close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Перевозкина М.Г. ТЕСТИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ КИНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ Perevozkina M.G. TESTING OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF POLYFUNCTIONAL CONNECTIONS BY KINETIC METHODS

код для вставкиСкачать
TESTING OF ANTIOXIDANT ACTIVITY OF POLYFUNCTIONAL CONNECTIONS BY KINETIC METHODS Перевозкина М.Г. ТЕСТИРОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ КИНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
Перевозкина Маргарита Геннадьевна
ТЕСТИРОВАНИЕ
АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ
ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ
СОЕДИНЕНИЙ
КИНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
Монография
Новосибирск
2014
УДК 54+615
ББК 24+52.8
П26
Главный редактор:
Дмитриева Н.В., кандидат медицинских наук, доктор психологических
наук, профессор.
Рецензенты:
Сидорова К.А., доктор биологических наук, профессор, директор
Института биотехнологии и ветеринарной медицины Государственного аграрного университета Северного Зауралья, г. Тюмень;
Козьминых В.О., доктор химических наук, профессор, заведующий
кафедрой химии естественнонаучного факультета Пермского государственного гуманитарно-педагогического университета.
Перевозкина, М.Г.
П26 «Тестирование антиоксидантной активности полифункциональных соединений кинетическими методами»: — Монография. —
Новосибирск: Изд. СибАК, 2014. — 240 c.
ISBN 978-5-4379-0368-1
Монография посвящена исследованию антиоксидантных свойств
органических соединений различной структуры (фенолов, аминов,
серосодержащих соединений) в процессе инициированного и каталитического окисления липидных субстратов, кинетики совместного
ингибирующего действия синтетических и природных антиоксидантов.
Книга основана на экспериментальном материале с непосредственным
участием автора.
Издание предназначено для врачей, клинических фармакологов,
исследователей в области медицины и фармакологии, аспирантов,
студентов медицинских и биологических специальностей.
ББК 24+52.8
ISBN 978-5-4379-0368-1
© Перевозкина М.Г., 2014
© НП «СибАК», 2014
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение……………………………………………………………...
6
Глава 1. Свободнорадикальное окисление липидов
в присутствии антиоксидантов (обзор литературы)……………...
8
1.1. Направления практического применения
антиоксидантов………………………………………………...
8
1.2. Основы теории свободнорадикального окисления
органических соединений…………………………………….
9
1.3. Кинетика и механизм действия ингибиторов…………..
14
1.4. Состав, локализация и биологические функции
липидов…………………………………………………………
21
1.5. Особенности кинетики и механизма окисления
липидов…………………………………………………………
29
1.6. Представления о механизмах синергизма
и антагонизма в совместном действии антиоксидантов……
38
Глава 2. Материалы и методы……………………………………...
45
Глава 3. Моделирование процессов окисления липидов
биомембран в присутствии антиоксидантов………………………
61
3.1. Разработка кинетической модели экспресстестирования антиоксидантов..……………………………….
61
3.2. Тестирование антиоксидантных свойств традиционных
лекарственных препаратов……………………………………
74
Глава 4. Антиоксидантная активность бис-фенилтиолов
при окислении мицеллярных субстратов…………………………..
113
Глава 5. Кинетика окисления катализируемых субстратов
в присутствии аскорбиновой кислоты и экстракта
элеутерококка………………………………………………………..
124
Глава 6. Кинетика окисления метилолеата в присутствии новых
производных салициловой кислоты……………………………….
132
Глава 7. Антиоксидантная активность мексидола и бис-[3-(3,5ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил]дисульфида
(стабилизатор СО-4) в составе синергических смесей…………....
145
Глава 8. Взаимосвязь химической структуры и ингибирующего
действия производных фенозана при окислении метилолеата….
161
Глава 9. Кинетика совместного ингибирующего действия
синтетических и природных антиоксидантов……………………..
179
Глава 10. Сравнительная оценка активности феноксильных
радикалов антиоксидантов различного строения…………………
198
Заключение………………………………………………………….
205
Список литературы………………………………………………...
209
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АО
— антиоксиданты
АОА — антиоксидантная активность
АРА
— антирадикальная активность
ХЛ
— хемилюминесценция
ПОЛ — перекисное окисление липидов
КК
— кинетические кривые
МО
— метилолеат
ЭО
— этилолеат
МЛ
— метиллинолеат
ЛК
— линолевая кислота
ФЛ
— фосфолипиды
ДПФХ — дипалмитоилфосфатидилхолин
АК
— арахидоновая кислота
-ТФ — -токоферол
ТФ
— токофероксильный радикал
ИХФАН — условное название группы производных фенозана-1
(метилокса)
[3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропионовой кислоты]
ЦТМАБ — триметилцетиламмоний бромид
ПАВ — поверхностно-активное вещество
АИБН — азо-бис-изо-бутиронитрил
5
ВВЕДЕНИЕ
К настоящему времени синтезировано и получило широкое
применение значительное количество антиоксидантов. Многие
из них применяются для стабилизации окисления топлива, смазочных
масел, пластмасс, резинотехнических изделий. Особые требования
предъявляются к ингибиторам окисления, применяемым в медицине,
фармации и пищевой промышленности. Перечень нетоксичных,
официально разрешенных к использованию антиоксидантов невелик.
Наиболее широко используют дибунол (ионол) [36, 82, 215],
α-токоферол [10—13, 36, 40, 41, 117, 175, 188, 213, 220, 229, 236, 239,
240, 241, 294, 296, 322, 360, 362, 364, 365, 393], β-каротин [124, 130—132,
215, 279, 290, 327, 349,
353, 370, 371, 374, 386, 411],
убихинон [53, 108, 137, 159, 168, 249, 272—274, 292, 306, 315, 316, 348,
354, 342], флавоноиды [272, 301].
Во всем мире происходит целенаправленный поиск эффективных
ингибиторов окисления среди природных объектов: морского
промысла [31], лекарственных растений [22, 79, 80], сапропелей [207]
и др. Исследования подобного рода позволили открыть новые классы
антиоксидантов, отыскать новые природные источники известных
ингибиторов окисления. В последние годы широко исследуются
в качестве потенциальных ингибиторов окисления природные
пигменты: β-каротин [271], астаксантин [81, 124, 344], зеаксантин и др.
Большинство структур, обнаруженных в результате скрининга
природных объектов, в последующем получают синтетическим путем.
Примером такого рода является убихинон (коэнзим Q 10), который стал
широко применяться в качестве лекарственного препарата,
обеспечивающего функционирование в организме электронотранспортных цепей, влияющих на энергетические процессы [63, 121,
137, 302, 342, 348].
Ведется поиск перспективных антиоксидантов из числа
традиционных лекарственных препаратов с целью расширения спектра
их фармакологического действия. Создаются новые кинетические
модели для тестирования антиоксидантной активности гидрофильных
соединений в условиях, приближенных к биологическим средам.
Синтезируются ингибиторы нового поколения на основе модификации химической структуры известных соединений. В результате
направленного синтеза получены новые антиоксиданты «гибридной»
структуры, сочетающие в себе несколько фрагментов, независимо
или синергически действующих на разные стадии сложного процесса
окисления [70, 123, 148, 149, 170, 173, 192, 193].
6
Работы такого рода стали возможны на основе теории
ингибирования процессов свободнорадикального окисления, знания
закономерностей и механизма действия различных классов
органических соединений.
Одним из направлений создания высокоэффективных ингибиторов окисления является поиск синергических смесей. Синергисты
обеспечивают значительное усиление действия ингибитора,
что позволяет применять его в меньшем количестве. В качестве
синергистов природного происхождения исследуются фосфолипиды [44, 45, 215, 216, 335, 336], аминокислоты [403, 410], аскорбиновая
кислота [286, 293, 326, 328, 365, 373, 385, 388, 404, 402].
Изучение кинетики и механизма взаимодействия антиоксидантов
и синергистов
разной
природы
представляет
теоретический
и практический интерес, поскольку позволяет создавать новые
способы предотвращения окисления органических материалов.
Эффекты антагонизма, возможные в действии новых синтетических
антиоксидантов и компонентов клеточных мембран, необходимо
учитывать при стабилизации окисления биологически активных
липидов, при использовании антиоксидантов в качестве лекарственных средств.
Настоящая работа вносит вклад в развитие всех указанных
направлений. В исследовании представлены результаты тестирования
новых антиоксидантов, синтезированных разными известными
отечественными школами: в Институте биохимической физики
им. Н.М. Эммануэля РАН (г. Москва), в Новосибирском институте
органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН (г. Новосибирск).
Несмотря на существенные различия в структурах исследуемых
нами синтетических антиоксидантов, их объединяет наличие одного
или нескольких фенольных фрагментов разной степени экранированности, а также присутствие амино-, амидных, сульфидных групп
или остатков аминоспиртов (коламина, холина). Структура последних
дополнительно включает заместители с разной длиной цепи
алкильного радикала, включающего 1, 8, 10, 12, 16 углеродных атомов.
Кроме скрининга эффективности антиоксидантов, предпринят
поиск синергических композиций с соединениями природного
происхождения (α-токоферолом и фосфолипидами), совместно локализованными в биологических мембранах. Обнаружение эффектов
неаддитивности в действии новых антиоксидантов и природных
соединений позволит учитывать их при стабилизации лабильных
липидов природного происхождения.
7
ГЛАВА 1.
СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
В ПРИСУТСТВИИ АНТИОКСИДАНТОВ
(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
В настоящей главе рассмотрены области практического
применения ингибиторов окислительной деструкции органических
соединений, изложены основы теории свободнорадикального
окисления углеводородов, показан механизм антиоксидантного
действия соединений различного строения, рассмотрен состав
и биологические функции липидов, особенности их окисления
в биологический мембранах.
1.1. Направления практического применения антиоксидантов
Антиоксиданты нашли широкое практическое применение
в химии и химической технологии, пищевой промышленности,
фармации [1, 66, 74, 82, 269, 378].
После
патентования
в 1940 году [269] 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола в качестве
добавки для стабилизации жиров и жиросодержащих продуктов,
широко развернулись работы по поиску малотоксичных антиоксидантов для пищевых продуктов. В этот период детально исследована
антиоксидантная, антирадикальная активность токоферолов в эфирах
высших ненасыщенных жирных кислот, углеводородах, других
модельных субстратах, пищевых жирах, приведены многочисленные
обзоры этих работ [39, 118, 269, 378]. Исследована антиоксидантная
активность различных природных соединений и их синтетических
аналогов [11, 12, 232], растительных экстрактов [79, 80], изучено
влияние аскорбиновой кислоты на процесс окисления, качество жиров
и пищевых продуктов.
В 50-х годах с развитием радиобиологии появились представления
о свободнорадикальном механизме развития не только процессов
радиационного поражения, но и других патологий [39, 125, 137,
138, 139, 142, 155]. Приоритет в развитии этих направлений принадлежит
отечественной
школе
ученых
Московского
государственного
университета во главе с профессором Б.Н. Тарусовым, который впервые
предположил, что мишенью для действия радиации могут быть не только
молекулы ДНК, но и легкоокисляемые структуры ненасыщенных
липидов биологических мембран. Исследования в области свободнорадикальных
процессов
принадлежат
школам
академиков
Н.Н. Семенова и Н.М. Эмануэля в стенах институтов Химической
8
и Биохимической физики РАН. Продолжением этого направления
являются работы под руководством профессора Е.Б. Бурлаковой,
посвященные влиянию малых и сверхмалых доз антиоксидантов
на протекание реакций окисления, механизмам образования
и трансформации активных форм кислорода (АФК) и продуктов
перекисного окисления липидов (ПОЛ) в организме.
В результате многочисленных исследований установлен
свободнорадикальный
механизм
развития
большинства
патологий [8, 18, 60, 111, 122, 138, 139, 155, 177, 191, 256].
Доказано
существование универсального механизма регулирования интенсивности ПОЛ биомембран с помощью биоантиоксидантов [11, 37, 39, 71,
76, 187, 238, 254, 337, 338, 363]. Следствием этих работ являлось
исследование антиоксидантной активности в биологических мембранах эндогенных и экзогенных ингибиторов окисления [105, 138, 139,
242, 280, 281, 308, 384, 395, 400, 412].
В настоящее время малотоксичные ингибиторы процессов
окисления используются в качестве радиозащитных и противоопухолевых препаратов, внедряются в антиоксидантотерапию при лечении
многих патологий от воспалительных процессов [59, 60, 109, 122,
196, 233, 278, 285] до сердечно-сосудистых заболеваний [77, 153, 185].
Антиоксиданты используются как адаптогены при стрессах [21, 164],
неблагоприятных воздействиях окружающей среды [229]. Развивается
новый раздел науки — биологическая кинетика. Теоретической базой
широкого применения антиоксидантов в различных направлениях
является теория свободнорадикальных процессов.
1.2. Основы теории свободнорадикального окисления
органических соединений
Окисление органических соединений молекулярным кислородом
протекает
по механизму разветвленных цепных реакций.
За это открытие отечественный физхимик Николай Николаевич
Семёнов и английский исследователь Сирил Хиншельвуд были
в 1956 году удостоены Нобелевской премии по химии [208].
Дальнейшее развитие теории применительно к жидкофазному
окислению углеводородов и жирно-кислотным компонентам липидов
принадлежит ученым школы академика Н.М. Эмануэля [259—269],
крупному русскому биохимику А.Н. Баху, зарубежным ученым:
K.O. Engler, J.L. Bolland, H.P. Koch [287—289].
Элементарный механизм жидкофазного окисления углеводородов молекулярным кислородом представлен схемой [208, 264]:
9
I.
Инициирования цепей
RH + O  R + HO
2RH + O  2R + HO
(0.1)
(0.2)
II. Продолжение цепей
R + O  RO
RO + RH  ROOH + R

(1)
(2)
III. Разветвление цепей
ROOH  RO + HO
2ROOH  RO+ RO + HO
n+
Me + ROOH  Me(n+1)+ + RO + OH
(3.1)
(3.2)
(3.3)
IV. Обрыв цепей
R  + R   M
R + RO  M
RO + RO M
(4)
(5)
(6)
Примечание. RH — углеводород (липид); R — алкильный
радикал; RO — алкоксильный радикал; RO — пероксидный радикал;
ROOH — органический гидропероксид, HO — гидроксильный
радикал; М — молекулярные продукты.
Известен би- и тримолекулярный механизм инициирования
в жидкофазном окислении органических соединений [268-270]
по реакциям (0.1) и (0.2).
В присутствии следовых концентраций катионов металлов
в субстратах
окисления [54, 55, 89, 98, 110, 121, 174, 224, 268, 270,
317, 341, 350, 351] могут протекать реакции:
Me(n+1)++ RH + O  Men+ + R + HO
Me(n+1)+ + RH  Men++ R+ H
(0.3)
(0.4)
Для Fe2+ и Fe3+ известна реакция зарождения цепей (0.3).
Механизм инициирования цепей ионами кобальта [259] был подробно
изучен на примере окисления бензальдегида:
Co3+ + RCHO  Co2+ + H+ RCO
10
(0.5)
Если катализатор введен в углеводород в состоянии высшей
валентности, то он может образовывать свободные радикалы [259]
при непосредственном взаимодействии стеарата кобальта с углеводородом по реакции:
CoSt3 + RH  CoSt2 + StH + R
(0.6)
Предполагают возможность участия Co2+ в реакциях
инициирования по реакциям (0.7) или (0.8) через промежуточный
комплекс с кислородом:
St2Co + O2 ↔ St2Co … O2 + RH  CoSt2OOH + R
St2Co … O2 + RH  CoSt2OH + RO
(0.7)
(0.8)
Для меди предполагается [387] зарождение цепей по реакциям:
Cu2+ + O  Cu1+ + O
Cu + H2O2  Cu2+ + OH+ OH
Fe2+ + H2O2  Fe3+ + OH+ OH
1+
Лимитирует цепной процесс обычно реакция (2). При этом
скорость процесса описывается зависимостью:

WO2  K 2 RH  RO2

,
(1.1)
где: К2 — константа скорости реакции образования гидропероксида (2).
В случае квадратичного обрыва цепей по реакции (6)
и в соответствии с принципом квазистационарных концентраций
получаем зависимость:

Wi  K 6 RO2
,
 2
(1.2)
где: Wi — скорость инициирования;
K6 — константа скорости реакции обрыва цепей (6). Из этой
зависимости выражают концентрацию пероксирадикалов:
11
RO  

2
Wi
K6
Скорость процесса окисления будет описываться зависимостью:
WO2 
K2
RH  Wi
K6
(1.3)
Из зависимости (1.3) следует, что при постоянной скорости
инициирования окисление протекает с одинаковой скоростью,
а изменение концентрации поглощенного кислорода во времени имеет
линейный характер.
Отношение констант скоростей реакций продолжения и обрыва
цепей (К2 /K6) является величиной постоянной, зависящей
от природы субстрата и может использоваться для характеристики
его окисляемости.
В отсутствии инициаторов окисление органических соединений
обычно имеет аутоускоренный характер, что обусловлено
разветвлением цепей по реакциям (3.1—3.2). Широко известно
разветвление цепей по реакциям гидропероксидов с катионами
металлов [209, 268]:
Men+ + ROOH  Me(n+1)+ + RO + OH
Me(n+1)+ + ROOH  Men+ + RO + H
Me(n+1)+ + ROOH  Men+ + RO + OH
Распад гидропероксидов происходит через промежуточную
стадию образования комплексов с катионами по схеме [209]:
kMen+ + mROOH ↔ [ kMen+… ROOH ] 
 kMe(n+1)+ + RO + OH + (m - 1) ROOH;
k1Me(n+1)+ + m1ROOH ↔ [ k1Men+ … m1ROOH ] 
 k1Men++ RO + H + (m1 - 1) ROOH
Известно комплексообразование гидропероксидов со стеаратом
железа (III) и меди (II) [259]. Предполагают образование комплекса
и последующий его распад:
FeSt3 + ROOH  FeSt3 ... ROOH  FeSt2 + RO + OH
CuSt + ROOH  CuSt ... ROOH  CuSt + RO + OH
12
Образование одновалентной меди приводит к запусканию
процесса распада гидропероксида.
Распад гидропероксида этилбензола под действием ацетата
кобальта
был
изучен
методом
хемилюминесценции [259].
На основании кинетических данных обоснован следующий механизм
распада гидропероксида:
ROOH + CoAc2  ROOH … CoAc2
ROOH … CoAc2 + CoAc2  RO+ CoAc2OH + CoAc2
ROOH … CoAc2 + CoAc2OH  RO+ 2CoAc2 + H2O
В случае реакции первого порядка относительно гидропероксида,
когда скорость разветвления цепей больше скорости зарождения
цепей, суммарная скорость процесса описывается выражением:
WO2 
K2
K6
RH 
Wi  K 3.1  ROOH  ,
(1.4)
или выражением (1.5), если разветвление цепей происходит
по реакции с катионами:
WO2 

K2
RH  Wi  K3.3  ROOH  Men 
K6
,
(1.5)
Возможны три варианта зависимости концентрации поглощенного кислорода от времени. Линейная зависимость соответствует
неразветвленному процессу, когда скорость инициирования
или зарождения цепей больше скорости разветвления цепей, параболическая — мономолекулярному механизму разветвления цепей
при квадратичном механизме их обрыва. Экспоненциальный характер
кинетики окисления наблюдается, когда отношение порядков реакции
разветвления и обрыва цепей равно единице. Это возможно
при квадратичных механизмах разветвления и обрыва цепей
или линейных механизмах обеих реакций.
При достаточной концентрации кислорода преобладает
квадратичный обрыв цепей по реакции (6). Известно участие [209, 268]
катионов металлов в реакциях обрыва цепей:
13
Men++ RO  продукты
Каталитическая роль катионов железа наблюдается при концентрациях до 5 × 10 М [268]. В концентрациях 10 - 10 М катионы
железа участвуют в обрыве цепей. Известно [4, 260, 268] участие
ионов меди в обрыве цепей по реакциям:
> C ( OH ) OO + Cu  Cu + H + O + > C = O
> C ( OH ) OO + Cu  Cu + > C ( OH ) OO
Процесс окисления, инициируемый катионами металлов, может
тормозиться за счет дезактивации катионов. Известна [209]
дезактивация Cu за счет образования неактивных биядерных
комплексов с орто-фенантролином. Схема процесса включает стадии
образования комплексов Cu1 с гидроперекисью, последующие
реакции комплексов Cu1 с катализатором (дезактивация катализатора)
и гидроперекисью (каталитическая стадия). Радикалы, образующиеся
при распаде комплекса, могут рекомбинировать в клетке растворителя [209, 268] (молекулярный распад гидроперекиси) либо
диффундировать из клетки (радикальный распад).
1.3. Кинетика и механизм действия ингибиторов
Важнейшим свойством цепных процессов является их способность к резкому торможению в присутствии добавок ингибиторов.
Торможение окисления происходит за счет участия ингибитора
в реакциях обрыва цепей:
RO + InH  ROOH + In
RO + In  M
In + In  M
(7)
(8)
(9)
В результате многочисленных исследований [15, 26, 35, 65, 88,
90, 92, 99, 128, 195, 200, 201, 205, 259] доказано участие ингибиторов
в других реакциях, среди которых наиболее изучены реакции:
In + RH  R + InH
InH + ROOH  In + RO + H2O
InH +ROOH  M6
InH + O  In + H2O
14
(10)
(11)
(11)
(12)
Примечание. InH — ингибитор; In— радикал ингибитора.
Полифункциональные соединения могут участвовать в реакции
(11) с образованием молекулярных продуктов. Такой механизм
действия характерен для серосодержащих соединений, аминов
и амидов.
InH +ROOH  M6
(11)
Денисов Е.Т. [88], в зависимости от участия только в реакциях
обрыва цепей или других реакциях, классифицировал ингибиторы
на сильные и слабые соответственно.
Когда K7 > K6 и обрыв цепей идет исключительно с участием
ингибитора, а длина цепей больше единицы, реализуется зависимость:

Wi  fK 7 RO2

InH  ,
(1.6)
Тогда концентрация пероксильных радикалов:
RO  

2
Wi
,
fK 7 InH 
(1.7)
и суммарная скорость процесса описывается выражением:


WO2  K 2 RH  RO2 

K2
RH  Wi ,
K7
f InH 
(1.8)
Константа скорости реакции обрыва цепей K7 характеризует
антирадикальную активность ингибитора, параметр f — число цепей,
обрываемых на одной молекуле ингибитора.
Эффективность торможения, которая определяется совокупностью реакций ингибитора, обозначается как антиоксидантная
активность (АОА). Количественной мерой АОА является период
индукции (i). Для сильных ингибиторов величина периода индукции
определяется зависимостью:
 
f InH 
,
Wi
15
(1.9)
Эта зависимость используется для расчета скорости
инициирования при известных , f и [InH].
Наиболее известными ингибиторами являются фенолы
и ароматические амины. Антиоксиданты делятся на неэкранированные
и экранированные фенолы. Последние имеют в орто-положениях
к функциональной группе — ОН алкильные или трет-бутильные
заместители.
Эффективность и механизм действия ингибиторов качественно
могут быть оценены по характеру кинетических кривых.
При высоких значениях K7 наблюдается полная остановка
процесса, затем при концентрации пероксидов не более 5 × 10 -4 М
и концентрации ингибитора не более 2 × 10 -6 М происходит резкий
выход из периода, аутоускорение и достижение предельной
скорости окисления, наблюдаемой при окислении субстрата
без ингибитора [85, 88].
В случае участия ингибитора в реакции продолжения цепей
эффективность его действия снижается, процесс идет с высокими
начальными
скоростями,
возрастающими
пропорционально
концентрации ингибитора. Выход из периода индукции происходит
плавно при высоких остаточных концентрациях ингибитора.
При участии ингибитора в распаде гидропероксидов по молекулярному механизму происходит дополнительное уменьшение
скорости в периоде индукции и резкий выход из периода индукции
при полном расходовании ингибитора.
За счет участия ингибитора в радикальном распаде гидропероксидов (реакция 11) происходит дополнительное инициирование,
сокращение периода индукции, быстрое расходование ингибитора.
Взаимосвязь K7 и строения фенолов обсуждается в ряде
работ [2, 37, 46, 47, 56, 121, 245, 265, 288, 313, 314, 318—321, 324,
367, 375, 376, 391]. Величина K7 повышается при увеличении
количества и объема орто- и пара-заместителей. Объемные ортозаместители создают стерические препятствия взаимодействию
фенольных антиоксидантов с RO2. Антирадикальная активность
фенолов усиливается также при наличии в орто- и пара-положениях
заместителей электронодонорной природы и ослабляется при введении
электроноакцепторов. Для большинства фенолов и ароматических
аминов значения K7 лежат в интервале 10 - 10 М-1 × с-1, энергия
активации составляет 12,5—6,7 кДж/моль, для одноатомных фенолов f
составляет обычно 1,8—2. Константа скорости реакции K7 слабо
зависит от структуры пероксильных радикалов, но зависит
от структуры ингибитора [83—85].
16
Влияние величины и положения алкильных групп на K7 производных фенола обсуждается в работах Эмануэля Н.М. [197, 198, 265].
В результате показано (табл. 1.1), что K7 фенола при 600 С
в этилбензоле составляет 3 × 10 М-1 × с-1. При введении метильной
группы в орто-положении K7 вoзрастает в 10 раз и составляет 2,5 ×
104 М-1 × с-1. При введении в орто-положение трет-бутила K7
возрастает в 1,6 раза по сравнению с орто-метилфенолом.
При введении трет-октила в пара-положение K7 практически
не меняется и составляет 3,5 × 10 М-1 × с-1.
При наличии двух алкилов в орто-положениях в феноле K7
возрастает в 2 раза и составляет 6,7 × 10  М-1 × с-1 для 2-метил-6-третбутилфенола и 8,6 × 10 М-1 × с-1 для 2,6-ди-трет-циклогексилфенола.
В то же время для 2,6-ди-трет-бутилфенола эта закономерность
не подтверждается, для 2,6-ди-трет-бутилфенола K7 составляет 0,95 ×
10 М-1 × с-1, для 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенола она имеет
величину 2,5 × 10 М-1 × с-1 и соответствует K7 для орто-метилфенола.
Практически такую же величину имеет K7 для 2,4,6-три-третбутилфенола, в 10 раз большую антирадикальную активность имеет
2,4,6-три-метилфенол.
Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что антирадикальная активность усиливается за счет донорного эффекта
метильных групп,
Таблица 1.1.
Константы K7 скорости взаимодействия фенолов с радикалами
RO при окислении этилбензола, инициатор — азо-бис-изобутиронитрил, 60 0С
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Ингибитор
фенол
4-метилфенол
2-трет-бутилфенол
2-трет-октилфенол
2-метил-6-трет-бутилфенол
2,6-дициклогексилфенол
2,6-ди-трет-бутилфенол
2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол (ионол)
2,4,6-три-трет-бутилфенол
пара-дигидроксибензол (гидрохинон)
орто-дигидроксибензол (пирокатехин)
4-трет-бутилпирокатехин
17
K7 ×10 М-1 × с-1
0,3 [265]
2,5 [265]
4,0 [265]
3,5 [265]
6,7 [265]
8,6 [265]
0,95 [265]
2,5 [265]
2,2 [265]
0,4 [265]
0,6 [265]
0,015 [2]
13
14
15
16
17
18
19
3,5-ди-трет-бутилпирокатехин
3,6-ди-трет-бутилпирокатехин
2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол (ионол)
-нафтол
гидрохинон
3,5,3,5-тетра-трет-бутил-4,4-гидроксифенилметан
3,5,3,5-тетра-трет-бутил-2,2-гидроксифенилметан
0,029 [2]
0,033 [2]
2,17 [246]
18,6 [246]
21,2 [246]
1,55 [246]
3,3 [246]
расположенных в орто- и пара-положениях. Известно,
что только метильные группы обладают эффектом сверхсопряжения,
поэтому понятным становится меньшее влияние на K7 других
алкильных групп. Вопрос о зависимости между K7 и донорноакцепторными способностями заместителей в феноле обсуждается
в ряде
работ [2, 29, 152, 246, 265].
По
данным
работ
Рогинского В.А. [29, 204] и Эмануэля Н.М. [259, 265] исследовали
изменения K7 с изменением донорной или акцепторной активности
заместителей
в
пара-положении
2,6-ди-трет-бутилфенола.
Наблюдается практически линейное увеличение K7 с увеличением
электронодонорной активности заместителей в ряду:
- H < - F < - CI < - CH < - OH < - OCH < - NH
В ряду производных с электроноакцепторными заместителями K 7
уменьшается пропорционально увеличению акцепторной активности:
- COOC2H5 < - COOH < - CHO < - CN < - NO2
Таблица 1.2.
Константы K7 скорости взаимодействия ароматических аминов
с радикалами RO при окислении этилбензола, инициатор —
азо-бис-изо-бутиронитрил, 60 0С
№
п/п
1
2
3
4
5
6
K7 ×105 М-1 × с-1
Ингибитор
N-фенил--нафтиламин
4-гидрокси--N-фенил--нафтиламин
N-фенил--нафтиламин
дифениламин
4-гидроксидифениламин
4,4-диметоксидифениламин
18
1,3 [265]
16,0 [265]
1,0 [265]
0,44 [265]
10,0 [265]
38,0 [265]
Цепалов В.Ф. с соавторами [246] сравнили K7 2,6-ди-трет-бутил4-метилфенола (ионола) и -нафтола, гидрохинона, фенолов и ряда
аминов (табл. 1.2). Полученные K7 для -нафтола и гидрохинона
 в 10 раз выше, чем у ионола. Для многих фенолов K 7 соизмерима
с антирадикальной активностью ионола.
Кучер Р.В. с соавторами [152] определили K7 в этилбензоле
для ряда двухатомных фенолов. Для резорцина получено более низкое
значение K7, равное 5,4 × 103 М-1 × с-1, по сравнению с K7 для ортои пара-изомеров, равных 1 × 105 и 2,6 × 105 М-1 × с-1 соответственно.
В работе Карпухиной Г.В. с соавторами [2] приведены большие
значения K7 для пирокатехина, чем для гидрохинона. На порядок
высокие значения K7 имеют 4-трет-бутил-, 3,5-ди-трет-бутили 3,6-ди-трет-бутилпирокатехин.
Большое внимание ученых привлекают свойства -токоферола
как наиболее важного биоантиоксиданта, характеризующегося
чрезвычайно высокой реакционной способностью по отношению
к пероксильным радикалам [47, 203].
В этилбензоле методом хемилюминесценции Аристрахова С.А.
с соавторами [11, 49] получили K7 для изомерных токоферолов
в этилбензоле в 100 раз выше, чем у ионола, составляющие (1,6—2,3) ×
106 М-1 × с-1. Для -токоферола известны значения K7 (2,3—3,3) ×
106 М-1 × с-1 [36], что почти в 200 раз выше эффективности ионола
и других 2,4,6- триалкилзамещенных фенолах.
Измерение константы K7 токоферолов различного строения,
отличающихся числом электронодонорных заместителей в бензольном
кольце 6-оксихроманового цикла, показало, что введение заместителя
в положение 5, 7, 8 облегчает отрыв атома водорода и увеличивает K 7.
Burton G.W. и Ingold K.U. [294—299] сравнивали K7 изомерных
токоферолов в стироле, в котором исключается реакция продолжения
цепей. Получено наибольшее значение K7 для -токоферола, равное
2,3 × 10 М-1×с-1.
Феноксильные радикалы (In) участвуют в процессах продолжения и обрыва цепи. Преобладание тех или иных процессов
оказывает существенное влияние на эффективность фенолов
как антиоксидантов.
Существуют
множественные
механизмы
«гибели» феноксилов. Основными направлениями превращений
феноксилов являются рекомбинация и диспропорционирование.
В результате реакции диспропорционирования образуются исходный
фенол и метиленхинон [106, 204]. Кинетической характеристикой
бимолекулярной гибели феноксилов является величина константы K 9.
Величина K9 зависит от структуры орто-заместителей. Замена орто19
трет-бутильных радикалов на метильные увеличивает значение K 9
практически в 104 раз [204]. В работе [202] данный факт объясняется
более высокой акцепторной способностью неэкранированных
и частично экранированных феноксилов по сравнению с пространственно затрудненными. Большую роль в обеспечении высокой
эффективности феноксила в реакции (9) играет наличие реакционноспособных атомов Н у алкильного заместителя в положении 4.
При рассмотрении кинетики окисления модельных систем,
ингибированных антиоксидантами, нельзя пренебрегать реакцией
продолжения цепи с участием радикалов ингибитора [87, 88,
239, 356—358]. Активные радикалы антиоксидантов выступают в роли
буфера и обеспечивают поддержание скорости окисления
на определенном стационарном уровне [237—239]. Антиоксиданты
-токоферол и убихинон при окислении образуют достаточно
активные феноксильные радикалы [36, 118]. Для -токоферола
и -каротина показано существование зависимости антиоксидантного
действия от концентрации как in vitro [42, 215, 216], так и in vivo [156],
что связывают с высокой активностью радикалов ингибиторов,
способных участвовать в реакциях продолжения цепей.
Установлено, чем больше прочность О-Н связи, тем выше
K10 [86—88, 151]. Стабильность феноксилов в основном зависит
от степеней экранирования реакционного центра и делокализации
неспаренного электрона в сопряженной системе двойных связей
радикала, стерический фактор при этом является определяющим [106].
На примере -токофероксильных радикалов показано, что с увеличением объема заместителей в положениях 5 и 7 в молекуле
токофероксила значение константы K10 уменьшается [42]. Таким
образом,
повышение
экранированности
способствует
росту
стабильности феноксилов, и, как следствие, снижается их активность
в реакции с субстратом.
Методом импульсного фотолиза были определены константы
взаимодействия токофероксилов с липидными субстратами различной
степени ненасыщенности [215, 216]. Показано, что K10 прямо
пропорциональна степени ненасыщенности высших жирных кислот.
Скорость взаимодействия токофероксильных радикалов с метилолеатом, линолевой и арахидоновой кислотами, содержащими 1, 2,
и 4 двойных
связи,
составляла
(2,5  1,5)  10-1 Мс-1,
2
-1
4
-1
(1,000,25)10 Мс , (1,000,60)10 Мс соответственно [215].
Установлено, что радикалы ингибитора могут образовываться
не только в реакции 7, но и при взаимодействии с первичными
продуктами окисления — гидропероксидами (ROOH), реакция (11).
20
InH + ROOH  In + H2O + RO
(11)
Образующиеся свободные радикалы служат дополнительным
источником инициирования. Реакция характеризуется значением
константы K11, которая сильно зависит от структуры фенола.
Например, константа скорости реакции гидроперекиси кумола
с нафталином составляет 6,7104 М-1с-1, а с 2,4,6-три-третбутилфенолом — 7,8104 М-1с-1. Показано, что по мере увеличения
ортоэкранированности фенола величина K11 уменьшается практически
на порядок [85, 88].
При использовании в качестве субстрата окисления эфиров
полиненасыщенных жирных кислот не исключена возможность
образования водородной связи между атомом водорода гидроксильной
группы фенола и карбоксильного атома кислорода эфира. В таком
комплексе активность антиоксидантов в реакции обрыва цепей резко
снижается. Наиболее стабильные комплексы образуются с участием
неэкранированных фенолов [203].
При высокой концентрации антиоксидантов в субстрате
окисления возможно образование межмолекулярных водородных
связей между молекулами ингибитора. Установлено, что 2,6-ди-третбутилфенол не образует самоассоциатов [106]. Для -токоферола при
концентрациях ~10-2 М наблюдалось образование межмолекулярных
водородных связей [113].
1.4. Состав, локализация и биологические функции липидов
Биоантиоксиданты взаимодействуют в живых клетках организма
прежде всего с липидами, поэтому в настоящем разделе будут
рассмотрены некоторые вопросы состава и функций липидов.
Детально вопросы классификации, структуры компонентов, жирнокислотный и фракционный состав липидов в зависимости от локализации,
функции липидов освещены в работах [25, 120, 121, 134, 382, 407],
медико-биологические
аспекты
метаболизма
липидов
—
в работах [228, 229, 332, 345, 409].
К липидам относят совокупность растворимых в органических
растворителях и нерастворимых в воде компонентов животных
организмов и растений. Все компоненты липидов делят на омыляемые
и неомыляемые. Совокупность компонентов, содержащих сложноэфирные связи, а также ацетали, способные гидролизоваться
с образованием спиртов, кислот или альдегидов, относят к омыляемым
липидам. Большинство омыляемых компонентов липидов представляют собой грицериды, а ацетали являются производными диолов.
21
Омыляемые липиды в свою очередь делятся на нейтральные
и полярные. Нейтральные липиды — моно-, ди-, триглицериды
жирных кислот или ацетали этиленгликоля, глицерина. Полярные
липиды — фосфолипиды, содержащие в молекулах сложноэфирные
связи глицерина и фосфорной кислоты, а также сложноэфирные связи
фосфорной кислоты и этаноламина, холина, сфингозина. В состав
неомыляемых компонентов липидов входят природные фенолы,
хиноны, стеролы, каротинойды и другие соединения, не содержащие
сложноэфирных связей, а также свободные жирные кислоты.
Липиды входят в состав мембран: эндоплазматических,
митохондриальных, ядерных, цитоплазматических, в состав различных
мембранных образований и внутриклеточных органелл, а также в виде
жировых клеток, известных как липиды «депо».
Липиды биологических мембран представлены в основном
фосфолипидами и частично нейтральными липидами. Липиды «депо»
представлены на 98 % нейтральными липидами, а также содержат
фосфатидилхолины и фосфатидилэтаноламины.
В организме человека и лабораторных животных наиболее
богаты липидами мозг, нервная ткань, мембраны клеток всех органов
и тканей. Большинство биомембран содержат около 40 % липидов.
Их содержание может составлять от 40 % до 80 % сухой массы [145].
У крыс липиды составляют 24 % сухой массы нейронов и 39 % сухой
массы клеток нейролгии. Содержание липидов в мозгу теплокровных
животных достигает 40 % на сухую массу, у взрослого человека
10—12 %.
Липиды мозга человека на 65—70 % состоят их фосфолипидов.
В плазматической мембране и миелине клеток мозга до 20 % общей
массы липидов может составлять холестерин.
Содержание общих липидов в плазме и сыворотке крови, а также
в цельной крови человека составляет 2,90—8,00 г/л, в том числе
триглицеридов 0,26—3,80 г/л, свободного холестерина 0,43—2,10 г/л,
фосфолипидов 1,38—2,90 г/л [19, 25, 75, 153, 227].
Фракционный состав липидов отдельных органов закреплен
генетически. Известны изменения жирно-кислотного состава
фосфолипидов животных в зависимости от локализации и воздействия
различных факторов [32, 56, 145, 169].
Липиды биологических мембран крупных животных представлены в основном фосфолипидами, которые имеют тесную связь
с протеинами. Фосфолипиды составляют от 0,43 до 1 % веса тканей
говядины [276]. В составе фосфолипидов найдены фосфатидилхолины
(ФХ), фосфатидилэтаноламины (ФЭА), фосфатидилсерины (ФС),
22
кардиомиелины (КЛ), фосфатидилинозиты (ФИ), сфингомиелины
(СМ) и другие компоненты. Наибольшая концентрация фосфатидилхолина отмечена в мембране ядер клеток и эндоплазматическом
ретикулуме [120, 122, 142, 330].
Липиды «депо» на 98 % представлены триглицеридами, а также
содержат фосфатидилхолины и фосфатидилэтаноламины.
Главными липидами мозга человека являются холиноплазмологены и этаноламиноплазмологены. Последние обладают наибольшей
полиненасыщенностью.
Кардиомиелинами
богаты
внутренние
мембраны. Полифосфатидилинозиты составляют 5—10 % фосфолипидов мозга.
Липиды мышечных тканей отличаются от липидов «депо»
высокими концентрациями фосфолипидов и полиненасыщенных
жирных кислот. В общих липидах межреберных мышц найдено
от 5,2 до 5,5 % фосфолипидов. В фосфолипидах мышц бычков найдено
8 фракций фосфолипидов, в том числе: ФЭА — 23 %, ФХ — 57 %,
дифосфатидилглицерины (ДФГ) — 5,7 %, СМ — 5,3 %, ФИ — 2 %,
лизофосфатидилэтаноламины (ЛФЭА), лизофосфатидилхолины (ЛФХ)
по 1 %.
По химической структуре фосфолипиды представляют собой
сложные эфиры трехатомного спирта (глицерина), этерифицированного двумя молекулами высших жирных кислот и одной молекулой
фосфорной кислоты, которая в свою очередь замещена в большинстве
фосфолипидов
одним
из
азотистых
оснований (холином,
этаноламином, сфингозином) или аминокислотой (серином) либо
циклическим многоатомным спиртом инозитом [276].
Показано, что в состав фосфолипидов входят ненасыщенные
и полиненасыщенные жирные кислоты (ЖК). Существует определенная избирательность в локализации различных фосфолипидов
в мембране. Особенности структуры и состава полярных липидов
биологических мембран тесно связаны со спецификой выполняемых
ими функций (регуляцией проницаемости для различных соединений,
образования комплексов ДНК и РНК с мембраной, локализации
специфических рецепторов) [38].
Полярные липиды являются субстратом или составной частью
мембраносвязанных ферментов. Показано, что структурное состояние
липидного бислоя мембраны влияет на активность ферментов
(аллостерический эффект) [48, 150].
Фосфолипиды играют важную роль на отдельных этапах цепи
реакций,
ведущих
к
фибринообразованию [61].
Повышение
свободнорадикального окисления фосфолипидов мембран вызывает
23
усиление коагуляционного потенциала крови. Существует корреляция
между степенью окисления фосфолипидов и активностью коагуляционных реакций.
Фосфолипиды обладают поверхностно активными и эмульгирующими свойствами, что определяет их значение в окислительных
процессах [258].
Фосфолипиды являются составной частью липопротеидов,
представляющих собой комплекс белков и липидов, образованный
нековалентными связями, в которых белки и полярные липиды
формируют поверхностный гидрофильный слой, окружающий
гидрофобную липидную организацию от водной среды и обеспечивающий транспорт липидов в кровяном русле, доставку их в органы
и ткани [136].
Липопротеиды различаются между собой по плотности и составу
липидных фракций и подразделяются на липопротеиды высокой
плотности (ЛПВП) и липопротеиды низкой плотности (ЛПНП). ЛПВП
содержат большое количество фосфолипидов и обеспечивают
транспорт холестерина из периферических тканей в печень. В ЛПНП
наблюдается низкое содержание фосфолипидов, но высокий уровень
холестерина [398]. Из литературных данных существует положительная корреляция между уровнем ЛПНП в крови и проявлением
ишемической болезни сердца (ИБС). Процессы ПОЛ рассматриваются
в качестве этиологического фактора атеросклероза и обусловлены
окислением ЛПНП [136, 157, 312, 344]. Применение антиоксидантов
значительно снижает уровень окисления ЛПНП и задерживает
развитие атеросклероза [136, 312].
Главным компонентом фосфолипидов плазмы крови являются
фосфатидилхолины, концентрация которых 2 г/дм, содержание фосфатидилэтаноламина составляет 300 мг/дм, плазмологенов 70—80 мг/дм,
сфингомиелинов
100—500 мг/дм [25, 75, 227, 300,
324, 330, 375].
В липопротеидах высокой плотности (ЛПВП) крови женщин
содержится 59 % -токоферола, у мужчин — 33 %. В эритроцитах
человека установлено содержание до 25 % холестерина, 60 %
фосфолипидов и 5—10 % гликолипидов. В составе фосфолипидов
обнаружено по 15—16 % сфингомиелинов, фосфотидилхолинов
и фосфатидилэтаноламинов и 7—8 % фосфатидилсеринов [227].
Во внешнем липидном слое локализовано до 70 % фосфатидилсеринов
и до 80—85 % сфингомиелинов. Внутренний липидный слой мембран
эритроцитов
содержит
80—90 %
фосфатидилэтаноламинов
и фосфатидилсеринов.
24
В составе липидов биомембран идентифицировано свыше
20 жирных кислот. Особенностью жирно-кислотного состава
животных липидов «депо» является высокое содержание насыщенных
кислот, до 50—60 % представленных пальмитиновой и стеариновой
кислотами. Главным ненасыщенным компонентом жирных кислот
животных липидов «депо» является олеиновая кислота, концентрация
которой достигает 50 %. Содержание суммы трех названных кислот
может достигать 90 %. Из полиненасыщенных кислот преобладает
линолевая в количестве 2—5 %, содержание линоленовой кислоты
не превышает 1 %, арахидоновая содержится в липидах «депо»
в микроконцентрациях [73, 340, 355, 407].
Фосфолипиды мышечной ткани свиней содержат около 19 %
тетра-, пента- и гексаеновых жирных кислот. Липиды светлых мышц
отличаются высокой концентрацией моноеновых кислот, липиды
темных мышц – полиеновыми кислотами. Фосфатидилэтаноламин
в мышцах живота свиней содержит большое количество линолевой
и арахидоновой кислот.
Жирно-кислотный состав фракций липидов печени человека
характеризуется содержанием насыщенных жирных кислот до 52,7 %,
максимальное содержание мононенасыщенных кислот отмечается
в триглицеридах — 40 %, и минимальное их количество — 27,6 %
присутствует в фосфолипидах. Наибольшей полиненасыщенностью
обладают фосфолипиды печени, наименьшей — триглицериды.
В липидах мозга человека идентифицировано до 30 кислот,
но из них 70—90 % составляют 7—8 кислот. Фосфатидилхолин
липидов мозга содержит свыше 70 % насыщенных жирных
кислот [145]. Богаты полиненасыщенными жирно-кислотными
компонентами фосфатидилсерины и фосфатидилэтаноламины серого
вещества мозга кроликов. В ФЭА арахидоновая кислота составляет
40 %. СМ являются наиболее насыщенными компонентами,
они содержат до 80 % стеариновой кислоты.
Самая насыщенная фракция фосфолипидов биомембран печени
крыс — сфингомиелины, в которых главным полиненасыщенным
компонентом является линолевая кислота. Максимальное содержание
линолевой кислоты обнаружено в митохондриях — 13,9 %.
Установлено изменение фракционного состава липидов
эритроцитов и плазмы крови при опухолевой патологии молочной
железы [122]. На ранних стадиях канцерогенеза в два раза повышено
содержание сфингомиелина.
Метаболизму жирных кислот, развитию и проявлению
злокачественных опухолей начали придавать немаловажное значение
25
лишь в последние годы. Установлены механизмы цитотоксичности
незаменимых жирных кислот, включая модификацию мембран
опухолевых клеток, изменение метаболизма простогландинов
и продуктов липоксигенных ферментов, а также активности ПОЛ
в отношении злокачественных клеток [39].
В составе липидов в плазме крови и мембранах эритроцитов
больных раком легкого наблюдалось некоторое падение уровня
стеариновой кислоты на 30,2 % у больных с центральной локализацией
опухоли и на 34,0 % с периферической. Появляется в составе липидов
плазмы крови (19:0) нонандекановая кислота, которая в норме
отсутствует. Среди непредельных жирных кислот у больных обеих
групп происходит сдвиг в сторону моноеновых кислот за счет
значительного роста доли олеиновой кислоты, которая составляла
162,5 % и 15,6 % от контрольных цифр центрального и периферического рака легкого соответственно. Дефицит полиненасыщенных
жирных кислот складывается из-за снижения доли С18 : 2 в среднем
на 17,0 % в обеих формах патологии. Содержание насыщенных
жирных кислот С15 : 0 и С17 : 0 заметно уменьшается, а С19 : 0 увеличивается в среднем в 4 раза. Происходит усиление синтеза
нонандекановой кислоты из более низкомолекулярных предшественников.
Физиологическая роль липидов определяется энергетической,
барьерной, транспортной функциями, участием в биосинтезе,
регуляции биосинтеза ферментов, функции «узнавания», определении
видовой специфичности, иммунореактивности.
Универсальным механизмом жизнеобеспечения клетки в целостном
организме являются биоэнергетические процессы, связанные с обменом
липидов. Наиболее подвижными и важными в энергетическом балансе
являются свободные жирные кислоты и нейтральные липиды.
Эти компоненты, поступая из живой ткани в кровь, связываются
с альбуминами и переносятся ко всем органам. В метаболизме липидов
«депо» доказана роль липазы и дегидрогеназы.
В биомембранах большая часть липидов располагается в виде
липопротеиновых компонентов, в них локализованы многие ферментативные процессы. В митохондриальных мембранах локализованы
ферменты цикла лимонной кислоты, β-окисления жирных кислот,
дыхательной цепи и ферменты окислительного фосфорилирования,
окисления пировиноградной кислоты до ацетил — КоА. В мембранах
эндоплазматической сети локализованы ферменты биосинтеза
фосфолипидов, стероидов, полисахаридов.
26
Гомеостаз клетки обеспечивается определенным уровнем
проницаемости биомембран. Изменение их состояния связывают
с развитием большинства патологий. Одним из механизмов изменения
проницаемости биомембран считают повышение уровня перекисного
окисления липидов. ПОЛ биомембран развивается в соответствии
со свободнорадикальным механизмом окисления органических
молекул, но его регулирование связано с наличием в клетке катионов
и ферментов, способных участвовать во многих элементарных
реакциях ПОЛ.
У больных ишемической болезнью сердца (ИБС) отмечается
накопление насыщенных жирных кислот и моноенов с нечетным
числом углеродных атомов, снижение уровня полиненасыщенных
жирных кислот в липидах плазмы крови [24, 141, 311].
При остром панкреатите [133, 162] отмечено повышение
в сыворотке крови концентрации общих липидов 5,15 ± 0,07 до
5,85 ± 0,09 мг/л, а также кислот состава С16 : 0, С16 : 1, С18 : 1, снижение
уровня стеариновой, линолевой, арахидоновой кислот.
Уровень ПОЛ в биомембранах регулируют биоантиоксиданты:
-токо-ферол, убихиноны (Q), витамин К [76, 329]. Увеличение
концентрации биоантиоксидантов приводит к обогащению мембран
легко окисляемыми фракциями, которые провоцируют расходование
антиоксидантов, таким образом поддерживается стационарный
уровень окисления.
Концентрация -токоферола в липидах животных тканей чаще
всего составляет (2—4) × 10 моль/дм, -каротина — 6,9 ×
10 моль/дм, холестерина — до 3,9 × 10 моль/дм [73, 300,
324, 375, 407].
Высокую антиоксидантную активность тканей организма
связывают прежде всего с -токоферолом. Суточная потребность
-токоферола у здорового человека составляет 10—25 мг [291].
Поступает в организм с пищей около 1—7 г в сутки -токоферола,
и только 4 % всего поступившего в организм достигает мембран
клеток при нормальной физиологии всасывания [231]. С возрастом
в организме человека уровень токоферола возрастает и достигает
максимума в возрасте от 19 до 39 лет [116]. Недостаток -токоферола
вызывает стерильность, мышечную дистрофию, нервные расстройства,
диатез, некроз печени, гемолиз эритроцитов, дегенерацию спиральных
канальцев и другие патологии.
При недостаточности -токоферола в фосфатидилхолинах
и фосфатидилэтаноламинах микросомальной фракции печени крыс
установлено [121] увеличение доли кислот состава С16 : 1, С18 : 1, С20 : 3
27
и снижение содержания кислот состава С22 : 4 и С22 : 6. При -токофероловой (витамин Е) недостаточности в фосфатидилхолинах
митохондрий крыс увеличивается содержание кислот состава С18 : 1,
С18 : 2, С20 : 4, в фосфатидилэтаноламинах уменьшается доля кислот
состава С18 : 2, С20 : 4, С22 : 6. При гиповитаминозе Е происходит
снижение интенсивности дыхательной цепи в процессах окислительного фосфорилирования, снижение содержания убихинона
и его метаболита убихроменола в тканях на 41,2 и 31,0 %
соответственно.
При введении -токоферола ацетата животным (орально,
внутримы- шечно, ректально) отмечают повышение уровня
-токоферола с максимумом накопления в крови на 6—12 часов после
введения препарата в минимальных дозах 50—100 мг/сут. и больших
дозах 3200—4000 мг/сут. [121].
При применении диеты с повышенным содержанием -токоферола
в мембранах отмечается двухкратное повышение содержания
ненасыщенных жирных кислот и снижение содержания насыщенных
жирных кислот на 25—30 %, нормализуется фосфолипидный состав,
что связывают с антиоксидантными свойствами -токоферола.
В клетке в тесном контакте с липидами находятся катионы
металлов, они входят в состав ферментов, белков или содержатся
в мицеллах. В животных клетках железо входит в состав гемоглобина,
цитохромов, каталазы, содержатся в ферритине, трансферрине.
В митохондриях печени крыс концентрация железа составляет
7,5 мкмоль/мг белка [307].
Кроме железа, в состав ферментов других белков входят медь,
кобальт, молибден, цинк и другие катионы. Медь содержится
в цитохроме-С-оксидазе,
в
голубых
белках,
супероксиддисмутазе [244]. Медьсодержащие белки участвуют в различных
биологических процессах: от переноса электронов до окисления.
Голубые белки условно делятся на три типа, содержащих только один
или несколько катионов меди. Главным медьсодержащим белком
плазмы крови животных является церулоплазмин, который катализирует четырехэлектронное восстановление кислорода до воды.
Предполагают, что церулоплазмин содержит 7—8 ионов меди
на 1 моль белка. Цитохром-С-оксидаза содержит четыре металлионных
центра, два иона Fe и два Cu. Наиболее важным медьсодержащим
белком является супероксиддисмутаза (СОД), которая катализирует
разложение токсичного супероксид иона по реакции:
2O + 2H  O + HO
28
В каждой молекуле СОД из эритроцитов было обнаружено
по одному иону меди и цинка.
Физиологическая концентрация меди в сыворотке крови составляет 17 ммоль/дм и повышается при ряде патологий, беременности,
при ревматоидном артрите и составляет 30  5,3 ммоль/дм.
Таким образом, единство строения и функции биологических
мембран теснейшим образом связано с процессами ПОЛ
фосфолипидов, составляющих структурную основу бислоя.
В настоящее время интерес к фосфолипидам возрос как к классу
лекарственных препаратов. Лекарственные средства, содержащие
фосфолипиды, эффективны в качестве гипохолестеринемичесих
средств, при лечении атеросклероза [234], гепатопротекторов,
антигипоксантов [20], адаптогенов, веществ, улучшающих память
и внимание, корригирующих состояние нервной системы при стрессах
и переутомлении.
1.5. Особенности кинетики и механизма окисления липидов
Около ста лет известно, что окисление липидов обуславливает
изменение качества пищевых продуктов, масляных фармакологических препаратов. В живой клетке также существует определенный
уровень неферментативного перекисного окисления, изменение
интенсивности которого лежит в основе развития многих патологий.
С целью определения эффективных путей торможения ПОЛ
в пищевых продуктах и живых клетках организма в течение последних
пятидесяти лет интенсивно изучают особенности механизма, кинетики
окисления липидов.
Farmer E.H. [313] спектрофотометрическим методом впервые
была установлена -ненасыщенная структура первичных гидропероксидов. Во многих работах Bolland Y.L. [287—289] и других
авторов [272, 314, 318—321, 397, 409] изучена кинетика окисления
жирно-кислотных компонентов липидов в зависимости от ненасыщенности. Показано, что при 500 С этиллинолеат окисляется
по цепному механизму с длиной цепей до 2000, скорость возрастает
пропорционально концентрации эфира и не зависит от концентрации
кислорода при парциальном давлении последнего выше 100 мм.рт.ст.
В этих условиях происходит квадратичный обрыв цепей
на пероксирадикалах. При концентрации гидропероксидов ниже
1 × 10-2 моль/дм развитие цепей происходит по мономолекулярному
механизму, константа скорости которого 5 × 10  дм/моль×с при 550 С.
При более высоких концентрациях гидропероксидов происходит
29
разветвление цепей за счет их бимолекулярного распада с константой
скорости 5 × 10 дм/моль×с при 500 С [287].
Увеличение степени ненасыщенности эфиров жирных кислот
в отношении 1 : 2 : 3 : 4 : 5 : 6 приводит к возрастанию скорости
окисления в отношении 0,025 : 1 : 2 : 4 : 6 : 8 при 37 0 С. Скорости
окисления олеата, линолеата, линолената соотносятся как 1 : (10—12) :
(16—25). Добавки кислот ускоряют [288] окисление эфиров,
сопряженные триены окисляются быстрее несопряженных.
При окислении олеатов найдено четыре изомерных С8-, С9-, С10и С11- -метиленовых гидропероксида в цис- и трансконфигурации [275]. Продуктами распада первичных гидропероксидов
являются: октаналь, -ундеценаль, 2-деценаль и нональ.
При окислении линолеатов обнаружена смесь С9- и С13сопряженных диеновых гидропероксидов [275, 284, 320, 331, 339, 346].
Первичный С11- радикал изомеризуется в более устойчивые
сопряженные диеновые С9- и С13- радикалы, из которых образуются
С9- и С13- пероксирадикалы и соответствующие гидропероксиды.
Гидропероксиды распадаются с образованием 2,4-декадиеналя
и гексаналя, а также 9- и 13-сопряженных диеновых гидроксипроизводных.
При окислении метиллинолената обнаружено четыре первичных
сопряженных диеновых гидропероксида: C9-, C12-, C13-, C16- [361, 397].
Гидропероксиды распадаются по пероксидной связи с образованием
суммы алканалей, алкеналей, алкадиеналей, С9-, С12-, С13-, С16сопряженных диеновых гидроксипроизводных. С12- и С13гидропероксирадикалы изомеризуются и окисляются с образованием
циклического пероксида, который распадается до малонового
альдегида по схеме 1.1.
Первичными продуктами окисления арахидонатов и других
высоконенасыщенных эфиров являются также сопряженные диеновые
гидропероксиды [380].
Обзоры работ по исследованию состава вторичных продуктов
окисления жирно-кислотных компонентов липидов принадлежат
Frankel E.N., Gaddis A.M. и Bading H.T. [278, 318—321, 323]. Описано
образование 5 альдегидов из олеата, 3 альдегидов из линолеата и 9
из линолената и арахидоната. При автоокислении метилолеата
идентифицировано образование насыщенных эпоксидов, ненасыщенных и насыщенных дигидроксидов. Вторичными продуктами
окисления метиллинолеата могут быть не только цикличные
пероксиды, но и 9-, 12-, 13-, 16- дигидропероксиды.
30
Схема 1.1.
Изучение особенностей процесса ПОЛ в клетке преследует две
цели: поиск путей стабилизации качества пищевых продуктов,
прогнозирование эффективной терапии ряда патологий. Особенности
ПОЛ в клетке обусловлены прежде всего каталитической активностью
катионов и возможностью участия ферментов в регулировании этих
процессов.
Активность геминового и негеминового железа изучают в тканях
и модельных липидных субстратах [303, 340, 347, 377, 378].
Wills E.D. [408] показал катализ окисления липидов
гемопротеинами и негеминовым железом. Оба типа катализа могут
быть различимы по величине активности при различных рН, путем
воздействия хелатирующих агентов.
Показано 1000-кратное ускорение окисления мышечной ткани
за счет присутствия гемопротеинов. Наблюдали окисление линолевой
кислоты, метиллинолеата, липидов печени трески в присутствии
гемоглобина.
В работах [325, 343, 408] сравнивали каталитическую активность
гемопротеина и негеминового железа при окислении линолевой
кислоты в эмульсии. Негеминовое железо активно в кислой среде
рН = 5,5, гемопротеины катализируют окисление в щелочной среде.
Активность негеминового железа ингибирует этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТУК), усиливает — аскорбиновая кислота.
31
Активность гемопротеинов ингибирует аскорбиновая кислота
и ее смесь с ЭДТУК. Геминовый катализ ингибируют тиолы, цианиды.
Тиолы (меркапто-этил-амины) ускоряют негеминовый катализ.
Инициирующая активность Fe ниже активности Fe [365].
В клетке оптимальная концентрация Fe регулируется ферментами,
меркаптосодержащими белками. Известны следующие реакции
восстановления Fe:
Fe + 2RSH  R-S-S-R + 2H + Fe
NADH + Fe- L  NAD + Fe + H - L
Восстановление Fe также может происходить под действием
аскорбиновой кислоты по схеме:
Схема 1.2.
Метгемоглобин
ускоряет
окисление
метиллинолеата
при pH = 5,6—7,8. Негеминовое
железо
ускоряет окисление
при низких pH. Нет катализа при pH = 6,4. Хелатирующие агенты
предотвращают негеминовый катализ, но не эффективны
при геминовом катализе.
В мышечной ткани гем — главный прооксидант, негиминовое
железо и аскорбиновая кислота также являются прооксидантами,
а хелатирующие агенты выступают эффективными ингибиторами.
Показано, что метгемоглобин при pH = 6,5 катализирует процесс
окисления при концентрации 10-6—10-7 М и ингибирует при
10-5—10-6 М. Быстрое окисление продолжается, если вводят метгемоглобин в развитый процесс окисления в концентрации 10-5—10-6 М.
В присутствии
протопорфирина
такой
эффект
достигается
при концентрации 10-4 М. При pH = 8,8 и концентрации 10-4—10-5 М
катионы Mn2+ и Co2+ ингибирует катализируемое гемом окисление
линолеата. Полагают, что катализ гемом заключается в ускорении
разветвление цепей на гидропероксидах. В присутствии избытка
протопорфирина обрываются цепи на радикалах (R ) или образуются
32
соединение
протопорфирина
с
метиллинолеатом,
которое
ограничивает концентрацию радикалов (R).
Известны работы [309, 377—379], в которых сравниваются
суммарные скорости процесса окисления липидных субстратов
в присутствии различных катионов. В изопропилолеате при 200 С
в ряду катионов Cu, Ni, Mn, Co, Fe более эффективными
при концентрации 1×10 моль/г оказались катионы меди.
При исследовании [379] каталитической активности хлоридов
железа, меди, марганца, никеля в окисленном подсолнечном масле,
эффект солей меди в концентрациях 0,2—20 мг/г оказался выше,
чем у солей железа.
Механизм и кинетика окисления липидов в присутствии катионов
железа
обсуждается
в
работах [303, 340, 347, 378].
Авторы
предполагают
образование
первичного
гидропероксирадикала
по реакции с Fe:
Fe + O + H  Fe + HO
Последующее образование радикалов
компонентов липидов и развитие цепей:
из
жирно-кислотных
RH + HO  R+ HO,
R + O  RO,

RO + RH  ROOH + R
Катионы
железа
гидропероксидов:
участвуют
в
радикальном
распаде
Fe + ROOH  RO + Fe + OH
Fe + ROOH  RO + Fe + H
Участие катионов железа приводит к увеличению скорости
процесса, не влияет на характер кинетических кривых. Ионы железа
могут участвовать также в реакциях обрыва цепей по реакциям,
приведенным в разделе 1.2.
В случае гематинового катализа первичный радикал может
образовываться при распаде продуктов взаимодействия гема
и гидропероксирадикалов жирно-кислотных компонентов липидов
(LH) c образованием пероксида, который образует радикал LO 
по реакции:
33
Радикал LO участвует в элементарных реакциях цепного
окисления. В процессах окисления липидов, активированных гемом,
фенолы предотвращают образование первичных гидропероксидов или
разрушают их, исключая образование их комплекса с гемом
и первичным LO- радикалом. Фенолы также могут обрывать цепи
на LO-радикалах. В развитом цепном процессе окисления липидов,
катализированных гемом, фенолы малоэффективны и расходуются
быстрее, чем липиды. Гематиновый катализ ингибируется аминами,
взаимодействующими с гемом, предотвращая образование гидропероксидов и образование первичных LO- радикалов, по реакции:
В клетке инициатором ПОЛ могут быть также гидроксилрадикалы, образующиеся при распаде гидропероксида водорода.
Уровень ПОЛ в клетке контролируют различные субстраты,
ферменты,
ингибиторы.
В
обзорах
Владимирова Ю.А.
и Бурлаковой Е.Б. [47, 56] приведены системы контроля всех стадий
инициирования ПОЛ в клетке.
В работе [387] показано, что катионы Cu могут способствовать,
подобно ионам Fe, образованию OH и инициированию ПОЛ. Смесь
гипоксантина и ксантиноксидазы продуцируют О и НО, последняя
в присутствии солей меди образует гидроксилрадикал. Добавки
2,5 ммоль/дм Cu являются оптимальными, что соответствует
концентрации ионов меди в крови.
34
Ингибирование процессов ПОЛ при помощи антиоксидантов
широко обсуждается в литературе. Целью подобных работ является
исследование механизма процесса и подбор соединений, активных
в торможении окислительной деструкции жиров и пищевых
продуктов, а также подбор средств антиоксидантотерапии.
Николаевским А.Т. с соавторами [171] исследована антирадикальная активность группы антиоксидантов в процессе инициированного (70—800 С) окисления подсолнечного масла. Из многоатомных фенолов или аминофенолов лишь оксигидрохинон,
2,4-ди-трет-бутилпирокатехин, 2,5-ди-трет-бутилгидрохинон, парааминофенол имеют достаточно высокую антирадикальную активность
в подсолнечном масле. Усиление антирадикальной активности
наблюдается при введении второй гидроксильной или аминогруппы
в пара-положение, а также введение трет-бутила в пара- и ортоположение.
Гольденбергом В.Н. [68, 69] изучена антирадикальная активность
ингибиторов окисления в маслах и жирах: -токоферола,
бутилгидроксианизола, 2,2-метилен-бис-(4-этил-6-трет-бутилфенола),
-нафтола, ионола, 2,4,6-три-трет-бутилфенола, неозона-Д, -нафтола.
Ингибирующая способность исследованных соединений при инициированном окислении жиров и масел значительно ниже,
чем в этилбензоле.
Наибольшую
антирадикальную
активность
в маслах проявляет -токоферол.
В
работе [381]
эффективность
ингибиторов
оценивали
при окислении липидного субстрата, катализируемого гемоглобином.
Самую низкую активность в этих условиях имел -токоферол.
Все соединения
проявляли
активность
при
концентрации


10 моль/дм . Высокую активность имеют нордигидрогваяретовая
кислота, 2,6-ди-трет-бутил-4-оксиметилфенол и ионол. Эти соединения были активны не только при концентрации 10  моль/дм,
но последние два при концентрации 10 моль/дм. В указанных
условиях изучена активность 26-азотсодержащих соединений, в том
числе аминокислот, фосфолипидов, гетероциклов. Наибольшую
активность показали глутатион (0,02 моль/дм) и лецитин (0,5 %).
Изучен синергизм в смесях нордигидрогваяретовой кислоты
с аскорбиновой кислотой или аминокислотами, аскорбиновой кислоты
с фенолами, в том числе -токоферолом. Наибольший эффект получен
для смеси 10-3 моль/дм3 ионола и 10-4 моль/дм3 аскорбиновой кислоты.
-Токоферол не проявлял активности в смесях с аскорбиновой
кислотой. Для смеси 10-4 моль/дм ионола и 10-4 моль/дм
35
аскорбиновой кислоты эффективность торможения составляла 300,
а для смеси -токоферола и аскорбиновой кислоты только 20.
В обзоре Niki E. [364] обсуждается антиоксидантная активность
соединений в аэробных организмах. Автор делит все контролирующие
системы на два типа: предохраняющие и обрывающие цепи.
К предохраняющим системам отнесены каталаза, глутатионпероксидаза, которые разлагают гидропероксиды молекулярным
путем. Трансферрин, альбумин связывают катионы Fe, Cu,
церулоплазмин окисляет Fe до менее активного Fe.
Ингибиторы, обрывающие цепи, делятся на водо- и липидорастворимые. К водорастворимым отнесены аскорбиновая и мочевая
кислоты. Matsushita S. [352] обнаружил, что мочевая кислота является
более эффективным антиоксидантом, чем -токоферол, при окислении
эмульсии линолевой кислоты. Показано, что мочевая кислота
хелатирует катионы металлов и защищает от окисления аскорбиновую
кислоту. Мочевая кислота пропорционально концентрации тормозит
окисление липосом из соевых фосфатидилхолинов, инициируемое
водорастворимым источником свободных радикалов — 2,2-азо-бис-(2амидинопропан) дигидрохлоридом (АПДГХ). Мочевая кислота
не поглощает радикалы липидов, но поглощает радикалы инициатора
перед тем, как они атакуют мембрану. Подобный результат наблюдали
для аскорбиновой кислоты. В безводной среде мочевая кислота
оказывается неэффективной.
Wainer D.D.M. с соавторами [402] определили ряд антирадикальной активности компонентов плазмы крови: ураты (35—65 %),
протеины (10—50 %), аскорбаты (0—24 %) и витамин Е (5—10 %).
Антирадикальная активность протеинов обусловлена сульфгидрильными группами, высокий вклад уратов обусловлен
их высокими концентрациями.
Среди липидрастворимых антирадикальных компонентов клетки
особый интерес представляет -токоферол. Разными методами,
в различных субстратах показана его высокая антирадикальная
активность, с K7 от 0,8 × 10 до 5 × 10 дм/моль×с [11, 12, 297,
298, 313, 314, 406]. Главная роль -токоферола в клетке связана
с его антирадикальной активностью, он отнесен к важнейшим
биоантиоксидантам
и
используется
в
антиоксидантотерапии [39, 91, 118, 172, 285].
Между тем вопрос о роли -токоферола в биомембранах далек
от своего решения. Мало известно о том, как -токоферол транспортируется, проникает и распределяется в биомембранах. Обзор работ,
приведенный выше, свидетельствует о противоречивости результатов
36
исследований антиоксидантной активности -токоферола в воднолипидных субстратах. Часто -токоферол проявляет низкую
антиоксидантную активность или становится инициатором окисления.
Прооксидантный эффект -токоферола в безводных липидных
субстратах возрастал при увеличении концентрации -токоферола
и ненасыщенности липидного субстрата.
В работе [364] обсуждается вопрос о стабилизации биомембран
-токоферолом, а также о его протекторном действии при опухолях
и старении, признается эффективность -токоферола при снижении
кардиотоксичности
противоопухолевых
препаратов.
В
ряде
работ [364, 365] наблюдали, что -токоферол, введенный в липосомальную мембрану тормозит окисление, инициированное липидили водорастворимыми
источниками
радикалов.
-Токоферол
расходуется линейно во времени, процесс ускоряется после
его расходования. Соотношение констант реакций K7/ K2 для -токоферола в липосомах на 70 % ниже, чем гомогенных растворах
метиллинолеата. Роль аскорбиновой кислоты при окислении липидных
систем может быть многообразной: она восстанавливает Feдо Fe,
являясь прооксидантом, на этом основано аскорбатзависимое
окисление в клетке. Аскорбиновая кислота регенерирует -токоферол,
восстанавливая токофероксильный радикал (ТФ), являясь синергистом. ТФ-радикал может также восстанавливаться цистеином,
глутатионом, которые выступают синергистами, активность соединений падает в ряду: аскорбиновая кислота > цистеин > глутатион.
Если пероксильные радикалы липидов LO  образуются в водной фазе
и атакуют мембрану извне, то растворимые в воде молекулы
антиоксидантов обрывают цепи, не допуская LO  до мембран,
при этом -токоферол не активен, и синергизма с аскорбиновой
кислотой не наблюдается.
В специальном исследовании [365, 391] установлен ряд
активности эфиров аскорбиновой кислоты при инициированном
окислении метиллинолеата при 370 С. Эфиры, содержащие заместители в положении 5 или 6 в аскорбиновой кислоте, являются
антиоксидантами. Эфиры, этерифицированные по положению 2,
не являются антиоксидантами. В растворе хлороформа изучено
влияние смесей -токоферола с эфирами аскорбиновой кислоты.
В смесях -токоферола с эфирами аскорбиновой кислоты
в положении 2, фактор ингибирования равен 2. В смесях -токоферола
с эфирами в положениях 5 и 6 фактор ингибирования больше 2,
37
что свидетельствует об участии эфиров в обрыве цепей. Эфиры аскорбиновой кислоты могут быть донорами водорода за счет OH-группы.
В работе [298] показано, что -токоферол концентрируется
на внутренней стороне мембраны, при этом ароматическое кольцо
молекулы находится в непосредственной близости с карбонилом
эфиров жирно-кислотных компонентов, фенольный гидроксил
локализован вблизи фосфатной области бислоя. Если ТФ -радикал
остается там же, где -токоферол, то ему легче регенерироваться
водорастворимыми реагентами. Труднее понять, как LO -радикал
реагирует с фенольным гидроксилом, хотя можно предположить,
что LO-радикал за счет высокой полярности легко двигается
к внутреннему слою мембраны.
Установлено, что в безводной среде аскорбиновая кислота
не обрывает цепи, но восстанавливает ТФ-радикал. В водной среде
-токоферол и аскорбиновая кислота тормозят окисление.
Для изучения эффективности -токоферола использовали плазму
крови и эритроциты. Инициированное окисление проводили
в присутствии -токоферола, аскорбиновой кислоты, мочевой
кислоты. Все соединения проявляли антиоксидантный эффект,
составляющий 50—70 % от общей антиоксидантной активности
плазмы крови. Остальная антиоксидантная активность была
обусловлена альбуминами плазмы, при этом первыми расходуются
SH-группы протеинов, затем расходуются ураты и в конце -токоферол. Из этого эксперимента авторы делают вывод, что главным
антиоксидантом плазмы крови является -токоферол.
Чтобы объяснить биологическую активность -токоферола был
проведен эксперимент [298] по адсорбции тканями синтетического
и природного -токоферола. Адсорбция природного -токоферола
зависела от типа ткани. Медленнее всего адсорбирует -токоферол
мозг, быстрее — легкие. Некоторые синтетические аналоги
-токоферола были активнее природного -токоферола.
1.6. Представления о механизмах синергизма и антагонизма
в совместном действии антиоксидантов
Интерес к явлению синергизма в присутствии антиоксидантов
при окислении липидных субстратов привел к необходимости
всестороннего изучения данного эффекта. Синергизм — это способность смеси давать больший эффект торможения, чем сумма эффектов,
получаемая при их раздельном использовании. В литературе
предложены классификации, учитывающие особенности механизма
38
действия компонентов синергических смесей [113, 126, 127]. Согласно
классификации, предложенной в работе [126], синергические смеси
принято делить на пять групп:
Первая группа объединяет смеси, в которых оба компонента
являются ингибиторами (In1Н) и (In2Н) и взаимодействуют
с радикалами (RO2).
Вторая группа — это смеси, в которых один из ингибиторов (InН)
реагируе т с пероксидными радикалами (RO2), а другой —
с алкильными радикалами (R) (хиноны, нитроксильные радикалы).
Третья группа — один из компонентов реагирует
с феноксильными радикалами (In) или радикалами, образующимися
из хинона (убихинон), а другой разрушает гидропероксиды (серои фосфорсодержащие соединения).
Четвертая группа объединяет составы, один из компонентов
которых взаимодействует с радикалами или гидропероксидом,
а другой снижает скорость инициирования, включая скорость
разветвления цепи (дезактиваторы металлов, УФ-абсорберы).
Пятая группа объединяет смеси, в которые входят антиоксиданты, реагирующие с радикалами или разрушающие гидропероксиды
и вещества, которые сами по себе не способны тормозить процесс
окисления.
Авторы выделяют три типа синергизма: кинетический,
химический и физический.
Кинетический синергизм, к нему относят эффекты, при которых
не происходит взаимодействия между компонентами. Такой тип
синергизма наиболее вероятен для смесей, компоненты которых
влияют на разные стадии процесса окисления. Проявление синергизма
в такой системе является следствием сложной схемы процесса.
Кинетический тип синергизма зависит от ряда факторов: кинетических
характеристик окисляемого субстрата, активности и соотношений
антиоксидантов, режима окисления.
Химический синергизм реализуется за счет химического
взаимодействия смесей антиоксидантов или продуктов их превращения. При этом происходит регенерация наиболее активного
ингибитора из его радикала за счет менее эффективного ингибитора,
продукта превращения или инертного вещества. Полифункциональные
соединения, такие как серосодержащие фенолы, полифенолы,
аминофенолы и т. д., способны проявлять автосинергический эффект,
обусловленный взаимодействием с радикалами, ведущими процесс,
и возможностью
разрушения
пероксидов.
Ряд
соединений,
39
обладающих антирадикальной активностью, могут образовывать
автосинергические смеси с продуктами своего превращения.
Физический синергизм связан с влиянием физических факторов
(растворимость, диффузия и т. д.) или взаимодействием компонентов,
имеющих физическую природу.
Другая классификация в работе [89] разделяет синергические
системы на три большие группы, внутри которых в свою очередь
имеется детализация. В большинстве случаев имеет место сочетание
нескольких механизмов.
Первая группа объединяет смеси, один из компонентов которых
эффективно обрывает цепи окисления, а другой выполняет роль
разрушителя гидропероксидов или дезактиватора катализатора,
разрушающего перекиси на радикалы. В качестве акцепторов RO 2
чаще всего используются фенолы, ароматические амины, а для
разрушения перекисей вводят тио- и фосфитсодержащие вещества.
Данный механизм синергизма начинает работать наиболее эффективно
в условиях, когда главным источником радикалов являются
гидропероксиды, т. е. при автоокислении субстрата.
Вторая группа синергических смесей свойственна для двух
исходных веществ (ингибиторов или не ингибиторов), которые
при взаимодействии между собой образуют более эффективный
антиоксидант.
Синергизм, обусловленный взаимодействием промежуточных
продуктов превращения ингибиторов, наблюдается при введении
бинарной смеси фенолов и ароматических аминов, двух фенолов
с разной антирадикальной активностью, а также сульфидов. В такой
системе один из компонентов смеси (синергист) восстанавливает
промежуточный продукт превращения ингибитора (чаще всего
феноксильный радикал — In).
Третья группа включает смеси ингибиторов, продукты
превращения которых, взаимодействуя между собой, усиливают
действие друг друга.
Эффект синергизма, обусловленный взаимодействием исходных
реагентов, достаточно широко распространен, при этом вещества
(ингибиторы или не ингибиторы) при взаимодействии образуют
стабильные продукты. Один из компонентов таких смесей,
как правило, является ингибитором.
Действие синергических смесей редко можно описать одним
из приведенных выше механизмов, чаще всего встречаются случаи
комбинации различных типов взаимодействия.
40
Известен синергизм при сочетанном действии смесей фенолов
с разной антирадикальной активностью [265]. При этом цепи
обрываются на более активном феноле по реакции 7, образующийся
при этом феноксильный радикал регенерируется при взаимодействии
с менее активным фенолом:
PhOH + RO  PhO + ROOH
PhO + PhOH  PhOH + PhO
Константа скорости данной реакции зависит от свойств
как донора атома Н-фенола, так и акцептора — феноксильного
радикала, и увеличивается с ростом электронодонорной способности
заместителей в молекуле фенола. Так, для реакции 2,4,6-три-третбутилфеноксила с 4-трет-бутилфенолом константа составляет
3,210-4 М-1с-1, а с 4-метоксифенолом — 1,310-2 М-1с-1 [265].
Показано,
что
орто-метилзамещенные
фенолы
превосходят
по активности антиоксиданты, содержащие орто-трет-бутильные
заместители.
Широко
изучен
синергизм
в
смесях
фенолов
и аминов [36, 265, 369], в которых амины обладают более высокой
антирадикальной активностью, а фенол более низкой. Ароматический
амин характеризуется более высоким значением константы реакции
K7, нежели экранированный фенол, но в результате окисления
образует высокоактивные аминильные радикалы Аm, способные
участвовать в реакциях продолжения цепей. Радикалы Аm
регенерируются в реакции обмена с замещенным фенолом, дающим
неактивные экранированные феноксилы:
AmH + RO Am + ROOH
Am + PhOH  AmH + PhO
Можно заключить, что механизм эффекта синергизма в действии
смеси фенолов или аминов обусловлен обрывом цепей на молекулах
антиоксиданта с высокими K7, а затем феноксил или аминильный
радикал наиболее активного ингибитора регенерируется компонентом
синергетической смеси, проявляющим более низкую антирадикальную
активность.
Известен синергизм в смесях фенолов или аминов с сероили фосфорсодержащими соединениями, в том числе тиолами,
сульфидами, сульфоксидами, фосфинами, фосфитами. Роль тиолов,
41
сульфидов связывают с разрушением гидропероксидов по молекулярному механизму [189]:
ROOH + R-S-R  R-SO-R + ROH
ROOH + (RO)P  ROH + (RO)P=O
Увеличение тормозящего действия смеси по сравнению
с суммарным действием обоих ингибиторов объясняется образованием
в ходе окисления более эффективных ингибиторов, чем исходные
соединения. При ингибировании процесса окисления смесями
ароматических аминов и соединений меди [268] образуется металлкомплексное соединение меди с амином по реакциям:
AmH + Cu (2) ↔ Cu (2) × AmH
Cu (2) × AmH + RO Cu (2) × Am + ROOH
Cu (2) × Am + RO Cu (2 )+ Продукт
Cu (2) × Am + ROOH  Cu (2) × AmH + Продукт
Реакции, протекающие в присутствии смесей ингибиторовсинергистов, обрывающих цепи, характеризуются увеличением
длительности периода индукции без изменения скорости окисления
в этой фазе. Реакции, протекающие при синергическом участии смесей
ингибиторов, обрывающих цепи и разрушающих гидропероксиды,
характеризуются удлинением периода индукции и уменьшением
скорости реакции.
Рассмотрим более подробно явления синергизма при взаимодействии природных антиоксидантов. В литературе известен
синергизм смесей фенолов с аскорбиновой кислотой [232, 237, 282,
305, 328, 366, 385, 402, 404, 388, 390]. Наиболее широко изучен
синергизм аскорбиновой кислоты и -токоферола. Описано
проявление эффектов синергизма в действии природных фенолов
с лимонной, винной кислотами [259].
Роль аскорбиновой кислоты при окислении липидных систем
может быть многообразной: она восстанавливает Feдо Fe. Катионы
Fe, вступая в реакцию Фентона:
ROOH + Fe→ RO + OH+ Fe3,
способствуют инициированию процесса и выполняют таким
образом роль прооксиданта. С этим связано аскорбатзависимое
окисление в клетке.
42
В специальном исследовании [364—366] установлен ряд
активности эфиров аскорбиновой кислоты при инициированном
окислении метиллинолеата. Показано, что эфиры аскорбиновой
кислоты, содержащие заместители в положении 5 или 6 либо в каждом
из указанных положений, являются антиоксидантами. В то же время
эфиры, этерифицированные по положению 2, не являются
антиоксидантами. Известно, что аскорбиновая кислота регенерирует
-токоферол, восстанавливая его радикал (ТФ) до активной формы
ингибитора [373]. Таким образом, витамин С является синергистом
антиоксидантов. Активность известных синергистов природного
происхождения, механизм действия которых сводится к восстановлению токофероксильных радикалов, изменяется в ряду: аскорбиновая
кислота > цистеин > глутатион.
Регенерация активной фенольной формы токоферола происходит
за счет атомов водорода органических кислот [385, 388, 402].
Подобный механизм реализуется и в случае совместного присутствия
-токоферола
и
фосфолипидов [44, 45, 104, 215, 216, 219, 368].
Синергизм фосфолипидов с -токоферолом возможен также
вследствие того, что азотистые основания (этаноламин, холин),
содержащиеся в составе фосфолипидов, способны разрушать
гидропероксиды и связывать прооксидантные металлы переменной
валентности [9, 215].
Эффект синергизма наблюдается в присутствии смеси
восстановленной формы убихинона с -токоферолом, обусловленный
регенерацией активной формы токоферола за счет гидрохинона [44, 342].
Описан синергический эффект смеси токоферола с -каротином [81, 396], в других работах, напротив, отмечается проявление
антагонизма [81, 215, 217, 218].
В работе [158] показана возможность синергизма в совместном
действии фенолов и природных алифатических аминов (витамина В 5
и L-карнитина).
Несмотря на имеющиеся классификации синергизма, возможность его проявления в действии антиоксидантов выявляется,
как правило, эмпирическим путем. В связи с этим экспериментальное
подтверждение гипотез, связывающих эффективность и химическое
строение антиоксидантов с целью прогнозирования возможности
синергизма или антагонизма в их совместном действии, представляется важным и актуальным.
На основании приведенных литературных данных можно утверждать, что представления об эффективности «гибридных» молекул,
43
сочетающих в своей структуре несколько реакционных центров,
весьма ограничены. В литературе мало сведений о наиболее
эффективном сочетании определенных характеристических групп,
их взаимном расположении в молекуле, позволяющем обеспечить
наибольшую эффективность ингибирования. Отсутствие указанных
данных не позволяет прогнозировать результаты направленного
синтеза антиоксидантов новой модифицированной структуры.
В настоящей работе изучены особенности антиоксидантного действия,
взаимосвязи строения и эффективности полифункциональных
соединений, возможности усиления ингибирующего действия
синтетических антиоксидантов с природными синергистами окисления
при совместном окислении липидных субстратов.
Выводы:
1. Инициирование ПОЛ в биологических мембранах связано
с катионами металлов.
2. Катионы Cu более активны в процессах ПОЛ биологических мембран, что следует из многочисленных экспериментов.
3. Антиоксидантная и антирадикальная активность соединений
зависит от состава субстрата, условий окисления.
4. Эффективность и механизм действия ингибиторов окисления
в безводных субстратах могут существенно отличаться от активности
соединений в водно-липидных субстратах, что должно учитываться
при антиоксидантотерапии, стабилизации липидов пищевых
продуктов, фармпрепаратов, косметических средств.
5. Тестирование биоантиоксидантов в
водно-липидных
каталитических моделях эффективнее для прогнозирования антиоксидантотерапии.
44
ГЛАВА 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В настоящей работе основным методом является кинетический
метод, основанный на волюмометрическом измерении концентрации
поглощенного кислорода. Для решения отдельных задач исследования
применялись:
хемилюминесцентный,
спектрофотометрический,
фотоколориметрический,
флюориметрический,
ВЭЖХ,
рефрактометрический методы.
Антирадикальную активность (АРА) соединений тестировали
в системе инициированного окисления этилбензола хемилюминесцентным (ХЛ) методом на фотометрической установке СНК-7
совместно с к. х. н. И.Ф. Русиной [206] по описанной ранее
методике [257]. Окисление этилбензола проводили в стеклянной
ячейке, расположенной в светонепроницаемой камере фотометрической установки, снабженной фотоумножителем ФЭУ-29. Ячейка
имеет термостатируемую рубашку. Через ячейку пропускали
очищенный от пыли и паров воды воздух. Исследуемое вещество
вводили в окислительную ячейку по ходу реакции с помощью
шприцевого устройства. Излучаемый свет фокусировался на фотоумножитель с помощью системы сферических зеркал. Окисление
инициировалось азо-бис-изо-бутиронитрилом (АИБН) в концентрации
3×10-3 М при t=(60±0,2)0С. Скорость зарождения свободных радикалов
определялась экспериментально с помощью реперного ингибитора —
хромана С и составляла 2,310-8 Мс-1. Для усиления свечения
использовался люминофор 9,10-дибромантрацен в концентрации
510-4 М, не оказывающий влияния на кинетику окисления.
Концентрация ингибитора составляла (1—5) 10-4 М. В ходе
эксперимента были получены типичные S-образные кинетические
кривые. Основной кинетической характеристикой ХЛ кривых является
величина тангенса угла наклона касательной, проведенной в точке
перегиба, пропорциональная максимальной скорости расходования
антиоксиданта [d(I0/I)/dt]max. Указанную величину использовали
для расчетов значения K7 с учетом уравнения:
dtI0 /I /dt max  0,22  0,02 k 7 
Wi / k 6 ,
где: k6 — константа скорости рекомбинации перекисных радикалов
(для этилбензола k6 = 4,1108 e -2100/RT),
45
I0 и I — экспериментально определяемые интенсивности ХЛ
в отсутствии и в присутствии антиоксиданта,
Wi — скорость инициирования [29, 241].
Стехиометрический коэффициент ингибирования f, показывающий число радикалов, гибнущих на одной молекуле антиоксиданта
(АО), оценивали по значению тангенса угла наклона зависимости
периодов индукции от концентрации введенного ингибитора либо
по формуле:

f  Wi t
t  1  I / I 0  dt
0
InH0
.
Антиоксидантную активность (АОА) соединений изучали
волюмометрическим методом в присутствии инертного растворителя
хлорбензола в манометрических установках типа Варбурга
при окислении модельного субстрата — метилолеата (МО) [241, 255].
Процесс инициировали за счет термического разложения при
t=(60±0,2)0С АИБН в концентрации 3×10-3 М, скорость инициирования
в условиях эксперимента составляла 4,2×10-8 М×с-1. Графическим
методом [247] определяли величину периода индукции ( i),
представляющую собой отрезок оси абсцисс, отсекаемый
перпендикуляром из точки пересечения касательных к кинетической
кривой. Эффективность торможения процесса окисления липидного
субстрата
определяли
совокупностью
реакций
ингибитора
и обозначали как антиоксидантную активность, количественно
рассчитанную по формуле АОА= i-S /S, где S и i — периоды
индукции окисления субстрата в отсутствие и в присутствии
исследуемого АО соответственно. Из наклона кинетических кривых
(КК) определяли начальную (Wнач.) и максимальную (Wмак.) скорости
окисления липидного субстрата с добавками АО. Скорость
инициирования определяли уравнением Wi = f [InH] / i, где f —
стехиометрический
коэффициент
ингибирования,
[InH]
—
концентрация стандартного ингибитора, i — период индукции.
В качестве стандартных ингибиторов использовали α-токоферол
(α -ТФ) и дибунол, при этом концентрации АО были сравнимыми.
Антиоксидантную активность в водно-липидной среде изучали
волюмометрическим методом в модифицированной установке типа
46
Варбурга при окислении модельного субстрата (метиллинолеата (МЛ),
метилолеата (МО) и этилолеата (ЭО)) в присутствии триметилцетиламмоний бромида (ЦТМАБ) в качестве поверхностно-активного
вещества (ПАВ) (10-4–10-2 М), с добавками растворов солей металлов
в количестве (10-6-10-1 М) при t=(60±0,2) 0С. Соотношение эфира
и воды составляло 1: 3, а общий объем пробы 4 мл [230]. Критическую
концентрацию мицеллообразования (ККМ) ЦТМАБ изучали методом
Ребиндера и рефрактометрическим методом.
Кинетику накопления гидропероксидов в модельном субстрате
исследовали в условиях автоокисления методом обратного йодометрического титрования в среде хлорбензола при t=(60±0,2) 0 С [283].
Навеску окисляемого модельного субстрата растворяли в смеси
ледяной уксусной кислоты и хлороформа в соотношении 3:2,
добавляли иодид калия, смесь перемешивали и оставляли в темноте.
Через равные промежутки времени отбирали пробы и определяли
в них перекисное число:
ПЧ 
0,1269  (a  b)
,
d
где: а — объем Na2S2O3, пошедший на титрование пробы;
b — объем Na2S2O3, пошедший на титрование контрольного
опыта;
d — масса навески субстрата окисления.
Для установления характера совместного действия двух
ингибиторов сопоставляли между собой простую сумму периодов
индукции отдельных компонентов (аддитивное действие Στі) и брутто
эффективность их смеси (τΣ). Если в результате сочетания ингибиторов
получили выигрыш в периодах индукции (Δτ) по сравнению
с аддитивным действием АО, т. е. (τΣ > Στі), то в совместном действии
ингибиторов определялся эффект синергизма. В случае если
совместное действие двух АО было меньше, чем сумма эффектов
ингибирования индивидуальных веществ (τ Σ < Στі), то делалось
заключение о проявлении антагонизма в совместном действии АО.
Эффект синергизма оценивали по разности Δτ =τΣ -Στі и в относительных единицах Δτ/ Στі×100 %.
Феноксильные радикалы получали методом стационарного
фотолиза, идентифицировали методом УФ-спектроскопии с использованием спектрофотометра «Specord М-40» с автоматизированной
записью и компьютерной обработкой спектров в области 290—425 мн.
Количество фенолов оценивали методом ИК-спектроскопии (в области
47
3620 см-1) на спектрофотометре «Specord 75-IR», этим же методом
исследовали взаимодействие феноксилов с субстратами окисления.
Фотолиз фенолов проводили в специально сконструированной камере,
снабженной двумя ртутными лампами, мощностью 250 Вт.
Все измерения проводили при 200 С в термостатируемых кюветах
длиной 0,5—1,0 см.
В работе были использованы α-токоферол и дибунол («Serva»,
Германия). Чистоту антиоксидантов исследовали методами УФи ИК-спектроскопии, ВЭЖХ на хроматографе «Милихром А-02»
со спектрофотометрическим детектором — двухлучевым УФспектрофотометром и колонкой «Nucleosil 100-5». При регистрации
хроматограмм использовали режим градиентного элюирования
с помощью воды, метанола и ацетонитрила (скорость подачи —
100 мкл/мин, объём кюветы — 1,2 мкл). Содержание основного
антиоксиданта составляло ≥ 99,9 %. Температура плавления дибунола
после очистки составляла 70 0С. При ТСХ в системе бензол:
петролейный эфир (95:5) на пластинках «Silufol» выявлялось одно
пятно -токоферола с Rf = 0,79.
В биологическом эксперименте исследовали влияние дозы
и кратности введения -токоферола ацетата per os животным
на изменение антиоксидантной, антирадикальной активности липидов
плазмы крови и эритроцитов.
Для эксперимента использовали 4 группы по 10 белых крыс
самцов линии Виста. Животные имели массу тела 160—200 г,
их содержали в условиях вивария на стационарном рационе
без ограничений в воде и пище с естественной сменой освещенности.
Первой группе животных вводили однократно per os по 20 мг
-токоферола ацетата. Через 6 часов забирали из аорты кровь
в количестве 3 мл, из которой выделяли плазму и эритроциты.
В липидах плазмы крови и эритроцитах анализировали кинетическим
методом антиоксидантную активность, спектрофотометрическим,
флуориметрическим методами определяли концентрацию сопряженных диеновых соединений и продуктов, реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой соответственно. Параллельно фотоколориметрическим методом анализировали концентрацию общих липидов
в плазме крови и эритроцитах.
Второй группе животных вводили одну и ту же дозу
-токоферола ацетата 7 раз в 8 часов утра каждого из семи дней. Через
6 часов после введения последней дозы забирали кровь и анализировали по перечисленным выше показателям.
48
Третьей группе животных вводили одну и ту же дозу
-токоферола ацетата 10 раз в 8 часов утра каждого из 10 дней. Через
6 часов после введения последней дозы забирали кровь
и анализировали по перечисленным выше показателям.
Четвертая группа животных была контрольной.
Изолирование липидов из компонентов крови животных
Кровь из аорты животных стабилизировали 1/10 объема 3,8 %
раствором цитрата натрия, центрифугировали 10 минут при 3000 об /
мин. Плазму отделяли от эритроцитов. Эритроциты дважды
промывали 0,9 % раствором натрия хлорида. Экстракцию липидов
фракций крови осуществляли по методике [228]. Отдельно из плазмы
крови и эритроцитов экстрагировали липиды 100-кратным избытком
бинарного растворителя гептан -2-пропанол (1 : 1 по объему) в течение
10 минут, расслаивали добавлением по каплям дистиллированную
воду. Отбирали гептановый экстракт, в котором анализировали
антиоксидантную активность липидов, концентрацию продуктов ПОЛ,
общих липидов по методикам [140, 229].
Анализ суммарной антиоксидантной активности липидов
Показатели суммарной антиоксидантной активности липидов
определяли кинетическим методом [229]. Сущность метода состоит
в том, что гептановый экстракт липидов обезвоживали сульфатом
натрия, аликвоту в 3 мл смешивали с 1 мл раствора АИБН
в хлорбензоле с концентрацией ингибитора в пробе, равной
1,8 × 10 моль/дм. Пробу насыщали кислородом, отмечали
поглощение кислорода во времени. По результатам анализа строили
график. По графику отмечали время поглощения 25 мм кислорода
и использовали его как показатель суммарной антиоксидантной
активности. По наклону линейного участка кинетической кривой
рассчитывали скорость окисления и использовали этот параметр
как показатель антиоксидантной активности липидов.
Анализ концентрации сопряженных диеновых и триеновых
соединений
Первичными продуктами ПОЛ являются сопряженные диеновые
гидропероксиды. При их распаде и дальнейшем окислении могут
образовываться другие сопряженные диеновые или триеновые
соединения. Эти соединения поглощали при 230 и 270 нм
соответственно. Для анализа концентрации сопряженных диеновых
и триеновых соединений аликвоту гептанового экстракта липидов
плазмы крови или эритроцитов фотометрировали в области 220—230
и 260—280 нм против спектрально чистого гептана. В качестве
показателей концентрации сопряженных диеновых или триеновых
49
соединений использовали оптическую плотность в максимуме, обычно
при 232 и 268 нм (Д и Д). Показатели оптической плотности
соотносятся с концентрацией общих липидов по выражениям:
Д / мг. = Д / p ,
Д / мг. = Д / p ,
где: p — масса общих липидов в 1 мл гептанового экстракта.
Анализ концентрации продуктов, реагирующих с 2 - тиобарбитуровой кислотой
При окислении полиненасыщенных кислот липидов может
образовываться малоновый альдегид, который дает окрашенный или
флюоресцирующий продукт с 2-тиобарбитуровой кислотой (2-ТБК).
Хотя в литературе существуют разногласия в оценках природы
окрашенных
продуктов [154, 229, 277, 343, 346],
в
медикобиологических
исследованиях
интенсивности
ПОЛ
именно
эту реакцию используют чаще всего. В настоящей работе использовали усовершенствованную методику [229] оценки концентрации
продуктов, реагирующих с 2-ТБК. Суть ее в том, что для анализа
использовали аликвоту общего гептанового экстракта липидов.
К 0,3 мл гептанового экстракта добавляли 0,3 мл — 2-ТБК
(0,67 % раствор в воде), смешивали в пробирке на 10 мл,
термостатировали 15 минут при 105—1100 С с обратным холодильником на глицериновой бане, охлаждали, добавляли n-бутанол
до 7 мл, встряхивали, флюориметрировали при длине волны
возбуждения 535 нм и волне флюоресценции 515 нм. Результаты
рассчитывали по формуле и выражали как тиобарбитуровое число
(ТБЧ):
ТБЧ = Ip / Iф ,
где: Ip и Iф — интенсивность свечения рабочего и фонового
растворов соответственно, результаты также пересчитывали с учетом
содержания липидов в субстрате по формуле:
ТБЧ / мг. = Ip / Iф × p ,
где: p — масса липидов в 1 мл гептанового экстракта.
Анализ концентрации общих липидов
В аликвоте гептанового экстракта липидов объемом 0,05 мл
фотоколориметрическим методом анализировали концентрацию
50
общих липидов по стандартной методике [229], в которой
усовершенствован расчет концентраций применительно к липидам
крови [229]. С этой целью к пробе добавляли 2,5 мл концентрированной серной кислоты, нагревали 10 минут на кипящей водяной
бане (или 5 минут на глицериновой бане) в пробирках со шлифом
на 10 мл. Затем 0,2 мл охлажденного раствора смешивали с 3 мл
фосфорно-ванилинового реактива, пробу перемешивали, выдерживали
45 минут при комнатной температуре в темном месте и спектрофотометрировали в течение 15 минут при 534 нм против контрольной
пробы. Концентрацию липидов рассчитывали [229] по формуле:
С мг/мл = Д × n / K × l ,
где: K — удельный коэффициент экстинкции, постоянный для плазмы
крови, эритроцитов, цельной крови, равный 636,0 мг/мл;
n — коэффициент пересчета концентрации липидов в экстракте
на их концентрацию в 1 мл крови, при разведении 1 : 100 равный 3500 ;
l — толщина кюветы.
Приготовление фосфорно-ванилинового реактива (ФВР):
Готовят ФВР непосредственно перед употреблением. Для этого
растворяли 0,3 г ванилина в растворе фосфорной кислоты (22,5 мл
концентрированной HPO и 25 мл HO).
Методика волюметрических измерений
Для изучения кинетики окисления липидных субстратов
использовали волюметрическую установку (рис. 2.1.), предназначенную для измерений небольших концентраций кислорода
в присутствии источника свободных радикалов.
Установка состоит из термостатируемой реакционной ячейки (1)
(объёмом 2—4 мл), манометра (5), заполненного жидкостью Броуди,
магнитной мешалки (2), системы соединительных стеклянных трубок
и кранов (4, 7, 8), термостата (3), источника кислорода. Реакционная
ячейка с помощью шлифа на вакуумной смазке соединяется
со стеклянным отводом и через трехходовой кран (7) с манометром
и линией подачи кислорода.
Каталитическое окисление характеризуется высокой скоростью
окисления и поглощением больших объемов кислорода по сравнению
с инициированным окислением. Для проведения окисления
в катализируемых системах была создана установка (рис. 2.2.),
предназначенная для измерения больших концентраций кислорода.
Установка состоит из термостатируемой реакционной ячейки (1)
(объёмом 5—7 мл), манометра (5), заполненного жидкостью Броуди,
51
магнитной мешалки (2), системы соединительных трубок и кранов
(4, 7, 8), термостата (3), источника кислорода, уравнительной склянки
(6). Реакционная ячейка с помощью шлифа на вакуумной смазке
соединяется со стеклянным отводом и через трехходовой кран (7)
с манометром и линией подачи кислорода. Уравнительная склянка
с помощью резиновой трубки соединена с манометром.
Жидкость Броуди содержит 23 г хлорида натрия и 5 г
холеинового кислого натрия (или нитрита натрия), которые растворяли
в 500 мл воды, в раствор добавляли кислый фуксин [399].
Работа с установкой включает следующие этапы:

градуировка по методики Умбрейта [399], определение
констант реакционных сосудов;

подбор режима перемешивания и термостатирования,
при котором скорость окисления реакционной смеси не зависела
от интенсивности перемешивания.

измерение объема поглощенного кислорода в мм 3
во времени.
Реакционный сосуд заполняли исследуемой смесью и устанавливали на магнитную мешалку. В течение 5 минут происходило
термостатирование пробы. Систему заполняли кислородом, включали
секундомер (начало реакции), отмечали объем поглощенного
кислорода по показаниям манометра через 1—5 минут. После
поглощения 250—300 мл кислорода систему отключали.
Объем поглощенного кислорода рассчитывали по выражению:
V (мл) = h (мл) × k (мл),
где: h — показания манометра,
k — константы сосудов, которые имеют значения 1,1—1,2.
Объем кислорода в моль/дм3 рассчитывали по выражению:
V O2 (моль/дм) = V × 10 × 10 / 22,4 × Vпробы,
где: 10 — коэффициент перевода объема кислорода в дм,
22,4 — объем 1 моля газа,
10/Vпробы — коэффициент пересчета количества поглощенного
кислорода на 1 л субстрата.
52
Рисунок 2.1. Схема манометрической установки: 1 — ячейка,
2 — магнитная мешалка, 3 — термостат, 4 — двухходовой кран,
5 — манометр, 6 — винт, 7 — трехходовой кран,
8 — двухходовой кран
Рисунок 2.2. Схема модернизированной манометрической
установки: 1 — ячейка, 2 — магнитная мешалка, 3 — термостат,
4 — двухходовой кран, 5 — манометр, 6 — уравнительная склянка,
7 — трехходовой кран, 8 — двухходовой кран
53
Графические способы расчета кинетических параметров
По результатам эксперимента строили кинетические кривые,
по которым рассчитывали период индукции, начальную и максимальную скорости окисления. Типичная кинетическая кривая и схема
расчета кинетических параметров приведены на рис. 2.3. Период
индукции оценивали двумя способами. Период полного торможения
определяли по времени поглощения 1 мм кислорода на 1 мл
субстрата. Полный период индукции соответствовал времени выхода
на максимальную скорость. Его определяли графическим
методом [247]. С этой целью линейный участок кинетической кривой
продолжали до пересечения с осью абсцисс, получают отрезок АВ,
получали прямоугольный треугольник АВС. Середину катета АС
отмечали точкой Д, получали треугольник ВСД. Параллельно
гипотенузе ВД проводили касательную к кинетической кривой.
Из точки F опускали перпендикуляр FQ. Отрезок оси абсцисс
от начала координат до точки Q соответствовал полному периоду
индукции (i).
V, мм
3
120
100
V
80
t
60
40
A
20
D
0
0
i B 20 Q
C
40
60
80
t, мин
Рисунок 2.3. Схема расчета периода индукции
54
Максимальную скорость окисления (Wмак.) определяли
по наклону линейного участка кинетической кривой и рассчитывали
по выражению, результаты выражают в моль/л×с (М×с-1):
Wмак. = V O2 /  t,
где: V — объем поглощенного кислорода, дм;
t — время в секундах.
Расчет начальной скорости окисления осуществляли [268]
графическим методом «зеркала» и уточняли в двух-трех точках:
Wнач. = V O2 /  t.
Определение скорости инициирования
Скорость инициирования рассчитывали двумя методами:
аналитическим и графическим (метод ингибиторов).
Сущность
метода
ингибиторов [259]
состоит
в
том,
что в окисляющийся субстрат вводили сильный ингибитор — дибунол
(ионол) в возрастающих концентрациях. Определяли период индукции
для каждой концентрации. Строили график зависимости периода
индукции от концентрации ингибитора. По наклону линейного участка
этой зависимости и выражению определяли скорость инициирования:
Wi = f [InH] / ,
где: f — стехиометрический коэффициент ингибирования;
[InH] — концентрация ингибитора;
 — период индукции.
Скорость
инициирования
определяли
аналитическим
методом [263] по выражению:
Wi = l Ki [InH],
где: Ki — константа скорости распада ингибитора;
[InH] — концентрация ингибитора, моль/дм;
l — эффективность инициирования, которая определяется
степенью выхода радикалов из «клетки». Значение е для растворов
этилолеата и метиллинолеата в хлорбензоле при t=(600,2)0С
составляет 0,95; 1,2 соответственно [270].
55
Константу
из выражения:
скорости
распада
инициатора

 (
 = ,  ×  × −
рассчитывали
× )−
Получение и очистка эфиров высших ненасыщенных жирных
кислот
В качестве липидных субстратов использовали метиллинолеат,
метилолеат и этилолеат.
Метиллинолеат получали этерификацией линолевой кислоты
(марки х.ч.), четырехкратным избытком метанола в присутствии 3 %
серной кислоты, с последующей перегонкой эфиров под вакуумом
и выделением фракции 168—1700 С ( при 1 мм.рт.ст.) [34, 72].
100 г линолевой кислоты помещали в плоскодонную колбу на 1 л.
В процессе перемешивания на магнитной мешалке приливали 400 г
(500 мл) метанола и 12 г концентрированной серной кислоты
(d =1,84 г/мл). Колбу закрывали пробкой и выдерживали 1 час
при комнатной температуре и перемешивали на магнитной мешалке,
жидкость мутнела и расслаивалась. Метиллинолеат находился
в нижнем слое, который отделяли при помощи делительной воронки.
Остаток экстрагировали 150 мл гексана (или петролейного эфира).
Затем дополнительно проводили трехкратную экстракцию по 50 мл
гексана. Гексановые экстракты объединяли с метиллинолеатом
и промывали дистиллированной водой, затем 1 % раствором натрия
гидрокарбоната до слабощелочной или нейтральной реакции, затем
вновь дистиллированной водой до нейтральной реакции. Хорошо
разделяли слои. Гексановый экстракт сушили безводным натрия
сульфатом в количестве 10 % от массы, отфильтровывали и отгоняли
гексан на роторном испарителе в токе аргона. Остаток вновь сушили
безводным натрия сульфатом, отфильтровывали и перегоняли
под вакуумом, первую часть отбрасывали, отбирали среднюю фракцию
с температурой кипения 2000 С, запаивали в ампулы по 2—3 мл. Выход
продукта составлял 60 %.
Этилолеат получали этерификацией олеиновой кислоты
(марки х.ч.) четырёхкратным избытком этанола в присутствии 3 %
серной кислоты, с последующей перегонкой эфиров под вакуумом
и выделением фракции 158—160 0С (при 1 мм.рт.ст.) по методике
аналогичной для получения метиллинолеата [34]. Выход продукта
составлял 60 %.
56
Выделение и очистка инициатора, ингибиторов и растворителей
В качестве источника свободных радикалов использовали
2,2 - азо-бис-изо-бутиронитрил (АИБН). Очистку АИБН проводили
последовательной перекристаллизацией из безводных этанола, ацетона
и бензола.
Этиловый спирт нагревали до 700 С, готовили в нем насыщенный
раствор АИБН и проводили горячее фильтрование. Раствор охлаждали
до 10 0С, отфильтровывали под вакуумом. Осадок растворяли
в ацетоне при 50 0С, раствор фильтровали методом горячего
фильтрования, фильтрат охлаждали до –100 С и фильтровали
под вакуумом. Осадок растворяли при 400 С в бензоле, раствор
фильтровали на горячем фильтре, раствор охлаждали до –50 С,
отфильтровывали осадок и высушивали под вакуумом до постоянного
веса. Чистый АИБН хранят при –100 С в бюксе со шлифом [78].
Хлорбензол, бензол, гептан очищали от олефинов путем
их сульфирования,
последующего
отделения
сульфоэфиров,
промывали до нейтральной среды, сушили и перегоняли [27, 50],
чистоту контролировали по константам. Метиловый и этиловый
спирты обезвоживали кипячением в присутствии оксида кальция
в течение 6—8 часов на водяной бане с последующей перегонкой
с дефлегматором.
Ацетон обезвоживали нагреванием с безводным карбонатом
калия в течение 6—8 часов с последующей перегонкой
с дефлегматором.
-Токоферол (фирмы «Serva», Германия) очищали перегонкой
под вакуумом и последующей очисткой методом тонкослойной
хроматографии (ТСХ) в системе петролейный : диэтиловый эфир
(9 : 1 по объему). 2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол (дибунол, ионол)
чистили двух-кратной кристаллизацией из абсолютного этанола.
Дибунол растворяли в этаноле при 60 С, раствор фильтровали
методом горячего фильтрования, фильтрат охлаждали до –100 С,
осадок отфильтровывали под вакуумом, обезвоживали в эксикаторе
над PO до постоянного веса. Фенол очищали возгонкой, пирокатехин
дважды кристаллизовали из бензола.
Пример математической обработки экспериментальных данных
Полученные в процессе окисления липидных субстратов экспериментальные кинетические кривые описывались функциональными
зависимостями методом наименьших квадратов.
Пример. Найдем наилучшее приближение методом наименьших
квадратов. Для прямой у=kх+b находим S такое, чтобы для n значений
57
n
величина суммы квадратов отклонений S =
 (y i  k  x i  b) 2
i 1
была минимальной. Надо, другими словами, выбрать числа k и b так,
чтобы величина S была наименьшей.
Для этого найдем частные производные для S по k и b
и приравняем их нулю:
dS
= -2
db
n
dS
 (y i  k  x i  b) =0 и d k = 2
i 1
n
 (y i  k  x i  b)  (x i ) =0
i 1
Получаем систему уравнений для определения чисел k и b:
n
n
 n
 x  y  k x  2  b x  0
i i
i
i

i 1
i 1
i 1

n
n

y

k
x i  b n  0

i

i 1
i 1





Найдем k и b, для краткости обозначив
n
A1 =

xi ,
i1
n
n
A2 =
 x i  2 ,
A3 =
i 1

yi ,
i1
Перепишем систему в новом виде:
A 2  k  A1  b  A 4

 A1  k  b  n  A 3
58
n
A4 =
 x i  yi .
i 1
Решаем:
k = n  A 4  A 3  A1 ;
n  A 2   A1 
2
b = A 3  A 2  A 4  A1
n  A 2   A1 
2
В нашем случае нужно подобрать степенную функцию y = axm.
Сведем задачу к более простой. Для этого логарифмируем обе части
формулы: lg y = m lg x + lg a
Вводя новые переменные z = lg y и u = lg x, получаем линейную
зависимость z = mu + lg a, обрабатывая ее описываемым выше
методом наименьших квадратов, находим искомые степень m
и коэффициент a. Таким образом, задача сводится к линейной.
Находим ln t, lnV, ln t2 ln tV и сводим в таблицу 1. Подсчитывая
суммы этих величин, находим A1 A2 A3 A4.
Таблица 1.
Параметры кинетических кривых, полученные методом
наименьших квадратов
t
V
ln t
lnV
(ln t)2
ln t lnV
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
1
2
3,2
4,5
6
8
10
12
14
16
17,8
19,8
21,7
23,5
25,6
27,5
2,302585
2,995732
3,401197
3,688879
3,912023
4,094345
4,248495
4,382027
4,49981
4,60517
4,70048
4,787492
4,867534
4,941642
5,010635
5,075174
0
0,693147
1,163151
1,504077
1,791759
2,079442
2,302585
2,484907
2,639057
2,772589
2,879198
2,985682
3,077312
3,157
3,242592
3,314186
5,301898
8,974412
11,56814
13,60783
15,30392
16,76366
18,04971
19,20216
20,24829
21,20759
22,09452
22,92008
23,69289
24,41983
25,10647
25,75739
0
2,076483
3,956105
5,54836
7,009404
8,51395
9,782522
10,88893
11,87526
12,76824
13,53362
14,29393
14,97892
15,60077
16,24745
16,82007
67,51322 36,08669 294,2188
A1
A2
A3
163,894
A4

59
V=0,06t1,20 V=0,05t1,24
0,950936
2,184677
3,553831
5,01907
6,560172
8,164559
9,82356
11,53079
13,28135
15,07132
16,8975
18,75723
20,64825
22,56861
24,51663
26,49081
0,87749
2,078764
3,442791
4,924571
6,500561
8,155936
9,880384
11,66626
13,50763
15,39976
17,33875
19,32133
21,34472
23,40653
25,50465
27,63725
Вычисляем степень наилучшего приближения
m=
n  A 4  A 3  A1
= 1,244272,
2
n  A 2   A1 
где: n — количество измерений с ненулевым V (в данном случае
n =16)
Вычисляем ln a =
A 3  A 2  A 4  A1
= -2,994881,
2
n  A 2   A1 
отсюда а = e-2,994881=0,050043
Следовательно, наилучшее приближение V=0,05t1,24 .
Подсчитаем квадратичное отклонение S1 для найденной методом
последовательного перебора функции V=0,06t1,20 и S2 для функции
V=0,05t1,24 , найденной методом наименьших квадратов, и построим
рисунок (рис. 2.4.).
Рисунок 2.4. Кинетические параметры, полученные методом
наименьших квадратов (Ряд 3, S2=1,86); полученные методом
последовательного перебора функции (Ряд 2, S1=8,46);
точками (Ряд 1) обозначены исходные данные
60
ГЛАВА 3.
МОДЕЛИРОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ ОКИСЛЕНИЯ
ЛИПИДОВ БИОМЕМБРАН
В ПРИСУТСТВИИ АНТИОКСИДАНТОВ
3.1. Разработка кинетической модели
экспресс-тестирования антиоксидантов
Разработана кинетическая модель экспресс-тестирования
антиоксидантной активности различных классов органических
соединений в условиях, приближенных к биологическим средам.
Показано, что скорость окисления модельных субстратов в воднолипидной среде в 1000 раз выше, чем в безводной среде. Подобраны
оптимальные условия каталитического окисления эфиров высших
ненасыщенных жирных кислот в водно-липидной среде в зависимости
от природы и концентрации солей металлов переменной валентности
и поверхностно-активного вещества.
В настоящее время развитие многих патологий связывают
с активацией
перекисного
окисления
липидов
биомембран [39, 137, 138]. При этом в организме нарушается баланс
процессов образования и распада пероксидов, свойственный
нормальным тканям. Увеличение концентрации пероксидов меняет
физические и биологические свойства мембран. Поэтому терапию
многих
патологий
связывают
с
применением
антиоксидантов [102, 155]. Актуальной остается проблема предварительного
тестирования их антиоксидантной активности, расширение спектра
фармакологического действия уже известных лекарственных препаратов с целью выявления у них дополнительных антиоксидантных
свойств. Поскольку большинство известных моделей для тестирования
антиоксидантов являются гидрофобными, представлялось актуальным
подобрать гидрофильную липидную систему и проверить
её эффективность на примере известных химических соединений,
предположительно имеющих антиоксидантную активность, сравнить
их действие со стандартными ингибиторами окисления дибунолом
и -токоферолом.
Известно, что катионы металлов входят в структуру
биокластеров, активных центров многочисленных белков-ферментов.
Так, железо входит в состав гемоглобина, цитохромов, каталазы,
содержится в ферритине, трансферрине. Кобальт входит в состав
цианокобаламина (витамина В12), его аналоги являются кофакторами
61
различных ферментов, участвующих в эритропоэзе. Медь содержится
в цитохроме-С-оксидазе, в голубых белках, супероксиддисмутазе [55].
Особенности окисления липидов в клетке обусловлены прежде всего
каталитической активностью катионов металлов и возможностью
участия ферментов в регулировании этих процессов. Известны
многочисленные работы по тестированию активности катионов
металлов, которые относятся в основном к катализу гомогенных
липидных систем [14, 272, 298, 309, 376, 377]. Эти результаты имеют
ограниченное значение для описания процессов окисления, протекающих в мицеллах и живой клетке. Мало работ, в которых
сравниваются антиоксидантные свойства соединений различных
классов в безводной и водно-липидной средах в условиях инициирования и катализа. Поэтому актуальной являлась разработка
кинетического способа тестирования антиоксидантной активности
различных классов органических соединений (фенолов, аминов,
серосодержащих
соединений)
в
условиях,
приближенных
к биологическим средам, изучение антиоксидантной активности ряда
лекарственный препаратов в сравнении с реперными антиоксидантами
дибунолом (ионолом) и -токоферолом.
В настоящей главе приведены результаты каталитического
влияния солей металлов переменной валентности на процесс
окисления липидного субстрата в водно-липидной среде, приближенной к условиям клетки. Показаны оптимальные условия
каталитического окисления эфиров высших ненасыщенных кислот
в водно-липидной кинетической модели в зависимости от природы
и концентрации солей переходных металлов и поверхностноактивного вещества (ПАВ), перспективность использования
гетерогенной системы в качестве модели для изучения окисления
липидных субстратов различной природы.
Разработка кинетического метода базировалась на исследовании
активности солей металлов переменной валентности: сульфата железа
(II), хлорида железа (III), хлорида никеля (II), хлорида кобальта (II),
хлорида меди (II) в водно-липидных субстратах. Для эмульгирования
модельного
субстрата
использовали
поверхностно-активное
соединение три-метил-цетил-аммоний бромид (ЦТМАБ), в качестве
липидов исследовались: метилолеат (МО), этилолеат (ЭО), метиллинолеат (МЛ), линолевая кислота (ЛК). С целью выбора наиболее
эффективного катализатора изучали в сравнительном аспекте влияние
упомянутых выше солей на процесс окисления МЛ.
Механизм действия катализатора при окислении липидного
субстрата может быть охарактеризован по характеру кинетических
кривых (КК). При участии катионов металлов только в зарождении
62
цепей процесс окисления должен начинаться и протекать с постоянной
скоростью. Если катализатор участвует в зарождении цепей и распаде
гидропероксидов, то кинетика должна быть более сложной: КК
должны содержать прямолинейный начальный участок, который
соответствует только участию катионов в зарождении цепей
и накоплению
необходимых
концентраций
гидропероксилов.
При достижении
критических
концентраций
гидропероксидов
начинается их распад с участием катионов, ускорение процесса
и достижение максимальной скорости. Конкурентное участие
катионов в обрыве цепей должно приводить к замедлению процесса
и S-образному характеру КК. Замедление процесса возможно также
за счет перехода катиона металла в менее активную форму.
В присутствии катализатора известны следующие реакции
зарождения цепей [55, 160], при этом наблюдается цикличность
окисленной (Cu) и восстановленной (Cu) формы ионов:
RH + Cu → R● + Cu + H
ROOH + Cu → RO● + OH+ Cu
ROOH + Cu → RO● + H + Cu
Возможно участие катализатора в продолжении цепей :
RO● + Cu+ HO → RO● + Cu(OH)
Первыми исследовали в качестве катализатора соли железа (II,
III), исходя из того, что железо в свободном состоянии и в виде
комплексов является естественным катализатором процессов ПОЛ
в живой клетке организма.
На рис. 3.1. приведены кинетические кривые поглощения
кислорода МЛ в присутствии различных концентраций хлорида
железа. Из рис. 3.1. видно, что кривые имеют классическую
S-образную форму. На кривых можно различить два участка. Первый
участок характеризует аутоускоренный процесс, выход реакции
на максимальную стационарную скорость, второй — замедление
и достижение предельной скорости. Кинетические параметры
окисления приведены в табл. 3.1. Как видно из таблицы, при всех
концентрациях хлорида железа (III) начальные (W нач.) и максимальные
(Wмах.) скорости окисления меняются в незначительных пределах
и составляют (2,7  0,4)×10-5 и (4,3  0,8)×10-5 М × с-1.
В соответствии с общей концепцией механизма катализа,
результаты могут быть объяснены следующим образом: начальный
63
VO2, см
3
участок КК характеризует процесс медленного накопления радикалов
за счет участия катализатора в реакциях зарождения цепей. Второй
участок характеризует процесс накопления гидропероксидов,
катализатор участвует в разветвлении цепей за счет их радикального
распада. При этом скорость достигает максимального значения.
По мере накопления гидропероксидов или других продуктов
окисления образуются их комплексы с катионами железа, которые
распадаются затем по молекулярному механизму. На этом участке
кривой появляется ингибирующая активность катализатора, при этом
скорость окисления значительно снижается.
При окислении МЛ в зависимости от концентрации добавок
сульфата железа (II) наблюдали два характера кинетических кривых
при разных концентрациях катализатора (рис. 3.2). Первая зависимость
характеризует аутоускоренный процесс на всем протяжении
кинетической кривой (при соотношении катализатора и субстрата 1 :
100000—1 : 500). Второй вид КК имеет два участка (при соотношении
катализатора и субстрата 1 : 50—1 : 1).
18
1
16
14
2
34
12
10
8
6
4
2
0
0
50
100
150
200
250
300
t, мин
Рисунок 3.1. Кинетические кривые окисления метиллинолеата
в водно-липидной среде в присутствии добавок хлорида железа (III)
М: 1- 110-2; 2- 110-1;3- 110-4; 4- 110-3; 1×10 М ЦТМАБ, t=600 С
64
3
VO2, см
3
20
1
2
5
4
15
6
7
10
5
0
0
50
100
150
200
t, мин
Рисунок 3.2. Кинетические кривые окисления в водно-липидной
среде метиллинолеата в присутствии добавок сульфата железа
(II), М: 1- 1×10-4, 2- 2×10-4, 3- 1×10-5, 4- 1×10-2, 5- 5×10-4, 6- 1×10-6,
7- 1×10-1; 1×10 М ЦТМАБ, t=600 С
Первый участок — аутоускоренный процесс, где поглощается
небольшой объем кислорода (2,7—3,1) × 10 М, второй — замедление,
а затем достижение предельной скорости (при поглощении (5,6—6,3) ×
10 М кислорода). Приведенные данные свидетельствуют об участии
катионов железа (II) в реакциях зарождения цепей, в радикальном
распаде
гидропероксидов,
что соответствует
аутоускоренному
характеру КК. При S-образном характере КК возможно образование
комплексов продуктов окисления с катионами железа (II). При этом
молекулярный распад комплексов приводит к снижению скорости
окисления. На этом участке кривой проявляется ингибирующая
активность катализатора и скорость снижается.
Исследована кинетика окисления МЛ в зависимости от концентрации хлорида никеля (II). Показано, что при всех исследуемых
концентрациях КК окисления имеют S-образный характер (рис. 3.3).
Начальный участок КК характеризует процесс медленного накопления
радикалов за счет участия катализатора в реакциях зарождения цепей,
второй участок — процесс накопления гидропероксидов и участия
катализатора в разветвлении цепей.
65
VO2, см3
КК окисления МЛ в присутствии хлорида кобальта (II) и хлорида
меди (II) имеют аутоускоренный характер (рис. 3.4, рис. 3.5). Характер
КК может быть обусловлен участием катализатора в реакциях
зарождения и разветвления цепей. С увеличением концентрации
катализатора (хлорида кобальта (II) до 1×10-2 М, хлорида меди (II)
до 1×10-3 М) увеличивается максимальная скорость окисления, которая
в дальнейшем с повышением концентрации катализатора снижается.
При концентрации хлорида меди (II) (1—2)×10-3 М сокращается
период аутоускорения, и процесс начинается с максимальной
скорости.
С целью выбора наиболее эффективного катализатора изучали
в сравнительном аспекте влияние упомянутых выше солей на процесс
окисления МЛ. На рис. 3.6 представлены КК поглощения кислорода
в присутствии равных добавок (110 М) солей железа (II,III), никеля
(II), кобальта (II) и меди (II).
16
2
1
14
3 4
12
10
8
5
6
4
2
0
0
50
100
150
200
250
300
t, мин
Рисунок 3.3. Кинетические кривые окисления в водно-липидной
среде метиллинолеата в присутствии добавок хлорида никеля
( II ), М : 1- 7×10-3, 2- 5×10-2, 3- 1×10-1, 4- 7×10-4, 5- 2×10-4;
1×10 М ЦТМАБ, t=600 С
66
25
VO2, см
3
1
2
20
3
15
4
10
5
0
0
50
100
150
200
250
t, мин
Рисунок 3.4. Кинетические кривые окисления в водно-липидной
среде метиллинолеата в присутствии добавок хлорида кобальта
(II), М : 1 - 1×10-2, 2- 1×10-1, 3- 1×10-3, 4- 2×10-4; 1×10 М ЦТМАБ,
t=600 С
Из рис. 3.6 видно, что в сравнимых концентрациях наиболее
эффективным катализатором является хлорид меди (II). Для него
отмечается наибольшая скорость процесса, оцениваемая из наклона
КК (табл. 3.1).При сопоставлении абсолютных значений W мах
исследуемые катализаторы располагаются в следующем порядке: NiCl2
< FeCl3 < FeSO4 < CoCl2 < CuCl2.
Действие упомянутых выше солей было изучено в широком
диапазоне концентраций для отбора среди них наиболее эффективных
катализаторов. На рис. 3.7 приведены закономерности изменения
максимальной скорости процесса от концентрации катализатора.
Можно видеть, что концентрационные зависимости для всех веществ
носят экстремальный характер, экстремумы проявляются в разных
диапазонах. Скорости окисления липидных субстратов в присутствии
солей NiCl2 и FeCl3 выходят на максимум при концентрациях
1,0×10-3 М, далее с ростом концентрации их значение не меняется
и составляет (4,0±0,2)×10-5 М×с-1 и (5,0±0,3)×10-5 М×с-1 соответственно. Максимальная скорость при окислении с добавками сульфата
67
железа отмечается в диапазоне (0,1-1,0)×10-3 М и составляет
(9,4±0,4)×10-5 М×с-1, при дальнейшем росте концентрации — остается
постоянной и составляет (6,0±0,2)×10-5 М×с-1.
Зависимость (Wmax) систем с добавками хлорида кобальта имеет
-3
″пик″ при концентрации (9-11)×10 М, при которой ее величина
-5
составляет
(24,4±0,4)×10 М×с-1.
Хлорид
меди
по
своим
каталитическим свойствам выделяется среди всех исследуемых
веществ. Скорость окисления в присутствии хлорида меди выше
в 5 раз, чем в присутствии других солей металлов переменной
валентности
и
при
концентрации
2×10-3 М
составляет
-5
-1
(26,3±0,3)×10 М×с (табл. 3.1).
Ранее каталитическое действие металлов переменной валентности изучалось при окислении растительных масел, модельных
липидных субстратов [55, 272, 298, 367, 377, 378]. Был получен ряд
каталитической активности катионов: Cu > Mn > Fe > Cr > Ni
>> Zn.
30
VO2, см
3
1
2
25
4
3
5
6
20
7
15
10
5
0
0
50
100
150
200
250
t, мин
Рисунок 3.5. Кинетические кривые окисления в водно-липидной
среде метиллинолеата в присутствии добавок хлорида меди ( II ),
М : 1- 2×10-3, 2- 1×10-3, 3- 1×10-1, 4- 1×10-5, 5- 1×10-4, 6- 1×10-2,
7- 1×10-6; 1×10 М ЦТМАБ, t=600 С
68
VO2, см3
30
1
2
25
3
4
20
6
5
15
10
5
0
0
50
100
150
200
250
t, мин
Рисунок 3.6. Кинетика окисления метиллинолеата в воднолипидной среде в присутствии добавок солей металлов
в концентрации 1×10-3 М: 1- CuCl2 2×10 М; 2 - CuCl2, 3- FeSO4,
4- CoCl2, 5- FeCl3, 6- NiCl2; 1×10 М ЦТМАБ, t=600 С
-5
W O2max.10 , Mc
-1
30
2+
1 Cu
25
2+
2 Co
20
15
10
2+
3 Fe
2+
4 Ni
5
3+
Fe
5
0
0
2
4
6
8
10
12
C(Me)  10-3, М
Рисунок 3.7. Зависимость стационарных скоростей окисления
метиллинолеата в присутствии солей катализаторов
от их концентрации, М:1 – CuCl2, 2- CoCl2, 3-FeSO4, 4- NiCl2,
5- FeCl3; 1×10 М ЦТМАБ, t=600 С
69
Как видно из приведенных выше данных, изученные соли
вписываются в указанный ряд активности металлов, а хлорид меди
обладает наибольшей каталитической активностью при наименьшей
концентрации 210-3 М.
Следующим этапом создания модели для тестирования
биоантиоксидантов был выбор концентрации ПАВ. Известно [62, 178],
что скорость окисления в гомогенных системах ниже, чем в эмульсиях,
и зависит от степени ее дисперсности. В работе [55] установлено,
что соотношение констант скорости роста и обрыва цепи
при инициированном окислении кумола в эмульсиях и гомогенной
системе соотносится как 5,5:1 и равно 110 и 20 соответственно.
В нашем эксперименте было установлено, что скорость
окисления МЛ в водно-липидной среде в 1000 раз выше,
чем в безводной среде.
При выборе оптимальной добавки ЦТМАБ исследовали диапазон
концентраций (10—10) М. Результаты приведены на рис. 3.8
и табл. 3.2. При анализе наклонов КК можно видеть, что с ростом
концентраций ПАВ скорость процесса проходит через максимум,
соответствующий концентрации 1×10 М.
Таблица 3.1.
Кинетические параметры окисления метиллинолеата
в присутствии металлов переменной валентности, t= 60 0С,
С ЦТМАБ = 110-3 М, липиды : вода – 1 : 3
[Kat ], М
1×104
2×104
5×104
7×104
1×10
2×10
5×10
1×102
5×102
1×101
1×106
5×106
1×105
5×105
[Kat] / [ МЛ]
Wнач. ×10-5, Мс-1
I Хлорид железа (III)
1 : 1000
2,7
1 : 500
3,1
1 : 200
3,0
1 : 135
3,0
1 : 100
2,3
1 : 50
1,7
1 : 20
1,7
1 : 10
3,0
1:2
2,0
1:1
3,0
II Сульфат железа (II)
1 : 100000
3,1
1 : 20000
3,4
1 : 10000
7,6
1 : 2000
3,8
70
Wmax. ×10-5, Мс-1
3,7
6,5
3,6
4,4
3,2
3,5
3,5
5,3
3,9
4,9
5,1
5,7
6,6
7,2
1×104
2×104
5×104
1×10
2×10
1×102
1×101
1×104
2×104
7×104
1×10
2×10
3×10
5×10
7×10
1×102
3×102
5×102
1×101
2×101
1×104
2×104
5×104
1×10
2×10
5×10
8×10
1×102
1,2×102
5×102
6×102
1×101
1×106
1×105
1×104
1×10
2×10
4×10
1 : 1000
8,5
1 : 500
6,2
1 : 200
3,8
1 : 100
6,8
1 : 50
6,8
1 : 10
6,8
1:1
6,8
III Хлорид никеля (II)
1 : 1000
1,3
1 : 500
1,4
1 : 140
3,4
1 : 100
3,5
1 : 50
2,4
1 : 33
2,4
1 : 20
2,3
1 : 14
3,0
1 : 10
2,4
1 : 3,3
1,6
1:2
2,2
1:1
1,7
1 : 0,5
3,0
IV Хлорид кобальта (II)
1 : 1000
10,0
1 : 500
9,1
1 : 200
3,2
1 : 100
11,4
1 : 50
14,2
1 : 20
2,3
1 : 12,5
5,6
1 : 10
5,7
1:8
3,4
1:2
14,3
1 : 1,7
8,5
1:1
5,7
V Хлорид меди (II)
1 : 100000
3,5
1 : 10000
5,7
1 : 1000
3,7
1 : 100
8,6
1 : 50
14,4
1 : 25
14,3
71
8,3
9,1
4,9
5,9
6,1
5,4
5,7
3,1
3,3
3,5
4,1
3,2
3,2
3,8
4,7
4,3
3,9
4,6
4,7
4,4
4,2
4,1
10,2
6,8
7,3
10,4
15,5
24,4
10,5
4,5
11,4
7,4
9,6
4,3
5,7
14,5
26,3
18,1
5×10
1×102
2×102
5×102
1×101
1 : 20
1 : 10
1:5
1:2
1:1
13,7
12,8
11,3
5,7
8,5
15,0
8,6
8,9
15,4
14,5
Дальнейшее
повышение
концентрации
ПАВ
приводит
к снижению скорости окисления. Указанную концентрацию детергента, обеспечивающую наибольшую скорость реакции, можно
рекомендовать для использования в гетерогенных моделях окисления.
Методом Ребиндера и рефрактометрическим методом была определена
критическая
концентрация
мицеллообразования
ЦТМАБ
(1,0±0,2)×10 М, что соответствовало кинетическим данным.
VO2, см
3
1
20
2
3
4
15
10
5
5
0
0
50
100
150
200
250
t, мин
Рисунок 3.8. Кинетика окисления метиллинолеата в воднолипидной среде в присутствии 2×10-3 М CuCl2 и добавок ЦТМАБ,
М: 1-1×10-3, 2-5×10-4, 3-5× 10-3, 4-1×10-2, 5-1×10-4, t=600 С
Механизм каталитического окисления углеводородов (липидов)
в водно-эмульсионной среде сводится к следующему. В присутствии
ЦТМАБ формируются мицеллы [147]. Добавки катионного ПАВ
усиливают мицеллообразование, при этом катионы внедряются
72
в промежутки между углеводородными «хвостами» с образованием
двойного электрического слоя. С выработкой свободных радикалов
высших жирных кислот катионы катализатора должны иметь доступ
к гидрофобным хвостам субстрата. При низких концентрациях
катионы имеют большую вероятность донорно-акцепторного
взаимодействия с эфирными группами субстрата, приводящего
к образованию в присутствии катализатора свободных радикалов
по реакции:
Me(n1)+ + RH + O → Men + R● + HO●
Вероятно, существуют оптимальные концентрации ЦТМАБ,
при которых количество контактов катионов катализатора, сложного
эфира и кислорода максимально. При увеличении концентрации ПАВ
количество катионов на поверхности мицеллы возрастает, происходит
их более интенсивное отталкивание, приводящее к снижению скорости
зарождения цепей и скорости процесса [226].
Таблица 3.2.
Кинетические параметры окисления метиллинолеата
в присутствии 2 × 10-3 М CuCl2 и добавок ЦТМАБ, t= 600С,
липиды : вода - 1 : 3
[ПАВ], М
1×104
5×104
8×104
1×103
2×103
5×103
1×102
[Kat] / [ПАВ]
20 : 1
4:1
1 : 2,5
2:1
1:1
1 : 2,5
1:5
Wнач.×10-5, Мс-1
3,5
8,2
10,3
14,4
11,7
5,5
4,6
Wmax.×10-5, Мс-1
2,1
6,3
18,9
26,3
21,6
5,7
5,2
В соответствии с приведенной гипотезой добавки 1×10  М
ЦТМАБ являются оптимальными, обеспечивающими максимальный
контакт катионов меди и кислорода с жирно-кислотными радикалами.
Увеличение концентрации ЦТМАБ снижает количество таких
контактов и скорость процесса соответственно.
Механизм действия металлов связывают с каталитическим
разрушением гидропероксидов [55] в соответствии с реакциями:
ROOH + Fe3+ → RO2● + H+ + Fe2+
ROOH + Cu2+ → RO2● + H+ + Cu1+
73
Образующиеся при этом пероксильные радикалы участвуют
в дальнейшем в реакциях продолжения цепей окисления. Катионы
металлов могут конкурентно участвовать в обрыве цепей, что должно
приводить к замедлению процесса на глубоких стадиях окисления.
Замедление процесса возможно также за счет перехода катиона
металла в менее активную форму.
В результате проведенных исследований была предложена
новая
кинетическая
модель
для
экспресс-тестирования
биоантиоксидантов. Модельный субстрат содержит 1 мл эфиров
высших ненасыщенных жирных кислот (липиды), 1 мл водного
раствора 2×10 М хлорида меди (II) в конечной концентрации, 1 мл
водного раствора 1×10 М ЦТМАБ в конечной концентрации,
соотношение липиды-вода 1 : 3, добавляют 1 мл воды или раствора
исследуемого антиоксиданта (или точную навеску антиоксиданта),
общий объем пробы 4 мл, смесь перемешивают на магнитной
мешалке, помещают в термостатируемую при t=(600,2)0 С ячейку
(схема установки приведена в главе 2). Пробу насыщают кислородом,
соединяют с волюмометрической системой, измеряют объем
поглощенного кислорода во времени без добавок биоантиоксидантов
и в присутствии их в различных концентрациях [180, 181].
При известных скоростях инициирования и оптимальных концентрациях ингибитора рассчитывают антирадикальную активность
по величине параметра fK7, по периоду индукции () определяют
суммарную антиоксидантную активность. Сравнение начальных
и максимальных скоростей и характера КК позволяет оценить
механизм действия антиоксидантов.
3.2. Тестирование антиоксидантных свойств
традиционных лекарственных препаратов
Впервые исследована антиоксидантная активность ряда
лекарственных препаратов, независимо от спектра их фармакологического действия, в сравнении со стандартными антиоксидантами дибунолом и -токоферолом в водно-липидных катализируемых субстратах. Получен ряд увеличения антиоксидантной
активности лекарственных препаратов: фентоламин < салициловая
кислота < новокаин < парацетамол < коринфар < метилдофа <
адреналин < эмоксипин < аллопуринол < капотен < осалмид <
дибунол.
Установлены
константы
скорости
реакции
K7
с пероксильными радикалами для наиболее активных АО. Показано
74
участие эффективных ингибиторов окисления в процессе разрушения
гидропероксидов молекулярным путем.
В настоящей главе приведены результаты исследования кинетики
каталитического окисления субстрата в водно-липидной среде
в присутствии ряда полифункциональных соединений в зависимости
от концентрации и структуры, без учета спектра их фармакологического действия [28]. Ряд производных фенола составили:
салициловая кислота, парацетамол, осалмид. Ряд двухатомных
фенолов представляли: пирокатехин, адреналин, метилдофа.
В качестве гетероциклических производных использовались: фентоламин, аллопуринол, эмоксипин. В качестве аминов исследовали:
новокаин, коринфар. В качестве серосодержащего соединения изучали
капотен. Реперными антиоксиданты (АО) послужили -токоферол
и дибунол.
Химические
формулы
изучаемых
соединений
представлены в табл. 3.3.
Парацетамол
используется
как
противовоспалительное,
жаропонижающее и обезболивающее средство, ингибирует фермент
циклооксигеназу, тормозит образование простагландинов, участвующих в механизме возникновения гиперальгезии и повышенной
температуры. Салициловую кислоту используют как антисептическое
средство. Осалмид
Таблица 3.3.
Химические формулы изучаемых антиоксидантов
№
п/п
Название АО
1
Фенол
(гидроксибензол)
2
Салициловая кислота
(2-гидроксибензойная
кислота)
3
Парацетамол
(N-(4-гидроксифенил)
ацетамид)
Формула
75
Осалмид
4 (N-(4-гидрокси-фенил)2-гидроксибензамид)
5
Пирокатехин
(1,2-дигидроксибензол)
Адреналин
(1-(3ʹ,4′6
дигидроксифенил)-2(Nметил)-аминоэтанол)
7
Метилдофа
(2-амино-2-метил-3(3ʹ,4ʹ -дигидрокси)фенил-пропановая
кислота)
8
Фентоламин
(2-[N-пара-толил-N(мета-оксифенил)аминометил]имидазолина
гидрохлорид)
9
Аллопуринол
(1,5-Дигидро-4Нпиразоло[3,4d]пиримидин-4-он)
10
Эмоксипин
(2-этил-6-метил-3гидроксипиридина
гидрохлорид)
Новокаин
11 (2-(диэтиламино)этил-4аминобензоат)
76
Коринфар
(2,6-диметил-4-(2`нитрофенил)-1,412
дигидропиридин-3,5дикарбоновой кислоты
диметиловый эфир)
13
14
Капотен
1-[(2S)-3-меркапто-2метилпропионил]-Lпролин
Дибунол
(1-гидрокси-2,6-дитрет-бутил-4метилбензол)
-Токоферол
[2,5,7,8-тетра-метил-215
(4,8,12триметилтридецил)-6гидроксихроман)]
применяется как желчегонное средство. Эмоксипин применяется в
офтальмологии как ретинопротектор, в последнее время используется
при лечении гипертонии и ишемической болезни сердца. В медицине
адреналин используется как гипергликемическое, бронхолитическое,
гипертензивное, противоаллергическое, сосудосуживающее средство.
Метилдофа применяют как гипотензивное средство при разных
формах
гипертонической
болезни.
Коринфар
оказывает
антиангинальное и гипотензивное действие. Капотен применяют при
лечении легкой и умеренной гипертонии, а также при тяжелых формах
сердечно-сосудистых заболеваний. Аллопуринол, используемый при
гиперурикемии и ее осложнениях, таких как подагра, является
ингибитором
ксантиноксидазы.
Новокаин
оказывает
местноанестезирующее
действие.
Для
доказательства
свободнорадикального
механизма
каталитического
окисления
липидного субстрата использован метод ингибиторов. Проведено
исследование закономерностей окисления модельного субстрата (МЛ,
ЭО) в присутствии добавок стационарных ингибиторов окисления
77
дибунола и -токоферола. По результатам эксперимента рассчитаны
кинетические параметры окисления субстратов.
В нашем исследовании показан идентичный характер
кинетических кривых (КК) окисления этилолеата (ЭО) в растворе
хлорбензола в присутствии 6×10 М инициатора азо-бис-изобутиронитрил (АИБН) и водно-липидной системе в присутствии
2×10 М хлорида меди при разных концентрациях дибунола
(рис. 3.9 а. б). Показано, что в водно-липидной среде дибунол
проявляет себя как сильный ингибитор: наблюдается период полного
торможения, период аутоускорения и достижения максимальной
скорости окисления. Периоды индукции увеличиваются пропорционально увеличению концентрации дибунола (табл. 3.4). Наличие
торможения в присутствии добавок дибунола является признаком
радикально-цепного механизма процесса, а отсутствие комплексообразующей способности с катионами меди происходит благодаря
экранированности
двумя
трет-бутильными
заместителями
его донорно-акцепторного центра. По наклону прямой в координатах
,[InH] была рассчитана скорость инициирования в обеих системах
(рис. 3.10), получены значения 6,2×10 и 6,7×10 М×с-1 в безводной
и водно-липидной системе соответственно. Максимальные скорости
окисления этилолеата при t=(60 0,2) С равны 1,3×10
и 1,4×10 М×с-1 в безводной и водно-липидной среде соответственно,
различаются в 1000 раз.
Таблица 3.4.
Кинетические параметры при окислении этилолеата
в водно-липидной среде в присутствии дибунола
и 2×10 М хлорида меди (II), t= 600 С
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
С(АО),
М
Контроль ЭО
1×106
1×105
2×105
5×105
1×104
2×104
5×104
7×104
1×103
Wнач.×10-5,
М×с-1
7,5
7,3
7,0
5,1
2,6
2,1
1,6
1,3
1,1
1,0
, мин
15
40
65
95
110
140
210
360
450
600
78
Wmax.×10-5,
М×с-1
14,0
13,6
12,3
10,8
9,3
8,7
8,6
8,4
8,3
8,0
Установлено, что -токоферол характеризуется чрезвычайно
высокой константой скорости реакции с пероксильными радикалами
K7 = (3,3—3,5)106 М-1с-1 [39], что на два порядка превышает
аналогичные константы скорости для дибунола K7 =1,40104 М-1с-1.
Между тем вопрос о роли -токоферола в биомембранах далек
от своего решения. Известен сложный механизм действия
-токоферола в безводных углеводородных и липидных субстратах,
его участие не только в реакциях обрыва цепей, но и реакциях
продолжения цепей и распаде гидропероксидов. Последние реакции
приводят к снижению антиоксидантной активности -токоферола.
В настоящей работе приведены результаты тестирования
антиоксидантного действия -токоферола в условиях инициирования
и катализа, а также в биологическом эксперименте.
На рис. 3.11 приведены КК окисления метиллинолеата
в хлорбензоле (1:1) в присутствии 1×10—1×10 М -токоферола
и 6×10 М инициатора АИБН.
Показано, что КК в присутствии 1×10—1×10 М -токоферола
имеют аутоускоренный характер без периода полного торможения.
В этом интервале
V O , мм
2
3
12 4
3 5
7
6
8
120
a
100
80
60
40
20
0
0
100
200
300
400
500
600
700
t, мин
Рисунок 3.9 а. Кинетика окисления этилолеата в безводной среде
в присутствии добавок дибунола, М : 1- контроль, 6×10-3 М АИБН;
2- 5×10-6, 3- 1×10-5, 4- 5×10-5, 5- 1×10-4, 6- 5×10-4, 7- 7,5×10-4, 8- 1×10-3,
t=600 С
79
см3
30
O2,
25
V
20
1
2
3
4
5
6
б
15
10
5
0
0
100
200
300
400
t, мин
Рисунок 3.9 б. Кинетика окисления этилолеата в водно-липидной
среде в присутствии добавок дибунола, М : 1- контроль, 2- 1×10-6,
3- 2×10-5, 4- 5×10-5, 5- 1×10-4, 6- 5×10-4; 2×10-3 М CuCl2,
1×10 М ЦТМАБ, t=600 С
концентраций начальные скорости тем меньше, чем больше
добавки -токоферола, при всех концентрациях достигается одинаковая максимальная скорость. Период полного торможения появляется
только при концентрациях 1×10-4 и 5×10-4 М и меняется пропорционально концентрации. При дальнейшем повышении концентрации
-токоферола увеличивается начальная скорость окисления, сокращается период полного торможения, максимальная скорость
достигается тем позже и при более высоких концентрациях
поглощенного кислорода, чем выше концентрация -токоферола.
Результаты расчета начальной (Wнач.), максимальной (Wmax.) скоростей
и периода индукции приведены в табл. 3.5. Из табл. видно сохранение
близких (Wmax.) при концентрациях -токоферола от 1×10-7 до 1×10-1 М
и десятикратное снижение (Wнач.) при этих же концентрациях
-токоферола.
Представленные
результаты
свидетельствуют
о сложном механизме действия -токоферола в безводном растворе
МЛ, об его участии не только в реакциях обрыва, но и реакциях
продолжения цепей.
На рис. 3.12 приведены КК окисления модельного субстрата
в водно-липидной среде в присутствии (1 × 10 -8—1 × 10-1) М
80
-токоферола. В этих условиях окисление субстрата в присутствии
любых концентраций -токоферола происходит без периода индукции.
Добавки (1 × 10-3 —1 × 10-1) М -токоферола ускоряют процесс,
1×10-8 М -токоферола только незначительно уменьшает максимальную скорость, без заметного влияния на начальные стадии
окисления. Таким же образом влияют добавки (1×10-7 —1×10-6) М
-токоферола. В присутствии (1×10-5—1×10-4) М -токоферола
наблюдается замедление начальных стадий окисления и уменьшение
максимальной скорости (табл. 3.6). На рис. 3.13 показана зависимость
периода индукции от концентрации -токоферола с максимумом
(4—6)×10-5 М.
Полученные результаты указывают на более сложный механизм
действия -токоферола в катализируемом субстрате. Добавки
-токоферола при одних концентрациях могут инициировать процесс
окисления или слабо замедлять при других концентрациях. Причиной
ускорения процесса может быть комплексообразование OH-группы
-токоферола с катализатором. В нашем эксперименте инициирующая
активность -токоферола начинает проявляться тогда, когда
его содержание соответствует или превышает концентрацию
катализатора. Слабое торможение с добавками -токоферола может
быть обусловлено его участием в реакциях обрыва и продолжения
цепей. В процессе окисления -токоферол образует достаточно
активные токофероксильные радикалы, способные участвовать
в побочных реакциях продолжения цепей с молекулами субстрата
(RH): In + RH → R + InH. В результате этой реакции восстанавливается активная фенольная форма антиоксиданта, взаимодействующая в дальнейшем с пероксильными радикалами, ведущими цепи
окисления: RO + InH → ROOH +In. Таким образом, механизм
действия -токоферола меняется от состава субстрата.
Добавки -токоферола, проявившие антиоксидантную активность в водно-липидной среде, были использованы в биологическом
эксперименте, методика которого описана в главе 2.
81
, мин
700
2
1
600
500
400
300
200
100
0
0
2
4
6
8
10
C(AO)10-4, M
VO2, мм
3
Рисунок 3.10. Зависимости периода индукции от концентрации
дибунола в безводной среде в присутствии 6×10-3 М АИБН (1)
и в водно-липидной среде в присутствии 2×10-3 М CuCl2 (2),
1×10 М ЦТМАБ, субстрат окисления ЭО, t=600 С
1 2 34 5 6
25
7
8
9
10
20
15
10
5
0
0
100
200
300
400
500
600
t, мин
Рисунок 3.11. Кинетика окисления метиллинолеата
в присутствии добавок α - токоферола в растворе хлорбензола,
М : 1- контроль, 2- 1×10-8, 3- 1×10-7, 4- 1×10-6, 5- 1×10-5, 6- 1×10-4,
7- 5×10-4. 8- 1×10-3, 9- 1×10-2, 10- 1×10-1, t= 600 С
82
Таблица 3.5.
Кинетические параметры окисления МЛ в растворе хлорбензола
в присутствии 6×10-3 М АИБН и -токоферола, t= 600 С
С(-ТФ), М
, мин
Wнач.×10-8, М×с-1
Wmax.×10-7, М×с-1
Контроль МЛ
1×108
1×107
1×106
1×10-5
1×10-4
5×10-4
1×10-3
1×10-2
1×10-1
15
17
20
35
44
67
120
350
405
420
4,3
4,3
3,6
2,5
2,3
1,1
0,5
0,6
0,5
0,2
2,6
2,3
2,0
1,9
1,8
1,8
2,0
1,7
1,8
1,8
VO2, см3
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1
20
2
3 4
5
6
7
8
9
15
10
5
0
0
20
40
60
80
100
t мин
Рисунок 3.12. Кинетика окисления метиллинолеата в воднолипидной среде в присутствии добавок -токоферола, М : 1- 1×10-1,
2- 1×10-2, 3- 1×10-3, 4- контроль, 5-1×10-8, 6-1×10-7,7- 1×10-6,
8- 1×10-5, 9- 1×10-4; 2×10 М CuCl, 1×10 М ЦТМАБ, t=600 С
83
, мин
50
45
40
35
30
25
20
15
10
0
2
4
6
8
10
-4
С(АО)  10 , М
Рисунок 3.13. Зависимости периода индукции от концентрации
-токоферола в водно-липидной среде; 2×10-3 М CuCl2, 1×10 М
ЦТМАБ, субстрат окисления — метиллинолеат, t=600 С
Таблица 3.6.
Кинетические параметры при окислении МЛ в водно-липидной
среде в присутствии -токоферола и 2×10 М хлорида меди (II),
t= 600 С
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
С(-ТФ), М
, мин
Wнач.×10-4, М×с-1
Wmax.×10-4, М×с-1
Контроль МЛ
1×108
1×107
1×106
1×10-5
1×10-4
1×10-3
1×10-2
1×10-1
5
10
15
20
25
35
15
6
5
1,4
1,4
1,1
1,0
0,7
0,5
1,4
1,6
1,7
2,6
2,1
2,1
1,9
1,8
1,4
3,2
3,4
5,7
84
На рис. 3.14 приведены кинетические кривые окисления липидов
плазмы крови (кривая 1) и эритроцитов (кривая 2) контрольных
животных, а также подобные кривые для фракций крови через 6 часов
после введения 20 мг -токоферола ацетата на 100 г массы животного.
КК окисления липидов контрольных проб имеют экспоненциальный
характер: после небольшого периода индукции, аутоускорения
достигается максимальная скорость. Кривые окисления липидов
фракций крови после скармливания -токоферилацетата имеют
S-образный характер. Наблюдается сокращение периода индукции,
периода аутоускорения, идет быстрое достижение максимальной
скорости, а затем ее снижение.
Из теории цепных-разветвленных процессов известно [88],
что такой характер кривых соответствует глубоким стадиям
окисления. Анализ концентрации продуктов окисления подтверждает
этот вывод. Через 6 часов после приема препарата наблюдается
1,5-кратное повышение концентрации сопряженных диеновых
соединений и 4-кратное увеличение концентрации сопряженных
триенов в липидах плазмы крови и эритроцитов по сравнению
с показателями фракций крови контрольных животных. Показатели
концентрации первичных (Д), вторичных продуктов окисления
(ТБЧ) и концентрации общих липидов приведены в табл. 3.7.
200
VO2, мм
3
2
1
3
150
4
100
50
0
0
50
100
150
200
250
t, мин
Рисунок 3.14. Кинетика окисления липидов плазмы крови (2)
и эритроцитов (4) контрольных животных, плазмы (1)
и эритроцитов (3) подопытных животных после введения per os
-токоферола ацетата
85
Через 6 часов после приема препарата антиоксидантная
активность уменьшается в 1,5 раза. Через 7 и 10 суток после приема
препарата антиоксидантная активность липидов также ниже,
чем в контрольной группе. Суммарная скорость окисления липидов
через 7 суток после приема препарата несколько выше, чем в контрольной группе, через 10 суток после приема этот показатель
уменьшается в 2 раза.
Из табл. 3.7 видно, что под влиянием приема препарата
концентрация первичных продуктов окисления липидов на протяжении всего эксперимента выше, чем в контрольной группе. Концентрация вторичных продуктов в процессе эксперимента незначительно
снижается. Представленные результаты свидетельствуют о прооксидантном эффекте -токоферола на липиды фракций крови
при его приеме животными per os. Эффект усиливается с увеличением
дозы и длительности приема. Сравнение результатов биологического
и кинетического эксперимента свидетельствует в пользу использования каталитических водно-липидных систем субстратов
для тестирования биоантиоксидантов.
Таблица 3.7.
Кинетические параметры окисления липидов плазмы крови
и эритроцитов животных после введения per os
-токоферола ацетата
Условия
эксперимента
ПОКАЗАТЕЛИ
W,
ТБЧ,
Д,
Д,
мм/мин
ПЛАЗМА
58,0 ± 0,3 1,04 ± 0,03 0,30 ± 0,02 3,6 ± 0,1 0,9 ± 0,1
,
мин.
контроль
однократный
40,5 ± 0,6 1,13 ± 0,02 0,38 ± 0,04 3,4 ± 0,1
приём
приём в течение 7 сут. 47,0 ± 0,7 1,12 ± 0,02 0,36 ± 0,01 3,4 ± 0,1
приём в течение 10 сут. 45,0 ± 0,5 0,55 ± 0,05 0,38 ± 0,01 3,3 ± 0,1
ЭРИТРОЦИТЫ
контроль
59,3 ± 0,4 0,95 ± 0,04 0,28 ± 0,01 3,7 ± 0,1
однократный приём
46,7 ± 0,4 0,98 ± 0,09 0,42 ± 0,08 3,6 ± 0,1
приём в течение 7 сут. 43,3 ± 0,5 1,20 ± 0,02 0,38 ± 0,06 3,3 ± 0,1
приём в течение 10 сут. 42,5 ± 0,4 0,76 ± 0,06 0,37 ± 0,04 3,3 ± 0,1
0,8 ± 0,1
0,8 ± 0,1
0,7 ± 0,1
0,9 ± 0,1
0,8 ± 0,1
0,7 ± 0,1
0,8 ± 0,1
Поскольку известно [88, 204, 260, 265], что в углеводородной
среде увеличение антирадикальной активности (АРА) фенолов проис-
86
ходит под влиянием электронодонорных заместителей, рассмотрим
полученные ряды соединений в зависимости от структуры.
В соответствии с теорией, ингибиторы условно делятся
на сильные и слабые. Сильные ингибиторы эффективно тормозят
окисление, участвуя только в реакциях обрыва цепей. Кинетика такого
процесса характеризуется периодом полного торможения, аутоускорением и достижением максимальной скорости. Слабые ингибиторы
способны не только обрывать цепи, но и из-за высокой активности
своих радикалов, участвовать в реакциях продолжение цепей.
Кинетика такого процесса характеризуется отсутствием периода
полного торможения, достаточно высокими начальными скоростями,
аутоускорением на определенном уровне окисления, достижением
максимальной скорости. Алкилированные в пара- и орто-положения
фенолы, двухатомные фенолы считаются сильными ингибиторами.
Каждая алкильная или гидроксильная группа увеличивает АРА
на определенную величину. Ингибитор тем эффективнее, чем меньше
полярность и больше размер заместителя в пара- положении. В аминах
заместители-электронодоноры повышают их антирадикальную
активность. В фенолах и аминах антирадикальная активность
тем выше, чем ниже окислительно-восстановительный потенциал.
Иногда амины оказывают ускоряющее действие, что связано
с увеличением скорости зарождения цепей за счет взаимодействия
с гидропероксидами по радикальному механизму.
Методом хемилюминесценции в группе исследуемых соединений
была оценена величина константы скорости реакции K7 АО

с пероксильными радикалами [257]:
RO2+InH → ROOH + In,

где InH — ингибитор окисления, In — радикал ингибитора, RO2 —
пероксильный радикал. Стехиометрический фактор ингибирования f,
показывающий количество свободных радикалов, реагирующих
с молекулой ингибитора, приведен в табл. 3.8. При исследовании
кинетики изменения интенсивности ХЛ в присутствии исследуемых
соединений было установлено, что все АО оказывали ингибирующее
действие на процесс окисления модельного субстрата. Наибольшую
активность в реакции с пероксильными радикалами проявлял осалмид
(табл. 3.8), константа скорости реакции K7 которого обусловлена
акцепторным характером заместителя в пара-положении, наличием
-р-сопряжения между амино-группой и фенолом. АРА осалмида
может складываться из активности двух гидроксильных групп,
в парацетамоле донорный заместитель содержится в пара-положении.
В салициловой кислоте антирадикальная активность может снижаться
за счет акцепторного характера карбоксильной группы.
87
VO2, см3
1
30
2
3
4
25
5 6
20
7
8
15
10
5
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
t, мин
Рисунок 3.15. Кинетика окисления этилолеата в водно-липидной
среде в присутствии добавок фенола, М: 1- контроль, 2- 1×10-6,
3- 5×10-6, 4- 1×10-5, 5- 1×10-4, 6- 1×10-3, 7- 5×10-3, 8- 1×10-2; 2×10 М
CuCl , 1×10 М ЦТМАБ, t=600 С
Сравнение констант скорости реакции K7 исследуемых
соединений и -токоферола показывает, что основной природный АО
активнее в реакции с пероксильными радикалами в 360 раз. Однако
описанные выше закономерности изменения антирадикальной
активности в соответствии с донорным или акцепторным характером
заместителей далеко не однозначны.
На рис. 3.15 показаны КК окисления этилолеата в воднолипидной среде с добавками фенола. Все концентрации фенола
замедляли процесс окисления, снижая начальную и максимальную
скорости пропорционально концентрации (рис. 3.15, табл. 3.9).
Представленные результаты свидетельствуют о том, что в данной
системе фенол является слабым ингибитором, но продукты
его превращения участвуют в обрыве цепей.
88
3
VO2, см
25
1
3
4
2
20
6
5
15
10
5
0
0
100
200
300
400
500
600
700
t, мин
Рисунок 3.16. Кинетика окисления этилолеата в водно-липидной
среде в присутствии добавок АО в концентрации 1×10-3 М: 1контроль, 2-α-токоферол, 3-салициловая кислота, 4-фенол,
5-парацетамол, 6-осалмид; 2×10 М CuCl, 1×10 М ЦТМАБ,
t=600 С
Из литературы известно [265], что в этилбензоле при t=600 С K7
для фенола и пирокатехина равны 3×103 и 6×105 М-1с-1 соответственно. По результатам нашего исследования (табл. 3.9) эффективность торможения при всех концентрациях пирокатехина
соизмерима с подобными концентрациями фенола.
Таблица 3.8.
Значения константы скорости реакции АО с пероксильными
радикалами RO2● Wi=2,3×108 М×с-1; САО= 110-3 М; t=600 С
№ п/п
1
2
3
4
5
6
7
K7104, М-1с-1
0,24
0,23
4,00
6,86
0,61
360
1,40
Название фенола
Фенол
Салициловая кислота
Парацетамол
Осалмид
Эмоксипин
-токоферол
Дибунол
89
f
2,7
2,0
2,4
2,4
2,0
2,0
2,0
3
VO2, см
30
1
2
3
25
4
20
5
15
10
5
0
0
100
200
300
400
500
600
700
800
t, мин
Рисунок 3.17. Кинетика окисления этилолеата в водно-липидной
среде в присутствии добавок осалмида, М: 1- контроль, 2×10;
2- 1×10-4; 3- 5×10-4; 4- 1×10-3; 5 - 1×10-2; 2×10 М CuCl, 1×10 М
ЦТМАБ, t=600 С
VO2, см3
30
1
2
25
20
3
15
4
10
5
0
0
50
100
150
200
250
300
350
t, мин
Рисунок 3.18. Кинетика окисления этилолеата в водно-липидной
среде в присутствии добавок парацетамола, М: 1- контроль,
2- 1×10-4, 3- 1×10-3,4- 1×10-2; 2×10 М CuCl, 1×10 М ЦТМАБ, t=600 С
90
Антиоксидантная активность (АОА) салициловой кислоты
(рис. 3.16) всегда ниже, чем у фенола и не изменяется с увеличением
её концентрации (табл. 3.9). Такой характер влияния салициловой
кислоты может быть обусловлен образованием салицилата меди.
Впервые АОА осалмида была показана в нашей работе [180]. Осалмид
проявляет более высокую антиоксидантную активность, чем фенол,
салициловая кислота и парацетамол в соизмеримых концентрациях
(рис. 3.16). На рис. 3.17 показаны типичные КК окисления этилолеата
в водно-липидной среде в присутствии осалмида. Установлено,
что все исследуемые концентрации осалмида уменьшали начальную
и максимальную скорости окисления в 2—5 раз по сравнению
с контролем (табл. 3.9). Кинетические кривые окисления этилолеата
с добавками парацетамола представлены на рис. 3.18. В изученном
диапазоне концентраций парацетамола наблюдалось отсутствие периода
полного торможения, но отмечалось снижение начальной и максимальной скоростей окисления по сравнению с контролем в 3—5 раз
(табл. 3.9). Такой характер КК для парацетамола предполагает
подавление антиоксидантных свойств фенольного гидроксила за счет
образования хелатных комплексов с катионами меди (II) и проявление
ингибирующего эффекта только за счет аминогруппы.
На рис. 3.19 показаны зависимости периодов индукции
антиоксидантов от их концентраций: наблюдалась экстремальная
зависимость с максимумом в 5×10-4 М для -токоферола,
для салициловой кислоты максимум соответствовал концентрации
8×10-3 М, для осалмида, фенола и дибунола периоды индукции
возрастали с увеличением концентрации соединения, периоды
индукции парацетамола возрастали до 1×10-3 М и в дальнейшем
практически не изменялись. Исходя из концентрационных зависимостей, получаем ряд уменьшения АОА активности: дибунол >
осалмид > -токоферол > парацетамол > фенол > салициловая кислота.
Таблица 3.9.
Кинетические параметры окисления субстратов в водно-липидной
среде в присутствии 2×10 М CuCl в зависимости
от концентрации АО, t=600С
№
п/п
С(АО),
М
1
2
3
Контроль ЭО
1×106
1×105
i ,
мин.
Wнач.×10-5,
М×с-1
I Фенол
15
7,5
18
7,0
20
6,8
91
Wmax.×10-5,
М×с-1
14,0
12,0
8,4
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
5×105
1×104
2×104
5×104
7×104
1×103
2×103
5×103
7×103
1×102
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
Контроль ЭО
5×105
1×104
2×104
5×104
7×104
1×103
2×103
5×103
7×103
1×102
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
Контроль ЭО
5×105
1×104
2×104
5×104
7×104
1×103
2×103
5×103
7×103
1×102
36
37
38
39
40
41
42
Контроль ЭО
5×105
1×104
2×104
5×104
7×104
1×103
25
4,2
30
3,9
35
3,5
40
3,3
45
3,0
50
2,5
60
2,5
85
2,5
110
2,1
130
1,3
II Салициловая кислота
15
7,5
18
6,4
22
3,6
25
4,1
30
4,0
30
3,9
35
5,1
35
3,9
40
3,8
40
3,7
40
3,6
III Парацетамол
15
7,5
15
7,3
20
6,2
25
5,9
30
4,7
35
3,1
40
2,5
40
2,3
40
2,2
40
2,1
45
2,0
IV Осалмид
15
7,5
25
5,1
45
2,9
90
2,3
215
1,4
280
1,0
350
0,6
92
5,4
4,6
4,3
4,2
4,0
4,0
3,9
3,8
3,5
3,2
14,0
13,0
7,7
7,5
7,2
7,1
11,9
6,9
6,7
6,6
6,5
14,0
13,7
10,0
6,0
4,0
3,6
3,1
3,0
2,6
2,5
2,4
14,0
10
4,4
4,3
4,2
3,5
2,7
43
44
45
46
2×103
5×103
7×103
1×102
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
Контроль ЭО
5×105
1×104
2×104
5×104
7×104
1×103
2×103
5×103
7×103
1×102
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
Контроль ЭО
5×105
1×104
2×104
5×104
7×104
1×103
2×103
5×103
7×103
1×102
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
Контроль ЭО
5×105
1×104
2×104
5×104
7×104
1×103
2×103
5×103
7×103
1×102
80
Контроль ЭО
390
0,5
425
0,5
475
0,5
500
0,4
V Пирокатехин
15
7,5
10
10,1
9
12,0
26
9,4
50
8,3
60
6,2
70
5,1
80
4,1
90
2,2
110
2,0
120
1,9
V Адреналин
15
7,5
25
4,5
30
3,4
30
3,0
35
2,8
40
2,7
40
2,1
45
1,7
45
1,6
50
1,3
60
0,9
VI Метилдофа
15
7,5
20
7,1
30
6,8
30
4,8
35
3,6
35
3,5
35
3,4
40
2,5
45
1,8
55
1,6
60
0,9
VII Фентоламин
15
7,5
93
2,5
2,5
2,5
2,5
14,0
14,0
17,3
16,4
15,1
15,3
14,2
15,0
15,2
16,3
16,8
14,0
4,9
4,6
7,0
6,1
5,5
4,5
4,2
4,0
3,9
3,8
14,0
9,4
8,8
7,3
6,6
5,3
5,1
3,5
2,9
2,6
2,4
14,0
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
5×105
1×104
2×104
5×104
7×104
1×103
2×103
5×103
7×103
1×102
5×102
1×101
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
Контроль ЭО
5×105
1×104
2×104
5×104
7×104
1×103
2×103
5×103
7×103
1×102
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
Контроль ЭО
5×105
1×104
2×104
5×104
7×104
1×103
2×103
5×103
7×103
1×102
115
116
117
118
119
Контроль ЭО
5×105
1×104
2×104
5×104
15
7,4
15
7,4
15
7,3
15
7,3
15
7,1
20
6,8
20
6,8
20
6,8
30
6,5
55
6,1
65
5,7
70
5,2
VIII Аллопуринол
15
7,5
30
3,8
50
3,7
55
3,7
60
3,6
65
3,6
70
3,5
70
3,0
75
2,9
80
2,7
80
2,6
IX Эмоксипин
15
7,5
30
3,4
40
2,1
40
1,9
45
1,5
50
1,3
55
1,0
60
0,9
70
0,8
80
0,7
90
0,7
X Новокаин
15
7,5
20
6,8
45
6,7
50
6,6
50
6,6
94
13,8
13,7
13,6
13,8
13,8
13,8
13,4
13,2
13,2
13,4
13,3
13,1
14,0
11,5
5,3
5,0
5,0
5,5
5,5
5,5
5,5
5,5
5,6
14,0
5,1
4,3
4,0
3,7
3,6
3,5
3,4
3,2
3,0
2,6
14,0
9,8
9,2
8,7
8,5
120
121
122
123
124
125
7×104
1×103
2×103
5×103
7×103
1×102
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
Контроль ЭО
5×105
1×104
2×104
5×104
7×104
1×103
2×103
5×103
7×103
1×102
50
6,6
50
6,5
55
6,4
60
6,2
65
6,0
70
5,7
XI Коринфар
15
7,5
21
6,8
26
4,9
32
4,5
37
4,3
42
4,1
50
3,9
65
3,2
90
2,5
95
2,0
100
1,4
8,1
7,6
7,3
7,1
7,0
6,8
14,0
10
7,0
6,0
5,0
5,0
5,0
5,0
4,3
3,1
2,5
, мин
1
600
500
2
400
300
200
3 4
100
5
6
0
0
2
4
6
8
10
-4
С(АО) 10 , М
Рисунок 3.19. Зависимости периода индукции от концентрации
антиоксидантов в водно-липидной среде: 1- дибунол, 2-осалмид,
3--токоферол, 4-фенол, 5-парацетамол, 6-салициловая кислота;
2×10-3 М CuCl2, 1×10 М ЦТМАБ, субстрат окисления —
этилолеат, t=600 С
95
VO2, см3
30
1
2
3
4
25
5
20
15
10
5
0
0
50
100
150
200
t, мин
Рисунок 3.20. Кинетика окисления этилолеата в водно-липидной
среде в присутствии добавок пирокатехина, М: 1- контроль,
2- 1×10-4; 3- 1×10-3; 4- 5×10-3; 5- 1×10-2; 2×10 М CuCl, 1×10 М
ЦТМАБ, t=600 С
Особый интерес представляет присутствие аминофенолов
при каталитическом окислении липидных субстратов. Известно,
что многие активные компоненты клетки являются аминами, около
80 % лекарственных препаратов также представляют собой амины.
В настоящей работе исследованы аминофенолы и амины.
В соответствии с механизмом окисления аминофенолы могут
участвовать в различных элементарных реакциях:

реакции обрыва цепей, что должно приводить к увеличению
периода индукции и уменьшению начальных скоростей процесса
пропорционально концентрации:
7
RO2 + InH → ROOH + In

реакции разветвления, продолжения, инициирования цепей,
что должно приводить к увеличению скорости процесса, сокращению
периода индукции:
In + RH → R + InH
Iп + RH → R + продукты

96

реакции разрушения гидропероксидов по молекулярному
механизму, что приведет к уменьшению скорости процесса
пропорционально концентрации аминофенола:
ROOH + InH → молекулярные продукты.
Известно [14], что аминосодержащие соединения способствуют
разрушению гидропероксидов с образованием молекулярных
продуктов согласно схеме:
первичные амины ROOH + R΄-CH2NH2 → ROH + R΄-CH=NH + H2O
вторичные амины ROOH + (R΄-CH2)2NH → ROH + R΄-CH=NHCH2-R + H2O
третичные амины ROOH + (R΄-CH2)3N → ROH + R΄-CHO +
(R΄-CH2) 2-NH
Скорость реакции падает в ряду: третичные > вторичные >
первичные.
Известно [5, 51, 87], что амины легко подвергаются окислению,
продукты окисления алифатических аминов (нитроксильные
радикалы) могут эффективно ингибировать процесс, обеспечивая
многократный обрыв цепей окисления:
>NO + R → >NOR
>NOR + RO2→ >NO + продукты
Нитроксилы принимают также участие в разложении
пероксидов [129, 132].
В процессе окисления должны конкурировать различные
элементарные реакции за счет фенольного гидроксила и аминогруппы,
что сказывается на суммарной антиоксидантной активности
соединения.
Проведено сравнение антиоксидантного эффекта пирокатехина
и его производных: адреналина, метилдофа.
На рис. 3.20 приведены типичные КК окисления этилолеата
в зависимости от концентрации пирокатехина. Все добавки пирокатехина тормозят процесс окисления: наблюдается период индукции,
период аутоускорения и достижения максимальной скорости
окисления. При увеличении концентрации пирокатехина повышается
максимальная скорость процесса. Увеличение максимальной скорости
процесса окисления (табл. 3.9) в присутствии пирокатехина, вероятно,
связана с участием гидроксильных групп в образовании хелатов
с катионами меди (II), при этом снижается их эффективность
в процессе ингибирования. Пирокатехин существенно тормозит
97
окисление этилолеата только при концентрациях 1×10  М и выше,
когда его соотношение с катализатором составляет 5:1. В этих
условиях большая часть пирокатехина не задействована в комплексообразовании и проявляет антиоксидантную активность.
При концентрации пирокатехина 1×10 М происходит ускорение,
а при его концентрации 1×10 М замедление процесса.
На рис. 3.21 представлены спектры оптической плотности
пирокатехина в присутствии хлорида меди (II) и ПАВ при длине волны
(230—340) нм. Максимум поглощения пирокатехина прослеживается
при длине волны 276 нм. Область спектра 240—260 нм. характерна
для образования хинонов, а полоса 290—320 нм. обусловлена
образованием комплексных соединений пирокатехина с катионами
меди (схема 3.1) [95, 184].
Кинетические кривые с добавками адреналина приведены
на рис. 3.22. Наблюдается другой характер КК: небольшие периоды
индукции, которые практически не зависят от концентрации адреналина, но происходит значительное снижение максимальной скорости
процесса окисления в 3—4 раза.
2,0
D
1,5
1,0
1
0,5
2
3
0,0
240
260
280
300
320
340
, нм
Рисунок 3.21. Спектры оптической плотности смеси:
пирокатехин (5×10-4 М) + ЦТМАБ (1×10-3 М) + CuCl2 (2×10-3 М) (1);
пирокатехин (5×10-4 М) + ЦТМАБ (1×10-3 М)(2); ЦТМАБ (1×10-3 М)
+ CuCl2 (2×10-3 М) (3); растворитель – вода; t=200 С
98
Схема 3.1.
Такой характер КК предполагает подавление антиоксидантных
свойств фенольного гидроксила за счет образование хелатных
комплексов с катионами меди (II) и проявление ингибирующего
эффекта только за счет аминогруппы.
VO2, см3
30
1
2
25
3
4
20
5
6
15
7
8
10
5
0
0
50
100
150
200
250
300
t, мин
Рисунок 3.22. Кинетика окисления этилолеата в водно-липидной
среде в присутствии добавок адреналина, М: 1- контроль, 2- 1×10-6,
3- 5×10-6, 4- 1×10-5, 5- 5×10-5, 6- 1×10-4, 7- 1×10-3, 8- 1×10-2; 2×10 М
CuCl, 1×10 М ЦТМАБ, t=600 С
99
VO2, см3
30
1
2
25
3
4 5
20
6
15
7
10
5
0
0
50
100
150
200
250
300
t, мин
Рисунок 3.23. Кинетика окисления этилолеата в водно-липидной
среде в присутствии добавок метилдофы, М: 1- контроль, 2- 1×10-6,
3- 1×10-4, 4- 3×10-4, 5- 5×10-4, 6- 1×10-3, 7- 1×10-2; 2×10 М CuCl,
1×10 М ЦТМАБ, t=600С
На рис. 3.23 наблюдается аналогичный характер КК с добавками
метилдофа: незначительные периоды индукции, снижение начальной
и максимальной скоростей окисления в 3—6 раз по сравнению
с контролем. Снижение начальной скорости окисления указывает
на участие метилдофа в реакциях обрыва цепей. Снижение
максимальной скорости окисления (табл. 3.9) может свидетельствовать
об участии соединения в реакциях с гидропероксидами с образованием
молекулярных продуктов.
На рис. 3.24 показаны зависимости периодов индукции
антиоксидантов от их концентраций: наблюдалась экстремальная
зависимость с максимумом в 5×10-4 М для -токоферола, для пирокатехина периоды индукции возрастали с увеличением концентрации
соединения, периоды индукции адреналина и метилдофы возрастали
до 5×10-4 М и в дальнейшем не изменялись.
Рассмотрим ряд гетероциклических производных: фентоламин,
аллопуринол, эмоксипин. Фентоламин относится к амино-фенолам
первой группы, в присутствии которых при различных концентрациях
происходит окисление мицеллярного субстрата без периода индукции
и периода аутоускорения. Низкая АОА фентоламина может быть
100
, мин
обусловлена нарушением сопряжения из-за объемного заместителя
в положении 3. В эмоксипине в положениях 2 и 4 по отношению
к гидроксилу расположены донорные алкильные заместители.
На рис. 3.25 показано, что при всех концентрациях эмоксипин
тормозит начальные и максимальные скорости окисления.
В присутствии аллопуринола и эмоксипина наблюдаются периоды
индукции и периоды аутоускорения (рис. 3.25). Соединения относятся
к амино-фенолам второй группы. Вероятно, в этих условиях лимитирующей является реакция разрушения амином гидропероксидов
по молекулярному механизму. Зависимости периодов индукции
от концентрации эмоксипина, аллопуринола и фентоламина приведены
в табл. 3.9.
80
2
1
70
60
50
3
40
4
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
-4
С(АО)  10 , М
Рисунок 3.24. Зависимости периода индукции от концентрации
антиоксидантов: 1- -токоферол, 2-пирокатехин, 3-адреналин,
4-метилдофа; 2×10-3 М CuCl2, 1×10 М ЦТМАБ,
субстрат окисления — этилолеат, t=600 С
101
VO2, см3
30
1
2
25
20
3 4 5
6
15
7
8
10
5
0
0
50
100
150
200
250
300
t, мин
Рисунок 3.25. Кинетика окисления этилолеата в водно-липидной
среде в присутствии добавок эмоксипина, М: 1- контроль, 2-1×10-6,
3- 5×10-5, 4- 1×10-4, 5- 5×10-4, 6- 1×10-3, 7- 5×10-3, 8- 1×10-2; 2×10 М
CuCl, 1×10 М ЦТМАБ, t=600 С
Новокаин является амином. Окисление этилолеата в присутствии
различных концентраций новокаина происходит без периода индукции
и периода аутоускорения, с пропорциональным уменьшением
максимальной скорости окисления, что связано с разрушением
гидропероксидов по молекулярному механизму (рис. 3.26, табл. 3.9).
Общим в эффекте всех аминов является снижение максимальной
скорости процесса пропорционально увеличению концентрации.
Различие в эффекте состоит в том, что в присутствии одних аминов
при различных концентрациях происходит окисление без периода
индукции и периода аутоускорения. В присутствии других аминов
наблюдаются периоды индукции и периоды аутоускорения. К аминам
первой группы относятся новокаин, парацетамол, фентоламин.
К аминам второй группы относятся адреналин, метилдофа, эмоксипин,
аллопуринол, коринфар.
На рис. 3.27 представлены зависимости периодов индукции
от концентрации аминов. Для эмоксипина, аллопуринола и коринфара
наблюдается увеличение периодов индукции с ростом концентрации.
Для фентоламина и новокаина периоды индукции практически
не изменяются с увеличением концентрации.
102
30
O2,
1
25
V
см3
Идентичный характер эффекта амина и аминофенолов
свидетельствует о том, что активность фенольного гидроксила
полностью подавлена, возможно, за счет акцепторного характера
заместителей у аминогруппы.
Капотен является производным пролина с отдаленной боковой
тиольной группой. Химическая структура капотена позволяет
прогнозировать его ингибирующую активность за счет восстановления
гидропероксидов меркаптогруппой или хелатирования катализатора.
Представляло интерес исследовать антиоксидантную активность
капотена в процессе окисления метиллинолеата в условиях инициирования в среде хлорбензола и катализа в водно-липидной среде.
20
4
3
2
5
6
15
10
5
0
0
50
100
150
200
250
300
t, мин
Рисунок 3.26. Кинетика окисления этилолеата в водно-липидной
среде в присутствии добавок АО в концентрации 1×10-3 М:
1- контроль, 2-фентоламин, 3-новокаин, 4-коринфар,
5-аллопуринол, 6-эмоксипин; 2×10 М CuCl, 1×10 М ЦТМАБ,
t=600 С
103
, мин.
1
70
60
2
4
3
50
40
30
5
20
10
0
0
2
4
6
8
10
-4
С(АО)  10 , М
Рисунок 3.27. Зависимости периода индукции от концентрации
антиоксидантов: 1-аллопуринол, 2-эмоксипин, 3-новокаин,
4-коринфар, 5-фентоламин; 2×10-3 М CuCl2, субстрат окисления —
этилолеат, t=600 С
Таблица 3.10.
Кинетические параметры окисления МЛ в безводной среде
в присутствии 6×10 М АИБН в зависимости от концентрации
капотена, t= 600С
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
9
[InH],
М
Контроль МЛ
1×106
5×106
5×105
1×104
5×104
1×103
1×102
1×101
,
мин.
20
42
36
90
44
36
20
30
22
Wнач.×10-8,
М×с-1
6,0
5,0
4,7
4,5
4,5
4,9
6,0
7,2
8,0
Wmax.×10-7,
М×с-1
2,2
1,9
1,8
1,7
1,7
2,0
2,2
2,4
2,8
[АИБН]
[InH]
6000 : 1
1200 : 1
120 : 1
60 : 1
12 : 1
6:1
1 : 1,7
1 : 17
На рис. 3.28 представлены КК окисления МЛ в растворе
хлорбензола в присутствии широкого диапазона концентраций
104
VO2, мм
3
(1×10—1×10) М капотена. Показано, что капотен в безводной среде
проявляет сложный механизм действия, обусловленный его вероятным
участием в реакциях зарождения, продолжения и обрыва цепей.
Влияние капотена заключается в том, что при одних концентрациях
происходит уменьшение максимальной скорости, при других
наблюдается промотирование процесса окисления. Из таблицы 3.10
видно, что начальные и максимальные скорости процесса меняются
экстремально: снижаются с увеличением концентрации до 1×10  М
(соответствует соотношению инициатора и капотена 60:1)
и увеличиваются при дальнейшем её повышении. Зависимость
периода индукции от концентрации капотена в среде хлорбензола
имеет максимум при концентрации (4—5)×10 М (рис. 3.29).
Характер воздействия капотена на процесс инициированного
окисления МЛ может быть объяснен его участием в радикальном
процессе.
Радикал инициатора АИБН (Ri) конкурентно взаимодействует
с метиллинолеатом (RH) или с тиольной группой капотена (RSH)
по реакциям:
1
300
2 3 4 5
6
9
250
7
8
10
200
150
100
50
0
0
20
40
60
80
100 120 140 160 180
t, мин
Рисунок 3.28. Кинетика окисления метиллинолеата в безводной
среде в присутствии 6×10-3 М АИБН и капотена М: 2- контроль;
1- 1×10-2, 3-8×10-3, 4-1×10-1, 5 - 5×10-4, 6-5×10-6, 7-1×10-6, 8-1×10-3,
9-8×10-4,10-5×10-5, t=600 С
105
, мин
100
1
80
60
40
2
20
0
2
4
6
-5
8
10
-4
С(АО)  10 М (1); С(АО)  10 М (2)
Рисунок 3.29. Зависимости периода индукции от концентрации
капотена в безводной среде; 6 × 10-3 М АИБН,
субстрат окисления — метиллинолеат, t=600 С
Ri + RH → RiH + R
RSH + Ri→ RiH + RS
Далее радикалы метиллинолеата (R)
взаимодействуют с кислородом по реакциям:
и
капотена
(RS)
R + O → RO
RO + RH → ROOH + R
RSH + O → RS + HO2
RS + RH → RSH + R

Наблюдаемое увеличение начальной скорости процесса
при высоких концентрациях капотена происходит за счет участия
капотена в реакциях инициирования, при этом соотношение
инициатора и капотена составляет 1 : (1,7—17).
Снижение максимальной скорости окисления при небольших
добавках капотена может быть связано с участием соединения
в реакциях обрыва цепей:
RSH + RO → ROOH + R1 S
106
VO2, см
3
На рис. 3.30 приведены кинетические кривые каталитического
окисления МЛ в водно-липидной среде в присутствии (1×10—1×10) М
капотена. Показано, что все добавки соединения тормозят процесс
окисления, степень и характер влияния зависит от концентрации.
Низкие концентрации капотена (1×10—1×103) М пропорционально
уменьшают начальную и максимальную скорости процесса.
При концентрациях 1×10 М и выше происходит торможение
начальных стадий процесса, увеличение периода индукции
и достижение максимальной скорости процесса после выхода из периода
индукции (табл. 3.11). На рис. 3.31 показана линейная зависимость
периода индукции от роста концентрации капотена. Характер влияния
капотена на кинетику каталитического окисления МЛ может быть
объяснен следующим образом. Капотен может участвовать в реакциях
обрыва цепей, обеспечивая ингибирования процесса окисления.
25
1
2 34
5
6
7
20
15
10
5
0
0
100
200
300
400
t, мин
Рисунок 3.30. Кинетика окисления метиллинолеата в воднолипидной среде в присутствии капотена: 1- контроль; 2- 1×10-6 М;
3-1×10-5 М; 4-1×10-4 М; 5- 1×10-3 М; 6-1×10-2 М; 7- 1×10-1 М, 2×10 М
CuCl, 1×10 М ЦТМАБ, t=600 С
107
, мин
400
300
200
100
0
0
2
4
6
8
10
-2
С(АО)  10 , М
Рисунок 3.31 . Зависимость периода индукции от концентрации
капотена в водно-липидной среде; 2 × 10 -3 М CuCl, 1×10 М
ЦТМАБ, субстрат окисления – метиллинолеат, t=600 С
Снижение скорости окисления под влиянием капотена может
быть обусловлено его конкурентным участием с катализатором
в молекулярном
распаде
гидропероксидов,
что
сказывается
на снижении скорости разветвления цепей и скорости процесса
в целом:
RO + RSH → ROOH +RS
ROOH + RSH → M
ROOH + Cu → RO + H + Cu
Значимое торможение с последующим достижением максимальной скорости процесса начинается при соотношениях
катализатора и капотена 1:1 и усиливается при соотношениях 1:5
и 1:50. Очевидно, что в этих условиях происходит нейтрализация
катализатора за счет его восстановления в Cu. При большом избытке
капотена восстановление Cu в Cu происходит быстрее, наблюдается
эффективное торможение процесса окисления. Рассчитана скорость
инициирования для реперного антиоксиданта дибунола в безводной
и водно-липидной системах тестирования капотена, получены
значения 4,8×10 и 1,9×10 М×с-1 соответственно. Максимальная
108
скорость окисления липидных субстратов в безводной и воднолипидной средах в условиях эксперимента составляла 2,2×10 
и 2,6×10 М×с-1 соответственно.
1,2
ROOH г. I2 / 100 г. липидов
а
1
1,0
2
0,8
3
Ввод АО
0,6
0,4
0,2
50
100
150
200
250
300
350
400
ROOH г. I2 / 100 г. липидов
t, мин
0,20
б
1
0,16
Ввод АО
0,12
2 3
0,08
0,04
200
300
400
500
600
700
800
t , мин
Рисунок 3.32. Кинетика накопления гидропероксидов при
аутоокислении метилолеата (а) и линолевой кислоты (б)
в присутствии равных концентраций АО: 1 — контроль,
2 — эмоксипин, 3 — капотен (а); 1 — контроль, 2 — осалмид,
3 — парацетамол(б).Стрелкой показан ввод АО. С (АО) = 210-4 M,
t = 600 C
109
Общим в эффекте всех аминов и серосодержащего препарата
капотена является снижение максимальной скорости процесса,
пропорционально увеличению концентрации. Эффект уменьшения
начальной и максимальной скорости окисления отмечается для всех
АО, кроме пирокатехина и фентоламина, в наибольшей степени
это влияние проявляется в действии эмоксипина, осалмида
и парацетамола.
Для подтверждения гипотезы о возможном разрушении
гидропероксидов под действием АО были проведены эксперименты
по тестированию кинетики накопления гидропероксидов (ROOH)
с добавками в частично окисленный субстрат (время эксперимента
8 часов) каждого из исследуемых АО (рис. 3.32. а, б, рис. 3.33). После
внесения ингибитора, в течение первого часа наблюдалось снижение
концентрации гидропероксидов, в контрольном опыте ROOH
продолжали накапливаться.
1
ROOH г. I2 / 100 г. липидов
2,2
2,0
Ввод АО
1,8
2
1,6
3
1,4
1,2
1,0
0
50
100
150
200
t, мин
Рисунок 3.33. Кинетика накопления гидропероксидов
при аутоокислении метилолеата в присутствии равных
концентраций АО: 1 — контроль, 2 — адреналин, 3 — метилдофа.
Стрелкой показан ввод АО. С(АО) = 210-4 M, t = 600 C
110
Таблица 3.11.
Кинетические параметры окисления метиллинолеата
в водно-липидной среде в присутствии 2×10 М CuCl
в зависимости от концентрации капотена, t= 60 0 С
№
п/п
1
2
3
4
5
6
7
[InH],
М
Контроль
1×106
1×105
1×104
1×103
1×102
1×101
,
мин.
5
8
15
26
45
95
395
Wн.×10-5,
М×с-1
14,4
7,6
6,9
6,2
3,6
2,1
0,6
Wмак.×10-4,
М×с-1
2,6
1,6
1,0
1,6
1,7
1,7
1,7
[CuCl]
[InH]
2000 : 1
200 : 1
20 : 1
2:1
1:5
1 : 50
InH +ROOH  M6
Установлено, что все исследуемые соединения способствовали
разрушению гидропероксидов на 50—75 %.
Таким образом, указанные методы адекватно оценивают свойства
исследуемых соединений и позволяют полагать, что разрушение
гидропероксидов под их действием осуществлялось нерадикальным
путем, поскольку вторичного инициирования процесса не наблюдалось.
Выводы:
1. Разработана кинетическая модель тестирования биоантиоксидантов в водно-липидной каталитической среде, выбраны
оптимальные концентрации катализатора и поверхностно-активного
вещества.
2. Получен ряд каталитической активности солей металлов
переменной валентности: Cu > Co> Fe > Fe 3 > Ni.
3. Показан идентичный механизм действия стационарного
антиоксиданта дибунола при окислении безводных и водноэмульсионных липидных субстратов.
4. Установлена слабая антиоксидантная активность -токоферола при каталитическом окислении водно-эмульсионных липидных
субстратов и возможность его участия в комплексообразовании
с катионами меди (II).
5. Получен ряд увеличения антиоксидантной активности
полифункциональных соединений: фентоламин < салициловая кислота
< новокаин < пирокатехин < фенол < парацетамол < коринфар <
111
метилдофа < адреналин < эмоксипин < аллопуринол < капотен <
осалмид < дибунол.
6. Константа скорости реакции антиоксидантов с пероксильными радикалами K7 уменьшается в ряду: 3,60×106 М-1с-1
(-токоферол) > 6,86×104 М-1с-1 (осалмид) > 4,00×104 М-1с-1
(парацетамол) > 1,40×104 М-1с-1 (дибунол) > 6,10×103 М-1с-1
(эмоксипин) > 2,40×103 М-1с-1 (фенол) > 2,30×103 М-1с-1 (салициловая
кислота).
7. Установлено, что исследуемые соединения в процессе
окисления способны как эффективно уничтожать пероксильные
радикалы, так и разрушать гидропероксиды молекулярным путем.
Вероятно, что антирадикальная активность ингибиторов обусловлена
присутствием в их химической структуре фенольного гидроксила,
а способность разрушения гидропероксидов связана с наличием
амино-, амидной или тиольной группы.
Разработанный
способ
тестирования
биоантиоксидантов
волюмометрическим методом с использованием каталитического
окисления водно-липидных (эмульсионных) субстратов был внедрен
в НИИ клинической и профилактической кардиологии СО РАМН.
По результатам антиоксидантной активности ряда лекарственных
препаратов различного фармакологического действия было выявлено
наиболее эффективное соединение — осалмид. В Новосибирском
институте органической химии (НИОХ) им. Н.Н. Ворожцова СО РАН
на базе структуры осалмида была синтезирована группа замещенных
амидов и сульфида салициловой кислоты, имеющих в ортоположении экранирующие трет-бутильные заместители. Сравнительному тестированию ингибирующих свойств новых перспективных
соединений с целью выявления среди них активных антиоксидантов
будет посвящена отдельная глава.
112
ГЛАВА 4.
АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ
БИС-ФЕНИЛТИОЛОВ
ПРИ ОКИСЛЕНИИ МИЦЕЛЛЯРНЫХ СУБСТРАТОВ
Исследована антиоксидантная активность синтетических
тиолов:
4,4′-димеркаптодифенилоксида
и
4,4′-димеркаптодифенилметана в сравнении со стандартными ингибиторами окисления
дибунолом (ионолом) и -токоферолом в безводных инициированных
и водно-липидных катализируемых субстратах. Установлена высокая
антиоксидантная активность тиолов, превышающая ингибирующие
свойства -токоферола и уступающая активности дибунола.
Показано, что серосодержащие соединения с наличием меркаптогруппы в процессе окисления разрушают гидропероксиды
молекулярным путем.
Серосодержащим соединениям принадлежат важные физиологические функции во всех живых организмах. Сера входит в состав
аминокислот, активных центров ферментов, гормонов. Все серосодержащие соединения клетки рассматриваются как эндогенные
антиоксиданты [76, 143, 244].
В результате направленного синтеза в Ярославском государственном техническом университете (ЯГТУ) группой профессора, д. х. н.
Москвичева Ю.А. получены малотоксичные тиолы [167], имеющие
в своей структуре меркапто-группы.
В настоящей работе обсуждаются физико-химические закономерности воздействия 4,4′-димеркаптодифенилоксида (I) и 4,4′-димеркаптодифенилметана (II) на процесс окисления липидных субстратов
в безводной среде в присутствии источника свободных радикалов
АИБН и водно-эмульсионной среде в присутствии катализатора
хлорида меди (II). В таблице 4.1 представлены формулы изучаемых
соединений.
113
Таблица 4.1.
Химические формулы изучаемых антиоксидантов
№
п/п
Название АО
1
4,4′димеркаптодифенилоксид (I)
2
4,4′димеркаптодифенилметан (II)
3
Дибунол
(1-гидрокси-2,6-дитрет-бутил-4метилбензол)
4
-Токоферол
[2,5,7,8-тетра-метил2-(4,8,12триметилтридецил)6-гидроксихроман)]
Формула
Кинетические кривые (КК) поглощения кислорода при окислении
липидного субстрата в присутствии добавок тиолов в безводной среде
представлены на рис. 4.1. Показано, что все добавки тиолов тормозят
процесс и уменьшают максимальную скорость окисления (табл. 4.2).
Снижение максимальной скорости окисления может быть обусловлено
распадом гидропероксидов по молекулярному механизму. Полярность
связи S-H значительно ниже, чем полярность связи O-H, поэтому
тиолы являются более слабыми ингибиторами окисления,
чем соответствующие фенолы. Изучаемые тиолы не имеют третбутильных заместителей в орто-положении и являются неэкранированными соединениями, поэтому тиильные радикалы (RS) вступают
в побочные реакции продолжения цепей с молекулами субстрата (RH).
Установлено, что антиоксидантная активность изучаемых тиолов
соизмерима с активностью природного антиоксиданта (АО)
-токоферола, но уступает эффективности синтетического ингибитора
окисления дибунола (табл. 4.2).
114
3
VO2, мм
1
350
2
3
300
4
5
6
7
250
200
150
100
50
0
0
50
100
150
200
250
300
t, мин
Рисунок 4.1. Кинетика окисления метилолеата в присутствии
добавок АО в растворе хлорбензола, М: 1 — контроль, 2 — 2×10-4
α–токоферол, 3 — 2×10-4 дибунол, 4 — 2×10-4 тиол (I), 5 — 2×10-4
тиол (II), 6 — 4×10-4 тиол (I), 7 — 4×10-4 тиол (II), АИБН 6×10-3 М,
t=600 С
Таблица 4.2.
Кинетические параметры окисления метилолеата в растворе
хлорбензола в присутствии АО, С(АИБН)= 610-3 M, t=600 С
20
45
Wнач.×10-8,
М×с-1
6,7
0,2
Wmaк.×10-7,
М×с-1
1,4
1,0
410-4
140
0,1
0,8
Тиол II
210-4
50
0,2
0,9
5
Тиол II
410
150
0,1
0,7
6
Дибунол
210
105
0,8
1,3
7
-Токоферол
210
80
1,1
1,3
№
п/п
1
2
АО
С(АО),М
i, мин.
Контроль МО
Тиол I
210-4
3
Тиол I
4
-4
-4
-4
Характер воздействия тиолов на процесс инициированного
окисления липидного субстрата может быть объяснен его участием
115
в радикальном процессе. Образующиеся в процессе окисления
тиильные радикалы могут тормозить или промотировать процесс
окисления.
Известно [401], что инициатор АИБН распадается с образованием
радикалов по реакции:
Радикал инициатора (Ri) конкурентно взаимодействует
с липидным субстратом или с тиольной группой (RSH) по реакциям:
Ri + RH → RiH + R
RSH + Ri → RiH + RS
RS+ RH → R + RSH
Далее радикалы липидного субстрата (R) и тиола (RS)
взаимодействуют с кислородом по реакциям:
R + O → RO
RO + RH → ROOH + R
RS + O → RSO

RSO + RSH → RSOH + RS
RS + RS → RS-SR

Наблюдаемое увеличение суммарной скорости процесса
при высоких концентрациях тиола происходит за счет вклада более
быстрого окисления тиола по сравнению с окислением субстрата.
Снижение максимальной скорости при добавках тиола может быть
связано с участием соединения в реакциях распада гидропероксидов
с образованием молекулярных продуктов:
ROOH + RSH → ROH + RSOH
На рис. 4.2 представлена кинетика каталитического окисления
метиллинолеата в присутствии (1×10-1×10) М тиола (I). Наблюдается сложный, многообразный характер влияния тиола на кинетику
процесса. В зависимости от концентрации тиола можно выделить
два типа КК.
116
30
2
3
4
5
VO2, см
3
1
6
25
20
7
15
10
5
0
0
50
100
150
200
250
300
t, мин
VO2, см
3
Рисунок 4.2. Кинетика каталитического окисления
метиллинолеата в зависимости от концентрации тиола (I) М:
1 — контроль, CuCl2 2×10-3, 2 — 2×10-4, 3 — 3×10-3, 4 — 1×10-2,
5 — 5×10-3, 6 — 1×10-4, 7 — 1×10-3, t=600 С
1
30
2
3 4
5
6
7
25
8
20
15
10
5
0
0
50
100
150
200
250
300
t, мин
Рисунок 4.3. Кинетика каталитического окисления
метиллинолеата в зависимости от концентрации тиола (II) М:
1 — контроль, CuCl2 2×10-3, 2 — 1×10-4, 3 — 2×10-4, 4 — 1×10-3,
5 — 3×10-3,6 — 4×10-3, 7 — 1×10-2, 8 — 5×10-3, t= 600 С
117
При концентрациях тиола (2×103-1×102) М наблюдается
S-образный характер КК, при концентрациях (1×10 4-1×103) М
процесс начинается с максимальной скоростью и сопровождается
уменьшением скорости процесса окисления (табл. 4.3).
При каталитическом окислении отсутствие аутоускорения,
уменьшение максимальной скорости процесса может быть связано
с восстановлением катализатора (Cu2+) в неактивную форму (Cu1+)
или его участием в обрыве цепей продуктов окисления тиола.
С учетом возможных различных реакций тиола [259] представленные
результаты могут быть объяснены следующим образом: вероятно,
на начальных
стадиях
каталитического
процесса
окисления
конкурентно участвуют радикалы липидного субстрата (RH) и тиола
(RS), образующиеся по реакциям:
RH + Cu → R● + Cu + H
RSH + Cu → RS● + Cu + H
Активность тиолов в образовании тиильных радикалов описана
в ряде работ [23, 76, 259]. При этом катализатор превращается
в неактивную форму, скорость инициирования и скорость суммарного
процесса снижается. Период торможения наступает тем позднее,
чем выше концентрация тиола, что может свидетельствовать
об участии тиолов в реакциях продолжении цепей:
RH + RS● → R● + RSH
При избытке тиола вклад этой реакции становится более
заметным. После выхода из периода индукции процесс окисления
сопровождается увеличением скорости процесса благодаря регенерации катализатора:
ROOH + Cu → RO● + Cu + OH
Восстановление катализатора возможно по реакции с сульфидами, дисульфидами или другими продуктами окисления тиола:
2 Cu1++ R-S-S-R + 2 H → 2 Cu + 2 RSH
На рис. 4.3 приведены КК каталитического окисления липидного
субстрата в присутствии (1×10 - 1×10) М тиола (II). Показано,
что добавки тиола (II) (1×10-2×10) М вызывают более слабое
118
торможение процесса, чем соизмеримые концентрации тиола (I),
при этом также происходит снижение начальной и максимальной
скорости (табл. 4.3). Причина такого характера влияния тиола (II)
может заключаться в меньшей активности RS●- радикала:
RO●+ RSH → ROOH + RS●
RS● + RH → R● + RSH
Таблица 4.3.
Кинетические параметры каталитического окисления
метиллинолеата в водно-липидной среде в присутствии тиолов
и 2×10 М хлорида меди (II), t= 600 С
№
С(АО),
п/п
М
I
1 Контроль МЛ
2
1×104
3
2×104
4
1×103
5
2×103
6
3×103
7
4×103
8
5×103
9
10×103
II
1 Контроль МЛ
2
1×104
3
2×104
4
1×103
5
2×103
6
3×103
7
4×103
8
5×103
9
10×103
,
мин.
5
8
10
65
70
135
180
210
200
5
8
10
12
15
45
200
265
185
Wнач.×10-4,
М×с-1
Тиол I
1,4
1,4
1,2
1,1
0,7
0,9
0,9
1,0
1,4
Тиол II
1,4
1,4
1,4
0,7
0,6
0,5
0,5
0,5
3,4
Wmax.×10-4,
М×с-1
[CuCl]
[InH]
2,6
1,9
1,7
1,6
3,5
3,5
3,6
3,6
3,7
20 : 1
10 : 1
2:1
1:1
1 : 1,5
1:2
1 : 2,5
1:5
2,6
1,9
1,9
1,9
1,9
2,0
2,5
2,5
2,6
20 : 1
10 : 1
2:1
1:1
1 : 1,5
1:2
1 : 2,5
1:5
В присутствии добавок (3—5)×10 М тиола (II) после короткого
начального периода окисления наблюдается период полного торможения, продолжительность которого зависит от концентрации тиола.
119
, мин
300
1
250
2
200
150
100
50
0
0
2
4
6
8
10
-3
C(АО ) 10 , М
Рисунок 4.4. Зависимость периодов индукции от концентрации АО:
1 — тиол (II), 2 — тиол (I), CuCl2 2×10-3М, субстрат окисления
МЛ, t= 600 С
1
ROOH г. I2 / 100 г. липидов
2,2
2,0
Ввод АО
1,8
2
3
1,6
1,4
1,2
1,0
0
50
100
150
200
t, мин
Рисунок 4.5. Кинетика накопления гидропероксидов при
аутоокислении МО в присутствии равных концентраций АО:
1 — контроль, 2 — тиол (I), 3 — тиол (II). Стрелкой показан
ввод АО. С (АО)=210-4 M, t=600 C
120
Зависимости периодов индукции от концентрации тиолов
приведены на рис. 4.4. Показан экстремальный характер кривых,
концентрационные пики совпадают в диапазоне концентраций
(5-8)×103 М. Поскольку появление периода торможения происходит
при больших концентрациях тиола (II), чем аналогичное воздействие
тиола (I), то можно говорить о большей активности последнего
в реакциях восстановления катализатора.
На основании представлений об особенностях химической
структуры и кинетики окисления липидных субстратов в присутствии
тиолов полагали, что соединения способны разрушать гидропероксиды. Для подтверждения гипотезы о возможном разрушении
гидропероксидов под действием тиолов был проведен эксперимент
по прямому тестированию кинетики накопления гидропероксидов
(ROOH) после введения соединений в частично окисленный субстрат
(время эксперимента 10 часов). В течение первого часа наблюдалось
снижение концентрации гидропероксидов (рис. 4.5), в контрольном
опыте ROOH продолжали накапливаться. Установлено, что все исследуемые добавки тиолов способствовали разрушению гидропероксидов
на 40—50 %.
В нашем исследовании установлен идентичный характер
кинетических кривых окисления липидного субстрата в растворе
хлорбензола в присутствии 6×10 М инициатора и водно-липидной
системе в присутствии 2×10 М хлорида меди (II) при равных
концентрациях дибунола. Показано, что в водно-липидной среде
дибунол проявляет себя как сильный ингибитор: наблюдается период
полного торможения, период аутоускорения и достижение максимальной скорости окисления. Периоды индукции увеличиваются
пропорционально увеличению концентрации дибунола (табл. 4.4).
Наличие торможения в присутствии добавок дибунола являлось
признаком радикально-цепного механизма процесса, а отсутствие
комплексообразующей способности с катионами меди было связано
с экранированностью
двумя
трет-бутильными заместителями
его донорно-акцепторного центра.
По наклону прямой в координатах ,[InH] была рассчитана
скорость инициирования в обеих системах, получены значения
4,8×10 и 1,9×10 М×с-1 в безводной и водно-липидной среде
соответственно. Скорость окисления липидных субстратов в безводной
и водно-эмульсионной средах равны 1,4×10 и 2,6×10 М×с-1
соответственно.
121
Таблица 4.4.
Кинетические параметры окисления метиллинолеата
в водно-эмульсионной среде в присутствии 2×10 М CuCl
в зависимости от концентрации -токоферола и дибунола, t=600С
№ п/п
I
II
1
2
3
4
5
6
7
8
III
1
2
3
4
5
6
7
8
9
[InH], М
Контроль МЛ
, мин
5
1×108
1×107
1×106
1×10-5
1×10-4
1×10-3
1×10-2
1×10-1
10
15
20
25
35
15
6
5
1×106
1×105
2×105
5×105
1×104
2×104
5×104
8×104
1×103
30
40
75
130
160
180
270
430
590
Wнач.×10-5, М×с-1 Wmax.×10-4, М×с-1
14,4
2,6
-Токоферол
14,0
2,1
11,0
2,1
9,7
1,9
6,8
1,8
5,2
1,4
14,6
3,2
15,7
3,4
16,8
5,7
Дибунол
13,8
2,5
12,7
2,3
9,8
2,1
5,0
1,9
4,1
1,8
3,8
1,7
3,1
1,6
2,3
1,6
1,9
1,5
Антиоксидантную
активность
-токоферола
оценивали
по характеру изменения кинетических параметров по сравнению
с дибунолом, для которого установлен механизм ингибирования
процесса окисления в углеводородах за счет только реакций обрыва
цепей (табл. 4.4). Анализ кинетических кривых окисления метиллинолеата показал существенные отличия механизма действия
-токоферола от дибунола в зависимости от концентрации.
Значимый период полного торможения для -токоферола
при инициированном окислении метилолеата появляется только
при концентрациях свыше 1×10 М и меняется пропорционально
концентрации. При дальнейшем повышении концентрации -токоферола свыше 1×103 М увеличивается начальная скорость окисления,
сокращается период полного торможения. Представленные результаты
свидетельствуют о сложном механизме действия -токоферола
122
в безводной среде, о его участии не только в реакциях обрыва,
но и реакциях продолжения цепей.
В водно-липидной среде -токоферол проявлял слабые
антиоксидантные свойства (табл. 4.4), в концентрациях свыше
1×103 М промотировал процесс окисления липидных субстратов,
при концентрации (1×10—1×10) М незначительно уменьшал
максимальную скорость, без заметного влияния на начальные стадии
окисления. В присутствии (1×10—1×10) М -токоферола наблюдалось замедление начальных стадий окисления и уменьшение
максимальной скорости. Причиной ускорения процесса может быть
комплексообразование OH-группы -токоферола с катионами меди.
В процессе окисления -токоферол образует достаточно активные
токофероксильные радикалы (In), способные участвовать в побочных
реакциях продолжения цепей с молекулами субстрата (RH) [40]:
In + RH →R + InH
В результате этой реакции восстанавливается активная
фенольная форма антиоксиданта, взаимодействующая в дальнейшем
с пероксильными радикалами, ведущими цепи окисления:
RO + InH → ROOH +In
В целом, результаты настоящего исследования свидетельствуют
о сложном механизме воздействия тиолов на процесс окисления
липидных субстратов. Показана возможность участия тиолов в реакциях
инициирования, продолжения, обрыва цепей, распада гидропероксидов
и восстановления катализатора в неактивную форму. Полученные данные
могут способствовать расширению спектра применения тиолов и быть
методологической основой для разработки новых подходов оценки
антиоксидантной активности серосодержащих соединений.
Выводы:
1. Установлено, что синтетический ингибитор окисления дибунол
в двух кинетических моделях в безводной и водно-липидной средах
превосходит по своему действию природный антиоксидант -токоферол.
2. Выявлена высокая антиоксидантная активность тиолов
в водно-липидных катализируемых субстратах, превышающая ингибирующие свойства -токоферола и уступающая активности дибунола.
3. Установлено, что серосодержащие соединения с наличием
тиольной группы в процессе окисления разрушают гидропероксиды
молекулярным путем.
123
ГЛАВА 5.
КИНЕТИКА ОКИСЛЕНИЯ
КАТАЛИЗИРУЕМЫХ СУБСТРАТОВ
В ПРИСУТСТВИИ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ
И ЭКСТРАКТА ЭЛЕУТЕРОКОККА
В модельной системе каталитического окисления метиллинолеата установлен эффект синергизма в совместном антиоксидантном действии экстракта элеутерококка и аскорбиновой
кислоты.
В настоящей главе исследована антиоксидантная активность
суммы компонентов экстракта корней элеутерококка (ЭЭ). Элеутерококк оказывает многостороннее действие на организм: возбуждает
центральную нервную систему, усиливает двигательную активность
и условнорефлекторную деятельность, повышает основной обмен,
понижает содержание сахара в крови, обладает гонадотропными
свойствами [79, 80]. Известна более высокая фармакологическая
активность комплексного препарата ЭЭ по сравнению с его отдельными компонентами. Дардымовым И.В. [80] выделена гликозидная
фракция из метанольного экстракта корней элеутерококка, в которой
обнаружено семь гликозидов, названных элеутерозидами: 3-0--Дглюкозид -ситостерина (А), 4--глюкозид синапового спирта (В), 7-глюкозид изофраксидина (В1), этил--Д-галактозид (С), диглюкозиды (-)
— сирингарезинола (Д и Е), а также гликозид F, которые находятся
в соотношении : 8 : 30 : 10 : 12 : 24 : 2 : 1. Большинство гликозидов
выделено в кристаллическом виде, установлена их химическая
структура, которая приведена ниже.
Изученные гликозиды представляют собой моно- или биозиды.
Кроме элеутерозидов, в экстрактах элеутерококка содержатся:
глюкоза, сахароза, крахмал, полисахариды, воска, смолы, пектиновые
вещества и многие другие соединения.
В нашем эксперименте использовался экстракт элеутерококка
заводского производства, который выпаривали и получали
(0,0075—2,5) % водные растворы.
-Аскорбиновая кислота (АК) является -лактоном 2,3-дегидроL-гулоновой кислоты. Характерной чертой структуры аскорбиновой
кислоты является наличие ендиольной группы - C  C -, которая
определяет высокую биологическую активность и окислительновосстановительные свойства соединения [64].
124
Гликозиды из корней элеутерококка
Схема 5.1. Аскорбиновая кислота
Отсутствие токсичности, высокая физиологическая активность,
лечебный
эффект,
окислительно-восстановительные
свойства
аскорбиновой кислоты стимулируют работы по ее использованию
в качестве антиоксиданта для стабилизации качества пищевых
продуктов или для антиоксидантотерапии. Исходя из структуры,
первоначально предполагали, что аскорбиновая кислота не может
проявлять антирадикальной активности, а должна быть синергистом
в антиоксидантных композициях. К этому направлению относятся
работы [381, 383, 389], в которых аскорбиновая кислота исследована
125
как синергист в смеси с -токоферолом. В работе [381] показано
увеличение антиоксидантной активности -токоферола в лярде
в присутствии 0,01—0,05 % аскорбиновой кислоты. Подобные
результаты получены для смесей -токоферола с аскорбиновой
кислотой в метилолеате, лярде [383]. Роль аскорбиновой кислоты
связывают с восстановлением токофероксильных радикалов
и регенерацией сильного ингибитора. В то же время синергическая
активность аскорбиновой кислоты может быть обусловлена
хелатированием катализаторов.
В обзоре Niki Е. [364, 365] аскорбиновая кислота отнесена
к водорастворимым антирадикальным соединениям и показана
ее возможность взаимодействия со свободными радикалами жирнокислотных компонентов липидов. Между тем известно [97],
что аскорбиновая кислота способна восстанавливать при окислении
липидных субстратов менее активные Fe до более активных Fe
или более активные Cu до менее активных Cu. В клетке
аскорбиновая кислота совместно с катионами может ускорять
образование свободных, например, OH- радикалов [76]. В этом случае
добавки аскорбиновой кислоты будут ускорять или тормозить процесс
окисления. Действительно, в ряде работ [190, 347, 391] показан
прооксидантный эффект аскорбиновой кислоты in vitro. Известны
работы по исследованию влияния приема аскорбиновой кислоты
экспериментальными животными на уровень интенсивности
ПОЛ [190]. Показано, что введение аскорбиновой кислоты снижает
уровень ПОЛ. Выбор для исследований экстракта элеутерококка
обусловлен высокой физиологической активностью его компонентов.
Кроме того, известна [103] антиоксидантная активность экстракта
элеутерококка в суспензии яичного желтка в присутствии катионов
железа (II).
Для изучения ингибирующих свойств индивидуальных
соединений и их смесей использовали волюмометрический метод.
В качестве субстратов окисления применяли метиллинолеат (МЛ).
Липиды окисляли в присутствии триметилцетиламмоний бромида,
применяемого в качестве ПАВ, и хлорида меди (II) как инициатора
окисления, добавляемых в количестве 110-3 М и 210-3 М соответственно. Температура опытов составляла 60С. Эффективность
действия добавок оценивали по разнице значений периодов индукции
(τ) и скорости окисления (W) модельного субстрата в отсутствие
(контроль) и в присутствии добавок изучаемых веществ. Совместное
действие компонентов смеси оценивали по значению разности
периодов индукции окисления в присутствии смеси и простой суммы
126
VO2, см3
индивидуальных компонентов (Δτ=τΣ - i.) или выражали в процентах
(/i)100 %.
С целью прогнозирования антиоксидантной активности
препарата изучено влияние отдельных его компонентов на окисление
модельного субстрата. Установлено, что эффект аскорбиновой
кислоты на каталитическое окисление МЛ зависит от концентрации
и соотношения с катализатором. Добавки (1—10)×10-6 М аскорбиновой кислоты, соответствующие ее отношению с катализатором
как 1:2000 и 1:200, вызывают ускорение процесса без изменения
характера кинетических кривых (КК), при этом максимальная скорость
процесса составляла (2,95—3,14)  10-4 Мс-1 (контроль МЛ 2,6
10-4 Мс-1). Вероятно, при избытке катализатора аскорбиновая кислота
образует с ним комплексные соединения, катализирующие процесс
окисления. В ряде работ показан прооксидантный эффект
аскорбиновой кислоты. Известно, что аскорбиновая кислота является
восстановителем и при ее избытке может происходить восстановление
каталитически активной формы Cu2+ в неактивную Cu1+, что приводит
к торможению процесса.
1
2
25
3
4
20
15
5
10
6
5
0
0
50
100
150
200
t, мин
Рисунок 5.1. Кинетические кривые каталитического окисления МЛ
в водно-липидной среде в присутствии добавок аскорбиновой
кислоты, М: 1 — 1×10-6, 2 — 1×10-5, 3 — контроль, 4 — 1×10-3,
5 — 5×10-2, 6 — 1×10-1; CuCl2 2×10-3 М, t=600 C
127
VO2, см3
1
3
2
20
4
15
56
7
10
5
0
0
50
100
150
200
250
300
t, мин
Рисунок 5.2. Кинетические кривые каталитического окисления МЛ
в водно-липидной среде в присутствии добавок экстракта
элеутерококка, %: 1 — контроль, 2 — 0,0075, 3 — 0,025, 4 — 0,125,
5 — 0,75, 6 — 1,25, 7 — 2,5; CuCl2 2×10-3 М, t=600C
VO2, см3
60
1
2 3
50
4
40
30
20
10
0
0
50
100
150
200
250
300
350
t, мин
Рисунок 5.3. Кинетические кривые каталитического окисления МЛ
в водно-липидной среде (1 — контроль) в присутствии добавок:
7,5×10-4 М аскорбиновой кислоты (2); 0,025 % экстракта
элеутерококка (3) и их смеси в тех же концентрациях (4);
CuCl2 2×10-3 М, t=600 C
128
В нашем эксперименте концентрации аскорбиновой кислоты,
расположенные в диапазоне (1×10-4—1×10-1) М, существенно
замедляли процесс (рис. 5.1). При этом значительно снижалась
максимальная скорость окисления (3,35—9,60) 10-5 Мс-1, что связано
со способностью аскорбиновой кислоты разрушать гидропероксиды
с образованием молекулярных продуктов.
Приведенные результаты показывают сложный характер
воздействия аскорбиновой кислоты на процесс окисления: проявление
каталитического действия и возможность ингибирования окисления.
На основании экспериментальных данных были выбраны и использованы количества аскорбиновой кислоты, не обладающие
инициирующим действием (7,5×10-4 М).
Это позволило описать действие бинарных концентраций
аскорбиновой кислоты с суммой действующих веществ элеутерококка.
Экстракт элеутерококка представляет собой гликозиды
по спиртовому или фенольному гидроксилу производных полициклических или ароматических углеводородов. Добавки экстракта
элеутерококка при окислении модельного субстрата (0,025—0,125 %)
воздействуют как типичные ингибиторы, тормозят начальные стадии
при сохранении максимальной скорости (Рис. 5.2). Увеличение
добавок экстракта (0,75—2,5 %) приводило к изменению формы КК:
существенно снижалась начальная скорость окисления (3,40—4,20) 
10-5 Мс-1. За наблюдаемый период времени процесс не выходил
на максимальную скорость окисления, описанную для малых
концентраций.
Таблица 5.1.
Результаты исследования антиоксидантных свойств аскорбиновой
кислоты (АК), экстракта элеутерококка (ЭЭ) и их смесей
Состав
С(АО)
-4
АК
7,5×10 М
АК
ЭЭ
ЭЭ
ЭЭ
АК
ЭЭ
АК
2,5×10-3 М
0,025 %
0,125 %
0,75 %
7,5×10-4 М
0,01 %
7,5×10-4 М
инд
AO,
мин
29
42
40
76
80
29
25
29
i,
,
(/
 i )
100%
мин
Σ, мин
мин
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
54
115
61
113,0
69
180
111
160,9
129
ЭЭ
АК
ЭЭ
АК
ЭЭ
АК
ЭЭ
0,025 %
7,5×10-4 М
0,125 %
7,5×10-4 М
0,25 %
7,5×10-4 М
0,75 %
40
29
76
29
85
29
80
105
210
105
100,0
114
220
106
93,0
109
205
96
88,1
180
160
i / i  100 %
140
120
100
80
60
40
20
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
С(АО), %
Рисунок 5.4. Зависимость эффекта синергизма в композиции
аскорбиновая кислота и экстракт элеутерококка
от концентрации ЭЭ, %; С(АК) = const = 7,510-4 M,
субстрат окисления – МЛ, Wi = 1,9×10 М×с-1, t = 600 C
Изучали совместное действие экстракта элеутерококка
в концентрациях (0,025—0,75) % с аскорбиновой кислотой. При исследовании бинарных смесей аскорбиновой кислоты и экстракта
элеутерококка было установлено проявление эффекта синергизма
в их совместном действии. Периоды индукции, обеспечиваемые
смесью веществ, значительно превышали простую сумму периодов
индукции каждого компонента (аддитивное действие).
Так, величина периода индукции в присутствии индивидуальной
аскорбиновой кислоты (С(АО) = 7,5×10-4 М) составляет 29 мин.,
для добавок экстракта элеутерококка (0,025 %) он равнялся 40 мин.,
бинарная смесь эффективно ингибировала окисление и обеспечивала
130
период индукции, равный 180 мин. (рис. 5.3). Эффект синергизма
составлял 160,9 % (рис. 5.4, табл. 5.1).
Механизм эффекта синергизма, установленного в совместном
действии экстракта элеутерококка и аскорбиновой кислоты, связан
с возможностью регенерации феноксильных радикалов, образующихся
при окислении природных фенолов элеутерококка, вновь включающихся в процесс окисления в качестве ловушки свободных
радикалов, ведущих процесс окисления.
Выводы:
1. Диапазоны оптимальных концентраций для экстракта
элеутерококка
и
аскорбиновой
кислоты,
соответствующие
максимальной эффективности антиоксидантной смеси, составляли
(0,025—0,25) % и (2—8)  10-4 М соответственно.
2. Обнаруженный эффект синергизма в сочетанном действии
фенольных соединений элеутерококка и аскорбиновой кислоты может
иметь перспективы практического применения для стабилизации
окисления природных липидов, фармацевтических препаратов,
косметических средств.
131
ГЛАВА 6.
КИНЕТИКА ОКИСЛЕНИЯ МЕТИЛОЛЕАТА
В ПРИСУТСТВИИ НОВЫХ ПРОИЗВОДНЫХ
САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ
В
Новосибирском
институте
органической
химии
им. Н.Н. Ворожцова СО РАН на базе структуры осалмида
(N-(4-гидроксифенил)-2-гидроксибензамида) была синтезирована
группа замещенных амидов и сульфида салициловой кислоты,
имеющих в орто-положении экранирующие трет-бутильные
заместители. Показано, что амиды салициловой кислоты в процессе
окисления
действуют
по
двум
механизмам:
реагируют
с пероксильными радикалами с константой скорости реакции, равной
K7=(0,52—6,86)104 М-1×с-1, и разрушают гидропероксиды с образованием молекулярных продуктов.
Производные салициловой кислоты нашли широкое применение
в медицине в качестве жаропонижающих, противовоспалительных,
анальгезирующих, противомикробных, антисептических средств.
В сельском
хозяйстве
производные
салициловой
кислоты
стимулируют ризогенез, ускоряют развитие побегов, защищают клетки
растений от окислительного стресса, осуществляют противовирусную
защиту растений [3, 7, 39, 52, 85, 93, 199]. По результатам антиоксидантной активности ряда лекарственных препаратов, независимо
от спектра их фармакологического действия, было выявлено наиболее
эффективное соединение — осалмид. В Новосибирском институте
органической химии (НИОХ) им. Н.Н. Ворожцова СО РАН на базе
структуры осалмида направленным синтезом была получена группа
замещенных амидов салициловой кислоты, имеющих в ортоположении экранирующие трет-бутильные заместители. Ранее
сравнительный анализ ингибирующих свойств соединений с целью
выявления среди них активных антиоксидантов (АО) не проводился.
Представлялось актуальным изучить антиоксидантные свойства новых
амидов салициловой кислоты в зависимости от структуры, указать
перспективы дальнейшей химической модификации соединений
с рациональной комбинацией нескольких активных центров.
В настоящей главе исследована антирадикальная и антиоксидантная активность новых амидов салициловой кислоты в сравнении
с осалмидом и парацетамолом, а также с известными ингибиторами
окисления -токоферолом и дибунолом. В табл. 6.1 показаны формулы
исследуемых соединений, представляющих собой амидные производные салициловой кислоты. Большинство из указанных соединений
132
содержат орто-трет-бутильные заместители и являются пространственно затрудненными фенолами.
Методом хемилюминесценции (ХЛ) в группе исследуемых
соединений была оценена величина константы скорости реакции K7
АО с пероксильными радикалами [208].

RO2 + InH → ROOH + In,
где: InH — ингибитор окисления,
In — радикал ингибитора,
RO2— пероксильный радикал. Определен фактор ингибирования f, показывающий количество свободных радикалов, реагирующих с молекулой ингибитора (табл. 6.1). При исследовании
кинетики изменения интенсивности ХЛ в присутствии исследуемых
соединений было установлено, что все АО оказывают ингибирующее
действие на процесс окисления модельного субстрата. Показано,
что наибольшую активность в реакции с пероксильными радикалами
из производных салициловой кислоты проявляет осалмид (табл. 6.1),
высокая константа скорости реакции K7 которого обусловлена
наличием -р-сопряжения между амино-группой и фенолом. Анализ
значений констант скорости реакций K7 структур, отличающихся
степенью экранированности ОН-группы, показывает, что введение
экранирующих заместителей приводит к существенному снижению
антирадикальной активности АО (табл. 6.1). Сопоставление антирадикальной активности исследуемых нами аминофенолов, у которых
амино-группа находится на разном удалении от бензольного кольца,
показывает, что по мере удаления этих групп снижается возможность
--сопряжения и значение константы снижается вдвое (табл. 6.1).
Таблица 6.1.
Кинетические характеристики АО различного
химического строения
№
п/п
Название
АО
I
Парацетамол
(N-(4-гидроксифенил)ацетамид)
Формула
Соединения
К7104,
М-1с-1
f
4,00±0,13 2,4
133
Осалмид
(N-(4II гидроксифенил)2-гидроксибензамид)
3-трет-бутил-N(3,5-ди-третбутил-4III
гидроксифенил)2-гидрокси-5этилбензамид
N-[3-(3,5-дитрет-бутил-4гидроксифенил)IV
пропил]-2гидроксибензамид
6,86±0,15 2,4
1,69±0,04 2,6
0,52±0,02 3,3
3-трет-бутил-N[3-(3,5-дитрет-бутил-4V гидроксифенил)пропил]-2гидрокси-5этилбензамид
0,85±0,03 3,6
3-трет-бутил-N[3-(3,5-дитрет-бутил-4VI гидроксифенил)пропил]-2гидрокси-5-этилбензсульфид
0,74±0,02 4,5
-Токоферол
[2,5,7,8-тетраметил-2-(4,8,12VII
триметилтридецил)-6гидроксихроман)]
Дибунол
(1-гидрокси-2,6VIII
ди-трет-бутил4-метилбензол)
360±0,12
2,0
1,40±0,02 2,0
134
Таким образом, существует тесная взаимосвязь между значением
константы скорости реакции K7 и природой заместителя в параположении. Полученные нами данные о характере влияния
заместителей разной природы согласуются со сведениями, приводимыми в известных монографиях и обзорах [39, 85, 112,
203, 204, 259].
Сравнение констант скорости реакции K7 исследуемых фенолов и
-токоферола показывает, что основной природный АО более активен
в реакции с пероксильными радикалами (практически в 360 раз).
Стехиометрический фактор ингибирования f для большинства
изучаемых соединений был близок или равен 3 (табл. 6.1).
Эффективность антиоксиданта в значительной степени
определяется величиной константы скорости реакции K7 фенола
с пероксильными радикалами и зависит от энергии разрыва связи O-H
(DO-H), длины связи O-H, энергии активации Е7, от характера
заместителя в орто- и пара-положении [29]. Известно, что энергия
активации Е7 линейно возрастает с ростом прочности связи O-H
в фенолах, а введение в орто-положение трет-бутильных групп
приводит к снижению DO-H. Было замечено, что при равных значениях
DO-H некоторые неэкранированные фенолы более активны в реакции
с пероксильными радикалами, чем их экранированные аналоги [84],
что было связано с изменениями распределения электронной
плотности в ароматическом кольце. Показано, что чем длиннее связь
между атомами в молекуле, тем меньше её прочность.
При помощи компьютерной программы Current Gaussian 09
Revision D.01были рассчитаны длины связей между атомами
в молекулах изучаемых антиоксидантов, возможность образования
внутримолекулярной водородной связи (ВВС), дипольные моменты
и энергии активации молекул Еа (схема 6.1, табл. 6.2). Показано,
что длина связи O-H в ароматическом кольце А соединений больше,
чем длина связи O-H в кольце Б. Вероятно, что наиболее активными
группами O-H в реакциях с пероксильными радикалами являются
гидроксильные группы из кольца А. Введение трет-бутильного
заместителя в бензольное кольцо А увеличивает длину связи O-H
в соединениях. Длина ВВС между группами O-H...O = C уменьшается
с введением в орто-положение трет-бутильных заместителей
(табл. 6.2). Длина связи C-N в молекуле парацетамола составляет
1,37673×10-10 м. В молекулах амидов салициловой кислоты с увеличением заместителей в орто- и пара-положении длина связи C-N
изменяется от 1,36458×10-10 м (у осалмида) до 1,35994×10-10 м (у АО V).
Показано, что амиды (на примере осалмида) не образуют ВВС между
135
группами N-H ... O-H, по расчетам длина связи будет составлять
2,12221×10-10 м, а дипольный момент µ=3,3548 D, поэтому
существование такой молекулы не оптимально (схема 1). Длина связи
C-S у сульфида салициловой кислоты составляет 1,36001×10-10 м.
Таблица 6.2.
Расчетные параметры длины связей между атомами,
дипольного момента и энергии активации молекул
антиоксидантов при помощи компьютерной программы
Current Gaussian 09 Revision D.01
Длина
связи O–H
№ Название (бензольп/п
АО
ное
кольцо А),
×10-10 м
1
АО I
0,96604
2
АО II
0,98787
Длина
связи O–H
(бензольное кольцо
Б), ×10-10 м
0,96282
3
АО III
0,99792
0,96073
4
АО IV
0,99633
0,96117
5
АО V
1,00105
0,96115
6
7
АО VI
Дибунол
0,99134
0,96093
0,96116
-
Энергия
активации ДипольЕа
ный
молекулы момент,
АО,
µ, D
кДж/моль
-515,499693 2,1263
-782,6772869 2,6778
2,0732
1332,8884321
2,1775
1214,9407749
2,0449
1450,8413009
-1793,665124 2,5171
-661,3149206 1,8521
Длина
связи
O–H ...
O=C,
×10-10 м
1,67786
1,60562
1,63868
1,59062
1,59839
-
Таким образом, величина константы скорости реакции K 7
является важной характеристикой ингибирующего действия АО,
но наиболее полное представление об участии ингибитора в сложном
многостадийном процессе окисления можно получить только
на основании данных об антиокислительной активности соединения.
Известно, что для большинства синтетических АО имеет место
положительная корреляционная связь между концентрацией АО
и величиной периодов индукции. В последние годы показано,
что для ряда природных АО указанная зависимость может отклоняться
от прямолинейности в области высоких концентраций [156, 215, 239].
В связи с этим для исследуемых АО считали важным изучить характер
изменения брутто-эффективности от их содержания в субстрате.
136
Схема 6.1. Длины связей между атомами в молекуле осалмида
Ингибирующее действие всех указанных соединений тестировалось в широком диапазоне концентраций (5,010-5 —2,510-3 М)
и сравнивалось с действием известных АО — дибуном, -токоферолом. Было показано, что исследуемые АО увеличивают периоды
индукции окисления модельного субстрата МО. На рис. 6.1 приведены
кинетические кривые окисления МО в присутствии равных
концентраций различных АО. Для всех синтетических антиоксидантов
наблюдалась линейная зависимость между периодом индукции
и концентрацией. Из рис. 6.2 видно, что периоды индукции при инги137
бировании α-токоферола нарастают до концентрации 2,510-3 М,
свыше которой происходит постепенное снижение эффективности
торможения процесса. Этот факт объясняется, по всей вероятности,
различиями в активности феноксильных радикалов АО разного
строения. Известно, что пространственно незатрудненные феноксилы
проявляют высокую активность в побочных реакциях продолжения
цепей, приводящих к снижению действия АО [204].
Показано, что у осалмида антиоксидантная активность по сравнению с парацетамолом снижается в 2 раза, а брутто-ингибирующая
активность пространственно замещенных фенолов выше практически
в 2 раза пространственно незатрудненных АО (табл. 6.3). При этом
осалмид, имеющий высокое значение константы скорости реакции K7
взаимодействия с пероксильными радикалами, проявляет наименьшую
антиоксидантную активность, что обусловлено отсутствием
в его структуре экранирующих трет-бутильных заместителей.
Осалмид образует достаточно активные феноксильные радикалы (In),
которые участвуют в реакциях продолжения цепей с молекулами
субстрата (RH): In + RH  R + InH.
Сопоставление между собой ряда структур: амидов салициловой
кислоты (III, IV, V) (табл. 6.3) показывает, что разделение между собой
тремя метиленовыми группами амидного и фенольного фрагментов
молекулы приводит к повышению брутто-ингибирующего действия
АО. Очевидно, этот эффект связан с отсутствием -р-сопряжения
между амино-группой и бензольным ядром. В литературе были
получены аналогичные закономерности для других групп соединений
[112, 123]. Было установлено, что структуры (IV, V, VI) близки
по своему антиоксидантному действию (табл. 6.3).
Показано, что ОН-группа, расположенная в орто-положении
к карбоксильной СООН-группе, независимо от степени ее экранирования, не вносит существенного вклада в эффективность
ингибирования (табл. 6.3). На основании полученных данных можно
рекомендовать осуществление синтеза потенциальных АО, у которых
экранированная фенольная ОН-группа должна находиться в параположении к амидной группе, что исключит возможность образования
внутримолекулярной водородной связи. Направленный синтез
указанных соединений позволит создать новую группу высокоэффективных ингибиторов окисления.
Легко заметить, что ингибиторы «гибридной» структуры либо
близки (II,III), либо превосходят (I, IV, V, VI) по своему действию
природный АО - -токоферол, а структуры (I, V, VI) соизмеримы
с эффективностью дибунола (табл. 6.3, рис. 6.1, 6.2).
138
3
Vo2,MM
1
5
34
2
7
120
6
8
100
80
60
40
20
0
0
100
200
300
400
500
600
700
t , мин.
, мин.
Рисунок 6.1. Кинетические кривые поглощения кислорода МО в
среде хлорбензола в присутствии АО: 1 — контроль, 2 — токоферол, 3 — дибунол, 4 — АО (III), 5 — АО (IV), 6-АО (V), 7 —
АО (II), 8 — АО (I); С(АО) = 210-4 М, Wi=4,210-8 Мc-1, t = 600 С.
Номер антиоксиданта соответствует табл. 6.1
1 2
3,4
1200
5
6
1000
7
800
600
400
200
0
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
4
С (АО) х 10 , М
Рисунок 6.2. Зависимость периодов индукции от концентрации АО:
1 — АО (I), 2 — дибунол, 3 — АО (V), 4 — АО (IV), 5 — АО (III),
6-АО (II), 7 — -токоферол; Wi=4,210-8 Мc-1, t = 600 С.
Номер антиоксиданта соответствует табл. 6.1
139
Таблица 6.3.
Кинетические параметры инициированного окисления
метилолеата в присутствии различных концентраций
исследуемых антиоксидантов Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 С
W o2 нач 10-7, W o2 max 10-7, W o2 max MO
№ С (АО) 10-4,
 инд,
п/п
W o2 max AO
М
мин
Mc-1
Mc-1
0
Метилолеат
1
0
26
1,90
8,00
—
I
Парацетамол
2
1
130
0,65
1,40
5,7
3
2
220
0,57
1,30
6,2
4
4
425
0,50
1,16
6,9
5
6
625
0,31
0,66
12,1
6
8
820
0,21
0,30
26,7
7
10
1030
0,20
0,28
28,6
II
Осалмид
8
1
50
1,24
3,10
2,6
9
2
110
1,06
2,19
3,7
10
4
200
0,76
1,98
4,0
11
6
300
0,62
1,30
6,2
12
8
410
0,46
1,18
6,8
13
10
500
0,37
1,12
7,1
3-трет-бутил-N-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-2III
гидрокси-5-этилбензамид
14
1
150
1,06
7,14
1,1
15
2
200
0,62
4,60
1,7
16
4
280
0,47
3,40
2,4
17
6
420
0,32
3,39
2,4
18
8
500
0,29
3,26
2,5
19
10
620
0,27
2,38
3,4
N-[3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-пропил]-2IV
гидроксибензамид
20
1
150
1,76
3,72
2,2
21
2
240
0,83
3,26
2,5
22
4
370
0,73
3,12
2,6
23
6
540
0,61
2,87
2,8
24
8
710
0,52
2,46
3,3
25
10
890
0,35
2,11
3,8
140
V
26
27
28
29
30
31
VI
32
33
34
35
36
37
VII
38
39
40
41
42
VIII
43
44
45
46
47
3-трет-бутил-N-[3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил]-2-гидрокси-5-этилбензамид
1
150
1,73
3,65
2,2
2
240
0,64
3,24
2,5
4
380
0,48
3,10
2,6
6
550
0,33
2,84
2,8
8
720
0,31
2,26
3,5
10
900
0,27
2,05
3,9
3-трет-бутил-N-[3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил]-2-гидрокси-5-этилбензсульфид
1
160
1,70
3,60
2,0
2
230
0,61
3,30
2,4
4
390
0,46
3,06
2,6
6
560
0,30
2,85
2,8
8
730
0,28
2,24
3,5
10
910
0,26
2,01
3,8
Дибунол (ионол)
2
190
0,68
6,3
1,3
4
380
0,69
6,2
1,3
6
570
0,67
6,4
1,3
8
750
0,68
6,1
1,3
10
950
0,69
6,3
1,3
-Токоферол
2
160
0,78
6,5
1,2
4
280
0,76
6,4
1,2
6
400
0,77
6,5
1,2
8
500
0,76
6,3
1,2
10
600
0,76
6,4
1,2
В работе была проанализирована закономерность изменения
начальной (Wo2нач) и максимальной (Wo2max) скорости окисления
в присутствии различных концентраций изучаемых АО. Изучение
показало, что указанные кинетические параметры практически
не изменяются с ростом концентрации дибунола и α-токоферола,
но существенно уменьшаются при введении ингибиторов, содержащих
амидную группу (табл. 6.3). По всей вероятности, выявленная закономерность связана с участием амидных производных салициловой
кислоты в реакции нерадикального разрушения гидропероксидов.
Для подтверждения гипотезы о возможном разрушении
гидропероксидов под действием гибридных АО были проведены
эксперименты по прямому тестированию кинетики накопления
гидропероксидов (ROOH) после введения в частично окисленную
линолевую кислоту (ЛК) каждого из исследуемых АО (рис. 6.3).
141
Из рис. 6.3 видно, что влияние всех АО было однотипным: после
внесения ингибитора в течение первого часа наблюдалось снижение
концентрации гидропероксидов практически до исходного уровня,
который в дальнейшем не возрастал в течение всего периода
наблюдений (8 часов). В контроле пероксиды продолжали накапливаться. По масштабу разрушения гидропероксидов исследуемые АО
были сравнимы между собой, однако у парацетамола указанные
свойства были наиболее выражены. Установлено, что все исследуемые
соединения способствуют разрушению гидропероксидов на 70—75 %
(табл. 6.4).
1
г.I2/100 г.липидов
0,35
0,30
0,25
Вброс АО
0,20
0,15
2
3 4
0,10
5
0,05
0,00
200
300
400
500
600
700
800
t , мин.
Рисунок 6.3. Кинетика накопления гидропероксидов при
аутоокислении линолевой кислоты в присутствии равных
концентраций АО: 1 — контроль, 2 — АО(III), 3 — АО (V), (VI),
4 — АО (II), 5 — АО (I). Стрелкой показан вброс АО.
С (АО)=соnst=210-4 M, t=600 C. Номер антиоксиданта
соответствует табл. 6.1.
Следовательно, изучаемые соединения в процессе окисления
способны как эффективно уничтожать пероксильные радикалы,
так и разрушать гидропероксиды молекулярным путем. Вероятно,
что антирадикальная
активность
ингибиторов
обусловлена
присутствием в их химической структуре фенольного гидроксила,
а способность разрушения гидропероксидов связана с наличием
амидной группы.
142
Таблица 6.4.
Кинетика разрушения гидропероксидов при аутоокислении
линолевой кислоты в присутствии равных концентраций АО
С (АО)=соnst=210-4M, t=600 C. Номер антиоксиданта соответствует
табл. 6.1.
№
п/п
Антиоксидант
WROOH  10-4,
гI2/100г лип. с-1
1
2
3
4
5
6
7
ЛК (контроль)
АО (I)
АО (II)
АО (III)
АО (IV)
АО (V)
АО (VI)
5,52
4,50
3,81
3,33
3,42
3,48
3,45
Процент
разрушения ROOH
за 7 часов
—
75,4
72,9
71,7
71,9
72,2
72,0
Полученные результаты могут служить методологической
основой для оценки комплексного действия антиоксидантов,
перспективных для стабилизации окисления пищевых и биологически
активных липидов, лекарственных препаратов, косметических средств.
Исследуемые АО малотоксичные и могут использоваться в медицине,
косметологии, пищевой технологии.
Выводы:
1. Изучена
кинетика
окисления
модельного
субстрата
в присутствии новых перспективных производных салициловой кислоты.
Показано, что парацетамол, все амиды и сульфид салициловой кислоты
(I—VI) эффективно тормозят процесс окисления метилолеата.
2. Хемилюминесцентным методом определены значения
констант скорости реакции K7 антиоксидантов (I—VI) с пероксильными радикалами (0,52—6,86)×104 М-1с-1.
3. Установлено, что введение экранирующих орто-третбутильных заместителей и разделение ароматических фрагментов тремя
метиленовыми группами приводит к увеличению антиоксидантной
активности соединений.
4. Показано, что введение экранирующих орто-третбутильных заместителей приводит к уменьшению в четыре раза
значений констант скорости реакции K7 с антиоксидантами,
а разделение ароматических фрагментов тремя метиленовыми
группами в два раза.
143
5. Установлена способность
производных салициловой
кислоты (II—VI) и парацетамола (I) при аутоокислении линолевой
кислоты разрушать гидропероксиды до 70—75 % без образования
свободных радикалов.
6. На основе полученных данных можно рекомендовать
осуществление синтеза потенциальных антиоксидантов, у которых
экранированная фенольная ОН-группа должна находиться в параположении к амидной группе, что исключит возможность образования
внутримолекулярной водородной связи.
144
ГЛАВА 7.
АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ МЕКСИДОЛА
И БИС-[3-(3,5-ДИ-ТРЕТ-БУТИЛ-4ГИДРОКСИФЕНИЛ)ПРОПИЛ]ДИСУЛЬФИДА
(СТАБИЛИЗАТОРА СО-4)
В СОСТАВЕ СИНЕРГИЧЕСКИХ СМЕСЕЙ
В модельной системе инициированного окисления метилолеата
изучена антиоксидантная активность производных 3-гидроксипиридина: мексидола и эмоксипина в сравнении со стандартными
антиоксидантами -токоферолом и дибунолом. Установлен линейный
характер зависимости ингибирующего действия от концентрации
исследуемых соединений. Выявлена способность антиоксидантов
разрушать гидропероксиды молекулярным путем. Впервые описаны
эффекты совместного ингибирующего действия бинарных смесей
мексидола с серосодержащим фенолом - гомологом тиофана - бис-[3(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил]дисульфидом
(стабилизатор СО-4) и -токоферолом, достигающие 25—75 %.
В последнее время проводится широкий поиск и тестирование
эффективности новых ингибиторов окисления, а также их смесей.
Производным 3-гидроксипиридина [163, 210] как ингибиторам
свободнорадикального окисления липидов уделяется большое
внимание в клинике и эксперименте. Эмоксипин применяется
в офтальмологии как ретинопротектор, используется при лечении
гипертонии и ишемической болезни сердца, бронхолегочной
патологии [58, 67, 96, 223]. Мексидол широко применяют при лечении
острого панкреатита, рака яичников, ишемии мозга, различных видов
гипоксии [115, 211, 214, 250]. Для ингибирования окисления пищевых
и косметических масел, жировых основ фармацевтических препаратов
широко используют синергические композиции, которые могут
состоять из нескольких ингибиторов окисления, взаимно усиливающих действие друг друга, либо включать антиоксидант (АО)
и вещество — синергист. Последний, как правило, не проявляет
самостоятельно ингибирующего действия, но в его присутствии
эффективность ингибитора значительно возрастает. Ассортимент
нетоксичных антиоксидантов в последнее время значительно
увеличивается. Несмотря на широкое применение производных
3-гидроксипиридина: мексидола и эмоксипина в клинической
практике, где их использование давало хороший лечебный эффект,
механизм антиоксидантного действия этих соединений мало изучен.
145
Серосодержащие фенолы вызывают также большой интерес
благодаря их способности эффективно тормозить окисление
по нескольким механизмам — реагировать с пероксильными радикалами и разрушать гидропероксиды с образованием молекулярных
продуктов [112, 193]. Известно, что эндогенная сера входит в состав
аминокислот: метионина, цистеина, цистина; в состав активных
центров ферментов: СоА, СОД, цитохромов; в состав гормонов:
инсулина, окситоцина и др. В окислительно-восстановительных
процессах клетки большая роль принадлежит серосодержащим
соединениям.
Тиофан — препарат новейшей отечественной разработки,
полифункциональный антиоксидант, обладающий противоопухолевым, мембраностабилизирующим, цитопротекторным действием,
и может использоваться для купирования цитотоксических эффектов
в тканях при токсическом гепатите, противоопухолевой химиотерапии.
В Новосибирском институте органической химии им. Н.Н. Ворожцова
СО РАН (НИОХ СО РАН) синтезирован гомолог тиофана — бис-[3(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропил]дисульфид
(стабилизатор СО-4) [194]. Это соединение не обладает местным
и общетоксическим действием, не оказывает влияние на эмбриогенез
и развитие потомства, что позволяет использовать его в лечебной
практике [57, 101, 112, 212, 225]. Мексидол и эмоксипин синтезированы
в
Институте
биохимической
физики
(ИБХФ)
им. Н.М. Эмануэля РАН. СО-4 синтезирован в НИОХ СО РАН.
В табл. 7.1. представлены формулы исследуемых соединений.
Мексидол и эмоксипин представляют собой сукцинат и гидрохлорид
2-этил-6-метил-3-гидроксипиридина соответственно. В структуре
СО-4 дисульфид зеркально удален цепочкой из трех углеводородных
атомов от ароматической системы.
Таблица 7.1.
Кинетические характеристики АО различного
химического строения
№
п/п
Название АО
Формулы АО
Эмоксипин
(2-этил-6-метил-3гидроксиI
пиридина
гидрохлорид)
146
K7104,
М-1с-1
f
0,61
2,0
II
III
IV
V
Мексидол
(2-этил-6-метил-3гидроксипиридина
сукцинат)
СО-4
(бис-[3-(3,5-дитрет-бутил-4гидроксифенил)
пропил]
дисульфид)
Дибунол
(1-гидрокси-2,6ди-трет-бутил-4метилбензол)
-Токоферол
[2,5,7,8-тетраметил-2-(4,8,12триметилтридецил)-6гидроксихроман)]
2,80
2,0
1,30
3,8
1,40
2,0
360,00
2,0
Методом хемилюминесценции (ХЛ) определена константа
скорости элементарной реакции АО с пероксильными радикалами K 7
и f-фактор ингибирования, показывающий количество свободных
радикалов, реагирующих с молекулой ингибитора (реакция (7),
общепринятая схема [208]):
7
RO2 + InH → ROOH + In
(7),
где: InH — ингибитор окисления;
In — радикал ингибитора;
RO2— пероксильный радикал.
Ранее антиоксидантные свойства СО-4 и мексидола были
показаны в нашей работе [183]. Установлено, что для стандартного
антиоксиданта α-токоферола (α-ТФ) величина константы скорости
реакции K7 с пероксильными радикалами была в 250 раз выше,
чем для СО-4 и дибунола, в 130 раз для мексидола, в 590 раз
для эмоксипина. Стехиометрический коэффициент ингибирования f
для СО-4 был близок к 4, для мексидола, эмоксипина, дибунола
и α-токоферола он равнялся 2 (табл. 7.1). Таким образом, на молекуле
СО-4 погибают в среднем 4 свободных радикала. Высокое значение f
обусловлено наличием в молекуле двух реакционных центров,
147
взаимодействующих независимо друг от друга. Полученные нами
результаты согласуются с литературными данными [135]. Известны
константы скорости реакции K7=4,5×104 М-1×с-1 и K7=14,0×104 М-1×с-1
для эмоксипина и мексидола соответственно, при этом мексидол был
также эффективнее эмоксипина.
Все исследуемые соединения увеличивали периоды индукции
окисления модельного субстрата метилолеата (МО). На рис. 7.1
приведены кинетические кривые окисления МО в присутствии равных
концентраций различных АО. Видно, что с добавками СО-4
и мексидола значительно снижалась максимальная скорость окисления
по сравнению с контролем. При концентрации соединений 1×10 -3 М
максимальная скорость окисления уменьшается в 1,3, в 2,1 и в 8,3 раза
в присутствии СО-4, эмоксипина и мексидола соответственно.
Для -токоферола и дибунола снижение максимальной скорости
процесса окисления не наблюдалось (табл. 7.2). Можно полагать,
что СО-4 и производные 3-гидроксипиридина способны разрушать
гидропероксиды по молекулярному механизму. Антиоксидантная
активность мексидола превышала в 2 раза эффективность эмоксипина
благодаря присутствию в его молекуле янтарной кислоты, которая
является антиоксидантом и синергистом ингибиторов окисления [58, 119],
что послужило причиной выигрыша в периодах индукции.
1
VO2, мм3
140
2
3
5
6
4
120
100
80
60
40
20
0
0
50
100
150
200
250
300
t, мин
Рисунок 7.1. Кинетические кривые поглощения кислорода МО
в среде хлорбензола в присутствии АО: 1 — контроль,
2 — эмоксипин, 3 — мексидол, 4 — -токоферол, 5 — дибунол,
6 — СО-4. С (АО) = const = 110-4 М, Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 С
148
, мин
1
1200
4
2
3
1000
800
600
5
400
200
0
0
5
10
15
20
25
30
-4
С (АО) х 10 М
Рисунок 7.2. Зависимость периодов индукции от концентрации АО:
1 — СО-4, 2 — дибунол, 3 — -токоферол, 4 — мексидол,
5 — эмоксипин. Wi=4,210-8 Мc-1, t=600 С
В последние годы установлено, что для ряда природных АО
прямо пропорциональная зависимость периодов индукции от концентрации соединений проявляется лишь в области малых доз, с ростом
концентрации АО возможно снижение эффективности [156, 215, 217].
В связи с этим для исследуемых АО важно изучить характер
изменения величины периода индукции от их содержания в субстрате.
Изучение ингибирующего действия АО проводили в широком
диапазоне концентраций. Показано, что для дибунола, СО-4,
мексидола и эмоксипина период индукции возрастал прямо пропорционально их концентрации в модельной системе, тогда как для
-токоферола эта зависимость носила экстремальный характер,
описанный в литературе [215] и воспроизведенный в нашей работе
(рис. 7.2). Максимум кривой в условиях наших опытов отмечался
при концентрации 2,5×10-3 М. Антиоксидантная активность мексидола
соизмерима с активностью α-токоферола и выше в 2,2 раза
эффективности эмоксипина. СО-4 тормозил процесс окисления
и превосходил по своему действию сильный реперный ингибитор
дибунол. Из рис. 7.2 видно, что в равных концентрациях СО-4 обеспечивал более высокие периоды торможения, чем дибунол и α-токоферол. Таким образом, удаление дисульфидной группы от бензольного
149
кольца, отсутствие π-ρ-сопряжения, увеличивало эффективность СО-4.
Вероятно, различные фрагменты молекулы действовали по разным
механизмам.
Для проверки гипотезы по разрушению гидропероксидов
антиоксидантами была изучена кинетика их накопления при аутоокислении МО. В определенный момент в достаточно окисленный
субстрат вводили АО в концентрации 2×10 -4 М. Как видно из рис. 7.3,
в течение первого часа концентрация гидропероксидов снижалась
и в течение восьми часов оставалась на низком уровне, тогда
как в контрольном
эксперименте
гидропероксиды
продолжали
накапливаться. Было установлено, что СО-4, мексидол и эмоксипин
разрушали гидропероксиды на 44,4 %, 19,7 % и 17,5 % соответственно.
Наиболее эффективным разрушителем гидропероксидов
Таблица 7.2.
Кинетические параметры окисления МО в присутствии
различных концентраций исследуемых АО, Wi= 4,210-8 Мc-1,
t=600 С
№ С(АО) 
п/п 10-4, М
0
1
I
2
3
4
5
6
II
7
8
9
10
11
III
12
13
14
15
16
 инд,
мин
Wo2 нач. 
10-7, Mc-1
0
26
1,9
2
4
6
8
10
45
65
110
160
180
1,8
1,7
1,6
1,5
1,5
2
4
6
8
10
110
180
250
320
400
1,1
0,9
0,8
0,7
0,6
2
4
6
8
10
240
500
660
900
1100
1,8
1,6
1,4
1,0
0,9
Wo2 max. 
10-7, Mc-1
Метилолеат
8,0
Эмоксипин
7,1
5,8
4,3
4,0
3,9
Мексидол
4,3
2,5
2,9
1,4
0,9
СО-4
12,1
6,5
6,6
6,6
6.1
150
АОА=
Wo2 мак. MO
Wo2мак. МО+AO
i-S /S
—
—
1,1
1,4
1,9
2,0
2,1
1,7
2,5
4,2
6,2
6,9
1,8
3,2
2,8
5,7
8,3
4,2
6,9
9,6
12,3
15,4
0,6
1,2
1,2
1,2
1,3
9,2
19,2
25,4
34,6
42,3
IV
17
18
19
20
21
V
22
23
24
25
26
2
4
6
8
10
190
380
570
750
950
0,7
0,7
0,7
0,7
0,7
2
4
6
8
10
160
280
400
500
600
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
Дибунол
6,3
6,2
6,4
6,1
6,3
-Токоферол
6,5
6,4
6,5
6,3
6,4
1,3
1,3
1,3
1,3
1,3
7,3
14,6
21,9
28,9
36,5
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
6,2
10,8
15,4
19,2
23,1
являлся СО-4. Таким образом, благодаря своей «гибридной» структуре
АО действовали по двум механизмам: уничтожали пероксильные
радикалы и разрушали гидропероксиды молекулярным путем.
1
г I2 / 100 г липидов
0,7
2
3
0,6
Ввод АО
0,5
0,4
4
0,3
0,2
0
100
200
300
400
500
600
700
t , мин
Рисунок 7.3. Кинетика накопления и разрушения гидропероксидов
при аутоокислении МО в присутствии равных концентраций АО:
1 — контроль, 2 — эмоксипин, 3 — мексидол, 4 — СО-4.
Стрелкой показан ввод АО. С (АО)=соnst=210-4 M, t=600 C
151
80
а
i / add  100 %
60
40
20
0
0
2
4
6
8
-20
10
-4
С(АО)  10 , М
-40
-60
50
б
i / add  100 %
40
30
20
10
0
0
2
4
6
-10
8
10
-4
С(АО)  10 , М
-20
Рисунок 7.4. а) Зависимость эффекта синергизма в композиции
-ТФ + СО-4 от концентрации СО-4, С(-ТФ) = const = 2,510-4 M,
Wi= 4,210-8 Мc-1, t = 600 C. б) Зависимость эффекта синергизма
в композиции мексидол + СО-4 от концентрации СО-4,
С(мексидола) = const = 110-4 M, Wi= 4,210-8 Мc-1, t = 600 С
152
Синтетические АО широко используются для стабилизации
систем, содержащих природные ингибиторы, например α-токоферол.
Поэтому следующим этапом было изучение механизма совместного
действия СО-4 и α-токоферола, установление оптимальных
их концентраций, обеспечивающих максимальный ингибирующий
эффект. В связи с этим была изучена эффективность бинарной смеси
АО в сравнении с их прогнозируемым аддитивным эффектом,
проявляющимся при использовании соединений порознь. Изучена
зависимость изменения величины эффекта синергизма от концентрации каждого из компонентов смеси. Так, оптимальная область
концентраций СО-4 соответствует интервалу (1,5—2,0)×104 М.
Таблица 7.3.
Зависимость величины синергического эффекта от концентрации
-8
-1
α -токоферола и СО-4, субстрат окисления МО, Wi= 4,210 Мc , t
0
= 60 С
№ С(АО)10-4,
п/п
М
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
инд AO, i, мин
мин
Σ, мин
,мин
(/i)
100 %
0,25
2,50
5,00
7,50
10,00
15,00
С (СО-4) = const = 110-4 М, инд = 130 мин
60
190
230
40
160
290
510
220
350
480
970
490
450
580
1200
620
600
730
1210
480
800
930
980
50
21,1
75,9
102,1
106,9
65,8
5,4
0,10
1,00
2,00
4,00
6,00
8,00
С (α-ТФ) = const = 2,510-4 М, инд = 160 мин
75
235
280
45
130
290
510
220
240
400
710
310
500
660
870
210
760
920
710
210
900
1060
690
370
19,1
75,9
77,5
31,9
-22,8
-34,9
При этих концентрациях СО-4 обеспечивает наибольший
синергический эффект (65—75 %). Величина синергизма увеличивается с ростом концентрации α-токоферола в смеси (рис. 7.4 а,
табл. 7.3).
Механизм совместного действия компонентов бинарной смеси,
вероятно, сводится к следующему. Константа скорости K7
для α-токоферола (Ph1OH) имеет высокое значение, а антирадикальная
153
активность пространственно затрудненного СО-4 (Ph2OH) существенно ниже. При окислении α-токоферола образуются активные
токофероксильные радикалы [40, 271, 359], а при окислении экранированных фенолов — неактивные феноксилы [88, 89, 204]. На первых
стадиях окисления преимущественно расходуется более активный
ингибитор, а образующиеся токофероксилы быстро обмениваются
атомом водорода с экранированным фенолом по реакции: Ph 1O +
Ph2OH ↔ Ph1OH + Ph2O. Восстановленная форма более активного АО
способна вновь обрывать цепи окисления по реакции: Ph1OH + RO2 →
ROOH + Ph1O. Феноксилы Ph2O малоактивны и в дальнейшем
цепном процессе практически не участвуют.
Таблица 7.4.
Зависимость величины синергического эффекта от концентрации
АО в смесях СО-4 и мексидола, субстрат окисления МО.
Wi= 4,210-8 Мc-1, t = 600 С
№ С(АО)10-4 ,
п/п
М
инд AO, i , мин Σ ,мин
мин
,мин
(/i)
100%
С (СО-4) = const = 110-4 М, инд = 130 мин
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
1,0
2,0
5,0
7,0
8,0
10,0
16,0
20,0
25,0
30,0
35,0
60
110
220
280
320
400
650
800
950
1100
1300
190
240
350
410
450
530
780
930
1080
1230
1430
270
360
540
680
710
840
1230
1460
1680
1910
2210
12
13
14
15
16
17
18
С (мексидол) = const = 110-4 М, инд = 60 мин
0,5
80
140
160
20
1,0
130
190
270
80
2,0
240
300
430
130
4,0
500
560
740
180
5,0
580
640
720
80
7,0
800
860
790
-70
10,0
1100
1160
980
-180
154
80
120
190
270
260
310
450
530
600
680
780
42,1
50,0,
54,3
65,9
57,8
58,5
57,7
57,0
55,6
55,3
54,6
14,2
42,1
43,3
24,3
11,1
-8,9
-18,4
Впервые была изучена эффективность совместного действия
бинарных смесей СО-4 и мексидола. Установлено, что оптимальная
область концентраций СО-4 соответствует интервалу (1—5)10-4 М
(рис. 7.4 б), а мексидола оптимальные концентрации — (2—20)10-4 М
(табл. 7.4). При указанных концентрациях СО-4 и мексидола
обеспечивается наибольший синергический эффект (65 %). Эти
данные показывают, что экранированные фенолы образуют высокоэффективные синергические смеси с производными 3-гидроксипиридина.
Вероятно, эффект синергизма для смесей мексидола с СО-4
усиливается благодаря способности этих АО разрушать гидропероксиды без образования свободных радикалов, исключая дополнительный путь расходования АО в реакции с алкоксильными
радикалами. В состав синергической композиции входит мексидол,
представляющий собой АО с относительно высоким значением
константы скорости реакции K7 (Ph3OH) и пространственно
затрудненный СО-4 (Ph2OH), антирадикальная активность которого
в 2 раза ниже по сравнению с мексидолом. При окислении мексидола
образуются достаточно активные радикалы, а при окислении СО-4 —
неактивные феноксилы [215]. На начальных стадиях окисления
преимущественно расходуется более активный АО, но образующиеся
при его окислении радикалы обмениваются атомом водорода
с экранированным фенолом СО-4 по реакции, равновесие которой
сильно смещено вправо: Ph3O + Ph2OH ↔ Ph3OН + Ph2O. Таким
образом, происходит регенерация активной формы мексидола.
В настоящей работе показаны эффекты синергизма мексидола
и -токоферола в процессе окисления метилолеата. Количество
-токоферола в опытах оставалось постоянным 2,5×10-4 М, а концентрация мексидола изменялась в широком диапазоне. Кинетические
параметры окисления метилолеата в присутствии бинарной смеси
мексидола и -токоферола приведены на рис. 7.5 и табл. 7.5. Показано,
что в диапазоне низких концентраций мексидола проявлялся эффект
синергизма антиоксидантов, а в области высоких концентраций —
эффект антагонизма. Область концентраций мексидола (5×10-4—1×10-3 М)
соответствовала максимальному синергическому эффекту (25—30 %).
Величина антагонизма возрастала с увеличением концентрации
мексидола и в интервале (2,5×10-3—3,5×10-3 М) не превышала 8 %.
Эффект ингибирования, соответствующий максимальному
действию смесей, может быть достигнут при использовании
индивидуального мексидола при концентрациях в 2,5 раза больших,
чем в составе синергической композиции.
155
35
30
i / i 100 %
25
20
15
10
5
0
0
-5
-10
5
10
15
20
25
30
35
40
-4
С(АО)  10 , М
Рисунок 7.5. Зависимость эффекта синергизма в композиции -ТФ
и мексидола от концентрации мексидола; С (-ТФ) = const = 2,510-4
M, Wi = 4,210-8 Мc-1, t = 600 С
Изучено действие фосфолипидов (ФЛ) в смесях с ингибитором
окисления СО-4. Действие смеси сравнивали с эффектом реперных АО
(дибунола и α-токоферола), эффект синергизма которых с фосфолипидами был установлен ранее [215, 217]. Совместное действие
антиоксидантов с фосфолипидами сравнивали с антиоксидантным
эффектом индивидуальных компонентов, составляющих смесь.
Известно, что фосфолипиды не ингибируют процесс окисления,
но могут выступать в качестве синергистов для антиоксидантов.
Кинетические параметры поглощения кислорода метилолеатом
в присутствии антиоксидантов и их смесей с фосфолипидами
приведены в табл. 7.6. При сопоставлении периодов индукции видно,
что смесь фосфолипидов и антиоксидантов более эффективна,
чем индивидуальные антиоксиданты. Наблюдалось увеличение
периодов индукции (Δτ) и уменьшение максимальной скорости
окисления (ΔWО2 мак.).
156
Таблица 7.5.
Зависимость величины синергического эффекта от концентрации
мексидола и -токоферола, субстрат окисления МО, Wi = 4,2  10-8
Мс-1, t = 600 С
№ С(АО)10-4,
п/п
М
инд AO,
мин
i,, мин
, мин
,мин
(/i)
100 %
С(-ТФ)=соnst=2,5×10-4 М, =160 мин
1
1,0
60
220
225
5
2,3
2
2,0
110
270
290
20
7,4
3
5,0
220
380
495
115
30,3
4
7,0
280
440
550
110
25,0
5
8,0
320
480
560
80
16,7
6
10,0
400
560
652
92
16,4
7
16,0
650
810
840
30
3,7
8
20,0
800
960
970
10
1,0
9
25,0
950
1110
1080
-30
-2,7
10
30,0
1100
1260
1205
-55
-4,4
11
35,0
1300
1460
1350
-110
-7,5
Для смесей антиоксидантов и фосфолипидов выполнялись
следующие соотношения, свидетельствующие о синергизме: τi < τΣ,
(где τi и τΣ – периоды индукции окисления метилолеата в присутствии
АО и смеси АО + ФЛ соответственно) и W О2 max (АО) > WО2 max (АО+ ФЛ)
(где WО2 max (АО) и W О2 max (АО+ ФЛ) – скорости окисления МО
в присутствии АО и смеси АО + ФЛ соответственно).
Исследована зависимость изменения величины эффекта
синергизма от концентрации фосфолипидов в смеси. Как видно
из рис. 7.6 а, кривые для всех исследуемых антиоксидантов имели
однотипный характер. В области (0-3)×10-3 М действие смеси
увеличивалось прямо пропорционально концентрации, затем
в диапазоне (3—5)×10-3 М сохранялось плато эффективности,
а дальнейшее увеличение концентрации фосфолипидов приводило
к снижению величины синергизма.
Вероятно, систему неферментативной защиты липидов
в организме от окисления представляют не только антиоксиданты,
но и синергисты, роль которых выполняют фосфолипиды.
157
Таблица 7.6.
Кинетические характеристики окисления метилолеата
в присутствии смесей АО и ФЛ, С(АО)= 210-4 М, С(ФЛ)=5 10-4 М,
Wi=4,210-8 Мc-1, t = 600 С
Название τинд, τΣ, мин. WО2 мак. (АО) WО2 мак. (АО+ ФЛ) Δτ, (/i)
АО
мин. смеси ×10-7, М×с-1 ×10-7, М×с-1
мин.
100 %
α-ТФ
160
200
6,50
6,00
40
25,0
СО-4
240
290
12,10
4,35
50
20,8
Дибунол 190
210
6,30
5,80
20
10,5
Зависимости синергического эффекта композиций антиоксидантов с фосфолипидами от концентрации АО показаны на рис. 7.6 б.
Эффективность синергизма уменьшалась в следующем ряду:
α-токоферол > СО-4 > дибунол. Таким образом, в присутствии одного
и того же фосфолипида величина эффекта синергизма определялась
химической структурой ингибитора. Установлено, что эффект
максимален для неэкранированных фенолов и минимален
для пространственно замещенных АО.
Механизм эффектов синергизма в совместном действии
α-токоферола и фосфолипидов был изучен в работе [215]. Прямым
методом было показано, что входящие в состав фосфолипидов
полиненасыщенные жирные кислоты способствовали восстановлению
активной фенольной формы α-токоферола. При этом снижалось
участие α-токоферола в побочной реакции (10), приводящей
к дополнительному инициированию процесса. Аминоспирты (этаноламин, холин), входящие в структуру фосфолипидов, могут разрушать
гидропероксиды нерадикальным путем.
158
а
инд/  add  100 %
30
1
2
25
20
15
3
10
5
0
0
2
4
6
8
10
-3
С (ФЛ)  10 , М
б
 инд /  add  100 %
30
1
2
25
20
15
3
10
5
0
0
2
4
6
8
10
-4
С (АО)  10 , М
Рисунок 7.6. а) Зависимость периодов индукции в синергических
композициях различных АО с ФЛ от концентрации ФЛ:
1 — α-токоферол, 2 — СО-4, 3 — дибунол; Wi= 4,210-8 Мc-1,
С(АО) = const = 210-4 M, t = 600 С. б) Зависимость эффекта
синергизма в совместном действии ФЛ с различными АО
от их концентрации: 1 — α-токоферол, 2 — СО-4, 3 — дибунол;
Wi= 4,210-8 Мc-1, С(ФЛ) = const = 510-3 M, t = 600 С
159
Вследствие этого исключается еще один путь расходования
α-токоферола в реакции с гидроксильными и алкоксильными радикалами,
образующимися
при
гомолитическом
разложении
гидропероксидов.
Таким образом, синергические композиции имеют перспективы
широкого использования для сохранения свойств и увеличения сроков
хранения биологически активных липидов, пищевых продуктов,
лекарственных и косметических средств.
Выводы:
1. Получен ряд уменьшения константы скорости реакции
антиоксидантов с пероксильными радикалами K7: 3,60×106 М-1с-1
(-токоферол) > 2,80×104 М-1с-1 (мексидол) > 1,40×104 М-1с-1
(дибунол) > 1,30×104 М-1с-1 (СО-4) > 6,10×103 М-1с-1 (эмоксипин).
2. Показано, что СО-4, мексидол и эмоксипин в процессе
окисления метилолеата способны как эффективно уничтожать
пероксильные радикалы, так и разрушать гидропероксиды молекулярным путем. Вероятно, что антирадикальная активность
ингибиторов обусловлена присутствием в их химической структуре
гидроксила, а способность разрушения гидропероксидов связана
с наличием серы и азота.
3. Установлен эффект синергизма в совместном ингибирующем действии серосодержащего антиоксиданта СО-4 с -токоферолом при окислении метилолеата, достигающий 60—75 %.
4. Изучен эффект синергизма в совместном ингибирующем
действии мексидола с СО-4, составляющий 40—65 %.
5. Исследован эффект совместного антиоксидантного действия
мексидола и -токоферола, достигающий 25—30 %.
6. Показано, что СО-4, дибунол и α-токоферол образуют
синергические смеси с яичным фосфатидилхолином, эффективность
бинарных смесей составляет 20—30 %. Вне зависимости от природы
ингибитора наиболее эффективны соотношения между антиоксидантом и фосфолипидами 1:2 – 1:1.
160
ГЛАВА 8.
ВЗАИМОСВЯЗЬ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ
И ИНГИБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ
ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОЗАНА
ПРИ ОКИСЛЕНИИ МЕТИЛОЛЕАТА
Изучены особенности ингибирующего действия пространственно затрудненных фенольных антиоксидантов, производных
фенозана
[3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропионовой
кислоты], которые содержат остаток этаноламина, замещенного
по атому азота алкильными заместителями R1 с разной длиной цепи
от 1 до 16 углеродных атомов. Антиоксиданты в процессе окисления
действуют по двум механизмам: реагируют с пероксильными
радикалами с константой скорости реакции K7=(0,59-1,06)104 М-1×с-1
и разрушают гидропероксиды с образованием молекулярных
продуктов. Мицелла- или ламелла- подобные свойства структур
ИХФАН зависят от длины углеводородной цепи радикала R1.
В последние годы ведется поиск и направленный синтез новых
полифункциональных антиоксидантов фенольного ряда, превосходящих по своей эффективности существующие аналоги, с учетом
особенностей взаимосвязи структуры и антиоксидантной активности.
Перспективным направлением создания высокоэффективных антиоксидантов является синтез «гибридных молекул», сочетающих
в своей структуре несколько функциональных групп, независимо
или синергически действующих на процесс окисления субстратов
в липидной или водной фазе. В Институте биохимической физики
(ИБХФ) им. Н.М. Эмануэля РАН на основе фенозана-1 (метилокса)
[3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)пропионовой
кислоты]
синтезирован ряд стерически затрудненных антиоксидантов (АО),
которые содержат в своей структуре остаток этаноламина,
замещенного у кватернизированного (аммонийного) атома азота одним
или несколькими N-алкильными заместителями с разной длиной цепи,
включающей от одного до 16 углеродных атомов (табл. 8.1).
Ингибиторы известны под названием ИХФАН [170].
Ранее было показано, что соединения не обладают местным
и общетоксическим действием, не оказывают влияния на эмбриогенез
и развитие потомства, проявляют противосудорожное, ноотропное
действие, антиацетилхолинэстеразную активность [16, 17, 94, 114, 161,
165, 166, 235], регулируют рост клеток растений, обладают выраженным противомикробным действием [30, 33, 186, 248]. Установ161
лено, что по мере увеличения гидрофобности производных в ряду
ИХФАН, их эхиноцитогенная, стоматоцитогенная и гемолитическая
активности сначала возрастают, затем, пройдя через максимум,
уменьшаются, а микровязкость эритроцитарной мембраны претерпевает противоположные по знаку изменения [179]. Определено,
что производные ИХФАН, содержащие в алифатической цепи
бокового заместителя С8 и С10 углеродных атомов, являются наиболее
эффективными модификаторами структуры эритроцитарной мембраны
и морфологии эритроцитов. Большие концентрации 10-3 —10-5 М
ИХФАН значительно меняют структуру мембран — деструктурируют
микродомены липидов. При концентрации 10 -5—10-4 М ИХФАН
формируют собственную фазу в бислое, имеющую иные термоиндукционные параметры. Максимально действуют ИХФАН С10
и С12, меньше С8 и С16, по-видимому, длина «заякоривающего»
фрагмента С10, С12 оптимальна [6].
Из анализа химических структур (схема 8.1, табл. 8.1) можно
предполагать, что одни соединения (фенозан К и его метиловый эфир)
по своей природе липофильны, образуют с липидами гомогенные
растворы, другие АО, имеющие в структуре полярный фрагмент
(кватернизированный атом азота), могут самопроизвольно формировать мицеллы, в которых за счет ориентации полярных
и неполярных групп гидроксигруппа фенола может оказаться скрытым
внутри микрореактора.
В настоящей главе показаны особенности ингибирования
указанными соединениями процесса окисления липидов в гомогенном
и мицеллярном растворах, взаимосвязь эффективности и строения
ингибиторов, механизм их действия.
Схема 8.1.
162
В группе исследуемых АО методом хемилюминесценции оценена
величина константы скорости реакции АО с пероксильными
радикалами (реакция 7, согласно общепринятой схеме [208]):

RO2+InH → ROOH + In.
В разных условиях окисления определяли фактор ингибирования f,
показывающий число свободных радикалов, реагирующих с молекулой
ингибитора. Антирадикальную активность (K7) ИХФАН сравнивали
с дибунолом и -токоферолом. Значения K7 для фенозана К и его
метилового эфира близки между собой (табл. 8.1), сравнимы с величиной
K7 для дибунола (1,40104 М-1с-1). Антирадикальная активность
ИХФАН-9 и ИХФАН-10 по сравнению с ними ниже в 1,5—2 раза
(табл. 8.1). Уменьшение значений K7 ИХФАН по сравнению со значением
K7 для дибунола обусловлено влиянием электроноакцепторных
заместителей, снижающих антирадикальную активность АО 204.
ИХФАН в реакции с RO2• значительно уступают -токоферолу (K7=3,6
106 М-1с-1). Стехиометрический коэффициент ингибирования для
большинства известных АО равен 2. Таким образом, приведенные данные
показывают, что действие исследуемых АО обусловлено антирадикальной активностью в отношении пероксильных радикалов RO2•,
ведущих процесс окисления. При этом на одной молекуле ингибитора
погибает в среднем два свободных радикала.
Таблица 8.1.
Кинетические характеристики антиоксидантов
№
Антиоксидант
п/п
1 Фенозан К
Метиловый эфир
2
фенозана
3 ИХФАН-9
4 ИХФАН-10
5 ИХФАН-10-С-8
6 ИХФАН-10-С-10
7 ИХФАН-10-С-12
8 ИХФАН-10-С-16
—
К7104,
М-1с-1
2,20
2,0
i,*
мин
920
CH3
—
2,30
2,0
1050
40,4
H
CH3
C8H17
C10H21
C12H25
C16H33
Сукцинат
I
Br
Br
Br
Br
0,79
0,59
1,06
0,98
0,97
0,94
1,9
2,0
2,8
2,6
2,4
2,2
1025
1125
350
500
425
1075
39,4
43,3
13,5
19,2
16,3
41,5
R (R1)
X
K
f
АОА**
35,4
Примечание. Период индукции при *С(АО )= 1 × 10-3 М; **АОА =
(АО -МО) / МО.
163
1
VO2,MM
3
120
3
2
6
5
4
100
7
80
60
40
20
0
0
40
80
120
160
200
240
280
320
t , мин
Рисунок 8.1. Кинетические кривые поглощения кислорода
при инициированном окислении метилолеата в присутствии
равных концентраций АО: 1-контроль, 2-ИХФАН-10-С-8,
3-ИХФАН-10-С-10, 4-ИХФАН-10-С-12, 5-ИХФАН-10-С-16,
6-ИХФАН-9, 7-ИХФАН-10; МО : хлорбензол 1 : 1. САО = 210-4 М,
Wi = 4.210-8 М c-1, t= 600 С
Таблица 8.2.
Кинетические параметры окисления метилолеата в присутствии
различных концентраций исследуемых антиоксидантов
Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 С
feff
Wнач 10-7, Wmax 10-7,
Wmax (MO)/
Wmax (AO)
f1
f3
Mc-1
Mc-1
Метилолеат
0
26
1,90
8,00
1,0
Сукцинат (N,N-диметил-2-аммониоэтил)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4гидроксифенил)пропионата (ИХФАН-9)
1
100
1,77
7,20
1,1
2,6 2,6
2
200
1,24
4,93
1,6
2,6 2,6
4
410
0,93
4,40
1,8
2,6 2,6
6
600
0,74
3,45
2,3
2,6 2,6
8
820
0,44
3,41
2,4
2,6 2,6
10
1025
0,21
3,35
2,4
2,6 2,6
С(АО) 10-4,
М
 инд,
мин
164
Иодид (N,N,N-триметил-2-аммониоэтил)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4гидроксифенил)пропионата (ИХФАН-10)
1
110
1,06
5,95
1,3
2,8 2,8
2
210
0,74
4,52
1,8
2,8 2,8
4
450
0,62
3,92
2,1
2,8 2,8
6
670
0,54
3,31
2,4
2,8 2,8
8
900
0,37
3,27
2,4
2,8 2,8
10
1125
0,31
3,18
2,5
2,8 2,8
Бромид (N,N-диметил-N-октил-2-аммониоэтил)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4гидроксифенил)пропионата (ИХФАН-10-С-8)
1
50
1,86
7,67
1,0
0.6 —
2
60
1,49
7,08
1,1
0.6 —
4
80
0,92
5,06
1,6
0.5 —
6
100
0,73
4,15
1,9
— 0.6
8
225
0,57
3,72
2,2
— 0.7
10
350
0,29
3,47
2,3
— 0.9
Бромид (N,N-диметил-N-децил-2-аммониоэтил)-3-(3,5-ди-трет-бутил-4гидроксифенил)пропионата (ИХФАН-10-С-10)
1
60
1,24
5,58
1,4
1.3 —
2
100
1,06
4,43
1,8
1.0 —
4
190
0,93
4,13
2,0
1.0 —
6
260
0,28
4,00
2,0
0.8
8
400
0,21
3,72
2,2
1.0
10
540
0,20
3,31
2,4
— 1.1
Бромид (N,N-диметил-N-додецил-2-аммониоэтил)-3-(3,5-ди-третбутил-4-гидроксифенил)пропионата (ИХФАН-10-С-12)
1
50
1,65
6,98
1,1
1.3 —
2
90
1,49
4,65
1,7
1.3 —
4
100
0,74
4,20
1,9
1.2 —
6
180
0,72
4,10
2,0
— 1.1
8
325
0,62
3,55
2,3
— 1.3
10
440
0,60
3,35
2,4
— 1.4
Бромид (N,N-диметил-N-гексадецил-2-аммониоэтил)-3-(3,5-ди-третбутил-4-гидроксифенил)пропионата (ИХФАН-10-С-16)
1
75
1,06
4,22
1,9
1.9 —
2
130
0,93
4,09
2,0
1.6 —
4
200
0,90
3,65
2,2
—
6
475
0,47
3,57
2,2
2.0
8
750
0,37
3,44
2,3
2.4
10
1075
0,35
3,19
2,5
2.7
165
2
4
6
8
10
190
380
570
750
950
0,68
0,69
0,67
0,68
0,69
2
4
6
8
10
160
280
400
500
600
0,78
0,76
0,77
0,76
0,76
Дибунол
6,3
6,2
6,4
6,1
6,3
-Токоферол
6,5
6,4
6,5
6,3
6,4
1,3
1,3
1,3
1,3
1,3
2.2
2,2
2,2
2,2
2,2
2.2
2,2
2,2
2,2
2,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1,2
1.6
1,6
1,6
1,6
1,6
1.6
1,6
1,6
1,6
1,6
В структуре исследуемых АО присутствуют либо замещенные
аминогруппы, либо фрагменты четвертичного аммониевого основания.
Известно, что эти классы соединений способны разрушать
гидропероксиды (ROOH) 9. Кинетически нерадикальное разрушение
ROOH может проявляться в снижении начальной (Wнач.) и максимальной
(Wмах.) скоростей окисления субстрата. В связи с этим нами исследована
зависимость данных параметров от структуры ИХФАН (рис. 8.1).
-7
-1
Wmax. 10 , М с
8
7
1
6
2
3
4
5
5 6
4
3
0
2
4
6
8
10

С(АО)  М
Рисунок 8.2. Зависимость максимальной скорости окисления МО
в присутствии АО: ИХФАН-10-С-8 (1), ИХФАН-10-С-12 (2),
ИХФАН-10-С-10 (3), ИХФАН-9 (4), ИХФАН-10 (5), ИХФАН-10-С-16;
МО : хлорбензол 1 : 1. Wi = 4,210-8 М c-1, t= 600 С
166
г. I2/100 г. липидов
0,8
Ввод АО
1
0,7
0,6
0,5
2 3 456 7
0,4
0,3
0,2
0
100
200
300
400
500
600
700
800
t , мин.
Рисунок 8.3. Кинетические кривые накопления гидропероксидов
при аутоокислении МО в присутствии равных концентраций АО.
Стрелкой обозначен момент введения АО в реакционную смесь.
1 – МО (контроль), 2- ИХФАН-10-С-8, 3 -ИХФАН-10-С-10,
4 - ИХФАН-10-С-12, 5 - ИХФАН-9, 6 - ИХФАН-10-С-16, 7 - ИХФАН10; С(АО) =210-4 М, t = 600 C
Таблица 8.3.
Кинетика разрушения гидропероксидов при аутоокислении
метилолеата в присутствии антиоксидантов, С (АО) = 210-4 M,
t=600 C
№
п/п
Антиоксидант
1
2
3
4
5
6
7
Контроль МО
ИХФАН-10
ИХФАН-9
ИХФАН-10-С-8
ИХФАН-10-С-10
ИХФАН-10-С-12
ИХФАН-10-С-16
W10-4,
гI2/100г липидовс-1
накопление
разрушение
5,90
—
—
—
—
—
—
—
5,60
4,80
4.2
4.5
4.8
5.1
167
Разрушения
ROOH
за 7 часов,
(%)
—
54,7
48,4
41,0
44,1
46,8
50,1
1
2,3
i, мин
1600
а
4
5
1200
6
800
400
0
0
5
10
15
20
25
30
-4
i, мин
С(АО)  10 , М
1600
б
2
1
III
1200
3
II
I
800
4
5
400
0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
-4
С(АО)  10 , М
Рисунок 8.4 а) Зависимость изменения величины периодов индукции
от концентрации АО: 1- ИХФАН-10, 2- Метиловый эфир фенозана,
3- ИХФАН-9, 4-Фенозан К, 5-дибунол, 6--токоферол.
б) Зависимость изменения величины периодов индукции
от концентрации АО: 1 - ИХФАН-10, 2 - ИХФАН-10-С-16,
3 - ИХФАН-10-С-12, 4 - ИХФАН-10-С-10, 5 - ИХФАН-10-С-8;
МО: хлорбензол 1:1. Wi = 4.210-8 М c-1, t= 600 С
168
Из рис. 8.1 видно, что введение АО в систему окисления
приводит не только к увеличению периодов индукции по сравнению
с контролем, но и к уменьшению начальной и максимальной скоростей
окисления (табл. 8.2). Следует отметить, что в наибольшей степени
на величины Wнач. и Wмах влияют ИХФАН-9, ИХФАН-10 и ИХФАН10-С-16 (табл. 8.2). На рис. 8.2 представлена зависимость изменения
максимальной скорости окисления метилолеата (МО) от концентрации
ИХФАН в субстрате. Установлено, что для всех ингибиторов форма
кривых воспроизводится. В области (0—6)10-4 М происходит
линейное падение скорости, затем ее величина постепенно выходит
на плато и практически не меняется в области (8—10)10-4 М. По всей
вероятности, разрушение гидропероксидов является особенностью
механизма действия исследуемых АО.
Для подтверждения этой гипотезы мы изучили кинетику
накопления гидропероксидов после введения ИХФАН в частично
окисленный субстрат (МО) (рис. 8.3). В течение первого часа концентрация гидропероксидов снижается и в течение дальнейших 8 часов
остается постоянной на низком уровне, тогда как в контрольном
эксперименте
(в
отсутствие
АО)
пероксиды
продолжали
накапливаться.
Наиболее эффективными соединениями, способными разрушать
гидропероксиды, являются ИХФАН-9, ИХФАН-10 и ИХФАН-10-С-16
(табл. 8.3).
Результаты двух независимых методов свидетельствуют
об участии АО в разрушении первичных продуктов окисления. Распад
гидропероксидов сопровождается, по всей вероятности, образованием
молекулярных продуктов, поскольку вторичного инициирования
окисления не происходило. Таким образом, исследуемые АО способны
эффективно обрывать цепи окисления при взаимодействии с пероксильными радикалами, а также предотвращать возможность
вторичного инициирования процесса за счет разрушения гидропероксидов молекулярным путем.
Антиоксидантное действие ИХФАН изучали в сравнении
с известными АО: дибунолом и -токоферолом. Кинетические кривые
поглощения кислорода в присутствии сравнимых количеств ИХФАН
приведены на рис. 8.1. Видно, что все изучаемые соединения тормозят
процесс окисления метилолеата (табл. 8.1). Исходя из характера
зависимости периодов индукции от концентрации АО, соединения
можно разделить на две группы. Для фенозана К, метилового эфира
фенозана-1 К, дибунола, ИХФАН-9 и ИХФАН-10 зависимость носит
линейный характер (рис. 8.4 а). Следует отметить, что указанные
169
ИХФАН превосходят по своему ингибирующему действию
-токоферол (практически в 2 раза), а также дибунол, фенозан К
и метиловый эфир фенозана-1 (на 30 %) (рис. 8.3 а). Наибольшие
периоды торможения во всем изученном диапазоне концентраций
проявляются для ИХФАН-10. Для другой группы ингибиторов
зависимость периодов индукции от концентрации имеет не линейный,
а S-образный характер (рис. 8.4 б). К этой группе относятся АО,
содержащие при атоме N алкильные заместители с различным числом
углеродных атомов (см. табл. 8.1). Для этих АО на однотипных
S-образных кривых выделяется три участка (рис. 8.4 б). На первом
участке для всех АО зависимость носит линейный характер, с ростом
концентрации на кривых появляется второй, достаточно узкий отрезок,
в пределах которого изменения периодов индукции не происходит.
При превышении некоторой «пороговой» концентрации вновь
наблюдается увеличение брутто-эффективности торможения, прямо
пропорциональное концентрации АО. Указанные различия в действии
АО связаны с их строением. «Пороговая» концентрация, соответствующая излому концентрационных кривых, уменьшается пропорционально росту длины цепи заместителя R1 (рис. 8.5 а). Указанная
корреляция указывает на то, что при определенных концентрациях АО
возможно образование макромолекулярных структур, как известно,
критическая концентрация мицеллообразования уменьшается с ростом
длины углеводородного радикала полярной молекулы [107].
Наклоны концентрационных кривых на первом и третьем
участках существенно различаются между собой и связаны с длиной
цепи заместителя R1 (рис. 8.5 а). Количественно наклоны оценивали
по значению i/InH, представляющему собой отношение прироста
периодов индукции к приращению концентрации АО. Существует
прямая корреляционная связь между параметром i/InH и длиной
цепи радикала R1 (рис. 8.5 б). Из этих данных с учетом уравнения:
i = fInH/Wi, где f — фактор ингибирования, показывающий
количество свободных радикалов, реагирующих с молекулой
ингибитора, и экспериментально установленного методом ингибиторов значения скорости инициирования (W i=4,210-8 Мс-1),
оценивали эффективное значение feff. Значения feff, определенные
для группы АО, которые не имеют излома на концентрационных
зависимостях (рис. 8.4 а), численно не менялись во всем диапазоне
изученных концентраций (табл. 8.2), тогда как для другой группы
ингибиторов — ИХФАН — величины feff на первом и третьем участках
кривых различались между собой.
170
-4
С(АО)  10 , М
а
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
8
10
12
14
16
1
-1
4,5
4,0
7
i / [InH]  10 М  с
число атомов углерода в радикале R1
3,5
2
б
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
8
10
12
14
16
число углеводородных атомов в радикале R1
Рисунок 8.5. а) Взаимосвязь пороговой концентрации
мицеллообразования и длины цепи радикала R1. б) Взаимосвязь
i/InH и длины цепи заместителя R1: 1 — на третьем участке
концентрационной зависимости, 2 — на первом участке
концентрационной зависимости
Описанные выше закономерности связаны, по всей вероятности,
с образованием монослойных, а при увеличении концентрации —
бислойных микрогетерогенных структур. Очевидно, легкость
их образования связана с длиной углеводородного радикала
171
при аммонийном атома азота. В структуре монослойных мицелл
длинноцепочечные радикалы АО, по всей вероятности, ориентированы
к внешней поверхности, а полярные OH-группы фенола —
к внутренней. Между соседними OH-группами может возникать
водородная связь, что уменьшает возможность их взаимодействия
с пероксильными радикалами, ведущими процесс окисления.
При формировании бислойных структур фенольные фрагменты
молекул располагаются на внешней и внутренней поверхностях
бислоя, а гидрофобные радикалы R1 внутри структуры ориентированы
друг к другу. Локализация OH-групп фенола на внешней поверхности
мицеллы позволяет им беспрепятственно реагировать с пероксильными радикалами. Кинетически это выражается в аномально
высоких значениях feff на третьем участке концентрационных кривых.
Для проверки гипотезы о возможности структурирования АО
было изучено изменение показателя преломления в зависимости
от концентрации АО. При «пороговых» концентрациях АО резко
меняются оптические свойства растворов, на концентрационных
кривых появляется излом, обусловленный формированием мицелл.
Была оценена критическая концентрация мицеллообразования
растворов методом Ребиндера [100], которая практически соответствовала «пороговым» концентрациям. Следовательно, данные
независимых методов подтверждают предположение о формировании
в растворе липидов микрогетерогенных систем.
Таким образом, эффективность ингибирования определяется
не только антирадикальной активностью исследуемых АО, возможностью разрушения ROOH молекулярным путем, но и образованием
с их участием микрогетерогенных систем.
В связи с вышеизложенным выше были изучены кинетические
особенности окисления липидов в водно-эмульсионной среде
в присутствии додецилсульфата натрия при соотношении вода : масло,
равном 1:1. Зависимости периодов индукции от концентрации АО
в водно-эмульсионной среде показаны на рис. 8.6 а, б. Для АО,
не имеющих замещенных аминогрупп (дибунол, фенозан К
и его метиловый эфир), зависимость изменения величины периодов
индукции от концентрации носит линейный характер (рис. 8.6 а), тогда
как для замещенных производных фенозана дозозависимые кривые
экстремальны (рис. 8.6 б). Видно, что независимо от строения
ингибиторов указанные кривые однотипны: в диапазоне концентраций
(2,0—4,5)×10-4 М они выходят на плато, и дальнейшее увеличение
количества АО не приводит к росту i. Максимальные значения i
уменьшаются по мере роста числа углеродных атомов в цепи
заместителя R1. Рис. 8.6 б, в сущности, воспроизводит первый и второй
172
i, мин
участок кривых, представленных на рис. 8.4. б. Указанное соответствие обусловлено, вероятно, образованием однотипных микрогетерогенных систем.
2000
2 3
1
а
4
1600
1200
800
400
0
0
5
10
15
20
25
30
-4
С(АО)  10 , М
1
i, мин
б
2
250
200
3
150
4
100
5
6
50
0
0
2
4
6
8
10
12
14
-4
C  10 , M
Рисунок 8.6 а) Зависимость изменения величины периодов
от концентрации АО в водно-эмульсионной среде при
инициированном окислении: 1 - Фенозан, 2 – Метиловый эфир
фенозана, 3 - ИХФАН-9, 4 –-токоферол. б) 1- ИХФАН-10-С-10,
2- ИХФАН-10-С-12, 3- ИХФАН-10-С-8, 4-ИХФАН-9,
5-ИХФАНа-10-С-16, 6- ИХФАН-10; t=600 C
173
Схема 8.2. Длины связей между атомами в молекуле фенозана К
Схема 8.3. Длины связей между атомами в молекуле ИХФАН-10
По-видимому, формируются микрореакторы, ядро которых
составляют активные ОН-группы фенолов, а снаружи мицеллы
располагаются
ионогенные
аммониевые
группы,
связанные
с алкильным заместителем R1. Додецилсульфат натрия в этих условиях
обеспечивает стабилизацию системы за счет взаимодействия
гидрофобных фрагментов молекул ингибитора и поверхностноактивного вещества [107].
При помощи компьютерной программы Current Gaussian 09
Revision D.01были рассчитаны длины связей между атомами
в молекулах изучаемых антиоксидантов (схема 8.2, 8.3). Показано,
что длина связи O-H для дибунола, фенозана К и метилового эфира
фенозана имеет близкие значения. Введение в структуру антиоксидантов остатка этаноламина, замещенного по атому азота
алкильными заместителями, увеличивает длину связи O-H (табл. 8.4),
которая практически не зависит от длины углеводородной цепи
радикала R1. Известно, что константа скорости реакции ИХФАН
с пероксильными радикалами K7 по сравнению с фенозаном ниже
174
в 1,5—2 раза (табл. 8.1). Вероятно, снижение антирадикальной
активности ИХФАН можно объяснить формированием с их участием
надмолекулярных структур, которые препятствуют ускоренному
протеканию реакций.
Таблица 8.4.
Расчетные параметры длины связей между атомами при помощи
компьютерной программы Current Gaussian 09 Revision D.01
№ п/п
1
2
3
4
5
6
7
8
Название АО
Дибунол
Фенозан К
Метиловый эфир фенозана
ИХФАН-10
ИХФАН-10-С-8
ИХФАН-10-С-10
ИХФАН-10-С-12
ИХФАН-10-С-16
Длина связи O–H,×10-10 м
0,96093
0,96091
0,96111
0,96556
0,96543
0,96544
0,96545
0,96547
Для проверки гипотезы о возможности структурирования
антиоксидантов в системе окисления в нашей совместной работе [304]
было проведено детальное исследование с использованием ATRинфракрасной спектроскопии (ATR-ИК). Были изучены структурные
изменения в гидрофобной среде в самих агрегатах ИХФАН с длинной
углеводородной цепью и их взаимодействии с фосфолипидами
(ДПФХ).
Дипалмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ) относится к фосфатидилхолину, преобладающему в фосфолипидах и составляющему
основную структуру эукариотов клеточных мембран. ДПФХ с двумя
С16-цепями очень часто используется в качестве модели липидной
биомембранной структуры. Инфракрасная спектроскопия может
способствовать проникновению во всю молекулярную структуру
компонентов ИХФАН. Эта методика позволяет проследить мельчайшие изменения в собранных вместе структурах амфифилических
молекул [405]. Основное в процессе агрегации молекул —
это оптимизация взаимодействия Van der Waals углеводородных
хвостов в гидрофобном ядре амфифилических соединений. Форма
и длина цепей определяют структуру липидного агрегата [310].
Положение слоёв, связанных с вибрацией углеводородных цепей, даёт
информацию о молекулярной организации амфифилических
компонентов. Самые важные частоты представлены в таблице 8.5.
175
Таблица 8.5.
Вибрационные колебания CH2 группы в сухой пленке ИХФАНов
при t = 300С, полученные ATR – ИК спектроскопией
Компонент
ИХФАН-9
ИХФАН-10-С-8
ИХФАН-10-С-10
ИХФАН-10-С-12
ИХФАН-10-С-16
ДПФХ
R1
—
C8H17
C10H21
C12H25
C16H33
C16H33, C16H33
Ѵs CH2, см-1
Ѵas CH2, см-1
2855,9
2856,5
2855,1
2854,8
2853,7
2849,8
2926,2
2926,4
2925,5
2925,0
2924,4
2917,1
Установлено, что алифатический хвост каждого анализированного гомолога ИХФАН в условиях сухой пленки принимает более
неупорядоченное состояние, чем аналогичный хвост ДПФХ.
Молекулы ИХФАН с короткими хвостами принимают более
неупорядоченное gauche-насыщенное состояние, чем с длинными
хвостами. Анализ данных из этой таблицы 8.5 указывает,
что положение полос Ѵs[CH2] почти линейно коррелирует с длиной
алкильной цепи, такая же корреляция существует для полос Ѵas[CH2].
Упаковка алкильного хвоста новых амфифилических соединений
может отличаться от той, которая у ДПФХ. В действительности,
молекулы ИХФАН могли принимать структуры мицелл. Подобные
структуры, скорее всего, существуют в нашем случае с высокой
конформационной неупорядоченностью в гидрофобном ядре.
Сами молекулы ИХФАН принимают положение gauche — rich,
как было показано выше, и смесь ИХФАН/ДПФХ также принимает
более высокую конформационную неупорядоченность в гидрофобной
части по сравнению с пленкой чистого ДПФХ. Молекулы ИХФАН-10С-16 состоят из одной углеводородной цепочки, связанной
с гидрофильной «верхушкой», которая имеет сравнительно больший
диаметр (см. схему. 8.1). Это вызывает конусообразную форму
молекул ИХФАН. При объединении конических частей ИХФАН
с цилиндрическими молекулами ДПФХ образуется надмолекулярная
структура, которая вызывает больше свободного пространства между
алкильными цепочками и увеличение количества gauche -конформеров
в целой системе.
Более длинный хвост гомологов колеблется сильнее в межи внутримолекулярных взаимодействиях в гидрофобной части
смешанной пленки ДПФХ по сравнению с более короткими хвостами.
Длина различных цепочек объединенного соединения в результате
приводит к различной глубине проникновения в бислойный ДПФХ.
176
Гомологи ИХФАН с длинным углеводородным хвостом проникают
глубже в структуру ДПФХ и вызывают ее неупорядоченность.
Объединения конического ИХФАН и цилиндрического ДПФХ
вызывает подъем в свободных пространствах вокруг алифатических
хвостов и уменьшение уплотнения углеводородных цепочек, которые
уменьшают Van der Waals взаимодействия между ними.
Таким образом, структура ИХФАН-10-С-10 является оптимальной для того, чтобы внедряться в структуры липидов биомембран
и вызывать совместную конформационную неупорядоченность
в меньшей степени.
Похожие результаты были обсуждены в работе Кривандина А.В.
с соавторами [146]. Методом малоуглового рентгеновского рассеяния
исследована структура многослойных липосом, полученных
из растворов в хлороформе яичного фосфатидилхолина и синтетического антиоксиданта ИХФАН-10-С-10. Показано, что в присутствии ИХФАН-10-С-10 происходило уменьшение толщины липидных
мембран и периода их укладки в липосомах. Наибольшей величины
этот эффект достигался при содержании ИХФАН-10-С-10 в дисперсии
около 5 % от массы липидов. При более высоком содержании
ИХФАН-10-С-10 наблюдается ухудшение упорядоченности мембран
в липосомах, что авторы связывают с микрофазной сегрегацией
ИХФАН-10-С-10 в мембранном мультислое. Результаты работы
показывают, что ИХФАН-10-С-10 в значительных количествах может
встраиваться в липидные мембраны. На этом основано пролонгированное действие лекарственных препаратов на основе ИХФАН.
Таким образом, результаты настоящей работы показывают,
что эффективность действия ИХФАН в качестве антиоксидантов
зависит от их химического строения и от условий окисления.
Соединения ИХФАН-9 и ИХФАН-10 в гомогенных и гетерогенных
растворах по своей активности превосходят известные синтетические
и природные ингибиторы окисления (дибунол, -токоферол). Аналоги,
имеющие длинноцепочечные заместители при кватернизированном
атоме азота, за счет образования микрогетерогенных систем
проявляют относительно слабое брутто-ингибирующее действие,
которое усиливается с ростом длины заместителя R1.
Можно полагать, что размеры бислойных структур, образуемых
ИХФАН с длиной заместителя R1, сопоставимой с длиной цепи
высших жирных кислот в структуре фосфолипидов (18—22 углеродных атомов), будут соответствовать толщине биологических
мембран. Это обстоятельство обеспечит их максимальное удерживание в мембранах и стабилизацию неферментативных процессов
177
окисления на внутренней цитоплазматической и наружной
поверхностях клеточных мембран.
Относительно низкая токсичность и высокая эффективность
ИХФАН позволяют рассматривать их в качестве антиоксидантов,
перспективных для стабилизации окисления гомогенатов и эмульсий
пищевых
и
биологически
активных
липидов
различного
происхождения.
Выводы
1. ИХФАН в процессе окисления действуют по двум
механизмам: реагируют с пероксильными радикалами с константой
скорости реакции K7=(0,59-1,06)104 М-1×с-1 и разрушают гидропероксиды с образованием молекулярных продуктов.
2. Структура ИХФАН-10-С-10 является оптимальной для того,
чтобы встраиваться в липидные мембраны и вызывать в меньшей
степени совместную конформационную неупорядоченность.
178
ГЛАВА 9.
КИНЕТИКА СОВМЕСТНОГО
ИНГИБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ
СИНТЕТИЧЕСКИХ И ПРИРОДНЫХ
АНТИОКСИДАНТОВ
Установлен эффект синергизма в совместном ингибирующем
действии α-токоферола, фосфолипидов и антиоксидантов группы
ИХФАН, производных салициловой кислоты, достигающий 30—70 %.
Независимыми методами (УФ-спектроскопии и методом высокоэффективной жидкостной хроматографии) в сравнении изучена
кинетика расходования α-токоферола в процессе окисления метилолеата при использовании его порознь и в составе бинарной смеси
с синтетическими антиоксидантами. Показано, что в составе
синергической композиции существенно снижается скорость
расходования наиболее эффективного ингибитора α-токоферола.
Для стабилизации окисления пищевых и косметических масел,
жировых основ фармпрепаратов все более широко используют
синергические композиции, которые могут состоять из нескольких
ингибиторов окисления, взаимно усиливающих действие друг друга,
либо включать антиоксидант и вещество — синергист, которое
не проявляет ингибирующего действия, но в его присутствии
эффективность ингибитора значительно возрастает. Использование
эффектов синергизма позволяет получать высокоэффективные
композиции и при этом существенно снижать абсолютные количества
ингибитора, уменьшая тем самым негативные последствия длительного применения высоких доз синтетических антиоксидантов.
В литературе имеются данные о проявлении эффектов
синергизма при совместном действии смесей α-токоферола (α-ТФ)
с фосфолипидами [44, 45, 215, 216, 221, 251, 252, 253, 333, 334],
аскорбиновой и другими органическими кислотами [259, 286, 328, 366,
385, 388, 402, 404],
β-каротином [394, 396],
алифатическими
аминами [158], дибунолом [188, 215], флавоноидами [394].
Эффект синергизма в действии антиоксидантов (АО)
до настоящего времени выявлялся эмпирическим путем. Несмотря
на имеющиеся классификации синергизма, отсутствуют достоверные
критерии, позволяющие на основании представлений о химическом
строении составляющих АО прогнозировать возможность аддитивности, синергизма или антагонизма в их совместном действии. В связи
с этим необходимо экспериментальное обоснование гипотез,
связывающих эффективность и состав синергических композиций.
179
На основании полученных данных представляется возможным
прогнозировать действие смесей АО, разрабатывать новые способы
стабилизации органических материалов различной природы. Применение ряда синтетических АО в медицине и пищевой промышленности ограничивается в связи с возможностью проявления ими
токсического действия в больших концентрациях. Выход может быть
найден при использовании малых количеств синтетических
ингибиторов окисления в композиции с нетоксичными синергистами.
В качестве потенциальных синергистов могут рассматриваться
компоненты биологических мембран, например, α-токоферол,
фосфолипиды, природные соединения метаболического типа действия
(L-карнитин, пантотеновая кислота и др. [158]). Подобные композиции, проявляющие низкую токсичность, позволят обеспечить
высокую эффективность ингибирования и возможность их длительного использования в пищевых или лечебных целях.
В настоящей главе показана взаимосвязь между химическим
строением и эффективностью совместного действия смеси синтетических фенолов различной степени экранированности с α-токоферолом
и фосфолипидами (яичным фосфатидилхолином).
Исследована кинетика реакций свободнорадикального окисления
в системах, одним из компонентов которых был -токоферол,
а вторым — неэкранированный [парацетамол, осалмид] или пространственно затрудненный фенол [ИХФАН-10, ИХФАН-10-С-16,
3-трет-бутил-N-[3-(3,5-ди-трет-бутил-4-гидроксифенил)-пропил]2-гидрокси-5-этил-бензамид (Амид (V)), 3-трет-бутил-N-[3-(3,5-дитрет-бутил-4-гидроксифенил)-пропил]-2-гидрокси
-5-этилбензсульфид (Сульфид (VI)]. В исследуемых композициях изменяли
абсолютные количества и соотношения компонентов. При этом
количественно оценивали действие индивидуальных АО и их бинарных смесей.
Для установления характера сочетанного действия двух
ингибиторов сопоставляли между собой простую сумму периодов
индукции отдельных компонентов (аддитивное действие) (Στі)
и брутто эффективности их смеси (τΣ). Если в результате сочетания
ингибиторов получили выигрыш в периодах индукции (Δτ) по сравнению с аддитивным действием АО, т. е. (τΣ >Στі), то в совместном
действии ингибиторов констатировали эффект синергизма. В случае
если совместное действие двух АО было меньше, чем сумма эффектов
ингибирования индивидуальных веществ (τΣ <Στі), то делалось
заключение о проявлении антагонизма в совместном действии АО.
Эффект синергизма оценивали по разности Δτ =τΣ -Στі либо выражали
отношением Δτ/Στі×100 %.
180
Совместный ингибирующий эффект АО значительно превышал
простую сумму периодов индукции индивидуальных компонентов,
что свидетельствовало о проявлении в их совместном действии
эффекта синергизма. Получены сложные бимодальные кривые
(рис. 9.1, рис. 9.2), при анализе которых видно, что смесь -токоферола с пространственно затрудненными фенолами эффективна
в области низких концентраций, увеличение добавок фенолов приобретает антагонистический характер. Оптимальная область концентраций АО соответствует интервалу (1,0—5,0)10-4 М, для -токоферола — (2,5—5,0)10-4 М (табл. 9.1, табл. 9.2). При этих уровнях АО
обеспечивается наибольший синергический эффект, равный 50—55 %.
Эффект синергизма для смесей -токоферола с исследуемыми
фенолами связан со способностью АО разрушать гидропероксиды
без образования радикальных продуктов, тем самым исключается
дополнительный путь расходования -токоферола. При этом могут
быть использованы концентрации антиоксидантов меньше в 2—5 раз.
В состав синергической композиции входит -токоферол,
представляющий собой фенол с высоким значением K7 (PhOH I)
и пространственно затрудненный АО (PhOH II), антирадикальная
активность
70
1
 / i  100 %
60
50
2
40
30
20
10
0
-10
-20
0
2
4
6
8
10
-4
С(АО)  10 , М
Рисунок 9.1 . Зависимость эффекта синергизма от концентрации
ИХФАН-10-С-16 (1) и ИХФАН-10 (2); С(-ТФ) = const = 2,510-4M,
Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 C
181
60
i 100 %
50
1
40
2
30
20
10
0
-10
-20
0
2
4
6
8
10
-4
С(АО)  10 , М
Рисунок 9.2. Зависимость эффекта синергизма в композиции
-ТФ + Сульфид (VI) (1), -ТФ + Амид (V) (2) от концентрации АО;
С(-ТФ) = const = 2,510-4M, Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 C
которого существенно ниже. При окислении -токоферола
образуются активные токофероксильные радикалы [40, 359, 357],
а при окислении экранированных фенолов — неактивные феноксилы [88, 89, 204]. На начальных стадиях окисления преимущественно расходуется активный антиоксидант, но образующиеся
при его окислении
токофероксилы
обмениваются
водородом
с экранированным фенолом по реакции:
PhO I + PhOH II  PhOН I + PhO II
182
Таблица 9.1.
Зависимость величины синергического эффекта от концентрации
α-ТФ и ИХФАН-10, ИХФАН-10-С-16, субстрат окисления МО,
Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 C
№
-4
п/п С(АО) 10 , М
1
2
3
4
5
6
инд AO, i, мин Σ, мин
мин
, мин
(/i)
100%
ИХФАН-10 + С (α -ТФ) = const = 2,510-4 М, инд = 190 мин
1,0
110
300
330
30
10,0
2,0
210
400
490
90
22,5
4,0
450
640
910
270
42,2
6,0
670
860
1040
180
20,9
8,0
900
1090
1070
-20
-1,8
10,0
1125
1315
1080
-235
-17,9
α -ТФ + С (ИХФАН-10) = const = 210-4 М, инд = 210 мин
7
8
9
10
11
12
13
14
15
2,5
5,0
12,5
190
300
650
400
510
860
490
640
1180
90
130
320
22,5
25,5
37,2
ИХФАН-10-С-16 + С (α -ТФ) = const = 2,510-4 М, инд = 190 мин
1,0
75
265
300
35
13,2
2,0
130
320
420
100
31,3
4,0
200
390
650
260
66,7
6,0
475
665
920
255
38,4
8,0
750
940
1000
60
6,4
10,0
1075
1265
1080
-185
-14,6
α ТФ + С (ИХФАН-10-С-16) = const = 210-4 М, инд = 130 мин
16
17
18
2,5
5,0
12,5
190
300
650
320
430
780
420
570
1200
100
140
420
31,3
32,6
53,9
Таким образом происходит регенерация активной фенольной
формы -токоферола.
Восстановленная форма более активного АО способна вновь
обрывать цепи окисления по реакции:
PhOH + RO2 ROOH + PhO
183
Феноксилы PhO II вследствие своей малой активности
в дальнейшем практически не участвуют в цепном процессе.
Таблица 9.2.
Зависимость величины синергического эффекта от концентрации
α -ТФ и АО, субстрат окисления МО, Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 C
№
-4
п/п С(АО)  10 , М
1
2
3
4
5
6
инд AO, i, мин Σ, мин
мин
, мин
(/i)
100 %
Амид (V) + С (α -ТФ) = const = 2,510-4 М, инд = 190 мин
1,0
150
340
435
95
27,9
2,0
240
430
610
180
41,9
4,0
380
570
855
285
50,0
6,0
550
740
815
75
10,1
8,0
720
910
770
-140
-15,4
10,0
900
1090
900
-190
-17,4
α -ТФ + Амид (V) = const = 210-4 М, инд = 240 мин
7
8
9
10
11
12
13
14
15
2,5
5,0
12,5
190
300
650
430
540
890
610
830
1370
180
290
480
41,9
53,7
53,9
Сульфид (VI) + С (α -ТФ) = const = 2,510-4 М, инд = 190 мин
1,0
160
350
455
105
30,0
2,0
230
420
605
185
44,0
4,0
390
580
900
320
55,2
6,0
560
750
860
110
14,7
8,0
730
920
830
-90
-9,9
10,0
910
1100
1260
-160
-14,5
α -ТФ + Сульфид (VI) = const = 210-4 М, инд = 230 мин
16
17
18
2,5
5,0
12,5
190
300
650
420
530
880
610
830
1360
190
300
480
45,2
56,6
54,5
Эффект антагонизма при высоких концентрациях ингибиторов
связан с участием феноксилов в побочных процессах с RH, O 2, за счет
распада образующихся хинолидных пероксидов. Указанные побочные
реакции с ростом концентрации АО могут увеличивать скорость
инициирования и снижать эффективность действия ингибиторов,
приводить к эффекту антагонизма в совместном действии АО.
Возможно также, что эффект антагонизма обусловлен межмолекулярными взаимодействиями между -токоферолом и природными
184
хинонами, что приводило к уменьшению количества активной
фенольной формы -токоферола и снижению эффективности
совместного действия смеси.
Таблица 9.3.
Зависимость величины эффекта антагонизма от концентрации
α -ТФ и АО, субстрат окисления МО, Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 C
№ С(АО)  10-4,
п/п
М
1
2
3
4
5
6
инд AO, i, мин Σ, мин
мин
, мин
(/i)
100%
парацетамол + С (α -ТФ) = const = 2,510-4 М, инд = 190 мин
1,0
130
320
245
-75
-23,4
2,0
220
410
280
-130
-31,7
4,0
425
615
380
-235
-38,2
6,0
625
815
480
-335
-41,1
8,0
820
1010
575
-435
-43,1
10,0
1030
1220
720
-500
-41,0
α-ТФ + С (парацетамола) = const = 110-4 М, инд = 130 мин
7
8
9
2,5
5,0
12,5
190
300
650
320
430
780
250
280
470
-70
-150
-310
10
11
12
13
14
15
осалмид + С (α-ТФ) = const = 2,510-4 М, инд = 190 мин
1,0
50
240
165
-75
2,0
110
300
195
-105
4,0
200
390
250
-140
6,0
300
490
300
-190
8,0
410
600
365
-235
10,0
500
690
410
-280
-21,9
-34,9
-39,7
-31,3
-35,0
-35,9
-38,8
-39,2
-40,6
α-ТФ + С (осалмида) = const = 110-4 М, инд = 50 мин
16
17
18
2,5
5,0
12,5
190
300
650
240
350
700
165
220
410
-75
-130
-290
-31,3
-37,1
-41,4
При сопоставлении между собой действия смесей -токоферола
в композиции с парацетамолом или осалмидом и их прогнозируемого
аддитивного эффекта было констатировано проявление антагонизма
(рис. 9.3, табл. 9.3). Величина антагонизма в действии -токоферола
с парацетамолом или осалмидом достигает 40%.
185
Антагонизм в действии -токоферола в смеси с указанными
неэкранированными АО, возможно, обусловлен несколькими
причинами:
-4
С(АО)  10 , М
0
 / i  100 %
0
2
4
6
8
10
12
-10
-20
-30
1
2
-40
-50
Рисунок 9.3. Зависимость эффекта антагонизма от концентрации
осалмида (1) и парацетамола (2) в композиции АО + α-ТФ
(2,5010-4 M); Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 C
1. При окислении неэкранированных АО образуются
достаточно активные феноксилы, которые участвуют в обменной
реакции с активным ингибитором, способствуя его дополнительному
расходованию:
InH + In1  In + In1H
2. Неэкранированный феноксильный радикал проявляет
достаточно высокую активность в реакциях с субстратом окисления:
186
1,0
7
1
а
0,8
0,6
D
0,4
0,2
1
7
0,0
-0,2
250
300
350
400
, нм
0,8
б
D
0,6
0,4
1
0,2
5
0,0
200
250
300
350
400
450
, нм
Рисунок 9.4. Спектры оптической плотности смеси -ТФ
(2,5×10-4М) + метилолеат (2,0×10-2М) + АИБН (3,0×10-3М) +
осалмид (2,5×10-4М)(а); -ТФ (2,5×10-4М) + метилолеат (2,0×10-2М)
+ АИБН (3,0×10-3М) + Амид V (2,5×10-4М)в ацетонитриле в процессе
окисления t=600 C, слой 0,1 см, промежуток между регистрацией
спектров 1 час. Раствор сравнения: метилолеат (2,0×10-2М) +
осалмид (2,5×10-4М)(а); метилолеат (2,0×10-2М) +
амид V (2,5×10-4М)в ацетонитриле
187
0,3
0,2
1
7
а
0,1
7
D
0,0
-0,1
1
-0,2
-0,3
-0,4
250
300
350
400
450
, нм
0,4
1
б
0,2
1
7
D
0,0
-0,2
-0,4
-0,6
250
300
350
400
450
, нм
Рисунок 9.5. Спектры оптической плотности смеси -ТФ
(2,5×10-4М) + метилолеат (2,0×10-2М) + АИБН (3,0×10-3М) +
ИХФАН-10 (2,5×10-4М)(а); -ТФ (2,5×10-4М) + метилолеат
(2,0×10-2М) + АИБН (3,0×10-3М) + ИХФАН-10-С-16 (2,5×10-4М)(б)
в ацетонитриле в процессе окисления t=600 C, слой 0,1 см,
промежуток между регистрацией спектров 1 час. Раствор
сравнения: метилолеат (2,0×10-2М) + ИХФАН-10 (2,5×10-4М)(а);
метилолеат (2,0×10-2М) + ИХФАН-10-С-16 (2,5×10-4М) (б)в
ацетонитриле
188
In1 + RH  R + In1H
R+ O2  RO2,
что приводит к образованию относительно малоактивного АО
и дополнительному инициированию процесса.
3. Гидроксильная группа изучаемых нами АО может
образовывать водородную связь с ОН-группой -токоферола,
что исключает ее участие в реакции с пероксильными радикалами,
ведущими окисление.
Исходя из полученных данных, можно предположить
возможность проявления антагонизма на клеточном уровне при
лечении парацетамолом или осалмидом.
Закономерности изменения скорости расходования -токоферола
изучали методом УФ-спектроскопии. -Токоферол имеет характерную
длинноволновую полосу поглощения при 295 нм, которая
в дальнейшем
будет
использоваться
для
фотометрического
определения концентраций. Коэффициент экстинции -токоферола
составляет 2900 дм3/М×см в ацетонитриле. Присутствие метилолеата
(МО), антиоксидантов и инициатора в выбранных концентрациях
не мешало определению концентрации -токоферола. Дополнительно
в кювету сравнения на двух лучевом спектрофотометре помещался
раствор МО и антиоксиданта в той же концентрации, что и в реакционной смеси. В результате спектрофотометр регистрировал
поглощение света, обусловленное только -токоферолом и продуктами его трансформации. Инициатор АИБН практически не оказывал
влияние на измерения поглощения в области 295 нм. Поэтому
он не добавлялся в кювету сравнения, тем самым предотвращался
химический процесс по радикальному механизму в кювете сравнения.
Смоделированные условия эксперимента соответствовали манометрическим исследованиям.
В спектрах исходных веществ антиоксидантов и МО практически
отсутствовало поглощение в области 330—400 нм, характерное
для свободных радикалов. Обычно в этой области наблюдается
поглощение, связанное с переносом заряда внутри молекул. Слабое
поглощение в этой области наблюдалось только для АИБН.
На рис. 9.4 а, б, 9.5 а, б показаны спектры поглощения
-токоферола в разные промежутки времени в системах с добавками
осалмида,
Амида
(V),
ИХФАН-10
и
ИХФАН-10-С-16.
Из рис. 9.4 а, б, 9.5 а, б видно, что интенсивность поглощения полосы,
характерной для -токоферола, с течением реакции уменьшается.
Установлено, что при использовании в смеси парацетамола и осалмида
189
концентрация
-токоферола
быстро
снижается
(табл. 9.4),
а в присутствии Амида (V), Сульфида (VI) (рис. 9.7, табл. 9.5),
ИХФАН-10, ИХФАН-10-С-16 (рис. 9.8 а, б) расходование α-токоферола замедляется.
Рисунок 9.6. Типичная хроматограмма компонентов реакционной
смеси в процессе окисления -ТФ (2,5×10-4М) + метилолеат
(2,0×10-2М) + АИБН (3,0×10-3М) + осалмид (5×10-4 М)
в ацетонитриле. Градиентное элюирование метанолом
Из данных рис. 9.4 а, б, 9.5 а, б с учетом закона Бугера-ЛамбертаБера рассчитывали количество -токоферола и скорость его расходования в разное время реакции окисления. Для выбранных
концентраций реагентов, изменения концентрации -токоферола
в композиции с пространственно затрудненными фенолами оказалась
меньшей по сравнению с композицией, где их добавки отсутствовали.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том,
что эффект синергизма обусловлен снижением расходования
-токоферола в присутствии фенолов с орто-трет-бутильными
заместителями.
Методом ВЭЖХ была исследована динамика концентраций
антиоксидантов в реакционных смесях в процессе окисления
субстрата. При регистрации хроматограмм использовался режим
градиентного элюирования с использованием ацетонитрила, воды
и метанола. Хроматографический пик -токоферола имеет время
выхода около 20 мин., и с течением времени наблюдалось уменьшение
190
высоты пика (рис. 9.6). Это однозначно подтверждает выводы
спектрофотометрических исследований, что концентрация -токоферола в процессе окисления композиции снижается. На хроматограмме можно выделить пик другого АО, снижение его концентрации
в процессе окисления композиции идет медленно и составляет всего
лишь 10—15 % (табл. 9.4).
Таблица 9.4.
Кинетические характеристики расходования -токоферола,
парацетамола и осалмида в процессе окисления, С (-ТФ) = const =
2,510-4 М, субстрат окисления МО, Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 C
Состав смеси
Осалмид
Парацетамол
Скорость расходования АО,
Wрасх.×10-8 Мс-1
АО**
-токоферол*
0,93±0,03
—
1,04±0,04
0,15±0,02
1,28±0,05
0,24±0,02
1,67±0,06
0,40±0,01
1,86±0,06
0,79±0,02
2,17±0,06
1,59±0,03
0,93±0,03
—
1,39±0,05
0,10±0,02
2,08±0,06
0,14±0,02
С(АО)10-4,
М
0
0,5
1,0
2,5
5,0
7,5
0
0,25
0,50
Примечание. * — скорость расходования, рассчитанная методом УФ —
спектроскопии; ** — скорость расходования, рассчитанная методом ВЭЖХ
На основе данных метода ВЭЖХ были проанализированы
кинетические зависимости расходования концентрации -токоферола
и АО. Показано, что скорость расходования -токоферола
уменьшается с ростом количества пространственно затрудненных
фенолов (табл. 9.5). Так, при концентрации Амида (V) 2,5×10 -4 М
в системе окисления -токоферол расходуется полностью за 8 часов,
а при концентрации Амида (V) 2,5×10-5 всего за 3 часа.
При использовании в реакционной смеси Амида (V) и Сульфида (VI)
расходование -токоферола замедлялось (табл. 9.5). Для выбранных
концентраций реагентов изменение концентрации -токоферола
в композиции с АО оказалось меньшим по сравнению с композицией,
где АО отсутствовали (рис. 9.7). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что эффект синергизма обусловлен снижением
расходования -токоферола в присутствии синтетических АО.
191
Таблица 9.5.
Кинетические характеристики расходования -токоферола,
Амида (V) и Сульфида (VI) в процессе окисления, С(-ТФ) = const =
2,510-4 М, субстрат окисления МО, Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 C
Состав смеси
Амид (V)
Сульфид (VI)
Скорость расходования АО,
Wрасх.×10-8 Мс-1
АО**
-токоферол*
2,78±0,02
—
2,22±0,02
0,20±0,02
1,43±0,01
0,13±0,01
0,98±0,01
0,11±0,01
2,78±0,02
—
1,96±0,01
0,10±0,01
1,33±0,01
0,12±0,01
0,76±0,01
0,19±0,02
С(АО)10-4,
М
0
0,25
0,50
2,50
0
0,25
0,50
2,50
Примечание. * — скорость расходования, рассчитанная методом УФ —
спектроскопии; ** — скорость расходования, рассчитанная методом ВЭЖХ
Наряду с -токоферолом, важнейшими компонентами
биологических мембран являются фосфолипиды (ФЛ). По химической
структуре ФЛ представляют собой сложный эфир трехатомного спирта
глицерола, этерефицированного двумя остатками молекул высших,
преимущественно полиненасыщенных жирных кислот и одной
молекулой фосфорной кислоты, которая в свою очередь замещена
в большинстве ФЛ одним из азотистых оснований (холином,
этаноламином) или аминокислотой (серином), либо циклическим
спиртом инозитом. Было установлено [215], что индивидуальные ФЛ
в модельных субстратах (МО, этилбензол) не проявляют антиоксидантной и антирадикальной активности, а при относительно высоких
концентрациях (>1×10-2 М) увеличивают начальную скорость окисления. В присутствии ФЛ наблюдали значительное увеличение
ингибирующей способности -токоферола и дибунола. Такой
способностью обладали полярные липиды природного происхождения, отдельные фракции ФЛ, выделенные из различных источников.
В литературе эффект синергизма описан в основном для смесей ФЛ
с -токоферолом, кверцетином и толухиноном [44, 45, 215, 216,
333, 334, 394].
192
С (-ТФ), %
100
80
60
40
1
2
3
20
0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200
t , мин.
Рисунок 9.7. Кинетика расходования -ТФ по данным
УФ-спектроскопии при инициированном окислении МО
в присутствии: 1 - смеси -ТФ+ Сульфид (VI) (2,5×10-5 М),
2 - смеси -ТФ + Амид (V), 3 - -ТФ; С(-ТФ) = const = 2,510-4 М,
Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 С
В настоящей работе изучено действие ФЛ в композиции с рядом
ингибиторов окисления: парацетамолом, осалмидом, ИХФАН-10,
Амидом (V). Действие изучаемых смесей сравнивалось с эффектом
реперных АО дибунола и -токоферолом, эффект синергизма с ФЛ
которых был установлен ранее [215, 216, 219].
Совместное действие АО с ФЛ сравнивалось с антиоксидантным
эффектом индивидуальных компонентов, составляющих смесь.
В таблице 9.6 приведены кинетические параметры поглощения
кислорода МО в присутствии АО и их смесей с ФЛ. При сопоставлении периодов индукции видно, что смесь ФЛ и АО более эффективна, чем индивидуальные АО. Наблюдалось увеличение периодов
индукции и уменьшение максимальной скорости окисления (W -1О2 max).
193
Ci /C0
1
1,0
а
2
0,8
0,6
3
0,4
4
5
0,2
6
7
0,0
0
50
100
150
200
250
Ci /C0
t , мин
1
1,0
2
б
0,8
0,6
0,4
4
5
0,2
3
6
7
0,0
0
50
100
150
200
250
t , мин
Рисунок 9.8 а) Кинетические зависимости расходования
-ТФ С(-ТФ) =2,5×10-4М (3-7) и ИХФАН-10 (1-2) в композиции
-ТФ + ИХФАН-10 по спектроскопическим и хроматографическим
данным: 1,3 - 2,5×10-3 М; 2,4 - 1,25×10-3 М; 5 - 2,5×10-4 М; 6 - 5,0×10-5 М;
7 - 2,5×10-5 М. Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 С. б) Кинетические
зависимости расходования -ТФ С(-ТФ) =2,5×10-4М (3-7) и ИХФАН10-С-16 (1-2) в композиции -ТФ + ИХФАН-10-С-16
по спектроскопическим и хроматографическим данным:
1,3 - 2,5×10-3 М; 2,4 - 1,25×10-3 М; 5 - 2,5×10-4 М; 6 - 5,0×10-5 М;
7 - 2,5×10-5 М. Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 С
194
Для смесей АО и ФЛ выполнялись
свидетельствующие о синергизме: τΣ>Σ(τТФ+τФЛ)
соотношения,
W-1 О2<Σ(W-1 О2+W-1 О2 ФЛ)
инд / add.  100 %
Поскольку ФЛ не тормозят окисление, то приращение значений
периодов индукции связано с эффектом синергизма, проявляющегося
при сочетанном действии ФЛ с исследуемыми АО. Сравнительная
характеристика эффективности смесей приведена в табл. 9.6.
Была исследована зависимость изменения величины эффекта
синергизма от концентрации ФЛ в смеси. Указанная зависимость
приведена на рис. 9.9. Как видно из рисунка, характер кривых для всех
исследуемых АО однотипен. В области (0—3)×10-3 М действие смеси
увеличивается прямо пропорционально концентрации, затем
в диапазоне (3—5)×10-3М сохраняется плато эффективности, дальнейший рост количества ФЛ приводит к постепенному уменьшению
величины синергизма.
Вероятно, систему неферментативной защиты липидов
от окисления представляют не только собственно АО, но и синергисты, роль которых выполняют ФЛ.
40
2
1
35
3
30
5
4
25
20
15
6
10
5
0
0
2
4
6
8
-3
10
С(ФЛ)  10 , М
Рисунок 9.9. Зависимость периодов индукции в синергических
композициях различных АО с ФЛ от концентрации ФЛ:
1-парацетамол, 2-осалмид, 3- α-ТФ, 4- ИХФАН-10, 5- Амид (V),
6-дибунол; Wi= 4,210-8 Мc-1, С(АО) = const = 110-4M, t=600 C
195
1
 / add.  100 %
35
2 3
30
4
25
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
-4
С(АО)  10 , М
Рисунок 9.10. Зависимость эффекта синергизма в совместном
действии ФЛ с различными АО от их концентрации: парацетамол
(1); Амид V (2); α-ТФ (3); ИХФАН-10 (4); Wi= 4,210-8 Мc-1,
С(АО) = const = 110-4M, t=600 C
Таблица 9.6.
Кинетические характеристики окисления метилолеата
в присутствии смесей АО и ФЛ; С(АО) = 210-4 M, С(ФЛ) = 510-4 M,
Wi= 4,210-8 Мc-1, t=600 C
Название АО
α-ТФ
Парацетамол
Осалмид
Амид (V)
ИХФАН-10
Дибунол
τинд, τΣ, мин Wmax×10-7 Wmax×10-7
мин. смеси М×с-1 АО М×с-1 смеси
160
200
6,50
6,00
220
290
1,30
0,97
110
145
2,19
1,93
240
300
3,24
2,08
210
260
4,52
2,13
190
210
6,30
5,80
Δτ,
мин
40
70
35
50
50
20
(/i)
100%
25,0
31,8
31,8
20,9
23,8
10,5
Сопоставление синергических эффектов для различных АО
показало, что их эффективность уменьшается в ряду: парацетамол >
осалмид > -токоферол > СО-4 > ИХФАН-10 > дибунол.
В присутствии одного и того же ФЛ величина эффекта
синергизма определяется химической структурой ингибитора. Обра196
щает внимание, что эффект максимален для неэкранированных
фенолов и минимален для пространственно замещенных АО (рис. 9.10,
табл. 9.6).
Механизм эффектов синергизма в совместном действии
-токоферола и ФЛ был изучен в работе [215]. Прямым методом было
показано, что входящие в состав ФЛ, полиненасыщенные жирные
кислоты способствуют восстановлению активной фенольной формы
-токоферола. При этом снижается участие -токоферола в побочной
реакции (10), приводящей к дополнительному инициированию
процесса. Аминоспирты (этаноламин, холин), входящие в структуру
ФЛ могут разрушать гидропероксиды нерадикальным путем.
Исключается еще один путь расходования -токоферола в реакции
с гидроксильными и алкоксильными радикалами, образующимися
при гомолитическом разложении гидропероксидов.
Таким образом, приведенные данные показывают перспективность совместного применения экранированных фенолов, ФЛ
и -токоферола с целью разработки на их основе синергических
композиций для высокоэффективных способов стабилизации
процессов окисления. Полученные результаты могут служить
методологической основой для оценки комплексного действия смесей,
перспективных для стабилизации окисления пищевых и биологически
активных липидов, лекарственных препаратов, косметических средств.
Выводы:
1 Установлен эффект синергизма в совместном ингибирующем действии ИХФАН-10, ИХФАН-10-С-16 с -токоферолом
при окислении метилолеата, достигающий 40—70 %.
2 Изучен эффект синергизма в совместном ингибирующем
действии Амида (V), Сульфида (VI) с -токоферолом, составляющий
40—55 %.
3 Исследован эффект антагонизма в совместном ингибирующем действии осалмида и парацетамола с -токоферола,
достигающий 30—40 %.
4 Показано, что изученные антиоксиданты образуют синергические смеси с яичным фосфатидилхолином, эффективность бинарных
смесей составляет 20—30 %.
197
ГЛАВА 10.
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА АКТИВНОСТИ
ФЕНОКСИЛЬНЫХ РАДИКАЛОВ
АНТИОКСИДАНТОВ РАЗЛИЧНОГО СТРОЕНИЯ
Методом стационарного фотолиза определены константы
скорости реакции диспропорционирования феноксильных радикалов
антиоксидантов, равные K9=(0,75-2,78)103 М-1×с-1. Определены
значения констант скорости реакции K10эфф. феноксильных радикалов
с липидами разной степени ненасыщенности: метиолеатом,
линолевой,
арахидоновой
кислотами,
в
составе
которых
присутствуют соответственно 1, 2 и 4-кратные связи, а также
фосфолипидами, в состав которых входят полиненасыщенные
жирные кислоты. Установлено, что значение K10эфф. снижается
пропорционально количеству орто-трет-бутильных заместителей
в структуре антиоксидантов и увеличивается с ростом числа
двойных связей в субстрате окисления.
Одним из критериев эффективности антиоксидантов (АО)
является активность образующихся при их окислении феноксильных
радикалов в реакциях (8), (8), (9), (9) и реакциях с субстратом
окисления (10).

In + R → M (8)
`
In + RO2 → M (8)
,`
In + In →

In – In + InH (9), (9)

In + RH →
InH + R (10),
где: RH — липид,
R— алкильный радикал,
InH — ингибитор окисления;
In — радикал ингибитора;
RO2— пероксильный радикал,
In – In — димер,
M — молекулярные продукты.
Энергия
активации
реакции
феноксильных
радикалов
с пероксильными радикалами (реакция (8)), как правило, близка
к нулю. Константы скорости реакции K8 для пространственно
198
затрудненных фенолов меняются в узких пределах, они слабо зависят
от природы радикалов ингибитора и пероксильного радикала, обычно
имеют величину  3×108 (М×с)-1. Таким образом, решающую роль
в антиоксидантной активности фенолов играет реакционная
способность образуемых ими радикалов по реакции (9), которую
считают основным путем гибели феноксильных радикалов в условиях
свободнорадикального окисления.
Изучена активность феноксильных радикалов антиоксидантов
разной степени экранированности при взаимодействии с модельными
субстратами возрастающей ненасыщенности, проведен анализ
взаимосвязи антиоксидантного действия и активности радикалов
ингибитора. Исследования проводили в ряду фенольных АО возрастающей степени экранированности: гидроксибензол < -токоферол <
ИХФАН, СО-4, амиды и сульфид салициловой кислоты, дибунол.
Тестировали активность радикалов основного природного АО —
-токоферола, содержащего в орто-положении по отношению
к ОН-группе два метильных заместителя. Динамику расходования АО
получали методом ИК-спектроскопии в области поглощения
фенольного гидроксила (3600 см-1) после облучения образцов жестким
УФ-светом. При этом сравнивали кинетику превращений фенолов
в двух системах, одна их которых не содержала субстрата, а другая
включала липиды разной степени ненасыщенности. В первой системе
расходование
ингибитора
было
обусловлено
образованием
при фотолизе радикалов, участвующих преимущественно в реакциях
(9), а во второй к указанным реакциям добавлялась реакция (10) —
восстановления феноксилов до фенолов.
На рис. 10.1 а, б приведены ИК-спектры поглощения растворов
-токоферола и дибунола до и после их фотооблучения в течение
определенного времени, при этом интенсивность полосы поглощения
ОН-группы существенно снижалась с увеличением времени фотолиза
за счет образования феноксильных радикалов. Изучены ИК-спектры
растворов АО с различными концентрациями, что позволило
на основании закона Бугера-Ламберта-Бэра определить концентрацию
ингибитора, не прореагировавшего за определенное время фотолиза.
На основании полученных данных строили кинетические кривые
расходования АО.
На рис. 10.2 а, б представлены кривые расходования ИХФАН-10С-10 и СО-4 в процессе фотооблучения растворов с равной начальной
концентрацией АО. Из начальных участков кинетических кривых
определяли скорость расходования АО (табл. 10.1). На основании
199
данных о скорости расходования АО рассчитывали
эффективной константы K9 эфф. с учетом уравнения:
значение
Wрасх. = K9 эфф. In 2
Стационарную концентрацию In определяли методом
УФ-спектроскопии при  = 410-425 нм по формуле In = D /(l  )
с учетом длины кюветы l, наблюдаемой оптической плотности D
и молярного коэффициента экстинкции , принятого равным
4000 лмоль-1с-1 по аналогии с коэффициентом экстинкции
модельных радикалов производных -токоферола [357]. Полученные
нами значения константы K9эфф. для всех исследуемых ингибиторов
являются величинами одного порядка (табл. 10.1). В литературе для
-токоферола приводится величина того же порядка — 3,3103 М-1с-1
(25 0С), при 500 С она составляет 2,2103 М-1с-1, для феноксилов
дибунола K9эфф. = 4,7103 М-1с-1 [204]. Полученные нами значения
константы диспропорционирования токофероксильных радикалов
сравнимы с литературными данными. Снижение константы скорости
реакции K9эфф. у СО-4, по всей вероятности, связано с большим
объемом пара-заместителя, создающим стерические препятствия
для образования димеров в реакции диспропорционирования (реакция
(9)), что было показано для других групп соединений [112, 222].
Установлено, что степень экранированности оказывает
существенное влияние на скорость расходования АО. Так, в равных
концентрациях неэкранированный гидроксибензол расходуется в 5 раз
медленнее пространственно затрудненного дибунола (табл. 10.1).
Феноксильные радикалы, образующиеся при стационарном
фотолизе растворов фенолов, в присутствии ненасыщенных
соединений могут не только вступать в реакцию диспропорционирования, но и расходоваться при взаимодействии с субстратом.
В результате реакции (10) может происходить регенерация фенольной
формы АО. Показано, что при фотолизе растворов АО, дополнительно
включающих субстрат окисления, происходит изменение кинетики
расходования ингибитора.
200
а
1
3
2
3
Е  10 , дм /моль  см
4
2
-2
3
4
1
0
3600
3610
3620
3630
3640
3650
3660
-2
3
Е  10 , дм /моль  см
v, см
-1
б
6
5
1
4
2
3
3
4
2
1
0
3600
3620
3640
3660
3680
3700
v, см
-1
Рисунок 10.1. ИК-спектры поглощения растворов α –
токоферол (а) и дибунола (б) в зависимости от времени их
фотооблучения: 1 - 0; 1 – 20; 3 – 40; 4 - 60 секунд. C(АО) = 8  10-3 М, t
= 200 С
201
Кинетические кривые расходования ИХФАН-10-С-10 и СО-4
с добавкой метилолеата (МО), линолевой кислоты (ЛК), арахидоновой
кислоты (АК) и фосфолипидов (ФЛ) представлены на рис. 10.2 а, б.
Видно, что скорость регенерации АО и активность феноксильных
радикалов в реакции (10) снижается по мере увеличения
экранированности группы OH и повышается при увеличении числа
двойных связей в субстрате окисления (табл. 10.1). Возможность
регенерации активной формы АО в процессе окисления может
способствовать и увеличению эффективности ингибирования. Однако
это происходит лишь при низкой активности алкильных и пероксильных радикалов (R и RO2) в реакциях продолжения цепей [243]:

In + RH →

,
InH + R → RO2 →
ROOH + R
Если образующиеся радикалы (R и RO2) более активны
в реакции (2), чем феноксилы, а активность ингибитора в реакции (7)
невелика, то за счет реакции (10) процесс окисления будет ускоряться.
Следовательно, можно полагать, что ингибирующее действие АО
связано не только с их активностью в реакции с пероксильными
радикалами, но и с активностью феноксилов в реакции с субстратом
окисления. При этом будет проявляться синергизм, если в присутствии
вещества-синергиста образуются радикалы, менее активные, чем RO2.
Количество фенола (InH), который восстанавливался в результате
реакции (10), определялось разностью между концентрациями фенола
в присутствии субстрата (InHS) и без него (InH), отнесенные к одному
и тому же времени облучения по формуле InH = InHS – InH.
Из кинетических кривых, приведенных на рис. 10.2 а, б, определяли
скорость расходования АО в присутствии и в отсутствие субстрата,
а также скорость восстановления феноксилов как InH /t. Из уравнения:
InH / ∆t = K10эфф. RH  In
определяли K10эфф. (табл. 10.1).
202
С(АО)  10-3, М
8
а
7
1
6
2
3
5
4
4
5
3
2
-3
С(АО)  10 , М
0
20
40
60
80
100
120
t фот., с
б
8
1
7
2
6
3
5
4
4
5
3
2
0
20
40
60
80
100
120
t фот., с
Рисунок 10.2 а. Изменения концентрации ИХФАН-10-С-10
в процессе фотооблучения его растворов: 1 - ИХФАН-10-С-10 +
арахидоновая кислота; 2 - ИХФАН-10-С-10 + фосфолипиды;
3 - ИХФАН-10-С-10 + линолевая кислота; 4 - ИХФАН-10-С-10 +
метилолеат; 5 - ИХФАН-10-С-10. б) Изменения концентрации
СО-4 в процессе фотооблучения его растворов: 1 - СО-4 +
арахидоновая кислота; 2 - СО-4 + фосфолипиды; 3 - СО-4 +
линолевая кислота; 4 - СО-4 + метилолеат; 5 - СО-4.
Концентрации АО и субстратов окисления C = 8  10-3 М, t = 200 C
203
Таблица 10.1.
Кинетические характеристики феноксильных радикалов фенолов различного строения С
(субстрата) = 810-3 М, t = 200 С
АО
Гидроксибензол
-Токоферол
Фенозан К
МЭФ
ИХФАН-9
ИХФАН-10
ИХФАН-10-С-8
ИХФАН-10-С-10
ИХФАН-10-С-12
ИХФАН-10-С-16
Дибунол
СО-4
Амид (IV)*
Амид (V)*
Сульфид (VI)*
K9 эфф.
 103,
М-1с-1
0,75
2,08
2,35
2,30
2,35
2,40
2,00
1,88
1,63
1,25
2,78
0,90
1,75
2,38
2,31
Wрасход 10-5, Мс-1
Число -связей в субстрате
0*
1
2
4
ФЛ**
3,0
2,7
2,0
1,4
1,6
8,3
5,0
2,5
0,6
1,0
9,4
5,7
4,4
3,3
2,2
9,2
5,5
4,0
3,0
2,0
9,4
5,6
4,2
3,2
2,1
9,6
5,4
4,1
3,1
2,0
8,0
5,3
3,9
3,0
1,9
7,5
5,0
3,5
2,5
1,5
6,5
4,7
3,1
2,1
1,2
5,0
3,2
2,7
1,3
1,0
16,0
12,5
10,0
5,6
6,7
3,6
2,9
2,2
1,1
1,5
7,0
2,9
2,5
0,8
1,3
11,5
6,5
4,9
1,8
2,4
11,2
6,7
5,0
2,0
2,5
(АО)
=С
Wрег 10-5, Мс-1
K10 эфф 102 М-1с-1
Число -связей в субстрате Число -связей в субстрате
1
2
4
ФЛ**
1
2
4
ФЛ**
3,6
8,0
10,5
9,5
0,21
0,48
0,63 0,57
2,5
5,5
7,0
6,5
0,16
0,34
0,44 0,31
1,9
3,9
5,6
4,1
0,12
0,24
0,35 0,26
2,0
3,8
5,8
4,3
0,13
0,24
0,36 0,27
1,7
3,6
5,7
4,1
0,11
0,23
0,36 0,26
1,8
3,3
5,1
3,7
0,11
0,20
0,30 0,22
2,9
3,2
4,8
3,6
0,18
0,20
0,30 0,23
3,0
3,5
4,5
4,0
0,19
0,22
0,28 0,25
2,8
3,6
4,9
4,2
0,18
0,23
0,31 0,26
2,7
3,7
5,4
4,9
0,17
0,23
0,34 0,31
1,5
1,7
6,0
4,3
0,08
0,09
0,31 0,22
1,8
2,3
6,2
4,5
0,11
0,14
0,39 0,28
2,5
5,3
5,5
5,4
0,16
0,33
0,34 0,34
1,4
3,7
5,5
5,1
0,08
0,21
0,31 0,29
1,3
3,8
5,6
5,0
0,07
0,22
0,32 0,28
*— номер АО соответствует главе 6, табл. 6.1.
*— 0 — субстрат отсутствует; 1 — в качестве субстрата окисления использовался МО (содержит одну π-связь),
2 — ЛК (две π-связи), 4 — АК (четыре π-связи), ФЛ** — фосфолипиды, в состав которых входят полиненасыщенные
жирные кислоты.
204
Самую высокую активность проявляли токофероксильные
радикалы, чем феноксилы пространственно затрудненных АО —
дибунола, СО-4, фенозана К и его метилового эфира, ИХФАН.
Результаты активности феноксильных радикалов, полученные
методом стационарного фотолиза, представляют интерес в качестве
критерия оценки комплексного действия ингибиторов окисления,
перспективных для стабилизации липидов, лекарственных препаратов,
косметических средств.
Выводы:
1. Показано, что значение K10эфф. снижается пропорционально
количеству орто-трет-бутильных заместителей в структуре
антиоксидантов и увеличивается с ростом числа двойных связей
в субстрате окисления.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Полифункциональные
соединения
широко
применяются
для стабилизации окисления пищевых жиров, масел, косметических
средств, лекарственных препаратов. В медицине антиоксиданты
используются в качестве дополнительных средств коррекции
патологических состояний на фоне усиленного свободнорадикального
окисления. Ведется целенаправленный синтез новых ингибиторов
окисления, поиск и скрининг потенциальных антиоксидантов из числа
известных лекарственных препаратов различного фармакологического
действия, а также среди соединений природного происхождения.
Первоначальное тестирование антиоксидантов осуществляется
в модельных системах, что позволяет количественно оценить элементарные реакции многостадийного процесса окисления, установить
взаимосвязь между их строением и антиоксидантными свойствами.
Поскольку большинство известных моделей для тестирования
являются гидрофобными, представлялось актуальным подобрать
гидрофильную липидную систему и проверить её эффективность
на примере известных лекарственных препаратов, а также
протестировать антиоксидантную активность вновь синтезированных
и известных природных соединений.
Для разработки кинетической модели экспресс-тестирования
антиоксидантов исследовали окисление водно-липидных субстратов
в присутствии солей переходных металлов (сульфата железа (II),
хлорида железа (III), хлорида кобальта (II), хлорида никеля (II),
хлорида меди (II)) и поверхностно-активного соединения
205
(триметилцетиламмоний бромида), в качестве моделей липидов
использовались этилолеат и метиллинолеат. В результате проведенных
исследований выявлен наиболее эффективный катализатор — хлорид
меди (II) и предложена новая кинетическая модель для тестирования
биоантиоксидантов. Модельный субстрат содержал эфиры высших
ненасыщенных жирных кислот, водные растворы 2×10 М хлорида
меди (II) и 1×10 М триметилцетиламмоний бромида в конечной
концентрации, соотношение липиды : вода — 1 : 3.
В рамках указанной выше проблемы осуществляли поиск
потенциальных антиоксидантов среди широкого ряда лекарственных
препаратов, установили взаимосвязь между их строением и ингибирующими свойствами, теоретическое обоснование направленного
синтеза новых эффективных структур. В качестве препаратов
для оценки эффективности новой кинетической модели были выбраны
фармакопейные лекарственные препараты с учетом их фенольного
или аминного ароматического характера, без учета спектра
их фармакологического действия. Изучались фенол и его производные:
салициловая кислота, парацетамол, осалмид; гетероциклические
соединения: фентоламин, аллопуринол, эмоксипин; пирокатехин
и его производные: адреналин, метилдофа; из ароматических аминов
исследованы новокаин и коринфар; в качестве серосодержащего
соединения протестирован капотен. В качестве стандартных
антиоксидантов
использовались
2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол
(дибунол, ионол) и -токоферол. В результате наших исследований
получен ряд увеличения антиоксидантной активности лекарственных
препаратов: фентоламин < салициловая кислота < новокаин <
парацетамол < коринфар < метилдофа < адреналин < эмоксипин <
аллопуринол < капотен < осалмид < дибунол.
Разработанный
способ
тестирования
биоантиоксидантов
волюмометрическим методом с использованием каталитического
окисления водно-липидных (эмульсионных) субстратов был внедрен
в НИИ клинической и профилактической кардиологии СО РАМН.
По результатам антиоксидантной активности ряда лекарственных
препаратов различного фармакологического действия было выявлено
наиболее эффективное соединение — осалмид. В Новосибирском
институте органической химии (НИОХ) им. Н.Н. Ворожцова СО РАН
на базе структуры осалмида была синтезирована группа
перспективных амидов салициловой кислоты, имеющих в ортоположении экранирующие трет-бутильные заместители.
Исследована антиоксидантная активность бис-фенилтиолов:
4,4′-ди-меркаптодифенилоксида и 4,4′-димеркаптодифенилметана,
206
синтезированных в Ярославском государственном техническом
университете (ЯГТУ) группой профессора, д. х. н. Москвичева Ю.А.,
в безводных инициированных и водно-липидных катализируемых
субстратах. Установлена высокая антиоксидантная активность тиолов,
превышающая ингибирующие свойства -токоферола и уступающая
активности дибунола. Показано, что серосодержащие соединения
с наличием тиольной группы в процессе окисления разрушают
гидропероксиды молекулярным путем.
Эффект аскорбиновой кислоты при каталитическом окислении
липидных субстратов зависит от её соотношения с катализатором.
При большом избытке катализатора аскорбиновая кислота действует
как инициатор. При соотношениях аскорбиновой кислоты
и катализатора, близких 1 : 1, соединение действует как антиоксидант,
при большом избытке аскорбиновой кислоты наблюдается S-образный
характер кинетических кривых. На основе кинетических данных
предполагается, что аскорбиновая кислота действует как восстановитель катализатора в неактивную форму (Cu) или как инициатор
в виде комплекса с катионами (Cu).
Добавки экстракта элеутерококка способны
тормозить
каталитическое окисление липидных субстратов, возможно, за счет
участия спиртовых гидроксильных групп гликозидов в обрыве цепей.
Обнаружен синергизм бинарной смеси аскорбиновой кислоты
и экстракта элеутерококка, достигающий 160 %.
Перспективными антиоксидантами, обеспечивающими высокую
эффективность ингибирования, являются «гибридные» молекулы.
При этом в структуре антиоксиданта целесообразно присутствие
пространственно затрудненного фенола, реагирующего со свободными
радикалами, и фрагмента, обеспечивающего разрушение гидропероксидов без образования свободных радикалов. Экспериментальное доказательство этих свойств позволит создать новую группу
нетоксичных ингибиторов окисления принципиально нового механизма действия, эффективность которых в сравнении с известными
аналогами может оказаться высокой за счет внутреннего синергизма
в действии различных фрагментов «гибридной» структуры молекул.
В
настоящем
исследовании
представлены
результаты
тестирования антиоксидантов, синтезированных отечественными
научными школами: в Институте биохимической физики
им. Н.М. Эммануэля РАН, г. Москва, и в Новосибирском Институте
органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН. Исследуемые
антиоксиданты в процессе окисления действовали по двум
207
механизмам: реагировали с пероксильными радикалами и разрушали
гидропероксиды с образованием молекулярных продуктов.
Наряду с изучением действия индивидуальных антиоксидантов
разного строения особое значение имело исследование возможности
синергизма в совместном действии двух ингибиторов или их смеси
с веществом-синергистом. Эффект синергизма в действии антиоксидантов позволял получать высокие эффекты ингибирования
при их низких концентрациях. Совместное действие -токоферола
с пространственно затрудненными фенолами в области относительно
низких концентраций многократно превышало аддитивный эффект
индивидуальных компонентов (40—70 %), что свидетельствовало
о проявлении эффекта синергизма, в области высоких концентраций
в действии -токоферола со всеми антиоксидантами проявлялся
антагонизм.
Для бинарных систем, включающих -токоферол и полифункциональные соединения, важное значение имеет реакция последних
с гидропероксидами. Благодаря способности соединений реагировать
с пероксильными радикалами и разрушать гидропероксиды молекулярным путем, появляется возможность внутреннего синергизма
различных функциональных групп, который усиливается в присутствии -токоферола.
Объяснение эффекта антагонизма при высоких концентрациях
ингибиторов связано, по всей вероятности, с участием феноксилов
в побочных реакциях с субстратом окисления, которые с ростом
концентрации антиоксидантов могут увеличивать скорость инициирования и снижать эффективность действия ингибиторов, приводить
к эффекту антагонизма в их совместном действии. Проявление
антагонизма в совместном действии антиоксидантов связано
с накоплением в системе продуктов окисления хиноидного строения.
Эффект антагонизма обусловлен межмолекулярными взаимодействиями между -токоферолом и природными хинонами,
что приводило к уменьшению количества фенольной формы активного
антиоксиданта
и
снижению
эффективности
совместного
действия смеси.
Совместное антиоксидантное действие яичного фосфатидилхолина с рядом соединений различного строения показало проявление
синергизма со всеми ингибиторами. Эффект был максимален в случае
неэкранированных фенолов (парацетамола, осалмида, -токоферола)
и снижался в присутствии соединений с орто-трет-бутильными
заместителями. Эффект синергизма достигал 20—30 %. Механизм
эффекта синергизма связан с взаимодействием феноксилов
208
с фосфолипидами, приводящим к регенерации активной формы
антиоксиданта. Образующиеся малоактивные по сравнению с RO 2
радикалы не участвуют в дополнительном инициировании процесса.
Известно, что входящее в состав фосфолипидов азотистое основание
способно разрушать гидропероксиды нерадикальным путем,
что приводит к уменьшению роли реакций вырожденного разветвления, уменьшению скорости расходования антиоксидантов.
Таким образом, результаты настоящего исследования свидетельствуют, что перспективен направленный синтез полифункциональных
соединений, включающих в своей структуре несколько центров гибели
пероксильных радикалов, а также фрагментов, способствующих
разрушению гидропероксидов. Целесообразной является высокоэффективная стабилизация субстратов к окислению с использованием
синергических композиций, позволяющих ингибировать процесс при
малых количествах антиоксидантов, что особенно важно для
медицины, косметологии, пищевой технологии. Реализация этих задач
возможна на основе знаний взаимосвязи между химическим строением
и антиоксидантной активностью соединений, представлениями
об эффектах синергизма и антагонизма в совместном действии
ингибиторов. Результаты настоящей работы впервые выявляют
взаимосвязь структура — эффективность для группы антиоксидантов
различного строения, показывают перспективы усиления действия
ингибиторов за счет введения в систему вещества-синергиста.
По результатам
исследований
зарегистрировано
13 патентов
на изобретение. Полученные в работе данные могут быть использованы в качестве методологической основы для решения вопросов,
связанных с направленным синтезом высокоэффективных ингибиторов свободнорадикального окисления, а также в подборе ингибиторов и их смесей с прогнозируемой эффективностью, необходимых
для предотвращения окислительной деструкции углеводородов,
включая пищевые продукты, лекарственные и косметические средства.
Список литературы:
1.
2.
3.
Абрамова Ж.И. Оксингендлер Г.И. Человек и противоокислительные
вещества. Л.: Наука, 1985. — 230 с.
Азатян Н.А., Карпухина Г.В., Белостоцкая И.С. и др. Механизм ингибирования процессов окисления двухатомными фенолами // Нефтехимия. —
1973. — Т. 8. — С. 435—440.
Акберова С.И., Мусаев П.И., Магомедов Н.М. и др. Пара-аминобензойная
кислота как антиоксидант // Биоантиоксидант: Тез. докл. V международн.
конф. М., 1998. — 103 с.
209
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Александров А.А., Денисов Е.Т. Отрицательный катализ ионами меди
в цепной реакции окисления циклогексанола // Изв. А.Н. СССР, сер.
химич. — 1969. — № 8. — С. 1652—1665.
Александров А.Л. Специфика жидкофазного окисления алифатических,
алкилароматических и N-алкиламидов молекулярным кислородом //
Кинетика и катализ. — 1987. — Т. 28. — № 3. — С. 536—549.
Алексеева О.М., Ким Ю.А., Миль Е.М. и др. Сравнительное исследование
влияния гибридных антиоксидантов на структуру и функции компонентов
биологических мембран // Биоантиоксидант: Тез. докл. VIII Международн. конф. М., 2010. — С. 17—18.
Алимбаева А.С., Жакина А.Х., Газалиев А.М. и др. А. Синтез
и биологическая активность некоторых производных гидразида салициловой кислоты // Известия НАН РК. Серия химия. — 2007. — № 6. —
C. 82—85.
Алуховская Л.И., Ивашкевич С.П.,Омельченко Л.И. Изменения липидного состава эритроцитарных плазматических и митохондриальных
мембран коркового слоя почек при экспериментальном Д-гиповитаминозе
// Вопр. мед. химии. — 1982. — Т. 28. — № 3. — С. 105—110.
Антоновский В.Л. Органические перекисные инициаторы. М.: Химия,
1972. — 448 с.
Аристархова С.А., Бурлакова Е.Б., Кухтина Е.Н. и др. К механизму
различной биологической активности - и - токоферолов // Вопросы
питания. — 1974. — № 5. — С. 34—37.
Аристархова С.А., Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Изучение ингибирующей
активности токоферола // Изв. АН СССР, сер. хим. — 1972. — № 12. —
С. 2714—2718.
Аристархова С.А., Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. К вопросу о взаимосвязи
природных антиоксидантов в липидах // Биофизика. — 1974. — Т. 19. —
№ 4. — С. 688—691.
Аристархова С.А., Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Вклад токоферолов
в антирадикальные и антиокислительные свойства липидов печени //
Биофизика. — 1973. — Т. 18. — № 5. — С. 857—861.
Арутюнян Р.С., Налбандян Дж.М., Бейлерян Н.М. О механизме распада
нитрила азоизомаслянной кислоты в водных эмульсиях // Кинетика
и катализ. — 1984. — Т. 26. — № 5. — С. 1050—1054.
Арутюнян Р.С., Налбандян Дж.М., Бейлерян Н.М. Инициированное
окисление кумола в водных эмульсиях // Кинетика и катализ. — 1985. —
Т. 26. — вып. 4. — № 6. — С. 1475—1477.
Архипова Г.В., Архипов В.И., Федотова И.Б. и др. Влияние синтетического антиоксиданта фенозана-К на диссоциированное обучение
и состав липидов структур головного мозга у крыс линии КМ // Биоантиоксидант: Тез. докл. международн. конф. М., — 1989. — Т. 1 — С. 146.
210
17. Архипова Г.В., Бурлакова Е.Б., Корман Д.Б. Молекулярные основы
разработки и внедрения антиоксиданта фенозана нового противосудорожного препарата с ноотропным действием для лечения эпилепсии
и больных с нарушениями памяти и обучаемости // Биоантиоксидант: Тез.
докл. VI международн. конф. М., 2002. — С. 45—46.
18. Арчаков А.И. Микросомальное окисление. М.: Наука, 1975. — 326 с.
19. Бабаскин П.М. Определение липидных спектров сыворотки и цельной
крови методом прямой денситометрии тонкослойных хроматограмм //
Лечебное дело. — 1977. — № 7. — С. 406—407.
20. Балдашева Ф.Р., Горбунова М.В., Моисеенко С.П. и др. Влияние
липостабила на состояние рецепторной активности у новорожденных
с перитональной гипоксией // Биологически активные добавки к пище —
нутрицевтики и их использование с профилактической и лечебной целью
при наиболее распространенных заболеваниях. Тюмень. 1995. — С. 14—16.
21. Барабой В.А., Брехман И.И., Голотин В.Г. и др. Перекисное окисление
и стресс. СПб.: Наука, 1992. — 142 с.
22. Барнаулов А.Д., Лимаренко А.Ю., Куркин В.А. и др. Сравнительная
оценка биологической активности соединений, выделенных из видов
Rhodiola L // Фармация. — 1994. — Т. 43. — № 6. — С. 32—37.
23. Баррет Дж.К. Тиолы. Общая органическая химия. / [Под ред.
Н.К. Кочеткова]. М.: Химия, — 1983. — Т. 5. — С. 130—163.
24. Барсель В.А., Щедрина И.С., Вахляев В.Д. и др. Состояние системы
перекисного окисления липидов у больных ишемической болезни сердца
// Кардиология. — 1998. — № 5. — С. 18—20.
25. Бах А.Н. Химия дыхательных процессов // Собрание трудов по химии
и биохимии. М.: Изд-во АН СССР, 1950. — 326 с.
26. Бейлерян С.К., Григорян С.К., Чалтыкян О.А. Исследование распада
кумилгидроперекиси в неводных растворах // Изв. АН Арм. ССР. —
1964. — Т. 17. — С. 245—248.
27. Беккер Г., Пергер В., Домшке Г. Органикум. Практикум по органической
химии. М.: Мир, — 1979. — Т. 2. — 442 с.
28. Беликов В.Г. Синтетические и природные лекарственные средства. М.:
Высш.шк., 1993. — 720 с.
29. Беляков В.А., Шанина Е.Л., Рогинский В.А. и др. Энергия O-H
и ингибирующая способность пространственно-затрудненных фенолов //
Изв. АН СССР. — 1975. — № 12. — С. 2685—2691.
30. Богатыренко Т.Н., Бурлакова Е.Б., Конрадов А.А. Активность антиоксидантов как регуляторов роста клеток растений и ее связь с их физикохимическими константами // Биоантиоксидант: Тез. докл. V международн.
конф. М., 1998. — С. 26.
211
31. Богуславская Л.В., Бурлакова Е.Б., Кольцова Е.А. и др. Синергическое
влияние фосфолипидов на ингибирование автоокисления метилолеата
полигидроксинафтохинонами. // Биоантиоксидант: Тез. докл. международн. конф. М., 1986. — С. 26.
32. Болдырев А.А. Введение в мембранологию. М.: Изд-во МГУ, 1990. —
208 с.
33. Будаговская Н.В., Гуляев В.И. Влияние амбиола, фенозана и верапамила
на скорость роста растений // Биоантиоксидант: Тез. докл.
VI международн. конф. М., 2002. — С. 68—69.
34. Булацкий Н.П., Савенков Н.М. Мягкий метод синтеза метиловых эфиров
высших жирных кислот // Масло-жиров. пром. — 1969. — № 10. —
С. 14—15.
35. Бурлакова Е.Б., Эмануэль Н.М. Особенности действия меркаптамина
и ингибиторов радикально-цепных процессов в реакциях, моделирующих
окисление липидов // Докл. АН СССР. — 1960. — Т. 135. — № 3. —
С. 599—601.
36. Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты и синтетические ингибиторы
радикальных реакций // Успехи химии. — 1975. — Т. 44. — № 10. —
С. 874—886.
37. Бурлакова Е.Б. Молекулярные механизмы действия антиоксидантов
при лечении сердечно-сосудистых заболеваний // Кардиология. —
1980. — № 8. — С. 48—52.
38. Бурлакова Е.Б. Роль липидов в процессе передачи информации в клетке //
Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. М.: Наука, 1981. —
С. 23—34.
39. Бурлакова Е.Б., Алесенко А.В., Молочкина А.М. и др. Биоантиоксиданты
в лучевом поражении и злокачественном росте. М.: Наука, 1975. — 214 с.
40. Бурлакова Е.Б., Крашаков С.А., Храпова Н.Г. Роль токоферолов
в пероксидном окислении липидов биомембран // Биологические
мембраны. — 1998. — Т. 15. — № 2. — С. 137–167.
41. Бурлакова Е.Б., Кухтина Е.Н., Ольховская И.П. и др. Изучение
антирадикальной активности аналогов и гомологов токоферола методом
хемилюминесценции // Биофизика. — 1979. — Т. 24. — С. 975—979.
42. Бурлакова Е.Б., Крашаков С.А., Храпова Н.Г. Кинетические особенности
токоферолов как антиоксидантов. Черноголовка, 1992. — 56 с.
43. Бурлакова Е.Б., Сторожок Н.М., Храпова Н.Г. Изучение суммарной
активности природных антиоксидантов липидов хемилюминесцентным
методом // Биофизика. — 1988. — Т. 33. — № 4. — С. 584—588.
44. Бурлакова Е.Б., Сторожок Н.М., Храпова Н.Г. Исследование роли
функциональных групп в действии фосфолипидов как синергистов
окисления // Биологические мембраны. — 1990. — Т. 7. — № 6. —
С. 612—618.
212
45. Бурлакова Е.Б., Сторожок Н.М., Храпова Н.Г. и др. Изучение аддитивного
антиокислительного действия суммы природных антиоксидантов липидов
// Вопросы медицинской химии. — 1990. — Т. 36. — № 4. — С. 72—74.
46. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Связь физико-химических характеристик
ингибиторов радикальных процессов с их строением // Теория и практика
жидкофазного окисления. М.: Наука, 1974. — С. 244—248.
47. Бурлакова Е.Б., Храпова М.Г. Перекисное окисление липидов мембран
и природные антиоксиданты // Успехи химии. — 1985. — Т. 54. —
№ 9. — С. 1540—1558.
48. Бурлакова Е.Б., Гайнцева В.Д., Слепухина Л.В. и др. Антирадикальная
активность и радиозащитные свойства ингибиторов радикальных реакций
// Докл. АН СССР. — 1964. — Т. 164. — № 4. — С. 1398—1400.
49. Бурлакова Е.Б., Кухтина Е.Н., Сарычева И.К. и др. О влиянии боковой
фитильной цепи токоферолов на окислительные реакции, протекающие
в липидах // Биохимия. — 1982. — Т. 47. — № 6. — С. 987—992.
50. Вайсбергер А., Проскауэр Э., Ридунк Д. и др. Органические растворители.
М.: Ин. лит-ра, 1958. — 560 с.
51. Варламов В.Т. Вторичные ароматические амины как катализаторы
и ингибиторы цепной реакции хинонимина с гидрохиноном // Докл.
АН. — 1995. — Т. 345. — № 3. — С. 339—342.
52. Васюкова Н.Н., Озерецковская О.Л. Индуцированная устойчивость
растений и салициловая кислота // Прикладная биохимия и микробиология. — 2007. — Т. 43. — № 4. — С. 405—411.
53. Виноградова Л.Ф., Харлицкая Е.В., Мирзоян Ж.А. и др. Антицитолитическая активность убихинона-10 при поражении печени хлорированными углеводородами // Экспериментальная и клиническая
фармакология. — 1994. — Т. 57. — № 6. — С. 54—57.
54. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. — 252 с.
55. Владимиров Ю.А., Суслова Т.Б., Оленев В.И. Регуляторная роль ионов
железа в перекисном окислении липидов в митохондриях. Митохондрии.
Транспорт электронов и преобразование энергии. М., 1976. — С. 109—125.
56. Владимиров Ю.А. Свободно-радикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран // Биофизика. —
1987. — Т. 32. — № 5. — С. 830—844.
57. Воевода Т.В., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В. Изучение токсического
действия фенольного антиоксиданта СО-3 в субхроническом эксперименте // Экспериментальная и клиническая фармакология. — 2000. —
Т. 63. — № 4. — С. 57—60.
213
58. Волчегорский И.А., Тур Е.В., Солянникова О.В. и др. Эффективность
применения производных 3-оксипиридина и янтарной кислоты в комплексном лечении первичной открытоугольной глаукомы // Экспериментальная и клиническая фармакология. — 2012. — Т. 75. — № 7. — С. 20—26.
59. Воскресенский О.Н. Влияние природных антиоксидантов на патологические процессы, связанные со старением // Итоги науки и техники.
Общие проблемы биологии. — 1986. — Т. 5. — С. 163—201.
60. Воскресенский О.Н., Девяткина Т.В. Элементарные факторы в генезе
атеросклероза // Вопр. питания. — 1978. — № 16. — С. 30—34.
61. Галян С.Л. Предупреждение и ограничение витаминами-антиоксидантами
нарушений гемостаза, вызываемых тромбинемией. Автореф. дисс. …
докт. мед. наук. Челябинск, 1993. — 43 с.
62. Гаммет Л. Основы физической органической химии [Под ред.
Л.С. Эфроса]. М.: Мир, 1972. — 534 с.
63. Георгиев В.Н., Дурнев А.Д., Середенин С.Б. Антимутагенные свойства
убихинона-10 // Бюл. экспер. биол. и мед. — 1994. — № 9. — С. 270—273.
64. Гладких С.П. Аскорбиновая кислота и методы повышения ее устойчивости в лекарственных формах // Технология. 1970. — С. 37—42.
65. Гладышев С.П., Цепалов В.Ф. Тестирование химических соединений
как стабилизаторов полимерных материалов // Успехи химии. — 1975. —
Т. 44. — № 10. — С. 1830—1850.
66. Глушенко Н.Н. Антиоксиданты в косметики // Биоантиоксидант: Тез.
докл. VI международн. конф. М., 2002. — С. 115—116.
67. Голиков А.П., Овчинников А.Л., Полумисков В.Ю. Антиоксидант эмоксипин: влияние на формирование очага некроза и репаративные процессы
при инфаркте миокарда // Кардиология. — 1990. — № 7. — С. 50—53.
68. Гольденберг В.И., Шмулович В.Г. Юрченко Н.И. Хемилюминесцентные
методы исследования ингибированного окисления минеральных масел
и жиров // Нефтехимия. — 1978. — Т. 18. — № 5. — С. 731—738.
69. Гольденберг В.Н., Юрченко Н.И., Ершов В.В. и др. Антирадикальная
активность ингибиторов окисления в жирах // Изв. АН. СССР. сер.
химич. — 1977. — № 11. — С. 2473—2477.
70. Гонский Я.И., Шершун Г.Г., Баган О.Ф. и др. Антиперекисное и мембранопротекторное действие антиоксидантов – производных фенолов
при экспериментальной ожоговой болезни // Биоантиоксидант: Тез. докл.
международн. конф. М., — 1989. — Т. 1. — С. 106.
71. Гончарова Л.Л., Покровская Л.А., Ушакова И.Н. и др. Роль антиоксидантных механизмов в реакциях организма на действие низкоинтенсивного
лазерного излучения // Радиационная биология. Радиоэкология. — 1994. —
Т. 34. — № 3. — С. 368—374.
72. Горяев М.И., Евдакова Н.А. Справочник по газожиткостной хроматографии органических кислот. Алма-Ата: Наука, 1977. — 550 с.
214
73. Горяев М.И. Синтез и применение моноглицеридов. Алма-Ата: Наука,
1975. — 135 с.
74. Грасси Н., Скотт Дж. Деструкция и стабилизация полимеров. М.: Мир,
1988. — С. 82—99.
75. Грибанов Г.А., Сергеева С.А. Экспресс-микроанализ общих липидов
сыворотки крови и их фракций // Вопр. мед. химии. — 1975. — Т. 21. —
№ 6. — С. 652—655.
76. Губский Ю.А. Регуляция перекисного окисления липидов в биологических мембранах // Биохимия животных и человека. — 1978. — № 2. —
С. 72—76.
77. Гудивон Я.С. Эффективность сочетаемого применения строфантина
и альфа-токоферола при острой сердечной недостаточности // Фармакология кардиотонических средств. М., 1987. — С. 76—83.
78. Гук А.Ф., Цепалов В.Ф. Влияние вязкости среды на скорость образования
радикалов при распаде инициатора азобисизобутиронитрила в реакции
окисления полистирола в растворах // Кинетика и катализ. — 1971. —
Т. 12. — Вып. 4. — № 6. — С. 910—913.
79. Дардымов И.В. Женьшень, элеутерококк. М.: Наука, 1976. — 184 с.
80. Дардымов И.В. Механизм действия препаратов женьшеня и элеутерококка Автореф. дисс. … докт. мед. наук. Л.,1987. — 41 с.
81. Дарюхина Е.Н. Кинетические эффекты совместного ингибирующего
действия -токоферола с природными соединениями изопреноидного
строения и фосфолипидами. Автореф. дисс. … канд. хим. наук. Тюмень,
2004. — 23 с.
82. Дегтярев И.А., Заиков Г.Е. Ионол. Распределение в организме и биологическое действие // Хим.-фарм. журн. — 1985. — № 10. — С. 1160—1168.
83. Денисов Е.Т. Регенерация ингибиторов и отрицательный катализ
в цепных реакциях окисления // Кинетика и катализ. — 1970. — Т. 11. —
№ 2. — С. 312—320.
84. Денисов Е.Т. Хиноны как акцепторы атома водорода и активаторы
антиоксидантов // Кинетика и катализ. — 1997. — Т. 38. — № 6. —
С. 832—838.
85. Денисов Е.Т. Константы скорости гомолитических жидкофазных реакций
М.: Наука, 1971. — 711 с.
86. Денисов Е.Т. Циклические механизмы обрыва цепей в реакциях
окисления органических соединений // Успехи химии. — 1996. —
Т. 65. — № 6. — С. 547—563.
87. Денисов Е.Т. Кинетика гомогенных химических реакций. М.: Высшая
школа, 1978. — 367 с.
88. Денисов Е.Т. Элементарные реакции ингибиторов окисления // Успехи
химии. — 1973. — Т. 42. — № 3. — С. 361—390.
215
89. Денисов Е.Т., Азатян В.В. Ингибирование цепных реакций. Черноголовка,
1997. — С. 114—179.
90. Денисов Е.Т., Эмануэль Н.М. Кинетические критерии эффективности
ингибиторов окисления // Кинетика и катализ. — 1973. — Т. 14. —
№ 4. — С. 823—829.
91. Джапаридзе Л.М. Влияние умеренной недостаточности витамина Е
на метаболизм и функцию сердца. Автореф. дисс. ... докт. мед. наук. М.,
1987. — 24 с.
92. Дмитриев Л.Ф., Верховский М.И. О механизме взаимодействия токоферола с перекисными радикалами // Биохимия. — 1990. — Т. 55. —
№ 11. — С. 2025—2030.
93. Дмитриева С.А., Пономарева А.А., Минибаева Ф.В. и др. АФК и протонопосредованное действие салициловой кислоты на рост и ультраструктуру
клеток корня пшеницы // Учен. Зап. Казан. Ун-та. Сер. Естеств. науки. —
2008. — Т. 150. — С. 123—135.
94. Домбровский В.С. Изучение связывания фенозана с сывороточным
альбумином человека // Биоантиоксидант: Тез. докл. международн. конф.
М., — 1989. — Т. 1. — С. 247—248.
95. Дормидонтов Ю.П. Методы УФ, ИК и ЯМР спектроскопии и их применение в органической химии. Учебное пособие. Пермь: ПГУ химический
факультет, 2001. — 79 с.
96. Доровских В.А., Целуйко С.С., Кодинцев В.В. и др. Эмоксипин в клинике
и эксперименте. Благовещенск. Из-во Полисфера, 2005. — 110 с.
97. Дремена Е.С., Шаров В.С. Кинетика Fe (2) — индуцированного перекисного окисления липидов в липосомах в присутствии аскорбиновой
кислоты, концентрированные эффекты ионов Fe (2) // Биофизика. —
1995. — Т. 40. — № 2. — С. 335—340.
98. Дремина Е.С., Вахрушева Т.В., Шаров В.С. и др. Хемилюминесцентное
исследование содержания продуктов перекисного окисления липидов,
индуцированного ионами меди в различных фракциях липопротеинов
плазмы крови человека // Бюл. эксп. биол. и медицины. — 1995. —
№ 2. — С. 145—149.
99. Дубинский В.З., Рогинский В.А., Миллер В.Б. О роли хинолидных
перекисей при окислении ингибированном фенолами // Докл.
АН СССР. — 1975. — Т. 220. — № 6. — С. 1360—1363.
100. Дулицкая Р.Ф., Фельдман Р.И. Практикум по физической и коллоидной
химии. М.: Высшая школа, 1978. — 296 с.
101. Душкин М.И., Просенко А.Е., Кандалинцева Н.В. и др. Влияние
антиоксиданта Тиофан на индукцию цитохромов Р-450 печени крыс. //
Научный вестник Тюменской медицинской академии. — 2003. — № 1. —
С. 11—13.
216
102. Евстигнеева Р.П., Волков И.М., Чудинова В.В. Витамин Е как универсальный антиоксидант и стабилизатор биологических мембран // Биологические мембраны. — 1998. — Т. 15. — № 2. — С. 119—135
103. Еляков Г.Б., Оводов Ю.С. Гликозиды аралиевых // Химия природ.
Соединений. — 1972. — № 6. — С. 697—709.
104. Енгибарян А.А., Карагезян К.Г. Роль сочетанного применения альфатокоферола и нуклеинита натрия в нормализации фосфолипидного
состава мышцы сердца при моделировании инфаркта миокарда // Укр.
биохим. журн. — 1984. — Т. 52. — № 2. — С. 146—152.
105. Ерин А.Н., Спирин М.М., Табидзе Л.В. и др. Образование комплексов
-токоферола с жирными кислотами. Возможный механизм стабилизации
мембран витаминов Е // Биохимия. — 1983. — Т. 48. — № 11. —
С. 1855—1861.
106. Ершов В.В.,
Никифоров Г.А.,
Володькин А.А.
Пространственнозатрудненные фенолы. М, 1972. — 351 с.
107. Ершов Ю.А., Попков В.А., Берлянд А.С. Общая химия. Биофизическая
химия. Химия биогенных элементов. М.: Высш.шк., 1993. — 560 с.
108. Заславский Ю.А., Храпова Н.Г., Терехова С.Ф. и др. Вклад убихинона
в антирадикальные и антиоксилительные свойства липидов // Биофизика. — 1977. — Т. 22. — № 2. — С. 359—361.
109. Захарова Н.А. Антирадикальные свойства природных фенолов и их синтетических аналогов. Дисс. …канд. хим. наук. М., 1972. — 180 с.
110. Захаров И.В. Механизм каталитического аутоокисления этилбензола
и тетралина в присутствии солей кобальта и брома // Кинетика
и катализ. — 1974. — Т. 15. — № 6. — С. 1457—1465.
111. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Окислительный стресс.
Биохимические и патофизиологические аспекты. М.: Наука / Интерпериодика, 2001. — 343 с.
112. Зенков Н.К., Кандалинцева Н.В., Ланкин В.З. Фенольные биоантиоксиданты. Новосибирск, СО РАМН, 2003. — 328 с.
113. Золотова Т.В., Карпухина Г.В., Майзус З.К. и др. Некоторые особенности
механизма синегризма при действии смесей ингибиторов, обрывающих
цепи окисления и разрушающих перекиси // Докл. АН СССР. –— 1975. —
Т. 223. — № 2. — С. 120—123.
114. Зорина О.М., Брагинская Ф.И. Воздействие биоантиоксидантов (производных фенозана) на мембраносвязанную антихолинэстеразу и механичнские свойства эритроцитов // Биоантиоксидант: Тез. докл. международн. конф. М., — 1989. — Т. 1 — С. 81—82.
217
115. Зорькина А.В., Просвирина О.Н. Влияние рубомицина, мексидола
и эмоксипина на некоторые метаболические показатели и процесс
спонтанного метастазирования в условиях экспериментальной неоплазии
// Экспериментальная и клиническая фармакология. — 2007. — Т. 70. —
№ 1. — С. 57—59.
116. Зуев И.В. Модификация флюорометрического микрометода определения
свободного токоферола в сыворотке крови и в мембранах эритроцитов //
Мед. журн. Узбекистана. — 1984. — № 7. — С. 68—70.
117. Иваненко Е.Ф. Биохимия витаминов. Киев: Высшая школа, 1970. — 134 с.
118. Иванов И.И., Мерзляк М.Н., Тарусов Б.Н. Витамин Е, биологическая роль
в связи с антиоксидантными свойствами // Биоантиокислители. Труды
МОИП. М.: Наука, — 1975. — Т. 52. — С. 30—52.
119. Ивницкий Ю.Ю., Головко А.И., Софронов Г.А. Янтарная кислота
в системе средств метаболической коррекции функционального состояния
резистентности организма. СПб.: Лань, 1998. — 82 с.
120. Кагава Ясуо. Биомембраны. М.: Высш. шк., 1985. — 303 с.
121. Каган В.Е., Писарев В.А., Архипенко Ю.В. и др. Модификация ферментной системы транспорта кальция в саркоплазматическом ретикулуме при
перекисном окислении липидов. Повреждение при развитии патологических состояний // Биохимия. — 1983. — Т. 47. — № 7. — С. 1141—1148.
122. Кальнова Н.Ю., Пальмина Н.П. Изменение фосфолипидного состава
и антиокислительной активности липидов эритроцитов при опухолях
молочной железы и их радиационном лечении // Биохимия. — 1980. —
Т. 45. — № 9. — С. 1646—1653.
123. Кандалинцева Н.В. Синтез, свойства и исследование антиокислительной
активности
галогенидов
S-[ω-(4-гидроксиарил)алкил]изотиурония.
Автореф. дисс. … канд. хим. наук. Новосибирск, Новосибирский
государственный педагогический университет, 2002. — 24 с.
124. Капитанов А.Б., Пименов А.М. Каротинойды как антиоксидантные
модуляторы клеточного метаболизма // Успехи современной биологии. —
1996. — Т. 116. — № 2. — С. 98—112.
125. Карагезян М.К., Овсепян Л.М., Захарян Г.В. и др. Нарушение липидного
метаболизма и дыхательной функции митохондрий мозга и печени белых
крыс при моделировании зеараленового токсикоза и нормализующие
эффекты свободного этаноламина и его соединений // Биоантиоксидант:
Тез. докл. VI международн. конф. М., 2002. — С. 245—246.
126. Карпухина Г.В., Эмануэль Н.М. Классификация синергических смесей
антиоксидантов и механизмов синергизма // Докл. АН СССР. — 1984. —
Т. 276. — № 5. — С. 1163—1167.
127. Карпухина Г.В., Майзус З.К., Эмануэль Н.М. Механизм явления синергизма при ингибировании цепных вырожденно-разветвленных реакций
окисления смесями ароматических аминов и 2,6-дизамещенных фенолов //
Докл. АН СССР. — 1968. — Т. 182. — № 4. — С. 870—873.
218
128. Карпухин О.Н., Шляпинтох В.Я., Золотова Н.В. Хемилюминесценция
в реакциях ингибированного окисления и активность ингибиторов. //
Изв. АН СССР, сер.хим. — 1963. — № 10. — С. 1718—1793.
129. Карташева З.С., Касаикина О.Т. Каталитическое действие нитроксильных
радикалов в реакции пероксидов с экранированными фенолами //
Кинетика и катализ. — 1991. — Т. 32. — № 2. — С. 291—296.
130. Касаикина О.Т., Гагарина А.Б., Эмануэль Н.М. Реакционная способность
-каротина при взаимодействии со свободными радикалами // Изв. АН
СССР. — 1975. — № 10. — С. 2243—2247.
131. Касаикина О.Т., Кортенска В.Д., Маринова Э.М. и др. Ингибирующая
активность природных фенольных антиоксидантов в процессе окисления
липидных субстратов // Изв. Академии наук. Сер. хим. — 1997. — № 6. —
С. 1119—1122.
132. Касаикина О.Т. Полифункциональные антиоксиданты на основе гидрированного хинолина. Эффективность торможения, реакционная
способность, химические превращения в процессе окисления. Автореф.
дисс. … докт. хим. наук. Черноголовка, 1992. — 45 с.
133. Кеда Б.И., Хомяков А.Е. Определение содержания высших жирных
кислот в сыворотке крови людей методом газовой хроматографии // Лаб.
дело. — 1975. — № 2. — С. 87—90.
134. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализы и идентификация
липидов. М.: Мир, 1975. — 324 с.
135. Клебанов Г.И.,
Любицкий О.Б., Васильева О.В.
Антиоксидантные
свойства производных 3-оксипиридина: мексидола, эмоксипина и проксипина // Вопросы мед. химии. — 2001. — № 3. — С. 288—300.
136. Климов А.Н. Липопротеиды плазмы крови: некоторые нерешенные
и дискуссионные вопросы: Тез. докл. VI симпозиума по биохимии
липидов. С.П., 1995. — С. 3—11.
137. Коган А.Х., Сыркин А.Л., Дриницина С.В. Кислородные свободнорадикальные процессы в патогенезе ишемической болезни сердца и перспективы применения антиоксиданта Q10 (убихинона) для их коррекции //
Кардиология. — 1997. — № 12. — С. 62—70.
138. Козлов Ю.П. Свободные радикалы и их роль в нормальных
и патологических процессах. М.: Изд. МГУ, 1973. — 174 с.
139. Козлов Ю.П., Данилов В.С., Каган В.Е. и др. Свободнорадикальное
окисление липидов в биологических мембранах. М.: Изд. МГУ, 1972. —
79 с.
140. Колб В.Г., Камышников В.С. Клиническая биохимия. Минск: Беларусь,
1976. — С. 152—154.
141. Колмыкова В.И., Захарова Е.В. Нарушение состава жирных кислот
и процессов перекисного окисления липидов при хронической ишемической болезни сердца // Сов. медицина. 1989. — С. 5—8.
219
142. Коломийцева И.К. Радиационная биохимия мембранных липидов. М.:
Наука, 1989. — 180 с.
143. Кондратьева М.Б., Валеева И.Х., Камбург Р.Г. и др. Биоантиокислительная активность оригинальных производных сульфоновых кислот //
Биоантиоксидант: Тез. докл. IV Всерос. конф. М., — 1993. — Т. 1. —
С. 55—56.
144. Конь И.Я., Горгошидзе Л.Ш., Васильева О.Н. и др. Витамин А и перекисное окисление липидов: влияние недостаточности ретинола //
Биохимия. — 1986. — Т. 51. — № 1. — С. 70—76.
145. Крепс Е.М. Липиды клеточных мембран. Л.: Наука, 1981. — 399 с.
146. Кривандин А.В., Фаткуллина Л.Д., Шаталова О.В. и др. Исследование
встраивания антиоксиданта ИХФАН в липосомы методом малоуглового
рентгеновского рассеяния // Химическая физика. — 2013. — Т. 32. —
№ 5. — С. 91—96.
147. Круглов Д.А. Влияние катионных поверхностно-активных веществ
на окисление лимонена. Дисс. … канд. хим. наук. М., 2009. — 97 с.
148. Крысин А.П. Новая технология получения фенольных антиоксидантов,
содержащих в алифатической цепи пара-заместителя функциональную
группу // Биоантиоксидант: Тез. докл. V международн. конф. М., 1998. —
С. 50—51.
149. Крысин А.П. Обоснование наличия в структуре биоантиоксиданта
фотостабилизирующего фрагмента. Синтез новых производных салициловой кислоты. // Биоантиоксиданты. Научный вестник Тюменской
мед. академии. Тюмень. — 2003. — № 1. — С. 75—77.
150. Курганов Б.И. Аллостерические ферменты. М.: Наука, 1978. — 246 с.
151. Кухтина Е.Н., Храпова Н.Г., Бурлакова Е.Б. Особенности антиоксилительного действия токоферолов как природных антиоксидантов // Докл.
АН СССР. — 1983. — Т. 272. — № 3. — С. 729—732.
152. Кучер Р.В., Пейчева А.И., Николаевская А.Н. Исследование ингибирующей способности диоксипроизводных бензола в реакции жидкофазного окисления этилбензола // Нефтехимия. — 1972. — Т. 12. —
№ 1. — С. 53—57.
153. Ланкин В.З., Закиров А.Н., Касаткина Л.В. и др. Перекиси липидов
и атеросклероз. Содержание продуктов перекисного окисления липидов
в крови больных ишемической болезнью сердца // Кардиология. —
1979. — № 10. — С. 69—72.
154. Ланкин В.З., Гуревич С.М., Бурлакова Е.Б. Изучение аскорбатзависимого
переокисления липидов тканей при помощи теста с 2-тио-барбитуровой
кислотой // Биоантиокислители. М.: Наука, — 1975. — Т. 52. — С. 73—78.
155. Ланкин В.З., Вихерт А.М., Тихазе А.К. и др. Роль перекисного окисления
липидов в этиологии и патогенезе атеросклероза // Вопр. мед. хим. —
1989. — № 3. — С. 18—24.
220
156. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Коновалова Г.Г. и др. Концентрационная
инверсия антиоксидантного и прооксидантного действия -каротина
в тканях in vivo // Бюлл. эксп. биологии и медицины. — 1999. — Т. 128. —
№ 9. — С. 314—316.
157. Ломухин Ю.М., Арчаков А.И., Владимиров Ю.В. и др. Холестериноз. М.:
Медицина, 1983. — 277 с.
158. Луконькин И.Н. Эффекты синергизма в совместном антиоксидантном
действии -токоферола с производными пантоевой кислоты и L-карнитином. Дис. … канд. хим. наук. Тюмень, 2000. — 139 с.
159. Лукьянова Л.Д., Чернобаева Г.Н., Власова И.Г. и др. Коррекция нарушений энергетического обмена при гипоксии с помощью витамина К //
Экспериментальная и клиническая фармакология. — 1992. — Т. 55. —
№ 1. — С. 44—47.
160. Майзус З.К., Скибида И.П., Гагарина А.Б. Окисление углеводородов
в жидкой фазе в присутствии соединений переменной валентности //
Журнал физической химии. — 1975. — Т. 49. — № 1. — С. 2491—2503.
161. Мальцева Е.Л., Пальмина Н.П., Бурлакова Е.Б. Природный (α-токоферол)
и синтетический (калиевая соль фенозана) антиоксиданты как регуляторы
активности протеинкиназы С в широком диапазоне концентраций //
Биологические мембраны. — 1988. — Т. 15. — № 2. — С. 199—212.
162. Мансурова И.Д., Султанова У.К. Определение содержания высших
жирных кислот в сыворотке крови здоровых и больных хроническим
панкреатитом методом газовой хроматографии // Лаб. дело. № 9. —
С. 524—527.
163. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М.: Новая волна, 2000. — 608 с.
164. Меерсон Ф.З. Адаптация, стресс и профилактика. М.: Наука, 1981. — 278 с.
165. Михайлов Г.М., Омарова Л.А., Варыханов А.А. Островский О.Л. Влияние
препарата «ИХФАН-2» на показатели, характеризующие его антиокислительную активность в опытах in vivo и in vitro // Биоантиоксидант: Тез.
докл. международн. конф. М., — 1989. — Т. 1. — С. 73—74.
166. Молочкина Е.М., Озерова И.Б., Брагинская Ф.И. и др. Антиоксидантные
(АО) и антиацетилхолинэстеразные (антиАХЭ) свойства гибридных
соединений группы Ихфанов // Биоантиоксидант: Тез. докл. V международн. конф. М., 1998. — С. 153—154.
167. Москвичев Ю.А., Тарасов А.В., Алов Е.М., Герасимова Н.П. Синтез
органических соединений серы на основе производных ароматических
сульфокислот // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). —
1995. — Т. 49. — № 6. — С. 21—34.
168. Наумов В.В. Кинетические характеристики реакций убихинонов
и родственных соединений как антиоксидантов в модельных системах
возрастающей сложности. Автореф. дисс. … канд. хим. наук. М., 1985. —
24 с.
221
169. Никитин В.А., Попова Л.Я. Фосфолипиды митохондрий печени
в онтогенезе белых крыс // Молекулярная биология старения. Киев:
Наукова думка, 1969. — С. 3—9.
170. Никифоров Г.А., Белостоцкая И.С., Вольева В.Б. и др. Биоантиоксиданты
«поплавкового» типа на основе производных 2,6-дитретбутил-фенола //
Биоантиоксиданты. Научный вестник Тюменской мед. академии,
Тюмень. — 2003. — № 1. — С. 50—51.
171. Николаевский А.Н., Филиппенко Т.А., Серговская Т.С. Ингибирующие
свойства некоторых антиоксидантов окисления подсолничного масла //
Хим.-фарм. журн. — 1980. — № 11. — С. 102—106.
172. Никушкин Е.В. Перекисное окисление липидов при эпилепсии. Антиоксиданты в противосудорожной терапии. Автореф. дисс. ... докт. мед. наук.
М., 1991. — 42 с.
173. Огурцов Ю.А. Изучение антиоксидантного и гепатопротекторного
действия новых синтетических производных коричной кислоты. Автореф.
дисс. ... канд. мед. наук. Пятигорск, 1993. — 20 с.
174. Опейда И.А., Шендрик А.Н., Качурин И.О и др. Кинетика поглощения
кислорода и хемилюминесценции при окислении липидов в присутствии
ионов Fe2+// Кинетика и катализ. — 1994. — Т. 35. — № 1. — С. 38—44.
175. Орлова С.В. Энциклопедия биологически активных добавок к пище. М.:
Мир, 1998. — С. 3—4.
176. Орлова Т.Н., Толстикова Т.Г., Сорокина И.В. и др. Фармакокинетика
нового фенольного антиоксиданта СО-3 // Химико-фармацевтический
журнал. — 2000. — Т. 34. — № 9. — С. 9—11.
177. Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров Ю.А. Активные формы
кислорода и их роль в организме//Успехи биологической химии. М.:
Наука, 1990. — Т. 31. — С. 181—209.
178. Паничева Л.П., Третьяков Н.Ю., Яковлева С.А. и др. Мицелярно- каталитическое окисление углеводородов. 1. Окисление кумола кислородом
в водных растворах додецилсульфата натрия в присутствии сульфата
меди // Кинетика и катализ. — 1990. — Т. 31. — № 1. — С. 96—101.
179. Паршина Е.Ю., Гендель Л.Я., Рубин А.Б. Влияние гидрофобных свойств
производных ряда ихфанов на их мембранотропное действие // Химикофармацевтический журнал. — 2012. — Т. 46. — № 2. — С. 17—20.
180. Перевозкина М.Г., Тихонова В.В., Ушкалова В.Н. Каталитическое
окисление липидных субстратов в присутствии фенолов и аминов //
Свободно-радикальное окисление липидов в эксперименте и клинике.
Тюмень. Из-во Тюм.ГУ, 1997. — С. 90—104.
181. Перевозкина М.Г. Каталитическое окисление липидов в водных растворах
в присутствии солей металлов переменной валентности // Актуальные
проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины
и фармации: Тез. докл. 35-й Всерос. науч. конф. Тюмень, 2001. — С. 55—57.
222
182. Перевозкина М.Г. Кинетика и механизм ингибирующего действия
производных фенозана, салициловой кислоты и их синергических смесей
с α- токоферолом и фосфолипидами. Автореф. дисс. ... канд. хим. наук.
Тюмень, 2003. — 28 с.
183. Перевозкина М.Г., Силина Е.Г., Глушков В.С. и др. Эффекты синергизма
мексидола с серосодержащим фенолом СО-4 и -токоферолом в процессе
ингибированного окисления метилолеата // Молекулярные механизмы
регуляции функции клеток: Тез. докл. межд. симп. Тюмень, 2005. —
С. 150—152.
184. Перевощикова Н.Б., Суханова Е.А. Исследование комплексообразования
железа (III) с некоторыми органическими красителями в водных
растворах // Вестник Удмуртского университета. Физика. Химия. —
2011. — Вып. 2. — С. 64—76.
185. Петрович Ю.А., Гуткин Д.В. Свободнорадикальное окисление и его роль
в патогенезе воспаления, ишемии и стресса // Патол. физиология
и экспериментальная терапия. — 1986. — № 5. — С. 85—92.
186. Петрыкина З.М., Полин А.Н., Плеханова Л.Г. Антимикробная активность
фенозана // Биоантиоксидант: Тез. докл. международн. конф. М., —
1989. — Т. 1. — С. 93—94.
187. Петряев Е.П., Шадыро О.И. Радиационная химия бифункциональных
органических соединений. Минск, 1986. — 164 с.
188. Пименова Н.С. Механизм действия ряда антиоксидантов и стабилизация
липидных витаминных препаратов. Дис. канд. хим. наук. М., 1985. — 173 С.
189. Победимский Д.Г., Бугаченко А.А. О механизме ингибирующего действия
фосфитов и сульфитов. Сообщение 1. Кинетика и механизм реакции
гидроперекисей с алифатическими фосфитами // Изв. АН СССР, сер.
химич. — 1968. — № 6. — С. 1181—1186.
190. Полякова Н.В., Шишкина Л.Н., Тырсин Ю.А. Влияние аскорбиновой
кислоты и ее производных на перекисное окисление липидов in vitro и in
vivo // Биоантиоксидант: Тез. докл. IV конф. М., — 1992. — Т. 1. — С. 39—40.
191. Прайор У. Свободные радикалы в биологии. М.: Мир, — 1979. — Т. 1. —
С. 279—283.
192. Просенко А.Е. -(4-гидроксиарил)галогеноалканы и серосодержащие
антиоксиданты на их основе. Автореф. дисс. … канд. хим. наук.
Новосибирск, 2000. — 22 с.
193. Просенко А.Е. Полифункциональные серо-, азот, фосфорсодержащие
антиоксиданты на основе алкилированных фенолов: синтез, свойства,
перспективы применения. Автореф. дисс. … докт. хим. наук. Новосибирск,
Новосибирский государственный педагогический ун-т, 2010. — 48 с.
194. Просенко А.Е., Ким А.М., Крысин А.П. и др. Бис-[-(3,5-ди-трет-бутил-4оксифенил)алкил]сульфиды в качестве термостабилизаторов полимерных
материалов// А.с. СССР № 1072420 (1983).
223
195. Походенко В.Д. Феноксильные радикалы. Киев: Наук. Думка, 1969. — 194 с.
196. Раманаускайте Р.Ю., Абронина И.Ф., Карасева Л.И. и др. Коррекция
-каротином противоопухолевого иммунитета при экспериментальной
химиотерапии злокачественных новообразований // Бюл. экспер. биол.
и мед. — 1994. — № 9. — С. 295—297.
197. Рафикова В.С., Скибида И.П., Майзус З.К. Роль реакций алкильных
радикалов в процессе сопряженного окисления н - декана и этилбензола //
Докл. АН СССР, — 1968, — Т. 182, — С. 357—362.
198. Рафикова В.С., Скибида И.П., Майзус З.К. и др. Роль реакций передачи
цепи R + RH в цепном вырожденноразветвленном процессе сопряженного
окисления углеводородов // Докл. АН СССР. — 1971. — Т. 198. — № 5. —
С. 1131—1136.
199. Рахманкулова З.Ф., Федяев В.В., Рахматуллина С.Р. и др. Влияние предпосевной обработки семян пшеницы салициловой кислотой на её эндогенное содержание, активность дыхательных путей и антиоксидантный
баланс растений // Физиология растений. — 2010. — Т. 57. — № 6. —
С. 835—840.
200. Реморова А.А., Рогинский В.А. Константы скорости реакции феноксильных радикалов -токоферола с эфирами ненасыщенных жирных
кислот и вклад этой реакции в кинетику ингибированного окисления
липидов // Кинетика и катализ. — 1991. — Т. 32. — № 4. — С. 808—813.
201. Рогинский В.А. Эффективность жиро- и водорастворимых фенольных
антиоксидантов при окислении эфиров полиненасыщенных жирных
кислот в микрогетерогенных растворах // Биологические мембраны. —
1990. — Т. 7. — № 3. — С. 297—305.
202. Рогинский В.А. Спектры ЭПР и кинетика диспропорционирования
замещенных феноксильных радикалов. Изв. АН СССР. Сер. хим. —
1985. — № 9. — С. 1987—1996.
203. Рогинский В.А. Кинетика окисления эфиров полиненасышенных жирных
кислот, ингибированного замещенными фенолами // Кинетика
и катализ. — 1990. — Т. 31. — № 3. — С. 546—552.
204. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты: реакционная способность
и эффективность. М.: Наука, 1984. — 247 с.
205. Рогинский В.А., Крашенинникова Г.А. Термодинамика и кинетика радикальных процессов в системе токоферол 4-метил-2,6-ди-трет.-бутилфенол // Докл. АН СССР. — 1987. — Т. 293. — № 1. — С. 157—162.
206. Русина И.Ф. Хемилюминесцентные методы в исследовании ингибиторов
окисления. Автореф. дис. … канд. хим. наук. М.: Институт химической
физики им. Н.Н. Семёнова РАН, 2011. —22 с.
207. Саратиков А.С., Литвиненко Ю.А., Буркова В.Н. и др. Антиоксидантные
и гепатопротекторные свойства липроксола // Биоантиоксидант: Тез. докл.
VI международн. конф. М., 2002. — С. 513—515.
224
208. Семенов Н.Н. О некоторых проблемах химической кинетики и реакционной способности (Свободные радикалы и цепные реакции). 2-е изд.,
перераб. и доп. М.: Изд. АН СССР, 1958. — 686 с.
209. Скибида И.П. Кинетика и механизм распада перекисей в присутствии
соединений переходных металлов // Успехи химии. — 1975. — Т. 44. —
№ 10. — С. 1729—1747.
210. Смирнов Л.Д. Перспективные направления поиска антиоксидантов
и биологически активных веществ в ряду азотистых гетероциклов //
Биоантиоксидант: Тез. докл. VII межд. конф. М., 2006. — С. 42—47.
211. Смирнов Л.Д., Дюмаев К.М. β-Оксипроизводные шестичленных гетероциклов. Синтез, ингибирующая активность и биологические свойства //
Химико-фармацевтический журнал. — 1982. — № 4. — С. 412—428.
212. Сорокина И.В., Лапик A.C., Долгих М.П. и др. К токсикологии стабилизатора СО-3 // Изв. СО АН СССР. Сер. Биол. — 1987. — № 1. — С. 123—128.
213. Спиричев В.Б., Конь И.Я. Биологическая роль жирорастворимых
витаминов // Итоги науки и техники. ВИНИТИ. Сер. Физиология человека
и животных. — 1989. — Т. 37. — 226 с.
214. Столярова В.В, Карпова Н.В., Кечина Е.П. и др. Экспериментальноклиническое исследование влияния мексидола и эмоксипина на электрическую нестабильность миокарда при метаболических нарушениях //
Вестник восстановительной медицины. — 2008. — № 4. — С. 92—95.
215. Сторожок Н.М.
Межмолекулярные
взаимодействия
компонентов
природных липидов в процессе окисления. Автореф. дис. … докт. хим.
наук. М.,1996. — 50 с.
216. Сторожок Н.М., Храпова Н.Г., Бурлакова Е.Б. Исследование межмолекулярных взаимодействий компонентов природных липидов в процессе
окисления // Химическая кинетика. — 1995. — Т. 14. — № 11. — С. 29—46.
217. Сторожок Н.М., Кутузова И.В. Исследование проявлений антагонизма
в совместном антиоксидантном действии -каротина и витамина А
с -токоферолом // Хим. фарм. журнал. — 1995. — № 12. — С. 37—41.
218. Сторожок Н.М., Кутузова И.В. Ингибирующие эффекты смесей -токоферола с -каротином или витамином А при оксилении эфиров
полиненасыщенных жирных кислот // Вопр. мед. химии. — 1996. — Т. 42. —
№ 1. — С. 15—21.
219. Сторожок Н.М. О роли и механизме действия фосфолипидов в процессе
окисления природных систем, содержащих антиоксиданты // Вопросы
питания. — 1996. — № 2. — С. 25—28.
220. Сторожок Н.М., Друлле А.Я., Логин Я.Я. и др. Антиоксидантная
активность природных и синтетических хинонов // Вопросы мед. химии. —
1995. — Т. 41. — № 1. — С. 21—24.
225
221. Сторожок Н.М., Пирогов О.Н., Крашаков Н.Г. и др. Кинетика и константы
скорости реакции феноксильных радикалов -токоферола и хромана С
с ненасыщенными жирными кислотами и фосфолипидами // Кинетика
и катализ. — 1995. — Т. 36. — № 6. — С. 818—824.
222. Сторожок Н.М., Гуреева Н.В., Крысин А.П. и др. Взаимосвязь между
ингибирующими свойствами и активностью феноксильных радикалов
антиоксидантов различного химического строения // Кинетика
и катализ. — 2004. — Т. 45. — № 4. — С. 519—527.
223. Струнина Ю.З. Эмоксипин в лечении хронической обструктивной болезни
легких // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. — 2006. — № S23. —
С. 59—60.
224. Суслова Т.Б., Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов
в биологических мембранах // Биологические мембраны. М., 1973. —
С. 75—93.
225. Толстикова Т.Г., Долгих М.П., Сорокина И.В. и др. Острая токсичность
ряда новых производных 1,6-дитрет-бутилфенола // Научный вестник
Тюменской медицинской академии. — 2003. — № 1. — С. 66—69.
226. Трунова Н.А. Влияние природы поверхностно-активных веществ
на распад гидропероксидов в коллоидных системах. Дис. … канд. хим.
наук. М., 2009. — 117 с.
227. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р. Основы биохимии. М.: Мир, —
1981. — Т. 3. — 1878 с.
228. Ушкалова В.Н., Иоанидис Н.В., Деева З.М. и др. Анализ свободных
радикалов липидов крови спектрофотометрическим, флюориметрическим
и кинетическим методами // Лаб. дело. — 1987. — № 6. — С. 446—450.
229. Ушкалова В.Н., Иоанидис Н.В., Кадочникова Г.Д. и др. Контроль
перекисного окисления липидов. Новосибирск, 1993. — 181 с.
230. Ушкалова В.Н., Перевозкина М.Г., Барышников Э.В. Разработка способа
тестирования средств антиоксидантотерапии // Свободно-радикальное
окисление липидов в эксперименте и клинике. Тюмень. Из-во Тюм.ГУ,
1997. — С. 77—82.
231. Халмурадов А.Г., Тоцкий В.Н., Чаговец Р.В. Транспорт жирорастворимых
витаминов. Киев: Наукова думка, 1980. — 216 с.
232. Харитонова А.А., Козлова З.Г., Цепалов В.Ф. и др. Кинетический анализ
свойств антиоксидантов в сложных композициях с помощью модельной
цепной реакции // Кинетика и катализ. — 1979. — Т. 20. — № 3. —
С. 593—599.
233. Хомяков А.Е., Кеда Б.И. Содержание высших жирных кислот и общих
липидов в сыворотке крови больных острым панкреатитом // Клин.
медицина. — 1974. — Т. 52. — № 11. — С. 70—78.
234. Хорш А.К. Гиперлипопротеинемия и атеросклероз// Эссенциальные
фосфолипиды в лечении атеросклероза. Л., 1989. — С. 21—30.
226
235. Хохлов А.П. Влияние синтетического антиоксиданта фенозана К
на активность М-холинергической системы крыс in vivo //
Биоантиоксидант. Черноголовка, — 1986. — Т. 1. — С. 114—115.
236. Храпова Н.Г. Изучение антирадикальной активности токоферолов
методом хемилюминесценции // Витамины. Киев: Наукова думка, —
1975. — № 8. — С. 22—30.
237. Храпова Н.Г. Кинетические характеристики токоферолов как регуляторов
перекисного окисления липидов // Липиды: структура, биосинтез,
превращения и функции. М.: Наука, 1977. — С. 157—170.
238. Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов и системы, регулирующие
его интенсивность // Биохимия липидов и их роль в обмене веществ. М.:
Наука, 1981. — С. 147—154.
239. Храпова Н.Г. Система природных антиоксидантов и возможность
направленного воздействия на нее синтетическими ингибиторами.
Автореф. дисс. … докт. хим. наук. М., 1988. — 49 с.
240. Храпова Н.Г. Сравнение антиокислительного действия природных
и синтетических антиоксидантов // Биоантиоксидант. Черноголовка,
1983. — С. 12—13.
241. Храпова Н.Г. Определение антирадикальной активности веществ природного происхождения методом хемилюминесценции // Исследование
синтетических и природных антиоксидантов in vivo и in vitro. М.: Наука,
1992. — С. 8—15
242. Храпова Н.Г., Бурлакова Е.Б., Кухтина Е.Н. и др. Особенности
антиокислительного действия слабых ингибиторов. // Нефтехимия. —
1978. — Т. 18. — № 5. — С. 724—730.
243. Худяков И.В., Левин П.П., Кузьмин В.А. Обратимая рекомбинация
радикалов // Успехи химии. — 1980. — Т. 49. — № 10. — С. 1990—2031.
244. Хьюз М. Неорганическая химия биологических процессов / [Под ред.
Г.Н. Новодаровой]. М.: Мир, 1983. — 414 с.
245. Цепалов В.Ф., Харитонова А.А., Гладышев Г.П. и др. Определение
констант скорости и коэффициентов ингибирования фенолов-антиоксидантов с помощью модельной цепной реакции // Кинетика и катализ. —
1977. — Т. 18. — № 5. — С. 1261—1267.
246. Цепалов В.Ф., Харитонова А.А., Гладышев Г.П. и др. Определение
констант скорости и коэффициентов ингибирования стабилизаторов
с помощью модельной цепной реакции // Кинетика и катализ. — 1977. —
Т. 18. — № 6. — С. 1395—1403.
247. Цепалов В.Ф.
Метод
количественного
анализа
антиоксидантов
с помощью модельной реакции инициированного окисления // Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vivo и in vitro. М.:
Наука, 1992. — С. 16—26.
227
248. Черноморец М.В., Леманова Н.Б., Зоз Н.Н. и др. Влияние фенозана
на морозо-зимостойкость виноградного растения // Биоантиоксидант: Тез.
докл. международн. конф. М., — 1989. — Т. 1. — С. 198—199.
249. Чернухина Л.А., Донченко Г.В., Золоташко О.М. и др. Влияние фенилаланина и -токоферола на обмен убихинона и убихроменола в печени
Е-авитаминозных крыс in vitro // Укр. биохим. журн. — 1976. — Т. 48. —
№ 2. — С. 206—210.
250. Чеснокова Н.Б., Безнос О.В., Павленко Т.А. и др. Сравнительное
экспериментальное исследование влияния глазных капель на основе
производных 3-оксипиридина (мексидола и эмоксипина) на локальные
метаболические процессы и заживления ожоговой раны глаза кролика
различной локализации. Сообщение 2. Послеожоговая ишемия конъюнктивы // Российский офтальмологический журнал. — 2013. — Т. 6. —
№ 2. — С. 94—99.
251. Чудинова В.В., Захарова Е.И., Алексеев С.М. и др. Образование комплекса между -токоферолом и гидропероксидами жирных кислот в гомогенных растворах // Докл. АН. — 1992. — Т. 322. — № 4. — С. 773—776.
252. Чудинова В.В., Захарова Е.И., Алексеев С.М. и др. Изучение взаимодействия -токоферола с фосфолипидами, жирными кислотами и их оксигенированными производными методом Р31-ЯМР-спектроскопии //
Биоорган. хими. — 1993. — Т. 19. — № 2. — С. 243—249.
253. Шамовский И.Л., Яровская И.Ю. Исследование структуры комплекса
молекул токоферола и арахидоновой кислоты методом теоретического
конформационного анализа // Биологические мембраны. — 1990. —
Т. 7. — № 5. — С. 556—560.
254. Шанин Ю.Н., Шанин В.Ю., Зиновьев Е.В. Антиоксидантная терапия
в клинической практике. М.: Изд-во «Элби», 2009. — 128 с.
255. Шишкина Л.Н. Определение антиокислительной активности индивидуальных веществ и липидов на метилолеатной окислительной модели //
Исследование синтетических и природных антиоксидантов in vitro и in
vivo. М.: Наука, 1992. — С. 26—30.
256. Шишкина Л.Н., Алесенко А.В., Пальмина Н.П. и др. Антиокислительная
активность липидов и радиочувствительность. // Радиобиология. —
1976. — Т. 16. — № 1. — С. 39—43.
257. Шляпинтох В.Я., Капухин О.Н., Постников Л.М. и др. Хемилюминесцентные методы исследования медленных химических процессов. М.:
Наука, 1966. — 300 с.
258. Шумахер Р., Гудерманн К., Шнайдер Е. Механизм действия «эссенциальных» фосфолипидов и итоги фармакологических исследований
при нарушениях липидного обмена // Эссенциальные фосфолипиды
в лечении атеросклероза. Л., 1989. — С. 4—6.
259. Эмануэль Н.М., Денисов Е.Т., Майзус З.К. Цепные реакции окисления
углеводородов в жидкой фазе. М.: Наука, 1965. — 375 с.
228
260. Эмануэль Н.М. Механизм действия антиоксидантов. Современные
представления // Нефтехимия. — 1982. — Т. 22. — № 4. — С. 435—447.
261. Эмануэль Н.М., Кузьмина М.Г. Экспериментальные методы химической
кинетики. М.: Изд-во МГУ, 1985. — 384 с.
262. Эмануэль Н.М. Биофизические аспекты действия физических и химических факторов на живые организмы, защитные свойства антиоксидантов // Биофизика. — 1984. — Т. 29. — № 4. — С. 706—719.
263. Эмануэль Н.М., Зайков Г.Е., Майзус З.К. Роль среды в радикально-цепных
реакциях окисления органических соединений. М.: Наука, 1973. — 279 с.
264. Эмануэль Н.М. Кинетика и механизм цепных реакций жидкофазного
окисления углеводородов // Проблемы кинетики элементарных
химических реакций. М.: Наука, 1973. — С. 31—50.
265. Эмануэль Н.М., Майзус З.К., Карпухина Г.В. и др. Механизм
синергетического действия смесей ингибиторов в процессах окисления //
Тез. докл. междун. симп. по методам оценки и практическому применению стабилизаторов и синергических смесей. М., 1973. — С. 1—18.
266. Эмануэль Н.М. Антиоксиданты и увеличение продолжительности жизни
// Физиологический журнал. — 1984. — Т. 30. — № 1. — С. 1—8.
267. Эмануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов. М.:
Наука, 1977. — 416 с.
268. Эмануэль Н.М. Химическая и биологическая кинетика // Успехи химии. —
1981. — Т. 50. — № 10. — С. 1721—1809.
269. Эмануэль Н.М., Лясковская Ю.Н. Торможение процесса окисления жиров.
М.: Пищепромиздат, 1961. — 360 с.
270. Янишлиева Н., Скибида И., Майзус З. и др. О скорости и механизме
зарождения цепей при окислении метиловых эфиров олеиновой, линолевой
и линоленовой кислот // Изв. отд. хим. наук Болг. АН. — 1971. — Т. 4. —
С. 1—9.
271. Albanes D. -carotene and lung cancer: a case study // Am. J. Clin. Nutr. —
1999. — Vol. 69. — P. 1345—1350.
272. Allen Y.C., Farag P. A comparison between the metal-catalysed autoxidation of
agueous emulsions of linoleic acid, trilinolein and phospholipids 3 Symp. int.
oxide lipides catalyses metaux. Paris. 1974. — P. 44—56.
273. Alonso A., Jomez-Fernandez J.C., Aranda F.J. et al. On the interaction of
ubiquinones with phospholipid belayers // FEBS Lett. — 1981. — Vol. 132. —
№ 1. — P. 19—22.
274. Ames B.N., Shigenaga M.K., Hagen M.H. Oxidants, antioxidants and the
degenerative disseases of aging // Proc. Nat Acad Sci. — 1993. — Vol. 90. —
№ 17. — P. 1915—1922.
275. Angelo A.I.St., Legendre M.G., Dupuy H.P. Identification of lipoxygenase —
linoleate decomposition products by direct gas chromatography-mass-spectrometry // Lipids. — 1980. — Vol. 15. — № 1. — P. 45——49.
229
276. Ansell S.B., Hawthorne Y.N., Dawson R.M.C. Form and function of
phospholipids. Amsterdam.: Elsevier, — 1973. — Vol. 3. — 494 p.
277. Asakawa T., Matsushita S. Coloring conditions of thiobarbituric acid test for
detecting lipid hydroperoxides // Lipids. — 1980. — Vol. 15. — № 3. —
P. 137—140.
278. Bading H.T. Aroma compouds from better with cold - storage oxidation defects
and from autoxidized fatty acids // Neth. Nilk. Dairy Y. — 1970. — Vol. 24. —
P. 61—63.
279. Baker D.L., Krol E.S., Jacobsen N. et al. Reaction of beta-carotene with
cigarette smoke oxidants. Identification of carotenoid oxidation products and
evalution of prooxidant/antioxidant effect // Chem. Res. Tocxicol. — 1999. —
Vol. 12. — № 6. — P. 535—543.
280. Barclay L.R.C., Ingold K.U., Autoxidation of a modelmembrane: A
cоmparison of the autoxidation of egg lecithin phosphatidylcholine in water
and in chlorobenzene // J. Am. Chem. Soc. — 1980. — Vol. 102. — № 26. —
P. 7792—7794.
281. Barclay L.R.C., Vinqvist M.R., Mukai K. et al. Chain-breaking phenolic
antioxidants: steric and electronic effects in polyalkylchromanols, tocopherols
analogs,
hydroquinones,
and
superior
antioxidants
of
the
polyalkylbenzochromanol and naphthofuran class // J. Org. Chem. — 1993. —
Vol. 58. — № 26. — P. 7416—7420.
282. Barclay L.R.C., Edwards C.D., Mukai K. et al. Chain-breaking naphtholic
antioxidants:
antioxidant
activities
of
polyalkylbenzochromanol,
polyalkylbenzochromenol, and 2,3-dihydro-5-hydroxy-2,2,4-trimethylnaphtho
[1,2-b]furan compared to an -tocopherol model in sodium dodecyl sulfate
micelles // J.org. Chem. — 1995. — Vol. 60. — № 9. — P. 2739—2744.
283. Barthel G., Grosch W. Peroxide value determination – comparison of some
methods // J. Amer. Oil Chem. Soc. — 1974. — Vol. 51. — № 12. — P. 540—544.
284. Begemann P.H., Woestenburg W.Y., Leer S. Structure of four methyl linoleate
diperoxides // J. Agric. Food Chem. — 1968. — Vol. 16. — № 4. — P. 674—684.
285. Bierenbaum M.L., Noonau F.Y., Machlin L.J. The Effect of supplemental
vitamin E on serum parameters in diabetecs, post. coronary and normal subjects
// Nutr. Res. Int. — 1985. — № 31. — P. 1170—1180.
286. Bisly R.N., Parker A.W. Reaction of ascorbate with the tocopheroxyl radical in
micellar bilayer membrane systems // Arch. Biochem. and Biophis. — 1995. —
Vol. 317. — № 1. — P. 170—178.
287. Bolland J.L. Kinetic studies in the chemistry of rubber and related materials. 1.
The thermal oxidation of ethyllinoleate // Proc. Rogal. Society. — 1946. —
Vol. 186. — P. 218—237.
288. Bolland J.L., Ten Have P. Kinetic studies in the chemisnry of Rubber and
related materials. 5. the ingibitory effect of fhenolic compound on the thermal
oxidation of ethyl linoleate // Trans. Farad. Soc. — 1947. — Vol. 3. — № 1. —
P. 1—21.
230
289. Bolland J.L. Ten Have P. Kinetic studies the chtmistry of Rubber and related
materials. 4. The inhibitory effect of hydroquin one the thermal oxidation of
ethyl linoleate // Trans. Farad. Soc. — 1947. — Vol. 43. — P. 201—209.
290. Bonry W., Ingold K. Extraordinary kinetics behavior of the -tocopherol
(vitamin E) radical // J. Org. Chem. — 1995. — Vol. 60. — P. 1456—1467.
291. Bour H. Actualite de la vitamin E // Rev. Prat. — 1984. — № 23. —
P. 1270—1271.
292. Boveris A., Cadenas E., Stoppani A.O.M. Role of ubiquinonen in the
mitochondrial generation of hydroge peroxide // Biochem. J. — 1976. —
Vol. 156. — № 2. — P. 435—444.
293. Buettner G.R. The pecking order of free radicals and antioxidants: lipid
peroxidation, -tocopherol and ascorbate // Arch. Biochem. and Biophis. —
1993. — Vol. 300. — № 2. — P. 535—543.
294. Burton G.W., Pade V.L., Gabe E.J. et al. Antioxidant activity of vitamin E and
related phenols. Importance of stereoelectronics factors // J. Am. Chem. Soc. —
1980. — Vol. 102. — № 26. — P. 7791—7792.
295. Burton G.W., Pade V.L., Cabe E.J. et al. Antioxidation of biological
membranes // J. Amer. Chem. Soc. — 1982. — Vol. 102. — P. 7792—7798.
296. Burton G.W., Joyce F., Ingold K.U. Is vitamin E the only lipid-soluble, chainbreaking antioxidant in human blood plasma and erythrocyte membranes //
Arch. Biochem. and Biophis. — 1983. — Vol. 221. — № 1. — P. 281—290.
297. Burton G.W., Ingold K.U. Vitamin E. Application of the Principles of Physical
Organic Chemistry to the Exploration of Its Structure and Function // Acc.
Chem. Res. — 1986. — Vol. 19 — № 7. — P. 194—201.
298. Burton G.W., Ingold K.U. Autoxidation of biological molecules. 1. The antioxidant
activity of vitamin E and related chainbreaning phenolic antioxidant in vitro // J.
Amer. Chem. Soc. — 1987. — Vol. 103. — № 21. — P. 6472—6477.
299. Burton G.W., Joyce A., Ingold K.U. First proof that vitamin E is major lipidsoluble, chain-breaking antioxidant in human blood plasma // Lancet. — 1982. —
№ 8293. — P. 327—329.
300. Caldironi N.A., Bazan N.G. Effect of antioxidants on malonaldehyde production
and fatty acid composition in pieces of bovine musde and adipose tissue stored frech
and frozen // J. Food. Sci. — 1982. — Vol. 47. — № 4. — P. 1329—1338.
301. Cao G., Sofic E., Prior R.L. Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids:
structure-activity relationships // Free Radical Biology and Medicine. — 1997. —
Vol. 22. — № 5. — P. 749—760.
302. Сastelli Т., Littaru G.P., Bertoli E. et al. Specifity of lipid and coenzime Q in
mitochondrial NADH and succinoxidase of beaf heart and sereviasial // Arch.
Biochem. Biophys. — 1971. — Vol. 142. — P. 407—416.
303. Castell By C.H., Spears D.M. Heavy Metal Ions and the Development of
Rancidity in Blended Fish Muscle // J. Fish. Res. Bd. Canada. — 1968. —
Vol. 25. — № 4. — P. 639—656.
231
304. Cieślik-Boczula K,
Czarnik-Matusewicz B.,
Filarowski A.,
Koll A.,
Perevozkina M., Boens N., De Borggraeve W.M. ATR-IR spectroscopic study of
the structural changes in the hydrophobic region of ICPAN/DPPC bilayers // Journal
of molecular structure. — 2008. — Vol. 878. — № 1—3. — P. 162—168.
305. Cort W.M. Antioxidant activity of tocopherols, accrbyl, palmitate and ascorbic acid
and their mode of action // J. Amer. Oil Chem. Soc. — 1974. — Vol. 51. —
№ 7. — P. 321—325.
306. Crane F.L. Biochemical functions of coenzyme Q10 // J. AM. Coll. Nutr. —
2001. — Vol. 20. — № 6. — P. 591—598.
307. Donovan D.H., Menzel D.B. Effect of diltary fat and vitamin E on mouse lung
lipids // J. Nutr. — 1979. — Vol. 108. — № 11. — P. 1856—1864.
308. Ekiel I.H., Hughes L., Burton G.W. et al. Structure and Dynamics of Tocopherol in Model Mеmbranes and in Solution: A Broad-Line and HighResolution NMR Studi // Biochemistry. — 1988. — Vol. 27. — № 5. —
Р. 1432—1440.
309. El-Zeany B.A., Pokorny Y., Yanicek G. Effect of metallic compounds on the
autoxidation of fatty acids and their derivatives. 4. Autoxidation of fish oil fatty
acid esters in mixture with protein in presence of copper and iron salts // Sb.
VSCHT V Praze. — 1974. — № 42. — P. 5—18.
310. Epand R.M. Lipid Polymorphism and Membrane Properties. In Current Topics
in Membranes. D.M. Fambrough and D.J. Benos, editors. San Diego. Canada.
Academic Press, 1997. — 568 p.
311. Eskidsen-Helmond V.E., Van Heugten N.A., Lamers J.M. Regulation and
functional significance of phospholipid D in myocardium // Mol. Cell Biochem. —
1996. — Apr. 12—26. — № 157-1. — P. 239—248.
312. Esterbauer H., Wag G., Puhl H. Lipid peroxidation and its role in
atherosclerosis // Br. Med. Bull. — 1993. — Vol. 49. — № 2. — P. 566—576.
313. Farmer E.H., Koch H.P., Sutton D.A. The course of antoxidation reactions in
polyisoprenes and allied compo und P.7 Rearrangement of double bonds during
autoxidation // J. Chem. Soc. 1943. — P. 541—546.
314. Fatemi S.H., Hammond E.G. Analysis of Oieate, Linoieate and Linolenate
hydroperoxides in oxidized ester mixtures // Lipids. — 1980. — Vol. 15. —
№ 5. — P. 379—385.
315. Fato R., Ragaiani P., Lenaz G. at al. Effect of some lipophilic substances on
fluorescence polarization of perylene in lipid vesicles and mitochondrial
membranes // Bull. Soc. H. Biol. Sper. — 1980. — Vol. 56. — № 10. —
P. 911—995.
316. Fato R., Bertoli E., Costelli C.P. et al. Eluidizing effect of endogenous
ubiquinone in bovine heart mitochondrial membranes // FEBS Lett. — 1984. —
Vol. 172. — № 1. — P. 6—10.
317. Fendlez J.H., Fendlez E.J. Catalisic in Micellar and Macromoleculas Systems.
N.J.-Academic Press, 1975. — 290 p.
232
318. Frankel E.N. Hydroperoxides // Lipids and their oxidation: Proc. of the simp.
on foods. Wesport (Connecticut): Avi Pulishing C. 1962. — P. 51—78.
319. Frankel E.N., Dufek E.Y., Neff W.E. Analysis of Autoxidised fats by
chromatography Mass Spectrometry. 6. Methyl 9, 15 u 12, 15 oktas
ekadienoate // Lipids. — 1980. — Vol. 15. — № 9. — P. 661—667.
320. Frankel E.N., Neff W.E., Weisleder D. Photosensitized Oxidation of methyl
linoleate : Socondary and volatile thermal decomposition products // Lipids. —
1982. — Vol. 17. — № 1. — P. 11—18.
321. Frankel E.N. Secondary products of lipid oxidation // Chem. and Phys. of
lipids. — 1987. — V. 44. — № 24. — P. 73—85.
322. Fukuzama K., Hayashi K., Suruki A. Effect of a-tocopherol analog on
lysosome membranes and fatty acids monolayers // Chem. Phys. Lipids. —
1977. — Vol. 18. — № 1. — P. 39—48
323. Gaddis A.M., Ellis R., Currie G.T. et al. Carbonyls in oxidizing fat.
X. Quantitative differences in individual aldehydes isolated from autoxidized
lard by mild methods of extraction // J. Amer. Oil Chem. Soc. — 1966. —
Vol. 43. — № 4. — P. 242—244.
324. Gensen R.Y., Clark R.M., Ferris A.M. Composition of the lipids in milk : A.
Review // Lipids. — 1980. — Vol. 15. — № 5. — P. 345—355.
325. Gorelik S., Kanner J. Oxymyoglobin oxidation and membrane lipid
peroxidation initated by iron redox cycle: prevention of oxidation by enzymic
and nonenzymic antioxidants // J. Arg. And Food Chem. — 2001. — Vol. 49. —
№ 12. — P. 5945—5950.
326. Gotoh N., Niki E. Rates of interactions of superoxide with vitamin E, vitamin C
and related compounds as measured by chemiluminescense // Biochem. and
Biophys. Acta. — 1992. — Vol. 1115. — P. 201—207.
327. Grimble R.F. Effect of antioxidative vitamins on immune function with clinical
applications // Int. J. Vitam. Nutr. Res. — 1997 — Vol. 67. — № 5. —
P. 312—320.
328. Halpner A., Handelman G., Harris J. et al. Protection by vitamin C of loss of
vitamin E in cultured rat hepatocytes // Arc. of Boichem. and Biophys. — 1998. —
Vol. 359. — № 2. — P. 305—309.
329. Harman D. Vitamin E — Effect on serum cholesterol and lipoprotein //
Circulation. — 1960. — Vol. 22. — № 22. — P. 151—153.
330. Hawhhorne I.N., Ansell S.B. Phospholipids. New comprehensive biochemistry.
Amsterdam.: Elsevier, — 1982. — Vol. 4. — 484 p.
331. Henderson S.K., Witchwoot A., Nawar W.W. The Autoxidation of linoleates at
elevated temperatures // J. Amer. Oil Chem. Soc. — 1980. — Vol. 57. —
№ 12. — P. 409—413.
332. Hirano Y., Olcott H.S. Effect of Heme Compounds on Lipid Oxidation //
J. Amer. Oil Chem. Soc. — 1977. — Vol. 48. — № 10. — P. 523—524.
233
333. Hudson B.J., Mahgoub S.E. Synergism between phospholipids and naturally
occurring antioxidants in leaf lipids // J. Sci. Food and Agr. — 1981. —
Vol. 32. — № 2. — P. 208—210.
334. Hudson B.J., Chavan M. Phospholipids as antioxidant synergists for tocoferols
in the autoxidation of edible oils // Lebensm., Wiss. + Technol. — 1984. —
Vol. 17. — № 4. — P. 191—194.
335. Husain S.R., Cillard Y., Cillard P.d Tocopherol Proxidant Effect and
Malondialdehyde Production // J. Amer. Oil. Chem. Soc. — 1987. — Vol. 64. —
№ 1, — P. 109—111.
336. Jialal I., Norcus E.P., Cristol L. et al. Beta-carotene inhibits the oxidative
modification of low density lipoproteins // Biochem. et Biophys. Acta. — 1991. —
Vol. 1086. — P. 134—138.
337. Kaul N., Devaraj S., Jialal I. Alpha-tocopherol and atherosclerosis // Exp. Biol.
Med. — 2001. — Vol. 226. — № 1. — P. 5—12.
338. Keaney J.F., Simon D.I., Freedman J.E. Vitamin E and vascular homeostasis:
implications for atherosclerosis // FASEB J. — 1999. — Vol. 13. — № 9. —
P. 965—975.
339. Kikugawa K., Kogi K. Oxidation products of linoleate and linolenate exposed
to nitrogen dioxide // Chem. Pharm. Bull. — 1987. — V. 35. — № 1. —
P. 344—349.
340. Kwoh T.L. Catalysts of Lipid Peroxidation in Meats // J. Amer. Oil Chem. Soc. —
1971. — Vol. 48. — P. 550—555.
341. Labuza T.P., Maloney Y.F., Karel M. Autoxidation of Methyl Linoleate in Freeze Died Model Systems // Effect of Water on Cobalt Catalyzed Oxidation // J. Food.
Sci. — 1966. — Vol. 31. — P. 885—891.
342. Lass A., Sohal R.S. Electron Transport-Linked Ubiquinone-Dependent Recycling of
-Tocopherol Inhibits Autooxidation of Mitochondrial Membranes // Archives of
Biochemistry and Biophysics. — 1998. — Vol. 352. — № 2. — P. 229—236.
343. Li C.T., Wick M., Marriott N.G. Evaluation of lipid oxidation in aminal fat //
Ohio Agr. Res. And Dev. Cent. — 1999. — № 172. — P. 38—43.
344. Lim B.P., Nagao A., Terao J., Tahaka K., Suzuki T., Takama K. Ahtioxydant
activity of xantholipid on peroxil radical-mediated phospholipid peroxidation //
Biochem. et Biophys. Acta. — 1992. — Vol. 1126. — P. 178—184.
345. Logane M.K., Davies R.E. Lipid oxidation: biologic effects and antioxidants :
A review // Lipids. — 1980. — Vol. 15. — № 6. — P. 485—494.
346. Lomanno S.S., Nawar W.W. Effect of heating temperature and time on volatile
oxidative decomposition of linolenate // J. Food. Sci. — 1982. — Vol. 47. —
№ 3. — P. 744—746.
347. Love Y.D., Plearson A.M. Lipid Oxidation in Meat and Meat Products A Rewiew //
J. Amer. Oil Chem. Soc. — 1971. — Vol. 48. — № 10. — P. 547—549.
234
348. Maggio B., Diplock A.T., Lucy J.A. Interactions of tocoferols and ubiquinones
with monolayers of phospholipids // Biochem. J. — 1977. — Vol. 161. — № 1. —
P. 111—121.
349. Malila N., Virtamo J., Virtanen M. et al. The effect of alpha-tocopherol and
beta-carotene supplementation on colorectal adenomas in middle-aged male
smokers // Cancer. Epidemiol. Biomarkers. rev. — 1999. — Vol. 8. — № 6. —
P. 489—493.
350. Marcuse R., Fredriksson P.O. Fat Oxidation at Low Oxygen Pressure. 2.
Kinetic Studies on Linoleic Acid Oxidation in Emulsions in the Presence of
Antioxidants // J. Amer. Oil Chem. Soc. — 1969. — Vol. 46. — № 5. —
P. 262—268.
351. Marcuse R. Metal catalyzed lipid exidation // 3. Symp. int. oxid lipides
catalyses metaux, Paris. — 1973. — P. 7—21.
352. Matsushita S., Ibuki F., Aoki A. Chemical reactivity of the nucleic acid bases.
I. Antioxidative ability of the nucleic acids and their related substances on the
oxidation of unsaturated fatty acids / Arch Biochem Biophys. — 1963. —
Sep. 102. — P. 446—451.
353. Mayne S.T., Handelman G.J., Beecher G. -carotene and lung cancer in haeavy
smokers – a plausible relationship // J. Natl. Cancer Inst. — 1996. — Vol. 88. —
P. 1513—1515.
354. Mellors A., Tappel A.L. The inhibition of mitochondrial peroxidation by ubiquinol
and ubiquinone // J. Biol.Chem. — 1966. — Vol. 241. — P. 4353—4356.
355. Moerek R.E., Ballir H.R. Lipid autoxidation in mechanically deboned chicken
meat // J. Food. Sci. — 1974. — Vol. 39. — № 5. — P. 876—879.
356. Mukai K., Fukuda K., Tajima K. et al. A kinetic study of reaction of
tocopherols with a substituted phenoxyl radical // J. Org. Chem. — 1988. —
Vol. 53. — № 2. — P. 430—432.
357. Mukai K., Okauchi Y. Kinetic study of the reaction between tocopheroxyl
radical and unsaturated fatty acid esters in benzene // Lipids. — 1989. —
Vol. 24. — № 11. — P. 936—939.
358. Mukai K., Oka W., Watanabe K. et al. Kinetic studi of free-radical-scavengin
action of flavonoids in homogeneous and aqueous Triton X-100 micellar
solutions // J. Phys. Chem. — 1997. — Vol. 101. — № 20. — P. 3746—3753.
359. Nagaoka S., Okauchi Y., Urano S. et al. Kinetic and ad initio study of the
prooxidant effect of vitamin E. Hydrogen abstraction from fatty acid esters and
egg yolk lecithin // J. Am. Chem. Soc. — 1990. — Vol. 122. — № 24. —
P. 8921—8924.
360. Nair P.P., Partnalk R.N., Hausurerth J.W. Cellular transport and binding of d-atocopherol // Tocopherol oxygen and biomembranes. London 1978. —
P. 121—130.
235
361. Neff W.E., Frankel E.N., Weisleder D. Photosensitized oxidation of methyl
linolenate. Secondary products // Lipids. — 1982. — Vol. 17. — № 11. —
P. 780—790.
362. Nerin K., Taha S., Moser U. et al. Effect of vitamine E and probucol on dietary
cholesterol-induced atherosclerosis in rabbits // Free Radical Biology &
Medicine. — 1998. — Vol. 24. — № 2. — P. 226—233.
363. Newaz M.A., Nawal N.N.A. Effect of α-tocoferol on lipid peroxydation and
total antioxidant status in spontaneously hypertensive rats // Amerircan Journal
of Hypertension. — 1988. — № 11. — P. 1480—1485.
364. Niki E. Antioxidants in relation to lipid poroxidation // J. Chem. and Phys.
Lipids. — 1987. — Vol. 44. — P. 227—253.
365. Niki E., Takahashi M., Komiko E. Antioxidant activi ty of vitamin E in
liposomal membranes // Chemistry letters. — 1986. — № 9. — P. 1573—1576.
366. Niki E. Interaction of аscorbic acid and -tocopherol// Ann. NY Acad. Sci. —
1987. — Vol. 48. — № 1. — P. 186—199.
367. Ohlson R. Fats and oils demetalization : its intlulnce on their oxidative stability
// 3. Symp. int. oxide lipides catalises metaux. Paris. 1973. — P. 184—192.
368. Ohsima T., Fujita V., Koizumi C. Oхidative stability of sardine and mackrel
lipid with reference to synergism between phospholipid and -tocopherol // J.
Amer.Oil. Chem. Soc. — 1993. — Vol. 70. — № 3. — P. 269—276.
369. Olcott H.S. Observations on the synergistic effects of aliphatic amines with
phenolic-type antioxidants // The Technology of Fish Utilisation / Ed. R.
Kreizer. 1965. — P. 134—135.
370. Olson J.A. Carotenoids and vitamin A — an overview // Lipid-Solubile
Antioxidants. Biochemistry and Clinical Applications. Basel: Birkhauser
Verlag, 1992. — P. 178—192.
371. Omenn G.S., Goodman G.E., Thornquist M.D. et al. Risk factor for lung cancer
and for intervention effect in CARET, the beta-carotene and retinol efficacy
trial // J. Natl. Cancer. Inst. — 1996. — Vol. 88. — № 21. — P. 1550—1559.
372. Onat D., Boscoboinik D., Azzi A. et al. Effect of -tocopherol and silibin
dihemisuccinate on the proliferation of human skin fibroblasts // Biotechnol.
Appl. Biochem. — 1999. — Vol. 29. — P. 213—215.
373. Рacker J.E., Slater T.E., Willson R.L. Direct observation of a free radical
interaction between vitamin E and vitamin C// Nature. — 1979. — Vol. 278. —
№ 5706. — P. 737—738.
374. Palozza P., Krinsky N.I., Antioxidant effects of carotenoids in vivo and in vitro —
an overview // Methods in Enzymology. — 1992. — Vol. 213. — P. 403—420.
375. Parkhurst R.M., Skinner W.A., Sturm P.A. The effect of varions concentations of
tocophercls and tocopherol mixtures es the oxidative stability of a sample of lard //
J. Amer. Oil Chem. Soc. — 1968. — Vol. 45. — № 10. — P. 641—642.
376. Pisareva S.I., Sidorenko A.A. Quantitative analysis of binary antioxidant mixtures //
React. Kinet. Catal. Lett. — 1986. — Vol. 32. — № 1. — P. 153—158.
236
377. Pokorny J. Effect of metallic compounds on the autoxidation of fatty acids and
their derivatives. 3. Effect of metallic chlorides on the autoxidation of stabilized
isopropyl oleate // Sb. VSCHT V Praze. — 1969. — № 27. — P. 67—81.
378. Pokorny J., Luan N.T., Janicek G. Changes of to copherols in vegetable oils
under the conditiong of deep fat frying // Sb. Vysoke skoly chemickotechnologicke V Praze. — 1973. — № 39. — P. 24—41.
379. Pokorny J., Kondratenko S.S., Janicek G. Autoxidation of some vegetable oils
at elevated temperatures. 14. Effect of heavymetals and inhibitors on the
meximum oxidati on rate of sunflower seed oil // Sb. Vysoke skoly chem.
technol. V Praze. — 1967. — № 18. — P. 61—66.
380. Porter N.A., Wolf R A., Weenen H. The free radical oxidation of polyusaturated
lecithins // Lipids. — 1980. — Vol. 15. — № 3. — P. 163—167.
381. Privett O.S., Quackenbush A. The relation of synergist to antioxidant in fats //
Amer. J. Oil Ehem. Poc. — 1954. — Vol. 31. — № 8. — P. 321—323.
382. Reichwald I., Meizies A. Die fettsauren der Lipide im flisch von suswasserfischen
und Sufischen // Z. fur Ernahrungswissen schaft. — 1973. — Vol. 12. — № 1. —
P. 86—91.
383. Reinton R., Rogstad A. Antioxidant activity of tocopherols and ascorbic acid // J.
Food. Sci. — 1981. — Vol. 46. — № 3. — P. 970—973.
384. Rhee K.S., Watts B.M. Effect of Antioxidants on Lipoxidase Activity in Model
Systems and Pea (Pisum sativum) Slurries // J. Food. Sci. — 1966. — Vol. 31. —
P. 669—674.
385. Roginsky V.А., Stegmann H.В. Kinetics of The reaction between ascorbate and
free radical from vitamin E as studied by ESR Steadi-State method // Chem.
and Phys. of Lipids. — 1993. — № 65. — P. 103—112.
386. Rousseau E.J., Davidson A.J., Dunn B. Protection by -carotene and related
compounds against oxygen-mediated cytotoxicity and genotoxicity —
implications for carcinogenesis and anticarcinogenesis // Free Radical Biol. and
Med. — 1992. — Vol. 13. — P. 407—433.
387. Rowley D.A., Halliwell B. Superoxide — dependent and ascorbate —
dependent formation of hydroxyl radicals in the presence of copper salts: A
physiologically significant reaction ? // Arch. of Biochem. and Biophys. —
1983. — Vol. 225. — № 1. — August. — P. 279—284.
388. Scarpa M., Rigo A., Maiorino M. Formation of -tocopherol radical and
recycling of -tocopherol by ascorbate during peroxidation of
phosphatidylcholine liposomes // Biochem. et Biophys. Acta. — 1984. —
Vol. 801. — P. 215—219.
389. Sedlacek B.A.Y. Mechanismus der Wirkung von Ascorbylpalmitat und anderen
Antioxydantien auf die Autoxidation der Fette // Nahrung. — 1975. — Vol. 19. —
№ 3. — P. 219—229.
237
390. Sugata S., Urano S., Matsushita Y. et al. A comment on the evaluation of
equilibrium constants for -tocopherol interaction with fatty acids by absorbance in
the ultraviolet region // Biochem. et Biophys. Acta. — 1988. — Vol. 962. —
№ 3. — P. 385—386.
391. Takahashi M., Niki E., Kawakami A. Oxidation of lipids. 14. Inhibition of oxidation
of methyllinoleate by esters of ascorbic acid // Bull. Chem. Soc. Jan. — 1986. —
Vol. 59. — № 10. — P. 3179—3183.
392. Tappel A.L., Brown W.D., Maier V.P. Unsaturated lipid peroxidation catalysed
by hematin compounds and its inhibition by vitamin E // J. Amer. Oil Chem.
Soc. — 1961. — Vol. 38. — P. 5—9.
393. Tappel A.L. Studies of the mechanism of vitamin E action. 11. Inhibition of
unsaturated fatty acid oxidation catalysed by hematin compounds // J. Amer.
Oil Chem. Soc. — 1953. — Vol. 30. — P. 473—485.
394. Terao J., Yamaushi R., Marakami H. et al. Inhibitory effects of -tocopherol
and -carotene on singlet oxygen-initiated photooxidation on methyllinoleate
and soybean oil // J. Food Proc. Presery. — 1980. — Vol. 4. — № 1. —
P. 79—93.
395. Terao J., Yamaushi R., Shirai M. et al. Protection by quercetin and quercetin 3O-beta–D-glucuronide of peroxynitrite-induced antioxidant consumption in
human plasma low-density lipoprotein // Free Radic. Res. — 2001. — Vol. 36. —
№ 6. — P. 925—931.
396. Tesoriere L., Bongiomo A., Pintaudi A.M. et al. Synergistic Interactions between
Vitamin A and Vitamin E against Lipid Peroxidation in Phosphatidylcholine
Liposomes // Archives of Biochemistry and Biophysics. — 1996. — Vol. 326. —
№ 1. — P. 57—63.
397. Thomas M.Y., Pryor W.A. Singlet oxygen oxidation of methyllinoleate :
Isolation and characterization of the NaBH yreduced products // Lipids. —
1980. — Vol. 15. — № 7. — P. 544—548.
398. Tompson G.R. A handbook of hyperlipidemia. Copyright MERC. Inc, 1989. —
255 p.
399. Umbreit W.W, Burns R.H. Stauffer J.F. Manometric Techniques. Burgess
Publishing Co., Minneapolis Minn, 1964. — P. 24—36.
400. Urano S., Matsuo M., Sakanaka T. et al. Mobility and Molecular Orientation of
Vitamin E in Liposomal Membranes as Determined by 19F NMR and
Fluorescence Polarization Techniques // Archives of Biochemistry and
Biophysics. — 1993. — Vol. 303. — № 1. — P. 10—14.
401. Van Hook I.P., Tobolsky A.U. The thermal decomposition of 2,2’-azo-bis-isobuthironitril // J.Amer.Chem .Coc . — 1958. — Vol. 80. — № 4. — P. 779—782.
402. Wainer D.D.M., Burton G.W., Ingold K.U. The relative contributions of
vitamin E, urate, ascorbate and proteins to the total peroxyl radical-trapping
antioxidant activity of human blood plasma // Biochem. et Biophys. acta. —
1987. — Vol. 924. — P. 408—419.
238
403. Wang X., Takahashi H., Hatta I. et al. An X-ray di¡raction study of the effect of
-tocopherol on the structure and phase behaviour of bilayers of
dimyristoylphosphatidylethanolamine // Biochimica et Biophysica Acta. —
1999. — Vol. 1418. — P. 335—343.
404. Watanabe A., Noguchi N., Takahashi M. et al. Rate constants for hydrogen
atom abstraction by alpha-tocopheroxyl radical from lipid, hydroperoxyde and
ascorbic acid // Chem. Lett. — 1999. — Vol. 7. — P. 613—618.
405. Westlund P.O., Yarwood J. A Fourier transform infrared study of the lamellar
liquid crystalline phase of dimethyldodecyl amineoxide-water and
dimethyldodecyl amineoxide-gramicidin-D-water systems // Vibrational
Spectrosc. –— 1996. — Vol. 10. — № 2. — P. 191—201.
406. Wheldon G.H., Bhaet A., Keller P. et al. D-1-alfa-Tocopherylacetate (Vitamin
E): A longterm toxicity and carcinogenicity study in rals // Int. J. Vitamin. —
1983. — Vol. 53. — P. 287—296.
407. Williams Y.C., Field R.A., Miller C.L. et al. Lipid characterization of
longissimus and biceps femoris muscless from beef animals exsanquinated an
various times alter stunning // J. Food. Sci. — 1982. — Vol. 47. — № 4. —
P. 1384—1385.
408. Wills E.D. Mechanisms of lipid peroxide formation in tissues. Role of metals
and haematin proteins in the catalysis of the oxidation of unsaturated fatty acids
// J. Biochim. et Biophys. Acta. — 1965. — Vol. 98. — № 2. — P. 238—251.
409. Yamamoto Y., Niki E., Kamiya Y. Oxidation of lipids: 3. Oxidation of methyl
linoleate in solution // Lipids. — 1982. — Vol. 17. — № 12. — P. 870—877.
410. Yamauchi R., Hara Y., Murase H. et al. Analysis of the addition products of
alpha-tocopherol with phosphatidylcholine-peroxyl radicals by highperformance liquid chromatography with chemyluminescent detection // Lipids. —
2000. — Vol. 35. — № 12. — P. 1405—1410.
411. Zhang P., Omaye S.T. Antioxidant and prooxidant roles for beta-carotene, alphatocopherol and ascorbic acid in human lung cancer // Toxicol. In Vitro. — 2001. —
Vol. 15. — № 1. — P. 13—24.
412. Zhou Y.-C., Zheng R.L. Phenolic compounds and an analog as superoxide anion
scavengers and antioxidants // Biochem. Pharmacol. — 1991. — Vol. 42. —
P. 1177—1179.
239
Монография
Перевозкина Маргарита Геннадьевна
ТЕСТИРОВАНИЕ
АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ
ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ
КИНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ
Научное издание
Подписано в печать 23.04.2014. Формат бумаги 60х84/16.
Бумага офсет №1. Гарнитура Times. Печать цифровая.
Усл. печ. л. 15. Тираж 550 экз.
Издательство «СибАК»
630075, г. Новосибирск, Залесского 5/1, оф. 605
E-mail: mail@sibac.info
Отпечатано в полном соответствии с качеством предоставленного
оригинал-макета в типографии Allprint
630004, г. Новосибирск, Вокзальная магистраль, 3
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа