close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Функциональный анализ продуктов генов mcc-подобных кластеров из геномов бактерий Bacillus amyloliquefaciens DSM7 Yersinia pseudotuberculosis IP32953 Streptococcus equinus JB1

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Цибульская Дарья Сергеевна
Функциональный анализ продуктов генов mcc-подобных кластеров из геномов
бактерий Bacillus amyloliquefaciens DSM7, Yersinia pseudotuberculosis IP32953,
Streptococcus equinus JB1.
Специальность 03.01.07 – «молекулярная генетика»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2018
Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Федерального
государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии
наук.
Научный руководитель:
Дубилей Светлана Алексеевна
кандидат биологических наук.
Официальные оппоненты:
Смирнов Иван Витальевич
доктор
химических
наук,
руководитель
группы
комбинаторных
методов
конструирования
биокатализаторов,
старший
научный
сотрудник
лаборатории биокатализа Федерального государственного
бюджетного
учреждения
науки
Института
биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и
Ю.А. Овчинникова Российской академии наук.
Кубланов Илья Валерьевич
кандидат биологических наук, заведующий лабораторией
метаболизма экстремофильных прокариот Института
биохимии имени А.Н. Баха РАН Федерального
государственного учреждения «Федеральный
исследовательский центр «Фундаментальные основы
биотехнологии» Российской академии наук»
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки Институт молекулярной биологии им. В.А.
Энгельгардта Российской академии наук.
Защита диссертации состоится 19 июня 2018 года в 11 часов на заседании диссертационного
совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки
Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова,
д. 34/5
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного
бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук по адресу:
http://www.genebiology.ru/dissertation/dis-24-Cibulskaya/Cibulskaya-text-diss.pdf
Автореферат разослан
«_____»_____________________ 2018 года.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук
Набирочкина Елена Николаевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
С момента открытия в 1928 году Александром Флемингом пенициллина начался золотой
век антибиотиков [1]. Благодаря антибиотикам средняя продолжительность жизни людей в
мире заметно выросла. Антибиотики помогли справиться с такими серьезными заболеваниями,
как холера, чума и туберкулез. Однако совсем скоро появилась проблема распространения
микроорганизмов, устойчивых к антибиотикам. Многие из существующих препаратов уже не
способны справиться с различными патогенными бактериями. Именно поэтому исследование и
разработка новых классов антибактериальных соединений является важной и актуальной
задачей современных научных исследований.
Существует несколько подходов при разработке антибактериальных препаратов: поиск
природных антибиотиков, химическая модификация природных антибиотиков и скрининг
химических комбинаторных библиотек. Самым продуктивным способом на данный момент
является поиск новых классов природных антибиотиков. Прямой поиск штаммов
микроорганизмов, продуцирующих антибактериальные соединения, сейчас не является
эффективным, в связи с большой вероятностью обнаружения ранее открытых соединений.
Более перспективным подходом является биоинформатический поиск кластеров генов,
ответственных за синтез антибиотиков. С помощью такого подхода недавно были обнаружены
и описаны генные кластеры синтеза различных микроцин-С-подобных соединений [2].
Микроцин С – это рибосомально-синтезированный и посттрансляционно модифицированный
антибиотик, действие которого в основном направленно на штаммы семейства
Enterobacteriaceae [3]–[7]. Микроцин С ингибирует одну из аминоацил-тРНК-синтетаз, тем
самым блокируя трансляцию [8]. В этой работе описаны новые кластеры генов, в которых
закодирован путь биосинтеза новых микроцин-С-подобных соединений.
Цели и задачи исследования
Целью данной работы было изучение функций генов, входящих в биоинформатически
предсказанные mcc-подобные кластеры генов из бактерий Bacillus amyloliquefaciens DSM7,
Yersinia pseudotuberculosis IP32953, Streptococcus equinus JB1.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1.
Исследование функции продуктов генов mccBX0 и mccX1, закодированных в
геномах B. amyloliquefaciens DSM7, Y. pseudotuberculosis IP 32953 и генов mccBX0, mccE2X1,
закодированных в геноме S. equinus JB1.
2.
Проверка биоинформатических предсказаний функций дополнительных генов
mccD, mccE1 и mccE2, входящих mcc-подобный кластер генов из Y. pseudotuberculosis IP32953.
3.
Получение микроцин-С-подобного соединения Y. pseudotuberculosis IP32953 и
исследование его антибактериальной активности.
Научная новизна. Теоретическая и практическая значимость работы
На примере mcc-подобных кластеров из B. amyloliquefaciens DSM7 и
Y. pseudotuberculosis IP 32953 впервые было показано, что mcc-подобные кластеры генов с
1
геном mccBX0, продукт которого является двудоменным ферментом, кодируют путь синтеза
карбоксиметилированного пептидил-цитидилата. Впервые показано, что N-концевой домен
двудоменного белка MccBX0, закодированного в mcc-подобных кластерах B. amyloliquefaciens
DSM7, Y. pseudotuberculosis IP32953 и S. equinus JB1, осуществляет реакцию цитидилирования
пептида-предшественника. Впервые было показано, что продукты генов mccX1,
присутствующих в кластерах B. amyloliquefaciens DSM7, Y. pseudotuberculosis IP 32953 и Сконцевой домен продукта гена mccE2X1 S. equinus JB1 синтезируют карбокси-Sаденозилметионин (карбокси-SAM) из S-аденозилметионина (SAM) и префеновой кислоты.
Было установлено, что С-концевой домен MccBX0 из организмов B. amyloliquefaciens DSM7,
Y. pseudotuberculosis IP32953 и S. equinus JB1 осуществляет перенос карбоксиметильной группы
с карбокси-SАМ на остаток цитозина цитидилированного пептида.
Было показано, что ферментативно созданный пептидил-цитидилат MccA из Escherichia
coli и карбоксиметилированный пептидил-цитидилат MccA из E. coli функционально схожи с
микроцином С из E. coli: в чувствительные клетки они проникают через клеточный транспортер
YejABEF, а мишенью этих соединений является аспартил-тРНК-синтетаза (Asp-RS).
Было выделено и очищено антибактериальное соединение, закодированное в mccподобном кластере генов Y. pseudotuberculosis IP32953. Было показано, что оно представляет
собой
процессированный
С-концевой
11-аминокислотный
аминопропилированный
карбоксиметилированный цитидилированный фрагмент пептида MccAYps и его окисленный
вариант (McCYps). McCYps, как и другие короткие пептидил-нуклеотиды, попадает в клетку
через транспортер YejABEF, процессируется клеточными аминопептидазами и ингибирует AspRS. Было показано, что N-концевой домен белка MccE2X1 из S. equinus JB1 (MccE2Seq,) и RimL
из E. coli (RimLEco) обуславливают устойчивость к действию McCYps и McCEco, а продукт гена
mccE2 из Y. pseudotuberculosis IP32953 (MccE2Yps) – к McCYps.
Таким образом, впервые была описана группа рибосомально-синтезированных и
посттрансляционно-модифицированных цитозин-содержащих антибиотиков, а также
идентифицированы белки, участвующие в уникальных биохимических реакциях. Результаты,
полученные в данной работе, могут быть применены в дальнейшем для разработки нового
класса пептидил-нуклеотидных антибиотиков.
Методология и методы исследования
Работа выполнена с использованием современного оборудования и широкого спектра
методов молекулярной биологии и генетики, микробиологии, биохимии. В работе были
применены такие методы как: полимеразная цепная реакция, выделение и очистка плазмидной
и геномной ДНК, выделение и очистка РНК, обратная транскрипция, электрофорез
нуклеиновых кислот в агарозном геле, продукция и очистка рекомбинантных белков, методы
молекулярного клонирования, нокаут генов, микробиологические методы работы с
бактериальными культурами, методы хроматографии и другие.
Положения, выносимые на защиту
1.
N-концевые домены белков MccBX0, закодированных в mcc-подобных кластерах
генов из B. amyloliquefaciens DSM7, S. equinus JB1 и Y. pseudotuberculosis IP32953, являются
2
ЦМФ-трансферазами. Реакция цитидилирования пептидов-предшественников MccABam,
MccASeq и MccAYps проходит через образование сукцинимидных производных.
2.
Продукты генов mccX1 из mcc-подобных кластеров генов из организмов
B. amyloliquefaciens DSM7 и Y. pseudotuberculosis IP32953, а также С-концевой домен продукта
гена mccE2X1 из mcc-подобного кластера из S. equinus JB1 являются карбокси-Sаденозилметионин синтазами. В качестве субстратов для синтеза карбокси-Sаденозилметионина MccX1Bam, MccX1Seq и MccX1Yps используют префеновую кислоту и Sаденозилметионин.
3.
C-концевые домены белков MccBX0, закодированных в mcc-подобных кластерах
генов из B. amyloliquefaciens DSM7, S. equinus JB1 и Y. pseudotuberculosis IP32953, являются
карбоксиметилтрансферазами. MccX0Bam, MccX0Seq и MccX0Yps катализируют реакцию переноса
карбоксиметильной группы с карбокси-S-аденозилметионина на цитозин пептидилцитидилатов.
4.
Продукты генов mccD и mccE1 из mcc-подобного кластера генов из
Y. pseudotuberculosis
IP32953
катализируют
реакцию
аминопропилирования
Yps
карбоксиметилированного цитидилированного MccA пептида.
5.
Микроцин-С-подобное соединение, закодированное в mcc-подобном кластере из
Y. pseudotuberculosis IP 32953, представляет собой 11-аминокислотный аминопропилированный
карбоксиметилированный цитидилированный пептид и его окисленное по цитозину
производное (McCYps). McCYps подавляет рост штаммов E. coli B и Y. pseudotuberculosis 3526.
6.
Продукт гена mccE2 из mcc-подобного кластера из Y. pseudotuberculosis IP32953 и
MccE2 из S. equinus JB1 являются белками иммунности.
7.
Микроцин-С-подобные соединения, содержащие карбоксиметилированный
цитидилат, ингибируют аспартил-тРНК-синтетазу E. coli.
Степень достоверности и апробация результатов
По результатам диссертационной работы были опубликованы 2 статьи в рецензируемых
научных журналах. Основные результаты были представлены также на 6 научных
конференциях (см. перечень в разделе «Список работ, опубликованных по теме диссертации»).
Личное участие автора в проведении исследований
Автором самостоятельно была выполнена бóльшая часть in vivo и in vitro экспериментов,
были получены плазмиды и исследуемые рекомбинантные белки, используемые в
экспериментах, был осуществлен нокаут гена hns в штамме E. coli BW25113, была
осуществлена пробоподготовка для масс-спектрометрического анализа, обработка и оценка
полученных результатов, подготовка иллюстрационного материала. Имена соавторов,
участвовавших в проведении экспериментов, указаны в соответствующих опубликованных
работах. Масс-спектрометрический анализ образцов был проведен Серебряковой Мариной
Васильевной (МГУ имени М.В. Ломоносова, Научно-исследовательский институт физикохимической биологии имени А.Н.Белозерского).
3
Структура и объем работы
Диссертационная работа состоит из введения, четырех глав («Обзор литературы»,
«Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение»), выводов и двух
приложений. Работа изложена на 132 страницах, содержит 32 рисунков в основной части и 8
рисунков в приложении 2, а также 2 таблицы в основной части и 2 в приложении 1. Список
литературы включает 141 источник.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Описание mcc-подобных кластеров, кодирующих гомологи MccBЕco с
дополнительным С-концевым доменом
Среди членов MccB/PaaA семейства белков были предсказаны два белка-гомолога
Eco
MccB , содержащих дополнительный С-концевой метилтрансферазный домен, обозначенный
в этой работе как X0. Эти белки закодированы в геномах Y. pseudotuberculosis IP 32953 и
B. amyloliquefaciens DSM7 в составе mcc-подобных кластеров генов [2]. mcc-подобные кластеры
этих бактерий помимо генов mccA, mccBX0 и mccC также содержат ген, обозначенный нами как
mccX1. Кластер из Y. pseudotuberculosis IP 32953 состоит из восьми генов. Ген mccAYps кодирует
42 аминокислотный пептид. Далее по направлению рамки считывания следует гомолог гена
mccCEco. Между генами mccAYps и mccCYps находится некодирующая область, в
последовательности которой присутствует участок длиной 22 нуклеотида, для которого
предсказано формирование шпилечной структуры. После гена mccCYps расположен ген,
кодирующий MccBX0Yps. За ним следуют два гена с неизвестной функцией, обозначенных как
mccX1Yps и mccX2Yps. MccX1Yps имеет гомологию с членами суперсемейства SAМ-зависимых
метилтрансфераз, а продукт гена mccX2Yps - с членами неохарактеризованного семейства
YqcI/YcgG белков [2]. За ними следуют гомологи генов mccDEco и mccEEco, причем гомологи С
и N-концевых доменов MccEEco кодируются двумя генами. mccE1Yps кодирует гомолог Nконцевого декарбоксилазного домена (MccE1Yps), и mccE2Yps кодирует гомолог C-концевого
ацетилтрансферазного домена (MccE2Yps) белка MccEEco.
Кластер генов из генома B. amyloliquefaciens DSM7 состоит из 4 генов. Первым геном
является mccBX0Bam ген. Затем следует ген mccX1Bam, далее располагается ОРС, кодирующая
предполагаемый пептид-предшественник MccABam размером в 19 аминокислот. После гена
mccABam, находится 33 нуклеотидная последовательность, для которой предсказывается
формирование шпилечной структуры. Следующий за mccABam ген, кодирующий экспортный
насос, гомологичный mccCEco. В результате нового биоинформатического поиска в геноме
S. equinus JB1 нами был обнаружен новый mcc-подобный кластер генов. Первым геном
является удлиненный mccBX0Seq, за ним нами предсказан ген mccASeq, который кодирует 19аминокислотный пептид. После mccASeq присутствует область, для которой предсказывается
формирование шпилечной структуры. Далее по направлению рамки считывания расположен
ген, который представляет собой два слитых гена: гомолог mccE2Yps и гомолог mccX1Yps. За ними
следуют две ОРС, каждая из которых потенциально кодирует фрагмент MccCSeq белка. В
процессе работы все последовательности генов были повторно секвенированы, в результате
4
чего была обнаружена ошибка секвенирования в базе данных GenBank NCBI (рис. 1), которая
привела к ошибочно возникшему стоп-кодону внутри гена mccCSeq. С учетом этой ошибки
после гена mccE2X1Seq располагается только один ген – mccCSeq.
Рисунок 1 - Выравнивание последовательностей
фрагмента гена mccC из генома S. equinus JB1. сверху
указана последовательность из GenBank (NCBI),
снизу - полученная в процессе работы. Звездочкой
отмечены одинаковые позиции. Над последовательностью
из GenBank указана соответствующая аминокислотная
последовательность.
Под
последовательностью,
полученной в процессе работы, указана соответствующая
аминокислотная последовательность.
2. Исследование функций генов кластера mccBam.
2.1. Проверка предсказания mcc-подобного кластера из B. amyloliquefaciens DSM7 in vivo
Для проверки продукции микроцин-С-подобного соединения штамм B. amyloliquefaciens
DSM7, содержащий «минимальный» кластер mccABX0CX1 генов, был выращен в разных
условиях: на LB и M9 среде, при температуре 20-37 °С, с добавлением глюкозы и без.
Клеточный лизат и кондиционированная среда, в которой рос микроорганизм, были
проанализированы
масс-спектрометрически,
однако
ни
предсказанного
пептидапредшественника (расчетная величина отношения массы к заряду для моноизотопного иона
(m/z=2297.3), или его деформилированного варианта (m/z=2269.3), ни аденилированного
соединения (m/z=2626.6), или его деформилированного варианта (расчетный m/z=2598.5)
обнаружить не удалось. Возможным объяснением этого может являться наличие специальных
условий, при которых происходит индукция экспрессии генов кластера. Весь кластер генов был
помещен в мультикопийную плазмиду pHT01, содержащий Pgrac промотор и lac оператор.
Таким вектором был трансформирован штамм B. subtilis 168. Масс-спектрометрический анализ
лизатов клеток, выращенных в присутствии индуктора изопропилтиогалактозида, выявил
наличие нескольких пиков отличия между штаммом с контрольной пустой pHT01 плазмидой и
плазмидой, несущей mccBam-кластер (рис. 2А). Были детектированы сигналы [MH+]
соответствующие предсказанному MccABam пептиду: его формилированной (m/z 2297.3) и
деформилированной форме (m/z 2269.3). Также были обнаружены соответствующие пики
сукцинимидных производных этих пептидов: m/z 2251.3 и m/z 2279.3. Однако пик,
соответствующий аденилированному варианту пептида, отличающийся на массу 329 Да, найден
не был. При этом были обнаружены пики, относящиеся к неизвестным соединениям, которые
имеют молекулярную массу на 305 и 363 Да больше, чем молекулярная масса пептидапредшественника. С использованием тандемного МАЛДИ масс-спектрометрический анализа
(MC/MC анализ) был получен спектр фрагментации иона m/z 2574.4, в котором детектировали
появление дочерних пиков m/z 2269 и m/z 2251, что соответствует MccABam пептиду и его
дегидратированной форме (рис. 2Б). Сигнал [MH+] со значением 2331 относился к
фосфорилированному MccABam, а [MH+] сигнал 2463 – MccABam -рибозо-фосфату.
Следовательно, возможная нуклеотидная составляющая имеет молекулярную массу 111 Да.
Спектр фрагментации m/z 2602.4 с дочерним ионом m/z 2279.3 был схож со спектром
фрагментации иона m/z 2574.4 за исключением наличия формильной группы на N-конце
5
пептида. Расчетная разность масс в случае аденозина составляет 135 Да, разница масс в 111 Да
соответствует массе цитозина, из чего можно предположить, что пики m/z 2574.4 и m/z 2602.4
являются неформилированной и формилированной цитидилированными формами MccABam
пептида.
MС/MС спектры m/z 2632.4 и m/z 2660.5 совпадали по набору пиков со спектрограммами
m/z 2574.4 и m/z 2602.4, соответственно. Таким образом, наблюдаемая разница в молекулярном
весе пар соединений должна относиться к азотистому основанию. Азотистое основание с
молекулярным весом 169 Да неизвестно, однако присутствие в клетке двух пептидилнуклеотидов, отличающихся по азотистому основанию может указывать на существование
дополнительной неизвестной модификации по цитозиновой части антибиотика.
Рисунок 2 - Масс-спектрометрический анализ клеток, содержащих mcc-подобный кластер из B.
amyloliquefaciens DSM7. А – МАЛДИ масс-спектрометрический анализ клеточных лизатов. На верхней панели
приведена спектрограмма клеток B. subtilis, несущих pHT01 пустой вектор. На нижней панели приведена
спектрограмма клеток B. subtilis, несущих mccBam-pHT01 вектор, содержащая дополнительные пики. Б – фрагменты
MС/MС-спектров, исходных масс-ионов 2574.4 и 2632.4, показанных на рисунке А. Оба спектра содержат m/z 2269
пик, что соответствует пептидной части соединения, а также дополнительные пики, разница масс между которыми
соответствует массе фосфатной группы (80 Да) и рибозы (114 Да, на спектре обозначена «Rib.»). Разница массы в
111 Да на верхней панели соответствует массе цитозина, в то время, как разница массы в 169 Да на нижней панели
не соответствует никакому из известных азотистых оснований.
2.2.
Сравнение нуклеотидной специфичности MccBX0Bam и MccBEco
Чтобы проверить действительно ли MccBX0Bam цитидилирует, а не аденилирует пептидпредшественник, рекомбинантный MccBX0Bam был проинкубирован с химически
синтезированным неформилированным 19-аминокислотным пептидом MccABam в присутствии
АТФ, цитидинтрифосфата (ЦТФ), уридинтрифосфата (УТФ) и гуанозинтрифосфата (ГТФ).
Масс-спектрометрический анализ реакций (рис. 3) выявил пик m/z 2269.3, соответствующий
собственно пептиду, а также пик сукцинимидного производного m/z 2251.3. Кроме того, во всех
случаях образовывались пептидил-нуклеотидные соединения: пептидидил-аденилат, пептидилцитидилат, пептидил – уридилат, пептидил-гуанилат. Эффективность прохождения реакции
уменьшалась в следующем порядке: ЦТФ ≫ АТФ ∼ УТФ≫ ГТФ. Если реакцию проводили в
смеси со всеми четырьмя нуклеозидтрифосфатами, то обнаруживался только MccABam-ЦМФ.
6
Неожиданная нуклеотидная специфичность MccBX0Bam могла быть обусловлена
наличием дополнительного С-концевого домена, который отсутствует у MccBEco. Для проверки
этого утверждения был выделен и очищен рекомбинантный MccBBam, лишенный С-концевого
домена (MccBBam). Однако в реакциях in vitro с химически-синтезированным пептидом MccABam
модификация этого пептида происходила даже эффективнее, чем при добавлении
полноразмерного фермента, и наблюдалась схожая субстратная специфичность в отношении
различных нуклеозидтрифосфатов (НТФ). Это указывает на то, что С-концевой домен
MccBX0Bam не является необходимым для нуклеотидилтрансферазной реакции и не
обуславливает специфичность белка. Этот неожиданный результат натолкнул на идею проверки
специфичности нуклеотидилтрансферазной реакции MccBEco. В реакционную смесь был
добавлен
очищенный
рекомбинантный
MccBEco,
химически-синтезированный
Eco
неформилированный пептид MccA и разные нуклеотиды. Реакция прошла только в одном
случае при добавлении АТФ с образованием пептидил-аденилата. Однако, когда в реакцию
добавили формилированный пептид MccAEco, образование пептидил-нуклеотидов наблюдалось
во всех случаях. При этом в реакции конкурирования между четырьмя типами
нуклеозидтрифосфатов MccBEco предпочитал использовать АТФ. Таким образом, оказалось, что
ферменты MccB обладают релаксированной нуклеотидной специфичностью, что, несомненно,
может найти применение в прикладных аспектах, таких как, например, мечение пептидов с
помощью нуклеотидов. Стоит отметить, что при анализе продукции клеток E. coli , несущих
плазмиду с mccEco-кластером, никогда подобных соединений обнаружено не было [9]. Это дает
право утверждать, что естественной реакцией для MccBEco является присоединение молекулы
АМФ, а не какой-либо другой. Во всех случаях наблюдали образование сукцинимидного
промежуточного продукта, что указывает на то, что механизм реакции такой же, как и в случае
аденилирования MccAEco [10].
В результате опытов in vivo и in vitro было показано, что MccBX0Bam, а именно его Nконцевой домен, осуществляет реакцию цитидилирования пептида, а не аденилирования, как в
случае фермента из E. coli.
2.3. Функция С-концевого домена MccBX0Bam белка MccX1Bam
Во всех кластерах с длинным геном mccBX0 был обнаружен также ген, обозначенный
нами как mccX1. Было обнаружено, что продукт гена mccX1Bam имеет гомологию с клеточным
белком CmoAEco. CmoAEco катализирует реакцию синтеза карбокси-S-аденозилметионина
(карбокси-SAM). В качестве субстратов реакции синтеза карбокси-SAM используются SAM и
префеновая кислота. Карбокси-SAM используется в качестве донора карбоксиметильной
группы вторым ферментом CmoBEco в реакции карбоксиметилирования гидроксильной группы
5-гидроксиуридина в 34-й позиции (вобл позиции) некоторых тРНК [11], [12]. С другой
стороны, для С-концевого домена MccBX0Bam, программой BLAST аннотировался Sаденозилметионин-зависимый метилтрансферазный домен. Ферменты, имеющие такую
метилтрансферазную активность, относятся к SAM-зависимым метилтрансферазам I класса.
Примечательно, что программа BLAST предсказывает гомологию CmoBEco с тем же
суперсемейством.
7
Рисунок 3 - Нуклеотидная специфичность MccB из E. coli и B. amyloliquefaciens DSM7 в
нуклеотидилтрансферазной реакции in vitro. Продукты реакций были проанализированы МАЛДИ массспектрометрическим анализом. A – MccBX0Bam инкубировали c MccABam пептидов m/z 2269.3 в присутствие разных
НТФ («+АТФ», «+ЦТФ», «+ГТФ», «+УТФ») и смеси НТФ в эквивомолярном соотношении («+НТФ»). На массспектрах указана разница массы между пиками пептида (m/z 2269.3) и пептидил-нуклеотида. Пик m/z 2251.3
является промежуточным продуктом реакции - сукцинимидным производным. Б –то же, что и А, только вместо
полноразмерного фермента добавлен MccBBam. В – MccBEco инкубировали c неформилированным пептидом
MccAEco (m/z 763.4). Г – MccBEco проинкубирован c формилированным пептидом MccAEco (m/z 791.5). Пик
натриевой соли MccA и пептидил-нуклеотидов отмечен звездочкой.
Хотя очевидной гомологии между CmoBEco и X0 доменом найдено не было, мы
предположили, что MccX1Bam/MccX0Bam могут осуществлять схожие биохимические реакции,
катализируемые CmoAEco/CmoBEco. Для проверки этого утверждения, была протестирована
способность MccX1Bam катализировать реакцию синтеза карбокси-SAM. При инкубации
MccX1Bam либо CmoAEco с SAM и префеновой кислотой и последующей высокоэффективной
жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) продуктов реакции наблюдалось образование нового
хроматографического пика, который отсутствовал при ВЭЖХ смеси только SAM и префената.
Такой же хроматографический пик наблюдали среди множества других пиков при химическом
синтезе карбокси-SAM из S-аденозилгомоцистеина (SAH) и йодуксусной кислоты (рис.4 А-Г).
В результате масс-спектрометрического анализа хроматографических фракций во всех случаях
был детектирован сигнал [MH+] 443.2, что соответствует m/z карбокси-SAM. При анализе
спектра фрагментации этого иона (рис.4 Д-Е) были получены дочерние ионы аденина (m/z 136)
в паре с комплементирующей частью (m/z 308); аденозина (m/z 250) в паре с
комплементирующей частью (m/z 192) и 3-амино-3-карбоксипропила (m/z 102) в паре с
комплементирующей частью (m/z 342). Так как остаток аденозина (m/z 443.2) не был
модифицирован, соответственно метилированной частью является метиониновая группа.
Поскольку 3-амино-3-карбоксипропильный конец метионина (m/z 102) также не
модифицирован, карбоксильная группа должна быть соединена с S-метильной группой
8
метионина. Полученная структурная формула синтезированного карбокси-SAM приведена на
рисунке 4Е.
Далее было проверено, осуществляет ли MccBX0Bam, а именно его С-концевой домен
реакцию модификации цитидилированного MccABam пептида. Очищенный с помощью ВЭЖХ
цитидилированный пептид MccABam (MccABam-ЦМФ) инкубировали с MccBX0Bam и
ферментативно, либо химически синтезированным карбокси-SAM. Полученные реакции были
проанализированы методом МАЛДИ масс-спектрометрии. Во всех случаях наблюдали
появление пика m/z 2632.4. Образовавшийся масс-ион соответствует карбоксиметилированному
цитидилированному MccABam пептиду (MccABam-кмЦМФ). Спектр фрагментации этого масспика был идентичен полученному ранее спектру фрагментации масс-пика m/z 2632.4,
наблюдаемом при анализе продукции клеток B. subtilis с плазмидой pHT01-mccBam (рис. 2Б).
Это означает, что in vivo и in vitro было получено одно и то же соединение. Также был
протестирован только C-концевой домен MccBX0 на способность осуществлять
карбоксиметилтрансферазную реакцию. Как видно из рисунка 4Ж, MccX0 при наличии
карбокси-SAM успешно синтезировал MccABam-кмЦМФ.
В целом, полученные данные достоверно показывают, что C-концевой домен MccBX0Bam
использует карбокси-SAM в качестве донора карбоксиметильной группы для модификации
MccABam-ЦМФ пептида с образованием MccABam-кмЦМФ, причем спектр фрагментации
полученного соединения показывает, что карбоксиметильная группа присоединена к
азотистому основанию пептидил-цитидилата.
Рисунок 4 - MccX1Bam синтезирует карбокси-SAM,
который затем используется MccBX0Bam в
качестве донора карбоксиметильной группы для
модификации пептидил-цитидилата. Левая часть
панели А-Г - хроматограммы ВЭЖХ продуктов
реакции синтеза карбокси-SAM. А - реакция SAM с
префеновой кислотой без добавления фермента. Б –
реакция SAM, префеновая кислота и MccX1Bam.
В - реакция SAM, префеновая кислота и CmoAEco. Г –
Химический синтез карбокси-SAM из SAH и
йодуксусной
кислоты.
Собранные
фракции,
отмеченные пунктирной линией, были использованы
в реакции in vitro цитидилированного MccABam с
рекомбинантным MccBX0Bam. Справа от каждой
панели А-Г показаны результаты МАЛДИ массспектрометрического анализа таких in vitro реакций.
[MH+]
сигнал
2574.4
соответствует
цитидилированному MccABam пептиду. На панели Д
показан спектр фрагментации соединения m/z 443 с
образованием пар дочерних ионов m/z 102-342, 308136, 19-250. Результаты спектра фрагментации,
наложенные на структурную формулу карбоксиSAM, показаны на панели Е. На панели Ж показан
МАЛДИ
масс-спектр
реакции
химически
синтезированного
карбокси-SAM,
цитидилированного MccABam пептида и MccX0Bam.
9
2.4. Активность синтезированных пептидил-нуклеотидов
Полученные цитидилированные, уридилированные и гуанилированные микроцин-Сподобные соединения MccABam были проверены в отношении тестовой культуры E. coli B.
Однако ни одно из них не проявило биологической активности. В попытках найти
микроорганизм-мишень, производные MccABam были проверены по отношению к штаммам
Bacillus subtilis 168, Bacillus. megaterium, Streptococcus salivarius, Streptococcus thermophilus. Все
штаммы были устойчивы к тестируемым пептидил-нуклеотидам и их производным. С-концевой
домен MccBX0Bam в реакции in vitro модифицировал не только MccABam-ЦМФ, но и MccAEcoЦМФ. Тогда, для проверки активности цитидилированных соединений, были взяты
производные MccAEco – MccAEco-АМФ, MccAEco-ЦМФ, MccAEco-ГМФ, MccAEco-УМФ, а также
MccAEco-кмЦМФ. На газон чувствительных клеток E. coli B были нанесены очищенные ВЭЖХ
нуклеотидные производные пептида MccAEco (рис. 5). Соединения MccAEco-АМФ, MccAEcoЦМФ и MccAEco-кмЦМФ ингибировали рост клеток дикого типа, в то время как MccAEco-ГМФ
и MccAEco-УМФ никакой активности не проявили. Мишенью для действия всех микроцин-Сподобных соединений, исследованных ранее, является аспартил-тРНК-синтетаза [8]. Изменение
нуклеотидной части антибиотика могла бы изменить и мишень его действия. Однако
сверхэкспрессия гена aspS из E. coli, кодирующего Asp-RS снимала действия антибиотиков, в
то время как при сверхэкспрессии proS E. coli, кодирующего пролин-тРНК-синтетазу, которая
также как и Asp-RS относится ко II классу аминоацил-тРНК-синтетаз [13], зоны ингибирования
клеточного роста не уменьшались. Ингибирование аспартил-тРНК-синтетазы различными
пептидил-нуклеотидами было дополнительно продемонстрированно в опытах in vitro.
Очищенные с помощью ВЭЖХ пептидил-нуклеотиды инкубировали в лизате E. coli клеток для
прохождения процессинга пептидной части. Затем к смеси добавляли тРНК и
радиоактивномеченный Asp14 и измеряли эффективность аминоацилирования аспартил-тРНК
по включению метки. В случае MccAEco-ГМФ и MccAEco-УМФ не наблюдалось заметного
ингибирования реакции, тогда как MccAEco-АМФ, MccAEco-ЦМФ и MccAEco-кмЦМФ в
несколько раз ингибировали включение Asp14.
Рисунок 5 – биологическая активность MccAEco пептидил-нуклеотидов. А – пять микролитров 50 мкМ
раствора ВЭЖХ-очищенных пептидил-нуклеотидов были нанесены на клеточные газоны, приготовленные на
основе минимальной M9 среды. В качестве положительного контроля использовали 5 мкл 2 мМ раствора
канамицина. Пронумерованные панели показывают результат с различными тестируемыми штаммами: 1 – дикий
тип E. coli B; 3 - E. coli B со сверхэкспрессией гена aspS из E. coli, кодирующего Asp-RS; 4 - E. coli B со
10
сверхэкспрессией proS из E. coli, кодирующего Pro-RSEco. Б – Измерение активности аспартил-тРНК-синтетазы в
присутствии процессированных пептидил-нуклеотидов в реакции in vitro. Концентрация использованных веществ
составляла 25 мкM. В качестве отрицательного контроля вместо пептидил-нуклеотидов к реакции была добавлена
вода. На диаграмме отмечены стандартные отклонения, полученные в результате 3-х независимых измерений.
3. Исследование функций генов, входящих в кластер mccSeq
Белок MccBX0Seq и С-концевой домен белка MccE2X1Seq катализируют каскад
реакций биосинтеза карбоксиметилированного пептидил-цитидилата
Для проверки нуклеотидной специфичности MccBX0 из кластера S. equinus JB1, были
выделены рекомбинантные белки MccBX0Seq и его N-концевой домен. Примечательно, что
автоматическая программа аннотации геномов прокариот NCBI (NCBI Prokaryotic Genome
Annotation Pipeline) [14] некорректно определила начало mccBX0Seq гена: в процессе работы был
определен старт-кодон на 27 кодонов раньше аннотированного. Интересно, что трансляция
начиналась с редко используемого старт кодона ATT. Как и в случае MccBX0Bam фермент
MccBX0Seq обладал способностью осуществлять все четыре типа нуклеотидилтрансферазной
реакции и предпочитал ЦТФ среди всех прочих нуклеотидов (рис. 6А). Таким образом,
нуклеотидилтрансферазный домен белка MccBX0Seq, как и нуклеотидилтрансферазный домен
белка MccBX0Bam является цитидилтрансферазой.
3.1.
Рисунок 6 – Белок MccBX0Seq и С-концевой домен белка MccE2X1Seq катализируют каскад реакций
биосинтеза карбоксиметилированного пептидил-цитидилата. А - Нуклеотидная специфичность MccB из S.
equinus JB1 в нуклеотидилтрансферазной реакции in vitro. Продукты реакций были проанализированы МАЛДИ
масс-спектрометрически. MccBX0Seq, либо MccBSeq инкубировали c пептидом MccASeq пептидом (m/z 2085.3) в
присутствие разных НТФ («+АТФ», «+ЦТФ», «+ГТФ», «+УТФ») и смеси НТФ в эквивомолярном соотношении
(«+НТФ»). На масс-спектрах указана разница массы между пиком пептида (m/z 2085.3) и пептидил-нуклеотида.
Пик m/z 2067 является промежуточным продуктом реакции - сукцинимидным производным. Пик натриевой и
калиевой соли MccASeq и пептидил-нуклеотидов отмечен звездочкой. Б - Проверка функции MccX1Seq и MccX0Seq.
Продукты реакций были проанализированы МАЛДИ масс-спектрометрически. К пептиду MccASeq были добавлены
компоненты, указанные слева от спектров. Звездочкой отмечены натриевые соли пептида и его производных. m/z
2085.3 соответствует сигналу пептида, m/z 2390.4 и m/z 2448.4 соответствуют цитидилированному пептиду MccASeq
и его карбоксиметилированному производному соответственно.
11
Метилтрансфераза, гомологичная белку MccX1Bam, входит в состав слитого белка
MccE2X1Seq. Чтобы проверить, выполняют ли С-концевой домен MccBX0 Seq и С-концевой домен
белка MccE2X1Seq из S. equinus JB1, ту же функцию, что и пара MccX0Bam и MccX1Bam,
соответствующие ферменты были выделены, очищены и проверены в реакции in vitro (рис.6Б).
В случае MccX1Seq был выделен С-концевой домен двудоменного белка MccE2X1Seq. При
добавлении в реакцию пептида MccASeq, MccBSeq, MccX1Seq, ЦТФ, SAM и префеновой кислоты
наблюдали образование только цитидилированного продукта (m/z 2390.4). При добавлении
полноразмерного MccBX0Seq детектировали пик соответствующий MccASeq-кмЦМФ (m/z
2448.4). При отсутствии либо префеновой кислоты, либо SAM, но при наличии MccBX0Seq
наблюдали образование только цитидилированного пептида. Интересно, что при инкубации
MccASeq
пептида
с
карбокси-SAM
и
MccBX0Seq
наблюдали
образование
карбоксиметилированного уридинилированного пептида. Таким образом, была показана
принципиальная возможность карбоксиметилирования урацила, что дает косвенную
информацию о локализации карбоксиметильной группы на азотистом основании нуклеотида.
Таким образом, было показано, что MccX1Seq является карбокси-SAM-синтазой, а Сконцевой домен MccВX0Seq является карбоксиметилтрансферазой.
N-концевой домен белка MccE2X1Seq обеспечивает иммунность к пептидилнуклеотидным антибиотикам
N-концевой домен двудоменного белка MccE2X1Seq имеет гомологию с C-концевым
ацетилтрансферазным
доменом
белка
MccEEco.
Ацетилирование
-NH2
группы
Eco
процессированного McC приводит к потере аффинности такого соединения с аспартил-тРНКсинтетазой [15]. Мы предположили, что ацетилтрансферазный домен белка MccE2X1Seq также
выполняет функцию иммунности в отношении микроцин-С-подобных соединений. К
сожалению, MccASeq-АМФ, MccASeq-ЦМФ, MccASeq-кмЦМФ, MccASeq-кмУМФ не проявляли
антимикробного действия в отношении штаммов E. coli. . Это может быть связано с медленным
процессингом пептидной части антибиотика и/или наличием клеточных механизмов
нейтрализации таких соединений [2], [16]. Для проверки предсказания функции гена mccE2X1Seq,
фрагмент гена, кодирующий ацетилтрансферазный домен, был помещен на плазмиду pBAD с
индуцируемым арабинозным промотором. Как видно на рисунке 7, клетки, содержащие
плазмиду pBAD-mccE2Seq были устойчивы к действию как пептидил-аденилата, так и пептидилцитидилата и карбоксиметилированного производного пептидил-цитидилата MccAEco. Таким
образом, в отличие от MccE2 из E. coli, ацетилтрансферазный домен белка MccE2X1Seq имеет
релаксированную специфичность и выполняет функцию иммунности в отношении широкого
спектра пептидил-нуклеотидов.
3.2.
Рисунок 7 – Суперпродукция MccE2Seq обеспечивает
устойчивость к MccAEco пептидил-нуклеотидов. На
клеточный газон нанесены пять микролитров 50 мкМ
раствора ВЭЖХ-очищенных пептидил-нуклеотидов. В
качестве положительного контроля использовали 5 мкл
2 мМ раствора канамицина. Пронумерованные панели
показывают результат с различными тестируемыми
штаммами: А – дикий тип E. coli B; Б - E. coli B со
суперпродукцией MccE2Seq.
12
4. Исследование функций генов, входящих в кластер mccYps
4.1. Белки MccBX0Yps и MccX1Yps осуществляют биосинтез
карбоксиметилированного пептидил-цитидилата
Yps
Ген mccBX0
эволюционно гораздо ближе к уже изученным нами mccBX0Bam и
mccBX0Seq, чем к гену mccBEco. MccBX0Yps состоит из двух доменов, нуклеотидилтрансферазного
и метилтрансферазного. Было показано, что MccBX0Yps полноразмерный и его N-концевой
домен, так же как и белки MccBX0Bam и MccBX0Seq, могут осуществлять модификацию пептидапредшественника при участии любого из НТФ (рис. 8А). Однако, в случае ГТФ интенсивность
сигнала, соответствующего пептидил-гуанилату была почти на фоновом уровне, но в реакции
образовывалось сукцинимидное производное MccAYps. И, как и в случае других MccBX0, в
реакции субстратного конкурирования с MccBX0Yps образовывался цитидилированный пептид.
Для проверки предсказания функции карбокси-SAM-синтазной активности белка
Yps
MccX1
и карбоксиметилтрансферазной функции C-концевого домена MccBX0Yps были
очищены рекомбинантные белки и проведены реакции in vitro. Как показано на рисунке 8Б, при
добавлении в реакцию пептида-предшественника MccAYps, MccX1Yps, ЦТФ, SAM, префеновой
кислоты и белка MccBX0Yps наблюдали образование цитидилированного пептида с m/z 4656 и
соединения с m/z 5019, соответствующего карбоксиметилированному цитидилированному
MccAYps. Использование MccBYps без С-концевого метилтрансферазного домена приводило к
накоплению в реакции только цитидилированного продукта. В отсутствие в реакции либо
префеновой кислоты, либо SAM, но при наличии MccBX0Yps наблюдали образование только
цитидилированного пептида.
Рисунок 8 – Белки MccBX0Yps и MccX1Yps осуществляют биосинтез карбоксиметилированного пептидилцитидилата. А - Нуклеотидная специфичность MccB из Y. pseudotuberculosis IP 32953 в
нуклеотидилтрансферазной реакции in vitro. Продукты реакций были проанализированы МАЛДИ массспектрометрически. MccBX0Yps, либо MccBYps инкубировали c пептидом MccAYps пептидом (m/z 4656) в
13
присутствие разных НТФ («+АТФ», «+ЦТФ», «+ГТФ», «+УТФ») и смеси НТФ в эквивомолярном соотношении
(«+НТФ»). На масс-спектрах указана разница массы между пиком пептида (m/z 4656) и пептидил-нуклеотида. Пик
m/z 4638 является промежуточным продуктом реакции - сукцинимидным производным. Б - Идентификация
функции белка MccX1Yps, и С-концевого домена белка MccBX0Yps. Продукты реакций были проанализированы
МАЛДИ масс-спектрометрически. К пептиду MccAYps были добавлены компоненты, указанные слева от спектров.
Звездочкой отмечены натриевые соли пептида MccAYps и его производных. m/z 4656 соответствует сигналу
пептида, m/z 4961 и m/z 5019 соответствуют цитидилированному пептиду MccAYps и его карбоксиметилированному
производному соответственно.
Гетерологическая экспрессия mccYps-кластера и делеционный анализ функции
генов кластера mccYps
В кластере генов из Y. pseudotuberculosis IP 32953 помимо генов mccABX0X1 также
присутствуют дополнительные гены. Ген mccE2Yps кодирует белок, который имеет гомологию с
С-концевым доменом MccEEco и N-концевым доменом белка MccE2X1Seq, и, предположительно,
необходим для обеспечения иммунности клетки-продуцента к микроцину. Продукт гена
mccX2Yps не имеет гомологии ни с одним из белков с известной функцией. Гены mccDYps и
mccE1Yps являются близкими гомологами генов mccDEco и mccEEco, необходимыми для синтеза
аминопропилированного варианта McCEco.
Для идентификации полного спектра посттрансляционных модификаций MccAYps,
клетки Y. pseudotuberculosis IP 32953, содержащие в геноме кластер mccYps были
проанализированы методом МАЛДИ масс-спектрометрии. Однако масс-пиков, которые бы
соответствовали пептиду MccAYps или его модифицированным формам, обнаружить не удалось.
Для
дальнейшего
изучения
биосинтеза
микроцин-С-подобного
соединения
из
Yps
Y. pseudotuberculosis IP 32953 кластер генов mcc c 5’-нетранслируемой областью, содержащей
промотор, был помещен на мультикопийную плазмиду pDT1. Штаммы Y. pseudotuberculosis
3526 (не содержащего в геноме кластер генов mccYps) и E. coli BW25113 были
трансформированы плазмидой pDT1-mccYps. Однако и в этом случае масс-спектрометрический
анализ не выявил каких-либо дополнительных пиков отличия между клетками
Y. pseudotuberculosis 3526 с pDT1-mccYps плазмидой и без нее, а клетки с pDT1-mccYps не
проявляли никакой биологической активности по отношению к клеткам, не содержащим mccподобный кластер (рис. 9А). Тем не менее, в клетках E. coli BW25113, содержащих pDT1-mccYps
были обнаружены два пика, отсутствующие в контрольных клетках E. coli. Один из них
соответствовал немодифицированному MccAYps m/z 4656, а другой – N-концевому 31аминокислотному фрагменту MccAYps m/z 3777. Несмотря на наличие пика, соответствующего
MccAYps, такие клетки не подавляли рост тестовой культуры клеток E. coli B.
Размер mccYps-кластера составляет более 7 тыс. п.о. и может иметь сложную регуляцию
экспрессии и дополнительные внутренние промоторы. Поэтому возник вопрос, все ли гены
mccYps кластера экспрессируются в суррогатном хозяине. Для этого с использованием препарата
РНК, полученного из культуры E. coli BW25113 pDT1-mccYps, был проведена ОТ-ПЦР в режиме
реального времени с парами специфических праймеров к каждому mccYps-гену. Уровень
экспрессии был нормирован на ген устойчивости к канамицину aph, находящийся на pDT1
плазмиде. Как видно на рисунке 9Б, ген mccAYps имел высокий относительный уровень
экспрессии, в то время как уровень экспрессии генов mccCYps и mccBX0Yps был примерно в 40 раз
ниже. Так как ген mccBX0Yps кодирует нуклеотидилтрансферазу, его низкий уровень экспрессии,
4.2.
14
вероятно, и является причиной отсутствия [MH+] пика соответствующего модифицированному
MccAYps в клетках E.coli BW25113. Анализ ОТ-ПЦР в режиме реального времени РНК
культуры Y. pseudotuberculosis 3526, содержащей плазмиду pDT1- mccYps, выявил более
однородную экспрессию mccYps—генов. Однако уровень экспрессии был значительно ниже, чем
в клетках E. coli BW25113, что также может объяснять отсутствие различимых сигналов,
соответствующих модифицированному МссАYps на спектрограмме.
Ранее для PmccEco промотора mccEco-кластера было показано, что транскрипционный
фактор H-NS оказывает ингибирующее действие на экспрессию генов этого кластера [17], [18].
Мы предположили, что и в данном случае H-NS может угнетать экспрессию генов кластера
mccYps. Для проверки влияния глобального транскрипционного регулятора H-NS на уровень
экспрессии генов кластера mccYps, штамм E. coli BW25113 ∆hns был трансформирован
плазмидой pDT1-mccYps, а также контрольной плазмидой pDT1. Анализ относительного уровня
экспрессии генов кластера mccYps в таких клетках методом ОТ-ПЦР в режиме реального
времени показал, что экспрессия mccAYps была в 4 раза ниже по сравнению с относительным
уровнем экспрессии этого же гена в клетках дикого типа, тогда как уровень экспрессии генов
mccСYps и mccBX0Yps были в 700 и 250 раз выше, соответственно. Кроме того, при нанесении
культуры E. coli BW25113 Δhns клеток, содержащих pDT1-mccYps, на газон тестовой культуры
E. coli B наблюдалось образование зоны ингибирования клеточного роста (рис. 9А).
В результате сравнения масс-спектров клеток E. coli BW25113 Δhns, содержащих
плазмиду pDT1-mccYps и контрольный вектор pDT1, были обнаружены пики отличия,
соответствующие немодифицированному MccAYps (m/z 4656), сукцинимидному производному
MccAYps (m/z 4638), а также дополнительный пик m/z 5076 (9В). MС/MС анализ соединения m/z
5076 выявил мажорный масс-ион m/z 4656, который соответствует немодифицированному
MccAYps пептиду. Таким образом, соединение с m/z 5076, вероятно, является пептидом MccAYps
с дополнительной модификацией, масса которой 420 Да.
Чтобы определить функции продуктов отдельных генов в биосинтезе соединения с масспиком m/z 5076, были созданы производные плазмиды pDT1-mccYps с последовательно
делетированными mccYps-генами. Клетки E.coli BW25113 Δhns, содержащие такие плазмиды
были протестированы на продукцию антибактериальных соединений активных в отношении
тестового штамма E. coli. Также, такие клетки анализировали методом МАЛДИ массспектрометрии. Результаты представлены на рисунке 10. Клетки, содержащие плазмиду только
с генами mccACBX0Yps не ингибировали рост тестового штамма. В результате массспектрометрического анализа таких клеток, помимо масс-пика немодифицированного пептида,
были обнаружены пики, соответствующие сукцинимидному производному пептида (m/z 4638) и
цитидилированному пептиду (m/z 4961). В клетках, содержащих mccACBX0X1Yps, появлялся пик,
соответствующий
карбоксиметилированному
пептидил-цитидилату
MccAYps-кмЦМФ
(m/z 5019). Такие клетки также не угнетали рост клеток тестовой культуры, что хорошо
согласовывалось с проверкой биологической активности такого же соединения, полученного в
in vitro реакции.
15
Масс-спектрометрический анализ клеток, содержащих помимо минимального набора
генов mccACBX0X1Yps также ген mccX2 не выявил дополнительных масс-пиков, и продукция
антибактериального соединения не наблюдалась. Добавление к кластеру гена mccDYps не
приводило к продукции антибиотика, но, как и ожидалось, в клетках появлялось соединение с
m/z 5120, что соответствует карбоксиаминопропилированному MccAYps-кмЦМФ (MccAYps-капкмЦМФ). Таким образом, мы можем предположить, что белок MccDYps, как и его гомолог
MccDEco, осуществляет перенос карбоксиаминопропильной группы на пептидил-нуклеотид.
Рисунок 9 – Клетки E.coli BW 25113, содержащие pDT1- mccYps плазмиду, продуцируют антибактериальное
соединение при условии отсутствия гена hns. А – клеточный газон тестовой культуры E. coli B, на поверхность
которого нанесены клетки Y. pseudotuberculosis 3526, E. coli BW25113 и E. coli BW25113 Δhns, содержащие
плазмиду pDT1-mccYps или контрольную плазмиду pDT1. Клетки E. coli BW25113 Δhns, несущие плазмиду pDT1mccYps ингибировали рост тестового штамма E. coli Б – Относительный уровень экспрессии генов кластера mccYps в
клетках Y. pseudotuberculosis IP 32953, E. coli BW25113 и E. coli BW25113 Δhns, измеренный методом ОТ-ПЦР в
реальном времениpDT1- mccYps. Уровень экспрессии нормирован на уровень экспрессии гена aph, находящегося на
плазмиде pDT1- mccYps. В - Анализ клеток E.coli BW 25113 Δhns, продуцирующих активное соединение.
Представлен масс-спектр клеток, содержащих просто pDT1 плазмиду (верхняя панель) и содержащих плазмиду
pDT1- mccYps (нижняя панель). Справа показано ингибирование роста тестового штамма E. coli B, клетками E.coli
BW 25113 Δhns, содержащими плазмиду pDT1- mccYps.
Рисунок 10 - Анализ продукции клеток E.coli
BW 25113 Δhns, содержащих производные плазмиды
pDT1-mccYps. Слева представлен МАЛДИ массспектрометрический анализ клеток. Для каждой панели
указан набор генов, mccYps, находящихся на плазмиде.
Отношение m/z немодифицированного пептидапредшественника
равно
4656.
Соединение
с
молекулярной массой меньше на 18 Да (m/z 4638)
соответствует сукцинимидному производному пептидапредшественника. Добавка 305 Да к массе пептида
предшественника соответствует цитидилированию
пептида-предшественника. Разница в молекулярной
массе соединений с m/z 5019 и m/z 4961 составляет 58
Да,
что
соответствует
присоединению
карбоксиметильной
группы.
Присоединение
карбоксиаминопропильной
группы
приводит
к
увеличению
массы
соединения
на
101
Да.
Декарбоксилирование
карбоксиаминопропильной
группы уменьшает молекулярный вес соединения на 44
Да (разница между m/z 5120 и m/z 5076).
Клетки, содержащие плазмиду pDT1-mccACBX0X1X2DE1Yps, ингибировали рост тестовой
культуры. Масс-спектрометрический анализ выявил наличие пика с m/z 5076,
16
соответствующего аминопропилированному варианту MccAYps-кмЦМФ (MccAYps-ап-кмЦМФ).
Таким образом, можно утверждать, что белок MccE1Yps, как и его гомологичный ему Nконцевой домен белка MccEEco, является декарбоксилазой. Спектры фрагментации соединений
с m/z 5076, полученные из клеток, содержащих плазмиду pDT1-mccACBX0X1X2DE1Yps и
плазмиду с полным опероном pDT1-mccACBX0X1X2DE1E2Yps, совпадали, что указывает на
отсутствие модификации, либо изомеризацию соединения, не приводящую к изменению
спектра фрагментации.
4.3.
Выделение биоактивного микроцин-С-подобного соединения из
Y. pseudotuberculosis IP 32953
Для выделения активного соединения, продуцируемого клетками E. coli, содержащими
плазмиду pDT1-mccYps, питательная среда, в которой росла культура-продуцент, была
фракционирована с помощью обратно-фазовой ВЭЖХ, а соответствующие фракции были
проверены на биологическую активность. Хроматографическая фракция, содержащая
соединение с антибактериальной активностью была проанализирована методом МАЛДИ массспектрометрии. Однако в результате анализа не был обнаружен пик с m/z 5076, вместо этого
было обнаружена два масс-пика, отсутствующих в такой же ВЭЖХ-фракции, полученной при
разделении кондиционированной среды, в которой рос контрольный штамм. [MH+] сигнал
первого соединения был равен 1315.4, а второго – 1331.4 (рис. 11А). [MH+] сигнал 1315.4
соответствует фрагменту аминопропилированного карбоксиметилированного цитидил-MccAYps,
у которого удален N-концевой участок длиной 31 аминокислотных остатка, а пара остатков
цистеина формируют дисульфидный мост (рис. 11В). Действительно, обработка
дитиотреитолом (ДТТ) фракции, содержащей соединение m/z 1315.4, приводила к увеличению
молекулярного веса соединения на 2 Да (m/z 1317.4). Интересно, что масса соединения с m/z
1331.4 также увеличивалась на два дальтона. Спектры фрагментации соединений m/z 1315.4 и
m/z 1331.4 имели идентичный набор дочерних ионов (рис. 11Б). В обоих случаях присутствовал
дочерний масс-ион m/z 895, который соответствует С-концевой части пептида MccAYps - 11аминокислотному пептиду CysGlyAlaAlaThrCysGlyGlyGlySerAsn с дисульфидной связью.
Дочерние ионы с m/z 1032 и m/z 1146, соответствуют CysGlyAlaAlaThrCysGlyGlyGlySerAsn –
аминонопропил - фосфату и CysGlyAlaAlaThrCysGlyGlyGlySerAsn – аминонопропил – фосфат –
рибозе. Разница масс в 169 Да между пиками m/z 1315.4 и m/z 1146 соответствует
карбоксиметилированного цитозину. Разница масс в 185 Да между пиками m/z 1331.4 и m/z
1146 соответствует массе карбоксиметилированного цитозина с дополнительными 16 Да, что
указывает на присутствие дополнительного атома кислорода. Таким образом, соединение с m/z
1331.4 представляет собой окисленное по азотистому основанию соединение с m/z 1315.4.
Фракция, содержащая оба соединения, названа McCYps.
Иммунность к McCYps и сравнение механизмов токсичности микроцинов С из
E. coli и Y. pseudotuberculosis IP 32953.
Делеционный анализ не выявил посттрансляционных модификаций, вносимых
продуктами двух генов, входящих в кластер mccYps – mccX2Yps и mccE2Yps, однако продукты этих
генов могли бы быть белками иммунности к продуцируемому соединению. Как уже
4.4.
17
упоминалось, MccX2Yps не имеет гомологов с известной функцией и каких-либо
консервативных последовательностей, известных как сайты связывания кофакторов. MccE2Yps
гомологичен ацетилтрансферазам (имеет аминокислотный мотив, характерный для ацетил-КоА
связывающих ферментов). MccE2Yps имеет близкое сходство с ацетилтрансферазными доменами
белков MccE2X1Seq и MccEEco, обеспечивающими иммунность к пептидил-нуклеотидным
антибиотикам. Для проверки предположительной функции иммунности указанных генов, они
были помещены на плазмиду pBAD с индуцируемым арабинозным промотором. В
эксперименте тестировали не только McCYps, но и полностью модифицированный микроцин С
из E. coli (McCEco). Как показано на рисунке 12А, клетки E. coli B, трансформированные
плазмидой pBAD-mccX2Yps сохраняли чувствительность к действию как McCEco, так и McCYps.
Анализ продукции белка MccX2Yps показал, что основная часть рекомбинантного белка
находилась в клетке в тельцах включения, что, возможно, объясняет отсутствие устойчивости.
Интересный результат наблюдался при анализе устойчивости клеток со сверхэкспрессией
mccE2Yps: наблюдалось значительное снижение чувствительности E. coli B к и McCYps, но
чувствительность к McCEco не изменялась.
Рисунок 11 - Массспектрометрический
анализ McCYps. А –
МАЛДИ
массспектрометрический анализ
активной фракции McCYps
без обработки (верхняя
панель) и с обработкой
(нижняя
панель)
дитиотреитолом.
Б
–
MС/MС анализ пиков m/z
1315.4 (верхняя панель) и
m/z 1331.4 (нижняя панель).
Между пиками подписаны
названия химических групп,
массы
которых
соответствуют
разнице
между
масс-ионами.
В
предполагаемая
структурная
формула
McCYps
с
указанием
дочерних
масс-ионов,
образующихся
при
фрагментации соединения.
McCYps ингибировал рост штаммов E. coli B и Y. pseudotuberculosis 3526. Для штамма
E. coli B минимальная ингибирующая концентрация (МИК) McCYps составляет 3 мкM, что в 8
раз выше, чем МИК McCEco. Однако, в отношении штамма Y. pseudotuberculosis 3526 оба
вещества имеют близкий уровень ингибирующей активности (рис. 12Б). Ранее нами было
показано, что мишенью для действия пептидил-цитидилатных антибиотиков, так же как и для
пептидил-аденилатов является аспартил-тРНК-синтетаза. Клетки сверхэкспрессирующие aspS
были устойчивы к действию McCYps, в то время как клетки с индуцированной сверхэкспрессией
proS были так же чувствительны к McCYps как и клетки, содержащие контрольную плазмиду
(рис. 12 В). Таким образом, клеточной мишенью McCYps, очевидно, является, так же как и в
случае McCEco, аспартил-тРНК-синтетаза. МcCEco проникает в цитоплазму E. coli через
18
транспортер YejABEF. Клетки E. coli B, в которых отсутствовал ген, кодирующий субъединицу
YejB, были устойчивы к действию McCYps. Для процессинга пептидной части МсСEco и
высвобождения токсичного аспартамид-аденилата необходимо присутствие в клетках E. coli
BW28357 трех аминопептидаз PepA, PepB, PepN [19]. Клетки E. coli B с делецией трех генов
pepA, pepN, pepB были устойчивы к действию McCYps, а чувствительность к McCEco у них была
снижена в несколько раз. Таким образом, мы можем утверждать, что процессинг пептидной
части McCYps необходим для высвобождения токсичного компонента антибиотика. Активность
McCEco в отношении клеток E. coli B ΔpepA, ΔpepB, ΔpepN можно объяснить
предположительным наличием четвертой пептидазы в клетках, которая способна
процессировать микроцин С и отсутствует в штамме E. coli BW28357, так как для этого штамма
было показано, что отсутствие 3-х аминопептидаз придает клеткам полную устойчивость к
McCEco [19]. Полученные данные показывают, что McCYps, так же как и McCEco, синтезируется
клеткой-продуцентом в виде про-антибиотика, который попадает через клеточный
олигопептидный транспортер YejABEF в цитоплазму E. coli, где подвергается процессингу с
высвобождением действующего вещества, ингибирующего работу аспартил-тРНК-синтетазы.
Рисунок 12 - Активность McCYps и McCEco в отношении различных культур. Соответствующие клетки росли
при 30°С, на протяжении 16 часов. А - Анализ активности McCYps и McCEco относительно тестируемых культур. На
газон клеток нанесено 5 мкл 25 мкМ McCYps и 5 мкл 2,5 мкМ McCEco. В качестве контрольного антибиотика
нанесено 5 мкл 1 мМ гентамицина. Б - сравнение активности МИК McCYps и McCEco. Серийные разведения
микроцинов С наносили на газоны клеток E. coli B и Y. pseudotuberculosis 3526. Клеточные газоны растили при
30°С в течение 16 часов. МИК определяли как минимальную концентрацию антибиотика, которая вызывала
видимое ингибирование роста клеток. В - Сравнение активности McCYps и McCEco. На газон клеток нанесено 5 мкл
25 мкМ McCYps и 5 мкл 2,5 мкМ McCEco. В качестве контрольного антибиотика нанесено 5 мкл 1 мМ гентамицина.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Известно немногим более десятка цитозин-содержащих антибиотиков, все из которых
являются продуктами нерибосомального синтеза [20]. В этой работе впервые описан новый тип
цитозин-содержащих
рибосомально-синтезированных
и
посттрансляционномодифицированных микроцин-С-подобных антибиотиков. В ходе работы нам удалось
19
идентифицировать функции продуктов генов, входящих в mcc-подобные кластеры из B.
amyloliquefaciens DSM7, Y. pseudotuberculosis IP32953, S. equinus JB1, и ответственных за синтез
пептидил-цитидилатных антибиотиков (рис. 13).
Главным ферментом, участвующим в биосинтезе пептидил-нуклеотидных антибиотиков,
является белок MccB, который осуществляет первую стадию модификации пептидапредшественника микроцина С. Мы охарактеризовали новое семейство двудоменных MccBХ0
нуклеотидилтрансфераз, входящих в суперсемейство ThiF/HesA/MoeB/E1 фосфотрансфераз
[21], [22]. Ближайшим гомологом белков MccBX0, является аденилилтрансфераза MccBEco,
которая участвует в биосинтезе микроцина С из E. coli. MccBEco, осуществляя присоединение
молекулы АТФ в два этапа с образованием промежуточного продукта в виде пептидилсукцинимида. N-концевые домены изученных нами белков MccBX0 катализируют реакцию
цитидилирования пептида, по-видимому, по такому же механизму, как и в случае реакции
аденилирования, на что указывает наличие сукцинимидного интермедиата реакции. Ферменты
остаются активными и не меняют функцию даже в случае делеции C-концевого домена
В работе исследована специфичность нуклеотидилтрансферазной активности MccB из
E. coli, B. amyloliquefaciens DSM7, Y. pseudotuberculosis IP32953 и S. equinus JB1 в отношении
различных нуклеозидтрифосфатов в условиях in vitro. В результате таких реакций образуются
новые пептидил-нуклеотиды. Для некоторых из таких соединений была показана
биологическая активность. Сравнение первичной последовательности и трехмерных моделей
структур представителей двух семейств МссВ белков не выявило очевидных аминокислотных
мотивов,
которые
могли
бы
однозначно
отличить
аденилилтрансферазы
от
цитидилилтрансфераз. Возможно, будущие исследования структурных особенностей Nконцевых доменов MccBX0 разрешат загадку нуклеотидной специфичности таких ферментов.
Важной особенностью mcc-подобных кластеров генов, которые кодируют белок MccBX0
из B. amyloliquefaciens DSM7, Y. pseudotuberculosis IP 32953 и S. equinus JB1, является наличие
гена mccX1 (рис. 13). Продукт гена mccX1 из B. amyloliquefaciens DSM7, Y. pseudotuberculosis IP
32953 и S. equinus JB1 синтезирует карбокси-SAM из префеновой кислоты и SAM. MccX1
является гомологом клеточного белка CmoA из E.coli, который также является карбокси-SAM
синтазой. В клетках энтеробактерий карбокси-SAM используется белком CmоB в качестве
донора карбоксиметильной группы для модификации 5-гидроксиуридина в вобл позиции
антикодоновой петли тРНК. В результате этой реакции образуется 5-оксиацетил-уридин [11],
[12]. В синтезе микроцин-С-подобных антибиотиков карбокси-SAM используется C-концевым
доменом белка MccBX0 из исследуемых организмов в качестве донора карбоксиметильной
группы для модификации цитозина в пептидил-цитидине. При этом карбокси-SAM,
синтезированный CmoA, также может быть использован MccX0 для модификации пептидилцитидина. Позиция на цитозине, по которой присоединяется карбоксиметильная группа, пока
не определенна. СmoB катализирует перенос карбоксиметила на гидроксильную группу 5гидроксиуридина [11]. Однако, между CmoB и MccX0 нет очевидного структурного сходства.
Кроме того, в цитозине отсутствует гидроксильная группа в пятом положении, поэтому
очевидно, что позиция, по которой осуществляет реакцию MccX0, должна быть другой. Также
20
была показана принципиальная возможность синтеза in vitro карбоксиметилированного
пептидил-уридилата, что дает косвенную информацию о возможных местах расположения
карбоксиметильной группы на цитозине. Кроме случая использования карбокси-SAM в
модификации урацила тРНК в литературных источниках не было найдено другого примера
использования в живых системах карбокси-SAM. Таким образом, биосинтез
карбоксиметилированных цитидилированных микроцин-С-подобных соединений – это вторая
обнаруженная биохимическая система, в которой используется карбокси-SAM.
Рисунок 13 - Кластеры генов синтеза микроцина С и mcc-подобные кластеры. Стрелками схематично
изображены гены кластеров. На стрелках обозначены условные названия этих генов. Структурой в виде шпильки
схематично изображены потенциальные внутренние терминаторы транскрипции. Под генами указаны
идентификационные номера аннотированных продуктов этих генов из базы данных NCBI. Легенда белков,
кодируемых кластерами, расположена слева. Под схематично нарисованными кластерами указаны наименования
организмов, в которых были обнаружены эти кластеры.
Ферментативно
созданные
цитидилированные
и
карбоксиметилированные
Bam
Seq
цитидилированные пептиды MccA
и MccA , закодированные в mcc-подобных кластерах из
геномов B. amyloliquefaciens DSM7 и S. equinus JB1, не ингибировали рост тестируемых
клеточных культур. Однако нами был выделен первый природный пептидил-цитидилатный
антибиотик - McCYps. McCYps активен и ингибирует рост тестовых культур E. coli B и
Y. pseudotuberculosis 3526. Путь биосинтеза McCYps закодирован в mcc-подобном кластере,
расположенном в геноме Y. pseudotuberculosis IP 32953. В этом кластере присутствуют гены
mccBX0X1, ответственные за цитидилирование и карбоксиметилирование пептида, а также гены
mccDE1, ответственные за аминопропилирование карбоксиметилированного пептидилцитидилата. Нами показано, что соединение с предсказанной структурой действительно
синтезируется в клетке в виде полностью модифицированного 42 аминокислотного пептидапредшественника MccAYps. Клетки E. coli, несущие плазмиду с усеченным mccYpsACBX0X1X2кластером генов, не проявляли ингибирующую активность в отношении тестовой культуры
клеток, в отличие от клеток с полным mccYps-кластером. Вероятно, в случае McCYps, как и в
случае McCEco, наличие аминопропильной группы увеличивает антибактериальную активность
McCYps. Экспортируемый из клетки-продуцента микроцин (McCYps) представляет собой
аминопропилированный карбоксиметилированный цитидилат С-концевого фрагмента пептида
21
MccAYps. В нашей лаборатории показано, что McCYps с необрезанным N-концевым лидерным
пептидом не подавляет рост штамма E. coli, а процессинг и, соответственно, созревание McCYps
осуществляется клеточной протеазой TldD/E. Дополнительный шаг в виде процессинга премикроцина может быть необходим для дополнительной защиты клеток-продуцентов от
внутренней интоксикации микроцином. Кроме того, длинный 42-аминокислотный пептид,
возможно, структурирован и, вероятно, может увеличивать внутриклеточную стабильность
посттрансляционно-модифицированного соединения.
Расположение генов в mccYps -кластере предполагает, что они транскрибируются с
одного промотора. Однако, по-видимому, активности этого промотора недостаточно для
синтеза пре-McCYps в гетерологичной системе в штамме E. coli BW25113. Это следует из
наблюдения, что продукция McCYps происходит только в клетках, лишенных гена hns. Известно,
что белок H-NS является ингибитором инициации транскрипции для многих генов [23], [24].
Однако в данном случае в клетках с рабочим H-NS происходит транскрипция гена mccA и
накопление в клетках N-концевого процессированного пептида, то есть основной промотор
остается активным. Из этого следует, что механизм ингибирования продукции McCYps H-NS
фактором в данном случае, по-видимому, отличается от ранее описанных. Возможно, H-NS
фактор играет важную роль в регуляции экспрессии генов, следующих за mccA, либо он какимто образом напрямую подавляет активность продуктов этих генов. Интересно, что результаты
анализа уровня экспрессии отдельных генов кластера предполагают наличие внутренних
промоторов.
Клеточной мишенью пептидил-цитидилатов, как и в случае пептидил-аденилатов,
является аспартил-тРНК-синтетаза. Созданные in vitro химерные соединения, в которых пептид
MccAEco был модифицирован цитидилатом и карбоксиметилированным цитидилатом, так же
как и соответствующий пептидил-аденилат, были способны ингибировать рост E. coli B.
Суперэкспрессия гена aspS, кодирующего аспартил-тРНК-синтетазу E. coli приводила к
резистентности в отношении пептидил-нуклеотидных антибиотиков. Такой штамм был также
устойчив к действию природного антибиотика McCYps. Эксперименты по in vitro
ингибированию аспартил-тРНК-синтетазы показывают, что ферментативно созданный
карбоксиметилированный цитидилированный MccAEco пептид является более активным
соединением по сравнению с просто цитидилированным. Таким образом, биологическая роль
карбоксиметильной модификации заключается, по-видимому, в увеличении активности
пептидил-цитидилата. Однако MccAEco пептидил-аденилат был более активен, нежели MccAEco
пептидил-цитидилат с карбоксиметильной группой. Биологическая активность антибиотика –
это интегральный показатель, который зависит как от непосредственной аффинности
соединения к белковой мишени, так и от эффективности его проникновения в клетку. В случае
пролекарств важную роль также играет и эффективность превращения проантибиотика в
токсичное соединение. Таким образом, один и тот же антибиотик может быть активным и
нейтральным в отношении различных, даже близкородственных, бактерий. Это подтверждается
сравнением активности McCYps и McCEco. МИК McCEco в отношении тестовой культуры E. coli
как минимум в 6 раз ниже, чем МИК McCYps, то есть McCEco гораздо активнее. В то время как
22
МИК этих соединений в отношении тестовой культуры Y. pseudotuberculosis 3526 практически
одинаковы.
Изучение пептидил-нуклеотидных соединений является актуальным направлением
научных исследований. Безусловно, многие вопросы биосинтеза микроцин С-подобных
соединений и эволюции mcc-подобных кластеров генов требуют дальнейшего изучения,
однако, результаты, полученные в этой работе, могут быть использованы для создания новых
антибактериальных соединений, направленных против патогенных микроорганизмов.
Несомненно, в дальнейшем будут обнаружены новые mcc-подобные кластеры генов, возможно,
кодирующие новые способы модификации пептидил-нуклеотидов.
ВЫВОДЫ
1.
N-концевые домены белков MccBX0, закодированных в mcc-подобных кластерах генов
из B. amyloliquefaciens DSM7, S. equinus JB1 и Y. pseudotuberculosis IP32953, являются ЦМФтрансферазами. Реакция цитидилирования пептидов-предшественников MccABam, MccASeq и
MccAYps проходит через образование сукцинимидных производных.
2.
Продукты генов mccX1 из mcc-подобных кластеров генов из организмов
B. amyloliquefaciens DSM7 и Y. pseudotuberculosis IP32953, а также С-концевой домен продукта
гена mccE2X1 из mcc-подобного кластера из S. equinus JB1 являются карбокси-Sаденозилметионин синтазами. В качестве субстратов для синтеза карбокси-Sаденозилметионина MccX1Bam, MccX1Seq и MccX1Yps используют префеновую кислоту и Sаденозилметионин.
3.
C-концевые домены белков MccBX0, закодированных в mcc-подобных кластерах генов
из B. amyloliquefaciens DSM7, S. equinus JB1 и Y. pseudotuberculosis IP32953, являются
карбоксиметилтрансферазами. MccX0Bam, MccX0Seq и MccX0Yps катализируют реакцию переноса
карбоксиметильной группы с карбокси-S-аденозилметионина на цитозин пептидилцитидилатов.
4.
Продукты генов mccD и mccE1 из mcc-подобного кластера генов из Y. pseudotuberculosis
IP32953
катализируют
реакцию
аминопропилирования
карбоксиметилированного
Yps
цитидилированного MccA пептида.
5.
Микроцин-С-подобное соединение, закодированное в mcc-подобном кластере из
Y. pseudotuberculosis IP 32953, представляет собой 11-аминокислотный аминопропилированный
карбоксиметилированный цитидилированный пептид и его окисленное по цитозину
производное (McCYps). McCYps подавляет рост штаммов E. coli B и Y. pseudotuberculosis 3526.
6.
Продукт гена mccE2 из mcc-подобного кластера из Y. pseudotuberculosis IP32953 и MccE2
из S. equinus JB1 являются белками иммунности.
7.
Микроцин-С-подобные соединения, содержащие карбоксиметилированный цитидилат,
ингибируют аспартил-тРНК-синтетазу E. coli.
23
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Публикации в журналах:
1.
Tsibulskaya D., Mokina O., Kulikovsky A., Piskunova J., Severinov K., Serebryakova M. and
Dubiley S. The Product of Yersinia pseudotuberculosis mcc Operon Is a Peptide-Cytidine Antibiotic
Activated Inside Producing Cells by the TldD/E Protease.// J Am Chem Soc. -2017.-T. 139 – N.45 –
16178-16187 c.
2.
Serebryakova M., Tsibulskaya D., Mokina O., Kulikovsky A., Nautiyal M., Van Aerschot A.,
Severinov K., and Dubiley S. A Trojan-Horse Peptide-Carboxymethyl-Cytidine Antibiotic from
Bacillus amyloliquefaciens. // J Am Chem Soc.- 2016. –T.138. – N.48. – 15690-15698 c.
Тезисы конференций:
1.
S. Dubiley, A. Kulikovsky, D. Tsybulskaya, J. Piskunova, M. Serebryakova, K. Severinov.
Expanded family of peptidyl-nucleotide antibiotics // Challenges and new concepts in antibiotics
research , Institute Pasteur, Paris, France, 2018 – 225 p.
2.
Darya Tsibulskaya, Olga Mokina Alexei Kulikovsky, Konstantin Severinov, Marina
Serebryakova, Svetlana Dubiley. Trojan-horse peptide-cytidine antibiotics – an unusual subfamily of
microcin C-like compounds. New Approaches and Concepts in Microbiology, EMBL Heidelberg,
Germany, 2017 – 146 p.
3.
Tsibulskaya D., Mokina O., Kulikovsky A., Serebryakova M., Severinov K. and Dubiley S.
The new peptide-nucleotides compounds from mcc-like operons // 3rd Congress of Baltic
Microbiologists (CBM2016), Joint Life Sciences Center, Vilnius university, Vilnius, Lithuania, 2016 –
106 p.
4.
Alexei Kulikovsky, Inna Zukher, Olga Mokina, Darya Tsibulskaya, Marina Serebryakova,
Konstantin Severinov and Svetlana Dubiley. Validation of cognate MccA-MccB pairs from diverse
bacteria and determination of molecular mechanisms responsible for efficient synthesis of Trojanhorse peptide-nucleotide antibiotic microcin C. Antimicrobial Peptide Symposium, French National
Centre for Scientific Research (CNRS), Ifremer, and the Universities of Montpellier and Perpignan,
Montpellier, France, 2016 – 108 p.
5.
Цибульская Д.С. Исследование микроцин-С-подобного вещества, закодированного в
опероне Yersinia pseudotuberculosis // Международная научная конференция студентов,
аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2016», МГУ, Москва, Россия, 2016 г – 301 c.
6.
Tsibulskaya D., Zukher I. Analysis of mcc-like operon encoded in Bacillus amyloliquefaciens
genome. International conference for young scientists «Molecular Control of Gene Expression»,
Institute of Gene Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia, 2015 – 49-50 с.
24
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ В АВТОРЕФЕРАТЕ
[1]
Fleming A. On the Antibacterial Action of Cultures of a Penicillium, with Special Reference to their Use in the
Isolation of B. influenzæ / A. Fleming // Br. J. Exp. Pathol. – 1929. – Т. 10 – № 3– 226с.
[2]
Bantysh O. Enzymatic synthesis of bioinformatically predicted microcin C-like compounds encoded by diverse
bacteria / O. Bantysh, M. Serebryakova, K. S. Makarova, S. Dubiley, K. A. Datsenko, K. Severinov // MBio – 2014. – Т. 5
– № 3.
[3]
García-Bustos J.F. Microcin 7: purification and properties / J. F. García-Bustos, N. Pezzi, C. Asensio // Biochem.
Biophys. Res. Commun. – 1984. – Т. 119 – № 2– 779–85с.
[4]
Kurepina N.E. Cloning and mapping of the genetic determinants for microcin C51 production and immunity / N.
E. Kurepina, E. I. Basyuk, A. Z. Metlitskaya, D. A. Zaitsev, I. A. Khmel // MGG Mol. Gen. Genet. – 1993. – Т. 241 – №
5–6– 700–706с.
[5]
Khmel I.A. Isolation and characterization of Escherichia coli strains producing microcins of B and C types / I. A.
Khmel, V. M. Bondarenko, I. M. Manokhina, E. I. Basyuk, A. Z. Metlitskaya, V. A. Lipasova, Y. M. Romanova // FEMS
Microbiol Lett – 1993. – Т. 111 – № 2–3– 269–274с.
[6]
Guijarro J.I. Chemical structure and translation inhibition studies of the antibiotic microcin C7 / J. I. Guijarro, J. E.
Gonzalez-Pastor, F. Baleux, J. L. San Millan, M. A. Castilla, M. Rico, F. Moreno, M. Delepierre // J. Biol. Chem. – 1995. –
Т. 270 – № 40– 23520–23532с.
[7]
Severinov K. Microcin C: biosynthesis and mechanisms of bacterial resistance / K. Severinov, S. K. Nair // Future
Microbiol. – 2012. – Т. 7 – № 2– 281–289с.
[8]
Metlitskaya A. Aspartyl-tRNA synthetase is the target of peptide nucleotide antibiotic microcin C / A.
Metlitskaya, T. Kazakov, A. Kommer, O. Pavlova, M. Praetorius-Ibba, M. Ibba, I. Krasheninnikov, V. Kolb, I. Khmel, K.
Severinov // J. Biol. Chem. – 2006. – Т. 281 – № 26– 18033–18042с.
[9]
Metlitskaya A. Maturation of the translation inhibitor microcin / A. Metlitskaya, T. Kazakov, G. H. Vondenhoff,
M. Novikova, A. Shashkov, T. Zatsepin, E. Semenova, N. Zaitseva, V. Ramensky, A. Van Aerschot, K. Severinov // J.
Bacteriol. – 2009. – Т. 191 – № 7– 2380–2387с.
[10]
Roush R.F. Maturation of an Escherichia coli ribosomal peptide antibiotic by ATP-consuming N-P bond formation
in microcin C7 / R. F. Roush, E.M. Nolan, F.Löhr, C.T. Walsh // J.Am. Chem. Soc. – 2008. – Т. 130 – № 11– 3603–3609с.
[11]
Kim J. Structure-guided discovery of the metabolite carboxy-SAM that modulates tRNA function. / J. Kim, H.
Xiao, J. B. Bonanno, C. Kalyanaraman, S. Brown, X. Tang, N. F. Al-Obaidi, Y. Patskovsky, P. C. Babbitt, M. P. Jacobson,
Y.-S. Lee, S. C. Almo // Nature – 2013. – Т. 498 – № 7452– 123–6с.
[12]
Nasvall S.J. The modified wobble nucleoside uridine-5-oxyacetic acid in tRNAPro(cmo5UGG) promotes reading
of all four proline codons in vivo. / S. J. Nasvall, P. Chen, G. R. Bjork // RNA – 2004. – Т. 10 – № 10– 1662–73с.
[13]
Eriani G. Partition of tRNA synthetases into two classes based on mutually exclusive sets of sequence motifs / G.
Eriani, M. Delarue, O. Poch, J. Gangloff, D. Moras // Lett. to Nat. – 1990. – Т. 347– 203–206с.
[14]
Angiuoli S. V. Toward an Online Repository of Standard Operating Procedures (SOPs) for (Meta)genomic
Annotation / S. V. Angiuoli, A. Gussman, W. Klimke, G. Cochrane, D. Field, G. M. Garrity, C. D. Kodira, N. Kyrpides, R.
Madupu, V. Markowitz, T. Tatusova, N. Thomson, O. White // Omi. A J. Integr. Biol. – 2008. – Т. 12 – № 2– 137–141с.
[15]
Novikova M. MccE Provides resistance to protein synthesis inhibitor microcin C by acetylating the processed
form of the antibiotic / M. Novikova, T. Kazakov, G. H. Vondenhoff, E. Semenova, J. Rozenski, A. Metlytskaya, I. Zukher,
A. Tikhonov, A. Van Aerschot, K. Severinov // J. Biol. Chem. – 2010. – Т. 285 – № 17– 12662–12669с.
[16]
Kazakov T. The RimL transacetylase provides resistance to translation inhibitor microcin C / T. Kazakov, K.
Kuznedelov, E. Semenova, D. Mukhamedyarov, K. A. Datsenko, A. Metlitskaya, G. H. Vondenhoff, A. Tikhonov, V.
Agarwal, S. Nair, A. Van Aerschot, K. Severinov // J. Bacteriol. – 2014. – Т. 196 – № 19– 3377–3385с.
[17]
Moreno F. The regulation of microcin B, C and J operons. / F. Moreno, J. E. Gónzalez-Pastor, M. R. Baquero, D.
Bravo // Biochimie – 2002. – Т. 84 – № 5–6– 521–9с.
[18]
Fomenko D. Regulation of microcin C51 operon expression: the role of global regulators of transcription. / D.
Fomenko, A. Veselovskii, I. Khmel // Res. Microbiol. – 2001. – Т. 152 – № 5– 469–79с.
[19]
Kazakov T. Escherichia coli peptidase A, B, or N can process translation inhibitor microcin C / T. Kazakov, G. H.
Vondenhoff, K. A. Datsenko, M. Novikova, A. Metlitskaya, B. L. Wanner, K. Severinov // J. Bacteriol. – 2008. – Т. 190 –
№ 7– 2607–2610с.
[20]
Niu G. Nucleoside antibiotics: biosynthesis, regulation, and biotechnology. / G. Niu, H. Tan // Trends Microbiol. –
2015. – Т. 23 – № 2– 110–9с.
[21]
Burroughs A.M. Natural history of the E1-like superfamily: Implication for adenylation, sulfur transfer, and
ubiquitin conjugation / A. M. Burroughs, L. M. Iyer, L. Aravind // Proteins Struct. Funct. Bioinforma. – 2009. – Т. 75 – №
4– 895–910с.
[22]
Regni C.A. How the MccB bacterial ancestor of ubiquitin E1 initiates biosynthesis of the microcin C7 antibiotic. /
C. A. Regni, R.F.Roush, D.J.Miller, A.Nourse, C.T. Walsh, B.A. Schulman // EMBO J. – 2009. – Т. 28 – № 13– 1953–64с.
[23]
Dame R.T. Structural basis for H-NS-mediated trapping of RNA polymerase in the open initiation complex at the
rrnB P1. / R. T. Dame, C. Wyman, R. Wurm, R. Wagner, N. Goosen // J. Biol. Chem. – 2002. – Т. 277 – № 3– 2146–50с
[24]
Schröder O. The bacterial DNA-binding protein H-NS represses ribosomal RNA transcription by trapping RNA
polymerase in the initiation complex. / O. Schröder, R. Wagner // J. Mol. Biol. – 2000. – Т. 298 – № 5– 737–48с.
25
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа