close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Повышение эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий на основании дифференцированного подхода к выполнению вспомогательного хетчинга

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ИБРАГИМОВА
Эспет Омарбековна
ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОГРАММ
ВСПОМОГАТЕЛЬНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
НА ОСНОВАНИИ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО ПОДХОДА
К ВЫПОЛНЕНИЮ ВСПОМОГАТЕЛЬНОГО ХЕТЧИНГА
14.01.01- акушерство и гинекология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва 2018
Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном
учреждении «Национальный медицинский исследовательский центр
акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научные руководители:
доктор медицинских наук, доцент
кандидат биологических наук
Долгушина Наталия Витальевна
Макарова Наталья Петровна
Официальные оппоненты:
Серебренникова Клара Георгиевна – доктор медицинских наук, профессор,
ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки
России, кафедра акушерства и гинекологии с курсом перинатологии,
профессор
Рудакова Елена Борисовна – доктор медицинских наук, профессор, ГБУЗ МО
«Московский областной перинатальный центр», отделение вспомогательных
репродуктивных технологий, заведующий
Ведущая
организация:
ФГБОУ ВО «Российский национальный
исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова»
Минздрава России
Защита состоится « »
2018 года в 13.00 часов на заседании
диссертационного
совета
Д 208.125.01
на
базе
федерального
государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский
исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени
академика В.И. Кулакова» по адресу 117997, г. Москва, ул. Академика
Опарина, д. 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте федерального
государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский
исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени
академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской
Федерации http://sciense.ncagp.ru/upfiles/pdf/IbragimovaEO_diss.pdf
Автореферат разослан «___»_____________2018 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор медицинских наук, доцент
Калинина Елена Анатольевна
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования
Доля бесплодных браков в России превышает 15%, что, по данным
Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), является критическим
уровнем (Рудакова Е.Б., 2015). Отсутствие ребенка в семье приводит к
социально-психологическому
дискомфорту
супругов,
конфликтным
ситуациям в семье, росту числа разводов и, соответственно, к снижению
качества жизни. Причиной бесплодия, согласно статистике, в 30% случаев
является так называемый «женский фактор», в 30% — «мужской фактор», в
25% — сочетание «мужского и женского факторов», а в 15% случаев
причину бесплодия установить не удаётся.
По имеющимся данным, 50-75% всех морфологически нормальных
бластоцист человека не способны к самостоятельному выходу из блестящей
оболочки (от англ. – zona pellucida – ZP) (Шафеи Р.А., 2017). Выход
эмбриона из ZP обозначается термином хетчинг (от англ. hatching –
«вылупление»). Отсутствие спонтанного хетчинга является одной из причин
неудачи имплантации (Sheshagiri P.B., 2009). При затруднении спонтанного
хетчинга, а также по ряду принятых показаний (возраст пациентки старше 35
лет, 3 и более неудачные попытки ЭКО с переносом эмбрионов хорошего
качества
в
анамнезе,
изменение
морфологии
блестящей
оболочки,
использование криоконсервированных эмбрионов) выполняется процедура
вспомогательного хетчинга бластоцист (Приказ Минздрава России №107н от
30 августа 2012 г.). В настоящее время большое внимание уделяется
генетическим
причинам
неудач
хетчинга.
Изучение
генов,
экспрессирующихся в ТФЭ бластоцисты, таких как ген катепсинов (CTSL),
ген семейства транскрипционных факторов (GATA), ген β-субъединицы
хорионического
гонадотропина
(CGB),
направлением для дальнейших исследований.
является
перспективным
4
Наибольшее распространение в практике программ вспомогательных
репродуктивных технологий (ВРТ) получили методы частичного удаления
ZP: механический, химический и лазерный хетчинг (Cohen J., 1990; Tagir Y.,
2007). При данных методах оболочка частично надсекается в случайном
месте, и бластоциста выходит из ZP самостоятельно, затрачивая на это время.
Кроме того, данные методы вспомогательного хетчинга несут риск разрыва
клеток
эмбриобласта,
что
может
способствовать
формированию
многоплодных беременностей (Schieve L.A., 2000).
Принципиально новым подходом к вспомогательному хетчингу является
технология ферментативного хетчинга. Преимуществами данного метода
является полное удаление ZP, что экономит время бластоцисты на
вылупление,
и
формирующих
не
приводит
эмбрион,
к
что
механическому
позволяет
разделению
проводить
клеток,
профилактику
монозиготных беременностей в программах ВРТ при переносе одной
морфологически нормальной бластоцисты (Balaban B., 2002).
Согласно
имеющимся
на
сегодняшний
день
данным,
новая
эмбриологическая технология полного удаления блестящей оболочки может
способствовать
увеличению
частоты
наступления
беременности
в
программах ВРТ. Бластоциста без блестящей оболочки сразу после ее
переноса в полость матки контактирует с клетками эндометрия в период
имплантации, что способствует успешному наступлению беременности.
Степень разработанности темы исследования
Впервые был проведен механический вспомогательный хетчинг Cohen J.
и соавторами в 1990 году. Позже стали применяться химический, лазерный и
ферментативный хетчинг. Данные методики были разработаны с целью
повышения частоты имплантации эмбриона в программах ВРТ (Carney S.,
2012; Martins W., 2011).
Однако, в настоящее время не до конца изучены необходимость и
показания для проведения различных видов вспомогательного хетчинга, а
5
также недоказанной является роль вспомогательного хетчинга в развитии
монозиготной беременности в программах ВРТ.
Цель исследования:
Изучение
клинико-лабораторных
и
клеточно-молекулярных
предикторов спонтанного хетчинга, а также роли различных видов
вспомогательного
хетчинга
в
повышении
эффективности
программ
вспомогательных репродуктивных технологий.
Задачи исследования:
1. Оценить роль эмбриональных и клинико-лабораторных данных
пациентов программ ВРТ в генезе неудач спонтанного хетчинга бластоцист.
2. Определить клинико-лабораторные показания к вспомогательному
хетчингу бластоцист у пациентов c бесплодием в программах ВРТ.
3. Изучить параметры оогенеза и раннего эмбриогенеза в группах с
наличием и отсутствием вспомогательного хетчинга бластоцист, а также в
группах с частичным и полным удалением зоны пеллюцида.
4. Оценить результаты программ ВРТ в зависимости от проведения и
вида вспомогательного хетчинга бластоцист.
5. На основании выявленных эмбриональных и клинико-лабораторных
предикторов эффективности спонтанного и вспомогательного хетчинга
разработать алгоритм применения вспомогательного хетчинга бластоцист
человека в программах ВРТ.
Научная новизна
Определены
эмбриональные
и
клинико-лабораторные
факторы,
влияющие на эффективность спонтанного хетчинга бластоцист человека в
программах ВРТ.
Выявлены клинико-лабораторные показания для вспомогательного
хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ.
6
Доказана роль полного удаления зоны пеллюцида в повышении
эффективности
программ
ВРТ
и
снижении
риска
многоплодной
беременности.
Практическая значимость
На основании выявленных эмбриональных и клинико-лабораторных
предикторов
спонтанного
хетчинга
была
создана
формула
расчета
вероятность эффективности спонтанного хетчинга бластоцист человека в
программах ВРТ.
В результате оценки эффективности программ ВРТ в зависимости от
проведения
вспомогательного
хетчинга
были
определены
клинико-
лабораторные показания к проведению вспомогательного хетчинга в
программах ВРТ.
Учитывая
выявленные
ятрогенные
факторы,
способствующие
нарушению спонтанного, и влияющие на проведение вспомогательного
хетчинга,
были
направленные
на
предложены
повышение
схемы
стимуляции
эффективности
суперовуляции,
спонтанного
хетчинга
бластоцист в программах ВРТ.
Апробирована
технология
полного
удаления
зоны
пеллюцида,
направленная на увеличение эффективности программ ВРТ и снижения риска
многоплодной беременности.
Методология и методы исследования
Проведен проспективный и ретроспективный анализ супружеских пар с
бесплодием различного генеза. Предварительное обследование супружеских
пар проводилось в соответствии с приказом Минздрава России №107н.
В ходе работы были использованы специальные методы обследования:
ПЦР в реальном времени с целью оценки экспрессии генов CTSL2, GATA3,
CGB
и
HLA-G,
оценка
качества
эмбрионов
(«модифицированная»
классификация D. Gardner) и мониторинг хетчинга с определением ТЭО при
помощи световой микроскопии.
7
Положения, выносимые на защиту
1. В программах ВРТ эффективность спонтанного хетчинга связана с
качеством полученных бластоцист, что определяется эмбриональными
факторами: наличием экстрацитоплазматических дисморфизмов ооцитов и
более
высокой
экспрессией
м-РНК
генов
CTSL2,
GATA3
и
CGB
бластоцистами; и клинико-лабораторными данными пациенток: более
низким уровнем ФСГ и более редким назначением хорионического
гонадотропина в качестве триггера овуляции.
2. При вспомогательном хетчинге в виде полного удаления зоны
пеллюцида частота наступления беременности увеличивается в 1,9 раз по
сравнению с проведением лазерного хетчинга или его отсутствием, а риск
монозиготной многоплодной беременности снижается в 2 раза по сравнению
с отсутствием хетчинга и в 5,7 раз по сравнению с лазерным хетчингом.
3. Показаниями
для
вспомогательного
хетчинга
бластоцист
в
программах ВРТ являются уровень АМГ менее 2 нг/мл и число полученных
бластоцист менее 4, что связано с влиянием указанных факторов на качество
полученных бластоцист и их способность к спонтанному хетчингу, и
имплантации. Отсутствие вспомогательного хетчинга при наличии к нему
показаний снижает частоту живорождения в 1,9 раз, а вспомогательный
хетчинг при отсутствии к нему показаний увеличивает риск монозиготной
многоплодной беременности в 6 раз.
Личный вклад автора
Автор участвовал в выборе темы научной работы, разработке цели и
задач
исследования,
в
проведении
и
интерпретации
результатов
лабораторных исследований, в обобщении и статистической обработке
полученных данных. Автором лично осуществлялось обследование и ведение
супружеских
пар
на
всех
этапах
лечения
бесплодия
методом
экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов (ЭКО/ПЭ).
8
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные
положения
диссертации
специальности
14.01.01
–
«акушерство
проведенного
исследования
и
соответствуют
формуле
гинекология».
Результаты
соответствуют
области
исследования
специальности, конкретно пунктам 4 и 5 паспорта акушерства и гинекологии.
Апробация результатов
Работа
обсуждена
на
межклинической
конференции
отделения
вспомогательных технологий в лечении бесплодия имени проф. Б.В. Леонова
09.11.2017 г. и заседании апробационной комиссии ФГБУ «НМИЦ АГП им.
акад. В.И. Кулакова» Минздрава России 13.11.2017 г.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты
исследования
используются
в
практической
работе
отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия (заведующий
д.м.н., доцент Калинина Е.А.) ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова»
Минздрава России (директор академик РАН Сухих Г.Т.). Материалы и
результаты исследования включены в лекции и практические занятия для
клинических ординаторов и аспирантов ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И.
Кулакова» Минздрава России.
Результаты по теме диссертации опубликованы в 9 печатных работах, из
которых 3 в рецензируемых научных журналах и 1 - в зарубежном журнале
«Zygota» (ИФ=1,37).
Структура и объем диссертации
Диссертация
состоит
из
введения,
обзора
литературы,
2
глав
собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов,
практических рекомендаций и списка литературы. Работа представлена на
115 страницах текста, иллюстрирована 15 рисунками и 18 таблицами.
Библиографический указатель включает 15 работ на русском языке и 87
работы на английском языке.
9
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследования
Набор
пациентов
и
эмбриологическая
часть
исследования
осуществлялись в отделении вспомогательных технологий в лечении
бесплодия.
Лабораторные
исследования
проводились
в
лаборатории
молекулярно-генетических методов.
Для решения задачи №1 были отобраны 83 бластоцисты супружеских
пар,
донировавших
их
для
научных
исследований,
которые
были
стратифицированы на две группы: группа 1 (n=36) – бластоцисты,
совершившие спонтанный хетчинг; группа 2 (n=47) - бластоцисты, не
совершившие спонтанный хетчинг. Для решения задач №2-4 в исследование
были включены 309 супружеских пар с бесплодием различного генеза,
которые были стратифицированы на следующие группы: группа 1 (n=209) пациенты, у эмбрионов которых был проведен вспомогательный хетчинг
[группа 1а (n=106) - пациенты, у эмбрионов которых было проведено
частичное удаление зоны пеллюцида (лазерный хетчинг); группа 1б (n=103) пациенты, у эмбрионов которых было проведено полное удаление зоны
пеллюцида (ферментативный хетчинг)]; группа 2 (n=100) - пациенты,
эмбрионам которых хетчинг не был проведен.
Критериями включения в исследование были нормальный кариотип
супругов, перенос одного эмбриона, отсутствие противопоказаний к ВРТ,
подписанное информированное согласие на участие в исследовании.
Критериями исключения были любые состояния и осложнения, требующие
отмены ПЭ в изучаемом цикле.
Все включенные в исследование пациенты были обследованы согласно
приказу Минздрава России №107н от 30.08.2012 г. "О порядке использования
вспомогательных
репродуктивных
технологий,
противопоказаниях
и
ограничениях к их применению".
Оценка степени зрелости, качества ооцитов, толщины блестящей
оболочки, выявление различных дисморфизмов ооцитов, качества эмбрионов
10
и мониторинг хетчинга регистрировал эмбриолог методом световой
микроскопии через 144-146 часов после оплодотворения (микроскоп Nikon
TE 300, общее увеличение х400). Выделение РНК и анализ экспрессии генов
CTSL-2, GATA3, CGB проводили методом обратной транскрипции и
полимеразной цепной реакции в режиме реального времени согласно
стандартным
методикам
производителей
(Qiagen,
Германия;
ДНК-
Технология, Россия).
Стимуляцию
функции
яичников
проводили
по
протоколу
с
антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона (ант-ГнРГ) с использованием
препарата рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (рФСГ)
или комбинированного препарата ФСГ и лютеинизирующего гормона (ЛГ),
или человеческого менопаузального гонадотропина (чМГ). Доза препарата
для каждой пациентки подбиралась индивидуально. По достижении
лидирующими фолликулами диаметра 17 мм вводили триггер овуляции. В
качестве триггера овуляции использовался человеческий хорионический
гонадотропин (ХГ) в дозе 8 000 - 10 000 МЕ, или агонист ГнРГ (а-ГнРГ).
Через
36
часов
после
введения
триггера
овуляции
проводили
трансвагинальную пункцию яичников.
Все зрелые ооциты подвергались оплодотворению методом ЭКО или
интрацитоплазматической
инъекции
сперматозоида
(ИКСИ).
Морфологическая оценка эмбрионов осуществлялась через 120-122 часа
после оплодотворения. Учитывались морфологические характеристики
эмбрионов по классификации Гарднера. К эмбрионам отличного качества
относили бластоцисты 4 или 5 класса с качеством внутриклеточной массы
(ВКМ) и ТФЭ категории А.
Культивирование
диагностика
и
ПЭ,
беременности
ведение
посттрансферного
осуществлялись
по
периода
и
стандартизированным
методикам. В полость матки переносили строго один эмбрион. В каждой
группе производилась оценка параметров оогенеза, эмбриогенеза, частоты
наступления беременности и живорождения.
11
Статистическая обработка данных выполнялась с помощью пакета
статистических программ STATISTICA V10 (США) и «SPSS Statistics V22»
(США) и «SAS V8” (США).
Результаты собственных исследований и их обсуждение
На первом этапе исследования была произведена оценка клиниколабораторных и эмбриологических предикторов эффективности спонтанного
хетчинга бластоцист. Полученные в исследовании данные о частоте
спонтанного хетчинга (43,4%) согласуются с имеющимися литературными
данными, согласно которым 50 - 75% всех морфологически нормальных
бластоцист человека оказываются не способны к самостоятельному выходу
из блестящей оболочки (Thurin A, 1998; Шафеи Р.А., 2017). Было выявлено,
что такие факторы как: отличное качество полученных бластоцист, наличие
экстрацитоплазматических (э-ЦП) дисморфизмов ооцитов, низкий уровень
ФСГ
у пациенток
и
редкое назначение
ХГ
в качестве триггера
суперовуляции, оказывали положительное влияние на успех спонтанного
хетчинга. А такие факторы как: толщина ZP, наличие цитоплазматических
(ЦП) дисморфизмов ооцитов, наличие астенозооспермии (АЗС) или
тератозооспермии (ТЗС), возраст пациентов, их индекс массы тела (ИМТ),
длительность стимуляции, доза и вид вводимых гонадотропинов (ГТ), не
оказывали влияние на успех спонтанного хетчинга бластоцист человека
(Таблица 1).
Факторы, оказавшие влияние на эффективность спонтанного хетчинга,
реализовали свое действие через влияние на качество бластоцист и ZP, что
способствовало ее более быстрому и легкому разрыву. Это подтверждает
корреляционный анализ: наличие эЦП дисморфизмов ооцитов коррелировало
с толщиной ZP (r= -0,2451; р=0,0260), уровень ФСГ коррелировал со
степенью зрелости бластоцисты (r= 0,39674 p=0,0060), назначение ХГ в
качестве триггера овуляции также коррелировало со степенью зрелости
бластоцисты (r= -0,5210; p=0,0001).
12
Таблица 1
Характеристики бластоцист с наличием и отсутствием спонтанного хетчинга
Показатели
Группа 1
Группа 2
рХетчинг+ (n=36) Хетчинг- (n=47)
Толстая ZP (>30 мкм)*
4 (11,1%)
8 (17,0%)
0,4479
ЦП дисморфизмы ооцитов*
5 (13,9%)
6 (12,8%)
0,7560
эЦП дисморфизмы ооцитов*
3 (6,4%)
10 (27,8%)
0,0060
АЗС*
18 (38,3%)
7 (19,4%)
0,0570
ТЗС*
12 (33,3%)
14 (29,8%)
0,6410
Степень зрелости бластоцисты*
26 (72,2%)
2 (4,3%)
 5
<0,0001
8 (22,2%)
37 (78,7%)
 4
2 (5,6%)
8 (17,0%)
 2-3
Качество ВКМ*
10 (27,8%)
14 (29,8%)
 А
0,0017
6 (16,7%)
23 (48,9%)
 В
20 (55,5%)
10 (21,3%)
 С
Качество ТФЭ*
17 (47,2%)
11 (23,4%)
 А
0,0030
15 (41,7%)
15 (31,9%)
 В
4 (11,1%)
21 (44,7%)
 С
Число бластоцист отличного
12 (33,3%)
7 (14,9%)
0,0475
качества*
Возраст женщины, лет**
30,0±4,1
31,5±5,1
0,1535
Возраст мужчины, лет**
33,3±6,7
33,9±5,1
0,6077
ИМТ**
21,8±3,6
22,9±5,7
0,3236
ФСГ, МЕ/мл**
7,1±2,2
5,8±1,9
0,0079
Длительность стимуляции
9,2±1,4
9,1±1,2
0,6435
овуляции, дней**
Доза ГТ при стимуляции
2175±955
2252±700
0,6723
овуляции, МЕ**
Препарат для стимуляции овуляции*
17 (47,2%)
16 (34,1%)
 рФСГ
0,2240
19 (52,8%)
31 (65,9%)
 чМГ или рФСГ/ЛГ
Триггер овуляции*
36 (76,6%)
20 (55,6%)
 ХГ
0,0425
16 (44,4%)
11 (23,4%)
 а-ГнРГ
Число фолликулов**
14,2±4,0
13,9±4,2
0,6799
Число ооцитов**
11,6±3,3
12,0±4,2
0,6079
Число зрелых ооцитов**
9,8±3,7
10,8±3,8
0,2293
*Данные представлены как числа и %, χ2-тест;
**Данные представлены как средние ± стандартное отклонение, t-тест
13
эЦП
дисморфизмы
были
представлены
в
виде
расширения
перивителлинового пространства и наличия в нем дебриса. По данным
литературы, на развитие эЦП дисморфизмов значимое влияние оказывает
применение а-ГнРГ в качестве триггера овуляции (Горшкова А.Г., 2015). В
нашем исследовании также была отмечена связь между применением а-ГнРГ
в качестве триггера овуляции и спонтанным хетчингом. Возможно, данные
дефекты эЦП структур механически облегчают разрыв ZP и вылупление
бластоцисты, а влияние а-ГнРГ на эффективность спонтанного хетчинга
реализуется за счет развития эЦП дисморфизмов ооцитов.
При анализе экспрессии мРНК генов, ответственных за эффективность
спонтанного хетчинга в сравниваемых группах было выявлено, что в группе
бластоцист с эффективным хетчингом отмечалась более высокая экспрессия
м-РНК генов CTSL2, GATA3 и CGB (Рисунок 1). Степень зрелости
эмбрионов, качество ВКМ и качество ТФЭ слоя также были связаны с
экспрессией м-РНК генов CTSL2 и GATA3, которая была выше у эмбрионов 5
стадии развития и эмбрионов класса А.
Mean; Whisker: Mean±SD
6
CTSL2: p < 0,00001
GATA3: p = 0,0005
CGB: p = 0,0004
5
4
3
2
1
0
-1
1
0
Спонтанный хетчинг: 1 - да, 0 - нет
CTSL2
GATA3
CGB
Рисунок 1. Уровень экспрессии CTSL2, GATA3 и CGB в бластоцистах
человека в зависимости от эффективности спонтанного хетчинга.
14
Интересными являются полученные данные о негативном влиянии ХГ
на спонтанный хетчинг. Экспрессия CGB была связана с введением ХГ в
качестве триггера овуляции: у бластоцист при введении ХГ отмечалась более
низкая экспрессия CGB (1,58 (0,0-2,94)) по сравнению с бластоцистами при
введении а-ГнРГ в качестве триггера овуляции (1,85 (0,0-2,83)) (р=0,0877).
Это может свидетельствовать о возможном подавлении экзогенно введенным
ХГ выработки ХГ ТФЭ бластоцисты, что может негативно влиять на
спонтанный хетчинг.
Таким образом, согласно полученным данным, основное влияние на
эффективность спонтанного хетчинга бластоцист человека оказывают не
качество блестящей оболочки и гамет, а качество самих бластоцист.
Вероятно, бластоциста может моделировать свою дальнейшую судьбу с
помощью собственных генетических факторов. Экспрессия мРНК генов
CTSL2, GATA3 и CGB является более низкой у бластоцист низкого качества,
что не позволяет им совершить спонтанный хетчинг и имплантироваться в
эндометрий.
На
основании
выявленных
факторов
был
проведен
многофакторный анализ оценки вероятности эффективности спонтанного
хетчинга. В созданной модели с помощью метода логистической регрессии
было подтверждено, что значимое влияние на эффективность спонтанного
хетчинга оказывали: уровень ФСГ (при уровне ФСГ<7 МЕ/мл вероятность
спонтанного хетчинга возрастала в 4,6 раз, ОШкор=4,6 (95% ДИ=1,3; 15,9)),
качество полученных бластоцист (при наличии бластоцист отличного
качества вероятность спонтанного хетчинга возрастала в 7,5 раза, ОШкор=7,5
(95% ДИ=1,9; 29,3)), наличие эЦП дисморфизмов ооцитов (при наличии эЦП
дисморфизмов ооцитов вероятность спонтанного хетчинга возрастала в 2,5
раза, ОШкор=2,5 (95% ДИ=1,3; 4,8)) и применение ХГ в качестве триггера
овуляции (при применении ХГ вероятность спонтанного хетчинга снижалась
в 10,2 раза, ОШкор=10,2 (95% ДИ=2,4; 43,6)). В полученной модели площадь
под кривой (англ. – area under the curve, AUC) составила 83,5%. Была
15
получена следующая формула вероятности эффективности спонтанного
хетчинга бластоцист человека в программах ВРТ (Формула 1).
Exp [-3,8 + 1,5*ФСГ + 2,0*Б + 0,9*О -2,3*ХГ]
Р(Х)= (------------------------------------------------------------)*100%
1+Exp [-3,8 + 1,5*ФСГ + 2,0*Б + 0,9*О - 2,3*ХГ]
где Р (Х) – вероятность спонтанного хетчинга, Exp – экспонента, ФСГ– уровень ФСГ <7
МЕ/мл, Б – наличие бластоцист отличного качества, О – наличие эЦП дисморфизмов
ооцитов, ХГ – применение препаратов ХГ в качестве триггера овуляции
Формула 1. Вероятность эффективности спонтанного хетчинга бластоцист
человека в программах ВРТ в зависимости от клинико-лабораторных данных
пациентов.
Для оценки понятия высокого и низкого риска спонтанного хетчинга
были произведены расчеты эффективности спонтанного хетчинга при
различном сочетании предикторов. При самом оптимальном сочетании
предикторов, согласно разработанной формуле, вероятность спонтанного
хетчинга
составила
64,3%
(максимальная
вероятность).
При
самом
неоптимальном сочетании предикторов, согласно разработанной формуле,
вероятность
вероятность).
спонтанного
хетчинга
составила
0,2%
(минимальная
Медиана полученного распределения от 0,2% до 64,3%
составила 32,2%, поэтому высоким риском спонтанного хетчинга было
решено считать значение ≥32%, а низким риском - значение <32%.
На втором этапе исследования были определены показания для
проведения
вспомогательного
хетчинга.
При
оценке
клинико-
анамнестических данных пациенток в исследуемых группах не было
выявлено статистически значимых различий, которые могли бы явиться
показаниями к проведению вспомогательного хетчинга бластоцист, за
исключением большего числа попыток ЭКО в анамнезе в группах хетчинга
(р=0,0218). При сравнительном анализе гормонального статуса было
выявлено, что уровень антимюллерова гормона (АМГ) был значимо выше у
пациенток, бластоцистам которых не проводили вспомогательный хетчинг,
16
по сравнению с пациентками, бластоцистам которых выполняли тот или иной
вспомогательный хетчинг (р=0,0001). Другие лабораторные показатели не
отличались в группах сравнения. Таким образом, вспомогательный хетчинг
потребовался бластоцистам от пациенток с более низким овариальным
резервом, что связано опять же с качеством полученных бластоцист. При
проведении корреляционного анализа была выявлена прямая корреляционная
связь между числом полученных бластоцист отличного качества и уровнем
АМГ (r= 0,2246, p=0,0001) (Таблица 2).
Таблица 2
Клинико-лабораторные данные пациенток с проведением и отсутствием
вспомогательного хетчинга бластоцист
Группа 1 (n=209)
Группа 2
(Хетчинг+)
рПоказатели
(n=100)
уровень
Группа 1а
Группа 1б
(Хетчинг-)
(n=106)
(n=103)
Возраст, лет*
32,7±3,9
31,5±4,3
31,8±4,0
0,0742
ИМТ, кг/м2*
Число попыток ЭКО в
анамнезе**
АМГ, нг/мл*
рФСГ/ЛГ или чМГ для
стимуляции
овуляции***
Препараты ХГ в
качестве триггера
овуляции***
22,2±3,7
22,4±3,0
22,3±2,6
0,8617
0 (0-1)
0 (0-1)
0 (0-0)
0,0218
2,4±2,1
2,7±1,8
3,6±2,9
0,0004
56 (52,8%)
55 (53,4%)
41 (41%)
0,0463
93 (87,7%)
95 (92,2%)
68 (68%)
<0,0001
*Данные представлены как средние ± стандартное отклонение, ANOVA; **Данные
представлены как медиана с интерквартильным размахом, тест Крускалл-Уоллиса;
***Данные представлены как абсолютные значения и %, χ2-тест
Также
было
отмечено,
что
пациенткам,
бластоцистам
которых
потребовался вспомогательный хетчинг, чаще назначались препараты,
содержащие ЛГ (рФСГ/ЛГ или чМГ для стимуляции овуляции) и ХГ в
качестве триггера овуляции, что согласуется с данными, полученными в
первой части исследования.
17
На основании проведенного анализа характеристик сперматогенеза,
оогенеза и раннего эмбриогенеза, было установлено, что в группе без
вспомогательного хетчинга была более низкая частота АЗС у мужчин
(р=0,0152), и было получено значимо больше бластоцист отличного качества
по
сравнению
с
группами,
в
которых
выполнялась
методика
вспомогательного хетчинга (р=0,0004). Это также свидетельствует о роли
качества гамет и самих бластоцист в неэффективности спонтанного хетчинга,
что определяет показания для проведения вспомогательного хетчинга
(Таблица 3).
Таблица 3
Характеристика полученных ооцитов и эмбрионов в группах сравнения
Группа 1 n=209
Группа 2
Показатели
(Хетчинг+)
р1n=100
р2Группа 1а Группа 1б
(Хетчинг-)
n=106
n=103
АЗС*
29(27,4%) 31(30,1%)
16 (16%)
0,0473
6 (4-9)
0,6003
Число ОКК**
6 (4-10)
0,3402
6 (4-9)
7 (4-10)
5 (3-8)
Число зрелых ооцитов
0,4488
5 (3-8,5)
**
0,4434
5 (3-7)
5 (3-8)
4 (3-6)
0,4157
Число зигот**
4,5 (3-7)
0,4283
4 (3-6)
4 (3-6)
2 (1-4)
0,0001
Число бластоцист**
4 (2-5)
2 (1-3)
3 (1-5)
0,0002***
1 (0-2)
Число бластоцист
0,0004
2 (1-3)
отличного качества**
0 (0-2)
1 (1-2)
<0,0001***
*Данные представлены как абсолютные значения и %, χ2-тест; ** Данные представлены как
медианы с интерквартильным размахом, тест Манна Уитни/тест Крускалла-Уоллиса; р1
– сравнение групп 1 и 2, р2 – сравнение 3-х групп; ***разница между группой 2 по
сравнению с группами 1а и 1б (поправка Бонферрони)
С целью определения показаний для проведения вспомогательного
хетчинга
был
проведен
многофакторный
анализ,
который
включал
клинически значимые показатели: уровень АМГ и число полученных
бластоцист. Показатели числа попыток ЭКО в анамнезе и вида ГТ для
стимуляции суперовуляции не имели статистической значимости в созданной
18
модели. Наличие АЗС не было конфаундером по определению, так как не
коррелировало с числом полученных бластоцист (r= -0,1464, р=0,0650).
Согласно полученным данным при уровне АМГ <2 нг/мл вероятность
проведения вспомогательного хетчинга возрастала в 2,1 раза (95% ДИ=1,2;
3,7), а при числе бластоцист <4 - в 2,5 раза (95% ДИ=1,5; 4,3). В полученной
модели AUC составила 72,3%. Исходя из этого, уровень АМГ и число
полученных
бластоцист
являются
показаниями
для
проведения
вспомогательного хетчинга, что связано с качеством полученных бластоцист
и возможностью совершения ими спонтанного хетчинга, и дальнейшей
имплантации.
На третьем этапе исследования мы оценили исходы программ ВРТ в
зависимости от проведения и вида вспомогательного хетчинга. По данных
Кохрановского обзора, применение вспомогательного хетчинга значимо
увеличивает частоту наступления клинической беременности (ОШ=1,13; 95%
ДИ 1,01; 1,27) (Carney C, 2012). Тем не менее, отсутствуют убедительные
данные о влиянии вспомогательного хетчинга на частоту живорождения, а
также о влиянии различных методик хетчинга на исходы программ ВРТ. По
данным
некоторых
исследователей,
вспомогательный
хетчинг
с
использованием различных методов дает аналогичную частоту имплантации
и наступления беременности (Balaban B, 2002). В нашем исследовании
частота наступления клинической беременности была выше в 1,9 раз (95%
ДИ=1,01;3,6) в группе пациенток с проведением ферментативного хетчинга
(р=0,0292). Эти данные не только согласуются с данными литературы о
положительном влиянии проведения процедуры вспомогательного хетчинга
на частоту наступления беременности, но и свидетельствуют о преимуществе
полного ферментативного удаления блестящей оболочки с целью повышения
эффективности программ ВРТ (Рисунок 2).
19
*
*
Рисунок 2. Исходы программ ВРТ в зависимости от наличия и вида
вспомогательного хетчинга бластоцист, *р<0,05.
Особое
внимание
заслуживают
полученные
данные
о
влиянии
вспомогательного хетчинга на развитие монохориальной многоплодной
беременности. Как известно, монохориальная многоплодная беременность
является грозным осложнением гестационного периода, ассоциированная с
повышенным риском перинатальной заболеваемости и смертности (Schieve
LA, 2000). Некоторые исследователи отмечают повышенный риск развития
монохориальной многоплодной беременности при применении ВРТ в целом,
а также при оплодотворении методом ИКСИ или при проведении
вспомогательного хетчинга с частичной диссекцией ZP (Schieve LA, 2000;
Costa
AL,
2001).
ферментативного
В
нашем
хетчинга
исследовании
не было
в
группе
зарегистрировано
проведения
многоплодных
беременностей, в то время как при проведении лазерного хетчинга
многоплодная беременность наблюдалась в 5,7 раза чаще, а при отсутствии
хетчинга - в 2 раз чаще, по сравнению с проведением ферментативного
хетчинга, что согласуются с имеющимися литературными данными (Рисунок
2). Это подтверждает предположение о роли нарушения целостности
блестящей оболочки в формировании монозиготных двоен в программах
ВРТ.
Также
это
позволяет
рекомендовать
проназный
хетчинг
как
приоритетный метод вспомогательного хетчинга, что позволит добиться не
20
только повышения эффективности программ ВРТ, но и снижения частоты
осложнений беременности, связанных с многоплодием.
На четвертом этапе исследования, был проведен анализ эффективности
вспомогательного хетчинга в зависимости от наличия и отсутствия
выявленных показаний для его проведения. Для этого пациентки были
поделены на группы по принципу наличия и отсутствия данных показаний.
Группу А составили пациентки с уровнем АМГ <2 нг/мл, или пациентки с
числом бластоцист <4 (n=228). Группу Б составили пациентки с уровнем
АМГ ≥4 нг/мл и числом бластоцист более и равным 4 (n=81). В группе А
вспомогательный хетчинг был проведен 175 пациенткам (76,7%) - группа А1,
и не проведен 53 пациенткам (23,3%) - группа А2. В группе Б
вспомогательный хетчинг был проведен 34 пациенткам (42%) - группа Б1, и
не проведен - 47 пациенткам (58%) (р<0,0001). Таким образом, 1/3
пациенткам, у которых были показания для вспомогательного хетчинга, он
не был проведен, однако почти 1/2 пациенток без показаний к его
проведению, он был проведен. Частота биохимической и клинической
беременности не различались в представленных группах пациенток, однако
частота живорождения была значимо ниже у пациенток с наличием
показаний к вспомогательному хетчингу, у которых он не был проведен
(ОР=1,9; 95% ДИ=1,05; 3,6). А риск формирования монозиготных двоен был
в 6 раз выше у пациенток с отсутствием показаний для вспомогательного
хетчинга, у которых он был проведен (р<0,0001), что в свою очередь влечет
за собой все сопутствующие осложнения многоплодной беременности как
для плода, так и для матери (Рисунок 3).
21
*
*
Рисунок 3. Исходы программ ВРТ в зависимости от наличия выявленных
показаний и проведения вспомогательного хетчинга бластоцист, *р<0, 05.
Таким образом, как отсутствие вспомогательного хетчинга при наличии
показаний к его проведению, так и его проведение при отсутствии к этому
показаний, приводит к снижению эффективности программ ВРТ и развитию
их
осложнений
(повышении
риска
монозиготных
многоплодных
беременностей).
На основании полученных в нашем исследовании данных был
разработан алгоритм дифференцированного применения вспомогательного
хетчинга бластоцист в программах вспомогательных репродуктивных
технологии (приложение).
ВЫВОДЫ
1. В практике ВРТ спонтанный хетчинг бластоцист происходит в 4,6
раз чаще у пациенток с уровнем ФСГ <7 МЕ/мл, и в 10,2 реже при введении
хорионического гонадотропина в качестве триггера овуляции, что связано с
влиянием данных клинико-лабораторных факторов на качество полученных
бластоцист.
2. Эффективность спонтанного хетчинга в программах ВРТ является
более высокой (в 7,5 раз) у бластоцист отличного качества при оценке по
22
Гарднеру
(4-5
степени
зрелости
с
внутриклеточной
массой
и
трофэктодермальным слоем категории А).
3. Отличное качество полученных в программах ВРТ бластоцист и их
способность к спонтанному хетчингу определяется качеством гамет и
эмбриональными
факторами.
Наличие
экстрацитоплазматических
дисморфизмов ооцитов увеличивает эффективность спонтанного хетчинга, а
наличие астенозооспермии снижает его эффективность в 2,5 раза. Также у
бластоцист, способных совершить спонтанный хетчинг, и у бластоцист
отличного качества отмечается более высокая экспрессия генов CTSL2,
GATA3 и CGB, что свидетельствует о роли катепсина L, GATA3 и
хорионического гонадотропина в регуляции спонтанного хетчинга.
4. Показаниями
для
вспомогательного
хетчинга
бластоцист
в
программах ВРТ являются уровень АМГ <2 нг/мл и число полученных
бластоцист <4, что связано с влиянием указанных факторов на качество
полученных бластоцист и их способность к совершению спонтанного
хетчинга и имплантации.
5. Эффективность программ ВРТ увеличивается в 1,9 раз при полном
удалении зоны пеллюцида по сравнению с лазерным хетчингом или его
отсутствием.
6. Вспомогательный хетчинг в виде полного удаления зоны пеллюцида
снижает риск монозиготной многоплодной беременности в 5,7 раз по
сравнению с лазерным хетчингом и в 2 раза по сравнению с отсутствием
хетчинга.
7. Отсутствие вспомогательного хетчинга при наличии к нему
показаний и его проведение при отсутствии к нему показаний в программах
ВРТ приводит к снижению живорождения в 1,9 раз и увеличению риска
монозиготной многоплодной беременности в 6 раз.
23
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Для
прогнозирования
эффективности
спонтанного
хетчинга
бластоцист человека в программах ВРТ может быть использована
разработанная формула прогноза в зависимости от клинико-лабораторных
данных пациентов.
Exp [-3,8 + 1,5*ФСГ + 2,0*Б + 0,9*О -2,3*ХГ]
b.
Р(Х)= (-----------------------------------------------------------------)*100%
1+Exp [-3,8 + 1,5*ФСГ + 2,0*Б + 0,9*О - 2,3*ХГ]
где Р (Х) – вероятность спонтанного хетчинга, Exp – экспонента, ФСГ– уровень ФСГ <7
МЕ/мл, Б – наличие бластоцист отличного качества, О – наличие эЦП дисморфизмов
ооцитов, ХГ – применение препаратов ХГ в качестве триггера овуляции
2. Показаниями
для
вспомогательного
хетчинга
бластоцист
в
программах ВРТ являются: уровень АМГ менее 2 нг/мл и число полученных
бластоцист менее 4, а также плохое качество полученных бластоцист.
3. Вследствие негативного влияния препаратов ЛГ и ХГ на спонтанный
хетчинг бластоцист в программах ВРТ у пациентов группы риска
неэффективности спонтанного хетчинга (уровень ФСГ≥7 МЕ/мл, уровень
АМГ <2 нг/мл, отсутствие бластоцист отличного качества в предыдущих
программах ВРТ) рекомендовано применение рФСГ для стимуляции
суперовуляции и а-ГнРГ в качестве триггера овуляции.
4. При наличии показаний к вспомогательному хетчингу рекомендовано
полное удаление зоны пеллюцида вследствие позитивного влияния данного
вида хетчинга на эффективность программ ВРТ и снижения риска
монозиготной многоплодной беременности.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Применение методики ферментативного вспомогательного хэтчинга в
циклах ВРТ / А.Г. Сыркашева, Н.В. Долгушина, А.Ю. Романов, Э.О.
Ибрагимова, Н.П. Макарова, Р.А. Шаффеи // Материалы X Юбилейного
международного конгресса по репродуктивной медицине. – М., 2016. – С.
297.
24
2. Роль качества эмбрионов в эффективности самостоятельного хетчинга
бластоцист человека в программах вспомогательных репродуктивных
технологий / Н.В. Долгушина, А.Г. Сыркашева, А.Ю. Романов, Э.О.
Ибрагимова, Н.П. Макарова // Мать и Дитя: материалы IX Регионального
научно-образовательного форума (Сочи, 2016). – М., 2016. – С.133
3. Роль вспомогательного хетчинга в программах лечения бесплодия
методами вспомогательных репродуктивных технологий: обзор литературы /
Э.О. Ибрагимова, Н.В. Долгушина, А.Г. Сыркашева, А.Ю. Романов, О.И.
Языкова, Н.П. Макарова // Гинекология. – 2016. – № 3 – С. 44–47.
4. Молекулярно-генетические
предикторы
эффективности
хетчинга
бластоцист человека в программах ВРТ / А.Г. Сыркашева, О.В. Бурменская,
Н.В. Долгушина, А.Ю. Романов, Э.О. Ибрагимова, Н.П. Макарова, Е.А.
Калинина,
Д.Ю.
Трофимов
//
Материалы
ХXVI
Международной
конференции РАРЧ. – М., 2016. – С.127.
5. Роль качества гамет в эффективности самостоятельного хетчинга
бластоцист человека в программах ВРТ / А.Ю. Романов, Э.О. Ибрагимова,
Н.В. Долгушина, А.Г. Сыркашева, Н.П. Макарова // Материалы XI
Международного конгресса по репродуктивной медицине. – М., 2016. – С.
415.
6. Генетическая регуляция процесса хетчинга бластоцист человека в
программах ЭКО / Э.О. Ибрагимова, Н.В. Долгушина, Н.П. Макарова, А.Г.
Сыркашева, А.Г. Бурдули, Е.А. Калинина // Репродуктивные технологии
сегодня и завтра: материалы XXVII ежегодной международной конференции
РАРЧ. – СПб., 2017. – С. 187
7. Cell and genetic predictors of human blastocyst hatching success in
assisted reproduction / A.G. Syrkasheva, N.V. Dolgushina, A.Y. Romanov, O.V.
Burmenskaya, N.P. Makarova, E.O. Ibragimova, E.A. Kalinina, G.T. Sukhikh //
Zygote. – 2017. – Vol. 25, №5. – P. 631–636
8. Предикторы эффективности спонтанного хетчинга бластоцист человека
в программах ВРТ / Н.В. Долгушина, Э.О. Ибрагимова, А.Ю. Романов, О.В.
25
Бурменская, Н.П. Макарова, Р.А. Шафеи, А.Г. Сыркашева // Акушерство и
гинекология. – 2018. – № 2. – С. 88–95
9. Роль проназного хетчинга в повышении эффективности программ
вспомогательных репродуктивных технологий / Н.В. Долгушина, Э.О.
Ибрагимова, А.Ю. Романов, Н.П. Макарова, А.А. Довгань, А.Г. Сыркашева,
Е.А. Калинина // Акушерство и гинекология. – 2018. – № 3 – С. 70–75.
26
Приложение. Алгоритм дифференцированного применения вспомогательного хетчинга бластоцист в программах ВРТ.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа