Са?* из цитоплазмы тропомиозин возвраща ­
ется в свое исходное «блокирующее » поло­
жение, обеспечива я расслабление. Таким об­
разом, в отсутствие Са1* тропомиозин создает структурные затруднения для продуктивног о взаимодействи я миозина с актином. При этом тропомиозин выполняет функции ••Bowjfjpj,-
ного усилителя, когда одна молекула тр,,ш* миозина способна «включать» или »выключав сразу 7 молекул актина. Взаимодействие ммояина с актином шГЛ-
но регулировать как со стороны актина (тр,^ покин-трипомиоэиновый комплекс), так и г~ стороны миозина. Как уже отмечалось, -мио" зииовый» тип регуляции характерен дл" мышц моллюсков и гладких мышц позвож ньи. В основе миозиновог о типа регуляции лежа т Са- зависимые изменения структуры происходящие в области к шейки», т е в т • месте, где располагаютс я легкие цепи мио зина. Кальций може т либо непосредствен! но связыватьс я в области контакта тяже­
лой и двух лег к и х цепей миозина, либо вызывать ряд процессов, следствием кото­
рых являетс я фосфорилировани е (перенос остатк а фосфат а с молекулы АТ Ф на оста­
ток серина ) определенных участков в од­
ной из лег ких цепей миозина. Связывание Са 1 * или фосфорилировани е легкой цепи миозина увеличивае т подвижност ь «шейки» миозина и делает возможным взаимодей­
ствие миозина с актином. В отсутствие Саг+ или при дефосфорилировани и головки мио­
зина по тем или иным причина м оказыва­
ются неспособными к продуктивному взаи­
модействи ю с актином. Надо отметить, что несмотр я на общее сходство молекулы мио­
зина г ладк и х и поперечнополосатых мышц имеют ряд сущест венных различий. Имен­
но поэт ому «миозиновый » т ип регуляции Рис. 6. Схема функционирования тропонин-тропо-
миозиновог о комплекса На поперечном сечении тонкого актинового фила-
мента показаны два сферических мономера актина. Положение тропомиозина показано в виде двух ма-
ленькик кругов. В отсутствие Саг * (маленький пунк­
тирный круг) тропомиозин мешает продуктивному взаимодействию головки миозина (миозин) с акти­
ном, в присутствии Саг * тропомиозин перемещает­
ся в глубь канавки актина (сплошной маленький круг), что делает возможным перемещение головки мио­
зина по актину и гекерацив сокращения ГУЖРЛГ**?£ЛЬН&£ ыти 111 играет ключевую роль в гладких мышцах и выполняет лишь довольно незначитель­
ные вспомогательные функции в попереч­
нополосатых и сердечных мышцах. Заключение В основе сокращении мышц лежит на­
правленное перемещение двух систем ни-
Т Р Й тонких нитей актина и толстых ни­
тей миозина — друг относительно друга. Взаимодействие актина с миояином регу­
лируется специальными Са-связывающими белками (тропонин, легкие цепи миозина). Гидролиз АТФ, осуществляемый миозином, сопровождаетс я выделение м энергии, ис­
пользуемой для осуществления механической работы. При этом энергия АТФ тратится на структурные изменения «головки», которые и лежат в основе сократительно й активно­
сти. Актин выполняет роль активатора мио­
зина и определяе т направленност ь переме­
щения миозина. Можно сравнит ь актин со своеобразным «рельсовым путем», по ко­
торому в строго определенно м направле ­
нии перемещается «локомотив» миозина. Как уже отмечалос ь во введении, актомиози -
новая система не являетс я единственно й двигательной системой клетки. В клетке есть целый набор белков-моторов. Помимо мио­
зина, такими белками- моторам и являютс я внутриклеточные динеин и кимезмм. Эти белки также способны гидролизовать АТФ и генерировать механические усилия. При этом кинезин и динеин перемещаются вдоль лик рот ру бочек, построенных из мономеров тпубулинй- Этот белок по многим Свойствам похож на актин. Оба белка способны к по­
лимеризации, при атом они формируют надмолекулярные структуры (микротрубоч­
ки и микрофиламенты). И актин, и тубу-
лин выступают в качестве активаторов и определяют направление движения белков-
моторов. Двигательная система, связанная с тубулином, обеспечивае т перемещение органелл внутри клетки, участвует в про­
цессах перемещения хромосом, транспорте мембранных везикул. Несмотря на целый ряд существенных различий, организация дви­
гательных систем, связанных с актином и тубулином, имеет много общего. Литература 1. Албертс Б„ Брей Д., Льюис Дж. и др. Мо­
лекулярная биология клетки. Пер. с англ, М.: Мир, 1994. т. 2, 2. Белки и пептиды /Под ред. В.Т. Иванова, В.М. Липкина. М.: Наука. 1995. т. 1. 3. Бэгшоу К. Мышечное сокращение. Пер, с англ. М.: Мир, 1985. 4. Каппуччииелли П. Подвижность живых кле­
ток. Пер. с англ. М,'. Мир, 1982. 5. Фултом Ф. Цитоскелет. Архитектура и хо­
реография клетки. Пер. с англ. М.: Мир, 1987. в. В. Иг Н в Г 0 в УГЛЕвОДУЗНАЮЩИЕ БЕЛКИ-ЛЕКТИНЫ Введение При рассмотрении различных уровней организации исивлй материи становится оче­
видным важнейшее значение явления комп-
л£.чемтар«осггш. Под ним биологи noHHMamt пространственное соответствие межклеточ­
ных, субклеточных и молекулирных взаимо­
действий отдельных элементов клетки (кле­
ток)» позволяющее популяции клеток (клетке) и ее субклеточным структурам оптимальным образом организовывать процессы экизнеде­
ятельности и выживать в изменчивом мире окружающей среды. Комплементарность ле­
жит в основе взаимодействия нуклеотидов в двунитчатой структуре нуклеиновых кис­
лот, нуклеиновых кислот с белками, фер­
ментов со своими субстратами, антигена с антителом (см. статью Д-Г. Кнорре «Что изучает молекулярная биология?» и статью И. Я, Шатского * Регуляция биосинтеза бел­
ков »). Еще один тип специфических взаимо­
действий, имеющий большое значение в процессах жизнедеятельности, — это уг­
левод-белковые взаимодействия, которые реализуются при связывании углеводов с особыми белками — лектинами. По опреде­
лению одного из лидеров современной лекти-
нологии доктора Яна Коцоурека (J. Kocourekjf, лектины — это белки, не относящиеся к клас­
су иммунных (иммунные белки—иммуно ­
глобулины, антитела), способные к обра­
тимому связыванию с углеводной частью гликоконъюгатов' без нарушения ковален-
тной структуры любых из узнаваемых ими гликоэ ильных лигандов (от лат. «ligo» — связываю). Функциональные свойства белков оп­
ределяютс я их конформацией, т. е, про­
странственным расположение м атомов (см. статью Н. К. Наградовий «Внутриклеточ ­
ная регуляци я формировани я нативно й пространственно й структур ы белков»), В архитектур е белковой молекул ы приня ­
то различат ь четыре структурных уровня. Первичная структура определяетс я пос­
ледовательность ю аминокисло т в цепи; еторичная структура образуетс я в ре­
з ультат е взаимодействи й между амино ­
кислотными остатками, расположенным и вблиз и друг друг а в линейной последо ­
вательности; примерами вторичной струк ­
туры служа т а - с нира л ь и Р- складчатый слой. Третична я с т ру кт у р е образуется результате взаимодействий между аиивс" кислотными остатками, далеко отстоящим" друг от друга в линейной последователь" ности. Белки, содержащие несколько по" л и пептидных целей, обладают еще Одним уровнем структурной организации — 4etn_ еертичной структурой. Под четвертичной, структурой подразумевают пространствен-
ное расположение полипептидов, или субъединиц, в составе макромолекулы бел­
ка. Особенностью пространственной струк_ туры белкон-лектинов является ее способ­
ность формироват ь центры узнавания связывания олигосахаридов2, обладающие высокой специфичностью по отношению к этим лигандаде. Лектины можно считать чувствительнейшими биосенсорами, детек­
тирующими определенные угле йодные пос­
ледовательност и в олигосахаридах. Входя в структуру тканей животных, растений и микроорганизмов, лектины принимают участие как в регуляции их метаболизма так и в защите от некоторых агентов внещ! ней среды Так, один из лектинов, белок вируса гриппа — гемагглютинин — игра­
ет большую роль в процессах поражения тканей человека и животных при вирус­
ной инфекции. Присоединяяс ь к рецептор-
ным участкам на поверхности эритроцитов, белок-лектин вызывает их склеивание {аг­
глютинацию). Другой лектин — конканавалин А —вы­
зывает преимущественну ю агглютинацию раковых клеток. Конканавалин А и неко­
торые другие лектины обладают .лгатогек-
ной активностью, т. е. стимулируют про­
цесс митотическог о деления и размножения покоящихс я лимфоцитов. Рецепторными участками клеток являются, как прави­
ло, определенные моно- и олигосахарз. Бу­
дучи выделены из живых объектов, лев-
тины становятс я ценными биохимическими реагентами, которые находят применение в экспериментально й цитохимии, диагно­
стике ряда заболевани й и в биотехноло-
гических процесса х выделения некоторых сложных углеводсодержащи х веществ, В последние годы делаются попытки исполь­
зования лектинов в качестве лекарствен­
ных препаратов. 1 Гликоконъюгаты — комплексы полисаха­
ридов с иными полисахаридами или белками. ! Углеводы, содержащие в молекуле от 2 до 10 (от греч. aoligos» — немногочисленный) ионо-
сахаридных остатков, связанных о-гликозидными связями УГЛГЬОДУЗНЛКНЦ** 6€л*т-д1п1ю1ы 1J1 Все вышесказанное привлекает к нау­
чению лектинов многих исследователей, рв(ч>тан«иих в рванообразных сферах бии-
логический науки, и прежде всего в био­
химии, цитологии, микробиологии, физио­
логии растений, биитехнологии и фармации Несмотря на то, что первый лектин был выделен более сотни лет тому назад, ин­
тенсивные исследования этих соединений начались сравнительно недавно и проводит­
ся всего лишь тридцать последних лет, У лектинологии — науки, развивающейся на стыке различных биологических дисциплин, большое будущее. История открыти я л е к т и и о в Первый лектин был открыт Г.П, Штиль-
марком (С. P. Stilmark) в Дерптском (ныне Тартуской) университете в 1868 г. Этот уни­
верситет занимал почетное место в иерар­
хии университетов Российской империи кон­
ца прошлого века. В нем работали и учились многие видные деятели науки и культу­
ры России, Эстонии и Германии. В то время работа мало кому известного медика, вы­
полненная в Институте фармакологии уни­
верситета и посвященна я исследованию природы токсичности семян клещевины, представленна я к защит е па соискание ученой степени доктора медицины, про­
шла незаметно. Г, Штильмарк был не первый, кто изу­
чал в Институте фармакологии токсины семян клещевины, но он впервые выделил из них белок, исследовал его свойства и дал ему название чрицин», по названию клещеви­
ны Ricrnws communis, существующе е и по­
ныне. Г. Штильмарк обнаружил способность токсинов вызывать агглютинацию эритроци­
тов. Таким образом рицин стал первым из открытых пектинов, относящихся к группе растительных лектинов, или фитогемагглю-
тли никое. Надо отметить важный вклад в первые шаги молодой науки лектинологии директора Института фармакологии докто­
ра Рудольфа Коберта (R. Robert ). Именно благодаря его энергии и целеустремленнос ­
ти проводились исследования и других при­
родных фитогемагглютининов. Достаточно сказать, что буквально эа несколько лет были получены, охарактеризован ы и даже переданы известно й химическо й фирме «Merck» для выпуска такие фитогемагглю-
тинины, как рицин и абрин. Пионерские работы эстонских исследо­
вателей в области лектинологии на десяти­
летия определили интерес иногих ученых к природе этих вещест в и их способности к агглютинации эритроцитов. Позже было открыто еще одно важное свойство неко­
торых растительных лектинов. Они оказа ­
лись митегенами, т. е, веществами, влия ­
ющими на циклы клеточного деления. Бла­
годаря этой особенности лектины исполь­
зуются в экспериментальной биологии, ге­
нетике, цитологии и онкологии. Термин "фитогемагглютинин* (ФГА) характеризует все растительные лектины; в эксперимен­
тальной биологии он закрепился за вполне конкретный лектинои, выделенным из се­
мян фасоли обыкновенной — Pfcaseolus vulgaris. Итак, рицин открыл список раститель­
ных лектинов. Сейчас этот список очень ве­
лик: это рицин, абрин и ФГА, это и КонА — конканавалкн,- лектин из конского боба СатюиоНо ensi/ormis, WGA (wheat germ agglutinine) — агглютинин из проростков семян пшеницы, и многие другие. Следует сказать, что сам термин лектин примени­
тельно к фитогемагглютининам появился совсем недавно. Ввел его в обиход выдаю­
щийся иммунолог У. Бойд [W- Boyd) в шес­
тидесятых годах нашего столетия, исполь­
зовав для этого латинское слово »)ейеге» — выбирать. Этим он подчеркивал способность фитогемагглютининов избирательно связы­
ваться с теми или иными углеводными ре­
цепторами клеток. К настоящему времени лектины выделены практически из всех живых организмов — от вирусов до чело­
века; стало ясно, что эти белки осуществ­
ляют свое влияние, связываясь с углевод­
ными рецепторами как чужеродных, так и своих клеток или субклеточных структур. Угле водные рецептор ы на пове рхнос т и клето к Все известные клетки похожи друг на друга по принципам структурной органи­
зации, и вместе с тем они значительно различаются по химическому составу. Это легко проследить при сравнении структур клеточной поверхности у про- и эукарио-
тичееких клеток3. Основу структуры клеточной поверхно­
сти составляет клеточная (плазматическая ) мембрана, состояща я из липидов, липо-
протеинов (сложных белков, в состав кото­
рых входит липиды), гликолипидов и гли-
копротеинов. К числу последних относятся так называемые интегральные белки, про­
низывающие мембрану и образующие на ее внешней стороне олигосахаридные цепоч­
ки, напоминающие антенны. У эукариоти-
ческих клеток многоклеточных организмов 3 Прокариотические клетки — это клетки, которые не имеют четко оформленного ядра, окруженного ядерной мембраной (бактерии, микоплаэмы, риккетсии). Эукариотически* клет­
ки — это клетки животных, растений, дрож­
жей; они имеют четко оформленные ядра с хро­
мосомным аппаратом. яти антенны направлены наружу: в межкле­
точное пространство, если это клетки тканин или в просвет сосудистых структур, vcrih Это клетки эндотелия. У прокариот над плаз­
матической мембраной расположен чаще нсего каркас клеточной стенки- Он по ка­
ким-то пока неизвестным причинам не Эк­
ранирует (или экранирует не полностью} олигосахаридные- цепи антенн. В состав клеточной стенки бактерий, имеющей по-
лисахаридную природу, входят дополнитель­
но олигосахаридные последовательности так называемого О-антигена» который опреде­
ляет своеобразие структуры бактериальной клетки и вызывает специфическую реакцию организма животного и человека на его введение. Таким образом, несмотря на сходство структур плазматических мембран и прин­
ципиальную тождественность их функций, у про- и эукариот имеются и значительные различия, На поверхности клеток локали­
зованы олигосахаридные цепи, структура которых уникальна для каждого вида кле­
ток. Разнообразие моносахаридов очень ве­
лико* однако чаше всего в состав этих олиго-
саха глюкоза Остаток нейтрального сахара ноос Схема расположения интегрального белка эритро­
цитов — гликофорина в клеточной мембране ридов эукариотических клеток ь «за (Glc). N-ацетилглюкоз* Шл2??Т: к-деа (Gal), N-ацетилгалактоза ( NA^ )( манноза (Man), фу коза (Fuc), ^-ацетилн или сиалова», киГ раминовзя, (NAcNeu). """ ~"слота Различные моносахара, соедини определенную последовательность, обпГ*Ь ° олигосачарид, который присоединяв11* одним концом к белковой молекуле по женной в липидный матрикс мембраны "тУ" пография олигосахаридных остатков по НОШЕНИЮ к мембранному белку показа 0Т~ рисунке, изображающем молекулу одд На из наиболее изученных интегральных Ы,'" ков мембраны эритроцитов человека и " вотных — гликофорина. к~ Олигосахарид ы мембранных белков сл« жат специфическими лигандами для свяя вания с лектинами. При этом существенн' что связывающие участки лектинов спе­
цифичны к определенным сахарам. Так. кон-
канавалин А связывается с остатками a-D-маннопиранозы и a-D-глюкопираноэц содержащими немодифицированные гидро-
«сильные группы в положениях С-3. С-4 и С-6. В этим белке есть также специфичес-
кие участки связывания ионов Са!* и пе­
реходных металлов, например Мп5*. Лек-
тин из бобов сои связывается с остатками D-N-ацетилгалактозамина и D-галактозы, а лектин из семян пшеницы специфичен к D-N-ацетил глюкоз а ми ну. Лектин чечевицы обладает сродством к a-D-маннопиранозиль-
ным и a-D-глюкопиранозильным остаткам, лектин улитки Helix pomatla специфичен к N-ацети л- D-гала ктозаминовым остаткам. Специфичность некоторых лектинов к оли-
госахаридным лигандам характеризуется также данными, приведенными в таблице. Итак, имея в руках препараты лекти­
нов с различной специфичностью, их мож­
но использовать для исследования клеточ­
ной поверхности. Для этого прибегают к фиксации клетки или тонкого среза и об­
работке препарата определенным лектином, но не обыкновенным, а меченым, длн того чтобы при микроскопическом исследовании можно было точно диагностировать состо­
яние мембраны. При этом лектины метят препаратом частиц коллоидного золота [п тогда при просматривании в электронном микроскопе четко видны места связывания лектина) или используют люминесцентную метку, детектируя лектины по свечению в флуоресцентном микроскопе. Описанные процедуры исследования поверхности клетки используют в лабораторной медицинской диагностике различных заболеваний, в су­
дебно-медицинской экспертизе и экспери­
ментальной цитологии. Препараты меченых лектинов выпускают многие биотехнологи­
ческие фирмы мира. Man - М*с( 31с- АсИс- Й NAcNeu- Gal - NAcGl c- Mar/ i (Fuel Конканавалин A (Con A) Gal - NAcGI c - Man \ Man- NAcGl c- Я Gal - NAcGl c- Mar/ Лиггин клещевины (RCA 1) NAcNeu~Gal - NAcGl c- Man- Man- H Леитин арахиса (PNA) Galpl - » 3NacGa(al - »Ser/Thr При-ечвние. Жирной линией обозначены участки сильного связывания олмгосах4 видного лмгвн-
дв с пектином, тонкой линией — зоны слабого связывания Роль э ндоге нных Лектино в Зачем клетке лектины? До настояще­
го времени роль собственных (эндогенных) лектинов клетки остается недостаточно яс­
ной, несмотря на то, что по этому поводу накоплен обширный экспериментальный материал. Некоторые иэ соображений, выс­
казываем ых на этот счет, таковы. Лектины поверхностей вирусов и бактериальных ви­
русов — фагов — служат для того, чтобы избирательно связываться с клетками макро-
и микроорганизмов и инфицироват ь их. Во всяком случае, для вируса гриппа и неко­
торых вирусов, вызывающих эксперимен­
тальные опухоли, это показано достаточ­
но убедительно. Таким образом, знакомство с лектинами вирусов может значительно продвинуть нас в понимании механизма возникновения некоторых болезней и в раз ­
работке эффективных методов защиты от инфекции. Лектины микроорганизмов, обитающих в тонком кишечнике человека и животных, определяют форму симбиотическог о сосу­
ществования макро- и микроорганизмов. Лишившись этих микроорганизмов, мы те­
ряем «друзей» и открываем доступ вредным, патогенным микроорганизмам. Это сфера Экологии желудочно- кишечног о тракта, которая очень важна для выяснения усло­
вий, обеспечивающих долголетнюю, здоро­
вую жизнь человека. Лектины могут представлят ь собой ком­
поненты систем, ответственных за узнава -
ние клеток; не исключено, что они соеди-
няют клеточные поверхност и друг с другом, связывая полисахаридкые группы двух со­
седних клеток. Связывани е лектинов с по­
верхностью плазматическо й мембраны клет­
ки может вызвать изменения в расположе­
нии мембранных белков и тликопротеинов. в физическом состоянии липидов, прони­
цаемости мембраны для рааличных веществ и активности мембранных ферментов. Ус­
тановлено, что эндогенные лектины могут изменять функционирование ионных кана­
лов, воздействуя тем самым на метаболизм клетки. Этим, собственно, и объясняется большая токсичность многих лектинов, в том числе и рицина, Роль лектинов в ряде биологических эффектов обусловлена их вмешательством в механизм связывания гормонов с их кле­
точными рецепторами. Это особенно ярко проявляется во влиянии многих раститель­
ных лектинов на механизм действия тако­
го важного гормона, как инсулин (инсулин — белковый гормон поджелудочной железы, принимающий участке в регуляции угле­
водного обмена в организме). По данным, полученным еще в начале семидесятых годов нашего столетия. WGA и КонА обладают способностью связыватьс я с рецепторами инсулина в клетках и тем самым влияют на регуляцию обмена глюкозы в организме животного. Еще одна малоисследованная, ни очень интересная функция эндогенных лектинов — их роль в акте размножения и ни началь­
ном этапе развития микроорганизмов — н эмбриогенезе. "Что касается размножении, то, как это показано в эксперимента х ни животных, специфически» адгезия («слипа­
ние») сперматозоидов на поверхности яйцек­
летки не проходит бел угленод-Гнлпкоиого узнавания с у ч а с т и т эндогенных лектинов. Наиболее изучены в этом отношении так называемые матриксные лектины корти­
кальных гранул яйцеклеток шпорценой ли-
гушкп — и:1люол энного объекта эмбриоло­
гов. Показано, что пни выполняют важную функцию защиты оплодотворенной клетки, делая ее недоступной для других сперма­
тозоидов. Еще более важна проблема иссле­
дования роли лектинов в процессах диффе ­
ренциации оплодотворенной яйцеклетки По данным эмбриологов, так называемые «эм­
бриональные » .лектины играют важнейшу ю роль в формировании нормального или ано­
мального организма на различных этапах развития яйцеклетки (дробления, гаСтру-
лы, нейрулы). Не лежит ли в основе неко­
торых генетических заболеваний человека и животных дефект, приводящий к нару­
шению образования некоторых лектинов и их функций? Ва жну ю роль в организ ме животног о играют так называемые лектины клиренс а Это большая группа эндогенных лектинов с различно й углеводно й специфичностью, способных «улавливать», в основном в пе­
чени, те или иные фрагмент ы углеводных с труктур, которые подле жа т дальнейше й Деградации. Система этих лектино в с лужи т Своеобразным фильтро м для улавливани я и у т илиз а ци и не ну жных д л я орг аниз м а структур. Обращаясь к рассмотрению роли лекти­
нов в растениях, нужно отметить, чтО не­
смотря на наличие лектинов в различных частях растительного организма, наибольшее их количество сосредоточено в семенах. Так, В семенах конского боба содержание лекти­
на кинканавалина А составляет 23—35% по отношению к общему содержанию белка; много лектина в семенах чечевицы и фасоли. В не­
которых случаях содержание лектина нара­
стает в процессе прорастания семян. Лекти­
ны семян имеют важное значение в регуляции деления клеток при прорастании, в том чис­
ле в процессе органогенеза, при котором из семени формируется растение. Широко рас­
пространены представления о том, что лек­
тины корневой системы выполняют роль за­
щитников растений от болезнетворных микроорганизмов и низших грибов, в больших количествах присутствующих в почве. Есть дан­
ные, указывающие на то, что лектины па­
тогенов обладают свойствами факторов агрес­
сии, позволяющих микробам или низшим грибам атаковать растение. Очень интересно направление иссле­
дования молекулярных механизмов «ин­
фицирования» растений азотфиксаторами — микроорганизмами, связывающими атмо­
сферный азот. Известно, что клетки азот-
фиксирующи х организмов рода ризобий, инфицируя корневую систему бобовых ра-
_ _ _ _ ^ _ BtJ»cHWaifpgf,„,r стений. вызывают разрастание иекоторЫ1( участков корней с образование и клубень­
ков . фиксирующих азот. Эта метаморфоз тканей корня начинается с монет а специ. фического лектин-углееодног о вааицидей_ ствня. лежащего в основе связывания „ ределенног о микроорганизма с вполне определенным видом бобового растения g,.^ тественно. что при создании так называе­
мых микробных удобрений необходимо боль­
шое внимание уделять этому начальному этапу ( белок- углеводном у узнаванию) подбирая при разработке новых бактериаль­
ных препаратов те микроорганизмы, кото­
рые обладают либо углеводными последо­
вательностями, узнаваемыми лектинаии растения, либо лектинами, специфичными к углеводным детерминанта м растения и расположенными на поверхности 6актериаль^ ной клетки. Разнообрази е возможных вари­
антов открывает обширное поле Деятельности для биотехнологов. Лектины в биотехнологии Как уже говорилось, лектины широко используются для диагностики рааакчттх наследственных заболеваний, для иденти­
фикации некоторых микроорганизмов, в исследовательской работе. В биотехнологии они находят применение в качестве специ­
фических реагентов, избирательно сорби­
рующих те или иные сложные соединения; гликопротеины, гормоны, сиалопротеины и др. Таким образом с помощью соответству­
ющих препаратов лектинов можно получить ценнейшие вещества, используемые при лечении многих тяжелых заболеваний. Весьма перспективной является проблема создания нового поколения препаратов — сво­
еобразных гибридов лектинов и антител для направленного воздействия на те или иные органы и ткани, где действие лектина могло бы оказать лечебный эффект. Одна из попы­
ток создания подобного препарата была не­
давно предпринята доктором А. Энгертсш (A. Engert). С целью лечения рака лимфати­
ческих узлов он использовал рицин, «сшитый» с антителами, избирательно доставляющими этот токсичный лектин к опухоли. Конечно, это лишь первые шаги в подобном использо­
вании лектинов, но поэтому они и важны. Литература 1. Королев И. П. Функции лектинов в клет­
ках .•' Общие проблемы физико-химической Био­
логии. М.: ВИНИТИ, 1384. т. 1. 2. Луцлк М. Д., Понасюх Е. Н., Лучик А. Д. Лек­
тины. Львов: Вища шк, 1981. И, К. Наградовв КАК ПОСТРОЕНЫ ФЕРМЕНТЫ Вве де ни е Историю .*tfзимологии [учения о фер­
ментах» можно условно разделить па три лгала. Первый ич них. начавшийся в 30-х гг. прошлого века, когда было обнаружено существование катализаторов биологичес-
кг>й прчроды — энзимов, или ферментов, продолжался около века и завершился ус­
тановлением важнейшего факта, что все ферменты являются белками- Вехой, раз­
деляющей первый и второй этапы разви­
тия энзимологии, можно считать серию исследований, показавших, что фермент не только может быть получен в химически чистом виде, но и закристаллизован. Пос­
ле классических работ Самнера (J. Sumner), закристаллизовавшег о уреаз у (1926 г.), и Нортропа (J Northrop), получившего крис­
таллы трипсина и пепсина (начало 30-х гг.), энзимология окончательно определилась как наука, предметом которой стало исследо­
вание индивидуальных макромолеку л — белков, обладающих способностью катали­
зировать химические реакции. В ходе пос­
ледующих десятилетий был заложен фун­
дамент этой науки и охарактеризован ы свойства сотен различных ферментов. Оказалось, что все они катализируют несколько основных типов химических пре­
вращений и могут быть разделены на 6 клас­
сов: I) оксидоредуктаз ы (переносят элект­
роны, гидрид-ионы или атомы водорода); 2) трансфераз ы (переносят отдельные ато­
мы между разными молекулами: 3) гидро­
лазы (катализируют гидролитическо е рас­
щепление связей); 4) лиаз ы (катализируют присоединение групп к двойным связям или образование двойных связей при удалении групп); 5) изомераз ы (катализируют пере­
нос групп внутри молекулы с образовани­
ем изомерных форм и 6) лигаз ы (катализи­
руют образование связей С- С, C- S, С- О и C~N при реакция х конденсации, сопря­
женных с расщепление м высокоэнергетичес -
кой фосфатной связи). Было установлено, что все эти реак ­
ции протекают по механизмам, известным из органической химии; вместе с тем фе р ­
менты оказалис ь несравненн о эффектив ­
нее катализаторо в небиологическо й приро­
ды, обеспечива я ускорение реакций на 10 порядков и выше. Были выявлены и описа­
ны и другие удивительные свойства био­
логических катализаторов — высокая (иногда абсолютная) специфичност ь по отношению к превращаемому субстрат у и способност ь подвергаться регуляции (т. е. изменять ак­
тивность) в присутствии специальных со­
единений — эффектпороя. Понимание мо­
лекулярных механизмов всех этих явлений требовало знания особенностей структур­
ной организации ферментов, <к>еспечива-
емых их белковой природой. Поэтому ус­
пехи развития энзимологии оказались тесно связаны с развитием методов белковой хи­
мии. Вначале сделалось возможным опре­
делить отдельные элементы первичной структуры, а затем и полную аминокислот­
ную последовательность ряда ферментов. Однако этих знаний оказалось явно недо­
статочно для объяснения функциональных свойств биологических катализаторов. Стало ясно, что эти свойства определяются осо­
бенностями пространственной организации макромолекулы, т. е. характером сворачи­
вания полипептидной цепи в третичную структуру. Однако до понимания того, как та Или иная функциональна я особенность фермента зависит от особенностей его про­
странственной структуры, было еще да­
леко. Качественно новый этап развития энзи-
мологии непосредственно связан с перио­
дом, называемым ренессансом в учении о структуре белковой молекулы. Он начался, когда благодаря развитию рентгеноетрук-
турнОго анализа стало выясняться, что при формировании молекулы фермента полипеп­
тидная цепь сворачивается не в «беспоря­
дочный клубок» (как считали раньше), а выстраиваетс я по определенным архитек­
турным принципам. Стало ясно, что от по­
нимания этих принципов, а также роли отдельных элементов пространственно й структуры зависит понимание молекуляр­
ных механизмов действия ферментов. На­
чало этого периода можно отнести к 70-м гг. нашего столетия, когда вслед за расшиф­
ровкой структуры лизоцима1 и некоторых протеолитических ферментов удалось уста­
новить строение ряда достаточно сложных белковых молекул. К настоящему времени определено около 3000 пространственных структур, из них несколько сотен — фер ­
менты. Наступило время, когда анализ на­
копленной и постоянно увеличивающейс я информации позволяе т не только понят ь структурные основы функционировани я отдельных ферментов, но и выявит ь общие принципы формировани я их активных цен-
1 Лиэоцим — фермент, расщепляющий гли-
козидные связи в пептидогликанах. Рис. 1. Типы пространственной структуры ферментов п-спирали обозначены либо как спиралевидные ленты, либо в виде цилиндров; р-тяжи — в виде стрелок, направ­
ленных по ходу полипептидной цепи от ее начала (N-конец) к концу (С-конец). Между этими элементами вторич­
ной структуры расположены гибкие петли. 7 — лизоцим куриного яйца. Желтым обозначен участок петли, -выр« зэнный- с помощью методов генетической инженерии (см. текст). Показано расположение двух дисупьфидных мостиков [мееду цистеиновыми остатками 64 и 60 и между остатками 76—94), -пришпиливающих" дли'*^~ петлю к основному каркасу молекулы. Активный центр расположе+н на границе между группой а-спиральных V)Ut/J0CFPO£MW W£fM£HTtJ 1M трон, реалм:1ации информационной подвиж-
initTM в ходе кпталипа, регуляторных вли­
янии и в конечном итоге перейти (I T объяс­
нения того, кок построен тот или иной фермент, к пониманию того, зачет он по­
строен именно так, а но иначе. Общие принцип ы ст рук т урно й орг аниз аци и ферменто р Характер пространственно й структу ­
ры белка (и в частногти, фермента) оп­
ределяется аминокислотной последователь­
ностью составляющей его полипептидной цепи, которая формирует элементы вто­
ричной структур ы — а- спирали, р- тяжи и петли. От их количества, размера и вза­
имной ориентации зависит «архитектур -
ный облик» молекулы, и следовательно, ее функциональные свойства. Существу ­
ют ферменты, построенные тольк о из «-спиралей и соединяющих их петель (гло­
бины; например, цитохромы1), только из f t - тяжей и петель ( химотрипсин), но в большинстве случаев имеется сочетание всех трех элементов вторичной ст рук т у ­
ры (рис. 1). а- Спирали могут быть совсем маленькими (4—5 аминокислотных остат­
ка), но иногда достигают довольно боль­
ших размеров (до 40 аминокислотных ос­
татков); в большинстве случаев спираль состоит из 3—4 витков. В отличие от а- спи рал ей р-тяжи никогда не встречаютс я «поодиночке » — они, как правило, образуют так называемые [1-листы (в составе которых связаны ме жтяже вы­
ми водородными связями). Топология этих листов — очень важна я характеристик а свойств фермента. Как видно на рис. 1, 1, в молекуле лизоцина имеетс я лист, состав­
ленный из двух р- тяжей, расположенных антипара л ле л ьно. Более сложные листы ха­
рактерны для молекулы химотрипсинэ (рис. 1, 4); листы, включающие параллель­
ные р-тяжи, можно видеть на примере 3-фосфоглицераткиназ ы (фермент глико­
лиза) (рис. 1, 6). Весьма распространенный "архитектурный мотив» — расположение Р-тяжей в виде *6очонка*, как это пока­
зано на примере триояофосфатиэомера -
лы ( фермен т гликолиза, см. статью Н. К. На градовой «Как работают фермен­
ты») — рис 1, 2; иногда листы организо­
ваны в структуру, получившую название «седло*, так как Р-тяжи перекрещивают ­
ся в одном месте. Такая структура харак­
терна, например, для карбоксипептидазы. На поверхности р-листов у на ко вы в а юте я гидрофобные остатки. Характер их распо­
ложения может определять мотив органи­
зации Р-структуры. Например, у «бочон­
ка» триозофосфатизомераа ы количество гидрофобных групп гораздо больше на внешней поверхности р-тяжей. чем внут­
ри. Они вступают во взаимодействие с гид­
рофобными группами а- спиралей, и это определяе т архитектуру молекулы (цент­
ральный «бочонок», обрамленный «- спи­
ралями). Комбинация Р-тяжей и а-спиралей образует стабильное гидрофобное ядро мо­
лекулы. Третий важный элемент структуры — петли, которые располагаютс я на поверх­
ности молекулы и в изобилии присутству­
ют в структуре каждого из изображенных ферменто в (рис.1). Петля — это продол­
жительный сегмент полипептидно й цепи* принимающий в трехмерной структуре раз­
нообразные конформации: различают линей­
ные петли ( вытянутые в пространстве), омега-петли (от греческой буквы И), име­
ющие небольшие расстояния между остат­
ками, расположенными у начала и у конца петли — не более 10 Е; такого рода петли 'Литохромы — гемопротеины, участвующие в переносе электронов в мембранах митохонд­
рий к других внутриклеточных структур. 'Химотрипсин — протеолнтический фермент, выделяемый поджелудочной железой в просвет двенадцатиперстной кишки. участков и Э-листом, состоящим из трех антилараллельных тяжей (он схематично обозначен в виде красного Овала) {из: Pickersgill, Я ег at. FEBS Lett., 1994, vol. 347, p. 200; с изменениями); 2 — триозефосфэтиэомераза. Темными линиями со стрелками обозначены петли, претерпевающие перемещение при связывании субстрата а активном центре, в состав которого входит гист»вдин (95), находящийся у начала короткой о-еппрали (на ее N-конце), а также глутамэт (165) {из: Werenga, R.K. еГ at. FEBS Lett., 1992, vol. 307, p. 35; с изменениями): 3 — субтилиэин. Активный центр формируется при участии аспэртата (32), гистидина (64) исер«на(221) [из; вгалглэп. С In; Introduction to Protein Structure. NY.: Garland Pbbl Inc.. 1991, p. 242; с изменениями); 4 — химотрипсин. Активный центр расположен на границе между двумя доменами и включает серии (195), гистидин (57) иаслартат (102) [из; Branden, С. In: Introduction to Protein Structure. N.Y.: Garland РиЫ. Inc.. 1991. p. 236; с изменениями); 5 — схематическое изображение НАД-связывающего домена, состоящего из р-тяжей: |)А. ОБ, ОС. pD, ()E и ()F и соеди­
няющих их спиралей «В, аС, о£ и aF. Красная стрелка показывает участок цепи, который у пактатдегидрогенаэы УДпинен и формирует дополнительную спираль иО и подвижную петлю (см. текст) [из: Branden, C-, EWund, H. In: Dehydrogenases Requiring Nicotinamide Coenzymes. Basel: Birkhauser, 1960. p. 46; с изменениями); 6 — 3-фосфог-
""дераткиназа. Активный центр формируется при взаимодействии участка, связывающего АТф (АДФ). располо­
женного нэ С-концевом домене (не рисунке слева), и участка, связывающего 3-фосфоглицерат (или 1,3-бисфос-
фоглицерат), расположенного на N-концевом домене (на рисунке справа). Эти области схематично обозначены Чисными овалами (из: Banks. И.О. eta!. Nature. 1979, vol. 279, р. Г75; С изменениями] -^^"^ЪРменп обычно планарны, т е. расположены в од­
ной плоскости. Третий тип петель — так на­
зываемые дзета-петли (от греческой буквы £) — нелинейные и непланарные. Аминокис­
лотные остатки, входящие в петлю, прак­
тически не образуют водородных связей между NH- и СО-группами основной цепи (что отличает их от остатков, формирую­
щих а-спирали и р-тяжи). Аминокислотные остатки петель гидрофильны и способны образовать собственное ядро за счет взаи­
модействий между боковыми группами. Петли сильно различаются по длине — от совсем коротких до включающих несколько десят­
ков аминокислотных остатков. Еще совсем недавно смысл существова­
ния петель в структуре ферментов оставался неясным; ситуация, однако, резко изме­
нилась в последние 7—8 лет. Стало оче­
видным, что во многих случаях петли вы­
полняют важнейшую роль, обеспечивая реализацию конформационной подвижнос­
ти фермента, необходимой для его функ­
ционирования. Лавинообразное накопление информации в этой области позволяет счи­
тать, что участие петель в работе фермен­
тов — широко распространенное явление. Исследование роли петель облегчается тем обстоятельством, что их «вырезание» с по­
мощью методов генетической инженерии, как правило, не отражаетс я на «архитектур­
ном облике» молекулы, т. е. не меняет вза­
имного расположения других элементов вторичной структуры. Такие лишенные петель белки обычно сохраняют конформа-
цию (пространственную структуру), близкую к конформации нативного (т. е. природного) белка. Однако функциональные свойства таких ферментов могут существенно изме­
ниться. Так, «вырезание» 11-членной петли, находящейся у входа в активный центр триозофосфатизомераз ы (рис. 1, 2, петля 6), практически полностью инактивирует фер­
мент. Это связано с тем, что петля б (как и движущиес я синхронно с ней петли 5, 7 и 8) принимает участие в формировании активного центра, индуцируемом связыва­
нием субстрата. Аминокислотные остатки, входящие в состав этих петель, фиксиру­
ют фосфатную группу субстрата — фосфо-
диоксиацетона, направляя его в область активного центра, где расположены ката­
литически важные остатки гистидина, за­
нимающего 95- е положение в первичной структуре, и глутамата (165- е положение). Движение петли обеспечивает правильную ориентацию этих остатков по отношению к субстрату (карбоксильная группа глутама­
та смещаетс я на 2 А). Важным результатом такого движения является также закрыва­
ние входа в активный центр и его экрани­
рование от растворителя. Аналогичный прин­
цип (движение петли, закрывающей активный центр и обеспечивающей er< fX°A B чательное формирование) лежит в °К°Н~ функционирования еще одного фепм"088 гликолиза — лактатдегидрогеназы Та же ряда других ферментов. Интересн Т*К~ во многих случаях подобное движение °' ЧТ° описывается как «закрывание века»"^11 петля движется как бы на «шарнирах»*' Т * обретая определенную жесткость. *' "Ри~ Естественно, что не все петли в щие в структуру молекулы ферме'нта°ДЯ~ посредственно вовлечены в катал • "е большая часть служит для поддери Их нативной (т. е. функционально активн"*? конформации. «Вырезание» таких пе может привести к получению ферм^н^ сохранившего определенную часть исх^' ной активности. Данное обстоятельство б °Д использовано в одной из работ по к о ^ 0 руированию лизоцима, обладающего меГ" шими размерами, чем природный фермент" с тем, чтобы сделать его способным пр ' никать через стенку бактериальных спор вызывая их разрушение. Замена петли соединяющей остатки 64 и 76 в структуп лизоцима (рис.1, 1), на более короткую 4-х членную петлю, привела к получению желаемого результата. Однако активность этого «укороченного» фермента составляла лишь 25% от активности нативного лизо­
цима. Последнее означает, что петля, распо­
ложенная на значительном расстоянии от активного центра, принимает определенное участие в формировании его структуры. Такое участие является косвенным, опос­
редованным сложной системой внутримоле­
кулярных взаимодействий, обеспечивающих стабилизацию пространственной структуры, характерной для данного фермента. Как правило, в формирование активного цент­
ра вовлечены аминокислотные остатки, зна­
чительно удаленные друг от друга в пер­
вичной структуре: это можно видеть и на примерах, приведенных на рис. 1 (глутамат 165 и гистидин 95 у триозофосфатизомеразы; аспартат 32, гистидин 64 и серии 221 у суб-
тилизина; аспартат 102, гистидин 57 и се­
рии 195 у химотрипсина). Таким образом, правильная взаимная ориентация данных ос­
татков в активном центре очень сильно за­
висит от совокупности взаимодействии, «приводящих» эти остатки в нужное поло­
жение. 4 Так.например, в случае субтилизина (рис.1, 3) функциональное состояние ак­
тивного центра зависит от правильног расположения 0-тяжа, несущего один и* каталитически важных остатков, и от пр 4 Субтилизин-
бактерий. прот! еолитически й фермен т flQCTPQtubt WPtttHtbt 1*1 вильног" расположении о>слирален. а ко-
TdjJblK лг*калигм>1шны два Други* 1КТД7КА - ка­
талитической триады* (см, Статью Н. К. Наг -
рвдовой - К а к pufioTBlOT фермент ы-! А Положение яти я элементов вторичной струк­
т уре, я свою очередь, зависит от и* спе­
цифических контактов с соседями я тре ­
тичной структур е белка, Так и м образом, состояние активног о центра зависит от всей совокупности внутримолекулярных взаимо­
действий, поддерживающи х пространствен­
ную ст рукт ур у Напомним, что это — си­
стема не к ое а ле нт ны х вз аимодейст ви й (водородные связи, элект рост ат ические, гидрофобные, ван- дер- ваал^сов ы нза И ми-
действия). Эт о позволяе т понять, почему иногда единична я мутаци я ( замена амино­
кислотног о остатка ( в области молекулы, даже удаленной от активног о центра, мо­
ж е т сильн о из менит ь фу нк циона льны е свойства фермента. Так а я «повышенная чув­
ствительность » ма к ромоле к у л ы белк а к небольшим локальным изменения м — чрез ­
вычайно важно е свойство ферментов, ле ­
жа ще е в основе их способност и подвергать ­
ся влиянию ( Ылостперически х эффекторов (см, ниже). Обратимся теперь к естественно воз­
никающему вопросу о взаимосвяз и Харак­
тера пространственной организации моле­
кулы фермент а с его функцией. Иными словами, существует ли корреляция между типом реакции, катализируемо й фермен­
том (окислительно-восстановительная, гид-
ролаэная, трансферазна я и т. д.), и ар­
хитектуро й его молекулы? Пожалуй, наиболее убедительный ответ на этот вопрос может дать рассмотрение большой груп­
пы ферментов, построенных по типу три^ озофосфатизомераз ы (рис. 1, 2), т.е. так называемых «бочонкообразных ферментов». Этот тип пространственно й организации — один из самых распространенных: 10% всех известных ферментов построены таким об­
разом, и среди них есть представители всех известных классов! Каким же образом обес­
печивается специфичност ь строения актив­
ных центров? Это достигаетс я благодаря тому, что сочетание 0- тяже й и се-спиралей, формирующих «бочонок», создае т как бы прочный «каркас», достаточно стабильный остов, на котором укрепляютс я многочис ­
ленные петли, обеспечивающи е широкое разнообразие вариантов построения актив­
ных центров. Следуе т отметить, что ак­
тивные центры таких ферментов, как пра­
вило, локализ уютс я на дне «бочонка», в С-концевой област и молекулы. Сопоставлени е с т рукт у р субтилизин а (рис. lF 3) и химотрипсин а (рис. 1, 4) дает нам пример отсутствия корреляци и между типом пространственно й структур ы фермен­
тов и их функцией. Оба эти фермент а — се-
риновые' лротеинаэы. использующие для кнтнлиш сочетание ия трех аминокислот ­
ных остатков, составляющих "триаду ак­
тивного центра — аспартат. шетиднк и се­
рии. Однак о элементы структуры белка, обеспечивающие сближение и ориентации этих остатко» в активном центре, совер­
шенно различны в обоих случаях. Здесь мы видии пример кохоерг ехтчо й эволюции на молекулярном уровне, когда одинаковые активные центры возникают на совершенно разной структурно й осиове(субтилизи н — это белок так называемог о а/р" типа, тог ­
да как химотрипсин построен из двух до­
менов, состоящих иа антипараллельных Р- тяжей). Приведенные примеры показывают, что общий «архитектурный облик» молекулы фермента — недостаточный критерий дли понимания его функциональных характери­
стик; такое понимание требует более де­
тального и глубокого анализа. Было бы неправильным, однако, считать, что такое заключение справедливо во всех случаях. Так, хорошо известное постоянство струк­
туры бел ков-глобинов (характерное сочета­
ние V—8 а-сниралей, соединенных петля­
ми) связано с обеспечиваемым при этом формированием полости, связывающей гем. Поэтому пространственная структура таких ферментов, как, например, цитохромы, прямо говорит об их функции. То же спра­
ведливо и в отношении структуры одного из доменов (см, ниже) НАД-зависимых де-
гидрогеназ. Как следует из названия, эти ферменты используют для катализа нико­
тина ми д-а дев и н дину к леот ид (НАД) в каче­
стве кофактора, принимающег о на себя гидрид-ион при окислении субстрата. Иссле­
дование пространственных структур не­
скольких таких дегидрогеназ показало, что каждая из них построена из двух доменов, един из которых служит для связывания НАД и обнаруживае т большое сходство у всех исследованных ферментов. Этот домен формируетс я примерно 150 аминокислотными остатками и представляет собой сочетание двух «складок РоеслиТкма»е, каждая из которых имеет следующую струк­
туру: Р- тяж—а-спираль—р-тяж—а-спир а ль— Р-тяж Первая складка Росеманна (РА—аВ— РВ—аС—рС, см. рис. 1, 5) образует специ­
фические контакты с аденозин-моионукле -
отидной частью НАД, вторая (PD—с<Е—РЕ— ! Сериновые протеиназы — протеолитичес-
кие ферменты, в состав активных центров ко­
торых входит аминокислота серии, * Название дано по имени ученого (М. Ross-
mann), впервые описавшего этот структурный мотив. «*•-—(№) — с никотина»4клми№»нукле<»тилноЯ. "Я рисунк е показана структура »ид»али-
лирчвакмиго» НАД-свнэывающего домена, т. е. структура, свойственная всем НАД-за-
висимым де гид роге на зам без учета их не­
больших Индивидуальных осооенностей- Осо­
бенностью лактатдегидрогеназы является то. что на пути от 3D к нЕ пол иле пти дна я цепь формирует дополнительную спираль «D (Ирэкду последним остатком тяжа ()D и спи-
ральк» ocD располагается петля, играюшая иектральную роль в катализе; о ней мы уже упоминали. Структуры типа складки Рос-
сманна довольно широко распространены и обычно встречаются в составе фермен­
тов, способных связывать нуклеотиды. В отличие от НАД-с вязы вающего домена структура второй половины молекулы фер­
мента, формирующей так называемый ка­
талитический домен, совершенно различ­
на у разных НАД-аависимых яегидрогеназ. Вместе с тем рассматриваемую группу фер­
ментов объединяет то, что во всех случа­
ях активный центр формируется на границе между НАД-свя-зывающим и каталитичес­
ким доменами. Ниже мы рассмотрим фун­
кциональные преимуществ а такого рода структурной организации ферментов. My л ьти д о ме н в а я структур а фе рме нт о в Образование пространственной структу­
ры большинства достаточно крупных фер­
ментов происходит в результат е сворачи­
вания отдельных участков полипептидной цепи в относительно автономные глобуляр­
ные образования, называемые доле «а ли. Окончательное формировани е третичной структуры таких белкой происходит благо­
даря специфическим взаимодействиям, воз­
никающим между отдельными доменами, каждый из которых сворачиваетс я самосто­
ятельно. Длинные полипептидные цепи обыч­
но формируют несколько доменов, величина которых значительно варьирует, составляя в среднем 150 аминокислотных остатков. Таким образом, домены можно рассматри­
вать как компактные «субструктуры» в со­
ставе макромолекул ы белка; они характе ­
ризуютс я тем, что число взаимодействи й между аминокислотными остатками в соста­
ве домена значительно превышае т таковое между соседними доменами. Благодар я этому междоменные области оказываютс я сравнительно легко доступны­
ми для растворител я и содержа т полости объемом 20—30 кубических ангстрем, вклю­
чающие несколько молекул воды. «Архи­
тектурные принципы» построения отдель ­
ных доменов, как правило, различны, что може т быт ь связ ан о с выполнение м ими раз ных функций. Согласно общепринятому представлению, мультидоменные ввлк вилникли в эволюции а результате слияни* генов, кодирующих разные домены. ил" вследствие дупликации (удвоения) генов*1 последующими изменениями, с Сложившееся к настоящему времен представление о сворачивании поли пептид" ной цепи в отдельные домены как об общ" принципе формирования пространственной структуры ферментов привело к качествен! ному скачку в развитии энэимологич, та как позволило выявить ряд общих законе^ мерностей, определяющих механизмы фу,,, кционирования биологических катализатйоь ~ Стало очевидным, что основные свойств ферментов, обеспечивающие как реализа­
цию каталиаа, так и регуляцию его эфф«к" тивности, в той или иной степени опреде­
ляются их мультидоменной структурой Роль мультидоменно й структур ы в катализ е Активные центры мультидоменных (в большинстве случаев — Двухдоменных) фер­
ментов, как правило, располагаются в меж­
доменной области. Таким образом, каждый из доменов вносит свой вклад в связыва­
ние участников реакции. В случае НАД-за-
висимых дегидрогена з присоединение и правильная ориентация молекулы НАД обес­
печиваются одним доменом (см. рис, 1, 5} а связывание субстрата и окончательное формирование активного центра —. другим. На рис. 1, 6 изображена двухдоменная струк­
тура 3-фосфоглицераткинаа ы и показана локализация мест связывания ее субстра­
тов — АТФ и 3-фосфоглицерат а на разных доменах. Важным следствием расположения актив­
ного центра на границе между доменами является обеспечение гибкости, подвижно­
сти данной области молекулы благодаря тому, что в ходе конс$ор-мационкы:г изменений, вызываемых связыванием субстратов', до­
мены претерпевают взаимное перемещение. Так, присоединение НАД и субстрата к ал-
когольдегидрогеназ е приводит к повороту каталитическог о домена относительно НАД-
связывающег о на 10°, что обеспечивает пра­
вильную взаимную ориентацию групп актив­
ного центр а и его экранировани е от растворителя. Описывая структуру НАД-связывающего домена, мы отмечали, что структурной ' Нековалентные взаимодействия молекулы субстрата с окружающими ее аминокислотныия остатками (например, образование водородных связей) вносят изменения в систему внутримо­
лекулярных вааимодействий, стабилизирующих определенную конформацию (относительно ста­
бильную структуру) молекулы белка. КАК построены ФСРЖНТЫ 14 скойенностьк! лактатде гидрогена аы является присутствие дополнительной а-гпирали м петли на границе между доменами (обозна­
чена стрелкой на рис. 1,5). Эта особенность ппредгляет и характер структурных изме­
нений лактатдегидрогенааы при связывании суОстрата. а именно — движение петли. Таким ооразом. один и тот же результат — формирование структуры активного цент­
ра — достигается у лактатдегидрогеналы и алкогольдегидрогенаэ ы с использование м разных принципов реализации конформа-
ционной подвижности белка Полипептидная цепь гексокинаяы, ката­
лизирующей перенос фосфатного остатка с АТФ на глюкозу, сворачиваетс я в два до­
мена — малый ( N- концевой ) и большой (С-концевой), На рис, 2 они обозначены зе­
леным и желтым цветом, В отсутствие глю­
козы между доменами имеется глубокая щель. АТФ может Связаться с такой формой фер­
мента, но это связывание «непродуктивно», т, е. не приводит к каталитическому превра­
щению АТФ (переносу фосфатног о остатка на воду). Связывание АТФ не вызывает кон-
форма ционных изменений- Совершенно иная картина наблюдаетс я при связывании глю­
козы на самом дне щели и взаимодействии ее с локализованными тан аминокислотны­
ми остатками. В результат е малый домен поворачивается относительно большого и зак­
рывает вход в активный центр. Это сопро­
вождается также переориентацие й функци­
ональных групп и формирование м активного центра, готовог о к катализ у. Описанные выше проявления «информационно й подвиж­
ности фермент а явились убедительным до ­
казательство м правильност и концепции, выдвинуто й Д. Кош ланд ом ( D. Kos hl and), Который еще в 1958 г. постулирова л прин­
цип индуцированного соотцяетоствия (induced fit) при взаимодействи и фермент а со СБОИ М субстратом. Информация, накопленная к настояще­
му ьремени, не позволяет сомневаться в том, что взаимное перемещение доменов — это один из наиболее распространенных меха­
низмов конформационных изменений, сопро­
вождающих функционирование белков (и не только ферментов) Рис. 3 суммирует совре­
менные представления об основных типах движения доменов: «'Скольжении** и «движе­
нии на шарнирах». Как правило, в каждом конкретном случае наблюдается сочетание ллементов обоих типой, хотя существуют ферменты, у которых явно преобладает один из них: «скольжение» домевоа — у цитрат-
синтетазы" и «шарнирный» тип движения — у аденилаткиназы. Два домена этого фер­
мента, включающие 30 и 38 остатков, пре­
терпевают при связывании субстратов (АМФ и АТФ) значительные перемещения, пово­
рачиваясь соответственно на 39° и 92°. Роль мультидоменной структуры в. регуляции активности ферментов Как уже отмечалось, одной из важней­
ших особенносте й ферменто в является их способност ь изменять свою активность в ответ на действие специфически х сигна­
лов, поступающи х из внешней среды. Та­
кими сигналами могут быть, например, из ­
ме не ни е конце нтраци и опре де ле нног о соединения, способног о связатьс я в спе­
циальном участке на поверхности белка (ал-
лостерическом центре; см. статью Н. К. На-
градовой «Олигомерная структура ферментов и ее функциональна я роль»), либо кова-
лентная модификаци я определенног о ами­
нокислотног о остатка, осуществляема я спе­
циальными ферментами, действующими под Е Фермент цикла трикарбоновых кислот. а СН^ОН Глюкоза АТФ, СНД-PQj - V^H он Глюкоэо-б-фоефат Глюкоза <£ » Рис. 2. Реакция, катализируемая гексокиназой (а), и схематическое (б) изображение конформационных изме­
нений гексокинаэы. вызываемых связыванием глюкозы Желтым изображен большой домен, зеленым — малый. ) — неактивная конформация фермента. Полость меж­
ду Доменами открыта для растворителя. При связывании АТФ на большом домене (фиолетовый треугольник) он не подвергается гидролизу, так как не сформирован активный центр и группы, обеспечивающие перенос фосфатного остатка с АТФ на гидроксил воды, не заняли правильного положения; г — связывание глюкозы вызывает конформационные изменения, сопровождающиеся движением малого домена и практически полным экранированием связанной глюкозы От растворителя. Вода вытесняется из активного центра; функциональ­
ные группы занимают правильное положение; АТФ оказывается в непосредственной близости от СН;0Н-
Фулпы глюкозы (обозначена красным кружком) [из: Bennett, W.S.Jr., SteiU, T.A. Pioc. Nat) Acad. Sci. USA, 1978, ^ 76. p. 4850; с изменениями) Домен l Q Домен 2 • Субстрат) междоменная область \ ШарНИ| Закрытая Кйнформация •Скольжение" -Движение на шарнирах" Рис.Э. Два механизма взаимного перемещения доменов — «скольжение» и -движение на шарнира*, (а) и скольжение доменов в цитратсинтетаэе (б) э— переход от открытой конформации (область активного центра доступна растворителю) к закрытой (суб­
страт, связанный в активном центре, экранирован от внешней среды} осуществляется путем перемещения одного домена относительно другого- При si ом cipyxiypa каждого Диме на остается неизменной: они движут­
ся целиком, как «жесткие тела». Тип перемещения (скольжение или движение на шарнирах) определяет») структурой междоменной области, Белки, у которых преобладает тип скольжения, построены как комбинация слоев структуры, расположенных один над другим; наиболее часто скольжение наблюдается между участками структуры, состоящими из сочетания с-спиралей, ориентированных под значительным углом друг к другу. Дви­
жение на шарнирах происходит в результате значительных изменений торэионных углов основной цели в участках, нэзывэемык шарнирами, приводящих к вращению полипептидной цепи относительно этих участков; б— скольжение доменов в цитратсинтетаэе- Верх — структура молекулы фермента, состоящей из двух ломе-
нов : малого, содержащего спирали N, О, Р,ОиЙ, обозначенного зеленым цветом, и большого (спирали А, В, С, D, Е, F, G, Н, I, J, К, L, S и Т), обозначенного розовым цветом. Активный центр располагается между ними. Связыва­
ние субстратов вызывает скольжение малого домена над большим, приводящее к экранированию активного центра от растворителя. Скольжение происходит в результате суммирования множественных изменений кон­
тактов между отдельными участками спиралей- Низ — изменение положения спиралей О и Р и соединяющей их петли в результате скольжения малого домена. Спираль О смещается на 10.1 А и поворачивается на 28°. Черным обозначено положение спиралей в отсутствие субстратов, зеленым — при их добавлении (из: Gerslein, М- е( at. Biochemistry, 1994, vol. 33. p. 6742; с изменениями] контролем гормональной и нервной систе­
мы. В обоих случаях внешнее воздействие приводит к изменениям в системе внутри­
молекулярных взаимодействий, стабилизи­
рующих конформацию белка. Эти измене­
ния, распространяющиес я по структуре макромолекулы, доходят до активного цен­
тра и специфическим образом влияют на его конформацию. Молекулярные механизмы аллостеричес-
ких эффектов пока мало изучены, однако в последнее время было показано, что они во многих случаях осуществляются с участием специальных регуляторных доменов и их спе­
цифических взаимодействий с доменами, ответственными за катализ. На рис. 4 изоб­
ражены пространственные структуры двух ферментов гликолиза, подвергающихся ал-
лостерической регуляции: фруктозо-1.6-бис-
фосфатазы, активность которой тормозится (ингибируется) АМФ, и пируваткиназы из E.roli, активатором которой служит фруктозо-
1,6-бисфоефат. Видно, что в обоих случаях связывание аллостерического эффектора происходит при участии специального домена. Для того чтобы присоединение АМФ в аллостерическом центре фруктозе-1.6-бис-
фосфатазы, находящемся в самом начале регуляторного домена (между спиралями HI и Н2; рис.4, I), оказало влияние на кон­
формацию активного центра, удаленного на 28 А, необходима передача конформацион-
ных изменений через междыненные контак­
ты. Таким обрезом, взаимодействие меж­
ду доменами становится важным элементом реализации регуляторног о влияния и а фер­
мент. Еще более демонстративна роль меж-
домениых контактов в конфирмационном переходе пируваткинаа ы из неактивног о состояния в активное, стабилизируемо е яллостерическим активатором. Этот переход характеризуетс я сближением доменов А и В, *-• одной стороны» и расхождением до­
менов А и С, с другой (см. рис.4, 2), По­
скольку данный переход — согласованный, связывание активатора даже в отсутствие субстрата Судет смещать конфирмационное равновесие в сторону каталитическ и актив­
ной коиформации фермента. Регуляторные домены играют опреде­
ляющую роль в функционировани и ряда ферментов, катализирующи х фосфорили-
рование белков с участием АТФ, — про-
теинкиназ. В состав протеинкиназ ы вхо­
дит квталитимески й домен ( структур а которог о практическ и одинакова во всех случвях) и один или несколько регулятор-
ных доменов. Взаимодействие с регулятор-
ным доменом удерживает каталитически й домен в неактивном состоянии; активация наступает в результате конформационног о изменения, индуцируемог о связыванием специфическог о эффектора с регулятор-
нмм доменом. Структурное разнообразие регуляторных доменов — важный фактор, обеспечивающий активацию определенных Активный * ' центр Домен А Ал пистерический .центр Домен С 1 ^ А * Ст роен1"е Ферментов, обладающих регуляторными доменами Пео _КТ03П"'•(5-6и(;Фосфатаэа, Молекула состоит из 335 аминокислотных остатков, образующих два домена. ч«1 " N'KOHLt eBOM Домен формирует центр связывания аллостерического ижиСитора — АМФ (обозначен Ч)ным кружком). Второй, С-концевой домен обеспечивает формирование активного центра фермента, Рас-
Чмл^н^"1^" Э г и м и Центрами составляет ZB A, H1-HS - а-спирали. BI-B13 — fl-тяжи [из: Ке, И. е( э(. Ргос. ам" S C'U S A' ,9 В 9'v o 1 вб, р. 1477; с изменениями); 2 —пируезткинаэа из Е.соИЛолигептидная цепь (470 нокислотнык остатков) скалывается в три домена. Первый (домен А) формируется остатками 1—70 и 171— знач" Со Ст о и т и а чередования р-тяжей и а-спиралей. С ним соединен домен В (остатки 71—170), обладающий 34&-^^ЬНОЙ подвижностью, а также домен С (остатки 352—470). Пунктиром обозначена часть цепи (остатки са "• соединяющая домены А и С, Активный центр расположена полости между доменами А и 8. Центр гранЫЕаНИЯ ал,1С1Ст е Ричес,!ОГ 0 активатора, фруктоэо-1,6-бисфосфэта (указан черным кружком), находится на нИе„ИЦе м е * д" доменами А и С. Присоединений субстрата вызывает вращение домена В на 17,2° и «эакрыва-
на с а к т и в н о г о иентрэ. Переход фермента в активное состояние сопряжен с перемещением (на 14,9 А) доме-
а"ивя ТН°СИТеЛЬН 0 я о ы е н а Ai ч т 0 увеличивает щель между ними и облегчает связывание аллостерического вегуп Т ° Р а СоГлэс ов анные взаимные перемещения доменов лежат в основе механизма аллостерической ' я ц и и Фермента (из: Mattevi. A. etal. Structure, 1995, vol. 3, p. 731; с изменениями] npciTf ннкича i под влиянием специфичес­
кой* ('Игната, получаемого клеткой и улав­
ливаемого, чсре.-i ряд предварительных г талий, регуллторньтм доменом. Аналогичный принцип лежит в основе регуляции активности внутриклеточных не-
ли.юсомальных протейная — кальпаимоя (торможен И Р активности каталитического домена вследствие его взаимодействия с ре-
гуляторными доме на м и, снимаемся* при взаимодействии регул яторных доменов со специфическими эффекторами). Полифункциональны е фе рме нт ы Как следует ил изложенного выше, меж­
ду размером молекулы биологического ка­
тализатора (т.*?. длиной его полипептидной цепи) и сложность» выполняемой им фун­
кции существует прямая зависимость. Ус­
ложнение функциональных свойств дости­
гается как за счет формирования активного центра на границе между двумя каталити­
ческими доменами, так и за счет Появле­
ния дополнительных доменов, ответствен­
ных аа регуляци ю активности. Такие ферменты, как лизоцим и гликогенфосфо-
рилаза", резко различаютс я по размера м (129 аминокислотных остатков в первом и 842 — во втором), хотя оба катализиру ­
ют реакции расщепления гликоэидной связи. Функциональный смысл «утяжеления» мо­
лекулы гликогенфосфорилаа ы состоит в при­
дании ей дополнительной способности ко­
ординироват ь работу активного центра в соответствии С сигналами, поступающими из внешней среды (изменение концентра­
ции метаболитов, нервные и гормональные сигналы) Фосфорилаз а относится к числу наиболее сложно регулируемых ферментов и соответственно наиболее сложно органи­
зованных структурно. У некоторых фермен­
тов длина полипептидной цепи может пре­
вышат ь 1000 аминокислотных остатков, но это, вероятно, близко к верхнему преде ­
лу. При этом во всех случаях, даже в са­
мых сложных, полипептидна я цепь форми­
рует при сворачивании обк и-единственный каталитически й центр, осуществляющи й определенную, свойственную данному фер­
менту реакцию. Однако существуе т группа ферментов, не подчиняющихс я правилу: «один фе р ­
мент — один активный центр». Это особые фермент ы, полипептидна я цепь которых сворачиваетс я в пространств е таким обра­
зом, чтобы сформировать яе один, а несколько разных активных центров, способных ка­
тализироват ь разные реакции. Отдельные отрезки полипептидной цепи таких полмфик. кциоиаллнмх ферментол способны к саМо стоя тельном у сворачиванию в крупные tnu. Вулярные образования {так называемы" сулердо-кены). Каждое из них формируй самостоятельный активный центр, строение и функции которого зависят от аминокис­
лотной последовательности соответствующе го супер домена. Наряду с этим данные гло6уляриМе структуры тесно контактируют иежду t 0. бой путем нековалентных взаимодействий образуя единый ансамбль. К настоящеи' времени описаны десятки полифункциональ­
ных ферментов. Чаще всего встречаются бифункциональные, однако существуют и трифункциональные. и даже семифунк-
циональные ферменты (например, синте-
таэа жирных кислот позвоночных живот­
ных). При рассмотрении свойств полифункци­
ональных ферментов возникают два вопроса' 1 Как возникли такие ферменты в эволю­
ции? 2 Каковы те новые качества, кото­
рые приобретают ферменты, оказываясь ковалентно связанными в единую структу­
ру? Согласно общепринятому представле­
нию, возникновение поли функциональных ферментов является следствием слияния генов, кодирующих отдельные супердоме­
ны, в единую структуру. Что касается от­
вета на второй вопрос, то его, очевидно, следует искать в том влиянии, которое могут оказывать специфические б елок-белковые взаимодействия между супердоменами на функциональные свойства формируемых ими активных центров. Суммируя результаты, полученные при исследовании свойств бифункциональных ферментов, можно выделить три основ­
ных случая (см. рис.5). Если ферменты, катализирующи е последовательные реак­
ции определенног о метаболическог о пути (например, А- Б- В), объединены в единую структуру, создаютс я условия для пере­
носа интермедиат а Б, служащег о продук­
том первой реакции и субстратом второй, непосредственно между активными цен­
трами, без его выхода в среду (рис.5, 1). Такое «туннелирование » интермедиата экспериментальн о показано в ряде слу­
чаев и подробно исследовано на примере триптофансинтетазы10. Вторая часть рис. 5 иллюстрирует спо­
собность супердоменов бифункционального фермент а к согласованному переходу из одного конформациоиног о состояния в ДРУ-
" Фермент гликолиза, катализирует расщеп­
ление гликозидных связей в молекуле глико­
гена. 14 Продукт первой реакции — индол, обра­
зующийся при расщеплении индолглицеролфос-
фата в первом активном центре, непосредственно переносится во второй активный центр, где я превращается в аминокислоту триптофав-
т К ПОС ТРОЕНЫ в!£РПЕН ТЫ Ц Т Q-
• "-• «Ь Рмс, 5. преимущества объединения моно­
функциональных ферментов в бифункцио­
нальный ' — "Туннелиронание- иитермедиата. Фер­
мент Е, катализирует превращение мета­
болита А в метаболит Б. фермент Ег— пре­
вращение метаболита 6 в метаболит В. При последовательном действии этик монофун­
кциональных ферментов скорость накопле­
ния В будет зависеть от концентрации Б в растворе, тогда как бифункциональный Фермент (Е} обеспечивает прямой пере­
нос Б из активного центра Е, е активный центр Е?: 2 — согласованное изменение обеих активностей бифункциональног о Фермента при связывании аллостеричес-
кого эффектора в одном центре: a— мо­
нофункциональный фермент обладает ал-
лостерическим центром (обозначен крес­
тиком) и при связывании эффектора (R) переходит в новое конформационное со­
стояние, б — монофункциональный фермент нечувствителен к аллостерическому эф­
фектору, в — обе части бифункционально­
го фермента изменяют конформзцию при связывании эффектора е одном центре; 3 — согласованная регуляция активности ферментов, катализирующих противопо­
ложно направленные реакции: а—фермент, обозначенный желтым цветом, катализируй ет реакцию превращения А в Б (где А — субстрат, на который переносится фосфат­
ный остаток с АТФ. а Б — фосфорилиро-
еанный субстрат). Фермент, обозначенный зеленым цветом, катализирует гидролиз фосфатной связи с осво­
бождением неорганическог о фосфата и регенерацией А. В клетке эта гипотетическая ситуация не реализует­
ся, так как оба фермента находятся под контролем аллостерическик эффекторов, оказывающих на ник противо­
положное влияние (б). Связывание эффектора R активирует один фермент (активация показана красным цве­
том), одновременно угнетая другой (показано синим], в случае, когда ферменты объединены в общую структуру, описанный результат достигается при связывании эффектора лишь с одним из супердоменов (в) roe. Благодаря сложной сети внутримоле­
кулярных взаимодействий, возникающих при ассоциации супердоменов, связывание специфического эффектора (R) с одним из них вызывает конфирмационные изменения, распространяющиес я и на соседний супер-
домен. Важным следствием является при­
обретение ферментом чувствительност и к аллостерическому зффектору, отсутствую­
щей в том случае, когда данный фермент существует как монофункциональный (рис. 5, 2, желтые фигуры). И наконец, третий случай, изображен­
ный на рис.5, 3, относится к объединению ферментов, катализирующих противополож­
но направленные реакции. Регуляция ак­
тивности таких ферментов (например, ки-
наз, катализирующи х фосфорилировани е различных субстратов с участием АТФ, и фосфата а, катализирующих их дефосфори-
лирование) имеет важнейшее значение, так как позволяет избежат ь напрасной траты энергии АТФ, которая бы имела место при бесконтрольном течении обоих процессов (рис. Ь, За). Механизм согласованной регу­
ляции киназной и фосфатазво й активнос­
тей в пределах одного и того же белка под­
робно исследован на бифункционально м ферменте — фруктоэо-6-фосфат-Й-киназе/ фру ктозо - 2,6 -би сфосфатаз е. Полифункциональные ферменты зани­
мают высшую ступень в иерархии струк­
турной организации ферментов, построен­
ных из единичной полипептидной цепи. Дальнейшее усложнение достигается при образовании так называемой четвертичной структуры, т. е. при ассоциации отдельных мономеров-субъединиц {каждая из которых представляет собой белковую глобулу, сфор­
мированную при сворачивании пол и пептид­
ной цепи) в олигомер (см. статью Н. К. Наг-
радовой *Олигомерная структура ферментов и ее функциональна я роль»). Заключение В заключение обратимся к рис.6, кото­
рый схематически показывает иерархичес ­
кие уровни структурной организации фер­
ментов. Схема имеет обобщающий характер и не относится к каким-либо конкретным при­
мерам; ее назначение в том, чтобы сое ре-
Ml sgлки и дернена. "<D ,o QQ> Rue. 6. Иерархия структурной организации ферментов 1а — мономерный фермент, содержащий один каталитический домен (К). Активный центр обозначен углубле­
нием на поверхности, 16 — димер. образованный в результате нековалентных взаимодействий между одинако­
выми мономерами {субъединицами). Эти взаимодействия реализуются в области межсубьединичных контак­
тов (обозначены крестиками) и могут обеспечивать взаимное влияние активных центров; 2а — два одинаковых мономера двухдоменного фермента. Разным цветом они обозначены лишь для ясности изложения. Междо­
менная область, в которой располагается активный центр, обозначена красным цветом; 26 — димеры. образо­
ванные при разных способах ассоциации мономеров: слева —домены каждого мономера не меняют взаимной ориентации, справа— домены переориентируются так. что активный центр формируется на границе межау доменами, принадлежащими разным субъединицам. Таким образом междоменнай область становится одно­
временно областью межсубъединичных контактов» и целостность активного центра становится зависимой от целостности структуры олигомера; За — мономер, состоящий из двух каталитических (К) и одного регуляторно-
го (Р) домена; 36 — димер, образованный при ассоциации двух мономеров типа За; 4а — мономер трифунаци­
онального фермента. Первый {EJ и третий (Еэ) супердомены включают по Дез домена, а второй (ЕЦ)— один. Контакты между супердоменами (т. е. между отдельными ферментами) обозначены черным; 46 — димер три-
функциональпого фермента. Область межсубьединичных контактов образуется между Ej. принадлежащими соседним мономерам. Нужно иметь н виду, что в трехмерной структуре макромолекулы подобных областей контактов может быть несколько доточить внимание на принципах, ле жа-
щих в основе усложнения свойств биоло­
гических катализаторов в соответствии с усложнением их функции. В самой общей форме эти принципы можно обозначить как увеличение количества и усложнение ме­
ханизмов специфических белок-белковых взаимодействий, способных изменять кон-
формационное состояние активного цен­
т р а. Условно ЭТИ взаимодействия можно подразделить на внутрисубъединичные (на рисунке слева) и межсубъединичные, хотя у олигомеров, которыми является большин­
ство ферментов, имеется тесное сочетание и тех, и других, как это показано в правой части рис. 6. Литература 1- Белки и пептиды /Под ред. В.Т. Иванова. В.М. Липки на. М.: Наука, 1995, т. 1. 2. Наградавп Н. К., Муронеч В. И. Мультидоиен-
ная организация ферментов. Итоги науки и тех­
ники. Сер. Биологическая химия. М.: ВИНИТИ, 1991. т. 38. 3. Шуяъц Г., Шчржер Р. Принципы структур­
ной организации белков. Пер. с англ. М.т Мир, 1982. Н, К. Няградошш ОЛИГОМЕРНАЯ СТРУКТУРА ФЕРМЕНТОВ И ЕЕ ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ Введение Функциональные свойства биологичес-
кого катализатора, т.е. его способность ускорить определенную химическую реак­
цию, а также идмекжь свою активность в ответ на сигналы внешней среды, опреде­
ляются особенностями пространственной организации его молекулы, а также ее размером. В зависимости от степени слож­
ности реакции, катализируемой фермен­
том (соответственно, сложности строения активного центра), а также от способнос­
ти фермента формировать дополнительные центры связывания молекул-регуляторов, размер мономера, или структурной едини­
цы, образуемой при сворачивании полипеп­
тидной цепи, обычно варьирует от 12—15 до 100 кД. Однако лишь сравнительно небольшое число ферментов функционируе т в моно­
мерной форме. Это наиболее просто уст­
роенные, часто внеклеточные фермент ы (рибонуклеаэа, лизоцим, трипсин). Боль­
шинство внутриклеточных ферментов со­
стоят из нескольких полипептидных цепей, или субъединиц, образующих четвертич­
ную структуру. Силы, участвующие во взаимодействии между субъединицами, аналогичны тем, которые стабилизируют третичную структуру белка. Это в основ­
ном взаимодействия нековалентной природы (водородные связи, гидрофобные, элект ­
ростатические и ван-дер-ваальсов ы взаи­
модействия). Чаще всего макромолекула по­
строена из одинаковых с убъе дини ц — мономеров, т. е. представляе т собой гомо-
олигймер. Более сложный тип четвертич ­
ной с т рукт ур ы свойстве н фе рме нт а м, включающим в свой состав не только ка­
талитические субъединицы (формирующи е активный центр), но т акже и специальные регуляториые субъединицы, способные свя­
зывать эффекторы, влияющи е на актив ­
ность каталитически х субъединиц. Струк ­
турная организаци я подобных ферменто в может достигат ь з на чит е льно й степен и сложности; на приме р, к а т а л и т и ч е с к а я субъединица киказ ы фосфорилаэ ы находит­
ся под контролем трех регуляторных субъе ­
диниц. В составе макромолекул ы имеютс я 4 копии элементарно й структурно- функци ­
ональной «единицы»: ctfjyo, где v — ката ­
литическа я субъединица, а а, Р и 8— ре ­
г уля т ориые; нв т ив ны й фе р ме н т име е т структуру (ару8)-4. Олитомеры, включаю­
щие в свой состав разные субъединицы, называются гетероолигомерами. Немало и других примеров, подтверждающих пред­
ставление, согласно которому образование олиговлеров является одних из главных принципов организации структуры фермен­
тов. Выяснение функционального смысла существования ферментов-олигомеров — сложная проблема, уже давно находяща­
яся в центре внимания ученых-энэимоло-
гов. Ее разработка связана с исследован иен влияния межсубъединичных взаимодействий на основные функциональные проявления фермента — катализ и регуляцию актив­
ности, а также с установлением молеку­
лярных механизмов такого влияния. Цель настоящей статьи — дать общее представ­
ление о развитии исследований в этих направлениях. Олигомерныс фе рме нты, с ос тоящи е из одинаковых с у б ъе д ини ц Подавляющее большинство олигомерных ферментов построено как димеры или по-
лидимеры (тетрамеры, гексамеры, окта ме­
ры); олигомеры с нечетным числом субъ­
единиц (тримеры, пентамеры) встречаются значительно реже. Лишь очень немногие ферменты содержат десять, двенадцать и более субъединиц. При ассоциации субъ-
единиц в олигомер часть поверхности каждой из них оказываетс я внутри образовавшей­
ся структуры и служит границей раздела. Совокупность пространственно организован­
ных аминокислотных остатков субъедини­
цы, вовлеченных во взаимодействие с со­
седней суСъединицей, называетс я областью контакта. В том случае, если контакт обес­
печивается при взаимодействии между иден­
тичными областями поверхносте й субъеди­
ниц, он называетс я изологически-м, если между разными — гетерологическим. Почти все известные в настояще е вре­
мя димеры и тетрамер ы содержа т контак­
ты иэологическог о типа (рис. 1, 1). При ас­
социации субъединиц в триме р образование полностью изологических контактов невоз ­
можно; известные тример ы обладают кон­
тактами гетерологическог о типа ( рис.1, 2). На рисунке также показа н один из возмож­
ных механизмов образования гетерологичее -
ких контактов в олигомере, основанный на своеобразном «обмене доменами» (см. ста ­
тью Н. К. На градовой «Как построены фер­
менты*) между соседними субъединицами. Если молекула фермента ( Б случае олиго-
мера — суОъединица! состоит ил несколь­
ких дпменпв {глобулярных образований. формируемых разными отрепками лолипеп-
тидной цени. способными к самоетоятель­
ному сворачивани ю в пространственну ю структуру), активный центр, как правило, образуется на границе между соседними доменами. При ассоциации подобных суб"ь-
единиц в олигомер возможны два вариан­
та: 1) сохранение активных центров «внутри* каждой субъединицы с образованием меж-
субъединичны- х контактов «на перифери и молекулы» и 2) изменение взаимной ориен­
тации доменов в составе каждой субъеди­
ницы с увеличением расстояния между ними, с одной стороны, и сближени е доменов, Рис* 1, Способы ассоциации идентичных субъеди-
нин в олнгомеры 1 — субъединицы димера связаны изологическими контактами. Олигомер имеет одну ось симметрии второго порядка (полное совмещение структуры субъединиц достигается при повороте одной из них на 180°). 2— гетерологические контакты в тримере. Олигомер имеет одну ось симметрии третьего по­
рядка (для полного совмещения структуры соседних субьединиц необходим поворот на 120°). а—6 и в— г— совокупности аминокислотных остатков в облас­
ти межсубъединичног о контакта: 3 — один из вари­
антов образовании гетерологических контактов меж­
ду субъединицами {А — мономер, состоящий из двух доменов, потенциально способен образовать актив­
ный центр а междоменной области. Показаны три идентичных мономера, обозначенных разными цве­
тами; Б— при ассоциации мономеров в тример про­
странственно сближенными и образующими актив­
ные центры оказываются домены, принадлежащие разным мономерам-субьединицам. Область контак­
тов между доменами становится также и областью межсубьединичных контактов. Звездочкой обозна­
чен активный центр) [из; Bennett. M.J. et at. Protein Science, 1995,vol. 4, p. 2456; с изменениями. © The Protein Society] способных сформировать активный ut n T D но входящих в состав соседних суб-ы>динИц' с другой (см. рис. 1, Э). В результате ме>*^ доменная область становится одновреыея" но как зоной активног о центра, так и гд ластью контакт а между с Уоъедини ц а м и Подобный механияы, вероятно. реализуете при образовани и тримерног о фрагмент молекулы аспартаттранскарбамилааы, дд* которой локализация активных центров ид границе между соседними суЙъединицаНи надежно установлена. Описаны и друг11е случаи образования активных центров на границе между с yfi-ь единица и и ферментов-
олигомеров, механизмы которых могут 6ыт ь иными, чем описанный выше «обмен до­
менов». Функциональное значение ассоциации одинаковых субъедивиц в олигомер Для ответа на вопрос о функциональном смысле существования олигомерных фермен­
тов мы должны понять, какие новые каче­
ства приобретает катализатор благодаря тому, что отдельные мономеры вступают между собой в белок-белковые взаимодей­
ствия. Вполне очевидным преимуществом олигомера перед мономером является его большая стабильность; это общепризнанное положение не требует специальной аргумен­
тации; можно лишь заметить, что, как по­
казано в последнее время, увеличение числа субъединиц в одигомере, сопровождающее­
ся возникновением дополнительных контактов между ними, служит одним из механизмов термоадаптации гипертермофильных бак­
терий. Обратимся теперь к двум главным ха­
рактеристикам фермента — его каталити­
ческим свойствам и способности подвергаться регуляции. Несмотря на то, что каждая отдельная субъединица олигомерного фер­
мента обладает всеми структурными пред­
посылками для формирования активного центра, в отсутствие контактов с соседни­
ми субъединицами ее активность может изменитьс я либо исчезнут ь вовсе. Чтобы понять, насколько важны межсу&ъединич-
ные контакты для формирования катали­
тически активной конформации фермента, необходимо исследовать свойства его изо­
лированных субъединиц. О способности изолированных субъединиц олигомерных ферментов к катализ у Активны ли отдельные субъединицы фермента-олигомера? Этот вопрос возни­
кает естественно, так как каждая из субъ-
едикиц содержит В своем составе все струк­
турные элемент ы белка, необходимые для формирования активного центра. Следова­
тельно, речь идет о способности изолиро-
t ...^ШГРНАЯСТРГЧУУЛ тгшшуени ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ анной суПъединицы самостоятельно, Оел УЧЯГТИ Я соседних суГ>ъединиц. свернуться I, каталитическ и активную конфирмацию. В т,к11тлрьгх случаях г4иа природа подсказы­
вает рсигсние я т » г < ) вопроса Так. иногда оЛ"« м т о т ж е Фе Р м *'н т' Е"де ле к ч ый из pj.jHUK источников в каталитическ и активной форме, являетс я либо миномерик, либо ,*лигомером. Это указывае т на потенциаль-
H VK' способность субъединичных форм дан ­
ных ферментов существоват ь в активно й состоянии; однак о в к аждо м конкретно м случае необходима экспериментальна я про­
верка такой возможност и Рис.2 лает представлени е о методичес ­
ких подходах, которые могут при этот ис­
пользоваться. Допустим, что имеютс я два дммера, отличающиес я тем. что при дис­
социации в мяг ких условиях первый обра­
зует активные субъединицы (I), а второй — неактивные (Л). Экспериментальн о проверить активность субъединиц в таких условиях в большинстве случаев весьма трудно из- з а существования равновесия димер <н> мономеры, которое в присутстви и субстрато в обычно смещается в сторону олиг омерно й формы; поэтому д а ж е в ра з ве де нны х ра с т вора х работающи й фермен т сущест вуе т к а к оли -
гомер. Получит ь мономерные формы мо ж ­
но, раз руши в межсубъединичны е к онт а к ­
ты обработко й д е н а т у р и р у ющи м аг ент о м |рис. 2, 2), однак о пр и этом происходи т и з ­
менени е т р е т и ч н о й с т р у к т у р ы и, е с т е ­
ственно, акт ивност ь не мо же т быт ь обна ­
ружена. После удаления денатурирующе ­
го агента третичная структура восстанав­
ливается, и становится возможной реассп-
циация суб-ьединиц в олигомер. При зг ой Возможны два пути: б -+ в —* г, в ходе кото­
рого происходи т полное восстановлени е пространственно й структур ы отдельных субъединии с их последующе й ассоциаци­
ей в димер, к путь б -> д -> е, при котором межсуб- ьединичные контакт ы возникают раньше, чем закончитс я полное восстанов­
ление пространственно й структуры, так что реактиваци я субъединиц происходит в со­
ставе димера. Различие между варианта ­
ми 1 (субъединицы обладают активностью) и П (субъединицы неактивны) состоит в том, что в первом случае восстановление актив­
ности возможно как на стадии е. т а к и на стадии с, тогда как во втором — только на стадии е. Для выбора между этими вариантами можно использовать анализ кинетики реак­
тивации; однако более надежными являются прямые методы исследования изолирован­
ных субъединиц в условиях, исключающих их реассоциацию в олигомер. Один из таких методов (иммобилизация на нерастворимом носителе) показан на рис. 2, 3. Применение этого, а также других подходов открывает возможность анализировать свойства отдель­
ных субъединиц. Рассмотрим в общих чер­
тах, какую информацию дают подобные ис­
следования. Неспособность субъединицы к катализу может объясняться одной из сле-
Рис, 2. Диссоциация димерной молекулы фер­
мента на субъединицы в разных условиях и по­
лучение изолированной субъединичной формы I— димер, отдельные субъединицы которого каталитически активны; //— димер, образую­
щий при диссоциации неактивные субъеди-
ницы. 1 — равновесие между олигомерной и мономерными формами в недензтурирующих условиях; 2— диссоциация на субъединицы при обработке денатурирующи м агентом с последующей реассоциацией при его удале­
нии (а — разворачивание полипептидной цепи; б — удаление денатурирующег о агента, сопро­
вождающееся частичным восстановление м пространственной структуры; в —- окончатель­
ное сворачивание мономеров в третичную структуру; г— реассоциация субъединиц, окон­
чивших сворачивание; д — ассоциация субье-
диниц, не закончивших процесс сворачивания, с последующим сворачивание м в составе олигомера (е)); 3 —димер, связанный с нера­
створимым носителем через одну субъедини­
цу, подвергается обработке денатурирующи м агентом, что приводит к отщеплению субъе­
диницы, не связанной с носителем коеалент-
но. После отмывания носителя со связанной субъединицей от денатурирующег о агента и отщепившегося белка (б) иммобилизованна я субьединица сворачивается в пространствен ­
ную структуру (в) - h g b S p V * * ^ - <§ ВСЯКИМ tBtPHtt.,.. Лунпцих причин: в формировании активно­
го црктра участвуют функциональные груп­
пы, входящие в состав соседних субьеди­
ниц «мкгомера: межсуб-ьединичные контакты необходимы для приобретения и стабилиза­
ции каталитически активной конформации белка. Иными сливами, аминокислотные ос­
татки, расположенные а области иежсубъ-
единичных контактов, участвуют в системе» внутримолекулярных взаимодействии, обес­
печивающих правильную взаимную ориен­
тацию групп активного центра И наконец, субъединица может быть неактивна потому, что для реализации каталиян необходимо тесное сопряжение работы соседних ак­
тивных центров в составе олигомера. Вы­
яснение того, какой ид этим механизмо в справедлив применительно к конкретному ферменту, существенн о для понимания структурных основ его каталитическог о дей­
ствия. В том случае, если отдельная субъеди ­
ница активна, также возможно несколько вариантов: 1) активность субъединицы от­
личается от активности олигомера (по ка­
талитической эффективности, специфично ­
сти, ме ханиз му и т.п.); с равните льно е исследование этих форм фермент а — про­
дуктивный подход для выяснения вклада межсубъ единичных взаимодействи й в реа­
лизацию разных элементов катализа; 2) ак­
тивность субъединиц ы не отличаетс я от активности олигомера, т. е, ассоциация субъ-
елинии никак не отражаетс я на состоянии их активных центров; в этом случа е роль олигомерной организации молекулы фермен­
та в основно м с водитс я к с т абилиз аци и структуры субъединиц; 3) активност ь с убъ­
единицы превышает активность мономера что может указывать на снятие (в резул^ тате диссоциации) конформационных огра_ ничений. накладываемых на активный центр межеубъединичными взаимодействиями, т. ц быть проявлением так называемой коопе-
pamueKwmi i еубъединиц. Рассмотрению зто-
го важного свойства, присущего некоторый ферментак-олигомерам, посвящено дальней­
шее изложение. Кооператинность суб-ьединиц в ферменте-оли том ере Если активные центры субъединиц фун­
кционируют независимо друг от Друга, ки­
нетическое поведение олигомерного фермента не отличаетс я от поведения моноиерного фермента, и зависимость скорости реакции оч концентрации субстрата описывается ги­
перболой (рис. 3, кривая 1). В том случае, когда возникновение межсубъединичных контактов создает систему, в которой функциональное Состояние определенног о активного центра зависит от состояния соседних, наблюдают­
ся разные отклонения от гиперболической за­
висимости скорости реакции от концентрации субстрата, отвечающие разным типам коо­
перативное ти субъединиц. Остановимся на рассмотрении одного из наиболее подробно изученных случаев — так называемой шлло-
жителъкай кооператиеноети- Кинетически она проявляетс я в виде сигмоидальной за­
висимости скорости реакции от концентрации Субстрата (рис. 3, кривая 2). Сравнение кри­
вых 1 и 2 позволяе т видеть функциональное преимуществ о олигомера, обладающег о ко-
оперативностъю активных центров, перед «не­
кооперативным» олигомером. Рис. э. Положительная неоперативность субьединиц в димерной молекуле фермента I— кинетические проявления хооперативности (зависимость скорости реакции от концентрации субстрата, [S]): 7 —димер, не обладающий коооеративностью; 2—димер, обнаруживающий положительную кооперативность; 3— Присутствие аллостерического активатора уменьшает кооперативность; 4 — присутствие аллостерического инги­
битора увеличивает ее. //— модель, описывающая положительную кооперативность: 1 — «некооператиаиый- димер существует в единственной конформации (R); 2— •кооперативный» димер существует в двух конформационных состояниях, находящихся s равновесии (Т и R), Переход между ними осуществляется при согласованном измене­
нии конформации обеих субьединиц. В отсутствие субстрата преобладает формат (константа равновесии, L В£»-
таточно валика ( L»i ). Связывание субстрата воз­
можно с обеими формами, однако форма R облада­
ет значительно большим сродством к нему. Поэтому при избытке субстрата вся популяция молекул пере­
ходит из формы Т в форму R. Кооперативность субь­
единиц наблюдается при частичном насыщении суб­
стратом и реализуется благодаря тому, что связыва­
ние одной молекулы субстрата, стабилизируя R-состояние во всем димере, смещает равновесие в сторону R-формы и увеличивает таким образом об­
щую концентрацию свободных активных центров, об­
ладающих высоким сродством к субстрату. Серым цветом обозначен путь конформационного перехо­
да; 3—влияние аллостерического активатора (овал), смещающего равновесие а сторону формы Я; 4 — аллостерический ингибитор (треугольник) смещает равновесие в сторону формы Т I Активность, % 100 4 6 В 10 "аЬусл.ед. 1 1В] Ц L,» L » l M ли/ПШРНЛ/* trPVHIVF* Vff-MtftfOa ft 11 ФУИкиИОЫАЛЬМА.Й РОЛЬ m дсйгт-»итч"Л1>11о. сгли для увеличения активности «некистервтивнпто» фермента от 1(1 до »"';*• необходимо примерно 811-крат-
г „„зрастение концентрации субстрата. 8 л в логичное увеличение активности .»] -
орератктнкТ!" фериентэ достигается уже при примерно 4-кратном ее возрастании. Подоб­
ное -усиление ответа- на изменение концен­
трации субстрата— чрезвычайно важная особенность так называемых регцллторнмх (бермеятав Катялияируя медленные, еко-
™сть-лимитирушшие стадии метаболичес­
ки* путей, эти ферменты епособчы коорди­
нировать суммарную скорость того или иного прпцесса в соответствии с изменениями ус­
ловий среды. Во многих случаях такие ферменты спо­
собны изменять свою активность не только при иаменении концентрации субстрата, по также в ответ на действие специальных эффекторов — метаболитов, евяэывающихея в участках, отличных от активного центра, и стабилизирующих фермент в определен­
ном конформационном состоянии (большей или меньшей активности). Ферменты, под­
верженные действию таких аллостперичес-
ких эффекторов, получили название »ол-
лостерические ферменты". В большинстве мультиферментных си­
стем аллоетерически м являетс я первый фермент метаболическог о пути; в качестве эффектора часто выступает конечный про­
дукт пути, осуществляющи й торможение первого фермента по принципу «обратной связи». Благодаря такому механизму регу­
ляции, а также действию эффекторов-ак­
тиваторов, скорость каждого метаболичес­
кого пути постоянно подстраивается к режиму, обеспечивающему потребности клетки в энергии или материале. Явление аллостерической регуляции ак­
тивности ферментов было обнаружено и описано более 30 лет назад, однако его структурные основы оставались в течение многих лет нерасшифрованными. Выдающий­
ся ученый, работы которого положили на­
чало исследованиям в этой области, автор термина «аллостерия» Жак Моно (J. Monad) назвал механизм кооперативности «вторым секретом жизни», вслед за первым, кото­
рым он считал структуру ДНК- Движение по пути, ведущему к раскрытию этого секре­
та, резко ускорилось в последние 10 лет, приведя к выяснению общих принципов, лежащих в основе аллостерического пове­
дения ряда ферментов. Отправной точкой Этого пути явилась разработка модели, объяс­
няющей аллостерическое поведение фермен­
тов на основании жшформационных переходов между разными состояниями олигомерной молекулы белка. Согласно этой модели, пред­
ложенной Моно и др, s I965 г„ олигомер иожет существовать в двух конформацион-
ных состояниях, находящихся в равновесии: ати достояния рэ^ич&нггея характером меж-
су*гьединичньгх контактов и особенностями расположения функциональных групп актив­
ных центров В одном из состояний, назы­
ваемом К (от англ. «relaxed» — релаксиро-
аанноер, активный центр связывает субстрат «правильно* и функционально активен, тогда как в другом состоянии существуют опре­
деленные конфирмационные ограничения, затрудняющие организацию активного цен­
тра, способного к эффективному функцио­
нированию. Это состояние называется Т (от англ. -tense" — напряженное). Существенно, что переход из одиого состояния в другое осуществляется всеми субъединица ни одновременно, поэтому мо­
дель называется нешкметричной», ИЛИ "Со­
гласованной». Между двумя состояниями существует равновесие, характеризующе­
еся аллостерической константо й L (см. рис, 3, 1J, 2). Субъединицы олигомера (на рис.3 — димерэ), находящегося в опреде­
ленном конформационном состоянии, не различаются по прочности связывания суб­
страта, т.е. присоединение первой и вто­
рой молекул субстрата к субъединицам в состоянии Т происходит с одинаковой кон­
стантой диссоциации (Кт). а присоединение субстрата к субъединицам в состоянии R — с константой KR. Так как К „ « Кт, т. е. ак­
тивные центры фермента в R-состоянии об­
ладают значительно большим сродством к суб- j страту, его добавление к равновесной смеси I молекул, находящихся в Т- и В-состояниях, I сдвигает равновесие в сторону R-формы. Это * приводит к возникновению дополнительного количества свободных активных центров, обладающих высоким сродством к субстрату (см. рис.3, П, 2). Таким образом, субстрат как бы индуцирует свое связывание, что на­
ходит отражение в характере кинетической кривой, описывающей положительную нео­
перативность (рис. 3, I, кривая 2). Легко по­
нять, что степень кооперативности субъединиц в составе олигомера зависит от величины ал­
лостерической константы L, т. е, от соотно­
шения концентраций Т- и R-форм, Чем выше аллостерическа я константа, тем сильнее вы­
ражена кооперативность. Если L = 0, весь фермент переходит в состояние R и коопе­
ративно сть исчезает. Влияние аллостерических эффекторов также объясняется сдвигом равновесия между формами Т и R. Как показано на рис. 3, II, 3, аллостерический активатор способен избирательно связываться с R-
состоянием олигомера, увеличивая этим кон­
центрацию данной формы и уменьшая ве­
личину L. Результатом является снижение степени кооперативности субъединиц и как следствие— активация фермента, наблю­
даемая в определенном диапазоне концен-
^ 2 * «/ц грации tyfui\nt'tii ij>Hi- ,Li. t. нрин^я :ц t: лругоИ iififniiir.1. лл.пос! еричес-кии иигиОи' Top», 1'НН:1ыи,'|НП. i Т-формоИ, смещает paB-
НолееИс л лругуЮ rri ffi i.i f y Григ :*. //. 41. уигличинз я нг-лкчину L и степень комоера-
TMBHiKi H f||ис *i. L кринлл 41 Г^то приво­
дит к ингмоиронамню |тпрМ1Ш<'НКН^. наолю-
Ла<'М"му нри ненасыщающих концентрациях 4-yfin pa та Насколько применима HiutcJTb Мини и др. к fH'UJlMiiiHy поведению ферментов? Как и нснкан модель, una ииеет гнои ограниче -
НИН. Например, МИЛ1М1» Постулируе т толь­
ко дна колформациолнмх i'oc-тмннин Гм'лка, т. е значительно умронг,ает ситуацию, WMC-
ГОШуЮ место в ДСЙСТНоТс.пьноСТИ Модель Моно, ооигмваннца н механиз м |Л1Л'««итгЛ1| -
ной кооператияности. нг MII№I> T ОБЪЯСНИТ Ь такое шнрпк п распространенно е НВЛР'НИС. как отрицательн а л кч>опсратцнностпь суГп.единиц Лелкои-олитмсрон l-'яд фермен-
тив, обнаруживающих положительную ко-
оперативность, лишь отчасти подчиняется в своем поведении модели Моно, иногда одни и те же экспериментальные результаты можно объяснить на основании разных мо­
делей или при сочетании элементов разных моделей. И вместе с тем основные положе­
ния модели, постулирующей способность олигомеров претерпевать согласованные кон-
формационные переходы между конфир­
мационными состояниями, обладающими разными функциональными свойствами, вы­
держали проверку временем и спустя 30 лет получили подтверждение в эксперименталь­
ных исследованиях. Использование метода рентгеноструктур-
кого анализа позволило охарактеризоват ь структурные различив между Т- и R-coe-
тоякилми ряда ферментов, алло с тер и чес кое поведение которых описывается в рамках модели Моно (аспартаттранскарбамилаза, фосфофруктокиназ а и пируваткиназ а из бактерий, гликогенфосфорилаз а из мышц кролика и др.). Сравнивая конформацию фер­
мента, стабилизированног о в Т-еостоянии (закристализоваиног о в отсутствие субстрата или в присутствии аллостерическог о инги­
битора), с конфирмацие й фермента, закри­
сталлизованног о в комплекс е с аналогом субстрата или с аллостерическим активато­
ром (R-состояние), можно было установить, какие области молекулы вовлечены в ал-
лостерически й переход. Изучение свойств мутантов, полученных с использование м ме­
тодов генетическо й инженерии и содержа ­
щих единичные аминокислотные замены в определенных участка х структуры, допол­
нило полученну ю информацию. Прямые структурные исследования сде­
лали возможным установит ь локализаци ю участко в связ ывани я аллостерически х э ф­
фекторов, а т а кже понять, какова систе ­
ма в И утри молекул Я рМЫХ взаимодействий, ,,, елинякидих яти участки с активными ц»^. ТраМИ ф.рмемта В результате сравнительных исследуд^ ний. проведенных в ралных лаГюратоциях на равных ферментах, оказалось вочиож ныи выявит ь сходство общих принципов реализации аллостерических переходов Так стало ясно, что изменение функционале ных свойств фермента при переходе нз у в R-состояние достигается чрезвычайно .•кононнЫМ Способом — путем КоНформаци-
онных изменений, локализованных в опре­
деленных областях молекулы, с минималь-
ным изменением третичной структуры Свяпывакис алл|истерических эффекторов — как активатора, так и ингибитора— осу­
ществляется в каждом случае в одним и тон мсе участке; специфичность их влияния на активный центр определяется тонкими раз­
личиями в характере взаимодействия мо­
лекулы эффектора с функциональными груп­
пами белка, а следовательно, различиями вызываемых эффекторами конформанион­
ных изменений. Во всех исследованных случаях актив-
ный центр фермента формируется на гра­
нице между Двумя доменами, а аллостери-
ческие участки располагаются поблизости от межсубъединичных контактов (исключение составляет аспартаттранскарбамилаза, свя­
зывающая эффекторы на специальной субъ­
единице, ее свойства будут рассмотрены ниже). Аллостерический переход сопровож­
дается изменениями в области активного центра (междоменные взаимодействия) и в области межсубъединичных контактов. Та­
кое сопряжение внутри- и межсубъединич­
ных структурных изменении создает пред­
посылки для согласованного перехода всех субъединиц в новое конформационное со­
стояние. Переход в R-состояние характери­
зуется такой переориентацие й фукциональ-
ных групп активног о центра, которая необходима для правильног о связывания субстрата. Большую роль в передаче сигнала из эффекторног о центра в активный центр играют во всех случаях подвижные элемен­
ты структур ы белка — петли. Именно они обеспечивают локальные конформационные изменения, от которых зависит переход активног о центра в функционально актив­
ное состояние. Так, связывание активато­
ра (АМФ) и ингибитора (глюкозо-6-фосфат ) в аллостерическо м центре гликогенфосфо-
рилаз ы оказ ывае т влияние на активный центр, находящийс я на расстоянии 30 К благодаря изменению положения подвиж­
ной петли, расположенно й у входа в актив­
ный центр. В присутствии ингибитора опу­
щенна я петля экранируе т активный центр; добавление АМФ «оттягивает » петлю, вы-
иМРНЛ* ( tW/tTVP* Ф£РМГН№Л И if ФУММЦНО*г*ЛЬНЛЯ РОЛЬ ^mjMimr — —- ^ —— * - и* двух я .шнформ* ^ионные перестройки, ие-
I W J" ,. к фирмирнваник! участка свн.-шва-
я у' I MI Hi>rn M:1 суостратов реакции — неор-
"и1И.ц.гк(1Ги фосфита I I ui i i f l cvi Kr петли 'Иннсит от пространственной ориентации u-сниралей, находящихся на ре кон-
а ;>ти ориентация в с вон! очередь пп-
"^"рлястг я характером взаимодействия 'Г'гпиралей <: соседними элементами струк-
' йры Связывание а л лис терн чес и их ;крфек-
„poe вносит изменения в систему этих ваа-
м(1Л**йствий, итражающии й на положении ^-спиралей: в присутствии АМФ одна из вралей смещается в сторону межсуоъ-
•линичных контактов, «оттягивая* подвиж-
петлю; аллостерически й ингибитор ну*' •га бывает противоположное ьлинпис. Олмгомериые фермеиты, состоящие из разных субъединиц Некоторые ферменты — гетероолигомеры построены из так называемых npemojuepoe. каждый из которых представляет собой со­
четание разных (чаще всего двух) субъ­
единиц. Хотя активный центр обычно рас­
полагается лишь на одной из них, контакт с соседней субъединицей оказывается не­
обходимым для формирования каталитически активной конформации. Примером может служить Na, К-АТФаэа — олигомер, состо­
ящий и:г гетеродимеров типа up. Структура некоторых олигомеров дополнительно ус­
ложняется за счет присутствия регулятор-
нык суО-ьединиц, функция которых — свя­
зать специфический эффектор и реализовать его влияние на каталитические суб-ъеди-
ницы. Передача влияния (т е конфориаци-
ОНньгх изменений, вызываемых эффектором} осуществляется через область контактов, связывающих регуляторную суб-ьединицу с каталитической, механи;зм этого влияния зависит от свойств фермента. В качестве иллюстрации рассмотрим два примера. Ас л а ртаттра н с ка рба н и л аза; регулнторные субъедивнцы обеспечивают реализации мсжсуб-ьедипнчной кооператиност к каталитических субъедмнио. и передают на них влияние аллостерических эффекторов Аспа ртаттра иска рба мила аа катализирует первую стадию биосинтеза пиримидинов: карбамилфосфат + L-аспартат -* -> N-карбамиласпарта т + Р>р где Рн — неорганический фосфат, и подвер­
жена аллостерической регуляции: ингибиру-
ется конечным продуктом метаболического пути — ЦТФ, а активируется под влияни­
ем АТФ, Как показано на рис. 4, додекамер-
Рис. 4. Схематическое изображение структуры аспартаттранскарбамилаэы из Е.соВ и ее изменений при алпо-
стерическом переходе из Т- в R-состояние ' — додекамерная молекула фермента состоит из шести каталитических субъединиц (крупные сферы) и шести регуляторных субъединиц (мелкие сферы). При диссоциации в присутствии ионов ртути олигомер распадает­
ся на два каталитических тримера и три регуляторных димера. Активные центры располагаются на границе между соседними субъединицами каталитического тримера (обозначены звездочками). Все каталитические субьединицы идентичны по своей структуре; розовый и зеленый цвета использованы для более наглядного изображения. То же относится к регуляторным субъединицам: «синие» и «красные» субъединицы имеют иден­
тичную структуру. Молекулярная масса каталитической субъединицы равна 34кД, регуляторной— 17 кД. II — переход из Т- в R-состояние (в присутствии субстратов и аллостерического активатора АТФ) сопровождается изменением взаимной ориентации субъединиц в олигомере. Аллостерический ингибитор ЦТФ вызывает пере­
ход из В-состоямия в Т-состояние. С — субстрат ная молекула фермент а содержи т ud'i'Ti. к ат алит ическ и х суоъединиц, достаточн о тгрочно снн^аиных н два примера (эта связь сохраннгтг и «ри диссоциации, происходящей и присутствии ионов ртути), и шесть регу-
лнторных субъединиц, о5ъединенных в ди-
меры. Каталитически е субъединицы связы-
ни ют с у бс траты и осуществляют реакцию, тогда как регулиторнц о обладают участка ­
ми связывания аллостеричсских эффекторов. Кажда я каталитическа я суПъсдиница состпит ил двух доменов: агпартат~свл.1ывающет о к карбамилфосфнт- связывающего. Активный центр формируетс я на границе между эти ­
ми доменами таким «Врачом, чти цдин до­
мен принадлежи т иди nil субъединице, а вто­
рой — друг ой. Так о й способ орг анизаци и активных центров на границ* 1 между сосед­
ними субъединицами обсуждалс я нами ра­
нее. Тримеры. освобожденные от контактов друг с другом, а т а к ж е с рег уляторным и субъединицэми, каталитическ и активны и не прожилин)!" кооперативных свойств ( их к и ­
нетическое поведение указывае т иа то. что активные центры функционируют независи­
мо друг от друга) - Иными словами, изоли ­
рованные тример ы сущест вуют тольк о в R-состоянии. Способност ь к перекод у в Т- состояни е ( и, следовательно, кооперативност ь ак т ив ­
ных центров) возникае т лишь при условии контактов межд у тримерами. А ято, в свою очередь, возможно лишь при участ и и ре -
гул я торных субъединиц, образующи х слож­
ную систему взаимодействий: к а жда я ре -
г улят орна я субъединиц а к о н т а к т ир у е т с двумя каталитическими субьединицами ( при­
надлежащим и разным т римерам), а т а к ж е с соседней рег уляторно й субъединицей. Т а ­
ким образом к ат алит ическ и е т ример ы к а к бы скрепляютс я рег уляторным и димерами в составе додекамер а Следуе т обрат ит ь внимание на то, что, являяс ь у ч а с т ник а ­
ми формировани я олигомерно й с т ру к т у ры, необходимой для возникновени я кооператив -
ног т и к ат алит ическ и х субъединиц, рег уля -
т орк ые субъединиц ы выполняют в данном случа е чист о с т р у к т у р н у ю роль, т а к к а к додек аме р способе н к переход у из Т - в R- состояни е в отсутстви е аллост ерически х эффекторов, связ ывающихс я с рег улят ор ­
ными субъединицами. Та к о й переход инду ­
цирует с я связывание м субстрата. Поэт ому можн о сказат ь, что перва я фу нк ци я рег у -
лят орных субъедини ц — это обеспечени е ^ о п е р а т и в н о с т и ме жд у к а т а лит иче с к им и субъединицами. Вт ора я их фу нк ци я — пе ­
редача сигнала аллостерическог о зффектор а на ак т ивные центры. К а к и в случа е друг и х аллостерически х ферментов, связывани е активатор а и инг и ­
битора осущест вляет с я в одном, и том ж е центре, и разный харак т е р их влияни я на конформацию фермент а зависит от специ­
фики их взаимодействия с функциональными г руппами участ к а связывания. Передача влияния иа аллостерическог о центра, рас­
положенног о на регуляторно й субъединице на расстоянии 60 А от каталитическог о цен ­
тра, реализуетс я через сложну ю цепь внут­
римолекулярных взаимодействий. Переход из Т- состояни я в R- состояние связан со сбли­
жением доменов каталитически х субъединиц, необходимым для формировани я функцио­
нально ак т ивно й конформаци и активног о центра. Ст рук т урные изменения, лежащие в основе аллостерическог о перехода, про­
исходят согласованно, затраг ива я весь оли-
гомер, и связан ы с изменение м взаимной ориентаци и субъедини ц (рис. 4, II). Пр о т е ин к ин а э а А: рег улят орные субъедняиц ы т ормоз я т акт ивност ь к а т а ли т и ч е с к и х субъедипи ц Прот еинк инаэ а А, или цик ло- АМФ- з а -
ьисимая протеинкинаэа, осуществляе т фос-
форилировани е многих белков, приводяще е к изменени ю их функциональных свойств. Акт ивност ь этог о фермент а строг о рег ули­
руется; в отсутстви е специальног о активи ­
рующег о сигнала протеинкинаэ а неактив­
на. Сиг нало м являютс я связывани е гормона с рецепторо м на внешне й стороне клеточ­
ной мембраны и ак т иваци я аденилатцикла -
з ы, с и н т е з и р у юще й ц и к л и ч е с к и й А М Ф (рис. 5), Механиз м активаци и протеинкиназ ы Плазматическая АТФ • гормон • циклический ЭДДФ •т_-ФФ" Рис. 9- Механизм активации протеинкиназы А Связывание гормона с рецептором, расположенным на внешней стороне цитоллаэматической мембраны, вызывает активацию аденилатциклаэы (*Ц) через посредство специального белка (Б). Образующийся циклический АМФ связывается с регуляторными субъединицами протеинкиназы, вызывая конформа-
ционные изменения, приводящие к диссоциации тет-
рамера на димер регуляторных субъадиниц и д м мономера каталити