close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

uploaded 0C307E8042

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
СТЕПАНОВ ДЕНИС НИКОЛАЕВИЧ
ОБОСНОВАНИЕ КОМПЛЕКСНОГО ПРИМЕНЕНИЯ
БАКТЕРИОФАГОВ И ПРЕПАРАТА АРГОВИТ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И
ЛЕЧЕНИЯ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА КУР В ПРОМЫШЛЕННОМ
ПТИЦЕВОДСТВЕ
06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология,
эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата ветеринарных наук
ОМСК – 2017
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном
образовательном учреждении высшего образования «Омский государственный
аграрный университет имени П.А. Столыпина».
Научный руководитель:
Плешакова Валентина Ивановна
доктор ветеринарных наук, профессор
Официальные оппоненты:
Золотухин Сергей Николаевич,
доктор биологических наук, профессор,
декан факультета ветеринарной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ
Татарникова Наталья Александровна,
доктор ветеринарных наук, профессор,
заведующая кафедрой инфекционных
болезней ФГБОУ ВО Пермская ГСХА
Ведущая организация:
ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургская
государственная академия
ветеринарной медицины»
Защита состоится «20» декабря 2017 года, в 15-00 часов на заседании
диссертационного совета Д 220.050.03 при ФГБОУ ВО Омский ГАУ по адресу:
644008, г. Омск, Институтская площадь 1
тел. (3812) 24-15-35, факс (3812) 24-39-63, E-mail:lescheva@list.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБОУ ВО
Омский ГАУ www.omgau.ru
Автореферат разослан «_____» ___________ 2017 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
канд. ветеринар. наук, доцент
Лещѐва Надежда Алексеевна
2
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Птицеводство является одной из
наиболее рентабельных и высокопродуктивных отраслей сельского хозяйства.
Однако, несмотря на достигнутые показатели, в промышленном птицеводстве
остается много нерешенных проблем. Одна из них – болезни бактериальной и
вирусной этиологии (Бакулин В. А., 2006; Черных М. Н., Федотов С. В., 2008;
Егоров И. А. с соавт., 2009; Тухфатова Р. Ф. и др., 2013).
Сальмонеллез занимает одно из ведущих мест среди бактериальных
инфекций на птицефабриках (Поломошнов Н. А. и др., 2011; Чугунова Е. О. и
др., 2014).
Хозяйства, сталкиваясь с проявлением инфекции, несут большие потери в
результате падежа молодняка, снижения продуктивности, качества продукции и
наложения
ограничительных
мероприятий
на
выпуск
продукции.
Обсемененные сальмонеллами яйца и мясо птиц являются основными
причинами пищевых токсикоинфекций у людей (Куриленко А. Н. и др., 2002;
Данилевская Н. В. и др., 2006).
До настоящего времени проводимые мероприятия против сальмонеллеза
птиц не всегда эффективны, санитарные мероприятия и применение
антибиотиков не позволяют избавить птицу от сальмонеллоносительства, не
способны профилактировать и ликвидировать инфекцию, а предотвращают
лишь массовое клиническое проявление болезни (Данилевская Н. В. и др., 2005,
2009; Ленѐв С. В., 2012).
Очевидно, что назрела необходимость коррекции медикаментозных
подходов при борьбе с сальмонеллезом, с учетом вступления России в ВТО и
ограничения широкого использования антибиотиков на производстве (Ленѐв С.
В. и др., 1996; Пименов Н. В., 2009, 2010; Pimenov N. V., 2013).
Современная ситуация в птицеводстве, связанная со снижением
эффективности антибиотикотерапии настоятельно требует поиска новых
средств и способов в борьбе с бактериальными инфекциями, в частности с
сальмонеллезом кур. В этом плане хорошие перспективы в качестве
антимикробной терапии имеют бактериофаги, которые эффективны в
отношении как чувствительных, так и устойчивых к антибиотикам бактерий.
Бактериофаги обладают рядом преимуществ: специфичностью действия,
отсутствием угнетения нормальной микрофлоры и аллергических реакций,
стимуляцией факторов специфического и неспецифического иммунитета
(Майская Л. М., 2003; Золотухин С. Н., 2006).
Кроме того, ряд исследователей указывают на положительное влияние
препаратов, производных нанокластерного серебра, при профилактике и
лечении ряда бактериальных инфекций у сельскохозяйственных животных
(Артемов А. В., 2009; Смирнов А. М. и др., 2011; Благитко Е. М. и др, 2004;
Костылева Р. Н., 2005).
Всѐ вышеизложенное, а также то, что на современном этапе развития
птицеводческой отрасли появляется необходимость в усовершенствовании
системы профилактических и лечебных мероприятий сальмонеллеза с учетом
3
ветеринарно-санитарной и экологической безопасности указывает на
несомненную актуальность темы представленных исследований.
Степень её разработанности. В настоящее время птицепоголовье
большинства хозяйств инфицировано сальмонеллой (Афонюшкин В. с соавт,
2008). Существующие способы лечения сальмонеллеза птиц предусматривают
проведение общих ветеринарно-санитарных мероприятий и ориентированы на
широкое применение антимикробных препаратов (Пименов Н. В., 2011; Лыско
С. Б., 2014; Соок Mark Е., 2001).
По мнению многих исследователей и экспертов комитета ВОЗ по
сальмонеллезу, проблема не может быть решена только применением
антибиотиков и химиопрепаратов. Их постоянное использование, несмотря на
эффективность,
приводит
к
возникновению
полирезистентных
микроорганизмов (Борисенкова А., 2004; Золотухин С. Н., 2006; Белов JI. П.,
Сорокин O. A., 2007; Смирнов Д. с соавт., 2011; Золотухин С. Н., 2016; Piddock
L., 2002).
Как альтернативу антибиотикам все чаще используют аутогенные и
коммерческие вакцины (Бортюк Я., 2008).
Э. Д. Джавадов (2007), Г. П. Косякова с соавт. (2007), Т. Габисония с соавт.
(2010) считают, что включение бактериофагов в противоэпизоотические
мероприятия в промышленном птицеводстве является более экологически
безопасным методом лечения, дающим высокий терапевтический эффект.
Авторами А. Борисенковой (2004), С. В. Цыгановой (2005, 2008), показана
эффективность применения выделенного бактериофага «IBP-1» против
сальмонелла-энтеритидис инфекции птиц в производственных условиях.
Лечение бройлеров бактериофагами приводит к снижению степени
зараженности бактериями сальмонеллы тушек бройлеров (Guilherme Augusto
Marietto Gonçalves et al, 2014).
на перспективность использования в борьбе с бактериальными
инфекциями серебросодержащих препаратов, обладающих широким спектром
антимикробной активности, в том числе в отношении антибиотикорезистентной
микрофлоры (З. Бернавски,1999; Н. А. Шкиль и др., 2003). Однако, в
литературных источниках отсутствуют данные о комплексном применении
бактериофагов и препаратов серебра при лечении и профилактике
сальмонеллезной инфекции кур, что свидетельствует об актуальности данного
направления исследований.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось
выделение и изучение основных биологических характеристик бактериофагов к
S. enteritidis, а также обоснование комплексного применения бактериофага и
препарата Арговит для профилактики и терапии сальмонеллеза кур.
Для реализации цели исследования были поставлены следующие задачи:
- определить место и роль сальмонеллеза в нозологическом профиле
болезней птиц в регионе;
- выделить и селекционировать высоколитический бактериофаг к
S. enteritidis;
4
- изучить основные биологические свойства селекционированного
бактериофага;
- изучить эффективность комплексного применения выделенного
бактериофага к S. enteritidis и препарата Арговит при экспериментальном
заражении сальмонеллезом цыплят;
- установить влияние комплексного применения сальмофага и препарата
Арговит на энтеромикробиоценоз и иммунобиологические показатели цыплят
больных сальмонеллезом;
- определить терапевтическую эффективность комплексного применения
выделенного противосальмонеллезного бактериофага и препарата Арговит в
производственных условиях птицефабрики.
Научная новизна. Впервые в регионе установлено, что в нозологической
структуре инфекционных болезней кур бактериальной этиологии на долю
сальмонеллеза приходится 22,7%. Изучены биологические свойства
выделенных культур Salmonella spp. с учетом их культуральноморфологических и биохимических характеристик. Определена устойчивость
выделенных культур Salmonella spp. к антибиотикам, применяемым на
птицефабриках региона.
Выделен и селекционирован специфичный бактериофаг к культурам
Salmonella enteritidis, циркулирующим на территории птицефабрик г. Омска и
Омской области, изучены его биологические свойства, экспериментально
доказана эффективность применения Phagum Salmonella enteritidis DS-1.
Впервые разработана схема применения выделенного бактериофага и
производных нанокластерного серебра, в частности препарата Арговит для
лечения и профилактики сальмонеллеза в условиях промышленного
птицеводства.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные
экспериментальные данные уточняют и дополняют сведения по теоретическим
аспектам обоснования применения бактериофагов и производных
нанокластерного серебра для профилактики и лечения бактериальных
инфекций, в частности сальмонеллеза кур.
Доказана
эффективность
использованной
схемы
комплексной
бактериофаготерапии
и
препарата
Арговит
при
коррекции
энтеробактериоценоза больных цыплят-бройлеров, санации организма птиц от
сальмонелл, повышении уровня неспецифической резистентности организма,
увеличении сохранности и продуктивных показателей цыплят-бройлеров.
Рекомендована для внедрения в систему профилактических и лечебных
мероприятий в птицеводстве региона схема комплексного применения
противосальмонеллезного бактериофага и препарата Арговит с установленной
эффективностью.
Теоретические положения и практические рекомендации, полученные при
выполнении диссертационной работы, внедрены в учебный процесс факультета
ветеринарной медицины ФГБОУ ВО Омский ГАУ; ФГБОУ ВО Башкирский
ГАУ; ФГБОУ ВО Уральский ГАУ; ФГБОУ ВО Пермская ГСХА; ФГБОУ ВО ГАУ
5
Северного Зауралья.
Методология и методы исследования. Методология проведенных
исследований основывалась на анализе и синтезе статистической информации и
экспериментальных данных по проблеме профилактики и лечения
сальмонеллеза кур в условиях промышленного птицеводства представленных в
отечественной и зарубежной специальной литературе, а также результатах
собственных экспериментальных исследований.
При проведении исследований были использованы следующие
специальные методы: эпизоотологические, клинические, гематологические,
бактериологические, иммунологические, статистические.
Основные положения, выносимые на защиту:
– эпизоотологическая значимость сальмонеллеза в этиологической
структуре бактериальных инфекций кур в условиях промышленного
птицеводства Омской области.
– биологические свойства выделенного и селекционированного
противосальмонеллезного бактериофага, а также экспериментальное
подтверждение эффективности применения препарата Арговит, их
корригирующего действия на энтеробактериоценоз и санацию больных
сальмонеллезом цыплят-бройлеров.
– гематологические, иммунологические показатели естественной
резистентности организма, сохранность и увеличение продуктивных свойств
цыплят-бройлеров
на
фоне
применения
противосальмонеллезного
бактериофага и препарата Арговит.
Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень
достоверности результатов проведенных исследований подтверждается
применением общепринятых и современных микробиологических методов и
статистической обработкой полученных результатов. Диссертационная работа
была выполнена в соответствии с темой научных исследований кафедры
ветеринарной микробиологии, инфекционных и инвазионных болезней ФГБОУ
ВО Омский ГАУ «Изучение паразитоценозов при инфекционных и
инвазионных болезнях животных и птиц и разработка мер борьбы и
профилактики с этими болезнями» (№ гос. регистрации 01201155468).
Материалы диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на:
научно-практической конференции аспирантов «Достижения молодых ученых –
аграрному производству» (г. Омск, 2012г.); Международной научнопрактической конференции «Бактериофаги: теоретические и практические
аспекты применения в медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» (г.
Ульяновск, 2013г.); Второй Международной научно-практической конференции
«Бактериофаги: теоретические и практические аспекты применения в
медицине, ветеринарии и пищевой промышленности» в рамках III
международного экологического форума «Окружающая среда и здоровье
человека» (г. Санкт-Петербург, 2014г.); X Международной научно-практической
конференции молодых исследователей (г. Волгоград, 2016г.); научных
конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов ФГБОУ
6
ВПО ОмГАУ им. П.А. Столыпина (Омск 2012, 2013 гг.).
Публикации
результатов
исследований.
По
материалам
диссертационной работы опубликовано шесть научных статей, отражающих
основное содержание диссертационной работы, в том числе две статьи - в
изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки
Российской Федерации.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133
страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы,
собственных
исследований,
заключения,
выводов
и
практических
рекомендаций, списка литературы из 234 наименований (включая 26
иностранных авторов) и 8 приложений. Работа иллюстрирована 17 таблицами и
16 рисунками.
2. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
2.1. Материалы и методы исследования
Работа
выполнена
на
кафедре
ветеринарной
микробиологии,
инфекционных и инвазионных болезней ФГБОУ ВО Омский ГАУ в период
2011-2017 гг.
Бактериологические исследования проведены на базе бюджетного
учреждения Омской области «Омская областная ветеринарная лаборатория» в
отделе болезней птиц и на базе производственно-технологической лаборатории
птицефабрики. При выяснении эпизоотической ситуации по бактериальным
инфекциям в целом, и по сальмонеллезу в частности, на птицефабриках Омска
и Омской области использовали эпизоотические журналы и данные отчетов
бюджетного учреждения Омской области «Омская областная ветеринарная
лаборатория» отдела болезней птиц за период с 2007 по 2016гг., а также
результаты собственных исследований.
Комплекс
бактериологических
исследований
осуществляли,
руководствуясь
существующими
общепринятыми
методиками.
Бактериологические исследования проб с технологического оборудования
птицефабрик, а так же комбикорма, используемого для кормления птиц,
осуществляли, руководствуясь методическими рекомендациями "Правила
бактериологического исследования кормов" (утв. Минсельхозом СССР
10.06.1975),
Методическими
указаниями
4.2.2723-10
«Лабораторная
диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и
объектах окружающей среды» (Утв. Руководителем Федеральной службы по
надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным
государственным санитарным врачом Российской Федерации Г. Г. Онищенко
13.08.2010 г.) и Методическими указаниями по лабораторной диагностике
сальмонеллезов человека и животных, обнаружение сальмонелл в кормах,
продуктах питания и объектах внешней среды, а также методическими
указаниями "Лабораторная диагностика сальмонеллезов человека и животных,
обнаружение сальмонелл в кормах, продуктах питания и объектах внешней
среды" (утв. Минздравом СССР, 1990 г.).
Устойчивость
выделенных
культур
Salmonella
spp.
к
7
химиотерапевтическим средствам определяли диско-диффузионным методом на
агаре с применением стандартных дисков, содержащих антибиотики, в
соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности
микроорганизмов к антибактериальным препаратам». В работе были
использованы коммерческие диски с известной концентрацией антибиотиков.
Работу по выделению бактериофагов и изучению их биологических
свойств проводили на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» г. Новосибирск в отделе
биофизики и экологии (консультант - зав. сектором бактериофагов, плазмид и
генетических конструкций, канд. биол. наук Пугачев В. Г.).
Для выделения изолятов бактериофагов сальмонелл в качестве источника
использовали сточную воду и фекалии птицы, содержащейся на промышленных
птицефабриках. Для выявления фагов в указанных объектах использовали
метод обогащения, предложенный Адамсом (1961).
При изучении биологических свойств выделенных бактериофагов
литическую активность оценивали по их способности вызывать лизис
бактериальной культуры в жидких или на плотных питательных средах.
Активность (по методу Аппельмана) выражали максимальным разведением, в
котором испытуемые фаги проявляли свое литическое действие.
Полученный в ходе эксперимента штамм Phagum Salmonella enteritidis DS1 депонирован в коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора под
номером Ph-1343. Идентификацию бактериофага проводили на базе ФБУН ГНЦ
ВБ «Вектор» Роспотребнадзора (г. Новосибирск).
Для научно-экспериментальных и производственных опытов объектом
исследований служили цыплята-бройлеры кросса Ross 308. При проведении
научно-экспериментальных исследований на базе бюджетного учреждения
Омской области «Омская областная ветеринарная лаборатория» было
сформировано 3 опытные группы цыплят по 10 голов и одна контрольная с тем
же количеством птицы. Моделирование сальмонеллезной инфекции проводили
путем экспериментального заражения птицы суспензией сальмонелл,
перорально из расчета 1х109 КОЕ/мл на 1 голову в возрасте 10 суток. Для
заражения использовали суспензию культуры Salmonella enteritidis, выделенной
из внутренних органов павших цыплят-бройлеров на одной из промышленных
птицефабрик региона.
Цыплят опытных групп подвергали лечению методом выпаивания. Цыплят
первой опытной группы лечили суспензией бактериофага штамма Phagum
Salmonella enteritidis DS-1, выделенным стандартным методом путем высева
образцов стоков птицеводческого хозяйства в суспензию бактериальной
культуры Salmonella enteritidis с последующим выделением единичных пятен
лизиса на агаризованной поверхности. Готовую суспензию фага с титром 8х109
PFU/ML выпаивали по схеме по 0,5 мл на гол/сут в течение 7сут
Для лечения птицы второй группы использовали суспензию бактериофага
DS-1 в сочетании с препаратом Арговит, который представляет собой
высокодисперсное
(кластерное)
серебро,
стабилизированное
низкомолекулярным
поливинилпирролидоном
(ООО
«НаучноПроизводственный Центр
«Вектор-Вита»,
г.
Новосибирск).
Перед
использованием готовили раствор Арговита на стерильной дистиллированной
8
воде (1:100). Суспензию бактериофага с Арговитом готовили непосредственно
перед применением из расчета 1,5 мл разбавленного Арговита и 0,5 мл
суспензии фагов на голову в течение 7 сут
Третью группу птицы лечили с применением антибактериального
препарата (энрофлоксацин) согласно инструкции производителя.
Цыплят контрольной группы содержали без лечения.
Гематологические исследования проводили по общепринятым методикам.
Подсчет количества эритроцитов и лейкоцитов осуществляли в счетной камере
Горяева. Выведение лейкоцитарной формулы осуществляли по методу
Филиппченко в мазках периферической крови. Гемоглобин определяли с
помощью гемометра Сали.
Для определения бактерицидной активности сыворотки крови
использовали метод, основанный на изменении оптической плотности
мясопептонного бульона при росте в нем микробов с добавлением и без
добавления испытуемой сыворотки (Смирнова О. В., Кузьмина Т. А., 1966).
Определение активности лизоцима осуществляли фотоэлектроколометрическим
методом по Дорофейчуку А.Г. с изменением температурного режима реакции
сыворотки крови кур с культурой М. lisodecticus.
Иммунологические исследования крови проводили на базе лаборатории
ГНУ ВНИИБТЖ РАСХН (консультант д-р ветеринар. наук Власенко В. С.).
Количество
Т-лимфоцитов
определяли
с
помощью
спонтанного
розеткообразования с эритроцитами барана (Е-рок): Т-киллеров – непрямого
глобулинового розеткообразования с эритроцитами быка (ЕА-рок); Влимфоцитов – комплементарного розеткообразования с эритроцитами быка
(Власенко В. С. с соавт., 2010). Функциональную активность лейкоцитов
оценивали в НСТ-тесте спонтанном без нагрузки, с последующей фиксацией
реакции с помощью многоканального иммунохимического анализатора
«Fluorofot STDL ess-486-M» (Власенко В. С. с соавт., 2015). Содержание
циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) определяли методом осаждения
полиэтиленгликолием (ПЭГ-6000) с последующим фотометрическим
определением оптической плотности образовавшегося преципитата на
проточном фотометре 5010 v5+ при λ=450 нм (Гриневич Ю. А., Алферов А. Н.,
1981).
Статистическую
обработку
полученных
данных
проводили
с
использованием компьютерной программы Microsoft Excel 2003. Проверку
достоверности различия результатов экспериментального цифрового материала
проводили с помощью таблицы t-распределения Стьюдента с учетом
рекомендаций Г. Ф. Лакина (1990) и В. А. Середина (2001).
9
2.2. Видовой состав и этиологическая структура возбудителей
инфекционных болезней кур бактериальной этиологии в условиях
промышленного птицеводства Омской области
Птицеводческая отрасль региона в настоящее время это эффективный и
быстро развивающийся сегмент агропроизводства, с нарастающей тенденцией
увеличения поголовья птицы разных видов. На территории Омской области в
настоящее время функционирует 11 крупных птицеводческих хозяйств. При
этом общее поголовье всех видов разводимой птицы составляет более 6,5 млн.
голов. В 2016 году произведено 670 млн. штук яиц, мяса птицы на убой в живом
весе – более 60 тыс. тонн.
Специфическая профилактика бактериальных и вирусных инфекций в
птицеводческих хозяйствах региона осуществляется с использованием вакцин
отечественного и импортного производства. Анализ ветеринарной отчетности
показал, что в каждом хозяйстве разработана и осуществляется схема
вакцинопрофилактики против ряда бактериальных и вирусных инфекций.
Данные ветеринарной отчетности, а также результаты собственных
исследований показали, что в период с 2007 по 2016 гг. в птицеводческих
хозяйствах Омской области среди бактериальных инфекций наиболее часто
регистрировали: колибактериоз, сальмонеллез, пастереллез, стафилококкоз и
стрептококкоз (Рисунок 1).
10
60
52,6
48,6
50
41,4
40,4
38,6
40
36,7
32,8
32,2
31,3
30
29,3
26,3
25
22,6
20,1
20
20,1
18,4
16,7
14,2
10
24,4
22,1
20,5
10,2
8,3
9,6
10,1
8,6
18,1
16,6
15,6
12,7
11,4
23,2
22,6
20,2
18
19
22,6
20,3
20,7
19,1
12,3
10,4
10
9,8
10,6
8,6
10,1
2014
2015
9,48,8
7,2
0
2007
2008
Колибактериоз
2009
2010
Стафилококкоз
2011
2012
Стрептококкоз
2013
Сальмонеллез
2016
Пастереллез
Рисунок 1 – Ретроспективный нозологический профиль инфекций
бактериальной этиологии у птиц в хозяйствах Омской области
Средний показатель за указанный период времени составил: по
колибактериозу 38,3%, стафилококкозу – 12,5%, стрептококкозу – 9,5%,
сальмонеллезу – 22,7%, пастереллезу – 18,5%.
Проведенный статистический ретроспективный анализ, а также результаты
собственных бактериологических исследований показали, что наиболее часто
из проб патологического материала выделялись микроорганизмы следующих
родов и видов: Escherichia coli, Mycoplasma sp., Staphylococcus aureus,
Salmonella spp, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeroginosa (Рисунок 2).
11
40
35,1
35
30
25
20
20,7
19,2
15
10
7,4
7,2
5,2
5
2,3
1,8
0,8
0,1
0,1
0,1
0
Видовой состав бактерий, выделенных из патологического материала птиц
Рисунок 2 – Видовой состав бактерий, выделенных из патологического
материала трупов птиц и отходов инкубации птицефабрик, % (n=3640)
Кроме того, в большинстве случав выделялись ассоциации указанных
микроорганизмов, в частности: Escherichia coli + Proteus vulgaris (21,3%);
Escherichia coli + Salmonella spp. (16,9%); Escherichia coli + Staphylococcus
aureus (26,4%); Escherichia coli + Klebsiella pneumoniae (18,6%); Salmonella spp.
+ Staphylococcus aureus (9,0%).
При бактериологическом исследовании проб (смывов) с технического
оборудования ряда птицефабрик региона, а также проб комбикормов
установлено, что количество мезофильных аэробных и факультативно
анаэробных микроорганизмов и бактерий группы кишечной палочки в 93%
случаев не превышало допустимых значений нормативных показателей. Так в
исследованных смывах с технологического оборудования в 5,4% случаев
выделяли культуры Escherichia coli и в 1,6% - культуры Salmonella enteritidis. В
пробах комбикормов культуры Escherichia coli изолировали в 6,1% случаев, а
Salmonella enteritidis в 0,9% случаев.
2.3. Биологические свойства сальмонелл, выделенных от цыплятбройлеров, и их резистентность к антибиотикам
Проведенные исследования показали, что большинство выделенных
культур сальмонелл хорошо росли на обычных питательных средах (МПА,
МПБ, агар Эндо, агар Левина и Плоскирева). На плотных питательных средах
они образовывали колонии двух видов: относительно крупные 2-3 мм (56,6%) и
более мелкие диаметром 0,8-1 мм (33,3%).
При изучении тинкториальных свойств культур выделенных сальмонелл
12
установлено, что они хорошо окрашивались водными растворами большинства
анилиновых красителей. По Граму окрашивались отрицательно.
Проведенные биохимические тесты показали, что все выделенные
культуры сальмонелл ферментировали глюкозу и манит, в тоже время 91,0%
культур не ферментировали сахарозу и все культуры – лактозу. При этом, 82%
выделенных культур сальмонелл утилизировали цитрат, а 72,7% образовывали
сероводород. У 100% выделенных культур установлена подвижность.
Положительную реакцию с метиловым красным показали 91,0% культур, в
100% случаев отмечали отрицательную реакцию Фогеса-Проскауэра и
отсутствие синтеза фенилаланиндезаминазы. При этом во всех случаях
выделенные культуры сальмонелл образовывали NO3.
С учетом цели и задач исследования нами был проведен анализ
серовариантной принадлежности выделенных бактерий рода Salmonella.
Установлено, что наиболее часто из патологического материала выделяли
Salmonella enteritidis – 82,1%, Salmonella gallinarum-pullorum – 9,2%, Salmonella
typhimurium – 7,5%, Salmonella infantis – 1,2%.
Анализ результатов изучения чувствительности выделенных культур
сальмонелл показал, что большинство антибиотиков, применяемых на
птицефабриках Омской области не во всех случаях обладают
антибактериальной активностью в отношении выделенных микроорганизмов.
Так установлено, что культуры Salmonella enteritidis проявляли множественную
лекарственную устойчивость к препаратам (80% от числа использованных) и
только к препаратам группы фторхинолонов (Энроксил, Энрофлон), обладали
чувствительностью.
В то же время, культуры Salmonella gallinarum-pullorum обладали
чувствительностью к 50% используемых препаратов, а именно к комплексным
препаратам – Долинк и Трифлон и препаратам группы фторхинолонов –
Энроксил, Энрофлон и Колмик-Е. Тогда как, Salmonella typhimurium были
чувствительны к одному комплексному препарату – Трифлону и препаратам
группы фторхинолонов – Энроксил и Энрофлон.
2.4. Биологические свойства сальмонеллезных бактериофагов,
выделенных из сточных вод птицеводческих хозяйств
При выделении бактериофагов сальмонелл в качестве источника
использовали сточную воду и фекалии птицы, содержащейся на промышленных
птицефабриках. Наличие фага в полученном фильтрате устанавливали методом
стекающей капли (по Отто) на газоне чувствительных культур Salmonella
enteritidis.
Нами с использованием метода обогащения по Адамсу были выделены 5
штаммов сальмонеллезных бактериофагов (Phagum Salmonella enteritidis: DS-1,
DS-2, DS-3, DS-4, DS-5).
Проведенные исследования морфологии фагов методом агаровых слоев
показали, что образуемые бактериофагами негативные колонии имели схожую
морфологию: округлую форму, ровные края, контурированные, диаметр от 1,0
до 3,0 мм, центральная часть колоний фагов, как правило, прозрачная. Также, в
13
некоторых случаях на газоне тестируемых культур обнаруживали вокруг зон
лизиса просветленные участки размером около 0,5 мм.
Установлено, что литическая активность выделенных бактериофагов по
методу Апельмана составляла 10-8 – 10-10, по методу Грациа от 1,5 х 108 – 2 х
1010.
Для изучения специфичности полученных фагов и оценки сегмента
штаммов-хозяев фагов были протестированы 9 культур Salmonella enteritidis, 5
культур Salmonella typhimurium, 3 культуры Salmonella gallinarum-pullorum и 1
культура Salmonella infantis. Культуры использовали из коллекций ФБУН ГНЦ
ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, БУ «ООВЛ», а также, выделенные из трупов
птиц, отходов инкубации и сточных вод птицеводческих хозяйств.
Анализ результатов изучения специфичности выделенных бактериофагов
показал, что полученные штаммы сальмонеллезных фагов не вызывали лизиса
микроорганизмов других родов и проявляли активность лишь в отношении
культур Salmonella enteritidis. Полученый бактериофаг DS-1 обладал
литическим действием в отношении 100% используемых культур Salmonella
enteritidis.
Проведенные исследования показали, что сальмонеллѐзный бактериофаг
DS-1 сохраняет свои литические свойства в течение 12 мес. при температуре
хранения от +5 до +60С.
2.5. Энтеробиоценоз цыплят-бройлеров при разных схемах лечения
экспериментального сальмонеллеза
Для проведения экспериментальных исследований было сформировано 4
группы цыплят-бройлеров кросса Ross 308: 3 опытных группы по 10 голов в
каждой и 4-я контрольная с тем же количеством птицы. Из внутренних органов
трупов цыплят-бройлеров птицеводческого хозяйства г. Омска на базе Омской
областной ветеринарной лаборатории была изолирована культура Salmonella
enteritidis. Специфичный к ней фаг выделен из проб сточных вод
птицеводческого хозяйства на базе ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» (г. Новосибирск),
где был приготовлен лизат бактериофага, фильтрованный через фильтр 0,22 мк
с концентрацией фага 109 PFU/мл. Препарат Арговит был получен в НПЦ
«Вектор-Вита» (г. Новосибирск).
Заражение цыплят проводили в 10-сут возрасте суточной бульонной
культурой Salmonella enteritidis, перорально, однократно, в дозе 1х109 КОЕ/мл
на 1 голову.
С лечебной целью цыплятам-бройлерам первой опытной группы
выпаивали суспензию сальмонеллезного бактериофага DS-1 (0,5 мл), второй –
сальмонеллезный бактериофаг в сочетании с препаратом Арговит (0,5 мл и 1,5
мл соответственно), третьей – антибактериальный препарат, наиболее часто
применяемый в птицеводческих хозяйствах региона при сальмонеллезах кур, а
именно энрофлоксацин. Указанный препарат применяли согласно инструкции
производителя.
Суспензию бактериофага и Арговита вводили индивидуально, перорально,
14
каждые 12 часов первые трое сут, затем – каждые 48 часов до выздоровления.
Лечение начинали на шестые сутки после заражения при проявлении
клинических признаков болезни.
На шестые сутки после заражения у 75% цыплят всех групп отмечали
ухудшение общего состояния, угнетение, вялость, снижение аппетита, жажду,
расстройство пищеварения в виде диареи. По результатам бактериологического
анализа установлено бактерионосительство Salmonella enteritidis у 47,5%
птицы, как в опытных, так и контрольной группах.
В последующем к 16-ти сут возрасту у цыплят 1-ой и 2-ой опытных групп
обнаруживали Salmonella enteritidis в 4 случаях (40,0%), а в 3-ий опытной
группе в 6-ти случаях (60,0%). В контрольной группе культуры Salmonella
enteritidis изолировали в 5-и случаях (50,0%). К 17-ти суткам в 1 и 2 группе
происходит увеличение количества выделенных культур Salmonella enteritidis до
6 (60,0%). Необходимо отметить, что среди птицы опытных групп наибольший
процент изоляции Salmonella enteritidis установлен в 3 группе – 80,0%. К 20-ти
сут возрасту цыплят-бройлеров в первой группе отмечали снижение выделения
сальмонелл до 30,0%. В тоже время во второй группе, где экспериментально
зараженным цыплятам применяли комплексное лечение (сальмофаг+Арговит)
не зарегистрировано выделение сальмонелл до окончания эксперимента. В
третьей экспериментальной группе, где цыплятам для лечения сальмонеллезной
инфекции применяли антибиотик, к 22 суткам зафиксировано наличие
Salmonella enteritidis в пробах фекалий в 40,0% случаев.
С целью выявления особенностей энтеробиоценоза цыплят-бройлеров,
экспериментально зараженных культурой Salmonella enteritidis, было
исследовано 280 проб фекалий, из которых изолировано 342 культуры. При этом
из фекалий выделяли разнообразную микрофлору как в монокультуре (n=72),
так и в ассоциациях (n=270). Так, в монокультуре наиболее часто
регистрировали микроорганизмы: Escherichia coli – 42,9%, Salmonella enteritidis
– 19,0% и Staphylococcus aureus – 14,3%.
Кроме того, установлено, что наиболее часто ассоциации микроорганизмов
составляли культуры Escherichia coli + Salmonella enteritidis + Staphylococcus
aureus – 12,9%, реже Staphylococcus aureus + Pseudomonas aeroginosa + Proteus
vulgaris – 1,7%.
2.6. Клинические, гематологические и иммунобиологические показатели
цыплят-бройлеров при комплексном применении сальмофага и препарата
Арговит для лечения экспериментального сальмонеллеза
Проведенные клинические исследования показали, что у цыплятбройлеров опытных и контрольной группы на 6-е сутки после заражения
культурой Salmonella enteritidis были установлены как однотипные, так и
разнообразные симптомы течения инфекции. Так, у экспериментально
зараженных цыплят отмечали потерю аппетита (80,0%), выраженную одышку
(60,0%). При этом у 92,5% особей наблюдали в той или иной степени
15
угнетенное состояние, у 82,5% – взъерошенность перьевого покрова. Кроме
того, у 82,5% цыплят-бройлеров отмечали диарею разной степени
выраженности и частоты. Вокруг клоакального отверстия наблюдали
прилипание фекальных масс.
Установлено, что количество гемоглобина у цыплят контрольной группы
достоверно (р<0,05) снижено по сравнению с показателями клинически
здоровых цыплят на 23,3%. В тоже время у цыплят опытной группы №2 данный
показатель был в верхних пределах физиологической нормы. Вместе с тем, у
цыплят опытной группы №3 количество гемоглобина на 42,1% меньше по
сравнению с животными 2-ой группы. Указанная закономерность наблюдается
относительно содержания эритроцитов. Так, у цыплят опытной группы №2
количество эритроцитов на 37,9% больше чем в 3 группе, птицу которой
подвергали лечению антибиотиком. Наиболее выраженные отличия между
контрольной и опытными группами прослеживаются в количественном
показателе лейкоцитов. Так, у цыплят контрольной группы данный показатель
был достоверно больше (р<0,05) по сравнению с цыплятами опытных групп, а
именно со 2 группой на 50,2%, с первой на 47,0% и с 3 опытной группой на
38,8%. Указанную выше закономерность наблюдали и в отношении
процентного содержания лимфоцитов. Содержание базофилов в опытных
группах не имело достоверных различий, тогда как установлено достоверное
различие между цыплятами контрольной и второй опытной группы, при этом в
контроле содержание базофилов на 45,5% больше (Таблица 1).
Контрольная №4
Опытная №1
(бактериофаг)
Опытная №2
(бактериофаг+Арговит)
Опытная №3
(антибиотик)
цыплят
Эозинофилы, %
крови
Базофилы, %
Лимфоциты, %
Лейкоциты, 109/л
(способ лечения)
Гемоглобин, г/л
Группа цыплят
Эритроциты, 1012/л
Таблица
1
–
Гематологические
показатели
экспериментальных и контрольной группы (22-е сут)
66,3±0,63
88,4±1,06
3,5±0,04 41,3±1,18 70,3±0,60 3,1±0,18 4,0±0,08
3,6±0,01 21,9±0,63 51,3±0,11 2,3±0,12 3,5±0,03
90,1±1,09
3,7±0,03 20,6±0,72 50,4±0,32 2,0±0,21 2,6±0,04
63,3±0,83
2,3±0,02 25,3±0,82 63,4±0,86 2,8±0,16 4,2±0,02
Проведенные биохимические исследования показали, что у цыплят
опытных групп происходило достоверное (р<0,05) уменьшение в сыворотке
крови общего белка.
При этом отмечается, что у цыплят контрольной группы содержание
16
общего белка на 19,4% больше по сравнению с цыплятами опытной группы №1
и на 15,3% по сравнению с опытной группой №2. Также установлено, что в
процессе лечения экспериментально зараженных цыплят наблюдается
групповая разнохарактерность протеинового профиля. Так, у цыплят 1, 2, 3
опытных групп отмечали достоверное увеличение содержания альбумина на
23,2%, 24,9% и 34,8% соответственно. Кроме того, у цыплят 1 и 2 опытных
групп в процессе применения противосальмонеллезного бактериофага и
препарата Арговит стабилизировалось альбумин-глобулиновое соотношение
(0,52 и 0,54 соответственно). В тоже время, у цыплят контрольной группы
указанный показатель достоверно ниже на 30,8%, а у птицы 3 опытной группы
достоверно больше на 46,3%.
Установлено, что у цыплят 1 и 2 опытных групп более высокое содержание
Т-лимфоцитов по сравнению с птицей контрольной группы и 3 опытной.
Так, у цыплят 1-ой опытной группы содержание Т-лимфоцитов было на
43,8% меньше чем у птицы контрольной группы. Необходимо отметить, что
наблюдается резкое уменьшение количества Т-лимфоцитов у цыплят 3 опытной
группы, которым для лечения применяли к энрофлоксацин. Также у птиц 1-ой и
2-ой опытной групп отмечали снижение содержания ЦИК по сравнению с
цыплятами контрольной группы. У цыплят-бройлеров 1 и 2 опытных групп в
процессе проведения экспериментальных наблюдений установлено достоверное
повышение бактерицидной и лизоцимной активности сыворотки крови.
2.7. Обоснование эффективности лечения и профилактики сальмонеллеза
цыплят-бройлеров в производственных условиях птицеводческого
хозяйства при использовании противосальмонеллезного бактериофага и
препарата Арговит
Для
обоснования
производственно-экономической
эффективности
предложенной схемы лечения сальмонеллезной инфекции цыплят-бройлеров
нами был проведен научно-производственный эксперимент на птицефабрике,
расположенной в Омской области производственной мощностью более 2 млн.
голов птицы. При этом было использовано 34 тыс. голов цыплят-бройлеров
кросса Ross 308 в качестве экспериментальной группы и такое же количество
птицы служило контролем.
В соответствии с предложенной схемой применения сальмонеллезного
бактериофага и препарата Арговит, обработку суточных цыплят осуществляли
методом аэрозольного распыления в спрей кабинете «Desvak». Смесью
бактериофага и Арговита обработано 34000 гол. птиц.
В дальнейшем, смесь бактериофага и Арговита цыплята получали методом
выпаивания на 8, 22, 29, 32 и 36-е сут жизни цыплят. Для обеспечения полного
потребления препаратов, птицу предварительно выдержали без питьевой воды,
постепенно увеличивая экспозицию с 40 мин до 60 мин, затем в теплую
водопроводную воду вносили смесь бактериофага в дозе 0,5 мл с
концентрацией 1,25х109 БОЕ/мл и Арговита в дозе 1,5 мл/гол. и смесь подавали
17
в систему поения. С учетом веса птицы, объем увеличивали с 5 до 13 литров к
36 сут. Время потребления птицей данного объема препарата оставалось
неизменным и составляло 1час 40 мин.
К завершению процесса выращивания птицы, а именно 40 сут падеж
цыплят в контрольной группе составил 6,9%, тогда как в опытной, где для
лечения и профилактики сальмонеллеза применяли комплекс бактериофага и
препарата Арговит, он был на 53,6% ниже.
За весь период эксперимента проведено 2367 бактериологических
исследований проб патологического материала от павшей птицы, в результате
выделены следующие микроорганизмы (n=472): Streptococcus spp. – 53
культуры (6,7%), Salmonella enteritidis – 32 (7,0%), Staphylococcus aureus – 43
(5,4%), Escherichia coli группа 1 серотип О2 – 242 (31%), Pseudomonas
aeruginosa – 31 (3,9%), Proteus vulgaris – 8 (1%), Mycoplasma sp. – 63 (8%). Из
них в опытной группе Streptococcus sp. – 29 культур, Salmonella enteritidis – 3,
Staphylococcus aureus – 21, Escherichia coli группа 1серотип О2 – 119,
Pseudomonas aeruginosa – 16, Proteus vulgaris – 4, Mycoplasma spp. – 29.
После первого применения бактериофага и Арговита, на 8-е сут в опыте
было выделено три культуры сальмонелл (Salmonella enteritidis), после второго
(22-е сут) из патологического материала (сердце, печень и костный мозг)
цыплят опытной группы выделение сальмонелл не регистрировали до
окончания эксперимента. Тогда как в контроле Salmonella enteritidis выделяли в
период до 32 сут эксперимента.
Результаты проведенного эксперимента в производственных условиях
показали, что сохранность цыплят в опытной группе составила 96,3%, что на
3,2% больше по сравнению с контролем.
Себестоимость 1 кг продукции также была меньше в опытной группе на
5,5%, при этом индекс продуктивности в опыте составил 278,2, а в контроле
242,1 или на 13% больше чем в опытной группе.
Установлено, что живая масса цыплят бройлеров в опытной группе была на
6,9 г/гол. больше по сравнению с контролем.
3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Нозологическая структура инфекционной патологии кур бактериальной
этиологии в птицеводческих хозяйствах Омской области представлена широким
спектром бактерий, а именно: Escherichia coli (35,1%), Mycoplasma sp. (20,7%),
Staphylococcus aureus (19,2%), на долю Salmonella spp. приходится 7,4%.
2. Анализ серовариантной принадлежности сальмонелл показал, что
наиболее часто из патологического материала в птицеводческих хозяйствах
региона выделяли Salmonella enteritidis – 82,1%, Salmonella gallinarum-pullorum
– 9,2%, Salmonella typhimurium – 7,5%.
3. Выделенные культуры сальмонелл в подавляющем большинстве
обладали типичными морфологическими, тинкториальными и биохимическими
свойствами, характерными для данной таксономической группы. В тоже время,
18
большинство культур Salmonella enteritidis и Salmonella typhimurium показали
высокую резистентность к тестируемым антибиотикам.
4. Выделенный противосальмонеллезный бактериофаг DS-1 является
высокоактивным (активность по Грациа 2,0 х 1010), с высокой степенью
специфичности и обладает выраженными литическими свойствами в
отношении возбудителей сальмонеллеза кур вызванного культурами Salmonella
enteritidis.
5. При экспериментальном моделировании сальмонеллеза цыплятбройлеров выделенный противосальмонеллезный бактериофаг DS-1 в
сочетании с препаратом Арговит показал 100% терапевтическую
эффективность, что на 40% больше по сравнению с традиционной схемой
лечения сальмонеллеза с использованием антибиотиков. Установлена полная
санация организма цыплят-бройлеров, зараженных возбудителем сальмонеллеза
при сочетанном применении используемого фага и препарата Арговит.
6. Применение противосальмонеллезного бактериофага в сочетании с
препаратом нанокластерного серебра у экспериментально зараженных цыплятбройлеров
нормализует
энтеромикробиоценоз,
повышает
иммунобиологические показатели, в частности лизоцимную и бактерицидную
активность сыворотки крови.
7. В производственных условиях птицеводческого хозяйства применение
схемы комплексной профилактики и терапии сальмонеллеза в опытной группе
цыплят-бройлеров сопровождалось полной санацией организма, при этом
сохранность цыплят-бройлеров увеличилась на 6,0%, а прирост живой массы
увеличился на 6,9% по сравнению с показателями контрольной группы.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Разработанная схема профилактических и лечебных мероприятий при
сальмонеллезе кур апробирована и применяется на промышленной
птицефабрике Омской области.
К практическому применению с целью профилактики и терапии
сальмонеллеза кур рекомендовано применение противосальмонеллезного
бактериофага в комплексе с препаратом, содержащим нанокластерное серебро.
Основные
положения
проведенных
комплексных
исследований
используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии, вирусологии,
эпизоотологии.
19
СПИСОК РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Плешакова, В. И. Фаготерапия сальмонеллеза кур с учетом особенностей
технологии выращивания птицы / В. И. Плешакова, Д. Н. Степанов // Сборник
материалов международной научно-практической конференции «Бактериофаги:
Теоретические и практические аспекты применения в медицине, ветеринарии и
пищевой промышленности», 23-25 апреля 2013 г. – Ульяновск, 2013. – Т. 2. – С.
73-76.
2. Плешакова, В. И. Видовой состав и этиологическая структура
возбудителей инфекционных болезней кур в условиях промышленного
птицеводства / В. И. Плешакова, В. В. Балашов, Д. Н. Степанов // Ученые
записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины им.
Н.Э. Баумана, 2014. - Т. 217. – С. 211-216.
3. Степанов, Д. Н. Опыт применения бактериофага для лечения
экспериментального сальмонеллеза цыплят-бройлеров / Д. Н. Степанов, В. И.
Плешакова, В. Г. Пугачев // Инфекция и иммунитет. – 2014. – С. 112.
4. Плешакова, В. И. Лечение и профилактика сальмонеллеза кур / В. И.
Плешакова, Д. Н. Степанов, Н.С. Золотова. // Вестник Омского
государственного аграрного университета. – 2015. – №1(17). – С. 51-54.
5. Степанов, Д. Н. Устойчивость к антибактериальным препаратам
микроорганизмов, выделенных от цыплят-бройлеров с диарейным
симптомокомплексом / Степанов, Д. Н., В. И. Плешакова // Наука и молодежь:
новые идеи и решения. – 2016. – Ч.3. – С. 49-53.
6. Плешакова, В. И. Лечение сальмонеллёза цыплят с применением
бактериофагов и наносеребра / В. И. Плешакова, В. С. Власенко, В. Г.
Пугачёв, Н. А. Лещёва, Д. Н. Степанов // Птицеводство. – 2017. – №4. – С.
43-49.
20
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
12
Размер файла
472 Кб
Теги
0c307e8042, uploaded
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа