close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Оценка эффективности комплекса гликозилированных полипептидов выделенного из морских ежей вида Strongylocentrotus droebachiensis в экспериментах при воспалительных процессах в бронхах

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
КАТЕЛЬНИКОВА
Анастасия Евгеньевна
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КОМПЛЕКСА ГЛИКОЗИЛИРОВАННЫХ
ПОЛИПЕПТИДОВ, ВЫДЕЛЕННОГО ИЗ МОРСКИХ ЕЖЕЙ ВИДА
STRONGYLOCENTROTUS DROEBACHIENSIS, В ЭКСПЕРИМЕНТАХ ПРИ
ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССАХ В БРОНХАХ
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
03.01.04 – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертация на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург
2018
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
исследования.
По
данным
Министерства
здравоохранения
Российской
Федерации
и
Федеральной
службы
государственной статистики, в России в 2012 г. заболевания органов дыхания у
взрослых по частоте занимали 2-е место и составляли 20 209,7 случаев на 100
тыс. населения. Высокая заболеваемость, как общая, так и первичная, была
зарегистрирована в Северо-Западном и Приволжском федеральных округах
(Иванова Е.В. и др., 2015). За период 2012-2015 г. в России зарегистрирован
рост встречаемости заболеваний органов дыхания, который в 2015 г. составил
33 790,0 на 100 тыс. взрослого населения (Росстат…, 2016), в большинстве
случаев обусловленный ухудшением экологического состояния окружающей
среды.
Наиболее распространенным заболеванием органов дыхания в популяции
является острый бронхит. Обычно бронхит развивается в ходе острой
респираторной инфекции (Носуля Е.В., 2013), но может возникать и под
влиянием химических, физических факторов и аллергенов. Рецидивированию
бронхита способствует ослабление иммунитета, загрязнение воздуха, табачный
дым, в том числе при пассивном курении, и предрасположенность к
аллергическим реакциям (Becker S. et al., 2005; Lee J. et al., 2012). Социальноэкономический потенциал России обуславливает уровень здоровья населения
трудоспособного возраста, что активизирует исследования по поиску новых
лекарственных средств, которые способны адекватно воздействовать на
ключевые звенья патогенеза болезней органов дыхания.
На современном фармацевтическом рынке присутствуют безрецептурные
препараты, позиционирующиеся как средства лечения бронхита. Зачастую
установление диагноза острого бронхита ассоциируется у врача с
необходимостью назначения антибактериальной терапии без веских
доказательств целесообразности их применения (Утешев Д.Б., 2010). Хотя
антибиотики и обеспечивают этиотропную терапию, тем не менее, кардинально
не изменяют течение острого бронхита ни по тяжести, ни по длительности
заболевания. Они, прежде всего, снижают риск осложнений, например развитие
пневмоний (Scaparrotta А. et al., 2013). Поскольку осложнения
антибактериальной терапии весьма разнообразны и варьируют от
невыраженных дискомфортных состояний до тяжелых и даже смертельных
исходов (анафилактический шок, синдромы Лайела, Стивенсона-Джонса),
предпочтительнее использовать препараты, позволяющие уменьшить
выраженность воспаления, число осложнений, и предотвращающие переход
болезни в хроническую форму.
В настоящее время перспективными лекарственными средствами
являются препараты, действующее вещество которых выделено из природного
сырья. Значительное число научно-исследовательских работ направленно на
выделение и синтез из морских организмов биологически активных соединений
и веществ (Blunt J.W. et al., 2017). По некоторым литературным данным,
соединения морского происхождения способны оказывать значительно
4
больший эффект в сравнение с известными биологически активными
веществами из животных и растений суши (Crawford A.D. et al., 2016; Martins
A. et al., 2014). Выделенные из гидробионтов линейные и цикличные пептиды
способны проявлять выраженные противовоспалительные, антиоксидантные,
цитотоксические, антимикробные свойства, выступать в роли специфических
блокаторов ионных каналов (Беседнова Н.Н., 2014; Крыжановский С.П., 2013;
Blunt J.W. et al., 2017; Crawford A.D. et al., 2016).
Степень разработанности темы исследования. На фармацевтическом
рынке США и стран Европейского союза зарегистрировано 7 лекарственных
препаратов из морских гидробионтов, четыре из которых являются
противоопухолевыми препаратами (Crawford A.D. et al., 2016; Montaser R.,
Luesch H., 2011). На I - III фазах клинических испытаний находятся около 26
лекарственных препаратов, из них 23 соединения – противоопухолевые, два
соединения – для лечения шизофрении и болезни Альцгеймера и одно – для
лечения хронической боли (Crawford A.D. et al., 2016).
В Российской Федерации зарегистрированы следующие лекарственные
препараты из морских организмов: Нуклеоспермат натрия, «Гистохром для
офтальмологии», «Гистохром для кардиологии», «Коллагеназа КК» (Регистр
лекарственных средств России, 2018).
Из-за широкого набора пептидов, изучение комплексов биологически
активных веществ из морских ежей, представляет собой особый интерес
(Крыжановский С.П., 2013). Помимо уже доказанных антиоксидантного,
гиполипидемического,
противовоспалительного,
противоопухолевого,
антибактериального и противовирусного действий, биологически активные
вещества (БАВ) из морских ежей способны регулировать уровень сахара в
крови, за счет ингибирования дипептидилпептидазы 4 типа (ДПП-4)
(Макаренко И.Е. и др., 2015). Коллективом сотрудников ЗАО «СанктПетербургский институт фармации» по запатентованной технологии (патент
РФ 2481119, приоритет от 05.03.2012 г.) был выделен комплекс
гликозилированных полипептидов (КГП) из внутренностей морских ежей S.
droebachiensis. Литературные данные дают основание предполагать наличие у
исследуемой субстанции фармакологической активности и соответствующих
механизмов действия (Крыжановский С.П., 2013; Abubakar L. et al., 2012;
Teixeira M.M., Hellewell P.G., 1997).
Цель исследования – изучить механизмы действия, эффективность на
моделях воспаления дыхательных путей у животных и безопасность комплекса
гликозилированных полипептидов, выделенного из морских ежей вида
Strongylocentrotus droebachiensis.
Задачи исследования
1. Изучить механизмы противовоспалительного действия комплекса
гликозилированных полипептидов, в частности, влияние на активность
циклооксигеназы-1, циклооксигеназы-2 и 5-липооксигеназы in vitro, влияние на
индуцированное фосфорилирование митоген-активированных протеинкиназ
р38, JNK1/2 и ERK1/2 in vitro, взаимодействие с Toll-подобными рецепторами 4
5
типа in vitro и определить влияние на основные звенья иммунного ответа
(гуморальный и клеточный) in vivo.
2. Биохимическими и морфогистологическими методами на модели
формалин-индуцированного бронхита и бронхита, вызванного сигаретным
дымом у крыс, подтвердить наличие противовоспалительных свойств у
изучаемого комплекса гликозилированных полипептидов, в сравнении с
препаратом, общепринятым в лечении острого бронхита (референтным).
3. Оценить безопасность кандидата в лекарственные средства на основе
комплекса гликозилированных полипептидов в моделях острой и хронической
токсичности.
Научная новизна исследования. Впервые проведен анализ механизмов
противовоспалительного
действия
комплекса
гликозилированных
полипептидов, выделенного из морских ежей. По результатам исследования in
vitro
мишенями
противовоспалительного
действия
комплекса
гликозилированных полипептидов являются: ЦОГ-2, МАР-киназа p38 и TLR4 .
Впервые проведено изучение специфической фармакологической
активности на двух моделях острого бронхита у крыс комплекса
гликозилированных полипептидов, выделенного из морских ежей, в сравнении
с известным синтетическим препаратом Амброксол. Установлено, что комплекс
гликозилированных полипептидов оказывает противовоспалительное действие,
снижая уровни ключевых показателей острого воспаления (общее количество
лейкоцитов и гранулоцитов) в бронхоальвеолярном лаваже (БАЛ) в модели
острого бронхита, индуцированного формалином и модели острого бронхита,
вызванного сигаретным дымом, у крыс. Кроме того, в модели острого
бронхита, вызванного сигаретным дымом, комплекс гликозилированных
полипептидов, снижал уровни провоспалительных цитокинов (IL-1β, TNF-ɑ,
IL-6, IL-8) в БАЛ и нормализовал антиоксидантный статус, за счет снижения
уровня малонового диальдегида и увеличения содержания восстановленного
глутатиона в крови животных. Противовоспалительное действие изучаемого
комплекса гликозилированных полипептидов подтверждено результатами
гистологического
исследования.
Установлено,
что
комплекс
гликозилированных полипептидов предотвращал развитие осложнений в виде
острого катарально-гнойного бронхита и пневмонии у животных на фоне
индукции патологии.
Впервые использован ингаляционный способ введения комплекса
гликозилированных полипептидов с противовоспалительным механизмом
действия на моделях острого воспаления бронхов у животных, за счет влияния
на TLR4 и ингибирования МАР-киназы p38, а также фермента ЦОГ-2, что
позволило воздействовать непосредственно на орган-мишень.
Впервые проведена оценка токсических эффектов кандидата в
лекарственные средства на основе комплекса гликозилированных
полипептидов. Показано отсутствие токсического действия у готового
лекарственного средства на основе комплекса гликозилированных
полипептидов при эндотрахеальном способе введения.
6
Теоретическая и практическая значимость работы. Доказанные
фармакологическая эффективность и безопасность позволяют рекомендовать
комплекс гликозилированных полипептидов, выделенный из морских ежей
вида S. droebachiensis, в качестве противовоспалительного средства для
лечения воспалительных заболеваний дыхательных путей.
Материалы диссертационной работы внедрены в учебные программы и
используются при чтении лекций и проведении практических занятий кафедр
фармакологии и биологической и общей химии федерального государственного
бюджетного образовательного учреждения высшего образования "СевероЗападный государственный медицинский университет имени И.И. Мечникова"
Министерства
здравоохранения
Российской
Федерации,
кафедры
фармакологии факультета фундаментальной медицины федерального
государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
образования "Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова",
кафедры фармакологии федерального государственного бюджетного
образовательного
учреждения
высшего
образования
"Смоленский
государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения
Российской Федерации.
Методология и методы исследования. Методология исследования
включала оценку механизмов, эффектов и токсического действия комплекса
гликозилированных полипептидов, выделенного из морских ежей, в
экспериментах in vitro и in vivo. Механизмы действия комплекса
гликозилированных полипептидов анализировали в условиях in vitro на
клеточных линиях HEK-Blue-hTLR4, U937 и А549. Противовоспалительную
активность комплекса гликозилированных полипептидов оценивали в
экспериментах in vivo на двух моделях острого бронхита, индуцированного
формалином, и вызванного сигаретным дымом у крыс. Оценку проводили по
следующим показателям: клеточный состав бронхоальвеолярного лаважа,
уровни провоспалительных цитокинов (IL-1β, TNF-ɑ, IL-6 и IL-8) и показатели
антиоксидантной
системы
(восстановленный
глутатион,
малоновый
диальдегид) (модель сигаретного дыма), гистологические исследования.
Безопасность кандидата в лекарственные средства на основе комплекса
гликозилированных полипептидов оценивали на двух моделях острой и
хронической токсичности. В рамках острой токсичности изучали летальность,
клинические симптомы интоксикации, поведенческие реакции, массовые
коэффициенты внутренних органов, местно-раздражающее действие.
Критериями оценки хронической токсичности являлись: летальность,
клинические симптомы интоксикации, поведенческие реакции, масса тела,
данные клинико-лабораторных исследований (клинический и биохимический
анализ крови), массовые коэффициенты внутренних органов, местнораздражающее действие, микроскопическое изучение внутренних органов и
тканей.
7
Положения, выносимые на защиту:
1. Механизмы противовоспалительного действия обусловлены тем, что
комплекс гликозилированных полипептидов является антагонистом TLR4,
ингибирует липополисахарид-индуцированное фосфорилирование МАРкиназы р38 и подавляет активности ЦОГ-2.
2. Противовоспалительное действие КГП в дозах 25, 50 и 100 мкг/кг,
подтвержденное биохимическими и морфогистологическими методами в
моделях острого формалин-индуцированного бронхита и бронхита, вызванного
сигаретным дымом, соответствует или превосходит референтный препарат
Амброксол в дозе 3600 мкг/кг.
3. Кандидат в лекарственные средства на основе комплекса
гликозилированных полипептидов, выделенного из морских ежей рода S.
droebachiensis, является безопасным для организма экспериментальных
животных и лишен токсических эффектов.
Степень достоверности исследования. Достоверность полученных в
ходе выполнения работы данных определяется достаточным для
статистической обработки количеством экспериментальных животных 188
мышей и 580 крыс в экспериментах in vivo, где выборка в каждой группе
составляла не меньше 6-12 мышей (крыс), в экспериментах на клеточных
линиях in vitro постановкой в нескольких параллелях.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены
на межвузовской студенческой конференции «Мечниковские чтения - 2012»
(Санкт-Петербург, Россия, 2012), XVIII международном съезде «Phytopharm
2014» (Санкт-Петербург, Россия, 2014), XXVIII зимней молодежной научной
школе «Перспективные направления физико-химической биологии и
биотехнологии» (Москва, Россия, 2016), 89-й конференции студенческого
научного общества «Мечниковские чтения - 2016» (Санкт-Петербург, Россия,
2016), XX международном съезде «Phytopharm 2016» (Санкт-Петербург,
Россия, 2016), III Всероссийской научной конференции молодых учёных
«Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург,
Россия, 2016), V Всероссийской научно-практической конференции студентов
и молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы науки
XXI века» (Смоленск, Россия, 2017), VII Ежегодного, международного
партнеринг-форума «Life Sciences Invest. Partnering Russia» (Санкт-Петербург,
Россия, 2017).
Апробация диссертации прошла на межкафедральном заседании
(протокол №12 от 22 мая 2017 г.) кафедр фармакологии и биологической и
общей химии федерального государственного бюджетного образовательного
учреждения высшего образования «Северо-Западный государственный
медицинский университет имени И.И. Мечникова» Министерства
здравоохранения Российской Федерации.
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 7 статей в
рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 6 тезисов.
8
Личное участие автора в выполнении исследования. Исследования
были выполнены на базе кафедры фармакологии федерального
государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
образования «Северо-Западный государственный медицинский университет
имени И.И. Мечникова» Министерства здравоохранения Российской
Федерации и в Санкт-Петербургском институте фармации.
Личный вклад автора осуществлялся на всех этапах работы и состоял в
планировании экспериментов (90%), их непосредственном выполнении (80%),
обработке полученных результатов (85%), обсуждении результатов, написании
статей и тезисов (90%), написании диссертации и автореферата (100%).
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из
введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
результатов экспериментальных исследований и их обсуждения, заключения,
выводов, списка сокращений и условных обозначений, списка литературы и
приложений. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста. Список
литературы включает 273 источника (48 отечественных и 225 иностранных).
Диссертация иллюстрирована 35 рисунками и 26 таблицами.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Объекты исследования. Комплекс гликозилированных полипептидов
(субстанция). Исследуемая субстанция представляет собой комплекс
гликозилированных полипептидов (КГП), выделенный из внутренностей
зеленых морских ежей вида S. droebachiensis. Подробное описание выделения
комплекса гликозилированных полипептидов описано в патенте РФ 2481119
[приоритет от 05.03.2012 г.].
Стронгилостин (кандидат в лекарственные средства). Исследуемый
препарат Стронгилостин (рабочее название, далее СГ) – 0,02% раствор.
Действующее вещество – комплекс гликозилированных полипептидов,
выделенный из внутренностей зеленых морских ежей вида S. droebachiensis.
Анализ влияния КГП на активность циклооксигеназы-1 (ЦОГ-1) и
циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2). Влияние комплекса гликозилированных
полипептидов на активность ферментов ЦОГ-1 и ЦОГ-2 оценивали с помощью
набора реагентов COX Colorimetric Iinhibitor Screening Assay Kit (Cayman
Chemicals, USA) в соответствии с инструкцией производителя. Субстанцию
изучали в конечных концентрациях 200, 100, 50, 25, 12,5 и 6,25 мкг/мл.
Позитивные контроли – селективный ингибитор ЦОГ-1 SC-560 (Cayman
Chemicals, USA) и селективный ингибитор ЦОГ-2 нифлумовая кислота
(Cayman Chemicals, USA). Отрицательный контроль – дистиллированная вода
(растворитель). Оценку активности КГП проводили по концентрации конечного
продукта
реакции
простагландина
F2α
(PGF2α)
с
помощью
иммуноферментного анализа. Оптическую плотность измеряли на
спектрофотометре xMark (BioRad, США) при длине волны 405 нм.
9
Концентрацию простагландина вычисляли по калибровочной кривой,
построенной по оптической плотности разных концентраций стандарта.
Анализ влияния КГП на активность 5-липооксигеназы (5-ЛОГ).
Влияние комплекса гликозилированных полипептидов на ферментативную
активность 5-ЛОГ изучали методом иммуноферментного анализа с помощью
набора реагентов Lipoxygenase Inhibitor Screening Assay Kit (Cayman Chemical,
USA) и очищенной 5-Lipoxygenase potato (Cayman Chemical, USA). В
соответствии с данными производителя тест-системы в качестве
неселективного ингибитора 5-ЛОГ использовали NDGA (Cayman Chemicals,
USA). За отрицательный контроль был взят растворитель КГП –
дистиллированная вода. Используемая в эксперименте тест-система определяла
количество гидропероксидов, образующихся в реакции липооксигенации.
Фотометрическое измерение проводили на планшетном спектрофотометре
xMark (BioRad, USA) при длине волны 490 нм.
Анализ
влияния
КГП
на
процесс
фосфорилирования
внутриклеточных ферментов МАР-киназ. В культуре моноцитов человека
линии U937 (Институт цитологии РАН) методом иммуноблотинга оценивали
фосфорилирование МАР-киназ. Определяли количество фосфорилированных
форм белков после выдержки клеток с КГП в течение 16 ч и обработкой ЛПС в
концентрации 1 мкг/мл в течение 60 мин. Субстанцию КГП тестировали в
концентрациях 16, 8, 4, 2, 1 и 0,5 мкг/мл. Исследование проводили в сравнении
со специфическим ингибитором активации МАР-киназ ERK1/2 U0126 и
неспецифическим ингибитором ЛПС-сигналинга – антителами к толл-лайк
рецептору 4-го типа (Аnti-hTLR4 IgA25). Разделение белков осуществляли
методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии
додецилсульфат натрия (SDS-PAGE) (Maurer H., 1972). Результаты оценивали
после сканирования рентгеновской пленки на сканере Epson Perfection V330
Photo и измерении относительной плотности проявленных полос с помощью
программного обеспечения Scion Image.
Анализ взаимодействия КГП с TLR4. В исследовании использовали
клеточную линию HEK-Blue-hTLR4 (Invivogen, США). В данную линию
трансфецирована плазмида с геном фермента эмбриональной щелочной
фосфатазы. Стимуляция рецептора агонистом приводит к активации
транскрипционных факторов AP1 и NF-kB и выработке данного фермента.
Величину стимуляции рецептора определяли после добавления реагента
QUANTI-Blue (Invivogen) по субстрат-ферментной реакции. Измеряли
оптическую плотность на планшетном спектрофотометре xMark (BioRad, USA)
при длине волны 625-655 нм. Для нейтрализации рецепторов TLR4
использовали поликлональные антитела TLR4 Anti-hTLR4-IgA (InvivoGen,
USA). Субстанцию КГП тестировали в концентрациях 16, 8, 4, 2, 1 и 0,5
мкг/мл. В качестве лиганда использовали ЛПС в конечной концентрации 10
нг/мл.
Анализ влияния КГП на основные звенья иммунного ответа. Анализ
иммунотропного действия КГП проводили в трех тестах (реакция
10
бласттрансформации, продукция антител, реакция гиперчувствительности
замедленного типа), оценивающих влияние субстанции на пролиферацию Т- и
В-лимфоцитов, а также на развитие гуморального и клеточного иммунных
ответов у мышей. В каждом тесте было сформировано 4 группы животных:
контрольная и 3 экспериментальных. Во всех тестах КГП вводили один раз в
день ингаляционно из расчета 25, 50 и 100 мкг/кг. Курс введения составлял 7
дней. Контрольная группа животных по той же схеме получала
дистиллированную воду в аэрозольной форме. Эвтаназию животных
осуществляли с помощью СО2-камеры.
Оценка противовоспалительного действия КГП на модели острого
бронхита, индуцированного формалином у крыс. Индукцию острого
бронхита выполняли путем однократного эндотрахеального введения 1%
раствора формалина экспериментальным и контрольным группам животных.
Введение выполняли аэрозоллером модели IA-1B-R (Penn-Century Inc., USA).
Перед проведением манипуляции животных вводили в поверхностный наркоз
ветеринарным препаратом «Золетил 100» (Virbac S.A., Франция). Было
сформировано 6 групп животных по 28 особей в каждой: интактная,
контрольная и 4 экспериментальных. Исследуемые объекты вводили курсом в
виде аэрозоля с использованием ингаляционного пути введения. Комплекс
гликозилированных полипептидов в виде раствора распыляли в
индивидуальные изолированные боксы для животного ультразвуковым
ингалятором «Муссон-2» (ФГУП «Алмаз», Россия) один раз в день из расчета
25 мкг/кг, 50 мкг/кг и 100 мкг/кг. Референтный препарат Амброксол
(Амбробене, MERCKLE GmbH, Германия) распыляли один раз в день в дозе
3600 мкг/кг. Исследуемые объекты вводили на протяжении 7 дней, начиная со
дня введения формалина. Животные интактной и контрольной групп получали
дистиллированную воду по аналогичной схеме. Оценку эффективности
исследуемых объектов проводили через 24, 48 и 72 ч после введения индуктора
воспаления. На выбранных временных точках животных эвтаназировали
методом цервикальной дислокации по 6 животных из каждой группы.
Выполняли забор бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) с последующим
определением клеточного состава (лейкоциты, гранулоциты, моноциты,
лимфоциты) на гематологическом анализаторе «ABACUS juniorvet» (Австрия).
На 8-й день эксперимента осуществляли макроскопическое и гистологическое
исследование ткани легких при помощи светооптического микроскопа Carl
Zeiss (Германия). Гистологическим методом оценивали: количество
бокаловидных клеток (БК) в бронхах среднего калибра на уровне центрального
отдела легких на протяжении 1 мм; полуколичественную оценку степени
выраженности воспалительного инфильтрата по визуально-аналоговой шкале
морфологических изменений слизистого и подслизистого слоя бронхов при
остром бронхите: норма (0), слабая (1), умеренно-выраженная (2), выраженная
(3).
11
Оценка противовоспалительного действия КГП на модели острого
бронхита, индуцированного сигаретным дымом у крыс. Индукцию острого
бронхита осуществляли путем экспозиции экспериментальных и контрольной
групп животных сигаретным дымом с помощью специального оборудования
(курительная машина, разработка ЗАО «Санкт-Петербургский институт
фармации», Россия) на протяжении 28-ми дней. Животных методом
модифицированной блочной рандомизации распределяли на 6 групп по 12 в
каждой: интактная, контрольная и 4 экспериментальных. Ежедневно для
окуривания 6 клеток, содержащих по 12 животных, использовали 90 сигарет. В
индивидуальные изолированные боксы для животного при помощи
ультразвукового ингалятора «Муссон-2» (ФГУП «Алмаз», Россия) распыляли
раствор КГП один раз в день из расчета 25, 50 и 100 мкг/кг. Амброксол
распыляли один раз в день в дозе 3600 мкг/кг. Введение исследуемых объектов
производили, начиная с 14-го дня от начала индукции острого бронхита и в
течение последующих 14 дней. Контрольная группа животных по той же схеме
в виде аэрозоля получала дистиллированную воду. Оценку действия
исследуемых объектов проводили в 1-й, 7-й, 14-й и 28-й дни исследования для
этого производили забор крови из хвостовой вены. По окончании эксперимента
(28-й день) животных эвтаназировали методом цервикальной дислокации. При
этом каждую экспериментальную группу разделяли на 2 части по 6 животных в
каждой. У одной группы из 6 животных осуществляли забор БАЛ; во второй
группе животных осуществляли макроскопическое и гистологическое
исследование ткани левого легкого на уровне средней трети (ворот легкого).
Оценку противовоспалительной активности КГП осуществляли:
– По количеству лейкоцитов и лейкоцитарной формуле в образцах
цельной крови (гранулоциты, моноциты, лимфоциты). Дополнительно на 14-й и
28-й дни эксперимента в крови животных оценивали показатели
антиоксидантной
системы
(восстановленный
глутатион,
малоновый
диальдегид);
– По количеству лейкоцитов и лейкоцитарной формуле в БАЛ, а также
уровням провоспалительных цитокинов (IL-1β, TNF-ɑ, IL-6 и IL-8);
– По толщине слизистой бронхов на протяжении 500 мкм;
– По количественной оценке степени изменений в ткани легких в баллах
по визуально-аналоговой шкале морфологических изменений слизистого и
подслизистого слоя бронхов при остром бронхите: норма (0), слабая (1+),
средняя (2+), сильная (3+); количественной оценке содержания нейтрофилов,
лимфоцитов и макрофагов в экссудате в просвете бронхов: отсутствие клеток
(0); минимальное количество от 1 до 10 клеток (1+); умеренное количество от
11 до 30 клеток (2+); значительное количество от 31 и выше (3+).
Оценка безопасности кандидата в лекарственные средства на основе
КГП (Стронгилостин). Для оценки острой токсичности СГ использовали 100
аутбредных крыс (50 самцов и 50 самок) и 60 аутбредных мышей (30 самцов и
30 самок). Введение крысам препарата СГ осуществляли эндотрахеальным
способом в дозах 0,03, 0,1 и 0,2 мг/кг. Для полной оценки токсических
12
эффектов дополнительно тестируемый препарат вводили крысам подкожно и
мышам внутрибрюшинно в дозах 0,1, 0,2, 1, 2 и 5 мг/кг. Высшая исследуемая
доза была ограничена максимально возможным объемом для однократного
введения животному в сутки при указанных путях введения (Миронов А.Н.,
2012). После однократного введения СГ за животными наблюдали в течение 14
дней. Массу тела животных измеряли до начала исследования на 2-й, 7-й и
непосредственно перед эвтаназией для расчета процентного отношения массы
органов к массе тела (15-й день эксперимента). На 15-й день исследования
животных эвтаназировали и подвергали некропсии с осмотром внутренних
органов. С целью оценки местно-раздражающего действия препарата СГ
проводили гистологическое исследование органов и тканей в месте введения.
Исследование хронической токсичности препарата СГ при многократном
введении с периодом отсроченного наблюдения проводили на 240 аутбредных
крысах (120 самцов и 120 самок). В исследовании животных разделяли на 4
экспериментальные группы по 30 самцов и самок в каждой. Высшая или
максимально переносимая доза была определена максимально возможным
объемом для однократного эндотрахеального введения в сутки животному
массой 200 г и составила 0,2 мг/кг или 1 мл/кг. Введение СГ и
физиологического раствора выполняли с помощью аэрозоллера модель IA-1B-R
(Penn-Century Inc., USA) на протяжении 3 месяцев (90 дней). Период
отсроченного наблюдения составлял 30 дней. Животных эвтаназировали на
31-й, 91-й и 121-й дни исследования. Критериями оценки хронической
токсичности являлись: летальность, клинические симптомы интоксикации,
поведенческие реакции, масса тела, данные клинико-лабораторных
исследований, массовые коэффициенты внутренних органов, оценка местнораздражающего действия. Для определения повреждающего действия СГ на
внутренние органы и ткани животных проводили патологоанатомическое
исследование (макро- и микроскопическое) тимуса, сердца, легких, печени,
селезенки, надпочечников, почек, органов желудочно-кишечного тракта и
головного мозга. Дополнительно
с целью исключения возможного
иммунотоксического действия препарата выполняли гистологическое
исследование подмышечных и подчелюстных лимфатических узлов
(региональных к месту введения).
Статистическая обработка результатов. Статистический анализ
данных выполняли с использованием программного обеспечения Статистика
10.0 (StatSoft, США). Для статистической оценки показателей, подчиняющихся
закону
нормального
распределения,
использовали
однофакторный
дисперсионный анализ (ANOVA), с последующим попарным межгрупповым
сравнением (post hoc). Для данных, неподчиняющихся закону нормального
распределения (баллы), использовали непараметрический критерий КраскелаУоллиса. Различия были определены при 0,05 уровне значимости.
13
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Влияние КГП на энзиматическую активность ЦОГ-1 и ЦОГ-2.
Одним из возможных механизмов противовоспалительного действия новых
лекарственных средств является угнетение синтеза простагландинов из
арахидоновой кислоты путем ингибирования фермента циклооксигеназы
(ЦОГ). По результатам исследования установлено, что IC50 для селективного
ингибитора ЦОГ-1 SC-560 составила 0,1 мкМ (35 нг/мл). Субстанция КГП во
всех исследуемых концентрациях не оказывала влияния на активность ЦОГ-1
(ANOVA, p>0,05).
Тестируемый комплекс гликозилированных полипептидов дозозависимо
ингибировал активность фермента ЦОГ-2 (рис. 1).
Рисунок 1 – График зависимости количества простагландина F2ɑ,
продуцируемого в ходе каталитической реакции с участием фермента ЦОГ-2,
от концентрации КГП.
Рассчитанная эффективная концентрация (IC50, 50% ингибирующей
активности) КГП составила 67±3,1 мкг/мл. Для стандартного селективного
ингибитора ЦОГ-2 (нифлумовой кислоты), IC50 составила 0,03 мкг/мл, что
согласуется с данными тест-системы от производителя (Barnett J. et al., 1994).
Влияние КГП на активность 5-ЛОГ. Результаты тестирования
показали, что КГП в концентрациях 0,01-1000 мкг/мл не оказывал влияния на
активность фермента 5-ЛОГ.
Результаты оценки действия КГП на внутриклеточные MAP-киназы.
Оценка количества фосфорилированных форм МАР-киназы р38 показала, что
субстанция КГП оказывает ингибирующее действие на ЛПС-индуцированную
активацию (фосфорилирование) МАР-киназы p38. Данное действие носило
дозозависимый характер в виде экспоненциальной зависимости. Рассчитанная
эффективная концентрация (IC50) субстанции КГП составила 2,7 ± 0,3 мкг/мл
(рис. 2).
14
Рисунок 2 – Кривая зависимости количества фосфорилированной формы
МАР-киназы р38 в культуре клеток линии U937 от концентрации КГП.
Оценка действия КГП в отношении МАР-киназ ERK1 и ERK2 показала
отсутствие эффекта.
Для подтверждения того, что выявленное действие является результатом
фармакологического действия субстанции, а не результатом проявления
цитотоксичности, было проведено дополнительное исследование. Оценку
цитотоксического действия КГП осуществляли методом микротетразолиевого
теста с использованием культуры клеток аденокарциномы эпителиоцитов
лёгкого человека (А549). По результатам теста исследуемая субстанция в
концентрациях 0,5-128 мкг/мл не оказывала цитотоксического действия на
культуру клеток А549. Следовательно, ингибирующее действие КГП в
отношении ЛПС-индуцированного фосфорилирования МАР-киназы p38
является следствием не цитотоксического, а фармакодинамического действия
субстанции.
Оценка взаимодействия КГП с TLR4. Нами было показано
ингибирующее действие КГП на ЛПС-стимулированное фосфорилирование
МАР-киназы p38, поэтому мы предположили, что КГП может
взаимодействовать с TLR4 рецепторами, отвечающими за распознавание ЛПС
(Newton K., Dixit V.M., 2012). Результаты исследования представлены на
рисунке 3.
15
Рисунок 3 – Результаты взаимодействия КГП с рецепторами TLR4.
Стимуляция клеточной линии с помощью ЛПС в конечной концентрации
10 нг/мл привела к активации NF-kB и последующей зависимой выработке
фермента щелочной фосфатазы, обнаруженной по ферментативной цветной
реакции. Интенсивность реакции в единицах оптической плотности составила
0,71 ± 0,01. Нейтрализация антителами привела к блокированию экспрессии
фермента до фонового уровня (рис.3).
КГП во всех используемых концентрациях уменьшал взаимодействие
ЛПС с TLR4 дозозависимо. То есть КГП связывал TLR4, уменьшая
сигнализацию с рецепторов на ядерный фактор NF-kB, что привело к
снижению выработки щелочной фосфатазы и снижению оптической плотности
в обратно пропорциональной зависимости от концентрации КГП до фонового
уровня. Таким образом, выявленные закономерности свидетельствуют об
антагонистическом взаимодействие КГП с TLR4.
Оценка
иммунотропного
действия
КГП.
Результаты
экспериментальной работы показали, что КГП не влияет на пролиферативную
активность Т- и В-лимфоцитов и не изменяет содержание антител в сыворотке
крови иммунизированных эритроцитами барана мышей (ANOVA, p>0,05).
При постановке реакции гиперчувствительности замедленного типа КГП
в дозах 50 и 100 мкг/кг статистически значимо на 37% и 53% соответственно
уменьшал отек лапы мышей, вызванный двукратным введением ДНХБ.
По результатам исследования иммунотропного действия КГП, можно
заключить, что тестируемая субстанция не влияет на пролиферацию
лимфоцитов и на формирование гуморального звена иммунитета. Однако
результаты теста «реакция гиперчувствительности замедленного типа»
показали, что многократное ингаляционное введение КГП в дозах 50 и 100
мкг/кг оказывает иммуносупрессорное действие в отношении клеточного звена
16
иммунитета, свидетельствуя о возможном влиянии КГП на продукцию
лимфоцитами и макрофагами провоспалительных цитокинов.
Противовоспалительное действие КГП на модели острого бронхита,
индуцированного формалином у крыс. При оценке количества лейкоцитов в
БАЛ через 24 и 48 ч после введения формалина в группе животных с
патологией
без
фармакологической
защиты
(контрольная
группа)
регистрировали повышение уровня лейкоцитов за счет увеличения популяции
гранулоцитов и моноцитов (рис. 4). Через 72 ч после индукции воспаления
статистически значимо увеличилась популяция лимфоцитов (рис. 4).
Полученные данные, свидетельствует о наличии воспалительного процесса в
дыхательных путях.
Рисунок 4 - Клеточный состав бронхоальвеолярного лаважа крыс через
24, 48 и 72 ч после индукции острого бронхита формалином. Обозначение: * различия статистически значимы по сравнению с контрольными животными,
тест Тьюки, при р≤0,05; – # - различия статистически значимы по сравнению с
интактными животными, тест Тьюки, при р≤0,05.
Снижение ключевых признаков воспаления по сравнению с контролем
через 48 ч и 72 ч зарегистрировано в группах, получавших референтный
препарат Амброксол в дозе 3600 мкг/кг и КГП в дозах 50 и 100 мкг/кг. Также
через 72 ч зарегистрировано статистически значимое снижение в среднем в 3
раза по сравнению с контрольной группой животных количества лимфоцитов у
крыс, получавших препарат Амброксол в дозе 3600 мкг/кг и КГП в
исследуемых дозах (рис. 4). Причем состав БАЛ практически не отличался от
показателей интактной группы.
По результатам микроскопического исследования бронхов на фоне
введения КГП в дозах 25, 50 и 100 мкг/кг и референтного препарата,
регистрировали статистически значимое снижение инфильтрации слизистой
17
лейкоцитами по сравнению с контрольной группой. В дозах 50 и 100 мкг/кг
КГП статистически значимо относительно контрольной группы уменьшал
инфильтрацию подслизистого слоя бронхов мононуклеарами. Результаты
микроскопического исследования слизистого и подслизистого слоя бронхов в
различных экспериментальных группах животных отражены в таблице 1.
Таблица 1
Результаты микроскопического исследования бронхов среднего калибра
методом полуколичественной оценки степени выраженности воспалительного
инфильтрата, баллы, Me(Q1;Q2)
Инфильтрация слизистой
Инфильтрация
стенки
подслизистой стенки
№
п/
Группа
мононуклейкоцимононукп
лейкоцитами
леарами
тами
леарами
1
Интактная
0 (0;0)*
0 (0;0)*
0 (0;0)
1 (0;1)*
2
Контрольная
1 (1;1)
1 (1;2)
0 (0;1)
2 (2;2)
3
Амброксол
мкг/кг
0 (0;1)*
1 (1;1)
0 (0;0)
1 (1;2)*
4
КГП 25 мкг/кг
0 (0;1)*
1 (1;1)
0 (0;1)
1 (1;2)
5
КГП 50 мкг/кг
0 (0;1)*
1 (1;1)
0 (0;0)
1 (1;2)*
6
КГП 100 мкг/кг
0 (0;1)*
1 (1;1)
0 (0;0)
1 (1;1)*
3600
Примечание: * - различия статистически значимы по
контрольными животными, тест Манна-Уитни, при р≤0,05.
сравнению
с
Оценка количества бокаловидных клеток на 1 мм слизистой оболочки
бронхов показала примерно равнозначное, статистически достоверное (тест
Тьюки, при р≤0,05) их снижение по сравнению с контролем, как на фоне КГП в
дозах от 25 до 100 мкг/кг, так и препарата Амброксол в дозе 3600 мкг/кг.
На фоне введения формалина наблюдались поствоспалительная
гиперплазия бокаловидных клеток, признаки острого катарального и
катарально-гнойного бронхита. Каждое патологическое изменение в ткани
легких оценивали отдельно для каждого животного. Введение комплекса
гликозилированных полипептидов сопутствовало улучшению гистологической
картины, у большинства крыс отмечали легкие варианты патологии поствоспалительная гиперплазия бокаловидных клеток и острый катаральный
бронхит. При сравнительной гистологической оценке регистрировали
равнозначное снижение инфильтрации клеточными элементами слизистого и
подслизистого слоев, а также уменьшение количества бокаловидных клеток,
которые не уступали референтному препарату.
18
Таким образом, применение КГП во всех исследуемых дозах оказало
противовоспалительное действие, подтвержденное результатами изучения
клеточного состава БАЛ через 24, 48 и 72 ч после введения 1% раствора
формалина. Изменение морфогистологической картины слизистого и
подслизистого слоев бронхов на фоне защиты КГП от воздействия формалина
ограничивалась признаками катарального бронхита.
Противовоспалительное действие КГП на модели острого бронхита,
индуцированного сигаретным дымом у крыс. По результатам оценки уровня
лейкоцитов в БАЛ на 28-й день исследования в контрольной группе животных
отмечали рост данного показателя за счет повышения популяции гранулоцитов
и моноцитов, что свидетельствует о развитии воспалительного процесса в
легких (табл. 2). Количество лейкоцитов в БАЛ животных контрольной группы
превышало (в 2 раза) тот же показатель интактной группы; по популяции
моноцитов и нейтрофилов в 4 и 7 раз (ANOVA, p≤0,05).
В экспериментальных группах состав БАЛ практически не отличался от
показателей интактной группы. Тенденция к повышению числа гранулоцитов
отмечена в группах животных, получавших исследуемый КГП в дозе 25 мкг/кг
и Амброксол в дозе 3600 мкг/кг (табл. 2).
Таблица 2
Клеточный состав БАЛ на 28-й день исследования (M±m), n=6
День исследования
№
Группа
Лейкоциты, Лимфоциты, Моноциты, Гранулоциты,
п/п
109/л
109/л
109/л
109/л
1
Интактная
0,11±0,04*
0,09±0,03
0,009±0,002* 0,012±0,005*
2
Контрольная
0,26±0,02
0,14±0,02
0,037±0,002
0,080±0,007
Амброксол
3
0,12±0,02*
0,09±0,01
0,010±0,002* 0,020±0,005*
3600 мкг/кг
4
КГП 25 мкг/кг 0,11±0,01*
0,08±0,01
0,011±0,001* 0,020±0,004*
5
КГП 50 мкг/кг 0,11±0,02*
0,09±0,02
0,007±0,001* 0,016±0,002*
КГП
100
6
0,10±0,02*
0,08±0,02
0,007±0,002* 0,014±0,003*
мкг/кг
Примечание: * - различия статистически значимы по сравнению с
контрольными животными, тест Тьюки, при р≤0,05.
Снижение уровней провоспалительных цитокинов в БАЛ относительно
показателей контрольной группы (ANOVA, р≤0,05) максимально проявилось на
фоне введения КГП в дозе 100 мкг/кг (на 37%), превосходя эффект препарата
Амброксол (рис. 5).
19
Рисунок 5 - Уровни провоспалительных цитокинов TNF-ɑ, IL-1β, IL-6, IL8 в БАЛ животных, пг/мл. Примечание: * - различия статистически значимы по
сравнению с животными контрольной группы (p<0,05, ANOVA).
Анализ антиоксидантного статуса крыс на фоне длительной экспозиции
сигаретным дымом показал, что во всех экспериментальных группах на 14-й
день эксперимента регистрировали статистически значимое снижение в 2-3
раза восстановленного глутатиона (GSH). В группах крыс, получавших КГП в
исследуемых дозах, и крыс, получавших Амброксол, напротив, содержание
GSH увеличилось и стало сопоставимо с данными в интактной группе (рис. 6).
Причем, содержание GSH в крови животных, получавших КГП в дозах 25, 50 и
100 мкг/кг, равно как и препарата Амброксол, достоверно отличалось от
данного показателя животных контрольной группы (p≤0,05, ANOVA).
Рисунок 6 - Содержание восстановленного глутатиона (GSH) в крови
животных (n=12). Примечания: * - различия статистически значимы по
сравнению с животными контрольной группы (p≤0,05, ANOVA); # - различия
статистически значимы по сравнению с животными интактной группы (p≤0,05,
ANOVA).
20
По результатам гистологического исследования под воздействием
никотина в контрольной группе животных выявлены гиперплазия эпителия
бронхов, инфильтрация слизистого и подслизистого слоев стенки бронха
нейтрофилами, лимфоцитами, макрофагами, очаговый некроз слизистой
бронхов с деформацией слизистой, а также развитие осложнения в виде острой
мелкоочаговой бронхопневмонии.
В группах животных, получавших КГП (25 и 50 мкг/кг), гистологическая
картина ограничивалась признаками острого катарального, и, в единичных
случаях, острого катарально-гнойного бронхита. Введение КГП в дозе 100
мкг/кг препятствовало развитию осложнений; у животных фиксировали только
острый катаральный бронхит, тогда как на фоне референтного препарата
Амброксол преобладали признаки острого катарально-гнойного бронхита.
Таким образом, КГП во всех изученных дозах защищал бронхи от
негативного воздействия табачного дыма, в частности, снижая уровни
провоспалительных цитокинов и оказывая антиоксидантное действие.
Максимальный эффект тестируемого комплекса был достигнут
при
применении в дозе 100 мкг/кг, что в 36 раз меньше терапевтической дозы
препарата Амброксол и эквивалентно 18 мкг/кг для человека.
Результаты оценки безопасности кандидата в лекарственные
средства на основе КГП (Стронгилостин). По результатам изучения острой
токсичности препарата СГ на аутбредных крысах (эндотрахеальное введение в
дозах 0,03, 0,01 и 0,2 мг/кг; подкожное введение – 0,1, 0,2, 1, 2 и 5 мг/кг) и
мышах (внутрибрюшинное введение в дозах 0,1, 0,2, 1, 2 и 5 мг/кг) установить
значения ЛД50 не удалось, так как гибель животных на протяжении
эксперимента
отсутствовала.
Отклонений
в
состоянии
здоровья
экспериментальных животных после однократного эндотрахеального,
внутрибрюшинного и подкожного введения в исследуемых дозах не
наблюдали. После некропсии каких-либо макроскопических повреждений
внутренних органов обнаружено не было. При микроскопическом
исследовании тканей (трахея, легкие с бронхами, кожа, серозная оболочка) в
месте введения препарата СГ признаков местно-раздражающего действия не
обнаружено.
Многократное (в течение 90 дней) эндотрахеальное введение СГ в
исследуемых дозах не приводило к гибели животных, симптомы интоксикации
отсутствовали, снижения массы тела в течение периода введения (90 дней) и
отсроченного наблюдения (30 дней) не было. Клинические и биохимические
исследования крови животных на 31-й, 91-й и 121-й дни эксперимента
изменений, указывающих на токсическое поражение внутренних органов, не
выявили. Сравнительный анализ массовых коэффициентов внутренних органов
крыс контрольной группы и групп животных, получавших препарат СГ в
исследуемых дозах, достоверных отличий не выявил ни в один из дней
эвтаназии. Также отсутствовали какие-либо патологические изменения во
внутренних органах животных, получавших СГ в дозах 0,03, 0,1 и 0,2 мг/кг.
Однако в легких крыс в единичных случаях в экспериментальных и
21
контрольных группах на 91-й и 121-й дни исследования встречали умеренную
перибронхиальную лимфоцитарную инфильтрацию. Со стороны органов
иммунной системы, таких как тимус, селезенка, подчелюстные и подмышечные
лимфатические узлы, животных, получавших тестируемый препарат
деструктивных, дистрофических и очаговых склеротических изменений не
выявило.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Согласно поставленным в данной работе целям и задачам были
установлены механизмы противовоспалительного действия: КГП является
антагонистом рецепторов TLR4, что приводит к снижению фосфорилирования
внутриклеточной МАР-киназы р38. Кроме того, КГП ингибирует ЦОГ-2 и не
оказывает влияния на ЦОГ-1, тем самым, снижая риск развития тяжелых
побочных эффектов со стороны крови и желудочно-кишечного тракта.
Установлена способность КГП подавлять клеточный иммунный ответ. С
учетом способности КГП снижать фосфорилирование МАР-киназы р38,
возможно КГП способен подавлять активность NF-kB, тем самым изменять
экспрессию генов, подавляя клеточный иммунный ответ и выброс
провоспалительных медиаторов.
На двух экспериментальных моделях острого бронхита, индуцированного
формалином и сигаретным дымом у крыс, было показано выраженное
противовоспалительное действие КГП. КГП во всех исследуемых дозах при
ингаляционном пути введения снижал ключевые показатели воспаления в БАЛ,
включая уровни провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8), что
подтвердило установленную ранее способность КГП ингибировать МАРК р38 в
условиях in vitro. Также было отмечено антиоксидантное действие КГП на
модели острого бронхита, вызванного сигаретным дымом у крыс (увеличение
уровня содержания GSH). По результатам морфогистологического
исследования КГП во всех дозах снижал степень выраженности воспаления.
По совокупности фармакологических эффектов КГП сопоставим или
превосходит референтный препарат Амброксол. Максимальный эффект КГП
был достигнут при применении в дозе 100 мкг/кг, что в 36 раз меньше
терапевтической дозы Амброксола и эквивалентно 18 мкг/кг для человека при
пересчете доз с учетом метаболических коэффициентов (Миронов А.Н., 2012).
Кандидат в лекарственные средства на основе комплекса
гликозилированных полипептидов при эндотрахеальном способе введения не
оказывает токсических эффектов на организм животных, что говорит о
преимуществе КГП перед синтетическими лекарственными средствами, в том
числе перед НПВС, антибиотиками и противовирусными средствами.
ВЫВОДЫ
1. Ведущим механизмом противовоспалительного действия КГП
является его антагонизм по отношению к рецепторам TLR4, что приводит к
снижению фосфорилирования внутриклеточной МАР-киназы р38 в культуре
моноцитов человека линии U937 в рассчитанной эффективной концентрации
2,7 мкг/мл. Кроме того, КГП ингибирует ЦОГ-2, при этом IC50 (рассчитанная
22
эффективная концентрация) составила 67 мкг/мл, и не оказывает влияния на
активность ЦОГ-1.
2. Установленная
способность
КГП
ингибировать
ЛПСиндуцированную активацию (фосфорилирование) МАРК р38 в эксперименте in
vitro доказана на уровне in vivo по ингибированию продукции основных
провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8) в бронхоальвеолярном
лаваже при ингаляционном введении КГП животным, что является одним из
механизмов его противовоспалительного действия.
3. В ходе изучения фармакологической активности на двух моделях
острого бронхита при ингаляционном способе введения у крыс
биохимическими
и
морфогистологическими
методами,
установлено
выраженное противовоспалительное действие КГП в дозе 100 мкг/кг.
Дополнительно на модели острого бронхита, вызванного сигаретным дымом у
крыс, КГП
в дозах 25, 50 и 100 мкг/кг приводил к нормализации
антиоксидантного статуса, повышая уровень восстановленного глутатиона в
крови животных.
4. По эффективности противовоспалительного действия КГП в дозах 25
и 50 мкг/кг соответствует и в дозе 100 мкг/кг превосходит синтетический
препарат Амброксол в дозе 3600 мкг/кг.
5. Кандидат в лекарственные средства на основе комплекса
гликозилированных полипептидов, выделенного из морских ежей рода S.
droebachiensis, является безопасным для организма экспериментальных
животных и лишен токсических эффектов при эндотрахеальном пути введения.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ
ДИССЕРТАЦИИ
1.
Касторнова, А.Е. Модель бронхита, индуцированного формалином
у крыс / А.Е. Кательникова, О.В. Афонькина, М.Г. Ширунова // Мечниковские
чтения-2012. Материалы конференции 17 апреля 2012 г. – СПб, 2012. – С. 170.
2.
Kastornova, A.E. Immunomodulatory activity of lipophilic extract of
strongilocentrotus droebachiensis on immunosuppressed mice / A.E. Kastornova,
I.E. Makarenko, O.N. Pozharitskaya [et al.] // Phytopharm 2014. Обзоры по
клинической фармакологии и лекарственной терапии. – 2014. – Т. 12. – С. 73.
3.
Кательникова, А.Е. Оценка противовоспалительных свойств
комплекса гликозилированных полипептидов на модели острого бронхита,
индуцированного сигаретным дымом у крыс / А.Е. Кательникова, А.Н. Шиков,
В.Г. Макаров [и др.] // В книге: XXVIII зимняя молодежная научная школа
«Перспективные
направления
физико-химической
биологии
и
биотехнологии» Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова Российской академии наук – М., 2016. - С. 173-174.
4.
Кательникова,
А.Е.
Гистологическая
оценка
противовоспалительных свойств комплекса гликозилированных полипептидов
из морских ежей / А.Е. Кательникова // Мечниковские чтения-2016. 89-я
23
конференция студенческого научного общества: сборник материалов.
Материалы конференции 27-28 апреля 2016. Ч.II. – СПб, 2016. - С. 151.
5.
Кательникова, А.Е. Противовоспалительная активность
комплекса гликозилированных полипептидов, выделенных из морских
ежей / А.Е. Кательникова, В.В. Воробьева, К.Л. Крышень [и др.] //
Медицинский академический журнал. - 2016. - Т.16, № 4. - С.183-184.
6.
Кательникова, А.Е. Оценка безопасности лекарственного
средства на основе комплекса полипептидов морских ежей / А.Е.
Кательникова,
М.Н.
Макарова,
О.И.
Авдеева
[и
др.]
//
Фармация. - 2016. - Т. 65, № 8. - С. 48-52.
7.
Katelnikova, A.E. Effects of glycosylated polypeptide complex on IL1β, TNFɑ, IL-6 and IL-8 production in the model of acute bronchitis induced by a
cigarette smoke in rats / A.E. Katelnikova, E.A. Vakhromova, V.V. Vorobyova [et
al.] // Phytopharm 2016. Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной
терапии. - 2016. –Т. 14, № 14. - С. 25.
8.
Кательникова, А.Е. Поиск новых противовоспалительных
средств на основе комплекса гликозилированных пептидов, выделенных
из морских ежей вида Strongylocentrotus droebachiensis / А.Е. Кательникова,
К.Л. Крышень, В.Г. Макаров [и др.] // Обзоры по клинической
фармакологии и лекарственной терапии. - 2016. - Т.14, № 4. - С. 9-15.
9.
Кательникова,
А.Е.
Изучение
специфической
фармакологической
активности
комплекса
гликозилированных
полипептидов, выделенного из морских ежей вида Strongylocentrotus
droebachiensis на модели острого бронхита, индуцированного формалином
у крыс / А.Е. Кательникова, К.Л. Крышень, М.Н. Макарова [и др.] //
Биофармацевтический журнал. – 2016. – Т.8, № 6. - С. 56-63.
10. Кательникова,
А.Е.
Перспективы
использования
лекарственных средств на основе в лечении респираторных вирусных
инфекций и их осложнений / А.Е. Кательникова, В.Г. Макаров, В.В.
Воробьева [и др.] // Обзоры по клинической фармакологии и
лекарственной терапии. - 2017. - Т.15, № 1. - С. 3-13.
11. Кательникова, А.Е. Изучение противовоспалительных свойств
комплекса гликозилированных пептидов, выделенных из морских ежей вида
Strongylocentrotus droebachiensis, на модели острого бронхита / А.Е.
Кательникова // Материалы V Всероссийской научно-практической
конференции студентов и молодых ученых с международным участием
"Актуальные проблемы науки XXI века" 2017. Смоленский медицинский
альманах – Смоленск, 2017. - № 1. - С. 178-183.
12. Кательникова А.Е. Механизмы противовоспалительного
действия комплекса гликозилированных полипептидов, выделенного из
морских ежей вида Strongylocentrotus droebachiensis / А.Е. Кательникова,
К.Л. Крышень, М.Н. Макарова [и др.] // Российский иммунологический
журнал. - 2018. - Т.12(21). - № 1. - С. 73-79.
24
13. Katelnikova, A.E. Effect of glycosylated polypeptides complex
isolated from sea urchin on the activity of cycloxygenaze izophores and 5lipoxygenase / A.E. Katelnikova, K.L. Kryshen, M.N. Makarova [et al.] //
Вестник смоленской государственной медицинской академии. - 2018. - №1.
– С.37-42.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа