close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Презентация: Совгир Н.В

код для вставкиСкачать
Белорусский государственный университет
Биологический факультет Кафедра
микробиологии Система клонирования белков, обладающих антимикробной активностью
Магистерская диссертация
Совгир Натальи Владимировны
Научный руководитель д.б.н., профессор
Прокулевич Владимир Антонович
Минск 2009
Антимикробные пептиды
(
antimicrobial peptibes
) - очень короткие белковые молекулы, состоящие примерно из 20-50 аминокислот, которые вырабатываются клетками животных и человека для борьбы с микробами
Антимикробные пептиды - часть системы врожденного иммунитета животных. В отличие от антител, они не модифицируются в течение жизни организма и не "подстраиваются" под новые виды возбудителей
Самым богатым "месторождением" таких пептидов является кожа амфибий, в частности лягушек и жаб Актуальность выбранного направления работы
В последнее время актуальна проблема устойчивости штаммов бактерий к традиционным методам терапии, связанных с использованием широкого спектра антибиотических веществ. Бактерии приспосабливаются к любым видам антибиотиков, что сводит на нет все усилия по борьбе с инфекцией, и может привести к полному отказу от антибиотического воздействия на возбудителей инфекционных заболеваний Кроме того, участились случаи заболевания сельскохозяйственных животных эндометритами и маститами, имеющими бактериальную этиологию. Лечение животных по указу ветуправления с использованием антибиотиков проводить нежелательно, в связи с чем необходимо осуществлять поиск новых препаратов
Согласно литературным данным, к настоящему времени наиболее изучены пять антимикробных пептидов (
temporin A
, B
и G
, esculentin
1
b
и bombinin H
2), выделенных из кожи трех различных видов лягушек и жаб (
Rana temporaria
, Rana esculenta
и Bombina variegata
). Все пептиды являются эффективными антибактериальными агентами :
temporin A, B и G более эффективны против грамположительных бактерий и действуют при С = от 0,5 до 48 µМ esculentin 1b проявляет активность через 2-20 минуты в основном против грамотрицательных микроорганизмов при С = от 0,5 до 32 µМ bombinin H2 аналогично действует на все виды штаммов бактерий при С = от 4 до 16 µМ
Объект изучения
В качестве объекта изучения выступает белок эскулентин который, согласно проведенным исследованиям, активно убивает лекарственно-устойчивые штаммы грамположительных бактерий (
Staphylococcus aureus
, Enterococcus faecium
) в средних и низких концентрациях, и в более низких концентрациях,
грамотрицательные штаммы (
Stenotrophomonas maltophilia
, Acinetobacter baumanii
, Pseudomonas aeruginosa
). Активность молекулы эскулентина семейства 1
b
обусловлена N
-концевой областью (1-18)
Из 5 вышеупомянутых антибактериальных белков эскулентин характеризуется наибольшей длинной пептидной цепи (138 аминокислот) и наличием небольшого числа триплетов, кодирующих не характерные для бактерии E
. coli
аминокислоты
Целью работы является
разработка системы клонирования белков, обладающих антимикробной активностью, с использованием плазмиды pET
-24
a на основе штамма E
. coli
XL
-1
blue
Задачами работы являются:
1
.
Клонирование гена антимикробного белка эскулентина
2
. Оптимизация условий экспрессии для получения максимального выхода целевого продукта
3
. Очистка белкового продукта и оценка возможности его использования в качестве препарата для лечения эндометритов и маститов сельскохозяйственных животных Этапы проведения работы
На первом этапе был синтезирован ген эскулентина с использованием праймеров F1
,
R1
,
F2 и R2
. Данные праймеры были сконструированы на основе имеющихся в базе данных GenBank Национального центра биотехнологической информации последовательностей (последовательность 168-305 выделена зеленым цветом)
ORIGIN
1 aaagtcttcc agctgtctac attctcagca ccaactgaac cacccgccca aagatgttca
61 ccttgaagaa acccctgtta ctgattgtcc ttcttgggat gatctcctta tctctctgtg
121 agcaagagag aaatgccgat gaagaagagg gaagcgaaat aaaaag
agga
attttctcca
181 aattggccgg
gaaaaagctt
aaaaatttgc tcataagcgg actcaagaat gtaggcaagg
241 aagttggcat ggacgtggtc agaactggca tagacattgc aggttgtaaa attaaaggtg
301 aatg
ttaaaa cctgaaatgg aagccatcta aagtggaata tcatttagca aaatgctaaa
361 tgtctaataa aaaatagtaa tatc
Характеристика праймеров F1
,
R1
,
F2 и R2
Праймер
Нуклеотидная последовательность 5'-3' F1
5’
ccgtccttaaaagaggtttaaccggccctttttcgaaccg
3’
R1
5’
cgcctacattcttgagtccgcttatgagcaaatttttcgt
3’
F2
5’
gggcgttccttcaaccgtacctgcaccactcttgaccgtcga 3’
R2
5’
caccatcacctttaattttacaacctgcaatgtctaggc
3’
На следующем этапе синтезированный ген эскулентина был использован в качестве матрицы для амплификации с помощью полимеразной цепной реакции. Размер ожидаемого продукта равен 150 н.п.
Рис. 1. Результаты амплификации гена эскулентина с использованием праймеров F1
,
R1
,
F2 и R2
Дорожка 1
– продукт амплификации при температуре отжига 60°С
Дорожка 2
– маркер молекулярного веса Fermentas SM0333
1 2
Продукт амплификации затем был подвергнут рестрикции с использованием рестриктаз NdeI
(сайт рестрикции CATATG
)
и
XhoI (сайт рестрикции AAGCTT
)
Затем ген эскулентина был клонирован в вектор экспрессии pET-24a
(+), которым был трансформирован штамм Escherichia coli XL-1Blue
Рис. 2. Карта вектора экспрессии pET-24a(
+):
T7
промотор 311-327
Полилинкер (
BamH
1
– Xho
1) 158-203
Последовательность, кодирующая His-Tag 140-
157
T7 терминатор 26-72
Последовательность, кодирующая lac1 714-1793
Последовательность, отвечающая за устойчивость к Kam
3936-4748
После индукции ИПТГ был получен белковый продукт, который по размеру соответствовал белку эскулентину (около 19 кДа)
Рис. 3. Электрофорез суммарных клеточных белков штамма Escherichia coli XL-1Blue
(
pET-24b
(+)+
Esc
)
Дорожка 1
– белки-стандарта молекулярных масс (сверху вниз: 116 кДа,
66
кДа, 45 кДа, 35 кДа, 25 кДа, 18,4 кДа,
14,4 кДа)
Дорожка 2
– через 4 ч. после индукции ИПТГ в концентрации 0,4 мМоль/л
Дорожка 3 – без индукции ИПТГ
1 2 3
19 кДа
С использованием сконструированных праймеров синтезирован и амплифицирован ген антимикробного белка эскулентина
Продукт амплификации клонирован в вектор экспрессии
Полученный белковый продукт полностью соответствует белку эскулентину
Выводы
Спасибо за внимание !
Exit
Автор
dostelon
Документ
Категория
Презентации
Просмотров
329
Размер файла
772 Кб
Теги
совгир
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа