close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

БИОФИЗИКА МЕМБРАННЫХ ПРОЦЕССОВ

код для вставкиСкачать
методическое пособие для ВУЗов Структура и функционирование биологических мембран Транспорт веществ через биологическую мембрану Теория. Лабораторный практикум. Задания для самостоятельной работы Для студентов специальности «биофизика
Министерство образования и науки Украины
Донецкий национальный университет
БИОФИЗИКА МЕМБРАННЫХ ПРОЦЕССОВ
Структура и функционирование биологических мембран
Транспорт веществ через биологическую мембрану
Теория. Лабораторный практикум.
Задания для самостоятельной работы
Для студентов специальности "биофизика"
Донецк 2011
ББК ЕО*71р30-21
Биофизика мембранных процессов. Для студентов специальности "биофизика" // Сост. О.И. Доценко.- Донецк, ДонНУ, 2011.- 175 с.
Составители:О.И. Доценко, к.х.н., доцент
Введение. История изучения свойств и строения мембран: борьба противоборствующих идей
1. Мембранная теория. Основные положения:
1.1. Живая клетка подобна пузырькам
1.2. Содержимое клетки - водный раствор электролитов
1.3. Липидный бислой - непроницаемый барьер
1.4. Вода и ионы К+ в клетке свободны
Ученые, внесшие вклад в развитие мембранной теории:
ботаник фон Моль
К. фон Негели (1817-1891 гг.) В 1855 г. использован термин "мембрана" как окружающая клетку невидимая плёнка, служащая барьером между содержимым клетки и внешней средой и одновременно - полупроницаемой перегородкой, через которую могут проходить вода и некоторые растворенные в ней веществаМориц Траубе (1826-1894)
В 1867 г. М. Траубе предложил несколько типов перегородок, проницаемых только для воды. Я. Вант-Гофф впоследствии назвал такие перегородки полупроницаемыми. М. Траубе и другим исследователям удалось с помощью таких перегородок измерить максимальные давления при опытах с различными растворами.В. Пфеффер (1845-1920)
Идея, что мембранный барьер может быть полупроницаемым, была предложена физиологом растений Вильгельмом Пфеффером (Wilhelm Pfeffer). По его мнению, если клеточная мембрана может быть уподоблена пленке при диализе, то содержимое клетки не будет рассеиваться в окружающую жидкость, в то время как сама мембрана останется проницаемой для воды. Пфеффер провел ряд экспериментов на моделях мембраны, сделанных из ферроцианида меди. Легко пропуская воду и с трудом пропуская различные растворенные вещества, модели функционировали схожим образом с диализными мембранами. С помощью искусственной полупроницаемой мембраны Пфеффер измерил осмотическое давление растворов сахарозы. На основе этих экспериментов Пфеффер впоследствии и развил современную теорию клеточных мембран (Pfeffer, 1877). Юлиус Бернштейн (1839-1917)
В 1902 году Юлиус Бернштейн опубликовал теорию, названную им "мембранной". В этой теории постоянную разность электрических потенциалов нервной или мышечной клетки в состоянии покоя, ранее известную как потенциал покоя или повреждения, он назвал "мембранным потенциалом". Согласно Бернштейну, мембранный потенциал является следствием проницаемости мембраны мышечных клеток для К+ и ее непроницаемости для Na+ и всех анионов. Согласно мембранной теории Бернштейна, потенциал покоя должен зависеть от концентрации внутриклеточного К+.Я. Вант-Гофф (1852-1911),
Вильгельм Оствальд (1853-1932)
Дальнейшее изучение осмотических явлений в растительных клетках датским ботаником Х. де Фризом (1848-1935) послужило фундаментом при создании физико-химических теорий осмотического давления и электролитической диссоциации датчанином Я. Вант-Гоффом и шведским ученым С. Аррениусом (1859-1922).
В 1888 году немецкий физико-химик В. Нернст (1864-1941) вывел уравнение диффузионного потенциала. В 1890 году немецкий физико-химик и философ В. Оствальд (1853-1932) обратил внимание на возможную роль мембран в биоэлектрических процессах.Арчибальд Хилл (1886- 1977)
Исследования этого ученого были сосредоточены на измерении тепла, которое выделяется во время мышечных сокращений и механической работы, а также на выяснении взаимосвязи полученных данных с биохимическими аспектами мышечной активности. В 1923 г. Хилл получил Нобелевскую премию в области физиологии и медицины (1922) "за открытия в области теплообразования в мышцах". Он поделил премию с Отто Мейергофом.Эдвард Конвей (1894-1968)
В 1941 г. Бойл и Конвэй (Boyle, Conway) выдвинули предположение о существовании трансмембранных каналов оптимального размер - достаточно больших, чтобы пропустить ион калия с его оболочкой из молекул воды, но слишком малых, чтобы сквозь них мог пройти ион натрия с его оболочкой. Мембрана должна была действовать как сито, пропуская малые ионы и удерживая большие.Алан Л. Ходжкин
(1914-1998)
В 1948 г. Алан Ходжкин предложил модификацию мембранной теории клеточных потенциалов, которую он назвал "ионной теорией". Ионная теория Ходжкина признает за ионами разную способность проникать в клетку. Ионная теория смогла численно объяснить происхождение не только потенциала покоя, но и потенциала действия. Ионная теория Ходжкина - это модификация мембранной теории Бернштейна, и в силу этого она основывается на том же допущении фундаментального характера: вода и К+ в клетке находятся в свободном состоянии.Эндрю Хаксли (1917)
Лауреат Нобелевской премии по физиологии и медицине. В 1963 году (совместно с Джоном Эклсом и Аланом Ходжкином) за открытия, касающиеся ионных механизмов возбуждения и торможения в периферических и центральных участках нервных клеток.Фриц Липман (1899-1986)
В 1941 Ф. Липман предположил, что основным источником энергии для метаболических реакций является аденозинтрифосфат (АТФ). Однако было непонятно, как АТФ высвобождает энергию. В 1945 Липман вместе с коллегами открыл коэнзим А, являющий катализатором, способствующим превращению фосфатных связей в другие формы химической энергии. В 1953 Липман стал лауреатом Нобелевской премии по физиологии и медицине за "открытие коэнзима А и его значения для промежуточных стадий метаболизма".Йенс Скоу (1918)
В 1997 году Скоу получил Нобелевскую премию по химии за открытие Na+-K+-АТФазы.Ганс Уссинг
Изучение функционирования электрогенных насосов.Питер Митчелл
(1920)
Научные интересы связаны с изучением направленности биохимических реакций в пространстве относительно определенных внутриклеточных ориентиров. Автор хемиосмотической теории окислительного фосфорилирования. Заложил основы новой отрасли науки - векторной биологии. Лауреат Нобелевской премии по химии (1978). Строение мембраны согласно мембранной теории:
В 1925 году Гортер и Грендел показали, что площадь монослоя липидов, экстрагированных из мембран эритроцитов, в два раза больше суммарной площади эритроцитов. Гортер и Грендел экстрагировали липиды из гемолизированных эритроцитов ацетоном, затем выпарили раствор на поверхности воды и измерили площадь образовавшейся мономолекулярной пленки липидов. На основе результатов этих исследований было сделано предположение, что липиды в мембране располагаются в виде бимолекулярного слоя. Это предположение подтвердили исследования электрических параметров биологических мембран (Коул и Кёртис, 1935 год): высокое электрическое сопротивление, порядка 107 Омм2 и большая электроемкость. Вместе с тем имелись экспериментальные данные, которые свидетельствовали о том, что биологическая мембрана содержит в своем составе и белковые молекулы. Эти противоречия экспериментальных результатов были устранены Даниелли и Давсоном, предложившими в 1935 году так сказать "бутербродную" модель строения биологических мембран, которая с некоторыми несущественными изменениями продержалась в мембранологии в течении почти 40 лет. Согласно этой модели, на поверхности фосфолипидного бислоя в мембранах располагаются белки (рис. 1).
Совокупность результатов, полученных физическими и химическими методами исследования (рентгеноструктурный анализ, электронная спектроскопия, методы ЯМР, ЭПР и др) дала возможность предложить новую модель строения биологических мембран - жидкостно-мозаичную (Сингер и Никольсон, 1972 год). Согласно Сингеру и Никольсону, структурную основу биологической мембраны составляет двойной слой фосфолипидов, инкрустированный белками (рис. 2). Липиды находятся при физиологических условиях в жидком агрегатном состоянии, это позволяет сравнить мембрану с фосфолипидным морем, по которому плавают белковые "айсберги". Одним из подтверждений жидкостно-мозаичной модели является и тот факт, что, как установлено химическим анализом, в разных мембранах соотношение между содержанием белков и фосфолипидов сильно колеблется: количество белков в миелиновой мембране в 2,5 раза меньше, чем липидов, а в митохондриях, напротив, белков в 2,5 раза больше, чем липидов, в то время как, согласно "бутербродной" модели, соотношение количества белков и липидов во всех мембранах должно быть одинаковым.
Жидкостно-мозаичная модель строения мембраны в настоящее время общепринята (рис. 2). Однако, как всякая модель, она дает довольно упрощенную и схематическую картину строения мембраны. В частности, обнаружено, что белковые "айсберги" не всегда свободно плавают в липидном море, а могут быть "заякорены" на внутренние (цитоплазматические) структуры клетки. К таким структурам относятся микрофиламенты и микротрубочки. Микротрубочки - полые цилиндры диаметром около 300 нм из особого белка тубулина играют, по-видимому, важную роль в функционировании клетки.
2. Фазовая теория. Основные положения:
2.1. ионы К+ связаны с белками;
2.2. вода клетки тоже связана с белками, цитоплазма- белковый гель.
Ученые, внесшие вклад в развитие фазовой теории:
Феликс Дужардин (1801-1860)2
Феликс Дужардин (Felix Dujardin, француз), первооткрыватель протоплазмы, названной Томасом Хаксли (Thomas Huxley, 1825-1895) "физической основой жизни": он видел в ней желеподобную субстанцию, а не обычный раствор. И для этого были веские основания: уже первые наблюдатели отмечали, что протоплазма, выдавленная из растительной клетки, не смешивается с водой и сохраняет целостность.Томас Грехем (1805-1869)
Томас Грехем (Thomas Graham), посвятивший всю жизнь исследованию диффузии, делает в 1861 г. следующий шаг, имевший принципиальное значение для развития альтернатив мембранной теории - вводит понятие коллоидного состояния вещества и приходит к выводу, что вода активно взаимодействует с веществами биологического происхождения, например, с желатиной, крахмалом и т.п. При этом она переходит в связанное состояние и значительно меняет свои свойства как растворитель по сравнению с обычной водой. Именно благодаря связанной воде, как он полагал, тонкие пластины, приготовленные из различных гелей, обладали свойством полупроницаемости.Отто Бючли,
Макаллум,
Мур, Роаф Отто Бючли (Otto Bütscli) был первым, кто в 1894 году высказал мысль, о том, что протоплазма является структурированной, организованной системой, а не гомогенным коллоидом и тем более не раствором. Для сохранения целостности такой протоплазмы, как он полагал, мембрана не требуется. В 1905 году Макаллум (Macallum), используя метод внутриклеточного осаждения K+ кобольтонитритом натрия (sodium coboltinitrite) впервые показал, что K+ локализован главным образом в А-дисках миофибрилл мышечных клеток.
В 1906 году Мур (Moore), Роаф (Roaf) и др. находят новые экспериментальные свидетельства связанного состояния внутриклеточного K+ и проводят аналогию между механизмами накопления клеткой K+ и кислорода эритроцитом.Мартин Фишер
(1879- 1962)
Начиная с 1907 и по 1938 год выходит серия работ Мартина Фишера (Martin H. Fischer) и его сотрудников, в которых обосновывается взгляд на протоплазму как на "соединение белка, соли и воды в гигантскую молекулу".Бундерберг-де-Йонг (1893-1977)
В 1929 году ввел понятие "коацервация" - расслоение коллоидной системы с образованием коллоидных скоплений (коацерватов) в виде двух жидких слоев или капель. Предложил объяснение структуры коацерватов и физического состояния воды в них. Согласно взглядам Бундерберг-де-Йонга почти вся вода коацервата является не обычной жидкой водой, а гидратной.Д.Н. Насонов
(1895-1957)
А.С. Трошин
(1912-1985)
В 1940 году выходит в свет монография Д.Н. Насонова и В.Я. Александрова "Реакция живого вещества на внешние воздействия", в которой впервые за многие годы давалась систематическая развернутая критика мембранной теории. Выдающийся цитолог, первооткрыватель функции аппарата Гольджи, Д.Н. Насонов разработал оригинальные цитологические методы, среди которых центральное место занимал метод исследования распределения между клеткой и средой органических анионов и катионов. Д.Н. Насонов пришел к выводу, что изменения в поглощении органических ионов покоящейся, возбужденной и поврежденной клеткой объясняются не изменением проницаемости клеточной мембраны, а связыванием этих ионов белками протоплазмы.
Учеником Д.Н. Насонова, А.С. Трошиным, была создана количественная сорбционная теория распределения между клеткой и средой неорганических ионов и нейтральных молекул (см. монографию "Распределение веществ между клеткой и средой" (Л.: Наука, 1985).)
Д.Н. Насонов рассматривал протоплазму как коллоидную фазу, несмешивающуюся с водой, обладающую особыми свойствами (поэтому это направление получило название фазовой теории) и с этих позиций дал последовательное и логичное объяснение многих проблем клеточной физиологии (см. монографию "Местная реакция протоплазмы и распространяющееся возбуждение", М.-Л., Изд-во Академии наук СССР, 1959). Будучи последовательным, он отрицал значение и даже само существование клеточной мембраны. Ене Эрнст (1895-1981)
Считал мембранную теорию ошибочной. С его точки зрения, К+ в клетке существует в неионизированной, недиссоциированной и негидратированной форме. Эрнст и его сотрудники показали, что хотя и NaCl, и желатин снижают относительное давление водяного пара, желатин в этом отношении во много раз эффективнее. Поэтому мышца лягушки больше напоминает желе, чем разбавленный раствор NaCl.Людвиг Эдельманн (Ludwig Edelmann)
Впервые показал, что изолированная из клетки белковая структура способна избирательно связывать K+ в присутствии Na+ без участия Na,K-насоса.Джеральд Поллак
Профессор Вашингтонского университета, город Сиэтл, штат Вашингтон, специалист в области биохимии и биофизики мышечного сокращения с мировым именем. Предлагает новый универсальный подход к анализу разнообразных процессов функционирования живой клетки, основанный на физических и химических свойствах клеточных структур.Гильберт Линг
Первые положения современной фазовой теории были высказаны Лингом в 1952 г. 10 лет спустя он издает обширную монографию "Физическая теория жизни: гипотеза ассоциации-индукции" (A physical theory of the living state: the associationinduction hypothesis. Waltham (Massachusttes): Blaisdell, 1962), в которой детально рассматривает все "за" и "против" фазовых представлений и дает объяснение со своих позиций основных феноменов клеточной физиологии. Последующие 20 лет исследований были подытожены в следующей монографии "В поисках физической основы жизни" (In search of the physical basis of life. New York: Plenum Press, 1984). В ней мы находим фазовые теории электрических потенциалов, окислительного фосфорилирования, мышечного сокращения, активного транспорта через эпителии, подходы к механизмам синтеза белка, роста и дифференциации, канцерогенеза. Дальнейшее развитие этих идей представлено в последующих монографиях Линга (A Revolution in the Physiology of the Living Cell. Krieger Publishing Company, Malabar, Florida, 1992, Life at the Cell and Below-Cell Level. The Hidden History of a Fundamental Revolution in Biology. Pacific Press, 2001, see site:
http://www.bioparadigma.spb.ru/hidden_history/ling_newbook.htm). Основные положения теории "ассоциации-индукции" (АИ) Гильберта Линга
1. Ключевую роль в процессах ассоциации играют белки. К явлениям ассоциации относятся: связывание белком воды, ионов и органических соединений. 2. Связывание клеточными белками воды превращает тело клетки в фазу, несмешивающуюся с окружающей водной средой. Это происходит благодаря тому, что связанная вода отличается от обычной своей структурой. Причиной тому - некоторое увеличение собственного дипольного момента молекулы воды, вызванное ее взаимодействием с диполями полипептидного остова белка, представляющими собой закономерное (в шахматном порядке) чередование положительных -NH- и отрицательных диполей -СО-, входящих в состав пептидной связи -СО-NH-, соединяющей остатки аминокислот в полимер (рис.3). Увеличение дипольного момента воды (ее дополнительная поляризация) в составе адсорбированной фракции ведет к очень важному результату: прочность водородных связей между белком и водой, с одной стороны, и между молекулами связанной воды, с другой, возрастает на 126 кал/моль. Именно это обстоятельство стабилизирует структуру связанной воды и придает ей такие свойства, которые определяют основополагающие свойства живой клетки. 3. Поляризация молекул воды, адсорбированных поверхностью белка, является условием для многослойной адсорбции воды. Поскольку адсорбирующая поверхность представляет собой геометрически правильное чередование положительно и отрицательно заряженных диполей, то первый слой адсорбированной воды также будет отличаться определенной структурой, а структура - условие для кооперативных взаимодействий. В силу своей поляризованности, молекулы воды первого слоя являются притягательными (энергетически выгодными) партнерами для взаимодействия с ними свободных молекул воды потому, что образуют с ними более прочные водородные связи. Образуется второй слой, затем третий и т.д. Согласно оценкам, достаточно 6 слоев, чтобы вся вода клетки оказалась связанной (это объясняется очень высокой концентрацией белков в ней - 100-400 мг/мл - что указывает на сравнительно небольшое расстояние между соседними белками). Кроме эффекта поляризации важным является пространственное соответствие между расположением диполей на белке и размером молекулы воды: между диполями белка должно укладываться определенное количество молекул воды. В настоящий момент принято, что только каждая третья молекула воды первого слоя непосредственно взаимодействует с диполями белка. Остальные удерживаются на своих местах за счет "поддержки" соседних молекул воды за счет взаимодействия хвост-голова. При нарушении рассматриваемого стерического соответствия адсорбция воды становится невозможной (рис.4). Рис. 3. Идеальная NP поверхность. Расстояние между парой соседних N и Р центров равно среднему расстоянию между двумя соседними молекулами воды в нормальной жидкой воде - 3.1 Å.
Рис. 4. Процесс организации молекул води вблизи поверхности белка. А - диполи воды притягиваются заряженными участками на поверхности белка. В - адсорбированные диполи вызывают адсорбцию еще большего количества диполей. С - дополнительно заряженные участки на поверхности белка расширяют и укрепляют дипольную сеть. 4. Белковый матрикс клетки в состоянии покоя связывает не только воду, но и ионы K+ в присутствии ионов Na+. Объяснение такой избирательности также является одним из центральных положений теории АИ. (Ионы K+ связываются, согласно Лингу, - и -карбоксильными группами, принадлежащими соответственно остаткам аспарагиновой и глутаминовой аминокислот. Изменение электронной плотности на любых функциональных группах белка рассматривается Лингом как универсальный механизм регуляции свойств белковой молекулы. Любые взаимодействия (а не только ковалентные), в которые вступает белок, оказывают влияние на характер распределения электронной плотности на его функциональных группах, важно только, чтобы эти изменения были значимыми для той физиологической роли, которую данный белок играет в системе внутриклеточных взаимодействий. Из всех веществ АТФ (аденозинтрифосфорная кислота) рассматривается Лингом в качестве главного регулятора электронной плотности на функциональных группах белка. Именно это соединение, присоединяясь к белку, "настраивает" его полипептидный остов на взаимодействие с водой, а карбоксильные группы - на взаимодействие с K+, а не Na+. В результате возникает ионо-водо-белковый комплекс, который можно назвать физиологическим атомом клетки потому, что он обладает всеми четырьмя фундаментальными свойства целой клетки (о которых речь будет ниже), т.е. представляет собой минимальную клетку. При таком подходе живая клетка является кооперативной системой, супрамолекулой, состоящей из физиологических атомов. АТФ при взаимодействии с белком заявляет о себе как акцептор электронов. АТФ оттягивает на себя электронную плотность с наиболее значимых функциональных групп - с карбонильных атомов кислорода полипептидного остова (более поляризуемых, чем диполь -NH-) и с карбоксильных групп в боковых цепях (Лингом предложен метод расчета сдвигов электронной плотности на функциональных группах) (рис.5). Рис. 5. Роль АТФ в функционировании клетки.
Под влиянием АТФ карбонильные атомы полипептидного остова обретают избирательность к воде, и она адсорбируется остовом белка. Поляризация молекул воды создает необходимые условия для многослойной адсорбции. Карбоксильные группы белка под влиянием АТФ обнаруживают избирательность к ионам K+ в присутствии Na+ и связывают его. K+ поступает из среды до полного насыщения центров связывания, имеющихся в клетке. Связанная внутриклеточная вода хуже растворяет Na+ и он вытесняется из клетки в среду. Сниженная растворяющая способность связанной воды объясняется более прочными водородными связями, которыми стабилизируется ее структура, поэтому энергетическая цена встраивания веществ в такую воду выше, чем в обычную. Так Линг объясняет одно из основополагающих свойств клетки: избирательно аккумулировать K+ и вытеснять Na+. Этот же принцип лежит в основе возникновения любого асимметрично распределения вещества между клеткой и средой: в клетке способно накапливать только то, что в ней адсорбируется, свободные компоненты - вытесняются из клетки согласно правилу размера: чем больше объем частицы, тем эффективней она вытесняется связанной водой. Поскольку речь идет о состоянии покоя, явления ассоциации исследуются в условиях диффузионного равновесия. Строение цитоплазмы с точки зрения фазовой теории (рис. 6, 7).
Рис. 6. Цитоплазма - переполненная средаРис. 7. Расположение белков в мембране клетки. Мембрана красной клетки крови была исследована электронно-микроскопическим методом замораживания-скалывания. Сколотая поверхность (F -fractured) содержит множество частичек, которые, вероятно, представляют собой белковые молекулы. Узкая полоса (Е - exterior) - это внешняя поверхность клетки. Область за пределами сколотой поверхности - О (outside). Авторы: Пинто да Силва и Брэнтон (Pinto da Silva and Branton, 1970).
Основные компоненты биологических мембран
Тема 1. Мембранные липиды
Липидные бислои образуются амфифильными молекулами. Амфифильными эти молекулы называют потому, что они состоят из двух частей, различных по своей растворимости в воде: полярной "головки", обладающей высоким сродством к воде, т. е. гидрофильной, и "хвоста", образуемого неполярными углеводородными цепями жирных кислот; эта часть молекулы обладает низким сродством к воде, т. е. гидрофобна (рис.1.1). Рис.1.1. Схематическое изображение строения молекулы фосфолипида. Липиды - низкомолекулярные органические вещества, которые извлекаются из клеток животных, растений и микроорганизмов неполярными растворителями, такими, как хлороформ, эфир, бензол. Долгое время считалось, что липидам принадлежит довольно скромная роль в жизнедеятельности клеток - служить формой депонирования запасов метаболического топлива, принимать участие в некоторых защитных реакциях и т.д. Но в последние годы выявилось кардинальное значение липидов как активных компонентов биологических мембран.
В качестве определяющего признака для первичной классификации липидов часто используется природа связующего звена, соединяющего между собой гидрофильный и гидрофобный участки молекулы. Таким связующим звеном являются многоатомные алифатические спирты, содержащие две или три гидроксильные группы. Липиды, построенные на основе глицерина
Более половины липидов, встречающихся в природе, относится к классу глицеролипидов, или глицеридов, все они являются производными трехатомного спирта глицерина.
В глицеролипидах гидрофобную часть молекулы образуют высшие жирные кислоты, соединенные сложноэфирными связями с двумя гидроксильными группами глицерина. В полярных глицеролипидах третья гидроксильная группа связана с гидрофильной головкой (рис. 1.2). Фосфатидилэтаноламин Глицерин Рис. 1.2 Строение молекулы фосфолипида
Липиды, построенные на основе сфингозина
В составе липидов биомембран обнаруживаются алифатические аминоспирты, известные под названием сфинголипидных оснований (рис. 1.3):
Рис. 1.3. Спирт сфингозин
Головки могут иметь самое разнообразное устройство, но для липидов мембран наиболее характерны два их типа: производные сахаров- гликолипиды или производные фосфорной кислоты - фосфолипиды. Следует заметить, что полярные головки всех липидных молекул либо заряжены отрицательно, либо нейтральны (несут одновременно и отрицательные, и положительные). Положительно заряженные головки не встречаются. Это чрезвычайно важное обстоятельство, так как суммарный заряд мембран решающим образом влияет на многие стороны поведения клеток.
Фосфолипиды различаются как составом жирных кислот, так и структурой характеристической группы. Жирные кислоты в свободном состоянии редко встречаются в составе мембран живых организмов. Они являются основными гидрофобными компонентами липидов и одним из важнейших факторов регулирования проницаемости мембран, т. к. влияют на поверхностные свойства фосфолипидов, белок - липидные, липид - липидные взаимодействия, а также на функционирование мембраносвязанных ферментов.
В настоящее время открыто свыше 200 жирных кислот, различающиеся длиной углеводородной цепи, числом и положением двойных связей, конформацией, а также наличием функциональных групп - окси -, кето - и др. Жирные кислоты, входящие в состав липидов высших растений и животных, имеют, как правило, четное число углеродных атомов - от 12 до 26 (чаще 16 - 18).
Для сокращенного обозначения жирных кислот используют символ C (m:n), где m - число углеродных атомов, n - число двойных связей в молекуле. Так, например, олеиновая кислота, содержащая 18 атомов C и 1 двойную связь, обозначается C(18:1).
Насыщенные кислоты C16 (пальмитиновая), C18 (стеариновая), C20 (арахиновая).
Ненасыщенные: C(18:1) олеиновая, C(18:2) - линолевая, C(18:3) линоленовая; оксикислоты C24 - CH3(CH2)21CH(OH)COOH - цереброновая; СH3(CH2)13CH=CH(CH2)6CH(OH)COOH (оксинервоновая).
Содержание ненасыщенных жирных кислот, как правило, в природных липидах выше, чем насыщенных. В зависимости от числа двойных связей в цепи жирных кислот подразделяются на моно- и ди-, три-, тетраеновые, объединяемые под названием полиеновых жирных кислот. Характеристические группы, встречающиеся в липидах биомембран представлены на рис. 1.4. В фосфатидилэтаноламине такой группой является остаток этаноламина. В других фосфолипидах такой группой может быть остаток холина, серина и другие полярные молекулы.
инозитгалактоза
Рис. 1.4. Характеристические (полярные) группы фосфолипидов
Основные классы липидов
Липиды принято разделять на две основные группы: нейтральные и фосфолипиды. Фосфолипиды в свою очередь подразделяются на 2 группы: глицерофосфолипиды (производные фосфатидной кислоты) и сфингофосфолипиды (производные церамида, сфингомиелины).
Нейтральные липиды
Нейтральные липиды являются производными высших жирных кислот, спиртов и альдегидов и включают: глицериды, плазмалогены, алкилдиацилглицериды, гликозилглицериды.
Глицериды- эфиры высших жирных кислот и глицерина.
В тех случаях, когда первый и третий атомы углерода этерифицированы разными жирными кислотами, второй углеродный атом становится ассиметричным и молекула L-глицерина оптически активна.
Алкильные производные глицерина выделены из неомыляемой фракции липидов различных клеток животных, растений и микроорганизмов в виде моноалкилдиацилглицеринов:
Плазмалогены характеризуются наличием в них винильноэфирной группировки Гликолипиды - содержат липидный и углеводный компоненты, соединенные ковалентной связью. Кроме структурных и метаболических функций, гликолипиды обладают также антигенными свойствами. В состав липидов входят два остатка жирных кислот на 1 моль липидов, один или два остатка ()-D-галактопиранозы и глицерин:
МоногалактозилглицеридДигалактозилглицерид
Фосфолипиды
Главными представителями фосфолипидов являются фосфоглицериды.
R1 и R2- радикалы жирных кислот,
X- полярная головка (спиртовый остаток).
Молекула фосфоглицеридов содержит полярную головку, связанную с C3 и два неполярных углеводородных хвоста, связанных с C2 и C1. Соединения такого тапа, содержащие сильно гидрофобные и сильнополярные группы называются амфипатическими. Полярные головки фосфолипидов могут нести отрицательный, либо одновременно отрицательный и положительный заряды. Последние обуславливают общий нейтральный заряд молекулы фосфолипида. Эти свойства очень важны, так как суммарный заряд мембран определяет функциональное состояние клеток и субклеточных структур.
Отдельные представители фосфолипидов
Фосфатидная кислота. В биологических мембранах фосфатидная кислота содержится в незначительных количествах и, по-видимому, особо важной роли как структурный компонент не играет, но является исходным продуктом для биосинтеза других фосфолипидов.
Фосфатидная кислота Фосфатидилхолин (лецитин) и фосфатидилэтаноламин (кефалин) составляют 50% клеточных фракций.
Фосфатидилхолин (лецитин) Фосфатидилэтаноламин (кефалин)
Фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин метаболически связаны друг с другом и являются главными структурно-функциональными компонентами биологических мембран.
Фосфатидилсерин
Фосфатидилглицерин
Рис. 1.5. Структурная формула кардиолипинаКак структурный компонент биологических мембран фосфатидилглицерин обнаружен в хлоропластах растений, отдельных видах микроорганизмов и клетках различных органов животных.
Дифосфатидилглицериды. Наиболее широко распространенным представителем этой группы фосфолипидов является - кардиолипин непременный компонент митохондриальных мембран, выделенный первоначально из сердечной мышцы (рис. 1.5). Кардиолипин распространен в растениях и некоторых бактериях. Сфинголипиды
Сфинголипиды- важнейшие компоненты биологических мембран клеток почти всех жизненно важных органов животных и человека, у которых аминогруппа сфингозиновых оснований ацилирована жирной кислотой. В природных липидах часто наиболее встречается аминоспирт сфингозин.
В зависимости от характера заместителя в положении 1 аминоспирта сфингозина различают: фосфорсодержащие сфинголипиды и гликосфинголипиды.
Фосфорсодержащие сфинголипиды- производные церамидов, у которых водород первичной гидроксильной группы замещен остатком фосфорной кислоты. Типичным представителем этой группы липидов являются сфингомиелины.
Сфингомиелин обнаружен в мембранах различных органов высших позвоночных, особенно много его в белом и сером веществе мозга. Накопление сфингомиелина в мозге и нервной ткани связано с процессом миелинизации. Высокое содержание его обнаружено в плазме крови (до 15% общего содержания липидов) и в мембранах эритроцитов (30-40%). Между сфингомиелинами плазмы крови и эритроцитами происходит обмен.
Гликосфинголипиды находятся в плазматических мембранах клеток различных органов, в крови, обладают иммунологическими свойствами и выполняют важную роль в обеспечении межклеточных взаимодействий.
К гликосфинголипидам относятся цереброзиды.
В цереброзидах мозга человека 98% сфинголипидов содержит углеродордную цепочку С(181). Жирная кислота цереброзидов может быть насыщенной или ненасыщенной, но, как правило, неразветлённая. В большинстве случаев она содержит 22 или 24 углеродных атома. Цереброзиды содержаться в тканях животных, растений и микрооганизмов.
Сульфатиды представляют собой сложные эфиры цереброзида и серной кислоты, причём остаток серной кислоты связан с третьим углеродным атомом галактозы.
Много сульфатидов в мозге, нейронах, некоторое количество - в глиальных клетках, почках, лёгких, сердце и селезёнке млекопитающих.
К ганглиозидам относятся гликосфинголипиды, содержащие один или несколько остатков сиаловой кислоты в олигосахаридной цепи. Сиаловыми кислотами называют N-ацетилъные производные нейраминовой кислоты, которая представляет собой продукт конденсации маннозамина и пировиноградной кислоты.
Сиаловая кислота
Наиболее часто встречается в ганглиозидах N-ацетилнейраминовая кислота (NeuNAc). Кроме сиаловых кислот, в состав ганглиозидов входят жирные кислоты (преимущественно насыщенные с 16-22 углеродными атомами), сфингозиновые основания (чаще всего С18- и С20 -сфингозины), гексозы (глюкоза и галактоза) и гексозамины (обычно N-ацетилгалактозамин). Олигосахаридная цепь ганглиозидов может содержать от 2 до 10 и более углеводных остатков. Впервые ганглиозиды были обнаружены в ганглиях, откуда и произошло их название. Наиболее богат ганглиозидами мозг, особенно его серое вещество. Позднее они были обнаружены и в других тканях (почка, селезенка, печень, легкие и т. д.). Известно, что ганглиозиды локализуются преимущественно в плазматических мембранах и, видимо, в значительной степени определяют контактное торможение, адгезию и электрофоретическую подвижность клеток. Исследованиями, проведенными в последние годы, показано, что ганглиозиды специфично связывают токсины ботулизма, столбняка, холеры, дифтерийной палочки, а также стрихнин, бруцин, тебаин, вероятно, серотонин и, возможно, играют определенную роль в их рецепции. Существует мнение, что ганглиозиды принимают деятельное участие в транспорте ионов через мембрану нервных клеток. Следует отметить, что малигнизация клетки, т. е. трансформация нормальной клетки в злокачественную, сопровождается изменением состава ганглиозидов, В клетках, трансформированных вирусами, и в клетках опухолей значительно увеличивается количество ганглиозидов с укороченной олигосахаридной цепью, что, видимо, тесно связано с изменением свойств клеточной поверхности.
Одноцепные липиды обычно не синтезируются клетками в значительном количестве, т.к. они разрушают мембраны. Примером может служить действие одноцепного липида - лизолетицина, который образуется из "двухвостых" фосфолипидов под влиянием змеиного яда. В присутствии лизолецитина происходит распад клеточных мембран, что и является одной из причин смерти при укусе змеи.
Тем не менее, существует разновидность одноцепных липидов, которые вырабатываются клетками, хотя и в небольших количествах. В их молекулах связывающим звеном является не глицерин, а более простые спирты - этиленгликоль и его аналоги (рис. 1.6).
Диольные фосфолипиды обладают в отношении клеточных мембран ещё более сильной разрушающей силой, чем лизолетицин. Однако в очень малых дозах они не повреждают мембрану, а лишь меняют её свойства, например, повышают её проницаемость для небольших молекул и ионов. Видимо, некоторые клетки используют это свойство - начинают интенсивно синтезировать диольные липиды в период быстрого роста и прекращают их производство, когда рост замедляется. Возможно, это связано с тем, что в период роста клеток их мембраны должны быть более лабильными и более проницаемыми.
Рис. 1.6. Строение одноцепного диольного липида
Стероиды - спирты со стерановым скелетом, к которым относятся как немембранные липиды (из них наиболее важны гормоны), так и компоненты мембран. В перечень мембранных компонентов стероидного ряда входят холестерин, ситостерин, тетрахименин. В тканях животных распространен холестерин. В растительных клетках холестерин не обнаружен, его заменяют фитостерины. У бактерий стероиды отсутствуют.
Холестерин в биомембранах
В наружных плазматических мембранах высоко содержание стеринов -холестерина у животных или эргостерина у растений. На первый взгляд это может показаться странным, но имеет логическое объяснение, поскольку стерины легко упаковываются в пустоты между молекулами фосфолипидов-так называемые дефектные зоны, образуемые в области двойных связей жирнокислотных цепей фосфолипидов, и тем самым способствуют возрастанию прочности мембранных cтpуктyp.
Рис. 1.7. Холестерин в мембране Молекула холестерина не содержит длинных прямых цепочек, а состоит из четырех колец; крайнее шестичленное кольцо соединено с полярной гидроксильной группой (ОН), а наиболее отдаленное от него пятичленное кольцо- с разветвленной углеводородной цепочкой из восьми атомов углерода. Таким образом, молекула холестерина, как и другие липидные молекулы, имеет полярную головку и вытянутую в длину неполярную часть. Поэтому она хорошо встраивается в липидные ансамбли, образующие клеточные мембраны. Особенно много холестерина содержится в наружных мембранах. Например, в плазматической мембране клеток печени холестерин составляет 30% всех мембранных липидов.
В последнее время получены новые интересные данные о роли холестерина в биологических мембранах. Было показано, что он влияет на подвижность углеводородных хвостов мембранных липидов. Если мембрана слишком плотная, так что существует опасность застывания цепей, холестерин ее как бы разжижает и цепи в его присутствии становятся более подвижными. Если мембрана слишком "жидкая", то холестерин ее уплотняет. Таким образом, в норме холестерин играет роль регулятора, обеспечивающего правильное агрегатное состояние липидной части мембраны, необходимое для ее нормальной работы.
Один из возможных способов взаимной укладки фосфолипида (кефалина) и холестерина показан на рис. 1.7. Предполагают, что неполярные цепи молекулы лецитина вытянуты, а ее полярная головка изгибается так, что образуется фигура, напоминающая трость. В образующуюся при этом полость помещается молекула холестерина. Некоторые исследователи оспаривают обоснованность этой модели и полагают, что молекулы холестерина плавают в мембране более или менее свободно, или что в мембранах имеются островки, состоящие из нескольких молекулярных комплексов холестерина с липидами.
В последнее время получены данные, проливающие некоторый свет на природу уплотняющего действия холестерина, обычно углеводородные хвосты фосфолипидов располагаются не перпендикулярно к плоскости мембраны, а под некоторым углом. В присутствии холестерина наклон хвостов становится меньше. Так угол между неполярными хвостами молекул лецитина и воображаемым прямым углом к плоскости мембраны, составляющий 24о, уменьшается на 10о. Поэтому каждая молекула лецитина занимает в присутствии холестерина меньшую площадь на поверхности мембраны, в результате чего происходит ее уплотнение (рис. 1.8).
Сам холестерин образует при комнатной температуре жидкие конденсированные монослои с очень низкой сжимаемостью, что позволяет предположить наличие перпендикулярной ориентации молекул относительно поверхности при всех поверхностных давлениях; средняя площадь на молекулу, определяемая ее углеводородной частью 38 Å2.
Холестерин изменяет разность потенциалов на поверхности раздела мембрана - раствор, благодаря чему изменяется распределение заряженных частиц в мембране, изменяется вязкость мембраны, что является причиной изменения скорости переноса ионов.
Рис. 1.8. Холестерин уплотняет бислой, состоящий из фосфатидилхолина (PC), увеличивая его толщину. Бислой, соcтоящий из сфингомиелина (SM), достаточно плотный, хвосты сфингомиелина уже оптимально стабилизированы, поэтому введение холестерина не оказывает никакого эффекта на толщину двойного слоя.
Пространственная структура липидов
По данным рентгеноструктурного анализа монокристаллов высших жирных кислот, насыщенные углеводородные цепи представляют собой зигзагообразные структуры, в которых атомы углерода находятся на равных расстояниях друг от друга и укладываются в два параллельных ряда (рис. 1.9). Угол между C-C связями превышает тетраэдрический (10928) и лежит в пределах 110- 114. При увеличении цепи на одно метиленовое звено ее общая длина возрастает на 0,127 нм.
В настоящее время пространственная структура фосфолипидов в различном агрегатном состоянии хорошо изучена с помощью таких методов, как рентгеноструктурный анализ, ЯМР спектроскопия. Теоретический анализ показал, что число возможных конформаций для фосфолипидных молекул, удовлетворяющих их оптимальной упаковке в мембране, весьма ограничено и относительное расположение жирнокислотных цепей в молекуле определяется прежде всего конформацией глицеринового остатка. В диацилглицерофосфолипидах его конформация должна быть такой, чтобы было возможно параллельное расположение углеводородных цепей и оптимальные гидрофобные взаимодействия между ними.
Полностью транс...ttt...Кинк первого порядка ...g+tg-Изолированная цис связьЦис- tg- Рис. 1.9. Стереоконфигурация жирных кислот.
Углеродные связи в молекулах жирных кислот имеют различную конформацию (рис. 1.9). По своей структурной конфигурации насыщенные жирные кислоты сильно отличаются от ненасыщенных. Насыщенные жирные кислоты могут принимать множество конфигураций вследствие высокой свободы вращения вокруг одиночных С-С связей. Энергетически наиболее выгодной является транс-конфигурация. Ненасыщенные жирные кислоты имеют жесткую структуру, поскольку вращение вокруг двойных связей невозможно. Они существуют либо в транс- либо в цис- конфигурации. Ненасыщенные жирные кислоты содержат двойные связи почти всегда в цис- конформации (рис. 1.9) транс- ненасыщенные жирные кислоты в природе почти не встречаются. Цис-конфигурация двойной связи обусловливает изгиб цепи под углом приблизительно 30. По этой причине цис-ненасыщенные жирные кислоты с одной двойной связью вызывают локальные возмущения бислоя. При этом длина такой цепи уменьшается, а занимаемый ею объем возрастает. В области локализации двойных цис-связей образуются изгибы (так называемая гош-форма). При повышении температуры тепловая подвижность жирнокислотных цепей приводит к спонтанному возникновению изгибов. Если изгибы, соответствующие гош-конформации, появляются на близлежащих участках жирнокислотной цепи, эта область может принимать вид петли или полости (кинк). В результате взаимопревращения транс- и гош-конформаций (так называемого транс-гош-перехода) кинки могут "скользить" вдоль цепи, обеспечивая перемещение их содержимого поперек мембраны. Таким образом, может осуществляться диффузия захваченной воды через гидрофобный бислой. При повышении плотности упаковки бислоя конфигурационная подвижность С-С связей ограничивается. В таком бислое подвижность цепей ограничена согласованными колебаниями или вращательной подвижностью около точки прикрепления жирнокислотных радикалов к полярной "головке" фосфолипида. В этой ситуации в бислое наиболее предпочтительны две конформации цепи: когда вся цепь находится в транс-конфигурации или когда имеется "двойной гош", то есть изгибы, возникающие на двух соседних участках цепи вследствие образования гош-конформации, компенсируют друг друга, и вся цепь в целом не имеет изгибов.
Принципы организации липидного бислоя
Наличие у молекул липидов двух частей- сильно полярной (головки) и неполярной (хвостов) имеет прямое отношение к их способности образовывать мембраны. Такое объединение молекул энергетически выгоднее, чем раздельное пребывание в воде. В воде липиды могут образовывать различные структуры. Это свойство амфифильных молекул называется полиморфизмом.
Структуры, образуемые липидами
1. Монослой 3.Замкнутые везикулы 2. Бислой 4.Цилиндрические (гексагоналные)структуры
Бислой представляет собой термодинамически наиболее выгодную форму ассоциации тех липидов, молекулы которых не способны образовывать в воде небольшие агрегаты мицеллярного типа. Возможность упаковки молекул в бислой, как и в случае мицелл, определяется прежде всего соотношением размеров полярной и неполярной частей молекулы. Как правило, бислой легко формируется липидами, у которых невелики различия между площадью, занимаемой полярной головкой, и поперечным сечением углеводородных цепей.
Ассиметрия бислоя
Характерная особенность биологических мембран - различный состав липидов по обе стороны бислоя. Известны два механизма, обеспечивающих асимметричное распределение фосфолипидов в мембране. Один из них связан с термодинамической вероятностью распределения в соответствии со стереоконфигурацией их молекул.
При приготовлении липосом из смеси фосфолипидов их бислой будет характеризоваться несимметричным распределением компонентов. Во внешней части бислоя оказывается больше фосфатидилхолина, во внутренней - фосфатидилэтаноламина: это обстоятельство облегчает образование изгибов, формирует градиент гибкости. Способность бислоев формировать изгибы зависит от относительных размеров полярных головок и неполярных хвостов составляющих его фосфолипидов. Липиды с длинными хвостами и большими головками являются цилиндрическими по форме; липиды же с маленькими головками имеют форму конуса (Рис. 1.10, b).
Рис. 1.10. Способность бислоя к формированию изгибов зависит от строения составляющих его липидов. В результате двойные слои, составленные из цилиндрических липидов являются относительно плоскими, тогда как слои, состоящие из большого количества липидов, имеющих форму конуса, изгибаются. Этот эффект влияния состава липида на искривление двойного слоя может играть роль в формировании высоко изогнутых мембранных ям и волдырей, внутренних мембранных пузырьков и специализированных мембранных структур типа микроворсинок. Различие в поведении липидов легко объяснить, исходя из равновесного распределения молекул с различными жирнокислотными остатками в сильно искривленном бислое. Благодаря изгибу ламеллы средняя площадь на цепь для молекул внутреннего слоя оказывается больше, чем для молекул наружного монослоя. Поэтому для фосфатидилхолина, имеющего две ненасыщенные углеводородные цепи более "выгодно" находится во внутреннем, а не в наружном монослое, и переход из наружного слоя во внутренний происходит быстрее
Второй механизм реализуется за счет различий в составе среды по обе стороны бислоя в нативной клетке. С внеклеточной стороны мембрану омывает среда с высоким содержанием Na+ и Ca2+, со стороны цитоплазмы мембрана контактирует с Mg2+ и K+. Различия ионного состава вне- и внутриклеточной среды вносят вклад в создание и под- держание изгибов.
Асимметрия бислоя обеспечивается ферментами липидного обмена и липид-переносящими белками (белок-липидные комплексы приобретают гидрофильную природу). Виды подвижности липидов
Молекулы фосфолипидов способны к нескольким видам подвижности в бислое (рис. 1.11):
Рис. 1.11. Виды подвижности липидов 1. изменение ориентации полярных голов; 2. латеральное движение - перемещение в одном ряду бислойной структуры;
3. колебания ацильных цепей; 4. образование кинков и их перемещение вдоль ацильных цепей (в поперечном направлении); 5) ротационная подвижность (вращение вокруг длинной оси). Скорость вращательной диффузии для компонентов различных мембран неодинакова ;
6) переход с одной стороны бислоя на другую (по типу флип-флоп); 7) выход из бислоя. Метод спиновых меток для изучения подвижности компонентов мембраны
Суть метода спиновых меток заключается в следующем. В исследуемую систему вводят в качестве спиновых зондов парамагнитные молекулы, которые дают характерные сигналы электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Сигналы ЭПР спиновых меток зависят от их молекулярной подвижности и физико-химических свойств ближайшего окружения. Поэтому, наблюдая за сигналами ЭПР молекулярных зондов, можно изучать структурные характеристики исследуемой системы и динамику происходящих в ней молекулярных процессов. В качестве спиновых меток обычно используют стабильные нитроксильные радикалы. Все молекулы спиновых меток, несмотря на разнообразие их химического строения, как правило, содержат одинаковый парамагнитный фрагмент - химически стабильный нитроксильный радикал (>N-O*). На этом радикале локализован неспаренный электрон, служащий источником сигнала ЭПР.
С помощью спиновых меток были изучены различные искусственные и биологические мембраны. Один из наиболее важных результатов этих исследований заключается в том, что удалось выявить взаимосвязь между физическим состоянием липидов и функциональными свойствами мембран.
Спиновые метки оказались одним из самых удобных инструментов для изучения структурно-функциональных свойств искусственных и биологических мембран. Для этой цели, чаще всего, используют жирорастворимые спиновые метки, которые сравнительно легко встраиваются в мембрану и поэтому становятся чувствительными индикаторами происходящих в них структурных изменений. На рис. 1.12 показано схематическое расположение в бислойной липидной мембране двух таких меток - спин меченых производных стеариновой кислоты. Отрицательно заряженная карбоксильная группа СОО- стеариновой кислоты не проникает внутрь мембраны и удерживается вблизи ее поверхности в то время как электронейтральный жирорастворимый хвост молекулы оказывается втянутым в липидный бислой мембраны. Используя набор спиновых меток, у которых парамагнитные фрагменты "пришиты" к различным участкам стеариновой кислоты, можно зондировать строение липидного бислоя на разной глубине.
Рис. 1.12. А- схема расположения в мембране и спектры ЭПР липидорастворимых спиновых меток - производных стеариновой кислоты; Б- схематическое изображения профиля упорядоченности углеводородных цепей липидов в мембране. 1. Изучение с помощью ЭПР перемещений фосфолипидных молекул между поверхностями бислоя
Исследование перескока фосфолипидов в мембранах пузырьков было выполнено следующим образом. Прежде всего, в молекулу фосфатидилхолина была введена нитроксильная метка. Затем меченые молекулы смешали с обычными молекулами фосфатидилхолина и использовали эту смесь для образования бислойных пузырьков. Рис. 1.13, А иллюстрирует эксперимент. После обработки бислоя аскорбиновой кислотой при 0С парамагнитные меченные молекулы на наружной стороне бислоя переходят в непарамагнитное состояние. Молекулы, которые находятся на внутренней поверхности мембраны, недоступны для аскорбиновой кислоты, и их спектр ЭПР в ее присутствии не изменяется. Таким образом, после устранения всех парамагнитных меток на наружной стороне мембраны скорость уменьшения парамагнитизма бислоя становится мерой скорости, с которой фосфолипидные молекулы перескакивают из внутренней стороны мембраны на наружную. Спектр ЭПР бислоя, необработанного аскорбиновой кислотой (рис. 1.13, Б) имеет значительно большую интенсивность, чем спектр бислоя после кратковременной обработки при 0С (рис. 1.13, В).
Дальнейшая обработка пузырьков аскорбиновой кислотой не приводит к изменению интенсивности сигнала (рис. 1.13, Г). Этот факт означает, что молекулы аскорбиновой кислоты не приникают внутрь пузырька и что скорость перескоков при 0С чрезвычайно мала.
Рис. 1.13. А - схема опыта, основанного на обработке аскорбиновой кислотой бислойных пузырьков, состоящих частично из парамагнитных молекул фосфатидилхолина. Б -Спектр ЭПР до обработки аскорбиновой кислотой; относительной увеличение равно 1. В - Спектр после кратковременной обработки аскорбиновой кислотой; относительное увеличение равно 6. Г - Спектр после дальнейшей обработки аскорбиновой кислотой; относительной увеличение равно 6.
Была измерена скорость перехода фосфолипидов с внутренней поверхности мембраны на наружную после повышения температуры системы до 30С. Для определения числа перескоков за единицу времени периодически охлаждали систему до 0С, обрабатывая ее аскорбиновой кислотой и снимая спектры ЭПР, с тем, чтобы оценить число перескоков, происходящих за данный отрезок времени при 30С. Так как число имеющихся парамагнитных центров прямо пропорционально интегральной интенсивности спектра ЭПР, и можно определить число молекул на внутренней поверхности бислоя. В результате было установлено, что полупериод жизни для молекул, совершающих флип-флоп переходы, составляет при 30С около 6 часов.
То обстоятельство, что липиды не увлекаются флип-флопом, имеет глубокий биологический смысл и сыграло, возможно, решающую роль, когда природа в качестве обязательных компонентов мембран выбрала именно липиды. Ведь для выполнения одной из основных своих функций- постоянно поддерживать особые условия во "внутреннем пространстве" - всякая мембрана обязательно должна быть ассиметричной, иначе она бы превратилась в простую разделительную стенку. Если бы мембраны были построены из быстро кувыркающихся молекул, то они не могли бы сохранять в течение длительного времени свою ассиметричную структуру.
2. Использование спектров ЭПР для изучения латеральной диффузии в мембранах
Спинмеченные липидные молекулы вводят в одно место бислоя. Эти молекулы, диффундируя в его плоскости, через некоторое время распределяются равномерно по всему бислою (рис. 1.14). Рис. 1.14. Схема опыта по определению скорости латеральной диффузии (А, Б). С- Спектры ЭПР спин-меченных пузырьков, снятые через разное время после начала латеральной диффузии.
Когда меченые молекулы сконцентрированы в одном месте бислоя, между ними возникают сильные обменные спиновые взаимодействия. Они порождают довольно размытый спектр ЭПР. По мере того как молекулы в процессе диффузии расходятся, обменные спиновые взаимодействия уменьшаются, и возникает совершенно другой спектр. После установления равномерного распределения получаем спектр нитроксильного радикала с тремя максимумами (рис. 1.14, С).
В начале эксперимента (t=0) меченые молекулы фосфатидилхолина сконцентрированы в одном месте, и наблюдается широкий спектр; в ходе диффузии начинают проявляться три линии, и через 40-50 часов становятся четко различимы все особенности спектров взаимодействующих молекул.
Эти данные можно использовать для получения грубой оценки коэффициента диффузии D. Среднеквадратичное расстояние, на которое перемещается диффундирующая частица за время t, равно . при 25С. Это соответствует частоте парных перестановок соседних молекул около .
3. Флуоресцентный метод изучения латеральной диффузии
Эксперименты по восстановлению флюоресценции после "фотоотбеливания" (рис. 1.15) могут дать информацию о движении белков и липидов в пределах внешнего монослоя мембраны. Флуоресцентный реагент равномерно связывается с определенными мембранными липидами или белками. Затем фокусируют лазерный свет на маленькой области поверхности, безвозвратно отбеливая связанный реактив, уменьшая, таким образом, флюоресценцию в освещенной области. Через некоторое время флуоресценция обесцвеченной области увеличивается. Степень восстановления флуоресценции в обесцвеченной области пропорциональна фракции помеченных молекул, которые являются мобильными в мембране (рис. 1.15, b). Поскольку степень восстановления флуоресценции пропорциональна количеству диффундирующих меченных молекул, то можно легко рассчитать коэффициент латеральной диффузии белка или липида в мембране.
Рис. 1.15. Эксперименты по изучению латеральной диффузии белков и липидов [See Y. I. Henis et al., 1990, J. Cell Biol., 111,1409.]
Результаты исследования с меченными флуоресцирующим реагентом фосфолипидами показали, что, в плазматической мембране фибробласта, все фосфолипиды свободно перемещаются в пределах 0.5м (- micro-10-6) и не могут распространиться на более длинные расстояния. На основании полученных данных можно предположить, что богатые белком области плазматической мембраны, протяженностью приблизительно 1m, отделяют богатые липидами области. Фосфолипиды свободно передвигаются в пределах такой области, но не от одной богатой липидом области до смежной. Кроме того, скорость латеральной диффузии липидов в плазматической мембране почти на порядок меньше скорости липидов в чистом фосфолипидном бислое. Константы диффузии составляют и для плазматической мембраны и двойного бислоя липидов соответственно. Это различие предлагает, что липиды могут быть сильно связаны с интегральными белками мембран.
Модельные мембранные системы
Для исследования мембранных процессов на молекулярном уровне часто приходится работать с изолированными мембранами определенного типа. Выделить мембраны из клеток дело очень сложное и хлопотливое. Еще труднее поддерживать изолированные мембраны в исправном рабочем состоянии, слишком они хрупкие и неустойчивые. Кроме того, любая биологическая мембрана - сооружение очень сложное, в котором одновременно идут многочисленные взаимосвязанные процессы.
Отсюда возникло стремление создавать искусственные, хотя и сильно упрощенные, модели мембран и использовать их для исследования того или иного мембранного явления. Сравнивая свойства таких искусственных мембран (для которых точно известны и химический состав и молекулярная организация) со свойствами живых биологических мембран, можно получить представление о строении последних.
Монослой на границе раздела фаз
Поведение различных липидов в водной среде определяется соотношением гидрофильных и гидрофобных сил. Этими несколько неопределенными понятиями обычно обозначают всю совокупность нековалентных взаимодействий между молекулами, обеспечивающих с одной стороны максимальный контакт полярных участков с водой (в пределе этого простого растворения ), а с другой стороны - контакт углеводных участков друг с другом.
Большинство нейтральных липидов, имеющих очень небольшую полярную часть (по сравнению с углеводородной) или вообще ее не имеющих, практически не взаимодействуют с водой (образуют отдельную фазу). Вещества с большой полярной головой (лизолецитин, некоторые ганглеозиды) достаточно хорошо растворимы в воде и только при концентрациях ≈ 0,1мМ начинают объединяться в лабильные мицеллы.
Фосфо- и гликолипиды представляют собой как бы "золотую середину" между этими крайними случаями. Благодаря длинным углеводородным цепям они в мономерной форме очень плохо растворимы в воде и образуют агрегаты при очень низких концентрациях (10-8-10-10 М). В то же время большие полярные "головы" стремятся максимально контактировать с водой, определяя структуру образуемых агрегатов. Соотношение размеров полярной и неполярной частей молекул (их геометрия) у этих липидов таково, что оптимальной формой их агрегирования в широкой температурной и pH-области является биомолекулярный слой.
Большинство липидов в мономерной форме практически нерастворимо в воде, однако хорошо растекается по границе вода - воздух в виде мономолекулярного слоя. Такие слои являются хорошей моделью для изучения упаковки молекул в мембранном липидном биослое.
Монослой можно получить с помощью специальной установки, получившей название "весы Ленгмюра" (рис. 1.16). Липидные изомеры в монослое упакованы одинаковым способом: полярные части молекул погружены в водную фазу, а углеводородные части направлены в воздух или погружены в органический растворитель.
Монослой представляет собой как бы разрезанный пополам участок клеточной мембраны, состоящий из бимолекулярного слоя липидов. С помощью специального прибора можно точно измерить площадь мономолекулярной пленки. Зная молекулярный вес вещества, из которого построена пленка, легко рассчитать, какую площадь занимает каждая молекула. Эти измерения показали, что площадь молекулы липида на поверхности воды зависит от количества двойных связей в неполярных цепях липидов.
Рис. 1.16. Получение монослоя
Чем больше число двойных связей, тем больше эта площадь, и тем больше, следовательно, расстояние между полярными головками двух соседних липидных молекул. От этого зависит, в свою очередь плотность слоя и его проницаемость (чем больше двойных связей, тем больше проницаемость). Кроме того, расстояние между соседними полярными головками оказывает значительное влияние на адсорбцию различных ионов на поверхности ме6мбраны и на электростатическое взаимодействие липидов с мембранными белками. С помощью опытов, проведенных с мономолекулярными пленками, оказалось возможным количественно измерить это влияние и изучить его зависимость от молекулярного строения липидов. С другой стороны, наличие ионов металлов (особенно ионов Ca2+) в свою орчередь сильно влияет на расстояние между липидными молекулами и на физические свойства поверхности пленки.
Мономолекулярные пленки можно приготовить из смесей различных липидов и использовать их для исследования взаимного влияния липидных молекул в мономолекулярном слое. Этот подход широко использовали для выяснения вопроса о том, какую роль играет в мембране холестерин.
Удалось "посадить" на липидный слой некоторые ферменты и исследоватьих работу на границе раздела фаз. Такие опыты дали возможность установить зависимость активности ферментов от плотности упаковки липидных молекул в пленке и от ее поверхностного заряда.
Мономолекуляным пленкам как моделям клеточных мембран присущи два принципиальных недостатка. Во-первых, пленки находятся на границе между водой и воздухом, тогда как клеточные мембраны всегда разделяют два пространства. Во-вторых, мономолекулярные пленки непригодны для исследования проницаемости и ряда других свойств мембран.
Бислойные липидные мембраны
Изучение физических свойств липидного слоя мембран осуществляется преимущественно на двух видах искусственных мембранных структур, образованных синтетическими фосфолипидами или липидами, выделенными из биологических источников: липосомах и бислойных липидных мембранах (БЛМ). Для приготовления БЛМ (рис. 1.17) в стаканчик с раствором электролита помещают второй, тефлоновый стаканчик, в стенку которого сделано отверстие, диаметром около 1 мм. В стеклянный стакан (1) помещают раствор электролита (2) и опускают тефлоновый сосуд 3 с отверстием в стенке (4). В отверстии формируют БЛМ (рис. 1.17, 1.18) следующим образом. Рис. 1.17. Приготовление бимолекулярных липидных мембран (БЛМ).
Рис. 1.18. Образование БЛМ в отверстии в стенке тефлонового сосуда: a - вносим с помощью капилляра (4) каплю раствора фосфолипида в гептане (5) в отверстие в стенке сосуда (3). b - капля закрывает просвет отверстия. c - постепенно растворитель уходит и образуется БЛМ.
d - БЛМ при очень большом увеличении С помощью капилляра в отверстие вводят маленькую каплю раствора фосфолипида в жидком углеводороде, гептане или гексане. Молекулы фосфолипидов собираются на поверхности капли таким образом, что полярные головки молекул обращены в водную среду, а гидрофобные хвосты - внутрь капли.
Постепенно растворитель уходит из капли и улетучивается, а капля превращается в липидную пленку. В такой пленке полярные головки фосфолипидов обращены в водную фазу, а неполярные углеводородные цепи жирных кислот сливаются в сплошную вязкую фазу во внутренней части липидной мембраны. По многим свойствам эта пленка сходна с липидным слоем биологических мембран.
Если липосомы широко используются для изучения таких свойств липидного слоя мембран как микровязкость (методом флуоресцентных и спиновых зондов), фазовые переходы в липидах (методом микрокалориметрии) и химические реакции в липидном слое, то БЛМ идеально подходит для изучения ионной проницаемости путем измерения электрической проводимости мембраны и образующихся на ней потенциалов. Конечно, БЛМ не могут воспроизводить сложные функции клеточной мембраны, поскольку в них нет нужных для этого белков. Но, простейшие задачи, например разделение двух растворов, им, несомненно, под силу. Проверить такую способность служить барьером можно измеряя электрическое сопротивление БЛМ. Оказалось, что сопротивление БЛМ очень велико: оно равно примерно 107-108 Ом·см2. Заметим, что слой раствора электролита такой же толщины (например, KCl в концентрации 0,01 моль/л) имел бы сопротивление всего 10-4 Ом·см2. Биологическая мембрана по своему составу и строению сложнее описанного выше липидного бислоя. БЛМ является идеальной матрицей, на которой можно последовательно реконструировать и изучить всевозможные мембранные системы. Сама по себе БЛМ открывает огромные возможности для изучения тех свойств мембран, которые обусловлены прежде всего липидным матриксом. Например, можно исследовать электрохимические свойства границы раздела БЛМ - раствор электролита, строение двойного электрического слоя, адсорбцию заряженных частиц, изучить механические свойства системы, устойчивость бислоев в электрических полях и механизм их разрушения. Наконец, система двух БЛМ оказалась особенно продуктивной для изучения молекулярного механизма слияния мембран.
Липосомы
Липосомы -липидные везикулы, искусственно получаемые частицы, которые образованы одним или несколькими концентрическими замкнутыми липидными бислоями; внутренний водный объем липосом изолирован от внешней среды.
В зависимости от размера частиц и числа образующих их липидных слоев различают следующие липосомы (рис. 1.19):
1. Малые моноламелярные, образованные одиночным липидным бислоем (диаметр 20-50 нм);
2. Крупные моноламелярные, образованные также одиночным бислоем ((диаметр 50-200 нм и выше);
3. Многослойные (мультиламелярные), насчитывающие несколько десятков и даже сотен липидных бислоев.
Рис. 1.19. Виды липосом
Рис. 1.20. Способы включения различных веществ в липосомы. Водорастворимые вещества включаются во внутренний водный объем липосом.
Для приготовления липосом используют фосфолипиды. Многослойные липосомы легко образуются при встряхивании водной дисперсии набухшего липида. При этом образуется смесь липосом с широким распределением частиц по размерам. Расстояние между соседними бислоями составляет 2-3 нм, но может возрастать до 20 нм и более в случае заряженных бислоев. На 1 моль липида многослойные липосомы содержат 1-4 л воды. Можно сначала высушить раствор фосфолипидов в органическом растворителе (например, хлороформе) в пробирке, добавить в пробирку водный раствор и хорошенько потрясти пробирку. липиды переходят в водный раствор в виде многослойных липосом. Чтобы получить малые моноламелярные липосомы, спиртовой раствор фосфолипидов впрыскивают в большой объем водного раствора. Фосфолипиды, нерастворимые в воде, образуют мелкие пузырьки, стенки которых состоят из одного липидного бислоя. Однослойные липосомы получают также из многослойных при обработке их ультразвуком. Суспензию липосом обычно используют для изучения физических свойств липидного бислоя как вязкость, поверхностный заряд или диэлектрическая проницаемость, а также для изучения проницаемости для незаряженных молекул. Они пригодны для изучения пассивного транспорта ионов и малых молекул через липидный бислой. Включением мембранных белков в липидный бислой получают так называемые протеолипосомы, которые используют для моделирования разнообразных ферментативных, транспортных и рецепторных функций клеточных мембран. Липосомы используют также в иммунологических исследованиях, вводя в них различные антигены или ковалентно присоединяя к липосомам антитела. Они представляют собой удобную модель для изучения действия на мембраны многих лекарственных средств и других биологически активных веществ. Во внутренний водный объем липосом можно включать лекарства, пептиды, белки нуклеиновые кислоты (рис. 1.20), что создает возможность практического применения липосом в качестве средства доставки разных веществ в определенные органы и ткани.
Тема 2. Белки биомембран
Весовое соотношение белок/липид колеблется в пределах от 1/4 до 4/1. Белки обуславливают специфичность, а специфичность в свою очередь является отличительным признаком мембран того или иного типа.
Мембранные белки по биологической роли можно разделить на три группы: обладающие каталитической активностью (ферменты), специфически связывающие те или иные вещества (рецепторные белки) и неактивные (структурные) белки.
Ферментами называют белки, ускоряющие те или иные биохимические реакции. Почти каждая реакция в клетке катализируется своим особым ферментом, поэтому число различных ферментов в каждой клетке очень велико. Некоторые из ферментов работают, будучи растворенными во внутриклеточной жидкости (цитоплазме), другие прикреплены к тем или иным мембранам. Эти ферменты распределены внутри клетки не хаотически, а строго определенным образом, составляя связанные между собой ферментные комплексы. Как правило, мембранные ферменты работают исправно только тогда, когда они находятся в контакте с липидами. По-видимому, активирующее действие липидов на мембранные ферменты может быть двояким. Во-первых, в присутствии липидов может меняться форма молекулы мембранного фермента, так что его активный центр становиться доступным для субстрата. Во-вторых, липиды могут играть роль организатора ансамбля или конвейера, состоящего из многих ферментов. Молекулы мембранных ферментов, как и других белков мембран, содержат большие неполярные гидрофобные участки. Поэтому в водной среде они слипаются, большая часть активных центров оказывается закрытой и ферментная активность резко падает. В присутствии липидов мембранные ферменты самоорганизовываются в липидно-белковые комплексы и их ферментная активность может проявиться в полной мере. Для нормальной работы мембранных ферментов чрезвычайно важно, чтобы окружающие их липиды находились в жидком агрегатном состоянии.
Рецепторными белками называют белки, специфически связывающие те или иные низкомолекулярные вещества. При связывании сами рецепторные белки обратимо меняют свою форму. Эти изменения запускают внутри клетки ответные химические реакции. Таким образом клетка принимает различные сигналы, поступающие из внешней среды, и отвечает на них.
Структурные мембранные белки лишены ферментативных свойств и в химическом отношении мало изучены. Их исследование затрудняется главным образом двумя обстоятельствами. Во-первых, структурные белки "немы", т.е. не обладают специфической ферментативной активностью, на основании которой можно было бы судить об их присутствии или о степени очистки. Во-вторых, структурные белки отличаются тем, что в их молекулах имеются обширные гидрофобные участки. Наличие их, с одной стороны, заставляет молекулы мембранных белков объединяться в водной среде в большие, трудно расщепляемые агрегаты. С другой стороны, благодаря своим гидрофобным участкам структурные белки легко объединяются с липидами, образуя разнообразные липидно-белковые ансамбли - так называемые липипротеины. Роль структурных белков не ограничивается лишь функцией остова, на котором крепятся липиды и ферменты. Известно, например, что структурные белки могут влиять на работу ферментов и взаимодействуют со многими низкомолекулярными соединениями, в том числе с АТФ. Некоторые исследователи полагают, что они являются также и организаторами многих сложных процессов, протекающих в клетке.
Еще одна разновидность белков - важных компонентов поверхности клеток-гликопротеины. Гликопротеины - белковые молекулы, содержащие углеводные (сахарные цепочки. Структура одного из таких гликопротеинов показана на рис. 2.1. Сахара, составляющие углеводные цепочки гликопротеинов, могут иметь разнообразную структуру. Обычно в состав молекулы гликопротеинов входят также аминопроизводные сахаров. Прикрепление углеводных цепочек к остову белковой молекулы осуществляется в пузырьках и цистернах аппарата Гольджи. По-видимому, роль гликопротеинов в жизни клетки очень многообразна, но пока еще мало выяснена. Известно, что некоторые из них играют роль ферментов, другие обладают гормональной активностью. Предполагают, что одно из назначений гликопротеинов - обеспечивать белкам, синтезированным в клетке, возможность прохода через клеточную мембрану в окружающую среду. Гликопротеины, расположенные на поверхности клеток, вероятно, отвечают за такие важные процессы, как взаимное распознавание клеток. Гликопротеины, находящиеся на поверхности эритроцитов, определяют группу крови людей. Предполагают также, что от структуры гликопротеинов зависит подвижность клеточной оболочки и многие другие свойства поверхности клеток.
Рис. 2.1. Структура гликопротеина. Он состоит из белкового остова (справа), к которому присоединены сахарные цепочки. Длина и состав этих цепочек может варьировать. Заштрихованными фигурами обозначены радикалы аминокислот.
Взаимодействия белок-липид
Гидрофобные белки благодаря особенностям своей структуры легко встраиваются в фосфолипидный бислой. Для этого необходимо, чтобы температура среды была выше критической температуры для данного бислоя.
Взаимодействие белка с мембраной осуществляется в несколько стадий. Сначала происходит адсорбция белка на поверхности бислоя. Это изменяет конформацию белковой глобулы и индуцирует возникновение гидрофобного контакта между белком и ацильными цепями фосфолипидов. Затем белок внедряется в бислой. Глубина внедрения зависит от силы гидрофобных взаимодействий и от соотношения гидрофобных и гидрофильных областей на поверхности белковой глобулы.
Гидрофильные области белка взаимодействуют с примембранным слоем по одну или обе стороны мембраны. Таким образом, белковая молекула фиксируется в бислое с помощью взаимодействий двух типов - электростатических (на уровне полярных голов фосфолипидов) и гидрофобных (в толщине бислоя).
При формировании третичной структуры белковая молекула стремится занять наиболее компактный объем, защищая от водной атаки гидрофобные группы гидрофильными аминокислотными радикалами. При недостатке собственных гидрофильных групп у белковой молекулы возникает притяжение к гидрофобным мембранным структурам, куда она и встраивается после синтеза на рибосомах. Этому обстоятельству способствует то, что рибосомы тесно связаны с внутриклеточными мембранами. Экспериментальные данные свидетельствуют, что белковые молекулы, синтезируемые на рибосомах, начинают встраиваться в мембрану, к которой прикреплена рибосома, параллельно с наращиванием их первичной структуры.
Мембранные белки могут быть разделены на три группы на основании природы взаимодействий белка с мембраной: интегральные, якорные ("поставленные на якорь" молекулой липида) и периферические (рис. 2.2).
Рис. 2.2. Различные способы прикрепления мембранных белков к мембране: 1.- связывание с интегральными белками (сукцинатдегидрогеназа); 2.- электростатическое связывание с бислоем (миелиновый основной белок); 3. - гидрофобное связывание, но практически без погружения в бислой (пируватоксидаза E.coli); 4.- заякоривание с помощью короткого концевого сегмента (цитохром b5); 5.- одиночный трансмембранный сегмент (гликофорин); 6. множественные трансмембранные сегменты (лактозопермеаза); 7. -заякоривание с помощью ковалентносвязанного липида (щелочная фосфатаза эукариот).
Интегральные мембранные белки, также называемые трансмембранными белками, охватывают двойной липидный слой и построены из трех сегментов. Цитозольные и экзоплазматические домены имеют гидрофильные внешние поверхности, которые взаимодействуют с водными растворами с обеих сторон мембраны. Эти области напоминают другие растворимые в воде белки по их аминокислотному составу и структуре. Напротив, область, локализованная в мембране, имеющая толщину порядка 3 нм, содержит много гидрофобных аминокислот, боковые цепи которых направлены наружу и взаимодействуют с углеводородным ядром двойного слоя фосфолипидов. Во всех трансмембранных белках, исследованных до настоящего времени, область, локализованная в мембране, состоит из одной или нескольких -спиралей или складчатых -тяжей. Кроме того, многие трансмембранные белки являются гликопротеинами. Неизменно эти сахарные цепи локализованы в экзоплазматических доменах.
"Якорные" мембранные белки связаны ковалентно с одной или несколькими молекулами липида. Цепь самого полипептида не входит в двойной слой фосфолипидов.
Периферические мембранные белки не взаимодействуют с гидрофобным ядром липидного бислоя. Вместо этого они с помощью невалентных взаимодействий связаны с мембранными белками или головками липидов. Периферические белки могут быть "заякорены" на внутренние цитоплазматические структуры клетки (микрортрубочки и микрофиламенты Наконец, периферические белки на внешней поверхности плазматической мембраны и экзоплазматические домены интегральных мембранных белков часто присоединены к компонентам внеклеточной матрицы или к клеточным стенкам, окружающим бактериальные клетки и клетки растений.
Существуют три способа взаимодействия с липидными мембранами:
1. неспецифическое взаимодействие растворимых белков цитоплазмы с мембранными липидами;
2. специфическое связывание периферических белков с липидами мембраны;
3. взаимодействие между интегральными мембранными белками и окружающими их липидами.
Взаимодействия первого типа лучше всего исследованы в модельных системах, включающих сывороточный альбумин, полилизин, рибонуклеазу. В большинстве исследований взаимодействий растворимых белков с мембранными липидами, взаимодействие наблюдалось лишь при использовании заряженных липидов и при ионных силах растворов гораздо меньших физиологических значений. По-видимому, взаимодействие растворимых белков с мембранами имеет чисто электростатический характер и их действие на мембрану не отличается от действия любого полианиона.
Периферические мембранные белки в норме связаны с мембраной. Эта связь может быть обусловлена их взаимодействием с интегральными мембранными белками, липидами или белками и липидами одновременно. Связывание периферийных и водорастворимых белков с мембраной приводит к изменению структуры электрического поля вблизи места связывания, что в свою очередь, вызывает изменение локальной кривизны монослоя. Поскольку образование пустот в бислое энергетически невыгодно, должна измениться и локальная кривизна второго монослоя. Это может произойти либо за счет перераспределения липидов, либо при связывании полярного белка, либо того и другого вместе (рис. 2.3). Периферические белки оказывают менее значительное воздействие на состояние и подвижность ацильных цепей фосфолипмдов. От интегральных белков они отличаются меньшей глубиной проникновения в бислой.
Рис. 2.3. Взаимодействие периферического белка с бислоем
Интегральные белки так тесно связаны с мембранным бислоем, что изменение состояния этих белков передается на окружающие липиды. Деление мембранных белков на периферические и интегральные определяется их структурой, количеством гидрофобных аминокислот и их расположением в первичной структуре, то есть всеми теми свойствами, которые определяют характер взаимодействия белка с бислоем.
Подвижность липидов, непосредственно примыкающих к интегральным белкам мембраны- аннулярных липидов, сильно ограничивается вследствие их взаимодействия с белковой молекулой. Аннулярные липиды часто называют связанными.
Аннулярные липиды по своему поведению подвижности отличаются от суммарного липидного бислоя. Для ряда белков "подходящие" аннулярные липиды те, которые являются более жидкими, или, по крайней мере, содержат большое количество ненасыщенных жирных кислот, обеспечивающих более рыхлую упаковку окружающего слоя. В других случаях, наоборот, белковые молекулы ограничивают подвижность "примыкающих" к их поверхности липидов, и аннулярный слой оказывается более упорядоченным, заторможенным в своей подвижности.
Различают белок-липидные взаимодействия 4-х типов:
1. Локальное изменение упаковки бислоя (локальное возрастание упорядоченности аннулярного слоя (грамицидин, бактериородопсин) 2. Периферические белки, проникающие не на всю глубину бислоя, вызывают эластичную деформацию одной его стороны. Такое влияние на физико-химические параметры характеризуется определенным дальнодействием. Именно им определяется облегчение взаимодействия мембранных рецепторов с гормонами типа инсулин 3. Ярко выраженная гидрофобность белка может привести к резкому изменению градиента кривизны и деформировать бислой, как это имеет место в случае взаимодействия с мембраной цитохрома b5. 4. Сочетание гидрофильных и гидрофобных свойств белковой молекулы может обеспечить не только проникновение белка через бислой, но и существенное давление на него, что приводит к изменению геометрии бислоя - сжиманию одних частей и уширению других (гликофорин) Латеральная диффузия мембранных белков
Мембранные белки так же, как и мембранные липиды, способны вращаться вокруг оси, перпендикулярной плоскости бислоя - вращательная диффузия , а так же перемещаться в плоскости самой мембраны - латеральная диффузия . Однако они не могут перевертываться и осуществлять флип-флоп переход. Измерение скоростей латеральной диффузии различных белковых молекул во многих мембранах показало, что коэффициент диффузии D может варьировать в довольно широком диапазоне значений - от 510-9 до 10-12 степени кв.см/с. Латеральная подвижность многих мембранных белков ограничена. Ограничение подвижности достигается с помощью барьеров, образованных при участии клеточных контактов особого рода (так называемые плотные контакты). Существует несколько возможных способов регуляции латеральной подвижности мембранных белков. Один из способов регуляции осуществляется в пурпурной мембране Halobacterium. В ней молекулы бактериородопсина собраны в большие двумерные кристаллы, в которых отдельные белковые молекулы фиксированы по отношению друг к другу. Крупные агрегаты такого типа диффундируют со столь малой скоростью, что их можно считать практически неподвижными. В других случаях подвижность белков плазматической мембраны ограничивается в результате взаимодействия белков с внеклеточными образованиями , например когда специфические белки плазматических мембран двух взаимодействующих клеток ассоциируют друг с другом, формируя специализированный клеточный контакт. Наконец, движение и распределение молекул мембранных белков регулируются при взаимодействии мембранных белков с белковыми комплексами цитоплазмы, такими как актиновые филаменты. Именно этим способом спектрин связывает определенные белки плазматической мембраны эритроцитов. По-видимому, наиболее точное измерение было проведено на индивидуальных молекулах родопсина в мембранах диска, присутствующих в палочках сетчатки глаза у позвоночных. Для этого в молекулах родопсина, находящихся на одной стороне палочки, с помощью хорошо сфокусированного луча света большой интенсивности быстро обесцвечивают хромофор, а затем измеряют время, в течение которого обесцвеченные молекулы диффундируют на другую сторону клетки. Подобный же подход был использован для изучения скоростей диффузии некоторых белковых молекул в плазматической мембране живых клеток. В этом случае флуоресцирующие антитела, связанные с белками на поверхности клетки, обесцвечивались на малой площади с помощью лазерного луча, после чего измерялось время, необходимое для того, чтобы соседние необесцвеченные молекулы переместились путем диффузии в обесцвеченный участок. Измеренные таким способом скорости диффузии различных белков плазматической мембраны оказались в 10-1000 раз меньше, чем у молекул родопсина. Одно из возможных объяснений этих данных состоит в том, что скорости диффузии некоторых белков уменьшаются из-за взаимодействия с другими макромолекулами, находящимися либо в самой мембране, либо в непосредственной близости от нее. С другой стороны, вполне вероятно, что лазерный луч большой интенсивности повреждает мембрану, и это приводит к аномально низким скоростям диффузии. Клетки и гели
Гели - мягкие, плотные или подобные плотным субстанции, состоящие из двух или более компонентов, одним из которых является жидкость, представленная в избытке. Так, обычный желатиновый гель состоит из сети перекрещивающихся нитей коллагена и примерно 95% воды. Существуют и такие гидро-гели, которые могут удерживать 99.9% воды (Osaga, Gong, 1993).
Поскольку поверхность гелевого матрикса гидрофильна, - она адсорбирует воду. Слабо гидрофильные полимеры адсорбируют воду в умеренных количествах, в то время как полимеры с сильно гидрофильными свойствами могут адсорбировать объем воды в тысячи раз превышающей их собственный. Таким образом, термин "гидрофильный" предполагает адсорбцию не одного, а множества слоев воды. Несмотря на то, что ученые именуют такую воду "связанной" (Jhon, Andrade, 1973), по сути, она ни чем не отличается от "структурированной" воды, прилипающей к поверхностям белков в живой клетке; семантика может отличаться, но принцип один и тот же.
Степень структурированности воды в клетке зависит от близости соседних поверхностей; то же относится и к гелям. Исследование обычных гелей показало, что до предела насыщения степень структурированности воды изменяется пропорционально степени кросс-сшивки полимера. По данным ЯМР, в момент, когда нити располагаются свободно, вода проявляет слабую связанность, но более интенсивное перекрестное сшивание приводит к тому, что их поверхности придвигаются близко друг к другу, и при этом степень ограничения подвижности воды также начинает возрастать (Yasunaga, Anclo, 1993).
Структурированность воды предполагает устойчивость к замерзанию, что является неотъемлемым свойством как клеток, так и гелей. Клетки и гели имеют схожую физическую консистенцию. Консистенция зависит от концентрации белков в цитоплазме, равно как и от природы поверхностей соответствующих белков. Так, мышечная клетка, с ее плотно упакованными высоко заряженными белковыми филаментами, будет иметь желеподобную цитоплазму, в то время как сравнительно свободная от органелл и каких-либо структур эмбриологически не развитая цитоплазма яйца, будет больше похожа на жидкость (и будет гораздо легче замерзать).
Другим важным пунктом в сравнении гелей и клеток является поведение растворенных в них веществ. Если клеточная цитоплазма похожа на гель, то ее способность исключать из себя вещества в зависимости от размеров их молекул может быть также приписана и гелю. Тщательные исследования процесса проникновения молекул различных веществ были проведены на желатиновых гелях. Исследования показали, что вода в них представлена двумя фракциями. Первая растворяла вещества любого размера, а поступление сахаров, спиртов и других веществ во вторую фракцию зависело от размеров их молекул (Gary-Bobo, Lindenberg, 1969).
Другие типы гелей также способны исключать отдельные вещества. Например, гелевые пластинки из ацетата целлюлозы, содержат заполненные водой поры размером 3 нм. Большая часть этой воды даже не содержат молекул различных веществ, не замерзает при температурах до -60С (Frommer, Lancet, 1972). Кроме того, она является плохим растворителем (Taniguchi, Horigome, 1975). Для поливинилметилового эфира была обнаружена эксклюзия сахарозы с коэффициентом распределения от 0,1 до 0,4 (Ling и др., 1980). В гелях ионообменных смол различные вещества также исключаются в соответствии с размерами их молекул (Ginsburg, Cohen, 1964). Таким образом, правило об исключении молекул растворимых веществ из живых клеток вполне применимо и для гелей: исключение молекул все больших размеров зависит от степени структурированности воды в геле.
И так, гели и клетки весьма схожи по многим характеристикам: оба эти объекта построены из полимерных сетей, оба содержат структурированную воду, устойчивы к замерзанию, способны исключать молекулы различных веществ, оба обнаруживают значительные электрические потенциалы и имеют похожую физическую консистенцию. Тема 3. Фазовые переходы
3.1. Фазовые переходы в липидных бислоях
Монослой на границе раздела фаз. Лиотропный фазовый переход.  - А изотермы
Липидные изомеры в монослое упакованы одинаковым способом: полярные части молекул погружены в водную фазу, а углеводородные части направлены в воздух или погружены в органический растворитель.
Молекулы липида в нерастворимом монослое могут двигаться вдоль поверхности воды, при этом они ударяются о подвижный барьер, создавая поверхностное давление π. Работа внешней силы против этого давления при перемещении барьера длиной l на расстоянии dx равно С другой стороны, изменение поверхностной энергии при замещении поверхности, занятой монослоем, на чисто водную поверхность равно где σ0 и σ поверхностное натяжение воды и монослоя соответственно. Отсюда σ0=72,8 дин/см на границе вода - воздух ≈50 дин/см на границе воды и жидкого н-алкана при 20о, а σ - зависит от вида молекул, образующих мономолекулярную пленку. Изменения с подвижным барьером (весы Ленгмюра) позволяют непосредственно определить силу поверхностного давления от площади (А), приходящуюся на одну молекулу при постоянной температуре, если известно количество липида в монослое.
Участок а соответствует состоянию " двумерного газа ". На участке b происходит конденсация пленки при постоянном давлении, при этом " двумерный газ " и " двумерная жидкость " сосуществуют. Пленка на участке с, характеризуется сравнительно малым коэффициентом сжатия (А/π)т называется жидкорастянутой. При дальнейшем повышении давления (участок de) происходит переход двумерной жидкости в конденсированную пленку, характеризующуюся почти полной несжимаемостью. Участок f соответствует разрушению пленки (коллажу) с образованием капель или многослойных "доменов". Конденсированные пленки могут быть как в жидком, так и в твердом состоянии. Жидкие конденсированные пленки удерживаются в этом состоянии только за счет внешних сил (давление барьера) и спонтанно расширяются при снятии этого давления. Наоборот, твердые (квазикристаллические) пленки удерживаются чисто внутренними силами за счет межмолекулярных взаимодействий (боковой когезии в монослое). Для таких пленок характерно сопротивление сдвигу: они не вытекают через отверстие в барьере при наличии некоторого поверхностного давления.
Кривые для реальных пленок хорошо описываются уравнением, представляющим двумерный аналог уравнения Ван-дер-Ваальса.
а - константа Ван-дер-Ваальса, характеризующая силу межмолекулярного взаимодействия,
b - эффективная площадь сечения молекулы (b≈А0), k - постоянная Больцмана, Т - абсолютная температура.
В зависимости от поверхностной плотности липида, он ведет себя как газ, либо жидкость, либо твердое тело.
1. Если площадь поверхности, приходящаяся в среднем на одну молекулу высшей жирной кислоты превышает 0,5 нм2, то такая степенная функция ведет себя как двумерный газ.
π - поверхностное давление (Н/м), А - площадь поверхности на одну молекулу
А0 - площадь, занимаемая 1 молем N0 - число Авогадро 6,021023
k - постоянная Больцмана 2. При увеличении поверхностного давления молекулы постепенно сближаются. Если площадь, приходящаяся в среднем на одну молекулу ≈0,5нм2, то монослой называется растянутым и он соответствует жидкому состоянию, имеющему другую предельную молярную площадь À0. Такому монослою соответствуют значения π - 10-3- 10-2H/м
Уравнение состояния πс - поверхностное давление, предельное для газообразного состояния.
3. Если поверхностное давление превышает 10-2Н/м, то монослой называется конденсированным. Все амфифильные молекулы принимают указанную выше ориентацию. Полярные головы остаются гидратированными.
Уравнение состояния
k′ - коэффициент,
а - активность растворенного вещества
Аs - площадь поверхности
- предельная молярная площадь для конденсированного монослоя.
4. Дальнейшее повышение поверхностного давления приводит к потере полярными головами их гидратной оболочки с образованием твердого монослоя. При этом А (≈0,2 нм2) почти не зависит от длины углеводородной цепи, а монослой - практически несжимаем. Уравнение состояния - то же, что и для конденсированного монослоя (но с другим коэффициентом).
При еще больших поверхностных давлениях монослой разрушается и начинают образовываться мультислойные структуры.
Водно-липидные смеси. Полиморфизм
Смеси липидов с водой отличаются выраженным полиморфизмом. Даже индивидуальные очищенные липиды в гидратированном состоянии могут находиться в нескольких структурных модификациях. Какая из структур преобладает, зависит от таких параметров, как концентрация липида, температура, давление, ионная сила и рН. Особенно полезным при изучении типов структурной организации водно-липидных систем оказался метод дифракции рентгеновских лучей. При этом чаще всего варьируют концентрацию липида и температуру, а полученные данные представляют в виде фазовой диаграммы, показывающей, какую структуру система имеет в различных областях диаграммы "температура - концентрация". Наряду с дифракцией рентгеновских лучей для определения фазовых границ водно-липидных систем часто используют дифференциальную сканирующую калориметрию. Эти исследования проводят обычно при высоких концентрациях липида (>40%, в/в), однако многие структуры, обнаруженные при таких условиях, образуются также в липидных дисперсиях при большом избытке воды.
Основные типы структурной организации водно-липидных систем: 1. Жидкокристаллическая ламелярная (L)(T>Tc), содержание воды 5-22%, умеренно вязкая прозрачная жидкость. Несмотря на низкое содержание воды, обладает большей текучестью, чем гексагональная. Эта мезофаза состоит из двумерных слоев, из-за чего анизотропия свойств у нее ярко выражена. Считают, что именно в этой фазе находится основная масса липидов в биологических мембранах. Как свидетельствуют данные дифракции рентгеновских лучей, для этой фазы характерно упорядоченное расположение слоистых структур при значительной неупорядоченности ацильных цепей.- 2. Ламеллярная гелевая фаза (L). Она образуется при низкой температуре теми липидами, которые формируют слоистые структуры. В этой фазе молекулы упакованы более плотно (на молекулу приходится меньшая площадь поверхности), а ацильные цепи намного более упорядочены и находятся преимущественно в полнос-тью-транс-конфигурации, как и в липидных кристаллах. Поскольку цепи максимально вытянуты, толщина бислоя в фазе геля выше, чем в жидкокристаллической фазе. Плотность фазы геля несколько выше плотности жидкокристаллической фазы. Интересно, что дисперсии фосфатидилхолина в растворах, содержащих некоторые спирты, в том числе и глицерол, образуют необычную фазу геля, в которой противолежащие половины "бислоя" своими ацильными цепями полностью проникают друг в друга. Биологическая роль этого явления неясна.3) Жидкокристаллическая гранецентрировання (кубическая) вязкоизотропная фаза, содержание воды 23-40 %.
Кубические мезофазы с большим содержанием воды являются промежуточными между мицеллярным раствором и двухмерной гексагональной мезофазой. Кубические структуры состоят из сферических агрегатов.
При высоких концентрациях амфифила могут образовываться вязкие кубические мезофазы, обычно в довольно узком диапазоне концентраций и температур. Эти изотропные мезофазы являются промежуточными между гексагональными и ламеллярными. Считается, что они состоят из коротких стержневых структур, образующих две трехмерные взаимно переплетенные сети.4) Жидкокристаллическая гексагональная фаза I (HI), содержание воды 38-80%. Гексагональные фазы состоят из стержнеобразных структур, и, не смотря на значительное содержание воды, текучесть этих фаз мала. В двухкомпонентных системах фаза 1 находится в равновесии с мицеллярным раствором, а при высокой концентрации амфифила - с ламеллярной (или более вязкой фазой - изотропной).
В гексагональной фазе II (HII) липиды также образуют цилиндры, но в этом случае полярные группы обращены внутрь цилиндра и формируют водный канал. Упаковка самих цилиндров также является гексагональной.
5) Мицеллярный раствор -цилиндрические мицеллы; воды> 30%.
6) Миелиновые структуры; основу структуры составляют бимолекулярные слои, образующие концентрические цилиндры; содержание воды> 50%.
7) Липосомы с бимолекулярными мембранами. Могут существовать в виде многослойных концентрических структур. Содержание воды очень высокое.
8) Сферические мицеллы.
При изменениях температуры наблюдаются структурные переходы как в термотропных, так и в лиотропных жидких кристаллах. При этом температуры плавления для кристаллической фазы, температуры "просветления", а также точки возможных мезоморфных превращений внутри жидкокристаллической фазы могут не совпадать при нагревании и при охлаждении внутри одного и того же интервала температур. Последовательность состояний мезофазы также не всегда совпадает при нагревании и охлаждении. Известны случаи для термотропных жидких кристаллов, когда мезоморфная фаза образуется при охлаждении расплава, но не при плавлении кристаллической фазы. Такие фазовые превращения называются монотропными в отличие от энантиотропных, наблюдаемых как при нагревании, так и при охлаждении. Полиморфные превращения внутри мезофазы также могут быть монотропными.
Рис. 3.1. Фазовые диаграммы для моногалактозилдиацилглицерола (А) и дигалактозилдиацилглицерола, экстрагированных из листьев. В обоих случаях ацильные цепи характеризуются высокой степенью насыщенности. Термодинамика полиморфизма липидных структур
С точки зрения термодинамики основной силой, стабилизирующей гидратированные липидные агрегаты, являются гидрофобные взаимодействия. К другим стабилизирующим факторам относятся:
1.Вандерваальсовы силы: короткодействующие слабые силы притяжения между соседними гидрофобными цепями. Притяжение возникает за счет взаимодействия между индуцированными диполями.
2.Водородные связи: образуются между полярными головками некоторых липидов (например, между молекулами фосфатидилэтаноламина). В ряде случаев мостики между отрицально заряженными липидами образуются с помощью двухвалентных катионов.
Все эти силы по своей стабилизирующей способности значительно уступают гидрофобным взаимодействиям. Под действием гидрофобных сил система принимает такую структурную организацию, при которой сводятся к минимуму контакты между неполярными участками липидных молекул и водой. Эти силы имеют энтропийную природу и связаны с ограничениями, налагаемыми на упаковку молекул воды вокруг неполярных углеводородов.
Динамическая структура чистой воды весьма сложна, однако ясно, что она стабилизируется прежде всего межмолекулярными водородными связями. Когда какой-либо ион, например С1-, попадает в воду, он сольватируется, при этом молекулы воды образуют вокруг него гидратную оболочку. С точки зрения энтропии упорядочение молекул воды невыгодно, но это с избытком компенсируется сильными электростатическими взаимодействиями, так что суммарное изменение свободной энергии при растворении соли в воде оказывается термодинамически выгодным. Когда в воде растворяется неполярное вещество, структура воды вокруг каждой молекулы также нарушается. Молекулы воды стремятся ориентироваться таким образом, чтобы сохранились межмолекулярные водородные связи (каждая из них дает около 5-7 ккал/моль), но поскольку те молекулы воды, которые непосредственно контактируют с молекулами растворенного неполярного вещества, соседствуют с меньшим число молекул воды, в системе возникают значительные структурные напряжения. Это приводит к уменьшению энтропии системы, причем в данном случае компенсирующие электростатические взаимодействия отсутствуют. В результате суммарное изменение свободной энергии при переносе неполярного вещества из неполярного растворителя (например, гептана) в воду термодинамически неблагоприятно из-за энтропийных эффектов, связанных с нарушением структуры воды как растворителя. Невыгодные взаимодействия между неполярным растворяемым веществом и водой - это и есть "гидрофобные силы". С помощью термодинамических измерений можно количественно оценить стремление неполярных веществ минимизировать контакты с водой. Гидрофобные силы являются главным фактором стабилизации практически всех биологических макромолекулярных структур, включая глобулярные белки, а также фосфолипидный бислой. "Гидрофобность" таких простых молекул, как углеводороды, можно количественно оценить по данным равновесного распределения растворяемого вещества (скажем, этана) между двумя растворителями, например водой и гептаном.
Выразим концентрацию растворенного вещества в воде и в углеводороде в мольных долях, и Тогда константа равновесия К будет равна
Стандартная свободная энергия переноса вещества из одной фазы в другую, , является мерой его гидрофобности. Показано, что гидрофобность пропорциональна площади поверхности контакта между водой и неполярным растворенным веществом. Чем крупнее молекула (например, молекула углеводорода с длинной цепью), тем значительнее нарушения структуры воды из-за увеличения площади контакта. Для углеводородов с неразветвленной цепью гидрофобность составляет около - 800 кал/моль в расчете на одну -СН2-группу. Другими словами, при увеличении длины цепи на два метиленовых звена константа равновесия увеличивается в 10 раз.
Образование мицелл
Мицеллы представляют собой простейшие агрегаты, образуемые липидными молекулами в объемной фазе растворителя. В зависимости от природы растворителя липиды могут давать либо мицеллы обычного типа, либо так называемые "обращенные" мицеллы. В воде легко дают мицеллы те липиды, которые имеют объемистую и /или заряженную полярную головку и сравнительно небольшие углеводородные цепи.
При большом содержании воды обращенные мицеллы можно рассматривать как капельки микроэмульсии типа "масло в воде". Размер частиц микроэмульсий варьирует в широких пределах, от 5 до 100 нм и больше.
Рис. 3.2. Модель частицы липопротеина плазмы крови Классическим примером липидных эмульсий природного происхождения являются липопротеины плазмы крови, основная функция которых состоит в транспорте фосфолипидов, триацилглицеринов, холестерина и его эфиров в организме теплокровных животных. В плазме найдены четыре основных класса липопротеинов. В порядке возрастания удельной плотности они располагаются в следующий ряд: хиломикроны, липопротеины очень низкой плотности (ЛОНП), липопротеины низкой плотности (ЛНП) и липопротеины высокой плотности (ЛВП). Содержание различных классов липопротеинов у человека зависит от возраста, пола, условий жизни и т.д. и изменяется при некоторых патологических состояниях организма (инфаркт миокарда, атеросклероз и др. сосудистые заболевания). Морфологически липопротеины представляют собой сферические частицы мицеллоподобного типа (рис. 3.2).
Несмотря на различия в относительном содержании основных компонентов, входящих в состав липопротеинов, все они устроены по одинаковому принципу: внутреннее ядро липопротеиновых частиц состоит из неполярных нейтральных липидов (триацилглицеринов и эфиров холестерина), а на поверхности находится монослой, образуемый фосфолипидами, холестерином и амфифильными апопротеинами.
Концентрация липида, при которой начинают формироваться мицеллы, называют критической концентрацией мицеллоообразования (ККМ) (рис. 3.3).
Если в водный раствор постепенно добавлять амфифильное вещество, то при некоторой критической концентрации молекулы этого вещества начнут слипаться, образуя агрегаты. Это кооперативный процесс; основная масса образующихся агрегатов состоит из большого числа молекул, и лишь незначительная их часть образована двумя или несколькими молекулами. Качественной иллюстрацией этого явления служит рис. 3, на котором приведен график зависимости фактической концентрации мономеров амфифильного вещества от суммарной концентрации вещества, введенного в раствор.
Если считать липидные агрегаты в растворе отдельной фазой, то условие равновесного распределения мономеров между двумя фазами будет равенство химических потенциалов. Для простоты рассмотрим монодисперсную систему с молекулами на один агрегат. Это означает, что есть только один тип агрегатов, находящихся в равновесии с мономером. Хотя это и явное упрощение, но оно вполне приемлемо для молекул, образующих сферические мицеллы или небольшие моноламеллярные везикулы. Теперь рассмотрим условия равновесия системы при критической концентрации мицеллообразования и представим ККМ как такую концентрацию, при которой.
Рис. 3.3. Распределение амфифильных молекул между мономерной и мицеллярной формами в зависимости от полной концентрации молекул. Обозначим - химический потенциал молекулы липида в растворителе.
- стандартный химический потенциал молекулы липида в растворителе;
- концентрация мономеров (мольная доля) в растворителе.
- среднее число молекул в мицелле;
- мольная доля липида, находящегося в растворе в мицеллярной форме.
В равновесии Благодаря большому член при достаточно малых концентрациях диспергированного липида вблизи точки мицеллообразования мал по сравнению с . Приближенно можно считать, что переход к мицеллярной фазе происходит при некоторой концентрации , которую называют критической концентрацией мицеллообразования. При дальнейшем увеличении концентрации липида в растворе левая часть уравнения остается постоянной, а из вида правой части следует, что большие изменения будут компенсироваться во много раз меньшими изменениями , т.е. практически весь липид будет находиться в мицеллярной форме. При достаточно большом ( в везикулах фосфолипидов в воде)
Принцип противодействующих сил и образование мицелл
Основной вклад в величину дает свободная энергия гидрофобного переноса за счет вытеснения воды из неполярных областей амфифильных агрегатов при формировании мицеллы. Для простых амфифильных молекул с одной углеводородной цепью, как в случае алкилсульфатов (например, додецилсульфата), зависимость от длины цепи очень близка к зависимости для алкильных цепей от их длины. С точки зрения термодинамики перенос неполярных групп из воды в жидкий углеводород аналогичен их переносу во внутреннюю гидрофобную область мицеллы. Количественно это выражается в том, что при каждом увеличении длины цепи на два метиленовых звена ККМ уменьшается примерно на порядок.
Для н-алкилбетаинов этот параметр меняется в зависимости от числа атомов углерода в цепи R-амфифильной молекулы по формуле:
Если взять амфифильное вещество с другой полярной головкой, то коэффициент при Nc фактически останется тем же, а свободный член станет существенно меньше. Таким образом, полярная головка влияет только на один из этих двух параметров.
Структура и свойства мицелл определяется в основном двумя факторами: гидрофобным притяжением углеводородных цепей и взаимным отталкиванием полярных головок.
Наличие сил отталкивания для амфифильных молекул, обладающих полярными головками с нескомпенсированным зарядом, очевидно. Однако помимо этого имеет место и эффект сольватации, который играет главную роль в случае нейтральных головок: толстые сольватные слои вокруг головок препятствуют их сближению.
Рассмотрим эти два фактора в отдельности:
-член, ответственный за притяжение
-член, ответственный за отталкивание
Величина равна - изменению свободной энергии при переносе углеводорода из воды в чистый жидкий углеводород.
Член, отвечающий за электростатическое отталкивание, , вносит положительный вклад в . Нетрудно объяснить его влияние на коэффициент при . Так как с ростом увеличивается размер мицеллы, и расстояние между головками уменьшается (вместо, имеем ). Чем больше , тем больше член ответственный за притяжение. Необходимо сильное отталкивание, чтобы прекратился рост мицеллы. Вклад отталкивания тем значительнее, чем крупнее мицелла, так как сближаются полярные головки, а это в сою очередь повышает до такой величины, когда дальнейший рост мицеллы становится невыгодным.
Геометрия мицелл и критический параметр упаковки
Чем же определяется форма мицелл? Следует напомнить, что некоторые природные липиды, например фосфатидилэтаноламин с ненасыщенными жирнокислотными цепями, не образуют стабильных бислоев при диспергировании в воде. Чтобы выяснить механизмы, лежащие в основе стабильности бислоя, и понять, почему некоторые мембранные компоненты способствуют формированию небислойных структур, необходимо более глубоко рассмотреть термодинамику этих систем и обсудить, как форма липидных молекул влияет на их упаковку в мицеллах. Почему мембранные фосфолипиды не образуют глобулярных мицелл? При обсуждении вопроса об упаковке амфифильных молекул в мицеллах определенной геометрии (например, сферических) следует рассмотреть стерические требования к упаковке с двух точек зрения. Неполярная часть молекулы характеризуется определенным молекулярным объемом (v) и максимальной длиной этого участка. Без учета других характеристик эти два параметра будут определять максимальный радиус сферической мицеллы, а также число молекул, входящих в мицеллу. Другой параметр, который следует принять во внимание, - это оптимальная площадь, поверхности, занимаемой полярной головкой (So). У природных фосфолипидов площадь, приходящаяся на молекулу в некоей сферической мицелле, будет намного больше, чем требуется для оптимальной упаковки головок, и эти амфифильные соединения не образуют стабильных сферических мицелл. Говоря о наиболее стабильной геометрии мицелл, следует принять во внимание три молекулярных параметра.
1. So, оптимальная площадь поверхности, занимаемой молекулой на гидрофобной поверхности раздела. Она частично зависит от свойств раствора, особенно ионной силы в случае заряженных молекул.
2. l, максимальная длина алкильной цепи в простых амфифильных молекулах с одной цепью и в фосфолипидах. Она определяет верхний предел размера мицелл, например радиус сферической мицеллы или толщину бислоя. Обратите внимание, что мицеллы никогда не имеют полостей или дырок, поэтому радиус сферической мицеллы не может превышать l, хотя и может быть меньше этой величины. Обычно он несколько меньше длины максимально вытянутой цепи, имеющей полностью-транс-конфигурацию.
3. v, молекулярный объем углеводородной области амфифильной молекулы. Объем мицеллы, ограничиваемый границей раздела фаз углеводород-вода, считают равным , где - число молекул в мицелле.
Площадь поверхности, приходящейся на единицу объема, зависит от геометрии мицеллы, и именно этим в конечном счете определяется, какие мицеллы образуются различными амфифильными соединениями. Рассмотрим некоторые возможные формы мицелл.
Зная параметр , можно предсказать, какие мицеллы будут преимущественно образовываться теми или иными молекулами. Этот параметр называется критическим параметром упаковки и зависит от объема и длины неполярного участка молекулы, а также от оптимальной площади поверхности полярной головки.
Рассмотрим, например, сферическую мицеллу радиусом R, содержащую молекул.
Полная поверхность мицеллы , полный объем мицеллы ,
так что радиус мицеллы Поскольку радиус мицеллы не может быть больше l (R l) - максимально возможной длины углеводородной цепи липидной молекулы, то условие упаковки липидов в сферические мицеллы будет выглядеть как
Аналогичные расчеты легко провести также для мицелл цилиндрической формы и для плоского бислоя. Критические параметры в этом случае будут равны:
Цилиндр: Бислой: Отсюда следует, что при заданных v, l и So, если величина (v/lSo) < 1:3, то будут образовываться сферические мицеллы, если 1/3 < v/lSo < 1/2, то мицеллы будут глобулярными или цилиндрическими, а если l/2< v/lSo <l, то липиды будут образовывать стабильный бислой. Наличие двух длинных ацильных цепей в природных фосфолипидах увеличивает объемную составляющую (молекулярный объем и), именно это и приводит к формированию стабильного бислоя. Особый интерес представляет случай, когда природные липиды характеризуются параметром v/lSo > 1 и, следовательно, не образуют стабильных бислоев. Эти липиды, имеющие относительно небольшие полярные головки и формируют обращенную гексагональную фазу (Н11). Их роль в биологических мембранах неясна. Упрощенно липидные молекулы можно представить в виде конусов, цилиндров или перевернутых конусов в зависимости от соотношения двух величин: площади поперечного сечения углеводородного участка молекулы, примерно равной v/l и So, оптимальной площади поверхности, необходимой для размещения полярной головки.
Лизофосфолипиды, детергенты
Фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин(рН<4) Фосфатидилхолин, сфингомиелин, фосфатидилсерин,
Фосфатидиллинозитол, кардиолипин, фосфатидилглицерол Термотропный фазовый переход
Консистенция мембраны зависит от температуры. при физиологической температуре мембрана, как правило, находится в жидкостном состоянии, сохраняя при этом общую упорядоченность структуры, хотя отдельные ее части обладают свободой движения. при понижении температуры подвижность плоской мембраны уменьшается и мембрана переходит в состояние "кристаллического геля".
Этот переход зависит от химического состава. При этом важное значение имеют следующие параметры:
1. Длина цепи жирной кислоты. Жирная кислота с длинной цепью обладает более высокой подвижностью, чем жирная кислота с короткой цепью. С увеличением длины на группы Тф.п. увеличивается примерно на 2. Степень насыщения жирных кислот. Если пленка состоит из смеси насыщенных и ненасыщенных фосфолипидов, то в месте расположения двойных связей нарушается порядок, т.к. не будет соблюдаться строго параллельное расположение цепей. поэтому пленки из насыщенных и ненасыщенных цепей при этой же температуре более жидкие чем пленки, построенные из одних только насыщенных цепей. При увеличении степени насыщенности Тф.п. понижается.
3. Присутствие и распределение холестерина в мембране. Холестерин относится к так называемым простым липидам; это липидное соединение, которое является отличительной составной частью многих мембран.
4. Процентного содержания воды в системе. Тф.п. липидов в безводном состоянии много выше, чем для диспергированных в воде липидов.
При сравнительно низких температурах образования бислоя определяется ван-дер-ваальсовым притяжением плотно упакованных вытянутых углеводородных цепей в транс-конформации. взаимодействие вытянутых углеводородных цепей настолько эффектно, что практически любые липиды, имеющие хотя бы одну достаточно длинную углеводородную цепь, образуют стабильные твердые бислои с избытком воды.
Параметры перехода. Равновесие фаз. Область перехода
Фазой называют совокупность всех гомогенных частей системы, одинаковых по составу и по всем химическим и физическим свойствам и ограниченных от других частей некоторой поверхностью раздела.
"Классический" фазовый переход происходит изотермически при определенной температуре , и две фазы сосуществуют при этой температуре. Фазами могут быть участки жидкого бислоя и твердые домены.
В гетерогенной смеси вот время перехода происходит изменение состава фаз, поэтому он может происходить в широком температурном диапазоне. Однако и в гомогенных липидных бислоях фазовый переход может происходить в некотором температурном диапазоне, поэтому можно говорить о константе равновесия этого процесса. Причина состоит в том, что фазовый переход начинается с образования множества зародышей новой фазы. При достижении некоторого критического размера зародышей начинается сам кооперативный переход. Порядок перехода
Согласно классификации, предложенной Эренфестом, переходом -го порядка называется такой переход, для которого -я производная свободной энергии Гиббса претерпевает разрыв, в то время как сама функция и все производные более низких порядков непрерывны.
При фазовом переходе в мембранах изменяются скачком энтропия и ее объем, т.е. объем и энтропия системы, являющиеся первыми производными свободной энергии и претерпевают разрыв в точке фазового перехода. Для перехода первого порядка в то время как объем и энтропия меняются. С этой точки зрения любые фазовые переходы в липидах сопровождаются изменениями энтропии и объема, являются переходами первого рода.
Изменение свободной энергии в изотермическом процессе.
температура перехода.
Фазовый переход происходит при постоянной температуре с поглощением теплоты. Таким образом, для перехода первого рода характерно наличие скрытой теплоты перехода.
Теплоемкость при этом также изменяется скачком, что связано с зародышевым характером формирования новой фазы.
Фазовый переход второго рода по Эренфесту характеризуется отсутствием скрытой теплоты перехода, а также изменением энтропии и объема. С этой точки зрения ни один структурный переход в бислое не может быть переходом второго рода, т.к. даже появление "жидких" кластеров одного липида в "жидком" бислое гетерогенного состава обязательно связано с уменьшением энтропии.
Теплоемкость, равновесие, энтальпия Вант-Гоффа
Типичные экспериментальные изменения теплоты и теплоемкости при фазовом переходе показаны на рис.
Фазовые переходы в бислоях изучают с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). С его помощью регистрируют и исследуют изменения фазового состояния липидов, а также характеризуют нарушения этого состояния при взаимодействии липидов с другими веществами (белками, ионами или малыми гидрофобными молекулами). При ДСК образец и инертный стандарт нагревают независимо, так чтобы их температура была одинаковой. При этом количество тепла, необходимого для эндотермического перехода бислоя из состояния геля в жидкокристаллическое состояние, превышает количество тепла, необходимого для поддержания стандарта при такой же температуре. Затем строят зависимость разности потоков тепла от температуры. Этим методом определяют обычно следующие параметры:
1. температуру перехода T1, соответствующую началу перехода.
2. среднюю точку перехода Tc, соответствующую середине перехода.
3. энтальпию перехода H- количество тепла, необходимое для осуществления перехода в расчете на моль вещества или единицу массы.
4. теплоемкость Cp - количество тепла (в расчете на моль или грамм), необходимое для повышения температуры образца на один градус.
Все соотношения между термодинамическими величинами обычно выводятся для равновесных изотермических процессов. Формула справедлива для таких процессов. В липидном бислое фазовый переход практически никогда не является равновесным, поскольку две фазы ("жидкий" и "твердый" бислои) пространственно разделены и сосуществуют в виде смеси областей микроскопических размеров. Эффекты на границах этих областей приводят к тому, что в масштабах времени эксперимента устанавливается термодинамическое (кинетическое) равновесие между фазами не при одной температуре, а целой области температур.
В области температур фазового перехода, если плавление происходит достаточно медленно, устанавливается равновесие: жидкое состояние  твердое состояние
Можно считать, что вся мембрана состоит из участков жидких липидов и участков твердых липидов. Тогда обратимый процесс фазового перехода можно рассматривать как процесс превращения таких участков (доменов) друг в друга со скоростями, пропорциональными концентрации доменов. Иначе говоря, фазовое равновесие можно рассматривать как обратимую химическую реакцию: С константой равновесия
,
Где [l] и [s] - концентрации липидов в жидкой и твердой фазах, а ml и ms - количество липида в жидкой и твердой фазах, соответственно. Изменение свободной энергии при плавлении моля липида G равно изменению энтальпии H минус изменение тепловой энергии TS: причём отсюда находим
таким образом, зависимость
Представляет собой прямую линию с угловым коэффициентом и отсечкой на оси ординат, равной . Примеры такого рода прямых даны на рис. Таким образом, из кривых плавления, полученных экспериментально, можно найти термодинамические характеристики процесса H и S. Кооперативность фазовых переходов
Из кривых теплоемкости мы находим теплоту плавления образца q и молярную теплоту плавления Qm=Q/m, где m - количество молей липида в образце (рассчитанное как масса липида, деленная на его молекулярную массу). Из кривых плавления, мы находим энтальпию плавления H. На первый взгляд величины Qm и H должны быть примерно равны, поскольку система не совершает механической работы. Оказалось однако, что при плавлении синтетических липидов H превышает Qm в десятки, а иногда и в сотни раз. В чем же тут дело? Фазовое равновесие можно рассматривать как обратимую химическую реакцию: с константой равновесия. Спрашивается, какие "молекулы" l переходят в этой реакции в "молекулы" s. Очевидно, что это не отдельные молекулы фосфолипида, поскольку одна молекула не может находиться в жидкой или в твердой фазе. Переходит из одного состояния в другое одновременно несколько молекул, образующие некий "кластер", а лучше сказать кооперативную единицу. В пределах кооперативной единицы все молекулы находятся в одинаковом состоянии, образуя либо кристаллическую (твердую) фазу либо жидкую фазу. Каждый кластер мoжет изменять свое фазовое состояние по закону "все или ничего" и притом совершенно независимо от других кластеров. В этом смысле кооперативные единицы представляют собой как бы сверх-молекулы, которые могут переходить из состояния l в состояние s. Изменение свободной энергии G, энтальпии H и энтропии S (найденное из кривых теплоемкости) относится к молю таких "молекул". Очевидно, что если кооперативная единица образована n молекулами фосфолипида, то: где n - размер кооперативной единицы, т.е. число молекул фосфолипида, входящих в одну кооперативную единицу. Изменение объема бислоя
Исследование изменения объема водных дисперсий липидов в зависимости от температуры показало увеличение объема.
Кривая получена из измерений разности увеличения объема липида и чистой воды в условиях повышения температуры. Изменение объема непосредственно связано с изменением объема бислойных структур. (на 14% происходит увеличение объема).
Для объяснения механизма фазового перехода были предложены две гипотезы. Одно предположение состояло в том, что при углеводородные цепи начинают вращаться вокруг своих длинных осей. Однако, если молекулы фосфолипидов вращаются при то следует ожидать гораздо большего возрастания объема, чем в углеводородах, поскольку липиды имеют ассиметричную форму. Другое предположение было основано на образовании вращательных изомеров в углеводородных цепях липидов.
Поскольку вращательный барьер для отдельных С-С связей ниже, чем для вращения всей молекулы, предполагается, что для некоторых С-С связей имеет место переход от транс-конформации к гош-конфигурации.
Конформационные изменения в процессе фазового перехода
Плавление жирнокислотных цепей при фазовом переходе обусловлено вращательной изомеризацией. Наименьшей энергией обладает транс-, а наибольшей - цис-конфигурация.
Гош конформация (гош(+) и гош(-); поворот на относительно транс-конформации) сравнительно мало превышает по энергии транс-конформацию но эти состояния разделяет энергетический барьер высотой Если углеводородные цепи в полностью транс-конфигурации представляют собой линейные структуры, то появление одиночной гош-конформации в цепи приводит к искривлению конфигурации цепи на угол в плотно-упакованных мембранных системах с полностью транс-конформацией углеводородных цепей это искривление порождает серьезные стерические затруднения, делающие невозможным появление одиночных гош-конформаций.
Уменьшение стерических затруднений при плавлении углеводородных цепей в мембранах достигается при синхронном появлении в цепи сразу двух гош-конфигураций (гош(+) и гош(-)), разделенных С-С связью в транс-конформации. При последовательном повороте цепи на и пространственная конфигурация цепи в целом сохраняется прямолинейной. участок цепи, находящийся в гош(+) - транс - гош(-) конформации, формирует уступ или петлю в углеводородной цепи, которую называют кинком ( kink - петля).
Образование кинка сопровождается уменьшением эффективной длины цепи на ~ 0,127 нм, при этом часть цепи отодвигается на ~ 0,15 нм, образуя свободный объем (рис. 3.4).
Рис. 3.4. Конформация углеводородных цепей липидов в мембране: 1- полная транс-конформация, 2 - гош-транс-гош-конформация, 3 - цис-транс-гош-конформация
Хотя появление одного кинка в углеводородной цепи недостаточно для ее плавления, одиночные кинки облегчают возникновение кинков в соседних углеводородных цепях, формируя чередующиеся кинк-блоки.
Двойные (цис-) связи в жирнокислотных ненасыщенных цепях мембран могут играть роль зародышей образования кинков в соседних насыщенных цепях. В этом случае для образования кинка в ненасыщенной цепи необходимо появление одной гош-конформации при искривлении цепи на При этом устраняются стерические затруднения, возникающие при размещении ненасыщенной цепи в углеводородной зоне мембран из насыщенных липидов.
Возрастание энтропии при плавлении цепей оказывается связанным только с появлением множества новых возможных конфигураций цепей за счет транс-гош поворотов вокруг единичных С-С связей. Следовательно, можно говорить о "конфигурационном плавлении".
3.2. Фазовые переходы в гелях
Процесс перехода из одного состояния в другое может быть вызван слабо уловимым изменением в условиях внешней среды. На рис 3.5. показано резкое сжатие геля при изменении внешних условий (Таnаkа с соавт, 1992).
Рис. 3.5. Фазовый переход в геле при изменении внешних условий
Пример, показанный на рисунке 3.6 (Таnаkа с соавт, 1992), иллюстрирует переход, стимулированный изменением соотношения "органический растворитель - вода". Как только это соотношение переходит через пороговое значение, объем геля изменяется на два порядка относительно прежней величины. Рис. 3.6. Влияние состава растворителя на объем геля.
В таблице 3.1. дан перечень стимулирующих агентов и ответов на них, предложенный Аланом Хоффманом (Allan Hoffman, 1991),- специалистом в области изучения полимерных гелей. Эта таблица указывает на две особенности фазовых переходов в гелях. Первая - это многообразие стимулирующих агентов (левая панель). Сюда включены изменение рН, температуры, различные химические агенты и механическая сила - все агенты из ряда наиболее типичных эффекторов клеточной активности. Вторая особенность заключается во множестве ответных реакций (правая панель), большинство из которых, включая изменения формы, объема, проницаемости и электрического потенциала, похожи на разные виды клеточной активности.
Таблица 3.1. Перечень стимулирующих агентов фазовых переходов и ответов на них
СтимулыОтветные реакциирН
Температура
Химические или биохимические агенты
Растворители и соли
Электрическое поле
Электромагнитное излучение
Механическое воздействиеХимический ответ (стимуляция или ингибирование реакции)
Изменение форму (сжатие или разбухание)
Изменение проницаемости
Разделение фаз (осаждение)
Оптический ответ (помутнение, обесцвечивание, изменение цвета)
Изменение поверхностных свойств (становится несмачиваемой)
Механический ответ (затвердевание или размягчение)
Электрический ответ (электрический сигнал или электрохимическая реакция) Основы фазового перехода в гелях
Каркас геля составляет полимерный матрикс, который представлен длинными полимерным нитями, обычно химически или физически сшитыми друг с другом. Химические связи, как правило, остаются стабильными при нагревании, изменении рН или состава раствора. Они мало подвержены фазовому переходу (рис. 3.7). Физические сшивки обусловлены межмолекулярными взаимодействиями, такими как кулоновские силы, диполь-дипольные взаимодействия, силы Ван-дер-Ваальса или гидрофобные взаимодействия, которые сближают обезвоженные полимерные участки и водородные мостики Подобные связи, как правило, восприимчивы к внешним факторам и склонны разрушаться, что приводит к структурным переходам.
Свободные промежутки в полимерной сети содержат растворитель Его количество определяется, в основном, свойствами поверхности молекул полимера Ее пи поверхность гидрофобна, она организует сеть водных клатратов. Рис. 3.7. Схематическое изображение химический и физических поперечных связей в гелях (Yoshihito Osada, 2004) Если поверхность, как у большинства биологических полимеров, гидрофильна - она будет притягивать воду, на прилипших молекулах которой, в свою очередь, будут выстраиваться следующее водные слои. В определении степени слоистости главным фактором выступает плотность расположения заряженных участков (Льюис): поверхности с большим количеством таких участков будут структурировать больше воды, в то время как поверхности с меньшим количеством участков будут структурировать, соответственно, меньше. Высоко заряженные поверхности способны структурировать вплоть до 600 водных слоев (см, например, обзор Vogler, 1993)
Таким образом, содержание воды в геле зависит от природы поверхности полимера Гели, созданные на основе каркаса из незаряженных полимерных молекул как правило, обладают объемным отношением воды к полимеру от 5:1 до 10:1. В то же время, заряженные молекулы полимеров способны довести это отношение вплоть до 3000:1 Наслоение воды совсем не единственная сила для гидрофильного сдерживания ее молекул. Когда вокруг поверхностных зарядов скапливаются противоположно заряженные ионы, молекулами воды руководят также и осмотические силы, правда, тот факт, что объемное соотношение воды и полимера 10:1 легко достигается даже с использованием незаряженных молекул, указывает, что этот фактор, вероятно, имеет второстепенное значение
В сущности, полимерные и клеточные гели проявляют общие структурные свойства. Оба построены из полимерных матриц, которые могут обладать значительным поверхностным зарядом, и обе матрицы содержат значительное количество слоев организованной воды, толщина которых может быть оценена с помощью различных физико-химических методов.
Переходы в структуре геля влекут за собой серьезные изменения свойств, как полимера, так и растворителя. Наиболее часто встречающийся переход полимера из растянутого в сжатое состояние легко заметен, тогда как сопровождающее его изменение растворителя не всегда явно наблюдается. На рисунке 3.8 (Yasunaga с соавт, 1993) видно, как меняется время релаксации Т2, которое отражает свободу движения молекул воды. По мере того, как температура в растворе обыкновенного полимера, названного аббревиатурой PNIPAM, повышается, значение Т2 возрастает, что предполагает интенсивный рост подвижности воды Контрольный образец чистой воды (нижний график) демонстрирует схожее поведение. Далее, при критической температуре преобразования показатель Т2 стремительно падает, вода внезапно становится связанной в качестве составляющей геля. При дальнейшем росте температуры подвижность воды снова растет. Крутой изгиб графика указывает на резкое изменение в структуре воды во время фазового перехода.
Рис. 3.8. Изменение времени релаксации (T2) геля PNIPAM в зависимости от температуоы раствора
Изменение организации растворителя при фазовом переходе можно заметить, измеряя скорость, с какой молекулы различных веществ проходят сквозь гель. Токита и Танака (Tokita, Таnаkа, 1991) измерили скорость воды под давлением через полиакриламидный гель. В момент, когда гель претерпевал фазовый переход (до какого либо объемного изменения), скорость проникновения воды возрастала примерно в 1000 раз Ученые объяснили это явление увеличением пространственной неоднородности матрикса по ходу того, как одни промежутки между его молекулами открываются, а другие закрываются, сквозь открывающиеся промежутки может быть достигнута несоизмеримо более высокая скорость проникновения. Однако, 1000-кратное изменение скорости проникновения легко объяснимо также и изменением структуры воды, таким, какое показано на рисунке. Деструктуризация резко снижает вязкость и открывает пространство для успешной диффузии внутри геля.
Перемена в состоянии воды -это ключ к пониманию того, насколько глобальными могут быть физические изменения. Рассмотрим гель, чей полимер претерпевает переход из длинной конфигурации в короткую (рис. 3.9). Длинная конфигурация является стабильной, потому как гидрофильные поверхности полимера жаждут встречи с водой, - полимер вытягивается, чтобы максимально увеличить число контактов с ее молекулами, приводя, таким образом, энергию системы к минимуму. Укороченное состояние тоже стабильно. Здесь заряды изогнутой молекулы полимера контактируют друг с другом, вместо того, чтобы контактировать с водой. Рис. 3.9. Переход из длинной конфигурации в короткую. В удлиненном состоянии молекула полимера окружена структурированной водой, в укороченном - деструктурированной. На тех участках полимерной молекулы, где заряды не экспонированы, окружающая вода деструктурирована. То есть, два состояния геля радикально отличаются друг от друга, и один аспект этого отличия напрямую связан с состоянием воды.
Кооперативность фазового перехода
Теперь обсудим переход между двумя этими состояниями. Представим ситуацию, когда гель, находящийся в равновесном удлиненном состоянии, подвергается воздействию одного из запускающих агентов, перечисленных в таблице 3.1. Воздействие выводит систему из равновесия. Начавшись, этот процесс протекает до перехода системы в новое укороченное состояние. Неотвратимость процесса предполагает наличие своего рода кооперативности - когда первое возникшее изменение, обостряет склонность к следующему изменению в том же самом направлении. Кооперативность, как правило, является результатом соперничества между двумя и более силами.
Кооперативное поведение такого рода в различных гелях может быть реализовано по-разному, но в работе этого механизма, как правило, заняты как водная, так и полимерная составляющее. Каждая молекула воды, обычно связывается водородными связями еще до четырех соседних молекул, участвует в создании водородной сети, известной своим кооперативным эффектом, - один созникший водородный мостик стимулирует образование большего количества дополнительных мостиков (Stillinger, 1980). В связи с этим, возмущения водной структуры из локально деструктурированного участка могут распространяться на соседние участки (Watieron. 1997, Vogler, 19961) способствуя, таким образом, укорочению полимера. Дальнейшая деструктуризация ведет к еще большему укорочению и т.д. (рис. 3.10).
Рис. 3.10. Распространение фазового перехода, вызванное деполяризацией воды и сжатием полимера. Полимерный компонент также способствует распространению кооперативного эффекта, и это может быть реализовано несколькими путями. Один механизм основан на классической индукционной теории, сформулированной в начале прошлого столетия Льюисом (G N Lewis) и в некоторых деталях расширенной Лингом (Ling, 1962, 1992) Эта теория, известная больше как ассоциативно-индукционная гипотеза утверждает, что в углеродной цепочке белка или искусственного полимера локальное структурное изменение приводит к сдвигу электронного облака, которое вызывает сходный сдвиг и структурное изменение в соседнем регионе и т.д. Таким образом, процесс перехода распространяется вдоль молекулы полимера. Другой кооперативный механизм включает превалирующие в клетке по количеству двухвалентные катионы, такие как катион кальция. Из-за наличия у них двух положительных зарядов они могут связываться с близко расположенными анионными участками и крепко удерживать их, привязанными друг к другу. Такая связь заставит окружающие эти нити участки сети оставаться в близком соседстве, увеличивая вероятность образования дополнительных связей. Так, механизм перехода полимера из вытяннутого гидратированного состояния в конденсированное обезвоженное состояние действует как застежка молния.
Через кооперативный механизм, подобный этому, незначительный сдвиг в условиях внешней среды способен вызвать бурную ответную реакцию. Полимерный гель может конденсироваться и практически избавиться от своей воды. Или, напротив, - сокращенный полимер может претерпевать обратный переход, впитывая гигантские объемы воды и кооперативно расширяясь до неконденсированного состояния. Безусловно, это не всегда так просто. Некоторые полимеры обнаруживают промежуточные состояния квазистабильности (Annaka, Tanaka, 1992), и совсем не обязательно их сродство к воде подчиняется закону "все или ничего". Но все же, описанный выше принцип кооперативности, включающий как полимер, так и воду, может быть принят за общий случай.
Примеры фазовых переходов:
1. Химические респонденты. Примером химического респондента может стать гелевый клапан, используемый в фармакологии для адресной доставки лекарственного препарата. Из-за высокой плотности геля препарат не может просто так выйти наружу, но когда гель претерпевает "открывающие его поры" структурные изменения, содержимое выходит наружу. Гелевый клапан защищает лекарство от уничтожения в кислоте желудочного сока, раскрываясь в щелочной среде тонкого кишечника, так как фазовые переходы, как правило, рН-чувствительны. В качестве других примеров можно привести доставку инсулина. Кроме высвобождения различных веществ, фазовые переходы можно использовать и для их фракционирования. Приведенные выше примеры иллюстрируют процесс движения молекул различных веществ внутрь или наружу в соответствии с фазовыми переходами в гелях. 2. Механические респонденты. Гели, полученные в результате сополимеризации полиакриловой кислоты и полиакриламида чрезвычайно чувствительны к механической силе. Изменение давления вызывает изменение рН и электрического потенциала (Sawahata с соавт, 1995). Изобретатели этих сенсоров задаются вопросом, не используется ли такой же механизм для рецепции давления в живой клетке
Наконец, гели могут самостоятельно генерировать колебания. Так, если определенные электропроводящее гели поместить в постоянное электрическое поле, то через электроды, введенные в различные их участки, можно зарегистрировать устойчивые колебания тока. (Міyno, Osada, 1991). Способность генерировать колебания - это обычное свойство биоэлектрических систем, например, природных водителей ритма. Эти колебания, обыкновенно объясняемые наличием мембранных токов, очевидно, могут возникать и в гелях, лишенных каких-либо мембран, что говорит в пользу предположения о возможности их возникновения благодаря гелеподобным свойствам цитоплазмы.
3. Фазовые переходы в белково-подобных гелях.
- эластомерный гель, образованный из повторяющихся мотивов эластина (Urry, 1993), подвержен обратимому переходу из удлиненного в укороченное состояние. В процессе перехода генерируется достаточное количество механической силы для того, чтобы гель мог работать как искусственная мышца. Количество работы, приходящееся на единицу массы геля, равно количеству работы, производимой фрагментом мышцы такой же массы. Инициировать этот эластомерный переход можно с помощью множества факторов -температуры, рН, добавлением соли, помещением в органический растворитель, увеличением давления, действием света и др. - гель, построенный на основе сшитого коллагена. В растворе с высокой концентрацией соли этот гель укорачивается примерно до половины своей прежней длины, претерпевая переход из спиральной структуры в клубок; средний диаметр которого в состоянии равновесия гораздо меньше, чем длина спирали. Полунатуральный гель обладает полезными функциями. Эластино- и коллагено-подобные гели претерпевают фазовый переход, совершая, таким образом, механическую работу, которая могла бы быть полезна для искусственной мьшцы или силового привода. Также могут быть реализованы и дополнительные функции эластинового геля, такие как суперабсорбентность и арматурная функция. Гели, созданные из полимеров, содержащих белковые мотивы, находят применение в системах доставки лекарств. Тема 4. Поверхностный заряд мембраных систем
Заряд клеточной поверхности, несомненно, играет важную роль в разнообразных взаимодействиях клеток, однако роль эту мы еще не научились описывать количественно. Можно ожидать, что заряд оказывает существенное влияние на химические взаимодействия, регулируя сближение и ориентацию взаимодействующих компонентов, а также изменяя такие условия, как концентрация ионов и значение pH.Так было установлено, что значение pH на уровне клеточной поверхности примерно на 0,3-0,4 единицы меньше, чем в окружающей среде.
Поверхность изолированной клетки несет обычно отрицательный заряд, который легко обнаружить и оценить количественно методом микроэлектрофореза. Опухолевые клетки имеют, как правило, большую электрофоретическую подвижность и больший поверхностный отрицательный заряд, чем нормальные. Этот отрицательный заряд складывается из зарядов карбоксильных групп сиаловой кислоты, аминокислотных остатков и фосфатных групп.
Наличие заряженных групп на поверхности клеток приводит к образованию диффузного двойного электрического слоя, в котором заряд поверхности уравновешен зарядом противоположного знака, создаваемым окружающей средой.
Для изучения электроповерхностных явлений нам следует прежде всего установить связь между такими свойствами поверхностного слоя как состав, энергия и его электрическими параметрами (заряд, потенциал).
Величины, характеризующие электрическое состояние фазы
Для описания состояния заряженной фазы используют два класса величин, один из которых измеряется в вольтах, а другие имеют размерность энергии. Электрическое состояние фазы характеризуется посредством внутреннего электрического потенциала  , внешнего потенциала  и поверхностного потенциала .
Внутренний электрический потенциал измеряет работу переноса единичного заряда из глубины фазы в бесконечно удаленную точку в вакууме.
Когда единичный электрический заряд из точки у поверхности фазы переносится на бесконечное расстояние в вакууме, то мерой работы переноса служит внешний электрический потенциал.
Пусть теперь единичный электрический заряд из глубины фазы переносится в точку у поверхности фазы, находящуюся на таком же расстоянии (10-4 см). Работа, совершаемая при этом, представляет поверхностный потенциал.
Поверхностный потенциал на границе между твердым телом и раствором зависит от адсорбции ионов или дипольных молекул, в том числе и молекул растворителя, т.е. в состав поверхностного потенциала могут входить адсорбируемые слагаемые.
Работа переноса частицы из данной фазы в другую выражается посредством химического, электрохимического и реального потенциалов. Если частица электрически нейтральная, то работа ее переноса определяется разностью химических потенциалов . При переносе электрически заряженных частиц эта работа определяется разностью электрохимических потенциалов .
- химический потенциал, -заряд частицы,
 - внутренний электрический потенциал фазы.
,
т.к. Теория ДЭС
Для описания явлений, обусловленных существованием ДЭС, необходимо провести более детальное рассмотрение его структуры и получить количественные выражения, связывающие скачок потенциала с величиной поверхностного заряда 0 .
Согласно современным представлениями, развитыми в работах Гуи и Чемпмена и основанными на идее подвижности ионов внешней обкладке (ДЭС -плоский конденсатор, внешняя обкладка которого расположена в жидкости), распределение этих ионов в пространстве определяется двумя противоположными тенденциями: электростатическим притяжением, удерживающим противоионы у поверхности и тепловым движением (диффузией) этих ионов, выравнивающим их концентрации в поверхностном слое и объеме. Устанавливающиеся равновесное распределение (порядок беспорядок) образует вблизи поверхности раствора облако электрических зарядов с убывающей плотностью, совершенное аналогичное распределению плотности газов в атмосфере или седиментационному равновесию. Равновесие концентрации катионов (С+) и анионов (С-) в поверхностном слое и объеме раствора представляется схематично для отрицательно заряженной поверхности
В соответствии со сказанным, внешнюю обкладку можно разделить на два слоя: плотный слой ионов, приближенных вплотную к поверхности и диффузный (этот термин показывает, что причина пространственной размытости слоя -диффузия). - разность потенциалов между подвижной и неподвижной частями ДЭС.
Строение плотного слоя зависит от того, сохраняется ли гидратная оболочка иона при его адсорбции или же он частично дегидратирован. Толщину плотного слоя (d) определяют как расстояние от поверхности (центра тяжести зарядов внутренней обкладки) до плоскости, проходящей через центры ближайших к поверхности противоионов.
Эту плоскость называют плоскостью наибольшего приближения ионов.
Распределение потенциала в двойном электрическом поле Обозначая через 0 и 1 значения потенциала  на поверхности и плоскости наибольшего приближения, запишем граничные условия:
=0 при x=0
=1 при x=d
=0 при x=
Запишем условие электронейтральности ДЭС
(4.1)
0-поверхностная плотность заряда внутренней обкладки
-объемная плотность заряда противоположного знака в растворе.
Интегрирование включает все ионы внешней обкладки.
Рассмотрим зависимость  от x и связь между 0 и .
Концентрация ионов вблизи поверхности определяется законом Больцмана (4.2)
Ci - концентрация i-го иона в области поверхностного слоя
Сoi- в объеме раствора
Для поверхности, заряженной отрицательно,  и, согласно уравнению для катионов (z>0) характерно сгущение во внешней обкладке (Сi>C0i), для анионов (z<0), наоборот, Сi<C0i
(4.3)
Свободный заряд складывается из избытка противоионов и недостатка ионов, заряженных одинаково с поверхностью, называемыми коионами.
Связь между  и  дает уравнение Пуассона
(4.4)
-диэлектрическая проницаемость;2= оператор Лапласа.
Считаем, что радиус кривизны много больше толщины поверхностного слоя (R>>)
В этом случае плоского ДЭС
(4.5)
Применение уравнений 4.4, 4.5 означает допущение о непрерывности распространения заряда во внешней обкладке, тогда как на самом деле он дискретен. Поскольку, однако, ионы внешней обкладки обладают значительной подвижностью, они статистически размазываются равномерно в каждой точке эквипотенциальной поверхности, поэтому применение (4.4, 4.5) не должно вносить заметной ошибки.
Учитывая 4.2, 4.3 и 4.5
уравнение Пуассона-Больцмана
Умножим обе части на Интегрируем от 0 до 
Ограничимся случаем бинарного симметричного электролита, для которого С0=-=С0+=С,
Разложение квадрата разности
При x>d
(безразмерный потенциал)
При =1, x=d
, где Уравнение Гуи
Уравнение Гуи выражает плотность поверхностного заряда 0 как функцию безразмерного потенциала r1(1) в плоскости наибольшего приближения ионов и равновесной концентрации электролита C.
Уравнение Гуи учитывает лишь кулоновское притяжение между ионами и не учитывает специфической адсорбции противоионов под действием некулоновских (Ван-дер-ваальсовских) сил.
Теория Штерна
Штерн вводит понятие адсорбционного потенциала иона Фі выражающего изменение потенциальной энергии системы при переносе одного иона вещества из глубины раствора в поверхностный слой при  = 0, т.е. при отсутствии электрического поля.
 Условие электронейтральности:
-0=1+2
1- плотность заряда в плотном слое (называемом слоем Штерна в случае специфической адсорбции) 2 - плотность заряда в диффузном слое.
Объём 1 см2 плотного слоя равен 2d
1=2d   = zF(C+ - C-)
Выражение для 2 имеет форму уравнения Гуи
В полученное выражение для первый член изменяется линейно с С, второй - с . Это означает, что по мере увеличения С в растворе относительный вклад заряда плотного слоя в величину заряда внешней обкладки должен возрастать.
При малых Фі целесообразнее пользоваться уравнением Гуи.
Емкость ДЭС
Представление о ДЭС как о плоском конденсаторе весьма плодотворно, ибо позволяет оценить его толщину, характерезующую его протяжённость в жидкой фазе.
Плотный слой Для плоского конденсатора ёмкость плотного слоя
Подставим (4.1) в уравнение Гуи
При Диффузный слой
Рассмотрим случай для малых значений : ; или В этом случае разложение уравнения Гуи в ряд по малому параметру даёт:
; Умножим под корнем числитель и знаменатель на и вынесем из под корня
- приведённая толщина диффузного слоя
Теория ДЭС, широко используемая для интерпретации поверхностных явлений, нуждается в экспериментальной проверке. Однако мы не имеем возможности измерить прямыми методами. Можно измерить другую, близкую к величину - электрокинетический потенциал (дзета - потенциал).
Дзета - потенциал определяют как потенциал границы скольжения фаз, также отсчитываемый от уровня границы раздела.
Граница скольжения устанавливается при относительном перемещении фаз, например при течении жидкости вдоль твёрдой поверхности. Мы не знаем точно, где она проходит по отношению к ДЭС. Можно с достаточной уверенностью предполагать, что первый слой ионов со своими гидратными оболочками и первый слой молекул воды, смачивающих твёрдую фазу, не перемещаются относительно твёрдой фазы при течении жидкости. Поэтому следует полагать, что граница скольжения проходит либо на расстоянии d от поверхности и в этом случае , либо смещена глубже в жидкую фазу, оставляя часть ионов диффузионного слоя в неподвижном гидродинамическом слое жидкости; в этом случае .
В первом приближении можно считать, что .
Зависимость между электрофоретической подвижность и дзета-потенциалом (который является измеряемым при электрофорезе эквивалентом поверхностного заряда клеток или иных крупных частиц при физиологических концентрациях солей, когда двойной электрохимический слой тонок) приближенно описывается уравнением Гельмгольца-Смолуховского:
где - электрофоретическая подвижность, т.е. ,
E - напряженность поля, - вязкость среды,
- диэлектрическая постоянная среды, - дзета-потенциал.
С помощью этого уравнения можно вычислить дзета-потенциал клеток. Если результат требуется выразить, как обычно, в милливольтах, то из уравнения при выводят нормированную формулу:
(мВ),
при этом указывают в пуазах, а B в см2с-1В-110-4.
Пользуясь этим расчетом, можно проследить за изменениями поверхностных зарядов клеток в различных условиях.
Обработка клеток ферментами, например, нейраминидазой, ведет к характерным изменениям поверхностного заряда, анализ которых помогает при изучении структуры мембраны.
Каждому типу клеток свойственна характерная электрофоретическая подвижность с очень небольшим разбросом величин. В связи с этим полагают, что величина заряда клеточной поверхности детерминирована генетически; поэтому измерение электрофоретической подвижности считают подходящим методом изучения и идентификации клеток. Величина электрокинетического потенциала при равных других условиях зависит от физико-химической структуры поверхности клеток - от собственного заряда при диссоциации ионогенных групп, от ионов, адсорбирующихся на поверхности.
Эритроциты имеют стабильные величины дзета - потенциала для одного и того же вида животных и обнаружены значительные вариации потенциала для различных видов. У человека наименьшей подвижностью обладают гранулоциты (0,620,0310-4 см2с-1В-1), далее следуют лимифоциты (0,790,0210-4 см2с-1В-1), а быстрее всего движутся эритроциты (1,010,0210-4 см2с-1В-1). При различных заболеваниях так называемая "гемоцитоферограмма" претерпевает значительные изменения.
Эмброуз впервые применил клеточный электрофорез для выяснения различий между нормальными и опухолевами клетками. Были обнаружены различия электрокинетических свойств не только у клеток разных штаммов опухолей, но и у клеток одного штамма на разных этапах роста опухоли. Толщина двойного слоя и величина - потенциала зависит от концентрации и природы соли. При уменьшении концентрации соли в 200 раз толщина двойного слоя увеличивается примерно в 5 раз, а при достаточно высокой концентрации соли величина - потенциала может снизиться до 0. Снижение - потенциала с ростом концентрации соли вызвано уменьшением толщины диффузного слоя. В очень концентрированных растворах диффузная часть двойного слоя настолько прижата к стенке мицеллы, что - потенциал практически исчезает. В таком состоянии, называемом изоэлектрическим, мицелла ведёт себя, как незаряженная частица. В действительности на её поверхности заряды и ионы, конечно, сохраняются, но они взаимно компенсируют друг друга. Если же в воде присутствуют двухвалентные катионы (например Ca2+), то избыток положительного заряда может оказаться столь большим, что - потенциал изменит свой знак.
Липидная мицелла с суммарным отрицательным зарядом будет относиться не безразлично и к окружающей её воде. Ионы Н+ притягиваются отрицательно заряженной поверхностью мицеллы, а гидроксильные группы отталкиваются в водную фазу. Поэтому кислотность среды вблизи поверхности мицеллы заметно отличается от кислотности водного раствора.
Таким образом, у поверхности липидов существенно меняются концентрация солей, физические свойства и кислотность среды. Эти изменения оказывают большое влияние как на процессы, протекающие внутри клетки, так и на взаимодействие липидов с белками.
Тема 5. Перекисное окисление липидов
Повреждение компонентов биологических мембран при патологических процессах
Рис. 5.1. Мембранные структуры, чувствительные к действии поврежденийНа рис. 5.1 дано схематическое изображение типичной мембраны с указанием тех ее элементов, повреждение которых может иметь место в патологии и лежать в основе развития различных заболеваний. Наиболее тяжелые последствия вызывает повреждение липидного слоя (или бислоя) мембран. Изучение воздействия разного рода повреждающих агентов на изолированные клетки (например, эритроциты), митохондрии, фосфолипидные везикулы (липосомы), плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ) и другие модельные объекты показало, что, в конечном счете, существует всего четыре основных процесса, которые непосредственно обусловливают нарушение целостноголипидного бислоя в патологии [Владимиров Ю. А., 1973]:перекисное окисление липидов; * действие мембранных фосфолипаз; * механическое (осмотическое) растяжение мембраны; * адсорбция на бислое полиэлектролитов, включая некоторые белки и пептиды. Чтобы понять роль этих процессов в развитии патологического состояния, надо знать химические и физические условия протекания каждого из них, пути их регуляции в живой клетке и причины ее нарушения, характер повреждения свойств мембран под действием данного процесса, биологические последствия такого повреждения мембран для жизнедеятельности клетки и организма в целом. Рассмотрим эти вопросы на примере наиболее изученного процесса - перекисного окисления (пероксидации) липидов. Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов
Перекисное окисление (пероксидация) липидов - пример процесса, идущего с участием свободных радикалов. Свободные радикалы - это молекулярные частицы, имеющие непарный электрон на внешней орбитали и обладающие высокой реакционной способностью. Их изучение ведется методом ЭПР (спиновые ловушки), хемилюминесценции и путем применения ингибиторов реакций, в которых участвуют радикалы определенного типа. В таблице 1 дан перечень основных типов свободных радикалов, образующихся в организме человека. Таблица 5.1. Свободные радикалы, образующиеся в клетках нашего организма
РадикалОсновной источникВредные реакцииПервичные радикалы:СемихиноныЦепи переноса электроновHQ· + O2 Q+ ·O2- + H+СупероксидКлетки-фагоциты·O2- + Fe3+  O2 + Fe2+Монооксид азота(NO)Клетки эндотелия и многие другиеNO· + ·O2-  OONO- (пероксинитрит)Вторичные радикалы:Радикал гидроксилаH2O2 + Fe2+  Fe3+ + HO- + HO· (реакция Фентона)
HOCl + Fe2+  Fe3+ + Cl- + HO· (реакция Осипова)Повреждение ДНК и РНК, цепное окисление липидовРадикалы липидовЦепное окисление липидовПовреждение липидного бислоя и мембранных ферментовРадикалы антиоксидантовЦепное окисление липидовИногда оказывают прооксидантное действиеРадикалы, образующиеся при метаболизме ксенобиотиковПромышленные токсины и некоторые лекарстваОбразование вторичных радикаловРадикалы, образующиеся при действии светаПоглощающие свет веществаОбразование вторичных радикалов
Цепное окисление липидов
Реакция цепного окисления липидов играет исключительную роль в клеточной патологии. Она протекает в несколько стадий, которые получили название инициирование, продолжение, разветвление и обрыв цепи. Инициирование цепи
Радикал гидроксила, будучи небольшой по размеру незаряженной частицей, способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами (которые принято обозначать как LH), входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови. При этом в липидном слое мембран образуются липидные радикалы: HO· + LH H2O + L· (5.1)
Липидный радикал (L·) вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом; при этом образуется новый свободный радикал - радикал липоперекиси (LOO·):
L· + O2  LOO· (5.2)
Продолжение цепи
Радикал LOO· атакует одну из соседних молекул фосфолипида с образованием гидроперекиси липида LOOH и нового радикала L·:
LOO· + LH  LOOH + L· (5.3)
Чередование двух последних реакций как раз и представляет собой цепную реакцию перекисного окисления липидов. Разветвление цепи
Существенное ускорение пероксидации липидов наблюдается в присутствии небольших количеств ионов двухвалентного железа. В этом случае происходит разветвление цепей в результате взаимодействия Fe2+ c гидроперекисями липидов:
Fe2+ + LOOH Fe3+ + HO- + LO·
Образующиеся радикалы LO· инициируют новые цепи окисления липидов:
LO· + LH  LOH + L·;
L· + O2  LOO·  и т. д.
Обрыв цепей
В биологических мембранах цепи могут состоять из десятка и более звеньев. Но в конце концов цепь обрывается в результате взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами (InH), ионами металлов переменной валентности (например, теми же Fe2+) или друг с другом: LOO· + Fe2+ + H+  LOOH + Fe3+
LOO· + InH  In· + LOOH
LOO· + LOO·  молекулярные продукты + фотон
Биологические последствия пероксидации липидов
Увеличенное образование свободных радикалов в организме и связанное с этим усиление процессов пероксидации липидов (которое иногда называют "оксидативным стрессом") сопровождается рядом нарушений в свойствах биологических мембран и функционировании клеток. В таблице 5.2 приведены наиболее важные изменения в мембранных структурах при перекисном окислении липидов. Клеточные системы антирадикальной защиты
В нормальных условиях процесс перекисного окисления липидов находится под строгим контролем ферментативных и неферментативных систем клетки, от чего скорость его невелика. Принято делить химические соединения и физические воздействия, влияющие на скорость перекисного окисления липидов, на прооксиданты (усиливают процессы перекисного окисления) и антиоксиданты (тормозят перекисное окисление липидов). К прооксидантам в живой клетке относятся высокие концентрации кислорода (например, при длительной гипербарической оксигенации больного), ферментные системы, генерирующие супероксидные радикалы (например, ксантиноксидаза, ферменты плазматической мембраны фагоцитов и др.), ионы двухвалентного железа. Хотя сам процесс перекисного окисления развивается в виде цепных реакций в липидной фазе мембран и липопротеинов, начальные (а возможно, и промежуточные) стадии этой сложной системы реакций протекают в водной фазе. Часть защитных систем клетки также локализуется в липидной фазе, а часть - в водной фазе. В зависимости от этого можно говорить о водорастворимых и гидрофобных антиоксидантах. В таблице 5.3 приведены наиболее известные антиоксиданты. Таблица 5.2. Наиболее важные изменения в мембранных структурах при перекисном окислении липидов
Действие перекисного окисления на мембранные белки Действие перекисного окисления на липидный слой мембранОкисление тиоловых соединений
Повреждение переносчиков
Появление проницаемости для ионов
Повреждение транспортных АТФазУвеличение микровязкости мембран
Изменение поверхностного заряда мембран и липопротеинов
Уменьшение гидрофобного объема
Увеличение полярности липидной фазы
Увеличение проницаемости для ионов водорода
Увеличение проницаемости для ионов кальция
Таблица 5.3. Наиболее известные антиоксиданты
АнтиоксидантДействиеЦерулоплазмин (плазма крови)Окисляет Fe2+ до Fe3+ молекулярным кислородомАпо-белок трансферрина (плазма крови)Связывает Fe3+Ферритин (цитоплазма)Окисляет Fe2+ и депонирует Fe3+КарнозинСвязывает Fe2+Супероксиддисмутазы (повсеместно)Удаляет супероксид с образованием пероксида водородаКаталаза (внутри клеток)Разлагает пероксид водорода с выделением кислородаГлутатион-пероксидазы (в цитоплазме)Удаляет пероксид водорода за счет окисления глутатиона
Удаляет гидроперекиси липидовГлутатионредуктазаВосстанавливает окисленный глутатионТокоферол, тироксин, стероидыПерехватывают радикалы липидовАскорбиновая кислотаРегенерирует окисляющиеся токоферол и убихинонГлутатионИспользуется для восстановления пероксидов Супероксиддисмутаза (СОД) - КФ 1.15.1.1 катализирует реакцию
В итоге реакции образуется пероксид водорода, способный инактивировать СОД. Поэтому СОД локализована и функционирует обычно в содружестве с каталазой, быстро и эффективно разлагающей Н2О2. Скорость супероксиддисмутазной реакции весьма велика, константа скорости второго порядка достигает 2•109 моль-1•с-1. Активный центр фермента содержит атомы металлов с переменной валентности.
Каталаза -КФ 1.11.1.6 - гемопротеид, катализирующий реакцию
Реакция протекает в две стадии: сначала образуется комплекс фермента с одной, затем - со второй молекулой пероксида водорода. Каталаза способна реагировать и с другими донорами водорода; в этом случае комплекс фермента с одной молекулой пероксида реагирует с субстратами подобно пероксидазе:
Каталаза из печени быка имеет молекулярную массу около 248 кДа и содержит четыре гемовых группы. Субъединицы лишены самостоятельной каталитической активности. Скорость катализа исключительно велика: одна молекула каталазы в секунду разлагает до 44 тыс. молекул пероксида водорода; пероксидазная активность каталазы существенно ниже. Основная функция каталазы в клетке - разложение пероксида водорода, образующегося при дисмутации супероксидного анион-радикала. Наиболее высокая активность каталазы отмечена в гепатоцитах, в пероксисомах последних фермент составляет до 40 % всего белка. Таким образом, АО-ферменты СОД и каталаза, функционируя совместно, в большинстве случаев своевременно инактивируют активные формы кислорода (АФК), и Н2О2, образующиеся как в процессе нормальной жизнедеятельности клеток, так и в условиях значительной активации ПОЛ, в том числе патологически обусловленной. Однако наиболее эффективно ПОЛ активируется в липидных (фосфолииидных структурах биомембран и сопровождается образованием липидных пероксидов, слабо устраняемых системой СОД - каталаза. Кроме того, даже в условиях успешной дезактивации супероксида (СОД) и пероксида водорода (каталаза) существует опасность образования особо высокореактивного радикала , хотя бы по реакции Хабер-Вайсса:
Время жизни столь ничтожно, что его ферментативная инактивация невозможна. Требуются другие, рассматриваемые далее, механизмы защиты. Разумеется, чем более полно инактивируют свои активные субстраты СОД и каталаза, тем меньше возможностей образования .
Система глутатиона
Глутатионзависимая АО-система включает три глютатион зависимых фермента: ГПО, ГР и ГТ. Центральный метаболит системы - трипептид глутатион, (GSH) - глутамилцистеинглглицин, обладающий и собственной АО-активностью и функционирующий в качестве кофактора, донора водорода, метаболита и субстрата с ферментами системы, а также с СОД и каталазой.
С функциональной точки зрения в АО-системе глутатиона южно выделить четыре звена:
1) обеспечения функционирования системы - ГР;
2) детоксикации пероксидных соединений - ГПО и каталаза;
3) антирадикальной защиты - СОД и GSH;
4) детоксикации электрофильных соединений - ГТ.
Глутатионредуктаза (ГР) - НАД(Ф)Н: окисленный глутатион оксидоредуктаза, К.Ф. 1.6.4.2, катализирует реакцию:
2НАД(Ф)Н + GS-SG  2НАД(Ф) + 2GSH Центральное место этого фермента в метаболизме глутатиона и всей его системы связано с тем, что он осуществляет единственный известный механизм восстановления GSH из его окисленной формы GS-SG. Остальные ферменты, кроме глутатионсинтетаз, являются потребителями восстановленного глутатиона.
ГР - флавопротеин с простетической группой флавинадениндинуклеотидом; его молекула состоит из двух идентичных субъедиииц. Глутатионпероксидаза (ГПО) - К.Ф. 1.11.1.9, катализирует реакцию:
2GSH + Н2О2  GS-SG + 2Н2О ГПО - селенопротеин, однако не исключено, что по крайней мере в сыворотке крови человека ГПО присутствует как селеногликопротеин. Молекула ГПО имеет молекулярную массу около 74 кДа и состоит из четырех идентичных субъединиц. ГПО обезвреживает не только Н2О2, но и органические, в том числе липидные, пероксиды, образующиеся в организме при активации ПОЛ. Фермент локализован преимущественно в цитозоле клеток, в незначительном количестве находится также в микросомах. Функционирует сопряженно с ГР, защищая клетки от генерируемого вне их пероксида водорода. Глутатионтрансфераза (ГТ) -К.Ф.2.5.1, катализирует реакции типа:
RX + GSH  НХ + GS-SG.
ГТ осуществляют четыре основных типа реакций:
1)присоединение к субстрату полной молекулы глютатиона: R + GSH  HRSG;
2)нуклеофильное замещение:
RX + GSH RSG + НХ;
"уходящей" группой в этой реакции может быть галоген, , RO-, RS-, СN- и др.;
3) восстановление органических пероксидов до соответствующих спиртов:
ROOH + 2GSH  ROH + GSSG+ Н2О;
4) изомеризация (стероидов, простагландинов).
Вторая по значимости АО- система биологических жидкостей - система аскорбиновой кислоты.
Наличие в АК двух сопряжённых двойных связей (углерод-углеродной и углерод-кислородной) обуславливает ее способность к обратимому окислению, продуктом которого является дегидроаскорбиновая кислота (ДАК). ДАК устойчива, но ее лактонное кольцо, в отличие от стабилизированного двойной связью лактонного кольца L-АК в водном растворе легко гидролизуется с образованием 2,3-дикетогулоновой кислоты (2,3-ДКГК). Эта реакция необратима, ее скорость возрастает при повышении температуры и рН среды. Через ряд дальнейших превращений ДКГК переходит в щавелевую и L-треоновую кислоты (рис.5.2). Такое же превращение имеет место в организме.
Способность к окислительно-восстановительным превращениям, связанная с ендольной группировкой, которая стабилизирована находящейся в цикле соседней карбонильной группировкой, сопровождающаяся перенесением атомов водорода к акцепторам, является важнейшей каталитической функцией АК в живом организме. L-АК по своей биологической активности высокоспецифична. L-ДАК имеет витаминную активность, равноценную L-АК, тогда как 2,3-ДКГК полностью ее лишена. Вследствие легкой окисляемости L-АК - донор Н+, она количественно легко восстанавливает многочисленные соединения, как-то: йод, перманганат калия и другие. Рис. 5.2. Процессы окисления аскорбиновой кислоты.
L-АК - переносчик Н+ в некоторых ферментативных реакциях живой клетки, она легко окисляется пероксидазой, цитохромоксидазой, каталазой. L-АК восстанавливает окисленные формы ферментов, окисляясь в ДАК, обратимо легко регенерирующуюся в АК под действием глутатиона за счет его сульфгидрильной группы:
Часть ІІ. Транспорт веществ через мембрану
Классификация транспортных мембранных процессов согласно мембранной теории
Тема 6. Простая диффузия
Растворенные или взвешенные в жидкости частицы находятся в непрерывном движении, которое в отношении внешних полей является хаотическим. Рассмотрим некий элемент объема, концентрация частиц в котором больше чем в окружающем растворе. Тогда в соответствии с законами вероятности, число частиц, покинувших этот элемент за данным промежуток времени, будет больше чем число поступивших частиц. По этой причине в растворах со временем выравнивается концентрация - этот процесс называется диффузией. Скорость диффузии подчиняется важному феноменологическому закону, который называется I законом Фика:
Поток равен числу частиц, диффундирующих вдоль оси Х в единицу времени через единичную площадку, перпендикулярную это оси. Поток прямо пропорционален коэффициенту диффузии и градиенту концентрации dС/dх в данной точке оси х в данный момент времени.
Чисто феноменологически первый закон Фика можно рассматривать как некий частный случай общей формулы Теорела для потока: Поток = Подвижность Концентрация  движущая сила, где поток есть количество вещества в молях, которое проходит в единицу времени через единичную площадку, перпендикулярно направлению движения.
В отсутствии внешних полей система стремиться к равновесию, при котором растворенное вещество имеет одинаковый химический потенциал в каждой точке раствора. Следовательно, при описании простой диффузии в качестве полной движущей силы в уравнение Теорелла следует ввести градиент химического потенциала со знаком минус, который в одномерном случае равен частной производной по х. Обозначив , получим I закон диффузии Фика
II Закон Фика
Пусть имеются две плоскости, расположенные на бесконечно малом расстоянии друг от друга перпендикулярно оси х и пересекающие эту ось в точках х и x+dx. Градиент концентрации в первой плоскости равен ,
а во второй Диффузионные потоки через обе плоскости равны соответственно:
Разность этих потоков определяет скорость изменения числа молей вещества между плоскостями на единицу площади Поскольку объём, заключенный между плоскостями с единичной площадью, численно равен , скорость изменения концентрации в этом объёме равна:
т.е. скорость изменения концентрации пропорциональна второй производной от концентрации по координате х. В более общем случае, когда диффузия не одномерна, следует пользоваться уравнением Коэффициент диффузии
Другой подход к вычислению коэффициентов диффузии был развит Энштейном, согласно котрому, для частицы произвольной формы -константа Больцмана, Т-абсолютная температура; В-коэффициент трения частицы при движении ее в сплошной среде.
Если частица имеет сферическую форму, то величина коэффициента трения определяется уравнением Стокса
R-радиус частицы, -вязкость среды
Зная радиус диффундирующей частицы, измерив вязкость среды при заданной температуре, можно вычислить значение коэффициента диффузии.
Из уравнения Стокса-Энштейна следует важная особенность параметра D.
1. Зависимость от молекулярного веса вещества. Если молекулы представить в виде шариков с постоянной плотностью d, то их масса , M-молекулярный вес, N-число Авогадро
Коэффициент диффузии должен не сильно зависеть от молекулярного веса диффундирующего вещества. Так, увеличение молекулярного веса в 100 раз должно приводить к уменьшению величины коэффициента диффузии молекулы в 4,6 раза.
2. Зависимость от температуры
Как следует из уравнения, температурный ход коэффициента диффузии определяется параметром . Так как изменением температуры в обычно используемом диапазоне (270-320К) можно пренебречь, коэффициент диффузии должен изменяться с температурой обратно-пропорционально изменению вязкости среды. Поскольку вязкость не очень чувствительна к изменению температуры, то и величина коэффициента диффузии имеет лишь небольшой температурный коэффициент.
Если D представить в виде -не зависит от температуры
то при диффузии в водной среде величина энергии активации процесса диффузии активации процесса диффузии равна
4,5 ккалмоль для мочевины
4,8 ккалмоль для аланина
5,0 ккалмоль для альбумина (М=69000).
Перемещения частиц в мембране
Случайные тепловые движения молекул приводят к тому, что вещества переносятся из области более высоких концентраций в область более низких. Это и есть дифузионный перенос.
Обычно процесс диффузии рассматривают как результат случайных блужданий частицы (молекулы или иона) под влиянием тепловых соударений с молекулами окружающей среды. Частица под влиянием тепловых соударений с окружающими молекулами совершает хаотические скачки. Они происходят, разумеется, в любом направлении, а следовательно, перемещение частицы при каждом скачке представляет собой вектор, который, как и всякий вектор может быть представлен в виде суммы составляющих по трём направлениям.
Рис. 6.1. Выбор направления потока при трансмембранном переносе ионов.
Выберем одно из них и обозначим его как направление оси Х. В случае переноса ионов через биомембраны за ось Х можно принять ось, перпендикулярную к мембране и направленную изнутри везикулы (например, клетки) наружу (см. рис. 6.1).
Как же перемещается ион в толще липидного слоя мембраны?
Такое перемещение возможно благодаря перестройке конфигурации жирнокислотных цепей и образованию нового "кинка". Ион движется, как бы перескакивая от кинка к кинку, как это изображено на рис. 6.2. Причина образования новых кинков и скачков иона - тепловые удары окружающих молекул. Рис. 6.2. Движение иона поперёк мембраны путём перескакивания из одного "кинка" в другой. Согласно схеме, показанной на рис. 6.2, частица движется в направлении X. На рисунке показаны не разные молекулы фосфолипидов в бислое, а разные стадии процесса переноса иона поперёк мембраны. 2-8 -изменение во времени положения иона в мембране.
Понятно, что не всякое взаимодействие с окружающими молекулами вызывает изменение координаты нашей частицы. Чтобы раздвинуть цепи жирных кислот и перескочить в новую петлю, молекула должна обладать достаточной кинетической энергией. В сплошной среде, такой как липидный слой мембраны, ион находится как бы в потенциальной яме. Выскочить из неё можно только преодолев определённый энергетический барьер (рис. 6.3). Однако в результате хаотического теплового движения окружающих молекул и самого иона время от времени становится возможен перескок частицы из одной "ямы" в другую, соседнюю "яму". Вероятность такого перескока зависит от глубины ямы и температуры.
Рис. 6.3. Схема переноса ионов в мембране в результате случайных скачков иона между энергетическими "ямами".
Введём следующие обозначения:
 - частота перескоков частицы в соседнее устойчивое положение. Слева направо каждую секунду частица будет "прыгать" в среднем (/2) раз; столько же скачков каждая частица сделает в среднем справа налево.
 - расстояние между двумя соседними энергетическими "ямами", т.е. длина пробега молекулы при каждом "скачке".
Представим себе, что через мембрану мы провели плоскость S, нормальную к оси Х (рис. 6.4).
Рис. 6.4. Диффузионный поток ионов через мембрану.
S - площадь нормальная к направлению потока,
 -длина пробега молекулы при каждом скачке. С1 и С2 - молярные концентрации ионов слева и справа от мембраны в слоях толщиной . Каждую секунду слева направо будут переноситься все частицы в объёме S, что соответствует С1S киломолей вещества, где С1 - концентрация вещества слева от плоскости S, кмоль/м3;  - длина пробега молекулы при каждом "скачке". Это и будет однонаправленный поток ионов через площадь S:
(6.1)
Аналогичным образом находим однонаправленный поток частиц (например, ионов K+) справа налево (6.2)
Разница между этими потоками даёт нам общую величину потока ионов в направлении оси X:
(6.3) Уравнение 6.3 показывает, как может случайное перемещение каждой частицы приводить к направленному суммарному потоку ионов. Ионы уходят из области с большей концентрацией в область с меньшей концентрацией именно в силу совершенно хаотического движения каждой частицы. Статистика оказывается движущей силой потока.
К сожалению, точное значение средней концентрации в тонких слоях, прилегающих к плоскости S, неизвестны, как и их разность (С1-С2). Чтобы выйти из положения, заменим отношение (С1-С2)/ на производную функцию (dС/dx); в результате получаем:
(6.4)
Это уравнение стоит сравнить с хорошо известным из физики эмпирическим уравнением диффузии (которое описывает так называемый первый закон Фика):
(6.5)
Мы видим, что эмпирический коэффициент D на самом деле зависит всего-то от частоты "перескоков" молекулы () и расстояния (), на которое молекула "прыгает" при каждом перескоке.
(6.6)
Поток ионов через мембрану. Проницаемость
Величина (dС/dx), входящая в уравнение I закона Фика, не поддаётся непосредственному экспериментальному определению; в самом деле, как нам измерить градиент концентрации иона внутри липидного слоя мембраны? Чтобы перейти к величинам, измеряемым в опыте, нужно решить дифференциальное уравнение, т.е. провести разделение переменных и интегрирование. Эту процедуру можно осуществить при одном важном условии: одинаковости плотности потока при различных координатах плоскости S, через которую проходит поток.
Подумаем о физическом смысле такого постоянства потока. Если добавить в среду, омывающую клетку, какое-нибудь новое соединение (или изменить концентрацию одного из имеющихся), то в первый момент градиент концентрации (dС/dx) возникнет только около внешней поверхности мембраны и только там "хлынет" поток частиц в мембрану. Но затем поток установится, приняв некоторое постоянное значение, и величина потока в разных "срезах" мембраны будет одинаковой. Найдем зависимость величины такого установившегося во времени потока от концентраций частиц у левой Cm1 и правой Cm2 границ мембраны. Для этого проинтегрируем уравнение I закона Фика, предварительно разделив переменные:
;
;
(6.7)
Откуда:
(6.8)
Концентрации частиц внутри мембраны, хотя бы и на границе с водной фазой (Cm1 и Cm2), нам неизвестны; однако их можно найти, если известны концентрации этих частиц в окружающей водной среде (C1 и C2, рис. 6.5). Градиент концентрации частиц - это тангенс угла наклона концентрационной кривой в данном месте мембраны (т.е. при данном X).
Можно считать, что частицы вещества распределяются между фазами по закону:
(6.9)
где K - коэффициент распределения частиц между мембранной и водной фазами. Очевидно, что данное уравнение предполагает, что мембрана симметрична в том смысле, что коэффициенты распределения ионов одинаковы на обеих границах мембраны.
Рис. 6.5. Концентрационный профиль мембраны, т.е. зависимость концентрации вещества от координаты оси X, перпендикулярной к плоскости мембраны. Cm1 и Cm2 - концентрации частиц в мембране на границе с водной фазой- C1 и C2 - концентрации частиц в водной фазе у границ с мембраной. Подставив величины Cm1 и Cm2 из уравнения 3 в уравнение 3, получаем окончательно:
(6.10)
Это уравнение аналогично известному второму закону Фика:
(6.11)
где эмпирический коэффициент P называют коэффициентом проницаемости или просто проницаемостью.
Итак:
(6.12)
Связь коэффициента проницаемости с другими величинами в последнем уравнении полна глубокого физического смысла. В самом деле, проницаемость:
1. Прямо пропорциональна коэффициенту диффузии иона D в веществе мембраны. Последняя величина связана с геометрическими размерами иона и вязкостью мембраны. Для сферических частиц коэффициент диффузии связан с вязкостью среды и радиусом иона r уравнением Стокса:
(6.13)
В более вязкой среде диффузия затруднена, и проницаемость вязкой мембраны ниже, чем проницаемость мембраны с более "жидким", или лучше сказать, более текучим липидным слоем.
2. Прямо пропорциональна коэффициенту распределения иона K в системе мембрана/вода, т.е. гидрофобности иона. Поэтому жирорастворимые лекарства проникают в клетки в общем-то лучше, чем водорастворимые.
3. Обратно пропорциональна толщине мембраны l.
Кинетика переноса веществ при диффузии
Если поток идет через поверхность А в объём V, то изменение концентрации в объёме V будет зависеть от разности концентраций Co и Ci. При условии Ci=0 при t=0 и Ci=Co при t= и обозначив ; ; ; k - константа скорости поступления вещества в объём V.
Для выхода вещества из конечного объёма V в бесконечный объем:
; ; ; Оба уравнения отражают кинетику первого порядка
Зависимость (для входа вещества) и (для выхода) от времени представляет на графике прямую линию с наклоном Выводы:
1. При расчете на единицу поверхности мембраны однонаправленный поток 2. Поток внутрь клетки , из клетки 3. 4. При равенстве концентраций с обеих сторон мембраны поток вещества равен нулю. Но это не означает, что прекращается движение молекул, а свидетельствует лишь о том, что движение молекул через данную поверхность одинаково в обоих направлениях.
Тема 7. Процессы пассивного и активного транспорта
7.1. Термодинамика процессов переноса Характерной особенностью термодинамического равновесия является отсутствие в системе самопроизвольных процессов. Работу может совершать только система, способная к самопроизвольным изменениям, а потому равновесная система работу не совершает.
Типичные системы, в которых происходит мембранный транспорт, являются изотермическими и изобарическими. Постоянство температуры обеспечивается высокой теплопроводностью тканей или среды, а постоянство давления - сообщением с атмосферой.
Способность таких систем совершать работу по изменению объема при постоянном давлении определяется свободной энергией Гиббса. В равновесии свободная энергия системы остается постоянной.
Отдельные части системы, разделенные мембраной, представляют собой открытые системы, свободная энергия которых может изменяется при переносе вещества через мембрану. Если этот процесс сопровождается уменьшением свободной энергии системы в целом, он протекает самопроизвольно и носит название "пассивного" транспорта. Перенос вещества может происходить и с возрастанием парциальной свободной энергии, если он сопряжен с такими химическими реакциями или транспортом других молекул, в ходе которых свободная энергия всей системы в конечном счете уменьшается. Такие процессы называются "активным" и "вторично активным" транспортом соответственно.
Изменение свободной энергии Гиббса G, вызванное поступлением в систему молей вещества J, равно
(7.1)
Частная производная в этом соотношении называют химическим потенциаломвещества J и определяет парциальную моляльную свободную энергию Гиббса компонента J при постоянных температуре и давлении.
Предположим, что мембрана разделяет два отсека, содержащих раствор вещества j, химический потенциал которого в наружном отсеке , а во внутреннем -. Перенос молей вещества из внутреннего отсека в наружный сопровождается изменением свободной энергии всей системы на величину (7.2)
и этот процесс протекает самопроизвольно, если изменение свободной энергии отрицательно, т.е. при . Пассивный транспорт прекращается, и система приходит в состояние термодинамического равновесия, когда (7.3)
химический потенциал неэлектролита в разбавленном растворе записывается в виде
(7.4),
- стандартная свободная энергия вещества. Из (3) и (4) следует, что в термодинамическом равновесии
(7.5)
т.е. концентрация неэлектролита в двух растворах должна быть одинаковой.
В выражении для электрохимического потенциала ионов необходимо включить член, соответствующий электростатической энергии, а при описании переноса молекул растворителя (находящегося в избытке) нельзя пренебрегать гидростатическим давлением, и химический потенциал этих молекул не мог быть выражен только через концентрацию.
Уравнение (7.2) позволяет рассчитать энергию, необходимую для активного транспорта. При переносе вещества против градиента химического потенциала (против градиента концентрации) свободная энергия возрастает со скоростью (7.6)
или на единицу площади поверхности мембраны
(7.7) где
(7.8) Последнее выражение определяет поток вещества, т.е. число молей, переносимых в единицу времени через единицу площади. Это увеличение свободной энергии должно компенсироваться по меньшей мере таким же уменьшением и в ходе химических реакций, протекающих на поверхности или внутри мембраны, либо при сопряженном транспорте другого вещества по градиенту его концентрации.
7.2. Пассивный транспорт веществ с помощью переносчиков
Нерастворимые в липидах вещества, с радиусом молекулы больше 4А через мембрану проникать не могут. Действительно, шестиатомные спирты, имеющие радиус молекулы 4,2 А, в большинство клеток практически не проникают. Однако моносахариды с таким же размером молекул являются, как правило, относительно хорошо проникающими веществами. Исследование проницаемости клеток для сахаров, аминокислот позволило прийти к заключению о наличии специфических транспортных систем, осуществляющих перенос этих веществ через мембрану. В начале для этого типа транспорта, протекающего по градиенту концентрации, был предложен термин "облегченная диффузия", но впоследствии, стал употребляться термин "транспорт посредством переносчиков". Термин "пассивный транспорт" представлен более правильным, т.к. термин "транспорт посредством переносчиков" включает гипотетическое предположение о существовании переносчиков. Однако практическое рассмотрение характеристик пассивного транспорта удобно вести на основе модели с переносчиками, которая разработана наиболее подробно, но не обусловлена жесткими условиями относительно свойств переносчиков. Переносчики разделяют на подвижные и переносчики, связанные с мембраной.
Транспортные белки, связанные с мембраной, можно разделить на три группы:
1. АТФ-азные (АТР-азные) системы. Они осуществляют АТФ-зависимый активный транспорт через мембраны против концентрационного градиента. Имеется множество различных АТФ-аз, способных транспортировать различные вещества от неорганических катионов (ионные насосы) до пептидов (пептидные насосы) и неполярных соединений (например, переносчики лекарственных веществ или белки, обеспечивающие множественную лекарственную устойчивость). Во всех клетках имеются ионные насосы (ионтранспортирующие АТФ-азы), осуществляющие постоянный перенос таких катионов, как Н+ и Na+, K+ и Са2+, что существенно важно для поддержания электрохимического градиента.
2. Канальные белки образуют в биомембранах заполненные водой поры, проницаемые для определенных ионов. Например, имеются специфические ионные каналы для ионов Na+, К+, Са2+ и Cl-. Некоторые из каналов открыты большую часть времени. Например, для обеспечения процесса переноса у бактерий имеются трансмембранные каналообразующие белки, так называемые порины. Эти белки - тримеры образуют поры, заполненные водой и проницаемые для молекул с молекулярной массой до 600 Да. В высших организмах пориноподобные белки найдены в мембранах митохондрий и хлоропластов. Однако, большинство каналов для ионов открываются только в ответ на воздействие определенного химического вещества или электрического сигнала.
3. Транспортные белки-переносчики. В отличие от ионных каналов транспортные белки избирательно связывают молекулы субстрата и за счет конформационных изменений переносят их через мембрану. В этом отношении транспортные белки (белки-переносчики, пермеазы) похожи на ферменты. Единственное различие состоит в том, что они "катализируют" направленный транспорт, а не ферментативную реакцию. Они проявляют специфичность - иногда групповую - к субстратам, подлежащим переносу. Кроме того, для них характерны определенное сродство, выражаемое в виде константы диссоциации Ks, Km и максимальная транспортная способность Vmax.
Транспорт может идти по механизму унипорта (облегченной диффузии), согласно которому только одно вещество переносится через биомембрану в одном направлении с помощью канальных или транспортных белков (например, транспорт глюкозы в клетках печени). Активный транспорт может протекать по механизму сопряженного переноса (симпорт, сопряженный транспорт), когда два вещества переносятся одновременно в одном направлении как. например, транспорт аминокислот или глюкозы вместе с ионами натрия в кишечных эпителиальных клетках, либо в противоположном направлении (антипорт, обменная диффузия), как, например, обмен ионов НСО3- на Cl- в мембране эритроцитов.
Рис. 7.1. Изменение свободной энергии, сопровождающее переход гидрофильного вещества через мембрану (Nelson & Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd ed., 2000). Почему проникновение полярного/ гидрофильного раствора через мембрану без помощи переносчика является медленным процессом?
На рис. 7.1 показано изменение свободной энергии, сопровождающее переход гидрофильного вещества через мембрану. Путь а - простая диффузия: удаление гидратной оболочки чрезвычайно эндогенный процесс (G> 0), и энергия активации (G*) для распространения через двойной слой очень высока. Переносчик уменьшает G* для трансмембранного распространения раствора, формируя нековалентные взаимодействия с обезвоженным веществом, заменяя водородные связи, которые это вещество образовывало с H2O (отрицательная G уравновешивает положительную G дегидратации), и обеспечивает гидрофильный трансмембранный перенос (альтернативный путь для прохождения двойного липидного слоя, без взаимодействия с гидрофобным мембранным ядром).
Кинетика пассивного транспорта с помощью переносчиков
Вещество во внешней среде обозначено как и его концентрация ; вещество внутри клетки - и его внутриклеточная концентрация , -переносчик, его концентрация , -комплекс вещества с переносчиком. Предполагается, что через мембрану могут перемещаться как свободные, так и наружные переносчики. Рассмотрим случай полностью симметричной системы, когда
т.е. скорости образования и скорость распада одинаковы с обеих сторон мембраны и скорости движения свободного и наружного переносчика равны и не зависят от направления перемещения. . Однонаправленный поток вещества в клетку описывается уравнением Михаэлиса-Ментен:
,
при , и , .
Методы определения констант Михаэлиса
Зависимость однонаправленного потока от концентрации субстрата при постоянной концентрации переносчика определяется гиперболичной функцией:
Наиболее часто используют метод обратных величин, известный как метод Лайнуивера-Бэрка:
или Характерные черты пассивного транспорта с помощью переносчиков:
1. Однонаправленный поток вещества в клетку должен подчиняться уравнению Михаэлиса-Ментен. Иными словами, при увеличении внешней концентрации поток должен расти не линейно, и стремиться к пределу. Часто такую зависимость называют эффектом насыщения потока.
2. Наличие специфических химических групп в мембране, на которую связывается вещество, предполагает зависимость потока от строения транспортируемых молекул.
3. Поскольку система переноса имеет ограниченное число транспортных мест, между различными веществами, транспортировка одной и той же системой, должна наблюдаться конкуренция.
4. Торможение транспорта может вызываться и веществами другого класса, но проявляющими способность связываться на местах транспорта. Таким образом, для транспортной системы могут существовать специфические ингибиторы, оказывающие влияние в очень малых концентрациях. 5.Характерной чертой, часто рассматриваемой как наиболее существенное доказательство наличия системы подвижных переносчиков, является эффект противопотока, т.е. возможность индуцировать поток одного вещества против градиента концентрации другого.
Унипорт глюкозы через клеточную мембрану
Внутриклеточная концентрация свободной глюкозы значительно ниже ее внеклеточной концентрации. На рис. 7.2 показана зависимость скорости переноса глюкозы от ее внеклеточной концентрации. Рис. 7.2. Клеточный перенос глюкозы при участии белков-переносчиков типа GLUT. Скорость переноса подчиняется простой ферментативной кинетике и значительно превышает расчетную норму входа глюкозы путем обычной диффузии.
Большинство имеющихся данных свидетельствует о том, что скорость транспорта глюкозы через плазматическую мембрану мышечных и жировых клеток определяет интенсивность фосфорилирования глюкозы и ее дальнейший метаболизм. D-глюкоза и другие сахара с аналогичной конфигурацией по С1-С3 (галактоза, D-ксилоза и L-арабиноза) проникают в клетки путем облегченной диффузии, опосредованной переносчиком. Сначала глюкоза связывается с переносчиком глюкозы [ГЛУТ (GLUT)], локализованным в клеточной мембране. Перенос глюкозы через мембрану обеспечивается за счет изменения конформации молекулы переносчика. Для многочисленных мембранных белков известна лишь последовательность аминокислот, но не трехмерная структура. Из-за трудностей кристаллизации мембранных белков к настоящему времени известны трехмерные структуры только некоторых из них. Ниже, рис. 7.3, приведена структура переносчика глюкозы, содержащего 12 трансмембранных α-спиральных фрагментов и один олигосахарид, ориентированный в окружающую среду.
Переносчики глюкозы представляют собой семейство структурно близких мембранных белков с различными функциями. ГЛУТ-1 и ГЛУТ-3 имеют высокое сродство к глюкозе (Кm около 1,5 мМ). Они обнаружены почти во всех клетках и обеспечивают постоянное поступление глюкозы. Изомерные сахара D-манноза и D-галактоза, которые отличаются от D-глюкозы по конфигурации только в одном углеродном атоме, также транспортируются GLUT1. Однако, Км для глюкозы (1.5 мМ) намного ниже, чем Км для D-маннозы (20 мМ) или D-галактозы (30 мМ). GLUT1 составляет 2 процента от общего содержания белка в пламатической мембране эритроцитов. Глюкоза, поступившая в эритроцит, подвергается единственному превращению - она фосфорилируется с участием АТФ с образованием глюкозо - 6 - фосфата. Поскольку эта реакция, первый шаг в метаболизме глюкозы, является быстрой, то внутриклеточная концентрация глюкозы не увеличивается, так как глюкоза используется клеткой. Таким образом, поддерживается градиент концентрации глюкозы между клеткой и окружающей средой, обеспечивающий поступление глюкозы в клетку.
Рис. 7.3. Возможная структура GLUT1 (Nelson & Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 3rd ed., 2000) и его принцип действия в мембране клетки.
Считают, что переносчик глюкозы GLUT1 существует в двух конформациях (рис 7.3). T1 связывающий центр глюкозы находится на внешней поверхности плазматической мембраны, T2 связывающий центр - на внутренней поверхности. D-глюкоза, связавшись снаружи в связывающем центре Т1, вызывает конформационный переход Т1 к T2. Глюкоза поступает в цитоплазму, вызывая конформационное изменение Т2 к T1, готовому связать следующую молекулу глюкозы с внешней стороны мембраны. Таким образом, кинетика однонаправленного транспорта глюкозы с участием переносчика GLUT1 из окружающей среды в клетку может быть описана тем же самым уравнением, используемым для описания простой, катализируемой ферментом, химической реакции. Для простоты, предположим, что глюкоза S, присутствует первоначально только за пределами мембраны. В этом случае, мы можем записать:
Процесс полностью обратим, и когда [S]in приближается к [S]out, скорости входа и выхода глюкозы становятся равными. Концентрация глюкозы в плазме крови [Glc] ~4.5-5 мМ, что намного больше чем Km (D-Glc) (~1.5 мM). Таким образом, GLUT1 работает около Vmax. ГЛУТ-2 (GLUT2) найден в клетках печени и поджелудочной железы. Этот переносчик обладает гораздо меньшим сродством к глюкозе (Km 15-20 мМ). Это означает, что связывание глюкозы ГЛУТ-2 пропорционально концентрации глюкозы в крови. ГЛУТ-4 с Km около 5 мМ найден в плазматической мембране мышечных и жировых клеток. Гормон инсулин вызывает увеличение количества молекул ГЛУТ-4 на поверхности клетки и таким образом стимулирует поступление глюкозы в эти ткани. ГЛУТ-5 синтезируется клетками кишечного эпителия. Этот переносчик обеспечивает симпорт глюкозы с ионами Na+.
Во многих клетках инсулин усиливает процесс переноса глюкозы, что обусловливается увеличением числа переносчиков (Vmax-эффект), а не повышением сродства связывания (Км-эффект). Согласно имеющимся данным, в жировых клетках это происходит путем мобилизации переносчиков глюкозы из неактивного их пула в аппарате Гольджи с дальнейшим направлением их к активному участку плазматической мембраны. Такая транслокация переносчиков - процесс, зависимый от температуры и энергии и независимый от синтеза белков. Печеночные клетки представляют собой важное исключение из этой схемы. Инсулин не стимулирует облегченной диффузии глюкозы в гепатоциты, но усиливает ее приток косвенным путем, индуцируя глюкокиназу - фермент, превращающий глюкозу в глюкозо- 6-фосфат. В результате быстро протекающего фосфорилирования, концентрация свободной глюкозы в гепатоцитах поддерживается на очень низком уровне, что способствует проникновению глюкозы в клетки путем простой диффузии по градиенту концентрации. Инсулин способствует также проникновению в клетки аминокислот (особенно в мышечные клетки) и стимулирует перемещение К+, Са2+, нуклеозидов и органического фосфата. Эти эффекты зависят от влияния инсулина на поступление в клетку глюкозы. Установлено, что инсулин-индуцируемые белки-переносчики глюкозы представляют собой семейство, состоящее из нескольких изоформ, кодируемых разными генами. К середине 90-х гг было охарактеризовано 5 изоформ белковой природы, которые по хронологическому порядку опубликования их структур получили обозначения GLUT1, GLUT2,..., GLUT5. Обнаружена также одна псевдогенная форма, структура которой на 80% состоит из нуклеотидной последовательности GLUT3. Две любые изоформы семейства GLUT на 50-76% гомологичны между собой, но ни одна из них не имеет гомологии с переносчиками системы активного транспорта, глюкозы. Каждая из изоформ является тканеспецифичным белком, однако GLUT1 , GLUT2 и GLUT3 одновременно сосуществуют в почке , GLUT1 и GLUT3 сосуществуют помимо почки в плаценте и головном мозге , GLUT2 и GLUT5 - в тонком кишечнике ( Bell G., 1991). Не исключено, что аномальная экспрессия GLUT4 и, в особенности, GLUT2 лежит в основе патогенеза если не большинства, то, по крайней мере, значительного числа случаев НИЗСД (инсулиннезависимый сахарный диабет)( Orci L., et al., 1989; Unger R., 1991). НИЗСД: роль GLUT2 в инсулинорезистентности
Наибольший интерес при исследовании инсулинорезистентности при НИЗСД вызывают изоформы GLUT4 и GLUT2. GLUT2 помимо почек, кишечника и печени, экспрессируется в -клетках, где является сенсором уровня глюкозы в крови . Известно, что при гликемии (натощак более 7,8 мМ) у больных НИЗСД отсутствует стимулирующее влияние глюкозы на секрецию инсулина при сохранении эффекта других секретогенов. При изучении одной из диабетических линий крыс было показано, что снижение экспрессии GLUT2 в B-клетках предшествует снижению поступления в них глюкозы и последующим кинетическому и количественному типам нарушения секреции инсулина. Последовательность этой триады нарушений во всех случаях была неизменной и вела к развитию у животных диабетической гипергликемии. Не исключено, что аномальная экспрессия GLUT4 и, в особенности, GLUT2 лежит в основе патогенеза если не большинства, то, по крайней мере, значительного числа случаев НИЗСД у людей ( Orci L., et al., 1989 ; Unger R., 1991 ). 7.3. Активный транспорт с помощью переносчиков В общем виде функция активного транспорта сводится к обеспечению потока вещества против градиента концентрации, т.е. в стационарном состоянии Ci > Co в случае активного потока внутрь клетки и Ci < Co - для активного удаления вещества из клетки. Несмотря на неравенство Ci и Co для стационарного состояния, необходимо соблюдение равенства потоков внутрь и наружу: Jin = Jout; Jnet = 0. При пасcивном транспорте вещества через мембрану такое условие может обеспечиваться только при Ci = Co.
Наличие переносчиков представляет основу для реализации в стационарном состоянии Ci Co, Jin = Jout. Достаточным и необходимым условием для равенства потоков при Ci  Co является неравенство Km с обеих сторон мембраны относится к внешней, - к внутренней стороне мембраны. При условии , Допущение о различии Km c обеих сторон мембраны равносильно предположению о различии переносчиков. Поэтому на схеме транспорта можно использовать обозначения для двух переносчиков, например, X и Y, хотя их различия заключается только в значении Km для данного вещества. Поэтому нужно предположить, что перемещение переносчика через мембрану и в свободном виде, и в комплексе с веществом сопряжено с изменением его свойств. С энергетической точки зрения такая система невыгодна и она реализуется только в случае так называемого вторичного активного транспорта. Неравенство Km с обеих сторон мембраны обеспечивается при этом типе транспорта за счет различного влияния на переносчики внешней и внутренней среды. Непосредственная затрата энергии осуществляется на поддержание асимметрии между клеткой и средой.
Практически необходимым условием работы такой системы активного транспорта является сопряжение потоков разных веществ так, что только в одном из потоков расходуется энергия, запасенная в виде концентрационного градиента одного из транспортируемых веществ.
Следует отметить, что в системе сопряженного транспорта поток против градиента может обеспечиваться и за счет изменения Vmax, если допустить, что комплекс переносчика с одним веществом практически неспособен перемещаться через мембрану и только присоединение второго вещества делают его подвижным.
Na+-зависимый симпорт аминокислот и глюкозы в животных клетках против концентрационного градиента
Активный транспорт глюкозы осуществляется за счет Na+ - глюкозного котранспортера. Он располагается в реснитчатых эпителиальных клетках тонкого кишечника и в клетках проксимального отдела почечных канальцев. Переносчик импортирует в клетку 1 моль глюкозы и 2 моля ионов Na+.
Рассмотрим изменение свободной энергии системы.
, ,
, Примем, что концентрации ионов Na+ снаружи и внутри клетки равны =12мМ, =145мМ, а мембранный потенциал mV. Таким образом, при перемещении 2 молей ионов Na+ система получает энергию в количестве 25,7 кДж (кДж).
В состоянии равновесия . . Перемещение двух молей ионов Na+ может создать внутриклеточную концентрацию глюкозы в 30000 раз превышающую внешнюю концентрацию. Таким образом, котранспорт двух ионов Na+ и одной молекулы глюкозы, позволяет клеткам накапливать очень высокую концентрацию глюкозы относительно внешней концентрации.
На рис. 7.4 показана модель переноса Na+/глюкоза по типу симпорта. Эта модель предполагает конформационные изменения в белке-переносчике, аналогичные тем, которые происходят в унипорт-транспортерах, таких как GLUT1, не требующих котранспортного иона. Связывание всех субстратов в активном центре переносчика во внеклеточной области необходимо для конформационного перехода, способствующего изменению положения связывающего центра и обеспечивающего транспорт глюкозы и ионов Na+ внутрь клетки).
Рис. 7.4. Модель переноса 2Na+/глюкоза по типу симпорта. Связывание Na+ и глюкозы с участками связывающего центра, направленнымм во внешнюю среду (шаг 1) приводит к структуре переносчика с участками активного центра, направленными внутрь клетки (шаг 2). Выход связанных Na+ и глюкозы в цитозоль (шаг 3) позволяет белку вернуться к его первоначальной конформации, с активным центом, направленным наружу (шаг 4), готовой транспортировать следующие субстраты. [M. Panayotova-Heiermann et al. // J. Biol. Chem.- 1997.- 272:20324 (рассмотрены детали строения и функционирования мембраносвязанных переносчиков)].
Тема 8. Транспорт ионов. Ионные равновесия
Существует несколько возможных механизмов прохождения ионов через мембрану:
1) Растворение иона в липидной фазе мембраны, диффузия и последующий переход из мембраны в раствор;
2) движение по ионным каналам, являющихся структурными компонентами мембран;
3) транспорт с участием переносчиков.
Эти механизмы переноса установлены как для биологических мембран, так и для бислойных липидных мембран. Отдельную категорию составляют транспорт через мембранные барьеры клетки по механизму пиноцитоза.
Скорость проникновения ионов через мембрану определяется такими ее свойствами, как толщина, значение диэлектрической проницаемости, наличие фиксированных электрических зарядов на ее поверхности, знак и плотность расположения этих фиксированных зарядов на мембране, наличие фиксированных зарядов в порах и др.
8.1. Мембранный потенциал в случае простого ионного равновесия
Рассмотрим следующий простой пример. Пусть мы имеем два раствора KCl с концентрацией 10 мМ (раствор 1) и 100 мМ (раствор 2), разделенные проницаемой для катионов мембраной (рис. 8.1). Допустим, мембрана имеет поры, вдоль которых расположены фиксированные отрицательные заряды. Если поры достаточно узкие и плотность фиксированных зарядов высока, через мембрану будут проникать только ионы калия, тогда как анионы хлора из-за электростатического отталкивания не смогут войти в поры.
Механизм установления равновесия для ионов калия и хлора различен. Равновесие для ионов Cl- достигается за счет механических и электростатических сил, поскольку эти ионы не проникают через мембрану. До тех пор пока в структуре мембраны не произойдет существенных изменений, суммарный поток ионов хлора и обменная диффузия, регистрируемая с помощью меченных частиц будет отсутствовать. Установление же равновесия для ионов калия является термодинамическим процессом и обусловлено взаимным уравновешиванием движущих сил в системе. В процессе установления равновесия небольшое количество ионов калия проходит через мембрану, заряжая ее, и приводя к появлению разности электрических потенциалов. Диффузия ведет к накоплению положительного заряда в компартменте 1 (электростатические силы заставляют этот заряд удерживаться на мембране) и оставляет в компартменте 2 избыток отрицательного заряда, который благодаря электростатическим силам собирается на мембране с правой стороны (рис. 8.1). Это приводит к образованию электрического поля, направленного от 1 к 2, возрастающего по величине по мере диффузии ионов К+ из раствора 2 в раствор 1. Возрастающее электрическое поле все более препятствует диффузии. Когда разность потенциалов "уравновешивает" градиент концентрации ионов калия, дальнейшая диффузия этих ионов через мембрану прекращается и наступает равновесие.
Рис. 8.1. Образование мембраннго потенциала в случае простого ионного равновесия. В этом случае суммарный перенос ионов калия с одной стороны мембраны на другую не является самопроизвольным процессом и в результате такого переноса не может совершаться работа. Следовательно, электрохимические потенциалы ионов калия (максимальная работа, которую можно совершить при переносе одного моля ионов калия в некоторое условное стандартное состояние) будут одинаковы для обоих растворов, разделенных мембраной.
зависит только от природы растворителя.
Потенциал Нернста - потенциал, при котором ион сорта j находится в равновесии с действующей на него диффузионной силой. Можно рассматривать этот потенциал как электрическую меру уравновешиваемой им силы диффузии, возникающей из-за разности концентрации по разные стороны проницаемой мембраны.
Для биологических клеток трансмембранный потенциал принято определять как разность внутреннего и наружного потенциалов (рис 8.2).
Рис. 8.2. Некоторые электрические потенциалы внутри живой клетки.
o - потенциал вне клетки; i - потенциал внутри клетки;
x - потенциал внутри матрикса митохондрий Между водными фазами, разделяемыми мембранами, имеются разности потенциалов, называемые трансмембранными или же просто мембранными потенциалами. 8.2. Уравнение электродиффузии Нернста-Планка
Рассматривая равновесные мембранные потенциалы мы выяснили, что условием термодинамического равновесия ионов является постоянство электрохимического потенциала во всем доступном для ионов пространстве. Отсюда следует, что движущей силой потока служит градиент электрохимического потенциала в среде. Даже это положение в случае клеточных мембран может оказаться лишь некоторым приближением, поскольку оно требует выполнения условия электронейтральности (электрохимический потенциал должен быть определен в каждой точке), так и условия теплового равновесия (согласно теории Эйнштейна коэффициент диффузии ).
Если электрохимический потенциал меняется вдоль одной координаты, например, вдоль оси х, то он является функцией двух переменных - t и x и его градиент равен частной производной по х:
Уравнение Нернста Планка
Первый член в первой части описывает только диффузию, второй - перемещение частиц в электрическом поле. Таким образом, дифференциальное уравнение электродиффузии Планка можно рассматривать как аналитическое выражение законов Фика и Ома одновременно.
Уравнение Нернста Планка описывает плотность потока ионов j под действием диффузии и электрического поля, обычно его размерность ─моль на единицу поверхности за единицу времени.
Если поток умножить на , то есть на заряд переносимый каждым молем, то получим величину плотности электрического тока:
Покажем, что уравнение Нернста является частным случаем уравнения Нернста-Планка: В состоянии равновесия Уравнение Гольдмана для однонаправленного потока одного типа частиц
Трудность применения уравнения Нернста- Планка к биологическим мембранам (даже в случае одномерного ее описания состоит в том, что изменения величин концентраций и потенциала внутри мембраны неизвестны и зависят от существующих пространственных электрических зарядов. Однако, поскольку мембрана тонка, в качестве хорошего приближения можно взять линейный закон изменения внутри мембраны, т.е. (гипотеза постоянного поля).
Это предположение было использовано Гольдманом, чтобы проинтегрировать уравнение Нернста- Планка.
Где и - концентрации иона j внутри мембраны вблизи обеих границ с водной фазой. Их можно выразить через концентрации иона в водной среде, по обе стороны мембраны, используя коэффициент распределения К.
, , где и - концентрации иона j в водной среде в объеме.
Совместный поток нескольких ионов
Уравнение Гольдмана-Ходжкина-Катца для стационарного потенциала
В общем случае биологическая мембрана не может быть уравновешена для всех ионов. Никакой трансмембранный потенциал не может одновременно уравновесить все ионы. Условие покоя может быть охарактеризовано как стационарное состояние.
8.3. Активный транспорт веществ через биологические мембраны. Опыт Усинга
Активный транспорт веществ через биологические мембраны имеет огромное значение. За счет активного транспорта в организме создаются разности концентраций, разности электрических потенциалов, давления, поддерживающие жизненные процессы, то есть с точки зрения термодинамики активный перенос удерживает организм в неравновесном состоянии, поддерживает жизнь, так как равновесие - это смерть организма. Существование активного транспорта веществ через биологические мембраны впервые было доказано в опытах Усинга (1949 год) на примере переноса ионов натрия через кожу лягушки (рис. 8.3). Экспериментальная камера Усинга, заполненная нормальным раствором Рингера, была разделена на две части свежеизолированной кожей лягушки. В опыте исследовали однонаправленные потоки ионов натрия через кожу лягушки в прямом и обратном направлениях.
Рис. 8.3. Схема опыта Усинга на коже лягушки, V- вольбметр для измерения разности потенциалов на коже лягушки, А- амперметр для измерения трансмембранного тока, Б- батарейка, П- потенциометр.
На изолированной коже лягушки, разделяющей раствор Рингера, возникает разность потенциалов (внутренняя сторона кожи положительна по отношению к наружной). В установке имелось специальное устройство: электрическая батарея с потенциометром - делителем напряжения, с помощью которых компенсировалась разность потенциалов на коже лягушки: , что контролировалось вольтметром. Кроме того, концентрация ионов натрия с внешней и внутренней сторон поддерживалась одинаковой. При этих условиях, как видно из уравнения Усинга-Теорелла,
Суммарный поток ионов через мембрану должен был бы отсутствовать. Его наличие свидетельствовало бы о переносе ионов против градиента концентрации, то есть об активном переносе. Для доказательства этого в левую часть экспериментальной камеры были добавлены радиоактивные изотопы 22Na, а в правую - 24Na. 22Na распадается с излучением жестких -квантов, излучение 24Na фиксировалось по мягким -лучам. Было показано, что поток 22Na больше потока 24Na. О наличии тока в цепи свидетельствовали и показания миллиамперметра.
Эти экспериментальные данные неопровержимо свидетельствовали о том, что перенос ионов натрия через кожу лягушки не подчиняется уравнению пассивного транспорта. Более того, оказалось, что суммарный поток ионов натрия исключительно чувствителен к факторам, влияющим на энергетический обмен в клетках кожи: наличию кислорода, действию разобщителей окислительного фосфорилирования, действию низких температур. Следовательно, речь должна идти об особом способе переноса ионов, названном впоследствии активным. Позднее было установлено, что активный перенос ионов натрия в коже лягушки обеспечивается ионными насосами, локализованными в клетках базального эпителия. Работа насоса блокировалась специфическим ингибитором уабаином.
Дальнейшие исследования показали, что в биологических мембранах имеется несколько разновидностей ионных насосов, работающих за счет свободной энергии гидролиза АТФ, - специальные системы интегральных белков (транспортные АТФазы). В настоящее время известны три типа электрогенных ионных насосов. Перенос ионов транспортными АТФазами происходит вследствие сопряжения процессов переноса с химическими реакциями за счет энергии метаболизма клеток.
Уравнение Уссинга.
сума двух потоков:
Уравнение Уссинга
Известны четыре типа молекулярных машин, осуществляющих первичный активный транспорт ионов.
Кальций - транспортная АТФаза (Са-АТФаза).
Это белок, входящий в состав мембран саркоплазматического ретикулума скелетных мышц и сердца, а также мембран эритроцитов и, вероятно, других клеточных мембран. При гидролизе 1 моля АТФ Са -АТФаза переносит через мембрану (внутрь пузырьков саркоплазматического ретикулума или наружу из клетки) 2 моля Ca2+ , причем ионы кальция могут переноситься из области более низких 10-7 М в область более высоких концентраций (10-3 М). Изменение электрохимического потенциала ионов Ca2+ при таком процессе равно:
Поскольку внутри саркоплазматического ретикулума потенциал примерно равен внутриклеточному (= 0), а 0 примерно одинаково для ионов кальция в водных растворах (если в растворах нет Ca2+ - связывающих соединений), т.е. 0, то можно считать, что при 37o C:
кДж/моль.
Изменение свободной энергии при переносе двух молей Ca2+ равно 46,4 кДж/моль, что приблизительно равно энергии гидролиза макроэргической связи АТФ при физиологических концентрациях АТФ, АДФ и ортофосфата.
Na-K-АТФаза
Этот фермент содержится во всех клеточных мембранах и осуществляет перенос 2 ионов K+ в клетку и 3 ионов Na+ из клетки при гидролизе одной молекулы АТФ. Рис. 8.4. Градиенты ионов натрия и калия и направления переноса этих ионов через плазматическую мембрану. Ионы К+ переносятся по градиенту мембранного потенциала, а Na+- против градиента мембранного потенциала (рис. 9.4), но оба иона транспортируются против химических концентрационных градиентов.
Например, в случае мышечного волокна, помещенного в физиологический раствор отношение концентраций внутри- и внеклеточного калия [K+]i/ [K+]o = 48 , а разность потенциалов m = i - o = - 88 мВ. Отсюда легко подсчитать, что при 37oC:
=
=
=
На перенос двух молей ионов K+ энергии расходуется немногим более 1/20 энергии гидролиза АТФ. Напротив, на перенос ионов Na+ расходуется много энергии, т.е. эти ионы переносятся не только в область более высоких концентраций, но и в область более высокого потенциала. Таким образом, основная энергия гидролиза АТФ идет на перенос ионов Na+, поэтому Na-K-АТФазу можно назвать натриевой помпой (насосом).
Н+-АТФаза
Этот фермент, или лучше сказать ферментный комплекс (состоящий из нескольких субъединиц), входит в состав всех энергопреобразующих мембран, т.е. внутренней мембраны митохондрий, мембран хлоропластов и хромотофоров фотосинтезирующих растений и бактерий, а также клеточных мембран бактерий. Все эти мембранные структуры участвуют в синтезе АТФ, причем Н+-АТФаза участвует в этом процессе, выполняя функцию АТФ-синтетазы. При наличии АТФ и не слишком высоких различиях электрохимического потенциала ионов водорода по сторонам мембраны Н+-АТФаза осуществляет активный перенос протонов. В митохондриях протоны переносятся из матрикса в окружающую среду; гидролиз одного моля АТФ сопровождается переносом обычно двух молей H+.В результате этого происходит защелачивание матрикса (создается pH на мембране) и генерируется мембранный потенциал m со знаком "минус" внутри митохондрий. Протонные помпы электрон-транспортных систем.
Согласно хемоосмотической теории окислительного фосфорилирования, в определенных участках дыхательной цепи митохондрий, хлоропластов и бактериальных клеток происходит трансмембранный перенос протонов, сопряженный с переносом электронов через данный участок дыхательной цепи; последний называется пунктом сопряжения. Перенос пары электронов через пункты сопряжения сопровождается переносом двух протонов через мембрану. Как известно, изменение свободной энергии окислительно-восстановительной реакции:
Ared + Box  Aox + Bred
Составляет
G = nF(EA - EB),
где EA - окислительно- восстановительные потенциалы донора (Aox Ared) и акцептора (Box Bred) электронов. Эта энергия и обеспечивает перенос протонов из области более низкого 1 в область высокого 2 значения электрохимического потенциала протона. Очевидно, что
; - случай равенства означает обратимость процесса.
Сопряженный транспорт
Создаваемое мембранными насосами неравновесное распределение ионов может приводить в движение вторичные процессы переноса ионов и молекул за счет различных механизмов сопряжения. Классическим примером служит сопряженный перенос аминокислот и сахаров через мембраны клеток эпителия. Клеточные мембраны эпителиоцитов различаются по строению и функции на базальной (обращенной в сторону кровяного русла) и апикальной сторонах (обращенной в просвет кишечника, почечных канальцев и т.д.). Базальная, плоская мембрана содержит Na-K-АТФазу, которая создает 1 на мембране, т.е. обеспечивает низкую концентрацию иона натрия в клетке и поддерживает отрицательный потенциал внутри клетки. Апикальная мембрана, представленная ворсинками (щеточной каемкой), содержит белковые переносчики ионов Na+,особенность которых состоит в том,что они способны переносить Na+ только вместе с молекулами аминокислот или углеводородов. Na+ переносится в клетку пассивно, т.е. в сторону уменьшения электрохимического потенциала. Молекулы сахара или аминокислоты переносятся активно, т.е. в сторону их более высокой концентрации. Суммарное изменение свободной энергии в этом процессе, разумеется, направлено в сторону ее снижения.
Na+ - зависимый экспорт ионов Ca2+ из мышечных клеток сердца по типу антипорта
В сердечных мышечных клетках 3Na+/Ca2+ антипорт, а не плазматическая мембранная Ca2+-ATФаза, играет основную роль в поддержании низкой концентрации Ca2+ в цитоплазме. Транспортная реакция антипорта катионов, может быть представлена следующим образом:
Перемещение трех ионов Na+ обязано приводить в действие экспорт одного иона Ca2+ из цитоплазмы с [Ca2+] ≈2 10-7 М во внеклеточную среду с [Ca2+] ≈2 10-3 М, приводящему к 10 000-кратныму градиенту ионов Ca2+. Как и в других мышечных клетках, повышение цитоплазматической концентрации Ca2+ в сердечной мышце вызывает ее сокращение. Снижение цитоплазматической концентрации Ca2+, из-за антипорта 3Na+/Ca2+, уменьшает силу сокращения сердечной мышцы.
Na+/K+-ATФаза плазматической мембраны клеток сердца, как в других соматических клетках, создает градиент концентрации Na+, необходимый для антипорта 3Na+/Ca2+. Инактивация Na+/K+-ATФазы сердечными гликозидами уабаином и дигоксином приводит к снижению содержания цитоплазматического K+ и, что более важно, к увеличению концентрации цитоплазматического Na+. Вследствие этого, уменьшенный электрохимический градиент Na+ снижает эффективность функционирования 3Na+/Ca2+ антипорта. В результате меньше ионов Ca2+ экспортируется в цитоплазму, увеличивается концентрация внутриклеточного Ca2+, заставляя мышцы сердца сокращаться более интенсивно. Из-за способности увеличивать силу сердечных сокращений, ингибиторы Na+/K+-ATФазы широко используются в медицинской практике при остановке сердца. 8.4. Ионофоры. Индуцированный транспорт ионов
Затраты энергии, необходимые для проникновения иона в неполярную фазу, можно оценить по формуле Борна, согласно которой энергия, затрачиваемая на перемещение иона из воды в мембрану, зависит от его радиуса r и диэлектрических проницаемостей воды B и мембраны м.
Эта формула имеет наиболее простую и наглядную запись:
где z - валентность иона, е - элементарный заряд. Как видно из формулы, энергия перехода иона в мембрану снижается с увеличением радиуса иона. Поэтому крупные органические ионы проникают через БЛМ легче, чем катионы щелочных металлов. Как видно из формулы, величина энергетического барьера в мембране уменьшается, а следовательно, проницаемость мембраны для иона возрастает не только при увеличении его радиуса, но и при приближении значений м к B. На этих физических принципах и основан перенос ионов ионофорами. Ионофоры могут образовывать с ионом комплекс большого размера - переносчики - либо формировать пору в мембране, заполненную водой, - каналы.
Впервые явление транспорта ионов через биологические мембраны по механизму переносчиков было обнаружено Б. Прессманом в 1964 г. В качестве таких переносчиков он использовал некоторые антибиотики, названные им ионофорами. Классическим представителем мембранных ионофоров является антибиотик депсипептидной природы - валиномицин.
Молекула валиномицина построена из трех идентичных фрагментов, в каждый из которых входит остаток D-валина, L-молочной кислоты, L-валина и D-гидроксиизовалериановой кислоты. Валиномицин способен избирательно увеличивать проницаемость липидных бислоев для ионов щелочных металлов. Валиномицин образует в неполярных растворителях устойчивые комплексы с К + , Rb + , Cs + , но очень слабо взаимодействует с ионами Na+; К, Na-селективность этого депсипептида является рекордной и составляет величину порядка 104-105. Такое поведение валиномицина связано с его пространственным строением: депсипептидная цепь антибиотика формирует "ионную ловушку", точно подогнанную под ионы калия.
Конформация самого валиномицина в неполярных средах напоминает собой браслет, стабилизированный шестью внутримолекулярными водородными связями (С=О- Н-N); в более полярных средах реализуется форма лишь с тремя Н-связями, а в водных растворах предпочтительной оказывается открытая форма, лишенная водородных связей.
В конформации валиномицина, установленной на основании данных ЯМР- и ИК-спектроскопии и подвержденной затем рентгеноструктурным анализом, амидные карбонилы участвуют в стабилизации "браслета", а сложноэфирные карбонилы свободны (рис. 8.4, а).
Комплексы валиномицина с К+ в любых средах сохраняют конформацию браслета, при этом ион металла попадает во внутреннюю полость молекулы и связывается шестью сложноэфирными карбонилами с помощью ион-дипольных взаимодействий (рис. 8.4, б).
а
БРис. 8.4. Конформация валиномицина (а) и его К+ комплекса (б). Размеры полости хорошо соответствуют ионным радиусам несольватированных ионов калия (г= 0,133 нм) и рубидия (г= 0,149 нм), но несколько малы для цезия (г=0,165 нм) и слишком велики для натрия (г= 0,098 нм), что находится в полном согласии с данными по селективности комплексообразования. Валиномицин, таким образом, обеспечивает связываемому иону идеальную "сольватную оболочку", фиксированную в оптимальном положении молекулярным каркасом антибиотика, и благоприятными для комплексообразования оказываются не только энергетические (энергия шести ион-дипольных взаимодействий), но и энтропийные факторы.
В комплексе валиномицин - калий ион оказывается хорошо "спрятанным" во внутренней сфере антибиотика, а внешняя сфера достаточно гидрофобна и обеспечивает беспрепятственное передвижение иона через липидную мембрану. Установленный впервые на примере валиномицина принцип функционирования ионофоров оказался универсальным не только для мембранных переносчиков, но и для других типов молекулярных ловушек и катализаторов, широко используемых в настоящее время в химии и в технике. Достаточно часто высказывается мысль, что валиномицин во многих отношениях напоминает фермент. Действительно, роль ферментов сводится к катализу тех или иных химических реакций, т. е. к снижению их энергии активации. Валиномицин понижает энергетический барьер перехода ионов калия с одной стороны мембраны на другую. Как и ферменты, валиномицин действует в каталитических количествах (вплоть до 10-9-10-10 моль/л), многократно регенерируясь после выполнения своей функции. Валиномицин имеет ярко выраженный специфический субстрат, а именно ион К +, причем проявляет по отношению к этому субстрату высочайшую селективность. Более того, при связывании "субстрата" молекула валиномицина претерпевает характерную для ферментов "индуцированную подгонку" (induced fit) своей конформации, заключающуюся в переориентации сложноэфирных карбонильных группировок из положения "наружу" в положение "внутрь" для захвата катиона. Наконец, валиномицин обладает высокой биологической активностью как антимикробный агент, что позволяет четко контролировать его поведение.
Аналогично валиномицину ведут себя и депсипептидные антибиотики энниатиновой группы. Меньшая эффективность комплексообразования в данном случае связана с более открытой структурой комплекса и большей доступностью иона для растворителя. Однако этот недостаток может в существенной степени компенсироваться тем, что ионы щелочных металлов способны в таком случае переноситься через мембрану в виде "сэндвичей" или "стопок", где соотношение макроцикл - катион равно 2:1 или 3:2.
Антибиотики-каналообразователи
Определенный прогресс в понимании того, какой может быть молекулярная организация трансмембранных каналов, связан с изучением антибиотиков-каналообразователей; среди них наиболее известны грамицидин А, амфотерицин В, аламетицин.
Грамицидин А является линейным пентадекапептидом с блокированными концевыми группами и чередующимися L- и D-конфигурациями аминокислотных остатков (рис. 8.5).
После того как Б. Прессманом было обнаружено индукционное влияние грамицидина А на ионный транспорт (К + , Na+, H+ и др.) через биологические мембраны, С. Хладки и Д. Хейдон в 1970 г. однозначно установили, что антибиотик функционирует в мембране по принципу канала.
А
БРис. 8.5. Строение грамицидина А.
Пространственное строение грамицидина А, хорошо согласующееся с его способностью функционировать в мембране в виде каналообразователя, было предложено в 1971-1972 гг. независимо Д. Урри (США) и Г. Н. Рамачандраном (Индия). Согласно их модели, две молекулы грамицидина А в конформации яш-спирали образуют димер "голова к голове".
В такой конформации молекулы грамицидина А образуют своеобразный полый цилиндр, в котором все СО- и NH-группы пептидной цепи соединены внутри- и межмолекулярными водородными связями. Хотя по своим параметрам структура хорошо соответствует толщине липидного бислоя и удовлетворительно объясняет наблюдаемую эффективность и селективность ионного транспорта, тем не менее вопрос о конформации грамицидина А в мембране требовал однозначных доказательств. В этой связи заслуживал внимания предложенный в 1974 г. Э. Блоутом и Б. Витчем альтернативный вариант пространственной укладки молекулы грамицидина А, в котором две молекулы антибиотика образуют двойную спираль (рис. 8.6, А).
Как сейчас можно считать установленным, и в растворах, и в мембране грамицидин А участвует в сложном конформационном равновесии, наиболее важными компонентами которого являются одно- и двутяжевые спиральные димеры. Диаметр осевой полости как однотяжевых, так и двутяжевых спиралей около 0,3 нм, т. е. достаточен для внедрения ионов металлов, а длина димера (~ 3 нм) близка толщине углеводородной зоны липидного бислоя. По-видимому, оба типа димеров способны образовывать ион-проводящие каналы.
А
БРис. 8.6. А- Пространственная укладка молекулы грамицидина А, согласно Э. Блоуту и Б. Витчем. Б- Возможные структурные перестройки грамицидина А в мембране. Отметим, что производительность одиночного канала грамицидина А весьма высока, до 109 ионов в секунду, что значительно превышает соответствующий показатель для антибиотиков-переносчиков (~105 ионов в секунду). Предполагается, что "выключение" грамицидинового канала, т. е. переход в непроводящее состояние, сопряжено с флуктуацией толщины мембраны: при увеличении толщины димер "голова к голове" диссоциирует до мономера, а двойная спираль частично расплетается. С этим предположением согласуется тот факт, что время жизни грамицидинового канала монотонно увеличивается при уменьшении средней толщины мембраны. Возможные структурные перестройки грамицидина А в мембране схематически могут быть изображены так, как на рис. 8.6, Б.
Рис. 8.7. Модель мембранной поры, образованной молекулами амфотерицина В. Среди антибиотиков-каналообразователей особого внимания заслуживают некоторые полиеновые макролиды, и прежде всего амфотерицин В.
Как оказалось, такие антибиотики образуют в мембранах довольно селективные поры с радиусом Стокса - Эйнштейна порядка 0,4 нм, которые в силу своих размеров оказываются проницаемыми для воды, ионов одновалентных металлов, некоторых анионов и небольших нейтральных молекул, например глюкозы. Согласно модели, выдвинутой А. Финкельштейном и Р. Хольцем в 1973 г., амфотерицин В образует канал, состоящий из двух стыкующихся внутри мембраны полупор, каждая из которых представляет собой агрегат из чередующихся молекул антибиотика и стерина (обычно эргостерина, имеющего 3-гидроксигруппу и при атоме С-9 боковую цепь), ориентированных длинными осями своих молекул перпендикулярно поверхности мембраны; размеры этих молекул и обычного мембранного фосфолипида - лецитина - практически совпадают. В образовании полупоры принимают участие 8-16 (обычно 10) молекул антибиотика, располагающихся так, что гидрофильные части (гидроксилы) ориентированы внутрь поры, а гидрофобные (полиеновые) части - в сторону мембраны; полупоры собираются на противоположных сторонах мембраны и стабилизируются на поверхности мембран полярными головками антибиотика, состоящими из заряженных группировок карбоксилат-иона и протонированного по аминогруппе остатка сахара (микозамина), а внутри мембраны - водородными связями между гидроксильными группами при атоме С-35 (рис. 8.7).
Тема 9. Установление равновесия по разные стороны мембраны. Транспорт неэлектролитов. Осмотическое давление
Рассмотрим систему, в которой молекулы неэлектролита D могут легко проходить через мембрану. Основной термодинамический принцип "управляющий" распределением диффундирующих молекул в системе с мембраной, состоит в том, что химические потенциалы данного компонента по разные стороны этой мембраны должны быть равны. Тогда в состоянии равновесия должны выполняться соотношения:
, а следовательно, Рассмотрим теперь случай, когда в растворе со стороны 2 находятся макромолекулы, причем мембрана для них непроницаема.
, Химический потенциал растворителя , где - стандартный химический потенциал растворителя,
- его мольная доля. В состоянии равновесия химический потенциал растворителя должен быть одинаковым с обеих сторон мембраны. Однако со стороны мембраны (1), где находится чистый растворитель, мы имеем, в то время как присутствие второго компонента со стороны (2) означает, что здесь . Как бы много растворителя ни перешло со стороны 1 на сторону 2, все равно мольные доли растворителя по обе стороны мембраны не станут равными. Следовательно, чтобы можно было достичь равновесия, стандартные химические потенциалы растворителя по разные стороны мембраны должны различаться как раз на ту величину, которая требуется, чтобы возместить разность в активности растворителя по обе стороны мембраны.
В экспериментальной установке равновесие устанавливается после того, как часть растворителя перетечёт со стороны 1 на сторону 2, так что давление в растворе на стороне 2 станет больше, чем на стороне 1 как раз на столько, чтобы обеспечить баланс химического потенциала растворителя с обеих сторон. Разность давления по обе стороны мембраны известна под названием осмотического давления.
, , поэтому
Уравнение устанавливает связь между активностью растворителя с той стороны мембраны, где находятся макромолекулы и разностью стандартных химических потенциалов с двух сторон мембраны.
Рассмотрим разбавленные растворы и предположим, что разность между и обусловлена исключительно различием в давлении. Т.к. dG является полным дифференциалом, то парциальный молярный объем.
, ,
где - осмотическое давление, равное .
Если учесть, что в разбавленных растворах близко к единице, поэтому логарифм можно разложить в ряд до первого члена
- мольная доля макромолекул со стороны (2).
, где
-молярная концентрация макромолекул, - концентрация макромолекул в г/л, - молекулярная масса макромолекул.
в сущности равно объему раствора (объемом растворителя можно пренебречь).
или
или
для очень разбавленных растворов.
Для реальных растворов это уравнение является всего лишь предельной формулой. В общем случае осмотическое давление может быть представлено в виде вириального разложения по степеням :
В - второй вириальный коэффициент.
Когда в растворе по ту сторону мембраны, где находятся растворённые молекулы, присутствуют различные макромолекулы 1, 2, 3 и т.д.
Выражение (2) принимает вид:
Полное осмотическое давление раствора - это просто сумма давлений, создаваемых каждым типом макромолекул.
Для определения молекулярной массы макромолекул, непроходящих через мембрану можно использовать график зависимости от .
;y = aх + b
; Физический смысл осмотического давления и его роль в биологических системах
Рассмотрим полупроницаемую перегородку, через которую могут проходить молекулы А, а молекулы Б не проходят. Пусть эта перегородка подобно поршню перемещается в указанном направлении.
При этом система разделена на две области, относительный объем которых изменяется при движении поршня справа налево, хотя полный объем системы при этом остается без изменения. Очевидно, при движении поршня справа налево молекулы А будут стремиться пройти сквозь него слева направо ( в большинстве реальных случаев А - несжимаемая жидкость, например вода). Если молекулы А начнут проходить слева направо, давление в правой части возрастет, и поршень сдвинется влево.
Предположим, что в начальный момент времени концентрация молекул А в левой части больше, чем в правой. Согласно законам термодинамики, образуется поток молекул в таком направлении, чтобы обеспечить выравнивания концентрации. Предположим, что в тех же начальных уровнях поршень удерживается в фиксированном начальном состоянии. Очевидно, при этом приходится прилагать к нему силу, величина которой на единицу поверхности в равновесном состоянии равна осмотическому давлению . Коэффициенты отражения
Во всех рассмотренных примерах мы имели дело с перегородками, которые действуют как идеальные молекулярные сита: некоторые молекулы проходили через них совершено свободно, а другие не могли проходить совсем. Такие крайние случаи характерны для воды и очень крупных белков, но большая часть растворенных в воде веществ, представляют собой незаряженные относительно небольшие молекулы. Мембрана по отношению к этим молекулам ведет себя некоторым промежуточным образом: какую-то часть данного компонента она пропускает, а какую-то нет. Поскольку в осмотическое давление вносят вклад только те молекулы, которые не могут проходить через мембрану, то осмотически активной можно считать некоторую часть молекул растворенного вещества. - коэффициент отражения, который определяет долю отраженных молекул от мембраны. =1 - полное отражение;
- количество проходящих молекул обусловлено соотношением размеров этих молекул и размера пор мембраны.
- все молекулы проходят через мембрану.
=
- наблюдаемое осмотическое давление,
- осмотическое давление, создаваемое электрически нейтральными молекулами, для которых мембрана полностью непроницаема.
Полный перепад осмотического давления двух веществ А и B с разностью концентраций и :
Основные принципы регулирования объема клетки. Мембранная теория
Вода находится в термодинамическом равновесии относительно клеточной мембраны. Другими словами, осмотическая концентрация цитоплазматической и внеклеточной жидкости в нормальных условиях равны. Изменение концентрации растворенного вещества в той или иной среде создают осмотический градиент. Поскольку мембрана клетки легко проницаема для воды, создание любого такого градиента немедленно приведет к потоку воды из клетки или в неё, чтобы восстановить нарушенное осмотическое равновесие. Поскольку мембраны клеток животных не могут создавать или поддерживать осмотический градиент, при изменении равновесия клетки либо набухают, либо сморщиваются. На изменения объёма клетки реагируют путем активации механизмов, которые регулируют их объём. Процесс, в результате которого набухшая или сморщенная клетка возвращается к нормальному объёму называется, соответственно, регулируемое уменьшение (RVD) и регулируемое увеличение объёма (RVI). Объём клетки может регулироваться только в результате захвата или выброса осмотически активных веществ. В большинстве своём - это неорганические ионы, например, натрий, калий и хлор, а также это могут быть органические молекулы небольшого размера, которые называются органическими осмолитами.
Захват или выброс электролитов, влияющих на объём клетки, регулируется процессами транспорта через мембраны. В большинстве животных клеток снижение объёма сопровождается потерей хлорида натрия в результате активации специфических каналов или транспортера для натрия и хлора одновременно. Увеличение объёма клетки сопровождается захватом как хлорида натрия, так и хлорида калия. Эти соли накапливаются в клетке в результате активации обменных каналов натрия на водород и ионов хлора на гидрокарбонат или активации транспортера для ионов натрия, калия и хлора. Система транспорта ионов в большинстве случаев оказывается вовлеченной в регуляцию объёма клетки (рис. 9.1) Эти транспортные пути активируются в течение нескольких секунд после изменения объёма. Система транспорта ионов имеет очень важное значение: она участвует в регуляции объёма клетки, контролирует рН внутри клетки и осуществляет трансэндотелиальный транспорт соли и воды.
Рис. 9.1. Регулирование объема клетки в результате работы переносчиков и каналов, осуществляющих удаление или поступление электролитов.
Органические осмолиты в высоких концентрациях (десятки и сотни ммоль/литр) находят в цитозоле всех животных организмов, начиная от бактерии и заканчивая человеком. Эти вещества играют ведущую роль в объёмном гомеостазе клетки и могут действовать, как основные цитопротекторы. В животных клетках органические осмолиты делятся на три основных класса: полионы (сорбитол и миоинозитол), аминокислоты и их производные (таурин, аланин и пролин) и метиламины (бетаин и глицерофосфатхолин (GPC)) (рис. 9.2). Органические осмолиты имеют уникальные биофизические и биохимические свойства, которые накапливаются в клетках без существенного изменения гомеостаза, структуры и функции. Напротив, другие вещества, например, электролиты или мочевина, могут повреждать клетку, когда они накапливаются в ней в высоких концентрациях или когда возникают большие сдвиги в их концентрации. Например, высокая концентрация внутри клетки неорганических ионов может вызвать денатурацию или преципитацию макромолекул клетки. Небольшие изменения концентрации электролитов внутри клетки изменяют ее мембранный потенциал, скорость ферментативных реакций и транспорт ионов через мембрану вследствие изменения ионного градиента.
Рис. 9.2. Основные классы органических осмолитов, найденных в животных клетках
Рис. 9.3. Механизмы накопления и удаления органических осмолитов. Объем регулирующее накопление органических осмолитов в клетках животных связан в значительной степени изменениями активности Na+-сопряженного мембранного транспорта и изменениями скоростей синтеза и деградации осмолитов. Накопление органических осмолитов связано либо с энергозависимым транспортом их из внеклеточной среды, либо с изменением скорости синтеза и распада осмолитов. Регуляция объёма клетки путем накопления осмолитов - это медленный процесс по сравнению с транспортом и захватом электролитов и может продолжаться несколько часов. Процесс является медленным потому, что активация путей накопления органических осмолитов требует запуска процессов транскрипции и трансляции генов, кодирующих эти осмолиты и ферменты, необходимые для их синтеза. Потеря клеткой органических осмолитов происходит в два этапа. Сначала происходит быстрая (в течение секунд) потеря органических осмолитов (рис. 9.3). В клетках животных этот выброс происходит через неселективные мембранные каналы, которые активируются при набухании клетки и пропускают также неорганические анионы.Второй механизм заключается в угнетении синтеза органических осмолитов в клетке. Естественно, это медленный процесс. При этом угнетается и синтез веществ, переносящих органических осмолитов. При снижении скорости транскрипции уровень РНК падает и количество функциональных белков уменьшается в течение нескольких часов или дней. Механизмы регуляции объёма очень чувствительны - например, клетки эпителия канальцев почек способны реагировать на изменение объёма в 3% в ту или другую сторону.
Было установлено, что изменение объёма клетки вызывает множество последующих реакций: набухание или сморщивание, изменение архитектоники цитоскелета, концентрации ионов внутри клетки, и изменение концентрации микромолекул в цитоплазме. Ни один из сигнальных механизмов не может влиять на синтез белка или транспортные каналы. Чтобы еще больше усложнить картину, скажем, что недавно было установлено, что клетки реагируют не только на простое набухание или сморщивание. Сейчас считают, что в клетках имеется множество волюм-детекторных и волюм-эффекторных механизмов, которые реагируют как на величину, так и на причину изменений объёма клеток. Такие функционально чувствительные датчики могут осуществлять контроль как за внутриклеточным рН, так и за ионным составом клетки в связи с изменениями ее объёма.
Регулирование объема клетки с точки зрения фазовой теории
Объем клетки складывается в основном из объема воды и клеточных белков. Соотношение количества воды и белков не остается постоянным и зависит как от физиологического состояния клетки, так и от ее типа. В целом это соотношение определяется тремя факторами, каждый из которых сводится, в конечном счете, к различиям в свойствах белков и в их количестве.
Первым фактором является способность доступных для растворителя участков полипептидных цепей и целых белков с полностью развернутой конформацией связывать воду, организуя ее в многослойную структуру поляризованных, ориентированных в пространстве молекул воды. Равновесный объем клетки определяется балансом сил между адсорбцией воды, увеличивающей объем клетки, и двумя другими факторами, противодействующими увеличению объема: солевыми связями (внутри- и межбелковыми), возникающими между фиксированными зарядами повсюду в клетке и ограничивающими способность белков связывать воду; и веществами с низким коэффициентом распределения между клеткой и средой (в клетке они представлены только свободной фракцией) и, поскольку их концентрация в клеточной воде меньше, чем в среде, этот компонент в общем балансе осмотических сил способствует потере воды клеткой, то есть уменьшению ее объема - вода уходит туда, где концентрация растворенных веществ выше.
Общий механизм набухания клетки при повреждении и под влиянием КС1 (в повышенных концентрациях), а также зависимость этого набухания от концентрации NaCl в среде и от содержания АТФ в клетке говорит в пользу взглядов теории АИ на регуляцию клеточного объема и ключевую роль АТФ как электроноакцепторного адсорбата в поддержании состояния покоя живой клетки.
Эффект Доннана
1) 2) (1)
Где М - концентрация макромолекул.
Очевидно, что в общем случае , т.к. и распределены по обе стороны мембраны неравномерно. Такая неравномерность возникает даже несмотря на то, что система находится в равновесии, и даже при условии, что ни , ни не связываются с .
Насколько велик эффект Доннана?
Важным параметром является величина представляющая собой отношение концентрации зарядов макромолекул к суммарной концентрации ионов со стороны 1.
Если , , так что со стороны I имеется 20-кратный избыток ионов , а со стороны II - 20-кратный избыток ионов . Такая ситуация будет иметь место, если в системе присутствуют белок в концентрации 10-4 Моль с общим зарядом в расчете на молекулу +10 и одновалентная соль (например, NaCl ), концентрация которой в растворе со стороны I равна 50 мкМ. Однако по мере того, как С приближается к zM и становиться больше ее, величина rD уменьшается до единицы. Это вполне естественно, так как в соответствии с уравнением (1) при . Таким образом, эффективный способ устранения эффекта Доннана состоит в увеличении до соответствующего уровня концентрации соли.
При , , .
Всегда устанавливается такое ассимметричное распределение ионов, при котором малые ионы, несущие заряд того же знака, что и макромолекулы, имеют более высокую концентрацию с той стороны мембраны, где нет макромолекул, при этом у других малых ионов соотношение концентраций обратное.
Потенциал Доннана можно рассчитать по уравнению Нернста:
Тема 10. Теория "ассоциации-индукции". Проницаемость клеток и модельных систем для ионов
На рис. 10.1 схематически изображена часть поверхности клетки. Непрерывная фаза этой поверхности представляет собой поляризованную и ориентированную воду, в которой видны четыре - и/или -карбоксильные группы (молекула белка, которой эти группы принадлежат, не показана). Одновалентный катион - скажем, К+ - может войти в клетку либо сквозным путем (путь 1), либо адсорбционно-десорбционным (путь 2, для краткости - адсорбционный путь). Низкая растворимость ионов в поверхностной структурированной воде делает сквозной путь затруднительным. Входящий этим путем катион сталкивается с непрерывным энергетическим барьером, обусловленным необходимостью взламывать структуру связанной воды, электростатически взаимодействуя с ее молекулами. Альтернативным механизмом является адсорбционно-десорбционная диффузия. Для катиона энергетически более выгодно вступить во взаимодействие с фиксированным анионом. Связавшись с ним, катион претерпевает колебания вокруг фиксированного аниона, после чего может десорбироваться и двигаться дальше внутрь клетки. Адсорбционно-десорбционный путь представляет собой наиболее вероятный способ проникновения в клетку ионов, которые непрочно адсорбируются фиксированными противоионами (см. ниже).
Рис. 10.1. Альтернативные пути входа одновалентного катиона (например, К+) в систему фиксированных отрицательных зарядов модели или живой клетки с анионными центрами на поверхности.
Рис. 10.2. Триплетний адсорбционно-десорбционный путь (диффузия, облегченная участием активирующего катиона) - вариант адсорбционно-десорбционного пути (рис. 35), по которому в клетку проникают катионы (К), сравнительно более прочно связывающиеся с фиксированными анионами. В зависимости от происхождения третьего, активирующего катиона (серые кружки), он подразделяется на "бильярдный", когда активирующий катион поступает снаружи, и на "ротационный", когда активирующий катион находится внутри клетки. Светлые кружки со знаком "минус" - фиксированные анионы. Черные кружки - катионы, проникающие в клетку из внешней среды. Если же катион адсорбируется прочнее, десорбция будет занимать больше времени. Однако ее может ускорить участие второго катиона, в связи с чем, этот путь назван триплетной (облегченной) адсорбционно-десорбционной диффузией или, более кратко, - триплетным (облегченным) адсорбционным путем (рис. 10.2). Обратите внимание, что в зависимости от того, с какой стороны мембраны поступает активирующий катион, - снаружи или из цитоплазмы, - триплетный путь подразделяется на бильярдный (удар извне) и ротационный (с замещением).
Таким образом, сквозной путь и два типа адсорбционно-десорбционной диффузии - адсорбционная и триплетно-адсорбционная - определяют все возможные пути проникновения ионов из среды в клетку: независимый путь (сквозная диффузия), конкурентный и облегченный. Реальность каждого из этих видов взаимодействий была подтверждена экспериментально. Например, ионы Rb+ конкурентно подавляют вход К+ в мышечные волокна лягушки, тогда как К+, наоборот, облегчает проникновение Rb+. Это согласуется и с теорией "ассоциации-индукции" и с известным фактом, что Rb+ более прочно, чем К+, адсорбируется - и -карбоксильными группами независимо от их локализации - на поверхности клетки или в толще цитоплазмы.
Тема 11. Сборка электрон-транспортных цепей. Окислительное фосфорилирование
11.1. Окислительно-восстановительные потенциалы
Процесс окисления можно определить как потерю электронов, а восстановление - как приобретение. Эти процессы являются комплементарными, поэтому если одно вещество окисляется, то другое должно восстанавливаться. Окисляемое и восстанавливаемое вещества являются соответственно донором и акцептором электронов. Типичную окислительно-восстановительную систему можно представить в следующем виде.
,
Где n - число электронов, участвующих в реакции. Поставляемые донорной системой электроны должны акцептироваться другой подходящей окислительно-восстановительной системой, окисленная форма которой имеет достаточно высокое сродство к электронам. Индивидуальные и суммарную реакции можно записать в следующем виде:
Окислительно-восстановительная реакция обратима и, следовательно, характеризуется константой равновесия, по которой можно определить изменение свободной энергии. Суммарная реакция включается две индивидуальные окислительно-восстановительные системы, которые обычно называют электродными реакциями, либо компонентами окислительно-восстановительной пары. Если инертный металлический электрод, например платиновый или серебряный, поместить в раствор, содержащий окислительно-восстановительную систему, то возникает разность потенциалов между электронами в растворе и в металле. Это приводит к образованию электродного потенциала. Можно показать, что величина этого потенциала, обозначаемого Е, определяется уравнением Нернста.
Где - постоянная для данной системы величина, называемая стандартным электродным потенциалом, R- газовая постоянная, Т - температура, n- число электронов, вовлекаемых в реакцию, F - число Фарадея, 96500 Кл.
Стандартный электродный потенциал - это потенциал системы в условиях, когда все растворенные вещества находятся в стандартных состояниях (т.е. их активности равны единице).
Электрод, погруженный в раствор окислительно-восстановительной системы, образует полуэлемент, потенциал которого в изолированном виде измерить невозможно, поскольку это одиночный электрод. Чтобы провести измерение, необходим скомбинировать его с другим полуэлементом, используя KCl -мостик; при этом образуется полный элемент, и разность потенциалов двух полуэлементов измеряют с помощью потенциометра. Желательно пользоваться стандартным полуэлементом, например водородным электродом, его потенциал условно принят равным нулю. В этой системе протекает следующая реакция:
И по определению потенциал системы равен нулю при всех значениях температуры, если инертный металлический электрод помещен в раствор с активностью водородных ионов, равной единице (т.е. рН=0), находящийся в равновесии с газообразным водородом при давлении 1 атм.
Для определения потенциала системы не обязательно пользоваться водородным электродом; может быть использован любой другой полуэлемент, потенциал которого по отношению к водородному электроду точно определен. Биологические окислительно-восстановительные реакции
Окислительно-восстановительные реакции играют важную роль в процессах аккумулирования и перехода энергии в биологических организмах. Например, пируват, образующийся как продукт гликолиза (см. рис. ), претерпевает окислительное декарбоксилирование, образуя ацетил кофермент А, который затем входит в цикл лимонной кислоты. В этом цикле ацетат переносится на оксалоацетат, образуя цитрат. Затем цитрат претерпевает ряд реакций, включающих постепенное окисление двух атомов углерода до СО2, и возвращается к четырехуглеродной молекуле (оксалоацетат) для повторного вхождения в цикл. Окисление ацетата до СО2 сопровождается восстановлением NAD+ до NADH и образованием 1 моль восстановленного флавинаденин динуклеотида (ФАDН2). Это восстановление, обусловленное циклом лимонной кислоты последовательно используется в биосинтетических реакциях и для образования АТФ путем окислительного фосфорилирования (респирации) в митохондриях. Ступенью, дополняющей цикл лимонной кислоты, является окисление малата до оксалоацетата, связанное с восстановлением NAD+ до NADH ферментом малатдегидрогеназой:
Для расчета величины , связанной с такой реакцией, можно использовать значения соответствующих окислительно-восстановительных полуреакций, приведенные ниже:
(Вольт)
NAD+ + Н+ + 2e- NADH-0,320
Оксалоацетат + 2Н+ + 2e- малат-0,166
кДж.
Эта ступень цикла несамопроизвольна в стандартных условиях. Однако она может стать самопроизвольной в условиях, когда велик выход NADH; это происходит при низких значениях соотношения [NADH]/[NAD+]. В этих условиях малат переходит в оксалоацетат, который в свою очередь служит для возвращения в цикл лимонной кислоты. Это пример метаболического регулирования, когда поддерживается разумный баланс расход-выход. Главный источник клеточного АТФ - это процесс окислительного фосфорилирования (респираторного переноса электронов), происходящий в митохондриях. Это серия реакций с переносом электрона, катализируемых тремя ферментными мембранными комплексами, посредством чего окисляется NADH. Каждый комплекс дает вклад в образование трансмембранного протонного градиента, связанного с образованием АТФ. Полная окислительная реакция:
2NADH + 2Н+ + O2(г)  2NAD+ + 2Н2O.
Термодинамика этого процесса в терминах каждого из трех ферментных комплексов будет проанализирована ниже.
Задача 1. При рН 7,0 для системы метиленовый синий- лейкометиленовый синий =0,011 В при 30С. Если электродный потенциал раствора данной системы равен 0,065 В, рассчитайте долю (в %) восстановленной (лейко) формы.
В процессе участвуют два атома водорода (эквивалентны 2 протонам плюс 2е, n=2 и Примем, что процент MCH2 равен x, тогда (100-х)/х=63,1 и х=1,56.
Следовательно, система содержит 1,56% лейкометиленового синего.
Задача 2. Для системы рибофлавин-лейкорибофлавин при рН 7,0 и 20С =-0,186 В. Рассчитайте окислительно-восстановительный потенциал этой системы для состояний, в которых она содержит а) 10% и б) 80% окисленной формы.
Запишем реакцию:
, где X - рибофлавин и - его восстановленная форма, в реакцию вовлекаются два е, n=2.
=-0,186+= -0,186+=-0,214 В.
Во втором случае: =-0,169В.
Рассмотрим реакции между двумя различными окислительно-восстановительными системами. Если при определенном рН смешать две системы с различными потенциалами, то реакция будет протекать до достижения состояния равновесия, при котором обе системы будут иметь одинаковый потенциал. В качестве примера рассмотрим системы сукцинатдегидрогеназы и метиленового синего, которые используются в методе Тунберга. Реакции, протекающие в этих системах, следующие:
Константа равновесия этой реакции
Поместим 1 мл раствора, содержащего сукцинат и фумарат (концентрации каждого 0,001 М), вместе с ферментом сукцинатдегидрогеназой в вакуумную пробирку Тунберга, а 1 мл раствора метиленового синего ( концентрации окисленной и восстановленной форм 0,001 М) - в боковой отросток этой пробирки, обе системы при рН 7,0 и 30С. для сукцинатной системы равно +0,005 В, а для системы МС-МСН2 +0,011В.
При смешивании растворов (путем переворачивания пробирки) сукцинат-фумаратная система, имеющая более низкий потенциал, будет восстанавливать систему метиленового синего и при этом сама окислятся. Следовательно, отношение [фумарат]/[сукцинат] будет увеличиваться, а отношение [MC]/[МСН2] уменьшаться, увеличение потенциала первой и уменьшение потенциала второй системы будет происходить до тех пор, пока не установиться положение равновесия, при котором обе системы будут иметь одинаковый потенциал, т.е.
Поскольку в рассматриваемом случае реакция начинается при равных концентрациях всех четырех компонентов, то на всех ее стадиях [фумарат]=[MCH2], [сукцинат]=[MC]. 0,006=; , Полагая процент MCH2 равным х, получим х/(100-х)=1,26 и х=55,8. Таким образом, в равновесии 55,8 % красителя будет восстановлено.
Свободная энергия окислительно- восстановительных реакций
Из рассмотренного примера:
или Это означает, что изменение стандартной свободной энергии при реакции между двумя окислительно-восстановительными системами можно рассчитать по разности величин . По такому же выражению можно рассчитать изменение свободной энергии, характеризующее каждую из двух индивидуальных систем:
Сукцинат- фумарат МС-МСН2
Для суммарной системы изменение свободной энергии составит
Тканевое дыхание
Расход органических веществ в живых тканях, сопровождаемый потреблением кислорода и выделением СО2 называется тканевым дыханием. Тканевое дыхание можно наблюдать, используя срезы тканей. Если срезы инкубировать в растворе глюкозы в замкнутом сосуде, то в растворе происходит убыль глюкозы, а в воздухе над жидкостью убыль кислорода и прирост СО2
Если опыт проводить в присутствии меченого кислорода, то обнаруживается, что весь кислород включается в молекулы воды, в то время как в СО2 меченный кислород не содержится. Из этого следует, что вдыхаемый кислород используется для синтеза воды за счет водорода окисляемых субстратов:
D·H2 + 1/2O2 = D +H2O + Q
DH2 - дегидрируемый субстрат, который служит донором водорода (дегидрируется), а кислород выполняет роль акцептора водорода (гидрируется).
С6Н12О6 + 6Н2О + 12А = 6СО2 +12 АН2
12АН2 + 6О2 = 12Н2О + 12А
С6Н12О6 + 6О2 = 6СО2 + 6Н2О
Уравнение отражает суммарный результат сложного метаболического пути окисления глюкозы, который включает много реакций и промежуточных продуктов. Некоторые промежуточные продукты являются субстратами дегидролиза: они дегидрируются, причем акцепторами водорода служат коферменты - переносчики водорода.
Далее происходит перенос водорода и коферментов на кислород. Это тоже многостадийный процесс, совершающийся при участии специальной ферментной системы в митохондриях.
Дыхательная цепь
Окисление субстратов в процессе дыхания можно представить как перенос электронов и протонов (т.е. в целом - атомов водорода) от органических веществ на кислород:
Этот процесс включает много этапов, в нем участвует ряд промежуточных переносчиков, образующих цепь переноса электронов и протонов, или дыхательную цепь.
Водород от первичных доноров вводится в дыхательную цепь с участием НАД-зависимых и ФАД-зависимых дегидрогеназ.
НАД-зависимые дегидрогеназы катализируют реакции окисления веществ путем дегидрирования; при этом окисляемое вещество служит донором водорода (D·H2), а НАД выполняет роль акцептора водорода, т.е. восстанавливается. Остаток никотинамида в НАД принимает непосредственное участие в реакции:
Из двух атомов водорода (2Н +2ē), отщепляемых от субстрата, к НАД присоединяется один протон (второй переходит в среду) и 2ē, в результате чего утрачивается положительный заряд пиридинового цикла НАД.
DН2 + НАД+ = НАДН +Н+ + D
Флавиновые дегидрогеназы составляют другую группу дегидрогеназ. Коферментами для них является флавинадениндинуклеотид (ФАД) или флавиномононуклеотид (ФМН). Эти коферменты являются производными рибофлавина (витамина В2)
В ходе реакции отщепляются от субстрата атомы водорода и присоединяются к изоаллоксазиновой группировке кофермента:
К флавиновым ферментам, содержащим ФМН, принадлежит НАДН-дегидрогеназа, которая окисляет НАДН. Акцептором Н в этой реакции служит кофермент Q (убихинон), который в клетке может существовать в окисленной и восстановленной формах (Q и QH2).
ФАД зависимые дегидрогеназы переносят водород на убихинон (образуется убихинол QH2), а НАД-зависимые дегидрогеназы - на НАД (образуется НАД·Н).
Далее с НАДН водород передается тоже на убихинон; эту реакцию катализирует НАД·Н-дегидрогеназа.
НАДН +Н+ + Q НАД +QH2
В процессе реакции водород сначала присоединяется к ФМН, соединенному с ферментом, а затем передается на убихинон.
На стадии образования QH2 сливаются два потока атомов водорода, вводимых в дыхательную цепь НАД-зависимыми и ФАД-зависимыми дегидрогеназами.
Затем в дыхательной цепи пути электронов и протонов расходятся. Перенос электронов осуществляется с помощью цитохромов. Цитохромы представляют собой гемопротеины (геминовые ферменты). Атом Fe в геме цитохромов может менять валентность, присоединяя или отдавая электрон:
Fe3+ + ē → Fe2+
Fe2+ - ē → Fe3+
Цитохромы дыхательной цепи обозначают латинскими буквами: b, c1, c, а и а3
Комплекс цитохромов b и c1 функционирует как QH2- дегидрогеназа: он осуществляет перенос электронов с QH2 на цитохром с:
QH2 + 2c(Fe3+) → Q + 2H+ + 2c(Fe2+)
Электроны последовательно проходят через атомы железа цитохромов b и с1, а затем поступают на цитохром с; протоны при этом освобождаются в раствор. Стехиометрический коэффициент 2 перед символом цитохрома обусловлен тем, что с QH2 передаются два электрона, а цитохромы за один цикл переносят по одному электрону.
Комплекс цитохромов a и a3 действует как цитохромоксидаза. Цитохромоксидаза, помимо гема, содержит ионы меди, которые тоже участвуют в переносе электронов, меняя валентность:
Cu2+ + ē → Cu+
Cu+ - ē → Cu2+
Этот комплекс цитохромов переносит электроны с цитохрома с на кислород:
Электроны последовательно присоединяются к ионам железа цитохромов a и a3, затем к иону меди и, наконец, попадают на кислород.
Кислород, поступающий в митохондрии из крови, связывается с атомом железа в гемме цитохрома a3 в форме молекулы O2 (подобно тому, как он связывается с гемоглобином). Затем каждый из атомов молекулы O2 последовательно присоединяет по два электрона и по два протона, превращаясь в молекулу воды:
O2 + 4ē +4H+ →2H2O
Таким путем через дыхательную цепь атомы водорода пищевых веществ достигают конечного акцептора- атмосферного кислорода. В организме человека в результате тканевого дыхания образуется 300-400 мл воды в сутки (метаболическая вода).
В этом перечне способность отдавать электроны (окисляться) убывает сверху вниз, а способность принимать ē (восстанавливаться) нарастает сверху вниз. Перемещение ē в дыхательной цепи происходит по градиенту ох-red потенциала.
Идентифицировано и выделено три главных связанных с мембраной комплекса дыхательных ферментов на пути от НАД·Н до О2.
1. НАДН-дегидрогеназный комплекс. Принимает ē от НАДН и передает их через флавин и по меньшей мере пять железосерных центров на убихинон - небольшую жирорастворимую молекулу, передающую ē на второй комплекс дыхательных ферментов b-c1.
2. Комплекс ферментов b-c1-состоит по меньшей мере из 8 разных полипептидных цепей и вероятно существует в виде димера с молекулярной массой 500000. Каждый мономер содержит три гемма, связанных с цитохромами и железосерный белок. Комплекс принимает ē от убихинона и передает их цитохрому с, небольшому периферическому мембранному белку, который затем переносит их на цитохромоксидазный комплекс.
3. Цитохромоксидазный комплекс. Выделен как димер с молекулярной массой 300000. Каждый мономер содержит два цитохрома и два атома меди. Этот комплекс принимает ē от цитохрома с и передает их на кислород.
Два компонента, переносящие электроны между тремя главными ферментными комплексами дыхательной цепи- убихинон и цитохром с- быстро перемещаются путем диффузии в плоскости мембраны.
Столкновения между этими подвижными переносчиками и ферментными комплексами вполне позволяют объяснить наблюдаемую скорость переноса ē (каждый комплекс отдает и принимает 1ē каждые 5-20 мс). Поэтому нет необходимости предполагать структурную упорядоченность цепи белков переносчиков в липидном бислое; ферментные комплексы, видимо, существуют в мембране как независимые компоненты и упорядоченный перенос ē обеспечивается только специфичностью функциональных взаимодействий между компонентами цепи.
Митохондриальная дыхательная цепь функционирует как последовательность реакций переноса ē от одного компонента к другому. Многие из компонентов просто принимают один или несколько ē, переходя из окисленной формы в восстановленную, у некоторых наряду с принятием ē, происходит присоединение Н+.
Fe3+(цит. с) + ē → Fe2+(цит.с)
НАД+ + 2ē + Н+ → НАД·Н
Электрохимическое описание red-ox реакции дает возможность разбить весь процесс на две полуреакции, включающие присоединение и отдачу ē.
Пара НАДН/НАД+ называется окислительно-восстановительной парой. Помещая электроды в раствор с соответствующей окислительно-восстановительной парой, можно измерить окислительно-восстановительный потенциал каждого переносчика ē, участвующего в окислительно-восстановительных реакциях. Окислительно-восстановительный потенциал служит мерой сродства молекулы переносчика к электронам. Пары соединений с наиболее отрицательными значениями E обладают наименьшим сродством к ē, т.е. содержат переносчики с наименьшей тенденцией принимать ē. Для пары НАДН/НАД+ E=-0,32В, что указывает на сильно выраженную способность НАДН отдавать ē, тогда как окислительно-восстановительный потенциал пары Н2О и 1/2О2 составляет +0,82В, что означает сильную тенденцию О2 к принятию ē.
Для описания термодинамиче ского равновесия между парами пользуются разностью их окислительно-осстановительных потенциалов:
Разность потенциалов между любыми двумя переносчиками прямо пропорционально энергии, высвобождаемой при переходе от одного переносчика к другому. Каждый комплекс действует как энергопреобразующее устройство, направляя эту свободную энергию на перемещение протонов через мембрану. Общая разность ох-red потенциалов между НАД·Н и О2 равна 1,12 В (0,82- (- 0,32) = 1,14); этому соответствует разность свободных энергий G, равная 220 кДж ( G = -nFE) в пересчете на каждую пару переносимых электронов. Такого количества энергии хватило бы на синтез 4 молекул АТФ. Однако, в действительности может синтезироваться не более трех молекул АТФ. Отметим, что энергия синтеза воды из молекул водорода и молекул кислорода равна 230 кДжмоль, то есть не существенно отличается от энергии синтеза воды при переносе водорода с НАДН на молекулу кислорода в живой клетке.
Восстановленная форма Окисленная форма Е в (рН 7) НАДН НАД - 0,32 Убихинон Убихинон +0,1 Цитохром b (Fe²+) Цитохром b (Fe³+) +0,12 Цитохром с1 (Fe²+) Цитохром с1(Fe³+) +0,21 Цитохром с (Fe²+) Цитохром с (Fe³+) +0,254 Цитохром 3 (Fe²+) Цитохром (Fe³+) +0,29 Н2О О2 +0,816 Термодинамика функционирования ферментных комплексов
1. NADH-Q-редуктаза
NADH, являясь растворимым восстановителем, синтезируемым в цикле лимонной кислоты, поступает в митохондрии. Она окисляется ферментным комплексом NADH-Q-редуктаза, который содержит несколько групп восстановителей. Сначала NADH восстанавливает флавин (FMN), который в свою очередь восстанавливает железо-сернистый центр (FeS). Затем электроны переходят на восстановленный убихинон (UQ). Мы можем схематически изобразить взаимосвязанные окислительно-восстановительные реакции, катализируемые этим комплексом:
UQH2 затем освобождается для продолжения следующего цикла. В течение этого процесса ионы Н+ разряжаются на внешней стороне митохондрийных мембран в межмембранном пространстве, Н+ принимаются из внутреннего пространства. Это источник вклада в градиент рН, который приводит к образованию АТФ. Реакция для этой части электронного переноса (на два электрона):
NADH + Н+ + UQ  NAD+ + UQH2
2. Цитохромредуктаза
UQH2 диффундирует во второй митохондрийный мембранно-связанный комплекс, цитохромредуктазу. UQH2 поставляет электроны на FeS-центр к водорастворимому цитохрому С.. Полная реакция:
QH2 + 2CytCокисл  Q + 2Н+ + 2CytCвосст
3. Цитохром-С-оксидаза
Третий митохондриальный мембранный комплекс, цитохром-С-оксидаза, получает электроны от CytCвосст и переносит их на молекулярный кислород, который требует в целом 4 электрона для перехода в две молекулы воды. Комплекс цитохром С оксидаза выполняет этот перенос при посредничестве двух гемцентров. Каждый гем связан с ионом меди, находящимся рядом с атомом железа гема. Реакция (на два переносимых электрона):
Для каждой из этих трех стадий митохондриального переноса электронов величина сильно отрицательна. Однако эта свободная энергия не рассеивается. Часть ее остается в виде химического потенциала, связанного с трансмембранным протонным градиентом, который в свою очередь запасает энергию движения протона для образования АТФ. Строение митохондриальной мембраны
1- наружная мембрана, 2-внутренняя мембрана, 3- матрикс, 4-межмембранное пространство. Каждая митохондрия окружена двумя высокоспециализированными мембранами, играющими ключевую роль в ее активности. Мембраны образуют два изолированных митохондриальных компартмента: внутренний матрикс и значительно более узкое межмембранное пространство. В состав наружной мембраны входит много копий белка, называемого порином, который образует широкие гидрофильные каналы в липидном бислое. Таким образом, эта мембрана напоминает сито, проницаемое для всех молекул массой 10000 дальтон и меньше, включая небольшие белки. Эти молекулы могут проникать в межмембранное пространство, но большая их часть не способна проходить через непроницаемую внутреннюю мембрану. Это означает, что состав межмембранного пространства эквивалентен составу цитозоля. Кроме того, в состав наружной мембраны входят ферменты, участвующие в синтезе митохондриальных липидов и переводящие липидные субстраты в такие формы, которые затем метаболизируются в матриксе.
Основная рабочая часть митохондрии- это матрикс и окружающая его внутренняя мембрана. Внутренняя мембрана высокоспецифична, она содержит большое количество "двойного" фосфолипида кардиолипина, что как полагают, и делает мембрану особенно непроницаемой для ионов. Эта мембрана образует многочисленные складки, увеличивающие общую поверхность мембраны. В ней содержатся белки трех главных типов: 1) белки, катализирующие окислительные реакции в дыхательной цепи; 2) ферментный комплекс, называемый АТФ-синтетазой, который синтезирует в матриксе АТФ; 3) специфические транспортные белки, регулирующие перенос метаболитов в матрикс и из него.
Матрикс содержит высококонцентрированную смесь из сотен различных ферментов, в том числе ферменты, необходимые для окисления пирувата и жирных кислот, и ферменты цикла лимонной кислоты. Кроме того, там находится несколько идентичных копий митохондриальной ДНК, специфические митохондриальные рибосомы, тРНК и различные ферменты, участвующие в экспрессии митохондриального генома.
Электрохимический протонный градиент Для работы энергопреобразующего механизма, лежащего в основе окислительного фосфорилирования, нужно, чтобы каждый ферментный комплекс дыхательной цепи был ориентирован во внутренней митохондриальной мембране определенным образом - так, чтобы все протоны перемещались в одном направлении - из матрикса наружу. Каким образом ненаправленные в пространстве химические реакции могут вызвать направленный (векторный) перенос веществ через мембрану. Митчелл предположил, что структура транспортных белков позволяет субстратам и продуктам проникать в активный центр и покидать его лишь по определенным путям. Белок, катализирующий перенос от субстрата к акцептору В, имеет такую структуру, что и движутся различными путями. Электроны переносятся от донора А к акцептору В по "петле", имеющей две ветви: в первой из связаны с простетической группой типа FAD, а вторая включает только электронный переносчик, например, железосерный центр. При переносе от переносчика атомов водорода к переносчику высвобождаются протоны, которые выделяются векторно на наружной стороне мембраны. В соответствии с этим, Митчелл предположил, что в каждом протон-переносящем сегменте ЭТЦ переносчики протонов () чередуются с переносчиками () образуя red-ox петлю.
Перенос от А к В идет против электрического поля. При такой организации электронного транспорта окисление донора электронов конечным акцептором В, находящимся на той же стороне мембраны, сопряжено с трансмембранным переносом протонов. Три комплекса ЭТЦ играют роль генератора электрохимического протонного градиента , сопрягающих перенос с трансмембранным переносом протонов.
Передвижение протонов приводит к двумя важным следствиям: 1) между двумя сторонами внутренней мембраны создается градиент рН - в матриксе рН выше, чем в цитозоле, где значение рН обычно близко к 7,0 (так как малые молекулы свободно проходят через наружную мембрану митохондрии, рН в межмембранном пространстве будет таким же, как в цитозоле); 2) на внутренней мембране создается градиент напряжения (мембранный потенциал), причем внутренняя сторона мембраны заряжается отрицательно, а наружная положительно.
Градиент рН () заставляет ионы переходить обратно в матрикс, а ионы из матрикса, что усиливает эффект мембранного потенциала (), под действием которого любой положительный заряд притягивается в матрикс, а любой отрицательный выталкивается из него. Совместное действие этих двух сил приводит к возникновению электрохимического протонного градиента.
служит термодинамической мерой того, насколько градиент протонов через мембрану далек от равновесия. Перенос и синтез АТФ сопряжены с работой двух различных обратимых протонных помп. При переносе образуется разность , которая затем используется для обращения протонной помпы (синтеза АТФ).
Электрохимический потенциал протонов по сторонам мембраны можно найти с использованием уравнения:
Потенциалы на наружной и внутренней сторонах мембраны:
Митчелл ввел концепцию протондвижущей силы (), измеряемой в милливольтах (мВ):
Так как градиент рН () в 1 единицу рН эквивалентен мембранному потенциалу около 60 мВ. Протондвижущая сила будет равна:
В типичной клетке эта сила на внутренней мембране дышащей митохондрии составляет 220 мВ и складывается из мембранного потенциала примерно 160мВ и градиента рН, близкого к -1 единице рН.
Относительный вклад и в 1. Если исходить из деэнергизованной органеллы:
2. Включение дыхания. Работа протонной помпы приведет к образованию , основным компонентом которого является . В случае митохондрий электрическая емкость мембраны такова, что перенос моля на 1 мг белка приведет к образованию . Буферная емкость митохондриального матрикса 20 нмолей на 1 мг белка. При потере 1 нмоля рН матрикса повысится на 0,03. . Таким образом, в этих условиях на 99% представлен в форме мембранного потенциала.
3. При образовании может происходить перераспределение проникающих ионов. Перенос К+ в присутствии валиномицина или перенос Ca2+ приводит к рассеванию и понижению .
В том случае, когда перенос 2-х или более протонов прочно сопряжен, необходимо учитывать общую разность электрохимических потенциалов.
Унипорт. Антипорт
При этом происходит дополнительный выброс протонов дыхательной цепью и повышение . Перенос 20 нмолей К+ (10нмолей Са2+), уравновешенный выбросом 20 нмолей Н+, приведет к образованию (-60=60 мВ). Поскольку дыхательная цепь может создать лишь , не превышающий исходный, то после переноса ионов конечная величина снизится на 60 мВ.
Понижение будет приводить к снижению уровня переноса ионов, пока система не достигает электрохимического равновесия.
4). Перераспределение электронейтральных проникающих форм слабых кислот и оснований. Например, накопление слабых кислот и оснований в ответ на образование , будет приводить к рассеиванию и возрастанию за счет работы дыхательной цепи. Возникает ситуация, когда в митохондриях накапливаются и катионы и анионы. Если их количество достаточно велико, то это приведет к осмотическому набуханию митохондрий. Однако этот эффект не наблюдается, если в митохондриях накапливаются Са2+ и . Они образуют осмотически неактивный комплекс и осмотическое давление в матриксе не повышается.
Основные положения хемиоосмотической гипотезы Митчелла
1. Электронпереносящие цепи митохондрий сопряжены с системой синтеза АТФ через разность электрохимических потенциалов.
2. Перенос электронов и синтез АТФ сопряжены с работой двух различных обратимых протонных помп. При переносе электронов образуется разность потенциалов , которая затем используется для обращения протонной помпы.
3. Дыхательная цепь должна переносить протоны через мембрану.
4. АТФ-синтетаза должна работать как обратимая протон-переносящая АТФаза.
5. Сопрягающие мембраны должны иметь низкую протонную проводимость.
6. Сопрягающие мембраны должны содержать специфические обменные переносчики, позволяющие метаболитам проникать через мембрану и сохранять осмотическую стабильность в условиях высокого мембранного потенциала.
Функционирование АТФ- синтазы
АТР-синтетаза является универсальным компонентом сопрягающих мембран. Она присутствует в митохондриях, в хлоропластах, в аэробных и фотосинтезирующих организмах и даже в тех бактериях, которые лишены функциональной дыхательной цепи и существуют за счет гликолиза. АТР-синтетазный комплекс имеет сходное строение во всех мембранах и сильно отличается от других АТР-зависимых ионных помп, таких, как Na+, К+-АТРаза из плазматической мембраны эукариотических клеток или Са2+ -АТРаза, отвечающая за накопление Са2+ в цистернах саркоплазматического ретикулума. АТР-синтетаза сопрягающих мембран использует энергию для поддержания концентрации АТР, отличающейся от равновесной концентрации по крайней мере на семь порядков. В случае анаэробных бактерий она использует АТР для поддержания , необходимой для транспортных процессов. АТР-синтетаза получила свое название в связи с тем, что в обычных условиях протонного градиента, поддерживаемого дыхательной цепью, синтезирует большую часть всего АТР клетки.
АТФ- синтазный комплекс состоит из девяти различных полипептидов; некоторые из них представлены в нескольких копиях. Комплекс можно разделить на две части: шляпку, которая видна в электронных микроскоп и является каталитическим компонентом комплекса (ее обозначают F1 в митохондриях, CF1 - в хлоропластах и TF1 в термофильных бактериях), и остальную часть комплекса, которая состоит из гидрофобных белков, погружена в мембрану и обеспечивает, по-видимому, перенос протонов через мембрану к F1. Гидрофобную часть обозначают Fo. F1 можно отделить от Fo и, следовательно, от мембраны с помощью различных воздействий, таких, как обработка мочевиной, хелатирующими агентами или уменьшением ионной силы. Изолированный F1-это растворимый белок с молекулярной массой -360000. Он состоит из 5 (иногда 6) полипептидов. Субъединичный состав F1 из различных источников очень сходен. Обычно молекулярная масса субъединиц, определенная с помощью электрофореза составляет 56000 (-субъединица), 53000 (-субъединица), 33000 (-субъединица), 16000 (-субъедини-ца) и 11 000 (-субъединица).
После отделения F1 от мембраны его свойства изменяются. Так, например, изолированный F1 обратимо диссоциирует на холоду с потерей каталитической активности (во всех случаях, кроме чрезвычайно стабильного TF1 из термофильной бактерии PS3 (Kagawa el al., 1979)). Растворимый F1 катализирует гидролиз ATP с очень высокой скоростью. При 25°С один моль F, может гидролизовать около 104 молей АТР в минуту. Вместе с тем обратную реакцию-синтез АТР на растворимом F1-наблюдать не удается. Изолированный F1 не обладает абсолютной специфичностью к нуклеотидам: он катализирует также гидролиз и ITP, и GTP.
Fo в АТФ-синтетазном комплексе создает протонную проводимость между внешней средой и активным центром F1. В норме перенос протонов сопряжен с синтезом АТР, однако после отделения F1 возникает неконтролируемая протонная проводимость, которая не зависит от синтеза АТР.
Функционирование F1Fo- AТФ-синтазы митохондрий, хлоропластов, и бактерий представлено схематично справа. Если электрохимический H+ градиент благоприятен, F1Fo катализирует синтез ATP, сопряженный с самопроизвольным потоком H+ в матрикс. Например, в митохондриях, градиент pH иразность потенциалов способствуют потоку H+ из межмембранного пространства в матрикс. Действие АТР-синтетазы обратимо: она способна использовать как энергию гидролиза АТР для перекачивания протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану (рис. 11.2), так и энергию потока протонов по электрохимическому градиенту для синтеза АТР (рис. 11.1). Таким образом, АТР-синтетаза - это обратимая сопрягающая система, которая осуществляет взаимопревращение энергии электрохимического протонного градиента и химических связей. Направление ее работы зависит от соотношения между крутизной протонного градиента и локальной величиной G для гидролиза АТР.
Рис.11.1. Синтез АТФ при наличии и рН
Рис. 11.2. Гидролиз АТФ при рассеинании градиента H+. Число протонов, необходимое для синтеза одной молекулы АТР, в точности не известно. Для упрощения приводимых ниже расчетов мы будем предполагать, что при прохождении через АТР-синтетазу каждых трех протонов синтезируется одна молекула АТР.
Как будет работать в данный момент АТР-синтетаза - в направлении синтеза или гидролиза АТР, - зависит от точного баланса между изменениями свободной энергии для прохождения трех протонов через мембрану в матрикс () и для синтеза АТР в матриксе (). 1. Величина изменения свободной энергии для гидролиза АТФ с образованием АДФ и Фн при условиях, существования в клетке, варьирует от -11 до -13 ккал/моль. Однако столь благоприятные условия для протекания этой реакции связаны с тем, что концентрация АТФ в клетке поддерживается на очень высоком уровне, по сравнению с концентрациями АДФ и Фн.
(11.1)
(11.2)
В равновесии Для реакции (1) справедливо следующее уравнение
При стандартных условиях, когда концентрации равны 1 моль/л, величину для гидролиза АТФ называют изменением стандартной свободной энергии для данной реакции. ; ккал/моль.
При какой-то еше более низкой концентрации АТФ по сравнению с АДФ и Фн, величина упадет до нуля. В этом случае скорость образования АТФ из АДФ и Фн будет равна скорости гидролиза АТФ. , реакция находится в равновесии.
При постоянной температуре величина постоянна и зависит только от природы реагирующих веществ, тогда как изменяется при изменении концентрации реагирующих веществ и указывает, насколько данная реакция далека от равновесия. Поэтому именно , а не определяет, ли данная реакция служить источником энергии для других реакций. Высокая концентрация АТФ в клетке (относительно АДФ и Фн) при активном синтезе этого вещества в митохондриях обусловливает большую отрицательную величину для реакции гидролиза АТФ и удерживает эту реакцию в состоянии, далеком от равновесия. В противном случае гидролиз АТФ не мог бы использоваться клеткой для осуществления других процессов и многие биостнтезирующие реакции пошли бы в обратном направлении.
Таким образом, определяется концентрациями трех веществ в матриксе митохондрии - АТР, ADP и Р.
2. будет пропорциональна протонодвижущей силе на внутренней мембране. Переход одного протона в матрикс по электрохимическому градиенту, равному 220 мВ, высвобождает 5,06 ккал/моль (21 кДж/моль), а переход трех протонов - в три раза больше энергии ( = -15,2 ккал/моль). Таким образом, при постоянной протонодвижущей силе (220 мВ) АТР-синтетаза будет синтезировать АТР до тех пор, пока отношение АТР к ADP и Р не достигнет такого значения, при котором величина станет в точности равна +15,2 ккал/моль (при этом + = 0). При таких условиях синтез АТР будет точно уравновешиваться его гидролизом.
Предположим, что в связи с реакциями, требующими затраты энергии, в цитозоле внезапно гидролизовалось большое количество АТР, и это привело к падению отношения АТР:ADP в матриксе митохондрии. В этом случае понизится и АТР-синтетаза вновь переключится на синтез АТР, пока не восстановится исходное отношение АТР: ADP. Если же протонодвижущая сила внезапно снизится и будет поддерживаться на постоянном уровне 200 мВ, то уменьшится до -13,8 ккал/моль. В результате АТР-синтетаза начнет расщеплять АТР, и эта реакция будет продолжаться до тех пор, пока соотношение между концентрациями АТР и ADP не достигнет какого-то нового значения (при котором = +13,8 ккал/моль), и так далее.
У многих бактерий АТР-синтетаза обращает свое действие при каждом переходе от аэробного метаболизма к анаэробному и обратно. Подобная обратимость свойственна и другим мембранным ферментам, сопрягающим перенос ионов с синтезом или гидролизом АТР. Например, натрий -калиевый и кальциевый насосы гидролизуют АТР и используют высвобождаемую энергию для перекачки через мембрану определенных ионов. Если любой из этих насосов заставить работать в условиях необычно крутого градиента транспортируемых ионов, то он будет действовать в обратном направлении - синтезировать АТР из ADP и P, вместо того чтобы осуществлять гидролиз АТР. Таким образом, подобно АТР-синтетазе, эти насосы способны преобразовывать энергию, запасаемую в трансмембранном ионном градиенте, непосредственно в энергию фосфатных связей АТР.
Лабораторный практикум
Лабораторная работа 1. Изучение кинетики разрушения мембраны детергентами
Цель работы: Сделать анализ кинетических и концентрационных зависимостей разрушения природной мембраны детергентами.
Теоретическая часть. Процесс разборки мембран на составные компоненты осуществляется детергентами - группой амфифильных соединений, способных связываться с мембранным белком гидрофобными связями, одновременно взаимодействуя полярными группами с водой. В результате молекулы детергента сначала разрыхляют мембрану, при повышении их концентрации образуют смешанные мицеллы, а затем и детергент-белковые комплексы (рис.1). В ряде случаев при замене липидного окружения на детергентное белок сохраняет хотя бы некоторые свои функции.
Рис.1. Разборка и сборка мембраны с помощью детергентов.
По способности к мезоморфизму детергенты делят на две группы. К группе А относятся детергенты, молекулы которых способны образовывать мицеллярные и аналогичные структуры (додецилсульфат Na, цетилтриметиламмоний бромид, тритоны, бриджи, лубролы). К приведенным детергентам группы А, обнаруживаемых в тканях животных, относятся жирные кислоты и лизофосфолипиды. К группе В относят детергенты, не способные к отчетливому мезоморфизму (холат Na, дезоксихолат Na, дигитонин, сапонин).
Одной из важных характеристик детергента является критическая концентрация мицеллообразования (ККМ), поскольку способ действия детергента на мембарну зависит от того, превышает используемая концентрация детергента эту величину или достигает ее. В первом случае детергент полностью солюбилизирует мембранные структуры и включает компоненты мембраны в собственные мицеллы, во втором - модифицирует мембрану, не разрушая полностью бислоя. Величины критических концентраций мицеллообразования для некоторых детергентов при комнатной температуре представлены в табл. 2. При использовании фактических данных, однако, следует учитывать зависимость этой величины от температуры.
Гемолиз, виды и стадии гемолиза
Гемолиз - это разрушение эритроцитов, сопровождающееся выходом из них гемоглобина и обусловленное действием различных агентов. Гемолитические факторы оказывают повреждающее действие на липидный компонент мембран эритроцитов. Они способствуют окислению эритроцитов по свободнорадикальному механизму. В результате увеличивается проницаемость мембран эритроцитов, что сопровождается перекисным гемолизом.
Исходя из того, какими факторами вызван гемолиз, различают следующие его виды.
Термогемолиз - это гемолиз эритроцитов, вызван повышением температуры. Существует несколько мнений относительно механизма этого явления. Во-первых, при повышении температуры от 42°С денатурирует большинство структурных белков мембраны эритроцитов. Как результат - образование "дырок" в оболочке клеток, достаточных для беспрепятственного выхода гемоглобина. Также существует мнение, что термогемолиз в эритроцитах происходит вследствие так называемого "плавления" мембранных липидов. Осмотический гемолиз происходит при помещении эритроцитов в гипотонический раствор. Так как концентрация веществ внутри клетки выше, чем в растворе, то вода по градиенту концентрации легко проникает в клетку, эритроцит при этом набухает, увеличивается в размерах, округляется, мембрана растягивается, поры и Na, K - ворота увеличиваются до размеров, достаточных для выхода макромолекул гемоглобина в раствор. Это продолжается до установления равновесия концентраций внутри и снаружи клеток.
Кислотный гемолиз - гемолиз, вызванный действием кислот. При действии кислоты происходит денатурация мембранных белков, то есть нарушение слабых стабилизирующих связей внутри молекул. Далее происходит нарушение белок - липидных взаимодействий и повышение проницаемости мембраны.
Криогемолиз - гемолиз при замораживании суспензии эритроцитов. Содержащаяся в полости клеток вода при замораживании приобретает определенную структуру и увеличивается в объеме. Образовавшиеся кристаллики льда своими острыми краями повреждают мембрану эритроцитов, что способствует выходу гемоглобина. Здесь имеет место механическое повреждение мембраны эритроцитов, а также влияние концентрированных растворов солей, образующихся по мере вымерзания воды.
Одним из широко распространенных способов исследования структурной устойчивости эритроцитов является изучение показателей кислотного и осмотического гемолиза этих клеток. Обычно используют такие расчетные данные, как усредненное время гемолиза и эритрограммы. При этом в проведенных исследованиях уделяется мало внимания латентному периоду повреждения эритроцитов, то есть изменениям, которые претерпевают клетки до состояния выраженного повреждения. Исследование кислотного гемолиза эритроцитов показало, что в первые же секунды контакта эритромассы с кислой внеклеточной средой белки эритроцитов конформационно изменяются. По-видимому, первоначальным объектом действия кислой среды становятся интегральные белки мембраны и примембранных структур эритроцитов, так как резкое изменение спектров поглощения гемоглобина - основного цитоплазматического белка - происходит в конце второго - начале третьего периода. Появление полосы с максимумом поглощения около 378 нм, характерной для кислотного денатурированного гемоглобина, происходит в начале - середине третьего периода.
Процесс гемолиза - процесс многоступенчатый, в котором выделяется ряд стадий. Вначале происходит увеличение оптической плотности, соответствующее набуханию (сферуляции) эритроцитов, потом лаг-фаза, в течение которой увеличивается осмотическое давление в эритроцитах при практически постоянном объеме, и, наконец, разрушение мембран и выход из клетки гемоглобина.
Из полученных экспериментальных данных следует, что первый - второй периоды кислотного гемолиза сопровождаются изменением состояния белков эритроцитов. В конце второго - начале третьего периодов происходит выход из клеток и денатурация гемоглобина, дальнейшее повреждение других белков. Исходная морфологическая и функциональная гетерогенность эритроцитов приводит к тому, что эритрограммы, рассчитываемые на этом этапе гемолиза клеток, имеют зачастую сложный характер. Таким образом, если длительность первого - второго периодов связана с латентным повреждением белков эритроцитов и нарушением, вероятно, межбелковых контактов и белок-липидных взаимодействий, то третий период - это период глубокого разрушения мембранной целостности кровяных клеток с дальнейшим нарушением белок-липидных, липид-липидных взаимодействий на больших участках мембраны.
При воздействии различных факторов на эритроциты возможны изменения первого - второго этапов вследствие разной экспонированности белков внешней среде, отличий в скорости поступления НСl в клетки крови, в устойчивости самих белков к действию кислой среды и т.д. Математическое описание кинетики гемолиза эритроцитов детергентами
Несмотря на неоднократные попытки выяснения общих закономерностей литического действия детергентов на эритроциты, количественная теория гемолиза детергентами к настоящему времени не разработана. Остается невыясненным механизм образования пор, через которые клетка теряет свое содержимое; информация о молекулярной организации и динамике пор отсутствует.
Ряд авторов рассматривают вызываемый детергентами выход гемоглобина в среду как следствие возрастания ионной проницаемости мембраны с последующим осмотическим гемолизом (коллоидно-осмотический механизм). Однако имеются данные о том, что выход гемоглобина из эритроцитов происходит в результате формирования сразу крупных пор, а вклад осмотической компоненты в гемолиз невелик. Аналогичный вывод сделан о гемолизе фосфолипазой А, литическое действие которой связано с образованием в мембране лизофосфолипидов, обладающих свойствами детергентов. Образование больших пор без промежуточного возрастания проницаемости для мелких молекул прямо продемонстрировано для лизиса детергентами фибробластов легких человека.
Кинетика гемолиза детергентами была исследована Бонсэллом и Хантом. Ими выведено уравнение гемолиза:
(1)
Где С- концентрация нелизированных клеток к моменту времени t, С0- исходная концентрация клеток, f - равновесная концентрация свободного детергента в среде; n- число молекул детергента, одновременно связывающихся с мембраной; K- константа. Уравнение (1) дает экспоненциальную кинетику лизиса и не описывает реальные сигмоидные кривые гемолиза детергентами. Для объяснения сигмоидности Бонсэлл и Хант постулировали существование диффузионного барьера, лимитирующего связывание детергента с мембраной. Кинетическая модель гемолиза, описываемая ниже, строится на следующих предположениях:
1. Сродство детергента к мембране остается практически постоянным в процессе связывания. Данное предположение подкрепляется тем фактом, что природные мембраны способны включать до 1,5-2 молей детергента на 1 моль фосфолипида, сохраняя при этом бислойную структуру. Увеличение же проницаемости для крупных молекул (образование пор) наблюдается при солярном соотношении детергент : фосфолипид  0.1., т.е. поры образуются при внутримембранной концентрации детергента, далекой от насыщения.
2. Параметры связывания детергента с мембраной эритроцита не меняются при гемолизе, т.е. целые и лизированные эритроциты одинаково связывают детергент.
3. Популяция эритроцитов гомогенна в отношении взаимодействия с детергентом.
Перечисленные предположения укрощают реальную картину взаимодействия детергента с эритроцитами, позволяя построить реальную картину взаимодействия и определить наиболее существенные его характеристики из экспериментальных данных. Более полная модель, учитывающая вторичные эффекты (изменение параметров взаимодействия в ходе связывания и гемолиза, гетерогенность эритроцитов), была бы чересчур сложна и вследствие этого практически неприменима. В случаях, когда вторичные эффекты играют заметную роль, их можно оценить качественно, анализируя отклонения экспериментальных данных от простой модели.
Исходя из вышеперечисленных предположений, установление сорбционного равновесия в системе эритроциты-детергент описывается следующим дифференциальным уравнением:
(2)
где b - количество детергента, сорбированного одним эритроцитом; f- концентрация свободного детергента в среде; s- общая объемная концентрация детергента в суспензии; C0 - исходная концентрация эритроцитов; k1,k-1- константы скоростей соответственно сорбции и десорбции. Проинтегрировав (2), получим выражение для кинетики связывания:
(3)
Где - коэффициент распределения детергента между клеточной мембраной и водной средой; -характеристическое время установления сорбционного равновесия.
В отличие от модели Бонсэла и Ханта формирование в плазматической мембране поры, в состав которой входит m молекул детергента, рассматривается как внутримембранная реакция, скорость которой пропорциональна , где n- кажущийся порядок реакции по концентрации детергента в мембране (n<m), а величина b пропорциональна этой концентрации. В свою очередь скорость лизиса пропорциональна скорости образования пор в мембранах еще не лизированных клеток
(5)
Где k2 - кажущаяся константа скорости лизиса. Подставив (3) в (5) и проинтегрировав, получим
(6)
Где u - переменная интегрирования. При t<< ( начальная скорость связывания) формула (6) упрощается:
(7)
Для установившегося сорбционного равновесия t>> можно показать:
(8)
(9)
Величина tl задает длительность лаг-фазы на кинетической кривой. При t>>tl получим уравнение, аналогичное (1).
В ходе лизиса (с ростом t) происходит переход от кинетики (7) к кинетике (9). Анализ (6) показывает, что при достаточно высокой концентрации детергента и (или)низкой концентрации эритроцитов регистрируемая стадия гемолиза пройдет за время t<< по кинетике (7). При уменьшении величины гемолиз будет завершаться на стадии приближения к сорбционному равновесию, либо при установившемся равновесии. В последнем случае, согласно (9), конечный участок кинетической кривой опишется экспонентой.
Зависимость степени гемолиза от концентрации детергента
Вид зависимости от s при постоянных t и C0 следует из (6)
Параметр  имеет простой физический смысл - это концентрация детергента, при которой число целых клеток за выбранное время t уменьшается в е раз ;
- соответствует количество связанного детергента в расчете на один эритроцит. При t<<, согласно (8), получим
Ход работы
В суспензии эритроцитов, полученной для работы, определяют количество клеток с помощью камеры Горяева.
Устройство и работа камеры Горяева. Камера состоит из толстого предметного стекла с нанесенными на них поперечными прорезями, образующими три поперечно расположенные плоские площадки. Средняя площадка продольной прорезью разделена на две, каждая из которых имеет выгравированную на ней сетку. По обе стороны средней площадки в камере Горяева расположены две других на 0,1 мм (в камере Фукс-Розенталя на 0,2 мм) выше средней. Плоскости этих площадок служат для притирания покровного стекла до появления так называемых Ньютоновских колец. После притирания покровного стекла создается камера, закрытая с двух боковых сторон, а с двух других остаются щели (капиллярные пространства), через которые и заполняют камеру.
Принцип сеток один и тот же. Они разделены на то или иное число квадратов, различным образом сгруппированных. Постоянной величиной во всех сетках является так называемый "малый квадрат", сторона которого равна 1/20 мм, следовательно, его площадь равна 1/400 мм2.
Сетка Горяева содержит 225 больших квадратов (15 рядов по 15 больших квадратов в каждом), разграфленных вертикально, горизонтально, крест на крест и неразграфленных.
При работе с камерами их рабочие поверхности должны быть чистыми и сухими. Во время подсчета форменных элементов недопустимо наличие пузырей воздуха на сетке камеры, так как это мешает точности подсчета.
Счёт проводят в 5-ти больших квадратах камеры, расположенных по диагонали. Расчет количества эритроцитов в 1 мкл клеточной суспензии производят по следующей формуле , где
80 - число сосчитанных квадратов, 1/4000 мкл - объём одного малого квадрата, Х - число эритроцитов в 1 мкл суспензии; а - число сосчитанных эритроцитов. Приготовление растворов детергента. В работе использованы коммерческие препараты детергентов фирмы "MERСK"
ДетергентККМ, мМИсходная концентрация раствора, мМольМолекулярная маса, гSDS (додецилсульфат Na)1,40,484288,38CTAB(цетилтриметиламмоний Br)1,00,2364,46CPC (цетилпиридиний Cl)0,550,2 Приготовить по 5 мл растворов детергентов следующих концентраций, путем разбавления исходных растворов физиологическим раствором.
SDS - 0,25; 0,225; 0,2; 0,18 мМоль/л
CTAB - ( уточнить у преподавателя)
CPC -( уточнить у преподавателя)
Заполнить таблицу приготовления растворов и показать ее преподавателю:
С детергента, мМольV детергентаV физ. р-раV общ Регистрация кинетики гемолиза
Изучение динамики гемолиза проводят на длине волны 650 нм (длина волны, при которой оптическая плотность образцов зависит от светорассеяния эритромассы). В кювету наливают 2 мл суспензии эритроцитов и помещают ее в кюветодержатель фотоэлектроколориметра. Устанавливают "0" по кювете сравнения, переводят движок в режим измерения и выставляют автоматический режим подачи показаний.
После этого кювету помещали в кюветодержатель прибора. С момента введения во взвесь эритроцитов 2 мл раствора детергента, регистрируют величину светопропускания исследуемого раствора каждые 5 сек. Изменение светопропускания исследуемого раствора связано с разрушением клеток крови. Измерение светопоглощения проводят до завершения гемолиза.
Так как с момента начала добавления детергента до начала регистрации оптической плотности раствора часть клеток уже может быть разрушена, то необходимо измерить поглощение, соответствующее исходной концентрации клеток (A0). Для этого к 2мл суспензии клеток добавляют 2 мл физиологического раствора и измеряют поглощение. Так как концентрация клеток в 1 мл суспензии известна, то рассчитывают количество клеток (C0), подвергающееся гемолизу.
Анализ полученных данных
1. Построение эритрограмм Далее в столбце С рассчитываем количество клеток (%), распавшихся в единицу времени. Моменту времени 0 соответствует % распавшихся клеток в момент добавления детергента.
Далее рассчитывается % распавшихся клеток за каждые 5 сек по формуле: Зависимость % распавшихся клеток (данные столбца С) от времени и представляет собой эритрограмму.
2. Построение кривой гемолиза
Кривая гемолиза представляет собой кумулятивную зависимость % распавшихся клеток от времени. Этапы расчета кумулятивной зависимости показаны на рис. Последнее значение этой зависимости должно равняться 100%, или приближаться к этому значению.
3. Расчет параметров связывания детергента с мембраной эритроцита
Как следует из уравнения (9) на экспоненциальном участке величина спада логарифма светорассеяния суспензии за время t определяется концентрацией как эритроцитов, так и детергента:
Построить зависимости lnA от lns для нескольких t для двух экспоненциальных участков кинетической кривой гемолиза. Определить параметры n и . Построить зависимость  от соотношения концентраций клетки/детергент. Проанализировать изменения значений параметра n на разных участках кинетической кривой гемолиза.
4. Составить отчет и сдать его преподавателю.
Лабораторная работа 2. Расчет термодинамических параметров фазового перехода липидного бислоя на основании данных дифференциальной сканирующей микрокалориметрии
Теоретическая часть работы
Для изучения фазовых переходов при нагревании используют метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии (сокращенно - ДСК). Не останавливаясь на конструкции прибора, отметим только, что в конечном счете с его помощью записывается кривая теплоемкости, т.е. зависимость теплоемкости липидов или мембран в суспензии от температуры: (1)
Метод называется дифференциальным, потому что измеряется только теплоемкость суспендированного материала на фоне гораздо большей теплоемкости раствора сравнения. На рисунке 1 подробно обозначены параметры кривой ДСК. На первом этапе нас будут интересовать три из них: 1. Температура фазового перехода ("плавления") Tc. 2. Температурный интервал ("ширина") фазового перехода. 3. Общее количество тепла Q, поглощенного при плавлении. Оно представляет собой площадь под кривой ДСК, т.е. функции C=f(T)
Рис.1. Характеристика фазовых переходов в липидах по данным дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. С-теплоемкость, T - полуширина фазового перехода, Tc - температура плавления. 1. Кривые плавления
Кривой плавления называется зависимость доли жидкой фазы в общем количестве изучаемого вещества, в данном случае - липидов мембран. Рис.2. Кривая плавления липидов в липосомах, приготовленных из ДПЛ (1,2-дипальмитоилфосфатидилхолин). - доля жидкой фазы, T - температура, Tc - температура плавления (= 0,5), ml - количество липида в жидкой фазе, ms -количество липида в твердой фазе. Обозначим количество липидов в жидкой фазе через ml, а количество липидов в твердой фазе через ms. Тогда доля жидких липидов будет равна: (2)
2. Методы измерения (построения) кривых плавления
Для определения доли жидкой фазы в общем объеме изучаемого материала, в нашем случае, - в липидной слое мембран, можно использовать разные методы.
Анализ кривых ДСК
Один из методов измерения кривых плавления основан на анализе кривых, полученных методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Обратимся снова к рисунку 1. Пусть удельная теплота плавления липида равна Qm, а количество липидов в образце составляет m кмолей. Общее количество энергии, поглощенной образцом в интервале температур плавления T1-T2 равно очевидно площади под кривой C=f(T), т.е. (3)
В интервале температур от T1 до текущей температуры T расплавится количество молей липида mд , и при этом поглотится количество тепла, равное: (4)
(заштрихованная площадь на рис.1). При температуре T молярная доля липидов, находящихся в жидкой фазе равна: (5)
Таким образом, измеряя по отношению площадей под кривой C=f(T) при разных температурах, мы строим кривую плавления =f(T).
Задание к лабораторной работе
В таблице 1 приведены данные дифференциальной сканирующей микрокалориметрии для липосом, полученных из 0,01моля 1,2-дипальмитоилфосфатидтлхолина.
TC
C , Дж/мольград TC C, Дж/мольград TC C , Дж/мольград 1 0,1925 16 2,31 31 2,1 2 0,196 17 2,52 32 1,82 3 0,21 18 2,73 33 1,575 4 0,2625 19 2,87 34 1,33 5 0,294 20 3,01 35 1,12 6 0,3395 21 3,115 36 0,91 7 0,455 22 3,22 37 0,7 8 0,56 23 3,255 38 0,56 9 0,7 24 3,22 39 0,455 10 0,91 25 3,115 40 0,3395 11 1,12 26 3,01 41 0,294 12 1,33 27 2,87 42 0,2625 13 1,575 28 2,73 43 0,21 14 1,82 29 2,52 44 0,196 15 2,1 30 2,31 45 0,19251. Построить зависимость теплоемкости липидного бислоя от температуры (зависимость рис.1).
2. Используя зависимость 1 определить температуру фазового перехода, температурный интервал фазового перехода и общее количество тепла, поглощенного при плавлении. Q рассчитать по формуле численного интегрирования (формуле Симпсона):
Q = f(x)dx= h/3[f(a) + 4f(a+h) + 2f(a+2h) + 4f(a+3h) + ... + 4f(b-h) + f(b)]
где h -температурный интервал измерения теплоемкости, в нашем случае h = 1С.
3. Используя формулу Симпсона найти количество жидкой фазы при нескольких значений температур (оно пропорционально количеству теплоты, выделившемуся при нагревании до определенного значения температуры -q).
4. Построить кривую плавления, используя материал п.1 теоретической части.
5. Построить зависимость (брать температуру по абсолютной величине).
6. Найти термодинамические параметры фазового перехода (см. лекцию). Рассчитать H и S. 7. Рассчитать размер кооперативной единицы
Лабораторная работа 3. Определение отрицательных зарядов на поверхности эритроцитов. Изучение изменения количества отрицательных зарядов эритроцитов мышей в зависимости от возраста и влияния внешних воздействий
Цель работы. Определение отрицательных зарядов на поверхности эритроцитов адсорбционным методом.
Теоретическая часть. Адсорбционный метод может быть использован для определения числа отрицательных зарядов на клеточной поверхности эритроцитов в норме и при патологическом состоянии, например при сахарном диабете. Для этого отмытую эритроцитарную массу смешивают с раствором катонного красителя в концентрации 4,3-27 г/м3 при соотношении объемов 1:9 и инкубируют в течение 2-3 ч при 18-22С, отделяют эритроциты от раствора, который фотометрируют. По значению адсорбции красителя проводят расчет числа зарядов на клеточной поверхности эритроцитов, исходя из формулы
, где N -число отрицательных зарядов на один эритроцит; NA - постоянная Авогадро; Amax- предельная адсорбция красителя, моль/м3; n - число эритроцитов в единице объема.
Способ основан на том, что отрицательный заряд клеточной поверхности эритроцитов полностью нейтрализуется положительным зарядом ' катионного красителя при его предельной адсорбции. С ростом концентрации красителя в растворе его адсорбция асимптотически приближается к предельной. При низких концентрациях красителя поверхность эритроцитов далека от насыщения. Этим обусловлен выбор нижнего предела концентрации используемого красителя в растворе. Адсорбционное равновесие достигается за 2-3 ч при 18-22С.
Ход работы. Эритроциты, выделенные из крови трижды отмывают изотоническим раствором (0,145 М) хлорида натрия, при рН = 7,2. Для отмывки на 1 мл эритроцитарной массы берут 5 мл раствора хлорида натрия. После центрифугирования 1 мл эритроцитарной массы добавляют к 9 мл красителя с концентрацией 16 г/м3 в изотоническом растворе при указанном выше рН, встряхивают и выдерживают полученную суспензию 3 ч при 18 С. Отделяют эритроциты от раствора центрифугированием. После адсорбции раствор фотометрируют при 590 нм. Измерения проводят но фотоэлектрокалориметре КФК-2МП. Определяют остаточную концентрацию красителя используя калибровочный график и затем связанную концентрацию красителя.
Число отрицательных зарядов, оцениваемое как равное числу зарядов, оцениваемое как равное числу зарядов красителя (относительный заряд одной молекул красителя равен +1) рассчитывают по формуле:
Например, в результате эксперимента, были получены следующие данные:
- изменение равновесной концентрации в результате поглощения красителя, г/м3 (15 г/м3); М- молекулярная масса красителя-319, 859 г/моль; W- объем клеток, м3; V-- объем изотонического раствора красителя, м3.
м-3
Построение калибровочного графика:
Приготовить серию растворов красителя, путем разбавления исходного раствора, концентрации 16г/м3. Общий объем каждого калибровочного должен составлять 4 мл. Замерить оптическую плотность каждого раствора. Данные оформить в виде таблицы:
V крас., млV физ. р-ра, млС р-ра красителяD4-163,50,51431122,51,5231,52,513 Постройте зависимость D -C. Найдите уравнение прямой. Используйте это уравнения для определения остаточной концентрации кравителя.
Задание к лабораторной работе:
1. Получить разомкнутые тени эритроцитов, выделенные из крови донора среднего возраста. Определить количество отрицательных зарядов на поверхности мембраны.
2. Получить разомкнутые тени эритроцитов, выделенные из крови донора молодого возраста. Определить количество отрицательных зарядов на поверхности мембраны.
3. Получить разомкнутые тени эритроцитов, выделенные из крови старых мышей. Определить количество отрицательных зарядов на поверхности мембраны.
4. Получить разомкнутые тени эритроцитов, выделенные из крови молодых мышей. Определить количество отрицательных зарядов на поверхности мембраны.
5. Изменить поверхностный заряд мембраны эритроцитов, путем смывания периферических белков (инкубирование в 1 М растворе KCl, pH 9 при 37С в течение 1 часа). Определить количество отрицательных зарядов на поверхности мембраны.
6. Изменить поверхностный заряд мембраны эритроцитов, путем обработки ее трипсином (фермент, ращепляющий гликозидные связи). 7. Оформить лабораторную работу. 8. Обсудить на семинарском занятии полученные результаты.
Задачи для решения
1. Строение и свойства биологических мембран
1. Регуляция поступления питательных веществ в клетку - основная функция плазматической мембраны. Эта функция особенно отчетливо проявляется у эпителиальных клеток, выстилающих кишечник, поскольку через них проходит весь поток питательных веществ, поступающих в организм. В соответствии с этим и плазматическая мембрана устроена так, что на той стороне клеток которая обращена в полость кишечника, она уложена в вид многочисленных пальцевидных выростов, называемых микровор синками. За счет этого поверхность эпителиальных клеток многократно возрастает, что способствует более эффективному поглощению питательных веществ. Представив каждую микроворсинку в виде цилиндра диаметром 0,1 мкм и высотой 1 мкм и считая, что лишь половина поверхности плазматической мембраны покрыто микроворсинками, попытайтесь оценить, во сколько раз увеличивается поверхность клетки (обращенная в полость кишечника) за счет дополнительной поверхности микроворсинок по сравнению с поверхностью клетки, покрытой плоской плазматической мембраной.
2. В яде змеи присутствуют протеаза (разрывающая пептидные связи в белках), нейраминидаза (отщепляющая остатки сиаловой кислоты от ганглиозидов) и фосфолипаза (расщепляющая фосфолипиды). В результате обработки изолированных эритроцитов этими очищенными ферментами были получены данные, свидетельствующие о том, что только фофлипаза вызывает гемолиз эритроцитов.
Анализ продуктов гемолиза, вызываемого фосфолипазой, показал необычно высокое содержание в них свободного фосфорилхолина (холина, соединенного с остатком фосфорной кислоты) и диацилглицерола (глицерола, соединенного с двумя цепями жирных кислот).
2.1. Что служит субстратом для фосфолипазы, в каком участке молекулы субстрат расщепляется?
2.2. На основании ваших знаний о структуре плазматической мембраны объясните, почему фосфолипаза вызывает лизис эритроцитов, а протеаза и нейраминидаза-нет.
3. Предположим, что вас интересует распределение различных фосфолипидов в плазматической мембране эритроцитов человека. Прежде всего, на долю фосфолипидов в бислое эритроцитов приходится 60% массы всех липидов, тогда как доля холестерола составляет 30%, а гликолипидов - 10%. Фосфолипиды включают: фосфатидилхолин (28%), фосфатидилэтаноламин (27%), сфингомиелин (26%), фосфатидилсерин (13%) и некоторые другие, минорные, фосфолипиды (несколько процентов). Чтобы выявить распределение этих фосфолипидов, зрелые эритроциты и их тени обрабатывают: 1) двумя различными фосфолипазами и 2) не проникающим через мембрану флуорохромом (SITS), который, связываясь химически с первичными аминогруппами, специфически метит их.
Под действием сфингомиелиназы разрушается до 85% сфингомиелина в случае эритроцитов (лизиса клеток при этом не происходит) и немного больше в случае теней эритроцитов. После обработки интактных эритроцитов смесью фосфолипаз из яда морских змеи в среду выходят продукты расщепления фосфатидилхолина (лизиса клеток не происходит), а при обработке теней эритроцитов эти же фосфолипазы вызывают, кроме того, разрушение фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина. Реагент SITS метит почти полностью фосфагидилэтаноламин и фосфатидилсерин в тенях эритроцитов и лишь около 1 % этих соединений в целых клетках.
А. Результаты этих опытов представлены в табл. 3.1. Они позволяют судить о распределении четырех основных фосфолипидов в мембранах эритроцитов. Какие фосфолипиды сосредоточены в обоих монослоях этих мембран и есть ли такие? Б. Почему в этих опытах использовали эритроциты?
Таблица 3.1. Чувствительность фосфолипидов в составе эритроцитов человека и в составе теней этих клеток к фосфолипазам и е метке SITS, не проникающей через мембрану.
ФосфолипидСфингомиелиназаЯд морских змейФлуоресценция SIТSЭритроцитыТени ЭритроцитыТениЭритроцитыТениФосфатидилхолин--++--Фосфатидилдиэтаноламин---+-+Сфингомиелин++----Фосфатидилсерин---+-+ 4. За поведением липидов в двух монослоях мембраны можно проследить, введя в отдельные молекулы в качестве метки нитроксильную группу, являющуюся стабильным органическим свободным радикалом (рис. 4.1). Такие спин-меченые липиды можно изучать методом электронного парамагнитного спинового резонанса (ЭПР) непосредственно в живых клетках. Перед тем как ввести спин-меченые липиды в мембраны клеток, смесь меченых и немеченых фосфолипидов обрабатывают ультразвуком с целью получения маленьких липидных везикул. При добавлении последних к суспензии целых клеток в определенных условиях везикулы сливаются с клетками, перенося меченые лиганды в их плазматическую мембрану. Меченые фосфолипиды вводили в мембраны зритроцитов описанным выше методом. Для того чтобы выяснить, одинаково ли встраиваются меченые фосфолипиды в два монослоя бислойной мембраны, в среду добавляли аскорбиновую кислоту (витамин С). Будучи восстановителем, растворимым в воде, этот реагент не проникает сквозь мембрану и разрушает все нитроксильные радикалы на внешней поверхности клетки. На рис. 4.2 представлена зависимость сигнала ЭПР от продолжительности инкубации клеток с двумя различными метками в присутствии витамина С и без него.
Нитроксильный радикал
Спин-меченный фосфолипид 1
Спин-меченный
фосфолипид 2Рис. 4.1. Схематическое изображение двух одинаковых липидов, меченных нитроксильным радикалом в различных положениях. A. Не учитывая пока различий в степени уменьшения сигнала ЭПР, попытайтесь объяснить, почему фосфолипид 1 (рис. 4.2, А) взаимодействует с аскорбиновой кислотой быстрее, чем фосфолипид 2 (рис. 4.2, Б). Заметьте, что область плато в случае фосфолипида 1 достигается за 15 мин, а в случае фосфолипида 2 -гораздо медленнее, за 1 ч.
Б. Для выяснения причин того, почему эти фосфолипиды различаются по скорости и величине уменьшения сигнала ЭПР, были проведены аналогичные опыты с тенями эритроцитов, обработанными так, что они были непроницаемы для аскорбата (из-за замыкания мембраны). В этих опытах в отсутствие аскорбата не наблюдалось снижении величины сигнала ЭПР для обоих фосфолипидов, а при добавлении аскорбата сигнал устанавливался на уровне 50%. Попробуйте объяснить, чем обусловлены различия в изменениях сигнала ЭПР в опытах с тенями эритроцитов и с целыми эритроцитами.
Рис. 4.2. Уменьшение интенсивности сигнала ЭПР в зависимости от длительности инкубации эритроцитов с меченым фосфолипидом 1 (А) и фосфолипидом 2 (Б) в присутствии аскорбата и без него.
B. Одинаково ли встраивались спин-меченые фосфолипиды 1 и 2 в оба монослоя мембраны эритроцитов?
5. Асимметрическое распределение фосфолипидов по двум слоям плазматической мембраны указывает на то, что спонтанный перескок липида с одной стороны мембраны на другую - редкое событие, хотя, возможно, любой спонтанный перескок быстро компенсируется соответствующими переносчиками фосфолипидов возвращающими их на прежнее место в монослое. Для того, чтобы определить, какая из этих двух возможностей реализуется, была измерена скорость перескока фосфолипидов в плазматической мембране интактных эритроцитов.
Рис.5.1 Уменьшение величины сигнала ЭПР от эритроцитов, содержащих спин-меченные фосфолипиды в наружном и внутреннем монослоях мембраны В одном из экспериментов использовали те же два фосфолипида со спин-метками (задача 4). С целью измерения скорости транслокации от внутреннего монослоя к наружному эритроциты со спин-мечеными фолипидами, сосредоточенными только во внутреннем монослое плазматической мембраны, инкубировали в течение различных периодов времени в присутствии аскорбата и следили за изменением интенсивности сигнала ЭПР. Для измерения скорости перескока фосфолипидов от наружного монослоя к внутреннему определяли снижение сигнала ЭПР при инкубации эритроцитов в той же среде, но без аскорбата. Результаты этих опытов представлены на рис. 5.1.
1. По результатам, представленным на рис. 5.1, рассчитайте скорость транслокации от внутреннего монослоя к наружному и от наружного к внутреннему. Удобно выражать такие величины как полупериод транслокации, т. е. время, за которое половина фосфолипидов перескакивает из одного монослоя в другой.
2. Из того что вы знаете относительно поведения двух спин-меченых фосфолипидов в задаче 4, попробуйте решить, какой из них был использован для мечения внутреннего монослоя плазматической мембраны целых эритроцитов, а какой - для мечения наружного монослоя.
3. Предложите способ получения эритроцитов, содержащих спин-меченые фосфолипиды только во внутреннем или только в наружном монослое плазматической мембраны.
6. Белки, пронизывающие мембрану, обладают характерной структурой в области бислоя. Какая из трех приведенных последовательностей, состоящих из 20 аминокислот, более всего подходит на роль такого трансмембранного сегмента и подходит ли какая-то из них вообще? Объясните причины вашего выбора.
1. ITLIYFGVMAGVIGTILLIS
2. ITPIYFGPMAGVIGTPLLIS
3. ITEIYFGRMAGVIGTDLLIS
Рис.7.1. Анализ белков, входящих в состав теней эритроцитов. 7. Для определения того, с какой стороной плазматической мембраны связаны основные мембранные белки - спектрин, белок полосы 3 и гликофорин, первоначально применяли ферментативный гидролиз теней эритроцитов. В этих опытах использовали сиалидазу, которая отщепляет остатки сиаловой кислоты от белка, и проназу для расщепления пептидных связей. Белки из нормальных теней и из теней, обработанных ферментом, разделяли с помощью электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле, а затем окрашивали на белки либо на углеводы (рис.7.1).
A. Каким образом информация, содержащаяся в рис. 7.1, позволяет решить, на какой стороне клеточной мембраны находится углеводная часть гликофорина: на внутренней, цитоплазматической или на наружной, и какие из белков эритроцитов экспонированы на наружной поверхности последних?
B. Как следовало бы модифицировать методику с использованием ферментов для выявления тех белков эритроцитов, которые пронизывают плазматическую мембрану?
8. Расчеты количества белков, связанных с мембраной, на клетку и доли поверхности плазматической мембраны, занятой этими белками, важны для понимания структуры плазматической мембраны. Для белков плазматической мембраны эритроцитов это вычислить наиболее просто, поскольку эритроциты легко выделить из крови и в них не содержится внутренних мембран, которые могли бы служить помехой при расчетах. С этой целью выделяют плазматические мембраны, после чего белки, связанные с мембранами, разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН, а затем окрашивают красителем Кумасси синим. Поскольку интенсивность окраски в первом приближении пропорциональна количеству белка в полосе, то можно количественно определить белки (табл.8.1)
1. По данным табл. 8.1 рассчитайте число молекул спектрина, белка полосы 3 и гликофорина на одну клетку. Исходите из того, что в 1 мл суспензии теней эритроцитов содержится 1010 клеток и 5 мг белка мембран.
2. Рассчитайте долю поверхности плазматических мембран, занятую белком полосы 3. Считайте, что молекула этого белка представляет собой цилиндр с радиусом 3 нм и высотой 10 нм, ориентированный перпендикулярно поверхности мембраны. Общая поверхность эритроцита-108 нм2.
Табл. 8.1. Доля красителя, связанного с тремя белками.
БелокМолекулярная массаПроцент красителяСпектрин250 00025Белок полосы 3100 00030Гликофорин30 0002,3 9. Рассчитайте молярное соотношение между липидом и белком в мембране, содержащей 40% липида и 60% белка по весу. Считайте, что средний молекулярный вес липидов равен 800, а средний молекулярный вес белка - 50 000. Какие функции должны быть характерны для данной мембраны.
10. Данные, полученные методом магнитного резонанса, показывают, что коэффициент диффузии фосфолипидов в биомолекулярной фосфолипидной мембране составляет около 10-8 см2/с. Рассчитайте время, необходимое для перемещения молекулы фосфолипида с одного конца клетки на другой (длина клетки может быть принята равной 210-4 см).
11. Исследования эритроцитов методом замораживания травления выявили глобулярные частицы, которые, как полагают, находятся внутри бислоя. Средний диаметр этих частиц 9 нм и их количество примерно 2,7∙10-3 частиц на 1 мкм2. Средняя площадь поверхности человеческого эритроцита 145 мкм2. Установите, имеется ли достаточно места в бислое для того, чтобы частицы могли расположиться между молекулами липида.
12. В животных клетках большинство мембран содержит около 60 % белка и 40% фосфоглицеридов.
а) Вычислите среднюю плотность мембраны, считая плотность белка равной 1,2 г/см3 и плотность фосфоглицерида -0,92 г/см3.
б) Будет ли образец такого мембранного материала всплывать или осаждаться при центрифугировании в растворе NaCl с удельной массой 1,05 г/см3.
13. При рН=7,0 был проведен электрофорез смеси липидов, содержащей а) кардиолипин, б) фосфатидилглицерин, в) фосфатидилэтаноламин, г) фосфатидилсерин. Укажите, какие из этих соединений должны двигаться к аноду, какие к катоду и какие оставаться на старте.
14. Сколько молекул фосфолипидов содержится в 1 мкм2 фосфолипидной двухслойной мембраны? Предположим что одна молекула фосфолипида занимает площадь 0.7 нм2 15. Некоторые клетки, функция которых состоит в поглощении питательных веществ из окружающей среды (например, клетки, выстилающие просвет тонких кишок), приспособлены к этой роли благодаря тому, что площадь их поверхности, соприкасающаяся с питательными веществами, увеличена за счет микроворсинок. Предположим, что эпителиальная клетка, расположенная в просвете тонкой кишки, имеет форму сферы диаметром 20 мкм. Поскольку лишь часть клетки обращена в просвет кишки, будем считать, что микроворсинки имеют форму цилиндров высотой 1 мкм и диаметром 0.1 мкм и располагаются в виде решетки с расстоянием 0.2 мкм между центрами двух соседних микроворсинок. Исходя из этих данных, рассчитайте: а) число микроворсинок на покрытом ими участке; б) площадь поверхности участка с учетом микроворсинок; в) на сколько процентов увеличивается поглощающая способность (определяемая соотношением площади поверхности клетки к ее объему) благодаря наличию микроворсинок?
16. Плазматические мембраны клетки - не статические структуры. В подвижных клетках, например культивируемых фибробластах, новые участки липидного бислоя обычно добавляются к плазматической мембране путем экзоцитоза в том конце клетки, который находится впереди по ходу движения, тогда как старые участки липидного бислоя изымаются путем эндоцитоза почти по всей клеточной поверхности. Этот процесс создает направленный поток липидов от передней границы клетки со скоростью около 1 мкм в минуту. Белки, распределение которых в мембране продолжает быть случайным, должны достаточно быстро диффундировать, чтобы противостоять такому потоку, иначе они соберутся в хвостовой части клетки. Оценки скорости диффузии белков в плазматической мембране дают величину от 10-8 до 10-10 см2/с при 37°С. Достаточны ли такие скорости диффузии для поддержания равномерного распределения белков в мембране?
Белок можно считать равномерно распределенным, если отношение его концентраций в двух достаточно удаленных друг от друга точках поверхности близко к 1; если же оно гораздо ниже 1, то молекулы белков распределены по поверхности мембраны неслучайным образом. Уравнение, связывающее скорость мембранного потока и скорость диффузии белков с их концентрациями в двух точках на поверхности клетки, записывается следующим образом:, где СА и СB - концентрации белка в точках А и В на поверхности клетки; F-скорость мембранного потока; l-расстояние между точками А и В вдоль направления этого потока и D -коэффициент диффузии мембранных белков.
1. Используя это уравнение, определите, какая из измеренных для мембранных белков скоростей диффузии (10-8, 10-9 или 10-10 см2/с) достаточна для сохранения их равномерного распределения в плазматической мембране.
2. К чему приведет снижение скорости диффузии мембранного белка, вызванное объединением молекул в большие агрегаты за счет перекрестного взаимодействия со специфичными антителами?
17. Фазовый переход мультиламеллярных липосом дипальмитоилфосфатидилхолина идет в интервале температур 41,8-43,5С. Энтальпия Вант-Гоффа (молярная энтальпия) составляет 774 кДж/моль. Рассчитайте константу равновесия фазового перехода.
18. Тс фазового перехода пальмитоила (С16) 41,8С. Н - 40,5 кДж/моль. Рассчитайте Ср, S, фазового перехода.
19. В клетках пойкилотермных ("холоднокровных") животных содержание ненасыщенных жирных кислот обычно выше, чем в клетках гомойотермных ("теплокровных") животных. Как вы это объясните.
20. Средняя площадь поверхности человеческого эритроцита равна 145 мкм2. Каждая клетка содержит 1,2610-11 мг липидного фосфата и 1,3910-10 мг холестерина. Предполагается, что весь липид находится в мембране. Исследования области, занятой липидами в монослое дали следующие результаты.
При сжатии монослоя усилием в 5 дин/см область, занятая одной молекулой холестерина, равна 0,35 нм2 и одной молекулой фосфолипида - 0,9 нм2. При сжатии усилием в 40 дин/см области соответственно равны 0,35 нм2 и 0,5 нм2. Вычислить, какую часть поверхности клетки занимает липидный монослой. Относительная молекулярная масса холестерина равна 386. Относительная атомная масса фосфора 31. Число Авагадро 6,021023.
21. Каков электрический заряд мембраны, если её емкость 1 мкФсм-1, а равновесный мембранный потенциал 70 мВ.
22. Толщину двойного слоя на границе мембрана - электролит характеризует дебаевский радиус . Определите  для случая, когда в растворе электролита, окружающим мембрану есть только ионы калия с концентрацией: 1) 10-5 М, 2) 10-2 М.
23. Найдите дебаевский радиус экранирования, создаваемого присутствующими в растворе ионами кальция с концентрацией 10-5 М и натрия с концентрацией 10-4М. Как изменяется , если в растворе будут только ионы кальция в концентрации 10-4 М?
24. Найдите дебаевский радиус экранирования, создаваемого присутствующими в растворе ионами кальция с концентрацией 10-5 М и натрия с концентрацией 10-4 М. Как измениться , если в растворе будут только ионы кальция в концентрации 10-4 М?
25. Емкость многих биологических мембран равна 1 мкФ/см2. Мембрана состоит в основном из липида с относительной диэлектрической проницаемостью 3,0. Какова эффективная толщина мембраны (0 для воды=10 пФ/м)?
26. В растворе электролита, окружающем мембрану, есть только ионы калия с концентрацией: 1) 10-5 М; 2) -10-2 М. Оцените величину диффузионного слоя у поверхности мембраны. Какой должна быть концентрация ионов К+, чтобы толщина диффузионного слоя была равна 0.
27. Величина рН вблизи клеточной поверхности 6,9, а в окружающей среде 7,3. Рассчитайте скачок потенциала на границе раздела двух фаз, считая, что ДЭС создается в результате перераспределения ионов Н+.
28. Концентрация ионов Са2+ в объеме раствора 10-5 М, а у поверхности клетки в 10 раз выше. Оцените скачок потенциала на границе раздела двух фаз.
2. Транспорт неэлектролитов
1.Бислойная липидная мембрана толщиной 10 нм разделяет камеру на две части. Поток метиленового синего через БЛМ постоянен и равен 310-4 Мсм/с, причем концентрация его с одной стороны мембраны равна 10-2 М, а с другой 210-3 М. Чему равен коэффициент диффузии этого вещества через БЛМ?
2. В клетках фагоцитов равновесная концентрация вещества устанавливается за 0,2 с. Чему равен коэффициент проницаемости этого вещества через мембрану фагоцитов, если считать клетку телом сферической формы диаметром 8 мкм?
3. Определите время, в течение которого устанавливается равновесная концентрация эритрола в клетке, если объем клетки 70 мкм3, коэффициент проницаемости 13 мкм/с, а площадь поверхности мембраны клетки 43 мкм2.
4. Найдите коэффициент проницаемости плазматической мембраны Mycoplasma для формамида, если при разнице концентраций этого вещества внутри и снаружи мембраны, равной 0,510-4 М, плотность потока его через мембрану равна 810-4 Мсм/с
5. Чему равен поток формамида через плазматическую мембрану Chara ceratophylla толщиной 8 нм, если коэффициент диффузии его составляет 1,410-8 см2с-1, концентрация формамида в начальный момент времени снаружи была 210-4 М, а внутри в десять раз меньше.
6. Используя законы классической термодинамики, получите в явном виде выражение для приращения свободной энергии при перемещении 1 моля вещества из области с концентрацией С1 в область с концентрацией С2. Считайте, что никаких других частиц в системе нет. При этом молекулы можно считать незаряженными, а температуру и давление в обеих областях - одинаковыми. Какими будут концентрации в равновесном состоянии. 7. Имеется клетка, "перекачивающая" электрически нейтральные частицы, концентрация которых снаружи и внутри клетки удовлетворяет соотношению
Чему равна минимальная работа по перекачке этого вещества? T=25°С. 8. За счет активного транспорта глюкозы в клетку устанавливается градиент концентраций равный 108. Рассчитать, сколько энергии нужно затратить для переноса 1 моля глюкозы в клетку. Достаточно ли для переноса глюкозы 1 моля АТФ.
9. Какой максимальный концентрационный градиент незаряженной молекулы, например, глюкозы, может быть достигнут за счет активного транспорта в клетку, обеспечиваемого энергией АТФ? Предположите, что для переноса одной молекулы растворенного вещества через мембрану необходим гидролиз одной молекулы АТФ. Исходите из того, что при гидролизе 1 моля АТФ изменение свободной энергии G составляет -50 кДж/моль.
10. Найдите среднюю величину смещения молекулы формамида в воде и растворе сахарозы за 1 мин, если коэффициенты диффузии этого вещества в воде и сахарозе равны соотвественно 1.610-5 и 0.310-5 см2с-1.
11. Из цилиндрической клетки водоросли длиной 8 см и радиусом 1 мм проходит сквозь плазмолемму вещество с коэффициентом проницаемости 510-6 м/с. Считая, что при этом концентрация вещества внутри клетки остается постоянной, найти сколько времени необходимо, чтобы 80% вещества поступило в окружающую среду, в котором это вещество отсутствовало. С каким коэффициентом проницаемости транспортировалось такое же количество вещества, если бы оно вытекало в течение 10 ч только через оба конца клетки.
12. Концентрация молочного сахара внутри кишечной палочки в 500 раз выше, чем во внешней среде. Сколько молей молочного сахара можно транспортировать в клетку за счёт гидролиза 1 моля АТФ?
3. Транспорт электролитов. Насосы.
1. При определении распределения ионов лития установлено, что концентрация их внутри клетки в 140 раз выше, чем снаружи (при 25С). Какова должна быть величина разности электрических потенциалов для того, чтобы установилось равновесие и сохранялось указанное асимметричное распределение ионов?
2. Рассчитайте потенциал покоя гигантского аксона кальмара, если известно, что концентрация ионов натрия снаружи равна 440 мМ, а внутри его 49 М (T=20С).
3. Потенциал покоя нерва конечности краба равен 89 мВ. Чему равна концентрация ионов калия внутри нерва, если снаружи она составляет 12 мМ (T=20С)?
4. Потенциал покоя клетки (разность внутреннего и наружного потенциалов) равен - 48 мВ. Используя данные задачи 14, установите, какие ионы при этом находятся в равновесии, а какие нет? Для последних укажите, в каком направлении движутся ионы. Какому условию должно удовлетворять результирующее движение ионов? Почему?
5. Какое из соединений имеет наименьшую проницаемость через мембрану: толуол, этанол, ионы калия, кальция? Приведите необходимые уравнения.
6. Определите равновесный мембранный потенциал митохондрий, если при 37С внутри митохондрий рН = 9, а в окружающей среде 7? 7. Вычислите с помощью приведенных здесь данных концентрацию внешнего К+, необходимую для достижения полумаксимальной скорости транспорта К+ в клетку.
IК+ мк-экв/г клеток/час С К+ вн 10-3мольдм-3 1,2 1,25 2,2 2,5 2,7 3,0 3,2 4,0 3,7 10,0 4,3 20,0 Рассчитайте подвижность К+.
8. Внутриклеточная концентрация К+ в мышце составляет 150 м-экв/л, а в плазме крови - 5 м-экв/л. Каков расход свободной энергии при транспорте 1 г-иона К+ из плазмы крови во внутриклеточную жидкость мышцы при 37С? Равновесный трансмембранный потенциал составляет - 60 мВ.
9. Рассчитайте, сколько энергии требуется для работы Na+- K+ насоса. Внутриклеточная концентрация Na+ поддерживается на уровне 10 мМ, К+- 140 мМ, при внешней концентрации Na+ 145 мМ, К+- 5мМ. Равновесный трансмембранный потенциал составляет - 60 мВ.
10. Имеется клетка, "перекачивающая" электрически нейтральные частицы, концентрация которых снаружи и внутри клетки удовлетворяет соотношению
Чему равна работа по перекачке заряженных частиц (z = +1) с данным в условии задачи отношением концентраций, если электрический потенциал клетки по отношению к окружению равен +58 мВ? Сколько потребуется при этом молей АТФ, если процесс имеет к.п.д. 100%?
11. Концентрация (в ммоль/л) вне- и внутриклеточных ионов для гигантской нервной клетки Aplysia приблизительно равны:
К+е 20 Na+e 485 Cl-e 485
К+i 280 Na+i 61 Cl-i 51
а)Определите (равновесный) потенциал Нернста для натрия, калия и хлора (i - внутри, е - снаружи);
б)Существует ли трансмембранный потенциал, при котором все ионы находятся в равновесии?
12. У одноклеточной водоросли Nitella с концентрация ионов К+ внутри клетки 500 мМ. Определить концентрацию ионов К+ в окружающем растворе, если равновесный трансмембранный потенциал составляет 178 мВ.
13. В нервном волокне кальмара концентрация ионов Na+ 101 мМ, а в морской воде 498 мМ. Сколько ионов Na+ переходит из морской воды в клетку при образовании потенциала покоя -70 мВ. Какое минимальное количество работы можно совершить для обратной перекачки этих ионов в окружающую среду? Какое минимальное количество АТФ для этого необходимо?
14. В приведенной ниже таблице содержатся примерные данные о концентрации ионов К+, Na+ и Cl- в мотонейронах кошки:
Снаружи, мМ Внутри, мМ Na+ 150 15 К+ 5.5 150 Cl- 125 9 1. Вычислите потенциал Нернста для каждого из этих ионов при 38 С, указывая соответствующий знак.
2. Зная, что измеренное значение электрического потенциала мотонейрона равно -70мВ (по отношению к внешней среде), определите, какие ионы находятся в равновесии, а какие нет.
15. Рассмотрим электролит, представляющий собой раствор соли (например, NaCl), содержащий однозарядные положительные (Na+) и однозарядные отрицательные ионы (С1-). Если две части сосуда с различными концентрациями соли разделены проницаемой мембраной, то через нее будет идти диффузионный поток в сторону меньшей концентрации соли.
А. Запишите выражение для стационарного потока J+ положительных ионов (катионов) через подвижность катионов u+, разность электрохимических потенциалов , толщину мембраны l и концентрацию соли в мембране С.
Б. Повторите этот вывод для стационарного потока анионов J-.
В. Выразите потоки J+ и J-. через концентрации и разности потенциалов в обеих частях.
Г. Считая, что заряд сохраняется, определите разность потенциалов между двумя частями.
Д. Чему равен коэффициент диффузии этого потока?
16. Рассматривается та же система, что и в задаче 16.
A.. Чему равен потенциал в части системы с большей концентрацией по сравнению с потенциалом системы с меньшей концентрацией, если положительные ионы движутся быстрее анионов?
Б. Чему равен этот потенциал, если, напротив, подвижность анионов выше, чем катионов?
B. Чему равна разность потенциалов, если u+ = u-?
17. При исследовании бактериальной суспензии в буфере рН = 6,0, были установлены следующие соотношения: Рассчитайте величину трансмембранного (элетрохимического градиента протонов). Предполагается, что система транспорта для неметаболизируемого аналога сахара функционирует по механизму симпорта с протоном. Рассмотрите возможность достижения величины отношения концентраций аналогично внутри и вне клетки, равной 200, при рассчитанном выше значении . Каковы ваши предположения о возможной метаболической природе , если исследуемый организм является:
а) строгим аэробом; б) анаэробом; в) фотосинтетическим организмом?
18. Внутриклеточная концентрация Na+ поддерживается на уровне 10мМ, K+- 140мМ, при внешней концентрации Na+ 145мМ, K+- 5мМ. Равновесный трансмембранный потенциал составляет -60 мВ. Определите, сколько молекул АТФ нужно гидролизовать для работы Na+-K+ насоса. При гидролизе АТФ изменение свободной энергии составляет -50,16 кДж/моль. Насколько эффективен Na+-K+ насос, т.е. какая доля энергии, освобождающаяся при гидролизе АТФ, используется для переноса ионов?
19. Какой максимальный градиент можно достичь за счет активного транспорта 1 моля Ca2+ за счет гидролиза 1 моля АТФ. Равновесный трансмембранный потенциал считать равным - -60 мВ. При гидролизе АТФ изменение свободной энергии составляет -50,16 кДж/моль.
20. В цитоплазме клеток концентрация ионов составляет 110-7 моль/л, во внутренней полости саркоплазматического ретикулума концентрация Ca2+ близка к 1мМ. Рассчитать, какое количество работы должна выполнить система по переносу 2-х ионов кальция внутрь саркоплазматического ретикулума. Внутри саркоплазматического ретикулума потенциал равен внутриклеточному, =0. Сколько молекул АТФ нужно гидролизовать для обеспечения переноса ионов Ca2+ через мембрану саркоплазматического ретикулума.
21. Ионные концентрации (моль/л) для гигантского нервного волокна животного Примерус равны: [K]i=300, [K]e=10, [Na]i=50, [Na]e=500 ммоль/л. Определить трансмембранный потенциал при условии, что мембрана проницаема только для калия. Если мембрана проницаема как для калия, так и для натрия, какой трансмембранный потенциал будет существовать в равновесии.
22. Ионные концентрации (моль/л) для гигантской нервной клетки моллюска Aplysia составляют: [K]i=280, [K]e=12, [Na]i=61, [Na]e=480 ммоль/л, [Cl]i=51, [Cl]e=490 ммоль/л. Проницаемости в покоящейся мембране находятся в отношении PK:PNa:PCl = 0.01:1.00:0.01. Определите потенциал покоя клетки.
23. Для биологически возбудимой нервной клетки типичное отношение вне- к внутриклеточной концентрации K, Na, Cl равно ......(Укажите, >1 или <1 это отношение).
24. Концентрация фруктозы во внеклеточной среде составляет 0.5 нМ. По типу симпорта фруктоза транспортируется в клетку, используя энергию трансмембранного протонного градиента. Считайте, что рН внеклеточной среды 6.0, а в клетке - 8.0. Трансмембранный потенциал клетки  = -50 мВ способствует переходу протонов из окружающей среды внутрь клетки. Найти самую высокую внутриклеточную концентрацию фруктозы, которую эта транспортная система может создать в клетке? Используйте T = 298 K.
25. Концентрация фруктозы во внеклеточной среде составляет 0.5 нМ. Активная транспортная система на плазматической мембране транспортирует фруктозу в клетку, используя свободную энергию гидролиза ATP. Какова самая высокая внутриклеточная концентрация фруктозы, которую эта транспортная система может создать в клетке? Проигнорируйте потенциальные проблемы растворимости, и т.д. Предположите, что один моль фруктозы транспортируется за счет гидролиза моля ATФ. Считайте, что ATФ гидролизируется на внутриклеточной поверхности мембраны, и что концентрации ATФ, АДФ и Pi составляют 3 мМ, 1 мМ, и 0.5 мМ соответственно. Используйте T = 298 К. Принять изменение стандартной свободной энергии гидролиза АТФ равной -30 кДж/моль. 4. Осмос. Доннановское равновесие
1. Предположим, что макромолекула М1 димеризуется по схеме 2М1  М2 с константой равновесия k, определяемой как k = [M1]2 / [M2]. Пусть полное осмотическое давление  в системе задается уравнением , с1 и с2 - концентрации М1 и М2 в г/л, а с - полная концентрация макромолекул, присутствующих в виде мономера, т.е. с = с1 + с2. Покажите, что при малых с можно представить  в виде ряда по степеням с. , М - молекулярная масса.
2. Рассчитайте осмотическое давление при 298 К в следующих случаях: а) отделении 200 г гемоглобина и 1 л раствора, а в правом - чистая вода; б) в левом отделении такой же раствор гемоглобина, а в правом - в начале опыта находится 6,0 г NaCl в 1 л раствора.
Считать рН раствора таким, что молекулы гемоглобина находятся в форме Na+Hb- (молекулярная масса гемоглобина 65 000).
3. Запишите выражение для отношения Доннана. Ответьте на следующие вопросы:
1. Чему равно отношение Доннана r, если белок не заряжен?
2. Чему равно r, если концентрация соли вне подсистемы, содержащей белок, очень велика?
3. Чему равна разность электрических потенциалов в двух предыдущих случаях?
4. Пусть с одной стороны полупроницаемой мембраны (стороны 2) присутствуют макромолекулы. Их концентрация равна 10 мкМ, а средний заряд на каждой + 9,9. Макромолекулы находятся в разбавленном водном растворе NaCl. Оказалось, что со стороны 1 мембраны (Na+) = 10 мкМ, а со стороны 2 - (Cl-) = 50 мкМ. Соответствуют ли эти значения ионных концентраций тем, которые должны наблюдаться в системе, находящейся в термодинамическом равновесии относительно распределения ионов Na+ и Cl- по разные стороны мембраны? Почему?
5. При некотором рН полный заряд белка равен +8. Раствор этого белка с концентрацией 10-2 М помещен в диализный мешок, который непроницаем для белка, но пропускает воду и небольшие молекулы. Диализ проводят против буферного раствора, содержащего 300 мМ КCl. Объем мешка считается постоянным и равным объему раствора КС1. Ответьте на следующие вопросы:
A. Какова равновесная концентрация К+ в диализном мешке?
Б. Чему равно осмотическое давление в равновесном состоянии при 27 градусах, если молекулы белка и ионы образует идеальный раствор?
B. Какова разность электрического потенциала в равновесном состоянии? Считать, что t = 27С.
6. Эндотелий капилляров, ограничивая движение белков, допускает свободное проникновение через него воды и растворенных солей. В результате возникает доннановское равновесие диффундирующих ионов. На основе этой информации дополните приведенную таблицу:
ИонПлазма крови мэкв/лМежтканевая жидкость мэкв/л Na+
К+
Сl-
HCO3- 150
?
?
28 144
4
144
? Чему равен трансмембранный потенциал?
7. При определении осмотического давления  высокомолекулярного вещества были получены следующие данные (27 °С):
С, г/100мл 2,0 2,75 3,4 5,0 6,0 7,25 8,3 , мм. рт.ст. 6,6 9,1 11,6 17,9 21,9 27,4 32,8
С помощью графического метода рассчитайте молекулярную массу вещества.
8. При исследовании осмотического давления сывороточного альбумина в 0,05 М ацетатном буфере при рН 4,8 (изоэлектрическая точка) и 0°С были получены следующие данные:
С, г/100 мл 0,78 1,25 2,79 2,82 3,38 4,18 8,98 12,45
растворителя
набл, см Н20 2,39 4,01 8,53 8,68 10,80 13,01 27,84 37,69
Определите молекулярную массу сывороточного альбумина. [Bark, J. Boil. Chem., 98, 353 (1932).]
9. Гутфрейнд определил осмотическое давление гемоглобина человека в 0,2 М фосфатном буфере. При 3 °С были получены следующие данные:
с, г/ 100 мл , см Н2О с, г/100 мл , см Н2О 0,47 1,6 3,25 12,8 0,56 2,0 3,47 13,2 0,60 2,2 3,75 14,9 1,29 4,7 4,34 17,6 1,66 6,5 4,83 19,9 2,39 9,5 5,40 22,6 3,09 11,3 7,01 30,6 Рассчитайте молекулярную массу гемоглобина человека. [G utfreund, in:: Haemoglobin, eds. Roughlon, Kendrew, London, Buterworth, 1949, p. 197.)
10. В системе из двух компартментов, компартменты 1 и 2 отделены друг от друга мембраной. Каждый компартмент содержит NaCl, KCl и KX. Мембрана проницаема для Na, K и Cl, но не проницаема для Х. Не наблюдается потока ни одного из ионов через мембрану. Даны следующие концентрации ионов [K]1=10, [K]2=50, [Na]1=4.5, [Cl]2=2.5 ммоль/л. Каковы основные соотношения между ионными компонентами. Найдите недостающие концентрации.
5. Окислительно-восстановительные потенциалы. Окислительное фосфорилирование
1. Определите долю ( в %) восстановленной формы крезилвиолета при рН 7.0, если окислительно-восстановительный потенциал среды равен а) -0.128 В и б) -0.179 В. для крезилвиолета при рН 7.0 составляет -0.166 В, n=2. Температура 30С.
2. Каково отношение восстановленной и окисленной форм пигмента тиоцианина, если измеренный окислительно-восстановительный потенциал системы равен -0.025 В? для тиоцианина -0.034 В при рассматриваемой температуре (25С) и n=2.
3. Лактатдегидрогеназная система, катализирующая окисление лактата в птруват, имеет =-0.180 В при 35С и рН 7.01. Каков будет потенциал системы, когда окисление пройдет на 95%?
4. Краситель 2,6-дихлорфенолиндофенол был использован для количественного определения аскорбиновой кислоты. при рН 7,0 и 30С для соответствующих систем равны 0,217 и 0,060 В. Какова величина потенциала красителя, когда он восстановлен аскорбиновой кислотой на 99,8%?
К системе аскорбиновая кислота - дегидроаскорбиновая кислота (в равных концентрациях) добавляли либо окисленную, либо восстановленную форму красителя (в такой же концентрации). Каковы будут величины окислительно-восстановительного потенциала системы?
5. -оксибутират (который образуется в процессе кетогенеза) окисляется в почках и мышцах. На первой стадии окисления образуется ацетоуксуснаякислота. Водород переносится при участии NAD и флавопротеида на цитохром а; в отношении последнего можно считать, что он находится в клетке в полувосстановленном состоянии. Определите свободную энергию процесса окисления -оксибутирата цитохромом а (приняв, что в исходном состоянии концентрации -оксибутирата и ацетоацетата равны). для системы -оксибутират - ацетоацетат равен -0,293 В, а для цитохрома а составляет +0,290 В при рН 7,5 и 37°С. Восстановленный цитохром а при действии цитохром-оксидоредуктазы окисляется атмосферным кислородом. для атмосферного кислорода +0,80 В. Рассчитайте энергию, освобождающуюся в ходе финальной реакции с кислородом.
6. Мембранный потенциал, возникающий вследствие направленного переноса протонов на мембране составляет примерно 50 мВ. Градиент рН между внутренней и внешней фазами тиллакоида составляет примерно 2,7. Достаточен ли термодинамически такой градиент рН для того, чтобы обеспечить протекание реакции фосфорилирования?
7. Как изменится вклад электрического потенциала в  в пурпурных бактериях при изменении рН на единицу. Мембранный потенциал равен 100 мВ.
8. Хлоропласты, прединкубированные в темноте в среде, содержащей сукцинат при кислом рН способны синтезировать АТФ в ответ на быстрое повышение рН до 8, при котором создается на мембране временный градиент рН. Рассчитать, синтез скольки молей АТФ возможен при выходе протонов, если   100 мВ.
9. Суммарный процесс биологического окисления можно представить в виде реакции . Изменение стандартной свободной энергии этой реакции --236647 Дж. Используя приведенную информацию, рассчитайте окислительно-восстановительный потенциал активирующей кислород системы, катализирующей финальную реакцию при рН 7,0 и 30°С. Считайте, что давление атмосферного кислорода равно 0,2 атм. (Примечание: в водных растворах концентрацию Н2О можно принять равной единице.)
10. Цитохром а представляет собой одноэлектронную окислительно-восстановительную систему со стандартным потенциалом  0,29 В при рН 7,0. Для реакции кислорода О2 (г)+4Н+ + 4е  2Н2О Е° равно +1,23 В при 25 °С.
Рассчитайте электродный потенциал для этой реакции при рН 7,0. Рассчитайте давление (теоретическое) кислорода, необходимое для поддержания системы цитохрома а в состоянии 99,9% окисления при 25°С. [По данным Ball, Symposium Quant. Biol., 7, 100 (1939); Harvard Medical Sciences 201 ab.]
11. Цитохромы - это железосодержащие белки - гемы, в которых порфириновое кольцо связано через центральные атомы азота с атомом железа, который может подвергаться одноэлектронной окислительно-восстановительной реакции. Цитохром f является примером молекул этого класса, и он действует как окислительно-восстановительный агент в хлоропластах при фотосинтезе. Стандартный потенциал восстановления E0' цитохрома f при рН 7 можно определить, связывая его реагентом с известным E0'таким как феррицианид/ферроцианид:
E0'=0,44 В.
В типичном эксперименте, проведенном спектрофотометрически, раствор при 25°С и рН 7, показал отношения и при равновесии.
а)Вычислите E0'(восстановления) для цитохрома f.
б)На основании стандартного потенциала E0' восстановления О2 до Н2О при рН 7 и 25°С сделайте вывод является ли цитохром f достаточно хорошим окислителем, чтобы обеспечить образование О2, из Н2О при рН 7?
12. Рассмотрим следующую реакцию, при которой переносятся два электрона:
2 цитохром С (ферро) + пируват + 2Н+  2 цитохром С (ферри) + лактат
а)Какова величина E0' для этой реакции при рН 7 и 25°С?
б)Вычислите константу равновесия для этой реакции при рН 7 и 25°С.
в)Вычислите изменение стандартной свободной энергии Гиббса для этой реакции при рН 7 и 25°С.
г)Вычислите изменение свободной энергии Гиббса (при рН 7 и 25°С), если концентрация лактата в пять раз выше концентрации пирувата и концентрация цитохрома С (ферри) в 10 раз выше концентрации цитохрома С(ферро).
Приложение. Равновесная термодинамика. Краткие сведения
Первый и второй законы термодинамики
Предметом термодинамики является рассмотрение общих закономерностей превращения энергии при ее переносе в форме теплоты и работы между телами.
В зависимости от характера обмена энергии и массы с окружающей средой через границы системы различают три группы систем. Изолированные системы не обмениваются с внешней средой ни энергией, ни массой, они полностью изолированы от влияния окружающей среды. Системы, которые через свои границы обмениваются энергией с окружающей средой, но не могут обмениваться массой (веществом), относятся к закрытым системам. Открытые системы обмениваются с окружающей средой и энергией, и массой
Всякая система характеризуется определенными свойствами, или термодинамическими параметрами. Их совокупность определяет термодинамическое состояние системы, поэтому изменение хотя бы одного из параметров приводит к изменению термодинамического состояния системы в целом.
Процессы, протекающие в системе и изменяющие ее состояние, могут быть равновесными или неравновесными. Равновесные, или обратимые, процессы протекают в системе таким образом, что вызванные ими изменения в состоянии системы могут произойти в обратной последовательности без дополнительных изменений в окружающей среде. Наоборот, неравновесные, или необратимые, процессы, к которым относятся реальные превращения в природе, не обладают этими свойствами, и их протекание в обратном направлении сопровождается остаточными изменениями в окружающей среде. В классической термодинамике рассматриваются главным образом равновесные состояния системы, при которых ее параметры сохраняют свое значение во всех точках системы и не изменяются самопроизвольно в о времени.
Термодинамическое равновесие - это состояние системы, при котором ее параметры не изменяются и она не обменивается с окружающей средой ни веществом, ни энергией
Стационарное состояние системы характеризуется тем, что ее параметры также не изменяются во времени, но происходит обмен веществ и энергии с окружающей средой.
Энергия - количественная мера определенного вида движения материи при ее превращениях. Основной единицей для измерения количества энергии и работы в системе СИ является джоуль (Дж). На практике часто пользуются внесистемной единицей - калорией (кал) 1 кал=4,184Дж, 1ккал=4,184 кДж.
Под внутренней энергией системы понимают ее общий запас, обусловленный всеми видами движений и взаимодействий составляющих ее молекул, атомов, ионов, элементарных частиц. Это энергия поступательного, колебательного и вращательного движения атомов, ионов, электронов, протонов, нейтронов, а также энергия силового взаимодействия этих частиц (электромагнитного, гравитационного). Нельзя вычислить абсолютное значение этой энергии для данной системы, так как она включает большое число трудно поддающихся учету слагаемых, некоторые из них при современном состоянии науки еще неизвестны. Поэтому в термодинамике вычисляют разность между запасом внутренней энергии системы для начального и конечного состояния.
Работа - любая макрофизическая форма передачи энергии.
Первый закон термодинамики. Этот закон является законом сохранения энергии в применении к процессам преобразования теплоты.
Обычная запись первого закона термодинамики имеет вид и означает, что теплота , поглощенная системой из внешней среды, идет па увеличение внутренней энергии системы и совершение работы против внешних сил.
Работа - любая макрофизичсская форма передачи энергии
В общем случае включает работу против сил внешнего давления и максимальную полезную работу , сопровождающую химические превращения:
-означает, что теплота и работа не являются функциями состояния системы и не могут быть полными дифференциалами. U- функция состояния системы , зависящая от термодинамических параметров
Попытки проверить опытным путем справедливость первого закона термодинамики для биологических веществ принимались давно. Лавуазье и Лаплас (1780) измеряли в ледяном калориметре количество теплоты и CO2, выделяемого организмом морской свинки, а затем сравнивали полученные величины с тепловым эффектом реакции сжигания исходных продуктов питания до CO2. Такого рода измерения показали, что потребление 1л O2 и выделение 1л CO2 при прямом сжигании или окислении в организме сопровождается выделением 21,2 кДж теплоты. Совпадение тепловых эффектов в обоих случаях и для других реакций свидетельствует о том, что пути превращения продуктов питания в метаболических процессах и в химических реакциях вне живой клетки является эквивалентным с точки зрения суммарных тепловых эффектов. Иными словами, для процессов метаболизма также справедлив известный в физической химии закон Гесса, что дает возможность рассчитывать тепловые эффекты сложных биохимических циклов, если известны лишь начальные и конечные продукты.
Прямые опыты показали, что количество энергии, поглощенной за сутки человеческим организмом вместе с питательными веществами, равно выделенной за это же время теплоте. Этот результат подтверждает справедливость для организмов первого закона термодинамики. Следовательно, сами по себе организмы не являются независимым источником какой-либо новой формы энергии.
Второй закон термодинамики. Этот закон устанавливает критерий, отражающий одностороннюю направленность необратимых процессов независимо от их конкретной природы.
Согласно второму закону, состояние системы может быть описано особой функцией состояния - энтропией S. Изменение энтропии dS определяется суммарным значением поглощенных системой приведенных теплот . При бесконечно малом изменении состояния системы изменение энтропии dS равно или больше значения поглощенной системой элементарной приведенной теплоты (если процесс носил соответственно равновесный или неравновесный характер):
Для системы не совершающей теплообмена с внешней средой, и уравнение принимает вид:
В изолированных системах энтропия остается неизменной в равновесных и возрастает в неравновесных процессах. Это и является критерием направленности превращений в изолированной системе. Таким образом, протекающий в изолированной системе самопроизвольный неравновесный процесс всегда вызывает увеличение энтропии до ее максимальных значений при окончании процесса и установлении термодинамического равновесия.
Характеристические функции
Первый и второй законы термодинамики устанавливают существование двух функций состояния системы - внутренней энергии (U) и энтропии (S), приращение которых не зависит от пути перехода из одного состояния в другое. Однако по величине этих функций нельзя судить о величине производимой работы (A). В классической термодинамике доказывается существование других характеристических функций состояния системы, изменение которых в равновесных процессах равно максимальной полезной работе.
В зависимости от условий протекания процесса различают четыре потенциала, которые характеризуются постоянством пары параметров:
Внутренняя энергия U S,V=const Энтальпия H=U+PV S,P=const Энергия Гельмгольца (изохорно-изотермический потенциал) F=U-TS T,V=const Энергия Гиббса (изобарно-изотермический потенциал) G=U+PV-TS T,P=const 1. для равновесных процессов:
;
Максимальное количество работы, которое можно совершить в процессе, протекающем при постоянных Т и P, равно уменьшению свободной энергии системы.
2. для неравновесных процессов:
При необратимом процессе совершается меньшее количество работы. В необратимом процессе, протекающем при постоянных температуре и давлении свободная энергия уменьшается.
Свободная энергия Гиббса: Полный дифференциал по этим переменным:
; (отсутствие всех видов работы, кроме работы по расширению)
(1); (2)
Свободная энергия Гиббса уменьшается с ростом температуры и увеличивается с ростом давления.
Температурная зависимость свободной энергии Гиббса
Интегрируя выражение (2) получаем G при постоянном давлении в температурном интервале от T1 до Т2:
(P=const)(3)
В уравнениях (2) и (3) S является функцией Т при постоянном давлении.
Для расчета температурной зависимости изменения свободной энергии Гиббса химической реакции
пАА + пBВ  пCС + nDD (4)
изменение свободной энергии реакции равно:
где и т. д. - мольные свободные энергии соединений С, D и т. д. Взяв производные уравнения (4) по температуре при постоянном давлении, получаем
(5)
где S - изменение энтропии реакции. Интегрируя уравнение (5), получаем
(6)
Если S реакции не изменяется значительно в температурном интервале от Т1 до Т2, уравнение (6) дает
Рассмотрим другое полезное уравнение для расчета температурной зависимости G при постоянном давлении:
Это уравнение Гиббса-Гельмгольца. Его можно вывести, взяв дифференциал от (G/Т) по температуре при постоянном давлении:
Считая , получаем
(7)
Умножив обе части уравнения (7) на Т2 и учитывая, что (dT/T2) = -d(\/T), получаем
(8)
Для рассматриваемой химической реакции (4) из уравнений (7) и (8) следует, что
,(9)
где Н - изменение энтальпии реакции
Если изменение Н мало по всему температурному интервалу, то из уравнения (9) получаем
(9)
Зависимость свободной энергии Гиббса от давления
, T=const
(10)
Для твердых веществ и жидкостей при умеренных давлениях объем приблизительно постоянен и не зависит от давления; тогда после интегрирования получим
(11)
Для газа следует использовать уравнение состояния в приближении идеального газа и записать V как функцию от Р. Подставляя уравнение состояния в уравнение (10), получим
(12)
Для расчета влияния давления на свободную энергию химической реакции применим уравнения (11) и (12) к каждому продукту реакции и реагирующему веществу.
Если все продукты и исходные вещества - твердые или жидкие, используем уравнение (11):
(13)
где Уравнение (13) показывает, что если объем продуктов реакции больше объема реагирующих веществ (), то повышение давления будет увеличивать свободную энергию реакции. Если хотя бы одно из реагирующих веществ или продуктов реакции газообразно, можно пренебречь объемом жидкостей и твердых веществ по сравнению с газом и использовать уравнение (12)
где - число моль газообразных продуктов минус число моль газообразных исходных веществ.
По величине характеристических функций можно судить о направлении самопроизвольных процессов и установлении равновесия в системе. При отсутствии всех видов работы () кроме работы по расширению и в условиях постоянства соответствующих пар термодинамических параметров (T, P)
Условие равновесия: Параметры состояния
Параметры состояния- (термодинамические параметры, термодинамические переменные)- физические величины, характеризующие состояние термодинамической системы в условиях термодинамического равновесия.
Различают экстенсивные параметры состояния(обобщенные координаты, факторы емкости), пропорциональные массе системы, и интенсивные параметры состояния (обобщенные силы, факторы интенсивности), не зависящие от массы системы. Значение экстенсивного параметра состояния для системы равно сумме его значений по всем элементам системы, т.е. экстенсивные параметры обладают свойством аддитивности. Отнесение экстенсивного параметра к единице массы или 1 молю вещества придает ему свойство интенсивного параметра, называемого удельной или молярной величиной. Интенсивные параметры состоянию могут иметь одно и то же значение во всей системе или изменяться от точки к точке, эти величины не аддитивны, значение аддитивного параметра не стремится к нулю при уменьшении размеров системы.
Полезная работа и приращение свободной энергии
"Полезная работа" определяется как вся работа по расширению при постоянном давлении.
Работа по расширению Произведение интенсивной переменной, внутреннего давления, на приращение экстенсивной переменной V.
Работа по перемещению Работа по переносу массы в область, где уже имеется какое-то ее количество
--интенсивная переменная, называемая химическим потенциалом;
-изменение массы системы. Знак минус означает, что для переноса массы из системы в окружающую среду, система совершает работы над окружающей средой.
Работа по переносу заряда в область, где уже есть заряженные частицы
Аналогичным образом при совершении электрической работы экстенсивной переменной является заряд системы q, которым она может обмениваться, а в качестве интенсивной переменной вводят электрический потенциал, характерный для каждой системы.
Знак минус означает, что работа выполняется над окружающей средой.
Выражение для свободной энергии в явном виде
Для практического применения свободной энергии необходимо найти соотношение между ее приращением и измеряемыми параметрами системы. Свободная энергия является функцией состояния и следовательно, в любых процессах, протекающих между фиксированными начальным и конечным состояниями, будет иметь место такое же ее изменение.
Запишем выражение I закона термодинамики с учетом всех видов произведенной работы.
При этом полное изменение энергии имеет вид:
В частности, если совершается только работа по переносу массы, то
-химический потенциал системы
-число молей вещества, поступившего в систему.
Если система распадается на несколько подсистем, каждая из которых характеризуется своим химическим потенциалом , то изменение свободной энергии будет записываться в виде суммы свободной энергии подсистем:
Химический потенциал
В дальнейшем нас в основном будут интересовать химические реакции, изменяющие состав самой системы.
В таких случаях число молей всех составных частей системы.
- означает постоянство масс всех компонентов, кроме i-го.
Частная производная свободной энергии Гиббса по числу молей компонента называется химическим потенциалом.
Химический потенциал в дифференциальном виде
Типичная кривая зависимости химического потенциала от концентрации для разбавленных растворов на рисунке.
С увеличением С, одинаковым ее приращениям соответствуют все меньшие приращения химического потенциала.
Установлено, что при малых изменениях концентрации
из которого вытекает, что одно и то же приращение приведет при большой концентрации С к меньшему изменению , чем при малой.
Разность химических потенциалов является величиной относительной, поэтому "нулевой уровень" потенциала при данных T и P можно выбрать произвольно. В данном случае несущественно с какого нулевого уровня ведется отсчет, а важна разность между конечными и начальными значениями.
- стандартный химический потенциал.
Зависимость химического потенциала от давления и температуры
Т.к. dG является полным дифференциалом, то парциальный молярный объем. Таким образом, зависимость химического потенциала от давления Рассмотрим систему, состоящую из двух фаз, между которыми распределен интересующий нас компонент. Переход массы dn из первой во вторую фазу вызовет изменение потенциала dG. В равновесии Равенство химических потенциалов это условие равновесия перехода компонента из фазы I в фазу II.
В отсутствие равновесия . Самопроизвольный переход будет происходить из состояния с большим химическим потенциалом в состояние с меньшим химическим потенциалом.
Электрохимический потенциал
Электрическая работа по переносу заряда в область с электрическим потенциалом :
Пусть положительный заряд перемещается из области с электрическим потенциалом в область с потенциалом .
Заряд, который несет на себе заряженная молекула =Z e
Z- количество e-заряд 1,610-19 Кл
Заряд 1 моля вещества - Z e N0 N=61023 моль
еN0=F число Фарадея
Если перенос между фразами представляет собой транспорт заряженных ионов, то работа по переносу:
Расчеты стандартных энергий биохимических реакций
1. При одном обороте или акте реакции число израсходованных молекул исходных веществ и число образованных молекул продуктов пропорционально соответствующим стехиометрическим коэффициентам
Стандартная величина термодинамического потенциала Если концентрации реагентов равны 1¸
2. можно определить исходя из величин стандартных окислительно-восстановительных потенциалов.
∆G0 = -nF∆E0F =23063 кал ∕ моль (96500 Дж∕моль);
3. A + C Д + Е ∆G0=?
Известно, что:
Д + Р А ∆G1 2Е А + С ∆G2
С + Р Д ∆G3
Д + Р А
2Е А + С Д + Р + 2Е 2А + С ∆G1+∆G2
-
С + Р Д Д +P+ 2Е - С - P 2А+С-Д
Д + Е А + С ∆G10 =-1/2(∆G1 + ∆G2 - ∆G3)
Вопросы к экзамену
1. Мембрана как универсальный компонент биологических систем. Развитие представлений о структурной организации мембран
2. Основные положения теории ассоциации-индукции Г. Линга
3. Характеристика мембранных липидов. Одноцепные липиды.
4. Образование мицелл. Принцип противодействующих сил. Критическая концентрация мицеллообразования.
5. Пространственная организация липидов в бислое.
6. Ассиметрия бислоя.
7. Холестерин. Биологическая роль холестерина.
8. Белки мембран. Классификация белков.
9. Характеристика взаимодействий белок-липид, белок-белок.
10. Белки цитоскелета, из характеристика и функции.
11. Вода как составной элемент биомембран
12. Динамика структурных элементов мембраны. Метод спиновых меток для определения подвижности компонентов мембраны
13. Метод флуоресценции для изучения подвижности компонентов биомембран.
14. Взаимодействия в мембранах: липид-липидные, белок-липидные, белок-белок.
15. Монослой на границе раздела двух фаз, -А изотермы. Монослой как модельная мембранная система. 16. Плоские бислойные мембраны. Способы получения. Возможности бислойных модельных систем для изучения функционирования биомембран.
17. Липосомы, протеолипосомы. Области их применения.
18. Гели, их свойства. Использование гелевых структур в качестве моделей цитоплазмы клетки.
19. Водно-липидные смеси. Полиморфизм.
20. Термодинамика полиморфизма липидных структур.
21. Образование мицелл. ККМ. Принцип противодействующих сил.
22. Геометрия мицелл и критический параметр упаковки.
23. Термотропный фазовый переход. Область и порядок перехода.
24. Изменение термодинамических характеристик в области фазового перехода.
25. Метод калориметрии для определения термодинамических параметров фазового перехода.
26. Жидкокристаллическое состояние мембран.
27. Регуляция динамических свойств мембраны в ответ на изменение температуры окружающей среды.
28. Гипотеза кинков.
29. Поверхностный заряд мембранных систем. Уравнение Пуасона-Больцмана.
30. Уравнение Гуи-Чемпмена для поверхностной плотности заряда мембранных систем.
31. Уравнение Штерна для поверхностной плотности заряда мембранных систем.
32. Емкость плотного и диффузионного слоев. Толщина диффузионного слоя.
33. Электрокинетический потенциал мембранных систем, его практическое значение.
34. Характеристика свободных радикалов, образующихся в организме человека. Свободнорадикальное окисление липидов.
35. Функционирование антиоксидантных систем: СОД - каталаза, глутатиона, аскорбиновой кислоты. Антиоксиданты.
36. Биологические последствия пероксидации липидов.
37. Простая диффузия. Коэффициент диффузии, уравнение Стокса-Энштейна
38. Уравнение Теорелла. Первый закон Фика.
39. Второй закон Фика.
40. Диффузионный поток веществ через мембрану. Коэффициент проницаемости биомембран. 41. Кинетические уравнения диффузионных процессов.
42. Влияние примембранной воды для проницаемости веществ через мембрану.
43. Термодинамика процессов активного и пассивоного транспорта.
44. Транспорт неэлектролитов через биомембрану. Облегченная диффузия. Белки-переносчики.
45. Пассивный транспорт глюкозы через мембрану. Переносчики глюкозы. Инсулинзависимый транспорт глюкозы.
46. Активный транспорт неэлектролитов через биомембрану с участием переносчиков.
47. К/Na-АТФаза- свойства и биологическая роль.
48. Са2+- насос. Са2+- АТФаза.
49. Транспортные антибиотики.
50. Природа мембранного потенциала. Уравнение Нернста.
51. Профиль потенциала в двойном электрическом слое
52. Соотношение концентраций и потенциала в объеме фаз вода- неполярный растворитель.
53. Равновесие Доннана. Отношение Доннона. Потенциал Доннана.
54. Осмотическое давление. Определение молекулярной массы биополимеров.
55. Электрохимический потенциал и уравнение электродиффузии Нернста-Планка.
56. Уравнение Гольдмана для ионного потока.
57. Опыты Уссинга по изучению процессов активного транспорта. Уравнение Уссинга.
58. Уравнение Гольдмана для равновесного потенциала.
59. Описание транспорта ионов в теории ассоциации-индукции Г.Линга
60. Окислительно- восстановительные потенциалы. Вычисление свободной энергии Гиббса окислительно -восстановительной реакции.
61. Локализация электрон-транспортных цепей в мембране митохондрий; структурные аспекты функционирования связанных с мембраной переносчиков.
62. Хемиосмотический протонный цикл.
63. Электрохимический протонный градиент митохондрий. Протондвижущая сила. Относительный вклад  и рН в электрохимический протонный градиент.
64. Основные положения теории Митчела.
65. Структура АТФ-синтетазы. Функционирование Fo.
66. Условия функционирования АТФ-азы, АТФ-синтетазы.
67. Явление апоптоза. Молекулярные и клеточные механизмы.
Основная литература
1.Волькенштейн М.В. Биофизика. - М.: Наука, 1988. - 590 с. 2. Рубин А.Б. Биофизика, кн.1. - М.: Высшая школа, 1999. - 320 с.
3. Рубин А.Б. Биофизика, кн.2. - М.: Высшая школа, 2000. - 302 с.
4. Биофизика. / Под ред. П.Г.Костюка. - К.: Вища школа, 1988. - 504 с.
5. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. - М.: Мир, 1984-1985. - т.1-3.
6. Р. Геннис. Биомембраны.- М.: Мир, 1997.-624 с.
7. Структура и функции биологических мембран./П.Г.Богач, М.Д.Курский и др. К.: Вища школа, 1981. - 336 с.
8. Болдырев А.А. Биологические мембраны и транспорт ионов. - М.: Изд-во МГУ, 1985. - 208 с.
9. Кагава Ясуо. Биомембраны.-М.: Высш. Школа, 1985.-303 с.
10. Твердислов В.А. Физические механизмы функционирования биологических мембран.-М.: МГУ, 1987.-187 с.
11. Курський М.Д., Кучеренко С.М. Біомембранологія.- К.: Вища шк.., 1993.-259 с.
12. Накагаки Масаюки. Физическая химия мембран.-М:Мир, 1991
13. Зима В.Л. Біофізика: Збірник задач: Навч. посіб.- К.: Вища шк., 2001.-124 с.
14. Певзнер Л. Основы биоэнергетики.- М.: Мир, 1977.-310 с.
15. Антонов В.Ф. Липидные мембраны при фазових превращениях.- М.: Наука, 1992.-136 с.
16. Котык А., Яначек К. Мембранних транспорт . Междисциплинарный поход.- М.:Мир, 1980.
17. Болдырев А.А. Биологические мембраны и транспорт ионов: Уч. Пос. Для студентов.- М.: МГУ, 1985.
18. Г. Линг. Физическая теория живой клетки. Незамеченная революция.-СПб.: Наука, 2008.- 376 с.
Дополнительная литература
1. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя.-М.: Наука, 1981.
2. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран. - М.: Наука, 1982.
3. Габурда С.П. Связанная вода: Факты и гипотезы. - Новосибирск: Наука, 1982.-159 с.
4. Антонов В.Ф. Липидные мембраны при фазовых превращениях.- М.: Наука, 1992.-136 с.
5. Биологические мембраны. Методы./Под ред. Дж.Б.Финдлея, У.Г.Эванза. - М.: Мир, 1990. - 424 с.
6. Антонченко В.Я. Физика воды. - К.: Наукова думка, 1985. - 128 с
7. Лишко В.К., Шевченко М.И. Мембраны и жизнь клетки.-Киев: Наук. Думка, 1987
8. Конев С.В. Структурная лабильность биологических мембран и регуляторные процессы.-Минск: Наука и техника, 1987.-238 с.
9. Белоус А.М., Бондаренко В.А. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении.- Киев: Наук. Думка, 1982
10. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. Москва, Наука, 1972. 11. Антонченко В.Я. Физика воды. - К.: Наукова думка, 1985. - 128 с
12. Лишко В.К., Шевченко М.И. Мембраны и жизнь клетки.-Киев: Наук. Думка, 1987
13. Болдыренв А.А., Кайвяряйнен Е.И., Илюха В.А. Биомембранология: Учебное пособие. - Петрозаводск: Изд-во Кар. НЦ РАН, 2006.- 226 с.
14. Беспалова С.В., Ульянов А.Н. Электрические явления в биомембранах: Теория и лабораторный практикум.- Донецк.:ДонГУ, 1999.- 75 с.
15. Трошин А.С. Распределение веществ между клеткой и средой.- Л.: Наука.- 1985.-192 с.
16. Никольский Н.Н., Трошин А.С. Транспорт сахаров через клеточные мембраны.- Л.: Наука.- 1972.-233 с.
18. Поллак Дж. Клетки, гели и двигатели жизни. Новый унифицированный взгляд на леточные функции. -2001.
При составлении лекций, заданий для самостоятельного выполнения использованы следующие источники:
1. Уилсон Дж. Хант Т. Молекулярная биология клетки. Сборник задач.- М.: Мир.-1994.-505 с.
2. Страница проф. Болдырева А.А. на сайте Международного учебно-научного биотехнологического центра МГУ// Материалы к лекциям.
3. Тиноко И., Зауэр К., ВДНГ Дж, Паглиси Дж. Физическая химия. Принципы и применение в биологических науках.- М.:Техносфера, 2005.-744 с.
4. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия.-М.: Просвещ., 1987.-815 с.
5. Материалы Соросовского образовательного журнала
6. Поллак Дж. Клетки, гели и двигатели жизни. Новый унифицированный взгляд на леточные функции. -2001
2
Автор
burundukova93
Документ
Категория
Методические пособия
Просмотров
10 578
Размер файла
35 918 Кб
Теги
процессов, мембранных, биофизика
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа