close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

333.Лабораторный практикум по биологической химии.

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Министерство сельского хозяйства Российской Федерации
ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет»
Лабораторный практикум
по биологической химии
Оренбург
Издательский центр ОГАУ
2012
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
УДК 577.1
ББК 28.072
Н 65
Рекомендовано к изданию редакционно-издательским советом Оренбургского государственного аграрного университета (председатель совета –
профессор В.В. Каракулев).
Авторы-составители:
В.Н. Никулин – доктор сельскохозяйственных наук, профессор, зав. кафедрой
химии, член-корр. Международной славянской академии наук, образования, искусства и культуры, академик Международной академии аграрного образования
В.В. Курушкин – кандидат биологических наук, доцент
С.С. Шукшина – кандидат биологических наук, ст. преподаватель
А.В. Никулин – кандидат биологических наук, ст. преподаватель
Рецензенты:
В.В. Зайцев – доктор биологических наук, профессор, зав. кафедрой физиологии и биохимии ФГБОУ ВПО «Самарская сельскохозяйственная академия»;
Г.И. Якушева – кандидат педагогических наук, доцент, зав. кафедрой химии и
методики преподавания химии ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный педагогический университет».
Н 65 Лабораторный практикум по биологической химии: учебно-методическое
пособие / авт.-сост. В.Н. Никулин, С.С. Шукшина, В.В. Курушкин и др. –
Оренбург: Издательский центр ОГАУ, 2012. – 136 с.
ISBN 878-5-88838-746-7
В учебно-методическом пособии дается краткое теоретическое введение в предусмотренные ФГОС ВПО и рабочими учебными программами разделы, дающие представления
о химической сущности и биологическом значении наблюдаемых явлений. Изложен порядок
проведения лабораторных работ, в которых используются современные и наиболее доступные
методы химического анализа биологических объектов. Приведены задачи для самостоятельного решения, методика их выполнения, контрольные задания и тестовые вопросы для самоконтроля. Дан необходимый справочный материал.
Пособие рассчитано на бакалавров, студентов, магистров и аспирантов биологических
специальностей сельскохозяйственных вузов и специалистов агропромышленного комплекса.
УДК 577.1
БК 28.072
ISBN 878-5-88838-746-7
© Коллектив авторов, 2012
© Изд. центр ОГАУ, 2012
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ПРЕДИСЛОВИЕ
Современную биологическую химию условно делят на три крупных
раздела.
Статическая биохимия исследует химический состав организма. Под
химическим составом понимается как качественный состав и структуры
соединений, так и количественное их содержание в тех или иных биологических объектах.
Динамическая биохимия изучает превращения химических соединений и связанные с ними превращения энергии в организме.
Функциональная биохимия вскрывает связи между структурой химических соединений и процессами их превращений, с одной стороны, и
функции тканей или органов − с другой. Разумеется, такое деление биохимии в определенной степени условно, ибо все разделы тесно переплетаются и взаимно дополняют друг друга, а состав и строение веществ неотделимы от их преобразований, равно как и от функций тех органов и тканей,
в которых эти вещества находятся. Однако при изучении биохимии такое
деление весьма удобно, так как оно не только отражает историю развития
этой науки, но и обеспечивает постепенность перехода от простых вопросов к сложным.
Биохимия развивается очень интенсивно и имеет не только познавательное, но и большое практическое значение для животноводства, растениеводства, микробиологии, вирусологии, генетики, медицины, ветеринарии и ряда отраслей промышленности.
В зависимости от объекта и направления исследований биохимия распадается на несколько самостоятельных отраслей. Общая биохимия рассматривает закономерности состава и превращений химических соединений в процессах жизнедеятельности организма, являющихся общими для
многих видов животных существ. Биохимия растений исследует химический состав и обмен веществ у растительных организмов.
Биохимия животных изучает особенности состава химических соединений в живых организмах, обмена веществ и энергии у них в зависимости
от вида, породы, линии, факторов питания и содержания, а также особенности технологии производства продуктов животноводства. Ветеринарная
биохимия исследует химический состав и особенности обмена веществ в
организме животного на фоне его заболевания.
Настоящий практикум представляет собой учебно-методическое пособие, включающее разделы, предусмотренные ФГОС ВПО и программами,
для учебной, научно-исследовательской и самостоятельной работы бакалавров и магистров биологических направлений подготовки и студентов
специальности «Ветеринария». Он предназначен для научного и методиче3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ского обеспечения лабораторных работ по биологической химии, подготовки курсовых и дипломных работ, а также для преподавания данных дисциплин для студентов других направлений и специальностей аграрных вузов.
При создании практикума использована современная концепция преподавания данной дисциплины, основанная на представлении учебного материала в виде завершенных по содержанию блоков. Этот подход позволяет
использовать одно и то же учебное пособие при разных учебных планах,
изменяя лишь последовательность подачи изучаемого материала.
Учебный материал практикума представлен в виде отдельных занятий,
включающих лабораторные работы разной степени сложности. Методы
исследования, изложенные в практикуме, могут стать основой для последующей индивидуальной научно-исследовательской работы, подготовки
курсовых и дипломных проектов.
В связи с широким развитием заочного образования авторы учитывали
специфику самостоятельной работы студентов-заочников, которые практически не имеют возможности прослушать в полном объеме курс лекций
по данной дисциплине. Поэтому материал изложен в наиболее доступной
форме, по возможности не перегружен математическим аппаратом, теоретические положения иллюстрированы примерами из органической химии,
физиологии животных, клинической диагностики и других смежных наук.
Авторы надеются, что данное учебное пособие в целом отражает современное состояние учения по биологической химии и отвечает задачам,
стоящим перед изучающими эту дисциплину.
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АДФ
АЛТ
АМК
АМФ
АСТ
АТФ
ВМС
ГТФ
ДНК
ИЭТ
КоА
ЛДГ
ЛП
ЛПВП
ЛПНВ
ЛПОНП
НАД+
НАДН
НАДФ+
НАДФН
ПВК
ПОЛ
РНК
ТПФ
ТХУ
УДФ
УМФ
УТФ
Ф-1,6 ДФ
Ф-6-Ф
ФАД
ФАДН2
ФМН
ФФК
ЦПЭ
ЦТК
ЩУК
− аденозиндифосфат
− аланинаминотрансфераза
− аминокислота
− аденозинмонофосфат
− аспартатаминотрансфераза
− аденозинтрифосфат
− высокомолекулярные соединения
− гуаназинтрифосфат
− дезоксирибонуклеиновая кислота
− изоэлектрическая точка
− кофермент А (коэнзим А)
− лактатдегидрогеназа
− липопротеины
− липопротеины высокой плотности
− липопротеины низкой плотности
− липопротеины очень низкой плотности
− никотинамидадениндинуклеотид окисленный
− никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
− никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный
− никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный
− пировиноградная кислота
− перекисное окисление липидов
− рибонуклеиновая кислота
− тиаминпирофосфат
− трихлоруксусная кислота
− уридиндифосфат
− уридинмонофосфат
− уридинтрифосфат
− фруктозо-1,6-дифосфат
− фруктозо-6-фосфат
− флавинадениндинуклеотид окисленный
− флавинадениндинуклеотид восстановленный
− флавинмононуклеотид
− фосфофруктокиназа
− цепь переноса электронов
− цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса)
− щавелевоуксусная кислота
5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ig A, D, E, G, M
Hb
HbA
P
Pt
6
− иммуноглобулины А, D, E, G, M
− гемоглобин
− нормальный гемоглобин
− фосфат неорганический
− протеин
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1 СВОЙСТВА И МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ
1.1 Свойства белков
Все животные и растительные ткани состоят из различных химических
соединений: белков, углеводов, жиров и витаминов. И хотя все эти вещества необходимы для нормального развития организма, наибольшее значение имеют белки. Именно они служат той основной материей, из которой
состоят все частицы отдельной клетки и целого организма. Белки являются
высшей ступенью развития материи и с ними неразрывно связаны все неисчислимые многообразные проявления жизни, начиная с простейших функций самых примитивных существ и заканчивая сложнейшими функциями
человеческой деятельности.
Различают белки простые и сложные. Простой белок (протеин) рассматривается как продукт поликонденсации аминокислот, т.е. как специфический природный полимер. Сложные белки (протеиды) состоят из простого
белка и небелковых компонентов − углеводов, липидов, нуклеиновых и
фосфорной кислот и др.
Аминокислоты являются карбоновыми кислотами, содержащими
аминную и карбоксильную группы, которые находятся у одного и того же
углеродного атома:
H2N
CH
COOH
R
Разные аминокислоты могут содержать разное количество групп NH2
и COOH. В настоящее время открыто 26 аминокислот, входящих в состав
белка. Примерно половина из них содержит лишь по одной группе NH2 и
COOH − моноаминокислоты. Другие (дикарбоновые) содержат две карбоксильные группы на одну аминогруппу и обладают характерными кислотными свойствами. Третья группа аминокислот (диаминовые) содержит
одну карбоксильную группу на две аминогруппы и обладает выраженными
основными свойствами.
В строении белка различают микроструктуру, т.е. относительно небольшие фрагменты, представляющие собой полимеры из аминокислот, и
макроструктуру, образованную за счет объединения большого числа микроструктур, или субъединиц. На поверхности белков имеется большое число
гидрофильных групп, которые обусловливают создание вокруг этих макроструктур почти сплошной водной оболочки. Гидрофобные радикалы аминокислот, образующие полипептидные цепи, обращены преимущественно
внутрь структуры. Принято различать интермицеллярную воду, находящу7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
юся в свободном состоянии между отдельными белковыми макромолекулами, и интрамицеллярную, − находящуюся внутри белковых глобул. Для
устойчивости коллоидных частиц имеет значение только вода, создающая
внешнюю водную оболочку. Именно она и препятствует столкновению и
объединению белковых макромолекул.
1.2 Изоэлектрическая точка белков
Электрический заряд белков, помимо их своеобразного строения, является особенностью их свойств. В белковой молекуле содержатся две
полярные группы: основная − NH2 и кислотная − COOH, которые и сообщают макромолекуле амфотерные свойства. Эти группы принадлежат
концевым аминокислотам, т.е. находящимся на концах полипептидных
цепочек, а также дикарбоновым и диаминовым аминокислотам, расположенным в середине цепочки. Заряд белковой молекулы в нейтральной
среде определяется соотношением количества свободных карбоксильных
и аминных групп и степенью их диссоциации. Чем больше карбоксильных групп, тем выше отрицательный заряд, и белок будет проявлять свойства слабой кислоты. Преобладание аминогрупп сообщает белку основные свойства и положительный заряд. В кислой среде белок заряжается
положительно:
COOH
COOR
CH
NH3+
+ H+
R
CH
NH3+
В щелочной среде белок заряжается отрицательно:
COO-
COOR
CH
+ OHNH3
+
R
CH
NH3OH
Значение рН раствора белка, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии, т.е. в состоянии, при котором число разноименных
зарядов в белковой частице одинаковое и ее общий заряд равен нулю, называется изоэлектрической точкой данного белка.
Большинство природных белков содержат значительные количества
дикарбоновых кислот (глутаминовой и аспарагиновой) и, следовательно,
относятся к кислым белкам. Существует и относительно небольшая группа
основных белков с преобладанием свободных аминогрупп за счет повышенного содержания диаминовых кислот (лизина, аргинина, орнитина).
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Изоэлектрическая точка (ИЭТ) кислых белков лежит в слабокислой, основных − в слабощелочной среде.
В изоэлектрической точке растворы белков неустойчивы. Молекулы
белка с одинаковым количеством положительных и отрицательных зарядов легко выпадают в осадок. Значение рН, соответствующее изоэлектрической точке, является характерным для каждого белка. Например, для
желатина рН равно 4,7, для яичного альбумина – 4,71, зеина (кукурузного
белка) – 6,2; у протаминов и гистонов изоэлектрическая точка лежит в слабощелочной среде.
Выпадение белка в осадок в изоэлектрической точке можно ускорить
добавлением водоотнимающих веществ (спирта, ацетона, эфира) или танина. Одни из них (органические растворители) уменьшают степень гидратации белковых макромолекул, разрушают их водные оболочки, другие, как,
например, танин, образуют нерастворимые в воде соединения с азотистыми
гетероциклическими группировками.
Реактивы: желатин, 0,5%-ный раствор; уксусная кислота, 0,1 н раствор; ацетат натрия, 0,1 н раствор; этиловый спирт, 96%-ный раствор;
танин, 0,1%-ный раствор.
Ход работы. В пять пробирок наливают растворы уксусной кислоты и
уксуснокислого натрия в количествах, указанных в таблице, после чего в
каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора желатина и хорошо перемешивают, затем прибавляют по 4 мл этилового спирта (или по 1 мл раствора
танина) и снова перемешивают. Через 5−10 минут просматривают все пробирки и оценивают степень мутности смеси в каждой из них. рН наиболее
мутной смеси соответствует изоэлектрической точке желатина. Результаты
опыта записывают в таблицу.
Определение изоэлектрической точки белка
Состав буферной смеси,
мл
0,1 н
CH 3COONа
1
1,8
0,2
3,8
1
4
2
1,4
0,6
4,4
1
4
3
3
1,0
1,0
4,7
1
4
5
4
0,6
1,4
5,1
1
4
4
5
0,2
1,8
5,7
1
4
3
№
пробирки
0,1 н
СН3СООН
Степень
мутности
(по пятибалльной
системе)
1
рН
смеси
0,5%-ный
раствор
желатина,
мл
Этиловый
спирт,
мл
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Для изучения структур и функций белков требуется выделение и очистка их с минимальным количеством примесей, а в идеале − до гомогенного
состояния.
Реакции осаждения белков могут быть обратимыми и необратимыми.
В первом случае белки не подвергаются глубоким изменениям, поэтому получаемые осадки могут быть вновь растворены в первоначальном растворителе с сохранением своих нативных свойств. При необратимых реакциях
белки подвергаются глубоким изменениям.
Белковая молекула в растворе удерживается двумя факторами: зарядом
и гидратной оболочкой. Снятие заряда осуществляется путем подведения
рН к изоэлектрической точке. Удаление гидратной оболочки производится
водоотнимающими средствами (органические растворители, соли щелочноземельных металлов в высокой концентрации), изменением температуры
и др. Для осаждения белка необходимо устранить оба фактора устойчивости белковой молекулы.
1.3 Тепловая денатурация белков
Реактивы: раствор яичного белка (без добавления NaCl); растворы растительных белков; 1%-ный раствор CH3COOH; 10%-ный раствор
СН3СООН; 10%-ный раствор NaOН; насыщенный раствор NaСl.
Свертывание большинства белков начинается уже при температуре
50 – 55 °С. Воздействие высокой температуры ведет к тепловой денатурации белков, в результате которой происходят необратимые изменения
физико-химических и биологических свойств макромолекул. Нагревание
вызывает разрыв дисульфидных связей между полипептидными цепями
(разрушение вторичной и третичной структур), что приводит к их раскручиванию и изменению конформации макромолекул. В результате развертывания полипептидных цепей на поверхность белковой молекулы выходят
гидрофобные группы. При этом белок теряет растворимость, агрегирует и
выпадает в осадок. При кратковременном нагревании (при относительно
невысоких температурах) денатурация может и не произойти или проявиться в слабой степени, дальнейшее же повышение температуры (а особенно
при кипячении) ведет к быстрому свертыванию белка.
На скорость и интенсивность процесса тепловой денатурации оказывают большое влияние рН раствора и добавление электролитов. Быстро и
наиболее полно белки свертываются в изоэлектрической точке. Сдвиги рН
в кислую и щелочную стороны затормаживают процесс осаждения белков.
В сильно кислых и в сильно щелочных растворах осаждения белков при
кипячении практически не происходит. При добавлении кислот молекулы
белка заряжаются положительно, а в щелочных растворах они приобретают
отрицательные заряды.
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Прибавление электролитов (например, NaCI) ускоряет процесс коагуляции даже в кислой среде.
Ход работы. В пять пробирок наливают по 1−2 мл раствора яичного
или растительного белка. Белок в первой пробирке нагревают до кипения:
раствор мутнеет (разрушаются гидратные оболочки вокруг белковых частиц), но осадок не выпадает, так как мицеллы сохраняют одноименные
заряды, что препятствует их коагуляции.
К раствору белка во второй пробирке добавляют одну каплю 1%-ного
раствора уксусной кислоты СН3СООН и нагревают: осадок белка выпадает
быстро, поскольку заряд мицелл нейтрализован и белок близок к изоэлектрическому состоянию.
К раствору белка в третьей пробирке прибавляют 5 – 8 капель 10%-ного
раствора уксусной кислоты СН3СООН и нагревают до кипения: осадок не
образуется, так как мицеллы белка приобрели положительные заряды, что
является стабилизирующим фактором и препятствует коагуляции.
В четвертую пробирку добавляют 5 – 8 капель 10%-ного раствора едкого натра NaOH и нагревают до кипения: осадок не выпадает, поскольку
мицеллы заряжены отрицательно.
В пятую пробирку прибавляют 4 – 5 капель 10%-ного раствора уксусной кислоты СН3СООН и 5 – 6 капель насыщенного раствора хлористого
натрия NaCI, нагревают до кипения − белок выпадает в осадок.
1.4 Осаждение белков солями тяжелых металлов
Реактивы: раствор яичного белка; раствор растительного белка:
5%- ный раствор (СН3СОО)2Рb; 2,5%-ный раствор AgNO3; 5%-ный раствор FеСl3; 5%-ный раствор СuSO4.
Белки осаждаются солями меди, свинца, ртути, цинка, серебра и других
тяжелых металлов.
Характер взаимодействия белков с ионами тяжелых металлов сложен
и многообразен. Это прежде всего образование комплексных соединений, не растворимых в воде, но растворяющихся в избытке соли (кроме
AgNО3 и HgCl2); соли тяжелых металлов, адсорбируясь на белковых мицеллах, изменяют их электрический заряд (вплоть до полной нейтрализации). Денатурация белков солями тяжелых металлов вызывается глубокими нарушениями вторичной и третичной структур макромолекул белка, изменением положения пептидных цепей, которое обусловливается в
основном разрывом связей между ними (главным образом дисульфидных).
Дисульфидным связям принадлежит видная роль в поддержании вторичной и третичной структур белка. Разрыв их влечет за собой изменение
структур – необратимую денатурацию белка.
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Растворение осадка белков в избытке соли объясняется явлением адсорбционной пептизации. Ионы металла, адсорбируясь на поверхности
белковых мицелл, придают им положительные заряды. Одноименно заряженные мицеллы отталкиваются, что способствует их переходу из осадка
в раствор.
Свойство белков связывать ионы тяжелых металлов используется в медицине при оказании первой помощи пострадавшим от отравления солями
меди, свинца, ртути и др.
Ход работы. В четыре пробирки наливают по 1 – 2 мл раствора белка
и по каплям добавляют растворы солей: в первую – ацетата свинца, во вторую − сульфата меди, в третью − хлорида железа (III), в четвертую − нитрата
серебра (до выпадения осадков). Затем прибавляют избыток указанных реактивов и наблюдают растворение осадков в первых трех пробирках. Осадок,
вызванный прибавлением нитрата серебра, не растворяется в избытке соли.
1.5 Методика решения задач
Как заряжены частицы белка при рН = 4,0, если ИЭТ этого белка
равна 8,5?
Дано:
Решение:
рН = 4,0
Изоэлектрическая точка данного белка − значение рН
ИЭТ = 8,5
раствора белка, при котором белок становится электронейтральным, т.е. суммарный заряд белковой моКак заряжены
лекулы равен нулю.
частицы белка?
Таким образом, при рН = 8,5 число противоположно
заряженных ионов NH3+ и СОО− равно. При смещении
рН к 4,0, т.е. в кислую сторону, увеличится концентрация ионов Н+. В результате заряд на группе NH3+
сохраняется, а диссоциация по карбоксильной группе
подавляется:
В результате суммарный заряд белковой молекулы будет иметь положительный знак.
Ответ: суммарный заряд белковой молекулы будет
иметь положительный знак.
1.6 Контрольные задания
1. От чего зависти скорость седиментации белков: а) от числа растворенных молекул; б) от молекулярной массы белка; в) от плотности растворителя разделяемых белков?
12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. Подберите к каждому уровню структурной организации белка (первичная, вторичная и т.д.) соответствующее понятие: а) конформация пептидного остова, в формировании которого участвуют водородные связи
между всеми пептидными группировками; б) порядок чередования аминокислот в белках; в) пространственное расположение и характер взаимодействия пептидных цепей в олигомерном белке; г) конформация полипептидной цепи, стабилизированная связями между радикалами аминокислот.
3. Как влияет реакция среды на диссоциацию белка и заряд частицы
белка? Напишите реакции диссоциации аминокислоты в нейтральной, кислой и щелочной среде.
4. Дать определение понятий − изоэлектрическое состояние и изоэлектрическая точка коллоидных систем. Как изменяются свойства коллоидных
систем в изоэлектрическом состоянии?
5. В чем сущность процесса осаждения белков? Что такое высаливание
и денатурация белков? Каков механизм этих процессов?
6. Как заряжены частицы белка при рН = 9,0, если ИЭТ этого белка
равна 7,5?
7. Белок помещен в буферный раствор с рН = 5,5. Его ИЭТ равна 4,8.
Как будут заряжены частицы белка?
8. ИЭТ желатина равна 4,7. Как будут заряжены частицы белка, если
поместить его в раствор с рН = 3; 6,5; 4,7? Ответ обоснуйте.
1.7 Тестовые вопросы для самоконтроля
1. К каким сложным белкам относят муцин слюны?
а) гликопротеины
б) нуклеопротеины
в) металлопротеины
г) фосфопротеины
д) липопротеины
2. Выберите аминокислоту, не входящую в состав белков:
а) β-аланин
б) α-аланин
в) триптофан
г) γ-аминомасляная кислота
д) пролин
3. Какая аминокислота является полярной?
а) аспарагиновая кислота
б) глицин
в) изолейцин
г) треонин
д) фенилаланин
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4. Какая аминокислота заряжена отрицательно при рН = 7?
а) глутаминовая кислота
б) аргинин
в) фенилаланин
г) цистеин
д) аспарагин
5. В какой среде находится ИЭТ кислых аминокислот?
а) нейтральной
б) слабокислой
в) сильнокислой
г) сильнощелочной
д) слабощелочной
6. Какая реакция является качественной на ароматические аминокислоты?
а) реакция Фоля
б) ксантопротеиновая реакция
в) нингидриновая реакция
г) реакция Пиотровского
д) реакция Сакагучи
7. Какая реакция является качественной на серосодержащие аминокислоты?
а) реакция Фоля
б) ксантопротеиновая реакция
в) нингидриновая реакция
г) реакция Пиотровского
д) реакция Сакагучи
8. Какие аминокислоты являются незаменимыми?
а) аланин
б) аргинин
в) триптофан
г) серин
д) треонин
9. Какая пространственная структура белка образована за счет взаимодействия между радикалами аминокислот?
а) первичная
б) третичная
в) вторичная
г) четвертичная
д) гексагональная
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
10. Суммарный заряд дипептида глу-арг при рН = 7 равен:
а) 0
б) -1
в) +1
г) -2
д) +3
Ответы: 1а, 2 а,г, 3а, 4а, 5б, 6б, 7а, 8б,в д, 9б, 10а.
2 ФЕРМЕНТЫ (ЭНЗИМЫ)
Ферменты (энзимы) − биологические катализаторы процессов обмена веществ. Они представляют собой высокомолекулярные соединения и
относятся к простым или сложным белкам. По характеру своего действия
ферментативный катализ чаще всего является гетерогенным (микрогетерогенным).
Обладая многими свойствами, сходными со свойствами неорганических катализаторов, ферменты характеризуются рядом особенностей, к
которым следует отнести термолабильность, большую зависимость их
активности от рН среды, высокую специфичность (как групповую, так и
индивидуальную, включая стереохимическую), огромную эффективность
каталитического действия и др. Протекает ферментативный катализ с большой скоростью и в мягких условиях.
Активность ферментов в значительной мере зависит от состава среды.
Многие химические вещества способны усиливать (активаторы) или затормаживать (ингибиторы) каталитическую активность ферментов. Ферменты
можно разделить на две большие группы: ферменты-протеины (простые
белки) и ферменты-протеиды (сложные белки). К протеинам относятся
многочисленные ферменты, катализирующие процессы гидролитического
расщепления сложных соединений на более простые (например, пепсин,
амилазы, уреаза и др.).
Ферменты-протеиды состоят из белковой части − апофермента и термостабильной небелковой − кофермента (легко диссоциирует с белковой частью), или простетической группы (прочно связана с белком). В большинстве
своем коферменты − это сопряженные (резонансные) органические молекулы.
Многие простетические группы представляют собой производные
витаминов (главным образом группы В). Часто роль кофермента играют
металлы (железо, магний, медь, кобальт, цинк, марганец, молибден).
Ферментативный катализ идет на поверхности фермента. Превращаемые вещества называются субстратами. Превращение субстрата происходит в области активного центра, который сформирован в третичной
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
структуре большинства ферментов. У простых белков-ферментов активный
центр образован сближенными в пространстве радикалами аминокислот
первичной структуры. У сложных ферментов и активный центр сложный,
двухкомпонентный, состоящий из аминокислотных остатков, соединенных
с небелковой частью молекулы. В активном центре выделяют две части:
субстратная (радикалы аминокислот обеспечивают фиксацию субстрата) и
каталитическая (радикалы аминокислот и (или) кофакторы обеспечивают
катализ).
Ферментативная реакция протекает в три стадии: 1) образование фермент субстратного комплекса: E + S ↔ ES − быстрая стадия, соответствующая фиксации субстрата на субстратном (якорном) участке активного центра. Ускорение реакции достигается за счет сближения и правильной ориентации субстратов относительно друг друга и увеличения их эффективной
концентрации (поскольку в растворе их столкновения случайны); 2) происходит химическая реакция через переходное состояние с образованием
продукта реакции на поверхности фермента: ES → EZ → EP. Как правило,
субстрат вступает во временные промежуточные реакции с определенными
функциональными группами активного центра, в результате чего реакция
требует более низкой энергии активации; 3) продукт отделяется, а фермент
в неизменном виде может вновь вступать в катализ: EP →E + P.
В соответствии с рекомендациями Международного биологического
союза (1961 г.) все ферменты разделены на шесть классов.
Оксидоредуктазы. Катализируют окислительно-восстановительные
реакции. Оксидоредуктазы подразделяются на две большие группы: а) дегидрогеназы, катализирующие процесс окисления органических веществ
путем отнятия водорода и переноса его на другой субстрат; б) оксидазы,
катализирующие перенос водорода с субстрата, подвергающегося окислению, на кислород.
Трансферазы. Эти ферменты катализируют реакции переноса атомных
групп (аминогрупп, остатков фосфорной кислоты, метильных групп и т.д.).
Гидролазы. Катализируют реакции гидролитического распада сложных соединений на более простые. К этому классу относятся многочисленные ферменты, действующие на сложно-эфирные связи (эстеразы, например, липазы, катализирующие процесс гидролитического расщепления
липидов), гликозильные соединения (например, гликозидазы, катализирующие гидролитический распад поли- и олигосахаридов), пептидные связи
(пептидазы или пептидгидролазы), кислотноангидридные (полифосфатазы) и др.
Лиазы. Катализируют негидролитическое отщепление от субстратов
определенных групп с образованием двойной связи.
16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Изомеразы. Ферменты, отнесенные к этому классу, катализируют разнообразные реакции изомеризации, например превращение цис-формы в
трансформу, взаимопревращение альдоз и кетоз, внутримолекулярный перенос групп (в последнем случае ферменты называют мутазами) и т.д.
Лигазы (синтетазы). Катализируют присоединение друг к другу двух
молекул, сопряженное с разрывом пирофосфорной связи в молекуле АТФ
(или аналогичных трифосфатов). Сюда относятся ферменты, образующие
связи между молекулами углерода и кислорода, серы, азота или между двумя молекулами углерода.
При диагностике различных заболеваний используют показатели активности десятков ферментов и изоферментов. В клинической практике
часто определяют активность аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), щелочной фосфатазы (ЩФ), глутаматдегидрогеназы (ГлДГ), аргиназы, уракиназы, гистидазы, алкогольдегидрогеназы, цитохромоксидазы, транскетолазы, амилазы,
сорбитолдегидрогеназы и др.
Например, автоматический биохимический анализатор «Selectra» позволяет определять содержание ферментов, электролитов, специфических
белков в сыворотке, плазме, моче, спинномозговой жидкости (рис. 1).
Рис. 1 – Автоматический биохимический анализатор «Selectra»
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2.1 Исследование общих свойств ферментов
Ферментативный гидролиз крахмала. Ферментативный гидролиз
крахмала протекает под влиянием ферментов амилаз, которые содержатся
в слюне, соке поджелудочной железы, крови, печени, мозге. Источниками
амилаз в промышленности служат проросшие зерна злаков (солод) и культуры плесневых грибов.
Известны α- и β-амилазы, которые несколько различаются по характеру действия. Под влиянием α-амилазы процесс гидролитического расщепления крахмала задерживается главным образом на стадии декстринов, а мальтозы образуется немного, тогда как под действием β-амилазы
расщепление идет в сторону преимущественного образования мальтозы.
Последовательно этот процесс можно представить следующим образом:
Крахмал
Растворимый крахмал
Амилодекстрины (фиолетово-синее окрашивание с йодом)
Эритродекстрины (буровато-красное окрашивание с йодом)
Ахроодекстрины (желтое или буровато-желтое окрашивание с йодом)
Мальтодекстрины (с йодом не дают окрашивания)
Мальтоза
Мальтоза под действием фермента мальтазы (α-глюкозидазы) распадается на две молекулы α-D-глюкозы. Встречается также фермент глюкоамилаза, катализирующий распад крахмала до глюкозы.
Реактивы: а) слюна. Свежую слюну разводят в 10 раз дистиллированной водой; б) крахмал, 1%-ный раствор; в) раствор йода в йодистом калии
(раствор Люголя): в нескольких миллилитрах воды растворяют 1 г йодистого калия, в концентрированном растворе соли растворяют 1 г йода и
доливают водой до 300 мл; г) едкий натр, 5%-ный раствор; д) серно-кислая
медь, 5%-ный раствор.
В две пробирки наливают по 2 мл 1%-ного раствора крахмала, в одну из
них добавляют 1 мл разведенной слюны (1 : 10), в другую − 1 мл воды и ставят на 10 мин в водяную баню, нагретую до 37−38 °С (внимательно следят
за температурой, не допуская ее повышения), или, еще лучше, в ультратермостат, после чего охлаждают пробирки под краном. Проделывают реакции
Троммера и с йодом, для чего содержимое каждой пробирки делят пополам.
Инактивация ферментов высокой температурой. Являясь белковыми веществами, ферменты весьма чувствительны к температуре, при которой протекает реакция. Температурный оптимум действия ферментов
теплокровных животных составляет 37−38 °С. При небольшом повышении
температуры (например, 40−45 °С) скорость ферментативных реакций вначале повышается, но уже при дальнейшем нагревании (выше 50 °С) падает,
18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
а при 70−80 °С утрачивается. Кипячение влечет за собой полную потерю
каталитической активности ферментов вследствие денатурации их белковой части (апоферментов). При температурах ниже нуля скорость ферментативных реакций значительно понижается, но сами ферменты не разрушаются и при осторожном оттаивании восстанавливают свою активность.
Реактивы: а) слюна, разведенная в 5 раз дистиллированной водой;
б) крахмал, 1%-ный раствор; в) раствор йода в йодистом калии (см. предыдущую работу); г) реактивы для реакции Троммера (см. предыдущую работу).
В две пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны. Содержимое
одной из них нагревают до кипения и кипятят 2−3 мин. Затем в обе пробирки добавляют по 1 мл раствора крахмала и ставят на 10 мин в водяную
баню, нагретую до 38 °С, после чего проделывают реакции Троммера и с
йодом. Убеждаются, что в пробирке, в которой фермент был инактивирован
кипячением, расщепления крахмала не произошло.
Специфичность действия ферментов. Это одно из важнейших
свойств ферментов. Каждый фермент воздействует лишь на определенное
вещество или группу веществ, близких по своей структуре. Различают следующие виды специфичности: а) абсолютную, когда ферменты катализируют лишь одну реакцию превращения какого-либо вещества. Например,
уреаза (карбамид-амидогидролаза) катализирует только реакцию гидролитического расщепления мочевины до аммиака и двуокиси углерода; б) групповую, когда ферментом катализируются реакции превращения близких
по своей структуре веществ, построенных по одному типу. Так сахараза
(β-фруктофуранозидаза) катализирует реакцию гидролитического расщепления сахарозы с освобождением молекул глюкозы и фруктозы, но тот же
фермент катализирует также реакцию частичного гидролиза трисахарида
фосфатиды (α-галактозидо-α-глюкозидо-β-фруктозида), при которой освобождается лишь молекула фруктозы, а связь между галактозой и глюкозой
остается ненарушенной; в) стереохимическую, которая проявляется в том,
что фермент катализирует реакцию расщепления или синтеза только одного из стереоизомеров, не воздействуя на другой. Окисление L-молочной
кислоты до пировиноградной катализируется ферментом лактатдегидрогеназой, тогда как тот же процесс у D-молочной кислоты катализируется
другим ферментом − D-лактатдегидрогеназой.
Реактивы: а) слюна, разведенная в 10 раз дистиллированной водой;
б) сахароза, 1%-ный раствор; в) крахмал, 1%-ный раствор; г) реактивы,
для реакции Троммера.
В две пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны, затем в одну из
них добавляют 1 мл раствора сахарозы, а в другую − столько же раствора
крахмала. Обе пробирки прогревают 10 мин в водяной бане при температуре 38 °С, после чего охлаждают и с содержимым каждой из них проделы19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
вают реакцию Троммера. Убеждаются, что амилаза катализировала лишь
процесс гидролитического расщепления крахмала и не оказала действия на
сахарозу.
Влияние рН среды на активность амилазы слюны. Каждый фермент
проявляет максимум своего каталитического действия при строго определенном рН среды. Наивысшую активность многие ферменты проявляют в
изоэлектрической точке.
Оптимальное значение рН для пепсина составляет 1,5−2,0, амилазы
слюны − 6,8−7,0, трипсина − 7,8, липазы поджелудочной железы − 7,0−7,8.
Было, однако, показано, что ферменты, катализирующие одни и те же реакции, но выделенные из различных субстратов, проявляют оптимум действия при неодинаковых значениях рН. Так, оптимум действия кишечной
сахаразы наблюдается при рН 6,2, а сахаразы, выделенной из дрожжей,−
при рН 4,8−5,0. Оптимум рН амилазы слюны составляет 6,8−7,0, а амилаза
солода проявляет максимум каталитической активности при рН 4,4 − 4,5.
Реактивы: а) слюна, разведенная дистиллированной водой в 100 раз;
б) крахмал, 0,5%-ный раствор; в) лимонная кислота, 0,1 М раствор
(19,212 г кислоты в 1 л); г) фосфорно-кислый натрий двузамещенный,
0,2 М раствор (содержит 36,62 г соли в 1 л); д) раствор Люголя (раствор
йода в йодистом калии); е) хлористый натрий, 1%-ный раствор.
В семь однотипных пробирок пипетками наливают растворы лимонной
кислоты и фосфорнокислого натрия в количествах, указанных в таблице,
получая, таким образом, буферные смеси со значениями рН от 5,6 до 8,0.
В каждую пробирку добавляют по 10 капель 1%-ного раствора хлористого
натрия, 0,5%-ного раствора крахмала, разведенной в 100 раз слюны и перемешивают.
Фосфатно-цитратные буферные смеси
20
Номер
пробирки
Количество
0,2 М раствора
Количество
0,1 М раствора
рН буферной
смеси
1
0,58
0,42
5,6
2
0,63
0,37
6,0
3
0,69
0,31
6,4
4
0,77
0,23
6,8
5
0,87
0,13
7,2
6
0,94
0,06
7,6
7
0,97
0,03
8,0
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Пробирки ставят на 10 мин в водяную баню при температуре 38 °С, после чего быстро охлаждают, добавляют во все пробирки по 1 капле раствора
Люголя, перемешивают и наблюдают окраску. Устанавливают, при каком рН
произошло наиболее полное расщепление крахмала (желтая или буроватожелтая окраска с йодом). Реакция весьма специфична и показательна.
Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы. Активаторы ферментов – это вещества: 1) формирующие активный центр фермента (Co2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Ca2+); 2) облегчающие образование ферментсубстратного комплекса (Mg2+); 3) восстанавливающие SH-группы (глутатион, цистеин, меркаптоэтанол); 4) стабилизирующие нативную структуру
белка-фермента. Активируют ферментативные реакции обычно катионы
металлов (в таблице Менделеева с 19 по 30-й).
Ингибиторы ферментов – это соединения, которые, взаимодействуя с ферментом, препятствуют образованию нормального ферментсубстратного комплекса, уменьшая тем самым скорость реакции или прекращая ее. Ингибиторы делят на две группы: неспецифические, вызывающие денатурацию белка-фермента (соли тяжелых металлов, кислоты,
щелочи и др.); специфические, действие которых связано с механизмами
ферментативного катализа.
Реактивы: а) слюна, разведенная дистиллированной водой в 10 раз;
б) дистиллированная вода; в) хлорид натрия, 1%-ный раствор; г) сульфат
меди, 1%-ный раствор; д) крахмал, 1%-ный раствор; е) раствор Люголя.
В три пробирки наливают по 1 мл разведенной слюны, затем в одну из
них добавляют 2 капли дистиллированной воды, во вторую – 2 капли раствора хлорида натрия, в третью – 2 капли раствора сульфата меди. В каждую пробирку добавляют по 5 капель раствора крахмала и перемешивают.
Через 5 минут в каждую пробирку добавляют по 1 капле раствора Люголя,
перемешивают и наблюдают окраску. Делают соответствующие выводы.
Кинетика действия липазы. Липолитические ферменты поджелудочной железы гидролизуют жиры пищи в тонком кишечнике. Изучая кинетику липазы, можно проследить в динамике активность фермента и обозначить факторы, влияющие на этот процесс.
Реактивы: а) молоко, разведенное в 10 раз дистиллированной водой;
б) дистиллированная вода; в) липаза из поджелудочной железы; г) 0,01 н
раствор гидроксида натрия; д) фенолфталеин.
В две пробирки наливают по 10 мл разведенного молока, в одну из них
добавляют 1 мл воды (контроль). Затем в обе пробирки добавляют по 1 мл
липазы и инкубируют смеси при 37 °С до инкубации, а также через 15, 30
и 45 мин после ее начала отбирают пробы по 2 мл из каждой пробирки.
Титруют пробы 0,01 н раствором NaOH до розовой окраски в присутствии
1 – 2 капель фенолфталеина. Количество жирных кислот, освободившихся
21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
при действии липазы на триацилглицерины молока, эквивалентно количеству щелочи, прореагировавшей при титровании. Строят график зависимости освобождающихся жирных кислот (мл 0,01 н NaOH – ось ординат)
от времени (мин – ось абсцисс). Делают выводы о зависимости скорости
реакции от времени.
Определение молокоствораживающей активности пепсина. Метод
основан на способности пепсина коагулировать казеин молока.
Реактивы: а) ацетатный буфер; б) обезжиренное молоко; в) раствор
пепсина.
Готовят молочно-ацетатную смесь, смешивая равные объемы молока и
ацетатного буфера. В пробирку вносят 5 мл смеси, добавляют 0,1 мл раствора фермента. Затем содержимое пробирок перемешивают и постоянно энергично встряхивают, наблюдая за стекающим по стенкам молоком.
Время от момента добавления источника фермента до появления на стенках пробирок мелких хлопьев казеина точно фиксируют по секундомеру.
Температура смеси 30 °С.
2.2 Количественное определение каталазы
крови по Баху
Каталаза − фермент, разлагающий перекись водорода по уравнению:
2Н2О2 → 2Н2О + О2.
Каталаза содержится в большем или меньшем количестве во всех тканях и жидкостях организма, особенно много в красных кровяных шариках
человека и животных.
Количественное определение каталазы крови сводится к определению
так называемого «каталазного числа».
Каталазным числом называется количество мл Н2О2, которое разлагается в 1 мл исследуемой крови за 30 мин. Принцип определения каталазного
числа основывается на следующей реакции:
2КМnО4 + 5Н2О2 + 4H2SO4 → 2KHSO4 + 2КМnSO4 + 8Н2О + О2,
т.е. по количеству разрушенной H2O судят об активности каталазы.
Реактивы: а) кровь, б) дистиллированная вода, в) перекись водорода,
г) серная кислота, 10%-ный раствор; д) КМnО4, 0,1 н раствор.
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Наливают в колбочку 20 мл воды. Вносят микропипеткой 0,02 мл исследуемой крови, предварительно обтерев кончик капилляра от приставшей снаружи крови, пипетку промывают путем всасывания и выпускания
обратно жидкости. Получается раствор крови 1:1000. Отмеряют в две колбочки по 7 мл дистиллированной воды. В одну колбу вносят 1 мл основного
раствора крови. В другую колбу вносят 1 мл основного раствора крови,
предварительно прокипяченного (разрушена каталаза). Оставляют стоять
обе колбочки при комнатной температуре на 30 мин, предварительно прилив в каждую колбочку по 2 мл Н2О2. Через 30 мин приливают в каждую
колбочку по 3 мл раствора H2SO4 и оттитровывают содержимое колбочки
раствором КМnО4 до появления розового окрашивания, неисчезающего в
течение 30 с.
Вычисление «каталазного числа». Вычесть из количества мл КМnО4,
пошедшего на титрование контрольной пробы, количество мл КМnО4, пошедшее на титрование опытной пробы. Разницу умножить на 1,7 – получается каталазное число в миллиграммах, граммэквивалент H2O =17.
2.3 Контрольные задания
1. Перечислите основные свойства ферментов.
2. Какие центры выделяют в составе ферментов? Охарактеризуйте каждый центр простого и сложного ферментов.
3. Что понимают под активностью фермента? Какие факторы определяют активность ферментов?
4. Что представляют собой мультиферментные комплексы?
5. Заполните таблицу
Витамин
Тиамин
Рибофлавин
Никотинамид
Пиридоксин
Пантотеновая кислота
Биотин
Кофермент
Тип катализируемой реакции
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6. Заполните таблицу
Фермент
Каталаза
Пероксидаза
Липаза
Щелочная фосфатаза
Гиалуронидаза
Уреаза
Пепсин
Амилаза
Гексокиназа
Трипсин
Карбоксилаза
Класс
Тип катализируемой реакции
7. Что такое проферменты и изоферменты?
2.4 Тестовые вопросы для самоконтроля
1. Чем обусловлена специфичность действия ферментов?
а) их биологической активностью
б) комплементарностью активного центра фермента субстрату
в) их пептидной природой
г) регулируемостью по принципу обратной связи
д) наличием изомеров
2. Какую реакцию катализирует фермент глюкокиназа?
а) дефосфорилирование глюкозо-6-фосфата
б) фосфорилирование глюкозы
в) образование фруктозо-6-фосфата
г) синтез АТФ
д) синтез глюкозы
3. Каким видом специфичности обладает фермент, катализирующий
превращение только одного субстрата?
а) абсолютной специфичностью
б) групповой специфичностью
в) стереоспецифичностью
г) относительной групповой специфичностью
д) комплементароной специфичностью
4. На ферментативную активность фермента влияют:
а) наличие или отсутствие неорганического фосфата
б) рН среды
в) температура
г) присутствие активаторов и ингибиторов
д) наличие определенного уровня белка в крови
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5. Константа Михаэлиса показывает:
а) концентрацию субстрата, при которой скорость ферментативной
реакции составляет половину максимальной
б) концентрацию фермента, при которой скорость ферментативной
реакции составляет половину максимальной
в) концентрацию витамина, при которой скорость ферментативной
реакции составляет половину максимальной
г) концентрацию субстрата, при которой скорость ферментативной
реакции максимальна
д) концентрацию субстрата, при которой скорость ферментативной
реакции составляет половину минимальной
6. Константа Михаэлиса измеряется в:
а) единицах концентрации субстрата
б) единицах концентрации фермента
в) единицах концентрации активного центра
г) единицах объема субстрата
д) активностях
7. Уникальное сочетание нескольких аминокислотных остатков, участвующих в присоединении и превращении субстрата, называется:
а) активный центр фермента
б) каталитический центр фермента
в) кофермент-связывающий домен
г) кофермент
д) простетическая группа
8. Какое название носит комплекс белка-фермента со своим коферментом?
а) апофермент
б) изофермент
в) кофактор
г) простетическая группа
д) холофермент
9. Под активностью фермента понимают:
а) скорость катализируемой реакции
б) объем катализируемой реакции
в) синтез проферментов
г) скорость классификации ферментов
д) скорость катализируемой витаминами реакции
10. Коферментами, образующимися из витамина В2 (рибофлавина), являются:
а) флавинмононуклеотид
б) флавинадениндинуклеотид
в) никотинамидадениндинуклеотид
25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
г) аденозинтрифосфорная кислота
д) никотинамидадениндинуклеотидфосфат
Ответы: 1б, 2б, 3а, 4б,в,г, 5а, 6а, 7а, 8д, 9а, 10а,б.
3 ВИТАМИНЫ
Витамины – низкомолекулярные вещества, относящиеся к различным
классам органических соединений. Они условно объединены в одну группу по признаку жизненной необходимости для организма. Витамины – непременные участники важнейших физиологических и биохимических процессов у животных, растений и микроорганизмов. Многие из них входят в
состав простетических групп двухкомпонентных ферментов или являются
веществами, служащими для синтеза указанных соединений, активируют
некоторые ферментные системы.
В основном витамины синтезируются растениями, с которыми главным образом и поступают в организм человека и животных. Некоторые из
них образуются симбиотической микрофлорой пищеварительного тракта.
Недостаточное содержание витаминов в пище и кормах, а также нарушение их всасывания в организме ведут к развитию тяжелых нарушений
обмена веществ, известных под названием гиповитаминозов и авитаминозов. Заболевание, возникающее в результате отсутствия того или иного витамина в пище, называют авитаминозом. При относительной недостаточности какого-нибудь витамина наблюдается гиповитаминоз.
Функции витаминов тесно связаны между собой, поэтому обычно наблюдаются полиавитаминозы или полигиповитаминозы. Авитаминозы
встречаются весьма редко, чаще же наблюдаются гиповитаминозы как
результат нерационального питания. Избыточный прием ряда витаминов
ведет к нарушениям обменных функций, известных под названием гипервитаминозов.
В основу классификации витаминов положена их растворимость. По
этому признаку витамины делят на две группы: а) витамины, растворимые
в жирах и органических растворителях; б) витамины, растворимые в воде.
Растворимыми в жирах и органических растворителях являются: 1) витамины группы А; 2) витамины группы D; 3) витамины группы Е; 4) витамины группы К; 5) непредельные (полиненасыщенные) жирные кислоты,
имеющие две и больше двойных связей.
Растворимыми в воде являются: 1) витамины группы В: В1 − тиамин,
В2 − рибофлавин, РР − никотинамид, B6 − пиридоксин, Н − биотин, пантотеновая и парааминобензойная кислоты, холин, инозит, фолиевая кислота,
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В12 – цианкобаламин, В15 − пангамовая кислота; 2) витамин С (аскорбиновая кислота); 3) витамин Р (биофлавоноиды).
Для своевременного выявления гиповитаминозов, помимо исследования кормов, проверяют содержание витаминов в крови, молозиве, молоке,
моче, печени и других тканях, используют косвенные показатели. При изучении обмена витаминов применяют биологические, химические, физикохимические, изотопные и другие методы. В биологических субстратах содержание витаминов чаще определяют с помощью колориметрических,
спектрофотометрических, спектрофлуориметрических и газохроматографических методов.
Например, жидкостный хроматограф «Хромос ЖХ-301» со спектрофотометрическим детектором позволяет определять содержание витамина
А и группы В, гормоны, пестициды, консерванты, ароматические соединения (рис. 2).
Рис. 2 – Жидкостный хроматограф «Хромос ЖХ-301»
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3.1 Качественные реакции на витамины
Витамины группы А
Общие сведения. К группе витаминов А относятся несколько веществ,
близких по строению и физиологическим функциям.
Витамин А1 (ретинол) образуется при расщеплении желто-оранжевых
пигментов растений − каротиноидов − в печени и слизистой оболочке тонких кишок при участии фермента каротиназы.
СН3
СН3
СН3
СН3
СН = СН С=СН СН=СН С=СН СН2ОН
СН3
Витамин А1 (ретинол)
Таким образом, каротиноиды являются провитаминами витамина А.
В витамин А1 превращаются α-, β-, γ-каротины, криптоксантин и некоторые другие каротиноиды. Наиболее активен β-каротин, в состав молекулы
которого входят два кольца β-ионона:
СН3
СН3
СН3
СН3
СН3
СН3
СН3
СН3
СН =СН С=СН СН=СН С=СН СН=СН СН =С СН =СН СН =С СН =СН
Н3 С
β-каротин
СН3
При расщеплении симметричной молекулы β-каротина освобождаются
две молекулы витамина А1.
Витамин А2 (дегидроретинол) найден в печени пресноводных рыб. Он
отличается от витамина А1 наличием добавочной двойной связи в кольце
β-ионона:
СН3
СН3
СН3
СН3
СН =СН С=СН СН=СН С=СН СН2ОН
СН3
Витамин А2 (дегидроретинол)
Качественные реакции на витамины группы А. Реакция с серной
кислотой. Под воздействием концентрированной серной кислоты растворы
витамина А приобретают сине-фиолетовую окраску, возникновение кото28
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
рой связано с водоотнимающим действием реактива. Окраска является нестойкой и быстро сменяется буроватой вследствие образования липохрома.
Реактивы: а) рыбий жир, медицинский. Употребляют только свежий
препарат; б) серная кислота, концентрированная (р2о= 1,836); в) хлороформ.
1 каплю рыбьего жира растворяют в 20−25 каплях хлороформа, к раствору добавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты и встряхивают. Появляется сине-фиолетовое окрашивание, которое вскоре переходит в
красновато-бурое и бурое.
Витамины группы D (кальциферолы)
Общие сведения. Витамины группы D являются веществами стероидной природы. Наибольшее практическое значение имеют витамины D2
(эргокальциферол) и D3 (холекальциферол).
Витамин D2 образуется из эргостерина при облучении ультрафиолетовыми лучами. Значительные количества эргостерина найдены в дрожжах и
спорынье (содержится также в зеленых растениях). Процесс превращения
эргостерина в эргокальциферол требует затраты тепловой энергии и протекает при температуре около 80 °С:
СН3
СН −СН = СН − СН −СН − СН3
СН3
СН3
СН3 СН3
Эргостерин
СН3
НО
СН −СН = СН − СН −СН − СН3
СН2
НО
СН3
СН3 СН3
Витамин D2
Качественные реакции на витамины группы D. Реакция с анилином. Реактивы: а) рыбий жир, витаминизированный, б) анилин, в) соляная
кислота, концентрированная.
К 1 мл витаминизированного рыбьего жира прибавляют 4 – 5 мл анилина и 0,5 мл концентрированной соляной кислоты. Содержимое пробирки
нагревают до кипения и кипятят 20 – 30 с. Жидкость принимает красную
окраску.
29
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Реакция с бромом. Реактивы: а) рыбий жир, витаминизированный,
б) раствор брома в хлороформе (1:60).
На часовом стекле смешивают 2–3 капли рыбьего жира и 3– 4 капли хлороформного раствора брома. Через некоторое время появляется зеленоватоголубое окрашивание.
Витамины группы E (токоферолы)
Общие сведения. К группе витаминов Е относятся несколько соединений, в основе строения которых лежит бициклическое ядро хромана, связанное с остатком спирта фитола.
6
7
5
4
8
1
3
2
О
Хроман
Как видно, хроман состоит из бензольного и пиранового циклов. В зависимости от количества метальных групп и их расположения различают α-,
β-, γ-, δ-, ε-, ζ- и η-токоферолы. Наибольшей витаминной активностью обладает α-токоферол, у которого бензольное кольцо является полностью замещенным:
СН3
НО
Н3С
О
СН3
СН3
СН3
СН3
СН3
(СН2)3 − СН (СН2)3 − СН(СН2)3 −СН −СН3
α-токоферол
Токоферолами богаты растительные масла, например соевое, подсолнечное, кунжутное, пшеничных зародышей, сафлоровое, арахисовое, хлопковое, льняное, рапсовое. Содержатся они также во многих продуктах растительного и животного происхождения: яйцах, печеночном жире трески,
молоке и сливочном масле, печени, говядине, кочанном салате, шпинате,
семенах арахиса, плодах шиповника, белой смородины и др. Суточная потребность человека в витамине Е составляет от 10 до 30 мг α-токоферола.
Качественные реакции на токоферолы. Реакция с азотной кислотой.
Реагируя с сильными окислителями, например с концентрированной азотной
кислотой, α-токоферол превращается в о-токоферилхинон, который затем образует соединение, окрашенное в красный или желтовато-красный цвет.
30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
O
O
СН3
Н3С
О
о-токоферилхинон
R
R-остаток фитола
СН3
Реактивы: а) масляный концентрат витамина Е, 0,15%-ный раствор
в абсолютном этиловом или бутиловом спирте, б) азотная кислота, концентрированная.
К нескольким каплям спиртового раствора витамина Е осторожно добавляют 8 –10 капель концентрированной азотной кислоты и пробирку
слегка встряхивают, через 1–2 мин содержимое пробирки приобретает
красное или желтовато-красное окрашивание.
Реакция протекает бурно, поэтому рекомендуется азотную кислоту
прибавлять медленно, по стенке пробирки и проводить реакцию в вытяжном шкафу.
Витамины группы К (филлохиноны)
Общие сведения. Факторы свертывания крови − витамины группы К −
являются производными 2-метил-1,4-нафтохинона:
О
СН3
2-метил-1,4- нафт охинон
О
Витамин K1 синтезируется в хлоропластах зеленых растений.
Составные части его молекулы − 2-метил-1,4-нафтохинон и остаток спирта
фитола:
О
СН3
СН3
СН3
СН3
CH2 − CH = C − (CH2)3 − CH − (CH2)3 − CH − CH3
О
Витамин К1
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Много витамина К1 содержится в белокочанной и цветной капусте,
томатах (особенно зеленых), шпинате, тыкве, плодах шиповника, листьях
крапивы, люцерне, петрушке, хвое сосны и ели, листьях каштана, моркови.
Витамин K1 найден и в животных продуктах − телятине, говядине, свинине,
почках, печени.
Витамин К2 синтезируется микроорганизмами − симбионтами, находящимися в кишечнике. Выделен он также из гниющей рыбной муки.
По химическому строению представляет собой 2-метил-3-дифарнезил-1,4нафтохинон:
О
СН3
СН3
СН3
CH2 − (CH = C − CH2 − CH2)5 − CH = C − CH3
Витамин К2
О
Витаминная ценность витамина К2 ниже, чем витамина К1, и составляет примерно 50 % активности последнего.
Качественные реакции на 2-метил-1,4-нафтохинон. Реакция с анилином, 2-метил-1,4-нафтохинон (метинон) с анилином образует 2-метил-3фениламино-1,4-нафтохинон, обладающий красной окраской:
О
О
СН3
2
СН3
+
Метинон
NH
Анилин NH2
О
О
2-метил-3-фениламино1,4-нафтохинон
OH
CH3
+
Продукт восстановления 2-метил1,4-нафтохинона
OH
Реактивы: а) викасол, 0,1%-ный водный раствор, или метинон,
0,2%- ный раствор в этиловом спирте; б) анилин.
32
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
К 1 мл раствора викасола или метинона добавляют 6−8 капель анилина
и взбалтывают. Содержимое пробирки приобретает красную окраску.
3.2 Количественное определение витамина С
Общие сведения. Антицинготный витамин С − аскорбиновая кислота − по химическому составу является лактоном 2,3-диенол-гулоновой
кислоты. Аскорбиновая кислота – окисленное производное шестиатомного
спирта сорбита − характерна наличием диенольной группы —С=С—, которая обусловливает способность витамина С легко подвергаться окислению
с одновременным восстановлением других соединений.
О
С
ОН
ОН
С
С
НОС
О
С=О
НОНС − НС
НОС
СН2
НС
НОСН
О
Варианты структурной формулы
аскорбиновой кислоты
СН2ОН
Витаминной активностью обладает лишь L-аскорбиновая кислота;
D-аскорбиновая кислота физиологически инертна.
L-аскорбиновая кислота − бесцветные кристаллы, легко растворимые в
воде, сильно кислого вкуса. Нерастворима в бензоле, хлороформе, диэтиловом эфире, жирах. Водные растворы аскорбиновой кислоты имеют кислую
реакцию. Аскорбиновая кислота легко окисляется, образуя дегидроаскорбиновую кислоту, сохраняющую витаминную ценность:
О
О
С
НОС
С
О
НОС
−Н
+Н
О
С
О
С
НС
НС
НОСН
НОСН
СН2ОН
L− аскорбиновая
кислота
О
СН2ОН
L− дегидроаскорбиновая
кислота
33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Витамин С принимает участие во многих ферментативных реакциях,
являясь активатором или ингибитором ряда энзиматических систем.
Исследование восстанавливающих свойств аскорбиновой кислоты.
Легко вступая в окислительно-восстановительные реакции, аскорбиновая
кислота восстанавливает метиленовую синь, 2,6-дихлорфенолиндофенол,
железосинеродистый калий, азотно-кислое серебро и другие вещества. Это
свойство положено в основу качественных реакций на витамин С.
Реакция с метиленовой синью. Аскорбиновая кислота на свету восстанавливает метиленовую синь в бесцветное соединение (лейкоформу),
окисляясь в дегидроаскорбиновую кислоту.
Реактивы: а) сок картофеля или капусты. Клубень картофеля или часть
кочана капусты натирают на терке из нержавеющей стали. Растертую
массу отжимают через марлю, сложенную в два слоя; б) метиленовая синь,
0,01%-ный раствор; в) натрий углекислый, 5%-ный раствор.
К 1 мл свежеотжатого сока картофеля или капусты добавляют 1−2 капли раствора метиленовой сини и 2−3 капли раствора соды. Пробирку слегка
подогревают. Наблюдают обесцвечивание синей окраски.
Реакция с 2,6-дихлорфенолиндофенолом. Аскорбиновая кислота
окисляется 2,6-дихлорфенолиндофенолом в дегидроаскорбиновую кислоту, а сам реактив восстанавливается при этом в бесцветное соединение
(лейкоформу):
О
С
НОС
Cl
H
H
H
С
С
С
С
О
НОС
+
О
НОСН
СН2ОН
С
С
С
С
Cl
H
H
H
2,4-дихлорфенолиндофенол
(синяя окраска)
О
С
О
С
О
С
О
+
ОH
Cl
H
С
С
H
H
H
С
С
С−N−C
С
C − ΟNa
НС
С
С
С
С
НОСН
Cl
H
H
H
СН2ОН
34
C − ΟNa
С=N−C
С
НС
Лейкоформа 2,6-дихлорфенолиндофенола
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Реактивы: а) сок капусты или картофеля (приготовление − см. предыдущую работу); б) 2,6-дихлорфенолиндофенол, натриевая соль, 0,001 н раствор; в) соляная кислота, 2%-ный раствор.
В пробирку наливают 1 мл сока капусты или картофеля, прибавляют
3−4 капли 2%-ного раствора соляной кислоты и по каплям раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола. Реактив будет обесцвечиваться до тех пор, пока вся
аскорбиновая кислота не окислится в дегидроаскорбиновую, после чего
первая же капля раствора окрасит жидкость в розовый цвет, так как 2,6-дихлорфенолиндофенол уже не восстанавливается.
Количественное определение витамина С в молоке. Принцип метода: метод основан на титровании пробы в кислой среде раствором соли
2,6-дихлорфенолиндофенола без предварительного осаждения белков.
10 мл молока разводят дистиллированной водой в 3 раза (или такое же
количество молока в шесть раз). 10 мл разведенного молока вносят пипеткой в коническую колбу на 25 – 50 мл, куда заранее наливают 1 мл 2% -ного
раствора соляной кислоты и доводят дистиллированной водой до объема
15 мл. Затем взбалтывают содержимое колбы, титруют 0,001 н раствором
2,6-дихлорфенолиндофенола до появления слабо-розового окрашивания.
Для слепого опыта берут 2%-ный раствор соляной кислоты в таких количествах, как указано выше, и вместо молока добавляют воду. Количество
краски, пошедшей на титрование при слепом опыте, вычисляют из количества краски, которая была израсходована на титрование молока. Расчет:
содержание витамина С в молоке рассчитывают по формуле:
B × K × C × 0,038 ×100
X мг % =
10
В − количество краски в мл, пошедшее на титрование молока, за вычетом поправки на слепой опыт; К − поправка на титр краски; С − число,
выражающее разведенное молоко (например, при разведении молока 1:2 −
разведение равно 3); 0,038 − число мг аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл, затраченному на титрование (точно) 0,001 н раствора натриевой
соли 2,6-дихлорфенолиндофенола; 10 − количество молока в мл, взятое для
титрования; 100 − пересчет в мг%.
3.3 Контрольные задания
1. Назовите основные причины развития а- и гиповитаминозов.
Недостаток каких витаминов чаще развивается у жвачных животных?
Поясните свой ответ.
35
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. Заполните таблицу
Буквенное обозначение
A
D
E
Химическое название
Физиологическое название
Жирорастворимые витамины
K
F
Q
Водорастворимые витамины
B1
B2
B3
B5 (PP)
B6
B12
C
H
3. Заполните таблицу
Название
Источники
витамина
Значение для
обмена
веществ
Гипо-, а- и
Обмен
гипервитав организме
минозы
Применение
4. Какие витамины, исходя из их роли в метаболизме, следует включить
в поливитаминный препарат прежде всего?
5. Какие витамины преимущественно участвуют в процессах: а) катаболизма и освобождения энергии; б) биосинтеза?
3.4 Тестовые вопросы для самоконтроля
1. Выберите жирорастворимые витамины:
а) C и D
б) А, D, E и K
в) А, В, С и D
г) все витамины группы В
д) А, D, E, С и K
2. Какие витамины относятся к жирорастворимым?
а) тиамин
б) ретинол
в) рибофлавин
г) пиридоксин
д) токоферол
3. Какие витамины относятся к водорастворимым?
а) тиамин
б) пиридоксин
в) эргокальциферол
36
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
г) филлохинон
д) токоферол
4. Состояние, связанное с недостаточным поступлением какого-либо
витамина в организм, называется:
а) гиповитаминоз
б) гипервитаминоз
в) авитаминоз
г) уремия
д) пеллагра
5. К провитаминам группы D относятся:
а) эргостерол
б) 7-дегидрохолестерол
в) холестерин
г) ретинол
д) токоферол
6. Нарушение сумеречного зрения, сухость роговицы и снижение сопротивляемости организма инфекциям – симптомы гиповитаминоза витамина:
а) ретинола
б) эргокальциферола
в) тиамина
г) рибофлавина
д) пантотеновой кислоты
7. В чем заключается биологическая роль витамина А?
а) участвует в сумеречном зрении
б) регулирует дифференцировку зрения
в) участвует в качестве кофермента в окислительно-восстановительных реакциях
г) поддерживает постоянство ионов кальция в организме
д) гидролизует пептидные связи в ксенобиотиках
8. Признаками цинги являются:
а) кровоизлияния на коже
б) отеки конечностей
в) повышенный обмен веществ в организме
г) усиленная минерализация костей
д) нервно-психические расстройства
9. Недостаток витамина С в организме вызывает:
а) цингу
б) ожирение
в) диабет
г) болезнь бери-бери
д) пеллагру
37
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
10. Какая болезнь развивается при недостатке в пище витамина В1?
а) бери-бери
б) цинга
в) пеллагра
г) анемия
д) сфероцитоз
Ответы: 1б, 2б,д, 3а,б, 4а, 5а,б, 6а, 7а,б, 8а,б, 9а, 10а.
4 ГОРМОНЫ
Гормоны – специфические регуляторы биохимических процессов
в организме, вырабатываемые железами внутренней секреции. Они играют большую роль в обеспечении замечательной способности живых организмов – саморегулировании (авторегуляции) биохимических и физиологических процессов, поддержании их на относительно стабильном уровне.
В организме человека и животных гормоны вырабатываются щитовидной и паращитовидными железами, надпочечниками, поджелудочной
железой, гипофизом, половыми железами, эпифизом. Некоторые гормоны
(или гормоноподобные вещества) вырабатываются в желудочно-кишечном
тракте, системе кровообращения, околоушной слюнной железе, почках и
других органах и тканях.
По химической природе гормоны можно разделить на три группы.
Производные аминокислот (гормоны щитовидной железы и мозгового
слоя надпочечников).
Полипептиды и белки (гормоны гипофиза, поджелудочной железы).
Стероидные соединения (гормоны коркового слоя надпочечников и половых желез).
Характер влияния гормонов на обмен веществ отличен от механизма
действия ферментов и витаминов. Они не входят в состав молекул биологических катализаторов, ферментов, отличаясь этим от витаминов.
Гормоны в отличие от ферментов не принимают непосредственного,
видимого участия в химических реакциях и их не удается включить в химические уравнения, выражающие основные процессы обмена белков, нуклеиновых кислот, липидов, углеводов, минеральных соединений. Считают,
что роль гормонов сводится к так называемому аллостерическому регулированию, т.е. изменению пространственной конфигурации молекул.
Ряд гормонов, главным образом белковой и пептидной природы, влияет
на проницаемость клеточных и субклеточных мембран, некоторым из них
свойственны функции активаторов или ингибиторов ферментных систем (в
первую очередь – окислительно-восстановительных), другие (в основном
стероидные) принимают участие в процессах биосинтеза белковых веществ.
38
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Роль ряда гормонов сводится к преимущественному регулированию
процессов работы других желез внутренней секреции.
4.1 Открытие йода в щитовидной железе
В щитовидной железе синтезируются несколько соединений, обладающих гормональным действием. В составе молекулы основного гормона –
тироксина (тетраиодтиронина) содержатся четыре атома йода.
I
I
CH2 − CH − COOH
O
HO
NH2
I
I
Тироксин
Тироксин и трииодтиронин, окисляясь, образуют тетра- и трииодуксусную кислоты, которые играют каталитическую роль в окислительных
процессах. Щитовидная железа вырабатывает также гормон тиреокальцитонин, снижающий уровень кальция в крови.
Реактивы: а) препарат тиреоидин (представляет собой обезжиренную, высушенную и измельченную щитовидную железу убойного скота);
б) углекислый натрий, в порошке; в) азотно-кислый калий, в порошке;
г) серная кислота, 15%-ный раствор; д) хлороформ; е) хлорамин, 5%-ный
раствор, свежеприготовленный (или хлорная вода).
0,5 г порошка тиреоидина тщательно смешивают в тигле с 2 г смеси
азотно-кислого натрия и углекислого натрия (5 : 7) и нагревают до обугливания. Остаток растворяют в 20 мл воды и фильтруют. Фильтрат подкисляют 15%-ным раствором серной кислоты до слабокислой реакции (по
лакмусу), после чего к нему добавляют 5 мл хлороформа, 4–5 мл свежеприготовленного раствора хлорамина (или хлорной воды) и встряхивают.
Хлороформный слой принимает красно-фиолетовое окрашивание.
4.2 Гормоны мозгового слоя надпочечников
Общие сведения. В хромаффинных клетках мозгового слоя надпочечников образуются два гормона – адреналин и норадреналин. Они являются
производными ортодиоксибензола (пирокатехина) и синтезируются в организме в результате ферментативных превращений аминокислоты тирозина
(или фенилаланина) при участии метионина.
39
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
OH
OH
OH
H
H
C
OH
C
NH2
H
OH
H
H
C
OH
C
NH
СН3
H
Норадреналин
Адреналин
Адреналин и норадреналин образуются также в хромаффинных клетках ганглиозной ткани.
Адреналин – весьма неустойчивое вещество. Он легко окисляется и сам
является хорошим восстановителем. Так, он способен восстанавливать металлическое серебро из раствора азотно-кислого серебра, медь – из закиси
меди и т.д. Особенно легко проходит окисление адреналина в нейтральной и
щелочной среде. Продукты окисления адреналина (дегидроадреналин, адренохром и др.) принимают участие в окислительных процессах в организме.
Качественные реакции на адреналин. Реакция с хлорным железом.
Растворы адреналина дают с хлорным железом изумрудно-зеленое окрашивание, характерное для гидроксильных групп, расположенных в ортоположении.
Реактивы: а) адреналин, раствор 1: 1000; б) хлорное железо, 3%-ный
раствор; в) аммиак, 10%-ный раствор.
0,5 мл раствора адреналина смешивают с 2 мл воды и прибавляют 1 каплю
раствора хлорного железа. Содержимое пробирки тотчас же окрашивается в
изумрудно-зеленый цвет. От прибавления 1 капли раствора аммиака окраска
переходит в вишнево-красную, а затем принимает коричневый оттенок.
4.3 Гормоны поджелудочной железы
Общие сведения. В поджелудочной железе вырабатывается несколько
веществ, обладающих гормональным действием.
Β-клетки островков Лангерганса синтезируют инсулин, являющийся
одним из важнейших регуляторов обмена углеводов в организме. Роль
островковых клеток в выработке инсулина была доказана Л.В. Соболевым.
40
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В α-клетках островков Лангерганса образуется гормон глюкагон. Он
также влияет на углеводный обмен, но его действие оказывается противоположным инсулину.
Клетки эпителия мелких протоков железы вырабатывают гормон липокаин, участвующий в обмене жиров.
Гормон ваготонин повышает тонус парасимпатической нервной системы, а центропнеин влияет на дыхательный центр. Эти гормоны изучены
еще недостаточно.
Реакции на инсулин. Реакция с разбавленным раствором едкой щелочи. При добавлении к раствору инсулина очень разбавленного раствора
едкого натра или едкого кали выпадает хлопьевидный осадок, растворяющийся при подкислении.
Реактивы: а) раствор инсулина (в ампулах); б) едкий натр или едкое
кали, 0,7%-ный раствор; в) уксусная кислота, 0,5%-ный раствор.
К 10−15 каплям раствора инсулина добавляют по каплям 0,1%-ный раствор едкой щелочи до выпадения хлопьевидного осадка (рН 5,0−5,2), который растворяется при подкислении 0,5%-ным раствором уксусной кислоты
до рН 2,5−3,5.
Реакции, свидетельствующие о белковой природе инсулина. С раствором инсулина проделывают реакции, доказывающие его белковую природу − биуретовую.
4.4 Контрольные задания
1. Сравните механизм действия пептидных и стероидных гормонов.
Что в них общего и чем они отличаются?
2. Какие гормоны оказывают: а) более быстрый эффект; б) более длительное действие – проникающие или непроникающие в клетку-мишень?
3. Заполните таблицу
Метаболические
эффекты
Прочее
Тканимишени
Углеводы
Регуляция
выработки
Жиры
Механизм
действия
Белки
Название
гормона,
железа
Нарушения
функции
+
−
Какие гормоны и почему применяются в животноводстве и ветеринарии?
41
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4.5 Тестовые вопросы для самоконтроля
1. Выберите из представленных ниже свойства гормонов:
а) действие на расстоянии от места выделения
б) специфичность соединения с компонентом рецептора
в) высокая скорость образования и распада
г) роль посредника между ЦНС и тканями
д) все перечисленные свойства
2. Отметьте основную функцию паращитовидной железы:
а) поддержание натриевого баланса
б) поддержание калиевого баланса
в) поддержание кальциевого баланса
г) поддержание баланса бикарбонатов
д) поддержание баланса фосфат-ионов
3. Удаление какой железы приводит к понижению концентрации кальция в крови, судорогам и смерти?
а) щитовидной
б) эндокринных
в) надпочечников
г) паращитовидных
д) поджелудочной
4. Укажите структуру, синтезирующую гормон кальцитонин:
а) передняя доля гипофиза
б) задняя доля гипофиза
в) паращитовидная железа
г) щитовидная железа
д) матка и предстательная железа
5. Укажите предшественник тироксина при образовании его в щитовидной железе:
а) гистидин
б) индол-5,6-хинон
в) тиреоглобулин
г) триптофан
д) тирамин
6. Выберите гормон, вызывающий гипогликемию:
а) адреналин
б) инсулин
в) глюкагон
г) кортизол
д) соматотропин
42
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7. Выберите из приведенных вещество, которое требуется для преобразования норадреналина в адреналин:
а) дигидроксифенилаланин
б) 3-метоксиэпинефрин
в) S-аденозинметионин
г) тирозин
д) 3-метокси-4-гидроксиминдальная кислота
8. Укажите первоначальный стероид, образующийся при отщеплении
боковой цепи холестерола, из которого продуцируются все остальные стероидные гормоны:
а) прегненолон
б) эстрон
в) эстрадиол
г) эстриол
д) лютропин
9. Выберите гормон, оказывающий наибольшее влияние на водносолевой обмен:
а) адреналин
б) альдостерон
в) глюкагон
г) кортизол
д) секретин
10. Укажите характеристики, присущие рецепторам:
а) предназначены для присоединения лекарств
б) не восприимчивы к антагонистам
в) предназначены для присоединения гормонов
г) расположены на наружной поверхности клеток и внутри них
д) являются «молекулами узнавания»
Ответы: 1д, 2в,д, 3г, 4в, 5в, 6б, 7в, 8а, 9б, 10в,г,д.
5 ХИМИЯ И ОБМЕН УГЛЕВОДОВ
В биосфере на долю углеводов приходится больше, чем всех других
органических соединений вместе взятых. В растениях они составляют
80−90 % из расчета на сухое вещество; в животном организме на их долю
приходится 2 % массы тела. Однако значение углеводов велико для всех
видов живых организмов.
Для большинства организмов природные углеводы выполняют следующие функции: 1) являются источником углерода, который необходим для
синтеза белков, нуклеиновых кислот, липидов и др.; 2) обеспечивают до
43
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
70 % потребности организма в энергии. При окислении 1 г углеводов выделяется ≈ 16,9 кДж энергии; 3) резервная. Крахмал и гликоген представляют собой форму хранения питательных веществ, выполняя функцию временного депо глюкозы; 4) структурная. Целлюлоза и другие полисахариды
растений образуют прочный остов; в комплексе с белками и липидами они
входят в состав биомембран всех клеток; 5) защитная. Кислые гетерополисахариды выполняют роль биологического смазочного материала, выстилая трущиеся поверхности суставов, слизистой пищеварительных путей,
носа, бронхов, трахеи и др.
Углеводы выполняют в живых организмах и ряд специализированных
ролей. Так, пентозы рибоза и дезоксирибоза входят в состав важнейших биологически активных веществ − нуклеиновых кислот, нуклеотидов и нуклеозидов. Углеводы являются важными составными частями молекул многих
антибиотиков (стрептомицинов, неомицинов, линкомицина, новобиоцина
и др.). Они играют большую роль в явлениях иммунитета: многие микробные антигены, вызывающие образование антител, относятся к углеводам (полисахаридам). В качестве антител выступают гликопротеиды − комплексные
соединения углеводов с белками. Наличие групп крови также связано с гликопротеидами, особенно с их углеводными (олигосахаридными) остатками.
Наконец следует подчеркнуть, что вещества, обладающие исключительно
важным физиологическим значением, как антикоагулянт гепарин, гиалуроновая кислота, играющая значительную роль в защите от проникновения
болезнетворных микроорганизмов, и другие также относятся к углеводам.
Некоторые производные углеводов обладают витаминным действием, например витамин С (аскорбиновая кислота), витамин В15 (пангамовая кислота).
Углеводы классифицируют по их способности к гидролизу. Простые углеводы − моносахариды или монозы − гидролизу не подвергаются. Сложные
углеводы способны гидролитически расщепляться до моносахаридов.
Углеводы делят на три группы: 1) моносахариды, или монозы; 2) олигосахариды, или кристаллические полисахариды, молекулы которых состоят из
2 – 10 остатков моноз; 3) высшие, или коллоидные, полисахариды (полиозы),
в состав которых входят более 10 остатков моносахаридов. Моно- и олигосахариды образуют в воде истинные растворы, из которых способны кристаллизоваться. Они обладают сладким вкусом. Высшие полисахариды относятся к высокомолекулярным веществам. В отличие от моно- и олигосахаридов
их называют коллоидными или некристаллизующимися углеводами.
Состояние углеводного обмена оценивают по содержанию в крови глюкозы, молочной и пировиноградной кислот, гликогена и других веществ.
Для этого используют анализатор «Биосен 5030 GP+» (рис. 3). Применяют
методы нагрузки глюкозой, фруктозой, галактозой, пробы с инсулином,
адреналином и т.д.
44
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 3 – Анализатор «Биосен 5030 GP+» для определения
глюкозы и лактата в сыворотке, плазме и крови
5.1 Количественное определение глюкозы в крови
Общие сведения. Глюкоза является основным метаболитом углеводного обмена. Основные источники глюкозы: 1) пища; 2) распад резервного
полисахарида гликогена; 3) синтез глюкозы из неуглеводных предшественников (главным образом из гликогенных аминокислот) − глюконеогенез.
Основные пути расходования глюкозы: 1) образование энергии при аэробном и анаэробном окислении глюкозы; 2) превращение в другие полисахариды; 3) превращение в гликоген и гетерополисахариды; 4) превращение в
жир, некоторые аминокислоты и др. В кровь глюкоза попадает из кишечника (пища), печени и почек (фермент глюкозо-6-фосфатаза). Остальные
ткани потребляют глюкозу.
Глюкоза является основным компонентом сахара в крови, концентрация которой в норме колеблется от 3,33 до 5,55 у человека и от 2,22 до
3,33 ммоль/л у крупного рогатого скота. Другие сахара (фруктоза, галактоза, пентозы) присутствуют в крови в незначительных количествах.
Определение глюкозы по Хагедорну − Иенсену
Для количественного определения глюкозы в крови чаще всего пользуются микрометодом Хагедорна – Иенсена. Суть его состоит в том, что глю45
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
коза окисляется железосинеродистым калием (красной кровяной солью) в
щелочной среде до глюконовой кислоты, при этом красная кровяная соль
восстанавливается до желтой (железосинеродистого калия).
О
О
С
С
Н
НОСН
ОН
НСОН
НСОН
+ 2 K3Fe (CN)6 + 2 KOH
НОСН
НСОН
НСОН
НСОН
НСОН
СН2ОН
+ 2 K4Fe (CN)6 + H2O
Глюконовая кислота
СН2ОН
Реакция доходит до конца лишь в присутствии ионов Zn2+. Образуется
нерастворимый цинк-железосинеродистый калий.
2K4Fe(CN)6 + 3ZnSO4 = K2Zn3[Fe(CN)6]2↓ + 3K2SO4.
Избыток железосинеродистого калия, не израсходованный на окисление глюкозы, определяется йодометрическим путем:
2K3Fe(CN)6 + 2KI + 8CH3COOH = 2K4Fe(CN)6 + I2 + 8CH3COOK.
Выделившийся йод оттитровывают тиосульфатом натрия (гипосульфитом):
I2 + 2Na2S3O3 = 2NaI + Na2S4O6.
Реактивы: а) оксалатная кровь. Кровь берут из ушной вены кролика. Чтобы предупредить ее свертывание, к 10 мл крови добавляют 0,01 г
щавелево-кислого натрия. Можно также брать кровь из пальца; б) содовый раствор железосинеродистого калия: 1,65 г K3Fe(CN)6 и 10,6 г безводного углекислого натрия растворяют в мерной колбе на 1 л. Раствор
хранят в склянке из темного стекла; в) тиосульфат натрия (гипосульфит,
серноватисто-кислый натрий), 0,005 н раствор; г) едкое кали, 0,1 н раствор; д) серно-кислый цинк. Готовят 45%-ный раствор серно-кислого цинка; перед употреблением его разводят в 100 раз, получая 0,45%-ный раствор; в) хлорцинковый раствор: 10 г серно-кислого цинка и 50 г хлористого
натрия растворяют в 100 мл воды в мерной колбе на 200 мл, раствор до46
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
водят водой до метки и фильтруют; ж) йодистый калий: 5 г соли (не содержащей свободного йода) растворяют в 25 мл воды. Раствор готовят
перед употреблением; з) уксусная кислота, 3%-ный раствор; и) крахмал,
1%-ный раствор.
В четыре пробирки наливают по 1 мл 0,1 н раствора едкого натра и
5 мл 0,45%-ного раствора сернокислого цинка. Выпадает студенистый осадок гидрата окиси цинка. В две пробирки сухой микропипеткой вносят по
0,1 мл крови. Пипетку погружают в раствор гидрата окиси цинка почти до
дна пробирки, осторожно выпускают кровь и хорошо перемешивают ее
с содержимым пробирки, 2−3 раза втягивая и выпуская жидкость. В две
другие пробирки вносят по 0,1 мл дистиллированной воды (контроль). Все
пробирки ставят в кипящую водяную баню точно на 3 мин. Белки крови
выпадают в виде бурых сгустков. Содержимое четырех пробирок фильтруют через вату в четыре сухих пронумерованных стаканчика. Кусочки ваты
в воронках до фильтрования промывают горячей дистиллированной водой
(по 2 мл). Пробирки, в которых осаждали белок, ополаскивают 2 раза горячей водой (по 2−3 мл), присоединяя промывные воды к основным фильтратам (через те же воронки с ватой). Фильтрат должен быть прозрачным.
Во все четыре стаканчика добавляют точно по 2 мл содового раствора железосинеродистого калия, а затем нагревают на кипящей водяной
бане 15 мин. После охлаждения в каждый стаканчик доливают по 2,6 мл
хлорцинкового раствора, 0,4 мл раствора йодистого калия и 2 мл 3%-ного
раствора уксусной кислоты. Выделившийся йод оттитровывают из микробюретки 0,005 н раствором тиосульфата натрия (индикатор − раствор крахмала).
На титрование контрольной пробы должно быть израсходовано около
2 мл 0,005 н раствора тиосульфата. В опытных образцах объем раствора
тиосульфата, израсходованный на титрование, обратно пропорционален содержанию глюкозы в крови.
Для расчета содержания глюкозы пользуются таблицей.
Пример расчета. На титрование исследуемого образца израсходовано
1,29 мл 0,005 н раствора тиосульфата, контрольного − 1,92 мл. По таблице
находим, что 1,29 мл раствора тиосульфата соответствуют 0,125 мг глюкозы, а 1,92 мл того же раствора − 0,014 мг. Содержание глюкозы в 0,1 мл
крови равно 0,125 − 0,014 = 1,111 мг, а в 100 мл 0,111 × 1000 = 111 мг.
47
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Содержание глюкозы в 0,1 мл крови, мг
Миллилитры
раствора
тиосуль- 0,00
фата
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
0,70
0,80
0,90
1,00
1,10
1,20
1,30
1,40
1,50
1,60
1,70
1,80
1,90
0,385
0,355
0,331
0,310
0,290
0,270
0,251
0,232
0,213
0,195
0,177
0,159
0,141
0,124
0,106
0,088
0,070
0,052
0,034
0,017
Сотые доли раствора тиосульфата, мл
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,382
0,352
0,329
0,308
0,288
0,268
0,249
0,230
0,211
0,193
0,175
0,157
0,139
0,122
0,104
0,082
0,068
0,060
0,032
0,015
0,379
0,350
0,327
0,306
0,286
0,266
0,247
0,228
0,209
0,191
0,173
0,155
0,138
0,120
0,102
0,084
0,066
0,048
0,031
0,14
0,376
0,345
0,325
0,304
0,284
0,264
0,245
0,226
0,208
0,190
0,172
0,154
0,136
0,119
0,101
0,083
0,065
0,047
0,029
0,012
0,0373
0,345
0,323
0,302
0,282
0,262
0,243
0,224
0,206
0,188
0,170
0,152
0,134
0,117
0,099
0,081
0,063
0,045
0,027
0,010
0,370
0,343
0,321
0,300
0,280
0,260
0,241
0,222
0,204
0,186
0,168
0,150
0,132
0,115
0,097
0,079
0,061
0,043
0,025
0,008
0,367
0,341
0,318
0,296
0,278
0,259
0,40
0,221
0,202
0,184
0,165
0,148
0,131
0,113
0,095
0,077
0,059
0,041
0,024
0,007
0,364
0,338
0,316
0,296
0,276
0,257
0,238
0,219
0,200
0,182
0,164
0,146
0,0129
0,111
0,093
0,075
0,067
0,039
0,022
0,006
0,361
0,336
0,314
0,294
0,274
0,255
0,236
0,217
0,199
0,181
0,163
0,145
0,127
0,110
0,092
0,074
0,056
0,036
0,020
0,003
0,358
0,333
0,312
0,292
0,272
0,253
0,234
0,215
0,197
0,179
0,161
0,143
0,125
0,108
0,090
0,072
0,054
0,036
0,019
0,002
Определение глюкозы унифицированным ортотолуидиновым методом. Принцип ортотолуидинового метода состоит в том, что глюкоза при
нагревании с ортотолуидиновым реактивом в растворе уксусной кислоты
дает зеленое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации сахара в крови.
Реактивы: а) ортотолуидиновый реактив; б) раствор трихлоруксусной кислоты, 30 г/л; в) основной стандартный раствор глюкозы, 5,55 и
16,67 ммоль/л; г) кровь (сыворотка, моча).
В центрифужную пробирку набирают 0,1 мл крови и 0,9 мл ТХУ и центрифугируют смесь 10 мин. Отбирают 0,5 мл полученного безбелкового
центрифугата в отдельную пробирку и смешивают с 4,5 мл ортотолуиди48
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нового реактива. Для приготовления стандарта смешивают 0,9 мл ТХУ и
0,1 мл стандартного раствора глюкозы, отбирают 0,5 мл смеси и добавляют
к 4,5 мл ортотолуидинового реактива. Обе пробирки (опыт и стандарт – каждая по 5 мл) кипятят на водяной бане ровно 8 мин. Затем сразу охлаждают
до комнатной температуры под водопроводной водой. Колориметрируют на
КФК при длине волны 595 нм, в кювете толщиной 5 мм против стандарта.
Расчет производится по формуле: Соп = Аоп (Сст/ Аст), где Соп − концентрация
глюкозы в опытной пробе, Dосф/л; Сст − концентрация глюкозы в стандартной пробе, близкая к определяемой (5,55 или 16,67 ммоль/л); Аоп и Аст −
оптические плотности опытного и стандартного растворов соответственно.
Определение глюкозы ферментативным способом (глюкозооксидазным). Глюкоза окисляется в присутствии глюкозооксидазы в глюконолактон и перекись водорода. Образовавшаяся перекись водорода под действием пероксидазы окисляет субстрат с образованием окрашенного продукта, концентрация которого определяется фотометрически.
Реактивы: а) буферный раствор, рН 6,0 (400 мл); б) реагент (смесь
ферментов) − 0,4 г; в) стандарты глюкозы (5,55 и 16,0 ммоль/л) − по
2,0 мл; г) рабочий реагент: за сутки до проведения анализа реагент 2 растворяют буферным раствором (сохраняется в холодильнике в течение
1 мес.); д) сыворотка крови.
В первую пробирку вносят 0,02 мл сыворотки, во вторую − 0,02 мл стандарта, в третью − 0,02 мл контроля. В каждую из пробирок добавляют по 2 мл
рабочего реагента. Полученные реакционные смеси перемешивают и инкубируют 15 мин при 37 °С. Измеряют оптическую плотность опытной пробы
(Аоп) и стандартной (Аст) против контроля (холостая проба). Окраска стабильна 15 мин. Линейная область − 2−27 ммоль/л, длина волны 490−540 нм (синезеленый или зеленый светофильтр), кювета толщиной 5 мм.
Расчет: концентрацию глюкозы в сыворотке (С) определяют по формуле: С = Аоп (Сст/ Аст), где Сст − концентрация одного из стандартных растворов глюкозы, которому соответствует оптическая плотность Аст. Если
оптическая плотность пробы превышает 0,85, тестируемый образец разводят дистиллированной водой в соотношении 1:1, а полученный результат
умножают на 2.
5.2 Исследование анаэробного распада
гликогена или крахмала
Анаэробный распад глюкозы функционирует в эритроцитах (лишены
митохондрий) и «белых мышечных волокнах», служащих для интенсивной,
но кратковременной работы. Эти клетки плохо приспособлены для использования кислорода.
49
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Анаэробный распад гликогена (гликогенолиз) или глюкозы (гликолиз)
начинается с этапа образования глюкозофосфорных эфиров. При гликогенолизе вначале образуется глюкозо-1-фосфат, который затем под влиянием
фермента фосфоглюкомутазы превращается в глюкозо-6-фосфат.
При фосфорилировании глюкозы процесс начинается с образования
глюкозо-6-фосфата.
Наряду с фосфорилитическим распадом гликогена в мышцах имеет место (правда, в значительно меньшей степени) и гидролитическое расщепление его под влиянием амилазы и мальтазы.
Схематически процесс анаэробного расщепления углеводов в мышцах
можно представить следующим образом.
Гликогенолиз
Гликоген + Н3РО4
Фосфорилаза
↓↑
Гликолиз
Глюкозо-1-фосфат
Глюкоза +АТФ
Глюкомутаза
↓↑
↓
Глюкозо-6-фосфат
АДФ
Фосфоизомераза
↓↑
Фруктозо-6-фосфат + АТФ
Фосфофруктокиназа ↓ ↑
Фруктозо-1,6-дифосфат + АДФ
Альдолаза
↓↑
Фосфоглицериновый альдегид + фосфодиоксиацетон
↓↑
2 молекулы фосфоглицеринового альдегида + 2Н3РО4 + 2НАД
Дегидрогеназа фосфоглицеринового альдегида ↓ ↑
2 молекулы 1,3-дифосфоглицериновой кислоты + 2НАД·Н2 + 2АДФ
Фосфоглицераткиназа
↓↑
2 молекулы 3-фосфоглицериновой кислоты + 2АТФ
Фосфоглицеромутаза
↓↑
2 молекулы 2-фосфоглицериновой кислоты
Фосфопируватгидратаза
↓↑
2 молекулы фосфоенолпировиноградной кислоты + 2АДФ
Пируваткиназа
↓↑
2 молекулы енолпировиноградной кислоты + 2АТФ
↓↑
1 молекула пировиноградной кислоты + 2НАД·Н2
Лактатдегидрогеназа
↓↑
2 молекулы молочной кислоты + 2НАД
50
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таким образом, если к кашице мышечной ткани добавить раствор
гликогена или крахмала и эту смесь поместить в анаэробные условия при
температуре 36,5−37 °С, то через 1−2 ч можно наблюдать образование молочной кислоты, которую открывают реакцией с серной кислотой и гваяколом или с серной кислотой и спиртовым раствором тиофена в присутствии
серно-кислой меди.
Реактивы и материалы: а) кашица мышечной ткани. Мышцы только что убитого кролика, крысы или лягушки нарезают ножницами на
маленькие кусочки (на холоде). Кашицу готовят непосредственно перед
употреблением, растирая нарезанные мышцы с небольшим количеством
дистиллированной воды; б) фосфатный буфер рН 8,04. Готовят два раствора: 1−1/15 М раствор (11,876 г соли в 1 л); 2−1/15 М раствор КН2РО4
(9,078 г соли в 1 л). Для получения буферной системы (рН 8,04) смешивают 95 мл первого раствора с 5 мл второго; в) метафосфорная кислота,
5%- ный раствор; г) гликоген или крахмал, 0,5%-ный раствор; д) вазелиновое масло; е) гидрат окиси кальция (Са(ОН)2·Н2O), в порошке; ж) сернокислая медь, 15%-ный раствор; з) серная кислота, концентрированная;
и) гваякол (монометиловый эфир пирокатехина), 0,2%-ный спиртовой
раствор; к) тиофен, 10−20 капель препарата растворяют в 100 мл этилового спирта.
В две пробирки вносят по 0,5 г свежеприготовленной мышечной кашицы и 3 мл фосфатного буфера (рН 8,04). Первая пробирка является контрольной, вторая − опытной. В контрольную пробирку для инактивации
ферментов добавляют 2 мл 5%-ного раствора метафосфорной кислоты и
1 мл дистиллированной воды. Во вторую пробирку вливают 1 мл 0,5%-ного
раствора крахмала или гликогена, затем в обе пробирки добавляют по 1 мл
вазелинового масла (для защиты реагирующих веществ от кислорода воздуха) и ставят на 1 ч в термостат при температуре 36,5−37 °С. После часа
инкубации пробирки вынимают из термостата и во второй инактивируют
ферменты добавлением 2 мл 5%-ного раствора метафосфорной кислоты.
Контрольную и опытную пробы фильтруют через бумагу в сухие пронумерованные пробирки. Для осаждения углеводов к фильтратам прибавляют по 0,5 г гидрата окиси кальция и 1 мл 15%-ного раствора серно-кислой
меди, потом пробирки ставят на 10−15 мин, время от времени взбалтывая,
после чего снова фильтруют.
С фильтратами проделывают реакции на молочную кислоту. Для этого
берут четыре пробирки и в первые две наливают по 10 капель фильтрата контрольной пробы, в третью и четвертую − по 10 капель опытной. Пробирки
ставят в сосуд со снегом и осторожно (по стенке) добавляют в каждую из
них по 30−40 капель концентрированной серной кислоты, во вторую и четвертую приливают также по 1 капле раствора серно-кислой меди. После
51
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
этого все пробирки нагревают на кипящей водяной бане 2−3 мин и быстро
охлаждают. В первую и третью пробирки наливают по 3−4 капли 0,2%- ного
спиртового раствора гваякола, во вторую и четвертую − столько же спиртового раствора тиофена. Через несколько минут в третьей пробирке появляется красное окрашивание, в четвертой − вишнево-красное, которое
усиливается при нагревании на водяной бане. В первой и второй пробирках
может появиться розоватая окраска, обусловленная наличием следов молочной кислоты в мышечной кашице.
Примечание. Опыт проводят в пробирках из термоустойчивого стекла,
соблюдая все меры предосторожности, принятые при работе с концентрированной серной кислотой.
5.3 Контрольные задания
1. Напишите структурные формулы следующих углеводов: а) глюкозо6-фосфат; б) фруктозо-6-фосфат; в) галактозо-1-фосфат; г) мальтоза; д) лактоза; е) сахароза; ж) крахмал; з) гликоген; и) целлюлоза.
2. Перечислите шесть путей утилизации глюкозы в клетке.
3. Что такое гликолиз? Какие ферменты в гликолизе являются ключевыми? Какие реакции гликолиза являются необратимыми?
4. Напишите схемы реакций с использованием структурных формул
субстратов и продуктов и с указанием ферментов, катализирующих данные
реакции:
а) глюкоза + АТФ → глюкозо-6-фосфат;
б) фруктозо-1,6-дифосфат → 3-фосфоглицериновый альдегид + фосфодиоксиацетон;
в) 3-фосфоглицериновая кислота → 2 фосфоглицериновая кислота;
г) фосфоенолпировиноградная кислота + АДФ → пировиноградная
кислота + АТФ;
д) пировиноградная кислота + НАДН+Н+ → молочная кислота + НАД.
Для какого метаболического пути характерны данные реакции?
Что такое окислительное декарбоксилирование ПВК?
Напишите восемь реакций цикла Кребса с использованием структурных формул субстратов и продуктов и с указанием ферментов, катализирующих данные реакции.
Назовите субстраты глюконеогенеза. В каких органах наиболее интенсивно протекает глюконеогенез? Какие реакции его обеспечивают?
Сколько молекул АТФ образуется при а) окислении глюкозы до конечных продуктов; б) гликолизе?
Объясните принципы методов определения глюкозы в крови.
52
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5.4 Тестовые вопросы для самоконтроля
1. В результате какой реакции в процессе гликолиза образуется глюкозо6-фосфат?
а) изомеризации фруктозо-6-фосфата
б) окисления 6-фосфоглюконата
в) расщепления гликогена при действии гликогенфосфорилазы
г) взаимодействия глюкозы с АТФ
д) при действии транскетолазы
2. Конечным продуктом аэробного гликолиза является:
а) лактат
б) пируват
в) вода
г) углекислый газ
д) ЩУК
3. Конечным продуктом анаэробного гликолиза является:
а) лактат
б) пируват
в) ЩУК
г) гликоген
д) ацетил-КоА
4. Гексокиназа катализирует реакцию:
а) расщепление триозофосфата на две триозы
б) фосфорилирование глюкозы
в) образование фруктозо-6-фосфата
г) синтез АТФ
д) образование пирувата
5. В процессе гликолиза АТФ расходуется в реакциях образования:
а) фруктозо-6-фосфата
б) глюкозо-6-фосфата
в) фруктозо-1,6-дифосфата
г) 3-фосфоглицеральальдегида
д) 3-фосфоглицерата
6. В процессе гликолиза АТФ образуется в реакциях превращения:
а) 1,3-дифосфоглицерата
б) фосфоеноилпирувата
в) 3-фосфоглицерата
г) 3-фосфоглицеральдегида
д) 2-фосфоглицерата
53
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7. Образование 2-фосфоглицерата в процессе гликолиза катализирует
фермент:
а) фосфоглицератмутаза
б) триозофосфатизомераза
в) глицеральдегидфосфатдегидрогеназа
г) фосфоглицераткиназа
д) енолаза
8. Для превращения фруктозо-6-фосфата во фруктозо-1,6-дифосфат
под влиянием фосфофруктокиназы в процессе гликолиза необходим:
а) НАД
б) АДФ
в) АТФ
г) КоА
д) О2
9. Конечным продуктом спиртового брожения является:
а) глюкоза
б) пируват
в) лактат
г) этанол
д) глицерин
10. Выберите название процесса ферментативного превращения АДФ в
АТФ, сопряженного с переносом электронов от субстрата на молекулярный
кислород:
а) окислительное фосфорилирование
б) субстратное фосфорилирование
в) глюконеогенез
г) АТФ-синтаза
д) дефосфорилирование
Ответы: 1г, 2в,г, 3а, 4б, 5б,в, 6а,б, 7а, 8в, 9г, 10а
6 ХИМИЯ И ОБМЕН ЛИПИДОВ
Под общим названием «липиды» объединяют большую группу нейтральных жиров и жироподобных веществ (или липоидов). Свойством, общим для всех этих соединений, является их растворимость в органических
растворителях (бензоле, петролейном эфире, бензине, хлороформе, ацетоне, диэтиловом эфире, сероуглероде и др.) и нерастворимость в воде.
Липиды делят на две группы: неомыляемые (не содержат жирных кислот) и омыляемые. К неомыляемым относятся стероиды, каротиноиды и
терпеноиды (построены из изопреновых остатков). Омыляемые липиды де54
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
лят на простые и сложные. К простым относятся жиры − триацилглицерины
(резерв энергии) и воски − эфиры одноатомного спирта с жирной кислотой
(кожное сало). Сложные липиды делят на фосфолипиды и гликолипиды.
По физиологическому значению липиды делят на резервные и структурные. Резервные липиды депонируются в больших количествах и при
необходимости расходуются для энергетических нужд организма. Их содержание в организме зависит от уровня и характера питания. К резервным
липидам относят триглицериды. Все остальные липиды можно отнести к
структурным (протоплазматическим). Количество этих липидов не убывает даже при сильном голодании и не увеличивается при патологическом
ожирении.
Функции липидов: 1) пластическая − липиды входят в состав мембран
и определяют их свойства (проницаемость, передача нервного импульса
и др.); 2) энергетическая − липиды служат энергетическим материалом для
организма; при окислении 1 г жира выделяется 39 кДж/моль энергии, что
в два раза больше, чем при окислении 1 г белков или углеводов; липиды −
долгосрочный резерв энергии; 3) защитная − липиды предохраняют тело и
органы от механического повреждения и сохраняют тепло (подкожный жир,
жировая капсула почек, сальник в брюшной полости); 4) регуляторная −
некоторые липиды являются предшественниками витаминов, гормонов
(стероидные), в т.ч. гормонов местного действия − эйкозаноидов: простагландинов, тромбоксанов и лейкотриенов. От состава, свойств, состояния
мембранных липидов во многом зависит активность мембранно-связанных
ферментов; 5) эмульгирование жиров (пищеварение), стабилизация липидсодержащих жидкостей (желчь) и транспорт гидрофобных молекул (мицеллы, липопротеины). С нарушениями обмена липидов связаны такие заболевания, как атеросклероз, ожирение, желчнокаменная болезнь и др.
6.1 Жиры (нейтральные жиры)
Общие понятия. Жиры – сложные эфиры глицерина и высокомолекулярных жирных кислот.
В состав жиров входят многочисленные предельные (или насыщенные)
и непредельные (или ненасыщенные) жирные кислоты. Среди предельных
кислот чаще встречаются стеариновая (С17Н35СООН) и пальмитиновая
(C15H31COOH). Из непредельных жирных кислот основная роль принадлежит олеиновой (C17H33COOH), линолевой (C17H31COOH) и линоленовой
(C17H29COOH), большое физиологическое значение имеет также арахидоновая (C19H31COOH) кислота. Непредельные жирные кислоты характеризуются наличием двойных связей: в молекуле олеиновой кислоты содержится одна двойная связь, в молекуле линолевой − две, линоленовой − три,
55
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
арахидоновой − четыре. Благодаря наличию двойных связей непредельные
кислоты отличаются высокой реакционной способностью. Линолевая, линоленовая и арахидоновая (так называемые полиненасыщенные) кислоты не синтезируются в организме человека и должны поступать с пищей.
Недостаток этих кислот в пище вызывает серьезные нарушения обмена веществ, исчезающие при потреблении продуктов, в состав которых входят
непредельные жирные кислоты. Поэтому указанные соединения относят к
веществам, обладающим витаминным действием (витамин F). Линолевая и
линоленовая кислоты содержатся в растительных маслах (льняном, подсолнечном и др.), арахидоновая кислота − в печеночных жирах рыб, сливочном
масле и некоторых видах маргарина.
В состав масел некоторых тропических растений входят также циклические жирные кислоты (хаульмугровая, гиднокарповая и др.).
Определение количества глицерина в жире. Химическое определение содержания глицерина в жирах является довольно трудоемким и продолжительным. Сравнительно неплохие результаты дает расчетный метод.
Зная эфирное число жира, можно вычислить содержание глицерина, приняв во внимание, что для высвобождения одной молекулы глицерина надо
израсходовать три молекулы едкого калия.
О
СН2 − О − С − С17Н35
О
СН − О − С − С17Н35
+ КОН
О
СН2 − О − С − С17Н35
СН2
OН
CH
OН
CH2
OН
+ 3 С17Н35СООК
Процентное содержание глицерина в жире − г − рассчитывают по формуле:
r = 92,06 × э.ч. × 100 ,
56,11 × 3 × 1000
где 92,06 − молекулярный вес глицерина;
э.ч. − эфирное число жира;
56,11 − молекулярный вес едкого кали.
Йодное число. Йодное число показывает количество граммов йода, которое присоединяется к 100 г жира. Оно свидетельствует о количественном
содержании непредельных кислот в жире, что позволяет судить о его устойчивости к окислению, полимеризации и другим превращениям. Йодное
число является показателем, характерным для каждого вида свежего жира.
56
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Наиболее точным является определение йодного числа по Гюблю,
однако оно связано с применением весьма ядовитого реактива − сулемы
(HgCl2) и поэтому не может быть рекомендовано для студенческого практикума. Описываем более простой и быстрый метод определения йодного
числа, применение которого не связано с использованием сулемы. Метод
обладает вполне удовлетворительной точностью.
Определение йодного числа с бромистым йодом (по Ганусу).
Бромистый йод образуется при взаимодействии йода с бромом в уксуснокислой среде.
Бромистый йод количественно присоединяется к непредельным жирным кислотам по месту двойных связей.
Избыток бромистого йода, не вошедший в реакцию, реагирует с йодистым калием по уравнению:
BrI + KI→KBr + I2.
Выделившийся йод оттитровывают тиосульфатом:
I2 + Na2S2O3 =2NaI + Na2S4O6.
Реактивы: а) растительное масло; б) реактив Гануса: 13 г кристаллического йода растворяют в 100 мл ледяной уксусной кислоты (в мерной колбе емкостью 1 л). К раствору добавляют 8,2 г брома и доводят
ледяной уксусной кислотой до 1 л. Хранят в склянке оранжевого стекла с
притертой пробкой. Раствор готовится лаборантом (в вытяжном шкафу!); в) йодистый калий, 20%-ный раствор, готовится непосредственно
перед определением; г) тиосульфат натрия (гипосульфит, серноватистокислый натрий), 0,1 н раствор; д) крахмал, 1%-ный раствор; е) хлороформ.
В сухую коническую колбу или склянку с притертой пробкой емкостью 250−300 мл отвешивают на аналитических весах 0,2−0,3 г масла и
растворяют его в 10 мл хлороформа. В другую такую же колбу или склянку вносят 10 мл хлороформа без масла («слепой опыт»). В обе колбы из
бюретки (со стеклянным краном) добавляют по 25 мл реактива Гануса.
Сосуды плотно закрывают пробками, смоченными в растворе йодистого
калия. Содержимое сосудов осторожно взбалтывают, после чего сосуды
ставят в темное место на 1−1,5 ч. По истечении указанного времени в оба
сосуда добавляют по 10 мл 20%-ного раствора йодистого калия и 50 мл
воды и выделившийся йод оттитровывают 0,1 н раствором тиосульфата
натрия до слабо-желтой окраски, потом добавляют 10 – 12 капель раствора
крахмала и продолжают титрование до полного обесцвечивания раствора.
При расчетах принимают во внимание, что 1 мл 0,1 н раствора тиосульфата натрия соответствует 1 мл 0,1 н раствора йода. Йодное число − й.ч. –
вычисляют по формуле:
57
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Й .ч. =
(с − о)к 0,01269×100 ,
н
где с − количество 0,1 н раствора тиосульфата, израсходованное
на титрование контрольной пробы («слепой опыт»), мл;
о − количество 0,1 н раствора тиосульфата, израсходованное при титровании опытного образца, мл;
к − поправочный коэффициент к титру приблизительно 0,1 н раствора
тиосульфата; 0,01269 − титр раствора тиосульфата по йоду;
н − навеска масла, г.
6.2 Фосфатиды, или фосфолипиды
Общие сведения. Одной из наиболее распространенных групп жироподобных веществ, или липоидов, являются фосфолипиды, или фосфатиды. Различают три группы фосфолипидов: а) фосфоглицериды, в состав которых входят глицерин, жирные кислоты, фосфорная кислота и азотистые
основания (холин, коламин, оксиаминокислота серин); б) инозитфосфатиды (фосфатидилинозитиды), содержащие вместо азотистого основания
циклический шестиатомный спирт инозит; в) сфингомиэлины (сфингофосфолипиды), молекулы которых состоят из высокомолекулярного двухатомного ненасыщенного аминоспирта сфингозина, остатков жирной и фосфорной кислот и азотистого основания холина. В молекулах сфингомиэлинов
жирная кислота соединена пептидной связью с аминогруппой сфингозина.
Выделение лецитинов из желтка куриного яйца. Лецитины относятся к фосфоглицеридам (фосфотидилхолинам). При гидролизе лецитинов
освобождаются молекула глицерина, две молекулы жирных кислот (из которых одна является непредельной), молекулы фосфорной кислоты и азотистого основания холина.
Фосфорная кислота в молекуле лецитина соединена сложноэфирной
связью со спиртовой группой холина.
СН3
OH
НО − СН2 − СН2 − N
CH3
CH3
CH3
или
СН2 − СН2 − N
ОН
СН3
Холин
58
+
ОН −
СН3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В зависимости от того, к какому углеродному атому глицерина присоединен остаток холинфосфорной кислоты, выделяют α- и β-лецитины.
Лецитины различаются также по жирным кислотам, входящим в их состав.
СН2
О
OCR1
CH
O
OCR2
OH
CH2
O
Р
О
CH3
CH3CH3
НО − СН2 − СН2 − N
ОН
СН2
О
OCR1
CH
O
Р
OH
О
CH2
O
α-лецитин
НО − СН2 − СН2 − N
ОН
OCR2
CH3
CH3CH3
β−лецитин
R1, R2 − остатки
жирных кислот
Реактивы: а) желток куриного яйца; б) этиловый спирт; в) ацетон;
г) хлористый кадмий, насыщенный спиртовой раствор.
В небольшой стаканчик вносят около 1/5 − 1/6 желтка куриного яйца и,
помешивая стеклянной палочкой, добавляют 10 мл горячего спирта. После
остывания содержимое стаканчика фильтруют в сухую пробирку. Фильтрат
должен быть прозрачным. Если в нем появляется муть, фильтрование повторяют до получения прозрачного фильтрата.
Со спиртовым раствором лецитинов проделывают ряд реакций.
Осаждение ацетоном. В сухую пробирку наливают 2−3 мл ацетона и
по каплям прибавляют спиртовой раствор лецитинов. Выпадает осадок, так
как лецитины в ацетоне не растворяются.
Получение эмульсии лецитинов. Для получения эмульсии к 2−3 мл
спиртового раствора лецитинов добавляют (по каплям) дистиллированную
воду. Образуется устойчивая эмульсия лецитинов в воде.
Осаждение хлористым кадмием. В сухой пробирке к 1 мл спиртового
раствора лецитинов добавляют по каплям насыщенный раствор хлористого
кадмия. Выпадает белый осадок соединения лецитинов с хлористым кадмием.
59
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6.3 Стероиды
Стероиды являются производными циклопентанпергидрофенантрена,
содержащего три нелинейно конденсированных насыщенных циклогексановых и одно циклопентановое кольцо:
12
11
17
13
14
1
2
10
9
5
3
6
4
8
16
15
Циклопентанпергидрофенантрен
7
К стероидам относится большое количество биологически важных
соединений: сбственно стеролы (или стерины), витамины группы D, половые гормоны, гормоны коры надпочечников, растительные сапонины и
гликозиды.
Наиболее известный среди стеринов − холестерин, содержащийся почти во всех тканях организма. Особенно много его в центральной и периферической нервной системе, подкожном жире, почках и др. Холестерин
является одним из главных компонентов цитоплазматической мембраны, а
также липопротеинов плазмы крови.
Холестерин служит исходным предшественником для синтеза всех стероидов, функционирующих в организме, − половых гормонов и гормонов
коры надпочечников, желчных кислот, витамина D3. Холестерин, входящий
в состав клеточных мембран, оказывает существенное влияние на состояние мембраны и таким образом участвует в регуляции ее проницаемости.
Много холестерина содержится в молоке, сливочном масле, яичном желтке.
Реакция Сальковского на холестерин. Под действием концентрированной серной кислоты происходит дегидратация молекулы холестерина с
образованием холестерилена − соединения, окрашенного в красный цвет.
CH3
CH3
Н
CH3
СН − (СН2)3 − СН − СН3
СН3
холестерин
СН3
CH3
− Н2О
СН − (СН2)3 − СН − СН3
СН3
СН3
холестерилен
ОН
Реактивы: а) холестерин, 1%-ный хлороформный раствор, или растительное масло, хлороформный раствор; б) серная кислота, концентрированная (р2о= 1,836).
60
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
К 2−3 мл хлороформного раствора холестерина (или растительного
масла) в пробирке осторожно, наслаивая по стенке, добавляют 1−2 мл концентрированной серной кислоты. Пробирку легко встряхивают. Вначале
верхний слой, а затем и вся жидкость в пробирке принимает красную, оранжевую или красно-фиолетовую окраску.
Получение кристаллов холестерида. В липопротеиновых фракциях
крови примерно только одна треть его находится в виде спирта, а две трети − в форме эфиров жирных кислот (холестеридов):
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
O
R
О
эфир холестерина (холестерид)
Реактивы: а) холестерин в порошке; б) ледяная уксусная кислота.
В пробирку вносят 10 капель уксусной кислоты и на кончике лопатки
немного холестерина. Нагревают до кипения. Охладив пробирку на воздухе, наблюдают появление осадка. Несколько капель полученной взвеси
переносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом кристаллы ацетилхолестерида.
6.4 Ферментативный гидролиз липидов
Общие сведения. Жиры и липоиды подвергаются гидролитическому
расщеплению в пищеварительном тракте. Нейтральные жиры распадаются
на глицерин и жирные кислоты; фосфатиды (лецитины, кефалины, серинфосфатиды и др.) расщепляются на глицерин, жирные кислоты, фосфорную кислоту и азотистые основания − холин, каламин (этаноламин), серин
и т.д. При гидролизе стеридов освобождаются холестерин или эргостерин
и жирные кислоты.
Гидролитический распад жиров катализируется ферментами липазами,
которые содержатся в соке желудка, поджелудочной железы и тонкого кишечника. Роль желудочной липазы у взрослого человека весьма невелика, так
как фермент катализирует расщепление лишь тонкодиспергированных, предварительно эмульгированных жиров (например, молочного). Значительная
роль в переваривании жиров принадлежит липазе поджелудочной железы.
Расщепление жиров происходит главным образом в тонком кишечнике.
61
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Липаза поджелудочной железы выделяется в малоактивной форме и
активируется желчными кислотами. Значение желчных кислот в переваривании жира очень велико. Они являются не только активаторами липазы.
Будучи поверхностно-активными веществами желчные кислоты способствуют эмульгированию жиров, что увеличивает во много раз их поверхность соприкосновения с водным раствором липазы.
Липазы содержатся также в растительных объектах (семенах злаков,
масличных растений) и микроорганизмах. При их участии происходит порча
круп, муки и других продуктов при хранении. Гидролитическое расщепление жиров протекает в несколько стадий. Липаза действует главным образом
на внешние (α) эфирные связи молекулы триглицерида. Вначале отщепляются жирные кислоты, связанные с глицерином в α-положении, и образуется глицерин-2-жирная кислота, которая затем изомеризуется в глицерин-1жирную кислоту, подвергающуюся уже окончательному расщеплению.
СН2
О
OCR1
CH
O
OCR2
CH2
O
+2 H2O
Липаза
СН2
OН
CH
O
Триглицерид
СН2
OН
CH
O
CH2
OН
СН2
O
CH
OН
CH2
OН
Изомеризация
OCR2
+ H2O
Липаза
COOH + R3
COOH
OН
Глицерин-2-жирная кислота
СН2
O
CH
OН
CH2
OCR2
+ R1
Свободные жирные кислоты
CH2
OCR3
OCR2
OCR2
OН
Глицерин-1-жирная кислота
СН2
OН
CH
OН
CH2
OН
+
R2
COOH
Продукты гидролитического расщепления жиров всасываются в тонком кишечнике. Глицерин растворим в воде и всасывается легко. Жирные
кислоты образуют растворимые комплексные соединения с желчными кислотами (так называемые холеиновые кислоты), которые также всасываются
в кишечнике. Холеиновые кислоты затем расщепляются на свои компоненты в клетках эпителия кишечных ворсинок.
62
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Освободившиеся желчные кислоты всасываются в кровь и через систему воротной вены снова поступают в печень. Жирные же кислоты вступают в сложноэфирную связь с глицерином, образуя жир, свойственный уже
данному виду животного.
Гидролиз фосфолипидов катализируется ферментами фосфолипазами
(А, В, С, D), расщепление холестеридов происходит под влиянием холестеролэстеразы.
Качественная реакция на желчные кислоты. Желчные кислоты по
своему строению близки к холестерину и являются производными холановой кислоты.
CH3
CH3
СН − СН2 − СН2 − СООН
СН3
холановая кислота
Желчные кислоты (холевая, дезоксихолевая, литохолевая) входят в состав желчи как в чистом виде, так и в виде парных соединений с фосфатидом (глицином) и таурином (с которыми они соединяются посредством
пептидной ковалентной связи).
Для открытия желчных кислот используют их способность давать
красное окрашивание с оксиметилфурфуролом (реакция Петтенкофера).
Оксиметилфурфурол образуется при реакции фруктозы с концентрированной соляной или серной кислотой.
Реактивы: а) желчь, водный раствор (1:2); б) сахароза, 5%-ный раствор,
или фруктоза, 3%-ный раствор; в) серная кислота, концентрированная.
В сухую пробирку наливают 10 капель разведенной желчи, добавляют
1−2 капли раствора сахарозы (или фруктозы) и, наклонив пробирку, осторожно (по стенке) наслаивают равный объем концентрированной серной
кислоты. На границе слоев образуется пурпурное кольцо, которое затем
принимает красно-фиолетовое окрашивание.
6.5 Контрольные задания
1. Что такое липиды и липоиды?
2. К какому классу липидов относится холестерин? Что представляют
собой холестериды? Какова роль холестерина в организме?
3. Перечислите желчные кислоты. Из какого вещества они образуются?
Какова роль желчных кислот?
4. Напишите схему гидролиза олеодистеарина. Какова дальнейшая
63
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
судьба полученных соединений? Напишите соответствующие реакции,
укажите участвующие ферменты.
5. Приведите схему синтеза пальмитиновой кислоты из ацетил-КоА и
оксида углерода (IV).
6. Напишите схемы образования кетоновых тел. В каком органе они
синтезируются?
7. Перечислите фракции липопротеинов плазмы крови, участвующие
в транспорте липидов. Какие из них связывают с возникновением атеросклероза?
6.6 Тестовые вопросы для самоконтроля
1. Некоторые свободные жирные кислоты доставляются клетками крови, будучи присоединены к:
а) альбумину сыворотки крови
б) глобулину сыворотки крови
в) мембране эритроцитов
г) липазе
д) митохондрии
2. Какую реакцию цикла окисления жирных кислот катализирует
ацетил-КоА-ацетилтрансфераза (тиолаза)?
а) реакцию тиолитического расщепления
б) реакцию окисления КоА
в) реакцию дегидрирования КоА-эфиров ненасыщенных жирных
кислот по α- и β-атомам углерода
г) гидратацию двойной связи транс-еноил-КоА, в результате чего образуется L-стереоизомер β-гидроксиацил-КоА
д)
дегидратацию
L-β-гидроксиацил-КоА
с
образованием
β-кетоацилКоА
3. Липиды выполняют следующую функцию из представленных:
а) энергетическую
б) каталитическую
в) генетическую
г) дополнительные факторы питания
д) регуляторы обмена веществ
4. Активизация жирной кислоты происходит:
а) в цитозоле: жирная кислота связывается с КоА и образуется ацилКоА
б) в цитоплазме: жирная кислота соединяется с карнитином
в) жирная кислота соединяется с ацетил-КоА
г) образуется цис-еноил-КоА, который превращается в транс-еноилКоА
64
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
д) жирная кислота соединяется с пальмитиновой кислотой
5. Процесс биосинтеза ВЖК локализован:
а) во внешней мембране митохондрий
б) во внутренней мембране митохондрий
в) в мембране эндоплазматического ретикулума
г) в клеточной мембране
д) в ядерной мембране
6. Высшие жирные кислоты в процессе их катаболизма разрушаются
преимущественно путем:
а) процессов восстановления
б) декарбоксилирования
в) гидролиза
г) β-окисления
д) α-окисления
7. Триглицериды – это:
а) сложные эфиры трехатомного спирта глицерина и высших монокарбоновых кислот
б) сложные эфиры высших спиртов и высших монокарбоновых кислот
в) сложные эфиры высших монокарбоновых кислот и полициклических спиртов
г) сложные эфиры высших монокарбоновых кислот и стеролов
д) простые эфиры двухатомного спирта и высших монокарбоновых
кислот
8. Кетоз – это:
а) значительное накопление кетоновых тел в крови и экскреция их с
мочой
б) процесс образования кетоновых тел под действием глюкагона и
адреналина
в) синтез кетоновых тел в клеточных мембранах под действием
желчных кислот
г) утилизация кетоновых тел в печени с участием специфических
ферментов
д) окисление кетоновых тел с избыточным выделением энергии
9. Накопление кетоновых тел в организме приводит к:
а) метаболическому ацидозу
б) атеросклерозу
в) гиперхолестеринемии
г) усилению процесса липолиза
д) декарбоксилированию фосфатидилсерина
65
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
10. Синтез кетоновых тел происходит в:
а) печени
б) клеточных мембранах
в) коре надпочечников
г) скелетных мышцах
д) миокарде
Ответы: 1а, 2а, 3а, 4б, 5в, 6г, 7а, 8а, 9а, 10а.
7 ХИМИЯ И ОБМЕН АМИНОКИСЛОТ,
ПЕПТИДОВ И БЕЛКОВ
7.1 Колориметрическое определение общего
количества азота
Среднее содержание азота в белках составляет 16 %. Для пересчета общего количества азота на белок нужно найденное количество общего азота
умножить на коэффициент 6,25. При исследовании зерна и продуктов его
переработки принят пересчетный коэффициент 5,70, молока и молочных
продуктов − 6,38.
При определении содержания общего азота в биологическом материале
получают величину, которая характеризует общее количество азотсодержащих соединений (белков, нуклеиновых кислот, амидов, аминокислот, креатина, мочевой кислоты, аммонийных солей, аммиака, солей азотной и азотистой кислот и др.) в исследуемом объекте. Умножая ее на пересчетный
коэффициент, получают представление о содержании не чистого белка в
продукте, а так называемого «сырого протеина», поэтому при более точных
исследованиях наряду с определением количества общего азота следует также изучить содержание белкового азота, азота аминокислот и амидов и т.д.
Для определений общего азота продукт минерализуют нагреванием с
концентрированной серной кислотой при участии катализаторов (сернокислой меди, ртути, селена и др.) и окислителей (пергидроля, марганцовокислого калия). При этом углерод и водород окисляются до двуокиси углерода и воды, а азот отщепляется в виде аммиака:
R-CHNH2-COOH + H2SO4 → CO2 + NH3 + H2O + SO2.
Аммиак далее реагирует с серной кислотой:
2NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4.
66
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Аммонийные соли (или аммиак) взаимодействуют с реактивом
Несслера, образуя иодид меркураммония, окрашенный в желто-бурый цвет.
Hg
N+H2 I− + 7 KI + 2 H2O
NH3 + 2 K2 HgI4 + 3 KOH = O
Hg
реактив
Несслера
йодид
меркураммония
Интенсивность окраски пропорциональна содержанию аммиака в растворе, что позволяет применить эту реакцию для количественного определения содержания общего азота в биологическом материале.
Реактивы: а) реактив Несслера (двойная соль йодистой ртути и йодистого калия в растворе едкого кали или натра). Используется готовый или
приготавливается лаборантом по такой прописи: в 20 мл воды растворяют 10 г двуйодистой ртути (HgJ2) и 8 г йодистого калия. Образуется комплексное соединение. В 80 мл воды отдельно растворяют 20 г едкого натра.
Оба раствора после остывания сливают в один сосуд и фильтруют через
стеклянную вату; б) серная кислота, концентрированная (Р’2о=1,836);
в) пергидроль; г) едкий натр, 0,25 н раствор, д) стандартный раствор: навеску 0,7643 г химически чистого хлористого аммония (NH4Cl) или 0,9429 г
химически чистого серно-кислого аммония ((NH4)2SO4) вносят в мерную
колбу на 1 л, растворяют в 20−30 мл дистиллированной воды, свободной от
аммиака, и той же водой доводят до метки. Получают так называемый
основной раствор. 10 мл основного раствора пипеткой вливают в литровую мерную колбу и доводят до метки дистиллированной водой, свободной
от аммиака. Получают рабочий стандартный раствор, 1 мл которого соответствует 0,002 мг азота; е) дистиллированная вода, освобожденная
от аммиака: дистиллированную воду слабо подкисляют серной кислотой и
вторично перегоняют, отбрасывая первую и последнюю порции.
Продукт, подлежащий исследованию, тщательно измельчают. Навеску
измельченного продукта в 0,03 – 0,08 г вносят в пробирку из термоустойчивого стекла (диаметром 15 мм), куда добавляют 2 мл концентрированной
серной кислоты и 1−2 капли пергидроля. Удерживая в наклонном положении (с помощью держателя), пробирку нагревают на слабом огне. В течение 2−3 мин обычно происходит обесцвечивание жидкости. При дальнейшем нагревании бесцветная и прозрачная жидкость не должна желтеть.
Если же она принимает желтое окрашивание, то это свидетельствует о неполном сожжении органических веществ. В этом случае содержимое пробирки охлаждают, добавляют еще 1−2 капли пергидроля и снова нагревают
на медленном огне. Всего расходуют не более 4−5 капель пергидроля.
67
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
При минерализации органических веществ избегают бурного кипения
жидкости.
После того как все органические вещества окислились, на что указывает устойчивое обесцвечивание жидкости, содержимое пробирки количественно переносят в мерную колбу на 100 мл, на дно которой заранее
наливают 10−15 мл воды, освобожденной от аммиака. После охлаждения
мерную колбу доводят до метки той же водой.
Пипеткой отбирают из мерной колбы 10 мл раствора, добавляют 3 капли раствора фенолфталеина и оттитровывают 0,25 н раствором едкого натра до появления устойчивого слабо-розового окрашивания. Затем той же
пипеткой снова отбирают из мерной колбы 10 мл раствора, вносят в другую
мерную колбу на 100 мл и добавляют столько же 0,25 н раствора едкого
натра, сколько было израсходовано на нейтрализацию кислоты при предварительном титровании (фенолфталеин не прибавляют), после чего раствор в колбе доводят водой до метки и тщательно перемешивают. Раствор
используется для определения содержания общего азота.
Берут две мерные колбы на 100 мл. В одну из них пипеткой вносят
10 мл испытуемого раствора, в другую − 10 мл рабочего стандартного раствора. В обе колбы приливают по 50 мл воды, 4 мл реактива Несслера, доводят водой до метки и перемешивают.
Интенсивность окраски обоих растворов уравнивают в колориметре
КОЛ-1М или другого типа, фотометре ФМ-58 или ФМ-58И.
Расчет производится следующим образом. Навеска продукта 0,05 г.
После сжигания раствор доводится до 100 мл, 10 мл полученного раствора
после нейтрализации вновь разводится до объема 100 мл.
К 10 мл указанного раствора было добавлено 4 мл реактива Несслера
и воды до объема 100 мл. В другую мерную колбу внесли 10 мл рабочего стандартного раствора (1 мл которого содержит 0,002 мг азота) и также
прибавили 4 мл реактива Несслера и воды до общего объема 100 мл.
При уравнивании интенсивности окрасок испытуемого и стандартного раствора в колориметре высота столба стандартного раствора составила
25 мм, испытуемого − 20 мм. Общее количество азота х1 в продукте следующее:
x1 =
0,002 ×10 ×20×10×10×100%
= 3,2%.
25×1000×0,05
Содержание «сырого протеина» х2 = х1× 6,25 = 3,2 × 6,25 = 20%.
68
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7.2 Определение общего азота по Къельдалю
(микрометод)
Метод определения общего содержания азота в биологических объектах
по Къельдалю считается наиболее точным. В своей классической прописи
определение, однако, является продолжительным по времени и относительно
трудоемким, поэтому в последнее время, особенно при массовых анализах,
расширилась область применения других методов (колориметрических, титрометрических, адсорбционных и др.). Но в тех случаях, когда требуется высокая
точность анализа (например, в научно-исследовательских работах, арбитражных исследованиях), метод Къельдаля по-прежнему остается основным.
При определении общего количества азота органическое вещество минерализуют кипячением с концентрированной серной кислотой (см. «Колориметрическое определение общего количества азота»). Освобождающийся аммиак связывается серной кислотой, при этом образуется сернокислый аммоний. Добавлением концентрированного раствора едкого натра
вытесняют аммиак. Аммиак поглощается титрованным раствором серной
кислоты, который заведомо берут в избытке. Отгонку аммиака ускоряют
пропусканием водяного пара. Избыток раствора серной кислоты, не вошедший в реакцию, оттитровывают едким натром.
По разности между количествами миллилитров раствора серной кислоты, взятыми для поглощения аммиака и оставшимися затем в излишке после окончания реакции, определяют число миллилитров, израсходованное
для нейтрализации аммиака.
1 мл 0,01 н раствора серной кислоты соответствует 0,000142 г азота.
Реактивы: а) серная кислота, концентрированная (Р20=1,836), проверенная на содержание азота; б) пергидроль; в) серно-кислая медь, х.ч.;
г) серно-кислый калий, х.ч.; д) едкий натр, 33%-ный раствор. Для освобождения от аммиака рекомендуется нагреть раствор до кипения, кипятить
1−2 мин, затем охладить; е) едкий натр, 0,01 н раствор; ж) метиловый
красный (метил-рот): 0,05 г порошка индикатора растворяют в 15 мл
95%-ного этилового спирта. К раствору добавляют 10 мл дистиллированной воды и перемешивают.
Рис. 4 – Анализатор азота по Къельдалю UDK 132
69
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 5 – Аппарат для микроопределения азота (по К.П. Петрову)
Посуда и аппаратура: а) колбы Къельдаля емкостью 50−100 мл; б) аппарат для микроопределения азота.
Органическое вещество сжигают так, как описано в работе
«Колориметрическое определение общего количества азота». В качестве
катализатора пользуются смесью серно-кислой меди и серно-кислого калия (1:3). Для ускорения сжигания можно добавить пергидроль. Сжигание
производят в колбах Къельдаля из тугоплавкого стекла.
После окончания сжигания колбу охлаждают, к прозрачной и бесцветной жидкости осторожно (по стенке!) добавляют 15 мл дистиллированной
воды (заранее проверенной с помощью реактива Несслера на отсутствие
аммиака), 2 капли раствора метилового красного и присоединяют к аппарату для микроопределений азота.
Аппарат для микроопределений азота (рис. 5) состоит из парообразователя 1, предохранительного сосуда 3, колбы Къельдаля 5, каплеуловителя 11, холодильника 10 и приемника − конической колбы 12.
Парообразователем служит обычная плоскодонная колба, в которую
наливают дистиллированную воду, подкисленную серной или фосфорной
кислотой. Колбу-парообразователь снабжают предохранительной стеклянной трубкой, которая доходит до дна. Для равномерного кипения на дно
колбы кладут несколько кусочков пемзы или стеклянных капилляров.
70
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В приемную колбу 12 пипеткой вносят 20 мл 0,01 н раствора серной
кислоты. Колбу устанавливают так, чтобы форштосс был погружен в кислоту на 2−3 мм (во избежание потерь аммиака).
В колбу Къельдаля через воронку 7 наливают 33%-ный раствор едкого натра (из расчета 5−6 мл раствора щелочи на 1 мл концентрированной
серной кислоты, взятой для сжигания) до изменения окраски индикатора в
желтую, после чего тотчас же закрывают зажим на воронке 7. Открывают
зажим 13 (одновременно закрывая зажим 4 на предохранительном сосуде) и начинают пропускать пар. Отгонку аммиака продолжают 10−15 мин.
В последние минуты отгонки конец форштосса вынимают из раствора кислоты (чтобы избежать засасывания жидкости). Окончив отгонку, смывают
форштосс 2−3 мл дистиллированной воды, присоединяя их к раствору в
приемной колбе.
В приемник добавляют 2−3 капли раствора метилового красного и оттитровывают избыток кислоты, не вошедшей в реакцию, 0,01 н раствором
едкого натра до появления желтого окрашивания. Общее процентное содержание азота в исследуемом материале х1 рассчитывают по формуле:
A×0,000142 ×100 ,
x1 =
н
где А − количество 0,01 н раствора серной кислоты, связавшейся
с аммиаком, мл;
н − навеска продукта, г.
Для перевода на «сырой протеин» найденное количество общего азота
умножают на коэффициент 6,25.
7.3 Определение белкового и небелкового азота
Белки осаждают гидратом окиси меди (или основным уксусно-кислым
свинцом). Осадок белковых веществ отфильтровывают. В осадке определяют азот белков, в фильтрате − небелковый. Если известно содержание
общего азота в исследуемом объекте, можно ограничиться определением
или белкового или небелкового азота и по разности рассчитать значение
второго показателя.
Реактивы: а) серно-кислая медь (CuSO4 × 5Н2О), 6%-ный раствор;
б) едкий натр, 1,25%-ный раствор; в) едкий натр, 0,25 н раствор; г) хлористый барий, 5%-ный раствор; д) реактив Несслера; е) серная кислота,
концентрированная (Р20 – 1,836); ж) пергидроль; з) стандартный раствор
хлористого или серно-кислого аммония (см. «Колориметрическое определение общего количества азота»); и) дистиллированная вода, освобожденная от аммиака.
71
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Продукт, подлежащий исследованию, тщательно измельчают. Навеску
1−2 г тонко измельченного продукта (взвешивают на аналитических весах)
вносят в химический стакан или коническую колбу емкостью 100−150 мл,
прибавляют 50 мл горячей дистиллированной воды и нагревают до кипения. Если исследованию подвергаются зерновые продукты, богатые
крахмалом, то к навеске добавляют теплую воду (40−45 °С) и нагревают
10 мин на водяной бане при температуре не выше 50 °С. Для осаждения
белков прибавляют 25 мл 6%-ного раствора серно-кислой меди, перемешивают стеклянной палочкой и приливают (все время помешивая) 25 мл
1,25%- ного раствора едкого натра, после чего оставляют на 30−60 мин для
более полного осаждения белков.
После отстаивания осадка жидкость осторожно сливают через фильтр,
стараясь не взмутить осадка. Осадок несколько раз промывают горячей водой (вначале декантацией, а затем переводят на фильтр) до отрицательной
реакции на ионы (реакция с раствором хлористого бария). Фильтр с осадком
подсушивают и минерализуют как при определении общего азота. В дальнейшем поступают, как описано выше (см. работы «Колориметрическое
определение общего количества азота» или «Определение общего азота по
Къельдалю»).
Найденное количество азота (за вычетом его содержания в фильтре)
умножают на пересчетный коэффициент (6,25; 6,38 или 5,7, в зависимости
от продукта, который подвергается исследованию), получая таким образом
содержание белковых веществ.
Метод определения белкового азота трудоемок: промывание осадка
требует продолжительного времени, минерализация фильтра с осадком
протекает медленно, жидкость при сжигании вспенивается. Осадок белка
поэтому не отфильтровывают, а вместе с надосадочной жидкостью количественно переводят в мерную колбу на 100 мл. Содержимое колбы доводят
водой до метки. Прозрачную жидкость отделяют фильтрованием (или центрифугированием), аликвотную часть фильтрата подвергают минерализации и в ней определяют содержание небелкового азота.
Зная содержание общего и небелкового азота в продукте, можно по разности рассчитать количество белкового азота (и, следовательно, белков).
7.4 Определение азота аминокислот
При количественном определении азота аминокислот применяют различные методы (газометрические, например, по Ван-Слайку или
Д.А. Цуверкалову, титрометрические, колориметрические, фотометрические). Благодаря своей простоте и вполне удовлетворительной точности
наибольшее распространение получили метод формольного титрования и
72
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
различные варианты медного способа — по Попе и Стивенсу, Войвуду и др.
Определение азота аминокислот методом формольного титрования. Аминные группы аминокислот вступают в реакцию с формальдегидом с образованием метиленовых соединений (метиленаминокислот).
O
R
CH
COOH
+
H
C
R
H
CH
NH2
N
+
COOH
H2O
CH2
Метиленаминокислоты обладают более сильными кислотными свойствами, чем аминокислоты, и легко оттитровываются щелочью.
R
CH
N
COOH
CH2
+
NaOH
R
CH
N
COONa
+
H2O
CH2
По количеству раствора щелочи (мл), израсходованному на титрование, можно рассчитать содержание азота аминогрупп. При этом принимают, что количество карбоксильных групп, оттитрованных щелочью,
эквивалентно количеству аминогрупп, прореагировавших с формальдегидом. Это справедливо лишь для моноаминомонокарбоновых аминокислот.
Диаминомонокарбоновая кислота аргинин не реагирует с формальдегидом,
поэтому не участвует в реакции. При титровании тирозина взаимодействуют со щелочью не только карбоксильная, но и фенольная группа.
Достоинствами метода формольного титрования являются быстрота и
удобство определения. Это основная причина его широкого распространения в практике, несмотря на относительно невысокую точность.
Реактивы: а) глицин, 0,02 М раствор; б) формалин, 40%-ный; в) этиловый спирт, 95−96%-ный; г) тимолфталеин: 0,05 г индикатора растворяют в 100 мл 96%-ного этилового спирта; д) метиловый красный: 0,2 г
индикатора растворяют в 100 мл 60%-ного этилового спирта; е) фенолфталеин: 0,5 г фенолфталеина растворяют в 100 мл 90%-ного этилового
спирта; ж) едкий натр, растворы 0,2 н и 0,05 н концентрации.
В стаканчик или коническую колбу наливают 20 мл раствора глицина.
В другой такой же сосуд вливают 20 мл воды, заранее прокипяченной (для
освобождения от СО2) и охлажденной, которая служит контролем.
В оба сосуда добавляют по 3 капли индикатора метилового красного и
титруют 0,05 н раствором едкого натра до появления отчетливого желтого
окрашивания. После этого в сосуды доливают по 10 мл формольной смеси.
Для приготовления формольной смеси к 50 мл 40%-ного формалина
добавляют 2 мл 0,5%-ного раствора фенолфталеина и оттитровывают 0,2 н
73
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
раствором едкого натра до слабо-розового окрашивания (обычно расходуют не больше 5 капель раствора щелочи).
После добавления формольной смеси опытную и контрольную пробы
титруют 0,2 н раствором едкого натра до появления интенсивной красной
окраски (рН 9,1). Сначала титруют одну из проб, затем вторую дотитровывают до той же окраски.
При расчетах содержания аминного азота х (мг) в 20 мл испытуемого
раствора принимают во внимание, что 1 мл 0,2 н раствора NaOH соответствует 2,8 мг азота:
Х = (А – В) k × 2,8 ,
где А − количество 0,2 н раствора едкого натра, израсходованное
на титрование опытного образца, мл;
В − количество 0,2 н раствора едкого натра, израсходованное на титрование контрольного образца, мл;
κ − поправочный коэффициент 0,2 н раствора едкого натра.
Полученный результат пересчитывают затем на 100 г исследуемого вещества.
При формольном титровании вместо индикатора фенолфталеина часто
рекомендуют пользоваться раствором тимолфталеина, у которого синее
окрашивание проявляется при рН 9,5−9,7. Доказано, что при применении
фенолфталеина титрование идет не совсем до конца, при добавлении же
тимолфталеина карбоксильные группы аминокислот оттитровываются более полно.
С тимолфталеином анализ проводят так же, как и при добавлении
фенолфталеина, но формольную смесь готовят несколько иначе: к 50 мл
40%-ного формалина приливают 25 мл 95−96%-ного этилового спирта,
5 мл раствора тимолфталеина и добавляют (по каплям) 0,2 н раствор едкого натра до появления зеленоватого или зеленовато-голубого окрашивания.
Опытный и контрольный образцы оттитровывают 0,2 н раствором едкого
натра до появления интенсивного синего окрашивания.
7.5 Хроматография аминокислот
Для разделения смеси вырезают полоску хроматографической бумаги
длиной 15−16 см и шириной 1,5 см в зависимости от величины хроматографической камеры. В качестве камеры используют большие пробирки,
стеклянные цилиндры. Бумагу брать только пинцетом. Один из концов полоски «заостряют», отрезая кусочки ножницами. Проводят простым карандашом линию на расстоянии 2 см от края. На линию наносят смесь АМК
стеклянной палочкой. После подсыхания полоски вновь наносят порцию
АМК. Повторяют 3 – 4 раза.
74
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
На дно хроматографической камеры, не смачивая стенок, наливают из
пипетки 1,2 мл смеси бутанола, уксусной кислоты и воды (2 : 3,5 : 2,5).
Конец верхней хроматографической полоски прикрепляют с помощью
иголки к пробке, которой плотно закрывают хроматографическую камеру, при этом заостренный конец хроматограммы погружают в растворитель на 1 см. Полоска со смесью АМК не должна касаться растворителя.
Хроматографирование проводят в течение 1,5−3 часов. За это время проявитель пройдет по хроматограмме путь снизу вверх, равный примерно 10 см.
1. Пробка
2. Иголка
3. Фронт растворителя
4. Пробирка
5. Полоска хроматографической бумаги
6. Место нанесения АМК
7. Растворитель
... .. .. ..
.... .....
.. .. ... ...
1
2
3
4
5
6
7
Затем хроматографическую бумагу вынимают из камеры, отмечают
границу продвижения растворителя и высушивают над плиткой. Затем наносят с помощью пульверизатора 0,5%-ный раствор нингидрина в ацетоне
равномерно без подтеков. После испарения ацетона бумагу помещают в
сушильный шкаф = 700 °С на 15 мин. Отдельные АМК обнаруживаются в
виде цветных пятен.
При нагревании смеси АМК с раствором нингидрина происходит распад АМК с образованием двуокиси углерода, аммиака и соответствующего
альдегида, при этом нингидрин восстанавливается. Восстановленный нингидрин конденсируется с NH3 и окисленной молекулой нингидрина, образуя окрашенный продукт сине-фиолетового цвета. Фактор удерживания (Rf)
аминокислот определяют по формуле:
Rf =
расстояние, пройденное АМК
расстояние, пройденное фронтом растворителя
Сравнивая Rf известных аминокислот (табл.) с полученными Rf аминокислот смеси, определяют аминокислотный состав.
Значения Rf аминокислот (при температуре 20 °С)
75
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Фенилаланин
Лизин
Аргинин
Гистидин
Серин
Треонин
Глицин
Аспарагиновая кислота
Глутаминовая кислота
Тирозин
α-аланин
Метионин
Триптофан
Пролин
Лейцин
Валин
Цистин
Растворители
Фенол
Бутанол-уксус. к-та, вода
насыщенный водой
0,66
0,87
0,16
0,82
0,18
0,90
0,17
0,69
0,32
0,36
0,36
0,47
0,34
0,41
0,33
0,15
0,37
0,25
0,53
0,63
0,39
0,56
0,58
0,83
0,62
0,85
0,50
0,89
0,72
0,87
0,66
0,76
0,13
0,75
Для анализа аминокислотного состава белков можно использовать аминокислотный анализатор на базе ACME-9000 и Pinnacle PCX (рис. 6).
Рис. 6 – Аминокислотный анализатор
7.6 Гидролитическое расщепление белка
ферментами поджелудочной железы
Пептоны, образовавшиеся при переваривании белков в желудке, а также белки, поступившие в двенадцатиперстную кишку в непереваренном
виде, подвергаются воздействию протеолитических ферментов, выделяю76
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
щихся главным образом поджелудочной железой и частично клетками слизистой оболочки тонкого кишечника.
В соке поджелудочной железы содержатся трипсин, химотрипсин и
карбоксипептидаза.
Трипсин − один из важнейших протеолитических ферментов. Он выделяется в виде неактивного профермента трипсиногена. Под влиянием
фермента энтерокиназы, содержащегося в кишечном соке, трипсиноген
превращается в активную форму − трипсин. Трипсин катализирует гидролитическое расщепление не только полипептидов, образовавшихся при
распаде белков в желудке, но и тех белков, которые поступили в кишечник
в непереваренном виде. Оптимум действия трипсина лежит при рН 7,8. Под
влиянием трипсина происходит гидролитический распад пептидных связей
с образованием низкомолекулярных полипептидов со значительно меньшей величиной молекулы, чем у исходных веществ, а также небольшого
количества свободных аминокислот.
Химотрипсиноген тоже выделяется в неактивном виде и активируется
трипсином. Химотрипсин, как и трипсин, катализирует процесс гидролиза
пептидных связей полипептидов и белков. Трипсин с наибольшей скоростью расщепляет пептидные связи, образованные карбоксильными группами лизина и аргинина, тогда как химотрипсин действует главным образом на пептидные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные
группы метионина, фенилаланина, тирозина и триптофана.
Дальнейшее расщепление полипептидов происходит под действием пептидаз − карбоксипептидазы, аминопептидазы и дипептидаз.
Карбоксипептидаза катализирует процесс гидролиза полипептида со стороны свободной карбоксильной группы. Аминопептидаза и дипептидазы
содержатся в соке тонких кишок. Аминопептидаза катализирует гидролитическое расщепление полипептида со стороны свободной аминогруппы.
Дипептиды, образовавшиеся в результате действия перечисленных ферментов, расщепляются (при участии дипептидаз) на свободные аминокислоты.
Таким образом, конечными продуктами гидролитического расщепления
белков в желудочно-кишечном тракте являются аминокислоты, которые и
усваиваются организмом.
Определив содержание азота α-аминокислот в белке до его контакта с
ферментом, затем через некоторое время, в процессе расщепления, можно
установить интенсивность процесса гидролиза.
Содержание азота аминокислот (аминного азота) определяют с помощью метода, основанного на том, что α-аминокислоты и пептиды образуют внутрикомплексные соединения с ионами двухвалентной меди.
Указанные соединения реагируют с йодистым калием в кислой среде, при
этом выделяется йод, который оттитровывают серноватисто-кислым на77
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
трием (гипосульфитом, тиосульфатом). Реакции протекают по следующим
уравнениям:
CO
2
CH2
O
NH2
Cu
NH2
O
CH2
CO
COOK
+ 4 KI = 2 CuI + I2 + 4 CH2
NH2
I2 + 2 Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6
1 мл 0,01 н раствора гипосульфита соответствует 0,28 мг азота аминокислот.
Реактивы: а) желатин, 1%-ный раствор; б) панкреатин (препарат
поджелудочной железы): 2 г препарата растворяют в 20 мл 1%-ного раствора двууглекислого натрия (гидрокарбоната натрия). Раствор фильтруют; в) хлорная медь; 27,3 г соли растворяют в мерной колбе на 1 л и
доводят водой до метки; г) натрий фосфорно-кислый трехзамещенный
(Na3PO4×12H2O): 68,5 г соли растворяют в мерной колбе на 1 л и доводят
водой до метки. Раствор можно готовить также из двухзамещенного фосфорнокислого натрия. В этом случае 64,5 г Na3HPO4 × 12H2O растворяют в
500 мл дистиллированной воды (предварительно прокипяченной для освобождения от СО2 и остуженной), раствор количественно переносят в мерную колбу на 1 л, добавляют 7,2 г едкого натра, после растворения которого
раствор доводят водой до метки; д) боратный буфер (рН 8,8); 28,6 г буры
(тетраборнокислого натрия) растворяют в 750 мл воды (в мерной колбе на
1 л), прибавляют 50 мл 1 нормального раствора соляной кислоты и доводят
водой до метки; е) суспензия фосфорно-кислой меди в боратном буфере:
100 мл раствора хлорной меди смешивают с 200 мл раствора трехзамещенного фосфорно-кислого натрия и добавляют 200 мл боратного буферного
раствора. Суспензию готовят не более чем на один день, лучше всего перед
употреблением; ж) тимолфталеин: 0,25 г индикатора растворяют в 100 мл
50%-ного этилового спирта; з) тиосульфат натрия, гипосульфит (Na2S2O3
5Н2О), 0,1 н раствор. Перед употреблением из него готовят 0,01 н раствор;
и) крахмал, 0,5%-ный раствор; к) йодистый калий (KI), 10%-ный раствор.
Готовят перед употреблением; л) уксусная кислота, концентрированная;
м) трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; н) едкий натр, 1 н раствор.
Нумеруют четыре конические колбы емкостью по 50 мл. Во все колбы
вносят по 2 мл раствора панкреатина. В колбах 3 и 4 нагреванием в кипящей водяной бане в течение 5 мин разрушают ферменты, в колбах 1 и 2
остаются активные ферменты.
В колбы 1 и 3 пипеткой вносят по 20 мл раствора желатина, в колбы 2 и
4 − по 20 мл дистиллированной воды. Растворы во всех колбах перемеши78
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
вают и немедленно отбирают из каждой колбы по 2−6 мл смеси в мерные
колбы на 25 мл для определения азота аминокислот.
В каждую мерную колбу еще до внесения смеси наливают по 2 мл
10%- ного раствора трихлоруксусной кислоты для инактивирования ферментов. В первую очередь добавляют трихлоруксусную кислоту в колбу 1.
В растворах, внесенных в мерные колбы, определяют содержание азота
аминокислот.
Все исходные смеси (в конических колбах) ставят на 1 ч в термостат
при температуре 38 °С.
Для определения азота аминокислот в каждую мерную колбу прибавляют 2 капли раствора тимолфталеина и по каплям 1 н раствор едкого натра
до светло-голубого окрашивания (рН 10,2). К нейтрализованным растворам
доливают по 10 мл суспензии фосфорно-кислой меди и тщательно перемешивают. Если весь объем суспензии прореагировал, добавляют еще 5 мл.
Колбы доводят водой до метки, хорошо перемешивают и смесь фильтруют (через фильтр из плотной бумаги) или центрифугируют. Фильтрат
(или центрифугат) должен быть совершенно прозрачным.
Примечание. В случае необходимости фильтрат (центрифугат) можно
оставить на следующий день (в темном и холодном месте).
В две конические колбы пипеткой вносят по 10 мл фильтрата, прибавляют по 0,5 мл уксусной кислоты и 5 мл раствора йодистого калия (или 0,5 г
порошка KI), выделившийся йод тотчас же оттитровывают 0,01 н раствором тиосульфата натрия (гипосульфита). Раствор тиосульфата добавляют
до тех пор, пока окраска жидкости в колбе не станет светло-желтой, после
чего приливают 5−6 капель раствора крахмала и дотитровывают тиосульфатом до появления синей окраски.
На основании результатов титрований вычисляют содержание азота
аминокислот вo всем объеме каждого из исходных растворов (в конических
колбах). Данные, характеризующие содержание аминного азота в колбах
2 или 4, будут указывать на количество свободного азота аминокислот в
2 мл ферментного препарата (раствора панкреатина). Разность в содержании азота аминокислот в колбах 3 и 4 указывает на количество азота свободных аминогрупп в 20 мл раствора желатина. Разность в содержании
аминного азота в колбах 1 и 2 (1 – 2) должна быть практически такой же,
как и в колбах 3 и 4 (3 – 4).
После часа инкубации колбы вынимают из термостата и повторяют
определения аминного азота. Данные анализа пересчитывают на исходный
объем смеси − 22 мл (2 мл раствора панкреатина + 20 мл раствора желатина
или воды).
Разность между содержанием аминного азота в колбах 3 и 4 должна
быть такой же, как и до инкубации, разность же между колбами 1 и 2 долж79
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
на возрасти после инкубации по сравнению с той же величиной в начале
опыта.
Иногда наблюдаются случаи, когда содержание азота аминокислот
в колбе 2 после инкубации оказывается более высоким, чем в колбе 4.
Это свидетельствует о самопереваривании (автолизе) ферментного препарата.
Рассмотрим следующий пример расчета. В коническую колбу внесли
2 мл раствора панкреатина и 20 мл раствора желатина; оттуда в мерную
колбу для определения аминного азота отобрали 2 мл смеси. После фильтрования были отобраны две пробы по 10 мл прозрачного фильтрата, на
титрование которых израсходовали соответственно 1,92 и 1,96 мл 0,01 н
раствора тиосульфата натрия (среднее − 1,94 мл).
1 мл 0,01 н раствора тиосульфата натрия (гипосульфита) соответствует
0,28 мг азота аминокислот.
Количество азота аминокислот х1 (мг) в объеме мерной колбы (25 мл):
1,94×0,28×25 .
x1 =
10
Содержание азота аминокислот х2 (мг) в исходном растворе (22 мл):
x2 =
1,94×0,28×22 .
10×2
7.7 Дезаминирование аминокислот
Общие сведения. Дезаминирование − один из путей дальнейшего превращения аминокислот в организме. В результате этого процесса аминокислоты отщепляют аммиак и превращаются в безазотистые соединения.
Возможны несколько типов дезаминирования:
а) окислительное
R
CH
+
COOH
1
2
O2
R
C
COOH
O
NH2
б) восстановительное
R
CH
NH2
80
COOH
+ 2H
R
CH2
COOH + NH3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
в) гидролитическое
R
CH
COOH
+ H2O
R
CH
COOH
+
NH3
OH
NH2
Окислительное дезаминирование превалирует у животных, растений
и многих видов микроорганизмов, другие типы дезаминирования встречаются главным образом у некоторых анаэробных микробов. Окислительное
дезаминирование протекает в два этапа.
Первый этап
R
CH
+
NH2
1
2
R
O2
CH
NH + H2O
COOH
COOH
аминокислота
Промежуточными акцепторами водорода являются НАД или ФМН, которые восстанавливаются до НАД·Н2 или ФМН·Н2. В дальнейшем водород
восстановленных форм коферментов переносится на кислород с образованием воды.
Второй этап. Аминокислота присоединяет воду и распадается на кетокислоту и аммиак:
R
R
CH
NH
COOH
аминокислота
+ H2O
C
O
+ NH3
COOH
кетокислота
Второй этап проходит спонтанно, без участия ферментов.
Окислительное дезаминирование D-, L-аланина. D-, L-аланин под
действием фермента оксидазы-D-аминокислот окисляется в пировиноградную кислоту. При этом отцепляется аммиак, который можно определить с
помощью реактива Несслера.
81
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
СН3
CH
COOH
СН3
NH2
+
1
2
O2
C
О + NH3
Оксидоредуктаза-ДCOOH
аминокислот
Пировиноградная
кислота
Реактивы: а) ферментный препарат оксидазы D-аминокислот.
Освобожденные от капсулы почки крысы на холоду тщательно разрезают
ножницами на мелкие кусочки, которые затем растирают в ступке в кашицу. Кашицу дважды экстрагируют 10-кратным объемом охлажденного
ацетона. Ацетон отсасывают на воронке Бюхнера, а осадок два раза промывают диэтиловым эфиром. Эфир испаряют на воздухе (в вытяжном
шкафу), выключив в лаборатории нагревательные приборы. Порошок ферментного препарата хранят в холодильнике. Он сохраняет свою активность в течение 5−7 дней. Перед употреблением порошок экстрагируют
20 мин, фосфатной буферной смесью (рН 7,6) в отношении 1:20, после
чего центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин; б) D-, L-аланин, 2,5%-ный
раствор на фосфатной буферной смеси (рН 7,6); в) фосфатная буферная
смесь, рH 7,8; г) серная кислота, 10%-ный раствор; д) реактив Несслера
(см. работу «Колориметрическое определение общего количества азота»).
Опыт проводят в трех пробирках. В первую вносят 1 мл ферментного препарата (центрифугата) и 1 мл фосфатного буфера, во вторую − 1 мл
раствора аланина и 1 мл буферной смеси, в третью − 1 мл ферментного
препарата и 1 мл раствора аланина. Все пробы тщательно перемешивают,
плотно закрывают заранее подобранными пробками и помещают в водяную баню 37−38 °С на 1 ч (лучше пользоваться ультратермостатом). Во время инкубации тщательно следят за температурой воды в бане, не допуская
ее повышения. По истечении указанного срока во все пробирки приливают
по 1 мл 10%-ного раствора серной кислоты и 3−4 мл реактива Несслера
и наблюдают за окраской жидкости. В опытной пробе (третья пробирка)
появляется интенсивное желто-оранжевое окрашивание (до желто-бурого),
вызванное продуктом взаимодействия аммиака с реактивом Несслера (иодидом меркураммония). Жидкость в первой и второй пробирках, которые
служили контролем, примет бледно-желтую окраску.
82
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7.8 Переаминирование (трансаминирование)
аминокислот
Общие сведения. Трансаминирование играет важную роль в процессах биологического распада и синтеза аминокислот. Реакция переаминирования, открытая советскими учеными А.Е. Браунштейном и М.Г. Крицман,
заключается в переносе аминогруппы с аминокислоты на кетокислоту, которая таким образом преобразуется в аминокислоту. Аминокислота − донатор аминогруппы, кетокислота − ее акцептор. Реакция катализируется ферментами трансаминазами, простетической группой которых служит фосфопиридоксаль, являющийся промежуточным переносчиком аминогруппы. Присоединив аминогруппу, фосфопиридоксаль превращается в фосфопиридоксамин, с которого уже аминогруппу принимает кетокислота.
Принцип работы. Алании и α-кетоглутаровая кислота подвергаются
переаминированию с образованием пировиноградной и глютаминовой кислот:
СООН
СН3
CH
NH2
+
СН2
C
СН2
COOH
C
Аланин
СООН
О
α-кетоглутаровая
кислота
СООН
СН3
О
+
COOH
Пировиноградная
кислота
СН2
СН2
CН
NH2
СООН
Глютаминовая
кислота
Образование пировиноградной кислоты можно доказать реакцией с салициловым альдегидом (оранжевая окраска). Для того чтобы задержать
процесс на стадии образования пировиноградной кислоты и предотвратить
ее восстановление в молочную, к реакционной смеси добавляют монобромуксусную кислоту.
Реактивы: а) L-аланин, 0,1 М раствор, приготовленный на 0,1 М растворе двууглекислого натрия; б) α-кетоглутаровая кислота, 0,1 М раствор, приготовленный на 0,1 М растворе двууглекислого натрия. Раствор
предварительно нейтрализуют 2%-ным раствором двууглекислого натрия
или 0,2 М раствором едкого натра, добавляя рассчитанное его количество;
в) двууглекислый натрий (бикарбонат натрия), 0,1 М раствор; г) монобромуксусная кислота (CH2BrСООН), 0,002 М раствор, нейтрализованный
щелочью; д) трихлоруксусная кислота, 20%-ный раствор, е) салициловый
альдегид, 2%-ный спиртовой раствор; ж) кали едкое, концентрированный
раствор (100 г КОН растворяют в 60 мл дистиллированной воды).
83
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Животное (мышь, крысу, кролика) быстро обезглавливают. На холоде
быстро готовят кашицу из скелетных мышц. Из мышечной кашицы берут
навески по 1 г (на маленьких часовых стеклах или кусочках плотной бумаги), которые до начала опыта хранят в холодильнике.
Опыт проводят в трех больших пробирках: первая и вторая − контрольные, третья − опытная. В первую пробирку вносят по 2 мл растворов аланина
и двууглекислого натрия и 1 мл раствора монобромуксусной кислоты; во вторую − то же, но вместо аланина приливают 2 мл раствора α-кетоглутаровой
кислоты; в третью − по 2 мл растворов аланина и α-кетоглутаровой кислоты
и 1 мл раствора монобромуксусной кислоты. Затем быстро во все три пробирки одновременно вносят мышечную кашицу, перемешивают, пробирки
закрывают пробками и помещают в термостат при 37−38 °С на 1 ч, все время
встряхивая пробы (удобно пользоваться ультратермостатом или, еще лучше,
аппаратом для встряхивания пробирок с термостатной ванной).
Через час пробы вынимают, в пробирки для осаждения белков приливают по 2 мл раствора трихлоруксусной кислоты, встряхивают для перемешивания и через 3−5 мин фильтруют.
К 2 мл фильтрата из каждой пробирки добавляют по 2 мл раствора едкого кали и 1 мл раствора салицилового альдегида, пробирки встряхивают
и ставят на 10−12 мин в водяную баню или ультратермостат при температуре 37−38 °С.
Жидкость в опытной пробирке принимает интенсивное оранжевое
окрашивание, свидетельствующее о наличии пировиноградной кислоты, в
контрольных пробирках окраска жидкости остается светло-желтой.
7.9 Контрольные задания
1. Чем определяется пищевая ценность белков?
2. Перечислите основные источники и пути расходования аминокислот.
3. Азотистый баланс. Какие существуют виды азотистого баланса?
4. Какова специфичность действия протеолитических ферментов: химотрипсина, пепсина, трипсина?
5. Какие продукты образуются при окислительном дезаминировании
аспарагиновой кислоты и аланина? Напишите схемы реакций и назовите
продукты реакций и ферменты, катализирующие эти реакции.
6. Какие диамины образуются в результате декарбоксилирования тирозина и гистидина? Напишите схемы реакций декарбоксилирования названных аминокислот и укажите ферменты, ускоряющие эти реакции.
7. Почему связывание аммиака в мочевину приводит к уменьшению его
токсичности?
8. Назовите источники синтеза летучих жирных кислот в преджелудках
жвачных. Какова их дальнейшая судьба?
84
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7.10 Тестовые вопросы для самоконтроля
1. Что является конечным продуктом распада аминокислот?
а) углекислый газ
б) аммиак
в) ПВК
г) ац-КоА
д) АТФ
2. Что является конечным продуктом распада аммиака?
а) углекислый газ
б) орнитин
в) аргинин
г) мочевина
д) вода
3. Где происходит образование мочевины?
а) почки
б) селезенка
в) печень
г) 12-перстная кишка
д) толстая кишка
4. Как называется путь утилизации аммиака из организма?
а) ЦТК
б) орнитиновый цикл
в) аммонийный цикл
г) переаминирование
д) гликолиз
5. На первой стадии орнитинового цикла происходит взаимодействие…
а) орнитина с мочевиной
б) мочевины с аммиаком
в) аргинина с мочевиной
г) орнитина с аргинином
д) орнитина с карбамилфосфатом
6. Под действием какого фермента происходит образование цитруллина
в орнитиновом цикле?
а) цитруллинкарбоксилаза
б) орнитингидролаза
в) орнитинкарбамилфосфаттрансфераза
г) аргининосукцинатсинтетаза
д) карбаматкиназа
7. Какие продукты образуются в орнитиновом цикле?
а) аммиак
85
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
б) мочевина
в) орнитин
г) АТФ
д) яблочная кислота
8. Сколько затрачивается молекул АТФ в орнитиновом цикле?
а) 1
б) 3
в) 5
г) 2
д) 0
9. К путям обезвреживания аммиака в организме относятся…
а) переаминирование
б) прямое аминирование
в) окислительное аминирование
г) дезаминирование
д) восстановительное аминирование
10. В результате прямого аминирования фумаровой кислоты образуется…
а) аспарагиновая кислота
б) кетоглутаровая кислота
в) ЩУК
г) глутаминовая кислота
д) яблочная кислота
Ответы: 1а,б, 2г, 3в, 4б, 5д, 6в, 7б,в, 8г, 9б,д, 10а.
86
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8 ХИМИЯ И ОБМЕН МИНЕРАЛЬНЫХ ВЕЩЕСТВ
Минеральные вещества – непременная составная часть живого организма. Они играют важную роль в обмене веществ, построении тканевых
и клеточных структур. Наличие устойчивой концентрации минеральных
соединений в тканях и жидкостях организма (главным образом в ионизированном состоянии) способствует поддержанию постоянства концентрации
водородных ионов.
Относительное постоянство содержания минеральных веществ является фактором, способствующим поддержанию стабильности осмотического давления крови, лимфы, клеточного сока, межклеточного содержимого
и т.д. Соотношение ионов между собой в жидкостях организма влияет в значительной мере на раздражимость клеток и тканевых структур. Показано,
что в первую очередь свойства раздражимости определяются соотношением ионов.
Na + + K +
+
Ca 2 + Mg 2 +
= const
Указанное отношение названо ионным коэффициентом. Преобладание
одновалентных ионов, т.е. увеличение значения числителя, влечет за собой повышение раздражимости, и, наоборот, сдвиг в сторону двухвалентных ионов связан с тормозящим, угнетающим раздражимость действием.
Устойчивость коллоидных систем (сохранение присущей им степени дисперсности, гидратированности, поддержание определенного электрокинетического потенциала и т.д.) также связана с различными ионами. Кроме
того, многие минеральные вещества выполняют специфические коферментные функции (соединения меди, цинка, железа, кобальта, магния,
марганца, молибдена), входят в состав молекул гормонов, активируют или
тормозят активность ферментов. Металлы, служащие коферментами, часто
играют роль связующего звена между белковой частью фермента и субстратом (особенно соединения магния и цинка).
Человек и животные получают минеральные вещества с пищей и кормом. Минеральные соединения должны постоянно поступать в организм,
так как постепенно происходит их выделение (с мочой, калом, потом, слезами и т.д.).
Некоторые минеральные соли задерживаются в организме. Так, соединения кальция, магния и фосфора концентрируются главным образом в
костной ткани, железо − в печени, хлористый натрий − в коже. В случае
недостаточного поступления указанных веществ в организм с пищей они
переходят из указанных депо в кровь.
87
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В зависимости от количественного содержания в организме и продуктах питания минеральные вещества разделяются на две группы: 1) макроэлементы; 2) микроэлементы.
К макроэлементам относятся кальций, фосфор, калий, сера, натрий,
хлор, магний, железо, фтор. Среднее содержание микроэлементов в животном организме (%) следующее:
Кальций
2,00
Хлор
0,15
Фосфор
1,10
Магний
0,05
Калий
0,35
Железо
0,004
Натрий
0,15
Фтор
0,001
Сера
0,25
Многие элементы обнаружены в очень небольших количествах
(10 – 3–10 – 12 %), и поэтому их называют микроэлементами. К ним относят йод,
кобальт, цинк, медь, стронций, марганец, молибден, никель, кадмий и др.
Микроэлементы принадлежат к биологически активным веществам.
Они участвуют в процессах тканевого дыхания, являются непременными
компонентами обмена белков, углеводов, липидов, витаминов, принимают
участие в процессах деления клеток, кроветворения, образования костной
ткани. Доказана роль микроэлементов в процессах фотосинтеза и усвоения
атмосферного азота растениями.
Установлена тесная связь микроэлементов с ферментами, витаминами,
гормонами. Микроэлементы весьма неравномерно распределены в организме животных. Так, йод концентрируется главным образом в щитовидной
железе, стронций − в костях, медь − в печени и костном мозге, молибден − в
почках, цинк − в поджелудочной железе, половых железах, гипофизе.
Потребность организма в минеральных веществах повышается при
беременности, кормлении грудью, росте. Недостаточное поступление минеральных веществ в организм вызывает глубокие нарушения обмена веществ, важнейших физиологических функций.
Для оценки состояния минерального обмена определяют содержание
в крови общего кальция, ионизированного кальция, неорганического фосфора и магния, натрия, калия, используют показатели активности щелочной фосфатазы, содержания микроэлементов, паратгормона, кальцитонина,
кальциферола и других веществ, имеющих непосредственную связь минеральным обменом. Содержание макро- и микроэлементов в биологических
жидкостях и тканях определяют, используя соответствующие приборы.
88
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Атомно-абсорбционный спектрометр «КВАНТ-2А»
Рис. 7 – «КВАНТ-2А»
Предназначен для проведения количественного элементного анализа
по атомным спектрам поглощения и испускания и, в первую очередь, для
определения содержания металлов (до 70 элементов) в растворах их солей:
в природных и сточных водах, в растворах – минерализатах консистентных
продуктов, технологических и прочих растворах.
Основные области применения спектрометра – контроль объектов окружающей среды (воды, воздуха, почв), анализ пищевых продуктов и сырья для
их изготовления, медицина и фармакология, химическая, нефтехимическая,
металлургическая, и другие отрасли промышленности, научные исследования.
Рентгенофлуоресцентный спектрометр
«Спектроскан МАКС GF2E»
Рис. 8 – «Спектроскан МАКС GF2E»
Спектрометр «Спектроскан МАКС
GF2E» предназначен для определения
содержания химических элементов в
различных веществах, находящихся в
твердом, порошкообразном или растворенном состояниях, а также нанесенных на поверхности и осажденных на
фильтры.
«Спектроскан МАКС GF2E» может
применяться в различных отраслях науки и техники для анализа элементного
состава вещества, а также для экологического контроля окружающей среды.
89
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Фотоколориметр КФК-3 – 01
Фотоколориметр
КФК3 – 01 фотоэлектрический предназначен для выполнения химических и клинических анализов растворов.
Он обеспечивает:
а) определение содержания
веществ (напр. меди, железа,
хлора, серебра) в различных
растворах;
б) определение содержания
в крови и моче сахара, билирубина, глюкозы, холестерина,
креатина;
Рис. 9 – КФК-3 – 01
в) определение содержания
в химических растворах мочевины, общего белка, щелочей, фосфатов.
Фотоколориметр КФК-3 – 01 выдает результаты измерения на цифровом табло в единицах коэффициентов пропускания t , оптической плотности D, концентрации С и позволяет выполнять кинетические измерения за
1, 2, 3, 4, 5 мин.
8.1 Определение содержания кальция
в сыворотке крови
Кальций, поступающий в организм, в основном концентрируется в
костной ткани в виде двойных углекислых, фосфорно-кислых и фтористых
солей:
[CaCO3× nCa3(PO4)2; CaF2× nCa3(PO4)2].
Кальций постоянно присутствует в плазме и сыворотке крови (среднее
содержание в сыворотке 9−11 мг%). В крови преобладающая часть кальция
(около 60%) находится в ионном состоянии, а около 40% его связано с альбуминами в виде комплексных соединений. Содержание ионов кальция в крови регулируется гормоном паращитовидных желез и тиреокальцитонином.
Кальций участвует в процессе свертывания крови; является активатором и ингибитором ряда ферментов (активирует лецитиназу, аденозинтрифосфатазу, угнетает действие енолазы, дипептидазы и других ферментов).
Содержание кальция в сыворотке крови определяют с помощью простого и быстрого метода де-Ваарда.
90
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Кальций осаждают в виде щавелево-кислой соли. Осадок растворяют в серной кислоте, при этом освобождается эквивалентное количество
щавелевой кислоты, которое оттитровывают марганцово-кислым калием.
Реакции протекают по следующим уравнениям:
C a C l2 +
COONH4
=
COONH4
COO
COO
C a + H 2S O 4 =
COO
Ca
COO
COOH
COOH
+
2 N H 4C l
+ C aS O 4
COOH
COOH
+ 2 K M n O 4 + 3 H 2S O 4 = 2 M n S O 4 + 8 H 2 O + 2 C O 2
Количество марганцо-вокислого калия, израсходованное на титрование, эквивалентно содержанию кальция во взятом для исследования объеме
сыворотки. 1 мл 0,01 н раствора KmnO4 соответствует 0,2 мг кальция.
Реактивы и материалы: а) сыворотка крови; б) щавелево-кислый аммоний, 4%-ный раствор; в) аммиак, 2%-ный раствор; г) серная кислота,
1 н раствор; д) марганцово-кислый калий, 0,01 н раствор.
В одну центрифужную пробирку пипеткой вносят 1 мл сыворотки крови, в другую − 1 мл дистиллированной воды (контроль). В обе пробирки
добавляют по 1 мл 4%-ного раствора щавелево-кислого аммония, перемешивают и оставляют на 30 мин, после чего центрифугируют 10−15 мин
(2500 оборотов в минуту). Прозрачную жидкость над осадком осторожно
отсасывают с помощью стеклянного капилляра или декантируют, стараясь
не взмутить осадка. В обе пробирки приливают по 4 мл 2%-ного раствора аммиака для отмывки от избытка щавелево-кислого аммония и снова
центрифугируют в течение 8−10 мин. Осадок щавелево-кислого кальция
нерастворим в щелочной среде, но хорошо растворяется в растворах минеральных кислот.
Промывку осадка производят два раза. Надосадочную жидкость тщательно отсасывают или декантируют, в обе пробирки прибавляют по 1 мл
1 н раствора серной кислоты и размешивают тонкими стеклянными палочками, не вынимая их из пробирок, до полного растворения осадков.
Затем пробирки (с палочками) ставят на 3−4 мин, в горячую водяную
баню. Горячие растворы титруют (из микробюретки) 0,01 н раствором
марганцово-кислого калия, все время помешивая палочками, до появления
слабо-розового окрашивания, сохраняющегося в течение 1 мин.
91
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Содержание кальция в сыворотке крови (мг%) х вычисляют по формуле
х = 0,2 × (О – К) × 100,
где О − количество 0,01 н раствора марганцово-кислого калия, израсходованное на титрование опытной пробы, мл;
К − то же при титровании контрольной пробы;
0,2 – количество кальция, соответствующее 1 мл 0,01 н раствора марганцовокислого калия, мг.
8.2 Определение содержания фосфора в молоке
Соединения фосфора играют большую и разностороннюю роль в обмене веществ. Фосфор − один из важнейших структурных элементов;
более 85% его общего количества в организме сосредоточено в скелете.
Фосфорная кислота и ее соединения − непременные компоненты синтеза нуклеиновых кислот, нуклеопротеидов, фосфопротеидов, фосфатидов,
ряда коферментов (НАД, НАДФ, ФМН, ФАД, пиридоксальфосфата, ТПФ
и др.). Соединения фосфора − активные участники гликолиза, гликогенолиза, окислительного фосфорилирования и ряда других обменных процессов.
Соли фосфорной кислоты входят в состав буферной системы, поддерживающей относительное постоянство рН крови.
Фосфор распространен в пищевых продуктах, много его в молоке, твороге, сыре, яйцах, мясе, горохе, фасоли, ржаной муке и хлебе. В женском молоке фосфора содержится в среднем 15 мг%, коровьем − 80, козьем − 110 мг%.
Содержание фосфора в молоке и других продуктах чаще всего определяют с помощью колориметрического метода Фиске − Суббароу (по
образованию так называемой «молибденовой сини»). Сущность этого метода состоит в том, что неорганические фосфаты образуют комплексные
соединения с молибденово-кислым аммонием, которые затем восстанавливаются в продукты, окрашенные в синий цвет («молибденовая синь»).
Интенсивность окраски пропорциональна содержанию фосфора в растворе. Органические соединения фосфора (например, фосфопротеиды, нуклеопротеиды, нуклеотиды, фосфатиды и др.) должны быть предварительно
минерализованы.
Реактивы и материалы: а) молоко; б) серная кислота, концентрированная, в) молибденово-кислый аммоний, 2,5%-ный раствор. В 300 мл воды
растворяют 12,5 г молибденово-кислого аммония. В отдельном сосуде
к 125 мл воды осторожно приливают 75 мл концентрированной серной
кислоты. После остывания оба раствора сливают вместе; г) эйконоген,
0,25%-ный раствор. В мерной колбе на 250 мл растворяют 59,5 г NaHSO3 и
2 г безводного Na2SO3, раствор фильтруют. К 125 мл раствора добавляют
0,5 г эйконогена (1-амино-2-нафтол-4-сульфоновой кислоты) и доливают
92
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
водой до 200 мл. Раствор не должен иметь щелочную реакцию. Хранят в
плотно закрытой склянке темного стекла. Срок годности − до двух недель.
Вместо эйконогена можно пользоваться свежеприготовленным 0,2%-ным
водным раствором аскорбиновой кислоты; д) пергидроль; е) стандартный
раствор: 4,394 г однозамещенного фосфорно-кислого калия (промытого
спиртом для удаления следов двузамещенного фосфата, перекристаллизованного и высушенного в эксикаторе над серной кислотой) растворяют
в воде в мерной колбе на 1 л. Получают основной раствор, 1 мл которого
содержит 1 мг фосфора. Из основного раствора готовят рабочий, разбавляя его водой в 20 раз, 1 мл рабочего раствора содержит 0,05 мг фосфора.
Для повышения устойчивости к основному и рабочему растворам добавляют по 15−20 капель хлороформа.
В большую пробирку из тугоплавкого стекла наливают 0,5 мл молока
и 2 мл концентрированной серной кислоты. Одновременно проводят контрольный опыт с 0,5 мл воды и 2 мл серной кислоты.
Обе пробирки закрывают маленькими воронками и ставят в наклонном
положении на песчаную баню (под тягой!). Осторожно нагревают до обугливания, после чего охлаждают, прибавляют в каждую пробирку по 0,5 мл
пергидроля и нагревают до кипения, кипятят несколько минут. Указанную
операцию повторяют до полного обесцвечивания жидкости.
Бесцветные минерализаты (опытной и контрольной проб) количественно переносят в две мерные колбы на 100 мл и доводят водой до меток.
Пипетками берут по 5 мл опытного и контрольного растворов и вносят в
мерные колбы на 50 мл. В колбу с контрольным раствором добавляют 1 мл
стандартного раствора КН2РО4. В обе колбы приливают по 1 мл раствора
молибденово-кислого аммония, 0,5 мл раствора эйконогена (или 1 мл свежеприготовленного 0,2%-ного раствора аскорбиновой кислоты) и по 25 мл
воды. Колбы оставляют на 15−20 мин, потом доводят водой до метки, перемешивают и колориметрируют.
Содержание фосфора (в миллиграммах на 100 мл молока) − Х − рассчитывают по формуле:
X=
0,0 5 × А × 1 0 0
Б ×m
где 0,05 − содержание фосфора в 1 мл стандартного раствора, мг;
А − показания колориметра для опытного раствора;
Б − показания колориметра для контрольного раствора;
m − количество молока, содержащееся в 5 мл раствора минерализата,
взятых для определения фосфора (т.е. в тех 5 мл раствора, которые
были внесены в мерную колбу на 50 мл), мл.
93
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8.3 Определение содержания йода в молоке
Для измерений содержания йода используется электрохимический метод анализа − метод инверсионной вольтамперометрии с линейной разверткой потенциала на твердом вращающемся электроде из углеродного материала. В основе метода инверсионной вольтамперометрии положен принцип
концентрирования определяемых элементов непосредственно в системе, в
которой проводится определение: определяемое вещество электрохимически концентрируется на торце рабочего электрода, а затем при обратном
(электролитическом) процессе переводится вновь в раствор. На стадии
растворения концентрата регистрируют вольтамперограмму, т.е. изменение тока рабочего электрода от приложенного потенциала. Качественной
характеристикой элемента, присутствующего в анализируемом растворе,
является наличие пика на регистрируемой вольтамперной кривой в определенной области потенциалов, высота пика пропорциональна концентрации
элемента.
Анализатор вольтамперометрический ВА-03
94
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8.4 Контрольные задания
1. Заполните таблицу
Элемент
Биологическая
роль
Состояния, при которых
уровень элемента
повышается
понижается
Содержание
в сыворотке
крови
Натрий
Калий
Кальций
Фосфор
2. Какова биологическая роль железа, меди, цинка, селена, йода в организме?
3. Приведите примеры органов депонирования различных элементов.
4. Как происходит всасывание элементов в желудочно-кишечном тракте?
5. Приведите примеры первичного и вторичного нарушения минерального обмена. При недостатке какого элемента развиваются флюороз, «лизуха»?
8.5 Тестовые вопросы для самоконтроля
1. _______ – макроэлемент, принимает участие в регуляции осмотического давления, входит в состав желудочного сока.
ОТВЕТ:
2. Микроэлемент, обладающий антиоксидантными свойствами, оказывает радиозащитное действие, повышает восприятие сетчаткой глаза световых лучей, участвует в иммунобиологической реактивности, при его недостатке возникает беломышечная болезнь, бесплодие. Суточная потребность составляет 0,1 мг/кг сухого вещества корма.
а) медь
б) кальций
в) магний
г) селен
д) цинк
е) железо
3. Элементарный состав шерсти овец зависит от породы, возраста, сезонных особенностей. Наличие какого химического элемента является обязательным для любой шерсти?
а) Na
б) Cu
в) Fe
г) S
95
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
д Co
е) Ag
4. Скорлупа является защитной оболочкой яйца. Она на 95 % состоит из
минеральных веществ. Какие соединения преобладают?
а) Na2CO3
б) MgCO3
в) CaSO4
г) CaCO3
д) NaCI
е) КС1
5. Этот вид воды обеспечивает приток к тканям питательных веществ и
удаление из них конечных продуктов обмена.
а) свободная
б) связанная 334
в) иммобильная
г) внутриклеточная
д) гидратационная
е) надмолекулярная
6. _______ поступает с кормом и водой. Всасывается в тонком отделе кишечника. Самая высокая его концентрация обнаруживается в плазме
крови. В составе соединения с хлором на 90 % определяет осмотическое
давление крови и регулирует водный обмен.
ОТВЕТ:
7. Эта вода образуется в организме при окислении органических веществ
(1 г углеводов – 0,55 г воды, 1 г белков – 0,41 г воды и 1 г жира – 1,07 г
воды).
а) свободная
б) связанная
в) экзогенная
г) гидратационная
д) иммобильная
е) эндогенная
8. _______ – микроэлемент, поступает с кормом. Около 70% входит в
состав гемма. Участвует в процессе дыхания.
ОТВЕТ:
9. _________ – макроэлемент, входящий в состав важнейшего макроэргического соединения.
ОТВЕТ:
10. Йод входит в состав:
96
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
а) глюкагона
б) паратгормона
в) кальцитонина
г) тироксина
д) эстрона
е) пролактина
Ответы: 1 хлор, 2г, 3г, 4г, 5а, 6 натрий, 7е , 8 железо, 9 фосфор,10г.
9 БИОХИМИЯ КРОВИ
Кровь − жидкая ткань. Она представляет собой непрозрачную жидкость красного цвета со слабощелочными свойствами (рН 7,3−7,5), своеобразного запаха и солоноватого вкуса. Кровь состоит из плазмы (50−55%) и
форменных элементов: эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов (45−50%).
В состав крови входят: белки, жиры, углеводы, различные промежуточные
и конечные продукты обмена, а также гормоны, витамины, минеральные
соединения.
Основные функции крови заключаются в доставке молекулярного кислорода и питательных веществ к клеткам животного организма и освобождении
тканей от углекислоты и конечных продуктов распада. Ткани организма весьма чувствительны к изменению состава крови, и даже небольшие изменения
в соотношении ее составных частей отражаются на состоянии непрерывно
протекающих обменных реакций организма. Всякие нарушения характера
метаболических процессов в тканях отражаются на составе крови, поэтому
определение количественного содержания ряда составных частей крови имеет исключительно важное значение для оценки состояния организма.
9.1 Техника получения сыворотки, плазмы
и дефибринированной крови
Получение сыворотки крови
Для получения сыворотки кровь набирают обычно из яремной вены
крупных животных в сухую стерильную пробирку. Следует следить за тем,
чтобы кровь текла равномерно и не разбивалась о стенки пробирки. Затем
кровь ставят в термостат при температуре 37 °С. Через 1 час ее переносят
на холод. Для лучшего отделения сгустка крови от сыворотки необходимо
обвести сгусток по краям пробирки стеклянной палочкой. Через 4−5 часов
стояния на холоде сыворотка в виде прозрачной желтоватой жидкости отделяется от кровяного сгустка и может быть использована для исследования.
Отстоявшаяся сыворотка отсасывается пипеткой.
97
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Для более быстрого получения сыворотки свернувшуюся кровь центрифугируют при 2500−3000 об/мин. В этом случае кровь можно набирать
сразу в центрифужную пробирку. Прозрачную сыворотку сливают в сухую
стерильную посуду и хранят в холодильнике при +4−7 °С.
Свертывание крови − чрезвычайно сложный ферментативный процесс,
в котором принимает участие ряд факторов. Исходным моментом является
разрушение тромбоцитов и выделение тромбокиназы (тромбопластина).
Под ее воздействием в присутствии ионов Са2+ плазменный белок протромбин превращается в тромбин. Последний вызывает переход растворенного
фибриногена в фибрин (в присутствии ионов Са2+), нити которого составляют основу тромба. Через несколько часов сгусток фибрина сжимается
(ретракция) и из него выдавливается сыворотка.
Получение плазмы крови
Плазма крови отличается от сыворотки наличием фибриногена. Для
того чтобы получить плазму крови, нужно предупредить процесс ее свертывания. С этой целью к крови прибавляют различные вещества, нарушающие
ту или иную фазу процесса свертывания. Чаще всего используемыми противосвертывающими веществами являются щавелево-кислый натрий или
калий, лимонно-кислый натрий, фтористый натрий, гепарин, гирудин и др.
Щавелево-кислые, лимонно-кислые и фтористые соли осаждают ионы
кальция в виде нерастворимых солей. Гепарин − вещество, получаемое из
печени, препятствует взаимодействию ионов кальция и протромбина и таким образом нарушает фазу образования активного фермента тромбина.
Гирудин − вещество, вырабатываемое пиявками, тормозит действие тромбина на фибриноген и тем самым нарушает последнюю фазу свертывания
крови.
Для получения плазмы в пробирки предварительно вносят одно из противосвертывающих средств (антикоагулянт). В расчете на 15−20 мл крови
берут следующее количество антикоагулянта: 2−3 капли 1%-ного раствора
гепарина или 3−4 капли трилона Б, 15−20 мг натрия лимоннокислого или
щавелево-кислого. В бóльших количествах добавлять эти средства нельзя, т.к. высокая их концентрация вызывает в крови различные изменения
вплоть до гемолиза.
Цельную кровь, сыворотку и плазму можно длительное время хранить
в холодильнике.
Получение дефибринированной крови
Вытекающую из сосуда кровь собирают в стакан и осторожно помешивают стеклянной палочкой, не касаясь при этом стенок стакана, чтобы не
травмировать эритроциты и избежать гемолиза. Фибрин наматывается на палочку и удаляется вместе с последней. Дефибринирование крови можно произвести с помощью другого метода. В стакан или колбу кладутся стеклянные
98
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
шарики (бусы), на которые и собирают кровь, вытекающую из кровеносного
сосуда. В процессе взятия крови содержимое стакана (колбы) помешивают
круговыми движениями, при этом фибрин оседает на шариках. Жидкую
кровь сливают через двойной слой марли и центрифугируют. Форменные
элементы крови оседают на дно, а сыворотка отсасывается пипеткой.
9.2 Свертывание крови
Значение ионов кальция для свертывания крови
Для этой работы можно воспользоваться оксалатной кровью, плазмой и
сывороткой. Щавелево-кислые соли препятствуют свертыванию крови, так
как осаждают ионы кальция, необходимые для превращения протромбина в
тромбин − фермент, вызывающий свертывание крови. Если появятся ионы
кальция, то восстанавливается способность крови к свертыванию − выпадает фибрин.
Ход работы. Берут четыре пробирки. В пробирку № 1 помещают
2−3 мл оксалатной крови; в пробирку № 2 − столько же оксалатной крови и
5−6 капель 3%-ного хлористого кальция; в пробирку № 3 − столько же оксалатной плазмы и 5−6 капель хлористого кальция; в пробирку № 4 − такое
же количество сыворотки крови и 5−6 капель хлористого кальция.
Пробирки слегка встряхивают и ставят в водяную баню при 37 °С.
Через 10−15 мин их вынимают и отмечают, где произошло свертывание.
Результаты опыта заносят в следующую таблицу. Делают соответствующие
выводы.
Условия опыта
№
пробирки
Субстрат
1
Оксалатная кровь
37°
2
Оксалатная кровь
37°
3
Оксалатная плазма
37°
4
Сыворотка
37°
добавлено
температ.
результат опыта
Определение скорости свертывания крови
Скорость свертывания крови может изменяться при ряде заболеваний
в связи с изменением ее состава. Поэтому определение скорости ее свертывания имеет большое практическое значение.
99
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Реактивы: этиловый спирт, диэтиловый эфир.
Ход работы. Кровь берется из тщательно выстриженной и обезжиренной при помощи спирта и эфира поверхности уха животного. Взятую каплю крови помещают на часовое стекло, которое как можно быстрее ставят
на водяную баню (30 °С). Время взятия крови регистрируют с помощью
секундомера с точностью до секунды.
Через 1 мин в капле крови с помощью стеклянной палочки производят
спиралеобразные движения, стремясь как бы захватить эту каплю. Затем
палочку быстро извлекают из капли, обмывают и высушивают. Спустя 30 с
операцию, описанную выше, вновь повторяют, и так до тех пор, пока на вытянутой из крови палочке не появятся ниточки фибрина. Это время и будет
началом свертывания крови.
Отмечается время образования сплошного сгустка, что считается окончанием процесса свертывания крови.
9.3 Электрофорез белков на бумаге
Белки сыворотки крови и отдельных тканей представлены набором
специфических белков, гетерогенных по своему составу, строению и функциям. Для разделения этих белков на отдельные фракции используют различные методы, в том числе и такой метод, как электрофорез на бумаге.
В основу этого метода положен следующий принцип. Каждый белок
несет на себе свободный электрический заряд и может перемещаться с
различной скоростью в электрическом поле. Величина электрического
заряда является индивидуальной характеристикой каждого белка, но она
зависит и от окружающей среды, в первую очередь от рН и ионной силы
раствора.
Если полоску фильтровальной бумаги смочить буферным раствором и
укрепить между полюсами электрического поля, после чего на нее нанести смесь белков и подключить источник электрического тока, то молекулы
белка будут мигрировать по фильтровальной бумаге в сторону полюса, заряд которого противоположен заряду белка. Скорость миграции молекул
белка пропорциональна величине их свободного заряда и градиенту потенциала электрического поля.
Картина, полученная в результате разделения белков на бумаге, обычно
выявляется при помощи красителей, специфически соединяющихся с белками (кислый, сине-черный, бромфеноловый синий и др.).
Приборы. Камера для электрофореза на бумаге. Источник постоянного тока силой до 20 мА и напряжением до 300 В. Электрофотоколориметр.
Штатив с пробирками. Микропипетка. Сушильный шкаф. Кювета
25×30 см. Пинцет.
100
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Реактивы. Хроматографическая бумага (полосы 3×26−30 см). Буферные растворы: 1) вероналовый буфер рН 8,6 (10,32 г мединала растворяют
в 300 мл дистиллированной воды, добавляют 1,84 г веронала и нагревают
на водяной бане до полного растворения веронала, после чего объем раствора доводят дистиллированной водой до 1 л); 2) борно-боратный буфер
рН 8,6 (5,57 г борной кислоты и 10,49 г буры растворяют в 700 мг дистиллированной воды и доводят водой до 1 л); 3) трисбуфер рН 8,9 (80,5 г триоксиметиламинометана, 6,02 г этилендиамино-четырехуксусной кислоты
и 4,6 г борной кислоты растворяют в 1 л дистиллированной воды); 4) краситель для обработки электропротеинограмм: а) кислый сине-черный
краситель (0,2 г), ледяная уксусная кислота (100 мл), метиловый спирт
(900 мл); б) бромфенол синий (0,5 г), сулема (10 г; ледяная уксусная кислота (20 мл), дистиллированная вода − 980 мл; в) бромфенол синий (0,1 г),
серно-кислый цинк водный (50 г), ледяная уксусная кислота (50 мл), вода
дистиллированная (900 мл); 5) растворы для отмывания избытка краски,
не связавшейся с белком: а) уксусная кислота, 2%-ный раствор; б) уксусная кислота, 10%- ная с 4% расплавленного фенола; в) спирт этиловый,
50%- ный; 6) растворы для элюции краски: а) едкий натрий, 0,01 н раствор
(для бромфенолового синего); б) едкий натр 0,1 н раствор (для кислого
сине-черного).
Ход работы. Электродные кюветы камеры заполняют буферным раствором и их отделения соединяют между собой кусочками фильтровальной
бумаги. Смачивают полосы хроматографической бумаги в буфере и остаток буфера удаляют путем промокания между листами фильтровальной
бумаги, после чего концы полос хроматографической бумаги опускают в
противоположные электродные камеры. Укрепляют их при помощи грузиков в строго горизонтальном положении. Бумажные полосы можно устанавливать также и сухими, которые затем должны пропитаться буферным
раствором.
На установленные полосы хроматографической бумаги при помощи
микропипетки наносят 0,01−0,03 мл сыворотки, отступив на 8−9 см от
катодного конца полосы. После этого камеру герметически закрывают и
подключают к источнику постоянного тока. Электрофорез осуществляется
при градиенте потенциала от 3 до 8 В на 1 см полосы. При длине полос
26−30 см это составляет 180−200 В. Сила тока при этом не должна превышать 0,3 мА на каждый сантиметр поперечного разреза бумажной полосы.
В зависимости от вида камеры, избранного буфера, вида и возраста животного, от которого бралась сыворотка, электрофорез продолжается от 6−7 до
16−18 часов. Так, в камерах ЭФА-1 при использовании борно-боратного буфера электрофорез длится 6−8 часов. По окончании электрофореза полосы
хроматографической бумаги извлекают из камеры и высушивают в сушиль101
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ном шкафу 20 мин при 105 °С. После высушивания электропротеинограммы окрашивают, погружая их на 30 мин в бромфеноловый синий краситель
с сулемой или на 8−20 ч в бромфеноловый синий с серно-кислым цинком.
Избыток краски отмывают 2%-ным раствором уксусной кислоты, сменяя
ее 4−5 раз. Для определения соотношения между фракциями белков полосу разрезают на отдельные участки по границам окрашенных участков,
каждую фракцию помещают в отдельную пробирку и заливают раствором
щелочи. Через 30 мин элюаты колориметрируют в электрофотоколориметре. Контролем при этом служит экстракт из неокрашенного участка спектропротеинограммы. Значения экстинций по каждой фракции суммируют
и их сумму принимают за 100%, после чего вычисляют, какой процент составляет каждая из фракций.
9.4 Контрольные задания
1. Перечислите основные функции крови.
2. В чем заключается разница между сывороткой и плазмой крови?
3. Назовите основные буферные системы крови. Объясните механизм
действия буферных систем на примере гидрокарбонатного буфера.
4. Какие белковые фракции получаются при электрофорезе плазмы
крови? Перечислите функции каждой фракции.
5. Как происходит свертывание крови, и какие вещества в нем участвуют?
6. Что такое остаточный азот плазмы крови? Азот каких веществ формирует основную часть остаточного азота?
7. Гем распадается с образованием железа и желчных пигментов.
Какова судьба этих соединений?
8. Перечислите производные гемоглобина.
9.5 Тестовые вопросы для самоконтроля
1. В норме рН крови составляет:
а) 7,36 – 7,4
б) 7, 89 – 7,99
в) 8,98 – 9,76
г) 6,54 – 6, 78
д) 5, 45 – 5, 67
2. Поддерживая постоянство температуры тела в разных его частях,
кровь выполняет:
а) терморегуляторную функцию
б) дыхательную функцию
102
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
в) выделительную функцию
г) строительную функцию
д) защитную функцию
3. Гомеостаз – это ...
а) постоянство внутренней среды
б) качественно-однородные вещества
в) система лечения малыми дозами лекарств
г) моделирование свойств живых организмов
д) неблагоприятные условия среды
4. Выберите утверждения, характеризующие эритроциты:
а) высокоспециализированные клетки
б) переносят водород от легких к тканям и диоксид углерода, образующийся при метаболизме, из тканей к альвеолам легких
в) транспорт О2 и СО2 в этих клетках осуществляет гемоглобин, составляющий 95% их сухого остатка
г) организм взрослого человека содержит около 25×1012 эритроцитов,
при этом каждые сутки обновляется примерно 1 % этого количества клеток
д) переносят азот и угарный газ от легких к тканям
5. Клетки, которые переносят кислород от легких к тканям и диоксид
углерода, образующийся при метаболизме, из тканей к альвеолам легких,
называются:
а) эритроциты
б) лимфоциты
в) нейтрофилы
г) моноциты
д) макрофаги
6. Особенности строения эритроцитов:
а) большая площадь поверхности обеспечивает эффективность газообмена
б) эластичная клеточная мембрана облегчает движение по узким капиллярам
в) специальная ферментативная система защищает эти клетки от активных форм кислорода
г) содержат многодольчатое ядро
д) способность образовывать псевдоподии
7. Эритроциты, так же как и другие клетки крови, образуются из:
а) полипотентных стволовых клеток костного мозга
б) лейкоцитов – нейтрофилов, моноцитов
в) интерлейкина-3
г) макрофагов
д) специализированных клеток плазматической мембраны
103
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8. Для снижения концентрации холестерина в крови рекомендуется:
а) диета с повышенным содержанием крахмала
б) ограничение животных жиров
в) диета с повышенным содержанием клетчатки
г) голодание
д) интенсивные физические нагрузки
9. Поддержание градиента концентраций Na+ и К+ по обе стороны
мембраны эритроцита обеспечивает:
а) мембранный фермент Na+,K+-ATФ-aза
б) цитоплазматический фермент Na+,K+-ATФ-aза
в) мембранный фермент Na+,K+-ATФ-aза
г) мембранный фермент Са2+-АТФ-аза
д) мембранный фермент Мg+,K+-ATФ-aза
10. Мембранный фермент, осуществляющий выведение из эритроцитов ионов кальция и поддерживающий градиент концентрации этого иона
по обе стороны мембраны...
а) мембранный фермент Na+,K+-ATФ-aза
б) цитоплазматический фермент Na+,K+-ATФ-aза
в) мембранный фермент Na+,K+-ATФ-aза
г) мембранный фермент Са2+-АТФ-аза
д) мембранный фермент Мg+,K+-ATФ-aза
Ответы: 1а, 2а, 3а, 4а,в,г, 5а, 6а,б,в, 7а, 8б, 9а, 10г.
10 БИОХИМИЯ МОЧИ
В процессе обмена веществ в организме образуются различные вредные продукты распада. Удаление этих продуктов производится с мочой.
С мочой, например, выделяется основная часть продуктов азотистого и минерального обмена, а также такие ядовитые продукты, как фенолы, аммиак,
лекарственные вещества и др.
Моча имеет сложный состав. Исследование мочи имеет большое значение, так как ее химический состав отражает даже самые незначительные
сдвиги в химизме крови. Анализ мочи помогает при постановке диагноза и
оценке эффективности лечения.
По своему составу моча значительно отличается от крови. В ней, как
правило, нет белка или имеются лишь его следы. Сахар практически отсутствует. В моче много мочевины (2,3%). Моча плотоядных животных кислая
(преобладают соли NaH2PO4), травоядных − щелочная (превалируют соли
Na2HPO4).
104
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Количество мочи у домашних животных зависит от самых разнообразных причин и колеблется в следующих пределах, в литрах в сутки: лошади 3−11; коровы 6−23; овцы 0,5−2,0; верблюды 8−15; свиньи 2−6; кролики
0,04−0,1; собаки 0,2 – 0,5; кошки 0,2−0,5.
Свежая моча большинства животных прозрачна, у лошади и осла она
немного мутная за счет фосфатов и тягуча благодаря присутствию муцина. Моча различных животных имеет цвет от светло-желтого до темно-коричневого. Цвет мочи зависит от количества растворенных в ней
пигментов, главным образом урохромов и других красящих веществ.
Ненормальную окраску моча может приобрести в связи с присутствием в
ней крови, гемоглобина, желчных пигментов и жира. Цвет мочи может изменяться в зависимости от введения лекарственных веществ.
Моча лошади имеет запах фенолов, крупного рогатого скота − затхлый,
у свиней запах мочи неприятный, острый, а у собак моча пахнет чесноком.
При стоянии на воздухе моча темнеет и приобретает аммиачный запах. Удельный вес мочи у различных животных неодинаков: лошади
1,025−1,060; кролики 1,010−1,060; коровы 1,025−1,050; козы 1,020−1,040;
овцы 1,020−1,070; свиньи 1,010−1,040; верблюды 1,030−1,060; собаки
1,015−1,060.
Осмотическое давление мочи зависит от концентрации в ней неорганических солей и главным образом хлоридов, фосфатов и карбонатов.
Оно изменяется в зависимости от характера кормления и водного режима. Депрессия мочи лошади составляет 1,7−2,0, крупного рогатого скота −
1,2−2,0 и свиньи − 1,0−1,5.
10.1 Количественное определение хлоридов в моче
Определение количества хлоридов в моче имеет большое значение при
диагностике отравления животных поваренной солью. В ряде случаев эти
показатели являются единственным надежным признаком отравления.
Принцип метода. Хлориды мочи оттитровываются раствором азотнокислой ртути в присутствии азотной кислоты и нитропруссида натрия.
Химизм реакции. Ионы хлора связываются в виде слабодиссоциированной хлорной ртути:
2NaCl+Hg(N03)2 → HgCl2 + 2NaNO3.
По мере связывания ионов хлора ионы ртути образуют осадок нитропруссида ртути:
Hg(NO3)2 + Na2[Fe(CN)5NO] → Hg(Fe(Cl)5NO] + 2NaN03.
105
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Реактивы: ртуть азотно-кислая окисная, 0,1 н раствор.
Приготовление: к 7 мл концентрированной азотной кислоты добавляют
мелкими порциями при осторожном помешивании 11 г желтой окиси ртути. Объем раствора доводят дистиллированной водой до 1 л и устанавливают титр по 0,1 н раствору. Для установления титра к 10 мл титрованного
раствора HCl добавляется 8−10 капель концентрированной азотной кислоты, 3−4 капли 30%-ного раствора нитропруссида натрия и оттитровывают
раствором азотно-кислой ртути до появления мути, не исчезающей в течение минуты. Нитропруссид натрия, 30%-ный раствор. Азотная кислота,
концентрированная.
Ход работы. 10−15 мл мочи фильтруют через бумажный фильтр в пробирку. 5 мл профильтрованной мочи переносят в коническую колбу, куда
добавляют 2−3 мл концентрированной азотной кислоты и 3−4 капли нитропруссида натрия.
Содержимое колбы титруется раствором азотно-кислой ртути до помутнения раствора. Образовавшаяся муть не должна исчезать на протяжении минуты.
Расчет: 1 мл 0,1 н раствора азотно-кислой ртути связывает 0,00355 г
хлора. Это соответствует 0,00585 г хлористого натрия. Допустим, на титрование 5 мл мочи пошло 15,30 мл азотно-кислой ртути.
Тогда 15,30 × 0,00585 = 0,089 г хлористого натрия, или 15,30 × 0,00355 =
0,054 г хлора.
Процентное содержание хлористого натрия в данной пробе мочи будет
составлять:
x =
0 , 089 × 100
5
= 1 , 79 % ,
а хлора:
x =
0 , 54 ×100
5
= 1 , 08 % .
Содержание хлоридов в моче домашних животных 0,6−0,9%.
10.2 Патологические составные части мочи
При различных патологических состояниях организма в моче могут появляться вещества, которых в составе нормальной мочи нет. К патологическим составным частям мочи относятся: белок, сахар, ацетоновые тела,
кровь, желчные пигменты, уробилин, индикан и другие вещества.
106
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Белок
В нормальной моче белок содержится в очень незначительных количествах. При патологических условиях (воспаление почек, расстройство
сердечной деятельности и др.) содержание белка в моче увеличивается настолько, что его можно обнаружить обычными реакциями. Белок мочи состоит преимущественно из сывороточного альбумина и сывороточного глобулина. Моча, содержащая кровь, также дает реакцию на белок. Появление
белка в моче обычно не превышает 1 %, очень редко доходит до 4 %; однако наблюдались случаи, когда содержание белка в моче достигало 8 %.
Обнаруживают белок в моче следующими пробами.
Проба с кипячением
Реактивы: лакмусовая бумага; уксусная кислота, 1%-ный раствор.
В пробирку берут 3−5 мл мочи. Мочу, кислую на лакмус, кипятят сразу,
мочу щелочной реакции предварительно слабо подкисляют 1%-ной уксусной кислотой, взбалтывают и затем подогревают до кипения. При наличии
в моче белка, в зависимости от его количества, в нагретой части образуются: опалесценция, муть или хлопья от коагулированного белка.
При кипячении пробирку держат в наклонном положении таким образом, чтобы пламя горелки охватывало верхний слой жидкости. Нельзя пробирку подогревать снизу, так как закипающая снизу моча выбрасывается из
пробирки. Нельзя пробирку держать и так, чтобы пламя охватывало стекло
выше слоя жидкости, так как пробирка от такого нагревания лопнет.
Если в моче белка немного и нагревание производилось только верхней
части пробирки, то появившаяся в верхней части пробирки опалесцирующая муть хорошо заметна на черном фоне.
Проба с азотной кислотой
Реактив: азотная кислота, 50%-ный раствор.
В пробирку наливают 1−2 мл 50%-ного раствора азотной кислоты, на
которую осторожно наслаивают, приливая по стенке пробирки профильтрованную мочу, так, чтобы получилось два несмешивающихся слоя: внизу − азотная кислота, наверху − моча. По линии соприкосновения жидкостей при наличии в моче белка образуется мутный белый слой или, как его
обычно называют, белое кольцо, состоящее из свернувшегося белка.
В случае нормальной мочи на границе двух жидкостей может появиться красное кольцо в результате изменения мочевых пигментов под влиянием азотной кислоты. Иногда мутное кольцо появляется выше границы.
Такое явление может зависеть от выпадения осадков кислых мочекислых солей, или муцина мочи.
107
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Углеводы
Появление сахара в моче наблюдается при бешенстве, нервной форме
чумы собак, нарушениях функции печени, панкреатической железы и др.
У лошадей глюкозурия встречается реже, чем у собак. Лактозурия наблюдается при родильном парезе, воспалении вымени, закупорке сосков, маститах. Содержание сахара в моче достигает 8−10 %, а иногда и больше.
Определение сахара в моче производится обычными реакциями на сахар.
Обнаружение сахара в моче с помощью качественной пробы
Троммера
Реактивы: едкий натрий, 10%-ный раствор; серно-кислая медь.
К 2−3 мл мочи нужно прибавить приблизительно 1/3 объема 10%ного раствора едкого натрия и затем осторожно, по каплям, разбавленный
раствор сернокислой меди до появления небольшой, не исчезающей при
взбалтывании голубой мути гидрата окиси меди. Затем жидкость в верхней
ее части нагревают до начала кипения.
Нагревание производится только до начала кипения, и ждут не более
1 мин появления желто-красного осадка закиси меди. Изменение цвета без
осадка может быть при наличии муцина, мочевой кислоты и др.
Ацетоновые тела
Ацетоновые тела − ацетон, ацетоуксусная и β-оксимасляная кислоты являются продуктами неполного окисления в организме жирных кислот и появляются в моче в результате расстройства жирового обмена, при
диабете, при истощении, при острых лихорадочных заболеваниях и др.
Источником образования ацетоновых тел, помимо жиров, могут служить и
белки после дезаминирования аминокислот. Наличие ацетона определяется
следующими реакциями.
Проба с йодистым калием
Реактивы: едкий натр, 10%-ный раствор; раствор йода в йодистом
калии.
В пробирку наливают 2−3 мл мочи, прибавляют несколько капель раствора едкого натра и затем по каплям раствор йода в йодистом калии. При наличии ацетона жидкость делается мутной вследствие выделения бледно-желтого
кристаллического осадка йодоформа, обладающего характерным запахом:
CH3−CO−CH3 + 3 J2 → CJ3−CO−CH3 + 3 HJ
CJ3−CO−CH3 + KOH → CHJ3 + CH3COOK
3 HJ + 3 KOH → 3 H2O + 3 KJ
CH3−CO−CH3 + 3 J2 + 4 KOH → 3 H2O + 3 KJ + CH3COOK + CHJ3 .
108
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Желчные пигменты
Желчные пигменты появляются в моче при застое желчи в желчном пузыре или вследствие повышенного распада кровяных пигментов. Желчные
пигменты попадают в кровь и оттуда выводятся с помощью почек. Часто
желчные пигменты появляются в моче собак. В моче лошадей они появляются при желтухах, при заболевании ИЭМ, пироплазмозе и др.
Сущность реакций на желчные пигменты состоит в том, что под влиянием азотной и азотистой кислот пигменты окисляются с образованием характерных для желчных пигментов колец зеленого, синего и фиолетового
цветов. Чувствительность этой пробы 1:80000.
Моча при наличии желчи имеет буровато-желтый цвет; при взбалтывании легко образуется желтая пена, которая долго не исчезает.
Проба Гмелина
Реактив: азотная кислота, концентрированная.
В пробирку наливают 1−2 мл концентрированной азотной кислоты с
примесью азотистой (азотная кислота, стоявшая на свету и пожелтевшая,
обычно содержит следы азотистой кислоты) и осторожно прибавляют
из пипетки по стенке пробирки исследуемую мочу так, чтобы жидкости
не смешались. В месте их соприкосновения образуется ряд цветных колец. Характерным для желчных пигментов является образование верхнего зеленого кольца и одновременно с ним синего или фиолетового.
Нижерасположенные желтое и красное кольца получаются и с нормальной
мочой. При стоянии все кольца постепенно становятся желтого цвета.
Индикан
В толстом кишечнике под влиянием бактериальных процессов аминокислота − триптофан − подвергается разложению с образованием индола.
Последний всасывается в кровь воротной вены и в печени обезвреживается, соединяясь после окисления с серной или глюкуроновой кислотой.
H2C
CH
NH2
C
OH
N
H
N
H
Триптофан
OSO3OK
OH
O
Индол
N
H
Индоксил
N
H
Индикан
В ничтожном количестве индикан содержится в любой нормальной
моче. В моче лошади индикана много всегда. Повышение содержания индикана имеет важное диагностическое значение при различных формах кишечной непроходимости.
109
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Принцип метода. Находящиеся в моче индоксилсерная и индоксилглюкуроновая кислоты при прибавлении крепкой соляной кислоты разлагаются на свои составные части и освободившийся при этом индоксил окисляется КМnО4 в синее индиго, растворимое в хлороформе. При нормальном
содержании индикана хлороформ имеет бледно-синюю окраску, при повышенном количестве − синюю окраску с фиолетовым оттенком, при резко
повышенном количестве − густую синюю окраску с фиолетовым оттенком.
Реактивы: соляная кислота, концентрированная; марганцовокислый
калий, 1−2%-ный; хлороформ.
К 2−3 мл мочи приливают такое же количество крепкой соляной кислоты, 2−3 капли 1−2%-ного КМnО4 и 2 мл хлороформа. Пробирку плотно
закрывают пробкой и несколько раз переворачивают, извлекая индиго хлороформом. При наличии индикана хлороформ окрашивается в синий цвет,
интенсивность которого зависит от количества индикана.
10.3 Определение креатинина в моче
Креатинин является составной частью мочи. Во взрослом организме
креатинин образуется в мышцах при дефосфорилировании креатинфосфорной кислоты.
NH2
С
N
P
HN
NH
CH3
С
N
NH
CH3
OH
O
OH
NH
+ АДФ
АТФ +
С
NH
N
CH3
CН2
CН2
CН2
СООН
СООН
С
Креатин
Креатинфосфат
O
Креатинин
Креатин в моче взрослых животных не содержится. Креатинурия наблюдается лишь в тех случаях, когда идет интенсивный распад тканей.
В моче молодняка содержатся как креатинин, так и креатин.
Принцип метода. В щелочной среде с пикриновой кислотой креатинин
дает пикрат креатинина красного цвета. В щелочной среде с раствором нитропруссида натрия креатинин образует изонитрозокреатинин, имеющий
красную окраску, переходящую постепенно в желтую.
Качественные реакции на креатинин
Реактивы: а) пикриновая кислота, насыщенный раствор (12 г в 1 л);
б) едкий натр, 10%-ный раствор; в) нитропруссид натрия, 3%-ный раствор; г) уксусная кислота, 5%-ный раствор.
110
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Реакция с пикриновой кислотой
В пробирку наливают 2 мл мочи и добавляют 5−6 капель раствора едкого натра и 3−4 капли пикриновой кислоты. Содержимое пробирки окрашивается в оранжевый цвет.
Реакция с нитропруссидом натрия
2 мл мочи подщелачивают 5−6 каплями едкого натра и добавляют
3 капли нитропруссида. Жидкость пробирки окрашивается в красный цвет,
который постепенно переходит в желтый. При подкислении уксусной кислотой переход красного цвета в желтый значительно ускоряется. Последнее
обстоятельство отличает реакцию на креатинин от реакции на ацетон. При
добавлении уксусной кислоты при наличии в моче ацетона красная окраска
переходит не в желтую, а в вишневую.
10.4 Определение аммиака в моче
Аммиак является продуктом дезаминирования аминокислот и нуклеотидов. Его содержание в моче зависит главным обрезом от характера пищи
и функционального состояния печени. Аммиак ядовит. В организме он
обезвреживается в печени и других тканях.
Принцип метода. При взаимодействии аммонийных солей с формальдегидом образуется соляная кислота, которая в последующем оттитровывается щелочью.
В нейтральной среде аммонийные соли распадаются с образованием
гексаметилентетрамина (уротропин) НСl:
4 N H 4C l + H − C − H
N 4 (C H 2 ) 6 + H 2 O + 4 H C l
O
Реактивы: а) едкий натр, 0,1 н раствор; б) фенолфталеин, 1%-ный
спиртовой раствор; в) формольная смесь (готовится перед употреблением). К 50 мл формалина прибавляется 1 мл 0,05%-ного водно-спиртового
(1:1) раствора фенолфталеина и затем 0,2 н раствор щелочи до слабого
розового окрашивания.
Ход работы. 5 мл свежей мочи наливают в колбу, туда же вносят 1−2 капли фенолфталеина и добавляют 0,1 н раствор щелочи, доводя содержимое
колбы до слабощелочной реакции по фенолфталеину (слабо-розовая окраска). Затем в колбу добавляют 2,5 мл формольной смеси и титруют 0,1 н
едким натром до слабо-розовой окраски, не исчезающей в течение 1 мин.
Учитывается количество щелочи, пошедшей на титрование.
Расчет: 1 мл 0,1 н раствора щелочи эквивалентен 1,7 мг аммиака.
Умножая количество миллилитров щелочи, пошедшей на титрование по111
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
сле добавления формольной смеси, на 1,7, получают содержание аммиака в
5 мл мочи, которое было взято для исследования.
Пример расчета. На титрование 5 мл мочи пошло 1,5 мл 0,1 н раствора
щелочи. Тогда:
x=
1,5×1 ,7 ×100
5
= 51,0 мг % аммиака
10.5 Контрольные задания
1. Какие органические и неорганические вещества присутствуют в
моче здорового животного?
2. Какие вещества появляются в моче при патологических состояниях?
3. Как образуется моча в почках?
4. Какое вещество является основным азотистым компонентом мочи
животных и птиц?
5. Какие гормоны регулируют водно-минеральный обмен? Какой гормон регулирует реабсорбцию ионов натрия из первичной мочи?
6. Какими методами определяется белок в моче?
10.6 Тестовые вопросы для самоконтроля
1. В каких пределах в норме колеблется суточное количество мочи?
а) 300 –700 мл
б) 500 –1000 мл
в) 1000 –1600 мл
г) 1500 –2500 мл
д) 2000 –3000 мл
2. Чем обусловлен цвет нормальной вторичной мочи?
а) непрямой билирубин
б) индикан
в) урохром
г) стеркобилиноген
д) гомогентизиновая кислота
3. В зависимости от чего может меняться интенсивность окраски мочи
от соломенно-желтой через оранжевую до интенсивно-коричневой?
а) концентрация гемоглобина
б) концентрация билирубина
в) концентрация гомогентизиновой кислоты
112
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
г) концентрация метгемоглобина
д) концентрация урохрома
4. Что измеряют урометром?
а) количество суточной мочи
б) оптическую плотность мочи
в) цвет мочи
г) удельный вес мочи
д) плотность мочи
5. Выберите конечный продукт обмена пурина у здоровых людей.
а) мочевина
б) мочевая кислота
в) креатин
г) ксантин
д) гипоксантин
6. Назовите соединение, выделяемое с мочой и отражающее роль печени в обезвреживании токсических веществ.
а) креатин
б) глутаминовая кислота
в) гиппуровая кислота
г) мочевая кислота
д) гомогентизиновая кислота
7. Что из перечисленного принадлежит к числу наиболее часто встречающихся осадков кислой мочи?
а) фосфорно-кислая аммиакмагнезия
б) углекислый кальций
в) кислый мочекислый аммоний
г) мочевая кислота
д) кальций фосфорно-кислый
8. Когда обнаруживают кетоновые тела в моче?
а) только при сахарном диабете
б) только при полном голодании
в) только при углеводном голодании
г) вообще не обнаруживают
д) при сахарном диабете, полном голодании, углеводном голодании
Ответы: 1в, 2в, 3д, 4д, 5б, 6в, 7г, 8д.
113
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
11 БИОХИМИЯ МОЛОКА
Молоко представляет собой непрозрачную белую жидкость с желтоватым оттенком, сладковатого вкуса и слабого своеобразного запаха. Цвет молока в значительной степени зависит от содержания в молоке провитамина
А − каротина, придающего ему желтоватый оттенок.
Удельный вес цельного молока несколько выше воды − 1,028−1,034,
снятого − 1,032−1,038. рН коровьего молока 6,57.
Молоко состоит из молочной плазмы и жира, взвешенного в виде мельчайших шариков размером 1−5 мкм. Состав молока разных животных представлен в следующей таблице.
Молоко
Коровье
Кобылье
Ослицы
Козье
Овечье
Верблюжье
Буйволицы
Свиньи
. Кошки
Собаки
Крольчихи
Оленье
Состав молока различных животных
Содержание в %
вода
белки
жиры
молочный
сахар
соли
87,3
90,3
90,1
87,0
84,0
86,5
83,0
82,4
81,5
77,0
70,0
65,0
3,4
1,7
1,8
3,7
5,1
4,0
4,6
6,1
9,3
9,7
15,5
14 – 20,0
3,6
1,1
1,4
4,0
6,1
4,0 – 5,0
7,4
6,4
3,5
9,3
10,4
17,0
5,0
6,0
6,0
4,5
4,2
5,6
4,2
4,0
4,9
3,1
1,9
2,8
0,7
0,4
0,5
0,9
1,0
0,9
0,9
1,1
0,7
0,9
2,7
1,5
Важнейшим белком молока является фосфопротеид – казеиноген, имеющий ИЭТ − 4,7. В молоке имеются также лактоальбумин и лактоглобулин.
Белки молока не свертываются при кипячении. Свертывание казеиногена
наступает лишь после подкисления молока. При подкислении степень диссоциации казеиногена значительно понижается. Свободный недиссоциированный казеиноген выпадает в осадок.
Главной составной частью липидов молока являются триглицериды с
преобладанием: олеиновой, миристиновой, пальмитиновой, лауриновой и
масляной кислот.
114
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Углеводы молока представлены преимущественно лактозой. Это дисахарид, состоящий из галактозы и глюкозы. Имеется небольшое количество
глюкозы (0,1 %).
Молоко при полноценном кормлении животных богато каротином и витамином А, а также витаминами групп С, D, В. В молоке содержится ряд
ферментов: амилаза, каталаза, ксантиноксидаза, дегидразы и др.
Минеральные вещества молока весьма разнообразны. Молоко богато
кальцием (до 140 мг%), фосфором (80−100 мг%), калием (140 мг%), но
сравнительно бедно железом. Как сообщает С.И. Афонский, количество
железа в 1 л молока коров определяется на уровне 0,5 мг, коз − 0,45, овец −
до 1,1, лошадей − до 0,7, свиней − до 1,1 и собак − до 4,1 мг.
Состав молока зависит от индивидуальных особенностей животного,
характера кормления и содержания. Физиологическое и патологическое состояние организма также влияет на состав и качество молока.
11.1 Качественный анализ молока
Белки молока
Казеиноген относится к группе фосфопротеидов. Он нерастворим в
воде, но легко растворяется в слабых щелочах. При кипячении казеиноген
не свертывается, соли казеиногена − казеинаты − с щелочными и щелочноземельными металлами легко растворимы. При гидролизе казеиногена
среди других аминокислот получены в значительном количестве триптофан, тирозин и метионин. Глицина совсем нет. Казеиноген молока может
быть выделен в виде казеина при действии на молоко кислотами, например, уксусной, молочной, соляной и другими или же в виде соли путем
насыщения молока средними солями щелочных металлов (серно-кислый
аммоний, хлористый натрий). При скисании молока казеиноген выпадает
в виде осадка (казеин) под действием молочной кислоты, образующейся
из молочного сахара (лактозы) под влиянием бактерий молочно-кислого
брожения. Этот же процесс происходит под влиянием сычужного фермента
в присутствии солей кальция. После удаления из молока казеиногена получается молочная сыворотка, в которой содержатся молочные альбумин и
глобулин, сахар и минеральные соли. Жир захватывается осадком казеина.
Осаждение казеина
Реактивы: а) уксусная кислота, 0,1%-ная; б) едкий натр, 1%-ный;
в) сода в растворе.
25−30 мл молока разбавляют в стакане или колбе 3−4 объемами воды и
к жидкости прибавляют по каплям при помешивании 0,1%-ную уксусную
кислоту до прекращения выделения хлопьевидного белого осадка казеина,
захватывающего с собой также и жиры. Прибавлять кислоту надо очень
115
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
осторожно, так как в избытке кислоты казеин легко растворяется. Осадок
отфильтровывают, тщательно промывают на фильтре 2 − 3 раза водой.
Осадок и фильтрат вместе с промывными водами сохраняют для дальнейшей работы.
Небольшую часть осадка (казеин + жир) обрабатывают 1%-ным едким
натром или раствором соды: казеин растворяется, жир остается во взвешенном состоянии. Жидкость фильтруют через влажный фильтр. Жир задерживается на фильтре. С фильтратом проводят реакции на белки (цветные и
по осаждению).
Молочный сахар
Молочный сахар − дисахарид − при гидролизе распадается на глюкозу
и галактозу.
Н
С
Н
С
ОН
НО
С
Н
НО
С
Н
Н
С
O
СН2ОН
Остаток галактозы
O
Н
С OH
Н
С
ОН
НО
С
Н
H
Н
O
С
С
СН2ОН
Остаток глюкозы
Как видно из формулы, молочный сахар содержит одну свободную альдегидную группу, вследствие чего он дает реакции восстановления металлов, реагирует с фенилгидразином, образуя озазон, растворяющийся в горячей воде, а при охлаждении выпадающий в виде тонких игл желтого цвета.
Для реакций используют безбелковый фильтрат, оставшийся от предыдущего опыта после осаждения альбуминов и глобулинов. С одной частью
фильтрата проводят пробу Троммера.
Определение кислотности молока
Определение кислотности молока имеет большое практическое значение для оценки его свежести. Свежее молоко связывает небольшое количество щелочи. Это зависит от наличия в нем белков и однозамещенных
фосфорно-кислых солей, обладающих слабокислыми свойствами.
В молоке при его хранении происходит молочно-кислое брожение, в
результате чего накапливается молочная кислота:
116
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
C12H22O11 + H2O → C6H12O6 + C8H12O6
лактоза
глюкоза галактоза
C6H12O6 → CH3CHOH COOH
глюкоза
молочная кислота
Кислотность молока выражается в градусах. Под 1 градусом подразумевается количество миллилитров децинормального раствора щелочи,
идущее на нейтрализацию 100 мл исследуемого молока. Свежее молоко
коровы имеет 15−18°, стоявшее молоко − 20−22°, несвернувшееся, но свертывающееся при кипячении − 24−27°.
Реактивы: а) едкий натр, 0,1 н раствор; б) фенолфталеин, 0,1%-ный
спиртовой раствор; в) молоко.
В коническую колбу отмеряют 10 мл исследуемого молока, добавляют
20 мл дистиллированной воды и 2−3 капли фенолфталеина. Содержимое
колбы тщательно взбалтывают и титруют из бюретки 0,1 н раствором щелочи до появления неисчезающего в течение двух минут слабо-розового
окрашивания.
Количество пошедшей на титрование щелочи, умноженное на 10 (пересчет на 100), и будет показывать кислотность данного молока в градусах.
Например: на титрование 10 мл молока пошло 2,2 мл щелочи.
Кислотность молока в градусах = 2,2×10=22°.
11.2 Количественные реакции на составные
части молока
Определение белков в молоке
Определение белка в молоке производят по той же схеме, что и белков
других тканей. Взятую навеску молока озоляют в колбе Кьельдаля с помощью серной кислоты в присутствии катализатора пергидроля. Прозрачный
минерализат исследуют на содержание азота ранее описанными методами.
Полученную цифру общего азота умножают на коэффициент − 6,45, принимается во внимание содержание азота в белках молока, равное 15,5 %;
100 : 15,5 = 6,45. Найденная величина и будет показывать количество белка
в молоке.
Определение содержания лактозы
Основным углеводом молока является молочный сахар, или лактоза.
Лактоза представляет собой дисахарид, состоящий из галактозы и глюкозы, сравнительно хорошо растворяется в воде. Она играет важную роль при
производстве ферментированных молочных продуктов, т.к. является основным питательным веществом для молочно-кислых микроорганизмов, под
воздействием которых происходит молочно-кислое брожение.
117
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Массовую долю лактозы в молоке определяют с помощью йодометрического метода, основанного на взаимодействии в щелочной среде альдегидной группы молочного сахара и йода.
Реактивы: а) раствор сульфата меди; б) раствор йода, 0,1 н раствор;
в) крахмал, 1%-ный раствор; г) тиосульфат натрия, 0,1 н раствор; д) гидроксид натрия, 0,1 н раствор; е) соляная кислота, 0,5 н раствор.
В стакан отвешивают 10 г молока и переносят его в мерную колбу на
250 мл. Стакан ополаскивают водой и выливают ее в ту же колбу, добавляют воду до половины колбы и перемешивают. Для осаждения белков и
жира приливают 5 мл сульфата меди и 2 мл гидроксида натрия, содержимое
перемешивают после добавления каждого раствора. В колбу доливают воду
до метки и раствор вновь перемешивают.
Содержимое колбы оставляют на 20−30 мин, затем фильтруют через
сухой фильтр в сухую колбу. Первые 20 мл фильтрата сливают. К 25 мл
фильтрата (что соответствует 1 г молока), отмеренного пипеткой в коническую колбу, добавляют 25 мл раствора йода и постепенно при непрерывном
помешивании наливают 37,5 мл раствора гидроксида натрия. Закрыв колбу
пробкой, оставляют ее на 20 мин в темноте. Затем приливают 8 мл соляной кислоты и выделившийся йод титруют раствором тиосульфата натрия в
присутствии раствора крахмала. Титрование сначала ведут без индикатора
до получения светло-желтой окраски. После этого прибавляют 1 мл раствора крахмала и продолжают титровать до момента, когда исчезнет синяя
окраска раствора.
Холостую пробу ставят следующим образом: к 25 мл раствора йода
постепенно, при непрерывном помешивании приливают 37,5 мл раствора гидроксида натрия. Затем приливают 8 мл соляной кислоты и титруют
выделившийся йод тиосульфатом натрия в присутствии раствора крахмала
как указано выше.
Содержимое молочного сахара А (%) вычисляют по формуле:
А = 1,75 (а − в),
где а − количество раствора тиосульфата натрия, пошедшего на титрование
йода, выделившегося в холостой пробе, мл;
в − количество раствора тиосульфата натрия, пошедшего на титрование
йода, выделившегося в фильтрате молока, мл.
Определение содержания кальция
Из общего количества минеральных веществ молока до 20 % падает на
долю кальция. Количество кальция в молоке различных животных зависит
от вида животных, характера кормления, сезона года и других факторов.
Среднее содержание кальция в молоке коровы 140 мг%, козы − 142 мг%,
кобылы − 83 мг%.
118
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Нормальное развитие молодняка и, в первую очередь, их рост и развитие
костяка в значительной степени обусловлено поступлением кальция с молоком. В молоке кальций находится в оптимальных соотношениях с фосфором
(1,5 : 1) и поэтому хорошо усваивается организмом. 78% кальция молока
представлено неорганическими солями, 22% соединено с белком казеином.
Определение кальция в молоке проводят по методу де-Ваарда. Ранее
метод де-Ваарда был изложен применительно к исследованию сыворотки
крови. Исследование молока имеет некоторые особенности.
Реактивы: а) щавелево-кислый аммоний, 4%-ный раствор; б) аммиак,
2%-ный раствор; в) серная кислота, 1 н раствор; г) марганцево-кислый
калий, 0,01 н раствор; д) молоко.
В цилиндр емкостью 10 мл набирают 1 мл молока и 9 мл дистиллированной воды. Содержимое тщательно перемешивают. 1 мл разведенного
молока переносят в центрифужную пробирку. Во вторую пробирку (слепой
опыт) наливают 1 мл воды. В обе пробирки добавляют по 0,5 мл щавелевокислого аммония.
Дальнейшие исследования производятся так же, как и при определении, кальция в сыворотке крови.
Расчет. Для исследования берут 1 мл разведенного молока (фактически
в 1 мл смеси содержится 0,1 мл молока). Допустим, что в условиях нашего
опыта на титрование исследуемых проб пошло 0,81 мл перманганата, а на
контроль (слепой опыт) − 0,20, тогда:
Содержание Ca =
0 , 2 ( 0 ,81 ) − 0 , 20
0 ,1
×100 = 122,0 мг%.
11.3 Контрольные задания
1. Каковы особенности химического состава молока различных видов
животных?
2. Как и где синтезируются основные компоненты молока коровы?
3. Наличие каких компонентов в молоке придает ему высокую биологическую ценность?
4. Перечислите особенности химического состава молозива.
11.4 Тестовые вопросы для самоконтроля
1. В молоке коров количество белка может колебаться от 2 до 5 %. Какой
фосфопротеид является основным белком молока?
ОТВЕТ:
119
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. Молоко является секретом молочной железы, оно состоит из плазмы
и жировых шариков. Плотность молока 1,027 – 1,033. Какую часть молока
(%) составляет вода?
а) 50
б) 60
в) 70
г) 80
д) 90
е) 100
3. Молоко, секретируемое в первые дни лактации, называется молозивом. Какое максимальное количество белка содержит молозиво?
а) 8
б) 10
в) 12
г) 14
д) 16
е) 18
4. В молоке коровы может содержаться от 3 до 6 % молочного сахара,
являющегося дисахаридом. Из остатков каких моноз состоит лактоза?
а) б – D – глюкоза, в – D – фруктоза
б) б – D – глюкоза, в – D – галактоза
в) 2 б – D – глюкозы
г) 2 б – D – галактозы
д) 2 в – D – фруктозы
е) б – D – глюкоза, в – D – манноза.
5. В жирах молока (триглицеридах) обнаружено 15 различных кислот.
Из общего числа жирных кислот около половины приходится на две ненасыщенную и насыщенную, какие?
а) С17Н31СООН, С17Н29СООН
б) С17Н31СООН, С17Н35СООН
в) С15Н31СООН, С17Н33СООН
г) С17Н31СООН, С17Н27СООН
д) С15Н31СООН, С17Н35СООН
е) С17Н33СООН, С16Н33СООН
6. Молекулы основного белка молока имеют глобулярную форму и образуют мицеллы, сычужный фермент разрушает мицеллы. Что происходит
с молоком?
а) декоагуляция
б) гидролизация
в) деление на фракции
г) створаживание
120
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
д) сбраживание
е) ничего не происходит
7. _____ – белок молока и молочных продуктов.
ОТВЕТ:
8. В молоке животных обнаружено 76 химических элементов. Различают
макроэлементы и микроэлементы. Микроэлементом является:
а) Са
б) Р
в) Mg
г) Na
д) Zn
е) S
9. В молоке в преобладающем количестве содержится ________
а) Са
б) Р
в) Mg
г) Na
д) Zn
е) S
10. Устойчивость коллоидных частиц казеина в молоке обусловлено ...
а) электрическим зарядом и гидрофильностью
б) строением первичной структуры
в) наличием незаменимых аминокислот
г) наличием заменимых аминокислот
д) присутствием в молоке витаминов
е) присутствием в молоке Са
Ответы: 1 казеин, 2д, 3е, 4б, 5в, 6г, 7 казеин, 8д, 9а, 10а.
121
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ПРАВИЛА
по технике безопасности при работе в химическом кабинете
1. Работать в химическом кабинете разрешается только в белом халате с
длинными рукавами. Длинные волосы должны быть аккуратно подобраны.
2. Не приступайте к работе до полного уяснения всей техники ее выполнения, так как беспорядочность, поспешность или неряшливость в
работе часто приводит к плохим результатам опыта и необходимости его
переделки с тратой реактивов или даже к несчастным случаям.
3. Все процедуры при выполнении работы (отмеривание реактивов, их
переливание, нагревание и т.д.) можно производить только на своем рабочем столе или в вытяжном шкафу.
4. Необходимо соблюдать большую осторожность при работе с крепкими кислотами и щелочами (10% и выше). Особая аккуратность и осторожность необходимы при работе с концентрированными кислотами и щелочами, а также с фенолом, уксусным ангидридом и пергидролем и др. Следует
остерегаться попадания указанных реактивов на кожу (ожоги) и на одежду
(разъедание ткани, возникновение дыр).
5. При нагревании пробирок в пламени спиртовки возможно бурное
вскипание и выброс содержимого на расстояние 2−3 м, что особенно опасно в случае попадания кипящих брызг в лицо и глаза. Для предупреждения подобных случаев нагревание пробирок следует проводить у мениска
жидкости при непрерывном вращении, периодически вынимая из пламени.
Необходимо следить, чтобы отверстие нагреваемой пробирки не было направлено на кого-либо из присутствующих в лаборатории.
6. При работе с центрифугами следует плотно закрывать крышку и запирать ее на замок. Увеличивать скорость вращения можно лишь постепенно. Открывать крышку центрифуги разрешается только после полной
остановки ротора.
7. Категорически запрещается нагревать на открытом пламени спиртовки взрывоопасные вещества (эфир, хлороформ и др.), а также зажигать
спиртовку в присутствии их паров.
8. По окончании работы все приборы отключаются, водопроводные
краны перекрываются.
9. Все вопросы по технике безопасности, возникшие в процессе работы, следует немедленно выяснить у преподавателя.
122
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ПРИЛОЖЕНИЯ
1. Химическая посуда
123
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. Множители и приставки для образования десятичных кратных
и дольных единиц
Приставки
Приставки
МножиМножиОбозначение
Обозначение
НаименоНаименотель
тель
междумеждувание
вание
русское
русское
народное
народное
1018
экса
Э
Е
10 – 1
деци
д
d
15
пета
П
Р
10 – 2
санти
с
с
10
тера
Т
Т
103
милли
м
m
1012
гига
Г
G
10 – 1
микро
мк
^
109
6
–9
мега
М
М
10
нано
н
п
10
кило
к
k
10 – 12
пико
п
Р
103
(гекто)
г
h
10 – 15
фемто
ф
f
102
1
18
(дека)
да
da
10
атто
а
а
10
124
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3. Основные обозначения
Греческие
буквы
Названия букв
Обозначаемая величина
α
альфа
Степень диссоциации, тип структуры белка,
степень гидролиза
β
бета
Степень гидролиза, тип структуры белка
γ
гамма
Коэффициент активности
Г
гамма
Поверхностный избыток вещества
Δ
дельта
Депрессия, смещение, приращение
ε
эпсилон
Диэлектрическая проницаемость
ζ
дзета
Дзета потенциал
η
эта
Вязкость, коэффициент полезного действия
κ
каппа
Удельная электропроводность
λ
ламда
Эквивалентная электропроводность, длина
волны света, скрытая теплота испарения
μ
мю
Ионная сила
π
пи
Отношение длины окружности к диаметру,
осмотическое давление
ρ
ро
Удельное сопротивление
Σ
сигма
(заглавная буква)
Символ суммы
σ
сигма
Поверхностное натяжение
τ
тау
Время, период полупревращения
φ
Фи
Работа выхода электрона, объем частицы
125
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4. Константы диссоциации некоторых слабых электролитов
Электролит
Выражение для константы
диссоциации К
Вода
К=
Гидрат окиси аммония
К=
Сернистая кислота
К1 =
Сероводородная кислота
К=
Синильная кислота
К=
Угольная кислота
К1 =
Фосфорная кислота
К1 =
Уксусная кислота
К=
126
[H+] [OH -]
[H2O]
[NH4 +] [OH -]
[NH4ON]
[H+] [HSO3 - ]
[H2SO3]
[H+] [HS - ]
[H2S]
[H+] [CN - ]
[HCN]
[H+] [HСO3 - ]
[H2СO3]
[H+] [H2РO4 - ]
[H3РO4]
[H+] [С2Н3O2 - ]
[НС2Н3O2 ]
Числовые величины
константы диссоциации
(при 25 градусах)
1,8 · 10 – 16
1,79 · 10 – 5
1,3 · 10 – 2
5,7 · 10 – 8
7,2 · 10 – 10
4,31 · 10 – 7
7,51 · 10 – 3
1,86 · 10 – 5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5. Диагностическое значение некоторых показателей крови животных
Показатель
АЛТ (аланинамино-трансфераза)
АСТ (аспартатамино-трансфераза)
Находится в большом количестве
в миокарде и печени,
для дифференциальной
диагностики используется
коэффициент
Ритиса= АСТ/АЛТ=1,3 в норме
Альфа-амилаза
(образуется в слюнных железах
и поджелудочной железе,
катализирует расщепление
углеводов)
ГЛДГ (глутомат-дегидрогеназа)
фермент матрикса митохондрий,
является специфическим
печеночным ферментом
Патология
Увеличение показателя
Снижение показателя
Паренхиматозные заболевания
печени, особенно в инкубационном
периоде вирусного гепатита
Коэффициент Ритиса
При инфекционном
повышается при поражениях
гепатите, за счет
миокарда, например, при
повышения активности
инфаркте, за счет
АЛТ
повышения активности АСТ
Заболевания поджелудочной
железы, поражения слюнных
желез, незначительно
при вирусном гепатите,
почечной недостаточности
Заболевания печени,
миоглобинурия лошадей,
инфаркт миокарда,
беломышечная болезнь,
лейкозы
127
Гипофункия
поджелудочной
железы
Не имеет
диагностического
значения
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Продолжение приложения 5
Показатель
ЩФ (щелочная фосфатаза)
лизосомальный фермент,
синтезируется в повышенных
количествах в гепатоцитах
при застое желчи, в остеобластах
при нарушении минерализации
костей
КК (креатин-киназа)
цитозольный фермент,
активный только
в поперечно-полосатой
мышечной
ткани
Глюкоза (сахар)
Патология
Увеличение показателя
Закупорка желчного
протока, циррозы,
новообразования
в печени, болезнь Кушинга,
гиперадренокортицизм,
заболевания костей,
связанные с повышенной
остеобластной
активностью (остеосаркома,
остеомаляция)
Дегенеративные миопатии
Снижение показателя
Не имеет
диагностического
значения
Инсулярная гипергликемия –
сахарный диабет, острый
панкреатит (проходящее
явление при затухании
заболевания);
экстраинсулярная
гипергликемия –
алиментарная,
центрального генеза
(травмы ц.н.с.,
менингиты и т.д.),
гормональная,
печеночная
Гипогликемия –
голодание,
нарушение
гликогенолиза
(заболевания печени,
отравления),
снижение секреции СТГ,
тироксина,
глюкокортикоидов,
почечная глюкозурия,
усиление гликолиза
(опухоль островков
Лангерганса)
128
Не имеет
диагностического
значения
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Продолжение приложения 5
Показатель
Общий белок
(гипо- и гиперальбуминемия
встречаются в тех же случаях)
Альфа-глобулины
Бета-глобулины
Гамма-глобулины
Креатинин (конечный продукт
обмена креатинфосфата,
участвующего в обеспечении
сокращения мышц)
Мочевая кислота (конечный
продукт превращения
пуриновых оснований)
Патология
Увеличение показателя
Гиперпротеинемия – миеломная
болезнь (патологический белок),
дегидратация (относительная
гиперпротеинемия), травмы, ожоги
Воспалительные процессы
Железодефицитные анемии,
нарушения липидного обмена,
прием эстрогенов, беременность,
заболевания почек
Острые воспаления, цирроз печени,
бронхиальная астма, ИБС,
туберкулез, хронический гепатит
Гломерулонефрит (ранний признак,
возрастает раньше мочевой кислоты),
тяжелая сердечная декомпенсация,
закупорка мочевыводящих
путей, остеодистрофия
Высокое содержание пуринов в пище,
заболевания почек, подагра, лейкозы,
В12 дефицитная анемия,
сахарный диабет
129
Снижение показателя
Гипопротеинемия – повышенная
потеря белка, заболевания почек,
кровопотери, злокачественные
новообразования, нарушения синтеза
белка при заболеваниях печени,
голодание, мальадсорбция
Не имеет
диагностического
значения
Длительные хронические
инфекции, лечение цитостатиками,
лучевая болезнь, нарушение
образования иммуноглобулинов
Не имеет
диагностического
значения
Не имеет
диагностического
значения
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Продолжение приложения 5
Показатель
Мочевина (конечный продукт
белкового обмена)
Холестерин
(80 % образуется в печени,
20 % поступает с пищей)
Триглицериды (эфиры
жирных кислот и глицерина)
Общий билирубин
Калий
Натрий
Патология
Увеличение показателя
Снижение показателя
Почечная недостаточность, нарушения Не имеет
оттока мочи, заболевания с усиленным диагностического
распадом белков, дегидратация,
значения
сердечно-сосудистые заболевания
Холестаз, сахарный диабет,
Гипертиреоз
механическая и паренхиматозная
желтуха, нефротический синдром,
гипотиреоз, гиперадренокортицизм
Гипертония, панкреатит,
Голодание, мальадсорбция,
нефротический синдром, гипотиреоз, тиреотоксикоз, парентеральное
сахарный диабет, заболевания печени, введение гепарина и витамина С
ИБС, прием кортикостероидов
Гемолитическая желтуха (В12
дефицитная анемия, сфероцитоз,
сидеробластная анемия, интоксикации)
при нормальном или слегка повышенном уровне прямого билирубина
Гиперкалиемия – почечная недостаГипокалиемия – первичный
точность, гемолитические анемии,
и вторичный альдостеронизм,
повышенный распад клеток (опухоли, несахарный диабет, рвота, понос
некрозы), анафилаксия, дегидратация,
гипофункция коры надпочечников
(б-нь Аддисона)
Гипернатриемия – несахарный
Гипонатриемия – недостаточность
диабет, гиперкортицизм, дегидратация почек, диабетический ацидоз,
недостаточность надпочечников,
понос, рвота
130
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Продолжение приложения 5
Показатель
Кальций (пластическая
и структурная роль – возбудимость,
сократимость, свертываемость крови,
активация ряда ферментов и гормонов)
Магний (участвует в углеводном
и фосфорном обмене, стимулирует
перистальтику ЖКТ, желчеотделение,
обладает сосудорасширяющим
и противовоспалительным действием)
Фосфор (обмен Р зависит от КЩС,
вит. Д, кальция, гормонов, главным
образом паращитовидных
и щитовидной желез; участвует
в различных метаболических
процессах)
Хлориды (участвуют в поддержании
КЩС и баланса воды)
Патология
Увеличение показателя
Гиперкальциемия – гиперфункция
паращитовидных желез, опухоли
паращитовидных желез, переломы
костей, злокачественные опухоли
костной ткани, лейкозы,
гипервитаминоз Д, желтухи,
перитонит, гангрена (задержка кальция
в поврежденных тканях)
Гипермагниемия (сочетается
с гиперкальциемией) – хроническая
почечная недостаточность,
гипотиреоз, диабетический ацидоз
Гиперфосфатемия гипофункция
паращитовидных желез,
гипервитаминоз Д,
диабетический кетоз, акромегалия,
заболевания почек
Гиперхлоремия – дегидратация,
заболевания почек, лечение
минералокортикоидами,
несахарный диабет, респираторный
алкалоз
131
Снижение показателя
Гипокальциемия – рахит, алиментарные дистрофии, беременность,
гипофункция паращитовидных
желез, острый панкреатит, экзема,
экссудативные диатезы,
гипонатриемия, лечение
кортикоидами
Гипомагниемия (сочетается
с гипокалиемией) – мальадсорбция,
полиурия, тиреотоксикоз, повышенная
функция паращитовидных желез,
беременность, цирроз печени
Гипофосфатемия – рахит,
гиперпаратиреоз, остеомаляция
Гипохлоремия – избыточное
потоотделение, рвота, понос,
респираторный ацидоз,
диабетический кетоз,
прием диуретиков
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Продолжение приложения 5
Показатель
Железо (дыхание, кроветворение,
иммунобиологических
и окислительно-восстановительных
реакциях, входит в состав многих
ферментов, гемаглобина, миоглобина.
Переносится в составе
белка трансферрина)
Медь (входит в состав
ферментов (цитохромоксидаза,
уриказа и др.), принимает участие
в обмене гормонов, белков, углеводов,
синтезе гемаглобина, иммунологических процессах, влияет
на деятельность ц.н.с., сердечнососудистой системы, процессы роста
и размножения.
Медь всасывается в ЖКТ,
накапливается в печени, почках,
селезенке, щитовидной железе
Кобальт (синтез вит. В12,
участвует
в углеводном и белковом
обменах)
Патология
Увеличение показателя
Снижение показателя
Гипосидеремия – острые
Гиперсидеремия – гемолитические
инфекционные заболевания,
анемии, перницитозоподобные
железодефицитные анемии,
анемии, вирусный гепатит,
хроническая почечная
наследственные и приобретенные
недостаточность
гиперхроматозы (повышенное
всасывание и накопление железа
в организме)
Гиперкупремия – острые
Гипокупремия –
инфекции, заболевания печени,
некоторые виды анемий
лейкозы, анемии, злокачественные
новообразования
Гипокобальтоз – тяжелое
заболевание, развивающееся
при недостаточном поступлении Со
с пищей (нарушение функций
ц.н.с., жкт, структуры кожи)
132
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Продолжение приложения 5
Показатель
Селен (антиоксидант, играет роль
в иммунной реактивности,
процессах размножения и зрении)
Патология
Увеличение показателя
При избыточном поступлении Se
развивается щелочная болезнь
и «вертячка» КРС и овец
Йод (входит в состав гормонов
щитовидной железы)
133
Снижение показателя
При недостатке Sе нарушаются
процессы размножения.
При недостатке вит. Е и Se
развивается беломышечная болезнь
При недостаточном поступлении
в организм развивается патология
щитовидной железы, нарушаются
процессы роста и размножения
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
СОДЕРЖАНИЕ
Предисловие ...................................................................................................... 3
Список сокращений .......................................................................................... 5
1 Свойства и методы выделения белков ....................................................... 7
1.1 Свойства белков ...................................................................................... 7
1.2 Изоэлектрическая точка белков ............................................................ 8
1.3 Тепловая денатурация белков .............................................................. 10
1.4 Осаждение белков солями тяжелых металлов ................................... 11
1.5 Методика решения задач...................................................................... 12
1.6 Контрольные задания ........................................................................... 12
1.7 Тестовые вопросы для самоконтроля ................................................. 13
2 Ферменты .................................................................................................... 15
2.1 Исследование общих свойств ферментов .......................................... 18
2.2 Количественное определение каталазы крови по Баху..................... 22
2.3 Контрольные задания ........................................................................... 23
2.4 Тестовые вопросы для самоконтроля ................................................. 24
3 Витамины ..................................................................................................... 26
3.1 Качественные реакции на витамины ................................................. 28
3.2 Количественное определение витамина С ......................................... 33
3.3 Контрольные задания ........................................................................... 35
3.4 Тестовые вопросы для самоконтроля ................................................. 36
4 Гормоны ........................................................................................................ 38
4.1 Открытие йода в щитовидной железе ................................................ 39
4.2 Гормоны мозгового слоя надпочечников............................................ 39
4.3 Гормоны поджелудочной железы........................................................ 40
4.4 Контрольные задания ........................................................................... 41
4.5 Тестовые вопросы для самоконтроля ................................................. 42
5 Химия и обмен углеводов .......................................................................... 43
5.1 Количественное определение глюкозы в крови................................. 45
5.2 Исследование анаэробного распада гликогена или крахмала .......... 49
5.3 Контрольные задания ........................................................................... 52
5.4 Тестовые вопросы для самоконтроля ................................................. 53
6 Химия и обмен липидов ............................................................................. 54
6.1 Жиры (нейтральные жиры) ................................................................. 55
6.2 Фосфатиды, или фосфолипиды........................................................... 58
6.3 Стероиды ............................................................................................... 60
6.4 Ферментативный гидролиз липидов................................................... 61
6.5 Контрольные задания ........................................................................... 63
6.6 Тестовые вопросы для самоконтроля ................................................ 64
134
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7 Химия и обмен аминокислот, пептидов и белков .................................. 66
7.1 Колориметрическое определение общего количества азота ............ 66
7.2 Определение общего азота по Къельдалю (микрометод) ................. 69
7.3 Определение белкового и небелкового азота ..................................... 71
7.4 Определение азота аминокислот......................................................... 72
7.5 Хроматография аминокислот .............................................................. 74
7.6 Гидролитическое расщепление белка ферментами
поджелудочной железы .............................................................................. 76
7.7 Дезаминирование аминокислот .......................................................... 80
7.8 Переаминирование (трансаминирование) аминокислот .................. 83
7.9 Контрольные задания ........................................................................... 84
7.10 Тестовые вопросы для самоконтроля ............................................... 85
8 Химия и обмен минеральных веществ ..................................................... 87
8.1 Определение содержания кальция в сыворотке крови ..................... 90
8.2 Определение содержания фосфора в молоке..................................... 92
8.3 Определение содержания йода в молоке ............................................ 94
8.4 Контрольные задания ........................................................................... 95
8.5 Тестовые вопросы для самоконтроля ............................................... 95
9 Биохимия крови ......................................................................................... 97
9.1 Техника получения сыворотки, плазмы
и дефибринированной крови ..................................................................... 97
9.2 Свертывание крови ............................................................................... 99
9.3 Электрофорез белков на бумаге ........................................................ 100
9.4 Контрольные задания ......................................................................... 102
9.5 Тестовые вопросы для самоконтроля ............................................... 102
10 Биохимия мочи ....................................................................................... 104
10.1 Количественное определение хлоридов в моче............................. 105
10.2 Патологические составные части мочи .......................................... 106
10.3 Определение креатинина в моче ..................................................... 110
10.4 Определение аммиака в моче .......................................................... 111
10.5 Контрольные задания ....................................................................... 112
10.6 Тестовые вопросы для самоконтроля ............................................. 112
11 Биохимия молока ................................................................................... 114
11.1 Качественный анализ молока .......................................................... 115
11.2 Количественные реакции на составные части молока.................. 117
11.3 Контрольные задания ....................................................................... 119
11.4 Тестовые вопросы для самоконтроля ............................................. 119
Правила по технике безопасности при работе
в химическом кабинете .............................................................................. 122
Приложения .................................................................................................. 123
135
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Учебное издание
Никулин Владимир Николаевич
Курушкин Виталий Викторович
Шукшина Светлана Сергеевна
Никулин Артем Владимирович
Лабораторный практикум по биологической химии
Подписано в печать 25.10.2012. Формат 60×84/16. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 7,9. Тираж 300 экз.
Отпечатано в Издательском центре ОГАУ. Заказ № 4444.
460014, г. Оренбург‚ ул. Челюскинцев‚ 18. Тел. (3532) 77 - 61-43.
Документ
Категория
Химические науки
Просмотров
419
Размер файла
7 965 Кб
Теги
практикум, 333, биологическая, химия, лабораторная
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа