close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Роль факторов персистенции условно-патогенных микроорганизмов в инфекционном процессе

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Пашкова Татьяна Михайловна
РОЛЬ ФАКТОРОВ ПЕРСИСТЕНЦИИ
УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
В ИНФЕКЦИОННОМ ПРОЦЕССЕ
06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,
микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Уфа – 2018
Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном
учреждении высшего образования «Оренбургский государственный аграрный университет» и федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделении Российской академии наук.
Научный консультант:
Сычева Мария Викторовна,
доктор биологических наук, доцент, ФГБОУ ВО
«Оренбургский государственный аграрный университет»,
кафедра микробиологии и заразных болезней, заведующий
Официальные оппоненты: Плешакова Валентина Ивановна,
доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВО
«Омский государственный аграрный университет имени
П.А. Столыпина», кафедра ветеринарной микробиологии,
инфекционных и инвазионных болезней, заведующий;
Спиридонов Геннадий Николаевич,
доктор биологических наук, заслуженный ветеринарный
врач Республики Татарстан, ФГБНУ «Федеральный центр
токсикологической, радиационной и биологической
безопасности Всероссийского научно-исследовательского
ветеринарного института», лаборатория бактериальных
инфекций, заведующий;
Пименов Николай Васильевич,
доктор биологических наук, профессор,
ФГБОУ ВО «Московская государственная академия
ветеринарной медицины и биотехнологии имени
К.И. Скрябина», кафедра биологии и патологии мелких
домашних, лабораторных и экзотических животных.
Ведущая организация:
ФГБУН «Сибирский федеральный центр агробиотехнологий РАН», г. Новосибирск
Защита диссертации состоится 21 декабря 2018 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.003.03 при ФГБОУ ВО «Башкирский государственный
аграрный университет» по адресу: 450001, Республика Башкортостан, г. Уфа, ул. 50-летия Октября, 34, ауд. 325.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБОУ ВО «Башкирский государственный аграрный университет» http://www.bsau.ru.
Автореферат разослан «____» ______________ 2018 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
Хазиев
Данис Дамирович
1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности. Инфекционная патология эндогенной этиологии в настоящее время является одной из
наиболее острых проблем ветеринарной науки и практики. Эндогенные инфекции,
вызванные микроорганизмами, постоянно и закономерно переживающими на поверхности тела, в открытых полостях или в органах и тканях своих облигатных хозяев, относятся к факторным инфекционным болезням, эпизоотическим процессам
которых не свойственна эстафетная передача возбудителя (Джупина С.И., 2001). На
фоне относительного благополучия по управляемым инфекциям основной ущерб
животноводству наносят именно факторные инфекционные болезни (Ефанова Л.И.
и др., 2012), возбудителями которых становятся потенциально патогенные микроорганизмы (Долгополов В.Н. и др., 2012; Федотов С.В., Капитонов Е.А., 2014; Исакова М.Н. и др., 2017; Портянко А.В. и др., 2018; Безбородова Н.А, Ким Н.А., 2018),
обладающие факторами персистенции, обеспечивающими «иммунорезистентность» и выживание при контакте с гуморальными и клеточными эффекторами
антибактериальной защиты макроорганизма (Бухарин О.В., 1999).
К настоящему времени у микроорганизмов различных таксономических
групп, представляющих потенциальную опасность развития эндогенного инфекционного процесса, выявлен широкий спектр факторов персистенции, включающий серорезистентность, антилизоцимный, антикомплементарный, антилактоферриновый, антииммуноглобулиновый и ряд других признаков (Ivanov I.B.,
Gritsenko V.A., 2009). В модельных экспериментах и клинических наблюдениях
показана связь этих свойств возбудителей с возникновением и особенностями
течения инфекционно-воспалительного процесса (Гриценко В.А. и др., 2012).
Однако имеющийся пул данных в основном ограничивается сведениями о возбудителях эндогенных инфекций человека, в то время как изучению факторных
инфекционных болезней животных и их возбудителей уделяется недостаточно
внимания (Джупина С.И., 2015; Макаров В.В., 2017). Так, остается открытым
вопрос о распространенности и выраженности факторов персистенции у возбудителей факторных инфекций животных; до настоящего времени отсутствуют
данные комплексной оценки биологических свойств потенциально патогенных
микроорганизмов, что затрудняет дифференциацию штаммов – представителей
симбиотической микробиоты от вирулентных вариантов микроорганизмов – возбудителей эндогенных инфекций. Неизвестно, как модифицируется персистентный потенциал условно-патогенных микроорганизмов в условиях микросимбиоценоза. Между тем, установление условий, способствующих формированию
патологического микробиоценоза, на фоне которого возникает факторное заболевание и происходит его хронизация, является первостепенной задачей ветеринарной науки и практики.
Кроме того, особый практический интерес представляет задача по поиску путей управления персистентными свойствами патогенов через их регуляцию факторами различного генеза.
Все вышеизложенное актуализирует постановку цели и задач нашей работы.
3
Цель – установить биологическую и патогенетическую значимость персистентных свойств микроорганизмов при факторных инфекциях животных и разработать подходы к дифференциации штаммов, прогнозированию течения и терапии эндогенных инфекций.
Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи.
1. Изучить видовой состав микроорганизмов, выделенных из разных биотопов здоровых животных и при инфекционно-воспалительных заболеваниях эндогенной природы, составить видовые регистры возбудителей, ранжированных по
их этиологической значимости.
2. Охарактеризовать персистентный потенциал доминантных и ассоциативных микроорганизмов, выделенных из разных биотопов тела здоровых животных
и при инфекционно-воспалительной патологии.
3. Разработать способы дифференциации микроорганизмов, отобрать штаммы представителей нормальной микрофлоры и оценить их биологическую активность in vitro.
4. Определить биопрофили приоритетных возбудителей и выявить информативные биомаркеры с разработкой на их основе новых технологий прогнозирования развития инфекционно-воспалительных заболеваний.
5. Изучить влияние доминантных бактерий, природных и синтетических веществ на персистентные свойства ассоциативных микроорганизмов для отбора
наиболее эффективно подавляющих персистентный потенциал микроорганизмов.
Область исследования. Исследование проведено в рамках специальности
06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология
с микотоксикологией и иммунология, паспорта специальности ВАК РФ (биологические науки) по: п. 1. «Природа и происхождение, структура, химический
состав, морфологические, биологические, физико-химические свойства патогенных бактерий, вирусов и токсигенных грибов. Классификация возбудителей и вызываемых ими инфекционных болезней животных»; 4. «Инфекционный процесс.
Природа патогенности, явления, процессы и механизмы взаимодействия микро- и
макроорганизмов на всех уровнях (молекулярно-генетическом, клеточном, тканевом, организменном, популяционном) в условиях воздействия экзогенных и
эндогенных факторов»; 5. «Методы выделения микроорганизмов и вирусов из
патологического материала, средства и методы диагностики инфекционных болезней животных, индикация патогенных микроорганизмов»; п. 9. «Активная
специфическая профилактика инфекционных болезней животных, вакцины, вакцинология, способы вакцинации. Средства и методы лечения и лекарственной
профилактики инфекционных болезней животных».
Научная новизна исследований. Выявлена способность микроорганизмов,
выделенных от здоровых и больных животных, к инактивации факторов естественной резистентности хозяина и впервые представлена сравнительная оценка
диагностической значимости биологических свойств микроорганизмов с характеристикой их биопрофилей.
4
Предложены новые подходы к дифференциации микроорганизмов на патогенные штаммы и представителей нормальной микрофлоры (патент РФ
№ 2612141; свидетельство о государственной регистрации программ для ЭВМ
№ 2018617605), основанные на оценке персистентного потенциала бактерий.
Получены данные о перспективности использования факторов персистенции
бактерий для прогнозирования течения инфекционно-воспалительных заболеваний у животных (свидетельства о государственной регистрации программ для
ЭВМ № 2017616114, № 2018616909).
Впервые установлена важная патогенетическая роль персистентных характеристик бактерий и грибов в развитии инфекционно-воспалительных заболеваний
у животных: они широко распространены среди штаммов, выделенных при изученных нозологиях, при этом выраженность исследуемых признаков выше при
хроническом течении заболевания по сравнению с острым.
Получены данные о повышении экспресии персистентных свойств микросимбионтов (бактерии/грибы) в условиях их межмикробных взаимодействий, что можно рассматривать как один из механизмов, способствующих
формированию патобиоценоза, на фоне которого развиваются эндогенные
инфекции.
Установлено подавление факторов персистенции грибов рода Candida
под действием доминантной микрофлоры (Enterococcus sp.) и отобран штамм
Enterococcus faecium, обладающий способностью снижать образование биопленок грибами (патент РФ № 2576008).
Впервые проведено полногеномное секвенирование и аннотация генома
штамма Enterococcus faecium ICIS 96, обладающего высокой антагонистической
активностью. Отсутствие у культуры генетических детерминант вирулентности
делает штамм перспективным для использования в качестве основы биопрепаратов пробиотической направленности.
Впервые предложен способ получения антимикробных пептидов (АМП) из
тромбоцитов курицы домашней (патент РФ № 2645070). Показано однозначное
снижение персистентных характеристик микроорганизмов под их влиянием, а
также под влиянием синтетического производного индолицидина, что является
обоснованием для разработки нового перспективного класса антимикробных
препаратов, эффективных в отношении патогенных микроорганизмов, способных длительно персистировать в организме хозяина.
Впервые с использованием персистентных свойств микроорганизмов разработан алгоритм выбора лекарственных растений для терапии животных с эндогенными инфекциями (свидетельство о государственной регистрации программ
для ЭВМ № 2018617097).
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представление о роли факторов персистенции микроорганизмов
в инфекционной патологии и являются основой для разработки новых практических решений по дифференциации штаммов и прогнозированию течения эндогенных инфекций.
5
Практическое значение работы подтверждено разработкой способов: «Способ дифференциации энтерококков кишечной микрофлоры животных» (патент РФ
№ 2612141); «Способ получения антимикробных пептидов из тромбоцитов курицы
домашней» (патент РФ № 2645070) и программ для ЭВМ: «Прогнозирование развития хронического наружного отита у собак», «Прогнозирование развития мастита у коров стафилококковой и стрептококковой этиологии», «Отбор лекарственных
растений для терапии эндогенных инфекций», «Дифференциация бактерий рода
Enterococcus на патогенные штаммы и представителей нормальной микрофлоры по
факторам персистенции» (свидетельства о государственной регистрации программ
для ЭВМ № 2017616114, № 2018616909, № 2018617097, № 2018617605), которые
апробированы и внедрены в работу ветеринарных учреждений области.
При изучении факторов персистенции микроорганизмов отобран штамм
Staphylococcus aureus, обладающий высокой антилизоцимной активностью, который целесообразно применять для скрининга антибактериальных средств, пригодных для борьбы с персистирующими патогенными стафилококками (патент
РФ № 2568058).
Выявлены штаммы Enterococcus faecium, обладающие уникальными свойствами, которые могут быть использованы при создании новых пробиотиков (патент РФ № 2576008, депонирование в GenBank).
Материалы работы использованы в информационно-методическом письме
Управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства, пищевой и перерабатывающей промышленности Оренбургской области «Региональный регистр антибиотикорезистентности микроорганизмов, выделенных при гнойновоспалительных заболеваниях собак» (Оренбург, 2018).
Методология и методы исследования. Методологической основой послужили труды отечественных и зарубежных ученых по изучению персистентных
свойств микроорганизмов. Основу диссертационного исследования составляют
системный подход в изучении рассматриваемой проблемы и комплексный анализ.
При проведении исследований и изложении материала были применены
общенаучные и специальные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, микробиологические, молекулярно-генетические, биохимические, математический анализ. Использование перечисленных методов и
статистический анализ экспериментальных данных обеспечили объективность и
достоверность полученных результатов и выводов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Способность микроорганизмов к инактивации факторов естественной
резистентности макроорганизма является совокупностью маркеров, информативных при дифференциации микроорганизмов на вирулентные штаммы и представителей нормальной микрофлоры, а также при прогнозировании развития заболеваний.
2. Потенцирование персистентных свойств ассоциативной микрофлоры, представленной бактериями и грибами, является одним из механизмов, способствующих формированию патобиоценоза, на фоне которого возникает заболевание.
6
3. Подавление персистентных свойств микроорганизмов – концепция отбора
антимикробных средств для терапии больных факторными инфекциями животных.
Связь работы с плановыми исследованиями и научными программами.
Представленные данные – составная часть темы открытого плана НИР ФГБОУ
ВО «Оренбургский государственный аграрный университет»: «Роль факторов
персистенции условно-патогенных микроорганизмов в инфекционном процессе»
(№ государственной регистрации АААА-А17-117092740002-9).
Исследования были проведены при поддержке гранта УрО РАН на совместные исследования с СО и ДВО РАН «Регуляция биологических свойств микроорганизмов растительными экстрактами как основа разработки антибактериальных
средств» (№ 12-С-4-1022); гранта РФФИ «Новые антимикробные пептиды, продуцируемые тромбоцитами животных и их биологическая активность в отношении различных групп микроорганизмов» (№ 14-04-97067 р_поволжье_а); гранта
Оренбургского ГАУ по результатам конкурса научно-технических и инновационных проектов «Прорыв» (Оренбург, 2013).
Степень достоверности и апробация работы. Достоверность полученных
результатов определяется высоким методическим уровнем исследования, четким
определением его цели и задач, адекватным подбором современных методов исследования, их корректным применением, использованием методов статистической обработки, подтверждающих достоверность полученных выводов, а также
апробацией основных результатов работы на научных конференциях.
Результаты научных исследований доложены, обсуждены и одобрены на I и
III Всероссийской молодежной научной школе-конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011, 2017);
III междисциплинарной конференции молодых ученых УрО РАН (Оренбург – Бузулукский бор, 2012); VI Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2012); I и II Всероссийской научно-практической конференции с элементами
научной школы для молодых ученых «Эндогенные бактериальные инфекции:
микробиологические и иммунологические аспекты» (Оренбург, 2013; 2016); Всероссийской научно-практической конференции по медицинской микробиологии
и клинической микологии «XVII Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2014);
Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной науки» (Ульяновск, 2015); VIII Российской научной конференции с международным участием «Персистенция и симбиоз микроорганизмов» (Оренбург,
2015); II Всероссийской школе-конференции молодых ученых «Современные
проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2015); Международном молодежном образовательном форуме «Евразия» (Оренбург, 2016);
Международном Евразийском экономическом форуме «Оренбуржье – сердце Евразии» (Оренбург, 2016); III научно-практической школе-конференции «Аллергология и клиническая иммунология (иммунодиагностика, иммунопрофилактика и
иммунотерапия)» (Сочи, 2017); XVIII международной научно-практической кон7
ференции аспирантов и молодых ученых «Знания молодых, наука, инновации,
практика» (Киров, 2018); Международной научно-практической конференции
«Достижения науки – агропромышленному комплексу» (Челябинск, 2018).
Фрагменты работы были представлены на областных конкурсах научноисследовательских работ и отмечены персональной премией (2014) и стипендией
(2012, 2016) правительства Оренбургской области для молодых ученых.
Итоги проведенных исследований доложены на расширенном заседании кафедры микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВО Оренбургский ГАУ и лаборатории по изучению механизмов и регуляции персистенции бактерий ФГБУН
Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (протокол № 20 от
22.06.2018).
Публикации. Основные научные результаты диссертации опубликованы в
43 печатных работах, из них 16 – в изданиях, рекомендованных ВАК при Министерстве образования и науки РФ, получено 4 патента РФ на изобретения и 4 свидетельства о государственной регистрации программ для ЭВМ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 276 страницах компьютерной верстки, содержит 24 таблицы и 37 рисунков. Диссертация состоит из
общей характеристики работы, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, заключения, выводов и рекомендаций по их
использованию, списка сокращений, библиографического списка, который включает 411 наименований, в том числе 175 работ иностранных авторов.
Ряд фрагментов работы выполнен совместно с сотрудниками ФГБУН Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (д.т.н. Ю.А. Хлопко),
ФГАОУ ВО «Тюменский государственный университет» (к.б.н. А.С. Васильченко), ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина
и Ю.А. Овчинникова» РАН (к.х.н. Е.А. Рогожин), АНО «ЦИНТ» Южноуральский
медицинский центр (к.б.н. А.С. Акжигитов), ФГБУН «Новосибирский институт
органической химии им. Н.Н. Ворожцова» СО РАН (д.х.н. А.В. Ткачев).
2 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
2.1 Материалы и методы исследования
Работа выполнена в период с 2010 по 2018 гг. на базе лаборатории кафедры
микробиологии и заразных болезней ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный аграрный университет» и лаборатории по изучению механизмов и регуляции
персистенции бактерий ФГБУН Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН. Общая схема экспериментов представлена на рисунке 1.
2.1.1 Характеристика культур микроорганизмов. Объектами исследований послужили 893 штамма микроорганизмов, из них 489 культур стафилококков и стрептококков, 262 штамма энтерококков, 71 изолят дрожжеподобных
грибов и 71 штамм ассоциантов, выделенных от животных с инфекционновоспалительными заболеваниями (наружный отит, пиометра, конъюнктивит).
8
9
АЛА
АКрА
Enterococcus spp.
(n = 262)
IgА-протеазная активность
Факторы персистенции
Candida spp.
(n = 38)
Ассоцианты
(n = 71)
АнтиHbА
Фитосубстанции
АЛфА
Рисунок 1 – Общая схема исследования
Анализ и статистическая обработка полученных данных
БПО
Выявление генетических детерминант
бактериоциногении
Streptococcus spp.
(n = 235)
Изучение регулирующего влияния биологически-активных веществ на персистентный потенциал
микроорганизмов и отбор наиболее эффективных ингибиторов
Природные и синтетические АМП
АИА
АЦА
Malassezia spp.
(n = 33)
Антибиотикочувствительность
Staphylococcus spp.
(n = 254)
Характеристика биологических свойств культур микроорганизмов (n = 893) и межмикробных взаимодействий
Культуры стафилококков и стрептококков были выделены из секрета вымени
109 коров с клинической формой мастита (серозный, катаральный и катаральногнойный), а также из 177 проб молока, полученных от коров с субклинической
формой мастита, и от 70 здоровых животных, принадлежащих ЗАО «Шевченко»
Ташлинского района Оренбургской области.
В работе использовано 122 штамма бактерий рода Enterococcus, выделенных
из кишечника здоровых животных и 140 штаммов энтерококков, изолированных
из клинического материала, полученного от продуктивных животных, принадлежащих учебному хозяйству Покровского сельскохозяйственного колледжа – филиала ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный аграрный университет»; СПК
колхоз «Урал» Оренбургского района и от мелких домашних животных, поступавших на лечение в ветеринарные клиники г. Оренбурга («Кот и Пес», «Ветдоктор», «Зоосфера»).
38 штаммов дрожжеподобных грибов рода Candida были выделены из кишечника цыплят-бройлеров, содержавшихся в условиях птицефабрики «Оренбургская» Оренбургского района Оренбургской области.
Изучены 33 клинических изолята грибов рода Malassezia и 71 штамм бактерий, выделенных от 88 собак различных пород и возрастных групп, половой принадлежности, квартирного и дворового содержания, больных наружным отитом,
пиометрой и конъюнктивитом и находящихся на лечении в ветеринарной клинике
«Ветдоктор».
2.1.2 Отбор проб, выделение и идентификация микроорганизмов. Микроорганизмы выделяли с помощью классического бактериологического метода
(Биргер М.О., 1982).
Культуры рода Enterococcus идентифицировали до вида с помощью мультиплексной полимеразной цепной реакции (ПЦР) по наличию видоспецифических
генов, кодирующих синтез супероксиддисмутазы (Jackson C.R. et al., 2004).
Идентификацию стафилококков, стрептококков, энтеробактерий, неферментирующих бактерий проводили общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных и биохимических свойств.
Биохимические свойства микроорганизмов выявляли с использованием
коммерческих тест-систем «ПБДС» (ООО НПО «Диагностические системы»,
Санкт-Петербург), «РАПИД-ЭНТЕРО» (НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург),
«ENTEROtest» (1 и 2), «STREPTOtest», «NEFERMtest», «STAPHYtest» («Erba
Lachema s.r.o.», European Union).
Дрожжеподобные грибы рода Candida идентифицировали по Р.Н. Ребровой
(1989).
Идентификацию грибов рода Malassezia осуществляли по J. Faergemann
(2002), T. Boekhout et al. (2010).
2.1.3 Методы изучения биологических свойств микроорганизмов. «Антиинтерфероновую» (АИА) активность определяли по методу В.Ю. Соколова
(1990). Антилизоцимную (АЛА), антикарнозиновую (АКрА) и антигемоглобиновую (AнтиHbA) активности определяли фотометрическим методом по О.В. Бу10
харину с соавт. (1997, 1999, 2005), IgA-протеазную и антицитокиновую (АЦА)
активности – иммуноферментным методом (Бухарин О.В. и др., 2004, 2011).
Антилактоферриновую (АЛфА) активность изучали по методу И.В. Валышевой
с соавт. (2003). Способность микроорганизмов образовывать биопленки (БПО)
оценивали фотометрически по методике G. O’Toole et al. (2000).
Чувствительность бактерий и грибов к антимикробным препаратам определяли методом диффузии в агар с помощью бумажных дисков, пропитанных
противомикробными препаратами, согласно МУК 4.2.1890-04 «Определение
чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» и инструкции научно-исследовательского центра фармакотерапии (2012).
Для количественной характеристики антимикотикорезистентности дрожжеподобных грибов и антибиотикорезистентности бактерий использован «Маркер
резистентности» – МР (Бондаренко В.И., 1990), который рассчитывали как отношение числа культур, резистентных к четырем и более антимикотикам (антибиотикам), к общему числу штаммов.
Для составления биопрофилей потенциально патогенных микроорганизмов
выраженность факторов персистенции приводили к условным единицам (у.е.). За
одну у.е. принимали 1 мкг/мл·ОП АЛА; 1 мг/мл АКрА; 10 г/л АнтиHbA; 1 нг/мл
АЛфА; за 10 у.е. – 100 % инактивации sIgA, ИЛ-4, ИЛ-8, ИФНγ.
2.1.4 Определение генетических детерминант бактериоциногении и вирулентности энтерококков. Наличие у энтерококков генов, кодирующих синтез
известных бактериоцинов (энтероцин А – entA, энтероцин B – entB, энтероцин P –
entP, энтероцин AS-48 – entAS-48, энтероцин L50A – entL50A, энтероцин L50В –
entL50B, бактериоцин 31 – bac31, цитолизины – cylLs, cylLl), выявляли при помощи гнездовой полимеразной цепной реакции (Foulquiй Moreno M.R. et al., 2003).
Генетические детерминанты известных факторов вирулентности: цитолизины – cylA, cylB, cylM, желатиназа – gelE, гиалуронидаза – hyl, поверхностные белки,
участвующие в адгезии – asa, белки-иммуносупрессоры – esp определяли с помощью специфической ПЦР (Vankerckhoven V. et al., 2004; Reviriego C. et al., 2005).
2.1.5 Полногеномное секвенирование фекального изолята Enterococcus
faecium ICIS 96. Геномную ДНК для полногеномного секвенирования выделяли
из суточной культуры E. faecium ICIS 96 фенол-хлороформным методом. Библиотеки ДНК готовили с использованием набора Nextera XT DNA (Illumina, США)
согласно инструкции производителя. Секвенирование полученных библиотек
ДНК проводили на секвенаторе MiSeq (Illumina) с использованием набора реагентов для секвенирования MiSeq® Reagent Kit v3 (Illumina) на базе Центра коллективного пользования научным оборудованием «Персистенция микроорганизмов» Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН.
Последовательности адаптеров, нуклеотиды с качеством ниже q30,
N-нуклеотиды, прочтения длиной менее 50 нуклеотидов были удалены из полученных данных с помощью программного обеспечения Trimmomatic (Bolger A.M.
et al., 2014). Сборку генома de novo проводили с помощью программного обеспечения SPAdes версии 3.7.1 (Bankevich A. et al., 2012).
11
Аннотирование полученных в результате полногеномного секвенирования
контигов было осуществлено с использованием алгоритма National Center for
Biotechnology Information (NCBI) Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP)
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok).
2.1.6 Методы изучения регулирующего влияния биологически активных веществ на персистентный потенциал микроорганизмов. В работе использовано 13 пептидных фракций, полученных в результате комплекса хроматографических процедур из тромбоцитов курицы домашней; производное
индолицидина (Ind-58), полученное путем химического синтеза в Государственном НИИ особо чистых биопрепаратов Федерального медико-биологического
агентства; растительные экстракты (РЭ) различных видов полыни (21 образец),
хвойных (19 образцов) и лекарственных (13 образцов) растений, предоставленные зав. лабораторией терпеновых соединений д.х.н., профессором Ткачевым А.В. (Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова
СО РАН); 15 фитосубстанций, содержащие флавоноиды и фенилпропаноиды,
предоставленные зав. кафедрой фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии д.ф.н., профессором В.А. Куркиным (ФГБОУ ВО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации).
Антиоксидантную активность (АОА) фитосубстанций определяли амперометрическим методом (Яшин А.Я., 2008) на анализаторе «ЦветЯуза-01-АА» (НПО
«Химавтоматика», Москва). АОА выражали в единицах кверцетина (ед.кв.).
Изучение влияния антимикробных пептидов (АМП) из тромбоцитов кур на
персистентные характеристики: антилизоцимную и антикарнозиновую активности проводили на тест-штаммах Staphylococcus aureus и Escherichia coli. Влияние различных концентраций Ind-58 на факторы персистенции микроорганизмов
определяли в отношении тест-культур коллекции: E. coli MG1655, S. aureus FDA
209 P. Суточные культуры тест-штаммов предварительно соинкубировали в течение часа с исследуемыми гомогенными пептидными фракциями и Ind-58 в минимальной подавляющей концентрации (МПК) и 1/4 МПК, установленных методом
микротитрования в бульоне (Wiegand I. et al., 2008).
Перед изучением влияния фитосубстанций на факторы персистенции
Klebsiella pneumoniae 247, E. coli, S. aureus P209, Bacillus subtilis, C. albicans,
S. haemolyticus, Pseudomonas aeruginosa определили их антимикробную активность в отношении указанных тест-штаммов. В качестве контроля использовали
спирт и стерильный изотонический раствор хлорида натрия. При изменении персистентных характеристик на 20 % и более по сравнению с контролем фитосубстанция считалась действенной (Шеенков Н.В., 1993).
2.1.7 Методы изучения межмикробных взаимодействий. Взаимодействие
грибов рода Malassezia и бактерий рода Staphylococcus оценено при их совместном культивировании в жидкой питательной среде Leeming-Notmann; грибов
рода Candida и бактерий рода Enterococcus – в бульоне Шедлера («Hi Media»,
Индия) по методике Е.И. Ермоленко с соавт. (2007).
12
2.1.8 Методы статистической обработки полученных результатов. Статистическую обработку данных проводили с помощью автоматизированных программ «Биостатистика» и Microsoft Office Excel 2007. Регрессионные уравнения
рассчитаны с помощью программы «STATISTICA 10».
2.2 Результаты исследования и их обсуждение
2.2.1 Видовой состав и биологические свойства микроорганизмов, выделенных от животных с факторными заболеваниями. Этиология и патогенез
факторных инфекций связаны с активизацией персистирующих в макроорганизме потенциально патогенных микроорганизмов, входящих в состав естественных
микробиоценозов тела животных (кожа, слизистые оболочки открытых полостей
организма).
В связи с этим для реализации поставленной цели был изучен видовой состав микроорганизмов, выделенных при наружном отите у собак и маститах у
коров.
Изучение возбудителей наружных отитов и их свойств определяется тем, что
данная инфекция является одной из самых распространенных патологий у собак,
которая нередко переходит в хроническую форму (Oliveira L.C., 2008; Lehner G.,
2010; Linek M., 2011).
Проведенный анализ видового состава микрофлоры показал, что она достаточна разнообразна и представлена как монокультурами бактерий разных видов
и грибов рода Malassezia, так и их ассоциациями. В 18 % случаев роста микроорганизмов выявлено не было.
Грибы рода Malassezia выделялись в монокультуре в 14 % случаев, в ассоциации с бактериями – в 40 % случаев. Среди грибов доминировал вид M. pachydermatis, другие виды малассезий (M. furfur и M. obtusa) выделялись значительно
реже. Бактерии являлись возбудителями отита в 28 % случаев, cреди них преобладали микроорганизмы рода Staphylococcus: S. hyicus, S. xylosus, S. intermedius и
S. gallinarum.
Реже выделялись микроорганизмы родов Corynebacterium и Klebsiella
(K. oxytoca, K. terrigena), видов Proteus vulgaris, P. aeruginosa и E. coli.
В единичных случаях высевались микроорганизмы родов Bacillus,
Streptococcus, Enterococcus (табл. 1).
В монокультуре были высеяны S. hyicus (25,7 %), P. aeruginosa (5,7 %), S. xylosus (2,86 %), Enterococcus spp. (2,86 %). В бактериальных ассоциациях преобладали стафилококки: S. xylosus (60 %) и S. hyicus (40 %). S. xylosus преимущественно выделяли с Bacillus spp., Corynebacterium spp., а также с K. terrigena (по
2,86 %). S. hyicus изолировали с бактериями видов E. coli и P. vulgaris (по 2,86 %).
В двухкомпонентных бактериально-грибковых ассоциациях совместно с
M. pachydermatis изолировали бактерии следующих видов: P. vulgaris (2,86 %),
S. xylosus (8,6 %), S. hyicus (17,1 %), S. intermedius (2,86 %). Сочленами трехкомпонентных бактериально-грибковых ассоциаций помимо грибов M. pachydermatis
13
являлись S. xylosus и K. oxytoca (2,86 %); S. hyicus и бактерии рода Corynebacterium (2,86 %); S. hyicus и P. vulgaris (2,86 %); S. gallinarum и E. coli (по 2,86 %).
Были обнаружены трехкомпонентные бактериально-грибковые ассоциации,
состоящие из M. obtusa и бактерий рода Corynebacterium и S. hyicus (2,86 %), а
также M. furfur, Corynebacterium spp. и Streptococcus spp. (2,86 %).
Таблица 1 – Биоразнообразие грибов и бактерий, выделенных
при наружном отите у собак
Микроорганизмы
Доля, %
Дрожжеподобные грибы
87,5
8,3
4,2
M. pachydermatis
M. furfur
M. obtusa
Бактерии
Staphylococcus spp.
S. hyicus
S. xylosus
S. intermedius
S. gallinarum
Enterobacteriaceae spp.
P. vulgaris
E. coli
K. oxytoca
K. terrigena
Corynebacterium spp.
Неферментирующие бактерии
P. aeruginosa
Bacillus spp.
Streptococcus spp.
Enterococcus spp.
65,2
43,5
17,3
2,2
2,2
15,2
6,4
4,4
2,2
2,2
8,6
4,4
4,4
2,2
2,2
2,2
На следующем этапе работы был исследован микробиоценоз слухового прохода собак с клиническими проявлениями острого наружного отита и с обострением хронического наружного отита.
Установлено, что при хронической форме течения отита грибы рода Malassezia высевались в 1,6 раз чаще, чем при остром процессе: в 76,9 ± 14,90 % и
47,2 ± 12,48 % случаев соответственно (p < 0,05). При анализе видового состава изолированных грибов показано, что как при остром, так и при хроническом
течении инфекционного процесса доминировал вид M. pachydermatis (87,5 %).
При этом отмечено, что при хроническом наружном отите, наряду с указанными
14
культурами дрожжеподобных грибов, в 12,5 % случаев были изолированы штаммы M. obtusa, а при остром течении инфекционного процесса в 12,5 % случаев
выделяли изоляты M. furfur.
При хроническом течении наружного отита M. pachydermatis выделялись как
в монокультуре (в 10 % случаев), так и в ассоциациях с бактериями, преимущественно стафилококками: со S. intermedius и со S. hyicus в 10 % случаев, со S. xylosus – в 20 % случаев.
Частота встречаемости бактерий, выделенных из наружного слухового прохода собак при разных формах течения отита, представлена на рисунке 2.
%
hy
ic
us
ga
lli
na
ru
S.
m
in
te
rm
ed
iu
s
P.
vu
lg
ar
is
E.
co
li
K.
ox
yt
oc
K.
a
te
rr
i
ge
P.
na
Co
ae
ry
ru
ne
gi
ba
no
ct
sa
er
St
iu
re
m
pt
sp
oc
p.
oc
En
cu
ss
te
ro
pp
co
.
cc
us
sp
Ba
p.
ci
llu
ss
pp
.
S.
S.
S.
xy
lo
su
s
60
50
40
30
20
10
0
Острый отит
Хронический отит
Рисунок 2 – Частота встречаемости бактерий, выделенных из наружного
слухового прохода собак, при разных формах течения отита
Из данных рисунка видно, что при обеих формах течения наружного отита
у собак были изолированы культуры S. xylosus, S. hyicus, P. aeruginosa, а также
микроорганизмы, относящиеся к роду Corynebacterium.
Энтеробактерии были обнаружены в 14,3 % проб, полученных от больных
животных с клиническими проявлениями острого наружного отита, и в 18,2 %
проб при хроническом течении заболевания. Бактерии, относящиеся к видам
P. vulgaris и E. coli, выделяли только из слухового прохода собак с острым наружным отитом (в 8,6 % и 5,7 % случаев соответственно), тогда как из наружного слухового прохода собак с хроническим отитом в 9,1 % случаев изолировали
культуры K. oxytoca и K. terrigena.
Культуры родов Streptococcus, Enterococcus и Bacillus высевали в 2,85 % случаев только от собак с острым течением наружного отита.
Показано, что из наружного слухового прохода собак с хроническим течением наружного отита достоверно чаще выделялись бактериально-грибковые ассоциации, а от собак с острым инфекционным процессом – микроорганизмы в
монокультуре (табл. 2).
15
Таблица 2 – Микробиоценоз слухового прохода собак с наружным отитом
Хронический наружный отит, %
Монокультура
20 ± 4,13
Острый наружный отит, %
Монокультура
67,7 ± 6,18**
Malassezia spp.
10
Malassezia spp.
16,5
Бактерии
Ассоциации
Два вида бактерий
Бактерии и грибы
Два вида
бактерий и грибы
10
80 ± 7,18**
10
40
Бактерии
Ассоциации
Два вида бактерий
Бактерии и грибы
Два вида
бактерий и грибы
51,2
32,3 ± 8,14
7,3
20
30
5
Примечание (здесь и далее): ** p < 0,01.
На следующем этапе работы мы определили биологические свойства наиболее часто выделяемых условно-патогенных микроорганизмов, изолированных
при разных формах наружного отита.
Установлено, что малассезии, выделенные от собак с острым отитом, значимо чаще обладали антикарнозиновой активностью (p < 0,05) и способностью
формировать биопленки. Вместе с тем у штаммов, полученных от собак с хронической формой заболевания, в 50,0 ± 8,80 % случаев отмечено наличие антигемоглобинового признака и в 37,5 ± 12,24 % случаев – антицитокиновой активности
в отношении ИЛ-8.
Значимых различий в распространенности АЛА, АЦА в отношении ИЛ-4
и ИФН-γ среди грибов, изолированных при разной форме течения инфекционного процесса, не обнаружено. Достоверно более высокие значения АнтиHbA
(p < 0,01) и антицитокиновой активности в отношении ИЛ-4 (p < 0,05) установлены у малассезий, выделенных от собак с хроническим наружным отитом.
Штаммы, изолированные при остром наружном отите, характеризовались более
высокими значениями АКрА и АЦА ИЛ-8. Значения АЛА, БПО, АЦА ИФН-γ и
МР у грибов, выделенных при разной форме наружного отита, достоверно не отличались (в соответствии с рисунком 3).
Все культуры Staphylococcus spp. от животных с хроническом наружным
отитом обладали антилизоцимной, антигемоглобиновой активностью и способностью к инактивации ИЛ-4 (в соответствии с рисунком 4).
У стафилококков, выделенных при острой форме течения заболевания, чаще
отмечалась способность к биопленкообразованию (31,8 ± 10,54 % случаев) и
инактивации ИЛ-8 (50,0 ± 10,70 % случаев), по сравнению со штаммами стафилококков, изолированными от животных с хроническим отитом: 12,5 ± 10,58 % и
25,0 ± 15,30 % случаев соответственно.
Изучение выраженности персистентных свойств микроорганизмов показало
достоверно более высокие значения АКрА и АЦА ИЛ-4 у стафилококков, выделенных при хроническом течении заболевания (2,2 ± 0,18 мг/мл и 67,3 ± 3,60 %
16
соответственно), по сравнению со штаммами, изолированными при остром течении наружного отита (1,2 ± 0,17 мг/мл, p < 0,01 и 56,8 ± 3,30 %, p < 0,05 соответственно). Выраженность БПО у стафилококков, изолированных при остром
наружном отите (2,1 ± 0,13 у.е.), была значимо выше по сравнению со штаммами,
выделенными при хроническом течении инфекционного процесса (1,3 ± 0,07 у.е.,
p < 0,01).
Достоверной разницы значений МР у стафилококков, изолированных при
разной форме наружного отита у собак, не выявлено.
Полученные результаты указывают на активное участие метаболитов оппортунистических грибов рода Malassezia и их ассоциантов в локальных иммунорегуляторных процессах, что может влиять на течение и исход инфекционного
процесса.
%
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
АЛА
АКрА
БПО
AнтиHbA
АЦА ИЛ-4
АЦА ИЛ-8
АЦА ИФН-γ
А
у.е.
6
*
5
**
4
3
2
1
0
АЛА
АКрА
БПО
AнтиHbA
АЦА ИЛ-4
АЦА ИЛ-8
АЦА ИФН-γ
МР
Б
Острый наружный отит
Хронический наружный отит
Рисунок 3 – Распространенность (А) и выраженность (Б) биологических свойств
Malassezia spp., выделенных при наружных отитах (здесь и далее: * p < 0,05)
В связи с тем, что нередко наружный отит переходит в хроническую форму, а
его длительность достигает трех и более лет (Ершов П.П., 2008), мы, основываясь
на полученных данных, рассчитали регрессионное уравнение, позволяющее прогнозировать развитие хронического наружного отита у собак:
Y = 0,92004 + 0,49954X1 – 0,42413X2 – 0,07499X3 – 0,01263X4 +
+ 0,07234X5 + 1,64236X6 + 0,01081X7 + 0,00009X8 – 2,09814X9,
17
где Х1 – наличие Malassezia spp.;
Х2 – наличие симбионтов;
Х3 – AнтиHbA Malassezia spp., г/л;
Х4 – АЦА ИЛ-4 Malassezia spp., % ;
Х5 – наличие Staphylococcus spp.;
Х6 – наличие Enterobacteriaceae spp.;
Х7 – АКрА Staphylococcus spp., мг/мл;
Х8 – АЦА ИЛ-4 Staphylococcus spp., %;
Х9 – АЛА Enterobacteriaceae spp., мкг/мл·ОП.
Для прогнозирования развития хронического наружного отита значения указанных биологических свойств исследуемых культур микроорганизмов в абсолютных единицах (АЛА, АКрА, АнтиHbA, АЦА ИЛ-4) и показатель наличия/
отсутствия микроорганизмов в микробиоценозе в условных единицах (наличие
симбионтов – 1, отсутствие симбионтов – 0, наличие Malassezia spp. – 1, отсутствие Malassezia spp. – 0) вводят в формулу.
%
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
у.е.
АЛА
АКрА
БПО
АнтиHbA
АЦА ИЛ-4
АЦА ИЛ-8 АЦА ИФН-γ
А
8
7
6
5
4
3
2
1
0
*
**
АЛА
АКрА
**
БПО
АнтиHbA
АЦА ИЛ-4
АЦА ИЛ-8 АЦА ИФН-γ
МР
Б
Острый наружный отит
Хронический наружный отит
Рисунок 4 – Распространенность (А) и выраженность (Б) биологических свойств
Staphylococcus spp., выделенных при наружных отитах
Оценку результата проводят путем сравнения полученной величины регрессионного уравнения с диапазоном величин, характерных для благоприятного
течения заболевания или хронизации процесса: если Y < 0,5 – прогнозируется
18
благоприятное течение заболевания, если Y > 0,5 – прогнозируется развитие хронического наружного отита.
Исследуемые нами выборки штаммов микроорганизмов, изолированных из
наружного слухового прохода собак с хронической и острой формой течения отита, были рассчитаны с помощью данного уравнения на вероятность вхождения
каждого из штаммов в определенную выборку. Результатом проведенных расчетов стало 92 % подтверждение данных, полученных в ходе бактериологического
эксперимента, что объясняется однородностью выборки.
Таким образом, способность микроорганизмов к инактивации факторов естественной резистентности, определяющая длительность их переживания в организме хозяина, способствует хронизации процесса, что находит подтверждение
в работах других авторов по оценке диагностической значимости персистентных
характеристик при неблагоприятном течении и хронических воспалительных
процессах (Капустина О.А. и др., 2012; Тарасенко В.С. и др., 2015).
Одной из ведущих причин воспаления молочной железы у коров остается
бактериальный фактор (Gotz F., 2002; Andersen H.J. et al., 2003; Фирсов Г.М.,
2017).
Нами изучено видовое разнообразие микроорганизмов, выделенных из молока здоровых животных и секрета вымени коров с субклинической и клинической
формами мастита (в соответствии с рисунком 5).
В
Б
А
Streptococcus spp.
S. aureus
S. aureus
E. coli
S. epidermidis
S. epidermidis
E coli+S. epidermidis
S. haemolyticus
S. hominis
S. epidermidis
S. auricularis
S. auricularis
S. hominis
S. haemolyticus
Роста нет
E. coli
S. agalactiae
S. lactis
S. warneri
S. agalactiae
S. lactis
S. uberis
S. uberis
Рисунок 5 – Таксономический состав микроорганизмов,
выделенных от здоровых животных (А), с клинической (Б)
и субклинической (В) формами мастита
19
Микроорганизмы, выделенные из молока здоровых животных, были представлены коагулазоотрицательными стафилококками (КОС): S. epidermidis,
S. auricularis, S. hominis, S. haemolyticus (28,8 % случаев); бактериями рода Streptococcus (19,2 %); энтеробактериями: E. coli в 3,9 % случаев, а также двухкомпонентной бактериальной ассоциацией: E. coli и S. epidermidis – в 5,8 %, причем в
42,3 % случаев микроорганизмы не выделялись.
При клинической форме мастита стафилококки видов S. aureus, S. epidermidis,
S. haemolyticus, S. auricularis выделялись в 75,1 %, E. coli – в 8,2 %, стрептококки
видов S. agalactiae, S. lactis, S. uberis – в 16,7 % случаев.
При субклинической форме заболевания стафилококки (S. aureus,
S. epidermidis, S. hominis, S. warneri) регистрировали у 76,7 %, стрептококки
(S. agalactiae, S. lactis, S. uberis) – у 23,3 % обследованных животных.
Установлено, что доминирующим видом как при клинической, так и при субклинической формах мастита являлся S. aureus, реже идентифицировали культуры S. epidermidis (13,9 % при клинической и 20 % – субклинической форме
заболевания) и стрептококков (в 16,7 % и 23,3 % случаев соответственно). Среди
выделенных стрептококков преобладал S. agalactiae (80,1 %); S. lactis выделяли в
10,4 %, S. uberis в 9,5 % случаев.
Высокая этиологическая значимость стафилококков и стрептококков определила необходимость изучения распространенности и выраженности персистентных свойств этих микроорганизмов: антилизоцимной, «антиинтерфероновой»,
антилактоферриновой активностей (в соответствии с рисунком 6).
Анализ полученных данных показал зависимость формы течения мастита
от спектра исходных биологических характеристик возбудителя. Распространенность изученных факторов персистенции (АЛА, АИА, АЛфА) и выраженность
АЛА и АИА у стафилококков и стрептококков уменьшалась в ряду: субклиническая форма мастита – клиническая форма мастита – здоровые животные. Выраженность АЛА стафилококков и стрептококков (2,0 ± 0,11; 1,6 ± 0,07 мкг/мл·ОП,
соответственно), АИА стафилококков и стрептококков (1,8 ± 0,09; 2,0 ± 0,10 у.е.,
соответственно) была достоверно выше у штаммов, выделенных от животных с
субклинической формой мастита, по сравнению со штаммами, изолированными
от здоровых животных (p < 0,01).
Следует отметить, что микроорганизмы, выделенные от животных всех трех
обследованных групп, характеризовались способностью к инактивации лактоферрина, что, по-видимому, определяется высоким уровнем содержания лактоферрина в молоке (Комолова Г.С. и др., 2011).
Полученные данные подтверждают принцип экологической детерминированности факторов персистенции микроорганизмов (Бухарин О.В., 1999). Однако у
бактерий, выделенных от больных животных, выраженность антилактоферринового признака была значимо выше (Staphylococcus spp. 2,1 ± 0,08 нг/мл при клинической форме мастита и 1,9 ± 0,09 нг/мл при субклинической форме мастита;
Streptococcus spp. 2,2 ± 0,09 нг/мл при клинической форме и 2,0 ± 0,08 нг/мл при
субклинической форме), чем у штаммов, изолированных от здоровых животных
20
(1,59 ± 0,05 и 1,64 ± 0,03 нг/мл соответственно). Данный факт объясняется селекцией штаммов, способных адаптироваться к лактоферрину, и формированием
устойчивых вариантов с максимальной выраженностью признака.
Наибольшую хозяйственно-экономическую проблему представляет субклинический мастит, который встречается в 4 – 5 раз чаще, чем клинически выраженный и наносит большой экономический ущерб животноводству за счет снижения молочной продуктивности, ухудшения качества молока, преждевременной
выбраковки животных и затрат на лечение (Бобрик Д.И., Макарова Е.С., 2017;
Зубова Т.В. и др., 2017; Ермолаев С., 2017).
Традиционный подход к решению проблемы диагностики субклинических
форм мастита связан с исследованием молока с помощью тестов, использующих
диагностикумы химической природы, что не позволяет достаточно полно оценить картину заболевания и является только основанием для отбора коров, подозрительных по заболеванию маститом, с целью дальнейшего бактериологического обследования животных.
%
100
80
*
*
*
*
60
40
20
0
АЛА
АИА
АЛфА
АЛА
Staphylococcus spp.
АЛфА
Streptococcus spp.
А
у.е.
2,5
*
**
2
1,5
АИА
**
**
**
**
**
**
*
**
**
**
1
0,5
0
АЛА
АИА
АЛфА
АЛА
АИА
АЛфА
Staphylococcus spp.
Клиническая форма мастита
Streptococcus spp.
Б
Субклиническая форма мастита
Здоровые животные
Рисунок 6 – Распространенность (А) и выраженность (Б) факторов
персистенции микроорганизмов, выделенных от здоровых животных
и животных с разными формами мастита
21
Проведенные нами исследования позволили вычленить из биопрофилей
стафилококков и стрептококков биологические свойства, по которым изученные штаммы значимо различались. В этот фенотипический комплекс вошли два
маркера бактериальной персистенции: АЛА и АЛфА. На основании полученных
данных рассчитано регрессионное уравнение, позволяющее прогнозировать развитие субклинического мастита у коров в 95 % случаев.
При изучении персистентных свойств выделенных из секрета вымени больных животных стафилококков обнаружен штамм Staphylococcus aureus 113, характеризующийся высоким уровнем антилизоцимной активности, который предложено использовать в качестве тест-культуры для отбора антибактериальных
средств.
Таким образом, проведенный клинико-бактериологический анализ микроорганизмов, выделенных при изученных факторных инфекциях, выявил зависимость характера течения заболевания от персистентных свойств возбудителя.
Установлено, что в биопрофиле возбудителей факторных инфекций приоритетное место по своей патогенетической значимости занимают персистентные свойства, обеспечивающие «иммунорезистентность» бактерий и их выживание при
контакте с гуморальными и клеточными эффекторами антибактериальной защиты (Бухарин О.В., 1999; Вялкова А.А., Гриценко В.А., 2002). В связи с вышеизложенным персистентные свойства микроорганизмов можно рассматривать как
каркас патогенного потенциала возбудителей факторных инфекций.
2.2.2 Видовой состав и биологические свойства бактерий рода Enterococcus, выделенных от здоровых животных и животных с инфекционновоспалительными заболеваниями. Одной из важнейших задач клинической
микробиологии является дифференциация патогенных вариантов микроорганизмов от представителей нормальной микрофлоры. Решение диагностической
задачи иллюстрируют наши материалы по дифференциации энтерококков, являющихся представителями нормальной микрофлоры животных, от вирулентных
культур Enterococcus spp. с использованием персистентных свойств.
Поскольку энтерококки входят в состав нормальной микрофлоры человека и
животных (Бондаренко В.М., Суворов А.Н., 2007; Karimaei S. et al., 2016) и в то
же время в ветеринарии они все чаще расцениваются как важнейшие возбудители
факторных инфекций животных (Черных О.Ю., 2009; Pomba C. et al., 2010; Кунилова Е.С. и др., 2012; Larsson J. et al., 2014; Wu X. et al., 2016), нами был изучен
видовой состав энтерококков, выделенных из кишечника у здоровых животных
и при дисбактериозе, а также из клинического материала при инфекционновоспалительной патологии (в соответствии с рисунком 7).
В результате идентификации, проведенной с помощью мультиплексной ПЦР,
из 122 штаммов энтерококков, изолированных из кишечника здоровых животных,
28 культур (23 %) было отнесено к виду E. faecium, 21 (17,1 %) изолят – к виду
E. hirae, 18 (14,8 %) штаммов – к виду E. durans, по 15 (12,3 %) культур – к видам
E. casseliflavus и E. avium, 14 (11,5 %) изолятов – к виду E. flavescens и 11 (9 %)
штаммов – к виду E. faecalis.
22
E. hirae
E. faecium
E. durans
E. faecalis
E. flavescens
E. casseliflavus
E. avium
А
Б
Рисунок 7 – Видовой состав фекальных (А) и клинических (Б) Enterococcus spp.
Видовой состав клинических изолятов был не менее разнообразен, однако доминирующее положение занимали культуры вида E. faecalis (38,6 %). 19 (13,5 %)
штаммов принадлежали к виду E. faecium, 16 (11,4 %) культур – к виду E. flavescens, 14 (10 %) штаммов – к виду E. avium, 13 (9,3 %) изолятов отнесены к виду
E. durans и по 12 (8,6 %) штаммов – к видам E. casseliflavus и E. hirae.
Далее нами изучены факторы персистенции и впервые у энтерококков, выделенных из кишечника здоровых сельскохозяйственных животных и из клинического материала при факторных инфекциях, установлена способность изменять
концентрацию цитокинов (ИЛ-4 и ИЛ-8) и проявлять антигемоглобиновую активность (в соответствии с рисунком 8). Показано, что 90,0 ± 4,24 % фекальных изолятов и 82,1 ± 7,37 % этиологически значимых культур обладали способностью
ингибировать ИЛ-4. Средние показатели антицитокиновой активности в отношении ИЛ-4 у клинических изолятов (42,3 ± 19,02 %) были значимо выше, чем у
кишечных энтерококков (24,0 ± 12,00 %, p < 0,05).
Изучение АЦА Enterococcus spp. в отношении ИЛ-8 показало, что данный
признак встречался у 92,0 ± 3,83 % фекальных изолятов и 85,2 ± 6,83 % культур энтерококков, выделенных от животных с инфекционно-воспалительными
заболеваниями. Средние значения признака были достоверно выше у клинических изолятов (57,3 ± 9,02 %), по сравнению с фекальными (38,5 ± 6,05 %)
(p < 0,05).
Изучение распространенности антигемоглобиновой активности среди энтерококков, выделенных от животных, показало, что 38,0 ± 6,86 % фекальных
изолятов и 88,9 ± 6,04 % клинических штаммов обладали данным свойством
(p < 0,05). Выраженность антигемоглобинового признака и МР у клинических и
фекальных изолятов достоверно не отличались.
Полученные в работе данные свидетельствуют о высоком уровне выраженности антицитокиновой активности у изолятов энтерококков, выделенных при
инфекционно-воспалительных заболеваниях, по сравнению с кишечными штаммами, что указывает на возможность влияния их экзометаболитов на локальный
цитокиновый баланс макроорганизма (Бухарин О.В. и др., 2011) и поддерживает
воспалительный процесс.
23
%
100
*
80
60
40
20
0
у.е.
7
6
5
4
3
2
1
0
АЦА ИЛ-4
АЦА ИЛ-8
А
АнтиHbA
АКрА
*
*
**
АЦА ИЛ-4
АЦА ИЛ-8
АнтиHbA
АКрА
МР
Б
фекальные изоляты
клинические изоляты
Рисунок 8 – Распространенность (А) и выраженность (Б) биологических свойств
фекальных и клинических изолятов Enterococcus spp.
Результаты о модификации энтерококками различного происхождения концентрации цитокинов, наряду с антигемоглобиновой активностью, использованы
нами для отличия вирулентных штаммов с применением регрессионного уравнения, дифференцирующего 95 % культур энтерококков, выделенных от животных.
Способность инактивировать карнозин была обнаружена нами как у энтерококков – возбудителей инфекционно-воспалительных заболеваний, так
и у Enterococcus spp. – представителей нормальной микробиоты кишечника. При этом выраженность АКрА у энтерококков, изолированных от животных с инфекционно-воспалительными заболеваниями, была достоверно выше
(2,5 ± 0,12 мг/мл), чем у культур Enterococcus spp., выделенных из кишечника
здоровых животных (1,5 ± 0,05 мг/мл, p < 0,01). Полученные данные положены в
основу способа дифференциации энтерококков кишечной микрофлоры на симбиотические и вирулентные штаммы, что может способствовать проведению своевременных и эффективных профилактических и терапевтических мероприятий.
Кроме того, разработанный способ можно использовать для отбора авирулентных
культур Enterococcus spp., перспективных для биотехнологии.
24
2.2.3 Анализ полного генома Enterococcus faecium ICIS 96. Непатогенные
бактерии рода Enterococcus представляют интерес с точки зрения получения
разнообразных бактериоцинов (Marekova M. et al., 2007; Chang S.Y. et al., 2013;
Vasilchenko A.S. et al., 2018), а также как потенциальные компоненты препаратов пробиотической направленности для ветеринарии (Torres-Henderson C. et al.,
2017; Sim I. et al., 2018; Liu J. et al., 2018). Поэтому на следующем этапе работы
мы приступили к решению задачи по поиску перспективных бактериоцинпродуцирующих культур энтерококков. Оценив с помощью ПЦР распространенность
в популяции фекальных энтерококков генетических детерминант, кодирующих синтез известных энтероцинов, мы отобрали из коллекции культур штамм
E. faecium ICIS 96, содержащий комплекс из пяти генов бактериоциногении и обладающий антагонистической активностью в отношении культур Listeria monocytogenes, L. innocua, L. ivanovii, L. seeligeri, E. coli и ванкомицинрезистентных
E. faecalis. Определив АКрА, мы установили, что культура E. faecium ICIS 96,
выделенная из толстого отдела кишечника здоровой лошади, относится к представителям мутуалистической микробиоты кишечного биотопа.
Полученные данные послужили экспериментальным обоснованием для проведения полногеномного секвенирования изолята E. faecium ICIS 96, дающего
исчерпывающую информацию об особенностях генов и структуре всего генома. На основании последней можно судить об организации систем регуляции
транскрипции генов и экспрессии белков, наличии факторов патогенности, генов
устойчивости к антибиотикам (Тотолян А.А., 2012; Kоser C.U. et al., 2012; Harris S.R. et al., 2013; Алексеева А.Е., Бруснигина Н.Ф., 2014), что особенно важно
при оценке промышленно-перспективных штаммов микроорганизмов.
Геномная последовательность штамма депонирована в базе данных NCBI
BioProject (геномный проект ID:PRJNA224116).
В геноме вновь секвенированной бактерии были идентифицированы гены,
ответственные за синтез витаминов (биотин, рибофлавин, пиридоксин) и генетические детерминанты, определяющие резистентность к некоторым антимикробным препаратам, таким как медь, гликопептид (блемицин), ионофорный антибиотик (тетроназин). Бактериоцин-продуцирующий потенциал E. faecium ICIS 96
определяется наличием пяти генетических детерминант бактериоциногении
(entA, entВ, entL50A/B, лактобин А/цереин 7b).
В структуре генома с помощью сервера RAST (rapid annotation using Subsistem
technology) гены, кодирующие синтез известных факторов вирулентности (Overbeek R. et al., 2014), обнаружены не были.
Таким образом, полученная черновая последовательность генома и анализ ее
функциональной аннотации определяют не только прикладной, но и фундаментальный интерес к изученному изоляту. В частности, E. faecium ICIS 96 является
перспективным кандидатом для использования в качестве основы биопрепаратов
пробиотической направленности и может служить модельным штаммом в исследованиях, направленных на изучение явления бактериального антагонизма, связанного с продукцией бактериоцинов.
25
2.2.4 Особенности межмикробных взаимодействий доминантных и ассоциативных микроорганизмов, изолированных при факторных инфекциях животных. Изучение особенностей межмикробных взаимодействий,
включающее изменение уровня экспрессии факторов их патогенности и персистенции, позволяет получить новые данные о механизмах формирования микросимбиоценозов при разных формах инфекционного процесса (Лахтин В.М.
и др., 2009).
Ранее О.В. Бухариным (2011) экспериментально обосновано использование
антилизоцимной активности микроорганизмов и способности образовывать биопленки в качестве биомишеней при оценке межмикробных взаимодействий.
Поэтому на следующем этапе работы для установления патогенетической
значимости персистентных свойств микроорганизмов при факторных инфекциях
животных нами изучены особенности межмикробных взаимодействий на примере бактерий и грибов.
Проведенные исследования взаимодействий вирулентных штаммов E. faecalis и C. albicans, выделенных при дисбактериозе кишечника и симбиотического
штамма E. faecium, выделенного из кишечника здорового животного, показали,
что вирулентный штамм E. faecalis повышал АЛА на 17,3 ± 0,02 % и БПО на
20 ± 0,05 % у всех изученных культур C. albicans. Вместе с тем отмечено, что
симбиотический штамм E. faecium снижал антилизоцимную активность у изолятов C. albicans на 28,5 ± 0,01 % и способность к образованию биопленок на
26,6 ± 0,04 % (p < 0,01).
Изучение взаимодействий S. hyicus и M. pachydermatis, наиболее часто выделяемых при наружных отитах у собак, показало, что под влиянием экзометаболитов малассезий у 88,9 % штаммов S. hyicus АЛА повышалась в среднем
на 43,2 ± 9,2 % и у 77,8 % стафилококков появлялась способность формировать биопленки. Под действием стафилококков у 57,1 % культур грибов в среднем на 30 ± 5,9 % повышалась способность к инактивации лизоцима и 35,7 %
M. pachydermatis приобретало способность образовывать биопленки.
Такая взаимная стимуляция персистентных свойств микроорганизмов может
быть одним из механизмов, способствующим формированию патологического
микробиоценоза, на фоне которого возникает заболевание и происходит его хронизация.
Полученные данные подтверждают выявленный ранее феномен оппозитного (усиление/подавление) влияния микроорганизмов на биологические свойства
пары микросимбионтов в условиях микросимбиоценоза (Бухарин О.В. и др., 2011)
и могут быть важны для понимания патогенетических особенностей формирования факторных инфекций и дисбиозов различных биотопов организма животных.
Аналогичные данные получила О.А. Капустина (2013), которая при изучении
межмикробных связей индигенной и ассоциативной микрофлоры кишечника и
репродуктивного тракта человека при дисбиозе и инфекционно-воспалительных
заболеваниях установила преимущественное подавление факторов персистенции
C. albicans под действием микроорганизмов рода Lactobacillus и E. faecium, явля26
ющихся представителями нормальной микрофлоры, и повышение персистентного потенциала C. albicans под действием условно-патогенного штамма E. faecalis.
Выявленная нами закономерность подтверждается и в работе Y. Tan et al.
(2018), зафиксировавших с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и сканирующей электронной микроскопии повреждение клеток грибов Candida spp. non-abicans видов и уменьшение их способности образовывать
биопленки на поверхности медицинского силикона после соинкубирования с супернатантами пробиотических Lactobacillus gasseri и L. rhamnosus.
Таким образом, полученные данные о повышении персистентных свойств
микросимбионтов (бактерии/грибы) в условиях их межмикробных взаимодействий можно рассматривать как один из механизмов, способствующих формированию патобиоценоза, на фоне которого развиваются факторные инфекции.
С другой стороны, полученные материалы открывают перспективу для дальнейшего изучения штаммов E. faecium, не обладающих детерминантами вирулентности и эффективно подавляющих персистентный потенциал C. albicans, в
качестве основы антимикотического биопрепарата.
Проведенные исследования позволили отобрать из коллекции симбиотических энтерококков штамм E. faecium 18, обладающий способностью максимально
снижать образование биопленок грибами рода Candida (табл. 3).
Таблица 3 – Влияние штаммов E. faecium на уровень биопленкообразующей
способности грибов рода Candida
Исследуемые
БПО тестируемых штаммов, у.е.
штаммы
C. albicans
C. glabrata
C. intermedia
энтерококков
1,7 ± 0,21*** 1,0 ± 0,01*** 0,95 ± 0,03***
E. faecium 18
2,7 ± 0,05*
2,0 ± 0,22*** 1,1 ± 0,01***
E. faecium 10
1,9 ± 0,12*** 1,2 ± 0,08*** 1,8 ± 0,08**
E. faecium 22
2,5 ± 0,06*
2,0 ± 0,11*** 1,1 ± 0,01***
E. faecium 21
3,5 ± 0,09
1,5 ± 0,01*** 2,4 ± 0,06***
E. faecium 32
Контроль (БПО у
3,5 ± 0,01
3,7 ± 0,02
2,9 ± 0,04
грибов Candida spp.)
C. utilis
1,2 ± 0,01***
2,2 ± 0,01*
1,7 ± 0,31***
1,5 ± 0,11***
1,4 ± 0,01***
2,9 ± 0,02
Примечание (здесь и далее): *** p < 0,001
С использованием ПЦР установлено, что в геноме штамма отсутствуют генетические детерминанты, кодирующие синтез ряда факторов вирулентности: цитолизины (cylM, cylB, cylA, cylLs); обуславливающие протеолитическую активность
(gelE); ответственные за продукцию гиалуронидазы (hyl); кодирующие белки клеточной стенки (esp); отвечающие за синтез поверхностного белка-адгезина (asa).
Таким образом, штамм E. faecium 18 может быть использован в качестве
основы антимикотического биопрепарата при производстве пробиотиков, оказывающих профилактическое и лечебное действие при дисбиозах кишечника.
27
2.2.5 Антибиотико/антимикотикорезистентность выделенных штаммов.
При изучении чувствительности к антимикробным средствам грибов и бактерий,
выделенных при наружных отитах у собак, установлено, что штаммы Malassezia spp., выделенные при остром течении отита, проявляли резистентность к
пяти изученным препаратам (нистатину в 25 ± 9,15 % случаев, клотримазолу –
18,7 ± 10,41 %, итраконазолу и флуконазолу – по 14,3 ± 9,26 % и амфотерицину
В – 6,2 ± 3,42 %); а штаммы малассезий, изолированные при хроническом наружном отите у собак – к четырем (нистатину в 25 ± 7,15 %, к итраконазолу –
14,3 ± 7,21 %, амфотерицину В и клотримазолу – по 12,5 ± 6,52 % случаев).
МР Malassezia spp., выделенных при остром и хроническом течении заболевания,
достоверно не отличался (0,13 ± 0,021 и 0,13 ± 0,011 соответственно).
Отмечена высокая устойчивость (80 – 90 % штаммов) к бензилпенициллину
у Staphylococcus spp., выделенных как в монокультуре, так и в ассоциации при
разных формах течения наружного отита у собак. МР Staphylococcus spp., выделенных при остром инфекционном процессе, был ниже (0,27 ± 0,060), чем МР
у стафилококков, изолированных при хроническом течении (0,37 ± 0,011) наружного отита у собак.
У бактерий семейства Enterobacteriaceae, изолированных при разном течении инфекционного процесса, зарегистрирована 100 % устойчивость к клиндамицину. Анализ чувствительности Enterobacteriaceae spp. к противомикробным
препаратам показал, что МР энтеробактерий, выделенных при остром наружном
отите, составил 0,2 ± 0,02, а при хроническом – 0,35 ± 0,041.
Неферментирующие бактерии демонстрировали 100 % устойчивость к цефтриаксону, цефепиму, амикацину, ампициллину и ко-тримоксазолу; Enterococcus
spp. – к линезолиду, цефтриаксону и тетрациклину.
Энтеробактерии и стафилококки, выделенные от собак с пиометрой, проявляли 100 % резистентность к некоторым изученным противомикробным препаратам. Так, изоляты E. cloacae оказались устойчивыми к цефокситину; штаммы
E. aerogenes были резистентны к цефуроксиму, цефепиму, тобрамицину; культуры M. morganii характеризовались устойчивостью к гентамицину, цефокситину,
эртапенему, имипенему, тобрамицину, хлорамфениколу; изоляты S. plymuthica – к
цефтазидиму и имипенему; штаммы M. morganii проявляли устойчивость к нитрофурантоину. Что касается грамположительных кокков, то штаммы S. aureus
были резистентны к оксациллину и гентамицину; изоляты S. hominis – к бензилпенициллину, оксациллину, эритромицину, линезолиду, ванкомицину, тайгециклину; штаммы S. epidermidis проявляли устойчивость к бензилпенициллину,
левофлоксацину, хинупристину; культуры S. lentus – к гентамицину, левофлоксацину, эритромицину, ванкомицину, тайгециклину, рифампицину.
Определение чувствительности условно-патогенных микроорганизмов, выделенных от собак с конъюнктивитом, к антибактериальным препаратам показало, что штаммы E. coli в 100 % случаев были резистентны к ампициллину, изоляты E. agglomerans в 100 % случаев проявляли резистентность к гентамицину,
цефепиму, имипенему, хлорамфениколу.
28
Широкая распространенность устойчивости к антимикробным препаратам
среди Enterococcus spp. (Heuer O.E. et al., 2006; Бухарин О.В., Валышев А.В., 2012;
Пошвина Д.В., Сычева М.В., 2014) продиктовала необходимость количественной
оценки антибиотикорезистентности фекальных и клинических штаммов энтерококков. Маркер резистентности фекальных штаммов энтерококков был меньше,
чем у клинических изолятов (0,28 ± 0,031 и 0,36 ± 0,101 соответственно).
Выявленная полиантибиотико- и полиантимикотикорезистентность к широко
применяемым в клинической практике антимикробным препаратам затрудняет
терапию больных животных, в то время как эффективность лечения и прогноз
болезни во многом зависят от рациональной стартовой эмпирической антибактериальной терапии. Полученные нами данные по устойчивости/чувствительности
патогенных микроорганизмов к антимикробным препаратам важны, в первую
очередь, для адекватного эмпирического выбора терапии.
Материалы работы использованы в информационно-методическом письме
Управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства, пищевой и перерабатывающей промышленности Оренбургской области «Региональный регистр антибиотикорезистентности микроорганизмов, выделенных при гнойновоспалительных заболеваниях собак» (Оренбург, 2018).
2.2.6 Выделение антимикробных пептидов, их антимикробная и биологическая активность. В связи со значительными темпами роста устойчивости
возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам (Виноградова К.А. и
др., 2013; Broom J., Broom A., 2018; Mason T. et al., 2018; Nguyen L. et al., 2018),
актуален поиск альтернативных терапевтических средств, резистентность к которым у микроорганизмов будет развиваться ограниченно или полностью отсутствовать (Fischetti V.A., 2018). Такими средствами могут явиться антимикробные
пептиды. Выделение и структурно-функциональное изучение эндогенных антибиотиков животного происхождения создает предпосылки для разработки и производства химически или биотехнологически синтезированных гомологов этих
соединений (Кокряков В.Н., 2006).
В результате исследований, выполненных М.В. Сычевой с соавт. (2010),
было сделано предположение о наличии в тромбоцитах курицы домашней антимикробных пептидов. Однако кислотный экстракт содержит уксусную кислоту,
исключающую возможность его использования in vivo, а также компоненты в
низкомолекулярном диапазоне, что не позволяет оценить функциональные свойства активных соединений в индивидуальном состоянии.
Нами разработан способ получения очищенных антимикробных пептидов из
тромбоцитов курицы домашней, с помощью которого можно проводить их наработку в полупрепаративных и препаративных количествах, достаточных для
последующего изучения их функциональных свойств, в том числе проведения
стадий предклинических испытаний.
Антимикробную активность полученных 13 гомогенных пептидных фракций
протестировали на тест-культурах E. coli K 12, B. subtilis, S. aureus Р 209, B. cereus, M. luteus, K. pneumoniaе, E. faecalis, E. cloacae, C. albicans методом микро29
титрования в бульоне. Оказалось, что все изученные пептидные фракции в той
или иной мере подавляют рост не только бактерий, но и грибов C. albicans, то
есть характеризуются антимикробной активностью и являются антимикробными
пептидами.
Далее для эксперимента по оценке регулирующего действия АМП на персистентный потенциал микроорганизмов были отобраны три фракции, обладающие наиболее выраженным антимикробным действием (7, 8 и 9 фракции). Было
установлено, что все использованные в эксперименте тромбоцитарные пептиды
значимо подавляли способность изученных микроорганизмов инактивировать
лизоцим и карнозин (в соответствии с рисунками 9, 10).
мкг/мл·ОП
2
1,5
*
1
*
0,5
*
*** ***
***
*
***
*** ***
***
0
S. aureus
контроль
7 1/4 МПК
E. coli
7 МПК
8 1/4 МПК
8 МПК
9 1/4 МПК
9 МПК
Рисунок 9 – Действие антимикробных пептидов на антилизоцимную
активность микроорганизмов
мг/мл
3
2,5
2
1,5
1
0,5
***
**
*
**
***
*
*
***
***
**
***
0
S. aureus
контроль
7 1/4 МПК
E. coli
7 МПК
8 1/4 МПК
8 МПК
9 1/4 МПК
9 МПК
Рисунок 10 –Действие антимикробных пептидов на антикарнозиновую
активность микроорганизмов
Наибольший подавляющий эффект на антилизоцимный признак золотистого
стафилококка оказывали АМП 7 фракции в МПК, 8 и 9 фракции в 1/4 МПК (более 40 %, p < 0,001). При изучении влияния исследуемых пептидов на АЛА кишечной палочки выявлен высокий ингибирующий потенциал у тромбоцитарных
АПМ 8 фракции (более 65 %, p < 0,001).
30
Под влиянием АМП всех фракций происходило снижение АКрА золотистого
стафилококка на 50 – 80 %. После соинкубирования клонов S. aureus с пептидами
8 фракции в 1/4 МПК антикарнозиновый признак перестал определяться.
Максимальный эффект подавления антикарнозиновой активности кишечной
палочки наблюдали после соинкубирования с АМП 8 фракции в МПК: снижение
уровня АКрА по сравнению с исходным на 98 % (p < 0,001).
Полученные результаты по характеристике свойств АМП из тромбоцитов курицы домашней являются обоснованием для разработки нового перспективного
класса антимикробных препаратов, эффективных в отношении мультирезистентных форм патогенных микроорганизмов, способных длительно персистировать в
организме хозяина, которые могут быть в будущем использованы в ветеринарии
для терапии животных с факторными инфекциями.
2.2.7 Функциональная активность синтетического производного индолицидина. Преимущества АМП по сравнению с конвенциальными антибиотиками микробного происхождения делают их крайне перспективными базовыми
соединениями для разработки лекарственных препаратов. Однако эндогенные
антимикробные пептиды могут оказывать цитотоксическое действие на клетки
высших эукариот, в связи с этим их прямое использование в ветеринарной практике ограничено (Jindal H.M. et al., 2015).
В настоящее время особое внимание привлекает индолицидин – катионный
антимикробный пептид, выделенный из нейтрофильных гранулоцитов быка. Интерес к данному соединению обусловлен не только широким спектром его биологической активности, включающей антимикробное (Galdieroet E. et al., 2016),
иммуномодулирующее (Артамонов А.Ю. и др., 2009) действия, стимуляцию регенерации тканей (Лазаренко В.А. и др., 2015), но и уникальной химической структурой, обеспечивающей значительный антимикробный эффект.
Побочным эффектом действия индолицидина является высокая цитотоксическая активность, которая ограничивает его прямое использование в ветеринарной
и медицинской практике и заставляет модифицировать молекулу таким образом,
чтобы сохранить ее высокий антимикробный потенциал, минимизировав побочные эффекты (Пантелеев П.В. и др., 2015).
В работе исследованы функциональные свойства полученного путем химического синтеза производного индолицидина (Ind-58), который характеризуется
более низкой токсической активностью в отношении эритроцитов.
Как показали наши исследования, Ind-58 обладал антимикробной активностью в отношении грамположительных (B. cereus ATCC 14893, S. aureus FDA
209 P – 6,25 мкг/мл) и грамотрицательных (E. coli MG1655 – 12,5 мкг/мл, P. aeruginosa ATCC 27853 – >100 мкг/мл) микроорганизмов с минимальными бактерицидными концентрациями на уровне нескольких десятков микрограмм на миллилитр.
В серии экспериментов установлено однонаправлено ингибирующее действие Ind-58 на АЛА микроорганизмов разных видов, при этом в обеих изученных концентрациях Ind-58 оказывал максимальный подавляющий эффект (более
70 %) в отношении выраженности антилизоцимного признака B. cereus по сравнению с исходным уровнем (p < 0,001).
31
После соинкубирования E. coli с Ind-58 в МПК и 1/4 МПК способность бактерий деградировать лизоцим снижалась на 57 % (p < 0,05) и 73 % (p < 0,01) соответственно, у P. aeruginosa ATCC 27853 – на 26 %. Умеренное подавление антилизоцимного признака с амплитудой от 11,7 % до 16,1 % регистрировали после
соинкубирования штаммов S. aureus с Ind-58 в МПК и 1/4 МПК соответственно.
Значения АЛА в абсолютных единицах представлены в таблице 4.
Таблица 4 – Влияние Ind-58 на антилизоцимную активность микроорганизмов
Микроорганизмы
S. aureus (n = 6)
B. cereus (n = 6)
E. coli (n = 6)
P. aeruginosa (n = 6)
Контроль, АЛА
(мкг/мл·ОП)
0,7 ± 0,02
1,3 ± 0,21
1,2 ± 0,11
1,4 ± 0,23
Ind-58
1/4 МПК
0,6 ± 0,03
0,4 ± 0,05***
0,3 ± 0,01**
1,0 ± 0,21
МПК
0,6 ± 0,11
0,3 ± 0,01***
0,5 ± 0,02*
1,0 ± 0,09
Полученные результаты свидетельствуют о наличии у синтетического производного Ind-58 антимикробной активности в отношении различных представителей грамположительных и грамотрицательных форм бактерий. Анализ
выраженности антилизоцимной активности микроорганизмов под влиянием синтетического производного индолицидина показал однозначное снижение изучаемого признака.
Таким образом, полученные нами данные о модификации факторов персистенции условно-патогенных микроорганизмов природными и синтетическими
антимикробными пептидами являются предпосылкой для всестороннего изучения функциональных свойств соединений данной группы и создания на их основе антимикробных препаратов, эффективных в отношении персистирующих патогенов.
2.2.8 Регуляция персистентных свойств микроорганизмов фитосубстанциями. Снижение эффективности антимикробных препаратов, появление антибиотикорезистентных штаммов обусловили необходимость поиска новых путей
борьбы с персистирующими патогенами (Бухарин О.В., 1999). Известно, что
потенциально-патогенные микроорганизмы, стремясь выжить в условиях биотопа, реализуют персистентные свойства, к числу которых относят наличие антилизоцимной активности и образование биопленок (Ильницкая А.С., Кичикова В.В.,
2011). В результате этого они приобретают способность противостоять факторам
естественной резистентности макроорганизма и антимикробным агентам различного происхождения (Karen I. et al., 2004; Бухарин О.В., 2006).
Подавление персистентных свойств возбудителя затрудняет его паразитирование внутри клеток и тем самым повышает эффективность лекарственных воздействий. С этой точки зрения важными являются данные об антимикробной и
антиперсистентной активности растительных экстрактов лекарственных растений, полученные в ходе исследования.
32
Изучение антимикробной активности растительных экстрактов ряда лекарственных растений (горичник Мориссона, циперус, китагавия байкальская,
багульник болотный, володушка, котовник, поручейник, мелколепестник канадский, дягиль, тимьян, жабрица, шизонепета многонадрезанная), полыни и
хвойных растений показало, что они обладали разнонаправленным действием на
рост условно-патогенных микроорганизмов.
Бактерицидное действие на K. pneumoniae и S. aureus оказывал РЭ володушки;
на S. aureus – РЭ багульника болотного; на E. coli – РЭ поручейника и тимьяна; на E.
coli и S. aureus – растительные экстракты котовника и мелколепестника канадского,
РЭ полыни туполопастной (шифры экстрактов 02 – 07, 02 – 70), полыни сантолинолистной (06 – 26), полыни сизой (06 – 44) и полыни Сиверса (11 – 54) подавляли рост
всех изученных бактерий; полынь лечебная (00 – 01), полынь крупнокорзинчатая
(01 – 02), полынь холодная (11 – 59) – E. coli; полынь горькая (05 – 03) – S. epidermidis; полынь пижмолистная (04 – 05) и полынь сизая (05 – 38) – S. aureus. Кроме того,
наряду с подавлением роста бактерий, под влиянием некоторых растительных экстрактов полыни лечебной (00 – 01) и полыни метельчатой (08 – 14) отмечена стимуляция роста S. aureus. Установлено индифферентное действие ряда растительных
экстрактов полыни лечебной (00 – 01), полыни сизой (00 – 02, 05 – 38, 11 – 09), полыни метельчатой (08 – 14) на рост S. epidermidis и полыни сизой (00 – 02, 06 – 02),
полыни селитряной (00 – 25), полыни горькой (05 – 03) – на рост S. aureus.
Установлено бактерицидное действие РЭ ели сибирской (08 – 38) и пихты сибирской (11 – 42) на K. pneumoniae; РЭ можжевельника казацкого, лиственницы
сибирской и ели сибирской (08 – 38) – S. aureus. Отмечено также бактериостатическое действие на штаммы E. coli РЭ можжевельника казацкого, ели сибирской (08 – 38, 10 – 28) и пихты сибирской (11 – 42); на изоляты B. subtilis – РЭ лиственницы сибирской (08 – 48), ели сибирской (08 – 38; 10 – 28) и пихты сибирской
(09 – 02) и индифферентное действие на рост бацилл РЭ можжевельника казацкого и пихты сибирской (11 – 42).
Растительные экстракты изученных лекарственных растений не обладали
фунгицидной активностью и не оказывали бактерицидного влияния на спорообразующие палочки (B. subtilis).
При изучении антиперсистентной активности установлено разнонаправленное влияние данных растительных экстрактов на АЛА и БПО: повышение, подавление и индифферентное действие. При этом наиболее эффективно (на 60 %
и более) АЛА изученных микроорганизмов подавляли экстракт дягиля, полынь
сизая (06 – 02), а способность образовывать биопленки – экстракт китагавии байкальской и полынь сизая (11 – 09). Все изученные РЭ полыни подавляли БПО
C. albicans на 20 – 40 %. Полученные данные представляют интерес в связи с
многочисленными сведениями о формировании биопленок Candida spр., что обеспечивает им устойчивость к различным противогрибковым препаратам (Vediyappan G. et al., 2010).
При этом отмечена стимуляция (на 60 % и более) АЛА C. albicans под влиянием РЭ горичника Мориссона, циперуса, полыни туполопастной (02 – 70), полы33
ни пижмолистной (04 – 05), полыни понтийской (05 – 27), полыни сантолинолистной (06 – 26, 11 – 60), полыни метельчатой (11 – 50) и полыни холодной (11 – 59);
БПО B. subtilis – под действием РЭ багульника болотного, тимьяна, жабрицы и
шизонепеты многонадрезанной.
Показано индифферентное действие РЭ полыни сизой (00 – 02) на способность E. coli, S. epidermidis, S. aureus формировать биопленки, а РЭ дягиля и жабрицы – на БПО K. pneumoniae, E. coli и S. aureus.
Поскольку этиологическая роль эпидермальных стафилококков тесно ассоциирована с их адгезивной способностью (Окулич В.К. и др., 2012), то заслуживает внимания тот факт, что соинкубирование РЭ полыни крупнокорзинчатой
(01 – 02) со S. epidermidis приводило к снижению БПО на 60 % и более.
Что касается растительных экстрактов хвойных растений, то они преимущественно (на 60 % и более) подавляли АЛА и БПО изученных микроорганизмов.
Однако отмечено стимулирующее влияние (на 60 % и более) РЭ лиственницы
сибирской (08 – 48) и ели сибирской (10 – 28) на БПО B. subtilis, а также индифферентное действие РЭ сосны сибирской (09 – 03), можжевельника сибирского
(02 – 53), можжевельника казацкого (09 – 20), ели сибирской (08 – 38, 10 – 28) и
пихты сибирской (11 – 42) на БПО E. coli.
Далее нами была проанализирована связь между степенью влияния на персистентные свойства микроорганизмов (S. aureus, S. haemolyticus 5581D, B. cereus,
E. coli, P. aeruginosa B1027) 15 фитосубстанций и уровнем их антиоксидантной
активности. Обоснованием для проведения данной работы стали полученные
А.В. Тарасевичем с соавт. (2003) результаты, согласно которым максимальное
действие на антилизоцимную активность энтеробактерий оказывают лекарственные растения, богатые антиоксидантами.
Все изученные фитосубстанции по выраженности антиоксидантной активности были разделены на три группы: с низкой АОА (от 0,16 до 0,82 ед. кв.) –
гвоздика, сирень, береза, элеутерококк колючий, мелисса, расторопша пятнистая,
полынь, эхинацея пурпурная, родиола розовая, фенхель и зверобой; средней АОА
(от 1,47 ед. кв. до 2,71 ед. кв.) – лимонник, анис, тополь; высокой АОА (4,55 ед.
кв.) – вторая фракция углекислотного экстракта гвоздики.
АЛА S. aureus максимально (на 60 % и более) подавляли родиола розовая,
эхинацея пурпурная и вторая фракция углекислотного экстракта гвоздики. Меллиса, полынь, лимонник, почки тополя, береза и углекислый экстракт фенхеля
повышали АЛА S. aureus на 60 % и более; углекислотный экстракт гвоздики оказывал индифферентное действие.
Антилизоцимный признак S. haemolyticus на 60 % более повышало большинство исследованных настоек и экстрактов лекарственных растений, кроме второй
фракции углекислотного экстракта гвоздики, которая подавляла АЛА стафилококка на 60 % и более.
На АЛА B. cereus изученные фитосубстанции влияли разнонаправлено: так,
наиболее эффективно (на 60 % и более) подавляли признак углекислотный экстракт фенхеля, аниса и вторая фракция углекислотного экстракта гвоздики; сти34
мулировала на 60 % и более эхинацея пурпурная; элеутерококк, родиола розовая,
полынь, лимонник, зверобой и углекислотный экстракт гвоздики не изменяли
антилизоцимную активность бацилл.
Антилизоцимную активность кишечной палочки эффективно подавляли (на
60 % и более) сирень, лимонник, углекислотный экстракт фенхеля и вторая фракция углекислотного экстракта гвоздики; повышали признак (на 60 % и более) –
мелисса, эхинацея пурпурная, почки тополя, зверобой и береза. Углекислотный
экстракт гвоздики не оказывал влияние на выраженность изученного признака у
E. coli.
Оценка влияния фитосубстанций на АЛА P. aeruginosa показала, что наиболее эффективно (на 60 % и более) снижал признак лимонник. Вместе с тем элеутерококк, мелисса, почки тополя, береза и углекислотный экстракт фенхеля усиливали его на 60 % и более, тогда как сирень и расторопша не оказывали влияния.
Таким образом, установлено, что однонаправлено подавляющее действие на
АЛА всех изученных микроорганизмов оказывала только вторая фракция углекислотного экстракта гвоздики, которая обладала высокой АОА.
Лекарственные препараты растительного происхождения имеют важное значение в терапии многих заболеваний. Полученные нами результаты представляют несомненный интерес в связи с тем, что многие лекарственные препараты
синтетического происхождения оказывают побочное действие на организм. Поэтому исключительное значение приобретает увеличение арсенала фитопрепаратов, поиск и исследование фармакологической активности биологически активных соединений малоизученных растений, а также расширение спектра действия
лекарственных препаратов растительного происхождения, уже применяемых в
ветеринарии.
Проведенные исследования открывают перспективу для дальнейшего изучения отобранных растительных экстрактов в качестве вспомогательных средств,
пригодных для терапии как острых инфекционно-воспалительных заболеваний,
так и ассоциированных с персистирующей микрофлорой.
Полученные данные позволили рассчитать алгоритм отбора лекарственных
растений, включающий в качестве информативных признаков степень подавления ими факторов персистенции условно-патогенных микроорганизмов (АЛА и
БПО), а также наличие или отсутствие условно-патогенных микроорганизмов в
микробиоценозе.
3 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В диссертации установлены видовой состав и биопрофиль микроорганизмов,
выделенных при факторных инфекциях и от здоровых животных. В результате
обосновано, что способность микроорганизмов к инактивации факторов естественной резистентности макроорганизма является совокупностью маркеров,
позволяющих дифференцировать штаммы на патогенные и представителей нор35
мальной микрофлоры, прогнозировать течение заболевания, а также отбирать
антимикробные средства для терапии и профилактики факторных инфекций. Выделены и охарактеризованы штаммы E. faecium, перспективные для использования в качестве основы биопрепаратов пробиотической направленности, а также
штамм S. aureus с высокой АЛА для скрининга антибактериальных средств.
Фундаментальные аспекты работы сфокусированы в области расшифровки
патогенетической значимости персистентных свойств условно-патогенных микроорганизмов, что позволило выявить один из механизмов формирования патобиоценоза, на фоне которого возникают факторные инфекции.
4 ВЫВОДЫ
1. Установлена способность микроорганизмов, выделенных из разных биотопов у здоровых животных и при факторных инфекциях, инактивировать механизмы естественной резистентности организма. Определены информативные
признаки, позволяющие патогену длительно персистировать в организме, и разработаны способы дифференциации микроорганизмов по факторам персистенции.
2. Клинико-бактериологический анализ микроорганизмов, выделенных при
факторных инфекциях, выявил зависимость характера течения заболевания от
персистентных свойств возбудителя. Установлены различия в биопрофилях микроорганизмов, выделенных от больных животных, и разработаны критерии прогнозирования развития и хронизации процесса с использованием персистентного
потенциала патогенов.
3. Выявлено преимущественное повышение (на 40 % и более) персистентных
свойств ассоциативной микрофлоры изученных биотопов (кишечник, наружный
слуховой проход) в условиях межмикробных взаимодействий in vitro. Полученные данные можно рассматривать как один из механизмов, способствующих формированию патобиоценоза, на фоне которого возникает заболевание.
4. На основании комплексного изучения фено- и генопрофиля энтерококков
отобран штамм Enterococcus faecium, обладающий способностью снижать образование биопленок грибами рода Candida на 50 – 70 %, и бактериоцинпродуцирующий штамм Enterococcus faecium ICIS 96. Отсутствие у культур генетических
детерминант вирулентности делает их перспективными для использования в качестве основы биопрепаратов пробиотической направленности.
5. В эксперименте установлено однозначное снижение (преимущественно на
40 – 80 %) способности микроорганизмов к инактивации факторов естественной
резистентности под воздействием природных (из тромбоцитов курицы домашней) и на 57 – 73 % – под воздействием синтетических (производное индолицидина) антимикробных пептидов, что открывает перспективу их дальнейшего изучения для расширения арсенала средств, используемых при лечении животных с
эндогенными инфекциями.
36
6. Экспериментально обоснован выбор эффективной фитосубстанции (растительные экстракты), заключающийся в подавлении на 60 % и более способности к биопленкообразованию и инактивации лизоцима условно-патогенными
микроорганизмами, вызывающими инфекционно-воспалительные заболевания.
Отобранная фитосубстанция может быть использована в клинической практике
в качестве вспомогательного противомикробного средства как на этапе этиотропного лечения, так и для профилактики инфекционных заболеваний.
5 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Выделенные штаммы энтерококков Enterococcus faecium 18 и Enterococcus
faecium ICIS 96, обладающие уникальными свойствами, рекомендуем использовать при создании пробиотиков.
2. Составлен региональный регистр антибиотикорезистентности микроорганизмов, изолированных при гнойно-воспалительных заболеваниях собак. Эти
данные отражены в информационно-методическом письме Управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства, пищевой и перерабатывающей промышленности Оренбургской области (Оренбург, 2018) и могут быть использованы при выборе эффективных препаратов для эмпирической терапии больных
животных.
3. При отборе фитосубстанций для терапии больных факторными инфекциями животных целесообразно оценивать их влияние на образование биопленок и
антилизоцимную активность тест-штаммов.
4. Для скрининга антибактериальных средств, пригодных для борьбы с персистирующими патогенными стафилококками, рекомендуем использовать штамм
S. aureus, обладающий высокой антилизоцимной активностью.
5. Разработанные программы для ЭВМ целесообразно использовать при прогнозировании течения факторных инфекций.
6. Для дифференциации энтерококков кишечной микрофлоры животных рекомендуем определять антикарнозиновую, антицитокиновую и антигемоглобиновую активности у выделенных штаммов.
6 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Публикации в ведущих рецензируемых изданиях, рекомендованных
перечнем ВАК при Министерстве образования и науки РФ
1. Влияние фитосубстанций, обладающих антиоксидантной активностью,
на персистентные свойства микроорганизмов / О.Л. Карташова, Т.М. Уткина
(Пашкова), А.В. Жестков и др. // Антибиотики и химиотерапия. – 2009. – Т. 54. –
№ 9 – 10. – С. 16 – 18.
37
2. Уткина, Т.М. Видовой состав и факторы персистенции микроорганизмов,
выделенных от собак с отитами / Т.М. Уткина, А.С. Акжигитов, Р.М. Нургалиева
// Вестник ветеринарии. – 2014. – № 69. – С. 47 – 49.
3. Уткина, Т.М. Модификация факторов персистенции стафилококков и
Malassezia pachydermatis при межмикробных взаимодействиях / Т.М. Уткина,
Л.П. Попова, А.С. Акжигитов // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2014. – № 13(174). – С. 125 – 127.
4. Карташова, О.Л. Регуляция антилизоцимной активности микроорганизмов
и их способности образовывать биопленки эфирными маслами лекарственных
растений / О.Л. Карташова, Т.М. Уткина, Л.П. Попова // Вестник Оренбургского
государственного университета. – 2014. – № 13 (174). – С. 45 – 49.
5. Видовая характеристика и факторы персистенции энтерококков, выделенных от животных в норме и при патологии / Д.В. Пошвина, Н.Е. Щепитова,
М.В. Сычева, Т.М. Уткина и др. // Ветеринария. – 2015. – № 6. – С. 26 – 30.
6. Регуляция антилизоцимной активности бактерий антимикробными пептидами из тромбоцитов кур / М.В. Сычева, Е.А. Рогожин, Т.М. Пашкова и
др. // Российский иммунологический журнал. – 2015. – Т. 9 (18). – № 2 (1). –
С. 704 – 705.
7. Антилистериозная активность Enterococcus faecium Ef79OSAU in vitro /
Н.Е. Щепитова, Т.М. Пашкова, К.А. Собянин, М.В. Сычева // Российский иммунологический журнал. – 2015. – Т. 9 (18). – № 2 (1). – С. 714 – 716.
8. Биологическая активность антимикробных пептидов из тромбоцитов кур
/ М.В. Сычева, А.С. Васильченко, Е.А. Рогожин, Т.М. Пашкова и др. // Журнал
микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2016. – № 2. – С. 24 – 29.
9. Пешкова, Ю.И. Влияние антимикробных пептидов из тромбоцитов Gallus
gallus на персистентные свойства микроорганизмов / Ю.И. Пешкова, М.В. Сычева, Т.М. Пашкова // Вестник Башкирского государственного аграрного университета. – 2016. – № 3. – С. 57 – 59.
10. Цитокиновая и антицитокиновая активность Staphylococcus aureus. Методические особенности / В.А. Зурочка, А.В. Зурочка, М.А. Добрынина, Е.Б. Зуева,
О.Л. Карташова, Т.М. Пашкова и др. // Российский иммунологический журнал. –
2017. – № 4. – С. 707 – 709.
11. Характеристика биопрофилей бактерий рода Enterococcus, выделенных от животных / Т.М. Пашкова, Е.Е. Кочкина, М.В. Сычева, О.Л. Карташова // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2017. – № 9. –
С. 70 – 75.
12. Распространенность генов бактериоциногении в популяции клинических изолятов Enterococcus spp. / Е.Е. Кочкина, Т.М. Пашкова, М.В. Сычева,
О.Л. Карташова // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. – 2017. – № 6(68). – С. 252 – 254.
13. Пашкова, Т.М. Характеристика антицитокиновой активности Enterococcus spp., изолированных от животных / Т.М. Пашкова // Вестник Оренбургского
государственного университета. – 2017. – № 9. – С. 82 – 84.
38
14. Antimicrobial activity of the indolicidin-derived novel synthetic peptide In58 / A.S. Vasilchenko, A.V. Vasilchenko, T.M. Pashkova et al. // Journal of Peptide
Science. – 2017. – No. 23. – P. 855 – 863.
15. Genome Sequence of Enterococcus faecium Strain ICIS 96 Demonstrating
Intermicrobial Antagonism Associated with Bacteriocin Production / T.M. Pashkova,
A.S. Vasilchenko, Y.A. Khlopko et al. // Genome Announcements. – 2018. – Vol. 6. –
No. 10. – doi: 10.1128/genomeA.00126-18
16. Пашкова, Т.М. Функциональная активность синтетического производного индолицидина / Т.М. Пашкова // Известия Оренбургского государственного
аграрного университета. – 2018. – № 2(70). – С. 179 – 182.
Публикации в других изданиях
17. Влияние эфирных масел полыни на рост микроорганизмов и образование
ими биопленок / О.Л. Карташова, А.В. Ткачев, Т.М. Уткина и др. // Бюллетень
Оренбургского научного центра УрО РАН [электронный журнал]. – 2012. – № 3. –
URL: http://www.elmag.uran.ru.
18. Уткина, Т.М. Антибактериальная активность эфирных масел полыни /
Т.М. Уткина, Л.П. Потехина, О.Л. Карташова // Материалы VI Всероссийской
конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и
растений с окружающей средой». – Саратов, 2012. – С. 153.
19. Карташова, О.Л. Регуляция персистентных свойств микроорганизмов
факторами различной природы (обзор) / О.Л. Карташова, Т.М. Уткина // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН [электронный журнал]. – 2013. –
№ 1. – URL: http://www.elmag.uran.ru.
20. Регуляция персистентных свойств микроорганизмов растительными экстрактами хвойных растений / Т.М. Уткина, Л.П. Потехина, О.Л. Карташова,
А.В. Ткачев // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН [электронный
журнал]. – 2013. – № 3. – URL: http://www.elmag.uran.ru.
21. Потехина, Л.П. Регуляция роста и способности Candida albicans образовывать биопленки растительными экстрактами полыни / Л.П. Потехина, Т.М. Уткина // Проблемы медицинской микологии. – 2014. – Т. 16. – № 2. – С. 116.
22. Уткина, Т.М. Влияние растительных экстрактов хвойных растений на
персистентные свойства Candida albicans / Т.М. Уткина, Л.П. Потехина // Проблемы медицинской микологии. – 2014. – Т. 16. – № 2. – С. 137.
23. Уткина, Т.М. Антимикробное и антиперсистентное действие растительных экстрактов различных видов полыни Южной Сибири / Т.М. Уткина, Л.П. Потехина, О.Л. Карташова // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). – 2014. –
№ 3. – С. 93 – 96.
24. Антикарнозиновая и антигемоглобиновая активности микроорганизмов,
выделенных от собак с наружными отитами / Т.М. Пашкова, А.С. Акжигитов,
О.Л. Карташова и др. // Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы ветеринарной науки». – Ульяновск, 2015. –
С. 60 – 62.
39
25. Акжигитов, А.С. Чувствительность к противогрибковым препаратам грибов рода Malassezia, выделенных при разных формах течения отитов у собак /
А.С. Акжигитов, Т.М. Пашкова, Р.М. Нургалиева // Бюллетень Оренбургского
научного центра УрО РАН [электронный журнал]. – 2015. – № 1. – URL: http://
www.elmag.uran.ru.
26. Акжигитов, А.С. Антилизоцимная активность микроорганизмов – возбудителей отитов у собак / А.С. Акжигитов, Т.М. Пашкова, О.Л. Карташова //
Проблемы медицинской микологии. – 2015. – Т. 17. – № 2. – С. 35.
27. Факторы персистенции грибов рода Malassezia, выделенных от здоровых
собак и собак с наружным отитом / Т.М. Пашкова, Л.П. Попова, О.Л. Карташова, А.С. Акжигитов // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН
[электронный журнал]. – 2015. – № 4. – URL: http://www.elmag.uran.ru.
28. Пашкова, Т.М. Экспериментально-клиническое обоснование использования лекарственных растений для лечения и профилактики эндогенных инфекций / Т.М. Пашкова // Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН
[электронный журнал]. – 2016. – № 2. – URL: http://www.elmag.uran.ru.
29. Пашкова, Т.М. Использование секретируемых факторов персистенции
микроорганизмов для дифференциации штаммов, прогнозирования длительности и тяжести течения факторных инфекций животных (обзор) / Т.М. Пашкова
// Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН [электронный журнал]. –
2017. – № 4. – URL: http://www.elmag.uran.ru.
30. Пашкова, Т.М. Антицитокиновая активность клинических изолятов Enterococcus spp. / Т.М. Пашкова, М.В. Сычева, О.Л. Карташова // Сборник трудов
«Фундаментальные и прикладные вопросы естественных и технических наук». –
Смоленск: ИЦ «Наукосфера», 2017. – С. 12 – 16.
31. Пашкова, Т.М. Биологические свойства энтерококков как возбудителей
факторных инфекций животных / Т.М. Пашкова, М.В. Сычева, О.Л. Карташова //
Материалы третьей Всероссийской молодежной школы-конференции с международным участием «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных
экосистемах». – Оренбург: ООО «Типография «Южный Урал», 2017. – С. 26.
32. Характеристика биопрофилей бактерий рода Enterococcus, выделенных
от животных / Е.Е. Кочкина, Т.М. Пашкова, М.В. Сычева, О.Л. Карташова //
Материалы третьей Всероссийской молодежной школы-конференции с международным участием «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных
экосистемах». – Оренбург: ООО «Типография «Южный Урал», 2017. – С. 27.
33. Пашкова, Т.М. Видовой состав и факторы персистенции грибов рода
Candida, выделенных от цыплят-бройлеров / Т.М. Пашкова, М.В. Сычева,
О.Л. Карташова // Материалы XVII Международной научно-практической конференции аспирантов и молодых ученых «Знания молодых: наука, практика и инновации». – Киров: Вятская ГСХА, 2018. – С. 162 – 166.
34. Пашкова, Т.М. Биологические свойства грибов рода Candida, выделенных от цыплят-бройлеров / Т.М. Пашкова, М.В. Сычева, О.Л. Карташова //
Материалы LVII Международной научно-практической конференции Институ40
та ветеринарной медицины «Проблемы ветеринарной медицины, ветеринарносанитарной экспертизы, биотехнологии и зоотехнии на современном этапе развития агропромышленного комплекса России». – Южно-Уральск: Южно-Уральский
государственный аграрный университет, 2018. – С. 145 – 151.
Патенты
35. Карташова, О.Л. Штамм бактерий Staphylococcus aureus, используемый в
качестве тест-культуры для отбора антибактериальных средств / О.Л. Карташова,
Т.М. Уткина, Л.П. Попова // Патент РФ № 2568058 от 10.11.2015 г. Бюл. № 8.
36. Штамм бактерий Enterococcus faecium, обладающий способностью снижать образование биопленок грибами рода Candida / М.В. Сычева, О.А. Пашинина, О.Л. Карташова, Т.М. Пашкова и др. // Патент РФ № 2576008 от 27.02.2016 г.
Бюл. № 6.
37. Способ дифференциации энтерококков кишечной микрофлоры животных
/ М.В. Сычева, Н.Е. Щепитова, О.Л. Карташова, Т.М. Пашкова и др. // Патент РФ
№ 2612141 от 2.03.2017 г. Бюл. № 7.
38. Способ получения антимикробных пептидов из тромбоцитов курицы домашней / М.В. Сычева, О.Л. Карташова, Е.А. Рогожин, Ю.И. Пешкова, А.С. Васильченко, Т.М. Пашкова // Патент РФ № 2645070 от 15.02.2018 г. Бюл. № 5.
Программы для ЭВМ
39. Прогнозирование развития хронического наружного отита у собак /
О.Л. Карташова, Т.М. Пашкова, О.А. Пашинина и др. // Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2017616114 от 1.06.2017.
40. Прогнозирование развития мастита у коров стафилококковой и стрептококковой этиологии / О.Л. Карташова, Т.М. Пашкова, А.М. Осипова и др. // Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2018616909
от 08.06.2018.
41. Способ отбора лекарственных растений для терапии эндогенных инфекций / О.Л. Карташова, Т.М. Пашкова, Ю.А. Хлопко, Л.П. Попова // Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2018617097 от
18.06.2018.
42. Дифференциация бактерий рода Enterococcus на патогенные штаммы и
представителей нормальной микрофлоры по факторам персистенции / Т.М. Пашкова, М.В. Сычева, О.Л. Карташова, Ю.А. Хлопко // Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2018617605 от 26.06.2018.
Методические материалы
43. Региональный регистр антибиотикорезистентности микроорганизмов,
выделенных при гнойно-воспалительных заболеваниях собак / О.Л. Карташова, М.В. Сычева, Т.М. Пашкова и др. // Информационно-методической письмо
Управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства, пищевой и перерабатывающей промышленности Оренбургской области. – Оренбург, 2018. – 20 с.
41
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АИА – «антиинтерфероновая» активность
АКрА – антикарнозиновая активность
АЛА – антилизоцимная активность
АЛфА – антилактоферриновая активность
АМП – антимикробные пептиды
АнтиHbA – антигемоглобиновая активность
АОА – антиоксидантная активность
АЦА – антицитокиновая активность
БПО – биопленкообразование
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ед. кв. – единицы квертицина
ИЛ-4 – интерлейкин 4
ИЛ-8 – интерлейкин 8
ИФН-γ – интерферон γ
МПК – минимальная подавляющая концентрация
МР – маркер резистентности
ПЦР – полимеразная цепная реакция
РЭ – растительный экстракт
asa – ген, кодирующий синтез белка-адгезина
bac31 – ген, кодирующий синтез бактериоцина 31
cylA – ген, ответственный за активацию цитолизина
cylB – ген, ответственный за транспорт цитолизина
cylM – ген, ответственный за посттрансляционную модификацию цитолизина
cylLs, cylLl – гены, кодирующие структурные субъединицы цитолизина
entA – ген, кодирующий синтез энтероцина А
entAS-48 – ген, кодирующий синтез энтероцина AS-48
entB – ген, кодирующий синтез энтероцина В
entL50A/B – ген, кодирующий синтез энтероцина L50A/B
entP – ген, кодирующий синтез энтероцина Р
esp – ген, кодирующий синтез поверхностных белков-иммуносупрессоров
gelE – ген, кодирующий синтез желатиназы
hyl – ген, кодирующий синтез гиалуронидазы
Ind-58 – индолицидин 58
sIgA – секреторный иммуноглобулин А
42
Пашкова Татьяна Михайловна
РОЛЬ ФАКТОРОВ ПЕРСИСТЕНЦИИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ
МИКРООРГАНИЗМОВ В ИНФЕКЦИОННОМ ПРОЦЕССЕ
06.02.02 Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,
микология с микотоксикологией и иммунология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Подписано в печать 19.09.2018.
Формат 60×84/16. Усл. печ. л. 2,0. Печать трафаретная.
Заказ № 9075. Тираж 100 экз.
Издательский центр ОГАУ
460014, г. Оренбург, ул. Челюскинцев, 18
Тел. (3532)77-61-43
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
9
Размер файла
1 035 Кб
Теги
условном, патогенных, процесс, инфекционным, факторов, роль, микроорганизмов, персистенции
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа