close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Исследование роли В-лимфоцитов в лёгочной патологии мышей при экспериментальной туберкулёзной инфекции

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Дятлов Александр Валерьевич
В-лимфоциты в лёгочной патологии при туберкулёзной инфекции у
мышей
14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология
Автореферат
диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук
Москва 2018
1
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном
учреждении «Центральный научно-исследовательский институт туберкулёза»
(ФГБНУ «ЦНИИТ»).
Научный руководитель:
Линге Ирина Андреевна, кандидат биологических наук, старший научный
сотрудник лаборатории иммуногенетики ФГБНУ «ЦНИИТ».
Официальные оппоненты:
Владимирский Михаил Александрович, доктор медицинских наук, профессор,
заведующий лабораторией иммунологических исследований и молекулярной
диагностики туберкулёза НИИ фтизиопульмонологии Первого МГМУ им. И.М.
Сеченова
Филатов Александр Васильевич, доктор биологических наук, профессор,
заведующий лабораторией №23 иммунохимии ФГБУ «ГНЦ «Институт
иммунологии» ФМБА России.
Ведущая организация:
Федеральное
бюджетное
учреждение
науки
Московский
научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г. Н.
Габричевского Роспотребнадзора.
Защита диссертации состоится « »
2018 г. в « » часов на заседании
диссертационного совета Д 208.130.01 при Федеральном Государственном
Бюджетном
Учреждении
«Национальный
исследовательский
центр
эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н. Ф. Гамалеи»
Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НИЦЭМ им. Н. Ф.
Гамалеи» Минздрава России) по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 18.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.
Ф. Гамалеи» Минздрава России и на сайте института http://www.gamaleya.ru/
Автореферат разослан « »
2018 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета
д. м. н., профессор
Русакова Е. В.
2
Общая характеристика работы
Актуальность темы исследования
На сегодняшний день туберкулёз является одной из десяти наиболее частых
причин смерти людей. В 2015 году количество новых случаев заболевания
туберкулёзом по всему миру по данным ВОЗ составляло 10,4 млн., а смертность от
туберкулёза составила 1,8 млн. человек в том числе 0,4 млн. случаев среди ВИЧположительных Россия является одной из 3-х стран с наибольшей встречаемостью
туберкулёза с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (МЛУ,
ШЛУ) 1. К сожалению, до настоящего времени не существует высокоэффективных
методов терапии, позволяющих гарантированно справляться с инфекцией у
пациентов с иммунодефицитами и в случаях заражения штаммами ШЛУ. В этих
случаях к категории «лечение выбора» относятся многочисленные хирургические
методы, которые существенно повышают успех лечения, но, как правило, ведут к
потере
значительных
участков
лёгкого.
Главным
фактором
патогенеза
Mycobacterium tuberculosis (Mtb) считается избыточное, плохо контролируемое
воспаление лёгочной ткани, приводящие к её разрушению 2. Толчком к развитию
воспаления является иммунный ответ на возбудителя, который необходим для
защиты хозяина, но должен оставаться под жёстким контролем, чтобы не
закончится развитием тяжёлой патологии. Подобная ситуация делает изучение
патогенеза туберкулёза, и в особенности его иммунологических аспектов, весьма
важной научной и практической проблемой.
Степень разработанности темы исследования
Туберкулёз
является
инфекционным
заболеванием,
вызываемым
факультативным внутриклеточным патогеном M. tuberculosis. Основными
игроками в борьбе с туберкулёзом являются Т-клетки и макрофаги, традиционно
считается, что В-клетки и антитела не играют большой роли в этом процессе 3. Тем
не менее, за последние десять лет интерес к В-клеткам при туберкулёзе возрос.
Показано, что В-лимфоциты инфильтрируют лёгочную ткань и образуют там
скопления, похожие на В-фолликулы вторичных лимфоидных органов (см. список
3
терминов «В-фолликулы»). Такие образования в литературе были названы
индуцируемыми лимфоидными фолликулами, эктопическими лимфоидными
фолликулами, третичными лимфоидными органами, или просто В-фолликулами 4.
Подобные скопления, располагающиеся вблизи туберкулёзных гранулём, были
описаны как в моделях на животных 5, так и у пациентов
при
этом
остаётся
малоизученной. В
частности,
6,7
. Роль В-фолликулов
остаётся
непонятным,
продуцируют ли фолликулярные В-клетки антитела к микобактериям, и следует ли
считать появление в лёгочной ткани плотных В-клеточных инфильтратов
компонентом патологии или защитной реакцией. Прямых экспериментальных
данных мало, и гипотезы основываются преимущественно на наблюдениях,
сделанных на других внутриклеточных патогенах, или на общих сведениях
относительно антиген-представляющих и регуляторных функций В-клеток. В
нескольких работах, выполненных на мышах, и посвящённых изучению роли
антител, показано, что пассивная иммунизация моноклональными антителами
против ряда компонентов клеточной стенки M. tuberculosis оказывала защитный
эффект против Mtb-инфекции
8,9
. В других работах адаптивный перенос В-клеток
мышам, не имеющим собственных, снижал уровень туберкулёзной патологии 10.
Тем не менее, результаты более поздних исследований на животных и на человеке
не позволяют однозначно определить роль В-клеток в туберкулёзной патологии.
В связи с этим, изучение В-клеточного звена иммунного ответа, роли лёгочных
В-лимфоцитов при туберкулёзе, и определение, их возможной регуляторных
функций, остаётся актуальной проблемой.
Цель исследования
Изучить роль В-клеток, инфильтрирующих лёгочную ткань, в иммунном ответе
и патологии лёгких при туберкулёзной инфекции у мышей.
4
Задачи исследования
Оценить динамику накопления В-лимфоцитов и формирования В-клеточных
фолликулов в лёгких чувствительных к туберкулёзу мышей линии I/St при
аэрозольном заражении вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv.
Охарактеризовать поверхностный фенотип лёгочных В-лимфоцитов.
Исследовать влияние лёгочных В-лимфоцитов на поляризацию лёгочных
макрофагов.
Определить профиль ключевых для противотуберкулёзного ответа цитокинов,
синтезируемых лёгочными В-клетками.
Оценить способность лёгочных В-лимфоцитов представлять антигены M.
tuberculosis специфичным Т-лимфоцитам.
Определить
состав
подклассов
и
специфичность
иммуноглобулинов,
продуцируемых лёгочными В-лимфоцитами при туберкулёзе.
Научная новизна исследования
Было показано, что В-клетки мышей линии I/St, чувствительной к туберкулёзу,
пролиферируют внутри лёгочных фолликулов. Это подтверждает гипотезу о том,
что В-клеточные фолликулы при туберкулёзе выполняют функцию третичных
лимфоидных органов.
Впервые подробно охарактеризован поверхностный фенотип популяции
лёгочных В-клеток при туберкулёзе. Описан её суб-популяционный состав,
сходный с классическими лимфоцитами В1 и В2 лимфоидных органов.
Впервые показано, что лёгочные клетки В2 не несут характерный для других
лимфоцитов В2 поверхностный маркёр CD23, являющийся низко аффинным Fcрецептором к IgE. Отсутствие маркера CD23 не связанно ни с активацией Влимфоцитов, ни с их дифференцировкой в плазматические клетки. Кроме того, они
не несут поверхностного IgE. Данный фенотип описан впервые и является
уникальным.
5
1. Впервые
определён
инфильтрирующими
спектр
цитокинов,
лёгочную
ткань
производимых
В-клетками,
туберкулёзе.
Основными
при
секретируемыми цитокинами оказались про-воспалительные IL-6 и IL-11.
2. Впервые было показано, что лёгочные В-клетки при туберкулёзе способны
эффективно выполнять роль антиген-представляющих клеток для специфичных
к антигенам микобактерий Т-лимфоцитов.
Впервые получена панель гибридом из В-клеток, инфильтрирующих лёгкие
мышей,
заражённых
синтезируемых
туберкулёзом.
лёгочными
Впервые
В-клетками
при
изучены
свойства
туберкулёзе,
а
антител,
именно:
их
изотипический состав и специфичность. Показано, что большая часть клонов
легочных
В-лимфоцитов
продуцируют
антитела,
не
реагирующие
с
микобактериями.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Описан
состав
поверхностных
маркеров,
характеризующих
лёгочную
популяцию В-лимфоцитов при туберкулёзе. Произведено сравнение с другими
популяциями В-клеток и найдены ключевые различия. Показано, что лёгочные В2
лимфоциты лишены поверхностного маркера CD23 и не несут поверхностного IgE.
Данный фенотип является уникальным для туберкулёзной патологии и описан
впервые.
Произведена оценка состава противовоспалительных цитокинов и антител,
вырабатываемых лёгочными В-клетками при туберкулёзе. Выявлены основные
характеристики антител, включая состав подклассов и их специфичность.
Выявлено что, приток В-лимфоцитов в лёгкие и образование ими фолликулов
имеет скорее патогенный, а не защитный характер.
Полученные результаты имеют прогностическое значение при оценке путей
развития
туберкулёзной
патологии
в
клинике.
Полученные
результаты
используются в курсах лекций для студентов биологического факультета
6
Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова и в
образовательных программах ординаторов и аспирантов ФГБНУ «ЦНИИТ».
Методология и методы исследования
В качестве основного метода исследования использовали экспериментальную
модель туберкулёза in vivo после аэрозольного заражения бактериями M.
tuberculosis штамма H37Rv мышей линий I/St, CBA и CBA/N.
Выделение
клеток
лёгкого
производили
методом
ферментативной
дезинтеграция лёгочной ткани нуклеаз-протеазным комплексом ферментов.
Обогащение популяции В-клеток осуществляли путём мечения В-клеток
антителами против CD19, связанными с магнитными бусами, с последующим
выделением на магнитных колонках. В-клеточные гибридомы получали из
очищенных магнитной сепарацией В-клеток лёгких традиционными методами
слияния
с
миеломой
с
последующим
клонированием
лимитирующими
разведениями. Фенотипическую характеристику В-лимфоцитов лёгких, селезёнки
и плевральной полости изучали при помощи проточной цитофлуорометрии.
Иммунологические характеристики изучали с использованием метода ELISA,
qPCR, при помощи антиген-специфических пролиферативных тестов и при
помощи специфических тестов, оценивающих активность ферментов; подклассы и
специфичность антител, производимых В-клетками, определяли методом ELISA.
Структуру лёгочной ткани оценивали гистологически и иммуногистохимически на
криосрезах лёгкого.
Личный вклад автора
Научные результаты, содержащиеся в диссертации, получены при личном
участии автора и представляют собой законченное самостоятельное научное
исследование. Автор принимал непосредственное участие в постановке задач,
планировании и выполнении экспериментов, и обработке данных. Автор
осуществлял заражение мышей бактериями M. tuberculosis H37Rv, ставил
эксперименты с применением иммунологических и молекулярно-биологических
7
методов, обрабатывал полученные результаты, участвовал в написании статей и
подготовке
рукописи
диссертационной
работы.
Опубликованные
и
представленные на научных конференциях данные включены Дятловым А. В. в
диссертацию.
Гибридомы из лёгочных В-лимфоцитов а также анализ антител был осуществлён
к. м. н., с. н. с. отдела иммунологии ФГБНУ «ЦНИИТ» Авдиенко В. Г. Авдиенко
В. Г является соавтором соответствующей публикации.
Внедрение результатов исследования
Результаты диссертационного исследования, проведённого Дятловым А. В.
используются в лекционном курсе для ординаторов и аспирантов, обучающихся в
ФГБНУ «ЦНИИТ», а также внедрены в работу отдела иммунологии ФГБНУ
«ЦНИИТ», о чём свидетельствуют соответствующие акты о внедрении:
«Использование полученной подробной характеристики лёгочных В-лимфоцитов
и данных об их влияния на противотуберкулёзный иммунитет при создании
учебных курсов для ординаторов и аспирантов, обучающихся на базе ФГБНУ
«ЦНИИТ» и «Использование полученной подробной характеристики лёгочных Влимфоцитов и данных об их влияния на противотуберкулёзный иммунитет при
планировании дальнейших исследований противотуберкулёзного иммунного
ответа, а также при создании диагностических подходов и противотуберкулёзных
препаратов».
Структура и объём диссертации
Диссертация имеет традиционную структуру и содержит Введение и Главы
«Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение»,
«Заключение» и завершается Выводами, Списком сокращений и Списком
литературы (225 источников).
Объём диссертации 126 страниц, иллюстративный материал представлен 19
рисунками и 2 таблицами.
8
Положения, выносимые на защиту
Методами in vivo и in vitro изучено влияние основных иммунологических
характеристик В-лимфоцитов лёгких и морфологии их расположения на течение
туберкулёзной патологии.
1. В-клеточные фолликулы в очагах туберкулёзного воспаления нужно
рассматривать как третичный орган иммунной системы.
2. Образование В-клеточных фолликулов в очаге патологии и инфильтрация Вклеток с изменённым фенотипом является негативным фактором при
развитии туберкулёзного процесса. В-клеточный иммунный ответ в лёгких
не оказывает существенного влияния на подавление размножения патогена,
и не снижает, а скорее увеличивает, уровень воспаления.
3. Основная популяция В-клеток в инфицированных туберкулёзом лёгких
состоит из клеток, близких по фенотипу к классическим лимфоцитам В2, но
отличающихся от них отсутствием рецептора CD23. Среди лёгочных Влимфоцитов отсутствуют клетки, несущие связанный с мембраной IgE.
Данный фенотип является уникальным для туберкулёзной патологии и ранее
описан не был.
4. Основными цитокинами, секретируемыми лёгочными В-клетками является
про-воспалительные IL-6 и IL-11.
5. Лёгочные В-лимфоциты при туберкулёзе способны эффективно выполнять
роль антиген-представляющих клеток для специфичных к антигенам
микобактерий Т-лимфоцитов.
6. Большая часть клонов В-лимфоцитов, полученных из поражённого ТБ
лёгкого, продуцируют антитела, не реагирующие с микобактериями. Роль
этих антител в туберкулёзной патологии остаётся неясной.
Степень достоверности исследования
Достоверность результатов диссертационного исследования подтверждается
достаточным количеством наблюдений, позволяющим определять существенность
9
полученных
экспериментальных
математической
статистики.
данных
В
с
работе
использованием
использованы
методов
современные
экспериментальные методы исследования, которые соответствуют поставленным
целям и задачам. Научные положения и выводы, сформулированные в
диссертации, логически вытекают из результатов проведённых комплексных
иммунологических исследований, включающих анализ методом проточной
цитофлуорометрии,
специализированные
тесты,
определяющие
активность
ферментов, методы иммуногистохимии и морфологии, а также молекулярнобиологические
тесты
(ELISA,
qPCR).
Все
исследования
проведены
с
использованием современного сертифицированного и поверенного оборудования
и международных протоколов. Полученные данные обрабатывались при помощи
общепринятых статистических подходов, компьютерных программ Excel и Prism и
представлены в виде фотографий, графиков и таблиц. Методы статистики
включали критерии ANOVA, t-тест Стьюдента, критерий F Фишера. Статистически
достоверными считались различия при p < 0,05.
Публикации
Материалы диссертации опубликованы в 7 научных работах, из них 3 в
журналах, рекомендованных ВАК, и 4 в тезисах научных конференций.
Апробация работы
Результаты исследований обсуждены: (1) на научно-практической конференции
молодых учёных с международным участием, посвящённой всемирному дню
борьбы с туберкулёзом, 2014; (2) на XXII международной научной конференции
студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов», 2015; (3) на конкурсе
молодых учёных в рамках IV Конгресса Национальной Ассоциации Фтизиатров,
2015; (4) на международной школе в Германии «12th Spring School on Immunology»;
(5) на международных школах и форумах «Форум Кох-Мечников» по туберкулёзу,
2016, 2017; (6) на международной конференции EMBO “Tuberculosis 2016”.
10
Апробация диссертации состоялась 19.09.2017г. на совместном заседании
отделов иммунологии и микробиологии ФГБНУ «ЦНИИТ» (протокол №1).
Результаты и обсуждение
При туберкулёзе В-клетки накапливаются в лёгких и формируют в них Вклеточные фолликулы
На первом этапе данного исследования мы провели детальный анализ динамики
накопления В-лимфоцитов в лёгких и формирования в них В-клеточных
фолликулов.
Анализ срезов лёгких, окрашенных на поверхностный маркёр В-клеток В220
выявил, что количество В-фолликулов и площадь, занимаемая ими на срезах
лёгкого, достигали максимума в промежутке между 7-й и 9-й неделями после
заражения, а затем начинали снижаться. В ходе цитофлуориметрического анализа
было показано, что динамика общего накопления В-клеток в лёгких совпадает с
динамикой изменения площади и количества В-клеточных фолликулов; кроме
того, оказалось, что практически все В-лимфоциты сосредоточены в В-фолликулах
и фактически отсутствуют в окружающей ткани.
В- и Т-лимфоциты пролиферируют в фолликулах
Количество клеток в фолликуле может увеличиваться как благодаря миграции
новых клеток, так и за счёт деления уже присутствующих в ткани. Мы определили,
происходит ли внутри В-клеточных фолликулов локальная пролиферация В- и Тклеток. Для этого провели флуоресцентную окраску срезов на В-клетки (B220), Тклетки (CD4) и маркёр пролиферации Ki67. Было установлено, что ядра некоторых
В-лимфоцитов (Рис. 1В) и Т-лимфоцитов CD4+ (Рис. 1С) находятся в митозе.
Следовательно, внутри фолликулов осуществляется локальная пролиферация В- и
Т-лимфоцитов в непосредственной близости друг от друга, т. е. точно также, как
это происходит в зародышевых центрах третичных лимфоидных органов.
11
Рисунок 1 Пролиферация В- и Т-лимфоцитов внутри В-клеточных фолликулов. Срезы лёгких
мышей линии I/St заражённых M. tuberculosis H37RV на 7 недель после заражения окрашены
флуоресцентно. В-клетки (B220 красный, A, B), Т-клетки CD4+(CD4, зелёный, A, C). Ядра
делящихся клеток - маркёр Ki67 (белый, A, B, C). Рисунки B и C представляют собой увеличенную
выделенную область рисунка A. Белые стрелки указывают на делящиеся В- (B) и Т-лимфоциты
(C).
Характеристика поверхностного фенотипа В-лимфоцитов
Несмотря на большое количество исследований В-лимфоцитов при туберкулёзе,
их суб-популяционный состав в лёгких при туберкулёзе в деталях описан не был.
В связи с этим мы решили подробно охарактеризовать поверхностный фенотип и
субпопуляционный состав В-клеток, мигрирующих в лёгкие при туберкулёзной
патологии. Мы сравнили состав В-клеточной популяции лёгких, плевральной
полости и селезёнки интактных мышей, а также через 3 и 7 недель после
аэрозольного заражения.
Общая характеристика. Как показано на, более 80% В-клеток лёгких, как
здоровых, так и заражённых животных, имеют поверхностный фенотип
CD19+B220hiIgMloIgDhi, характерный для популяции В2, а около 12% клеток –
CD19+B220loIgMhiIgDlo, что типично для клеток В1. Соотношение клеток В1 и В2 в
лёгких было одинаковым на всех исследуемых сроках после заражения. Кроме
того, мы исследовали В-клетки плевральной полости (ПП) – области
расположенной в непосредственной близости от лёгких. По данным литературы
лимфоциты В1 являются основными клетками ПП. Действительно, в клеточном
составе ПП интактных мышей I/St наблюдается обратное соотношение В1 и В2
клеток: примерно 70% клеток В1 и 30% В2. После заражения это соотношение
12
существенно сдвигается в сторону В2: на седьмой неделе в плевральной полости
содержание клеток В1 составляет около 35%, а В2 – 65%. Возрастает не только
относительное, но и абсолютное количество лимфоцитов В2. То есть в ходе
развития туберкулёзного процесса состав В-клеток ПП становится похожим на
состав В-клеток лёгких.
Помимо анализа фенотипов клеток в суспензии мы сделали окраску срезов на
поверхностные антитела IgM и IgD для того, чтобы определить их локализацию в
тканях. На Рис. 2 показано, что многочисленные В-лимфоциты, несущие IgD
(лимфоциты
В2),
образуют
скопления
(Рис.
2,
A,
C,
D),
тогда
как
немногочисленные лимфоциты В1, несущие IgM, расположены в ткани диффузно
(Рис. 2, B, C, D).
Рисунок 2 Расположение В-лимфоцитов мышей линии I/St, несущих IgD и IgM в ткани лёгкого
через 7 недель после заражения. В-клетки IgD+ - красная метка (A, C, D), В-клетки IgM+ зелёная
метка (B, C, D). Ядра клеток - DAPI представлены в синем цвете (D).
13
Лёгочные лимфоциты В2 не несут маркёра CD23. В разных работах авторы
используют различные единичные маркёры или их сочетания для определения субпопуляционного состава В-лимфоцитов, поэтому мы решили использовать
широкую панель антигенов для характеристики интересующих нас популяций. Мы
показали, что лимфоциты В1 действительно не несут маркеров CD23 и CD21/35,
характерных для клеток В2, но имеют маркёр CD43. Кроме того, часть популяции
клеток B1 экспрессировали CD11b и CD5. Таким образом, минорная популяция
лёгочных клеток В1 состояла из клеток B1a (CD19+B220loIgMhiIgDloCD43+CD23CD11b+CD5+) и B1b (CD19+B220loIgMhiIgDloCD43+CD23-CD11b+CD5-). Лёгочные
клетки В2 имели характерный фенотип CD19+B220hiIgMloIgDhi CD21/35+CD11bCD5-CD43-, однако на них отсутствовал типичный для лимфоцитов В2 маркёр
CD23, низко аффинный Fc рецептор к IgE , который нередко используют в качестве
единственного маркера лимфоцитов В2 11.
Стоит отметить, что CD23 отсутствовал на лёгочных клетках В2 вне зависимости
от наличия или отсутствия инфекции. Описанное отклонение лёгочных клеток В2
от классического фенотипа наблюдалось не только у чувствительных к туберкулёзу
мышей линии I/St, но и у мышей линии CBA, более устойчивой к туберкулёзной
инфекции, и также не зависело от наличия инфекции и этапа её развития.
Далее мы решили оценить экспрессию CD23 на лимфоцитах В2 плевральной
полости и селезёнки. В отличие от лёгочных клеток В2, уровень экспрессии CD23
на поверхности клеток В2 плевральной полости интактных мышей совпадает с
таковым у лимфоцитов В2 селезёнки, а после заражения M. tuberculosis часть
клеток В2 плевральной полости теряет экспрессию молекулы CD23 и становиться
похожа на клетки В2 лёгких. При этом, на лимфоцитах В2 селезёнки молекула
CD23 присутствует как у здоровых, так и у заражённых животных на одинаковом
уровне.
Отсутствие CD23 на лимфоцитах В2 не связано с их активацией или
дифференцировкой
в
плазматические
14
клетки.
Ранее
было
высказано
предположение о снижении уровня CD23 на В-лимфоцитах из-за их активации 12,
поскольку эти авторы отметили, что антигенная стимуляция В-клеток приводит к
смене фенотипа с CD69loCD86loCD23hi на CD69hiCD86hiCD23lo. В связи с этим мы
решили определить степень активации В-лимфоцитов IgMlo IgDhi по уровню
экспрессии маркеров активации CD69 и CD86 в начале развития адаптивного
ответа (3 нед.) и на 7-й неделе после заражения, когда наблюдается максимальное
количество В-лимфоцитов. Мы показали, что отсутствие CD23 на поверхности Влимфоцитов не связанно со степенью их активации; в целом, процент лимфоцитов
В2, несущих маркёры активации, не превышал 10 процентов.
Кроме того, отсутствие CD23 на лимфоцитах В2, может быть ассоциировано с
их дифференцировкой в плазматические клетки. Для проверки этой гипотезы мы
оценили количество плазматических клеток CD138+ в лёгких. FACS-анализ
показал, что всего лишь 0,8% лёгочных лимфоцитов несут поверхностный маркёр
плазматических клеток CD138. Таким образом, отсутствие CD23 на поверхности
лёгочных лимфоцитов В2 не объясняется переходом в состояние плазматических
клеток при инфекции.
В-лимфоциты способствуют частичной поляризации макрофагов по пути М2
Далее мы оценивали возможное влияние В-лимфоцитов на макрофаги – клетки
иммунной системы, играющие центральную роль в противотуберкулёзной защите.
В ходе иммунного ответа для макрофагов характерна поляризация по про- или
противовоспалительному пути, соответственно, М1 или М2, в зависимости от
полученных сигналов. Для определения влияния В-лимфоцитов на поляризацию
макрофагов мы использовали сравнение мышей двух конгенных линий: CBA и
мутантную линию CBA/N-xid. Эти животные отличаются одной точковой
мутацией в гене тирозиновой киназы Бруттона (btk) в Х-хромосоме. Мутация xid
(x-linked immunodeficiency), приводит к снижению общего числа В-лимфоцитов и
отсутствию субпуляции В1а у мышей СВА/N, но не к полному отсутствию всех Вклеток, как у мышей В-/-. Данная особенность выгодно отличает эту модель от
полного «нокаута» по В-клеткам, поскольку при полном отсутствии В-лимфоцитов
15
невозможно нормальное развитие вторичных лимфоидных органов и, как
следствие, нарушено нормальное развитие иммунного ответа. Сначала мы оценили
количество В-лимфоцитов в лёгких мышей СВА и CBA/N на разные сроки после
заражения. Результаты FACS-анализа показывают, что количество В-клеток в
лёгких мышей не отличается между линиями через 3 недели после заражения и
примерно в 2 раза больше у СВА, чем у CBA/N через 7, 11 и 15 недель после
заражения, с максимальным количеством В-клеток на срок 11 недель.
Поляризацию макрофагов мы оценивали по уровню экспрессии генов (qPCR) для
индуцируемой NO-синтазы (iNOS) и аргиназы (ARG); активность этих
конкурентных ферментов, характерных для поляризации макрофагов по пути М1
или М2, соответственно, а также по экспрессии поверхностных маркеров CD206 и
CD163 и по уровню экспрессии генов для противовоспалительных цитокинов TGFβ и IL-10 лёгочными макрофагами заражённых мышей.
Одним из основных маркеров поляризации макрофагов являются активность
индуцируемой NO-синтазы и аргиназы, конкурирующих за общий субстрат –
аргинин. Экспрессия на уровне мРНК и активность этих ферментов в лёгочных
макрофагах была одинаковой у мышей обеих линий, с преобладанием фермента
iNOS. Также не отличалась экспрессия гена fizz, кодирующего маркёр
реорганизации и восстановления ткани, характерный для макрофагов М2. Другими
словами, в поляризации легочных макрофагов обеих линий после заражения
преобладал путь М1.
Тем не менее, мы провели анализ выраженности дополнительных маркеров
поляризации макрофагов по пути М2: цитокинов IL-10 и TGF-β, а также
поверхностных маркеров CD163 и CD206. Уровень экспрессии гена, кодирующего
IL-10 в лёгочных макрофагах, сильно возрастал к 7-й неделе и оставался высоким
у мышей СВА на 11-й неделе после заражения, тогда как у мышей линии СВА/N
он был заметно ниже на оба исследуемых срока. Уровень экспрессии гена для TGFβ в лёгочных макрофагах мышей CBA и CBA/N на 7-й неделе увеличивался в 30 и
16
15 раз, соответственно. При этом экспрессия данного гена оставалась на высоком
уровне в макрофагах мышей СВА на 11-й неделе, тогда как у конгенной линии
уровень экспрессии возвращался к норме. Этот результат, как и количественные
различия в экспрессии поверхностных маркеров CD206 и CD163, свидетельствуют
о том, что в присутствии полноценной популяции В-клеток (мыши CBA) доля
лёгочных макрофагов, поляризующихся в сторону противовоспалительного
направления М2, выше, чем при дефиците В-клеток (мыши CBA/N).
Мы
также
определили
локализацию
iNOS
и
ARG,
производимых
активированными макрофагами непосредственно в ткани лёгкого методом
иммуногистохимии. Макрофаги, продуцирующих аргиназу, находятся внутри
гранулём, окружённых валом В-лимфоцитов (Рис. 3A). В участках лёгкого, где нет
сформированных В-фолликулов, макрофаги, содержащие аргиназу, рассеянны в
воспалённой ткани (Рис. 3C). При этом, макрофаги, продуцирующие iNOS
расположены как внутри, так и снаружи сформированных гранулём (Рис. 3 B, D).
Что касается жиросодержащих макрофагов, они расположены как внутри, так и
снаружи гранулём окружённых В-клеточными фолликулам. Макрофаги, внутри
гранулём производят как аргиназу, так и индуцируемую NO-синтазу, и являются
жиросодержащими.
17
Рисунок 3 Взаимное расположение макрофагов, производящих iNOS и ARG, а также Влимфоцитов (В220+) у мышей линий CBA (рис. А, В) и CBA/N (рис. С, D) на 12й неделе после
заражения M. tuberculosis. Зелёным на рисунках А, В, С, D окрашены В-лимфоциты (В220),
красным на рисунках А и С окрашена аргиназа, на рисунках В и D – индуцируемая NO-синтаза.
Окрашивались серийные срезы, представляющие один и тот же участок лёгкого.
Функциональная характеристика лёгочных В-клеток
Из полученных нами данных следует, что в лёгких мышей при туберкулёзе
присутствуют как В1 так и лимфоциты В2, которые способны производить
антитела, выступать в роли АПК, синтезировать цитокины и оказывать влияние на
другие типы клеток
13
. Поэтому, следующим этапом нашей работы стала оценка
основных видов возможной функциональной активности лёгочных В-лимфоцитов
при туберкулёзной инфекции.
Продукция цитокинов является одним из важнейших способов взаимодействия
клеток и их взаимного влияния. Регуляторная роль В-клеток во многих
18
патологических процессах подробно описана, однако при туберкулёзе этот вопрос
исследован слабо. Поэтому следующим этапом нашей работы стало определение
профиля цитокинов, продуцируемых В-лимфоцитами лёгких при заражении
мышей линии I/St.
Мы выделяли В-клетки лёгких методом магнитной сортировки, после чего
культивировали их в присутствии или без добавления антигенов микобактерий в
течение
48
часов
и
определяли
концентрацию
ключевых
про-
и
противовоспалительных цитокинов в культуральной среде методом ELISA.
Полученные результаты показывают, что лёгочные В-лимфоциты секретируют
большое количество про-воспалительных цитокинов IL-6 и IL-11, но не
классические цитокины первого типа TNF-α и IFN-γ, и противовоспалительные
цитокины IL-10 и TGF-β. Продукция IL-6 и IL-11 не зависела от присутствия
микобактериальных антигенов в культуре.
Кроме того, мы определили уровень продукции IL-6 и IL-11 В-клетками
селезёнки и показали, что они, в отличие от лёгочных В-лимфоцитов, не
производят данных цитокинов при туберкулёзной инфекции, несмотря на высокое
содержание микобактерий в селезёнке мышей линии I/St на данном сроке после
заражения.
Лёгочные В-лимфоциты в роли АПК. Для исследования способности
лёгочных В-клеток выполнять роль АПК при туберкулёзе сначала мы определили
уровень экспрессии молекул MHC Класса II (МНСII) на В-лимфоцитах селезёнки
и на В-лимфоцитах лёгких здоровых мышей и через 7 недель после заражения
методом проточной цитофлуорометрии. Полученные данные показывают, что
уровень экспрессии MHC II на лёгочных В-клетках здоровых животных достаточно
велик, а при заражении ещё немного возрастает, достигая уровня экспрессии этих
молекул на В-клетках селезёнки.
Для прямой оценки способности В-клеток выполнять роль АПК мы выделили Вклеточные популяции из лёгких и селезёнки заражённых животных. Способность
19
представлять антигены микобактерий оценивали по интенсивности пролиферации
in vitro полученной ранее Т-линий CD4+, специфичной к антигенам микобактерий.
Полученные данные, показывают, что В-клетки лёгких и селезёнки осуществляют
представление антигенов CD4+ Т-клеткам одинаково эффективно, из чего следует,
что
лёгочные
В-лимфоциты
обладают
выраженной
функцией
антиген-
представляющих клеток.
Исследование антител, производимых лёгочными В-лимфоцитами. Мы
решили изучить специфичность и состав подклассов антител, производимых
лёгочными В-лимфоцитами заражённых мышей линии I/St.
Для этого мы выделили В-лимфоциты лёгких через 12 недель после заражения,
поместили в культуру на 48 часов и определили концентрацию антител в среде,
состав классов и подклассов, а также способность реагировать с антигенами
микобактерий. Оказалось, что лёгочные В-лимфоциты спонтанно продуцируют
антитела классов IgA и IgG, но не IgM и IgE. При этом в классе IgG представлены
антитела подклассов: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. Для определения специфичности
антител
в
качестве
АГ
мы
использовали
ультразвуковой
дезинтеграт
микобактерий, их культуральный фильтрат, а также экстракт лёгочной ткани
незаражённых мышей. Интересно, что практически не обнаружились антитела,
специфичные к антигенам микобактерий и собственной ткани лёгкого, за
исключением небольшой реактивности антител классов IgA и IgG1 к антигенам
здоровой лёгочной ткани. Важно отметить, что при этом в сыворотке крови этих
же заражённых мышей обнаруживаются иммуноглобулины всех классов,
обладающие высокой специфичностью к антигенам микобактерий.
На поверхности лёгочных В-лимфоцитов отсутствует IgE. Имеются
обширные литературные данные о том, что рецептор CD23 участвует в регуляции
синтеза иммуноглобулина Е
14
. Согласно результатам, описанным выше,
иммуноглобулинов IgE нет среди спонтанно продуцируемых В-клетками лёгкого.
Мы решили сравнить наличие иммуноглобулинов IgE на поверхности В-клеток
20
лёгких, селезёнки и медиастинальных лимфоузлов, дренирующих ткань лёгких,
для чего были получены суспензии клеток этих органов на 9-й неделе после
заражения. Анализ методом проточной цитофлуорометрии показал, что IgE на
поверхности лёгочных В-лимфоцитов отсутствует, тогда как в селезёнке он
обнаруживается приблизительно на 10% В-клеток, а в медиастинальных
лимфоузлах – 5%
Специфичность лёгочных В-лимфоцитов. Поскольку мы обнаружили лишь
очень слабую продукцию антител специфичных к антигенам микобактерий
лёгочными В-лимфоцитами, мы решили провести более детальный анализ для
ответа на вопрос, существуют ли вообще подобные клоны в популяции В-клеток
лёгких при туберкулёзной инфекции. Для этого мы создали панель гибридом из
лёгочных В-лимфоцитов I/St. Из 288 лунок было получено 66 клонов, 26 из которых
производили иммуноглобулины.
Полученные моноклональные антитела были проанализированы методом
ELISA. Результаты представлены на Таблице 2. Только 5 из 26 клонов (19%)
обладали специфичностью к антигенам M. tuberculosis – смеси культурального
фильтрата и ультразвукового дезинтеграта микобактерий. Все они относились к
классу IgG: один клон относился к подклассу IgG1, два – к IgG2a и два – к IgG2b.
21 клон (81%) (11 IgM, 8 IgG2a и 2 IgG1) производили антитела неизвестной
специфичности, которые не взаимодействовали ни с тканью лёгкого, ни с
антигенами микобактерий.
21
Выводы
1.
Количество В-клеток и образуемых ими фолликулов у мышей линии I/St,
чувствительных к туберкулёзу, растёт по мере прогрессирования заболевания и
достигает своего максимума через 7-9 недель после заражения, после чего начинает
снижаться.
2.
Внутри В-клеточных фолликулов наблюдается пролиферация В- и Т-клеток
in situ в непосредственной близости друг от друга.
3.
Лёгочные макрофаги, судя по основным маркерам iNOS и ARG,
поляризованы по пути М1. Для частичной поляризацией по пути М2 требуется
нормальное количество В-лимфоцитов, судя по поверхностным маркерам CD163 и
CD206 и продукции цитокинов IL-10 и TGF-β в лёгких.
4.
10-15% лёгочных В-лимфоцитов относятся к суб-популяции В1, внутри
которой присутствуют как клетки B1a, так и В1b. 85-90% В-лимфоцитов лёгких
имеют фенотип близкий к лимфоцитам В2. Соотношение В-лимфоцитов В1 и В2
не меняется в ходе развития туберкулёзной патологии.
5.
На лёгочных В-лимфоцитах В2, в отличие от лимфоцитов В2 селезёнки,
отсутствует характерная для этой популяции молекула CD23. Среди легочных
лимфоцитов В2 отсутствует популяция, несущая связанный с мембраной IgE.
Лёгочные клетки В2 – особая популяция В-лимфоцитов.
6.
Лёгочные В-лимфоциты производят про-воспалительные цитокины IL-6 и
IL-11, и не производят эффекторные цитокины 1-го типа TNF-α и IFN-γ, и
противовоспалительные цитокины 2-го типа IL-10 и TGF-β.
7.
Лёгочные В-лимфоциты способны выполнять функцию АПК для Т-
лимфоцитов при туберкулёзной инфекции так же эффективно, как В-лимфоциты
селезёнки.
8.
Лёгочные В-лимфоциты синтезируют иммуноглобулины подклассов IgA,
IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 и IgM, но не IgE.
22
Большая часть В-клеток в заражённых ТБ лёгких производят антитела, не
9.
обладающие
специфичностью
к
микобактериям:
из
26
исследованных
моноклональных антител лишь 5 обладали такой специфичностью.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1.
Кондратьева Т.К., Линге И.А., Кондратьева Е.В., Дятлов А.В., Друцкая
М.С., Зварцев Р.В., Недоспасов С.А., Апт А.С. Роль TNF в иммунологическом
противотуберкулёзном ответе. // Биохимия (Biochemistry (Moscow)). – 2014. – №
12. – с.1657-1667. – 11 п. л.
2.
Дятлов А.В., Кондратьева Е.В., Кондратьева Т.К., Линге И.А. Исследование
роли В-лимфоцитов в поляризации лёгочных макрофагов при экспериментальной
туберкулёзной инфекции. // Сборник тезисов конференции «Новые технологии в
эпидемиологии диагностике и лечении туберкулёза взрослых и детей». – 2014. –
с.63-66. – 4 п. л.
3.
Дятлова А.В., Линге И.А. Характеристика В-клеток, инфильтрирующих
лёгкие мышей заражённых туберкулёзом. // Сборник тезисов конференции
«Ломоносов 2015». – 2015. – с.177. – 1 п. л.
4.
Dyatlov AV, Linge IA, Apt AS. Influence of B cells on tuberculosis pathology. //
Сборник материалов школы «12th Spring school on Immunology». – 2016. – с.82. – 1
п. л.
5.
При
Линге И.А., Дятлов А.В., Кондратьева Е.В., Апт А.С., Кондратьева Т.К.
экспериментальной
инфекции,
вызванной
Mycobacterium
avium,
образование скоплений В-лимфоцитов в лёгочной ткани является фактором
патогенеза. // Туберкулёз и болезни лёгких. – 2016. – № 4. – с.51-56. – 6 п. л.
6.
Linge I., Kondratieva E., Avdienko V., Dyatlov A., Apt A., Kondratieva T. B-
lymphocytes forming follicle-like structures in the lung tissue of TB-infected mice:
phenotypic and functional features. Tuberculosis 2016: Interdisciplinary research on
tuberculosis and pathogenic mycobacteria, Paris, September 19-23. – 2016. – с.-263. – 1
п. л.
23
7.
Linge I., Dyatlov A., Kondratieva E., Avdienko V., Apt A., Kondratieva T. B-
lymphocytes forming follicle-like structures in the lung tissue of tuberculosis-infected
mice: Dynamics, phenotypes and functional activity. // Tuberculosis (Edinb). – 2017.
– № 102. – с.16-23. – 8 п. л.
Список литературы
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
World Health Organisation. WHO Global Tuberculosis Raport. 2016.
Vyas SP, Goswami R. Striking the right immunological balance prevents progression of tuberculosis. Inflamm Res.
2017;66(12):1031-1056. doi:10.1007/s00011-017-1081-z.
Russell DG. Who puts the tubercle in tuberculosis? Nat Rev Microbiol. 2007;5(1):39-47. doi:10.1038/nrmicro1538.
Kahnert A, Höpken UE, Stein M, Bandermann S, Lipp M, Kaufmann SHE. Mycobacterium tuberculosis triggers
formation of lymphoid structure in murine lungs. J Infect Dis. 2007;195(1):46-54. doi:10.1086/508894.
Phuah JY, Mattila JT, Lin PL, Flynn JL. Activated B cells in the granulomas of nonhuman primates infected with
Mycobacterium tuberculosis. Am J Pathol. 2012;181(2):508-514. doi:10.1016/j.ajpath.2012.05.009.
Tsai MC, Chakravarty S, Zhu G, et al. Characterization of the tuberculous granuloma in murine and human lungs:
cellular composition and relative tissue oxygen tension. Cell Microbiol. 2006;8(2):218-232. doi:10.1111/j.14625822.2005.00612.x.
Ulrichs T, Kosmiadi G a, Trusov V, et al. Human tuberculous granulomas induce peripheral lymphoid follicle-like
structures to orchestrate local host defence in the lung. J Pathol. 2004;204(2):217-228. doi:10.1002/path.1628.
Reljic R, Clark SO, Williams A, et al. Intranasal IFN-gamma extends passive IgA antibody protection of mice against
Mycobacterium tuberculosis lung infection. Clin Exp Immunol. 2006;143(3):467-473. doi:10.1111/j.13652249.2006.03012.x.
Balu S, Reljic R, Lewis MJ, et al. A Novel Human IgA Monoclonal Antibody Protects against Tuberculosis. J
Immunol. 2011;186(5):3113-3119. doi:10.4049/jimmunol.1003189.A.
Maglione PJ, Xu J, Chan J. B cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon
pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 2007;178:7222-7234. doi:17513771.
Hardy RR, Hayakawa K. B cell development pathways. Annu Rev Immunol. 2001;19:595-621.
doi:10.1146/annurev.immunol.19.1.595.
McDonald KG, McDonough JS, Newberry RD. Adaptive Immune Responses Are Dispensable for Isolated Lymphoid
Follicle Formation: Antigen-Naive, Lymphotoxin-Sufficient B Lymphocytes Drive the Formation of Mature Isolated
Lymphoid Follicles. J Immunol. 2005;174(9):5720-5728. doi:10.4049/jimmunol.174.9.5720.
Garraud O, Borhis G, Badr G, et al. Revisiting the B-cell compartment in mouse and humans: more than one B-cell
subset exists in the marginal zone and beyond. BMC Immunol. 2012;13:63. doi:10.1186/1471-2172-13-63.
Fellmann M, Buschor P, Röthlisberger S, Zellweger F, Vogel M. High affinity targeting of CD23 inhibits IgE
synthesis in human B cells. Immunity, Inflamm Dis. 2015;3(4):339-349. doi:10.1002/iid3.72.
Список сокращений
ARG – arginase – аргиназа
B-фолликулы – В-клеточные фолликулы = третичные лимфоидные органы = индуцируемые лимфоидные
фолликулы = эктопические лимфоидные фолликулы – фолликулярные структуры, возникающие в области
хронического воспаления и выполняющие функции фолликулов первичных и вторичных лимфоидных органов. В
них осуществляется представление АГ, созревание аффинитета В-лимфоцитов и др.
ELISA – enzyme-linked immunosorbent assay – твердофазный иммуноферментный анализ
Fc – fragment crystallizable region (Fc region) – кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина (Fc фрагмент
иммуноглобулинов)
FcR – Fc receptor – рецептор к Fc фрагменту иммуноглобулинов
fizz – ген, кодирующий FIZZ
FIZZ – ингибиторный белок Resistin-likeβ
24
IFN-γ – интерферон-γ
IgA (G, M, D, E) – иммуноглобулины класса A (G, M, D, E)
IL – интерлейкин
iNOS – inducible NO synthase – индуцируемая NO синтаза
MHCI – major histocompatibility complex class I – главный комплекс гистосовместимости класса I
MHCII – major histocompatibility complex class II – главный комплекс гистосовместимости класса II
Mtb – Mycobacterium tuberculosis
qPCR – quantitative polymerase chain reaction – количественная полимеразная цепная реакция (ПЦР) = ПЦР в
реальном времени
TGF-β – transforming growth factor β – трансформирующий ростовой фактор β
TNF-α – tumor necrosis factor α – фактор некроза опухоли α
АГ – антиген
АПК – антиген-представляющие клетки
АТ – антитела
ВИЧ – вирус иммунодефицита человека
ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
КОЕ – колониеобразующие единицы
МЛУ – множественная лекарственная устойчивость
мРНК – матричная РНК
ПП – плевральная полость
РНК – рибонуклеиновая кислота
СПИД – синдром приобретённого иммунодефицита
ТБ - туберкулёз
ШЛУ – широкая лекарственная устойчивость
25
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
12
Размер файла
571 Кб
Теги
экспериментальной, инфекции, мыше, роли, лимфоциты, исследование, патологией, лёгочной, туберкулёзным
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа