close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Презентация: Костюнина В. С.

код для вставкиСкачать
 Дифференцировка Дифференцировка мезенхимальных мезенхимальных стволовых клеток в стволовых клеток в фибриновом геле.
фибриновом геле.
Магистрант кафедры генетики
Магистрант кафедры генетики
Костюнина В.С.
Костюнина В.С.
Научный руководитель
Научный руководитель
Глушен С.В.
Глушен С.В.
Актуальность темы.
Актуальность темы.
Большой проблемой для здравоохранения являются заболевания Большой проблемой для здравоохранения являются заболевания суставов. По данным ВОЗ ими страдает около 4% населения земного шара, с суставов. По данным ВОЗ ими страдает около 4% населения земного шара, с заболеваниями крупных суставов связано 30% случаев временной заболеваниями крупных суставов связано 30% случаев временной нетрудоспособности и 10% инвалидности. Вследствие крайне низких нетрудоспособности и 10% инвалидности. Вследствие крайне низких репаративных способностей суставного гиалинового хряща, подобные репаративных способностей суставного гиалинового хряща, подобные дефекты сохраняются в течение всей жизни человека и вызывают дефекты сохраняются в течение всей жизни человека и вызывают прогрессирование дегенеративных изменений в суставе. прогрессирование дегенеративных изменений в суставе. Один из методов лечения – трансплантация аутологичных хрящевых Один из методов лечения – трансплантация аутологичных хрящевых клеток. Сегодня перспективы имеет тканевая инженерия на основе взрослых клеток. Сегодня перспективы имеет тканевая инженерия на основе взрослых так называемых мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга так называемых мезенхимальных стволовых клеток (МСК) костного мозга (КМ) с целью получения предшественников хондроцитов, способных (КМ) с целью получения предшественников хондроцитов, способных in vivo
in vivo
к к регенерации хрящевой ткани. регенерации хрящевой ткани. Но существует проблема эффективного способа имплантации МСК в очаг Но существует проблема эффективного способа имплантации МСК в очаг поражения. Поэтому для этой цели необходимо использовать материалы–
поражения. Поэтому для этой цели необходимо использовать материалы–
носители, которые должны не вызывать явной воспалительной реакции, носители, которые должны не вызывать явной воспалительной реакции, иметь такие параметры микрорельефа поверхности, которые обеспечивали бы иметь такие параметры микрорельефа поверхности, которые обеспечивали бы оптимальные условия для адгезии, пролиферации, миграции оптимальные условия для адгезии, пролиферации, миграции иммобилизованных на них клеток. Показано наличие секреции хрящевого иммобилизованных на них клеток. Показано наличие секреции хрящевого матрикса матрикса in vivo
in vivo
при использовании инкапсулированных хондроцитов в при использовании инкапсулированных хондроцитов в гидрогелях из фибрина. Но для внедрения этого материала в клиническую гидрогелях из фибрина. Но для внедрения этого материала в клиническую практику необходимо изучить процесс дифференцировки клеток в условиях, практику необходимо изучить процесс дифференцировки клеток в условиях, создаваемых фибриновым гелем. создаваемых фибриновым гелем. Цели и задачи.
Цели и задачи.
Цель работы:
Цель работы:
Повысить эффективность технологий дифференцировки стволовых Повысить эффективность технологий дифференцировки стволовых клеток в хондрогенном направлении клеток в хондрогенном направлении in vitro
in vitro
за счет создания за счет создания трёхмерной клеточной конструкции на основе гемостатического трёхмерной клеточной конструкции на основе гемостатического фибринового средства «Фибриностат» (РНПЦ ГТ)
фибринового средства «Фибриностат» (РНПЦ ГТ)
Задачи:
Задачи:
1) Создать трёхмерную клеточную конструкцию с использованием 1) Создать трёхмерную клеточную конструкцию с использованием гемостатического фибринового средства «Фибриностат», пригодную гемостатического фибринового средства «Фибриностат», пригодную для предтрансплантационной подготовки клеточного материала. для предтрансплантационной подготовки клеточного материала. 2) Установить морфологические особенности и закономерности 2) Установить морфологические особенности и закономерности пролиферации в окружении фибринового геля мезенхимных пролиферации в окружении фибринового геля мезенхимных стволовых клеток в зависимости от источника (костный мозг, хрящ). стволовых клеток в зависимости от источника (костный мозг, хрящ). 3) Изучить динамику экспрессии хондроспецифических маркеров в 3-
3) Изучить динамику экспрессии хондроспецифических маркеров в 3-
мерной конструкции в условиях направленной хондрогенной мерной конструкции в условиях направленной хондрогенной дифференцировки цитохимическими и молекулярно-биологическими дифференцировки цитохимическими и молекулярно-биологическими методами. методами. Создание трехмерной клеточной конструкции для Создание трехмерной клеточной конструкции для предтрансплантационной подготовки предтрансплантационной подготовки клеточного материала.
клеточного материала.
МСК костного мозга в фибриновом сгустке
с концентрацией фибриногена 2 мг/мл
МСК костного мозга в фибриновом сгустке
с концентрацией фибриногена 8 мг/мл
Оценка изменения состояния клеток в процессе Оценка изменения состояния клеток в процессе создания трехмерной конструкции.
создания трехмерной конструкции.
Таблица 1
Таблица 1
Восстановление резазурина натриевой соли в процессе метаболической Восстановление резазурина натриевой соли в процессе метаболической активности клеток. активности клеток. Количество Количество клеток
клеток
% восстановления резазурина клетками в сгустке % восстановления резазурина клетками в сгустке при концентрации фибриногена при концентрации фибриногена 8 мг/мл 8 мг/мл 2 мг/мл 2 мг/мл 0 мг/мл (на 0 мг/мл (на пластике)
пластике)
9000
9000
46±4 46±4 64±3
64±3
82±2 82±2 3000
3000
42±2 42±2 50±1 50±1 63±4
63±4
1000
1000
37±4 37±4 42±2 42±2 46±2 46±2 Оценка способности МСК в фибриновом сгустке Оценка способности МСК в фибриновом сгустке дифференцироваться в хондрогенном дифференцироваться в хондрогенном направлении. направлении. МСК в фибриновом сгустке: 1)
с концентрацией фибриногена 2 мг/мл: А - опыт,
Б
- контроль; 2)
2) с концентрацией фибриногена 8 мг/мл: В
- опыт,
Г
- контроль
А
Б
В
Г
Гистохимическое подтверждение дифференцировки Гистохимическое подтверждение дифференцировки МСК в хондрогенном направлении.
МСК в хондрогенном направлении.
МСК, выделенные в фибриновом сгустке 8 мг/мл: 1) окраска альциановым синим: А
– опыт, Б –контроль, 2)
окраска сафранином О: В
– опыт, Г –контроль; 3)
окраска толуидиновым синим
: Д
– опыт, Е
– контроль. А
Б
В
Г
Д
Е
Подтверждение синтеза клетками кислых Подтверждение синтеза клетками кислых гликозаминогликанов – одних из основных гликозаминогликанов – одних из основных продуктов хондроцитов.
продуктов хондроцитов.
МСК в фибриновом сгустке
: верхний ряд
окраска сафранином О,
нижний ряд окраска толуидиновым синим; слева
– опыт (дифференцировка в хондрогенном направлении, 7 дней),
справа
– контроль.
Определение жизнеспособности клеток в Определение жизнеспособности клеток в процессе дифференцировки по включению процессе дифференцировки по включению натриевой соли резазурина.
натриевой соли резазурина.
Таблица 2
Таблица 2
Поглощение экстрагированного красителя толуидинового синего из Поглощение экстрагированного красителя толуидинового синего из опытных и контрольных образцов МСК КМ на 7 день опытных и контрольных образцов МСК КМ на 7 день дифференцировки.
дифференцировки.
Поглощение (длина волны 630 нм) Поглощение (длина волны 630 нм) экстрагированного красителя (ед.опт. пл.) из экстрагированного красителя (ед.опт. пл.) из сгустков с разной концентрацией сгустков с разной концентрацией фибриногена фибриногена 2 мг/мл 2 мг/мл 8 мг/мл 8 мг/мл Опыт Опыт 0,149±0,007 0,149±0,007 0,215±0,015 0,215±0,015 Контроль Контроль 0,054±0,01 0,054±0,01 0,078±0,008 0,078±0,008 Определение жизнеспособности клеток в Определение жизнеспособности клеток в процессе дифференцировки по включению процессе дифференцировки по включению натриевой соли резазурина.
натриевой соли резазурина.
Таблица 3
Таблица 3
Процент редукции клетками натриевой соли резазурина.
Процент редукции клетками натриевой соли резазурина.
Сгусток с Сгусток с концентрацией концентрацией фибриногена фибриногена Эксперимент Эксперимент Редукции красителя
Редукции красителя
, , %
%
8 мг/мл 8 мг/мл Опыт Опыт 23±1,6 23±1,6 Контроль Контроль 26±1,5 26±1,5 2 мг/мл 2 мг/мл Опыт Опыт 41±2,0 41±2,0 Контроль Контроль 50±3,1 50±3,1 Количественное определение аггрекана Количественное определение аггрекана с помощью с помощью RT-PCR.
RT-PCR.
Амплификация кДНК гена аггрекана
Амплификация кДНК гена аггрекана
(ACAN)
(ACAN)
в разных клетках
в разных клетках
:
:
К– контроль (МСК); К– контроль (МСК); 1 – хондроциты;
1 – хондроциты;
2 – МСК, прошедшие дифференцировку в хондрогенном направлении в 2 – МСК, прошедшие дифференцировку в хондрогенном направлении в фибриновом геле.
фибриновом геле.
Количественное определение коллагена Количественное определение коллагена II
II
типа
типа
с помощью с помощью RT-PCR.
RT-PCR.
Амплификация кДНК гена коллагена Амплификация кДНК гена коллагена II
II
типа (
типа (
COL1A1
COL1A1
) в разных клетках
) в разных клетках
:
:
К– контроль (МСК); К– контроль (МСК); 1 – хондроциты;
1 – хондроциты;
2 – МСК, прошедшие дифференцировку в хондрогенном направлении в 2 – МСК, прошедшие дифференцировку в хондрогенном направлении в фибриновом геле.
фибриновом геле.
Выявление наличия аггрекана и коллагена Выявление наличия аггрекана и коллагена II II типа
типа
с помощью электрофореза
с помощью электрофореза
.
.
Электрофорез кДНК гена Электрофорез кДНК гена коллагена коллагена II
II
типа (А), аггрекана типа (А), аггрекана (Б) в разных клетках
(Б) в разных клетках
:
:
К– контроль (МСК); К– контроль (МСК); 1 – хондроциты;
1 – хондроциты;
2 – МСК, прошедшие 2 – МСК, прошедшие дифференцировку в хондрогенном дифференцировку в хондрогенном направлении в фибриновом геле.
направлении в фибриновом геле.
А
Б
2 1 К
Заключение
Заключение
1.Подобраны оптимальные концентрации компонентов для 1.Подобраны оптимальные концентрации компонентов для приготовления фибринового сгустка ( апротинин – 200 Ед/мл, хлорид кальция приготовления фибринового сгустка ( апротинин – 200 Ед/мл, хлорид кальция – 5 мМ, фибриноген – 2 или 8 мг/мл), при длительном культивировании в – 5 мМ, фибриноген – 2 или 8 мг/мл), при длительном культивировании в котором МСК сохраняют свою жизнеспособность.
котором МСК сохраняют свою жизнеспособность.
2. Оценена способность МСК костного мозга и хряща, культивируемых 2. Оценена способность МСК костного мозга и хряща, культивируемых в фибриновом сгустке (2 и 8 мг/мл фибриногена), дифференцироваться в в фибриновом сгустке (2 и 8 мг/мл фибриногена), дифференцироваться в хондрогенном направлении. хондрогенном направлении. 3. Подтверждена дифференцировка МСК в хондрогенном направлении:
3. Подтверждена дифференцировка МСК в хондрогенном направлении:
- по изменению морфологии клеток (гистохимическое окрашивание); - по изменению морфологии клеток (гистохимическое окрашивание); - по накоплению протеогликанов (гистохимические методы окраски - по накоплению протеогликанов (гистохимические методы окраски толуидиновым синим, альциановым синим и сафранином О). толуидиновым синим, альциановым синим и сафранином О). Различия между опытными и контрольными образцами также подтверждены Различия между опытными и контрольными образцами также подтверждены количественно колориметрическим методом, количественно колориметрическим методом, RT-PCR RT-PCR и электрофорезом.
и электрофорезом.
Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования сгустка на основе фибриногена и тромбина как материала для переноса сгустка на основе фибриногена и тромбина как материала для переноса клеточных культур в организм. Однако внедрение в клиническую практику клеточных культур в организм. Однако внедрение в клиническую практику требует дальнейшего продолжения исследований по подбору оптимальных требует дальнейшего продолжения исследований по подбору оптимальных условий культивирования и дифференцировки клеток в необходимом условий культивирования и дифференцировки клеток в необходимом направлении. направлении. 
Автор
dostelon
Документ
Категория
Презентации
Просмотров
516
Размер файла
846 Кб
Теги
костюнина, презентация
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа