close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

611.Тихоокеанский медицинский журнал №3 2009

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ISSN 1609-1175
ихоокеанский
ТМедицинский
урнал
Ж
PACIFIC MEDICAL JOURNAL
2009, № 3
РЕЦЕНЗИРУЕМЫЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
Основан в 1997 году
Выходит один раз в три месяца
ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ
ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Издательство
МЕДИЦИНА ДВ
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Главный редактор В.Б. Шуматов
Редакционная коллегия:
Н.Н. Беседнова, Б.И. Гельцер, Е.В. Елисеева, Ю.В. Каминский, Е.В. Крукович, Ю.В. Кулаков,
В.Н. Лучанинова, Е.В. Маркелова (отв. секретарь), В.И. Невожай, В.А. Невзорова (зам. главного
редактора), В.А. Петров, В.Г. Сейидов, В.Б. Туркутюков, Ю.С. Хотимченко, В.М. Черток (зам. главного
редактора), В.В. Шапкин, А.Д. Юцковский
Редакционный совет:
А.С. Белевский (Москва), А.Ф. Беляев, А.В. Гордеец, Ю.И. Гринштейн (Красноярск), С.Е. Гуляева,
Н.А. Догадина, В.А. Иванис, Ю.И. Ишпахтин, В.П. Колосов (Благовещенск), Д.Б. Ларионова,
В.Ю. Мареев (Москва), В.Я. Мельников, П.А. Мотавкин, А.Я. Осин, А.А. Полежаев, Б.Я. Рыжавский
(Хабаровск), Л.М. Сомова, Г.И. Суханова, Н.Д. Татаркина, Л.Н. Трусова, Г.И. Цывкина, Jin Liang Hong
(КНР), Moon oh Riin (Республика Корея), Yamamoto Masahary (Япония), Zhao Baochang (КНР)
Научный редактор О.Г. Полушин
«Тихоокеанский медицинский журнал», 2009, № 3 (37)
Тихоокеанский медицинский журнал
Учредители:
Владивостокский государственный
медицинский университет,
Департамент здравоохранения
Приморского края,
НИИ эпидемиологии
и микробиологии СО РАМН,
Краевой клинический центр
охраны материнства и детства
Свидетельство о регистрации
Министерства РФ по делам печати,
телерадиовещания и средств массовых
коммуникаций
ПИ № 77–13548 от 20.09.2002 г.
Адрес редакции:
690950 г. Владивосток, пр‑т Острякова, 4,
Владивостокский государственный
медицинский университет
Тел./факс (4232) 45-77-80
Редактор
О.Н. Мишина
Зав. редакцией Л.В. Бирилло
Технический редактор
А.В. Яунвалкс
Тел. (4232) 45-56-49
Корректор О.М. Тучина
Издательство
«МЕДИЦИНА ДВ»
690950 г. Владивосток,
пр‑т Острякова, 4; тел. 45-56-49
Сдано в набор 27.03.2009 г.
Подписано в печать 13.07.2009 г.
Печать офсетная. Формат 60×90/8
Усл. печ. л. 16,5. Заказ № 343.
Тираж 1000 экз.
Отпечатано ИД «Принт-Восток»
в типографии № 1 г. Харбин (Китай)
Цена свободная
Выпуски «Тихоокеанского медицинского журнала» доступны на сайтах http://elibrary.ru и http://www.vgmu.ru
Правила оформления статей и сведения об авторах публикаций находятся на сайте http://www.vgmu.ru
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Содержание
Передовые статьи
Иммуномодуляторы из гидробионтов Тихого океана:
фундаментальные и прикладные аспекты....................................... 5
Лекции
Беседнова Н.Н., Запорожец Т.С.
Действие дезоксирибонуклеиновой кислоты прокариот
на гуморальные и клеточные факторы врожденного
и адаптивного иммунитета позвоночных........................................8
Беседнова Н.Н., Федянина Л.Н.
Противоопухолевое действие экзогенной
дезоксирибонуклеиновой кислоты................................................ 12
Оригинальные исследования
Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Акользина С.Е., Медуницын Н.В.
Иммуноадъювантный эффект цитокинов..................................... 19
Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А., Акользина С.Е., Медуницын Н.В.
Цитокины и вакцины..................................................................... 22
Моторя Е.С., Пивненко Т.Н., Гажа А.К., Иванушко Л.А.,
Воронцов В.Н., Санина Н.М.
Исследование иммуномодулирующей
и мембранотропной активности каротиноидов
из туники асцидии Halocynthia aurantium ...................................... 28
Чикаловец И.В., Молчанова В.И., Аминин Д.Л.,
Черников О.В., Пислягин Е.А., Лукьянов П.А.
Неомитилан – новый иммуномодулятор
из мидии Crenomytilus grayanus ....................................................... 32
Макаренкова И.Д., Ахматова Н.К., Семенова И.Б.,
Беседнова Н.Н., Звягинцева Т.Н.
Сульфатированные полисахариды из морских бурых
водорослей – индукторы созревания дендритных клеток............ 36
Ермак И.М., Давыдова В.Н., Аминин Д.Л., Барабанова А.О.,
Соколова Е.В., Богданович Р.Н., Полякова А.М., Соловьева Т.Ф.
Иммуномодулирующая активность каррагинанов
из красных водорослей дальневосточных морей........................... 40
Смолина Т.П., Запорожец Т.С., Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л.
Ранняя активация лимфоцитов и моноцитов
периферической крови человека компонентами
протеобактерий Pseudomonas nigrifaciens . ...................................... 45
Колдаев В.М., Ващенко В.В., Бездетко Г.Н.
Фотометрические параметры абсорбционных спектров
экстрактов из растений................................................................... 49
Пономарева Т.И., Добряков Ю.И.
Исследование иммунных свойств хаурантина
при иммуносупрессии в эксперименте.......................................... 52
Плехова Н.Г., Федянина Л.Н., Сомова Л.М.,
Беседнова Н.Н., Каленик Т.К.
Изменение метаболизма фагоцитов крови под влиянием
дезоксирибонуклеиновой кислоты из молок лососевых рыб....... 55
Приезжева Е.Ю., Лебедько О.А., Рыжавский Б.Я., Козлов В.К.
Влияние эхинохрома А на структуру и метаболизм
почек 40‑суточных белых крыс, подвергшихся
пренатальному воздействию нитрата свинца.................................. 58
Тупкало А.В.
Исследование дефектов в тонких органических пленках............. 61
Бузолева Л.С., Костюшко А.В., Кондрашова Н.М.
Оценка клинико-иммунологической эффективности
иммуномодуляторов природного происхождения
при экспериментальной пневмонии у мышей.............................. 64
Голохваст К.С., Паничев А.М., Гульков А.Н.,
Мишаков И.В., Ведягин А.А.
Антиоксидантные и иммуномодулирующие
свойства природных цеолитов........................................................ 68
Белова С.В.
Ферментный иммуномодулятор в терапии
экспериментального аутоиммунного артрита............................... 70
Бгатова Н.П., Голохваст К.С., Бгатов А.В., Паничев А.М.,
Пальчикова Н.А.
Модулирующее действие природного цеолита на структуру
пейеровых бляшек в условиях накопления цезия......................... 74
Кузнецова Т.А., Сомова Л.М., Плехова Н.Г., Звягинцева Т.Н.
Применение фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens
для коррекции иммунных нарушений при эндотоксемии............ 78
Иванушко Л.А., Соловьева Т.Ф., Запорожец Т.С.,
Сомова Л.М., Горбач В.И.
Антибактериальные и антитоксические свойства
хитозана и его производных........................................................... 82
Крылова Н.В., Леонова Г.Н., Попов А.М., Артюков А.А.,
Майстровская О.С., Козловская Э.П.
Противовирусная активность комплексного препарата
розмариновой кислоты, полученной из Zostera asiatica,
в отношении возбудителей клещевого энцефалита...................... 86
Макаренкова И.Д., Крылова Н.В., Леонова Г.Н.,
Беседнова Н.Н., Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М.
Протективное действие фукоидана из морской бурой
водоросли Laminaria japonica при экспериментальном
клещевом энцефалите..................................................................... 89
Вищук О.С., Ермакова С.П., Фам Дюк Тин,
Шевченко Н.М., Буи Минг Ли, Звягинцева Т.Н.
Противоопухолевая активность фукоиданов бурых водорослей...... 92
Жанаева С.Я., Алексеенко Т.В., Короленко Т.А., Звягинцева Т.Н.
Противоопухолевая и антиметастатическая активность
сульфатированного полисахарида фукоидана бурой
водоросли Охотского моря Fucus evanescens .................................. 96
Шутикова А.Л., Целуйко С.С., Запорожец Т.С.,
Эпштейн Л.М., Беседнова Н.Н.
Влияние моллюскама на мукоцилиарную систему
воздухоносного отдела легких и свободнорадикальные
процессы при гипотермии.............................................................. 99
Майстровский К.В., Запорожец Т.С., Федянина Л.Н.,
Каленик Т.К., Моткина Е.В., Имбс Т.И.
Влияние иммуномодулятора фукоидана из бурых водорослей
Fucus evanescens на показатели антиоксидантной системы,
липидного и углеводного обмена у мышей.....................................103
Невзорова В.А., Боровская Т.Ф., Дмитриева Т.Б.,
Скребкова Л.Д., Пазыч С.А.
Состояние местного и системного иммунного ответа
при внебольничной пневмонии у лиц молодого возраста.......... 106
Запорожец Т.С., Майстровский К.В., Раповка В.Г.,
Гажа А.К., Смолина Т.П., Звягинцева Т.Н.
Роль Т-клеточной дисфункции в развитии атеросклероза
сосудов нижних конечностей и возможности ее коррекции ......... 110
Козлов В.К., Козлов М.В., Гусева О.Е., Лебедько О.А., Морозова Н.В.
Антиоксидантная активность эхинохрома А при хронических
воспалительных заболеваниях легких у детей............................. 116
Гильмутдинова Л.Т., Гильмутдинов А.Р.,
Кудаярова Р.Р., Минеева Л.С.
Иммуномодулирующие эффекты кумысолечения
в санаторной реабилитации больных, оперированных
по поводу желчно-каменной болезни.......................................... 118
Киняйкин М.Ф., Суханова Г.И., Наумова И.В.,
Кузнецова Т.А., Овчинников А.Я., Полетаева И.М., Безнис В.М.
Роль гипоксемии в формировании нарушений
иммунитета и гемостаза у больных хронической
обструктивной болезнью легких................................................... 120
Киваева И.Ф., Головачева В.Д., Яцкова М.А., Добряков Е.Ю.,
Крыжановский С.П., Иванушко Л.А.
Комплексная биологически активная добавка к пище из хитозана
и моллюскама как средство сопровождения базисной терапии
язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки.......... 123
Костюшко А.В.
Состояние локального иммунитета
при внутрибольничной пневмонии............................................. 125
Крыжановский С.П., Запорожец Т.С.
Эндотелиальная и иммунная дисфункция
в раннем периоперационном периоде у пациентов
с травмой нижних конечностей.................................................... 128
Сотниченко С.А., Маркелова Е.В., Скляр Л.Ф.
ВИЧ-инфекция, сочетанная с туберкулезом,
в Приморском крае: выявление, клиническое течение,
иммунные механизмы патогенеза............................................... 133
Тезисы докладов Всероссийской конференции
«Иммуномодуляторы природного происхождения».................... 137
Некрологи
Георгий Павлович Сомов................................................... 141
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Contents
Editorials
Pacific hydrobionts-derived immune response
modulating agents: fundamental and applied aspects............................ 5
Lectures
Besednova N.N., Zaporozhets T.S.
Action of prokaryote's deoxiribonucleic acid on humoral and cellular
factors of innate and adaptive immunity of of vertebrate animals..........8
Besednova N.N., Fedyanina L.N.
Anticancer effect of exogenous deoxiribonucleic acid......................... 12
Original researches
Avdeeva Zh.I., Alpatova N.A., Akolzina S.E., Medunitsin N.V.
Immunoadjuvant effect of cytokines................................................... 19
Avdeeva Zh.I., Alpatova N.A., Akolzina S.E., Medunitsin N.V.
Cytokines and vaccines...................................................................... 22
Motorya E.S., Pivnenko T.N., Gazha A.S., Ivanushko L.A., Vorontsov V.N., Sanina N.M.
Study on immune-response modulating
and membrane-acting effects of carotenoids derived
from the tunic of Ascidia halocynthia aurantium ................................. 28
Chikalovets I.V., Molchanova V.I., Aminin D.L., Chernikov O.V.,
Pislyagin E.A., Lukianov P.A.
Neomythilane as new Crenomytilus grayanus
mussel-derived immune-response modulating agent.......................... 32
Makarenkova I.D., Akhmatova N.K., Semenova I.B., Besednova N.N., Zvyagintseva T.N.
Sulphated polysaccharides derived from sea brown algae
as inducing substances for dendritic cell matu-ration.......................... 36
Ermak I.M., Davidova V.N., Aminin D.L., Barabanova A.O., Sokolova E.V., Bogdanovich R.N., Polyakova A.M., Soloviova T.F.
Immunomodulating activity of the Far Eastern sea
red algae-derived carrageenans.......................................................... 40
Smolina T.P., Zaporozhets T.S., Gorshkova R.P., Nazarenko E.L.
Early activation of human peripheral blood lymphocytes
and monocytes by components of proteobacte-ria
Pseudoalteromonas nigrifaciens . ......................................................... 45
Koldaev V.M., Vaschenko V.V., Bezdetko G.N.
Photometrical parameters of absorption spectra
of plant-derived extracts.................................................................... 49
Ivanushko L.A., Soloviova T.F., Zaporozhets T.S., Somova L.M., Gorbatch V.I.
Antibacterial and antitoxic properties
of chitosan and its derivatives............................................................. 82
Kryilova N.V., Leonova G.N., Popov A.M., Artyukov A.A., Maistrovskaya O.S., Kozlovskaya E.P.
Antiviral activity of combined medication
Zostera asiatica-derived rosmarinic acid
against tick-borne encephalitis pathogen............................................ 86
Makarenkova I.D., Kryilova N.V., Leonova G.N., Besednova N.N.,
Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M.
Protective effects of fucoidan derived from brown algae
Laminaria japonica under experimental tick-borne encephalitis.......... 89
Vischuk O.S., Ermakova S.P., Fam Dyuk Tin, Shevchenko N.M., Bui Ming Li, Zvyagintseva T.N.
Anticancer activity of brown algae-derived fucoidans.......................... 92
Zhanaeva S.Ya., Alekseenko T.V., Korolenko T.A., Zvyagintseva T.N.
Anticancer and antimetastatic activity of sulphated
polysaccharide fucoidan derived from the Okhotsk Sea
brown algae Fucus evanescens . .......................................................... 96
Shutikova A.L., Tseluyiko S.S., Zaporozhets T.S.,
Epstein L.M., Besednova N.N.
Molluskam’s effect on mucociliary system of air-bearing
part of lungs and free radical processes under hypothermia................. 99
Maistrovskiy K.V., Zaporozhets T.S., Fedyanina L.N., Kalenik T.K., Motkina E.V., Imbs T.I.
Effects of immune response modulating agent
“Fucoidan” derived from Fucus evanescens brown algae
on the parameters of antioxidative system, lipid
and carbohydrate metabolism in mice.............................................. 103
Nevzorova V.A., Borovskaya T.F., Dmitrieva T.B., Skrebkova L.D., Pazyich S.A.
Local and system immune response in case
of community-acquired pneumonia in young patients...................... 106
Zaporozhets T.S., Maistrovskiy K.V., Rapovka V.G., Gazha A.K., Smolina T.P., Zvyagintseva T.N.
Role of T-cell dysfunction in the development
of lower limb atherosclerosis and treatment opportunities................. 110
Ponomareva T.I., Dobryakov Yu.I.
Experimental study of haurantin immune properties
in case of immunosuppression........................................................... 52
Kozlov V.K., Kozlov M.V., Guseva O.E., Lebedko O.A., Morozova N.V.
Antioxidative activity of Echinochrome A in case
of chronic inflammatory lung diseases in children............................ 116
Plekhova N.G., Fedyanina L.N., Somova L.M., Besednova N.N., Kalenik T.K.
Changing metabolism of phagocytes in blood in response
to action of salmon milt-derived deoxyribonu-cleic acid.................... 55
Gilmutdinova L.T., Gilmutdinov A.R., Kudayarova R.R., Mineeva L.S.
Immunomodulating effects of koumiss treatment during
sanatorium rehabilitation of patients operated for cholelithiasis............. 118
Prieszheva E.Yu., Lebedko O.A., Ryizhavskiy B.Ya., Kozlov V.K.
Effect of echinochrome on kidney structure and metabolism
in 40-day white rats exposed prenatally to lead nitrate........................ 58
Kinyaikin M.F., Sukhanova G.I., Naumova I.V., Kuznetsova T.A., Ovchinnikov A.Ya., Poletaeva I.M., Beznis V.M.
Role of hypoxemia in forming immune disorders and haemostasis
in patients with chronic obstructive pulmonary disease..................... 120
Tupkalo A.V.
Studying defects in thin organic films................................................. 61
Buzoleva L.S., Kostyushko A.V., Kondrashova N.M.
Estimating clinical and immunological efficiency
of plant immune-response modulating agents in case
of experimental mouse pneumonia.................................................... 64
Golokhvast K.S., Panichev A.M., Gulkov A.N., Mischakov I.V., Vedyagin A.A.
Antioxidative and immune-response modulating
properties of natural zeolites.............................................................. 68
Belova S.V.
Application of enzymatic immune-response modulating
agent to treat experimental antigen-induced ar-thritis........................ 70
Bgatova N.P., Golokhvast K.S., Bgatov A.V.,
Panichev A.M., Palchikova N.A.
Immunomodulating effect produced by natural zeolite
on peyer's patches structure under caesium accumulation................... 74
Kuznetsova T.A., Somova L.M., Plekhova N.G., Zvyagintseva T.N.
Application of brown algae Fucus evanescens-derived fucoidan
to correct immune dysfunctions under endotoxinemia....................... 78
Kivaeva I.F., Golovacheva V.D., Yatskova M.A., Dobryakov E.Yu., Kryizhanovskiy S.P., Ivanushko L.A.
Integrated chitosan- and molluskam-based dietary
supplement as a maintenance medication for baseline
therapy of gastric and duodenal ulcer............................................... 123
Kostyushko A.V.
State of local immunity in case of in-hospital pneumonia................. 125
Kryizhanovskiy S.P., Zaporozhets T.S.
Endothelial and immune dysfunctions during early
peri-operative period in patients with lower limb injuries.................. 128
Sotnichenko S.A., Markelova E.V., Sklyar L.F.
HIV infection associated with tuberculosis in Primorskiy Krai:
detection, clinical course and immune mechanisms of pathogenesis........ 133
Abstracts
Papers presented at the All-Russian Conference
“Plant Immune-Response Modulating Agents”................................. 137
Obituaries
Georgy Pavlovitch Somov.................................................................141
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Передовые статьи
УДК 615.37:[615.324:574.52](265)
ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ ИЗ ГИДРОБИОНТОВ ТИХОГО ОКЕАНА:
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ
Поиск регуляторов иммунных процессов и изучение
механизмов их действия привлекает в последние де‑
сятилетия внимание исследователей многих стран.
На фоне снижения эффективности традиционных
методов терапии соматических и инфекционных за‑
болеваний, роста устойчивости патогенных микро‑
организмов к имеющимся лекарственным средствам
продолжает оставаться актуальной разработка новых
эффективных и безвредных иммуномодуляторов, в
том числе и природного происхождения.
Большой интерес к иммуноактивным препаратам
в настоящее время обусловлен расширением возмож‑
ностей оценки иммунного статуса человека, а также
глубоким пониманием многих механизмов форми‑
рования первичных и вторичных иммунодефицитов,
иммунопатогенеза аутоиммунных, аллергических и
онкологических заболеваний.
Иммуномодуляторами могут быть вещества раз‑
личной химической природы из представителей на‑
земной и морской флоры и фауны [2]. Природные
биологически активные вещества, полученные из
объектов наземной флоры и фауны, послужили осно‑
вой для создания многих современных лекарственных
средств и биологически активных добавок к пище им‑
мунотропного действия. Во всем мире в качестве ис‑
точников получения новых иммуномодуляторов все
чаще используют морские биологические ресурсы.
В результате систематических исследований морс‑
ких гидробионтов (водорослей, рыб, беспозвоночных)
получены многоплановые данные, свидетельствую‑
щие о том, что общим их свойством является продуци‑
рование биологически активных веществ уникальной
химической структуры, обладающих способностью
действовать на различные компоненты врожденного
и приобретенного иммунитета [4].
Уникальность морских биологически активных ве‑
ществ связана с условиями существования гидробион‑
тов в водной среде, характеризующейся высоким со‑
держанием соли, слабым освещением или его полным
отсутствием, высоким давлением и необычно высоки‑
ми или низкими температурами. Подобные условия
жизни обеспечивают отличия морских организмов и
их метаболитов от наземных. Морские гидробионты
характеризуются не только разнообразием и высокой
эффективностью содержащихся в них биологически
активных веществ, которые зачастую лишены отри‑
цательных свойств, присущих веществам, получен‑
ным из наземных объектов, но и широкой и успешно
воспроизводимой сырьевой базой некоторых из них.
С другой стороны, к настоящему времени еще не
описаны даже основные свойства многих морских гид‑
робионтов. Одной из причин такого положения явля‑
ются трудности, связанные с заготовкой сырья, и вы‑
деление активных веществ в необходимых количествах.
Тем не менее биологически активные вещест­ва морс‑
кого происхождения являются образцами химических
соединений, которые после синтеза или получения
их биотехнологическими методами займут достойное
место среди других фармакологических препаратов.
В России изучением биологически активных ве‑
ществ морских гидробионтов занимаются в Тихооке‑
анском институте биоорганической химии ДВО РАН,
в Институте биологии моря ДВО РАН, Тихо­океанском
океанологическом институте им. В.И. Ильичева ДВО
РАН, Тихоокеанском научно-исследовательском ры‑
бохозяйственном центре (ТИНРО-центре), Инсти‑
туте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН,
Институте эволюционной физиологии и биохимии
им. И.М. Сеченова РАН, Азовском научно-исследова‑
тельском институте рыбного хозяйства и океаногра‑
фии, Северном отделении Полярного научно-иссле‑
довательского института морского рыбного хозяйства
и океано­графии им. Н.М. Книповича, Всероссийском
НИИ рыбного хозяйства и океанографии, НИИ эпи‑
демиологии и микробиологии СО РАМН, Владивос‑
токском государственном медицинском университете
и других научных учреждениях.
Дальний Восток располагает богатейшими и уни‑
кальными сырьевыми ресурсами для создания в ре‑
гионе промышленного производства биологически
активных веществ. Разработка научных основ даль‑
нейшего развития биотехнологий для применения в
здравоохранении, медицинской, пищевой промыш‑
ленности, использование современных наукоемких
технологий переработки биологических ресурсов в
хояйственном комплексе региона, ориентированном
сегодня преимущественно на вывоз сырья, позволит
более рационально и экономически целесообразно
использовать природные богатства Дальнего Востока.
Существенный вклад в разработку новых имму‑
номодуляторов из морского сырья внесли совмест‑
ные исследования НИИ эпидемиологии и микроби‑
ологии СО РАМН, Тихоокеанский институт биоорга‑
нической химии ДВО РАН и ТИНРО-центра. Были
исследованы иммуномодулирующие свойства поли‑
катионных и полианионных полисахаридов (фукои‑
данов, хитозана и их производных), а также низкомо‑
лекулярные соединения морского происхождения
(сульфатированные полиоксистероиды, пептиды,
нуклеиновые кислоты, комплексы аминокислот) из
морских беспозвоночных, водорослей и рыб. В на‑
стоящее время иммуномодуляторы из гидробионтов
исследуются в качестве модификаторов других функ‑
ций организма: для регуляции процесса старения ор‑
ганизма, изменения функциональной активности
системы гемостаза, оказания гепатозащитного,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
антивирусного, антибактериального действия и пр.
В результате проведенных работ создана основа для
конструирования оригинальных иммуномодулято‑
ров (лекарственных форм и биологически активных
добавок).
Большое внимание исследователей привлекают
сейчас фукоиданы – сульфатированные полисахари‑
ды из бурых водорослей [5–7]. В Тихоокеанском инс‑
титуте биоорганической химии ДВО РАН разработан
метод получения новых фукоиданов из бурых водо‑
рослей Fucus evanescens, Laminaria ja­po­ni­ca, и La­mi­na­
ria ci­cho­rioi­des, имеющих обширный ареал, достаточ‑
ные запасы и являющихся богатым источником фу‑
коиданов. Иммуномодулирующее действие фукои‑
данов достаточно полно представлено в ряде обзоров
[5, 6]. Фукоиданы ускоряют созревание дендритных
клеток, стимулируют фагоцитарные процессы и кис‑
лородзависимые механизмы бактерицидности ней‑
трофилов, обладают адъювантным действием, моду‑
лируют продукцию цитокинов. При исходно низком
уровне спонтанной выработки цитокинов фукоидан
обладает способностью к преимущественной индук‑
ции провоспалительных цитокинов. Это может быть
механизмом, который обеспечивает влияние препа‑
ратов на развитие воспалительной реакции на ран‑
них этапах инфекционного процесса и стимулирует
экспрессию молекул адгезии, выход нейтрофилов в
воспалительный очаг, активацию нейтрофилов, мак‑
рофагов и натуральных киллеров, усиление фагоци‑
тоза и продукции супероксидных радикалов фагоци‑
тами, пролиферацию лимфоцитов, а также увеличе‑
ние синтеза γ-интерферона NK-клетками.
Из других свойств фукоиданов, исследованных в
последние годы, следует отметить прямое антикоа‑
гулянтное, противовирусное, антитоксическое дейс‑
твие, а также гепатозащитный эффект [10, 11].
Сочетание иммуномодулирующих свойств с ан‑
тикоагулянтной активностью делают перспективным
использование фукоидана для улучшения геморео‑
логии, микроциркуляции и снижения склонности к
тромбозам при оперативных вмешательствах и кон‑
сервативном лечении состояний, сопровождающихся
развитием синдрома внутрисосудистого свертывания
крови (травмы, комбинированные поражения, инток‑
сикации, сепсис, инфекционные болезни), а также
вторичной иммунологической недостаточности.
Иммуностимулирующим действием обладает
ДНК из молок рыб, в частности осетровых и лосо‑
севых [1, 9, 13]. К настоящему времени существуют
лекарственные препараты и биологически актив‑
ные добавки, созданные на основе гонад осетровых.
В ТИНРО-центре разработана биологически актив‑
ная добавка к пище на основе ДНК из молок лосо‑
севых рыб, которая используется в качестве средства
сопровождения базисной терапии у онкологических
больных, а также при инфекционных болезнях [13].
Регуляторами многих биологических процессов
в организме, в том числе иммунных, являются со‑
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
единения пептидной природы [2]. Сотрудниками
НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН,
ТИНРО-центра и Владивостокского государствен‑
ного медицинского университета проведены ши‑
рокие исследования тинростима – пептида из нерв­
ной ткани дальневосточного кальмара. Механизмы
действия этого биополимера хорошо изучены и
достаточно полно представлены в литературе [5, 6].
Тинростим в качестве биологически активной до‑
бавки к пище с хорошими результатами применяли в
качестве средства сопровождения базисной терапии
псевдотуберкулеза, гепатитов, гонореи, пневмоний,
а также при гнойных осложнениях хирургических
вмешательств и т.д. В настоящее время проводятся
экспериментальные исследования лекарственной
формы тинростима.
Несмотря на многочисленные исследования
противомикробных, противоопухолевых, противо‑
воспалительных свойств хитозанов, полученных из
разных источников, интерес к новым производным
этих полисахаридов не угасает. Это обусловлено не‑
обходимостью изменить некоторые физико-хими‑
ческие свойства хитозана (нерастворимость, высокая
вязкость в нейтральных и щелочных водных раство‑
рах, плохая всасываемость из желудочно-кишечного
тракта) без потери биологической активности. Со‑
трудники НИИ эпидемиологии и микробиологии СО
РАМН и Тихоокеанского института биоорганичес‑
кой химии ДВО РАН исследовали в этом плане про‑
изводные этого полисахарида, которые отличаются
от исходного хитозана низкой молекулярной массой,
хорошей растворимостью в воде, лучшей всасывае‑
мостью в желудочно-кишечном тракте [8]. Для даль‑
нейшей работы отобраны образцы, обладающие раз‑
личной биологической активностью.
Большой интерес представляют исследования им‑
муномодулирующей активности липополисахаридов
и полисахаридов из морских протеобактерий, прово‑
димые учеными Тихоокеанского института биоорга‑
нической химии ДВО РАН и НИИ эпидемиологии
и микробиологии СО РАМН [12]. Описано свойство
этих биополимеров подавлять адгезию патогенных
микроорганизмов к клеткам макроорганизма, что
открывает перспективы создания на их основе новых
антиадгезивных препаратов.
Изучение природных соединений морского про‑
исхождения привело к открытию новых типов био‑
логически активных веществ, представляющих инте‑
рес для медицины в качестве потенциальных имму‑
номодуляторов и модификаторов биологического
ответа. К таким веществам относятся полярные вто‑
ричные метаболиты иглокожих, имеющие уникаль‑
ное химическое строение. Стероиды офиур обладают
цитотоксической, антигрибковой и антивирусной
активностью, являются ингибиторами или актива‑
торами ферментов. Исследования А.К. Гажа и др. [3]
показали, что эти биополимеры повышают уровень
врожденного иммунитета: существенно усиливают
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Передовые статьи
способность нейтрофилов к адгезии на пластике,
активируют кислородзависимые механизмы бакте‑
рицидности этих клеток, увеличивают их фагоцитар‑
ную активность. Установлена зависимость активнос‑
ти соединений от строения их молекул.
Полиоксистероиды увеличивают уровень анти‑
тел в сыворотке крови и число антителообразующих
клеток в селезенке к тимусзависимому антигену
(эритроцитам барана), снижают интенсивность ги‑
перчувствительности замедленного типа к этому ан‑
тигену. Все исследованные образцы полиоксистеро‑
идов усиливали спонтанную продукцию провоспа‑
лительных цитокинов – фактора некроза опухоли-α
и интерлейкина‑8, – вырабатываемых в культуре
клеток цельной крови преимущественно мононук‑
леарными фагоцитами. Сульфатированные окси­
стероиды в разной степени обеспечивают защитный
эффект при экспериментальной сальмонеллезной
инфекции.
Результаты комплексных фундаментальных и
прикладных исследований институтов различного
профиля демонстрируют перспективы целесообраз‑
ности дальнейшего поиска соединений из морских
гидробионтов, обладающих полезными свойствами,
могущих стать основой для создания лекарственных
препаратов иммунотропного действия. Такие био‑
логически активные вещества можно использовать
при острых и хронических заболеваниях, ведущим
патогенетическим фактором которых являются им‑
мунодефицитные синдромы. Представляется столь
же убедительной целесообразность применения им‑
муноактивных препаратов из морских гидробионтов
в качестве профилактических средств – позитивных
модификаторов биологического ответа клеток на
агрессивные экзогенные и эндогенные воздействия.
На основе соединений из морских гидробионтов и
их синтетических аналогов в ближайшие годы, не‑
сомненно, будут созданы новые эффективные ле‑
карственные препараты иммунотропного действия.
Данный номер «Тихоокеанского медицинского
журнала» создан на основе материалов, представ‑
ленных на Всероссийской конференции «Иммуно‑
модуляторы природного происхождения». Тематика
конференции охватывает как теоретические вопро‑
сы, отражающие достижения в области разработ‑
ки новых иммуномодулирующих препаратов, так и
прикладные аспекты использования иммуномоду‑
ляторов в различных областях медицины. Приво‑
дятся результаты экспериментального и клиничес‑
кого изучения эффективности иммуномодуляторов
различной химической природы. Организаторы
конференции выражают надежду на то, что она по­
служит дальнейшему развитию этого направления
иммунологии.
Литература
1. Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М. Дезоксирибонуклеиновая
кислота из молок лососевых рыб: пособие для врачей. Вла­
дивосток, 2003. 48 с.
2. Беседнова Н.Н., Эпштейн Л.М. Иммуноактивные пепти­
ды из гидробионтов и наземных животных. Владивосток:
ТИНРО-центр, 2004. 248 с.
3. Гажа А.К., Левина Э.В. Запорожец Т.С. Влияние сульфа­
тированных полиоксистероидов из морских иглокожих на
функциональную активность нейтрофильных гранулоци­
тов // Журн. микробиол. 2006. № 3. С. 101–103.
4. Еляков Г.Б., Стоник В.А. Морская биоорганическая хи­
мия – основа морской биотехнологии // Известия АН: се­
рия химия. 2003. № 1. С. 1–18.
5. Запорожец Т.С. Клеточные и молекулярные механизмы
иммуномодулирующего действия биополимеров морских
гидробионтов: дис. … д-ра мед. наук. Владивосток, 2006.
365 с.
6. Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н. Иммуноактивные био­
полимеры из морских гидробионтов. Владивосток, 2007.
218 с.
7. Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н. Елякова Л.А. Структура
и иммунотропное действие 1→3; 1→6-β-D-глюканов. Вла­
дивосток: Дальнаука, 2002. 160 с.
8. Иванушко Л.А., Соловьева Т.Ф., Запорожец Т.С. и др.
Сравнительное изучение иммуномодулирующих свойств
хитозана и его производных // Мед. иммунология. 2007.
Т. 9, № 5. С. 397–404.
9. Каплина Э.Н. Некоторые итоги клинического применения
препарата «Деринат» с 1976 по 2000 год // Использова­
ние препарата «Деринат» в различных областях медици­
ны: тез. докл. 1-й Всероссийской научно-практ. конф. М.,
2000. С. 47.
10. Кузнецова Т.А. Коррекция нарушений иммунитета и ге­
мостаза биополимерами из морских гидробионтов (экспе­
риментальные и клинические аспекты): дис. … д-ра мед.
наук. Владивосток, 2009. 316 с.
11. Макаренкова И.Д., Компанец Г.Г., Запорожец Т.С. Ин­
гибирование адгезии патогенных микроорганизмов на эу­
кариотических клетках // Журн. микробиол. 2006. № 6.
С. 56–60.
12. Смолина Т.П. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л. и др. Бло­
кирование адгезии Yersinia pseudotuberculosis с помощью
полисахаридов, выделенных из морских микроорганизмов
Pseudoalteromonas // Тихоокеанский медицинский журнал.
2001. № 2. С. 18–20.
13. Федянина Л.Н. Иммуномодулирующая активность низ­
комолекулярной ДНК из молок лососевых рыб (фундамен­
тальные и прикладные аспекты): дис. … д-ра мед. наук.
Владивосток, 2007. 320 с.
PACIFIC HYDROBIONTS-DERIVED IMMUNE
RESPONSE MODULATING AGENTS: FUNDAMENTAL
AND APPLIED ASPECTS
Summary – This is an advanced paper related to the results and
prospects of research into marine hydrobionts that contain bio‑
logically active substances of unique chemical structure known
to produce effect on various components of innate and acquired
immunity. The Far East abounds in natural resources that suffice
to stimulate regional production-scale extraction of biologically
active substances. Due consideration is given to the study into
immune modulating properties of polycationic and polyanionic
polysaccharides (fucoidans, chitosan and their derivatives) and
low-molecular compounds of marine origin (sulphated poly‑
oxysteroids, peptides, nucleic acids, and amino acid complexes)
derived from marine invertebrates, algae and fish. The scientific
basis to be developed in an effort to take next step forward in
the evolution of biological technologies that are very likely to be
applied in health care, medical and food industry, as well as the
usage of high technologies for processing of biological resources
in the export-oriented regional economy will allow to utilize the
Far Eastern natural resources in an economically feasible and
sustainable manner.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 5–7.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
УДК 612.017.11:577.213/217].08
Н.Н. Беседнова, Т.С. Запорожец
НИИ эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1)
ДЕЙСТВИЕ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ПРОКАРИОТ НА ГУМОРАЛЬНЫЕ
И КЛЕТОЧНЫЕ ФАКТОРЫ ВРОЖДЕННОГО И АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА ПОЗВОНОЧНЫХ
Ключевые слова: дезоксирибонуклеиновая кислота, олигодезоксинуклеотиды, иммунитет, иммунная система.
Представлены современные сведения о действии ДНК
эукариот, естественных и синтетических олигодезокси‑
нуклеотидов, на гуморальные и клеточные факторы врож‑
денного и адаптивного иммунитета. Освещены вопросы о
взаимодействии ДНК с толл-подобными рецепторами и
инициации врожденного иммунитета. Приведены данные
об иммуностимулирующих, адъювантных и антиинфек‑
ционных свойствах ДНК прокариот. Показано усиление
Т-хелперного 1-го типа иммунного ответа, что открывает
перспективы использования ДНК и олигодезоксинуклео‑
тидов при аллергических болезнях, в частности, при брон‑
хиальной астме.
Долгое время существовало мнение, что ДНК про- и
эукариот не оказывает заметного влияния на фун‑
кционирование иммунной системы позвоночных.
В дальнейшем это утверждение было пересмотрено
и ДНК прокариот стали считать одной из наиболее
иммуногенных молекул природного происхождения,
«золотым стандартом» адъювантов [24].
В 1984 г. японские ученые получили из My­co­bac­
te­ri­um bovis BCG препарат My-1, содержавший 70%
ДНК и 28% РНК, который активировал NK-клетки
и вызывал регрессию некоторых эксперименталь‑
ных опухолей [29]. Доказательством того, что именно
ДНК является действующим началом экстракта, бы‑
ла потеря последним иммуногенных свойств после
обработки нуклеолитическими ферментами. Позже
было установлено, что бактериальная ДНК повыша‑
ет литическую активность мононуклеаров перифери‑
ческой крови человека [19].
Иммуностимулирующую активность бактериаль‑
ной ДНК определяет присутствие в ее составе неме‑
тилированных динуклеотидов – CpG-мотивов. Высо‑
кополимерную ДНК или ее короткие последователь‑
ности, содержащие неметилированные CpG-мотивы,
оказывающие выраженный стимулирующий эффект
на иммунную систему позвоночных, называют имму‑
ностимулирующими CpG-ДНК [4]. ДНК можно по‑
лучать из различных грамположительных и грамот‑
рицательных бактерий, а также из ДНК-вирусов.
У 2% многоклеточных организмов иммунная сис‑
тема представлена двумя взаимосвязанными элемен‑
тами – врожденным и адаптивным иммунитетом [7].
Одной из функций врожденного иммунитета являет‑
ся распознавание и элиминация в первые часы после
заражения вторгшегося в организм патогена и вы‑
работка сигналов, обусловливающих формирование
специфического иммунного ответа. Быстрая защита
Беседнова Наталия Николаевна – д-р мед. наук, проф., акаде‑
мик РАМН, директор НИИЭМ СО РАМН; тел.: 8 (4232) 44-24-46;
e-mail: niiem_vl@mail.ru.
от любого патогена (в течение нескольких часов от
момента инвазии) может быть создана путем стиму‑
ляции системы врожденного иммунитета.
Индикация бактериальной ДНК иммунной
системой позвоночных происходит путем взаимо‑
действия этого биополимера с толл-подобными
рецепторами (Toll-Like Receptor – TLR), которые
являются наиболее древними представителями об‑
разраспознающих рецепторов, определяющих кон‑
сервативные молекулярные структуры – паттерны
возбудителей [17]. TLR в настоящее время счита‑
ются ключевым элементом распознавания «чужого»
системой клеток хозяина. В качестве «чужого» рас‑
сматриваются, как правило, патогенные и условнопатогенные микроорганизмы (бактерии, вирусы).
Паттерны, распознаваемые TLR, описаны у многих
грамположительных и грамотрицательных бакте‑
рий, ряда оболочечных вирусов, некоторых грибов
и отдельных простейших.
TLR состоят из двух доменов. Внеклеточный
домен содержит варьирующее число лектиновых
по­второв. Предполагают, что эти повторы обеспе‑
чивают прямое взаимодействие с лигандами микро‑
организмов или их нуклеиновыми кислотами. Ци‑
топлазматический участок TLR сходен с цитоплазма‑
тическим доменом рецептора интерлейкина-1. Через
него начинается трансляция сигналов, активирован‑
ных TLR. Передачу сигналов внутри клетки, несущей
TLR, представляют как последовательную активацию
цитоплазматических адаптерных молекул (MyD88 и
др.), киназ (МАРК) и ядерного фактора транскрип‑
ции (NFκB) [7].
TLR экспрессированы главным образом на клет‑
ках системы врожденного иммунитета – макрофагах,
дендритных клетках, нейтрофилах, моноцитах, Т- и
В-лимфоцитах, эпителиальных клетках, клетках ки‑
шечника, кератиноцитах кожи, клетках микроглии.
Бактериальную ДНК распознает TLR9, находящийся
во внутриклеточных органеллах – цитоплазматичес‑
ких эндоцитозных везикулах [21]. Есть данные, что
этот биополимер распознают еще TLR2 и TLR4.
При контакте ДНК или олигодезоксинуклеотидов
(ОДН) с TLR стремительно активируются различные
факторы врожденного иммунитета – первой линии
защиты организма от инфекционных возбудителей,
паразитов и трансформированных клеток [1, 24]. Ак‑
тивация внутреннего домена рецептора приводит к
выраженному и быстрому образованию реактивных
форм кислорода и активации нитроксидсинтазы. Все
это позволяет считать ДНК агонистом TLR9.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Лекции
Благодаря высокому содержанию в ДНК прокари‑
от неметилированных фрагментов CpG она воспри‑
нимается организмом позвоночных как патогенный
чужеродный агент, способный вызвать инфекцион‑
ный процесс.
CpG-ДНК непосредственно или как костимули‑
рующий сигнал активирует фактически все клетки
иммунной системы [10]. Нуклеотиды стимулируют
иммунокомпетентные клетки, способствуя их проли‑
ферации, дифференцировке, хемотаксису, секреции
цитокинов, высвобождению лизосомальных компо‑
нентов и образованию молекул реактивного кисло‑
рода или нитроксидсинтазы [6].
CpG-ДНК оказывает прямое активирующее дейс‑
твие на антигенпрезентирующие клетки (макрофаги,
дендритные клетки, В-лимфоциты). Этот биополимер
является мощным активирующим сигналом для де‑
ндритных клеток животных и человека, вызывает про‑
дукцию ими цитокинов, ассоциированных с Т‑хелпе‑
рами 1-го типа (интерлейкины 12 и 18), достигающую
высокого уровня. Кроме того, CpG-ДНК ускоряет со‑
зревание дендритных клеток, определяемое экспрес‑
сией CD83, экспрессию костимуляторных молекул
ICAM-1, а также CD40 и молекул главного комплекса
гистосовместимости II класса, что увеличивает спо‑
собность активировать Т-лимфоциты [19].
CpG-ДНК превосходит гранулоцитарно-мак‑
рофагальный
колониестимулирующий
фактор
(Gra­nu­lo­cyte-macrophage colony-stimulating factor –
GM-CSF) в действии на выживаемость первичных
дендритных клеток, полученных из крови, и инду‑
цирует дифференцировку клеток, которая находит
отражение в увеличении их размеров, числа гранул, а
также экспрессии молекул главного комплекса гис‑
тосовместимости II класса. Комбинация CpG-ДНК
и GM‑CSF еще больше усиливает активацию и со‑
зревание дендритных клеток, что свидетельствует о
различных путях действия этих факторов. Известно,
что CpG‑ДНК препятствует спонтанному апоптозу
дендритных клеток [26].
Макрофаги играют ведущую роль в клиренсе
ДНК. Отмечают значительные различия в последс‑
твиях стимуляции этим биополимером макрофа‑
гов и дендритных клеток. Так, по данным R.S. Chu
et al. [12] только для дендритных клеток характерна
активация процессинга и презентации антигена, т.к.
CpG-ДНК уменьшает экспрессию молекул главно‑
го комплекса гистосовместимости II класса на мак‑
рофагах, что приводит к угнетению процессинга и
презентации антигена этими клетками. При воздейс‑
твии CpG-ДНК в макрофагах увеличиваются уровни
внутриклеточных реактивных радикалов кислорода.
Однако есть сведения, что ДНК оказывает стимули‑
рующее действие как на дендритные клетки, так и на
макрофаги [28].
Под действием CpG-ДНК in vitro активируются
клетки глии, которые начинают продуцировать фак‑
тор некроза опухоли-α, интерлейкины 12p40 и 12p70,
а также оксид азота. Усиливается фагоцитарная актив‑
ность. После интрацеребровентрикулярной инъекции
CpG-ДНК микроглиальные клетки активируются и
продуцируют фактор некроза опухоли-α и интерлей‑
кин-12p40. Это свидетельствует о чувствительности
клеток микроглии к CpG-ДНК, в связи с чем она мо‑
жет играть значительную роль в течении инфекцион‑
ных болезней центральной нервной системы и быть
причиной иммунопатологических реакций [13].
CpG-ДНК активирует В-лимфоциты, усилива‑
ет экспрессию мембранного иммуноглобулина M и
стимулирует секрецию интерлейкина-6 и фактора
некроза опухоли-α. CpG-ДНК напрямую активирует
дендритные клетки и В-лимфоциты, экспрессиру‑
ющие TLR9, который связывает биополимер и тем
самым обусловливает его стимулирующий эффект.
Кроме того, CpG-ДНК стимулирует факторы врож‑
денного иммунитета напрямую и опосредованно
(через Т-лимфоциты, NK-клетки и нейтрофилы), в
результате чего изменяется экспрессия рецепторов
специфических цитокинов, костимуляторных моле‑
кул и молекул адгезии [11].
Эффект CpG-ОДН зависит от возраста животных.
Так, у жеребят ОДН не индуцируют специфическо‑
го созревания и экспрессии цитокинов макрофага‑
ми и дендритными клетками. Кроме того, у молодых
животных снижена экспрессия рецепторов молекул
главного комплекса гистосовместимости II клас‑
са как на макрофагах, так и на дендритных клетках.
У взрослых лошадей под действием CpG-ОДН на‑
блюдается выраженная продукция интерлейкина-12
и γ-интерферона [15].
CpG-мотивы бактериальной ДНК могут пролон‑
гировать и усиливать воспаление путем подавления
апоптоза нейтрофильных гранулоцитов [20].
Влияние ДНК на Т-лимфоциты может реализо‑
ваться как опосредованно через активированные ан‑
тигенпрезентирующие клетки и секретируемые ими
цитокины, так и путем непосредственного влияния
на эти клетки. Под действием ДНК происходит про‑
лиферация Т-клеток, секреция ими интерлейкина-2
и экспрессия интерлейкин-2-рецептора.
В настоящее время в клинической практике и на‑
учных исследованиях часто используют синтетичес‑
кие CpG-мотивы. Существуют различные классифи‑
кации этих веществ. По одной из них CpG-мотивы
разделяют на типы А, В, С, D, K [23]. Мотивы А и
D стимулируют продукцию α-интерферона, активи‑
руют NK-клетки, подавляют рост опухолей. Моти‑
вы типов B и К стимулируют антигенпрезентирую‑
щие клетки, активируют и вызывают пролиферацию
B‑лимфоцитов. Мотивы типа С способны вызывать
синтез интерферона 1-го типа (α/β-интерферона) и
значительную стимуляцию B-лимфоцитов.
Cинтетические олигонуклеотидные аналоги от‑
личаются не только нуклеотидной последовательнос‑
тью, но и активностью, а также спецификой опосре‑
дуемых иммуностимулирующих эффектов [32]. Они
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
10
проявляют такую же активность, как и природные. Как
показали исследования В.Г. Пак и др. [5], синтетичес‑
кие CpG‑ОДН повышали бактерицидную активность
клеток перитонеального экссудата, но не влияли на их
поглотительную активность. В качестве перспектив‑
ной для дальнейшего получения лекарственной формы
авторы предложили один из олигодезоксинуклеотидов
(ОДН 2395), который значительно стимулирует про‑
дукцию цитокинов, ассоциированных с Т-хелперами
1-го типа (интерлейкина-12 и γ‑интерферона), увели‑
чивает бактерицидность клеток перитонеального экс‑
судата и NK-литическую активность.
Синтетические ОДН, содержащие неметилирован‑
ные CpG-мотивы, напрямую стимулируют В-клетки
и плазмоцитоидные дендритные клетки, продукцию
Т‑хелперов 1-го типа и провоспалительных цитоки‑
нов и ускоряют созревание/активацию профессио‑
нальных антигенпредставляющих клеток. Активность
CpG-ОДН зависит от их первичной структуры [14].
ОДН, содержащие TTAGGG-мотивы, проявляют им‑
муносупрессивную активность и подавляют продук‑
цию провоспалительных цитокинов [23]. Экспери‑
ментальные исследования свидетельствуют о том, что
«супрессивные» ОДН могут быть использованы для
подавления иммунопатологических реакций.
Одним из наиболее интересных и практически
значимых свойств ДНК является ее способность зна‑
чительно повышать уровень иммунного ответа даже
на очень низкоиммуногенные антигены [16]. ДНК по
этому показателю превосходит адъювант Фрейнда.
CpG-ДНК защищает В-лимфоциты от спонтанного
апоптоза, действия антиопухолевой химиотерапии,
а также ультрафиолетовой радиации [33]. Адъюван‑
тную активность CpG-ДНК объясняют ее способ‑
ностью опосредованно через дендритные или другие
антигенпрезентирующие клетки активировать секре‑
цию цитокинов T-хелперами 1-го типа. Кроме того,
основным преимуществом CpG-ДНК является то,
что в отличие от полного адъюванта Фрейнда это ве‑
щество не обладает выраженной токсичностью [18].
Дезоксинуклеотиды также обладают адъювант‑
ными свойствами. Синтетические ОДН в настоящее
время рассматриваются в качестве потенциальных
адъювантов для опухолевых антигенов. Показана эф‑
фективность синтетических ОДН при вакцинации
против гриппа и гепатита В. При этом наблюдался
T-хелперный 1-го типа ответ при гриппозной вакци‑
нации и Т-хелперные 1-го и 2-го типов ответы – при
вакцинации против гепатита В [9].
Другие авторы в экспериментах показали, что им‑
мунизация мышей против гепатита В с использовани‑
ем CpG-ДНК и CpG-ОДН приводила к повышению
титра антител к антигену вируса, причем уровень ан‑
тител в этом случае был в 6 раз выше, чем при исполь‑
зовании стандартного адъюванта – гидроокиси алю‑
миния [23]. В случае же одновременного использова‑
ния этих двух адъювантов титры антител к антигену
вирусного гепатита В были в 35 раз выше, чем при ис‑
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
пользовании только гидроокиси алюминия. Кроме то‑
го, стандартный адъювант индуцировал Т-хелперный
2-го типа гуморальный ответ (иммуноглобулин G1), а
СpG-ОДН – Т-хелперный 1-го типа ответ с преиму‑
щественной продукцией иммуноглобулина G2.
Хорошие результаты дает комбинация CpG-ОДН
c сибиреязвенной вакциной (AVA – лицензирован‑
ная вакцина для иммунизации людей): увеличива‑
ется скорость образования антител, их титр и авид‑
ность. Не менее эффективно применение в качестве
адъюванта CpG-ОДН в комплексе с нетоксичной
субъединицей В холерного токсина. Такой конъюгат
стимулирует более высокие титры провоспалитель‑
ных цитокинов и хемокинов клетками мышиной се‑
лезенки. Иммуномодулирующий эффект комплекса
осуществляется через TLR9-MyD88- и NFκB-зависи‑
мый пути. При использовании столбнячного токсо‑
ида в качестве вакцинного антигена его комплекс с
CpG-ОДН значительно повышает уровень специфи‑
ческих иммуноглобулинов [8].
D. Verthelyi et al. [31] в экспериментах на макакахрезус установили эффективность CpG-ОДН (К и Д
типов) у ВИЧ-инфицированных животных. Как из‑
вестно, ВИЧ-инфицированным пациентам рекомен‑
дуется вакцинация против гепатита В. Однако у части
из них эффективность подобных прививок невысока.
В связи с этим авторы рекомендуют использовать их
результаты и провести клиническое изучение эффек‑
тивности CpG-ОДН в качестве адъюванта при вак‑
цинации таких лиц.
С целью повышения эффективности ОДН исполь‑
зуют катионные липидные комплексы, липосомы,
при применении которых увеличиваются показатели
иммунного ответа (в частности, уровень цитокинов)
и наблюдается выраженный терапевтический эффект
[30]. Вклад липосом в иммунный ответ определяется
их способностью связывать значительное число мо‑
лекул CpG-ОДН путем электростатического взаи‑
модействия, что обеспечивает индукцию высокого
уровня интерлейкина-12, необходимого для диффе‑
ренцировки Т-хелперов 1-го типа. Такие комплексы
могут быть основой для создания в будущем эффек‑
тивных вакцин.
Механизмы антиинфекционного действия микро‑
бной ДНК связаны в значительной степени с актива‑
цией врожденного иммунитета, а также с тем, что она
направляет иммунный ответ по Т-хелперному 1-го ти‑
па пути, который обеспечивает защиту от внутрикле‑
точных патогенов. Даже однократное введение живот‑
ным бактериальной CpG-ДНК создает долгосрочную
(в течение 2–4 недель) защиту против смертельной
дозы факультативных внутриклеточных паразитов
Lis­te­ria mo­no­cy­to­ge­nes, Fran­ci­sel­la tularensis, Plas­mo­di­um
ma­la­ria и др. [2]. Есть данные о том, что CpG-ДНК об‑
ладают иммунопротективной активностью и по отно‑
шению к внеклеточным микроорганизмам (Escherichia
co­li). Антиинфекционное действие ДНК достаточно
полно представлено в обзоре A.M. Krieg [24].
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Лекции
Бактериальная ДНК оказывает влияние на мор‑
фологию органов иммунной системы [3]. Подкожное
введение этого биополимера индуцирует локальную
транзиторную гиперплазию лимфатических узлов,
умеренное повышение спленического индекса и кле‑
точности селезенки. Введение СpG-ДНК в брюшную
полость вызывает резко выраженное увеличение мас‑
сы и клеточности этого органа. Ответ тимуса на вве‑
дение бактериальной ДНК носит двухфазный харак‑
тер: начальная фаза – ответ на антиген как на стимул,
и поздняя фаза – пролиферация.
Являясь мощным адъювантом и стимулятором
активности Т-хелперов 1-го типа, CpG-ДНК предот­
вращает повышение чувствительности к аллергенам
даже у предварительно сенсибилизированных жи‑
вотных [22]. Способность этих биополимеров изби‑
рательно стимулировать Т-хелперный 1-го типа ответ
может быть использована для лечения заболеваний,
обусловленных преобладанием активности Т-хелпе‑
ров 2-го типа, в частности, аллергических болезней
(например, бронхиальной астмы). Развитие T-хел‑
перного 1-го типа иммунного ответа происходит пу‑
тем воздействия CpG-ДНК на TLR. CpG-ОДН сни‑
жают уровень эозинофилии, уменьшают миграцию
Т-хелперов 2-го типа в легкие, образование слизи в
дыхательных путях, а также продукцию интерлейки‑
на-2. Все это резко обрывает воспалительный про‑
цесс [27].
Перспективными являются исследования, ка‑
сающиеся использования иммуностимулирующей
CpG‑ДНК в стареющем организме. На основании
доказательных экспериментов здесь рекомендовано
учитывать действие этого биополимера при разра‑
ботке стратегии иммунизации пожилых людей [25].
Таким образом, под действием бактериальной
ДНК имеют место два этапа активации иммунного
ответа: антигеннезависимый, состоящий в актива‑
ции факторов врожденного иммунитета, и антиген‑
зависимый, на котором происходит развитие специ‑
фического иммунного ответа. На первом этапе ДНК
стимулирует факторы врожденного иммунитета, в
результате чего происходит секреция γ-интерферо‑
на и цитокинов, необходимых для ее индукции (α- и
β‑интерферон, интерлейкины 12 и 18), которые оп‑
ределяют превращение недифференцированных
T‑хелперов в Т-хелперы 1-го типа. На втором этапе
под действием цитокинов первого этапа Т- и В-лим‑
фоциты активируются при контакте с антигеном, в
результате чего индуцируется секреция γ-интерферо‑
на и антител, специфических к антигену. Уровень ин‑
терферона на втором этапе активации гораздо выше,
чем на первом.
Совокупность изложенных материалов позволяет
заключить, что ДНК эукариот, а также ОДН (естес‑
твенные и синтетические) могут быстро создать не‑
специфическую защиту против различных патогенов
(бактерий, вирусов, простейших). Эти биополимеры
распознаются рецепторами системы врожденного
11
иммунитета, взаимодействие с которыми в течение
нескольких часов активирует эффекторную систему и
запускает процессы, ведущие к элиминации патогена
и формированию протективного (адаптивного) им‑
мунитета против конкретного патогена. Немаловаж‑
ное значение имеют адъювантные свойства ДНК, что
может быть использовано при вакцинации организма
слабоиммуногенными вакцинами или в тех случаях,
когда у человека или животных недостаточно выраба‑
тываются защитные антитела. ДНК прокариот, а так‑
же ОДН могут войти в набор бактериальных антиге‑
нов, несущих панель патогенассоциированных моле‑
кулярных структур, которые являются лигандами для
достаточно хорошо охарактеризованных девяти TLR.
Такая комбинация антигенов будет создавать быструю
защиту не только от бактерий, но и от вирусов [2].
Литература
1. Байракова А.Л., Воропаева Е.А., Афанасьев С.С. и др. Роль
и биологическое значение толл-подобных рецепторов в ан­
тиинфекционной резистентности организма // Вестник
РАМН. 2008. № 1. С. 45–54.
2. Биологическая безопасность // Онищенко Г.Г., Пальцев М.А.,
Зверев В.В. и др. Москва: Медицина, 2006. 304 с.
3. Олишевский С.В., Шляховенко М.А., Козак В.В., Яниш Ю.В.
Реакция различных органов иммунной системы на введение
бактериальной CpG-ДНК // Экспериментальная онколо­
гия. 2005. Т., 27, № 4. С. 50–55.
4. Олишевский С.В., Козак В.В., Яниш Ю.В. и др. Иммуности­
мулирующая СpG-ДНК: перспективы клинического приме­
нения в онкологии // Онкология. 2006. Т 8, № 2. С. 209–217.
5. Пак В.Г., Олиферук Н.С., Будихина А.С., Пинегин Б.В. Вли­
яние естественных и синтетических CpG-мотивов на бак­
терицидность, NK-литическую активность, индукции. ИЛ12 и ИФНγ in vitro // Иммунология. 2005. № 6. С. 332–335.
6. Серебряная Н.Б., Калинина Н.М. Иммуномодулирующая
активность и эффективность использования в терапии
воспалительных заболеваний препаратов нативной ДНК –
дерината и ферровира // Иммунитет и болезни: от теории
к терапии: мат. междунар. конгресса. М., 2005. С. 58–59.
7. Хаитов Р.М., Игнатьева Г.А. Сидорович И.Г. Иммуноло­
гия. М.: Медицина, 2002. 536 с.
8. Adamson J., Lindblad M., Lundqvist A. et al. Novel immuno­
stimulatory agent based on CpG ODN linked to the nontoxic B
subunit of cholera toxin // J. Immunol. 2006. V. 176, No. 8.
P. 4902–4913.
9. Avia J., Igal L., Plis-Finarov A. et al. Liposomal immuno­
stimulatory DNA sequence (ISS-ODN): an efficient paren­
teral and mucosal adjuvant for influenza and hepatitis B vac­
cines // Vaccine. 2002. Vol. 20, No. 27–28. P. 3342–3354.
10. Ballas Z.K. Modulation of NK cell activity by CpG oligodeoxy­
nucleotides // Immunologic Research. 2007. Vol. 39, No. 1–3.
P. 15–21.
11. Bendigs S., Salzer U., Lipford G.B. et al. CpG-oligodeoxynu­
cleotides co-stimulate primary T cells in the absence of antigenpresenting cells // Europ. J. Immunology. 1999. Vol. 29, No. 4.
P. 1209–1218.
12. Chu R.S., Askew D., Noss E.N. et al. CpG oligodeoxynucleotides
downregulate macrophage class II MHC antigen processing // J.
Immunology. 1999. Vol. 163. P. 1188–1194.
13. Dalpke A.H., Schafer M.K.-H., Frey M. et al. Immunostimula­
tory CpG-DNA Activaties Murine Microglia // The J. of Immu­
nology. 2002. Vol. 168. P. 4854–4863.
14. Du H., Xia Sh., Song H.et al. Structure efficacy relationships
of immunostimulatory activity of CpG-containing oligodeoxynu­
cleotides on mouse spleen cells // Acta Pharmacologica Sinica.
2007. Vol. 20, No. 10. P. 1637–1644.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
12
15. Flaminio M.J., Borges A.S., Nydam D.V. et al. The effect of
CpG-ODN on antigen presenting cells of the foal // J. Immune
Based Ther. Vaccines. 2007. No. 5. P. 18–23.
16. Gupta K.,Cooper C. A Reviev of the Role of CpG Oligodeoxy­
nucleotides as Toll-like Receptor 9 Agonist in Prophylactic and
Therapeutic Vaccine Development in infectious Diseases //
Drugs in Rand D. 2008. Vol. 9, No. 3. P. 137–145.
17. Hackett C.J. Innate immune activation as a broad-spectrum
biodefence strategy: prospects and research challenges // J. Al­
lergy Clin. Immunol. 2003. Vol. 112. P. 686–694.
18. Jahrsdorfer B., Weiner G. CpG oligodeoxynucleotides as im­
munotherapy in cancer // Cancer Therapeutics. 2006. Vol. 3,
No. 1. P. 27–32.
19. Jacob T., Walker P.S., Krieg A.M. et al. Activation of cutaneous
dendritic cells by СpG-containing ODN of TH1 responses by immu­
nostimulatory DNA // J. Immunol. 1998. Vol. 161. P. 3042–3049.
20. Jozsef L., Khreiss T., Filep J.G. CpG motifs in bacterial DNA
delay apoptosis of neutrophil granulocytes // Faseb J. 2004.
Vol. 18. P. 1776–1778.
21. Kensuke M. Innate immune sensing of pathogens and danger
signals by cell surface Toll-like receptors // Sem. Immunol.
2007. Vol. 19. P. 3–10.
22. Kline J.N., Krieg A.M. Toll-like receptor 9 activation with CpG
ODN for asthma therapy // Drug News Perspect. 2008. Vol. 21,
No. 8. P. 434–439.
23. Klinman D., Shirota H., Tross D. et al. Synthetic ODN as modulator
of inflammation // J. of Leucocyte Biol. 2008. Vol. 84. P. 958–964.
24. Krieg A.M. Antiinfective Application of Toll-like Receptor 9 Ago­
nist // The proceedings of the American Thoracis Society. 2007.
Vol. 4. P. 289–294.
25. Maletto B., Ropolo A., Moron V., Pistoresi – Palencia M.C.
CpG-DNA stimulates cellular and humoral immunity and pro­
motes Th1 differentiation in aged Balb/c mice // Journ. of Leu­
cocyte Biology. 2002. Vol. 72. P. 447–454.
26. Park Y., Lee S.W., Sung Y.C. Cutting Edge: CpG-DNA inhib­
its dendritic cell apoptosis by up-regulation cellular inhibitor of
apoptosis proteins, through the Phosphatidylinositide-3-OH ki­
nase pathway // J. Immunology. 2002. Vol.1, No. 168. P. 5–8.
27. Silverman E.S., Drazen J.M. Immunostimulatory DNA for Asth­
ma // Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 2003. Vol. 28. P. 645–647.
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
28. Sparwasser T., Hultner L., Koch E.S. Immunostimulatory CpGODN cause extramedullary murine hemopoesis // J. Immunol­
ogy. 1999. Vol. 162. P. 2368–2374.
29. Tocunaga T., Yamamoto H., Shimada S. et al. Antitumor activ­
ity of deoxyribonucleic acid fraction from Mycobacterium bovis
BCG // J. Nat. Cancer Inst. 1984. Vol. 72, No. 4. P. 955–962.
30. Yoshinaga T., Yasuda K., Ogawa Y. et al. DNA and its cationic
lipid complexes induce CpG-motif-dependent activation of murine
dendritic cells // Immunology. 2007. Vol. 120, No. 3. P. 295–302.
31. Verthelyi D., Klinman D.M. Immunoregulatory activity of CpGODN in humans and nonhuman primates // Clin. Immunol.
2003. Vol. 109. P. 64–71.
32. Wang H., Rayburn E., Zhang R. Synthetic ODN cjntaining
deoxycytidyl-deoxyguanosine dinucleotides (CpG-ODNs) and
modified analogs as novel anticancer therapeutics // Curr.
Pharm. Des. 2005. Vol. 11, No. 22. P. 2889–2997.
33. Wen-Ming-Chu.,Dragoi A.M., Cong Cao, Wan Y. Mechanism
of cell survival induced by CpG-DNA // The FASEB J. 2008.
Vol.22. P. 672–675.
Поступила в редакцию 27.03.2009.
ACTION OF PROKARYOTE’S DEOXYRIBONUCLEIC
ACID ON HUMORAL AND CELLULAR FACTORS
OF INNATE AND ADAPTIVE IMMUNITY
OF VERTEBRATE ANIMALS
N.N. Besednova, T.S. Zaporozhets
Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the RAMS,
Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087 Russia)
Summary – The paper gives due consideration to the effects of
eukaryote’s DNA, natural and synthetic oligodeoxynucleotides
produced on humoral and cellular factors of innate and adaptive
immunity, emphasizing the issues of DNA–Toll-like receptors
interaction and innate immunity initiation. Imparting the infor‑
mation about immunostimulating, adjuvant and anti-infectious
properties of the prokaryote’s DNA, the authors highlight inten‑
sification of T-helper factor type-1 immune response that allows
promising possibility to apply DNA and oligodeoxynucleotides for
the treatment of allergic diseases, including bronchial asthma.
Key words: deoxyribonucleic acid, oligodeoxynucleotides, immunity,
immune system.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 8–12.
УДК 616-006.04-085.37:577.213/217:[615.324:597.552.51]
Н.Н. Беседнова1, Л.Н. Федянина2
НИИ эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1),
Тихоокеанский государственный экономический университет (690091 г. Владивосток, Океанский пр-т, 19)
1 2 ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКЗОГЕННОЙ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ
Ключевые слова: дезоксирибонуклеиновая кислота, олигодезоксинуклеотиды, опухоли, иммуностимуляторы.
Обзор нового перспективного направления в иммуно‑
терапии злокачественных новообразований – примене‑
нии экзогенной ДНК, обогащенной неметилированными
CpG-мотивами, а также естественных и синтетических
CpG-олигодезоксинуклеотидов. Приведены результаты
совместного применения препаратов ДНК, химиотерапии
и лучевой терапии. Излагаются материалы собственных
исследований, посвященных эффективности ДНК из мо‑
лок лососевых рыб в профилактике и комплексной тера‑
пии онкологических заболеваний.
В основе цитотоксического действия большинства
современных химиотерапевтических препаратов ле‑
Беседнова Наталия Николаевна – академик РАМН, д-р мед.
наук, директор НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН;
тел.: 8 (4232) 44-14-38; e-mail: niiem_vl@mail.ru.
жит повреждение ДНК. Так, ингибирующее действие
на опухоли циклофосфана определяется индукцией
множественных двухцепочечных разрывов в ДНК
кроветворных клеток, приводящих к мутациям и хро‑
мосомным аберрациям и в итоге – к гибели клеток
[11]. Исходя из этого, экзогенную ДНК, полученную
из прокариот и эукариот, стали применять в комп‑
лексе базисной химиотерапии больных злокачест‑
венными новообразованиями с целью восстановле‑
ния лейкопоэза.
Препараты фрагментированной ДНК из эука‑
риотических клеток (органов мышей или плаценты
человека) обладают способностью стимулировать
восстановление количества лейкоцитов в перифе‑
рической крови мышей при угнетении гемопоэза
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Лекции
циклофосфаном [4]. Введение плацентарной ДНК
мышам с внутримышечными трансплантатами лим‑
фосаркомы приводит к выраженному торможению
роста опухоли. Сочетание циклофосфана с ДНК
вызывает более значительный противоопухолевый
эффект, чем применение одного химиопрепарата.
Лейкостимулирующий эффект наиболее сильно про‑
является при использовании аллогенной или таксо‑
номически более близкой (мышиной) ДНК. Гомоло‑
гическая рекомбинация происходит при нахождении
гомологичных участков не по всей длине фрагмента,
а только краевыми одноцепочечными «хвостами», на
которых формируется комплекс Rad 51. Фрагменты
экстраклеточной ДНК, попавшие в ядро, интегри‑
руются в реципиентный геном по способу гомоло‑
гической рекомбинации и таким образом «залечи‑
вают» те хромосомные дефекты, которые возникают
вследствие обработки цитостатиком. Такой способ
гомологичного обмена внехромосомного материала
ДНК и хроматина объясняет полученное в описан‑
ных экспериментах терапевтическое действие препа‑
ратов ДНК близких таксономических групп. Однако
авторы допускают, что кратковременное воздействие
гетерологичной ДНК вполне приемлемо при терапии
миелодепрессий, вызванных применением алкили‑
рующих агентов, и это может быть использовано в
перспективе при химиотерапии злокачественных но‑
вообразований [4].
В плазме крови и межклеточной жидкости живот‑
ных и человека содержится значительное количество
деградировавшей геномной ДНК, и ее концентра‑
ция в крови увеличивается при наличии в организме
злокачественной опухоли [17]. Эта ДНК поступает в
кровь из нормальных и опухолевых клеток в свобод‑
ном виде. В составе апоптотических телец она может
поглощаться другими, живыми, клетками и попадать
в ядро. По-видимому, транспортированные в клеточ‑
ное ядро фрагменты экстраклеточной ДНК за счет
механизма гомологической рекомбинации могут
встраиваться в соответствующие участки хромосом и
тем самым исправлять мутации или индуцировать ге‑
нетические изменения в соответствии с источником
фрагментов ДНК.
В.П. Николин и др. [4] исследовали влияние пре‑
паратов фрагментированной ДНК на рост перевива‑
емых опухолей у мышей. Авторы получали челове‑
ческую ДНК из плацент здоровых рожениц, а ДНК
мышей – из смеси тканей и органов этих животных
(печени, почек, селезенки, тимуса). Эксперименты
были проведены на трех перевиваемых новообразо‑
ваниях – опухоли Эрлиха, гепатоме ГА-1 и карцино‑
ме Льюиса. Было установлено, что препараты фраг‑
ментированной геномной ДНК обладают способнос‑
тью в большей или меньшей степени тормозить рост
этих опухолей и оказывают умеренное ингибирую‑
щее влияние на развитие опухолевых метастазов. Эту
способность проявляют препараты ДНК, полученные
как из тканей мышей, сингенных или аллогенных по
13
отношению к опухоленосителю, так и из ткани чело‑
века. Противоопухолевое действие ДНК В.П. Нико‑
лин и др. [4] объяснили процессом гомологической
рекомбинации, в результате которой происходит
постоянный обмен фрагментов экстраклеточной
ДНК с соответствующими гомологичными участка‑
ми хромосом клеточного генома. Высказано пред‑
положение, что попавшая в клетки деградированная
экстраклеточная ДНК может распознаваться ими как
поврежденная, в результате чего запускается р53-за‑
висимый путь задержки клеточного цикла с последу‑
ющим апоптозом. Эксперименты были проведены на
культуре фибробластов. Подобные механизмы могут
иметь место и в опухолевых клетках при введении эк‑
зогенной ДНК [15].
ДНК прокариот является патогенассоциирован‑
ным молекулярным паттерном и воспринимается им‑
мунной системой позвоночных как чужеродный агент,
что обусловлено наличием в ней неметилированных
фрагментов CpG [6]. Аналогами бактериальной ДНК
являются синтетические олигодезоксинуклеотиды
(ОДН), содержащие CpG-мотивы. ДНК прокариот, а
также естественные и синтетические ОДН являются
иммуностимуляторами и агонистами толл-подобно‑
го рецептора-9 (Toll-Like Receptor – TLR) [6, 7]. Вве‑
дение CpG-ДНК сопровождается активацией NK- и
NKT-клеток, дендритных клеток, макрофагов и ток‑
сических Т-лимфоцитов [20].
Последовательность ОДН, особенности их остова,
а также вид опухолевой модели оказывают влияние
на специфику иммунобиологической активности
CpG-ОДН относительно индуцируемого иммунного
ответа. Так, было показано [14], что введение CpGОДН 1585 вызывает опосредованную NK-клетками
регрессию меланомы, но не является эффективным
при лимфоме. В то же время введение CpG-ОДН
1826 вызывало подавление роста лимфомы, опосре‑
дованное NK- и Т-клетками.
Противоопухолевый компонент бактериальной
ДНК (ОК-432) – неметилированные CpG-мотивы из
стрептококка – индуцировал активность T-хелперов
1-го типа, повышал уровень цитокинов, продуцируе‑
мых этими клетками (γ-интерферон, фактор некроза
опухоли-α, интерлейкины 12 и 18), увеличивал ак‑
тивность NK-клеток, активировал в экспериментах
in vitro мононуклеары периферической крови [29].
Метилированные соединения такой способностью
не обладали. Противоопухолевое действие комплек‑
са авторы связывали с активацией TLR-9 CpG-моти‑
вами стрептококка [14].
В экспериментальной иммунотерапии опухолей
выделяют несколько стратегий применения активных
фрагментов бактериальной ДНК: а) монотерапия
CpG-ДНК, б) введение CpG-ДНК в составе ДНК-вак‑
цин, в) использование CpG-ДНК в качестве адъюван‑
та для повышения эффективности противоопухоле‑
вых вакцин или моноклональных антител и г) приме‑
нение CpG-ДНК в качестве иммуностимулятора или
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
14
иммунопротектора при сопроводительной терапии
[5]. Иммунотерапевтические эффекты CpG-ДНК
могут состоять в выраженном торможении опухоле‑
вого роста, увеличении продолжительности жизни
экспериментальных животных с опухолью, угнете‑
нии метастазирования, а также в полном отторжении
первично трансплантированных опухолевых клеток
или уже развившихся опухолевых узлов и повторно
трансплантированных опухолей. Выраженность дан‑
ных эффектов зависит от режима применения (про‑
филактический или терапевтический), дозы, коли‑
чества инъекций, количества трансплантированных
опухолевых клеток, агрессивности онкологической
модели, степени развития опухоли перед началом те‑
рапии CpG-ДНК и ее чувствительности к другим
способам лечения [5].
В наших экспериментах in vivo на модели асцит‑
ной формы карциномы Льюиса у мышей было ис‑
следовано противоопухолевое действие ДНК, полу‑
ченной из молок лососевых рыб [9]. Предварительно
было установлено, что этот биополимер в широком
диапазоне доз (0,2–200 мг/кг) не оказывает цитоток‑
сического действия на клетки асцитной карциномы
Льюиса в системе in vitro.
В экспериментах по изучению противоопухо‑
левого действия ДНК использовали две дозы пре‑
парата – 10 и 100 мг/кг веса мыши и две схемы его
введения – профилактическую и лечебную. Профи‑
лактическая схема: мышам за 7 дней до инокуляции
опухоли вводили ежедневно подкожно ДНК, на 7-й
день инокулировали клетки опухоли. Лечебная схе‑
ма: мышам инокулировали клетки опухоли, а затем
на протяжении 7 дней вводили ДНК. Контрольная
группа мышей получала 0,85% раствор NaCl. Во всех
экспериментах использовали неинбредных самцов
весом 18– 20 г. Животным внутрибрюшинно вводили
по 0,5 мл взвеси опухолевых клеток. Конечная доза
опухолевых клеток составляла 1–1,5×106 клеток на
мышь. Каждая группа состояла из 7 мышей. Сред‑
нюю продолжительность жизни животных определя‑
ли общепринятым способом.
Было установлено, что ДНК из молок лососевых
рыб увеличивает среднюю продолжительность жизни
мышей с асцитной формой карциномы Эрлиха, ко‑
торая у нелеченных животных составляет обычно от
12 до 20 дней. В наших экспериментах в контрольной
группе продолжительность жизни мышей составила
10,0±0,6 дня. В опытных группах она была значитель‑
но больше и зависела от дозы и схемы введения ДНК.
Максимальный и достоверный противоопухолевый
эффект (увеличение средней продолжительности
жизни на 37,2%) наблюдался при профилактической
схеме с дозой 10 мг/кг. При введении препарата в дозе
100 мг/кг как по лечебной, так и по профилактической
схемам продолжительность жизни мышей увеличива‑
лась не столь значительно (на 18,6 %).
Несмотря на высокую активность CpG-ДНК как
В-клеточного митогена, она не способствовует раз‑
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
витию лимфомы у трансгенных мышей, являющихся
моделью лимфомы Беркитта. В этой модели, напро‑
тив, CpG-ОДН полностью предотвращало развитие
лимфомы. Установлена эффективность внутриопу‑
холевого введения CpG-ОДН в комбинации с хими‑
отерапией [24]. Важным фактором, определяющим
противоопухолевую эффективность CpG-ДНК, слу‑
жит продукция интерферона 1-го типа при стимуля‑
ции и костимуляции Т-лимфоцитов [21].
Новым направлением в противоопухолевой тера‑
пии является использование дендритных клеток, об‑
работанных CpG-ОДН. Так, дендритные клетки, об‑
работанные CpG-ОДН 1826, оказывали антиопухо‑
левое действие в экспериментах на клеточной линии
мышиной лимфосаркомы [13]. При этом усиливался
цитотоксический эффект лимфоцитов и значительно
уменьшались размеры опухоли.
На модели эмбриональной рабдомиосаркомы бы‑
ло исследовано комбинированное действие систем‑
ного применения CpG-ДНК и циклофосфамида или
топотекана [31]. Введение CpG-ДНК совместно с
циклофосфаном повышало выживаемость мышей по
сравнению с таковой в случае введения только цикло‑
фосфана (70% против 41%). CpG-ДНК в комплексе с
топотеканом увеличивала выживаемость животных
с объемными новообразованиями. Необходимыми
условиями регрессии опухоли были: наличие TLR‑9
на клетках опухоли либо в организме на других клет‑
ках; индукция цитотоксических Т-лимфоцитов в
иммунном ответе; введение CpG в регион опухоли.
Такой подход является привлекательным, учитывая,
что CpG-ОДН уже применяются в клинике и имеют
хорошую репутацию в качестве противоопухолевых
препаратов. В клинической практике также отмече‑
ны положительные результаты использования ДНК
и ее комплексов с противоопухолевыми препаратами.
Безусловно, что химиотерапевтические препара‑
ты проявляют более выраженные противоопухоле‑
вые эффекты по сравнению с различными агентами,
стимулирующими или модулирующими противоопу‑
холевый иммунный ответ. Однако, угнетая и убивая
трансформированные, активно пролиферирующие
опухолевые клетки, цитостатики, к сожалению, вы‑
зывают серьезные повреждения неопухолевых эле‑
ментов, особенно гемопоэтических клеток костного
мозга, что влечет за собой выраженную иммуносуп‑
рессию. CpG-ДНК является сильным иммуности‑
мулятором и, помимо активации различных имму‑
нокомпетентных клеток, способна индуцировать
экстрамедуллярный гемопоэз, а также повышать
цитотоксическую активность Т-лимфоцитов у облу‑
ченных мышей. Кроме того, применение CpG-ДНК
индуцирует гораздо меньше побочных эффектов, чем
цитостатики или такие препараты, как γ-интерферон
и интерлейкин-12. Поэтому применение CpG-ДНК
в качестве средства сопроводительной терапии для
уменьшения иммуносупрессирующего влияния ци‑
тостатиков или лучевой терапии на сегодня рассмат‑
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Лекции
ривается как весьма перспективное направление в
онкологии [5].
Изучена возможность применения CpG-ДНК в
сочетании с лучевой терапией в эксперименте. При‑
менение CpG-ОДН значительно усиливало эффект
лучевой терапии, приводило к существенному увели‑
чению продолжительности жизни эксперименталь‑
ных животных. Полученные данные свидетельствуют
о значительном потенциале CpG-ДНК для улучше‑
ния результатов лучевой терапии больных онкологи‑
ческого профиля [5].
Обнаружено, что различные CpG-ДНК по-разно‑
му действуют на факторы врожденного иммунитета
[14]. Так, олигодезоксинуклеотид 1585 стимулировал
активность NK-клеток и в незначительной степени
индуцировал синтез цитокинов T-хелперами 1-го
типа. Этот препарат вызывал регрессию меланомы у
мышей. Такого эффекта авторы не наблюдали у пре‑
парата, оказывающего стимулирующее воздействие
на синтез цитокинов Т-хелперами 1-го типа. Эти ма‑
териалы свидетельствуют о том, что необходим тща‑
тельный анализ особенностей клеточной специфич‑
ности различных препаратов CpG-ДНК и понимание
клеточных механизмов, ответственных за противо‑
опухолевую активность, тем более что в настоящее
время предлагается достаточно много препаратов
ДНК и CpG-ОДН.
H. Wang et al. [30] сообщили о противоопухолевом
действии нового иммуномодулирующего олигонук‑
леотида, который они комбинировали с монокло‑
нальными антителами и применяли на трех моделях
рака молочной железы. Даже невысокие дозы ОДН
подавляли рост опухоли MCF-7 не менее чем на 40%.
В тех же случаях, когда препарат комбинировали с мо‑
ноклональными антителами, эффект составлял около
96%. Эффективность комбинации моноклональных
антиопухолевых антител с CpG-ДНК в опытах in vivo
установили также B. Jahrsdorfer и G. Weiner [20]. В слу‑
чае введения мышам только противоопухолевых мо‑
ноклональных антител опухоли развивались у 90%
животных. При инокуляции мышам моноклональных
противоопухолевых антител и CpG-ОДН опухоли ре‑
гистрировались только у 20% животных. Результаты in
vitro были лучше при обработке спленоцитов немети‑
лированными CpG, чем метилированными. При этом
существенно повышались показатели антителозави‑
симой клеточной цитотоксичности.
Даже однократное введение CpG-ОДН в мочевой
пузырь мышей с развившимся раком этого органа
уменьшало размеры опухоли [18]. При гистологи‑
ческом исследовании препаратов, полученных из об‑
ласти опухоли, обнаруживалась обширная инфиль‑
трация ткани макрофагами и лимфоцитами. У конт‑
рольных животных (получивших или физиологичес‑
кий раствор, или нестимулирующие CpG-ОДН) вес
мочевого пузыря не уменьшался, при гистологичес‑
ком исследовании имела место только очень слабая
инфильтрация тканей лейкоцитами. Основываясь
15
на результатах этих экспериментов, авторы считают
перспективным применение CpG-ОДН при раке мо‑
чевого пузыря, так как даже только введение биопо‑
лимера уменьшает размеры опухоли.
На модели фибросаркомы Meth A, растущей под‑
кожно у мышей линии Balb/c, было показано, что
многократные введения MY-1 в растущую опухоль
индуцировали через 4 дня ее инфильтрацию гете‑
рогенной популяцией мононуклеаров, состоящей
из естественных киллеров и макрофагов, а через 21
день – регрессию опухоли в результате реакции ги‑
перчувствительности замедленного типа [23]. Тера‑
певтический эффект вводимого в опухоль препарата
MY-1 обусловлен его иммунотропным действием,
что подтверждается экспериментами in vivo. Эффект
его был хуже в случае прививки фибросаркомы Meth
A бестимусным мышам nude, чем в случае ее привив‑
ки нормальным мышам Balb/c, что свидетельству‑
ет о причастности иммунной системы к процессам
экспериментального канцерогенеза. Это было под‑
тверждено также опытами in vitro: при воздействии
на лимфоциты периферической крови больных раз‑
личными злокачественными и доброкачественными
новообразованиями MY-1 стимулировал продукцию
фактора, активирующего макрофаги. [23].
Введение синтетических ОДН – агонистов TLR-9
в область опухоли у пациентов с базально-клеточной
карциномой, а также кожной или подкожной мела‑
номой приводило к полной или частичной регрессии
опухолевого роста, повышению уровня интерлейки‑
нов 6 и 12p40, γ-интерферона и фактора некроза опу‑
холи-α [19].
Длительное, с 10-дневными интервалами, сис‑
темное введение CpG-ОДН трансгенным мышам со
спонтанным раком молочной железы снижало число
метастазов в легких. Как и многие другие исследова‑
тели, авторы объясняли эффект CpG-ОДН повыше‑
нием показателей врожденного иммунитета под вли‑
янием биополимера [26].
О подавлении развития метастазов при примене‑
нии CpG-ОДН сообщали H.Ch. Cho et al. [16], кото‑
рые использовали в работе модели мышиной мелано‑
мы В16 F10 и рака толстой кишки СТ26. Системное
применение CpG после инъекции клеток меланомы
подавляло колонизацию легких злокачественными
клетками. Такие же результаты получены на второй
модели. Авторы полагают, что применение CpG-ОДН
может быть эффективным для предотвращения раз‑
вития метастазов после хирургических вмешательств.
ОДН оказывают прямое проапоптотическое
действие на клетки рака простаты мышей – клеточ‑
ную линию RM-1. Эффект зависит от дозы стиму‑
лятора. При этом ОДН активирует каспазный путь
и снижает активность факторов транскрипции
AP‑1 и NF-κβ. Оптимальной проапоптотической
активностью обладают polyG-последовательности.
ОДН, содержащие CpG и polyG, более эффективны,
так как оказывают и прямое противоопухолевое,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
16
и иммуностимулирующее действие [27]. Комбинация
CpG‑ОДН с антимикробным пептидом из семейства
кателицидинов LL-37 значительно повышает проли‑
феративную и функциональную активность NK‑кле‑
ток мышей, а также выживаемость животных, больных
раком яичников. Применение только CpG‑ОДН или
только пептида LL-37 менее эффективно.
Выраженный адъювантный эффект CpG-ОДН
отмечен при иммунизации мышей вакциной, вклю‑
чающей в себя раково-эмбриональный антиген
(TAT-CEA) и рекомбинантный белок HIV TATRTD
области с СpG, а также только TAT-CEA и СpGОДН (TAT-CEA+CpG). Наблюдалось повышение
CEA-специфического иммунитета, связанного с ак‑
тивностью цитотоксических лимфоцитов и γ-интер‑
ферона, секретируемого Т-лимфоцитами. При этом
в случае использования CpG-ОДН эти показатели
были заметно выше. Вакцинация комплексом TATCEA-CpG приводила к формированию T-хелперно‑
го 1-го типа иммунного ответа, причем соотношение
антител иммуноглобулинов G2a и G1 у таких живот‑
ных было выше, чем в случае использования только
одной вакцины [28].
В последние годы активно развивается новое на‑
правление в противоопухолевой терапии – приме‑
нение липидных наночастиц в качестве носителей
CpG-ДНК и CpG-ОДН. CpG-ОДН в комплексе с ли‑
посомными наночастицами усиливает адъювантный
эффект при иммунизации мышей туморассоцииро‑
ванными антигенами и повышает показатели врож‑
денного и приобретенного иммунитета [22]
M.M. Whitmore et al. [32] разработали модель, в
которой мышам внутривенно вводили комплекс,
состоящий из холестероловых катионных липосом,
протамина сульфата и некодируемой плазмидной
ДНК. Такая комбинация приводила к повышению
активности NK-клеток и увеличению синтеза цито‑
кинов Т-хелперами 1-го типа.
Как известно, химиотерапия наряду с хирургичес‑
ким и лучевым воздействием является важнейшим на‑
правлением лечения онкологических больных. Перс‑
пективы этого направления исследований достаточно
значительны, особенно в лечении неоперабельных и
метастатических новообразований. В настоящее вре‑
мя широко используют более 50 различных по меха‑
низму действия средств химиотерапии, десятки их се‑
годня проходят стадии апробации и отбора. Одним из
перспективных препаратов является полиплатиллен,
фармакологические свойства которого обусловлены
биологической активностью входящих в его состав ак‑
тивных компонентов: цис-платины и ДНК, которые
вступают в химическое взаимодействие. В результате
этого образуется конъюгат с концентрацией 1,4–1,5
мг/мл, представляющий собой систему направлен‑
ного транспорта препарата платины в опухоль. Поли‑
платиллен преимущественно накапливается в клетках
опухоли, выводится, главным образом, через кишеч‑
ник (отсюда отсутствие нефротоксичности) и не угне‑
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
тает костно-мозговое кроветворение. Препарат наибо‑
лее эффективен при лечении онкологических заболе‑
ваний печени, легкого, яичника, желчного пузыря,
кишечника, желудка и поджелудочной железы, костей
и мягких тканей, канцероматоза брюшины и плевры.
У 55% больных его применение вызывает стойкую ре‑
миссию, а у 35% – стабилизацию процесса. Увеличи‑
вается продолжительность (в 2–3 раза по сравнению с
контрольной группой) и улучшается качество жизни,
устраняются боли и проявления эндогенной интокси‑
кации, повышается аппетит [12].
Введение смеси дерината (натриевой соли ДНК
молок осетровых рыб) и антрациклинового антиби‑
отика больным с запущенными новообразованиями
брюшной полости позволило снизить токсичность
антибиотика и обеспечило возможность уменьшения
его курсовой дозы с 300 до 50 мг [3].
Клинические испытания, проведенные у больных
с острым миелолейкозом, показали, что комплексы
ДНК из молок сельди с даунорубицином и с доксо‑
рубицином оказывали менее выраженное тромбо‑
цитопеническое и кардиотоксическое действие, чем
сами химиопрепараты, индуцировали большую про‑
должительность ремиссий и большую выживаемость
больных. ДНК из бычьего тимуса в комплексе с док‑
сорубицином индуцировала ремиссию подобного за‑
болевания с такой же частотой, как и более токсич‑
ная комбинация из трех химиопрепаратов (митоксан­
трон+этопозид+цитозар) [8].
Деринат показал достаточно высокую эффектив‑
ность при лимфогранулематозе. Дети с выраженной
лейкопенией (от 200 до 1500 клеток в 1 мм3 крови),
возникшей в результате полиохимиотерапии, полу‑
чали инъекции дерината. На 2-й день после его вве‑
дения число лейкоцитов увеличивалось в 2,5–4 раза,
что позволило продолжить интенсивную противо‑
опухолевую терапию без перерыва и коррекции доз
химиопрепаратов. Включение соли ДНК-натрия из
молок осетровых рыб в комплекс лечения больных
лимфогранулематозом позволило сократить в два ра‑
за время пребывания больных в стационаре [2].
Препараты ДНК рекомендованы практически
всем пациентам, получающим химио- или лучевую
терапию, для стимуляции гемопоэза, снижения кар‑
дио- и миелотоксичности препаратов. Успех в тера‑
пии онкозаболеваний объясняют способностью ДНК
накапливаться в тканях, находящихся в критическом
состоянии, и служить проводником цитостатика [2].
M. Okamoto и M. Sato [25] установили, что клетки
микобактерий, убитые нагреванием и суспензирован‑
ные в минеральном масле, являются сильным иммуно‑
адъювантом. Активная фракция этого препарата BCGCWS усиливала цитотоксическую активность Т-клеток
и макрофагов по отношению к раковым клеткам и ока‑
зывала противоопухолевое действие in vivo на мышах
и крысах с трансплантированными и спонтанными
опухолями. Клинические испытания были выполнены
на пациентах с различными типами злокачественных
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Лекции
опухолей. Как показали исследования, под действием
этого препарата увеличивался срок выживаемости па‑
циентов, особенно больных раком желудка и легких.
При этом было установлено, что BCG-CWS оказывает
антиопухолевый эффект путем воздействия на TLR-2 и
TLR-4. Этот препарат активирует созревание дендрит‑
ных клеток и продукцию ими фактора некроза опухоли.
Через TLR-2 осуществляется индукция провоспали‑
тельного сигнала на макрофаги.
Противоопухолевый иммунный ответ, регистри‑
руемый после введения CpG-ДНК, характеризуется
преимущественно активацией NK-клеток, макрофа‑
гов и цитотоксических Т-лимфоцитов, а эффектив‑
ность проводимой иммунотерапии коррелирует с ан‑
тигенностью опухоли. Согласно результатам гисто‑
логических исследований, введение CpG-ДНК при‑
водит к массивной инфильтрации опухолевого узла
Т-лимфоцитами и макрофагами, за счет цитотокси‑
ческого влияния которых преимущественно и проис‑
ходит уничтожение отдельных опухолевых клеток и
разрушение опухоли в целом [5]. Иммуно­стимуляция
CpG-ДНК также влияет на микроокружение опухо‑
ли. При этом, действуя как противовоспалительный
стимул, CpG-ДНК повышает экспрессию молекул
адгезии на клетках эндотелия и тем самым способс‑
твует проникновению эффекторных клеток в ткань
новообразования.
Целесообразность иммунореабилитации после
удаления опухоли значительно увеличивается, что
объясняется, как минимум, двумя важными обстоя‑
тельствами. Во-первых, применением лучевой и хи‑
миотерапии, к которым иммунная система особенно
чувствительна. Как правило, следствие такой чувс‑
твительности – ослабление функций иммунокомпе‑
тентных клеток, обеспечивающих защиту организма,
что приводит к различным осложнениям, прежде
всего разнообразным инфекциям. Во-вторых, имму‑
нотерапия и иммунореабилитация могут иметь боль‑
шое значение для профилактики метастазов. Послед‑
нее объясняется хорошо известным фактом, согласно
которому эффективность лизиса опухолевых клеток
зависит от их соотношения с клетками-киллерами.
В условиях активной опухолевой прогрессии такие
соотношения складываются не в пользу киллерных
клеток даже при сохранении их функциональной ак‑
тивности. После удаления опухоли такие соотноше‑
ния изменяются и создаются оптимальные условия
для лизиса оставшихся опухолевых клеток [1].
Нами было изучено действие биологически актив‑
ной добавки к пище на основе ДНК из молок лососе‑
вых рыб на показатели системы цитокинов и гемопо‑
эза у больных раком молочной железы с удаленной
опухолью и получавших лучевую терапию [10]. Вы‑
бор этой категории лиц не случаен. Больные раком
молочной железы, поступающие в радиологическое
отделение для проведения стандартного курса пос‑
леоперационной лучевой терапии, получали хирур‑
гическое и/или химиотерапевтическое лечение 2–3
17
месяца назад. При поступлении в диспансер чувство‑
вали себя удовлетворительно и имели практически
нормальную картину периферической крови. У них,
таким образом, было минимизировано влияние опу‑
хольсоставляющего компонента и основное воздейс‑
твие, под влиянием которого изменялись показатели
иммунного статуса – лучевая и ДНК-терапия в ка‑
честве средства сопровождения.
Изучали уровень и динамику интерлейкина-3,
гранулоцитарно-макрофагального колониестимули­
ру­ющего фактора – ранних гемопоэтических цито‑
кинов, фактора некроза опухоли-α – провоспали‑
тельного цитокина, γ-интерферона и интерлейки‑
на‑10 – маркерных цитокинов Т-хелперного 1-го и
2-го типов ответа соответственно. Анализ динамики
уровня цитокинов проводили в зависимости от на‑
чального их уровня: с исходно низкими, с исходно
высокими и исходно средними значениями.
ДНК в качестве средства сопровождения лучевой
терапии при раке молочной железы оказывала мо‑
дулирующее действие в отношении уровня всех ис‑
следованных цитокинов. Однако в большей степени
и статистически значимо изменялся в сторону уве‑
личения уровень гранулоцитарно-макрофагального
колониестимулирующего фактора у лиц с исходно
низким его уровнем. ДНК повышала концентрацию
γ-интерферона и фактора некроза опухоли-α у боль‑
ных с низкими показателями, снижала уровень ин‑
терлейкина-10 при исходно высоких значений.
При применении биологически активной добавки
с ДНК не было установлено каких-либо побочных эф‑
фектов (как немедленных, так и отсроченных) и зна‑
чимых изменений биохимических показателей крови
и мочи, что свидетельствует о безопасности этого био‑
регулятора в отношении функции печени и почек.
Эксперименты показали, что в действии ДНК
доминирует способность стимулировать продук‑
цию провоспалительных цитокинов и цитокинов,
обеспечивающих иммунный ответ по T-хелперному
1‑му типу, что обеспечивает повышение показателей
врожденного иммунитета. С учетом всех положи‑
тельных аспектов действия ДНК из молок лососевых
рыб, ее практическое применение начинает занимать
одно из ведущих мест в общем арсенале современных
средств иммунотерапии и иммунореабилитации па‑
циентов с онкозаболеваниями.
Таким образом, включение иммуностимулирую‑
щей CpG-ДНК, а также естественных и синтетичес‑
ких ОДН в комплексную терапию онкологических
заболеваний обосновано значимостью иммунных
механизмов при данной патологии и в ряде случаев
прямым противоопухолевым эффектом препаратов.
Разрабатываются новые подходы к терапии при по‑
мощи нуклеиновых кислот, создаются иммобилизо‑
ванные формы ДНК. В ближайшие годы ученые, повидимому, смогут широко внедрить в клинику метод,
основанный на введении онкологическим больным
дендритных клеток, обработанных CpG-ДНК и ОДН.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
18
Терапия с помощью ДНК из про- и эукариотических
клеток является мощным резервом лечения больных
злокачественными новообразованиями.
Литература
1. Бережная Н.М., Чехун В.Ф. Система интерлейкинов и
рак. Киев: ДИА, 2000. 224 с.
2. Каплина Э.Н. Некоторые итоги клинического применения
препарата деринат с 1976 по 2000 г. // Использование пре­
парата деринат в различных областях медицины: тез. докл.
1-й Всероссийской научно-практ. конф. М., 2000. с. 47.
3. Мельников Д.Ю. Применение иммуноконъюгатов дерината
в химиотерапии онкологических больных // Там же С. 6–8.
4. Николин В.П., Попова Н.А., Себелева Т.Е. и др. Влияние
экзогенной ДНК на рост экспериментальных опухолей //
Вопросы онкологии. 2006. Т.52, № 1. С. 66–69.
5. Олишевский С.В., Козак В.В., Яниш Ю.В. и др. Иммуномо­
дулирующай СpG-ДНК: перспективы клинического приме­
нения в онкологии // Онкология. 2006. Т.8, № 2. С. 209–217.
6. Онищенко Г.Г., Пальцев М.А., Зверев В.В. и др. Биологи­
ческая безопасность. М.: Медицина. 2006. 304 с.
7. Пак В.Г., Олиферук Н.С., Будихина Ф.С., Пинегин Б.В.
Влияние естественных и синтетических CpG-мотивов на
бактерицидность, NK-литическую активность, индукцию
IL‑12 и IFN-γ in vitro // Иммунология. 2005. № 6. С. 332–335.
8. Пашук Л.К., Апрышко Г.Н., Трещалина Е.М. Препараты
ДНК как потенциальные терапевтические средства //
Хим.-фармац. журн. 1995. Т. 29, № 6. С. 61–64.
9. Федянина Л.Н., Беседнова Н.Н., Аминин Д.Л. и др. Изуче­
ние противоопухолевой активности ДНК из молок лосо­
севых рыб и некоторых ее механизмов в эксперименте //
Дальневосточный мед. журн. 2006. № 3. С. 59–62.
10. Федянина Л.Н. Иммуномодулирующая активность низ­
комолекулярной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)
из молок лососевых рыб (фундаментальные и прикладные
аспекты): дис. … д-ра мед наук. Владивосток. 2007. 320 с.
11. Якубов Л.А., Петрова Н.Н., Попова Н.А. и др. Роль экстра­
клеточной ДНК в поддержании постоянства и изменчивос­
ти клеточных геномов // ДАН. 2002. Т. 382. С. 406–410.
12. Яценко Л.Д. Химиотерапия неоперабельных опухолей ор­
ганов грудной и брюшной полости // Онкология. 2007. Т 9,
№ 1. С. 75–79.
13. Arab S., Motamedi M., Khansari N. et al. Dendritic cell Matu­
ration with CpG for tumor Immunotherapy // Iran. J. Immunol.
2006. Vol.3, No. 3. P. 99–105.
14. Ballas L., Krieg A.M., Warren T. et al. Divergent therapeutic
and immunologic effects of oligodeoxy nucleotides with distinct
CpG motifs // J. Immunol. 2001. Vol. 67. P. 4878–4886.
15. Bergsmedh A., Szeles A., Spetz A.L. et al. Loss of the p21 (Cip1/
Waf1) cyclin kinase inhibitor results in propagation of horizontally
transferred DNA // Cancer Res. 2002. Vol. 62, No. 2. P. 575–579.
16. Cho H. Ch., Kim B.H., Kim K. et al. Cancer immunotherapeutic
effect of novel CpG ODN in murine tumor model. Intern. Immu­
nopharmacology // 2008. Vol. 8, No. 10. P. 1401–1407.
17. Garcia-Olmo D.C., Gutierrez-Gonzales L., Ruiz-Piqueras R.
et al.Detection of circulating tumor cells and of tumor DNA in
plasma during tumor progression in rats // Cancer Lett. 2005.
Vol. 217, No. 1. P. 115–123.
18. Hegele A., Dalpke A., Heeg K. et al. Immunostimulatory CpG
Oligodeoxynucleotides Reduce Tumor Burden After Intravesical
Administration in an Orthotopic Murine Bladder Cancer Model
// Tumor Biol. 2005 Vol. 26. P. 274–280.
19. Hofmann M.A., Kors Ch., Audring H. et al. Phase 1 Evaluation
of Intralesionally injected TLR9 – agonist PF-3512676 in Pa­
tients with Basal cell Carcinoma or Metastatic Melanoma // J.
of Immunotherapy: abstract. 2008. Vol. 31, No. 5. P. 520–527.
20. Jahrsdorfer B., Weiner G. CpG oligodeoxynucleotides as im­
munotherapy in cancer // Cancer Therapeutics. 2006. Vol. 3,
No. 1. P. 27–32.
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
21. Jacob T., Walker P.S., Krieg A.M. et al. Activation of cutane­
ous dendritic cells by CpG – containing ODN of Th1 responses
by immunostimulatory DNA // J. Immunol. 1998. Vol. 161.
P. 3042–3049.
22. Jong de S., Chikh G., Sekirov L. et al. Encapsulation in lipo­
somal nanoparticles enhances the immunostimulatory, adjuvant
and anti-tumor activity of subcutaneously administered CpGODN // Cancer Immunol. Immunother. 2007. Vol. 56, No. 8.
P. 1251–1264.
23. Kuramoto Y., Kawakami Sh., Zhou Sh. et al. Use of mannosyl­
ated cationic liposomes /immunostimulatory CpG-DNA complex
for effective inhibition of peritoneal dissemination in mice // J.
of Gene Medicine. 2008. Vol. 10, No. 4. P. 392–399.
24. Li J., Song W., Czerwinski D.K. et al. Lymphoma Immuno­
therapy with CpG – ODN Requires TLR9 Either in the Host
or in the Tumor Itself // J. of Immunology. 2007. Vol. 179.
P. 2493–2500.
25. Okamoto M., Sato M. Toll-like receptor signaling in anticancer
immunity // J. of Medical Investigation. 2003. Vol. 50. P. 9–24.
26. Sfondrini L., Besusso D., Rumio C. et al. Prevention of spon­
taneous mammary adenocarcinoma in Hor-2- neu transgenic
mice by foreign DNA // FASEB. 2002. Vol. 16. P.1749–1754.
27. Shen W., Waldschmidt M., Zhao X. et al. Antitumor mecha­
nisms of ODN with CpG and poly G motifs in murine prostate
cancer cells: decrease of NF-?B and AP-1 binding activities
and induction of apoptosis // Antisense Nucleic Acid Drug Dev.
2002. Vol. 12, No. 3. P. 155–164.
28. Sun-JeWoo, Chang-Hyun Kim, Mi-Young Park et al. Co-ad­
ministration of carcinoembrionic antigen and HIVTAT fusion
protein with CpG-ODN induces potent antitumor immunity //
Cancer Science. 2008. Vol. 99, No. 5. P. 1034–1039.
29. Tetsuya O., Masato O., Tomoyuki T. Antitumor effect of OK432 – Derived DNA: one of the active constituents of OK-432,
a streptococcal immunotherapeutic agent // J. of Immunother­
rapy. 2006. Vol. 29, No. 2. P. 143–150.
30. Wang H. Rayburn E.R., Wang W. et al. Immunomodulatory
oligonucleotides as novel therapy for breast cancer: pharmaco­
kinetics? In vitro and in vivo anticancer activity? And poten­
tiation of antibody therapy // Mol. Cancer Ther. 2006. Vol. 5.
P. 2106–2114.
31. Weigel B.J., Rodeberg D.A., Krieg A.M., Blazar B.R. CpG ODN
Potentiate the antitumor Effects of Chemotherapy or Tumor Re­
section in an orthotopic Murine Model of Rhabdomyosarcoma
// Clin Cancer Research. 2003. Vol. 9. P. 3105–3114.
32. Whitmore M.M., Li S., Falo K\L., Huang L. Systemic admin­
istration of LPD prepared with CpG ODN inhibits the growth
of established pulmonary metastases by stimulating innate and
acquired antitumor immune responses // Cancer Immunol. Im­
munother. 2001. Vol. 50, No. 10. P. 503–514.
Поступила в редакцию 03.04.2009.
ANTICANCER EFFECT OF EXOGENOUS
DEOXYRIBONUCLEIC ACID
N.N. Besednova1, L.N. Fedyanina2
1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the
RAMS, Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087
Russia), 2 Pacific State University of Economics (19 Okeanskiy Av.
Vladivostok 690091 Russia)
Summary – The authors present an overview of a promising trend
in the immunotherapy of malignant neoplasms that consists in
application of exogenous DNA enriched in unmethylated CpG
motives and natural and synthetic CpG oligodeoxynucleotides.
The authors provide results of a combined application of DNAbased drugs, chemotherapy and radiation treatment, and sum‑
marize their findings devoted to the study of efficiency of salmon
milt-based DNA in preventing and administering complex ther‑
apy of oncological diseases.
Key words: deoxyribonucleic acid, oligodeoxynucleotides, neo­
plasms, immune response stimulating agents.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 12–18.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
19
УДК 615.37:612.017.1:57.08
Ж.И. Авдеева, Н.А. Алпатова, С.Е. Акользина, Н.В. Медуницын
Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (119002
г. Москва, пер. Сивцев Вражек, 41)
ИММУНОАДЪЮВАНТНЫЙ ЭФФЕКТ ЦИТОКИНОВ
Ключевые слова: цитокины, адъюванты, вакцины, иммунный ответ.
Изучение адъювантных свойств цитокинов на эксперимен‑
тальных моделях свидетельствует о стимуляции иммуно‑
генной активности вакцины против бешенства. Наиболее
выраженный эффект наблюдался при использовании вмес‑
те с вакциной комплекса рекомбинантных цитокинов. При
этом развитие иммунного ответа сопровождалось форми‑
рованием высокого уровня вируснейтрализующих антител.
Иммуноадъювантный эффект отмечен и при использова‑
нии рекомбинантных интерлейкина-1β и фактора некро‑
за опухоли-α в виде монопрепаратов, а также препарата
«Полиоксидоний». Результаты исследований свидетельс‑
твуют о возможности использования цитокинов и других
иммуномодулирующих препаратов в качестве адъювантов,
способных повышать иммуногенную активность вакцин, а
также о перспективности изучения новых подходов к уп‑
равлению иммунным ответом.
Цитокины – низкомолекулярные гликопротеины,
секретируемые преимущественно активированными
клетками иммунной системы, обладают широким
спектром биологического действия. Основные клас‑
сы цитокинов включают интерлейкины (ИЛ), интер‑
фероны α, β и γ, колониестимулирующие факторы,
факторы некроза опухолей (ФНО) α и β, семейство
ростовых факторов и хемокины [3, 8].
Цитокины определяют особенности формиро‑
вания иммунного ответа, способствуя распозна‑
ванию антигенов, повышая экспрессию молекул
главного комплекса гистосовместимости, моле‑
кул адгезии, вызывая активацию, пролиферацию
и дифференцировку клеток иммунной системы и
способствуя формированию клеток-эффекторов
[3, 6, 9, 10]. Интенсивность и характер иммунного
ответа при вакцинации зависят от многих факто‑
ров, прежде всего от свойств самой вакцины, пути
и схемы ее введения, а также от функционального
состояния организма и его генетических особен‑
ностей [4, 5].
Одним из перспективных направлений современ‑
ной вакцинологии является обеспечение адекватного
иммунного ответа при вакцинации. Использование
препаратов с иммуномодулирующей активностью на
фоне вакцинации может изменять баланс эндоген‑
ных цитокинов в организме и оказывать влияние на
развитие антигенспецифического иммунного ответа
[1, 2, 4, 5, 7]. В связи с этим цитокины, регулирующие
каскад иммунных реакций на любое антигенное воз‑
действие, можно рассматривать как потенциальные
иммуноадъюванты.
Авдеева Жанна Ильдаровна – д-р. мед. наук, профессор, за‑
ведующая лабораторией иммунологии ГНИИ стандартизации и
контроля; тел.: 8 (495) 241-25-34; e-mail: аvd-cytok@newmail.ru.
Материал и методы. Экспериментальные иссле‑
дования адъювантных свойств рекомбинантных
цитокинов человека и препарата «Полиоксидоний»
проведены на моделях иммунизации беспородных
белых мышей вакциной против бешенства. Живот‑
ные массой 12–14 г получены из питомника РАМН
«Столбовая». Для иммунизации использованы куль‑
туральная концентрированная, очищенная методом
ультрафильтрации, инактивированная сухая антира‑
бическая вакцина (КОКАВ) и культуральная инак‑
тивированная сухая антирабическая вакцина (КАВ)
производства ИПВЭ РАМН им. М.П. Чумакова.
Для внутримозгового заражения мышей применя‑
ли разрешающий фиксированный вирус бешенства,
штамм CVS (Challenge virus standard) в объеме 0,03 мл.
Заражающая доза вируса составляла 3–5 lg LD50.
В работе использованы рекомбинантные цитоки‑
ны человека: ИЛ-1β (НИИ ОЧБ, Санкт-Петербург),
ИЛ‑2 (ООО «Биотех», Санкт-Петербург), ФНОα (ВБ
«Вектор», Бердск). Также использованы препараты,
условно объединенные термином цитокины: тимо‑
зин-α1 человека рекомбинантный, гибридный белок
«Неотим», состоящий из ФНОα и тимозина-α1 (НИИ
прикладной микробиологии, Оболенск), а также
препарат «Полиоксидоний» (Институт иммунологии,
Москва).
В первой серии экспериментов вакцину КОКАВ
вводили внутрибрюшинно в разведениях 1:50, 1:500
и 1:5000. Каждая группа, соответствующая одному
из разведений, включала по 10–15 мышей. Вакцину
и цитокины в виде монопрепаратов или комплексов
вводили животным одновременно двукратно с интер‑
валом в одну неделю. Дозы для ИЛ-1β, ФНОα, тимо‑
зина-α1 и неотима составляли 1 мкг на мышь. Дозы
цитокинов, включенных в комплекс, составляли для
ИЛ-1β 10 нг, для ИЛ-2 – 10 МЕ, для ФНОα – 0,01 мкг
на животное. В контрольных группах мышей вакци‑
ну применяли в тех же разведениях, но без цитоки‑
нов. На 8-й день после иммунизации мышам вводили
фиксированный вирус бешенства. Наблюдение осу‑
ществляли в течение 30 дней, отмечая гибель живот‑
ных с 6 дня после заражения.
Для оценки гуморального иммунного ответа у жи‑
вотных на 7-е сутки после иммунизации брали кровь.
В сыворотке крови определяли титр вируснейтрали‑
зующих специфических антител в реакции биологи‑
ческой нейтрализации на беспородных белых мышах.
Во второй серии экспериментов оценивали имму‑
ноадъювантное действие ФНОα и полиоксидония.
Вакцину КАВ по вышеописанной схеме вводили
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
20
Разведения
вакцины
Кол-во вы‑
живших жи‑
вотных, %
Таблица 1
Влияние комплекса рекомбинантных цитокинов (ИЛ‑1β,
ИЛ‑2, ФНОα) на интенсивность иммунного ответа
животных, иммунизированных антирабической вакциной
Группа
Контроль –
КОКАВ (n=120)
1:50
40,0 ± 4,3
1:500
0
lg КР50
КР50
1,70 ± 0,1
1:50
1:5000 16,7±1,2
КОКАВ +
цитокины
(n=120)
1
1:50
83,4±3,81
1:500
46,1±2,31
2,56 ± 0,11 1:365
1:5000 7,7±1,3
Разница с контролем статистически значима.
lg КР50
1:25 27,3±3,5
Контроль –
КОКАВ
1:125 25,0±3,4
(n=108)
1:625
0
<1,40
Группа
КОКАВ +
ИЛ‑1β
(n=108)
КОКАВ +
ФНОα
(n=105)
1:25
1
2
1:33,1
<1:25 1:26,2
1:10,0
1:160,0
2
1:125 40,0±3,8
2
1,66±0,10 1:46 1:67,8
1:625 8,3±1,6
1:25
1:10,0
46,2±3,7
1:63,7
1:125 20,0±1,8
1,45±0,11 1:29 1:44,8
2
1:125
0
1:10,0
1:25
23,1±1,5
1:32,3
КОКАВ +
тимозин‑α1 1:125
(n=106)
1:625
КОКАВ +
неотим
(n=108)
45,5±4,2
КР50
Титр
антител1
Кол-во
выживших
животных,
%
Разведения
вакцины
Таблица 2
Влияние монопрепаратов цитокинов на эффективность
иммунизации животных вакциной КОКАВ
(результаты 3 экспериментов)
1:25
0
<1:25 1:12,6
0
1:10,0
27,3±2,0
1:28,2
1:125 20,0±1,9
1:625
<1,40
<1,40
<1:25 1:20,0
0
1:10,0
В реакции биологической нейтрализации.
Разница с контролем статистически значима.
в дозе 0,25 МЕ, ФНОα вводили внутрибрюшинно в
дозах 0,1 и 1,0 мкг (100 и 1000 Ед на особь) за 24
часа одновременно или через 24 часа после имму‑
низации вакциной. Полиоксидоний использовали
в дозах 40 или 500 мкг на мышь, а также в сочета‑
нии с ФНОα (0,1 мкг на мышь) через 24 часа после
иммунизации. Контролем служили группы живот‑
ных, которые получали одну вакцину, указанные
дозы ФНОα, полиоксидония или полиоксидония в
сочетании с ФНОα (двукратно с интервалом в одну
неделю), а также неиммунизированные мыши. Как
и в первой серии экспериментов, после окончания
иммунизации животным вводили фиксированный
вирус бешенства.
Эффективность иммунизации, как при изоли‑
рованном использовании антирабической вакцины,
так и при сочетании ее с цитокинами, оценивали по
проценту выживаемости животных, показателю пре‑
дельно допустимого разведения вакцины, обеспечи‑
вающего 50% выживаемость в абсолютных значени‑
ях (КР50) и в логарифмах (lg КР50), а также по уровню
титров вируснейтрализующих антител.
Статистическую обработку данных проводили с
использованием пакета программ Statgrafics. Досто‑
верность уровня различия сравниваемых величин
оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования и обсуждение полученных данных. Комплекс цитокинов, использован‑
ный при иммунизации животных антирабической
вакциной КОКАВ, способствовал повышению ее
эффективности. Отмечена большая выживаемость
мышей при заражении их вирусом бешенства по
сравнению с контрольной группой животных, им‑
мунизированных одной вакциной. Выживаемость
в опытной группе, получившей вместе с вакциной
комплекс цитокинов, увеличилась в 7,3 раза по
сравнению с контролем (табл. 1). Процент выжив‑
ших животных, иммунизированных вакциной в
разведении 1:50 и 1:500, в опытной группе статис‑
тически достоверно превышал показатели конт‑
рольной группы.
Использование в качестве адъювантов ИЛ-1β или
ФНОα при иммунизации животных антирабической
вакциной способствовало повышению ее эффектив‑
ности. Процент выживших мышей в группе с ИЛ-1β
при разведениях вакцины 1:25 и 1:125 был в 1,6 раза
выше аналогичных показателей в контроле. В груп‑
пе с ФНОα при разведении вакцины 1:25 указанный
показатель был в 1,7 раза выше контрольного. У жи‑
вотных, получивших вместе с вакциной ФНОα или
ИЛ-1β, выживаемость увеличивалась в 1,2–1,8 раза
по сравнению с контролем. В группах животных, по‑
лучивших одновременно с вакциной тимозин-α1 или
неотим, этот показатель остался на уровне контроля
(табл. 2).
При оценке титров вируснейтрализующих анти‑
тел установлено, что наиболее выраженное стимули‑
рующее действие на процесс антителообразования
оказывали ИЛ-1β и ФНОα. При введении вакцины в
разведении 1:25 в сочетании с указанными цитоки‑
нами отмечено увеличение титров антител в 1,9–4,8
раза. При разведении вакцины 1:125 ФНОα и ИЛ-1β
повышали титры антител в 1,7–2,5 раза выше уровня
контроля. При большем разведении вакцины сти‑
мулирующего влияния цитокинов на антителообра‑
зование не отмечено. В группах животных, которым
вводились тимозин-α1 и неотим, титры антител не
повышались (табл. 2).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
21
Рис. 1. Уровень защиты животных, иммунизированных
вакциной КАВ в сочетании с ФНОα, при заражении ви‑
русом бешенства («звездочкой» обозначена достоверность
различий с контрольной группой).
Рис. 2. Уровень защиты животных, иммунизированных
вакциной КАВ в сочетании с полиоксидонием и ФНО
(«звездочкой» обозначена достоверность различий с конт‑
рольной группой).
Во второй серии экспериментов ФНОα способс‑
твовал повышению резистентности животных при
заражении их вирусом в дозе 5 lg LD50. Большая вы‑
живаемость отмечена при введении цитокина в дозе
0,1 мкг на мышь, при этом процент выживших жи‑
вотных, соответственно схемам введения, был в 1,8,
2,2 и 3,1 раза выше показателя контрольной группы.
Введение ФНОα в обеих дозах через 24 часа после
иммунизации приводило к наиболее выраженному
повышению противовирусной устойчивости. Доля
выживших мышей в опытных группах равнялась
87,5%, в контроле – 28%. Введение ФНОα в дозе
0,1 мкг неиммунизированным животным также по‑
вышало их резистентность к последующему зараже‑
нию вирусом. Доля выживших мышей в указанной
группе составила 37,5%. Повышение дозы цитокина
до 1 мкг не сопровождалось появлением защитного
эффекта (рис. 1).
На основании полученных результатов можно
заключить, что использование рекомбинантного че‑
ловеческого ФНОα при иммунизации мышей анти‑
рабической вакциной приводит к существенному по‑
вышению резистентности животных при заражении
их вирусом бешенства. Адъювантный эффект зависит
от дозы и схемы введения цитокина.
При изучении влияния препарата «Полиоксидо‑
ний» на противовирусную устойчивость животных ус‑
тановлено, что его введение через сутки после имму‑
низации способствовало повышению протективной
активности антирабической вакцины и увеличивало
выживаемость животных при заражении их вирусом
бешенства. Защитный эффект зависел от дозы полиок‑
сидония, при этом количество выживших мышей со‑
ставило 44 и 56% соответственно (в контроле – 12,5%).
При сочетанном введении полиоксидония и ре‑
комбинантного ФНОα (0,1 мкг на мышь) выживае‑
мость экспериментальных животных составила 22 и
33% соответственно использованным дозам поли‑
оксидония, что несколько ниже, чем при введении
вакцины с полиоксидонием неиммунизированным
антирабической вакциной мышам, что не защищало
их от гибели (рис. 2).
Таким образом, проведенные исследования сви‑
детельствуют о стимуляции цитокинами иммуно‑
генной активности вакцины против бешенства. На‑
иболее выраженная защита наблюдается при приме‑
нении вместе с вакциной комплекса рекомбинант‑
ных цитокинов, который увеличивал выживаемость
экспериментальных животных в 7,3 раза. При этом
развитие иммунного ответа сопровождалось форми‑
рованием более высокого уровня вируснейтрализую‑
щих антител. Иммуноадъювантный эффект отмечен
также при использовании цитокинов в виде моно‑
препаратов. Рекомбинантный человеческий ФНОα
наиболее эффективен при введении в дозе 0,1 мкг
на мышь через сутки после иммунизации антираби‑
ческой вакциной, повышая при этом противовирус‑
ную устойчивость у неиммунизированных мышей.
Препарат «Полиоксидоний» в дозах 40 и 500 мкг
также дозозависимо усиливал защитные свойства
антирабической вакцины. Результаты эксперимен‑
тов свидетельствуют о возможности использования
цитокинов и других иммуномодулирующих препа‑
ратов в качестве адъювантов, способных повышать
иммуногенную активность вакцин, а также о перс‑
пективности изучения новых подходов к управле‑
нию иммунным ответом.
Литература
1. Авдеева Ж.И., Акользина С.Е., Алпатова Н.А. и др. Дейс­
твие цитокинов на протективные свойства антираби­
ческой вакцины // Цитокины и воспаление. 2007. Том 6,
№ 2. С. 46–50.
2. Акользина С.Е. Цитокины в вакцинах и их адъювантное
действие: автореф. дис. … канд. мед. наук. 1996. 30 c.
3. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. СПб.: Фоли­
ант. 2008, 554 с.
4. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: Триада Х, 2004. 446 с.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
22
5. Петров Р.В., Хаитов Р.М. Вакцины нового поколения на
основе синтетических полиионов: история создания, фе­
номенология и механизм действия, внедрения в практику
// Иммунология. 1998. № 5. С. 4–11.
6. Симбирцев А.С. Цитокины – новая система регуляции за­
щитных реакций организма. Цитокины и воспаление. 2002.
Т. 1, № 1. С. 9–17.
7. Шестопалов А.М., Рассадкин Ю.Н., Устинова Е.Н. и др.
Влияние фактора некроза опухолей альфа на эффектив­
ность вакцинации против бешенства // Вопросы вирусо­
логии. 2002. № 3. С. 37–40.
8. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999.
606 с.
9. Fradelizi D. Les cytokines: Facteurs solubles de la commu­
nication intercellulaire // Med. trop. 1998. Vol. 58, No. 4.
P. 427–432.
10. Nash A.D., Lofthouse S.A., Barcham G.J. et al. Recombinant
cytokines as immunological adjuvants // Immunol. Cell Biol.
1993. Vol. 71, No. 5. P. 367–379.
Поступила в редакцию 03.04.2009.
IMMUNOADJUVANT EFFECT OF CYTOKINES
Zh.I. Avdeeva, N.A. Alpatova, S.E. Akolzina, N.V. Medunitsin
L.I. Tarasevich State Research Institute for Standardization and
Control of Medical Biological Preparations (41 Sivtsev Vrazhek
Lane Moscow 119002 Russia)
Summary – The paper gives consideration to the adjuvant properties
of cytokines studied by using experimental models. They induced
immunogenic activities by means of rabies vaccine. Combined with
a complex of recombinant cytokines, the vaccine exhibited the most
noticeable effects. Augmenting immune response was observed in
parallel to high-level virus neutralizing antibody formation. The
immunoadjuvant effects were observed when using recombinant
interleukin-1b and tumor necrosis factor-α for monodrug therapy
and “Polyoxidonium”. The research results were indicative of the
possibility to apply cytokines and other immune-response modu‑
lating drugs as adjuvants capable of increasing immunogenic ac‑
tivities of the vaccines and highlight promising opportunities of
researching into new approaches to immune response control.
Key words: cytokines, adjuvants, vaccines, immune response.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 19–22.
УДК 615.37:612.017.1
Ж.И. Авдеева, Н.А. Алпатова, С.Е. Акользина, Н.В. Медуницын
Государственный НИИ стандартизации и контроля им. Л.А.Тарасевича (119002 Москва, пер. Сивцев Вражек, 41)
ЦИТОКИНЫ И ВАКЦИНЫ
Ключевые слова: цитокины, иммуноадъюванты, вакцины, иммунный ответ.
Вакцины, изготовленные на основе клеток млекопитаю‑
щих, содержат ряд провоспалительных цитокинов, набор
и концентрация которых зависят от вида вакцины. Спон‑
танная и антигениндуцированная продукция цитокинов
зависит от клеточной линии и характера антигена. Дипло‑
идные клеточные штаммы (М-22 и L-68) секретируют ци‑
токины спонтанно. Изучение синтеза цитокинов клеточ‑
ными культурами может быть одним из критериев выбора
субстрата для производства культуральных вакцин. Ис‑
следование адъювантных свойств цитокинов и препара‑
тов, обладающих иммуномодулирующей активностью, на
ряде экспериментальных моделей свидетельствуют о сти‑
мулирующем действии цитокинов на иммуногенную ак‑
тивность вакцин против гепатитов А и В. Наиболее выра‑
женными иммуностимулирующими свойствами обладают
рекомбинантные цитокины – фактор некроза опухоли-α
и интерлейкин-1β, а также препараты «Полиоксидоний»
и «Имунофан».
Цитокины оказывают влияние практически на все
клетки, воздействуя на большинство процессов,
протекающих в организме. Они обеспечивают меж‑
клеточную кооперацию и регулируют иммунные
процессы. Их активная продукция происходит в от‑
вет на различные стимулирующие агенты, их дейс‑
твие неспецифично. Цитокины образуют особую
сеть, модулируя экспрессию поверхностных рецеп‑
торов и индуцируя секрецию друг друга. Благодаря
высокоаффинным рецепторам на клетках-мишенях
(константа диссоциации в пределах 10–10–10–12 M),
они способны вызывать биологические эффекты в
Авдеева Жанна Ильдаровна – д-р мед. наук, профессор, за‑
ведующая лабораторией иммунологии ГНИИ стандартизации и
контроля; тел.: 8 (495) 241-25-34; e-mail: аvd-cytok@newmail.ru.
малых концентрациях. Действие цитокинов плейо­
тропно, им присуща локальная (ауто- и паракрин‑
ная) и системная (эндокринная) регуляторная ак‑
тивность [4, 8, 9, 12].
В настоящее время для оптимизации вакциналь‑
ного процесса используются различные иммуномо‑
дуляторы, которые отличаются друг от друга по про‑
исхождению и механизму действия. Исследования
по использованию цитокинов в качестве адъювантов
немногочисленны, хотя иммуномодулирующий эф‑
фект таких адъювантов, как липополисахарид и му‑
рамилдипептид, объясняют вовлечением в этот про‑
цесс цитокинов [1, 10, 11].
Цитокины обнаружены в вакцинах и других им‑
мунобиологических препаратах, субстратом для из‑
готовления которых являются клетки эукариотов.
Значимость выявления цитокинов в вакцинных пре‑
паратах важна для оценки их влияния на иммуноген‑
ную активность вакцин. Эпителиальные, фиброблас‑
тные и лимфоидные клеточные линии, используемые
для производства иммунобиологических препаратов,
способны секретировать цитокины спонтанно или
при антигенной стимуляции [3, 11, 12]. Установлено
содержание интерлейкинов (ИЛ) 1 и 6, а также гра‑
нулоцитарного и гранулоцитарно-макрофагального
колониестимулирующих факторов в антирабичес‑
кой и ряде других противовирусных вакцин. ИЛ-1β
и фактор некроза опухоли-α (ФНОα) выявлены в ле‑
карственных препаратах моноклональных антител,
изготовленных на основе лимфоидных клеток чело‑
века. Большое количество цитокинов присутствует
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
в препаратах интерферона, поскольку клетки челове‑
ка (лейкоциты и фибробласты), используемые для их
получения, способны секретировать цитокины как
при обычных условиях культивирования, так и при
стимуляции антигеном [6].
Несмотря на довольно высокую эффективность
различных видов имеющихся в настоящее время вак‑
цин, ни одна из них не дает 100% профилактического
и лечебного эффекта. В связи с этим поиск способов
повышения эффективности вакцинации, усиления
иммуногенных свойств вакцин очень актуален [2, 5, 7,
9, 10]. Использование цитокинов, регулирующих в ор‑
ганизме каскад иммунных реакций на антигенное воз‑
действие, в качестве потенциальных иммуноадъюван‑
тов было ограничено из-за сложности их получения из
природных источников в количествах, необходимых
для экспериментальных и клинических исследований.
Получение рекомбинантных цитокинов человека поз‑
волило приступить к решению этой задачи.
Материал и методы. Исследованы вакцины, при‑
готовленные на основе клеток эукариотов (антираби‑
ческая, полиомиелитная, коревая эксперименталь‑
ная, вакцина против гепатита А экспериментальная),
а также субстраты: первичная клеточная культура по‑
чек зеленых мартышек (ПЗМ), перевиваемая линия
клеток 4647 почек зеленых мартышек, диплоидный
клеточный штамм фибробластов кожи и мышцы эм‑
бриона человека (М-22), перевиваемая линия клеток
VERO почек зеленых мартышек, диплоидная культу‑
ра клеток фибробластов легкого человека (L-68).
Изучалась спонтанная и индуцированная вирусом
полиомиелита 1, 2, 3-го типов выработка цитокинов
субстратами ПЗМ, 4647 и М-22. Для определения со‑
держания цитокинов в вакцинах и супернатантах кле‑
точных культур использованы иммуноферментные
тест-системы (ООО «Протеиновый контур», г. СанктПетербург). Анализ иммуноадъювантных свойств ци‑
токинов проведен на моделях иммунизации против
гепатитов А и В. Использованы вакцина против гепа‑
тита А культуральная концентрированная очищенная
инактивированная адсорбированная жидкая – «ГЕПА-ин-ВАК» (ГНЦ ВБ «Вектор»), конъюгат вакцины
против гепатита А с полиоксидонием, содержащий
25 нг антигена вируса гепатита А и 2,5 мкг полиокси‑
дония, а также вакцина против гепатита В рекомби‑
нантная (НПО «Вирион» г. Томск), приготовленная
из полуфабриката вакцины Heberbiovac (Куба).
Использованы препараты цитокинов – ИЛ-1β че‑
ловека рекомбинантный (рчИЛ-1β), ФНОα человека
рекомбинантный (рчФНОα), ФНОβ человека реком‑
бинантный (рчФНОβ); «Гаммаферон» (γ-интерферон
человека рекомбинантный – рчИФγ) и другие пре‑
параты-адъюванты: «Имунофан», «Полиоксидоний»,
«Ридостин».
Эксперименты проведены на беспородных бе‑
лых мышах весом 14–18 г и морских свинках весом
250–350 г. При иммунизации животных дозы и схемы
введения соответствовали принципам определения
23
иммуногенной активности соответствующих вакцин
при оценке их качества. Эффект воздействия иссле‑
дуемых препаратов в качестве иммуноадъювантов
на иммуногенную активность вакцин оценивали по
изменению иммунизирующей дозы вакцины (ИД50),
показателю сероконверсии, уровню титров специфи‑
ческих антител.
Наличие суммарных антител и выявление титров
антител к антигену вируса гепатита А проводили с по‑
мощью коммерческих иммуноферментных тест-сис‑
тем «Вектогеп-А-антитела» («Вектор-Майстар», г. Но‑
восибирск). Уровень специфических антител против
антигена вируса гепатита В определяли с помощью
тест-системы «Гепаностика» («Органон техника»).
Цитокины в иммунобиологических препаратах
Вакцина против гепатита А, антирабическая, поли‑
омиелитная и коревая вакцины, полученные на осно‑
ве клеток эукариотов, содержали провоспалительные
цитокины. Содержание ИЛ-1β и ИЛ-6 колебалось в
широких пределах. Наиболее высокий уровень ИЛ‑1β
выявлен в вакцине против гепатита А, изготовлен‑
ной на основе клеточной линии 4647. В полиомие‑
литной вакцине, изготовленной на клеточной линии
VERO, ИЛ‑1β не выявлялся. Наибольшее количество
ИЛ‑6 выявлено в антирабической вакцине, наимень‑
шее – в вакцине против гепатита А, изготовленной
на основе клеточной линии 4647. Наиболее высокая
концентрация ФНОα зарегистрирована в полиомие‑
литной вакцине, изготовленной на клеточной линии
VERO. В полиомиелитной вакцине, изготовленной
на культуре клеток ПЗМ, а также в коревой вакцине
и вакцине против гепатита А содержание ФНОα было
в пределах 575–779 пг/мл. В антирабической вакцине
этот цитокин отсутствовал (табл. 1).
Супернатанты клеточных культур, используемых
при изготовлении вакцин (культуры клеток ПЗМ,
4647, VERO), без дополнительной стимуляции не вы‑
рабатывали цитокинов. Исключение составил дипло‑
идный клеточный штамм L-68, который спонтанно
продуцировал небольшое количество ИЛ-6, и дипло‑
идный клеточный штамм М-22, спонтанно продуци‑
ровавший ИЛ-6 и ФНОα. Под воздействием вируса
полиомиелита клеточные культуры приобретали спо‑
собность вырабатывать цитокины, которая зависела от
типа вируса. Под влиянием вируса 1-го типа наблюда‑
лась наибольшая выработка ФНОα всеми культурами.
Под влиянием вируса 2-го типа установлена наиболь‑
шая продукция ФНОα и ИЛ-6 клеточным штаммом
М-22, а также ФНОα и ИЛ-1β клеточной линией 4647.
Вирус полиомиелита 3-го типа индуцировал культу‑
ры клеток к продукции меньшего количества ИЛ-6 и
ФНОα по сравнению с вирусом 1-го типа и не стиму‑
лировал выработку ИЛ-1β (табл. 2).
Таким образом, установлено, что вакцины, изго‑
товленные на основе клеток млекопитающих, со‑
держат ряд провоспалительных цитокинов, набор и
концентрация которых зависят от вида препарата.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
24
Таблица 1
Содержание цитокинов в противовирусных вакцинах
Концентрация цитокинов1
Вакцина и субстрат
ИЛ-1β, пг/мл
ИЛ-6, МЕ/мл
ФНОα, пг/мл
н/о2
833,3±211,8
(410–1060)
0,0
26,0±4,0
(19–55)
62,0±3,3
(44–88)
779,0±96,0
(380–1280)
0,0
15,0±4,0
(11–19)
2830,0±30,0
(2800–2860)
27,0±8,0
(19–35)
71,5±32,1
(39–103)
600,0±79,0
(520–680)
130,8±12,8
(108–165)
0,9±0,3
(0,4–1,5)
575,0±39,0
(500–680)
Антирабическая вакцина на клеточной культуре
Полиомиелитная вакцина на культуре ПЗМ
Полиомиелитная вакцина на клеточной линии VERO
Коревая вакцина на культуре L-68
Вакцина против гепатита А на клеточной линии 4647
1
2
В скобках указаны пределы колебаний соответствующих показателей.
Не определяли.
Таблица 2
Уровень синтеза цитокинов клетками млекопитающих (спонтанный и индуцированный вирусом
полиомиелита 1–3-го типов)
Концентрация цитокинов1
Субстрат
ИЛ-1β, пг/мл
без стимуляции
Первичная культура
клеток ПЗМ:
Клеточный штамм М-22:
Клеточная линия 4647:
0,0
стимуляция 1-м типом
34,5±6,3
ИЛ-6, МЕ/мл
0,0
ФНОα, пг/мл
0,0
12,0
501,7±208,0
95,0±65,0
стимуляция 3-м типом
0,0
2,3
без стимуляции
0,0
0,3
190,0
стимуляция 1-м типом
0,0
66,1
973,3±279,6
стимуляция 2-м типом
0,0
156,4
545,0±186,0
стимуляция 3-м типом
0,0
1,8
405,6±167,1
без стимуляции
0,0
н/о
0,0
стимуляция 1-м типом
36,0
н/о
140,0
135,0±5,0
стимуляция 2-м типом
102,0
н/о
стимуляция 3-м типом
0,0
н/о
40,0
Клеточный штамм L-68:
без стимуляции
0,0
0,8
0,0
Клеточная линия VERO:
без стимуляции
0,0
н/о
0,0
1
н/о – не определяли.
Наибольший уровень ИЛ-1β зарегистрирован в вак‑
цине против гепатита А, ИЛ-6 – в антирабической
вакцине, ФНОα – в полиомиелитной вакцине, изго‑
товленной на клеточной линии VERO. Концентрация
цитокинов в различных вакцинах варьирует от серии к
серии. Спонтанная продукция ИЛ-1β, ИЛ-6 и ФНОα
изученными клеточными субстратами, за исключени‑
ем диплоидных клеточных штаммов М-22 и L-68, не
установлена. Синтез цитокинов наблюдается при ан‑
тигенной стимуляции клеточных культур вирусом по‑
лиомиелита. Продукция цитокинов зависит от клеточ‑
ной линии и типа вируса, более выраженный эффект
наблюдается под воздействием вируса 1-го и 2-го ти‑
пов. Определение высокоактивных цитокинов в пре‑
паратах, при изготовлении которых используются
культуры клеток эукариотов, является одним из новых
направлений в вакцинологии. Изучение спонтанной и
антигениндуцированной продукции цитокинов на
этапе культивирования клеточных культур, используе‑
мых для производства коммерческих вакцин, дает воз‑
можность прогнозировать присутствие цитокинов в
конечном продукте. Это предопределяет необходи‑
мость изучения влияния сопутствующих цитокинов
на свойства готового продукта. Изучение их синтеза
экспериментальными клеточными культурами может
быть одним из критериев выбора субстрата для произ‑
водства культуральных вакцин.
Адъювантное действие рчФНОα и полиоксидония
на иммуногенную активность вакцины против гепатита А
в экспериментах на мышах
Проведены исследования по изучению иммуноген‑
ной активности конъюгата антигена вируса гепатита А
и полиоксидония с добавлением его лекарственной
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
формы в различных концентрациях, а также иммуно‑
генной активности указанных выше компонентов в
сочетании с рчФНОα. Для получения антигена виру‑
са гепатита А, конъюгированного с полиоксидонием,
был использован полуфабрикат одной из коммерчес‑
ких серий вакцины против гепатита А – «ГЕП-А-инВАК» (без гидроокиси алюминия). В ГНЦ «Институт
иммунологии» на основе указанного полуфабриката
были приготовлены три экспериментальные серии
препарата, одна прививочная доза которых (25 нг ан‑
тигена вируса гепатита А) содержала различные дозы
полиоксидония (1000, 200 или 40 мкг).
В экспериментах использован препарат рчФНОα
с активностью 1×106 Ед/мл. Его вводили подкожно
в дозе 100 Ед на мышь в объеме 0,5 мл одновремен‑
но с полуфабрикатом вакцины. Иммуногенную ак‑
тивность каждой из трех серий конъюгированного
препарата и полуфабриката вакцины без полиок‑
сидония исследовали на мышах, используя как не‑
разведенные формы препарата, так и его разведения
1:2, 1:4, 1:8 и 1:16. Сыворотки от опытных и конт‑
рольных групп мышей были получены через 28 дней
от начала иммунизации и исследованы на наличие
суммарных антител и титров антител к антигену ви‑
руса гепатита А.
Исследования адъювантных свойств рчФНОα и
полиоксидония при оценке иммуногенной актив‑
ности конъюгата на экспериментальных животных
выявили дозозависимый эффект его лекарственной
формы. В группах животных, получивших рчФНОα
одновременно с конъюгатом вакцины с добавлением
лекарственной формы полиоксидония в оптималь‑
ной дозе (200 мкг), отмечено усиление иммунного
ответа на антиген по сравнению с животными, кото‑
рым не вводили рчФНОα. При этом показатель ИД50
составил 2,0 нг антигена в первой группе и 2,65 нг
антигена во второй группе (снижение ИД50 составило
24,6%). При сопоставлении групп животных, имму‑
низированных полуфабрикатом вакцины в сочета‑
нии с рчФНОα и только полуфабрикатом вакцины,
установлено снижение ИД50 на 45%.
Оценка уровня титров специфических антител к
антигену вируса гепатита А показала, что при вве‑
дении рчФНОα в сочетании с полуфабрикатом вак‑
цины наблюдалась стимуляция выработки антител
по сравнению с животными, иммунизированными
только полуфабрикатом вакцины. Так, у животных,
иммунизированных вакциной в дозе 12,5 нг антигена
с рчФНОα, в 40% случаев выявлялись антитела в тит‑
ре 1:160 и выше, тогда как в контрольной группе – в
титре 1:10. Аналогичная закономерность наблюда‑
лась и при использовании разведений вакцины.
Наиболее выраженное влияние полиоксидония
на формирование специфических антител наблюда‑
лось при использовании его в дозе 200 мкг на мышь.
Указанный дозозависимый эффект отмечался и при
сочетанном применении полиоксидония и рчФНОα.
25
В группах животных, иммунизированных конъюга‑
том вакцины (цельной и разведенной 1:2) в соче‑
тании с рчФНОα и полиоксидонием в дозе 200 мкг
на мышь титры антител 1:160 и выше выявлялись в
50–62,5% случаев.
Следует отметить, что наиболее выраженный
стимулирующий эффект рчФНОα проявлялся при
иммунизации животных малыми дозами конъюги‑
рованной вакцины (3,12 и 1,56 нг антигена) и при
сочетанном использовании его с малой дозой поли‑
оксидония (40 мкг на мышь). Таким образом, мож‑
но заключить, что рчФНОα и полиоксидоний ока‑
зывают стимулирующее влияние на иммуногенную
активность вакцины «ГЕП-А-ин-ВАК», индуцируя
синтез специфических антител к антигену вирусного
гепатита А.
Адъювантное действие цитокинов на иммуногенную активность
вакцины против гепатита А в экспериментах на морских свинках
Влияние препаратов цитокинов на иммуногенность
вакцины «ГЕП-А-ин-ВАК» изучено в эксперимен‑
тах на морских свинках. Животным одновременно
с вакциной вводили препараты цитокинов, имму‑
низацию проводили подкожно трехкратно с интер‑
валом в две недели. Дозы цитокинов были выбраны
на основании данных литературы и результатов собс‑
твенных предварительных исследований и составили
для рчФНОα 1 мкг или 1000 Ед, для ИЛ-1β – 1 мкг,
для рчИФγ – 50000 Ед на морскую свинку в объеме
0,5 мл. Контрольным группам животных вводили
«ГЕП-А-ин-ВАК» без цитокинов.
В экспериментах использовали три серии вакци‑
ны, различающиеся по содержанию антигена вирус‑
ного гепатита А. В первых двух сериях по данным им‑
муноферментного анализа оно составляло 60–70 Ед,
в третьей – 120 Ед. Результаты исследований оце‑
нивали по титру специфических антител и по числу
сероположительных животных. Титр антител опреде‑
ляли с помощью иммуноферментного анализа. Се‑
роположительными считались сыворотки животных
с титром более 1:10. Эффективность иммунизации
оценивали в динамике на 14-е сутки после 2-го и 3-го
введений препаратов.
После двухкратного введения препаратов более
высокий титр антител отмечен в группе морских
свинок, иммунизированных «ГЕП-А-ин-ВАК» в со‑
четании с рчФНОα. Средние титры антител в этой
группе превышали показатели в контроле в 7,8 раза.
Частота выявления сероположительных животных
после двухкратного введения препаратов в группах
с рчФНОα статистически достоверно отличалась от
аналогичных показателей в контрольной группе. По‑
казатели в группе морских свинок, иммунизирован‑
ных вакциной в сочетании с рчИЛ-1β, статистически
значимо не отличались от контроля.
После трехкратного введения препаратов увели‑
чение титров антител в группе с рчФНОα было в 12,4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
26
Таблица 3
Оценка влияния цитокинов на иммуногенную активность вакцины «ГЕП-А-ин-ВАК» (содержание антигена 60–70 Ед)
в экспериментах на морских свинках
Группа животных
«ГЕП-А-ин-ВАК» (контроль)
Кол-во
животных
Срок
обследования1
Хlg±Ilg2
Средний титр
антител
Кол-во серопозитив‑
ных животных, %
I
0,62±0,24
1:4
41,7±14,8
II
1,32±0,27
1:21
75,0±13,1
I
1,49±0,23
1:31
88,9±11,13
II
2,42±0,203
1:261
I
0,98±0,28
1:10
II
2,15±0,28
1:140
12
«ГЕП-А-ин-ВАК»+рчФНОα
9
«ГЕП-А-ин-ВАК»+рчИЛ-1β
9
3
3
100,0
66,7±16,4
100,0
I – 14-е сутки после двухкратного введения препаратов, II – 14-е сутки после трехкратного введения препаратов.
Средняя геометрическая титров антител.
3
Различие достоверно по отношению к контрольной группе.
1
2
Таблица 4
Оценка влияния цитокинов на иммуногенную активность вакцины «ГЕП-А-ин-ВАК» (содержание антигена 120 Ед)
в экспериментах на морских свинках
Группа животных
«ГЕП-А-ин-ВАК» (контроль)
«ГЕП-А-ин-ВАК»+рчФНОα
«ГЕП-А-ин-ВАК»+рчИЛ-1β
Кол-во
животных
19
8
8
«ГЕП-А-ин-ВАК»+рчИЛ-2
18
«ГЕП-А-ин-ВАК»+рчИФγ
10
«ГЕП-А-ин-ВАК»+рчФНОα+рчИФγ
«ГЕП-А-ин-ВАК»+«Имунофан»
19
18
Срок обсле‑
дования1
Хlg±Ilg2
Средний титр
антител
Кол-во серопозитив‑
ных животных, %
I
1,34±0,22
1:22
73,7±10,3
II
2,07±0,25
1:119
89,5±7,2
I
2,47±0,29
1:295
100,03
II
3,21±0,223
1:1622
100,0
I
2,42±0,22
1:263
100,03
II
3,13±0,183
1:1349
100,0
I
1,98±0,12
1:96
100,03
II
2,75±0,16
1:565
100,0
I
1,74±0,25
1:55
II
2,77±0,23
1:589
I
2,01±0,213
1:102
II
2,91±0,16
1:813
I
1,97±0,15
1:94
II
3,02±0,143
1:1054
3
3
3
3
3
90,0±10,0
100,0
89,5±7,2
100,0
95,3±6,43
100,0
I – 14-е сутки после двухкратного введения препаратов, II – 14-е сутки после трехкратного введения препаратов.
2
Средняя геометрическая титров антител.
3
Различие достоверно по отношению к контрольной группе.
1
раза, в группе с рчИЛ-1β – в 7 раз выше по сравнению
с показателями контроля. Частота выявления серо‑
положительных животных после третьего введения
препаратов в контрольной группе составила 75%, а
в группах животных, получивших вместе с вакциной
препарат рчФНОα или рчИЛ-1β, – 100% (табл. 3).
После двухкратного введения препаратов в груп‑
пах морских свинок, получивших вместе с вакци‑
ной все исследуемые цитокины или комбинацию
­рчФНОα и рчИФγ, средние титры антител превы‑
шали показатели контрольной группы в 4,6–13,4
раза. При этом частота выявления сероположитель‑
ных животных в группах с рчФНОα, рчИЛ-1β и ИЛ2 достигла 100%, аналогичный показатель в контро‑
ле составлял 73,7%.
После трехкратного введения препаратов средние
титры антител в группах животных с индивидуаль‑
ным использованием цитокинов (рчФНОα, рчИЛ‑1β
или «Имунофан») превышали в 9–13 раз, с комби‑
нацией из рчФНОα и рчИФγ – в 6,8 раза уровень
контроля. Следует отметить, что частота выявления
сероположительных животных после 3-го введения
препаратов в контрольной группе морских свинок,
иммунизированных «ГЕП-А-ин-ВАК» без цитоки‑
нов, составила 89,5%, а в группах животных, имму‑
низированных «ГЕП-А-ин-ВАК» в сочетании с ци‑
токинами – 100% (табл. 4).
При сопоставлении экспериментов c использо‑
ванием различных серий «ГЕП-А-ин-ВАК» наблю‑
далось возрастание эффективности иммунизации
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
вакциной, содержащей большее количество антиге‑
на (120 Ед). При введении с цитокинами отмечалось
усиление иммуногенного эффекта вакцины, незави‑
симо от количественного содержания в ней антигена
вируса гепатита А.
Таким образом, в экспериментах на морских свин‑
ках выявлено стимулирующее влияние цитокинов
(рчФНОα, рчИЛ-1β, рчИЛ-2, рчИФγ) и препарата
«Имунофан» на иммуногенную активность вакцины
против гепатита А. Введение цитокинов в качестве
адъювантов способствовало увеличению титров ан‑
тител к вирусу гепатита А по сравнению с контроль‑
ной группой, иммунизированной одной вакциной, и
обеспечивало 100% сероконверсию животных после
окончания введения препаратов.
Адъювантное действие рчФНОβ и ридостина на иммуногенные
свойства вакцины против гепатита В
Влияние рчФНОβ и ридостина на иммуногенную
активность вакцины против гепатита В оценивали в
экспериментах на белых мышах по уровню специфи‑
ческих антител к антигену вирусного гепатита В и по
числу сероположительных животных.
Вакцина в дозах 2,5, 1,25, 0,6, 0,3 и 0,15 мкг на
мышь вводилась внутрибрюшинно однократно.
Контрольные животные получали только указан‑
ные дозы вакцины. Опытным животным 1-й группы
вводили дозы вакцины в сочетании с препаратом
рчФНОβ из расчета 50 Ед на мышь. Для животных
2-й группы дозы вакцины сочетались с препара‑
том «Ридостин» из расчета 50 мкг на мышь. Через
30 суток индивидуально у каждого животного была
получена сыворотка крови для определения уровня
специфических антител.
При иммунизации минимальной дозой вакцины в
сочетании с препаратами рчФНОβ или «Ридостин» у
30% животных наблюдалось формирование антител к
антигену вирусного гепатита В. В контрольной груп‑
пе, иммунизированной только вакциной в указанной
дозе, антитела не выявлялись. Стимуляция форми‑
рования специфических антител при иммунизации
дозой вакцины, которая не вызывает иммунного
ответа у экспериментальных животных, свидетельс‑
твует о возможности снижения эффективной имму‑
низирующей дозы вакцины при использовании ее в
сочетании с рчФНОβ и ридостином.
Таким образом, проведенные исследования сви‑
детельствуют о стимулирующем действии цитоки‑
нов на иммуногенную активность вакцин против ге‑
патитов А и В. Наиболее выраженными свойствами
обладают рекомбинантные цитокины ФНОα, ИЛ1β, а также препараты «Полиоксидоний» и «Имуно‑
фан». Указанные соединения при индивидуальном
или сочетанном использовании усиливают имму‑
ногенность вакцины, повышая уровень титров спе‑
цифических антител, и обеспечивют более высокий
уровень сероконверсии, чем иммунизация моновак‑
27
циной. В заключение следует отметить, что присутс‑
твие высокоактивных цитокинов в вакцинах опре‑
деляет необходимость изучения их биологической
значимости и целесообразности стандартизации и
контроля вакцинных препаратов по содержанию в
них цитокинов.
Литература
1. Авдеева Ж.И., Акользина С.Е., Алпатова Н.А., Медуни­
цын Н.В. Оптимизация вакцинального процесса с помо­
щью цитокинов // Russian Journal of Immunol. 1999. Т. 4,
прил. 1. С. 54.
2. Авдеева Ж.И., Акользина С.Е., Алпатова Н.А., Карпо­
вич Л.Г., Медуницын Н.В. Влияние цитокинов на иммуно­
генные свойства вакцины против гепатита А // Вопросы
вирусологии. 2005. № 2. С. 23–27
3. Акользина С.Е. Цитокины в вакцинах и их адъювантное
действие: автореф. дис. … канд. мед. наук. М., 1996. 20 с.
4. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. Цитокины. СПб.: Фоли­
ант, 2008. 554 с.
5. Медуницын Н.В. Вакцинология. М.: Триада Х, 2004.
446 с.
6. Медуницын Н.В., Кузнецов В.П., Крылов О.Р., Авдеева
Ж.И. и др. Сопутствующая цитокиновая активность
в препаратах интерферона // Иммунология. 1987. № 4.
С. 34–40.
7. Петров Р.В., Хаитов Р.М. Вакцины нового поколения на
основе синтетических полиионов: история создания, фе­
номенология и механизм действия, внедрения в практику
// Иммунология. 1998. № 5. С. 4–11.
8. Титов Л.П. Цитокины // Медицина. 1998. № 2. С. 30–32.
9. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999.
606 с.
10. Armitage J.O. Emerging applications of recombinant human
granulocyte-macrophage colony-stimulating factor // Blood.
1998. Vol. 92, No. 12. P. 4491–4508.
11. Medunitsin N.V., Avdeeva J.I., Acolzina S.E. et.al. Presence of
cytokines in biological preparations // Biological. 2002. No. 30.
P. 1–6.
12. Senda T. Structure and function of cytokines and receptions
// Protein Nucl. Acid and Enzyme. 1999. Vol. 44, No. 4.
P. 318–324.
Поступила в редакцию 03.04.2009.
CYTOKINES AND VACCINES
Zh.I. Avdeeva, N.A. Alpatova, S.E. Akolzina, N.V. Medunitsin
L.I. Tarasevich State Research Institute for Standardization and
Control of Medical Biological Preparations (41 Sivtsev Vrazhek
Lane Moscow 119002 Russia)
Summary – The mammalian cell culture-derived vaccines con‑
tain some pro-inflammatory cytokines, the number and con‑
centration of which depend on the vaccine type. Spontaneous
and antigen-induced production of cytokines is subject on the
cell line and nature of antigen. Diploid cell strains (M‑22 and
L‑68) spontaneously secrete cytokines. Studying the cell cultureinduced cytokine synthesis can serve as one of the criteria to
choose substrate required to produce tissue culture vaccine. As
the researches into adjuvanticity of cytokines and related immu‑
nomodulating drugs in some experiments show, there is a stimu‑
latory effect produced by cytokines on the immunologic activity
of the A and B hepatitis vaccines. Recombinant cytokines being
tumor necrosis factor-α and interleukin-1β as well as “Polyoxi‑
donium” and “Imunofan” are considered to have most evident
immunomodulation properties.
Key words: cytokines, immunoadjuvants, vaccines, immune
response.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 22–27.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
28
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
УДК 615.37:[615.324:596.2]
Е.С. Моторя1, Т.Н. Пивненко1, А.К. Гажа2, Л.А. Иванушко2, В.Н. Воронцов3, Н.М. Санина3
1 ТИНРО-центр (690091 г. Владивосток, пер. Шевченко, 4), 2 НИИ эпидемиологии и микробиологии Сибирского
отделения РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 3 Дальневосточный государственный университет (690950 г.
Владивосток, ул. Октябрьская, 25)
ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕЙ И МЕМБРАНОТРОПНОЙ АКТИВНОСТИ
КАРОТИНОИДОВ ИЗ ТУНИКИ АСЦИДИИ HALOCYNTHIA AURANTIUM
Ключевые слова: асцидия, каротиноиды, функциональная активность нейтрофилов, мембранотропное действие.
Исследована иммуномодулирующая и мембранотропная
активность каротиноидов из туники асцидии Halocynthia
aura­nti­um. Показано наличие 12 компонентов, среди кото‑
рых преобладают ксантофиллы: астаксантин, аллоксантин,
диатоксантин, галоцинтиаксантин, фукоксантинол, ми‑
тилоксантинон. Галоцинтиаксантин присущ только этому
объекту и используется для идентификации препаратов на
его основе. По оригинальному запатентованному методу вы‑
делен масляный экстракт из туники асцидии, зарегистриро‑
ванный в качестве биологически активной добавки к пище.
Показано, что препарат стимулирует бактерицидную и фа‑
гоцитарную активность нейтрофилов, антиокислительные
свойства сыворотки крови, замедляет интенсивность пере‑
кисных процессов, оказывает противовоспалительный и
гемостимулирующий эффекты. Каротиноиды из туники ас‑
цидии обладают мембранотропной активностью, способны
связываться с фосфолипидами и стабилизировать структуру
мембран. Полученные результаты позволяют рекомендовать
биологически активную добавку «Масляный экстракт асци‑
дии» для расширенных клинических испытаний.
Гидробионты морских и пресноводных акваторий
отличаются от наземных организмов значительным
разнообразием вторичных метаболитов, существен‑
ная часть которых представлена функциональными
соединениями. К веществам такого типа относятся
каротиноиды, к настоящему времени из природных
источников выделено более 650 представителей это‑
го класса веществ. Наблюдая широкое распростране‑
ние и разнообразие каротиноидов в растительном и
животном мире, необходимо отметить важную роль
этих соединений для протекания нормальных физио‑
логических процессов.
В настоящее время установлено, что каротинои‑
ды проявляют антиоксидантную, иммуномодулиру‑
ющую, противоопухолевую активности, а также спо‑
собны модулировать экспрессию генов, обеспечивая
защиту от экспериментальных воспалительных по­
вреждений и неопластических трансформаций [9, 13,
14]. На примере астаксантина, типичного для многих
морских животных, показано, что его антиоксидант‑
ная активность в десять раз превышает аналогичные
свойства β-каротина [13]. Галоцинтиаксантин прояв‑
ляет ингибиторное действие к РНК-зависимой ДНКполимеразе вируса иммунодефицита человека 1-го и
2-го типов [12]. Также установлено, что неоксантин
и фукоксантин индуцируют апоптоз опухолевых кле‑
ток простаты человека [11].
Пивненко Татьяна Николаевна – д-р биол. наук, завсектором
биохимии лаборатории биохимии гидробионтов ТИНРО-центра;
тел.: 8 (4232) 40-08-05; e-mail: pivnenko@tinro.ru.
В дальневосточных и арктических морях широко
распространена асцидия Halocynthia aurantium, в ту‑
нике которой обнаружены уникальные по составу и
свойствам каротиноиды, среди которых преобладают
окисленные формы – аллоксантин, диатоксантин,
метилоксантинон, галоцинтиаксантин, астаксантин
и другие.
Присутствие в каротиноидах большого количества
(11 и более) двойных связей придает им высокую био‑
логическую активность, которая проявляется в тормо‑
жении процессов перекисного окисления липидов и
определяет такие их биологические функции, как пре‑
дотвращение предраковых и возрастных повреждений,
радиационных поражений, сердечно-сосудистых за‑
болеваний. Молекулярные механизмы, ответственные
за указанные эффекты, еще не ясны, но велика веро‑
ятность вовлечения в эти процессы антиоксидантных
свойств каротиноидов, а также их воздействия на фи‑
зические свойства клеточных мембран. Регуляторные
эффекты каротиноидов, вероятно, обусловлены их
способностью встраиваться в мембранные фосфоли‑
пидно-белковые структуры, и, тем самым, изменять
текучесть мембран. Это может сопровождаться как мо‑
дификацией взаимодействий между липидами и бел‑
ками, так и существенно влиять на антиоксидантную
активность каротиноидов. По мере увеличения длины
полиеновой цепочки возрастает степень ее стабилиза‑
ции и увеличивается антиоксидантная активность [4].
Животные, а также человек, не могут синтезировать
каротиноиды de novo, их поступление зависит толь‑
ко от источников питания. Таким образом, широкий
спектр биологических активностей каротиноидов, со‑
держащихся в морских организмах, свидетельствует
о целесообразности их выделения и использования в
лечебных и профилактических целях. Поэтому целью
настоящей работы был анализ иммуномодулирующей
и мембранотропной активностей каротиноидов из ту‑
ники асцидии H. aurantium.
Материалы и методы. Асцидия пурпурная H. auran­
ti­um была выловлена в заливах Петра Великого и По‑
сьет (Японское море). Свежевыловленную асцидию
разделывали, заготавливали тунику, мантию, гонады
и пищеварительную железу и хранили до анализа при
температуре –25°С (не более трех недель).
Выделение и определение количественного со‑
держания каротиноидов в органах и тканях гидро‑
бионта проводили спектрофотометрическим мето‑
дом [1]. Экстракт каротиноидов получали по методу,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
описанному в патенте РФ № 2339387 «Способ полу‑
чения биологически активной добавки из асцидии».
Для исследования иммуномодулирующей актив‑
ности использовали неинбредных мышей массой
14–16 г, находившихся на стандартной диете в бокси‑
рованных помещениях с соблюдением правил и меж‑
дународных рекомендаций Европейской конвенции
по защите позвоночных животных, используемых в
экспериментальных работах.
Мышам (8 особей в группе) в течение 21 дня вво‑
дили перорально экстракт каротиноидов в дозах 50 и
0,5 мкл на мышь. Контрольной группе животных вво‑
дили физиологический раствор. Через 21 день мышам
вводили внутрибрюшинно 1 мл стерильного 1% рас‑
твора пептона, через 4 часа (для получения популяции
нейтрофилов) под эфирным наркозом в брюшную
полость вводили по 4 мл раствора Хэнкса без феноло‑
вого красного с гепарином (5 ЕД/мл), в течение 2 мин
массировали брюшко, затем отсасывали содержимое
брюшной полости, центрифугировали однократно
при 1000 об./мин. Надосадочную жидкость сливали,
клетки ресуспензировали в растворе Хэнкса, доводили
до концентрации 2×106/мл, исследовали фагоцитар‑
ную [3] и бактерицидную [6] активности нейтрофилов
перитонеальной полости мышей (по отношению к Sta­
phy­lo­coc­cus aureus, штамм 209), а также антиоксидант‑
ную активность крови мышей [2, 7].
Общую антиоксидантную активность (АОА) плаз‑
мы крови выражали в процентах. Первоначально оп‑
ределяли разницу (∆Е) между показателями до и пос‑
ле инкубации в присутствии окислителей:
∆Еоп=Еоп t–Еоп о и ∆Ек=Ек t–Ек о,
где Еоп о, Ек о – экстинции проб до инкубации, Еоп t,
Ек t – экстинции проб после инкубации. Конечная
формула расчета:
АОА=(∆Ек–∆Еоп/∆Ек)×100%.
Для изучения мембранотропной активности каро‑
тиноидов из туники асцидии исследовали их влияние
на термотропный фазовый переход дипальмитоилфос‑
фотидилхолина (ДПФХ) методом дифференциальной
сканирующей калориметрии. ДПФХ 99% чистоты был
приобретен у Sigma Chemical Co. (США).
Для дифференциальной сканирующей калори‑
метрии ДПФХ (2 мг) или смесь ДПФХ с каротино‑
идами (в молярном соотношении 1,7 и 5) вносили в
стандартные микроконтейнеры, смешивали с 10 мкл
бидистиллированной воды, герметично запаковыва‑
ли и помещали в дифференциальный сканирующий
калориметр ДСМ-2M (НПО «Биоприбор», Россия).
В качестве образца сравнения использовали контей‑
нер, содержащий такое же количество воды. Образ‑
цы нагревали/охлаждали со скоростью сканирования
16°C/мин в интервале от 10 до 60°C при чувствитель‑
ности 40 мВт. Положение максимума теплопоглоще‑
ния на температурной шкале определяли как темпе‑
ратуру фазового перехода. Энтальпию перехода опре‑
29
деляли по площади эндотермического пика перехода
и по известной энтальпии стандартного образца ин‑
дия. Температурную шкалу калибровали по стандарт‑
ным образцам нафталина, ртути и индия.
Статистический анализ проводили с использова‑
нием прикладного пакета Biostat. Достоверность раз‑
личий оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования. Первоначально было
определено содержание каротиноидов в различных
органах и тканях асцидии. Для этого использовали
общепринятый метод исчерпывающей экстракции
этих компонентов с помощью ацетона. В дальней‑
шем была изучена экстрактивная способность дру‑
гих растворителей, в том числе тех, которые могут
быть использованы для получения биологически ак‑
тивных добавок (БАД) к пище. Предлагаемый нами
метод получения БАД включает реэкстракцию каро‑
тиноидов из этанолового экстракта в растительное
масло. При этом наблюдается практически полный
переход искомых компонентов в жировую фазу, че‑
го не удается достичь прямой масляной экстракцией.
Способ и получаемый продукт защищены патентом
РФ № 2339387.
Наибольшее количество каротиноидов содержит‑
ся в тунике, которая и была выбрана в качестве сырья
для изготовления экстракта. В мантии, пищевари‑
тельной железе и гонадах концентрация каротинои‑
дов значительно ниже, чем в тунике (табл. 1).
Японскими учеными был проведен сравнитель‑
ный анализ состава каротиноидов асцидий: Stye­la cla­
va, Botryllus schlosseri, Didemnum moseleyi, Ama­rou­ci­um
pliciferum, Styela plicata, Halocynthia roretzi, Ascidia za­ra,
Ciona intestinalis, Botrylloides violaceus и Polycitor pro­li­fe­
rus [15]. Показано, что фукоксантинол, галоцинтиак‑
сантин, метилоксантин и метилоксантинон присутс‑
твуют в большинстве видов этих гидробионтов. Все
соединения являются метаболитами фукоксантина,
источником которого является фитопланктон. В це‑
лом содержание каротиноидов в семействе асцидий
схоже (табл. 2).
Исследования масляного экстракта асцидии пур‑
пурной показали, что содержание тяжелых металлов,
радионуклидов и его микробиологическая конта‑
минация не превышают норм, указанных в СанПин
2.3.2.1078, регламентирующих показатели безопас‑
ности БАД к пище. Препарат прошел экспертизу в
Роспотребнадзоре РФ и зарегистрирован в Реестре
БАД. Получено СЭЗ № 77.99.13.003.Т.002367.10.07.
Таблица 1
Содержание каротиноидов в тканях и органах асцидии
пурпурной
Органы и ткани
Мантия
Туника
Пищеварительная железа
Гонады
Каротиноиды, мг/100 г ткани
16,68
36,76
10,80
3,17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
30
Таблица 2
Наиболее распространенные каротиноиды семейства
асцидий
Наименование
0,3–5,3
Ксантофиллы
лютеин
0,1–2,0
зеаксантин
0,9–10,2
диатоксантин
0,7–12,0
аллоксантин
10,0–43,0
астаксантин
0,6–5,3
фукоксантин
0,2–15,6
фукоксантинол
1,5–12,4
галоцинтиаксантин
1,0–15,7
метилоксантин
1,9–14,0
метилоксантинон
11,0–36,6
Таблица 3
Действие экстракта каротиноидов на бактерицидную
активность нейтрофилов перитонеальной полости мышей
Образец
Доза, мкл на
мышь
НСТ-тест1,
OD×103
Контроль
Экстракт каротиноидов
Экстракт каротиноидов
0,0
50,0
0,5
93,4±1,5
107,8±5,92
104,1±3,32
2
Образец
Доза, мкл
на мышь
ФП1, %
ФЧ2
Контроль
Экстракт каротиноидов
Экстракт каротиноидов
0,0
50,0
0,5
64±4,2
68±5,2
83±6,6
1,98±0,3
4,80±0,83
2,60±0,3
% от общего кол-ва каротиноидов
Каротины: β-каротин
1
Таблица 4
Действие экстракта каротиноидов на фагоцитарную
активность нейтрофилов перитонеальной полости мышей
Тест восстановления нитросинего тетразолия.
Разница с контролем статистически значима.
Результаты токсикологической экспертизы показа‑
ли, что экстракт из туники асцидии не вызывал гибе‑
ли мышей в течение 2 недель и не вызывал побочных
реакций. Образцы вводили внутригастрально в дозах,
превышающих рекомендуемые активные в 100 раз.
При исследовании бактерицидной и фагоцитар‑
ной активности нейтрофилов перитонеальной по‑
лости мышей были использованы дозировки, соот‑
ветствующие рекомендуемым, и в 100 раз меньшие
(табл. 3, 4). При этом различие в бактерицидной ак‑
тивности при столь значительном различии в дози‑
ровках оказалось невелико.
При введении мышам экстракта каротиноидов
в дозе 0,5 мкл на особь количество клеток, участву‑
ющих в фагоцитозе, увеличивалось на 20%, однако
среднее число микроорганизмов, поглощенных од‑
ним фагоцитом, практически не изменялось по срав‑
нению с контролем (табл. 4). При введении экстра‑
кта в дозе 50 мкл на особь фагоцитарный показатель
не менялся, хотя фагоцитарное число увеличилось
в 2 раза. Антиокислительные свойства крови значи‑
тельно повышались под действием экстракта кароти‑
ноидов. В дозе 50 мкл на мышь АОА увеличивалась
почти в 2 раза. Накопление малонового диальдегида
в модельной системе при дозе экстракта 0,5 мкл было
существенно ниже, чем в контроле (табл. 5).
Температура фазового перехода чистого ДПФХ
(без каротиноидов, выделенных из туники H. auran­
Фагоцитарный показатель.
Фагоцитарное число.
3
Разница с контролем статистически значима.
1
2
Таблица 5
Действие экстракта каротиноидов на антиокислительную
активность крови мышей.
Образец
Доза, мкл
на мышь
АОА, %
МДА1,
нмоль/г
Контроль
Экстракт каротиноидов
Экстракт каротиноидов
0,0
50,0
0,5
15,2±3,5
32,2±3,82
25,5±3,62
9,4±0,4
8,4±0,3
7,2±0,52
1
2
Малоновый диальдегид.
Разница с контролем статистически значима.
tium) составляла 42°С, что соответствует литератур‑
ным данным [10]. Добавление 1,7 мольного % ка‑
ротиноидов мало отражалось на этом показателе,
который снижался всего на 2°С, но резко влияло на
энтальпию фазового перехода, которая снижалась с
7,0 до 3,4 Дж/г. Одновременно с этим исчезал пред‑
переход при 37°С, который характерен для водной
дисперсии ДПФХ. Добавление 5 мольных % кароти‑
ноидов приводило к полному исчезновению калори‑
метрического фазового перехода ДПФХ (рис.).
Обсуждение полученных данных. Таким образом,
проведенные исследования показывают, что пурпур‑
ная асцидия может служить источником биологичес‑
ки активных соединений, а именно каротиноидов,
отличающихся уникальным составом и свойствами.
При этом разработанный способ получения в соста‑
ве масляного экстракта позволяет использовать их в
качестве БАД к пище. Для асцидии, как и для боль‑
шинства морских организмов, характерно наличие
окисленных форм каротиноидов – ксантофиллов
(для данного объекта более 12 соединений), обла‑
дающих более мощным антиоксидантным потен‑
циалом, предполагающим высокую биологическую
активность. В данном исследовании установлена
способность масляного экстракта асцидии стимули‑
ровать бактерицидную и фагоцитарную активность
нейтрофилов перитонеальной полости. При этом од‑
новременно усиливаются антиоксидантные свойства
сыворотки крови, что соответствует замедлению ин‑
тенсивности перекисных процессов.
Другим важным следствием уникальных физикохимических свойств молекул каротиноидов асцидии
является их способность встраиваться в мембраны.
Эффект каротиноидов из туники асцидии на фазо‑
вый переход ДПФХ (уменьшение энтальпии при
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
31
дии обладают значительно большей фосфолипидсвя‑
зывающей, а значит, и мембранотропной активностью
по сравнению с растительными каротиноидами. Фи‑
зическое состояние мембранных липидов имеет боль‑
шое значение для регуляции активности мембранных
рецепторов, сенсорных белков и ионных каналов, что,
в свою очередь, может быть использовано для созда‑
ния кардио- и гепатопротекторов.
Полученные результаты позволяют рекомендо‑
вать БАД «Масляный экстракт асцидии» для расши‑
ренных клинических испытаний.
Рис. Термограммы фазовых переходов гидратированного
ДПФХ (сплошная линия) и его смеси с 1,7 мольного % ка‑
ротиноидов из туники H. aurantium (пунктирная линия).
малоизменяющейся температуре перехода) подобен
действию холестерина, который является одним из
мембранообразующих компонентов плазматических
мембран животных и обладает «пластифицирующим»
действием на жидкостность фосфолипидов [5]. Моле‑
кулы каротиноидов, благодаря полиизопреноидным
цепям с конъюгированными двойными связями, об‑
ладают жесткой гидрофобной структурой, что также
характерно для молекул холестерина. Поэтому такие
соединения, встраиваясь в гидрофобный кор мембран,
оказывают двоякое действие на их физическое состоя‑
ние: разжижают в гелевом состоянии и, наоборот,
действуют как затвердитель в жидкокристаллическом
состоянии. В результате биомембраны с высоким со‑
держанием холестерина не проявляют калориметри‑
ческих переходов [8]. Этот «ликвифицирующий» эф‑
фект холестерина связан с тем, что фосфолипидные
молекулы, окруженные холестерином, вероятно, не
способны к участию в кооперативном процессе, пос‑
кольку холестерин иммобилизует фосфолипидные
молекулы и исключает их из фазового перехода.
Полученные данные позволяют предполагать, что
каротиноиды из туники асцидии связываются с фос‑
фолипидами, то есть обладают мембранотропной ак‑
тивностью и так же, как холестерин, стабилизируют
структуру мембран.
Интересно отметить, что калориметрический пере‑
ход ДПФХ исчезал при добавлении 5 мольных % каро‑
тиноидов из туники асцидии, тогда как растительные
каротиноиды с различной структурой оказывали по‑
добный эффект при заметно больших концентрациях
[10]. Так, в присутствии 5 мольных % виолаксантина,
зеаксантина, бета-каротина или лютеина еще регис‑
трировался отчетливый калориметрический переход
ДПФХ, тогда как каротин и ликопен мало снижали
энтальпию перехода даже при концентрации 10 моль‑
ных %. Следовательно, каротиноиды из туники асци‑
Литература
1. Белорукова А.А., Задорожный П.А., Пивненко Т.Н. и др.
Оценка содержания каротиноидов у асцидий Halocynthia
aurantium и Styella clava // Известия ТИНРО. 2006. Т. 147.
С. 347–353.
2. Бородин Е.А., Арчаков А.И. Стабилизация и реактивация
цитохрома Р-450 фосфатидилхолином при перекисном
окислении липидов // Биологические мембраны. 1987. № 7.
С. 719–728.
3. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунология в клинической
практике. М.: Наука, 1990. 224 с.
4. Лебская Т.К., Толкачева В.Ф., Варсанович Е.А., и др. При­
менение БАД «Рыбий жир с каротиноидами из морского
огурца» в терапии больных гипертонической болезнью и
ИБС с ожирением // Биологически активные добавки к пи­
ще: ХХI век: тез. докл. междунар. симп. СПб., 2000. С. 89.
5. Санина Н.М., Костецкий Э.Я. Влияние холестерина на
фазовые переходы фосфатидилхолина, полученного из ас­
цидии Halocynthia aurantium // Журн. эвол. биохим. физиол.
1995. Т. 31, № 1. С. 366–369.
6. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая
иммунология. М.: ВНИРО, 1995. 220 с.
7. Чумак А.Д., Миленина Н.И., Слуцкая Т.Н. и др. Влияние
различных добавок на окисление липидов и качество соленых
лососевых // Известия ТИНРО. 1992. Т. 114. С. 167–174.
8. Huang T.H., Lee C.W., Das Gupta S.K. et. al. A 13C and 2H
nuclear magnetic resonance study of phosphatidylcholine/cho­
lesterol interactions: characterization of liquid-gel phases //
Biochemistry. 1993b. Vol. 32. P. 13277–13287.
9. Konishi I., Hosokawa M., Sashima T. et. al. Halocynthiaxan­
thin and fucoxanthinol isolated from Halocynthia roretzi induce
apoptosis in human leukemia, breast and colon cancer cells //
Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology &
Pharmacology. 2006/ Vol. 142, Is. 1–2. P. 53–59.
10. Kostecka-Gugala A., Latowski D., Strzalka K. Thermotropic
phase behaviour of α-dipalmitoylphosphatidylcholine multibi­
layers is influenced to various extents by carotenoids containing
different structural features – evidence from differential scan­
ning calorimetry. Biochim. Biophys. Acta. 2003. Vol. 1609.
P. 193–202.
11. Kotake-Nara E., Asai A., Nagao A. Neoxanthin and fucoxan­
thin induce apoptosis in PC-3 human prostate cancer cells //
Cancer Let. 2005. Vol. 220, No. 1. P. 75–84.
12. Loya S., Kashman Y., Hizi A. The carotenoid halocynthiax­
anthin: a novel inhibitor of the reverse transcriptases of human
immunodeficiency viruses type 1 and type 2 // Arch. Biochem.
Biophys. 1992. Vol. 293, No. 2. P. 208–212.
13. Miki W. Biological functions and activities of animal carotenoids
// Pure & Appl. Chem. 1991. Vol. 63, No. 1. P. 141–146.
14. Nishino H., Tsushima M., Matsuno T., et al. Anti-neoplastic
effect of halocynthiaxanthin, a metabolite of fucoxanthin // An­
ticancer Drugs. 1992. Vol. 3, No. 5. P. 493–497.
15. Ookubo M., Matsuno T. Carotenoids of Sea Squirts – II. Com­
parative Biochemical studies of carotenoids in Sea Squirts //
Comp. Biochem. Physiol. 1985. Vol. 81B, No. 1. P. 137–141.
Поступила в редакцию 06.04.2009.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
32
STUDY ON IMMUNE-RESPONSE MODULATING AND
MEMBRANE-ACTING EFFECTS OF CAROTENOIDS
DERIVED FROM THE TUNIC OF ASCIDIA
HALOCYNTHIA AURANTIUM
E.S. Motorya1, T.N. Pivnenko1, A.K. Gazha2, L.A. Ivanushko2,
V.N. Vorontsov3, N.M. Sanina3
1 TINRO-Centre (4 Shevchenko Lane Vladivostok 690091
Russia), 2 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of
the RAMS, Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087
Russia), 3 Far Eastern National University (25 Oktyabrskaya St.
Vladivostok 690950 Russia)
Summary – The paper discusses immune-response modulating
and membrane-acting effects of carotenoids derived from the
Halocynthia aurantium ascidia tunic and gives consideration
to 12 components, among which xanthophylls are dominant.
These are: astaxanthin, alloxantin, diatoxanthine, halocynthi‑
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
axanthine, fucoxanthinol, and methylxanthine. Halocynthiax‑
anthine is peculiar to this form and used to identify halocynthi‑
axanthine-based drugs. Original patented method has allowed
to derive oily extract from the ascidian tunic registered as di‑
etary supplement. As shown, this medication induces bacte‑
ricidal and phagocytic activities of neutrophils, antioxygenic
properties of blood serum, inhibits peroxidation, and produces
anti-inflammatory and hemostimulating effects. The ascidian
tunic carotenoids have membrane-acting properties and ca‑
pability to be bound together with phospholipids and stabilize
membrane structure. The findings allow recommending the
dietary supplement “Ascidian-Derived Oily Extract” for ad‑
vanced clinical testing.
Key words: ascidia, carotenoids, functional activity of neutrophils,
membrane-acting effects.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 28–32.
УДК 615.37:577.114:[615.324:594.124]
И.В. Чикаловец1, В.И. Молчанова1, Д.Л. Аминин1, О.В. Черников1, Е.А. Пислягин2, П.А. Лукьянов1
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (690022, г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159),
Дальневосточный государственный университет (690950, Владивосток, ул. Суханова, 8)
1 2 НЕОМИТИЛАН – НОВЫЙ ИММУНОМОДУЛЯТОР ИЗ МИДИИ CRENOMYTILUS GRAYANUS
Ключевые слова: полисахариды, беспозвоночные, иммуномодулирующая активность.
Исследована иммуномодулирующая и противовоспали‑
тельная активность неомитилана – полисахарида из мидии
Сre­no­my­ti­lus grayаnus. В отличие от ранее выделенного из
этой же мидии полисахарида – митилана, неомитилан не
проявляет аллергизирующих свойств, т.к. содержит не бо‑
лее 1,5% белка. В эксперименте показано, что неомитилан
на 25–30% усиливает фагоцитарную активность макрофа‑
гов in vitro и более чем в 2 раза по сравнению с митиланом
повышает активность лизосомальных ферментов макрофа‑
гов и стимулирует формирование активных форм кислоро‑
да. При этом, так же как и митилан, неомитилан не обла‑
дает токсическими свойствами in vivo и не проявляет цито‑
токсической активности in vitro. Установлено, что неоми‑
тилан способен снижать уровень перекисного окисления
липидов и активность нитроксидсинтазы. Сделан вывод,
что митилан вследствие описанных свойств может служить
основой для получения лекарственных препаратов.
Поиск регуляторов иммунных процессов привлека‑
ет в последние десятилетия пристальное внимание
большого числа исследователей. Вещества, оказы‑
вающие регулирующее влияние на иммунную сис‑
тему, получили общее название иммуномодуляторов.
К ним относятся различные химические соединения,
важное место среди них принадлежит биоглика‑
нам – полисахаридам и гликоконъюгатам природ‑
ного происхождения. В качестве иммуномодулятора
из различных видов мидий, обитающих в Японском
и Черном морях, ранее нами был выделен биогли‑
кан – митилан, исследованы его физико-химические
и биологические свойства [2]. Однако присутствие
потенциально аллергогенной белковой компоненты
(3–8%) ограничивает использование этого биоглика‑
на в качестве медицинского препарата.
Чикаловец Ирина Владимировна – канд. хим. наук, старший
научный сотрудник ТИБОХ ДВО РАН; тел.: 8 (4232) 31-07-19;
e‑mail: ivchik6@mail.ru.
Целью настоящей работы явился сравнительный
анализ биологической активности неомитилана (бел‑
ковая компонента не более 1,5%) и митилана, выде‑
ленных из мидии Crenomytilus grayanus.
Материал и методы. Использовались первичные
культуры клеток млекопитающих и техники моле‑
кулярных флуоресцентных зондов. Эксперименты
выполнены на мышах линий CD-1 (весом 19–21 г),
СВА (самки весом 19–21 г) и Balb/С (весом 18–20 г).
Мыши содержались в стандартных условиях вивария
ТИБОХ ДВО РАН с соблюдением правил и между‑
народных рекомендаций Европейской конвенции по
защите позвоночных животных, используемых для
экспериментальных и научных целей.
Для определения острой токсичности раствор
неомитилана в дистиллированной воде в различных
концентрациях вводили внутрибрюшинно в объеме
0,5 мл на животное (по 5 мышей в каждой группе).
Наблюдение и оценка токсического эффекта прово‑
дились в течение 12 дней.
Для определения цитотоксической активности in
vitro получали лимфоциты из селезенки мышей ли‑
нии CD-1 [9]. В лунки 96-луночного планшета вно‑
сили по 20 мкл неомитилана в разных концентрациях
и по 200 мкл суспензии спленоцитов (2–5×106 кле‑
ток/мл) и инкубировали 1 час при 37°С. Затем в каж‑
дую лунку добавляли по 10 мкл раствора флуоресце‑
индиацетата (50 мкг/мл) в диметилсульфоксиде и
снова инкубировали 15 мин при 37°С. Клетки облуча‑
ли светом с длиной волны λex=485 нм, флуоресцен‑
цию регистрировали при λem=518 нм. Измерение
проводили с помощью флуоресцентного планшетно‑
го фотометра Fluoroskan Ascent (Thermo Labsystems,
Финляндия). Все эксперименты повторяли дважды.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
За 100% принимали флуоресценцию лунок, в кото‑
рые вместо исследуемого вещества добавляли по
20 мкл физраствора.
Для определения лизосомальной активности в
брюшинную полость мышей линии СВА вводили
тестируемые препараты в концентрации 300 мкг на
особь: 3 мыши – митилан, 3 мыши – неомитилан и 3
мыши – физраствор (контроль). Через 4 дня по мето‑
ду Р. Адамса [1] получали макрофаги из перитонеаль‑
ной жидкости и помещали их в специальные камеры
для анализа изображений. На клеточный монослой
наносили 200 мкл раствора флуоресцентного зонда
(акридиновый оранжевый, 10 мкM конечная кон‑
центрация) в физиологическом растворе и оставляли
камеры в термостате при 37°С на 30 мин, после чего
клетки трижды отмывали физраствором. Затем каме‑
ры монтировали на предметном столе флуоресцент‑
ного микроцитометра Axiovert 200 (Zeiss, Германия)
и проводили измерение интенсивности флуорес‑
ценции клеток с использованием системы регистра‑
ции флуоресцентного изображения (Cairn Research
Ltd., Англия). Клетки облучали светом длиной вол‑
ны λex=488 нм, флуоресценцию регистрировали при
λem=520 нм.
Интенсивность флуоресценции 300 случайно
выбранных изображений и оценку лизосомальной
активности в клетках осуществляли инструменталь‑
ными средствами программы AQM Advance 6 (Kinetic
Imaging Ltd., Англия). Все эксперименты выполняли
трижды. Лизосомальную активность рассчитывали,
принимая за 100% активность макрофагов контроль‑
ной группы.
Для определения активных форм кислорода
(АФК) иммунизацию мышей тест-препаратами и по‑
лучение макрофагов проводили как в предыдущем
эксперименте. На клеточный монослой наносили 200
мкл раствора флуоресцентного зонда (дихлорофлуо‑
ресцеин-диацетат, 10 мкM конечная концентрация) в
физрастворе и оставляли в термостате при 37°С на 10
мин. Затем монослой трижды отмывали физраство‑
ром, после чего камеры монтировали на предметном
столе флуоресцентного микроцитометра и проводи‑
ли измерение интенсивности флуоресценции клеток.
За 100% принимали количество АФК, продуцируемое
макрофагами контрольной группы.
Определение фагоцитарной активности клеток,
обработанных тестируемыми веществами, прово‑
дили в соответствии с общепринятой методикой [6].
Для оценки интенсивности фагоцитоза и реакции
внутриклеточного киллинга использовали бактерии
Sta­phy­lo­coc­cus aureus, меченные флуоресцеин-изо‑
тиоцианатом. Анализ фагоцитарной активности
перитонеальных мышиных макрофагов проводили
согласно протоколу компании «Молекуляр Пробс»
[12]. Макрофаги получали из перитонеальной жид‑
кости мышей линий Balb/С [1]. Клеточный моно­
слой снимали с поверхности чашек с помощью
33
скрепера. Рабочая концентрация составляла 2–5×106
кл./мл. Тестируемые вещества анализировались в
различных концентрациях: 1 мг/мл, 100 мкг/мл, 10
мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,1 мкг/мл в 4 повторах для каж‑
дой концентрации.
Влияние неомитилана на активность нитроксид‑
синтазы и процессы перекисного окисления липидов
(ПОЛ) в легких изучали на трех курящих доброволь‑
цах после ингаляции 3 и 10 мг неомитилана на чело‑
века однократно. После ингаляции 5 мл соответс‑
твующего раствора с помощью ультразвукового ин‑
галятора «Ротор» (Ротор, Барнаул) определяли уро‑
вень нитрит-иона и малонового диальдегида (МДА)
в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) в течение
первых суток [4].
Изучение аллергизирующих свойств неомитилана
и митилана проводили в соответствии с общеприня‑
той методикой [5]. Для оценки реакции гиперчувс‑
твительности замедленного типа 30 мышей линии
СВА (по 10 животных в группе) сенсибилизировали
однократно подкожно (в основание хвоста) эмуль‑
сией тест-препаратов в полном адъюванте Фрейнда
(1:1) в объеме 60 мкл (300 мкг на мышь). Для приго‑
товления эмульсии использовали физраствор. Жи‑
вотным контрольной группы вводили вместо препа‑
рата 60 мкл адъюванта с физраствором. На 5-е сутки
в подушечку правой лапки мышей вводили 50 мкл
раствора тестируемых веществ на физрастворе в дозе
300 мкг на особь. Контрольным животным вводили
физиологический раствор в аналогичном объеме. Че‑
рез 24 часа регистрировали ответ путем определения
диаметра правой («опытной») и левой («контроль‑
ной») лап. Индекс реакции выражали в процентах
прироста диаметра.
Для оценки аллергических реакций немедленного
типа выполняли конъюнктивальную пробу. Мышей
линии СВА однократно сенсибилизировали путем
внутрибрюшинного введения тест-препаратов в дозе
300 мкг на особь. В каждой группе было по 6 живот‑
ных. Для постановки пробы 1 каплю водного раство‑
ра исследуемых веществ (300 мкг) вводили глазной
пипеткой под верхнее веко мыши. Через 15 мин учи‑
тывали реакцию и оценивали ее визуально по четы‑
рехбалльной шкале.
Статистическую обработку данных выполня‑
ли с помощью программы SigmaPlot 3.02 (Jandel
Corporation, США).
Результаты исследования. Наблюдение в течение
12 дней позволило установить, что неомитилан не‑
токсичен для мышей при внутрибрюшинном введе‑
нии в дозах от 78,1 до 2500 мг/кг. При действии нео­
митилана на спленоциты жизнеспособность клеток
изменялась в зависимости от концентрации препа‑
рата в пределах 75,4–100%, что является допустимым
в экспериментах in vitro. Следовательно, неомитилан
не демонстрировал цитотоксической активности в
широком диапазоне доз – от 0,97 до 1000 мкг/мл.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
34
Кол-во животных
Активность1, %
Контроль
3
100,00
Митилан
3
142,16±3,67
Неомитилан
3
304,26±3,91
1
m±SE – средняя и стандартная ошибка средней.
Таблица 2
Определение влияния неомитилана и митилана
на формирование АФК
Группа
Кол-во животных
АФК1, %
Контроль
3
100,00
Митилан
3
200,11±4,95
Неомитилан
3
148,15±5,86
1
m±SE – средняя и стандартная ошибка.
Установлено статистически достоверное увели‑
чение лизосомальной активности перитонеальных
макрофагов мышей на 4-й день после инъекции тестпрепаратов в дозе 300 мкг на особь. Под действием
митилана лизосомальная активность увеличивалась
примерно на 40% по сравнению с контролем. В случае
использования неомитилана в той же дозе лизосомаль‑
ная активность макрофагов увеличивалась примерно в
3 раза по сравнению с активностью макрофагов конт‑
рольных мышей и более чем в 2 раза по сравнению с
активностью под действием митилана (табл. 1).
При внутрибрюшинной инъекции митилана и не‑
омитилана в дозе 300 мкг на особь наблюдалось статис‑
тически достоверное увеличение АФК по сравнению с
контролем в 2 и в 1,5 раза соответственно (табл. 2).
Показано, что тестируемые соединения способны
стимулировать фагоцитоз перитонеальных мышиных
макрофагов in vitro. Максимальная стимулирующая
концентрация была 10 мкг/мл, при которой за 2 часа
инкубации происходила стимуляция фагоцитоза на
25–30%. При исследовании противовоспалительных
свойств неомитилана у всех курящих добровольцев, у
которых вследствие патогенного воздействия табачно‑
го дыма повышен уровень ПОЛ и активности нитрок‑
сидсинтазы в среднем в 2–2,5 раза по сравнению с не‑
курящими, в течение первых 3–5 часов после ингаля‑
ции неомитилана наблюдалось достоверное снижение
уровня этих показателей в КВВ. Так, концентрация
нитрит-иона уменьшалась на 35 и 75% и уровень МДА
снижался на 40 и 70% соответственно. Эффект регис‑
трировался и к концу первых суток после ингаляции
неомитилана. Следует отметить, что неомитилан при
ингаляционном введении не обладает пирогенным
эффектом, колебания температуры тела добровольцев
не превышали физиологических значений.
Результаты определения аллергических свойств
свидетельствуют о том, что неомитилан в исследуе‑
Группа
Диаметр лапы, мм
контрольной
опытной
Индекс, %
Группа
Таблица 3
Влияние неомитилана и митилана на гиперергическую
реакцию замедленного типа
Кол-во
животных
Таблица 1
Влияние неомитилана и митилана на лизосомальную
активность перитонеальных макрофагов
Контроль
10
1,9500±0,0522 2,1200±0,0998 8,7
Митилан
10
2,1700±0,0955 3,1900±0,13861 47,1
Неомитилан
10
2,1800±0,1052 2,2700±0,1309 4,12
1
Разница с контролем статистически значима.
мой дозе практически не влиял на выраженность ги‑
перергии замедленного типа у мышей, в то время как
митилан достоверно увеличивал ее индекс на 47,1%
(табл. 3). При конъюнктивальной пробе исследуемые
биогликаны практически не оказывали никакого вли‑
яния на аллергическую реакцию немедленного типа.
Обсуждение полученных данных. Одним из про‑
явлений иммуномодулирующей активности биоло‑
гически активных веществ является их влияние на
функции фагоцитирующих клеток и, в частности, на
лизосомальную активность макрофагов [8]. Изучение
иммуномодулирующих свойств неомитилана показа‑
ло, что он индуцирует более высокую лизосомальную
активность, чем другие полисахариды. Растительные
биогликаны из Acanthopanax sessiliflorus и Angelica si­
nen­sis (Oliv.) Diels увеличивают активность лизосо‑
мальных ферментов не более чем на 230% [11, 14], в то
время как неомитилан – на 304%. Эти полисахариды
не являются гомогликанами и имеют β-гликозидную
связь. В литературе имеются противоречивые данные
относительно того, какие структурные компоненты
(полисахарид или белок) ответственны за проявление
активности. Так, японскими авторами при исследова‑
нии гликогенов (1,4; 1,6-α-D-глюканов), выделенных
различными способами из морского гребешка, сдела‑
но заключение о том, что тонкая структура углеводной
составляющей имеет определяющее значение в сти‑
муляции иммунной системы [13]. В противополож‑
ность этим данным показано, что наличие белковой
компоненты в 1,4; 1,6-α-D-глюканах, выделенных из
морского моллюска Ruditapes philippinarum, усиливает
их антиопухолевое и иммуномодулирующее действие
[15]. В экспериментах по изучению влияния неомити‑
лана и митилана, являющихся гликогеноподобными
1,4; 1,6-α-D-глюканами, на лизосомальную активность
перитонеальных макрофагов показано, что неомити‑
лан, содержащий не более 1,5% белка, проявляет бо‑
лее высокую активность по сравнению с митиланом,
содержание белка в котором может колебаться от 3 до
8%. Однако способность неомитилана к генерации
АФК перитонеальными мышиными макрофагами не‑
сколько ниже.
В последнее время большое внимание уделяется
исследованию КВВ. На сегодняшний день становится
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
очевидным, что состав конденсата отражает биохи‑
мические и воспалительные процессы в дыхательной
системе. Известно, что показателями воспалитель‑
ных процессов в организме являются повышенные
уровни пероксида водорода, монооксида углерода и
усиление интенсивности свободнорадикальных ре‑
акций ПОЛ. Конечные продукты окисления приво‑
дят к образованию биологически активных альдеги‑
дов, в частности, МДА, которые участвуют в даль‑
нейших процессах воспаления. Последний является
прогностически значимой величиной при изучении
ПОЛ [3]. Кроме того, проявления воспалительных
процессов в организме связаны с уровнем метабо‑
литов оксида азота. Оксид азота продуцируется при
участии конституционной нитроксидсинтазы эндо‑
телия сосудов, нейронов, эпителиальных клеток, а
также индуцибельной нитроксидсинтазой [7]. Нами
показано, что уровни метаболитов оксида азота и
МДА в КВВ у курящих людей значительно понижа‑
лись в зависимости от концентрации ингалируемого
неомитилана. По данным литературы, полисахарид,
выделенный из Tinospora cordifolia, также снижает
уровень ПОЛ, повышенный под действием фото‑
возбуждения [10].
При оценке аллергизирующих свойств биоглика‑
нов показано, что неомитилан не обладает провоспа‑
лительным действием, так как не влияет на выражен‑
ность реакции гиперчувствительности замедленного
типа и аллергическую реакцию немедленного типа у
мышей, в то время как митилан, не оказывая никако‑
го влияния на аллергическую реакцию немедленного
типа, существенно увеличивает выраженность гипе‑
рергии замедленного типа.
Таким образом, неомитилан, обладая иммуномо‑
дулирующими и противовоспалительными свойства‑
ми, может служить основой для получения лекарс‑
твенных препаратов, так как в отличие от митилана,
благодаря низкому содержанию белковой составля‑
ющей, не вызывает аллергических реакций.
Работа выполнена по теме «Разработка способа
включения биологически активных субстанций и биоло­
гически активных добавок к пище в молекулярно кап­
сулированные формы, обеспечивающие повышение их
биодоступности и биоэффективности» в рамках госу­
дарственного контракта № 02.522.11.2013.
Литература
1. Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М.:
Мир, 1983. 264 c.
2. Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н., Молчанова В.И. и др.
Сравнительная характеристика иммуномодулирующей
активности биогликанов морского происхождения //Ан­
тибиотики и химиотерапия. 2001. Т. 46, № 7. С. 6–10.
3. Кокоcов А.Н., Гольденбеpг Ю.М., Мищенко В.П. Перекис­
ное окисление липидов и гемостаз на этапах формирова­
ния хронического бронхита и бронхиальной астмы // Пуль­
монология. 1995. № 1. С. 38–40.
4. Корякова А.Г., Кулакова Н.В., Кобелев С.С. и др. Биохими­
ческая оценка эффективности липосомных форм феноте­
рола // Хим. фарм. журн. 2000. № 6. С. 3–5.
35
5. Методические указания по оценке аллергизирующих
свойств фармакологических веществ: руководство по эк­
спериментальному (доклиническому) изучению новых фар­
макологических веществ / Любимов Б.И., Коваленко Л.П.,
Федосеева В.Н. и др. М., 2000. С. 25–32.
6. Методические указания по изучению иммунотропной ак­
тивности фармакологических веществ: руководство по
экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических веществ / Хаитов Р.М., Гущин И.С.,
Пинегин Б.В. и др. М., 2000. С. 257–263.
7. Смирнов А.С., Таганович А.Д. Определение уровня NO2–/
NO3– в концентрате выдыхаемого воздуха. Восстановле­
ние нитратов цинком // Биомед. химия. 2006. Т. 52, № 1.
С. 101–107.
8. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы.
СПб.: Наука, 2001. 390 с.
9. Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. М.: Мир,
1989. 320 с.
10. Desai V.R., Kamat J.P., Sainis K.B. An immunomodulator from
Tinospora cordifolia with antioxidant activity in cell-free sys­
tems // Proc. Indian Acad. Sci. (Chem. Sci.). 2002. Vol. 114,
No. 6. P. 713–719.
11. Jeong S.C., Jeong Y.T., Yang B.K. et.al. Chemical characteris­
tics and immuno-stimulating properties of biopolymers extracted
from Acanthopanax sessiliflorus // J. Biochem. Mol. Biol. 2006.
Vol. 39. P. 84–90.
12. Molecular Probes protocol for the Vybrant Phagocytosis Assay
Kit // Haugland R.P. Handbook of fluorescent probes and re­
search products. 9th Edition, J. Gregory ed., Molecular Probes
Inc., 2002.
13. Takaya Y., Uchisawa H., Ichinohe H. et. al. Antitumor glycogen
from scallops and the interrelationship of structure and antitu­
mor activity // J. Mar. Biotechnol. 1998. Vol. 6. P. 208–213.
14. Yang X., Zhao Y., Wang H. et al. Macrophage Activation by an
Acidic Polysaccharide Isolated from Angelica Sinensis (Oliv.)
Diels // J. Biochem. Mol. Biol. 2007. Vol. 40, No. 5. P. 636–643.
15. Zhang L., Liu W., Han B. et al. Isolation and characterization
of antitumor polysaccharides from the marine mollusk Rudi­
tapes philippinarum // Eur. Food Res. Technol. 2008. Vol. 227.
P. 103–110.
Поступила в редакцию 08.04.2009.
NEOMYTHILANE AS NEW CRENOMYTILUS
GRAYANUS MUSSEL-DERIVED IMMUNE-RESPONSE
MODULATING AGENT
I.V. Chikalovets1, V.I. Molchanova1, D.L. Aminin1,
O.V. Chernikov1, E.A. Pislyagin2, P.A. Lukianov1
1 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS (159,
100‑Anniversary Av. Vladivostok 690022 Russia), 2 Far Eastern
National University (8, Sukhanov St. Vladivostok 690950 Russia)
Summary – The authors present their study into immune-re‑
sponse modulating and anti-inflammatory activities of neo‑
mythilane that is a derivative from the mussels Crenomytilus gray­
anus. Unlike the early mussel-derived polysaccharide mythilane,
this product appears not to exhibit allergenic properties because
it contains 1.5% of protein, at the most. The in vitro experiments
show neomythilane potentiating the macrophage phagocytic
activity by 25–30% and increasing activity of macrophage lyso‑
somal enzymes more than two times, and inducing generation of
active oxygen forms, as compared to mythilane. In this regard,
both mythilane and neomythilane have no toxic properties in vi‑
vo, without exhibiting cytotoxic activity in vitro. As determined,
neomythilane is capable of reducing lipid peroxidation and ni‑
troxide synthase activities. This allows to consider mythilane as a
basis for producing medicines.
Key words: polysaccharides, invertebrates, immune-response mod­
ulating activities.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 32–35.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
36
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
УДК 611.018.83:615.37:[615.322:582.272.46]:577.114
И.Д. Макаренкова1, Н.К. Ахматова2, И.Б. Семенова2, Н.Н. Беседнова1, Т.Н. Звягинцева3
НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 НИИ вакцин и сывороток
им. И.И. Мечникова РАМН (105064 г. Москва, М. Казенный пер., д. 5а), 3 Тихоокеанский институт биоорганической
химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159)
1 СУЛЬФАТИРОВАННЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ ИЗ МОРСКИХ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ –
ИНДУКТОРЫ СОЗРЕВАНИЯ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК
Ключевые слова: дендритные клетки, толл-подобные рецепторы, фукоиданы.
Проведено экспериментальное исследование влияния
сульфатированных полисахаридов – фукоиданов, выде‑
ленных из морских бурых водорослей Laminaria cichorioides
и Laminaria japonica, на созревание дендритных клеток, по‑
лученных из костного мозга мышей. Установлено, что фу‑
коиданы индуцируют экспрессию маркера терминальной
дифференцировки, усиливают экспрессию активационно‑
го маркера, молекул адгезии, поверхностных антигенпред‑
ставляющих, костимулирующих молекул и толл-подобных
рецепторов на мембранах дендритных клеток, что свиде‑
тельствует об их созревании.
Одними из ключевых элементов врожденного им‑
мунитета являются дендритные клетки, способные
распознавать патогенные микроорганизмы и участ‑
вовать в определении направленности и реализации
эффекторных функций [4–6, 8, 9]. Отличительной
чертой дендритных клеток по сравнению с други‑
ми антигенпрезентирующими клетками является их
способность представлять антигены и активировать
наивные Т-клетки [4, 5, 8].
Созревание дендритных клеток является слож‑
ным процессом, который запускается в условиях
инфекции, разрушения тканей и воспаления и ини‑
циируется различными факторами. К ним относятся
патогенассоциированные молекулярные структуры
патогенных микроорганизмов, являющиеся лиганда‑
ми толл-подобных рецепторов (Toll-Like Receptors –
TLR), TNF-подобные сигналы, провоспалительные
цитокины и продукты некроза тканей, в норме от‑
сутствующие в межклеточной среде [4–6, 9, 10].
В последние годы получены данные, свидетельс‑
твующие о том, что иммуномодуляторы микробного
происхождения являются не только индукторами со‑
зревания дендритных клеток, но и влияют на их фун‑
кциональную активность, что определяет направле‑
ние дифференцировки Т-лимфоцитов [1, 6].
Известно, что сульфатированные полисахариды –
фукоиданы из морских бурых водорослей – облада‑
ют выраженной иммуномодулирующей, антикоагу‑
лянтной, противовирусной, противовоспалительной,
противоопухолевой и антибактериальной активнос‑
тью [2, 7, 11]. Однако практически неизученным ос‑
тается их действие на созревание и функциональную
активность дендритных клеток. В 2008 г. за рубежом
появились единичные работы о стимулирующем вли‑
янии фукоидана из бурой водоросли Fucus vesiculosus
Макаренкова Илона Дамировна – канд. мед. наук, старший
научный сотрудник лаборатории иммунологии НИИЭМ СО РАМН;
тел.: 8 (4232) 44-24-46; e-mail: ilona_m@mail.ru.
на экспрессию определенных маркерных генов, свя‑
занных с созреванием дендритных клеток [12, 15].
Целью настоящей работы был анализ влияния фу‑
коиданов, выделенных из морских бурых водорослей
La­mi­na­ria japonica и Laminaria cichorioides на созрева‑
ние дендритных клеток костного мозга мышей.
Материал и методы. Эксперимент выполнен на
30 мышах линии СВА: самцы весом 18–20 г, полу‑
ченные из питомника НЦ биомедицинских техно‑
логий «Андреевка» (Московская обл.). Животные
содержались в стандартных условиях вивария, с
соблюдением правил и международных рекоменда‑
ций Европейской конвенции по защите позвоноч‑
ных животных, используемых в экспериментальных
работах. Исследования проведены с разрешения
комитета по биомедицинской этике НИИ вакцин и
сывороток им. И.И. Меч­никова.
Выделение, изучение химического состава и
структуры фукоиданов из морских бурых водорослей
проведено в Тихоокеанском институте биооргани‑
ческой химии ДВО РАН. Фукоидан, выделенный из
бурой водоросли L. japonica, является α-L-фуканом,
сульфатированным в основном по С-4 остаткам фу‑
козы (молекулярная масса 10–30 кДа), отличается
высоким содержанием галактозы. Моносахаридный
состав представлен галактозой, маннозой, ксилозой
и глюкозой в соотношении 65:20:8:4:3 [14]. Фукои‑
дан, выделенный из бурой водоросли L. cichorioides,
представляет собой полностью сульфатированный и
высокомолекулярный 1→3-α-L-фукан (молекуляр‑
ная масса 40–80 кДа).
Для получения предшественников дендритных
клеток мышей выводили из опыта под эфирным
наркозом. Костный мозг гомогенизировали в среде
RPMI-1640 (Sigma, США), осаждали центрифуги‑
рованием и переводили в обогащенную среду куль‑
тивирования (RPMI-1640 с добавлением 0,1 мг/мл
гентамицина сульфата и 10% термоактивированной
эмбриональной телячьей сыворотки) в концентра‑
ции 106 кл./мл. Для развития незрелых дендритных
клеток в 1-й и на 3-й день к суспензии костного моз‑
га добавляли 80 нг/мл мышиного рекомбинантного
гранулоцитарно-макрофагального колониестимули‑
рующего фактора и 20 нг/мл интерлейкина-4, кото‑
рый при культивировании ингибирует развитие гра‑
нулоцитов и макрофагов.
На 6-е сутки инкубации среду меняли и для ин‑
дукции созревания дендритных клеток вносили
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
фукоиданы (50 мкг/мл) из L. сichorioides и L. japonica.
В качестве положительного контроля использовали
классический индуктор созревания этих клеток –
фактор некроза опухоли-α (Tumor Necrosis Factor‑α –
TNFα) – 20 нг/мл. На 9-е сутки клетки отмывали от
среды культивирования и использовали в экспери‑
ментальных целях. Для определения поверхностных
маркеров, связанных с созреванием, исследовали:
1) незрелые дендритные клетки (контроль),
2) дендритные клетки, созревшие под действием
TNFα (положительный контроль),
3) дендритные клетки, созревшие под действием фу‑
коидана из L. сichorioides,
4) дендритные клетки, созревшие под действием фу‑
коидана из L. japonica.
Определение экспрессии поверхностных мар‑
керов проводили при помощи моноклональных ан‑
тител (Caltag Laboratories, США) против соответс‑
твующих антигенов – кластеров дифференцировки
(Clas­ter of Differentiation – CD): CD34, CD38, CD40,
CD11c, CD86, CD83. Кроме этого исследовали экс‑
прессию молекул главного комплекса гистосовмети‑
мости (Major Histocompatibility Complex – MHC) I и
II класса, F4/80, TLR-2, TLR-4 и TLR-9. Клетки от‑
мывали 2 раза холодным фосфатно-солевым буфером
с 1% эмбриональной телячьей сыворотккой, обраба‑
тывали флуоресцинизотиоционат- и фикоэритринмечеными антителами и фиксировали в фосфатносолевом буфере, содержавшем 1% параформальде‑
гида. Результаты учитывали на проточном цитометре
FacsCalibur (Becton Dickinson, США). Данные анали‑
зировали после выделения логического гейта клеточ‑
ной популяции в dot/plot распределении клеток по их
линейному переднему и боковому светорассеянию.
Анализировали минимум 10000 событий в гейте. Ста‑
тистическую обработку проводили при помощи про‑
граммного пакета WinMdi 2.8 и программы Primer of
Bio­statistics 4.03.
Результаты исследования. Изучение иммунофе‑
нотипа дендритных клеток, полученных из костного
мозга мышей, проводили на разных стадиях созрева‑
ния. Установлено, что добавление сульфатированных
полисахаридов из морских бурых водорослей в среду
культивирования индуцировало созревание клеток, о
чем свидетельствовала экспрессия на их поверхности
маркера терминальной дифференцировки CD83: под
действием фукоиданов из L. сichorioides – 10,27±0,63%
и L. japonica – 16,13±1,45% при отрицательном конт‑
роле. Также отмечено выраженное снижение экспрес‑
сии маркера незрелых дендритных клеток (CD34) на
их поверхности под действием фукоиданов из L. сi­cho­
rioides (0,66±0,33%) и L. japonica (0,24±0,14%), по от‑
ношению к контролю (23,2±0,82%, разница статис‑
тически значима).
Увеличение экспрессии активационного марке‑
ра CD38 под действием фукоиданов из L. сichorioides
(58±3,85%) и L. japonica (63,6±3,84%) по сравнению с
контролем (5,43±0,14%) и молекулы адгезии CD11c
37
указывало на способность созревших дендритных
клеток взаимодействовать с Т-лимфоцитами. При
этом отмечено, что фукоидан из L. cichorioides, спо‑
собствовал достоверно более выраженной экспрес‑
сии молекулы адгезии CD11c (73,63±2,23%) по срав‑
нению с фукоиданом из L. japonica (48,76±7,35%) и
контролем (43,13±0,55%).
Для эффективной активации Т-лимфоцит дол‑
жен получить от антигенпрезентирующей клетки не
только антигенспецифический, но и костимулиру‑
ющий сигнал. Результаты исследования экспрессии
молекул MHC I и II классов показали, что фукои‑
даны из L. сichorioides и L. japonica вызывали значи‑
тельное увеличение экспрессии молекулы MHC II
класса (41,8±2,91% и 44,03±6,73%), по сравнению с
показателями в контроле (19,07±0,63%). На поверх‑
ности дендритных клеток, созревших под действием
фукоиданов из L. сichorioides и L. japonica, показано
статистически недостоверное увеличение экспрессии
CD40 и значительное увеличение экспрессии CD86
(16,2±1,55 и 16,17±1,93% соответственно, контроль –
4,0±0,11%). Это свидетельствовало о способности
созревших дендритных клеток к активации наивных
Т-клеток в эффекторные (рис. 1).
Известно, что TLR являются одними из паттернраспознающих рецепторов дендритных клеток, от‑
ветственных за распознавание структур различных
классов патогенов, что ведет к выработке и переда‑
че сигналов для экспрессии разнообразных генов
иммунного ответа [3, 5, 6, 9, 10]. Результаты иссле‑
дования показали, что фукоиданы способствуют уве‑
личению экспрессии TLR-2 и TLR-4, но не оказы‑
вают влияния на экспрессию TLR-9 на дендритных
клетках. Установлено, что увеличение экспрессии
TLR-2 под действием фукоиданов из L. сichorioides и
L. ja­po­ni­ca составило 26,5±1,04 и 25,8±3,78%, конт‑
роль – 14,8±0,3%, а увеличение экспрессии TLR‑4 –
8,13±0,08 и 7,2±0,89%, контроль – 1,46±0,08%
(рис. 2).
Обсуждение полученных данных. Результаты ис‑
следования указывают на то, что фукоиданы, вы‑
деленные из морских бурых водорослей, являются
индукторами созревания дендритных клеток, о чем
свидетельствуют экспрессия маркера терминальной
дифференцировки (CD83), увеличение экспрессии
поверхностных молекул антигенного представления
(MHC II класса), костимулирующих молекул (CD40
и CD86), молекулы адгезии (CD11с) и активацион‑
ного маркера (CD38), способствующих образованию
иммунного синапса для обмена информации между
антигенпрезентирующими клетками и Т-лимфоци‑
тами и дифференцировке активированных Т-клеток
в эффекторные.
В процессе созревания дендритные клетки теряют
способность захватывать антиген, но приобретают
способность экспрессировать процессированный пеп‑
тидный антиген в контексте собственных молекул MHC
I и II класса. Представление пептида в комплексе
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
38
Рис. 1. Влияние фукоиданов на экспрессию поверхностных молекул дендритных клеток.
с MHC I класса необходимо для активации Т-лимфо‑
циов СD8+, тогда как представление пептида в комп‑
лексе с MHC II класса необходимо для активации
CD4+-лимфоцитов (T-хелперы 1-го типа) [4]. Выра‑
женное увеличение экспрессии молекулы МНС II
класса на поверхности дендритных клеток, созрев‑
ших под действием фукоиданов, является одним из
важных показателей их способности осуществлять
антигенное представление и позволяет предположить
прямое представление этими клетками антигена в
комплексе с MHC II класса CD4+-лимфоцитам. Уве‑
личение же экспрессии костимулирующих молекул
(CD40 и CD86) свидетельствует о том, что получен‑
ные дендритные клетки способны активировать на‑
ивные Т-лимфоциты.
Известно, что направление дифференцировки
CD4+-лимфоцитов зависит не только от характера
возбудителя или антигена, проникшего в организм,
но и от типа паттерн-рецепторов, участвующих в рас‑
познавании патогенассоциированных молекулярных
структур микроорганизмов [3, 6, 10]. Одними из ре‑
цепторов, ответственных за инициацию сигнала и
формирование врожденного иммунитета, являются
TLR, играющие главную роль в распознавании ли‑
гандов различных классов патогенов, а также ряда
эндогенных продуктов, выработке и передаче сигна‑
лов для экспрессии разнообразных генов иммунного
ответа (включая провоспалительные цитокины и ин‑
терферониндуцибельные гены). Кроме того, стиму‑
ляция TLR вызывает созревание дендритных клеток,
что приводит к индукции антигенпредставляющих и
костимулирующих молекул и способствует последу‑
ющей индукции адаптивного иммунного ответа [3, 5,
6, 9, 10, 13].
Усиление экспрессии TLR-2 и TLR-4 на дендрит‑
ных клетках под действием фукоиданов из морских
бурых водорослей свидетельствует, что созревшие
дендритные клетки способны оказывать влияние на
стимуляцию различных защитных эффекторных ме‑
ханизмов врожденного иммунитета и индуцировать
развитие адаптивного иммунного ответа.
Результаты исследования подтверждают, что
сульфатированные полисахариды из L. сichorioides
и L. japonica являются индукторами созревания де‑
ндритных клеток. Следует отметить, что действие фу‑
коиданов на их созревание у мышей было сопостави‑
мо с действием классического индуктора созревания
дендритных клеток – TNFα. В исследованиях Т.С. За‑
порожец [2] показано, что сульфатированные поли‑
сахариды индуцируют синтез и секрецию провоспа‑
лительных цитокинов (TNFα, интерлейкинов 1α и 8)
клетками моноцитарно/макрофагального ряда, что
способствует экспрессии молекул адгезии, активации
нейтрофилов, макрофагов и NK-клеток, усилению
фагоцитоза и пролиферации лимфоцитов, а также
увеличению синтеза γ-интерферона NK-клетками.
Известно, что созревание дендритных клеток ини‑
циируется различными факторами, к которым отно‑
сятся TNF-подобные сигналы и провоспалительные
цитокины [4, 5, 6, 9, 10]. Поэтому способность фуко‑
иданов индуцировать синтез последних, в частности
TNFα, может являться механизмом, который обеспе‑
чивает действие фукоиданов из L. сi­cho­rioi­des и L. ja­po­
ni­ca на созревание дендритных клеток.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
Рис. 2. Влияние фукоиданов на экспрессию TLR.
Полученные результаты согласуются с данными
Mi-Hyoung Kim и Hong-Gu Joo [12]. Было показа‑
но, что фукоидан из морской бурой водоросли Fucus
vesiculosus увеличивает экспрессию молекулы MHC
II класса, молекул адгезии (CD54) и костимуляции
(CD86). Это, по мнению авторов, свидетельствует о
способности фукоидана стимулировать экспрессию
определенных маркерных генов, связанных с созре‑
ванием дендритных клеток.
В работе M. Yang et al. также показано, что фуко‑
идан из F. vesiculosus стимулирует созревание моно‑
цитпроизводных дендритных клеток человека, по‑
вышает экспрессию костимулирующих и антиген‑
представляющих молекул, способствует снижению
эндоцитоза, а также усиливает продукцию этими
клетками фактора некроза опухоли-α и интерлейки‑
на-12. Полученные авторами результаты показыва‑
ют, что фукоидан способствует созреванию дендрит‑
ных клеток и поляризации клеточного Т-хелперного
1-го типа ответа [15].
Таким образом, результаты проведенного экспе‑
римента и данные литературы позволяют считать, что
сульфатированные полисахариды из морских бурых
водорослей, обладающие широким спектром биоло‑
гической активности, являются активаторами систе‑
мы врожденного иммунитета.
Литература
1. Ахматова Н.К. Молекулярные и клеточные механизмы
действия иммуномодуляторов микробного происхожде­
ния на функциональную активность эффекторов врож­
денного иммунитета: автореф. дис. … д-ра мед. наук. М.,
2006. 48 с.
2. Запорожец Т.С. Клеточные и молекулярные механизмы
иммуномодулирующего действия биополимеров морс­
39
ких гидробионтов: дис. … д-ра мед. наук. Владивосток,
2006. 352 с.
3. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С. Врожденные
компоненты иммунитета: Toll-подобные рецепторы в
норме и при иммунопатологии // Журн. микробиол. эпиде­
миол. и иммунобиол. 2005. № 4. С. 96–104.
4. Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Основные свойства де­
ндритных клеток // Иммунология. 2001. № 4. С. 7–16.
5. Пащенков М.В. Пинегин Б.В. Физиология клеток врож­
денной иммунной системы: дендритные клетки // Имму­
нология. 2006. № 6. С. 368–378.
6. Семенов Б.Ф. Зверев В.В. Концепция создания быстрой им­
мунологической защиты от патогенов // Журн. микробиол.
эпидемиол. и иммунобиол., 2007. № 4. С. 93–100.
7. Cumashi A., Ushakova N.A., Preobrazhenskaya M.E. et al. A
comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, an­
tiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoi­
dans from brown seaweeds // Glycobiology. 2007. Vol. 17, No.
5. P. 541–552.
8. Frantz S., Vincent K.A., Feron O., Kelly R.A. Innate immunity
and angiogenesis // Circ. Res. 2005. Vol. 96, No. 1. P. 15–26.
9. Hochrein H.O., Keeffe M. Dendritic cell subsets and toll-like re­
ceptors // Handb. Exp. Pharmacol. 2008. Vol. 183. P. 153–179.
10. Janeway C., Medzhitov R. Innate immune recognition //Annu.
Rev. Immunol. 2002. Vol. 20. P. 197–216.
11. Mandal P., Mateu C.G., Chattopadhyay K. et al. Structural fea­
tures and antiviral activity of sulphated fucans from the brown
seaweed Cystoseira indica //Antivir. Chem. Chemother. 2007.
Vol. 18, No. 3. Р. 153–162.
12. Mi-Hyoung Kim, Hong-Gu Joo. Immunostimulatory effects of
fucoidan on bone marrow-derived dendritic cells // Immuno­
logy Letters. 2008. Vol. 115. Р. 138–143.
13. Takeda K., Akira S. Toll-like receptors in innate immunity //
Int. Immunol. 2005. Vol. 17, No. 1. P. 1–14.
14. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Chizhov A.O. et al. Wa­
ter-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds.
Distribution, structure, and their dependence on the develop­
mental conditions // J. Exp. marine Biol. Ecol. 2003. Vol. 294,
No. 1. P. 1–13.
15 Yang M., Ma C., Sun J. et al. Fucoidan stimulation induces a
functional maturation of human monocyte-derived dendritic
cells // Int. Immunopharmacol. 2008. Vol. 8, No. 13–14.
Р. 1754–1760.
Поступила в редакцию 07.04.2009.
SULPHATED POLYSACCHARIDES DERIVED FROM
SEA BROWN ALGAE AS INDUCING SUBSTANCES FOR
DENDRITIC CELL MATURATION
I.D. Makarenkova1, N.K. Akhmatova2, I.B. Semenova2,
N.N. Besednova1, T.N. Zvyagintseva1
1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the RAMS,
Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087 Russia),
2 I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Serums,
RAMS (5a M. Kazenniy Lane Moscow 105064 Russia), 3 Pacific
Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS (159 100-Anniversary
Av. Vladivostok 690022 Russia)
Summary – The paper presents experimental study into the ef‑
fects of sulphated polysaccharides – fucoidans derived from the
sea brown algae Laminaria cichorioides and Laminaria japonica
on maturation of dendritic cells extracted from the mice bone
marrow. As reported, the fucoidans tend to induce expression
of terminal differentiation markers, intensify activation marker,
adhesion molecules, surface antigen-presenting and bone mar‑
row inducing molecules, as well as Toll-like receptors on the
dendritic cell membranes that appears to be indicative of their
maturation.
Key words: dendritic cells, Toll-like receptors, fucoidans.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 36–39.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
40
УДК 615.37:577.114:[615.322:582.273]
И.М. Ермак1, В.Н. Давыдова1, Д.Л. Аминин1, А.О. Барабанова1, Е.В. Соколова1, Р.Н. Богданович2, А.М. Полякова3,
Т.Ф. Соловьева1
Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159),
Медицинское объединение ДВО РАН (690022 г. Владивосток, ул. Кирова, 95), 3 Центральный НИИ эпидемиологии
(111123 г. Москва, ул. Новогиреевская, 3)
1 2 ИММУНОМОДУЛИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ КАРРАГИНАНОВ ИЗ КРАСНЫХ ВОДОРОСЛЕЙ
ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ МОРЕЙ
Ключевые слова: каррагинаны, цитокины, фагоцитоз, иммунный статус.
В клинике и эксперименте изучено иммуномодулирую‑
щее действие сульфатированных полисахаридов – кар‑
рагинанов, выделенных из красных водорослей семейств
Gigartinaceae и Tichocarpaceae Японского моря. На основе
данных, полученных in vitro, показана зависимость имму‑
номодулирующей активности от структуры полисахаридов.
Наиболее ярко выраженным биологическим эффектом
обладал лямбда-каррагинан. Под его влиянием увеличива‑
лась концентрация ионов кальция в мышиных лимфоци‑
тах, усиливалось формирование активных форм кислорода
в макрофагах и индукция апоптоза в клетках карциномы
Эрлиха. Более высокая способность индуцировать продук‑
цию провоспалительных цитокинов обнаружена у каппа- и
каппа/йота каррагинанов, установлена концентрационная
зависимость цитокининдуцирующей активности от кон‑
центрации полисахаридов. На основе клинических испы‑
таний отмечено положительное влияние каррагинана, ис‑
пользуемого в комплексной терапии больных острыми ки‑
шечными инфекциями, на состояние иммунной системы и
параметры гемостаза.
В ряду веществ, способных восстанавливать функци‑
ональную активность иммунокомпетентных клеток,
особое место отводится растительным полисахари‑
дам, которые могут не только модулировать различ‑
ные свойства иммунной системы, но и обладают
способностью к сорбции радионуклидов, тяжелых
металлов и бактерий, нормализации липидного об‑
мена, активации секретирующей и моторной функ‑
ций кишечника [8, 9, 11]. Реакция иммунной систе‑
мы на пероральное введение полисахаридов не носит
общего характера. Иммунотропное действие некото‑
рых растительных полисахаридов можно отнести к
феномену пищевой толерантности, а ряда других – к
явлению усиления иммунного ответа [2, 10].
Сульфатированные полисахариды красных водо‑
рослей – каррагинаны – относятся к растворимым
пищевым волокнам и внесены в список пищевых
и медицинских продуктов [6, 14]. Среди разнооб‑
разной биологической активности каррагинанов в
настоящее время наибольший интерес привлекают
противоязвенная, антикоагулирующая, противоопу‑
холевая и противовирусная [9, 14]. Биологические
свойства каррагинанов находятся в тесной связи с
их физико-химическими свойствами и структурой,
которая отличается большим разнообразием (к на‑
стоящему времени описано около 20 типов этих со‑
Ермак Ирина Михайловна – д-р хим. наук, в.н.с. лаборатории
молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ ДВО
РАН; тел.: 8 (4232) 31-07-19; e-mail: iren@piboc.dvo.ru.
единений) и блочным строением полимерной цепи,
что определяется родовой принадлежностью водо‑
росли и условиями ее произрастания [7, 9, 14]. Такие
полисахариды полиионной природы, как карраги‑
наны, способны к многоточечному взаимодействию
с поверхностью иммунокомпетентных клеток, что
может обеспечивать модуляцию различных звеньев
иммунной системы. В экспериментах in vivo показа‑
но, что каррагинаны влияют на синтез иммуноцита‑
ми провоспалительных цитокинов, таких как интер‑
лейкин-1, интерлейкин-6 и фактор некроза опухоли
и являются индукторами интерферона – важного
неспецифического фактора защиты организма от
инфекции [12]. Каррагинанам присущи также свойс‑
тва иммуноадъювантов: они способны оказывать как
иммуностимулирующий, так и иммуносупрессорный
эффекты [4, 9]. Однако имеющиеся литературные
данные о физиологической активности каррагинанов
приведены в основном для коммерческих образцов и
в большинстве своем не учитывают структурные осо‑
бенности этих сульфатированных полисахаридов.
Данная работа посвящена анализу иммуномоду‑
лирующего действия каррагинанов различных струк‑
турных типов, выделенных из красных водорослей
дальневосточных морей.
Материалы и методы. Водоросли Chondrus armatus,
Chondrus pinnulatus (Gigartinaceae) и Tichocarpus crinitus
(Tichocarpaceae) были собраны в Японском море (за‑
лив Петра Великого, м. Фальшивый). Полисахариды
выделяли, фракционировали, идентифицировали
методами инфракрасной и 13С-ядерно-магнитно-ре‑
зонансной спектроскопии [1, 13]. Способность кар‑
рагинанов вызывать индукцию синтеза фактора не‑
кроза опухоли и интерлейкинов в опытах in vitro была
определена на основе методики J. Bienvenu at al. [5] и
по схеме, описанной нами ранее [15].
Макрофаги получали из перитонеальной жид‑
кости мышей линии BALB/С, которых выводили из
эксперимента методом перивисцеральной дислока‑
ции. Перитонеальную жидкость инкубировали (37°С,
1 час) в чашках Петри до полного прикрепления мак‑
рофагов ко дну чашек, клеточный монослой трижды
промывали фосфатно-солевым буфером (pH 7,4) и
снимали с поверхности чашек. Рабочая концентра‑
ция составляла 5×106 клеток/мл. Лимфоциты (спле‑
ноциты) получали из селезенки мышей, которую
измельчали в фосфатно-солевом буферном растворе
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
(pH 7,4). Клеточную суспензию пропускали через
нейлоновый газ и полученную взвесь клеток трижды
отмывали фосфатно-солевым буфером, затем цен‑
трифугировали (1500 об./мин, 5 мин) и ресуспензи‑
ровали в необходимом количестве буфера. Конечная
концентрация в растворе – 2–5×106 клеток/мл.
Для определения лизосомальной активности в
макрофагах с помощью флуоресцентного зонда в
каждую лунку 96-луночного планшета вносили по
10 мкл вещества и по 100 мкл суспензии клеток и ин‑
кубировали смесь при 37°С в течение 1 часа. После
этого в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора ак‑
ридинового оранжевого и инкубировали смесь при
37°С в течение 30 мин). Флуоресценцию измеряли
при λex=485 нм и λem=538 нм.
Кальций, являясь одним из основных вторичных
посредников в передаче и усилении внутриклеточ‑
ных сигналов, функционирует как универсальный
ион и ключевой элемент в огромном разнообразии
внутриклеточных процессов, в том числе и в акти‑
вации иммунологических реакций. Для определения
активности ионов кальция в лимфоцитах к суспензии
клеток добавляли 1 мл фосфатно-солевого буфера,
10 мкл флуоресцентного зонда Calcium-green-1/АМ
и инкубировали при перемешивании 1 час в темно‑
те. Затем лимфоциты отмывали от свободного зонда,
центрифугируя их трижды (1500 об./мин, 5 мин). Ре‑
суспензировали клетки раствором фосфатно-соле‑
вого буфера и раскапывали по 10 мкл вещества и по
100 мкл клеток в каждую лунку 96-луночного план‑
шета. Флуоресценцию измеряли при λex=485 нм и
λem=518 нм.
Для детекции активных форм кислорода (пере‑
киси водорода и синглетного кислорода) в перито‑
неальных макрофагах с помощью флуоресцентного
зонда в каждую лунку 96-луночного планшета вноси‑
ли по 10 мкл вещества и 100 мкл суспензии клеток,
инкубировали 1 час. После этого в лунки добавляли
раствор зонда дигидрородамина-123 и снова инкуби‑
ровали при 37°С 10 мин. Флуоресценцию измеряли
при λex=485 нм и λem=518 нм.
Цитотоксическую активность каррагинанов и их
влияние на конденсацию хроматина изучали на мо‑
дели мышиной карциномы Эрлиха. Клетки карцино‑
мы (200 мкл в каждой лунке 96-луночного планшета,
содержащей по 20 мкл тестируемых соединений, ин‑
кубировали при 37°С 1 час. Затем к клеточной суспен‑
зии добавляли 10 мкл концентрированного раствора
Hoechst 33342 (конечная концентрация 5 мкМ) и че‑
рез 5 мин измеряли флуоресценцию при λex=355 нм
и λem=460 нм. Параллельно в смесь суспензии клеток
и тестируемых веществ вносили по 10 мкл водного
раствора этидиума бромида (концентрация 2,5 мкг/
мл), инкубировали при 37°С 10 мин. Интенсивность
флуоресценции измеряли при λex=485 нм, λem=620 нм.
Заключение об индукции апотоза в клетках делали на
основании сравнительного измерения интенсивнос‑
тей флуоресценций.
41
Использовали растворы Эрла и Хэнкса, DMEM,
RPMI-1640, HEPES, EGTA (Sigma, США), трипано‑
вый синий (Flow, США), Fluorescein diacetate, Acridine
orane, Hoechst 33342, Dihydrorhodamine 123, Calcium
Green-1/AM (Molecular Probes, США), фосфатно-со‑
левой буферный раствор («Биолот», Россия).
Изучение терапевтического эффекта каррагинана
при пищевых токсикоинфекциях сальмонеллезной
этиологии проведено на базе Клинической инфек‑
ционной больницы № 2 (г. Москва). Основанием для
клинических испытаний было разрешение Государс‑
твенного комитета РФ по стандартизации, метроло‑
гии и сертификации (№ 035/002158 от 21.06.1999 г.)
на применение каррагинана в качестве пищевой до‑
бавки и согласие этического комитета ЦНИИ эпиде‑
миологии. Проведено динамическое обследование 42
больных (мужчины и женщины, средний возраст – 31
год) с выраженным интоксикационным синдромом.
Пациенты поступали в стационар на 1–3-и сутки бо‑
лезни с признаками интоксикации и обезвоживания:
температура тела – до 38–39°С, озноб, головная боль,
частый (10–15 раз в сутки) жидкий стул, тошнота,
многократная рвота. Каррагинан (смесь каппа- и
лямбда-соединений – 3:1) в течение первых двух су‑
ток вводили per os с раствором хлосоль в дозе 150 мл
за 3 приема 22 больным. Контрольную группу соста‑
вили пациенты, получавшие базовую терапию (соле‑
вые растворы). Результаты оценивали по клиничес‑
ким данным и результатам исследования параметров
систем гемостаза и ммунитета.
Гемостаз характеризовали следующие показатели:
протромбиновое время, тромбиновое время, активи‑
рованное парциальное тромбопластиновое время и
уровень фибриногена F. Для характеристики системы
иммунитета подсчитывали относительное и абсолют‑
ное количество лимфоцитов. С помощью кластеров
дифференцировки (Cluster of Differentiation – CD)
определяли Т-лимфоциты (СD3+), В-лимфоциты
(СD19+), а также иммунорегуляторные субпопуляции:
Т-хелперы (CD4+) и цитотоксические Т-лимфоциты
(CD8+). Исследования проводили методом проточ‑
ной цитометрии на цитометре EPICS XL (Beckman
Coulter) с использованием моноклональных антител
IO-Test (двойная метка). Функциональную актив‑
ность нейтрофилов венозной крови определяли с
помощью спонтанного и стимулированного теста с
нитросиним тетразолием (НСТ-теста) и выражали в
условных единицах.
Результаты исследования. Полисахариды были
выделены из красных водорослей, представителей
семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae и фракцио‑
нированы на желирующие и нежелирующие типы.
Согласно данным спектроскопии, желирующие ти‑
пы полисахаридов из водоросли C. armatus относятся
к каппа-каррагинану, а из T. crinitus и C. pinnulatus –
к гибридным каппа/бета- и каппа/йота-структурам
соответственно [1, 13]. Нежелирующие полисахари‑
ды были представлены как лямбда-каррагинаном,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
42
Таблица 1
Структура каррагинанов из водорослей семейств Gigartinaceae и Tichocarpaceae
Вид
водоросли
Тип1
Структура дисахаридного звена
Мол.
мссса, кДа
каппа, ж
312
лямбда, н/ж
246
C. armatus
C. pinnulatus каппа/йота, ж
420
каппа/бета, ж
380
T. crinitus
икс, н/ж
1
–
ж – желирующие (KCL-нерастворимые фракции) и н/ж – нежелирующие (KCL-растворимые фракции) типы каррагинанов.
Рис. 1. Влияние каррагинанов на концентрацию Ca2+ в ци‑
топлазме лимфоцитов селезенки мышей.
Рис. 2. Влияние каррагинанов на лизосомальную актив‑
ность макрофагов.
так и новым структурным типом – икс-каррагинаном.
Молекулярные массы использованных в работе поли‑
сахаридов находились в пределах 246–420 кДа (табл. 1).
Для исследования иммуномодулирующего действия
каррагинанов разных структурных типов использова‑
ли различные экспериментальные системы.
Присутствие лямбда-каррагинана в инкубацион‑
ной среде в течение 5 мин вызывало увеличение кон‑
центрации кальция в цитоплазме мышиных сплено‑
цитов почти в два раза (рис. 1). Полумаксимальная
эффективная концентрация этого полисахарида,
рассчитанная графическим способом, равнялась
61 мкг/мл. Лямбда-каррагинан оказывал выражен‑
ное воздействие и на макрофаги, активируя процесс
формирования активных форм кислорода на 30% ин‑
тенсивнее по сравнению с контролем.
В экспериментах, позволяющих оценить влияние
препаратов на отдельные стороны поглотительной
способности (фагоцитоза) иммунокомпетентных
клеток, были использованы каррагинаны в концен‑
трации 100 мкг/мл и в качестве образца – липополи‑
сахарид из Escherichia coli. Среди исследованных ве‑
ществ каппа/бета-каррагинан показал наибольшую
эффективность. Он увеличивал активность лизосом
макрофагов мыши на 30%, что выражалось в увели‑
чении размеров органелл, их количестве и степени
закисления. Эффективная концентрация этого кар‑
рагинана, вызывающая полумаксимальный эффект,
была равна 37 мкг/мл. Остальные каррагинаны не
проявляли активности в этом тесте (рис. 2).
Способность каррагинанов активировать клетки и
вызывать в них синтез цитокинов была соотнесена с
активностью митогена – липополисахарида, цитокининдуцирующая активность которого была принята за
100%. Все исследованные образцы каррагинанов прояв‑
ляли цитокининдуцирующую активность, стимулируя
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
а
43
б
Рис. 3. Продукция фактора некроза опухоли-α (а) и интерлейкина-6 (б), индуцированная липополисахаридом (1),
каппа/бета- (2), каппа/йота- (3), каппа- (4), лямбда- (5) и икс-каррагинаном (6).
синтез фактора некроза опухоли-α и интерлейкина-6
мононуклеарными клетками крови человека (рис. 3).
Конденсация хроматина является одним из мар‑
керов наступления апоптоза (запрограммированной
смерти) клеток. При этом важно, чтобы вызывающие
ее препараты не проявляли цитотоксического эф‑
фекта. Среди исследованных соединений ни одно не
оказывало цитотоксического действия, оцененного
в тесте с этидиумом бромидом. В то же время лямб‑
да-каррагинан в концентрации 100 мкг/мл оказывал
существенное влияние на процесс конденсации хро‑
матина в ядрах опухолевых клеток, что регистриро‑
валось по резкому увеличению накопления флуорес‑
центного зонда Hoechst 33342. Это позволяет пред‑
положить, что среди исследованных полисахаридов
лямбда-каррагинан обладает селективным противо‑
опухолевым действием и может рассматриваться как
противоопухолевый препарат.
При исследование параметров системы гемостаза у
18 пациентов с пищевыми токсикоинфекциями были
выявлены признаки гиперкоагуляции (1-я фаза синд‑
рома диссеминированного внутрисосудистого сверты‑
вания крови) и у 24 – симптомы гипокоагуляции (2-я
фаза синдрома). Из плазменных параметров наиболее
информативными оказались значения активирован‑
ного парциального тромбопластинового времени, ко‑
торые также свидетельствовали о гипер- и гипокоагу‑
ляционных процессах у больных при поступлении в
стационар. Как показали результаты, пероральное вве‑
дение каррагинана на фоне стандартной терапии более
активно по сравнению с контрольной группой восста‑
навливало систему гемостаза. На 3-и сутки лечения
с применением каррагинана наблюдалось снижение
лейкоцитоза, уменьшение до нормальных значений ко‑
личества активированных клеток, увеличение относи‑
тельного и абсолютного числа лимфоцитов в перифе‑
рической крови за счет общей популяции T-лимфоци‑
тов и их иммунорегуляторных субпопуляций (табл. 2).
Обсуждение полученных данных. Разнообразный
структурный дизайн каррагинанов обусловливает ши‑
рокий спектр их биологических свойств. Наиболее
ярко выраженным эффектом из исследованных со‑
единений обладал лямбда-каррагинан, повышавший
концентрацию ионов кальция в лимфоцитах, уси‑
ливавший интенсивность формирования активных
форм кислорода в макрофагах и индукцию апоптоза
опухолевых клеток. Высокая активность в этих тестах
лямбда-каррагинана может быть обусловлена высокой
степенью его сульфатирования, что, как было показа‑
но для других полисахаридов, играет важную роль в
проявлении иммуностимулирующей активности [11].
В то же время в экспериментах, позволяющих оценить
влияние выбранных соединений на фагоцитоз имму‑
нокомпетентных клеток, наибольшую эффективность
проявлял каппа-каррагинан, существенно стимулируя
активность лизосом макрофагов мыши.
Способность влиять на продукцию цитокинов в
значительной мере зависела от концентрации карра‑
гинанов и их структуры. В диапазоне 10–1,0 мкг/мл
все типы каррагинанов вызывали повышение уров‑
ней фактора некроза опухоли-α и интерлейкина-6 (по
сравнению со спонтанной индукцией), в то время как
при низкой концентрации они были малоактивны.
Наибольшей цитокининдуцирующей активностью в
области высоких концентраций обладал каппа-кар‑
рагинан, а наименьшей – икс-каррагинан. Подобные
результаты были получены японскими исследовате‑
лями, которые обнаружили высокую индуцирующую
активность желирующих полисахаридов – каппа- и
йота-каррагинанов [12].
Ранее в экспериментах in vivo нами было показа‑
но, что каппа- и лямбда-каррагинаны ингибируют
токсичность липополисахарида грамотрицательных
бактерий и повышают резистентность организма к
действию эндотоксинов [3]. Известно, что гиперре‑
акция иммунной системы на фрагменты бактериаль‑
ных клеток лежит в основе многих воспалительных
заболеваний кишечника, в связи с чем в комплексной
терапии кишечных инфекций показано применение
средств, в том числе растительных полисахаридов,
восстанавливающих нормальную микрофлору [8, 10].
На собственном материале введение каррагинана в
схему стандартной терапии токсикоинфекций спо‑
собствовало коррекции гемостаза. При этом действие
препарата носило модулирующий (регуляторный)
характер: у больных с гиперкоагуляцией отмечалось
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
44
Таблица 2
Иммунологические показатели у больных острыми кишечными инфекциями в динамике на фоне стандартной терапии
и лечения с применением каррагинана
На 3-и сутки терапии
Показатель
Норма
До лечения
(n=42)
с каррагинанами (n=22)
без каррагинанов (n=20)
Контроль
(n=20)
Лейкоциты, абс.×109/л
%
Нейтрофилы
абс.×109/л
%
Лимфоциты
абс.×109/л
%
CD3+
абс.×109/л
%
CD4+
абс.×109/л
%
CD8+
абс.×109/л
CD4/CD8
%
CD19+
абс.×109/л
4,0–8,8
48–75
2,1–5,6
19–37
1,2–3,0
55–75
0,9–2,2
35–65
0,6–1,9
12–30
0,3–0,9
1,2–2,5
5–15
0,12–0,44
8,3±3,3
81,4±8,51
6,8±3,21
13,7±6,91
1,0±0,41
66,4±8,4
0,7±0,31
43,0±20,0
0,5±0,21
22,3±14,5
0,3±0,11
2,2 (0,4–4,8)
15,4±5,1
0,2±0,11
6,6±2,92, 3
60,8±8,93
4,2±2,73
31,5±7,52, 3
2,0±0,72, 3
73,5±7,43
1,4±0,52, 3
45,7±7,4
0,9±0,33
24,5±6,4
0,5±0,2
2,0 (0,9–3,6)
11,7±3,43
0,2±0,12, 3
5,7±1,8
67,8±5,7
3,9±1,3
26,0±5,41
1,37±0,31
74,2±5,2
1,0±0,21
49,8±4,11
0,8±0,3
22,8±5,2
0,4±0,2
2,4 (1,5–3,4)
10,9±4,0
0,2±0,11
6,5±1,5
62,5±11,4
4,12±1,6
34,0±10,6
2,1±0,6
68,7±7,3
1,42±0,3
40,0±17,0
0,8±0,1
25,6±6,0
0,6±0,2
1,6 (1,1–2,5)
12,4±3,5
0,3±0,1
Разница с контролем статистически значима.
Разница с группой «без каррагинанов» статистически значима.
3
Разница с показателями до лечения статистически значима.
1
2
снижение агрегационной активности тромбоцитов
(в среднем на 65%), а у больных с гипокоагуляцией
степень агрегации возрастала (в среднем на 22%). Как
показали клинические испытания в группе пациен‑
тов, принимавших каррагинан, нормализация пока‑
зателей иммунной системы происходила значительно
быстрее, чем в контрольной группе. Достаточно быс‑
трое восстановление показателей иммунной системы
при приеме каррагинана, вероятно, обусловлено его
иммунорегуляторными свойствами.
Полученные данные свидетельствуют о корригиру‑
ющем влиянии каррагинана на параметры системы ге‑
мостаза и показатели иммунной системы у обследован‑
ных больных. Таким образом, структурное разнообра‑
зие выделенных каррагинанов обеспечивает широкий
спектр их иммуномодулирующей активности. Резуль‑
таты проведенных работ позволяют надеяться на эф‑
фективное использование каррагинана в комплексной
терапии различных форм бактериальных инфекций.
Работа поддержана грантом по программе прези­
диума ДВО РАН « Молекулярная и клеточная биология»
и « Фундаментальная наука – медицине».
Литература
1. Барабанова А.О., Ермак И.М., Глазунов В.П. и др. Сравни­
тельная характеристика каррагинанов, выделенных из ве­
гетативной и репродуктивной форм водоросли Tichocarpus
crinitus (Gmel.) Rupr. (Rhodophyta, Tichocarpaceae) // Био­
химия. 2005. Т. 70. С. 430–437.
2. Звягинцева Т.Н., Беседнова Н.Н., Елякова Л.Л. Структу­
ра и иммунотропное действие 1,3; 1,6-β-D-глюканов. Вла­
дивосток: Дальнаука, 2002.
3. Хасина Э.И., Сгребнева М.Н., Ермак И.М., Малеев В.В.
Влияние каррагинана на неспецифическую резистент­
ность мышей при ЛПС-индуцированной эндотоксемии //
ЖМЭИ. 2007. № 2. С. 57–60.
4. Abe T., Kawamura H., Watanable H. et. al. Liver injury due
to sequential activation of natural killer cells and natural kill­
er T cells by carrageenan // J. Hepatol. 2002. Vol. 36, No. 3.
P. 614–623.
5. Bienvenu J., Doche C., Gutowski M. et. al. Production of proin­
flammatory cytokines and cytokines involved in the TH1/TH2
balance is modulated by pentoxifylline // J. Cardiovasc. Phar­
macol. 1995. Vol. 25. P. 80–84.
6. Bixler H.J. Recent developments in manufacturing and marketing
carrageenan. // Hydrobiologia. 1996. Vol. 326/327. P. 35–57.
7. Falshaw R., Richard H., David E. Stevenson. Structural analy­
sis of carrageenans from the red alga, Callophyllis hombroni­
ana Mont. K (Kallymeniaceae, Rhodophyta) // Carbohydr.
Research: 2005. Vol. 340, No. 6. P. 1149–1158.
8. Kilpatric D.C. Immunological aspects of the potential role of di­
etary carbohydrates and lectins in human health // Eur. J. Nutr.
1999.Vol. 38. P. 107–117.
9. Lahaye M., Kaeffer B. Seaweed dietary fibres: structure, physicochemical and biological properties relevant to intestinal physio­
logy // Sciences and Aliments. 1997. Vol. 17. P. 563–584.
10. Popov S.V., Popova G.Yu., Ovodova R.G. et. al. Effects of poly­
saccharides from Silen vulgaris on phagocytes // Int. J. Immu­
nopharmacol. 1999. Vol. 21. P. 617–624.
11. Rosha de Souza M.C., Marques C.T., Guerra Dore C.M. et. al.
Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and
red seaweeds // J. Appl. Phycol. 2007. Vol. 19. P. 153–160.
12. Tadeta K., Irifune K., Tomono K. et. al. Potential activity of car­
rageenan to enhance antibacterial host-defense system in mice
// J. Infect. Chemother. 1995. Vol. 1. P. 59–63.
13. Yermak I.M., Kim Yong Hwan, Titlyanov E.A. et. al. Chemical
structure and gel properties of carrageenan from algae belonging
to the Gigartinaceae and Tichocapaceae, collected from the Rus­
sian Pacific coast // J. Appl. Phycol. 1999. Vol. 11. P. 41–48.
14. Yermak I.M., Khotimchenko Yu.S. Chemical properties, biolog­
ical activities and applications of carrageenan from red algae//
in Recent Advances in Marine Biotechnology (Fingerman M,
Nagabhushanam R. eds). Sci. Publ. Inc. USA-UK. 2003. Vol. 9.
P. 207–255.
15. Yermak I.M., Davidova V. N., Gorbach V.I. et. al. Forming and
immunological properties of some lipopolysaccharide-chitosan
complexes // Biochimie. 2006. Vol. 88. No 1. P. 23–30.
Поступила в редакцию 14.04.2009.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
IMMUNOMODULATING ACTIVITY OF THE FAR
EASTERN SEA RED ALGAE-DERIVED
CARRAGEENANS
I.M. Ermak1, V.N. Davidova1, D.L. Aminin1, A.O. Barabanova1,
E.V. Sokolova, R.N. Bogdanovich2, A.M. Polyakova3,
T.F. Soloviova1
1 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS (159
100‑Anniversary Av. Vladivostok 690022 Russia), 2 Medical
Society, FEB RAS (95, Kirov St. Vladivostok 690022 Russia),
3 Central Research Centre of Epidemiology (3a Novogireevskaya
St., Moscow 111123 Russia)
Summary – Both in clinic and laboratory, the authors have studied
immunomodulating effects of sulphated polysaccharides – carra‑
geenans – derived from the red algae of Gigartinaceae and Ticho‑
carpaceae families (Sea of Japan). In vitro studies allowed to de‑
45
fine dependence between immunomodulating activity and poly‑
saccharides structure. Lambda-carrageenan was deemed to have
the most pronounced biological effect proved to increase calcium
ion concentration in mice lymphocytes, generate active forms of
oxygen in macrophages and induce apoptosis in Ehrlich›s carci‑
noma cells. Kappa and kappa/iota-carrageenans showed higher
capability to induce generation of pro-inflammatory cytokines.
There was concentration dependence between cytokine-induc‑
ing activity and polysaccharide concentration. Clinical testing
allowed to note positive effects of carrageenan used in integrated
treatment of patients suffering from acute enteric infections on the
immune system and hemostatic parameters.
Key words: carrageenans, cytokines, phagocytosis, immunological
status.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 40–45.
УДК 612.112:612.017.1:579.841.11:577.114
Т.П. Смолина1, Т.С. Запорожец1, Р.П. Горшкова2, Е.Л. Назаренко2
НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 Тихоокеанский институт
биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159)
1 РАННЯЯ АКТИВАЦИЯ ЛИМФОЦИТОВ И МОНОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
КОМПОНЕНТАМИ ПРОТЕОБАКТЕРИЙ PSEUDOALTEROMONAS NIGRIFACIENS
Ключевые слова: липополисахарид, полисахарид, морские бактерии, активация лимфоцитов.
Методом двуцветного анализа на проточном цитометре
определяли влияние липополисахарида, выделенного из
морских протеобактерий Pseudo­­altero­mo­nas nigrifaciens, и
его структурных компонентов на раннюю активацию мо‑
нонуклеаров клеток крови человека. Липополисахарид,
О-специфический полисахарид (О-ПС) и олигосахарид
кора (Cor) повышали уровень экспрессии CD69 и CD25
на лимфоцитах CD4+, CD8+, CD16+ и CD69 на моноцитах.
Липополисахарид увеличивал экспрессию CD95 на клетках
CD4+, CD8+, CD16+, а О-ПС и Cor – только на CD4+. Ни
один из исследуемых гликополимеров не вызывал статис‑
тически значимого изменения уровня экспрессии CD38.
О‑ПС и Cor сильнее увеличивали экспрессию активаци‑
онных маркеров на моноцитах и лимфоцитах, чем липопо‑
лисахарид. В большей степени О-ПС и Cor активировали
клетки, способные оказывать цитотоксическое действие.
Морские бактерии являются важной составной час‑
тью морских экосистем и могут быть получены прак‑
тически из каждого образца морской воды и морских
животных. Многие выделенные из морских микроор‑
ганизмов гликополимеры имеют в своем составе уни‑
кальные структурные компоненты и могут оказывать
биологическое действие, нередко более выраженное,
чем аналогичные вещества из наземных организмов,
однако эти полимеры еще недостаточно изучены.
В составе полисахаридов морских протеобактерий
рода Pseudoalteromonas идентифицированы редкие и
необычные N-ациламино- и кислые моносахариды, а
также высшие сахара [1].
Ранее нами было установлено, что кислые капсуль‑
ный и клеточные полисахариды морских микроорга‑
низмов рода Pseudoalteromonas обладают способностью
Смолина Татьяна Павловна - канд. биол. наук, в.н.с. лабора‑
тории иммунологии НИИЭМ СО РАМН; тел.:8 (4232) 44-24-46;
e-mail: tsmol@mail.ru.
блокировать адгезию патогенных микроорганизмов на
клетках животных и человека [4]. Существенное зна‑
чение в обеспечении антиадгезивного действия имеет
наличие в гликополимерах ацетильных групп и/или
углеводной последовательности, состоящей из остат‑
ков D-глюкозы, D-маннозы и D‑глюкуроновой кис‑
лоты [4]. Большую роль в снижении степени адгезии
бактерий липополисахаридом Pseudo­al­te­ro­mo­nas nig­ri­­­fa­
ciens (штамм КММ 156) играет его фрагмент – О‑спе‑
цифический полисахарид (О‑ПС), в то время как дру‑
гой фрагмент – олигосахарид кора (Cor) – не влияет
на процесс адгезии [5].
Липополисахарид (ЛПС) и другие компоненты
бактерий представляют собой биологические сиг‑
нальные молекулы, способные активизировать врож‑
денные и приобретенные системы защиты организма.
Цель настоящей работы: определить влияние ЛПС
P. nig­ri­fa­ciens на активацию лимфоцитов и моноцитов
человека, а также выяснить, оказывают ли стимулиру‑
ющее действие на лимфоциты и моноциты компонен‑
ты ЛПС, лишенные липида А (О-ПС и Cor). Для этого
определяли экспрессию маркеров активации – класте‑
ров дифференцировки (Claster of Dif­fe­ren­tia­tion – CD)
69, 25, 38 и 95 на лимфоцитах. Раннюю активацию мо‑
ноцитов оценивали по экспрессии CD69.
Материал и методы. Гликополимеры получены из
бактерий P. nigrifaciens штамма КММ 156, выделен‑
ного из ткани желудка дальневосточного двустворча‑
того моллюска Crenomytilus grayanus (бухта Троица) и
находящегося в коллекции морских микроорганиз‑
мов (ТИБОХ ДВО РАН). О-ПС, входящий в состав
ЛПС, имеет идентичное строение с капсульным по‑
лисахаридом и состоит из тетрасахаридных повторя‑
ющихся звеньев, содержащих два остатка L-рамнозы,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
46
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
Рис. 1. Влияние гликополимеров, выделенных из морских
протеобактерий P. nigrifaciens, на экспрессию CD69.
Рис. 2. Влияние гликополимеров, выделенных из морских
протеобактерий P. nigrifaciens, на экспрессию CD25.
один остаток 2-ацетамидо-2-дезокси-D-глюкозы и
один остаток 3-О-[(R)-1-карбоксиэтил]-D-глюкозы
(глюколактиловой кислоты) [2]. В состав ЛПС, кроме
О-специфического ПС, входит липид А в аномально
низком количестве и олигосахарид кора.
Материалом для исследования служила перифе‑
рическая кровь с гепарином (25 БД/мл), полученная
от здоровых доноров. Выделение мононуклеаров про‑
водили путем центрифугирования в одноступенчатом
градиенте плотности фиколла-верографина (1,077
г/мл). Клетки доводили до концентрации 2×106/мл.
Культивирование проводили в полной культуральной
среде: RPMI-1640, 0,01 М HEPES, 200 мМ L-глутами‑
на, 100 мг/мл гентамицина. Исследуемые гликополи‑
меры вносили в кровь или в культуру мононуклеаров
в конечной концентрации 20 мкг/мл (оптимальную
дозу определили предварительно). Контрольные про‑
бы инкубировали с полной культуральной средой.
Экспрессию активационных маркеров на повер‑
хности клеток оценивали через 4 и 24 часа методом
двуцветного цитометрического анализа в програм‑
ме Cell Quest на проточном цитометре FACSCalibur
(Becton Dickinson) c использованием моноклональ‑
ных антител к молекулам CD45-FITC/CD14-PE,
СD3-FITC, CD4-FITC, CD8-FITC, CD16-FITC,
CD14-FITC, CD69-PE, CD38-PE, CD25-PE, CD95PE (Beckman Coulter) и соответствующих изотипи‑
ческих контролей. Для корректного исключения из
зоны анализа всех частиц, которые не соответствова‑
ли по размерам и гранулярности живым лимфоцитам,
вводили необходимые логические ограничения в
гистограммы распределения частиц по малоугловому,
боковому светорассеянию и CD45. В каждой пробе
анализировали не менее 10 000 клеток.
Результаты представлены как процент лимфоци‑
тов или моноцитов, экспрессирующих активацион‑
ный маркер. Статистическую обработку полученных
данных проводили методами непараметрической ста‑
тистики с использованием пакета компьютерных про‑
грамм GEOSTAT, которые включали расчет медианы
и квартильного размаха (значения 75-го и 25-го про‑
центилей), а также оценку различий с использованием
критерия Вилкоксона для связанных групп [3].
Результаты исследования. После 4 часов культиви‑
рования крови с любым из гликополимеров – ЛПС,
О-ПС или Соr – количество моноцитов, экспрес‑
сирующих CD69, увеличивалось по сравнению с
контролем. Уровень CD14+CD69+ (в процентах от
CD14+) после стимуляции ЛПС возрастал до 30,23%
(25,69–58,95%) при контрольном значении 21,13%
(17,39–33,50%). Более значительное повышение
экспрессии CD69 на моноцитах вызывали О-ПС и
Cor. Количество моноцитов, экспрессирующих на
мембране CD69, после стимуляции О-ПС достига‑
ло 67,24% (62,44–79,81%), после воздействия Cor –
59,91% (53,71–75,53%). Известно, что лимфоциты
в интактном состоянии не экспрессируют CD69.
После 4 часов инкубации этот маркер появлялся на
контрольных лимфоцитах и лимфоцитах, стимули‑
рованных любым из исследуемых гликополимеров.
Уровень лимфоцитов CD69+ в контроле был невысок:
3,41% (3,55–9,18%), ЛПС увеличивал их количество в
2 раза, а О-ПС и Cor – более чем в 4,5 раза.
Через 24 часа инкубации определяли уровень экс‑
прессии CD69, CD38, CD25 и CD95 на лимфоцитах и
их популяциях (CD4+, CD8+), а также на NK-клетках,
для выявления которых использовали моноклональ‑
ные антитела к CD16. Количество лимфоцитов CD69+
во всех пробах увеличивалось по сравнению с 4-часо‑
вым сроком культивирования. Самый высокий уро‑
вень наблюдали в пробах, стимулированных О-ПС –
23,30% (20,00–31,23%) и Cor – 25,50% (22,90–30,52%).
Статистически значимое увеличение экспрессии
CD69 выявили на Т-лимфоцитах CD4+, CD8+ и на NKклетках (рис. 1). Наиболее значительное повышение
уровня этого маркера CD69 отмечалось на NK-лим‑
фоцитах, активированных О-ПС и Cor.
Доля NK-клеток, экспрессирующих CD69, в
результате активации О-ПС увеличивалась до
72,70±9,90%, инкубирование лимфоцитов с Cor при‑
водило к повышению экспрессии этого маркера до
66,38±7,71% (контроль – 20,29±3,42%). Все исследо‑
ванные гликополимеры статистически значимо уве‑
личивали экспрессию CD25 на всех исследуемых по‑
пуляциях лимфоцитов (рис. 2). Экспрессия CD95 под
действием ЛПС возрастала на клетках CD4+, CD8+
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
и CD16+, в то время как О-ПС и Cor стимулировали
экспрессию этого антигена только на клетках CD4+
(рис. 3). Все исследуемые вещества после 24-часовой
инкубации не приводили к статистически значимому
изменению экспрессии CD38 на лимфоцитах.
Обсуждение полученных данных. В результате ис‑
следования влияния ЛПС P. nigrifaciens и его струк‑
турных компонентов на процесс ранней активации
клеток крови выявлено стимулирующее действие
всех исследуемых гликополимеров на моноциты, Ти NK-лимфоциты человека. Это проявлялось в уве‑
личении экспрессии активационых молекул на мем‑
бранах клеток.
CD69 не экспрессируется на покоящихся лимфо‑
цитах периферической крови, но появляется после
активации лимфоцитов в течение 1–2 часов после
возбуждения. Экспрессия CD69 требует синтеза мат‑
ричной РНК и является очень непостоянной, так как
матричная РНК быстро деградирует под действием
функционального мотива AU-rich [10]. CD69 вов‑
лечен в ранние преобразования лимфоцитов, моно‑
цитов и активацию тромбоцитов. Экспрессируясь
на мембране моноцитов, CD69 действует как сигнал
трансдукции, что приводит к секреции провоспали‑
тельных медиаторов (простагландины Е2 и F1, лей‑
котриен В4) и увеличению продукции оксида азота
[7]. CD69 действует как молекула костимуляции для
Т-клеточной активации и пролиферации, включая
механизм увеличения концентрации внутриклеточ‑
ного Ca++, синтез различных цитокинов и их рецеп‑
торов. Установлена роль CD69 в лизисе, осуществля‑
емом активированными NK-клетками [6].
Все исследуемые вещества уже через 4 часа инку‑
бации с клетками крови увеличивали уровень экс‑
прессирующих CD69 моноцитов и лимфоцитов. При
этом гликополимеры О-ПС и Cor больше влияли на
экспрессию маркера на моноцитах и лимфоцитах,
чем ЛПС. Возможно, ЛПС не оказывал прямого ак‑
тивирующего воздействия на Т-лимфоциты, а дейс‑
твовал опосредованно – через активацию моноцитов,
так как их инкубировали совместно с лифоцитами. Из
литературы известно, что ЛПС не стимулирует экс‑
прессию CD69 на чистых В- и Т-клетках, экспрессия
этого маркера увеличивается лишь при совместном
культивировании В- и Т‑клеток с моноцитами [14].
К примеру, ЛПС Sal­mo­nel­la изначально индуцирует
активацию моноцитов, которые затем активируют
Т‑клетки через В7/CD28-контактзависимый меха‑
низм костимуляции [12]. В процессе стимуляции
пролиферативной активности NK-клеток ЛПС ре‑
гулирующая роль также принадлежит моноцитам [9].
Продолжение инкубации гликополимеров с лим‑
фоцитами до 24 часов приводило к дальнейшему рос‑
ту уровня CD69+-лимфоцитов. Так же как и после
4 часов инкубации, более эффективное действие че‑
рез 24 часа оказывали О-ПС и Cor. Все гликополиме‑
ры активировали обе субпопуляции Т-лимфоцитов:
CD4+ и CD8+. При сравнении процентного содержа‑
47
Рис. 3. Влияние гликополимеров, выделенных из морских
протеобактерий P. nigrifaciens, на экспрессию CD95.
ния экспрессирующих CD69 лимфоцитов в этих суб‑
популяциях отмечено, что CD69-позитивных лим‑
фоцитов было больше среди CD8+-лимфоцитов.
Увеличение уровня экспрессии CD69 на NKклетках (CD16+) индуцировали все исследуемые гли‑
кополимеры, однако более значительный эффект,
когда более 65% NK-клеток относились к популя‑
ции CD69+, наблюдали после воздействия О-ПС и
Cor. Известно, что экспрессия СD69 на NK-клетках
в большей степени связана с их цитотоксической
функцией, в то время как процесс пролиферации
характеризуется экспрессией CD25 [6]. Поскольку
большее количество натуральных киллеров, активи‑
рованных О-ПС и Cor, экспрессировали CD69, а не
CD25, то можно предположить, что эти гликополи‑
меры в большей степени усиливают их цитотоксич‑
ность, а не пролиферацию.
CD69 имеет прямое отношение к активации ге‑
нов, ответственных за синтез интерлейкина-2, и сиг‑
налы, поступающие с CD69, вызывают увеличение
как продукции этого цитокина, так и количества ре‑
цепторов к нему на клетках CD25+ [10], экспрессию
которых принято считать одной из ключевых стадий
процесса активации. ЛПС и его структурные компо‑
ненты увеличивали экспрессию CD25 на обеих суб‑
популяциях Т-клеток (CD4+ и CD8+) и на NK-клет‑
ках. Наиболее значительное увеличение экспрессии
CD25 на популяциях CD4+, CD8+ и CD16+ выявлено
при инкубации лимфоцитов с О-ПС. Большее сти‑
мулирующее воздействие все исследуемые глико‑
полимеры оказывали на лимфоциты CD8+ и СD16+.
С одной стороны, ЛПС, О-ПС и Cor активировали
лимфоциты, характеризующиеся эффекторным
потенциалом, с другой – приводили к увеличению
процентного содержания популяции CD4+CD25+, в
которой присутствуют как пролиферирующие, так
и регуляторные Т-лимфоциты, играющие важную
роль в осуществлении контроля иммунной систе‑
мы путем супрессирования пролиферации эффек‑
торных клеток. Из литературы известно, что ЛПС
увеличивает количество регуляторных Т-лимфоци‑
тов, оказывающих прямое ингибирующее действие
на эффекторные функции NK-клеток, как показано
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
48
на моделях in vit­ro [8, 13]. Однако результаты экс‑
периментов in vi­vo свидетельствуют о том, что ре‑
гуляторные Т-лимфоциты не влияют на продукцию
γ-интерферона натуральными киллерами, стимули‑
рованными ЛПС [8].
CD38 – трансмембранный гликопротеин, пред‑
ставляющий собой фермент, регулирующий концен‑
трацию цитоплазматического кальция, обеспечивает
проводимость сигнала активации в Т-клетки и явля‑
ется регулятором в гуморальном ответе, так как учас‑
твует и в В-клеточной активации. Клетки с высоким
уровнем экспрессии CD38 проявляют низкую проли‑
феративную активность, но обладают высоким потен‑
циалом в продукции интерлейкина-2 и γ‑интерферона.
CD38 обладает сходством с молекулами адгезии – лег‑
ко слущивается с поверхности [12]. Возможно, из-за
этой способности отсутствуют статистически значи‑
мые изменения его экспрессии после введения в куль‑
туру ЛПС или его компонентов. На экспресcию про‑
апоптотического маркера CD95 ЛПС и выделенные из
него компоненты оказывали различное действие. В то
время как ЛПС увеличивал экспрессию CD95 и на
Т‑лимфоцитах (CD4+ и CD8+), и NK-клетках, О-ПС
и Cor оказывали влияние только на CD4+-лимфоци‑
ты, увеличивая количество клеток с CD95. Отношение
CD4+CD95+ к CD4+ было выше в тех случаях, когда
стимуляторами служили О-ПС и Cor, а не ЛПС.
Полученные результаты свидетельствуют о том,
что ЛПС P. nigrifaciens штамма КММ156, выделенно‑
го из моллюска C. grayanus, оказывал активирующее
действие на моноциты, Т- и NK-лимфоциты, увели‑
чивая количество клеток, экспрессирующих актива‑
ционные молекулы: на моноцитах – CD69, на Т- и
NK-клетках – CD69, CD25 и CD95. Гликополимеры
О-ПС и Cor оказывали более сильное влияние на
моноциты и лимфоциты, чем ЛПС. В большей сте‑
пени они активировали клетки, способные оказы‑
вать цитотоксическое действие. Таким образом, вы‑
деленные компоненты ЛПС не только не потеряли
биологической активности, но стали оказывать более
выраженное, чем сам ЛПС, действие, направленное
в большей степени на эффекторные популяции лим‑
фоцитов. В связи с этим представляется перспектив‑
ным дальнейшее исследование этих гликополимеров
для определения возможности их использования в
качестве иммуномодуляторов.
Работа поддерживается грантом РФФИ 08-0412069-офи.
Литература
1. Горшкова Н.М. Таксономические критерии в система­
тике морских аэробных протеобактерий: автореф. дис. …
кaн. биол. наук. Владивосток. 2000. 26 c.
2. Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л., Зубков А.А. и др. Струк­
тура повторяющегося звена кислого полисахарида
Alteromonas haloplanktis KMM156 // Биоорган. химия. 1993.
Т. 19, № 3. С. 327–336.
3. Смолин В.А. Математическое моделирование в геологии и
геофизике (Статистика). Владивосток: ДВГТУ. 2007. 232 с.
4. Смолина Т.П., Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л. и др. Блоки­
рование адгезии Yersinia pseudotuberculosis с помощью поли­
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
сахаридов, выделенных из морских микроорганизмов Pseudo­al­
te­ro­mo­nas // Тихоокеанский мед. журн. 2001. № 2. С. 18–20.
5. Смолина Т.П., Горшкова Р.П., Назаренко Е.Л. и др. Инги­
бирование адгезии прокариотических и эукариотических
клеток липополисахаридом и его фрагментами из морских
протеобактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens КММ156
// Антибиотики и химиотерапия. 2005. № 5–6. С.4–6.
6. Clausen J., Vergeiner B., Enk M. et al. Functional significance
of the activation-associated receptor СD25 and CD69 on hu­
man NK-cells and NK-like T-cells // Immunobiology. 2003. V.
207, No. 2. P. 85–93.
7. De Maria R., Cifone M.G., R. Trotta R. et al. Triggering of hu­
man monocyte activation through CD69, a member of the natu­
ral killer cell gene complex family of signal transducing recep­
tors // Exp. Med. 1994. Vol. 180. P. 1999–2004.
8. Ghiringhelli F., Menard C., Terme M. et al. CD4+CD25+ Tregu­latory cells inhibit natural killer cell functions in a trans­
forming growth factor-β-dependent manner // Exp. Med. 2005.
Vol .202, No. 8. P. 1075–1085.
9. Goodier MR, Londei M. Lipopolysaccharide stimulates the prolifera­
tion of human CD56+CD3 NK cells: a regulatory role of monocytes
and IL10 // Immunology. 2000. Vol. 165, No. 1. P. 139–147.
10. Marzio R., Mauёl J., Betz-Corradin S. CD69 and regulation
of the immune function // Immunopharmacol Immunotoxicol.
1999. Vol. 21, No. 3. P. 565–582.
11. Mattern T., Flad H., Brade L. et al. Stimulation of human Tlymphocytes by LPS is MHC unrestricted but strongly dependent
on B7 interaction // Immunology. 1998. Vol. 160. P. 3412–3418.
12. Sandoval-Montes C., Santos-Argumedo L. CD38 is expressed
selectively during the activation of a subset of mature T-cells
with redused proliferation but improved potential to produce cy­
tokines // Leukocyte Biology. 2005. Vol. 77. P. 513–521.
13. Trzonkowski P.E., Szmit J., Mysliwska A. et al. CD4+CD25+
T regulatory cells inhibit cytotoxic activity of T CD8+ and NK
lymphocytes in the direct cell-to-cell interaction // Clin. Immu­
nol. 2004. Vol. 112. P. 258–267.
14. Vilanova M., Tavares. D., Ferreira P. et al. Role of Monocytes in
the Up-Regulation of the Early Activation Marker CD69 on B and
T Murine Lymphocytes Induced by Microbial Mitogens Scandi­
navian // Immunology. 1996. Vol. 43, No. 2. P. 155–163.
Поступила в редакцию 15.04.2009.
EARLY ACTIVATION OF HUMAN PERIPHERAL BLOOD
LYMPHOCYTES AND MONOCYTES BY COMPONENTS
OF PROTEOBACTERIA PSEUDOALTEROMONAS
NIGRIFACIENS
T.P. Smolina1, T.S. Zaporozhets1, R.P. Gorshkova2, E.L. Nazarenko2
1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the RAMS,
Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087 Russia),
2 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS
(159 100-Anniversary Av. Vladivostok 690022 Russia)
Summary – Applying bicolour flow cytometry technique by FACS­
Calibur (Becton Dickinson), the authors have determined effects
produced by lipopolysaccharide derived from the sea proteobacte‑
ria Pseudoalteromonas nigrifaciens and its structural components
on the early activation of human mononuclear blood cells. Lipo‑
polysaccharide, O-specific polysaccharide (O-PS) and oligosac‑
charide cor (Cor) increased the CD69 and CD25 expression on
the CD4+, CD8+, CD16+ lymphocytes and on the CD69 expres‑
sion monocytes. Lipopolysaccharide increased CD95 expression
on the CD4+, CD8+, CD16+ cells; OP-S and Cor increased the
CD4+ expression. None of the glycopolymers under study induced
statistically significant changes in the CD38 expression. Com‑
pared to the polysaccharide, O-PS and Cor caused more intense
increase of activation marker expression on the monocytes and
lymphocytes. To a greater extent, O-PS and Cor activated cells
capable of producing cytotoxic effect.
Key words: lipopolysaccharide, polysaccharide, sea bacteria, lym­
phocyte activation.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 45–48.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
49
УДК 543.422.3:615.322.073
В.М. Колдаев1, В.В. Ващенко1, Г.Н. Бездетко2
Владивостокский государственный медицинский университет (690950 г. Владивосток, пр-т Острякова, 2),
Горнотаежная станция ДВО РАН (692533 Приморский край, Уссурийский р-н, с. Горнотаежное, ул. Солнечная, 26)
1 2 ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ АБСОРБЦИОННЫХ СПЕКТРОВ ЭКСТРАКТОВ ИЗ РАСТЕНИЙ
Ключевые слова: абсорбционные спектры, экстракты, лекарственные растения.
Описана авторская методика определения дополнитель‑
ных фотометрических параметров абсорбционных спек‑
тров экстрактов из растений. Совокупность этих пара‑
метров может служить количественной характеристикой
экстракта и использоваться в производственной практике
при контроле производства лекарственных средств из рас‑
тительного сырья.
В фармации для исследования свойств экстрактов из
лекарственных растений широко используются оп‑
тические спектроскопические методы, включенные
в Российскую и Международную фармакопеи [2, 3].
Благодаря своей относительной простоте наиболь‑
шее применение из них нашли методы абсорбцион‑
ной спектрофотометрии в ультрафиолетовой и види‑
мой областях оптического спектра, основанные на
поглощении веществом энергии света [1, 4].
В практической абсорбционной спектроскопии
экстрактов, настоев и других жидких извлечений из
растений на спектрофотометре обычно регистриру‑
ют зависимость оптической плотности раствора от
длины волны света, т.е. кривую поглощения, которую
принимают за спектр поглощения, или абсорбцион‑
ный спектр (АС) [5–7].
Спектр поглощения растворов может иметь один
или несколько максимумов. Для описания таких
спектров используются стандартные фотометричес‑
кие параметры:
• максимальная оптическая плотность, или спектро‑
фотометрический максимум поглощения ( ), и со‑
ответствующая ему длина волны ( );
• ширина полосы поглощения ( ), равная разности
длин волн справа ( ) и слева ( ) от максимума в
точках (a, b) контура спектральной кривой, где оп‑
тическая плотность составляет половину макси‑
мальной – Dm /2;
• смещение максимума относительно середины поло‑
сы поглощения, или фактор асимметрии (ρ):
• интегральная интенсивность поглощения (S), чис‑
ленно равная площади под контуром спектра в пре‑
делах полосы поглощения (в отн. ед.) и некоторые
другие.
Значения фотометрических параметров АС зави‑
сят от свойств сырья, а также от условий экстрагиро‑
вания и могут использоваться на практике как коли‑
чественные характеристики экстракта.
Колдаев Владимир Михайлович – д-р биол. наук, профессор,
заведующий кафедрой физики, математики и информатики ВГМУ;
тел.: 8 (4232) 45-17-22; e-mail: physics@vgmu.ru.
Когда формы АС близки к колоколообразным
кривым Гаусса, определение λa, λb и других связан‑
ных с ними фотометрических параметров основа‑
но на пересечении ветвей спектральной линии на
уровне половины максимума (рис. 1) [6]. Однако за‑
частую спектры поглощения жидких извлечений из
лекарственных растений значительно отличаются от
гауссовских кривых; тогда восходящую и нисходя‑
щую ветви спектральной линии на уровне полови‑
ны максимума пересечь нельзя (рис. 2) и, соответс‑
твенно, невозможно определить такие стандартные
фотометрические параметры АС, как λa, λb , Δλ, ρ, S.
В этом случае для определения фотометрических
параметров спектра требуются иные методические
подходы, разработка которых и явилась целью на‑
шей работы.
Материал и методы. Обработку АС жидких извле‑
чений из растений предлагается проводить в следу‑
ющем порядке. Прежде всего, зарегистрированные
Рис. 1. Спектр поглощения 10% настойки корней бадана
толстолистного (Bergenia crassifolia).
По горизонтали: – длина волны, нм; по вертикали: D – оптическая
плотность, отн. ед.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
50
2) ширина (Δλ) полосы поглощения:
Δλ=λ1–λ2;
3) коэффициент горизонтальной асимметрии (КГА),
характеризующий сдвиг максимума поглощения в
сторону больших или меньших длин волн:
КГА=
2λm–(λ1 +λ2)
;
λ1 –λ2
4) коэффициент вертикальной асимметрии (КВА), по‑
казывающий соотношение ординат точек перегиба:
КВА=
Рис. 2. Нормированный спектр поглощения экстракта
корневищ солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis).
По горизонтали: – длина волны, нм; по вертикали: D – оптическая
плотность, отн. ед.
спектры для удобства их сравнения и сопоставления
целесообразно нормировать по наибольшему из мак‑
симумов спектральной кривой. Для этого вычисля‑
ется коэффициент нормировки (Kn=1/Dm) и спектр
представляется в виде:
Dn(λ)=KnD(λ),
где Dmn=1 – нормированный максимум при соответс‑
твующей ему длине волны λm (рис. 2).
Важно отметить, что нормированный АС не за‑
висит от концентрации экстрактивных веществ,
которая на практике известна не всегда достаточно
точно.
Для определения других параметров спектра не‑
обходимо выбрать соответствующие опорные точ‑
ки, характерные для спектральной кривой (точки на
уровне половины максимума не годятся, как указано
выше). Наиболее подходящими, на наш взгляд, яв‑
ляются точки перегиба спектральной линии справа и
слева от максимума (точки 1 и 2 на рис. 2). Координа‑
ты правой (λ1 ; D1) и левой (λ2 ; D2) от максимума точек
перегиба определяются методами математического
анализа, а затем вычисляются следующие фотомет‑
рические параметры:
1) наклон или крутизна правой (df1) и левой (df2) вет‑
вей спектральной линии (δλ – шаг спектрометрии):
df1=
D(λ1 –δλ)–D(λ1 +δλ)
,
2δλ
df2=
D(λ2 –δλ)–D(λ2 +δλ)
;
2δλ
D2–D1
;
Dm
5) интегральная интенсивность поглощения (S), чис‑
ленно равная площади, ограниченной спектральной
линией в пределах полосы поглощения.
Кроме того, вычисляется удельное поглощение
(
), которое является фармакопейным показате‑
лем поглощения для растворов лекарственных ве‑
ществ [2].
Безусловно, предлагаемый способ определе‑
ния фотометрических параметров требует кропот‑
ливой вычислительной работы. Но, учитывая, что
программное обеспечение современных цифровых
спектрофотометров [8] совместимо с компьютер‑
ными операционными системами, в частности с
Windows, вычисления можно автоматизировать. Для
этого нами разработана специальная прикладная
программа, в которой использованы стандартные
алгоритмы численного дифференцирования и ин‑
тегрирования для нахождения максимумов, точек
перегиба, крутизны и площади S, а также операто‑
ры вычисления коэффициентов горизонтальной и
вертикальной асимметрии и ширины полосы погло‑
щения. Полученные на спектрофотометре данные
достаточно транслировать в электронную таблицу и,
запустив программу, получить значения всех пред‑
лагаемых фотометрических параметров менее чем за
1 секунду.
Результаты исследования и обсуждение полученных данных. Для апробации предлагаемой методи‑
ки обработки АС готовили стандартные настои и
настойки из растений согласно фармакопейным
прописям [2], регистрацию спектров проводили на
цифровом спектрофотометре UV2051PC (Shimadzu,
Япония). Различие между соответствующими фото‑
метрическими параметрами для разных АС считали
значимым, когда оно составляло не менее 5%.
Абсорбционные спектры настоев и настоек из
разных частей растений различных семейств ма‑
ло отличались по стандартному параметру λm, но
по предлагаемым параметрам отмечалось замет‑
ное различие. Так, настои и настойки почек березы
маньчжурской по горизонтальной и вертикальной
асимметрии отличались на 21–23%, а по интеграль‑
ной интенсивности поглощения S – на 8,6%.
Примерно такие же результаты получены и для
аналогичных извлечений из веток. Фотометричес‑
кие параметры абсорбционного спектра настойки
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
0,168 26,36
0,151 16,51
0,168 14,85
1,319 0,758 26,91 266 0,808 288 –0,0173 0,976 260 0,0052 28 –0,571
1,051 0,951 1,05 276 0,719 286 –0,0554 0,871 268 0,0232 18 –0,111
1,787 0,559 3,57 276 0,753 286 –0,0512 0,920 270 0,0192 16 –0,250
2,412
0,958
0,598
2,327
0,670
0,434
0,808
1,725
Почки, настойка
Ветки, настой
Ветки, настойка
Листья, настойка
Листья, настой
Семена, настой
Семена, настойка
Листья, настойки
Листья, настой
Семена, настой
Семена, настойка
Калужница лесная
(Caltha silverstris)
Укроп пахучий (Anethum
graveolens)
Зонтичные (Apia­ceae)
Адонис амурский (Adonis
amurensis)
Донник лекарствен­ный
(Melilotus of­fi­ci­na­lis)
Бобовые (Fa­ba­ceae)
Лютиковые
(Ranunculaceae)
Береза маньчжурская
(Betula mandshurica)
Березовые (Be­tu­la­ceae)
0,414
1,044
1,672
0,429
1,492
2,302
1,236
0,579
25,09
9,77
1,31
14,42
6,97
4,43
1,17
6,90
268
264
236
238
324
320
274
276
0,948
0,871
0,831
0,624
0,595
0,664
0,652
0,675
272
272
250
252
360
352
286
286
–0,0191
–0,0291
–0,0254
–0,0435
–0,0208
–0,0223
–0,0511
–0,0706
0,955
0,868
0,996
0,813
0,912
0,902
0,978
0,858
262
250
234
228
308
308
270
270
0,0141
0,0141
0,0024
0,0287
0,0108
0,0133
0,0086
0,0327
10
22
16
24
52
44
16
16
0,200
0,006 9,82
0,273 –0,002 20,93
–0,750
0,165 15,14
–0,167
0,189 21,23
–0,384
0,317 46,29
–0,454
0,238 39,74
–0,500
0,325 14,19
–0,250
0,183 14,51
0,207 24,27
df2
λ2
D2
df1
λ1
D1
1,022 0,978 10,43 268 0,788 290 –0,0181 0,995 264 0,0031 26 –0,692
51
Почки, настой
КВА
КГА
Δλ
левая
Точка перегиба
правая
λm
Kn
Dm
Сырье, форма
Вид
Семейство
Фотометрические параметры спектров поглощения извлечений из разных частей лекарственных растений различных семейств (обозначения в тексте)
S
Таблица
Оригинальные исследования
и настоя из листьев донника лекарственного разли‑
чались по крутизне в правой точке перегиба и КГА на
10–52%, а по ширине полосы поглощения, КВА и
S – в 2–3 раза. Для абсорбционного спектра настоя
и настойки семян укропа пахучего различие по кру‑
тизне в правой и левой точках перегиба, ширине по‑
лосы поглощения, КВА и S составляло от 14 до 71%,
а по КГА – в 4,5 раза. Параметры КГА и КВА спектров
поглощения извлечений из листьев адониса амурс‑
кого и семян калужницы даурской отличались на
18–77% (табл.).
Таким образом, использование предлагаемых
фотометрических параметров (кроме стандартных
Dm и λm) позволяет установить достоверное различие
спектральных характеристик экстрактов в зависи‑
мости от способа их приготовления, что расширя‑
ет информационные возможности абсорбционной
спектроскопии в видимой и ультрафиолетовой об‑
ластях.
Совокупность предлагаемых параметров в целом
составляет спектрофотометрический паспорт жид‑
ких извлечений из лекарственных растений, кото‑
рый можно использовать как сравнительно простой
тест контроля лекарственных средств из раститель‑
ного сырья в процессе их производства.
Литература
1. Беликов В.Г. Анализ лекарственных веществ фотометри­
ческими методами // Российский химический журнал. 2002.
№ 4. С. 52–56.
2. Государственная фармакопея СССР. Общие методы анали­
за. Вып. 1. М.: Медицина, 1987. 334 с.
3. Международная фармакопея. Т. 1. Женева: ВОЗ, 1981.
386 с.
4. Овчинников М.М., Подгорный Г.Н., Балаховский И.С. Ко­
личественный спектрофотометрический анализ в ультра­
фиолетовой, видимой и ближней инфракрасной областях
// Клиническая лабораторная диагностика. 2002. № 2.
С. 6–11.
5. Плиев Т.Н. Молекулярная спектроскопия. Т. 1. Владикав­
каз: Иристон, 2001. С. 59–72.
6. Пиняжко Р.М., Каленюк Т.Г. Методы УФ-спектрофото­
метрии в фармацевтическом анализе. Киев: Здоров’я, 1976.
158 с.
7. Спектрофотометры УФВИДблИК: UV-2501PC. URL:
http://www.loim.vrn.ru (дата обращения 12.01.2009).
Поступила в редакцию 14.01.2009.
PHOTOMETRICAL PARAMETERS OF ABSORPTION
SPECTRA OF PLANT-DERIVED EXTRACTS
V.M. Koldaev, V.V. Vaschenko, G.N. Bezdetko
Vladivostok State Medical University (2 Ostryakova Av.
Vladivostok 690950 Russia), Gornotayozhnoye Station of FEB
RAS (26 Solnechnaya St. Gornotayozhnoye Settlement Ussuriisk
District 692533 Primorskiy Krai, Russia)
Summary – The authors describe their own methods of identi‑
fying additional photometrical parameters of absorption spec‑
tra of plant-derived extracts. The set of these parameters can
serve as quantitative indicator of extract and be used for pro‑
duction purposes to supervise manufacture of plant-derived
medicines.
Key words: absorption spectra, extracts, medicinal plants.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 49–51.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
52
УДК 615.37:[615.324:596.2].08
Т.И. Пономарева, Ю.И. Добряков
Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева ДВО РАН (690021 г. Владивосток, ул. Балтийская, 43)
ИССЛЕДОВАНИЕ ИММУННЫХ СВОЙСТВ ХАУРАНТИНА ПРИ ИММУНОСУПРЕСCИИ
В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
Ключевые слова: иммуносупрессия, лимфоциты, хаурантин.
В опытах на мышах-гибридах F1(CBA×C57BL/6) исследо‑
вали иммунотропное действие хаурантина – экстракта из
морского гидробионта – по способности влиять на иммун‑
ный ответ у интактных животных и при иммуносупрессии,
вызванной циклофосфаном. Показано, что хаурантин при
введении интактным мышам проявляет иммуностимули‑
рующую и иммунокоррегирующую активность, которая
реализуется через Т-клеточное звено иммунитета. При мо‑
делировании иммунодепрессии хаурантин не влиял на анти‑
телообразование в ранние сроки после введения цитостати‑
ка (через 24 часа) и достоверно повышал в селезенке мышей
уровень антителообразующих и розеткообразующих клеток
в период активного восстановления антителообразования
(через 9 суток). Предполагается, что одним из механизмов
иммуностимулирующего действия хаурантина может слу‑
жить его известная интерфероногенная активность.
Иммунная система, как один из ведущих элементов
гомеостаза, обеспечивает саморегуляцию и нормаль‑
ную жизнедеятельность организма. Исследования
последних лет показали, что любой патологический
процесс в организме сопровождается изменениями
в иммунной системе, глубина которых обусловлена
интенсивностью воздействия [9, 14]. В связи с уве‑
личением психологической нагрузки и неизбежным
воздействием на организм человека возрастающего
потока физических, химических и биологических
воздействий окружающей среды иммунозависимые
заболевания и состояния получают все большее рас‑
пространение в популяции. Повышенный риск воз‑
никновения иммунодефицитных состояний служит
основанием для поиска и применения препаратов,
регулирующих иммунные процессы. В последние го‑
ды пришло понимание необходимости расширения
сырьевой базы для получения лекарственных пре‑
паратов за счет богатейшего разнообразия флоры и
фауны моря. Экстракт из морского гидробионта ас‑
цидии пурпурной (Halocynthia aurantium) хаурантин
(патент RU № 1522487, ТУ 9169-007-20783642-96,
сви­детельство на товарный знак № 236689) – комп‑
лекс биологически активных веществ, основными
структурными компонентами которого являются
фосфолипиды, свободные аминокислоты и поли‑
ненасыщенные жирные кислоты семейства омега-3
[5]. Многокомпонентный состав хаурантина обеспе‑
чивает широкий спектр его фармакологической ак‑
тивности, включающей и регулирующее влияние на
многочисленные нарушения гомеостаза [1, 2]. При
испытании радиопротекторных свойств было выяв‑
Пономарева Татьяна Ивановна – канд. биол. наук, старший
научный сотрудник лаборатории биофизики ТОИ ДВО РАН; тел.:
8 (4232) 31-25-80; e-mail: pti@poi.dvo.ru.
лено, что хаурантин стимулирует пролиферативные
процессы в кроветворной ткани, действуя преиму‑
щественно на клетки, участвующие в иммунной за‑
щите организма – нейтрофилы и лимфоциты [10].
Наличие миелосупрессирующего или миелостимули‑
рующего эффектов служит основанием для исследо‑
вания иммунотропной активности препарата [7, 12],
что и явилось целью настоящей работы.
Материал и методы. Исследования проводили на
мышах-гибридах F1(CBA×C57BL/6) – 100 особей
массой по 18–20 г. Опыты выполнялись с соблюдени‑
ем принципов гуманности, изложенных в директивах
Европейского Сообщества (86/609/ЕС). Анализиро‑
вали влияние хаурантина на развитие иммунного от‑
вета у интактных животных и при медикаментозной
иммуносупрессии у мышей, обработанных циклофос‑
фаном (ЦФ) – 200 мг/кг внутрибрюшинно. В первом
случае животных иммунизировали эритроцитами ба‑
рана (ЭБ) – 2×107 клеток на мышь внутрибрюшинно.
В течение последующих 6 суток внутрижелудочно
вводили хаурантин по 0,4 мл/кг (из расчета 28 мг/кг
сухого остатка). Контрольные животные получали
ежедневно в том же объеме дистиллированную воду.
При моделировании иммуносупрессии мышей им‑
мунизировали ЭБ на следующий день или через 9 су‑
ток после введения ЦФ. Хаурантин вводили внутри‑
желудочно ежедневно в течение всего эксперимента,
начиная со дня иммунизации. Исследование клеточ‑
ного звена иммунитета включало определение попу‑
ляций и субпопуляций лимфоцитов периферической
крови в реакции розеткообразования [3]. О величине
гуморального иммунного ответа судили по количест‑
ву антителообразующих и розеткообразующих клеток
(АОК и РОК) к ЭБ в селезенке и титрам антител к ЭБ
в сыворотке крови мышей [3]. Результаты титрования
выражали в log2 обратных титров антител. Величина
индекса более 1,0 свидетельствовала об иммуниза‑
ции. Животных выводили из эксперимента методом
декапитации под легким эфирным наркозом. Статис‑
тическую обработку результатов проводили с исполь‑
зованием параметрического t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования. Шестидневное введение
хаурантина интактным мышам (контроль) вызывало
достоверное увеличение общего количества лейкоци‑
тов периферической крови и изменение соотноше‑
ния их морфологических форм. Также значимо была
увеличена численность субпопуляции Т-лимфоци‑
тов-хелперов. Введение хаурантина иммунизиро‑
ванным животным приводило к существенному сни‑
жению субпопуляции Т-лимфоцитов, повышенной
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
53
Таблица 1
Влияние хаурантина на показатели иммунокомпетентных клеток мышей-гибридов СВА×С57BL/6
Клетки, 106/мл
Лейкоциты
Нейтрофилы
Моноциты
Лимфоциты
Т-лимфоциты
Т- хелперы
Т-супрессоры
В-лимфоциты
1
2
Условия опыта
контроль
хаурантин
ЭБ
8,12±1,29
2,13±0,20
0,26±0,07
5,15±0,37
1,57±0,11
0,44±0,03
0,16±0,06
1,30±0,20
10,19±2,171
2,67±0,211
0,56±0,071
6,518±0,621
1,46±0,14
0,67±0,041
0,16±0,07
1,47±0,43
10,76±2,141
2,18±0,16
0,90±0,061
7,48±0,351
3,09±0,311
1,32±0,201
0,23±0,081
1,49±0,11
ЭБ + хаурантин
9,19±1,70
1,82±0,102
0,55±0,062
6,39±0,41
2,08±0,302
0,876±0,112
0,21±0,09
1,69±0,23
Разница с контролем статистически значима.
Разница с группой «ЭБ» статистически значима.
Таблица 2
Влияние хаурантина на антителообразование мышей СВА×С57BL/6, обработанных ЦФ
Условия опыта
Кол-во АОК,
тыс./орган
Кол-во РОК,
тыс./орган
log2 титра антител
к ЭБ
Контроль
ЭБ + хаурантин
ЦФ + ЭБ через 1 сут.
ЦФ + ЭБ и хаурантин через 1 сут.
ЦФ + ЭБ через 9 сут.
ЦФ + ЭБ и хаурантин через 9 сут.
25,8±2,4
44,0±4,21
1,1±0,21
1,0±0,21
11,7±0,81, 2
24,1±0,83, 4
350,0±14,0
430,0±10,31
12,3±1,41
14,1±1,81
62,3±4,71, 2
146,5±10,21, 3, 4
5,5±0,2
5,8±0,2
1,0±0,11
1,0±0,11
2,8±0,11, 2
4,3±0,33, 4
Разница с контролем статистически значима.
Разница с группой «ЦФ + ЭБ через 1 сут.» статистически значима.
3
Разница с группой «ЦФ + ЭБ и хаурантин через 1 сут.» статистически значима.
4
Разница с группой «ЦФ + ЭБ через 9 сут.» статистически значима.
1
2
антигенной стимуляции и достоверному (в 1,5 раза)
снижению числа Т-хелперных лимфоцитов (табл. 1).
Введение хаурантина необработанным ЦФ имму‑
низированным мышам достоверно стимулировало
антителообразование и увеличение количества им‑
мунных клеток в селезенке мышей. При иммуниза‑
ции животных на следующий день после введения
ЦФ наблюдалось практически полное подавление
антитело- и розеткообразования в селезенке (до 4 и
3,5% соответственно от иммунизированного контро‑
ля). Введение хаурантина в этих условиях не оказы‑
вало влияния на исследуемые показатели. Иммуни‑
зация же через 9 суток после обработки ЦФ значимо
увеличивала количество АОК (в 11 раз) и РОК (в 5 раз)
в селезенке, а также титры антител к ЭБ в сыворотке
крови мышей. Применение хаурантина в данных ус‑
ловиях приводило количество АОК и титры антител
к уровню иммунизированного контроля, количество
РОК также значительно возрастало, однако не дости‑
гало значений контрольных животных (табл. 2).
Обсуждение полученных данных. Одной из ос‑
новных индикаторных систем при скрининге имму‑
нотропных соединений или при изучении иммуно­
тропности лекарственных веществ является система
иммунного ответа (первичного, вторичного) на ге‑
терогенные эритроциты, обычно ЭБ. Показано, что
на различные химические вещества, в том числе и
лекарственные, в условиях in vitro и in vivo, развивает‑
ся иммунная реакция, которая на клеточном уровне
проявляется ростом числа антигенраспознающих и
антигенпродуцирующих лимфоцитов и их бластных
форм, а на гуморальном – увеличением титра антител,
специфичных вводимым веществам и эндобиотикам
[8, 9, 13, 15]. Интактные животные отреагировали на
6-дневное введение хаурантина как увеличением об‑
щего количества лейкоцитов и их морфологических
форм, так и достоверным увеличением числа имму‑
нокомпетентных клеток. Внутри популяции лимфо‑
цитов наиболее существенным изменениям подвер‑
глась популяция Т-клеток, выполняющих хелперную
функцию, вследствие этого при неизмененном ко‑
личестве Т-супрессоров значимо увеличился имму‑
норегуляторный индекс (Т-хелперы/Т-супрессоры).
Введение хаурантина иммунизированным животным
приводило к достоверному снижению субпопуляции
Т-лимфоцитов и, что очень важно, к снижению (в 1,5
раза) числа Т-хелперов. И хотя сохранялся довольно
высокий уровень этой субпопуляции в перифери‑
ческой крови, иммунорегуляторный индекс прибли‑
жался к физиологической норме. Менее всего были
подвержены действию хаурантина Т-лимфоциты с
супрессорной активностью: на фоне иммунизации
их количество снизилось на 10%. Вместе с тем повы‑
шенные иммунизацией титры антител к эритроцитам
барана (lоg2 5,3) в сыворотке крови мышей сохраня‑
лись на высоком уровне и в группе с хаурантином
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
54
(данные не приводятся). Представленные результаты
свидетельствуют о возможности коррекции хауран‑
тином нарушенного равновесия в соотношении им‑
мунорегуляторных клеток.
Динамика восстановления тимусзависимого им‑
мунного ответа при медикаментозной иммуносуп‑
рессии свидетельствует о том, что эффективность
действия хаурантина зависит от времени иммуниза‑
ции, прошедшего с момента введения цитостатика.
Хаурантин не влиял на антителообразование в ранние
сроки после введения ЦФ и повышал уровень АОК до
уровня иммунизированного контроля в период ак‑
тивного восстановления антителообразования. Ранее
нами было показано, что хаурантин стимулирует ре‑
паративные процессы в кроветворных органах при ра‑
диационном поражении [10]. Известна также способ‑
ность хаурантина влиять на метаболические процессы
при нарушенных функциях организма [6]. Отсутствие
эффекта хаурантина в первые сутки после обработки
животных ЦФ, по-видимому, обусловлено серьезны‑
ми нарушениями в иммунной системе, возникающи‑
ми непосредственно после повреждающего действия
цитостатика и характеризующимися массовой гибе‑
лью лимфоцитов и нарушением функций выживших
лимфоцитов, включая их способность к кооператив‑
ному взаимодействию и рециркуляции [12, 13]. Одним
из возможных механизмов стимулирующего действия
хаурантина на иммунореактивность организма может
быть его интерфероногенная активность [4].
Таким образом, представленные, а также полу‑
ченные нами ранее результаты [11], свидетельствуют
о наличии у хаурантина иммунокорригирующей и
иммуномодулирующей активности, которая реали‑
зуется через Т-клеточное звено иммунной системы.
Хаурантин является уникальным препаратом, пред‑
ставляющим собой сложную композицию природных
веществ, биологические свойства которых могут до‑
полнять друг друга. В частности, если фосфолипиды
рассматривать в качестве субстратов для модифика‑
ции и репарации клеточных мембран (это предполо‑
жение подтверждено работами Добрякова Е.Ю. [2] и
Кушнеровой Н.Ф. [6]), то аминокислоты могут быть
охарактеризованы как стимуляторы регенерации, а
каротиноиды и витамин С – как антиоксиданты.
Представленные данные предполагают дальнейшее
более углубленное исследование иммунных свойств
хаурантина.
Выводы
1. Хаурантин в системе in vivo проявляет иммунокор‑
ригирующее и иммуномодулирующее действие.
2. Иммунокорригирующая активность хаурантина
реализуется через стимуляцию популяции Т-лимфо‑
цитов, в частности, Т-хелперных клеток.
Литература
1. Добряков Ю.И., Добряков Е.Ю., Пономарева Т.И. Ис­
следование фармакологических свойств экстракта из
морского гидробионта – асцидии пурпурной (Halocynthia
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
aurantium) // Дальневосточные моря России. Т. 2. М.: На­
ука, 2007. С. 637–659.
2. Добряков Е.Ю. Фармакологические эффекты экстракта
из туники асцидии Halocynthia aurantium: дис. … канд. мед.
наук. Владивосток, 2004. 147 с.
3. Иммунологические методы / под ред. Г. Фримеля. М.: Ме­
дицина, 472 с.
4. Купин В.И. Элеутерококк и другие биологически активные
модификаторы в онкологии. М.: Медэкспорт, [Б.Г.]. 40 с.
5. Кушнерова Н.Ф., Добряков Ю.И., Янькова В.И. Химичес­
кий состав спиртовых извлечений из туники асцидии пур­
пурной Halocynthia aurantium // Валеология: Диагностика,
средства и практика обеспечения здоровья. Вып. 4. Влади­
восток: Дальнаука, 2000. С. 151–155.
6. Кушнерова Н.Ф., Фоменко С.Е., Лесникова Л.Н. Коррек­
ция стрессовых нарушений метаболизма экстрактом из
туники асцидии (Halocynthia aurantium) // Дальневосточ­
ные моря России. Т. 2. М.: Наука, 2007. С. 671–682.
7. Михайлова А.А., Миелопептиды и их роль в функциони­
ровании иммунной системы // Иммунология. 2001. № 5.
С. 16–18.
8. Нел А.И. Активация Т-лимфоцитов, опосредованная ре­
цептором антигена // Аллергология и иммунология. 2005.
Т. 6, № 3. С.15–28.
9. Новиков Д.К., Новикова В.И. Оценка иммунного статуса.
М.: Медицина, 1996. 248 с.
10. Пономарева Т.И. Изучение радиомодифицирующего эф­
фекта препаратов природного происхождения // Валеоло­
гия: Диагностика, средства и практика обеспечения здо­
ровья. Вып. 3. Владивосток: Дальнаука, 1996. С. 112–115.
11. Пономарева Т.И., Добряков Ю.И. Влияие хаурантина на
некоторые иммунологические показатели стрессирован­
ных крыс // Нейроиммунология. 2007. Т. 5, № 2. С. 93–95.
12. Сакаева Д.Д., Лазарева Д.Н. Влияние гентамицина на
иммунитет при иммунодефиците и действии иммуномо­
дуляторов // Экспер. и клин. фармакол. 1998. Т. 61, № 3.
С. 50–53.
13. Clements J.L., Boerth N.J., Lee J.R., et al. Integration of T-cell
receptor-dependent signaling pathways by adapter proteins //
Annu. Rev. Immunol. 1999. Vol. 17. Р. 89–108.
14. Padgett D.A., Glaser R. How stress influences the immune re­
sponse // Trends Immunol. 2003. Vol. 24. P. 444–448.
15. Van Oers N.S.T cell receptor-mediated sings and signals gov­
erning T cell development // Semin. Immunol. 1999. Vol.11.
P. 227–237.
Поступила в редакцию 07.04.2009.
EXPERIMENTAL STUDY OF HAURANTIN IMMUNE
PROPERTIES IN CASE OF IMMUNOSUPPRESSION
T.I. Ponomareva, Yu.I. Dobryakov
V.I. Ilichev Pacific Oceanological Institute, FEB RAS
(43 Baltiyskaya St. Vladivostok 690041 Russia)
Summary – The F1 (1CBA X C57BL/6) hybrid mice experi‑
ments allowed to study immune-response modulating effect pro‑
duced by marine hydrobiont-derived haurantin. This substance
appeared to have capability of giving immune response in intact
animals and under immunosuppression caused by cyclophos‑
phan. As reported, when introducing into intact mice, haurantin
tended to exhibit immune-response modulating and immuno‑
correcting activities to be seen via T-cell component of the im‑
mune system. In vitro immunosuppression simulation showed
that haurantin has had no effects on the antibody formation im‑
mediately after injecting cytostatic agent (in 24 hours) but for
certain induced the level of antibody-forming and rosette-form‑
ing cells in mice spleen during the period of active restoration of
the antibody formation (in 9 days). The well-known interferoninducing activities can be deemed as one of the immunomodula‑
tion mechanisms caused by haurantin.
Key words: ummunosupression, lymphocytes, haurantin.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 49–51.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
55
УДК 612.112:612.017.1:577.213/217:[615.324:597.552.51]
Н.Г. Плехова1, Л.Н. Федянина2, Л.М. Сомова1, Н.Н. Беседнова1, Т.К. Каленик2
НИИ микробиологии и эпидемиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (690087
г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 Тихоокеанский государственный экономический университет (690091 г. Владивосток,
Океанский пр-т, 19)
1 ИЗМЕНЕНИЕ МЕТАБОЛИЗМА ФАГОЦИТОВ КРОВИ ПОД ВЛИЯНИЕМ
ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ИЗ МОЛОК ЛОСОСЕВЫХ РЫБ
Ключевые слова: дезоксирибонуклеиновая кислота, нейтрофилы, макрофаги, ферменты.
Комплексное исследование состояния кислородзависи‑
мой системы фагоцитов крови выявило дозозависимое
стимулирующее воздействие ДНК на эти клетки. Оно
проявлялось в способности снижать активность фермен‑
тов, принимающих участие в образовании супероксидно‑
го анионного радикала и, напротив, повышать активность
миелопероксиды – катализатора преобразования аниона
кислорода в перекись водорода. Все это позволяет сделать
вывод, что ДНК молок лососевых обладает антиоксидант‑
ным эффектом в отношении фагоцитов крови. Кроме того,
стимулирующее влияние этого вещества на другие функ‑
ции фагоцитов (внутриклеточное содержание 5’-нуклео‑
тидазы и катионных белков) может стать решающим фак‑
тором, определяющим перспективность применения ДНК
молок лососевых рыб в качестве иммуностимулирующего
средства, так как известно, что катионные белки являются
представителями низкомолекулярных межклеточных регу‑
ляторов, участвующих в процессах сигнализации различ‑
ных физиологических функций организма.
По основным биохимическим параметрам фагоци‑
ты крови – моноциты и нейтрофилы – не имеют
принципиальных отличий от других клеток, однако
характерной особенностью их метаболизма являет‑
ся способность под влиянием различных факторов
экзогенного и эндогенного происхождения к мгно‑
венной активации [1]. Нейтрофилы – короткоживу‑
щие, но многочисленные элементы, и им отведена
главная роль в разрушении внеклеточных патогенов
и их токсинов. Другая группа фагоцитов, произ‑
водных от моноцитов, – макрофаги – относится к
длительноживущим клеткам. В норме большинство
нейтрофилов и моноцитов периферической крови
находятся в состоянии покоя. Способность этих кле‑
ток к стимуляции систем отражает их «готовность» к
осуществлению основных функций: бактерициднос‑
ти, поглощению и перевариванию патогенов, что в
дальнейшем обеспечивает антигенпредставляющие
и иммунорегуляторные функции [1, 8].
Для фагоцитов при фаго-, пино- и экзоцитозе ха‑
рактерно постоянное потребление (интерьеризация)
плазматической мембраны, которое компенсируется
перманентным синтезом ее компонентов. Опреде‑
ление активности эктоферментов мембраны макро‑
фагов, к которым относят аденозинтрифосфатазу и
5`-нуклеотидазу, позволяет оценить степень стимуля‑
ции этих клеток [14]. Также при стимуляции различ‑
ными агентами в фагоцитах наблюдается активация
Плехова Наталья Геннадьевна – канд. биол. наук, в.н.с. лабора‑
тории патоморфологии и электронной микроскопии НИИЭМ СО
РАМН; тел.: 8 (4232) 44-24-34; e-mail: pl_nat@hotmail.com.
ферментных систем, резко возрастают поглощение
кислорода, расход глюкозы, выделение углекислого
газа и молочной кислоты, а цепь таких взаимосвязан‑
ных реакций получила название «дыхательного, или
метаболического взрыва» [10, 12]. Комплексные ис‑
следования различных проявлений реактивности фа‑
гоцитирующих клеток, основанные как на количес‑
твенном определении ферментативной активности,
так и на оценке их способности к активации систем
под влиянием специфического стимулятора, позво‑
ляет подойти к углубленной оценке роли этих клеток
в защите организма.
Современные принципы биофармации базиру‑
ются на оптимальном подборе состава и вида лекарс‑
твенных форм, максимально эффективных с лечеб‑
ной точки зрения при содержании в них минимума
субстанций, обладающих побочными действиями
[5]. Изучение «судьбы» лекарственных средств в ор‑
ганизме – это первый этап исследования активности
биологически активных веществ, который включает
тестирование их свойств на моделях in vitro. К одной
из таких моделей относятся клетки врожденного им‑
мунитета – фагоцитирующие клетки крови (нейтро‑
филы и моноциты).
Цель настоящего исследования: охарактеризовать
метаболическую активность фагоцитов крови после
воздействия на них биологически активного вещест‑
ва – ДНК из молок лососевых рыб.
Материал и методы. В работе использовали ДНК из
молок лососевых рыб, полученную учеными ТИНРОцентра г. Владивостока по оригинальной технологии
[7]. Фракцию фагоцитирующих клеток, способных к
адгезии, получали из гепаринизированной крови до‑
норов [6]. Концентрацию клеток доводили до 2×106
в мл и клеточную суспензию разносили в пробирки
Эпиндорфа. К взвеси клеток добавляли ДНК в кон‑
центрациях от 0,001 до 10 мг/мл. Контакт вещества с
клетками составил 30, 90, 120, 150 и 180 мин. По исте‑
чении времени лейкоцитарная суспензия по 100 мкл
вносилась в лунки плоскодонного планшета в трип‑
летах для каждого образца. После 45 мин инкубации
надосадок отбирался, а клеточный монослой трижды
отмывался физиологическим раствором. Клетки вы‑
сушивали на воздухе и фиксировали в парах форма‑
лина в течение 10 мин.
Определяли активность 5’-нуклеотидазы, для вы‑
явления активности кислородзависимой системы
использовали гистохимический метод с нитросиним
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
56
а
б
в
г
Рис. Активность ферментов фагоцитов крови при их взаимодействии с ДНК.
а – активность 5`-нуклеотидазы; б – НСТ-тест; в – активность лактатдегидрогеназы; г – активность миелоперокcидазы. Ось ординат – ин­
декс стимуляции Т, ось абсцисс – количество внесенной ДНК («звездочкой» обозначена статистическая значимость различий между группами).
тетразолием – (НСТ-тест) и выявляли внутриклеточ‑
ное содержание лактатдегидрогеназы и миелоперок‑
сидазы, а также катионных белков цитоплазмати‑
ческих гранул нейтрофилов [6]. НСТ-тест отражает
степень активации кислородзависимого метаболизма
фагоцитов – функции гексозомонофосфатного шун‑
та и связанной с ним наработки свободных радика‑
лов кислорода [10].
Результаты спектрофотометрического анализа
активности ферментов выражали в виде унифициро‑
ванного показателя – индекса стимуляции, который
вычисляли по формуле:
Т=(Nо–Nk )/Nk×100,
где Т – индекс стимуляции (%), Nk – средний пока‑
затель оптической плотности исследуемого субстрата
в нестимулированных клетках; No - средний показа‑
тель оптической плотности исследуемого субстрата в
стимулированных клетках.
Результаты исследования и обсуждение полученных
данных. Одним из характерных признаков стимуля‑
ции фагоцитов является снижение внутриклеточного
содержания 5`-нуклеотидазы, что позволяет диффе‑
ренцировать активированные и покоящиеся клетки
[3, 14]. Добавление ДНК к монослою фагоцитов со‑
провождалось отчетливым снижением внутриклеточ‑
ного содержания 5`-нуклеотидазы (рис., а). Статис‑
тически значимо показатели отличались от контроля
через 120 мин после внесения вещества в концен‑
трации 0,001, 0,1 и 1 мг/мл (–10,4±1,8, –14,7±1,3 и
–12,6±0,9% соответственно). Минимальные показа‑
тели зарегистрированы через 180 мин после контак‑
та с ДНК (–20,3±1,7, –20,4±1,3 и –18,4±1,1% соот‑
ветственно) и оставались на данном уровне до конца
срока наблюдения. Таким образом, выявлена стиму‑
ляция фагоцитирующих клеток в ответ на введение
ДНК в концентрациях 0,001, 0,1 и 1 мг/мл.
При исследовании фагоцитов было выявлено ста‑
тистически значимое снижение показателей НСТтеста при низких концентрациях вещества (0,0001,
0,001, 0,01 и 0,1 мг/мл) уже после 60 мин контакта
(рис., б). Минимальные значения индекса стиму‑
ляции составили –10,4±0,9, –9,4±0,7, –9,4±0,8 и
–18,5±1,3% соответственно через 120 мин контакта.
Полученные данные указывают на регуляторное ан‑
тиокислительное действие препарата ДНК на кис‑
лородзависимый метаболизм изученной популяции
клеток.
Лактатдегидрогеназа принимает активное участие
в начальном преобразовании углеводов, результатом
которого является субстрат, используемый в образо‑
вании реактивных видов кислорода. Этот фермент
относится к первому комплексу электронно-транс‑
портной цепи и принимает участие в гидролизе [2].
В ответ на введение ДНК активность лактатдегидро‑
геназы в фагоцитах крови уменьшалась при всех кон‑
центрациях, кроме 0,0001 мг/мл (рис., в). Минималь‑
ные показатели при концентрации 0,001 и 0,01 мг/мл
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
57
Таблица
Внутриклеточное содержание катионных белков в фагоцитах после контакта с ДНК (M±m)
Индекс стимуляции после контакта, %1
Концентрация
ДНК, мг/мл
через 45 мин
через 90 мин
через 120 мин
через 150 мин
через 180 мин
0,0001
0,001
0,01
0,1
1
100,00±2,15
98,98±5,14
103,60±4,66
124,00±4,98
174,50±1,50
162,60±1,80
167,50±1,90
172,96±2,26
156,50±2,26
139,80±3,60
52,00±2,20
45,40±5,10
78,60±4,66
65,30±4,64
69,40±2,15
145,00±8,90
165,00±2,15
139,80±8,98
128,60±4,64
187,70±2,15
0,51±0,45
31,02±4,23
6,50±1,67
9,20±0,47
5,10±2,60
1
Разница с контролем (принят за 0) всех данных статистически значима.
были отрицательными и составили –17,6±0,7% через
150 мин и при добавлении ДНК в концентрациях 0,1
и 1 мг/мл – –19,6±1,1 и 13,7±1,2% соответственно
через 180 мин. Отчетливое уменьшение активности
лактатдегидрогеназы в фагоцитах под воздействием
препарата ДНК также подтверждает его антиокси‑
дантное действие и указывает на снижение способ‑
ности этих клеток к продукции реактивных форм
кислорода.
Миелопероксидаза – железосодержащий про‑
теин, являющийся катализатором преобразования
перекиси водорода в гидроксильный радикал из ги‑
похлорной кислоты и супероксидного аниона [10].
Было определено увеличение активности миелопе‑
роксидазы через 150 мин контакта фагоцитов с ДНК
(рис., г). Максимальные показатели отмечались через
180 мин контакта при всех концентрациях: 12,89±0,7,
44,38±3,4, 29,4±1,7, 30,9±2,1 и 28,4±1,7% соответс‑
твенно. Так как миелопероксидаза принадлежит к
системе защиты клеток от чрезмерного образования
реактивных форм кислорода, то можно предполо‑
жить, что ДНК молок лососевых рыб стимулирует
данную систему фагоцитов.
Особенностью нейтрофилов является наличие
в них обширного спектра молекул-эффекторов [9].
В последние два десятилетия отмечается новая тен‑
денция в идентификации широкого массива струк‑
турно и функционально разнообразных полипеп‑
тидов, которые способны выделять эти клетки [13].
Особый интерес вызывают неферментные бактери‑
цидные белки с низкой молекулярной массой, кото‑
рые обладают суммарным положительным зарядом
и бактерицидным действием [11, 13]. Эти протеины
способны играть роль медиатора воспаления, фак‑
тора проницаемости, стимулятора метаболических
процессов и служить источником неспецифических
опсонинов при фагоцитозе, модулируя свертывание
крови и стимулируя зависимый от комплемента ли‑
зис, адгезию и хемотаксис [9, 13].
После контакта фагоцитов с ДНК определено
резкое увеличение внутриклеточного содержания ка‑
тионных белков после 45 мин экспозиции. Макси‑
мальные показатели отмечались через 90 мин. В конце
срока наблюдения обнаруживалось снижение внутри­
клеточного содержания катионных белков до уровня
интактных клеток, что можно объяснить их выделени‑
ем фагоцитами во внеклеточное пространство (табл.).
Полученные данные указывают на отчетливую сти‑
муляцию ДНК синтетической активности фагоцитов.
Известно, что система фагоцитов, являясь звеном
быстрого реагирования, играет важнейшую роль не
только в антибактериальной, но и в противоопухоле‑
вой защите организма, а также в аллергических ре‑
акциях немедленной гиперчувствительности [9]. От
функциональной полноценности данных клеток во
многом зависит генез, течение и исход многих патоло‑
гических состояний [4]. Помимо того, что реактивные
формы кислорода, произведенные стимулированны‑
ми фагоцитами, используются этими клетками для
уничтожения поглощенных микроорганизмов, они
могут вызывать множественное разрушение окружаю‑
щих тканей, поэтому их образование должно быть от‑
регулированным [12]. При стимуляции фагоцитов на
первом этапе происходит образование супероксидно‑
го анионного радикала путем передачи ему электрона
от молекулярного кислорода, тогда как на втором эта‑
пе супероксидный анион преобразуется в следующий
мощный окислительный компонент – перекись во‑
дорода [2, 10]. Комплексное исследование состояния
кислородзависимой системы фагоцитов позволило
выявить выраженное дозозависимое стимулирующее
воздействие ДНК. Оно проявлялось в способности
снижать активность ферментов, принимающих учас‑
тие в образовании супероксидного анионного радика‑
ла, и, напротив, повышать активность миелоперокси‑
ды – катализатора преобразования аниона кислорода
в перекись водорода. Все это позволяет сделать вывод,
что ДНК из молок лососевых обладает антиоксидант‑
ным эффектом в отношении фагоцитов крови. Кроме
того, стимулирующее влияние исследуемого вещества
на функцию фагоцитов может стать решающим фак‑
тором, определяющим перспективность применения
ДНК в качестве иммуностимулирующего средства, в
частности, для повышения естественной резистент‑
ности организма к возбудителям различных инфекци‑
онных заболеваний [3]. Этот факт подтверждают полу‑
ченные нами данные о стимулирующем действии ДНК
на способность фагоцитов выделять во внеклеточное
пространство катионные белки, которые являются
представителями низкомолекулярных межклеточных
регуляторов, участвующих в процессах сигнализации
различных физиологических функций организма.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
58
Литература
1. Клебанов Г.И., Владимиров Ю.А. Клеточные механизмы
прайминга и активации фагоцитов // Успехи совр. биол.
1999. Т. 119, № 5. С. 462–475.
2. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. М.: Мир, 2000.
468 с.
3. Митькин В.В., Волков Н.И., Пшеничникова Т.Я., Су­
хих Т.Г. Действие даназола на активность 5’-нуклеати­
дазы пери­тонеальных макрофагов мышей // Бюл. экп. биол.
и мед. 1992. № 2. С.51–54.
4. Нестерова И.В. Вторичные иммунодефицитные состоя­
ния: cправочник по иммунологии. СПб.: Диалог, 2002. 214 с.
5. Нестерова И.В., Сепиашвили Р.И. Иммунотропные препара­
ты и современная иммунотерапия в клинической иммуноло­
гии и медицине // Иммунология. 2002. Т. 23, № 3. С. 132–138.
6. Определение функциональной активности лейкоцитов пе­
риферической крови в качестве показателя неспецифичес­
кой защиты организма: методические рекомендации / Со­мо­
ва Л.М., Плехова Н.Г., Кондрашова Н.М., Запорожец Т.С.
Владивосток: Полиграфкомбинат, 2005. 24 с.
7. Способ получения ДНК из молок рыб / Гаймула М.А., Кал­
на В.Х., Микстайс У.Я., Эпштейн Л.М. Пат. СССР
№ 915446. Заяв.10.10.1980; опубл. 01.07.1991 г.
8. Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы.
СПб: Наука, 2000. 232 с.
9. Шамова О.В., Сакута Г.А., Орлов Д.С. и др. Действие ан­
тимикробных пептидов из нейтрофильных гранулоцитов
на опухолевые и нормальные клетки в культуре // Цито­
логия. 2007. Т. 49, № 12. С. 1000–1010.
10. Babior B. M. NADPH oxidase: an update // Blood. 1999.
Vol. 93, No. 5. P. 1464–1476.
11. Ferencik M., Stefanovic J. Lysosomal enzymes of phagocytes
and the mechanism of their release // Folia microbial. Praha.
1999. Vol. 24, No. 6. P. 503–575.
12. Forman H.J., Torres M. Reactive oxygen species and cell signal­
ing (Respiratory burst in macrophage signaling) // Am. J. Respir.
Crit. Care Med. 2002. Vol. 166. P. S4–S8.
13. Levy O. Antimicrobial proteins and peptides: anti-infective mole­
cules of mammalian leukocytes // J. Leukocyte Biology. 2004.
Vol. 74. P. 909–925.
14. Livescu A., Manda G., Constantin C. et al. Plasma membrane
potential interferes with the respiratory burst of peripheral granu­
locytes // J. Cell. Mol. Med. 2003. Vol. 7, No. 1. Р. 73–78.
Поступила в редакцию 13.04.2009.
CHANGING METABOLISM OF PHAGOCYTES
IN BLOOD IN RESPONSE TO ACTION OF SALMON
MILT-DERIVED DEOXYRIBONUCLEIC ACID
N.G. Plekhova1, L.N. Fedyanina2, L.M. Somova1,
N.N. Besednova1, T.K. Kalenik2
1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the
RAMS, Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087
Russia), 2 Pacific State University of Economics (19 Okeanskiy Av.
Vladivostok 690091 Russia)
Summary – The paper provides an integrated study into the
state of oxygen-dependent systems of phagocytes in blood. As
shown, there was a dose-dependent stimulating effect produced
by DNA on these cells that appeared to have capability of de‑
creasing activity of ferments that participated in generation of
superoxide anionic radical and, in contrast, increasing activity
of myeloperoxidase being a catalyst of oxygen anion conversion
into hydrogen peroxide. This allowed to consider the salmon
milt DNA to have antioxidative effect with respect to hemato‑
phages. Besides, stimulatory effects of this substance on other
phagocyte functions (intracellular contents of 5’-nucleotidases
and cationic proteins) could be determinative for prospects of
applying the salmon milt-derived DNA as immune-response
stimulating drug because the cationic proteins have been known
to be representatives of low-molecular intracellular regulators
very likely to participate in signalling various physiological
functions of an organism.
Key words: deoxyribonucleic acid, neutrophils, macrophages,
ferments.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 52–55.
УДК 611.61:546.815:[615.324:593.95]-092.9
Е.Ю. Приезжева1, О.А. Лебедько1, Б.Я. Рыжавский2, В.К. Козлов1
1 Хабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН – НИИ
охраны материнства и детства (680022 г. Хабаровск, ул. Воронежская, 49, корп. 1), 2 Дальневосточный государственный
медицинский университет (680000 г. Хабаровск, ул. Муравьева-Амурского, 35 )
ВЛИЯНИЕ ЭХИНОХРОМА А НА СТРУКТУРУ И МЕТАБОЛИЗМ ПОЧЕК 40‑СУТОЧНЫХ БЕЛЫХ КРЫС,
ПОДВЕРГШИХСЯ ПРЕНАТАЛЬНОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ НИТРАТА СВИНЦА
Ключевые слова: свинец, морфология почек, свободнорадикальное окисление.
На модели 40-суточных белых крыс, подвергшихся прена‑
тальному воздействию нитрата свинца, изучено влияние
эхинохрома А на морфологию и функциональные показа‑
тели почек. Определялись показатели свободно-радикаль‑
ного окисления в гомогенатах почек и сыворотке крови.
Нитрат свинца индуцировал оксидативный стресс и де‑
структивные изменения в почках. Эхинохром А предотвра‑
щал формирование этих нарушений.
Соли тяжелых металлов, и прежде всего свинца, яв‑
ляются наиболее распространенными антропоген‑
ными токсикантами [9]. К действию ксенобиотиков
Лебедько Ольга Антоновна – д-р мед. наук, в.н.с., заведующая
клинико-диагностической лаборатории НИИ охраны материнства
и детства Хабаровского филиала ДНЦ физиологии и патологии
дыхания СО РАМН; тел.: 8 (4212) 35-65-91; е-mail: iomid@yandex.ru.
организм особо чувствителен на ранних этапах он‑
тогенеза. При этом почки, как главная экскреторная
структура, являются органом-мишенью [8]. Ранее
на собственной экспериментальной модели отсро‑
ченного внешнесредового дизэмбриогенетического
эффекта нитрата свинца было выявлено участие сво‑
бодных радикалов в патогенезе деструктивных изме‑
нений в почках, что было обусловлено пренатальным
воздействием данного экотоксиканта [5].
Эхинохром А (2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этилна‑
фталиндион-1,4), выделенный из основного пигмента
панцирей морских ежей, обладает мембраностабили‑
зирующими, противовоспалительными, иммуномо‑
дулирующими свойствами, в основе которых лежит
выраженный антиоксидантный антирадикальный
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
59
Таблица 1
Показатели хемилюминесценции гомогенатов почек 40-суточных белых крыс, пренатально получавших нитрат свинца
и эхинохром А (М±m), отн. ед.
Группа
Контроль
2-я группа
3-я группа
1
Ssp
h
Sind 1
S luc
H
Sind 2
0,062±0,004
0,362±0,0211
0,067±0,004
0,479±0,025
3,366±0,1771
0,433±0,020
0,557±0,040
3,740±0,1491
0,494±0,030
0,046±0,004
0,254±0,0101
0,050±0,004
0,634±0,030
5,682±0,287
0,617±0,040
1,295±0,051
8,186±0,6151
1,201±0,053
Разница с контролем статистически значима.
эффект [3, 4, 6, 7]. В доступной литературе мы не
встретили данных о применении эхинохрома А для
коррекции свободнорадикальных нарушений, опос‑
редованных пренатальным воздействием экотокси‑
кантов. Цель настоящей работы состояла в анализе
влияния эхинохрома А на свободнорадикальное
окисление в почках и сыворотке крови, а также на
морфологию почек белых крыс, подвергшихся пре‑
натальному воздействию нитрата свинца.
Материал и методы. Эксперимент выполняли с
соблюдением принципов гуманности, изложенных в
директивах европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и
Хельсинкской декларации. Выведение животных из
эксперимента осуществляли в соответствии с требо‑
ваниями правил проведения работ с использованием
экспериментальных животных (приложение к при‑
казу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977 г.).
Экспериментальные животные – 40-суточные
белые крысы – были разделены на три группы. 1‑я
группа – 37 животных – потомство 6 интактных
самок (контроль). 2-я группа – 60 животных – по‑
томство 7 самок, которым на 17–18‑й день беремен‑
ности через желудочный зонд вводили однократно
0,9–1,1 мл 4% раствора нитрата свинца (200 мг/кг
массы). В 3-й группе – 26 животных – изучалось по‑
томство 3 самок, получавших 1% раствор гистохрома
(Gistochrom), содержащий в 1 мл 0,01 г эхинохрома
и 0,045 г углекислого натрия. Препарат, разведен‑
ный 0,85% раствором NaCl (1:50), в дозе 0,1 мг/кг
дважды вводили беременным самкам внутрибрю‑
шинно: за день до введения нитрата свинца, осу‑
ществлявшегося на 17–18‑е сутки беременности, и
на следующий день после затравки. Все животные
содержались в условиях одного вивария, пищу и во‑
ду получали ad libitum. В 40-дневном возрасте жи‑
вотных выводили из эксперимента с использовани‑
ем эфирного наркоза.
Свободнорадикальное окисление изучали в по‑
чечных гомогенатах и сыворотке крови методом хе‑
милюминесценции. Регистрацию результатов осу‑
ществляли на люминесцентном спектрометре LS 50B
PERKIN ELMER [1, 2]. При исследовании спонтан‑
ной и индуцированной Fe2+ хемилюминесценции оп‑
ределяли: Ssp – светосумму за 1 мин спонтанной хе‑
милюминесценции, величина которой коррелирует
с интенсивностью генерации свободных радикалов;
максимум быстрой вспышки (h) индуцированной
хемилюминесценции, свидетельствующей о содер‑
жании гидроперекисей липидов; Sind 1 – светосумму
за 2 мин индуцированной хемилюминесценции, ве‑
личина которой отражает интенсивность накопления
перекисных радикалов. Также определяли S luc – све‑
тосумму за 1 мин люцигенинзависимой хемилюми‑
несценции, величина которой прямо коррелирует с
содержанием супероксиданион-радикала. Кинетику
хемилюминесценции, инициированную перекисью
водорода в присутствии люминола, анализировали
по двум параметрам: Н – амплитуде вспышки и Sind2 – светосумме за 2 мин, величины которых обратно
коррелируют с перекисной резистентностью биосуб‑
страта (Н) и активностью антиоксидантной антира‑
дикальной защиты (Sind 2). Интенсивность хемилю‑
минесценции, измеренную в милливольтах, рассчи‑
тывали на 1 мг влажной ткани или на 1 мл сыворотки
крови и выражали в относительных единицах.
Для морфологического анализа правую почку экс‑
периментальных животных фиксировали в жидкости
Карнуа, заливали в парафин. Срезы окрашивали гема‑
токсилином и эозином, подвергали обзорному изуче‑
нию, определяли число почечных телец в стандартном
поле зрения, окуляр-микрометром МОВ-15 измеря‑
ли их диаметр. Полученные данные обработаны ста‑
тистически с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования и обсуждение полученных данных. Анализ хемилюминограмм продемонс‑
трировал, что в почках и крови 40-суточных белых
крыс, перенесших пренатальное воздействие нитрата
свинца, в сравнении с аналогичными показателями у
контрольных животных имело место увеличение ин‑
тенсивности процессов свободнорадикального окис‑
ления в 5,8 и 3,2 раза соответственно, в т.ч. за счет
повышения продукции супероксид-анион радикалов
в 5,5 и 3, 6 раза, перекисных радикалов – в 6,7 и 3,6.
При этом активизировался первичный этап перокси‑
дации липидов – концентрация гидроперекисей ли‑
пидов возросла в 7 раз в почках и в 4 раза в сыворотке
крови (табл. 1, 2).
Нарушения процессинга свободных радикалов
сопровождались снижением резистентности к пере‑
кисному окислению (амплитуда Н увеличилась в 8,9
раз в почках и в 3,5 раза в сыворотке крови) и ослаб‑
лением антиоксидантной антирадикальной защиты
(показатель Sind-2 возрос в 6,3 раза в почках и в 3,5
раза в сыворотке крови). Подобная динамика свиде‑
тельствовала о развитии оксидативного стресса, как
в почках, так и на уровне организма в целом, причем
в данной ситуации более выраженного на органном
уровне. Таким образом, однократное пренатальное
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
60
Таблица 2
Показатели хемилюминесценции сыворотки крови 40-суточных белых крыс, пренатально получавших нитрат свинца
и эхинохром А (М±m), отн. ед.
Группа
Контроль
2-я группа
3-я группа
1
Ssp
h
Sind 1
S luc
H
Sind 2
0,191±0,014
0,623±0,0431
0,213±0,016
0,110±0,009
0,455±0,0331
0,127±0,008
0,314±0,024
1,130±0,0691
0,359±0,025
0,170±0,003
0,619±0,0041
0,184±0,003
0,873±0,042
3,056±0,207
0,944±0,048
1,060±0,044
3,777±0,3381
1,134±0,050
Разница с контролем статистически значима.
воздействие нитрата свинца способно активизиро‑
вать свободнорадикальное окисление исследуемых
субстратов в постнатальном периоде, вплоть до пре‑
пубертантного возраста (у 40-суточных крыс).
На фоне нарушений свободнорадикального ста‑
туса в почках крыс обнаружены патоморфологи‑
ческие изменения. Количество почечных телец на
стандартной площади среза коркового вещества у
животных, перенесших воздействие нитрата свинца
(9,4±0,6), было достоверно меньшим, чем в контроле
(11,5±0,45). Если в норме у 40-суточных крыс большая
часть почечных телец имела диаметр 70–110 мкм, то
у животных, подвергшихся пренатальному воздейс‑
твию нитрата свинца, нередко наблюдались тельца с
диаметром 45–50 мкм. В ряде случаев было обнару‑
жено значительное уменьшение числа капиллярных
петель клубочков, образование вокруг них фиброзных
капсул, резкое сморщивание почечных телец, проли‑
ферация соединительно-тканных клеток, которая в
ряде случаев распространялась на прилежащие к ним
канальцы. В отдельных наблюдениях в корковом ве‑
ществе были обнаружены кисты, сформировавшиеся
на месте некротизированных клубочков. Их размеры
обычно равнялись 150–200 мкм. В мозговом веществе
в просвете канальцев регистрировались цилиндры, а
также небольшие участки фиброза. В целом патомор‑
фологические процессы, выявленные у 40-суточных
белых крыс, подвергшихся пренатальному воздейс‑
твию свинца, можно определить как токсический
фибро­пластический гломерулонефрит.
Пренатальное воздействие эхинохрома А предо‑
твращало развитие оксидативного стресса: показа‑
тели хемилюминесцентной кинетики у 40-суточных
крыс группы «нитрат свинца + эхинохром А» не име‑
ли достоверных отличий от аналогичных величин в
контроле (табл. 1, 2). На фоне нормализации пока‑
зателей свободнорадикального статуса морфологи‑
ческая картина почек также соответствовала норме.
Полученные данные свидетельствуют в пользу того,
что деструктивные изменения в почках 40-суточных
крыс, пренатально получивших нитрат свинца, яв‑
ляются следствием свободнорадикального повреж‑
дения и окислительной модификации соответствую‑
щих биоструктур.
Выводы
1. Пренатальное воздействие нитрата свинца вызы‑
вает оксидативный стресс и токсический фиброплас‑
тический гломерулонефрит у 40-суточных белых крыс.
2. Эхинохром А предотвращает нарушения сво‑
боднорадикального статуса и деструктивные измене‑
ния в почках 40-суточных белых крыс, подвергнутых
пренатальному воздействию нитрата свинца.
Литература
1. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оцен­
ки свободнорадикального окисления и антиоксидантной
системы организма: методические рекомендации. СПб.:
Наука, 2000. 198 с.
2. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. и др. Свободные
радикалы в живых системах // Итоги науки и техники:
ВИНИТИ АН СССР. 1991. Т. 29. 147 с.
3. Мищенко Н.П., Федореев С.А., Багирова В.Л. Новый ориги­
нальный отечественный препарат гистохром // Хим.-фар­
мацевт. журнал. 2003. Т. 37, № 1. С. 49–53.
4. Мищенко Н.П., Федореев С.А., Догадова Л.П. Препарат
гистохром для офтальмологии // Вестник ДВО РАН. 2004.
№ 3. С. 111–119.
5. Приезжева Е.Ю., Лебедько О.А., Рыжавский Б.Я. и др.
Влияние введения нитрата свинца беременным крысам
на почки их потомства // Дальневосточный мед. журнал.
2007. № 3. С. 30–32.
6. Lebedev A.V., Ivanova M.V., Levitsky D.O. Echinochrome, a
naturally occurring iron chelator and free radical scavenger
in artificial and natural membrane systems // Life Sci. 2005.
Vol. 76, No. 8. P. 863–875.
7. Lebedev A.V., Ivanova M.V., Levitsky D.O. Iron chelators and
free radical scavengers in naturally occurring polyhydroxyl­
ated 1,4-naphthoquinones // Hemoglobin. 2008. Vol. 32, No. 1.
P.165–179.
8 Markowitz M. Lead poisoning // Pediatr Rev. 2000. Vol. 21,
No.10. P. 327–335.
9. Pavlova E.L., Lilova M.I., Savov V.M. Oxidative stress in chil­
dren with kidney disease // Pediatric. Nephrology. 2005. No. 11.
P. 1599–1604.
Поступила в редакцию 20.04.2009.
EFFECT OF ECHINOCHROME ON KIDNEY
STRUCTURE AND METABOLISM IN 40-DAY WHITE
RATS EXPOSED PRENATALLY TO LEAD NITRATE
E.Yu. Prieszheva1, O.A. Lebedko1, B.Ya. Ryizhavskiy2,
V.K. Kozlov1
1 Khabarovsk Branch of the Far Eastern Research Centre of
Physiology and Respiration Pathology, RAMS, Siberian Branch –
Research Centre of Motherhood and Childhood Protection
(1 Building 49 Voronezhskaya St. Khabarovsk 680022 Russia),
2 Far Eastern State Medical University (35 Muraviyov-Amurskiy
St. Khabarovsk 680000 Russia)
Summary – The authors have studied effect produced by echi‑
nochrome A on the kidneys morphology and functional param‑
eters using model of 40-day white rats exposed prenatally to lead
nitrate. The studies were aimed at defining parameters of freeradical oxidation in kidney homogenates and blood serum. The
lead nitrate induced oxidative stress and destructive changes in
kidneys. Echinochrome A prevented these disturbances.
Key words: lead, kidney morphology, free-radical oxidation.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 55–57.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
61
УДК 544.022.341:544.72.023.221:543.456.42/456
А.В. Тупкало
Владивостокский государственный медицинский университет (690950 г. Владивосток, пр-т Острякова, 2)
ИССЛЕДОВАНИЕ ДЕФЕКТОВ В ТОНКИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ПЛЕНКАХ
Ключевые слова: тонкие органические пленки, вакуум, пентацен, сканирующая туннельная микроскопия.
Тонкие органические пленки (ТОП) широко распро‑
странены в природе. В биологии они представляют
особый интерес, поскольку клеточные мембраны,
по сути, являются тонкими пленками молекулярных
кристаллов фосфолипидов и белков, и состояние
этих мембран определяет энергетический и хими‑
ческий баланс клетки. Кроме того, в физике полу‑
проводников тонкие пленки органических веществ
служат наиболее перспективным материалом для на‑
нотехнологий. При этом ТОП могут иметь различные
дефекты и неоднородности, которые нарушают их
биологические и электронные параметры. Первыми
исследованными органическими пленками стали ве‑
щества из класса меланинов – биологических краси‑
телей, широко представленных как в растительных,
так и в животных клетках [1, 2].
Свойства ТОП удобнее изучать на моделях, поэто‑
му в настояшей работе в качестве модельного вещест‑
ва использован пентацен (C22H14) – полициклический
ароматический углеводород, состоящий из пяти свя‑
занных бензольных колец. Пентацен при нормальных
условиях представляет собой молекулярный кристалл,
проводимость в котором осуществляется за счет пе‑
реноса заряда в молекулах, что делает его удовлетво‑
рительной имитацией реальных биологических сред.
Кроме того, этот углеводород отличается высокой
проводимостью, сравнимой с проводимостью амор‑
фного кремния (подвижность носителей в нем более
1 см2/В×с) и квантово-электронной эффективностью,
что делает его перспективным для применения в поле‑
вых транзисторах, свето- и фотодиодах [2, 5].
Известно, что одним из признаков разрушения
ТОП под воздействием окружающей среды является
возникновение на их поверхности и в объеме множес‑
тва точечных дефектов, совпадающее с ухудшением
электрических свойств [3, 4]. Целью данной работы
был поиск метода борьбы с дефектами ТОП. По дан‑
ным литературы, водород оказывает на пентацен на‑
ибольшее воздействие [6], поэтому в эксперименте
исследовался процесс деградации ТОП при взаимо‑
действии атомарного водорода с образцом пентацена.
Материал и методы. Кристаллическая пленка
пентацена была подвергнута контролируемому воз‑
действию атомарного водорода в пределах от 0 до 120
Ленгмюр (Л, 10–6 Торр×с), после чего образовавши‑
еся дефекты были изучены методами сканирующей
туннельной микроскопии (СТМ) и сканирующей
туннельной спектроскопии (СТС). Исследования
проводились в сверхвысоковакуумной системе с ба‑
зовым давлением 2×10–11 Торр, оборудованной ска‑
нирующим туннельным микроскопом с позициони‑
рующим триподом производства Sony разрешением
~0,1 Å. Подготовительная камера была оснащена ис‑
точниками висмута и пентацена, а также системой
разложения молекулярного водорода.
Исследовалась пленка толщиной около полутора
монослоев, нанесенная методом термического напы‑
ления на гексагональную решетку висмута, что поз‑
волило добиться ее высокого качества. Для получения
этого субстрата на подложку из монокристаллическо‑
го кремния p-типа, легированного бором (~10 Ом×см),
размером 21×7×0,5 мм напылялся слой висмута тол‑
щиной 30 монослоев, который затем подвергался от‑
жигу при температуре 100°С. Контроль качества по‑
верхности осуществлялся при помощи СТМ.
После подготовки образца камера через напуск‑
ной клапан заполнялась молекулярным водородом
до давления 1×10–7 Торр, после чего образец подвер‑
гался воздействию атомарного водорода, образовы‑
вавшегося при разложении заполняющего камеру
молекулярного водорода вольфрамовой спиралью
при температуре 1400°С. После обработки атомар‑
ным водородом поверхность образца исследовалась с
помощью СТМ и СТС: подсчитывалось число дефек‑
тов и изучалась их электронная структура.*
Результаты исследования и обсуждение полученных
данных. На СТМ-изображении поверхности пентаце‑
на до и после экспозиции атомарного водорода обна‑
ружены темные пятна, которые, по всей видимости,
представляли собой вакансии в кристаллической ре‑
шетке, поскольку их вид не менялся как в режиме пус‑
тых, так и в режиме заполненных состояний (рис. 1).
Тупкало Андрей Викторович – ассистент кафедры физики
ВГМУ; тел.: 8 (4232) 45-88-73; e-mail: andrey.tupkalo@gmail.com.
* Исследования выполнены в университете Тохоку, г. Сэндай
(Япония).
Исследовано поведение поверхности пленки пентацена
под воздействием атомарного водорода методом сканиру‑
ющей туннельной микроскопии. Рассмотрен процесс ад‑
сорбции атомарного водорода на поверхности пентацена и
образования точечных дефектов. Методом сканирующей
туннельной спектроскопии изучена электронная структу‑
ра дефектов и показано, что они образуются за счет хи‑
мических реакций атомарного водорода с поверхностью.
Отмечено возникновение ловушек зарядов в точечных
дефектах. Проанализирован процесс адсорбции, постро‑
ена его качественная модель. Кривая адсорбции состоит
из двух прямолинейных участков с переломом в точке
25 Ленгмюр, что свидетельствует о наличии двух разных
механизмов адсорбции. Построена качественная модель
процесса растравливания поверхности за счет разложения
молекул пентацена и предложена методика борьбы с этим
эффектом, пригодная для восстановления поверхности
полупроводника.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
62
а
б
в
г
Рис. 1. СТМ-изображения поверхности пентацена.
а, б – до обработки (clean); в, г – после обработки атомарным водо­
родом (Н). –3,0 V и +3,0 V – напряжение смещения, 100 pA – тун­
нельный ток, 150×150 Å2 – поле зрения микроскопа.
а
б
в
г
д
е
а
ж
Рис. 3. Кривая адсорбции атомарного водорода.
а–е – поверхность при экспозициях 6, 12, 30, 60, 90 и 120 Л соответс­
твенно, ж – кривая адсорбции (по горизонтали – экспозиция, Л).
б
Рис. 2. Электронная структура точечных дефектов.
а – СТМ-изображения точечных дефектов при разных напряжениях
смещения; б – локальная плотность состояний чистого пентацена
(при разных направлениях сканирования) и в области точечных де­
фектов (стрелки указывают на границы запрещенной зоны и допол­
нительные энергетические уровни внутри нее).
Были исследованы несколько образцов, для которых
плотность вакансий оказалась приблизительно одина‑
ковой и составила в среднем 3,8×10–4 Å–1.
Можно заметить, что под воздействием атомар‑
ного водорода на поверхности образовались также
дефекты, видимые при СТМ в режиме заполненных
состояний как единичные яркие пятна, но не наблю‑
давшиеся в режиме пустых состояний. Все дальней‑
шие действия проводились в предположении, что
эти пятна представляют собой изображения молекул
пентацена, вступивших в химическую реакцию с ато‑
мами водорода. Подобная чувствительность к напря‑
жению смещения позволяет сделать вывод о том, что
электронная структура этих областей отличается от
нормальных молекул пентацена, и они являются ло‑
вушками для носителей заряда.
Чтобы подтвердить эту гипотезу, дефекты были
исследованы методом СТС (рис. 2, а). На графике
электронной плотности (рис. 2, б) в области этих де‑
фектов нижняя граница запрещенной зоны пентаце‑
на смещалась на величину ~0,5–0,7 В, и вблизи нее
на уровне –0,7–0,8 В можно было наблюдать допол‑
нительное электронное состояние. Таким образом,
теория Нортропа [6] об образовании ловушек зарядов
под воздействием внешних адсорбентов нашла свое
экспериментальное подтверждение.
С увеличением экспозиции число индуцирован‑
ных дефектов росло (рис. 3, а–е). На построенной
на основе этих данных кривой адсорбции хорошо за‑
метны два линейных участка с точкой излома в райо‑
не 25 Л, соответствующие двум разным скоростям
адсобции – 3,8×1015 и 7,0×1014 1/Л соответственно
(рис. 3, е). Подобная разница в скоростях объясняет‑
ся, по-видимому, тем, что пентацен способен образо‑
вывать два соединения с водородом – гидропентацен
и дигидропентацен [2], однако различить их при по‑
мощи СТМ невозможно, поэтому процессы адсорб‑
ции этих соединений выглядят для наблюдателя ана‑
логично. Изменение скорости адсорбции происходи‑
ло из-за конкуренции этих двух процессов.
Линейный характер адсорбции показывает, что
процесс протекал в кинетически свободных условиях,
когда он еще не был лимитирован отсутствием сво‑
бодных реакционных позиций. Измерения при более
высокой экспозиции становились невозможными
из-за вызываемого атомарным водородом растрав‑
ливания поверхности (рис. 3, е). При экспозиции в
300 Л упорядоченные участки поверхности пентаце‑
на практически полностью исчезали, а доза в 600 Л
приводила к полной потере кристаллической струк‑
туры. Это разупорядочение поверхности не связано
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
а
б
в
г
Рис. 4. Модель растравливания и восстановления
поверхности.
а – грубая поверхность; б – процесс растравливания: 1–2 – адсорб­
ция атомарного водорода на поверхности, 3–4 – химическая реакция
водорода с пентаценом, 4–6 – распад и рекомбинация молекул пента­
цена; в – поверхность после отжига (стрелки показывают движение
молекулярных ступенек); г – процессы на поверхности во время от­
жига: до отжига – грубая поверхность, пентацен-хинон, рекомбини­
рованные молекулы; во премя отжига – предпочтительная десорбция
рекомбинированных молекул, движение ступенек оставляет за собой
гладкую поверхность.
ни с висмутовой подложкой, инертной в среде ато‑
марного водорода, ни с загрязнением образца, пос‑
кольку, как показали дополнительные эксперимен‑
ты, растравливанию подвергалась лишь поверхность
пентацена.
Таким образом, продолжительное воздействие вне‑
шней среды может приводить к разрушению кристал‑
лической структуры. Указанный процесс обратим, и
кристаллическая поверхность может быть восстановле‑
на путем отжига при температуре 70–80°С, когда на по‑
верхности возникают участки с упорядоченной струк‑
турой. Отжиг при меньших температурах не оказывал
на поверхность никакого воздействия, а при более вы‑
соких приводил к десорбции слоя пентацена, который
имеет температуру возгонки порядка 100°С (рис. 4).
На основе вышеприведенных фактов можно по­
строить качественные модели процесса адсорбции
и очистки поверхности. В первом случае (рис. 4, б)
при взаимодействии с поверхностью происходит
химическая реакция атомов водорода с молекулами
пентацена и образование гидро- и дигидропентацена
(C22H15 и C22H16). Увеличение экспозиции приводит к
усилению взаимодействия между этими производны‑
ми пентацена и нарушению стабильности молекулы,
а значит, и разрыву того бензольного кольца, к кото‑
рому присоединились эти атомы (рис. 4, г). Возник‑
шие при этом осколки молекул пентацена свободно
рекомбинируют между собой, образуя неупорядо‑
63
ченные полициклические кластеры, что и приводит к
возникновению грубой, растравленной поверхности.
Образовавшаяся при этом структура больше не
является упорядоченной и имеет за счет этого за‑
метно сниженную температуру десорбции. На СТМизображениях отожженной поверхности заметно,
что границы восстановленных областей приобрета‑
ют такую же ромбовидную форму, что и молекуляр‑
ные слои свеженапыленного пентацена, а сами слои
имеют бесформенный вид с отверстиями глубиной в
один монослой. Это свидетельствует о том, что здесь
происходит предпочтительная возгонка растравлен‑
ных участков.
Таким образом, в данной работе показано поведе‑
ние кристаллических пленок молекулярного пентацена
под воздействием атомарного водорода, изучена элек‑
тронная структура образующихся при этом дефектов
и предложен метод очистки результирующей загряз‑
ненной поверхности. Кроме этого, обнаружен эффект
растравливания поверхности атомарным водородом
и обоснована качественная модель данного процесса,
как и модель процесса очистки поверхности.
Литература
1. Bolto B.A., McNeill R. Weiss D.E. Electronic Conduction in
Polymers. III. Electronic Properties of Polypyrrole // Austr. J.
Chem. 1963. Vol. 16, No. 6. P. 1090–1103.
2. Dimitrakopoulos C.D., Mascaro D.J. Organic thin-film transis­
tors: A review of recent advances // IBM J.Res. & Dev. 2001.
Vol. 45, No. 1.
3. Jurchescu O.D. The effect of impurities on the mobility of single
crystal pentacene // App. Phys. Let. 2004. Vol. 84. P. 16.
4. Nazin G.V., Qiu X.H., Ho W. Charging and Interaction of Indi­
vidual Impurities in a Monolayer Organic Crystal // Phys. Rev.
Lett. 2005. Vol. 95. P. 166103.
5. Nelson S.F., Lin Y.-Y., Gundlach D.J., Jackson T.N. Tempera­
ture-Independent Transport in High-Mobility Pentacene Tran­
sistors // Appl. Phys. Lett. 1998. Vol. 72. P. 1854.
6. Northrup J.E., Chabinyc M.L. Gap states in organic semicon­
ductors: Hydrogen- and oxygen-induced states in pentacene //
Phys. Rev. B. 2003. Vol. 68. P. 041202(R).
Поступила в редакцию 12.01.2009.
STUDYING DEFECTS IN THIN ORGANIC FILMS
A.V. Tupkalo
Vladivostok State Medical University (2 Ostryakova Av.
Vladivostok 690950 Russia)
Summary – The author studies behaviour of pentacene film
surface exposed to atomic hydrogen by means of scanning
tunneling microscopy. Due consideration is given to adsorp‑
tion of atomic hydrogen on the pentacene surface and genera‑
tion of point defects. Scanning tunneling microscopy allows
researching into electronic structure of defects and showing
their generation to be caused by chemical reactions between
atomic hydrogen and surface. There are some charge traps in
point defects. Special emphasis is focused on analyzing adsorp‑
tion process and construction of qualitative model. The curve
of adsorption is comprised of two linear areas with a fracture in
point 25 Langmuir that is indicative of two various absorption
mechanisms. The author makes qualitative model of surface
open-up via pentacene molecule breakdown and proposes a
method of fighting with this effect suitable for semiconductor
surface restoration.
Key words: thin organic films, vacuum, pentacene, scanning
tunneling microscopy.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 61–63.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
64
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
УДК 616.24-002-085.37:612-092.9
Л.С. Бузолева1, А.В. Костюшко2, Н.М. Кондрашова2
НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 Владивостокский
государственный медицинский университет (690950 г. Владивосток, пр-т Острякова, 2)
1 ОЦЕНКА КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ
ПРИРОДНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ПНЕВМОНИИ У МЫШЕЙ
Ключевые слова: экспериментальная пневмония, иммуномодуляторы, γ-интерферон, интерлейкин-10.
Изучено влияние иммуномодуляторов природного проис‑
хождения – лейкинферона и тинростима – на фагоцитар‑
ную активность, кислородзависимые механизмы бактери‑
цидности и локальную продукцию оппозитных цитокинов
при экспериментальной стафилококковой и синегнойной
пневмонии. Установлено, что собственный эффект лейкин‑
ферона выражался в стимуляции кислородзависимых меха‑
низмов бактерицидности фагоцитов, тогда как тинростим
оказывал иммуномодулирующее действие на показатели
врожденного иммунитета. Лейкинферон вызывал увели‑
чение уровня γ-интерферона, тинростим более выраженно
усиливал выработку интерлейкина-10. Праймирующий эф‑
фект препаратов in vitro более выражен в модели стафило‑
кокковой пневмонии, при этом лейкинферон и тинростим
аналогично действовали in vivo на исследуемые показатели.
При синегнойной же пневмонии более выраженным проти‑
вовоспалительным эффектом обладал тинростим.
Изучению патогенеза и проблеме лечения пневмо‑
ний уделяется большое внимание как у нас в стране,
так и за рубежом [1, 3, 8]. Несмотря на успехи эти‑
отропной терапии и существенный рост числа анти‑
бактериальных препаратов, сохраняется тенденция
к увеличению смертности от этого заболевания [10].
Спектр возбудителей нозокомиальной пневмонии
характеризуется значительным разнообразием, что
затрудняет планирование эмпирической терапии до
получения данных микробиологического исследова‑
ния [1]. Это связано с тем, что, как правило, нозоко‑
миальная пневмония развивается на фоне тяжелой
патологии, сопровождающейся серьезными метабо‑
лическими, циркуляторными нарушениями и имму‑
нодефицитом [1, 3, 5, 9]. К факторам, усугубляющим
проблему, относятся длительное пребывание больно‑
го в стационаре и предшествующее применение ан‑
тибиотиков (с лечебной или профилактической це‑
лью). Однако этиология нозокомиальной пневмонии
устанавливается менее чем в 50% случаев, что создает
трудности в определении тактики целенаправленной
антибактериальной терапии [3, 10]. Поэтому благо‑
приятный исход заболевания часто зависит от адек‑
ватности патогенетической терапии.
В патогенезе пневмоний существенная роль от‑
водится иммунологической реактивности организма
[6]. Иммунопатогенетические механизмы развития
пневмоний обусловливают необходимость примене‑
ния эффективных иммуномодуляторов [4, 5, 7]. В то
же время данных о преимущественном назначении
Костюшко Анна Валерьевна – канд. мед. наук, доцент кафедры
патологической физиологии ВГМУ; тел.: 8 (4232) 45-07-00; e-mail:
avkostyushko@gmail.com.
того или иного иммунотропного средства в зависи‑
мости от этиологического варианта пневмонии недо‑
статочно, что и послужило основанием для изучения
влияния иммуномодуляторов природного происхож‑
дения – лейкинферона и тинростима – на некоторые
показатели врожденного иммунитета при экспери‑
ментальной пневмонии.
Материал и методы. Эксперименты выполнены на
белых нелинейных мышах массой 18–20 г, находив‑
шихся на стандартной диете в боксированных поме‑
щениях с соблюдением всех правил и международных
рекомендаций Европейской конвенции по защите
позвоночных животных, используемых в эксперимен‑
тальных работах. В каждой серии экспериментов учас‑
твовало по 5 мышей. В исследованиях были исполь‑
зованы патогенные штаммы Pseudomonas aeru­gi­no­sa и
Staphylococcus aureus, выделенные из бронхоальвеоляр‑
ной жидкости больных нозокомиальной пневмонией.
Экспериментальную модель получали, интраназаль‑
но заражая мышей 0,05 мл смыва (на 0,85% растворе
NaCl) суточной культуры микроорганизмов в дозе,
соответствующей LD50 (1×103 м.т./мл для P. aeruginosa
и 1×103 м.т./мл для S. aureus), которую устанавливали
по оптическому стандарту мутности (ГИСК им. Л.А.
Тарасевича). Развитие пневмонии было подтвержде‑
но высевом бактерий из ткани легких. Комплексный
препарат цитокинов – лейкинферон – вводили жи‑
вотным пятикратно 1 раз в сутки внутримышечно (по
0,1 мл в дозе 1300 МЕ) и ингаляционно (по 1300 МЕ
в 5 мл физраствора). Тинростим, состоящий из комп‑
лекса пептидов, выделенных из оптических ганглиев
кальмара Berritiuthis ma­gis­ter, вводили по аналогичной
схеме – 0,39 мг/сут. и 0,39 мг в 5 мл физраствора со‑
ответственно. Дозы были рассчитаны по формуле пе‑
ресчета равноэффективных доз фармакологических
препаратов для лабораторных животных и человека [2].
Контроль № 1 составили интактные животные, конт‑
роль № 2 – мыши, которым в течение 5 дней вводился
лейкинферон, контроль № 3 – мыши, которым в тече‑
ние 5 дней вводился тинростим. Группы «опыт» были
сформированы следующим образом: № 1 – заражение
мышей культурой S. aureus, № 2 – заражение мышей
культурой S. aureus и введение лейкинферона по схе‑
ме, № 3 – заражение мышей культурой S. aureus и вве‑
дение тинростима по схеме, № 4 – заражение мышей
культурой P. aeruginosa, № 5 – заражение мышей куль‑
турой P. aeruginosa и введение лейкинферона по схе‑
ме, № 6 – заражение мышей культурой P. aeruginosa и
введение тинростима по схеме. Забор материала для
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
65
Таблица
Влияние лейкинферона и тинростима на иммунологические показатели у мышей при экспериментальной пневмонии (М±m).
Показатель
Группа
Контроль № 1
Контроль № 2
Контроль № 3
Опыт № 1
Опыт № 2
Опыт № 3
Опыт № 4
Опыт № 5
Опыт № 6
Интактные мыши
Лейкинферон
Тинростим
S. aureus
S. aureus + лейкинферон
S. aureus + тинростим
P. aeruginosa
P. aeruginosa + лейкинферон
P. aeruginosa + тинростим
фагоцитарный
показатель, %
69,4±0,25
75,8±0,33
70,4±0,18
35,2±0,191
62,7±0,133
45,3±0,121, 5
43,7±0,151
55,6±0,171
44,2±0,161
Различие с контролем № 1 статистически значимо.
Различие с контролем № 2 статистически значимо.
3
Различие с опытом № 1 статистически значимо.
4
Различие с опытами № 1 и 2 статистически значимо.
фагоцитарное
число
7,3±0,02
8,2±0,021
7,2±0,032
5,3±0,051
5,2±0,041
5,4±0,081
4,8±0,031
5,4±0,031
5,1±0,051
НСТ-тест, усл. ед.
стимулиро‑
стимулиро‑
спонтанный
ванный лей‑
ванный тин‑
кинфероном
ростимом
0,28±0,07
0,63±0,091
0,36±0,051, 2
0,51±0,051
0,60±0,041, 3
0,54±0,031, 5
0,37±0,031
0,44±0,021
0,40±0,031
0,43±0,02
0,82±0,041
0,55±0,011, 2
0,92±0,081
0,63±0,031, 3
0,56±0,021, 4
0,62±0,021
0,44±0,056
0,42±0,017
0,31±0,04
0,79±0,031
0,43±0,072
0,78±0,021
0,61±0,041, 3
0,55±0,021, 4
0,51±0,011
0,42±0,036
0,39±0,057
Различие с опытом № 2 статистически значимо.
Различие с опытами № 4 и 6 статистически значимо.
7
Различие с опытами № 4 и 5 статистически значимо.
1
5
2
6
исследования осуществлялся на 7-е сутки экспери‑
мента. Выведение животных из опыта выполнялось
с использованием эфирного наркоза. Фагоцитарную
активность нейтрофилов оценивали в тесте поглоще‑
ния частиц полистирольного латекса («Реакомплекс»,
г. Чита), изучение внутриклеточного кислородзависи‑
мого метаболизма фагоцитов проводили с использо‑
ванием теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест)
спектрофотометрически: оптическую плотность вос‑
становленного диформазана измеряли при длине вол‑
ны 540 нм. Продукцию цитокинов – γ-интерферона
(ИФНγ) и интерлейкина-10 (ИЛ-10) исследовали
по их уровню в супернатанте гомогенизата легочной
ткани иммуноферментным методом с использовани‑
ем реактивов производства R&D system Inc. Статис‑
тическую обработку полученных данных выполняли
с помощью пакета SPSS (v16.0) с использованием Wкритерия Вилкоксона и U-критерия Манна–Уитни
с проверкой нормальности распределения по мето‑
ду Колмогорова–Смирнова. Критическое значение
уровня значимости W-критерия принималось равным
0,062, U-критерия – 0,032: третий уровень достовер‑
ности (p≤0,05) для численности групп n1=5 и n2=5.
Результаты исследования. Праймирование клеток
незараженных мышей лейкинфероном приводило
к увеличению интенсивности кислородзависимых
механизмов бактерицидности (индекс стимуляции –
1,54±0,01, р<0,05), обработка клеток тинростимом
не давала значимых результатов (индекс стимуля‑
ции – 1,1±0,03, р>0,05). Влияние лейкинферона и
тинростима на функциональную активность фаго‑
цитирующих клеток здоровых животных в сериях
проведенных экспериментов нельзя оценить как
однозначно стимулирующее. При оценке фагоци‑
тарного показателя и фагоцитарного числа не выяв‑
лено достоверных различий по сравнению с группой
интактных мышей, за исключением показателей по­
глотительной способности фагоцитов под влиянием
лейкинферона в контроле № 2: фагоцитарное число
увеличилось на 0,9, р<0,05 (табл.).
Спонтанная способность фагоцитов генерировать
активные формы кислорода в этой группе под влия‑
нием лейкинферона увеличилась более чем в два раза
при сравнении с группой интактных мышей. Прай‑
мирование клеток in vitro лейкинфероном приводило
к еще большему увеличению продукции нейтрофиль‑
ными гранулоцитами активных форм кислорода (ин‑
декс стимуляции – 1,3±0,01), как и праймирование
тинростимом (индекс стимуляции – 1,25±0,04).
Оценка данных в контроле № 3 (введение тин‑
ростима здоровым животным) дала следующие ре‑
зультаты: показатели фагоцитоза остались практи‑
чески на уровне интактных мышей, значения спон‑
танного НСТ-теста увеличились, индекс стимуляции
в НСТ-тесте с лейкинфероном был равен 1,53±0,01, в
НСТ-тесте с тинростимом – 1,19±0,02.
При экспериментальной пневмонии происходило
достоверное снижение функциональной активнос‑
ти и поглотительной способности фагоцитирующих
клеток. При этом фагоцитарный показатель при за‑
ражении мышей S. aureus (опыт № 1) на 7-е сутки
эксперимента был ниже, чем при заражении P. aeru­gi­
no­sa (опыт № 4), тогда как количество поглощенных
частиц латекса фагоцитом не зависело от этиологии
экспериментальной пневмонии. В ходе исследования
выявлено, что P. aeruginosa оказывал менее выражен‑
ное влияние на активацию гексозомонофосфатного
шунта, чем S. aureus. Так, показатели спонтанного
НСТ-теста при стафилококковой пневмонии увели‑
чивались на 0,23 усл. ед., а при пневмонии, вызванной
P. aeruginosa, – на 0,09 усл. ед. по сравнению с группой
интактных мышей (контроль № 1). В условиях in vitro
клетки мышей с пневмонией в обеих группах срав‑
нения достаточно активно генерировали кислород‑
ный взрыв под воздействием лейкинферона и менее
выраженно – под воздействием тинростима (табл.).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
66
Рис. Уровни ИФНγ и ИЛ-10 в супернатанте легочной тка‑
ни при пневмонии у мышей на фоне введения иммуномо‑
дуляторов.
Серия экспериментов с введением иммуномоду‑
ляторов при одновременном заражении животных
дала следующие результаты. На фоне действия лей‑
кинферона у мышей, зараженных S. aureus, фаго‑
цитарная способность нейтрофилов увеличилась на
27,5%, однако их поглотительная способность через
7 суток после заражения осталась практически неиз‑
менной. Показатель спонтанного НСТ-теста у мышей
данной опытной группы достоверно не увеличился,
дополнительная обработка клеток лейкинфероном и
тинростимом также не приводила к увеличению кис‑
лородзависимой микробицидной способности фа‑
гоцитов. Эффект тинростима при стафилококковой
пневмонии выражался в увеличении фагоцитарного
показателя на 10,1%. Однако показатели спонтанно‑
го НСТ-теста были практически на уровне таковых у
нелеченной группы мышей, зараженных S. aureus, и
фагоциты почти не реагировали на стимуляцию им‑
муномодуляторами in vitro (табл.).
Введение лейкинферона при одновременном ин‑
фицировании P. aeruginosa (опыт № 5) приводило к
незначительному увеличению значений спонтанно‑
го НСТ-теста (на 0,07 усл. ед.). При использовании
тинростима в этой серии экспериментов (опыт № 6)
спонтанный НСТ-тест увеличивался на 0,03 усл. ед.
Анализ показателей стимулированного теста в группе
мышей с пневмонией, вызванной P. aeruginosa, пока‑
зал, что in vitro на 7-е сутки эксперимента клетки не
были способны к дополнительной генерации актив‑
ных форм кислорода ни под воздействием лейкинфе‑
рона, ни под воздействием тинростима (табл.). Это
свидетельствовало об истощении резервных возмож‑
ностей фагоцитов в данных опытных группах.
Исследование цитокинов в супернатанте гомоге‑
низата легочной ткани выявило незначительное пре‑
валирование содержания цитокинов Т-хелперного
2-го типа над цитокинами Т-хелперного 1-го типа у
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
здоровых животных (ИЛ-10 – 85,03±5,08, ИФНγ –
74,33±6,7 пг/мл). Снижение провоспалительной ак‑
тивности цитокинов было зарегистрировано в груп‑
пах мышей, получавших тинростим: уровень ИФНγ
в этой серии экспериментов составил 47,94±2,35
пг/мл. Согласно результатам исследований, лей‑
кинферон оказывал значительное стимулирующее
воздействие на локальную продукцию легочными
иммуноцитами ИФНγ, уровень которого подни‑
мался до 147,9±19,61 пг/мл, что достоверно отлича‑
лось от показателей в других исследуемых группах.
Противовоспалительный эффект тинростима был
значительно выше, чем у лейкинферона, и составил
313,68±11,93 пг/мл против 132,05±5,62 пг/мл соот‑
ветственно, р<0,05 (рис.).
При заражении мышей S. aureus локальные уров‑
ни ИФНγ и ИЛ-10 изменялись недостоверно. Разви‑
тие пневмонии, ассоциированной с P. aeruginosa, со‑
провождалось достоверным уменьшением содержа‑
ния ИФНγ на 33,6 пг/мл и увеличением содержания
ИЛ-10 на 54,5 пг/мл.
При исследовании локального цитокинового
профиля на 7-е сутки после заражения мышей
S. aure­us и введения лейкинферона (опыт № 2) было
зарегистрировано достоверное увеличение уровней
как ИФНγ (134,13±5,45 пг/мл), так и ИЛ-10
(241,73±11,45 пг/мл). Стимулирующий эффект был
значительно выше у мышей с синегнойной пневмо‑
нией: уровень ИФНγ увеличился на 99,08 пг/мл по
сравнению с показателями опыта № 4 и равнялся
139,78±14,4 пг/мл. Уровень ИЛ-10, напротив, при
введении лейкинферона мышам с пневмонией, вы‑
званной P. aeruginosa, недостоверно снизился –
с 139,49±23,10 до 112,14±10,29 пг/мл (рис).
Сравнительная характеристика действия тин‑
ростима на локальную выработку цитокинов по‑
казала, что при стафилококковой пневмонии тин‑
ростим увеличивает продукцию ИФНγ на 90,6 пг/
мл, практически не оказывая влияния на продук‑
цию ИФНγ при синегнойной пневмонии. Таким об‑
разом, собственный эффект тинростима у здоровых
мышей, выражающийся в снижении содержания
ИФНγ, проявился неожиданно высоким увеличе‑
нием продукции ИФНγ на фоне стафилококковой
пневмонии, что превосходило аналогичный эффект
лейкинферона (рис.). Противовоспалительное дейс‑
твие тинростима было стабильно высоким как при
исследовании собственного эффекта препарата, так
и при действии в группах животных с пневмонией
(рис.). Так, уровень ИЛ-10 под влиянием тинрости‑
ма у мышей с пневмонией, вызванной S. aureus, уве‑
личился на 221,9 пг/мл, а при пневмонии, ассоции‑
рованной с P. aeru­gi­no­sa, – на 93,77 пг/мл.
Обсуждение полученных данных. Результаты про‑
веденного иммунологического исследования свиде‑
тельствуют о том, что собственный эффект лейкин‑
ферона выражается в стимуляции кислородзависи‑
мых механизмов бактерицидности фагоцитирующих
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
клеток, в то время как тинростим оказывает иммуно‑
модулирующий эффект на показатели врожденного
иммунитета у здоровых животных. Лейкинферон вы‑
зывает увеличение уровня провоспалительного цито‑
кина ИФНγ, тинростим более выраженно усиливает
выработку ИЛ-10.
Активация факторов врожденного и адаптивно‑
го иммунитета имеет свои отличия в зависимости от
этиологии воспаления в легких. Эксперимент дает
возможность оценить собственный эффект бактерий
на развитие пневмонии. Так, в модели эксперимен‑
тальной стафилококковой пневмонии показатели
спонтанного НСТ-теста были статистически значи‑
мо выше, чем при экспериментальной синегнойной
пневмонии. Праймирующий эффект исследованных
иммунотропных препаратов на клетки больных мы‑
шей in vitro был выше в модели стафилококковой,
чем синегнойной пневмонии. У эксперименталь‑
ных животных с пневмонией, вызванной S. аureus,
активация микробицидной активности in vitro под
воздействием лейкинферона была выше, чем при
воздействии тинростима. Аналогичные результаты
получены и в опытах заражения мышей P. аeruginosa:
индекс стимуляции лейкинфероном был выше, чем
индекс стимуляции тинростимом. S. aureus не вызы‑
вал выраженных изменений в продукции цитокинов
иммунокомпетентными клетками легких на 7-е сутки
эксперимента. При экспериментальной пневмонии,
вызванной P. aeruginosa, локальный уровень ИЛ-10 в
легких преобладал, что указывает на развитие Т-хел‑
перного иммунного ответа 2-го типа.
Исследование иммуномодулирующего действия
препаратов in vivo на фоне бактериальной пневмо‑
нии позволило констатировать, что при развитии
воспаления, вызванного S. аureus, уровень ИФНγ
увеличивался под воздействием обоих иммуномо‑
дуляторов. При пневмонии, вызванной P. aeruginosa,
уровень ИФНγ увеличивал только лейкинферон.
Противоспалительный эффект в виде роста уровня
ИЛ-10 при синегнойной пневмонии был зафиксиро‑
ван только в отношении тинростима. При введении
лейкинферона на фоне пневмонии, ассоциирован‑
ной с P. aeruginosa, происходило снижение уровня
ИЛ-10, то есть при экспериментальной пневмонии,
вызванной P. aeruginosa, лейкинферон менял тип
Т-хелперного иммунного ответа со 2-го на 1-й тип,
что, возможно, оказывало влияние на стимуляцию
иммуноцитов, удлиняло фазу действия провоспали‑
тельных медиаторов и увеличивало рекрутирование
новых клеток в очаг воспаления.
Таким образом, при экспериментальной ста‑
филококковой пневмонии выявлено аналогичное
действие лейкинферона и тинростима на показатели
фагоцитарной активности и оппозитных цитокинов,
тогда как при синегнойной пневмонии тинростим
обладал более выраженным противовоспалительным
эффектом.
67
Литература
1. Белобородов В.Б. Проблемы профилактики и эмпиричес­
кой антибактериальной терапии нозокомиальной пневмо­
нии, связанной с проведением искусственной вентиляции
легких. // Инфекции и антимикробная терапия. 2002. Т.4,
№ 4. С.108–113.
2. Волчегорский И.А., Долгушин И.И., Колесников О.Л. Эк­
спериментальное моделирование и лабораторная оценка
адаптивных реакций организма. Челябинск: Изд-во ЧГПУ,
2000. 168 с.
3. Домникова Н.П., Сидорова Л.Д., Непомнящих Г.И. Внут­
рибольничные пневмонии: патоморфогенез, особенности
клиники и терапии, критерии прогноза. М.: Изд-во РАМН,
2003. 288 с.
4. Кузнецов В.П., Маркелова Е.В., Силич Е.В., Беляев Д.Л.
Динамика цитокинов и роль иммунокоррекции при нозо­
комиальной пневмонии. // Российский иммунологический
журнал. 2002. Т.7, № 2. С.151–160.
5. Маркелова Е.В. Система цитокинов у больных с острыми
повреждениями легких и клинико-иммунологическое обос­
нование терапии лейкинфероном: дис. … д-ра мед. наук.
Владивосток, 2000. 338 с.
6. Система цитокинов и болезни органов дыхания. / Гельцер
Б.И., Просекова Е.В., Маркелова Е.В. и др. Владивосток:
Дальнаука, 2005. 256 с.
7. Швыдченко И.Н., Нестеров И.В., Синельникова Е.Ю. Ци­
токинсекретирующая функция нейтрофильных грануло­
цитов // Иммунология. 2005. № 1. С. 31–33.
8. Holmes M.C., Zhang P., Nelson S. et all. Neutrophil modula­
tion of the pulmonary chemokine response to lipopolysaccaride.
// Shock. 2002. Vol. 18. P. 555–560.
9. Manderscheid P.A., Bodkin R.P., Davidson B.A. Bacterial
clearance and cytokine profiles in a murine model of postsurgi­
cal nosokomial pneumonia. // Clinical and diagnostic labora­
tory immunology. 2004. Vol.11, 4. P. 742–751.
10. Vinsent J. Nosocomial infections in adult intensive-care units. //
Lancet. 2003. Vol. 361. P. 2068–2077.
Поступила в редакцию 10.04.2009.
ESTIMATING CLINICAL AND IMMUNOLOGICAL
EFFICIENCY OF PLANT IMMUNE-RESPONSE
MODULATING AGENTS IN CASE OF EXPERIMENTAL
MOUSE PNEUMONIA
L.S. Buzoleva1, A.V. Kostyushko2, N.M. Kondrashova2
1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the
RAMS, Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087
Russia), 2 Vladivostok State Medical University (2 Ostryakov Av.
Vladivostok 690950 Russia)
Summary – The authors have studied effects produced by
plant immune-response modulating agents – leukinferon
and tinrostim – on the phagocytic activity, oxygen-depen‑
dent mechanisms of bactericidal action and local production
of opposite cytokines in case of experimental staphylococcal
and pseudomonas pneumonias. As shown, intrinsic leukin‑
feron effects were produced when stimulating oxygen-depen‑
dent mechanisms for the bactericidal activity of phagocytes;
tinrostim induced immune response with respect to innate
immunity. Leukinferon caused increasing γ-interferon; tinros‑
tim more evidently intensified interleukin-10 production. The
staphylococcal pneumonia model showed priming effect of the
medications in vitro. The leukinferon and tinrostim produced
similar effects on the parameters under study in vivo. In case of
pseudomonas pneumonia, the most evident anti-inflammatory
effects were peculiar to the tinrostim.
Key words: cytokines, experimental pneumonia, immune-response
modulating agents.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 58–61.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
68
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
УДК 615.37:[615.326:549.67]
К.С. Голохваст1, 4, А.М. Паничев2, А.Н. Гульков1, И.В. Мишаков3, А.А. Ведягин3
Дальневосточный государственный технический университет (690990 г. Владивосток, ул. Пушкинская, 37),
Тихоокеанский институт географии ДВО РАН (690041 г. Владивосток, ул. Радио, 7), 3 Институт катализа СО РАН
(630090 г. Новосибирск, пр-т Лаврентьева, 5), 4 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (690041
г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 150)
1 2 АНТИОКСИДАНТНЫЕ И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ПРИРОДНЫХ ЦЕОЛИТОВ
Ключевые слова: цеолиты, ингаляция, лазерное излучение.
Система местного иммунитета легких постоянно испыты‑
вает на себе повреждающее действие ряда химико-физи‑
ческих и биологических факторов. К их числу относятся
и минеральные микрочастицы. Приведены результаты
оценки влияния цеолитов Вангинского и Куликовского
месторождений на состояние местного иммунитета легких.
В качестве фактора, провоцирующего активацию перекис‑
ного окисления липидов и снижающего функциональную
активность альвеолярных макрофагов и лимфоцитов, ис‑
пользовали низкоэнергетическое лазерное излучение. Ус‑
тановлено, что цеолиты Вангинского месторождения про‑
являют иммунопротекторные и антиоксидантные свойства
в отличие от цеолитов Куликовского месторождения, уси‑
ливающих свободнорадикальные реакции и подавляющих
систему местного иммунитета.
Цеолиты – минералы, обладающие уникальной спо‑
собностью к избирательному ионному обмену и сорб‑
ции ряда атомов и молекул, находят все большее при‑
менение в медицинской практике. В последние годы
в широком спектре фармакологического действия
цеолитов активно изучается их иммунная и антиок‑
сидантная активность [12, 13]. Низкоэнергетическое
лазерное излучение, которое, как известно, характе‑
ризуется целым рядом биологических эффектов, было
выбрано нами в качестве фактора, способного запус‑
кать каскад перекисного окисления липидов [2, 11].
Цель настоящей работы заключалась в оценке вли‑
яния природных цеолитов Куликовского и Вангинс‑
кого месторождений Амурской области в сочетании с
низкоэнергетическим лазерным излучением на био‑
химические показатели крови и ткани легких крыс, а
также на показатели местного иммунитета дыхатель‑
ной системы при ингаляционном пути введения.
Материал и методы. Исследования проводились на
белых беспородных крысах. Для активации перекисно‑
го окисления липидов (ПОЛ) животных облучали низ‑
коэнергетическим лазером. Часть крыс до облучения
подвергали ингаляции с применением цеолитсодержа‑
щих (морденитовых и клиноптилолитовых) туфов из
двух месторождений – Куликовского и Вангинского –
Амурской области. Цеолиты измельчали с помощью
ультразвукового дезинтегратора Bandelin Sonopulse
3400. Степень измельчения составляла около 1–5 мкм.
Части животных до облучения вводили в легкие це‑
олиты с помощью ультразвукового ингалятора УРСА0,25П (Россия). Распыление проводили в закрытой
Голохваст Кирилл Сергеевич – канд. биол. наук, доцент кафедры
охраны окружающей среды Института нефти и газа ДВГТУ; тел. +7
908-999-95-59; e-mail: droopy@mail.ru.
камере в течение 15 мин [4]. Животные были разделе‑
ны на 4 группы по 20 особей: 1) контроль – интактные
животные; 2) «Лазер» – животные, облучавшиеся низ‑
коэнергетическим лазером; 3) «Куликовское+лазер» и
4) «Вангинское+лазер» – животные, которым ингаля‑
ционно вводились цеолиты Куликовского и Вангинс‑
кого месторождений (соответственно) при облучении
низкоэнергетическим лазером. После эксперимен‑
тального воздействия из гомогената легких и плазмы
крови экстрагировали липиды по методу Блайя–Дайе‑
ра для определения продуктов ПОЛ: гидроперекисей,
малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюга‑
тов (ДК) [1, 8, 9]. В плазме крови и ткани легких оп‑
ределяли компоненты антиоксидантной системы: це‑
рулоплазмин и витамин Е [5, 6]. Низкоэнергетическое
лазерное облучение было выбрано как фактор, в оп‑
ределенных дозировках подавляющий функциональ‑
ную активность клеток системы местного иммунитета.
Для облучения применяли импульсный инфракрас‑
ный лазер Agnis-L01 с длиной волны 850 нм, энергией
импульса 3,7×10–7 Дж, частотой повторения импульса
240–1400 Гц и модуляции – 8–69 Гц [10]. Облучали
грудную клетку животных в 6 зонах (субаксилярной,
скапулярной и субскапулярной, справа и слева) по 10
с 1 раз в день на протяжении 15 дней [7]. После опыт‑
ных мероприятий (в соответствии с Правилами про‑
ведения работ с использованием экспериментальных
животных от 12.08.1977 г.) забирали материал для ис‑
следования. Исследовали клетки бронхоальвеолярно‑
го смыва – макрофаги и лимфоциты. На препаратах
идентифицировали клетки и в каждой группе подсчи‑
тывали содержание жизнеспособных клеток, количес‑
тво клеток в 1 мл, относительное число макрофагов и
лимфоцитов – основных участников системы местно‑
го иммунитета легких.
Результаты исследований. Количество жизнеспособ‑
ных клеток в контроле составило 88,2±4,3% от общего
количества. В группе «Лазер» число жизнеспособных
клеток было снижено – 67,3±3,1%. При воздействии
цеолитов Вангинского и Куликовского месторожде‑
ния в сочетании с лазерным излучением количество
жизнеспособных клеток достоверно не отличалось от
контроля – 84,5±3,3 и 83,7±3,6% соответственно. При
этом число клеток в 1 мл незначительно возрастало – с
(1,5±0,1)×105 (контроль) до (1,6±0,1)×105 («Лазер»),
(1,7±0,1)×105 («Куликовское+лазер») и (1,8±0,2)×105
(«Вангинское+лазер»). Нормальное соотношение мак‑
рофагов и лимфоцитов зарегистрировано в контроле
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
69
Таблица
Биохимические показатели ПОЛ и компонентов АОС в ткани легких и плазме крови экспериментальных животных
МДА, нмоль/г
Гидроперекиси,
нмоль/г
Витамин Е,
мкг/г
8,84±1,22
90,58±4,40
205,44±7,38
299,34±18,67
13,54±1,10
102,21±6,70
200,35±8,511
38,3±1,941
237,24±12,291
12,44±1,381
92,0±3,961
198,26±9,831
«Куликовское + лазер»
38,98±2,561
259,58±15,251
11,32±1,351
92,14±5,931
197,5±8,601
контроль
21,44±1,271
51,82±5,151
4,92±1,151
20,18±1,211
27,16±1,691
«Лазер»
19,12±0,89
68,23±5,6
5,3±1,32
1
29,89±2,05
26,34±1,821
«Вангинское + лазер»
11,58±4,82
35,0±7,351
4,96±0,801
24,88±0,871
29,08±2,161
«Куликовское + лазер»
21,18±0,55
52,72±6,101
4,44±0,541
27,24±2,281
21,94±1,281
Церулоплазмин, мг/100 г
ДК, нмоль/г
контроль
39,02±2,54
221,76±14,86
«Лазер»
33,43±1,34
«Вангинское + лазер»
Плазма
крови
Ткань
легких
Группа
1
1
1
1
1
1
1
1
Разница с контролем статистически значима.
и группе «Лазер»: 70±3,4 к 30±1,7% и 60±3,2 к 40±1,7%
соответственно. В группах «Куликовское+лазер» и
«Вангинское+лазер» это соотношение составило
67±3,3 к 33±1,6% и 69±4,1 к 31±1,4% соответственно.
Морфологических отличий клеток в эксперименталь‑
ных группах от контроля обнаружено не было.
Обсуждение полученных данных. Низкоэнергети‑
ческое лазерное излучение в используемом режиме
обладало прооксидантным действием, что согласу‑
ется с данными других исследователей [11]. В группе
«Куликовское+лазер» по сравнению контролем в тка‑
ни легких и плазме крови регистрировалось достовер‑
ное увеличение уровней диеновых конъюгатов, МДА,
гидроперекисей, а также снижение концентрации
церулоплазмина и витамина Е. Полученные данные
свидетельствуют о функциональном снижении ак‑
тивности антиоксидантной системы при ингаляции
цеолитов Куликовского месторождения в сочетании
с низкоэнергетическим лазерным излучением, что
может быть связано с повреждением легочной ткани
цеолитом и стимуляцией воспаления лазерным излу‑
чением. В группе «Вангинское+цеолит» обнаружено
повышение концентрации МДА и снижение уровня
церулоплазмина в гомогенате легких, а также повы‑
шение содержания гидроперекисей и МДА в плазме
крови. С другой стороны, наблюдалось статистичес‑
ки значимое снижение концентрации диеновых ко‑
нъюгатов и увеличение концентрации витамина Е в
плазме крови (табл.).
Результаты проведенных исследований позволяют
предположить, что как в случае с воздействием холо‑
да [3], так и при лазерном излучении, индуцирующем
ПОЛ, цеолиты отдельных месторождений (например,
Вангинского) проявляют себя как вещества с анти‑
оксидантными свойствами. Цеолиты Куликовского
месторождения, являясь по типу кристаллической
решетки преимущественно морденитом (игольчатая
структура), напротив, частично стимулируют ПОЛ.
Конкретные механизмы этого процесса непонятны
и не описаны в литературе и, несомненно, требуют
дальнейшего изучения.
Работа выполнена при поддержке Фонда содействия
развитию малых форм предприятий в научно-техни­
ческой сфере (программа У.М.Н.И.К.) и гранта СО РАН
ПСО-10 № 114.
Литература
1. Бородин Е.А., Арчаков А.И. Стабилизация и реактивация
цитохрома P-450 фосфатидилхолином при перекисном
окислении липидов // Биологические мембраны. 1987. № 7.
С. 719–728.
2. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление ли­
пидов в биологических мембранах М.: Наука, 1972. 320 с.
3. Голохваст К.С., Целуйко С.С. Иммуномодулирующие
свойства цеолитов Вангинского месторождения при инга­
ляторном введении в условиях общего охлаждения // Даль­
невосточный мед. журн. 2006. № 3. С. 92–94.
4. Голохваст К.С., Гульков А.Н., Паничев А.М. и др. Патент
РФ на полезную модель №76566. Установка для изуче­
ния внешних воздействий на животное. Опубликовано
27.09.2008. Бюл. № 27.
5. Кисилевич Р.Ж., Скварко С.И. Определение витамина Е в
сыворотке крови // Лаб. дело. 1972. № 8. С. 473–475.
6. Колб В.Г., Камышников В.С. Клиническая биохимия. Минск,
1976. 312 с.
7. Прокопенко А.В. Системный анализ структурных прояв­
лений компенсаторно-приспособительных реакций ниж­
них дыхательных путей: дис. … канд. мед. наук. Благове­
щенск, 2000. 238 с.
8. Романова Л.А. Стальная И.Д. Метод определения гидропе­
рекисей липидов с помощью тиоционата аммония // Совре­
менные методы в биохимии. М.: Медицина, 1977. С. 64–66.
9. Стальная Е.А. Метод определения диеновой конъюгации
ненасыщенных высших жирных кислот // Современные
методы в биохимии. М.: Медицина, 1977. С. 63–64.
10. Шабалин В.Н., Иваненко Т.В., Скокова Т.В. и др. Иммуно­
логические и физико-химические эффекты лазера на био­
логические объекты // Иммунология. 1990. Т. 6. С. 30–32.
11. Штарберг М.А. Антиокислительные свойства комбиниро­
ванных препаратов фосфолипидов с производными мало­
новой и тиобарбитуровой кислот: дис. … канд. мед. наук.
Благовещенск, 1996. 178 с.
12. Momcilovic B. Megamin, faith, hope and placebos – a criti­
cal review //Arh. Hig. Rada. Toksikol. 1999. Vol. 50, No. 1.
P. 67–78.
13. Sverko V., Sobocanec S., Balog T. et al. Natural micronized
and clinoptilolite mixed with extract Urtica dioica L. as pos­
sible antioxidant // Food Technol. Biotechnol. 2004. Vol. 42.
P. 189–192.
Поступила в редакцию 10.04.2009.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
70
ANTIOXIDATIVE AND IMMUNE-RESPONSE
MODULATING PROPERTIES OF NATURAL ZEOLITES
K.S. Golokhvast1, 4, A.M. Panichev2, A.N. Gulkov1,
I.V. Mischakov3, A.A. Vedyagin3
1 Far Eastern State Technical University (37 Pushkinskaya St.
Vladivostok 690990 Russia), 2 Pacific Institute of Geography,
FEB RAS (7 Radio St. Vladivostok 690041 Russia), 3 Institute of
Catalysis, RAS, Siberian Branch (5 Lavrentiev St. Novosibirsk
630090 Russia), 4 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB
RAS (159 100-Anniversary Av. Vladivostok 690022 Russia)
Summary – The local immunity system in lungs is permanently
exposed to injurious action of a number of chemical, physical
and biological factors. Among other things, these are mineral
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
microparticles. This paper gives consideration to assessment
of effects produced by the Vanginskiy and Kulikovskiy zeolite
deposits on the local immunity in lungs. The authors used lowenergy laser radiation as a factor very likely to induce lipid per‑
oxidation and reduce functional activity of alveolar macrophages
and lymphocytes. The studies allow to conclude that unlike the
Kulikovskiy deposit zeolites appeared to intensify free radical re‑
actions and suppress the local immunity system, the Vanginskiy
deposit zeolites exhibited immunoprotective and antioxidative
properties.
Key words: zeolites, inhalation, laser radiation.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 62–64.
УДК 616.72-002.77-085.37:615.35
С.В. Белова
Саратовский НИИ травматологии и ортопедии (410002 г. Саратов, ул. Чернышевского, 148)
ФЕРМЕНТНЫЙ ИММУНОМОДУЛЯТОР В ТЕРАПИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО
АУТОИММУННОГО АРТРИТА
Ключевые слова: экспериментальный аутоиммунный артрит, церулоплазмин.
У кроликов с экспериментальным аутоиммунным арт‑
ритом выявлены выраженные метаболические сдвиги,
проявлявшиеся нарушением обмена протеогликанов, ин‑
тенсификацией перекисного окисления липидов и несо‑
стоятельностью антиоксидантной системы защиты. При
этом изменения наблюдались как в сыворотке крови, так
и в суставном содержимом. Кроме того, имела место на‑
пряженность иммунопатологических реакций. Внутри‑
суставное введение иммуномодулятора церулоплазмина
в эксперименте привело к коррекции вышеописанных
изменений, улучшению клинической картины и лабора‑
торных показателей.
Аутоиммунные заболевания в развитых странах за‑
нимают третье место по частоте встречаемости и ре‑
гистрируются у 5–8% населения [11]. К системным
аутоиммунным поражениям относится и ревматоид‑
ный артрит, многие вопросы терапии которого до сих
пор остаются открытыми.
Одним из механизмов развития ревматоидно‑
го артрита являются воспалительно-деструктивные
процессы в суставных тканях, что сопровождается
активацией свободно-радикального окисления, ин‑
тенсификацией процессов перекисного окисления
липидов и несостоятельностью антиоксидантной
системы защиты [1, 4, 9].
Церулоплазмин (ЦП), являясь ключевым фермен‑
тным антиоксидантом сыворотки крови, обладает по‑
лифункциональными свойствами, в том числе и им‑
муномодулирующими. В последние годы данный пре‑
парат успешно применяется в комплексном консерва‑
тивном, пред- и послеоперативном лечении больных
ревматоидным артритом [1, 4]. В терапии подобных
пациентов предусматривается и внутрисуставная те‑
рапия, преимуществом которой является целенаправ‑
ленное воздействие на патологический очаг [6].
Белова Светлана Вячеславовна – канд. биол. наук, с.н.с. отдела
лабораторной и функциональной диагностики СарНИИТО; тел.:
8 (452) 23-46-68; e-mail: sarniito_bsv@mail.ru.
В клинике практикуется внутривенное введение
ЦП. Учитывая существенные метаболические изме‑
нения в суставных структурах у больных ревматоид‑
ным артритом, аутоиммунный компонент данной
патологии и собственный положительный опыт по
внутривенному применению ЦП [1, 4], а также его
свойства [4], можно ожидать положительного эффек‑
та и при внутрисуставном введении препарата.
Целью настоящего исследования послужил ана‑
лиз эффективности внутрисуставной терапии ауто‑
иммунного артрита ЦП в условиях эксперимента.
Материал и методы. Под наблюдением нахо‑
дилось 47 кроликов-самцов породы «шиншилла
русская» в возрасте 6 мес., весом 3–3,6 кг. Живот‑
ные содержались в стандартных условиях вивария
со свободным доступом к воде и пище. 10 особей
составили группу контроля, 23 особи с экспери‑
ментальным аутоиммунным артритом [2] получали
внутрисуставную терапию лекарственным препа‑
ратом Ceruloplasminum в дозе 1,5 мг/кг массы тела
(основная группа). Группу сравнения сформировали
14 животных с экспериментальным артритом, кото‑
рым выполнялись внутрисуставные инъекции 0,85%
раствора NaCl.
Эффективность результатов терапии оценивали с
помощью клинических (осмотр, пальпация, измере‑
ние окружности коленных суставов и объема движе‑
ний в них, определение массы тела), инструменталь‑
ных (тепловизионная термография) и лабораторных
методов исследования. Среди последних – гематоло‑
гические (СОЭ, уровень гемоглобина и эритроцитов,
лейкоформула), цитологические (общий цитоз и кле‑
точный состав суставной жидкости), иммунологи‑
ческие (уровень циркулирующих иммунных комп‑
лексов). Оценивали состояние процессов перекис‑
ного окисления липидов (по уровню малонового
диальдегида) и неклеточного ферментного звена
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
71
Таблица 1
Результаты гематологического исследования экспериментальных животных (M±m)
Контроль
Опыт до
лечения
10
37
СОЭ, мм/ч
Показатель
Кол-во животных
Опыт после лечения
основная группа группа сравнения
23
14
2,80±0,20
1
5,82±0,29
3,04±0,18
5,71±0,483
Гемоглобин, г/л
124,30±0,80
117,04±1,121
122,16±0,91
116,52±1,003
Эритроциты, 1012/л
4,04±0,10
3,18±0,151
3,74±0,12
3,07±0,14
Лейкоциты, 109/л
7,60±0,11
10,17±0,191
7,05±0,142
13,07±0,203
П/я нейтрофилы, %
3,96±0,18
5,94±0,10
2
4,01±0,11
7,06±0,193
С/я нейтрофилы %
42,60±1,81
52,84±1,421
43,60±1,072
55,01±1,693
Лимфоциты, %
47,80±0,84
30,18±0,411
43,63±0,502
28,06±0,783
Эозинофилы, %
1,49±0,10
2,12±0,061
1,60±0,082
3,11±0,093
Моноциты, %
3,44±0,12
4,09±0,28
3,40±0,10
4,19±0,31
1
2
Разница статистически значима по сравнению с контролем.
Разница статистически значима по сравнению с показателями до лечения.
3
Разница с основной группой статистически значима.
1
2
антиоксидантной системы (по активности ЦП в сы‑
воротке крови и суставном содержимом). Изучали об‑
мен протеогликанов соединительной ткани – общее
содержание гликозаминогликанов, определяемое по
уроновым кислотам и гексозам в сыворотке крови.
Проводили гистоморфометрические исследования
тканей коленных суставов. Статистическую обработ‑
ку полученных данных выполняли с использованием
пакета прикладных программ Medstat с вычислением
средней арифметической, среднеквадратического от‑
клонения, средней ошибки средней арифметической
и коэффициента Стьюдента.
Забор крови для лабораторных исследований осу‑
ществляли утром, натощак из краевой вены уха. Все
манипуляции проводись с соблюдением правил асеп‑
тики. Клинико-лабораторное обследование живот‑
ных осуществлялось в динамике: до иммунизации, до
и после терапии. Животных выводили из опыта путем
воздушной эмболии. Все эксперименты на животных
осуществляли в соответствии со стандартами Эти‑
ческого комитета и Хельсинкской декларации 1983 г.
Результаты исследования. После иммунизации у
всех животных основной группы наблюдались выра‑
женные метаболические нарушения, проявлявшиеся
клинически и подтверждавшиеся результатами инс‑
трументальных и лабораторных методов исследова‑
ния. При осмотре кролики были вялыми, гиподи‑
намичными, пониженного питания по сравнению с
интактными. Регистрировалась очаговая алопеция.
У всех иммунизированных кроликов развился выра‑
женный артрит правого коленного сустава, что про‑
являлось отеком, повышением местной температуры,
ограничением подвижности, выраженной болевой
реакцией. Данные дистанционной термографии сви‑
детельствовали о температурной асимметрии в об‑
ласти пораженных суставов. В среднем температура
суставов, пораженных артритом, была на 1,3°С выше,
чем интактных.
У животных основной группы СОЭ была повы‑
шена более чем в 2 раза по сравнению с нормой, на‑
блюдалось увеличение количества лейкоцитов, сдвиг
лейкоцитарной формулы влево, уменьшение коли‑
чества эритроцитов и лимфоцитов (табл. 1).
Исследование содержимого пораженных суставов
показало значительное повышение общего цитоза,
который сопровождался изменением качественного
состава клеточных элементов: определялись нейтро‑
филы, макрофаги, лимфоциты и рагоцитоподобные
клетки с характерными включениями в цитоплазме
(табл. 2). В этих же наблюдениях в сыворотке крови
определялся повышенный уровень малонового ди‑
альдегида – маркера перекисного окисления липидов,
достигавший 4,27±0,06 мкмоль/л (норма – 3,58±0,09
мкмоль/л) и повышение активности ЦП – основно‑
го фермента антиоксидантной системы до 41,08±1,69
усл. ед. (норма – 24,38±1,95 усл. ед.). Аналогичные
изменения были отмечены и в суставной жидкости:
уровень малонового диальдегида достигал 0,10±0,03
мкмоль/л (норма – 0,06±0,01 мкмоль/л), а актив‑
ность ЦП – 5,12±0,31 усл. ед. (норма – 3,40±0,11
усл. ед.). Наряду с этим наблюдалось статистически
достоверное повышение концентрации гликозами‑
ногликанов в сыворотке крови, определяемой по
уроновым кислотам – (2,58±0,08)×10–2 г/л и гексо‑
зам – (4,08±0,09)×10–2 г/л; норма – (1,71±0,01)×10–2
и (2,58±0,11)×10–2 г/л соответственно.
Статистически достоверное повышение содержа‑
ния циркулирующих иммунных комплексов отмече‑
но в сыворотке крови животных основной группы –
21,20±1,00 усл. ед. (контроль – 14,00±0,92 усл. ед.).
При гистоморфометрическом исследовании была
установлена инфильтрация синовиальной оболочки
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
72
Таблица 2
Общий цитоз и клеточный состав суставного содержимого коленных суставов
экспериментальных животных (М±m)
Контроль
Опыт до
лечения
10
37
Общий цитоз, 10 /л
0,15±0,01
Нейтрофилы, %
Показатель
Кол-во животных
Опыт после лечения
основная группа группа сравнения
23
14
2,24±0,09
2
0,40±0,08
2,61±0,103
9,51±0,11
56,19±2,411
20,17±1,382
58,13±3,253
Лимфоциты, %
8,43±0,09
38,11±1,921
11,82±0,512
42,00±2,073
Макрофаги, %
0
41,15±2,771
0,48±0,072
47,00±2,023
Рагоциты, %
0
27,40±0,50
0
31,00±0,813
9
1
1
2
Разница статистически значима по сравнению с контролем.
Разница статистически значима по сравнению с показателями до лечения.
3
Разница с основной группой статистически значима.
1
2
лимфоидно-гистиоцитарными и плазмоцитарными
элементами, а также пиронинофилия большинства
лимфоцитов и плазматических клеток, что было
связано с включением этих клеток в процесс анти‑
телообразования. В ткани менисков встречались
единичные плазматические клетки, наблюдались
пролиферация фибробластов и ослабление метахро‑
мазии глубоких зон.
Поверхность гиалинового хряща была матовой, без
блеска, неравномерной толщины, имелись небольшие
участки с разрыхленным и частично утраченным по‑
верхностным слоем, в котором располагались дистро‑
фически измененные хондроциты. При этом наиболее
выраженным признаком поражения была потеря гли‑
козаминогликанов поверхностной и частично основ‑
ной зонами суставного хряща, свидетельствующая о
деградации его матрикса. Строение субхондральной
кости было нарушено, наблюдалось истончение суб‑
хондральной костной пластинки и трабекул, свиде‑
тельствующее о потере костного вещества.
После терапии ЦП наступало улучшение клини‑
ческого состояния животных и лабораторных по‑
казателей (табл. 1, 2). В основной группе, судя по
уменьшению температурной асимметрии, отмечалось
выраженное уменьшение отека пораженного суста‑
ва. Данные гематологического исследования свиде‑
тельствовали о снижении общей активности воспа‑
лительного процесса (табл. 1). Снижалась и местная
воспалительная активность. Цитологическое иссле‑
дование показало снижение уровня общего цитоза
и улучшение качественного состава клеточных эле‑
ментов суставного содержимого (табл. 2). Установле‑
но положительное изменение показателей процессов
перекисного окисления липидов: снижение уровня
малонового диальдегида до 4,82±0,06 мкмоль/л и ак‑
тивности ЦП до 36,18±1,12 усл. ед.
Показатели метаболизма протеогликанов в сыво‑
ротке крови также изменялись в сторону улучшения:
гликозаминогликаны, определяемые по уроновым
кислотам, составили (1,73±0,08)×10–2 г/л, а по гексо‑
зам – (2,69±0,08)×10–2 г/л. После терапии уменьша‑
лась и напряженность иммунопатологических реак‑
ций, судя по статистически достоверно пониженно‑
му уровню циркулирующих иммунных комплексов
(до 16,02±1,04 усл. ед.).
Положительное влияние препарата подтверждал
и гистоморфометрический анализ тканей колен‑
ных суставов животных основной группы. При этом
микроскопическая характеристика синовиальной
оболочки, суставного хряща и субхондральной кос‑
ти приближалась к норме. Установлено торможение
процесса дезорганизации соединительной ткани и
снижение степени выраженности иммуноморфоло‑
гических признаков поражения. Сумма баллов всех
признаков поражения была значительно меньше,
чем у кроликов группы сравнения.
У животных группы сравнения положительной
динамики изучаемых показателей обнаружено не
было, напротив, имело место дальнейшее прогрес‑
сирование ревматоидного артрита, что подтвержда‑
лось данными клинико-лабораторного обследования
(табл. 1, 2).
Обсуждение полученных данных. Развитие аутоим‑
мунных заболеваний происходит в случае, когда ау‑
тоиммунный процесс по отношению к собственным
антигенам приводит к поражению клеток, тканей и
органов. Как правило, объектами при этом выступа‑
ют ДНК, рибонуклеопротеиды, ядерные и цитоплаз‑
матические белки. При ревматоидном артрите как
системном аутоиммунном заболевании аутоантите‑
ла направлены против молекулярных и структурных
компонентов клеток, образующих ткани и органы.
При этом выявляются антитела к ядерным рибонук‑
леопротеидам [5].
В более ранних собственных исследованиях у
больных ревматоидным артритом и у кроликов с ауто­
иммунным артритом было констатировано схожее
метаболическое состояние, проявлявшееся нарушени‑
ем обмена протеогликанов, активацией процессов пе‑
рекисного окисления липидов и несостоятельностью
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
антиоксидантной системы, а также напряженностью
иммунопатологических реакций [1].
Данное исследование внутрисуставной терапии
аутоиммунного артрита с помощью ферментного
иммуномодулятора – церулоплазмина в условиях эк‑
сперимента показало улучшение клинической кар‑
тины заболевания и результатов лабораторного об‑
следования. У леченых животных имелись положи‑
тельные сдвиги в метаболизме протеогликанов, о чем
свидетельствовала нормализация общего содержания
гликозаминогликанов в сыворотке крови. Улучше‑
ние показателей процессов перекисного окисления
липидов и активности антиоксидантной защиты на‑
блюдалось как в сыворотке крови, так и в синови‑
альной жидкости пораженных суставов. Результаты
гематологического и цитологического исследований
свидетельствовали о снижении общей и местной ак‑
тивности воспалительного процесса соответствен‑
но. Показатели иммунологического исследования
демонстрировали положительную динамику в отно‑
шении циркулирующих иммунных комплексов, что
указывало на снижение напряженности иммунопа‑
тологических реакций.
Результаты данной работы согласуются с исследо‑
ваниями авторов и разработчиков препарата, кото‑
рые указывали на то, что введение ЦП мышам линии
С57ВL/6 с онкологическим процессом (метастази‑
рующая карцинома легких Льюиса) удлиняет латен‑
тный период развития опухоли и тормозит ее рост.
Установлено, что ЦП потенцирует функциональную
активность Т- и В-клеточных звеньев иммунной сис‑
темы. Полученные данные позволили заключить, что
ЦП обладает способностью к стимуляции иммуноге‑
неза как на уровне индукции пролиферации имму‑
ноцитов, так и на уровне их дифференцировки. Как
полагали авторы, это могло быть обусловлено комп‑
лексным характером иммуномодулирующего дейс‑
твия ЦП [3].
Другие экспериментальные исследования так‑
же подтверждали положительный терапевтический
эффект изучаемого препарата. Так, при гиперам‑
мониемии у крыс церулоплазмин в суммарной дозе
60 мг/кг нормализовал коагуляционный гомеостаз
и ряд показателей функциональной активности
тромбоцитов [7]. В другом эксперименте при ги‑
побарической гипоксии у крыс изучалось антиок‑
сидантное и антигипоксическое действие церуло‑
плазмина, причем максимальный эффект препара‑
та наблюдался при его введении за один день до мо‑
делирования гипоксии [10]. При изучении влияния
проникающей радиации на крысах было показано,
что введение церулоплазмина животным за 1 час до
облучения нормализовало показатели перекисного
окисления липидов и активность антиоксидантных
энзимов [8].
Таким образом, использование иммуномодулято‑
ра церулоплазмина, обладающего полифункциональ‑
73
ными свойствами, способствует улучшению клини‑
ческой картины экспериментального аутоиммунного
артрита и лабораторных показателей.
Литература
1. Белова С.В. Перекисно-антиоксидантный дисбаланс в
условиях ревматоидного воспаления и возможность его
медикаментозной коррекции: автореф. дис. … канд. биол.
наук. Саратов, 1999. 23 с.
2. Белова С.В., Карякина Е.В., Кистнер Е.А. Способ моде­
лирования экспериментального ревматоидного артрита.
Решение о выдаче патента по заявке № 2007148301 от
15.10.2008, приор. от 24.12.2007 г.
3. Бердинских Н.К., Измайлова И.М., Юдин В.М. Иммуно­
модулирующая активность экзогенного церулоплазмина
при экспериментальном опухолевом процессе // Бюл. эксп.
биол. мед. 1992. Т. 113, № 5. С. 520–522.
4. Карякина Е.В., Белова С.В., Горячев В.И. Церулоплаз­
мин – фермент крови и лекарство. Саратов: Научная
книга. 2006. 140 с.
5. Красильщикова М.С., Зацепина О.В. Тяжелые метал­
лы как индукторы аутоиммунных процессов у человека и
лабораторных животных // Научно-практич. ревматол.
2007. № 3. С. 54–63.
6. Насонова В.А., Бунчук Н.В. Ревматические болезни: руко­
водство для врачей. М.: Медицина, 1997.
7. Осиков М.В., Макаров Е.В., Кривожихина Л.В. Церу­
лоплазмин устраняет нарушения гемостаза при экспе­
риментальной гипераммониемии // Бюллетень экспе­
риментальной биологии и медицины. 2006. Т. 142. № 10.
С. 396–399.
8. Hadiliia O.P., Andriichuk T.R., Merkulov S.P. et al. Effect
of the substances «Ammivit» and «cerloplasmin» on lipid per­
oxidation products level and of antioxidant system indicators
under irradiation // Ukr. Biokhim. Zh. 2002. Vol. 74, No. 1.
P. 97–100.
9. Kamanli A., Naziroglu M., Aydilek N., Hacievliyagil C. Plasma
lipid peroxidation and antioxidant levels in patients with rheu­
matoid arthritis // Cell. Biochem. Funct. 2004. Vol. 22, No. 1.
P. 53–57.
10. Krainova T.A., Efremova L.M., Mukhina I.V., Anastasiev V.V.
Antioxidant and antihypoxic effects of the ceruloplasmin prepa­
ration in the hypobaric hypoxia model // Eksp. Klin. Farmakol.
2003. Vol. 66, No. 3. P. 62–65.
11. Leffel E., Wolf C., Poklis A. et al. Drinking water exposure to
cadmium, an environmental contaminant, results in the exacer­
bation of autoimmune disease in the murine model // Toxicology.
2003. Vol. 188, No. 2–3. P. 233–250.
Поступила в редакцию 10.04.2009.
APPLICATION OF ENZYMATIC IMMUNE-RESPONSE
MODULATING AGENT TO TREAT EXPERIMENTAL
ANTIGEN-INDUCED ARTHRITIS
S.V. Belova
Saratov Research Centre of Traumatology and Orthopedic Surgery
(148 Chernyishevskiy St. Saratov 410002 Russia)
Summary – The authors have revealed marked metabolic shifts
in rabbits with experimental antigen-induced arthritis resulted
in a metabolic imbalance between proteoglycans, intensification
of lipid peroxidation and inadequacy of antioxidative protection
system. The changes were observed in blood serum and articula‑
tions content. There were tense immunopathological reactions.
Intra-articular introduction of the immune-response modulat‑
ing agent ceruloplasmin in this experiment resulted in the cor‑
rection of these changes and improvement of clinical picture and
laboratory indices.
Key words: experimental antigen-induced arthritis, ceruloplasmin.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 64–67.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
74
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
УДК 611.018.24:613.618.4:549.67
Н.П. Бгатова1, К.С. Голохваст2, А.В. Бгатов3, А.М. Паничев4 , Н.А. Пальчикова5
НИИ клинической и экспериментальной лимфологии СО РАМН (630117 г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2),
Дальневосточный государственный технический университет (690950 г. Владивосток, ул. Пушкинская, 37),
3 Новосибирский государственный аграрный университет (630039 Новосибирск, ул. Добролюбова, 162), 4 Тихоокеанский
институт географии ДВО РАН (690041 Владивосток, ул. Радио, 7), 5 Научный центр клинической и экспериментальной
медицины СО РАМН (630117 г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2)
1 2 МОДУЛИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПРИРОДНОГО ЦЕОЛИТА НА СТРУКТУРУ ПЕЙЕРОВЫХ БЛЯШЕК
В УСЛОВИЯХ НАКОПЛЕНИЯ ЦЕЗИЯ
Ключевые слова: цезий-137, природный цеолит, удельная радиоактивность, лимфоидная ткань.
Рассматривается структурная организация иммунных
структур пищеварительной системы – пейеровых бляшек
в условиях накопления в организме экспериментальных
животных (крыс Вистар) радиоактивного цезия и добавле‑
ния в рацион природного цеолита. Исследована динамика
выведения цезия‑137 и удельной радиоактивности крови,
кишечника, пейеровых бляшек. Выявлено корригирующее
влияние природного цеолита на структуру лимфоидной
ткани бляшек, свидетельствующее о сохранении их иммун‑
ной функции.
При накоплении в организме радиоактивных ве‑
ществ развиваются процессы атрофии и дегенера‑
ции в лимфоидных органах, происходит истощение
зародышевых центров и, как следствие, уменьшение
резистентности организма к инфекционным аген‑
там и снижение иммунного ответа [6, 7, 10]. Одним
из способов выведения радионуклидов является ис‑
пользование сорбентов с ионообменными свойства‑
ми [5, 9]. К таким средствам относятся природные
ионообменники и сорбенты – цеолиты [3].
Целью данной работы был анализ удельной ра‑
диоактивности и структуры лимфоидных фоллику‑
лов пейеровых бляшек при использовании природ‑
ного цеолита в условиях накопления в организме ра‑
диоактивного цезия.
Материал и методы. Исследование проводили в
специально оборудованном по 2 классу работ с ра‑
диоактивными веществами помещении межинсти‑
тутской радиоизотопной лаборатории СО РАМН
совместно с сотрудниками лаборатории эндокрино‑
логии НЦ клинической и экспериментальной ме‑
дицины СО РАМН (руководитель – д-р биол. наук
В.Г. Селятицкая).
В эксперименте использовали 136 половозрелых
крыс-самцов линии «Вистар». Стандартный рацион
(40 г на животное) крысы получали ежедневно при
свободном доступе к воде. В качестве радионуклида
использовали раствор хлористого цезия с изотопом
цезий-137 и удельной активностью 1,9 ТБк/л (соот‑
ветствует ТУ 95.1203-84). Из фабричного был при‑
готовлен рабочий раствор с удельной активностью
363,5 МБк/л. Рабочий раствор вводили животным
Бгатова Наталия Петровна – д-р биол. наук, профессор, завла‑
бораторией ультраструктурных исследований НИИ клинической и
экспериментальной лимфологии СО РАМН; e-mail: n_bgatova@ngs.ru.
через зонд per os из расчета 0,5 мл на 100 г массы тела,
что соответствовало 182 кБк на 100 г массы тела. Вве‑
дение радиоактивного вещества проводили с 10 до 11
часов, а в 16 часов давали первую порцию сорбента с
кормом.
Животных разделили на 2 группы: 1) крысы, по‑
лучавшие стандартный виварный рацион, и 2) крысы,
получавшие после затравки цезием-137 цеолит.
Использовали цеолит Холинского месторожде‑
ния (Бурятия), состоящий на 60% из клиноптило‑
лита и содержащий 5% монтмориллонита и до 35%
кварца, кристобалита и вулканического стекла [1].
Цеолит добавляли к пище ежедневно перед раздачей
корма из расчета 6% сорбента от сухой массы корма.
Животных выводили из эксперимента декапитаци‑
ей под эфирным наркозом на 3, 7 и 14-е сутки после
начала исследования. Измерение радиоактивности
проводили на счетчике «Гамма-12», используя в ка‑
честве стандарта исходный раствор 137Cs. Объектами
исследования служили образцы подвздошной кишки
с пейеровыми бляшками.
Для светооптического исследования образцы ор‑
ганов фиксировали в 1% растворе ОsО4 на фосфатном
буфере (pH 7,4), дегидратировали в этиловом спирте
возрастающей концентрации и заключали в эпон. Из
полученных блоков готовили срезы толщиной 1 мкм,
которые окрашивали метиленовым голубым и изуча‑
ли под световым микроскопом. Соотношение клеток
в лимфоидной ткани определяли с помощью свето‑
оптического микроскопа при использовании квад‑
ратной тестовой системы (площадью 6400 мкм2) из 25
точек и 5 линий.
Статистическую обработку результатов исследова‑
ний проводили с использованием программ Microsoft
Excel XP и Statistica 6.0. Оценку достоверности разли‑
чий определяли по t-критерию Стьюдента.
Результаты исследования. При добавлении к раци‑
ону цеолита в 1-е сутки у крыс было выведено в 4 раза
больше радиоактивности, чем при стандартном ра‑
ционе. На 2-е сутки выведение возросло в 10, на 3и – в 14 раз. В последующие дни интенсивность вы‑
ведения радиоактивности значительно снижалась.
При исследовании удельной радиоактивности крови
также было отмечено ее более активное снижение
при использовании рациона с цеолитом. На 3-и сутки
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
75
а
б
в
г
Рис. 1. Динамика выведения радиоактивного цезия с экскрементами (а) и удельная радиоактивность крови (б), кишечника
(в) и пейеровой бляшки (г) крыс, получавших с рационом цеолит («звездочкой» отмечены достоверные отличия от соот‑
ветствующих значений в контроле).
применения цеолита удельная радиоактивность кро‑
ви была меньше, чем у крыс контрольной группы на
38%, на 7-е сутки – на 52% и на 14-е сутки – на 45%.
Удельная радиоактивность кишечника к 14-м суткам
снизилась в 9,6 раза, а у крыс, получавших стандарт‑
ный рацион, – в 4,2 раза. При исследовании удель‑
ной радиоактивности пейеровых бляшек было выяв‑
лено на 45% большее ее снижение у животных, полу‑
чавших с рационом цеолит, на 3-и сутки исследова‑
ния, на 40% большее – на 7-е сутки и на 32%
большее – на 14-е сутки (рис. 1).
У животных, получавших стандартный виварный
рацион, в условиях накопления цезия-137 в пейеро‑
вых бляшках происходило снижение доли бластных
клеток и малых лимфоцитов, а также количества ми‑
тозов и возрастало содержание макрофагов (рис. 2).
Отмечался стаз эритроцитов. Наблюдали апоптоз
отдельных лимфоцитов. В связи со снижением доли
лимфоидных клеток в структуре пейеровых бляшек
в большей степени выявлялись ретикулярные клет‑
ки (рис. 3, а). Описанные структурные изменения в
пейеровых бляшках свидетельствовали о подавлении
пролиферации лимфоцитов и снижении их иммун‑
ной функции.
В условиях добавления к рациону природного це‑
олита достоверных изменений в структуре пейеровых
бляшек не регистрировалось. Сохранялись на уровне
нормы количества бластных форм, митозов, малых
лимфоцитов и макрофагов (рис. 2). Наблюдали скоп‑
ления малых лимфоцитов. В меньшей степени выяв‑
лялись ретикулярные клетки (рис. 3, б). Структурные
признаки состояния пейеровых бляшек свидетельс‑
твовали о сохранении иммунной функции органа.
Обсуждение полученных данных. Пейеровы бляш‑
ки являются иммунными структурами желудочнокишечного тракта [11]. Они расположены в каудаль‑
ном отделе подвздошной кишки в виде большого
количества лимфоидных фолликулов, образующих
агрегаты, занимающие всю толщину собственно‑
го слоя слизистой, а также подслизистой основы.
Эпителий кишки, соприкасающийся с лимфоидной
тканью в собственном слое, не содержит бокаловид‑
ных клеток, но инфильтрирован многочисленными
лимфоцитами. Эпителиальные клетки с характер‑
ным складчатым рельефом поверхности (М-клетки)
захватывают антиген в просвете кишки и мигриру‑
ют из эпителия крипт в лимфоидную ткань бляшки,
где передают макрофагам антиген, который затем
предъявляется Т-лимфоцитам [14].
Появление центров размножения рассматрива‑
ется как реакция лимфоидной ткани бляшек на бак‑
териальную флору и продукты ее жизнедеятельнос‑
ти в просвете кишки [12]. Кроме этого, активирую‑
щее воздействие на лимфоидную ткань оказывают
компоненты пищи, продукты ее переваривания и
другие вещества, попадающие в макроорганизм
извне, а также вещества со свойствами антигенов,
образовавшиеся в самом организме. Активная им‑
мунная защита слизистой оболочки обеспечивается
секрецией антител иммуноглобулина A. Эта первая
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
76
а
б
в
г
Рис. 2. Количество бластов (а), митозов (б), малых лимфоцитов (в) и макрофагов (г) в лимфоидной ткани пейеровых бля‑
шек крыс, получавших с рационом цеолит при накоплении в организме радиоактивного цезия («звездочкой» отмечены
достоверные отличия от соответствующих значений в условиях нормы – N).
а
б
Рис. 3. Фрагменты пейеровой бляшки крысы, получавшей
стандартный рацион (а), и крысы, получавшей цеолит при
накоплении в организме радиоактивного цезия (б).
Окраска толуидиновым синим, ×400.
линия защиты связана с взаимодействием с систе‑
мой В-клеток слизистой оболочки и гликопротеи‑
нов эпителия. Это количественно наиболее важный
рецептор иммунной системы, так как он ответстве‑
нен за внешний транспорт локально продуцируемо‑
го полимерного иммуноглобулина A, который явля‑
ется важным гуморальным медиатором иммунной
системы. В-клетки, ответственные за местную про‑
дукцию иммуноглобулинов, первоначально стиму‑
лируются в пейеровых бляшках, откуда мигрируют
как клетки памяти во все экзокринные ткани орга‑
низма [14]. Хотя многое еще непонятно в процессах
поглощении антигенов, стимуляции и подавлении
иммунного ответа, поддержания нормального го‑
меостаза в слизистой оболочке пищеварительного
тракта [15], можно утверждать, что пейеровы бляш‑
ки играют важную роль в формировании иммунного
ответа слизистой оболочки кишечника [13].
При пероральном поступлении радионуклидов
наблюдается поражение слизистой оболочки пище‑
варительного тракта и его региональных лимфоузлов,
а также паренхимы печени [8]. Действие радионук‑
лидов приводит к нарушению обмена углеводов, ли‑
пидов, белков, изменению активности ферментов и
накоплению в организме активных метаболитов [6].
Одним из патогенетических механизмов осложнений
и исхода поражений является нарушение иммунной
реактивности. Это одна из наиболее ранних реакций
на внутреннее облучение. Деструктивные и воспа‑
лительные процессы способствуют интоксикации
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
и иммунологической перестройке организма – ауто‑
сенсибилизации и образованию аутоантител, оказы‑
вающих цитотоксическое действие [10].
Механизм декорпорации радионуклидов при
применении энтеросорбции требует дальнейшего
изучения, однако анализ полученных данных позво‑
ляет сделать вывод о том, что имеет место как прямое
связывание их в просвете кишечника сорбентом, так
и непрямая (опосредованная) декорпорация за счет
общедетоксирующего действия энтеросорбции [9].
Пористая микроструктура и способность к ионооб‑
мену определяют уникальные адсорбционные и ка‑
тионообменные свойства цеолитов [7].
При использовании с рационом природного
цеолита удаление радионуклида происходило пре‑
имущественно с экскрементами, т.е. катионы цезия
встраивались на места свободных связей кристал‑
лической решетки минерала, решающее значение
в этом случае имеют ионообменные свойства сор‑
бента. В связи с тем, что действие инкорпорирован‑
ных радионуклидов проявляется по мере накопле‑
ния суммарной энергии распада изотопа и эффект
воздействия нарастает во времени, крайне важным
является быстрое удаление их из организма. Как по‑
казали наши данные, более эффективное снижение
радиоактивности организма и отдельных структур, в
частности пейеровых бляшек, при добавлении к ра‑
циону цеолита способствует сохранению их струк‑
туры и, по-видимому, функции. Поэтому целесо‑
образность использования природного ионообмен‑
ника и сорбента при накоплении радиоактивного
цезия несомненна.
Ранее было показано, что при профилактическом
введении в рацион животных цеолита в реактивных
центрах пейеровых бляшек происходило увеличе‑
ние количества бластных форм клеток и возрастало
количество митозов [2]. Имеются данные о протек‑
тивном, корригирующем влиянии на лимфоидные
органы природного цеолита при его использовании
в условиях интоксикации карбофосом [4]. Поэто‑
му цеолиты можно рассматривать как природные
минералы, обладающие иммуномодулирующими
свойствами.
Литература
1. Бгатов В.И., Ван А.В. Состав и распространение природ­
ных ионитов на юге Сибири // Лечебно-оздоровительные
факторы Алтая: сб. науч. трудов. Новосибирск, Белоку­
риха: РУ СО РАМН, 1993. С. 8–9.
2. Бгатова Н.П., Новоселов Я.Б. Использование биологи­
чески активных пищевых добавок на основе природных
минералов для детоксикации организма. Новосибирск:
Экор, 2000. 236 с.
3. Бгатова Н.П., Селятицкая В.Г., Пальчикова Н.А., Один­
цов С.В. Стимуляция декорпорации цезия-137 препарата­
ми с ионообменными и сорбционными свойствами и струк­
турная организация органов пищеварительной системы
// Медицинские и экологические эффекты ионизирующей
радиации: материалы I Международной научно-практи­
ческой конференции. Северск–Томск, 2001. С. 20–21.
77
4. Горчаков В.Н., Бгатова Н.П., И.Е. Пристяжнюк И.Е. и
др. Маркеры и протекторы радио- и токсикологического
прессинга на организм // Проблемы сорбционной детокси­
кации внутренней среды организма: материалы междуна­
родного симпозиума. Новосибирск, 1995. С. 78–83.
5. Киеня А.И., Кириченко О.В. Уровень инкорпорации 137Сs
организмом детей, проживающих на различной по плот­
ности загрязнения радионуклидами территории // Мате­
риалы научно-практической конференции. Гомель. 2003.
С. 73–75.
6. Кузин А.М., Копылов В.А. Радиотоксины. М.: Наука, 1983.
174 с.
7. Паничев А.М., Богомолов Н.И., Бгатова Н.П. и др. Цеоли­
ты в хирургии. Владивосток: ДВГТУ, 2004. 120 с.
8. Пинчук В.Г., Никитченко В.В., Гольдшмидт Б.Я. и др.
Биологические эффекты у животных, в связи с аварией на
Чернобыльской АЭС. Сообщение 4. Морфологические и уль­
траструктурные изменения печени крыс // Радиобиология.
1991. № 4. С. 648–653.
9. Хотимченко Ю.С., Одинцова М.В., Ковалев В.В. Полисор­
бовит. Томск: НТЛ, 2001. 132 с.
10. Шубик В.М. Иммунологические исследования в радиацион­
ной гигиене. М: Энергоатомиздат, 1987. 144 с.
11. MacDonald T.T. The mucosal immune system // Parasite Im­
munol. 2003. Vol. 25, No. 5. P. 235–246.
12. Makala L.H., Suzuki N., Nagasawa H. Peyer’s patches: orga­
nized lymphoid structures for the induction of mucosal immune
responses in the intestine // Pathobiology. 2002–2003. Vol. 70,
No. 2. – P. 55–68.
13. Tsuda M., Hosono A., Yanagibashi T., Hachimura S. et al. In­
testinal Bifidobacterium association in germ-free T cell receptor
transgenic mice down-regulates dietary antigen-specific immune
responses of the small intestine but enhances those of the large
intestine // Immunobiology. 2009. Vol. 214, No. 4. P. 279–289.
14. Tsuji M., Komatsu N., Kawamoto S., Suzuki K. et al. Prefer­
ential generation of follicular B helper T cells from Foxp3+ T
cells in gut Peyer›s patches // Science. 2009. Vol. 323, No. 5920.
P. 1488–1492.
15. Vivier E., Spits H., Cupedo T. Interleukin-22-producing innate
immune cells: new players in mucosal immunity and tissue re­
pair? // Nat Rev Immunol. 2009. Vol. 9, No. 4. P. 229–234.
Поступила в редакцию 10.04.2009.
IMMUNOMODULATING EFFECT PRODUCED
BY NATURAL ZEOLITE ON PEYER’S PATCHES
STRUCTURE UNDER CAESIUM ACCUMULATION
N.P. Bgatova1, K.S. Golokhvast2, A.V. Bgatov3, A.M. Panichev4,
N.A. Palchikova5
1 Research Centre of Clinical and Experimental Lymphology,
RAMS, Siberian Branch (2 Academician Timakov St. Novosibirsk
630117 Russia), 2 Far Eastern State Technical University
(37 Pushkinskaya St. Vladivostok 690990 Russia), 3 Novosibirsk
State Agrarian University (162 Dobrolyubov St. Novosibirsk
630039 Russia), 4 Pacific Institute of Geography, FEB RAS
(7 Radio St. Vladivostok 690041 Russia), 5 Scientific Centre
of Clinical and Experimental Medicine RAMS
Summary – The paper gives consideration to the immunity-relat‑
ed structural elements of digestive system – Peyer›s patches. The
authors were aimed to study accumulation of radioactive caesium
in organisms of experimental animals (Wistar rats) when supple‑
menting their diet with natural zeolite. Researching into dynam‑
ics of excreting caesium-137 and specific radioactivity of blood,
bowels and Peyer’s patches allowed to detect corrective effect pro‑
duced by the natural zeolite on the patch lymphoid tissue structure
being indicative of the immune function maintenance.
Key words: caesium-137, natural zeolite, specific radioactivity,
lymphoid tissue.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 68–71.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
78
УДК [615.98:579.84]-06:612.017\-085.322:582.272.46
Т.А. Кузнецова1, Л.М. Сомова1, Н.Г. Плехова1, Т.Н. Звягинцева2
НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 Тихоокеанский институт
биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159)
1 ПРИМЕНЕНИЕ ФУКОИДАНА ИЗ БУРОЙ ВОДОРОСЛИ FUCUS EVANESCENS ДЛЯ КОРРЕКЦИИ
ИММУННЫХ НАРУШЕНИЙ ПРИ ЭНДОТОКСИНЕМИИ
Ключевые слова: фукоидан, эндотоксинемия, липополисахарид, иммунитет.
Изучена возможность применения фукоидана из бурой во‑
доросли Fucus evanescens для коррекции нарушений гумо‑
рального и клеточного иммунитета при экспериментальной
эндотоксинемии, индуцированной введением липополи‑
сахарида. Выявлено ингибирование повышенного уровня
провоспалительных цитокинов, частичное восстановле‑
ние показателей адгезивной и бактерицидной активнос‑
ти нейтрофильных лейкоцитов на фоне индуцированной
липополисахаридом иммунодепрессии, а также снижение
степени микроциркуляторных нарушений в паренхиматоз‑
ных органах, что способствует повышению резистентности
животных к эндотоксину.
Актуальной проблемой лечения больных с эндоток‑
синемией является поиск препаратов для снижения
негативного влияния эндотоксина и повышения ре‑
зистентности организма к токсическому воздействию.
Проникая в системный кровоток, липополисахарид
(ЛПС), ответственный за все биологические эффек‑
ты эндотоксина, взаимодействует с гуморальными и
клеточными факторами иммунитета и инициирует
комплекс патологических процессов, включающих
нарушения со стороны различных органов и систем
макроорганизма. Развиваются кардиопульмональ‑
ная и сосудистая дисфункции, синдром диссемини‑
рованного внутрисосудистого свертывания, острая
почечная и печеночная недостаточность и другие
нарушения. Эти процессы являются результатом как
прямого, так и опосредованного действия эндоток‑
сина [2, 3, 9, 11].
Сульфатированный полисахарид из бурой во‑
доросли Fucus evanescens – фукоидан, обладающий
иммуномодулирующей, антикоагулянтной, проти‑
воопухолевой, антивирусной и другими видами ак‑
тивности [1, 4, 5], является одним из перспективных
препаратов для коррекции иммунных нарушений
при эндотоксинемии. Изучение данного вопроса
поставлено целью настоящей работы.
Материал и методы. Фукоидан (сульфатирован‑
ный полисахарид) выделяли методом горячей экс‑
тракции из бурой водоросли F. evanescens [7]. Эндо‑
токсинемию индуцировали введением мышам ЛПС
из Yersinia pseudotuberculosis в дозе 6,25±0,5 мг/кг, со‑
ставляющей LD100.
В экспериментах использовали неинбредных мы‑
шей и мышей линии ВALB/c весом 20–22 г, которых
распределили на следующие группы (по 10–15 особей):
1-я группа – животные, получившие ЛПС;
Кузнецова Татьяна Алексеевна – д-р мед. наук, в.н.с. лабора‑
тории иммунологии НИИЭМ СО РАМН; тел.: 8 (4232) 44-24-46;
е-mail: niiem_vl@mail.ru.
2-я группа – животные, получившие фукоидан одно‑
кратно внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг и через сут‑
ки – ЛПС;
3-я группа – животные, получившие фукоидан по
профилактической схеме десятикратно, а затем –
ЛПС;
4-я группа – животные, получившие фукоидан одно‑
кратно внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг (положитель‑
ный контроль);
5-я группа – животные, получившие однократно
внутрибрюшинно 0,5 мл 0,85% раствора NaCl (ин‑
тактный контроль).
Мыши поступали из питомника «Столбовая» и
содержались с соблюдением «Правил проведения
работ с использованием экспериментальных живот‑
ных» (приложение к приказу МЗ СССР № 755 от
12.08.1977 г.). Экспериментальные исследования про‑
ведены с разрешения Комитета по биомедицинской
этике НИИЭМ СО РАМН.
Защитный эффект фукоидана при разных схемах
введения оценивали по проценту выживаемости и
средней продолжительности жизни неинбредных
мышей, получивших ЛПС. Функциональную актив‑
ность нейтрофильных лейкоцитов перитонеальной
полости оценивали по показателям адгезивности
и теста с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) [10].
Уровень фактора некроза опухоли-а (TNFα) и ин‑
терлейкинов (IL) 1α и 6 в сыворотке крови мышей
ВАLB/c определяли с помощью иммуноферментно‑
го анализа с использованием наборов BD Biosciences
(BD OptEIA Set Mouse TNF(mono), США).
Животных выводили из опыта с использованием
эфирного наркоза через 4, 7, 17 и 24 часа после вве‑
дения ЛПС. Фрагменты миокарда, печени, почек и
легких фиксировали в 10% нейтральном растворе
забуференного формалина. Проводку материала и
заливку в парафин осуществляли по стандартной ме‑
тодике. Из каждого образца готовили 3–5 срезов, ко‑
торые окрашивали гематоксилином и эозином, для
выявления отложений фибрина производили окрас‑
ку по Шуенинову.
Статистическую обработку полученных данных
проводили с использованием пакета программ «Био‑
стат» и Еxcel, достоверность различий оценивали с
использованием t-критерия Стьюдента. Средние ве‑
личины и их ошибки вычисляли на основе 5–6 тес‑
тов, в каждом из которых кровь или экссудат пери‑
тонеальной полости собирали от пула из 10–15 жи‑
вотных.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
Результаты исследования. Все животные 1-й груп‑
пы, которым вводили ЛПС, погибали в течение суток
(средняя продолжительность жизни – 27,1±2,2 часа).
Однократное парентеральное введение фукоидана
(2‑я группа) не отражалось на показателях выживае‑
мости (все мыши также погибали). При десятикрат‑
ном введении фукоидана (3-я группа) выживаемость
составила 18,9±1,2%, средняя продолжительность
жизни – 52,8±4,3 часа.
Исследование функциональной активности ней‑
трофилов у мышей 1-й группы через 3 часа после вве‑
дения летальной дозы ЛПС свидетельствовало о зна‑
чительном (3–4-кратном) угнетении показателей ад‑
гезии и НСТ-теста по сравнению с таковыми в группе
интактного контроля. Под влиянием однократного
введения фукоидана у животных 2-й группы показа‑
тели адгезивной активности и бактерицидности ней‑
трофилов на фоне депрессии, вызванной введением
ЛПС, статистически значимо возрастали, но оста‑
вались ниже таковых в группе интактного контроля.
При десятикратном введении фукоидана (3-я группа)
эти показатели восстанавливались в большей степени.
У животных 4-й группы (положительный контроль),
под влиянием фукоидана наблюдалось увеличение
показателей адгезивной (в 1,8 раза) и бактерицидной
(в 1,6 раза) активности нейтрофилов по сравнению с
интактным контролем (табл.).
Влияние фукоидана на уровень цитокинов оцени‑
вали в динамике в течение 24 часов после введения
ЛПС. Через 2 часа в 1-й группе выявлено значитель‑
ное повышение концентрации TNFα и IL-1α в сы‑
воротке крови. По истечении 4 часов концентрация
этих цитокинов снижалась и к 24 часам приближа‑
лась к показателям контрольной группы. При вве‑
дении фукоидана (3-я группа) концентрация TNFα
и IL-1α на протяжении всего периода исследования
была ниже, чем в 1-й группе (рис. 1, а). Динамика IL6 имела иную закономерность, принимая максималь‑
ные значения через 8 часов с последующим снижени‑
ем. Его концентрация также значительно превышала
показатели интактных животных. Под действием
фукоидана выявлены более низкие значения IL-6 по
сравнению с таковыми в 1-й группе (рис. 1, б).
Патоморфологическое исследование выявило от‑
сутствие патологических изменений в органах мы‑
шей 4-й группы (рис. 2, а). Их легкие, почки, сердце
имели нормальное строение, как и у животных конт‑
рольной (5-й) группы.
Данные патоморфологического исследования
органов-мишеней мышей, которым вводили ЛПС
(1-я группа), свидетельствовали о гемоциркулятор‑
ных расстройствах с наличием сладжа эритроцитов
и тромбов в сосудах микроциркуляторного русла,
повышенной проницаемости сосудов и деструкции
эндотелия, а также дистрофически-некробиотичес‑
ких изменений клеток паренхиматозных органов
(рис. 2, б). Через 7 часов в печени обнаружено выра‑
женное повреждение стенок сосудов с их плазмати‑
79
Таблица
Влияние фукоидана на функциональную активность
нейтрофилов перитонеальной полости мышей при
экспериментальной эндотоксинемии
Группа
Адгезивная активность
кол-во клеток
1-я
365100±29200
2-я
596700±53200
2
Показатели НСТ-теста
ИС1
OD×10–3
ИС1
0,40
23,5±4,2
2
0,30
2, 3
0,56
0,65
43,5±5,1
3-я
2, 3
704300±44500
4-я
1678000±1268002
5-я
914600±75600
2, 3
0,77
2, 3
47,8±4,2
0,61
1,83
123,4±15,42
1,58
78,3±6,7
Индекс стимуляции, рассчитанный как отношение показате‑
лей в опытной группе к таковым в контрольной (5-й группе).
2 Разница с контролем (5-я группа) статистически значима.
3 Разница с 1-й группой статистически значима.
1 а
б
Рис. 1. Динамика уровней TNFα (а) и IL-6 (б) в сыворотке
крови мышей BALB/c («звездочкой» обозначена статисти‑
ческая достоверность различий между группами).
ческим пропитыванием, фибриноидным набуханием
и некрозом. В прилежащей паренхиме формирова‑
лись очажки дегенеративно-воспалительных изме‑
нений. По истечении 17 часов после введения ЛПС
в печени отмечено мозаичное поражение паренхимы
с наличием больших полей дистрофически изменен‑
ных и некротизированных гепатоцитов. Размеры ге‑
патоцитов в этих участках варьировали. Встречались
единичные двуядерные клетки. К концу срока на‑
блюдения (24 часа) на фоне сосудистых изменений
регистрировались типичные для псевдотуберкулеза
некротические очажки с мелкозернистым детритом,
многочисленные мелкие гранулемы без кариорекси‑
са центральной зоны (рис. 2, в).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
80
а
б
в
г
Рис. 2. Патогистология печени экспериментальных животных.
а – получавших только фукоидан; б, в – через 4 часа после введения ЛПС; г – получавших фукоидан в течение 2 недель до введения ЛПС. Окраска
гематоксилином и эозином; а, в, г – ×200, б – ×100.
Исследование в динамике органов животных,
которые получали профилактический курс инъек‑
ций фукоидана (3-я группа), показало, что в печени,
почках и легких в основном сохранилась целост‑
ность эндотелиальной выстилки сосудов, в их про‑
свете не обнаруживалось значительных отложений
фибрина. В печени через 4 часа наблюдалось уме‑
ренное полнокровие внутридольковых и междоль‑
ковых сосудов без деструктивных изменений эндо‑
телия и гепатоцитов. Вместе с тем имелись очаговые
изменения паренхимы в виде зернистой дистрофии
и вариабельности размеров печеночных клеток, свя‑
занной, скорее всего, с их пикнозом (рис. 2, г). Че‑
рез 24 часа обнаружена мозаичность рисунка печени
за счет дистрофических и некробиотических изме‑
нений больших участков паренхимы. Здесь регист‑
рировались зернистая дистрофия и некроз гепато‑
цитов, было нарушено строение печеночных балок.
Изредка выявлялись двуядерные клетки (1–2 в поле
зрения). О замедлении регенераторно-репаратив‑
ных процессов свидетельствовало отсутствие реак‑
ции со стороны клеток Купфера. Встречались сосу‑
ды с фибриноидным набуханием стенок и по­
вреждением эндотелия, но реже, чем у животных 1-й
группы.
В целом степень нарушений микроциркуляции и
дистрофически-некротических изменений органов
животных, получивших фукоидан, по сравнению с
1‑й группой была менее выражена.
Обсуждение полученных данных. Инициирующим
звеном патогенеза сепсиса и эндотоксинового шока
является поступление в системный кровоток эндо‑
токсина. Это дает начало сложному каскаду патоло‑
гических процессов: развитию системной воспали‑
тельной реакции, полиорганной недостаточности,
диссеминированному внутрисосудистому свертыва‑
нию крови, формированию вторичного иммуноде‑
фицита и другим осложнениям [2, 3, 8, 11, 13].
Наибольший клинический интерес вызывает вли‑
яние эндотоксина на основные защитные системы
организма, в том числе на факторы врожденного и
приобретенного иммунитета. В числе основных задач
иммунокорригирующей терапии сепсиса стоит моду‑
ляция активности иммунокомпетентных клеток, про‑
дукции про- и противовоспалительных цитокинов,
коррекция системной воспалительной реакции для
предотвращения полиорганной недостаточности [6].
Нейтрофилы, являясь основной эндотоксинсвя‑
зывающей популяцией клеток крови, участвуют в
процессах иммобилизации, транспорта и выведения
ЛПС из организма [12, 14]. ЛПС, взаимодействуя с
макрофагами, нейтрофилами и клетками эндотелия,
стимулирует избыточную продукцию провоспали‑
тельных цитокинов, оказывающих повреждающее
действие на ткани и органы, индуцируя эндотокси‑
новый шок [2, 8, 9, 12, 15].
В условиях нашего эксперимента под влияни‑
ем ЛПС установлено угнетение функциональной
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
активности нейтрофилов, гиперпродукция провос‑
палительных цитокинов (TNFα, IL-1α, IL-6), пато‑
логические изменения паренхиматозных органовмишеней. При введении животным фукоидана из
F. evanescens выявлена стимуляция функциональной
активности нейтрофилов, в результате чего наблюда‑
лось ослабление депрессивного влияния ЛПС на эти
клетки. Под влиянием фукоидана также снижались
повышенные уровни TNFα, IL-1α и IL-6. Последнее
особенно важно для понимания механизмов дейс‑
твия фукоидана, поскольку терапевтическая стра‑
тегия при лечении сепсиса и эндотоксинового шока
направлена против элементов гипервоспалительного
каскада, в частности, против этих цитокинов.
Результаты исследований показали, что клини‑
ко-морфологические проявления бактериальной
эндотоксинемии, вызванной ЛПС, менее выраже‑
ны у животных, получивших фукоидан. Введение
этого полисахарида способствует снижению сте‑
пени микроциркуляторных нарушений и вторич‑
ных дистрофически-деструктивных изменений в
печени, почках, легких. По-видимому, основное
патогенетическое значение фукоидана связано с
ослаблением повреждающего действия токсина на
эндотелий кровеносных сосудов. Это препятствует
развитию выраженных системных нарушений мик‑
роциркуляции и связанных с ними дистрофических
и некротических изменений клеток паренхиматоз‑
ных органов, приводящих к развитию полиорган‑
ной недостаточности.
Реализуя отмеченные выше механизмы, фукоидан
способствует сглаживанию клинических проявлений
эндотоксикоза, а в итоге повышает резистентность
мышей к токсическому действию ЛПС: мы наблю‑
дали повышение процента выживаемости (до 19%)
и средней продолжительности жизни (в 2 раза) при
100% смертности животных, получивших летальную
дозу эндотоксина.
Таким образом, фукоидан из бурой водоросли
F. eva­nes­cens можно отнести к числу перспективных
полисахаридов природного происхождения, повы‑
шающих резистентность организма к эндотоксинам.
Применение фукоидана в комплексе лечения эндо‑
токсинемии патогенетически обосновано и позволя‑
ет реализовать основные принципы коррекции нару‑
шений гуморального и клеточного иммунитета.
Литература
1. Алексеенко Т.В., Жанаева С.Я., Венедиктова А.А. и др.
Противоопухолевая и антиметастатическая активность
сульфатированного полисахарида фукоидана, выделенного
из бурой водоросли Охотского моря Fucus evanescens // Бюл.
эксперим. биол. и мед. 2007. Т. 143, № 6. С. 675–677.
2. Еськов А.П., Каюмов Р.И., Соколов А.Е. Механизм пов­
реждающего действия бактериального эндотоксина //
Энтеросорбция как метод предотвращения эндотоксино­
вой агрессии: сб. статей. М., 2004. С. 19–23.
3. Игонин А.А., Кукес В.Г., Пальцев М.А. Сепсис: молекуляр­
ные механизмы системного воспаления в качестве модели
для изучения перспективных терапевтических мишеней //
Молекулярная медицина. 2004. № 2. С.3–12.
81
4. Кузнецова Т.А., Запорожец Т.С., Беседнова Н.Н. и др. Им­
муностимулирующая и антикоагулянтная активность
фукоидана из бурой водоросли Охотского моря Fucus
evanescens // Антибиотики и химиотерапия. 2003. Т.48,
№ 4. С. 11–13.
5. Макаренкова И.Д., Компанец Г.Г., Беседнова Н.Н. и др.
Скрининг биополимеров из морских гидробионтов, влияю­
щих на адсорбцию вируса Хантаан // Вопр. вирусол. 2007.
№ 2. С. 29–32.
6. Нехаев И.В., Свиридова С.П., Мазурина О.Г. и др. Имму­
нокорригирующая терапия сепсиса // Сепсис в начале ХХI
века: практическое руководство / под ред. В.С. Савельева,
Б.Р. Гельфанда. М.: Литтерра, 2006. С. 113–123.
7. Патент № 2135518 (РФ). Способ получения водорас­
творимых полисахаридов бурых водорослей / Т.Н. Звя­
гинцева, Н.М. Шевченко, И.Б. Попивнич и др. // Бюл.
1999. № 24. 3 с.
8. Рябиченко Е.В., Бондаренко В.М., Веткова Л.Г. Молеку­
лярные аспекты повреждающего действия бактериаль­
ных липополисахаридов // Журн. микробиол., эпидемиол и
иммунобиол. 2004. № 3. С. 98–105.
9. Таболин В.А., Яковлев М.Ю., Ильина А.Я. и др. Патоге­
нетические механизмы и клинические аспекты действия
термостабильного эндотоксина кишечной микрофлоры //
Русский мед. журн. 2003. Т. 11, № 3. С. 55–60.
10. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., Истамов Х.И. Экологическая
иммунология. М.: ВНИРО, 1995. 220 с.
11. Яковлев М.Ю. «Эндотоксиновая агрессия» как предболезнь
или универсальный фактор патогенеза заболеваний чело­
века и животных // Успехи совр. биол. 2003. Т. 123, № 1.
С. 31–40.
12. Abraham E., Carmody A., Shenkar R., Arcaroli J. Neutrophils
as early immunologic effectors in hemorrhage- or endotoxemiainduced acute lung injury // Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol.
Physiol. 2000. Vol. 279. Р. 1137–1145.
13. Ayala A., Song G.Y., Chung C.S. et al. Immune depression
in polymicrobial sepsis: the role of necrotic (injured) tis­
sue and endotoxin // Сrit. Care Med. 2000. Vol. 28, No. 8.
P. 2949–2955.
14. Bouchon A., Dietrich J., Colonna M. Cutting edge: inflamma­
tory responses can be triggered by TREM-1, a novel receptor
expressed on neutrophils and monocytes // J. Immunol. 2000.
Vol. 164, No. 10. Р. 4991–4995.
15. Edwin S., Theo J. C., Johan K. Receptors, Mediators, and
Mechanisms Involved in Bacterial Sepsis and Septic Shock //
Clin. Microbiology Reviews. 2003. Vol. 16, No. 3. Р. 379–414.
Поступила в редакцию 07.04.2009.
APPLICATION OF BROWN ALGAE FUCUS EVANESCENSDERIVED FUCOIDAN TO CORRECT IMMUNE
DYSFUNCTIONS UNDER ENDOTOXINEMIA
T.A. Kuznetsova1, L.M. Somova1, N.G. Plekhova1,
T.N. Zvyagintseva2
1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the
RAMS, Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087
Russia), 2 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS (159
100‑Anniversary Av. Vladivostok 690022 Russia)
Summary – The paper discusses possibility of applying fucoidan
derived from the brown algae Fucus evanescens to correct hu‑
moral and cell-mediated immunity in cases of experimental en‑
dotoxinemia caused by lipopolysaccharide. The authors revealed
inhibition of higher level of proinflammatory cytokines, partial
restoration of adhesive and bactericidal activities of neutrophilic
leukocytes with parallel lipopolysaccharide-induced immuno‑
suppression and reducing level of microcirculation disorders
found in parenchymal organs very likely to increase animal’s
resistance to endotoxin.
Key words: fucoidan, endotoxinemia, lipopolysaccharide,
immunity.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 72–75.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
82
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
УДК 615.281:615.37:615.32:577.114
Л.А. Иванушко1, Т.Ф. Соловьева2, Т.С. Запорожец1, Л.М. Сомова1, В.И. Горбач2
НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 Тихоокеанский институт
биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159)
1 АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ И АНТИТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ХИТОЗАНА И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ
Ключевые слова: хитозан, антибактериальная активность, эндотоксемия, электронная микроскопия.
Исследованы антибактериальные и антитоксические
свойства хитозана и его производных (хитозан низкой
молекулярной массы, ацилированный хитозан, хитооли‑
госахариды, карбоксипропилхитозан), полученные при
химической или ферментативной деградации исходного
продукта. Показано, что низкомолекулярные ацилиро‑
ванный и дезацетилированный хитозаны, лучше раство‑
ряющиеся в нейтральных и щелочных растворах и лучше
всасывающиеся из желудочно-кишечного тракта, облада‑
ют более выраженной антимикробной и антитоксической
активностью по сравнению с исходным высокомолеку‑
лярным хитозаном.
На фоне снижения эффективности традиционных
методов терапии и роста лекарственной устойчивости
заболеваний особо актуальны поиск и разработка но‑
вых препаратов для регуляции нарушенных функций
иммунной системы. Полианионы и поликатионы,
благодаря способности к многоточечному коопера‑
тивному взаимодействию с иммунокомпетентными
клетками, могут обеспечить модуляцию различных
звеньев иммунной системы. В связи с этим полика‑
тионные и полианионные полисахариды, широко
представленные в морских водорослях и ракообраз‑
ных, могут рассматриваться как потенциальные им‑
муномодуляторы.
Одним из представителей природных поликатио‑
нов является хитозан – линейный полисахарид, поли‑
мерная цепь которого состоит из β-1,4-связанных ос‑
татков D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина.
Хитозан – нетоксичный, биоразрушаемый, био‑
совместимый полисахарид, обладающий широким
спектром биологической активности, вкючая анти‑
микробную [11, 14]. Известно, что способность по‑
давлять рост патогенных микроорганизмов свойс‑
твенна веществам, нейтрализующим эндотоксины [2,
10]. Однако механизмы воздействия высокомолеку‑
лярного хитозана и его производных на микробные
клетки изучены недостаточно.
Целью настоящей работы явился анализ ультра‑
структурных изменений патогенных штаммов Sal­mo­
nel­la typhimurium и Staphylococcus aureus под воздейс‑
твием хитозана и его производных, а также их спо‑
собности защищать от гибели мышей при эндотокси‑
новом шоке, индуцированном липополисахаридом
(ЛПС) Escherichia coli.
Материалы и методы. Для получения хитозана
использовали коммерческий хитин. Снятие N-аце‑
Иванушко Людмила Александровна – канд. мед. наук, с.н.с.
лаборатории иммунологии НИИЭМ СО РАМН; тел.: 8 (4232)
44-24-46; e-mail: l.iva_57@mail.ru.
татных групп с его молекул проводили методом
N-дезацетилирования с использованием в качестве
реагента смеси водной щелочи (40%) и изопропило‑
вого спирта (1/16 v/v). В результате с выходом 75%
получали высокомолекулярный хитозан с низкой
степенью N-ацетилирования. Деполимеризацией
хитозана с помощью перекиси водорода были полу‑
чены хитоолигосахариды (биоза, триоза, тетраоза), а
также хитозаны низкой молекулярной массы (4–20
кДа), имеющие значительно лучшую растворимость
в водных растворах при физиологических значениях
водородного показателя в сравнении с исходным со‑
единением.
Хитоолигосахариды и хитозан с низкой молеку‑
лярной массой были N-ацилированы при исполь‑
зовании смеси растворителей вода-N,N-диметил‑
формамида и N-гидроксисукцинимидного эфира
3-гидрокситетра-декановой кислоты. В результате
были получены производные, которые по данным
химического анализа, 1Н- и 13С-ЯМР-спектроскопии
и MALDI-TOF- масс-спектрометрии содержали один
остаток 3-гидрокситетрадекановой кислоты (3–ОН–С14)
на восстанавливающем конце молекулы и имели об‑
щую формулу (GlcNH)–3–OH–C14.
Алкилированием хитозана в щелочной среде оме‑
га-галогенпроизводными уксусной, пропионовой и
бутановой кислот были синтезированы N- и 6-О-кар­
боксиалкил (метил, этил, пропил)-хитозаны. Эти
цвиттерионные производные отличаются от исход‑
ного хитозана зарядом и хорошей растворимостью в
воде при нейтральной и щелочной реакции.
Эксперименты выполнены на 600 неинбредных
мышах-самцах массой 16–18 г, находившихся на
стандартной диете в боксированных помещениях с
соблюдением всех правил и рекомендаций Европей‑
ской конвенции по защите позвоночных животных,
используемых в экспериментальных работах. Эн‑
дотоксический шок индуцировали внутрибрюшин‑
ным введением бактериального ЛПС L2880 E. coli
серотипа 055:B5 (Sigma, USA) в дозах 1 и 10 мкг на
особь. С целью повышения чувствительности к ЛПС
мышам предварительно вводили внутрибрюшин‑
но D‑галактозамин в дозе 800 мг/кг [13]. Хитозаны
(высокомолекулярный – 140 кДа и низкомолекуляр‑
ный – 20 кДа, а также низкомолекулярный ацилхито‑
зан) вводили внутримышечно в дозе 100 мкг на особь
в различные сроки относительно введения разреша‑
ющей дозы ЛПС. В каждой группе было по 10 мышей,
эксперимент повторяли трижды, средние показатели
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
выживаемости определяли суммарно как результат
всех серий экспериментов.
Бактериостатическую активность препаратов
определяли дискодиффузионным методом [6]. Бак‑
терии выращивали в течение 24 часов при 37°С на
питательном агаре на основе панкреатического гид‑
ролизата кильки производства НПО «Питательные
среды» (г. Махачкала).
Исследуемые вещества в концентрации 100 и
500 мкг/мл наносились на субстрат-квадраты филь‑
тровальной бумаги размером 1х1 см, которые поме‑
щались в чашки Петри с предварительно выращен‑
ными в течение 1 часа на питательном агаре бакте‑
риями S. typhimurium (штамм 415) и S. aureus (штамм
906). В качестве контроля использовали бактерии,
на которые наносили фильтровальную бумагу, про‑
питанную 0,85% раствором NaCl. Результаты бакте‑
риостатической активности веществ оценивали по
интенсивности роста культур вокруг субстрат-квад‑
ратов. Эксперимент проводили трижды.
Для электронно-микроскопического исследо‑
вания после инкубации бактерий, выращенных на
мясопептонном агаре в присутствии исследуемых
веществ, субстрат-квадрат промывали в фиксато‑
ре по Ито [12]. Проводили дофиксацию бактерий
2% раствором четырехокиси осмия, дегидратацию
в этаноле возрастающей концентрации и заключа‑
ли в эпон-аралдит. Ультратонкие срезы контрасти‑
ровали уранилацетатом и цитратом свинца, затем
просматривали в электронном микроскопе JEM100S (JEOL, Japan) при ускоряющем напряжении
80 мв.
Статистическую обработку данных проводили с
помощью пакета программ Statistica 5 и Exel. Исполь‑
зовали непараметрический критерий Вилкоксона [4].
Результаты исследования. В предварительных
исследованиях было установлено бактериостати‑
ческое действие хитозана и его производных, на‑
иболее выраженное при использовании низко‑
молекулярного хитозана и ацилхитозана. Затем
была исследована ультраструктура S. typhimurium
и S. aureus, в отношении которых проявили бакте‑
риостатическое действие низкомолекулярный хи‑
тозан и ацилхитозан.
При изучении контрольных культур S. aureus бы‑
ла обнаружена типичная ультраструктурная органи‑
зация: микроорганизмы имели кокковидную форму,
характерную утолщенную трехслойную клеточную
стенку. При увеличении ×10 000 в поле зрения регис‑
трировалось до 8 бактерий, находившихся в стадии
деления (рис. 1, а). Под воздействием низкомолеку‑
лярного хитозана появились кокковидные формы
микроорганизмов, большинство из которых имели
электронно-плотный агломерат в зоне нуклеоида.
Клеточная стенка бактерий плохо контурировалась,
по сравнению с исходной культурой. В цитоплаз‑
ме были видны мелкие очажки просветления раз‑
83
а
б
Рис.1. Культуры S. aureus.
а – контрольная культура, 24 часа инкубации; б – после воздействия
хитозана низкомолекулярного: мелкоочаговый лизис, повышение элек­
тронной плотности и частичная гомогенизация цитоплазмы, кле­
точная стенка бактерий плохо контурирована. Электронная микро­
скопия, ×10 000.
мером 0,25 нм овальной формы, похожие на зоны
мелкоочагового лизиса, наблюдалось повышение
электронной плотности и частичная гомогенизация
цитоплазмы, из-за чего рибосомы просматривались
лишь в периферической зоне клетки. В поле зрения
встречалось не более трех делящихся бактериаль‑
ных клеток, что указывало на снижение репродук‑
тивной способности стафилококков после контакта
с указанным веществом (рис. 1, б). Это подтверж‑
далось уменьшением количества делящихся форм,
повышением электронной плотности цитоплазмы,
появлением в зоне нуклеоида электронно-плотно‑
го материала (агломерата), смазанность клеточной
стенки. Подобные изменения характерны для поко‑
ящихся бактерий [1, 3, 5].
Таким образом, данные микробиологического тес‑
тирования и электронно-микроскопическая картина
образцов S. aureus свидетельствовали о выраженном
бактериостатическом действии низкомолекулярного
хитозана.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
84
а
б
Рис. 2. Культуры S. typhimurium.
а – контрольная культура, 24 часа инкубации; б) после воздействия
ацилхитозана: очаговый и крупноочаговый лизис цитоплазмы. Элект­
ронная микроскопия, ×10 000.
В части бактериальных клеток имелись электрон‑
но-плотные агломераты, встречались также клетки
без морфологически выраженного нуклеоида, в ко‑
торых наблюдалось образование подобных агломе‑
ратов, расположенных по периферии цитоплазмы
(рис. 2, б).
Таким образом, результаты электронно-микро‑
скопических исследований свидетельствуют о глу‑
боких повреждениях структурно-функциональных
комплексов S. typhimurium, вызванных выраженным
бактериостатическим действием ацилхитозана. Как
было отмечено ранее [2, 10], способность подавлять
рост патогенных микроорганизмов свойственна ве‑
ществам, способным нейтрализовать эндотоксины.
В связи с этим в следующей серии экспериментов
нами была изучено влияние хитозана и его наиболее
активных производных на выживаемость мышей
при эндотоксиновом шоке.
Установлено, что высокомолекулярный хитозан
при однократном парентеральном введении не ока‑
зывал протективного действия независимо от време‑
ни введения относительно липополисахарида. В то
же время низкомолекулярный дезацетилированный
хитозан статистически значимо повышал устойчи‑
вость организма животных к воздействию липопо‑
лисахарида как при одновременном введении, так и
при введении через 2 часа после воздействия эндо‑
токсина. Низкомолекулярный ацилхитозан значимо
увеличивал выживаемость мышей при профилакти‑
ческом и при лечебном применении (табл.).
Обсуждение полученных данных. Таким образом,
производные хитозана (хитозан низкомолекуляр‑
ный и ацилхитозан) продемонстрировали высокую
антимикробную активность в отношении грамот‑
рицательных и грамположительных микроорганиз‑
мов. Антимикробные свойства хитозанов зависели
от молекулярной массы и степени ацилирования и
могли быть обусловлены уникальной способностью
ЛПС – 10 мкг ЛПС – 1 мкг
на особь
на особь
Бактерии контрольных культур S. typhimurium
име­ли типичную ультраструктуру, у части клеток
обнаруживалось расширение периплазматического
пространства на полюсах с наличием в нем аморф‑
ного вещества – экскреция вторичных метаболитов
(рис. 2, а). Через 24 часа инкубации с ацилхитозаном
происходили отчетливые изменения ультраструкту‑
ры бактерий, однако лизированные формы не
Таблица
обнаруживались. Наблюдался полиморфизм
Влияние производных хитозана на выживаемость мышей при
размеров бактерий, среди которых встреча‑ эндотоксиновом шоке, индуцированном бактериальным ЛПС, M±m
лись как овоидные, так и удлиненные палоч‑
Выживаемость при введении1, %
ковидные формы. В последних можно было
Время введения
различить начальные признаки формирова‑
ХВ
ХН
АХ
ния перегородок, но типичного бинарного
2
2
за 2 часа
0
0
56,7±0,12
деления не отмечено, что указывало на резкое
одновременно
20,0±5,8
56,7±0,12
60,0±11,62
торможение процесса размножения сальмо‑
через 2 часа
02
76,7±6,72
76,7±3,32
нелл. Клеточная стенка на значительных учас‑
тках имела нечеткое строение и была отслоена
контроль
16,7±3,3
от цитоплазматической мембраны.
2
за 2 часа
0
02
60,0±5,82
В большинстве микроорганизмов зона нук‑
одновременно
02
40,0±5,82
36,7±8,8
леоида слабо визуализировалась, цитоплазма
через 2 часа
6,7±3,3
40,0±5,82
36,7±6,72
имела пестрый рисунок за счет неравномерно‑
го распределения рибосом. Во многих клетках
контроль
0
наблюдался очаговый лизис с образованием
1 ХВ – хитозан высокомолекулярный, ХН – хитозан низкомолекуляр‑
овальных зон просветления цитоплазмы, а в ный, АХ – ацилхитозан.
2 отдельных клетках – крупноочаговый лизис.
Разница с соответствующим контролем статистически значима.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
этих соединений неспецифически (за счет электро‑
статических и ионных связей) взаимодействовать с
клеточной стенкой микроорганизмов.
Влияние производных хитозана на ультраструк‑
турную организацию S. typhimurium и S. aureus, отно‑
сящихся к разным систематическим группам, при‑
нципиально одинаково и связано с воздействием на
их поверхностные структуры. Повреждение стенки
может приводить к нарушению ригидности клеток
и процессов деления, вызывая гибель отдельных
микроорганизмов и популяции в целом. Нарушения
поверхностных структур бактерий вызывают изме‑
нение их метаболизма, в частности в отношении са‑
харов, которые являются основным энергетическим
источником для большинства бактерий. В литературе
высказывалась гипотеза о конкурентном замещении
хитозаном рецепторов к сахарам [9].
Обнаруженные нами нарушения в субмикрос‑
копической организации клеточной стенки и цито­
плазматической мембране могут свидетельствовать
о деструкции рецепторов или морфологическом
проявлении конкурентного замещения хитозаном
рецепторов к сахарам. Данные о влиянии хитозана
на субмикроскопическую организацию грамполо‑
жительных и грамотрицательных бактерий сви‑
детельствуют в пользу его бактериостатического
действия.
Ранее была показана способность высокомоле‑
кулярного и низкомолекулярного хитозанов к обра‑
зованию водорастворимых комплексов с липополи‑
сахаридами, прочность связей в которых зависит от
соотношения компонентов и от молекулярной мас‑
сы хитозана [8]. Так, высокомолекулярный хитозан
связывает липополисахариды в точке насыщения
меньше и с меньшей аффинностью, чем низкомоле‑
кулярный, а введение ацильного заместителя в низ‑
комолекулярное производное хитозана существен‑
но увеличивает его связывающую активность. Это,
в свою очередь, приводит к снижению токсических
свойств липополисахаридов [7]. Результаты изуче‑
ния протективных свойств хитозанов при эндоток‑
синовом шоке соотносятся с ранее полученными
данными о связи структуры хитозана с его антиток‑
сическими свойствами.
Таким образом, хитозан и его производные об‑
ладают выраженными антимикробными и анти‑
токсическим свойствами. Результаты проведенных
исследований позволяют считать, что хитозан и его
производные являются перспективными в отноше‑
нии связывания и детоксикации липополисахаридов
и создания на их основе специфических препаратов
для терапии сепсиса и эндотоксинового шока.
Литература
1. Гинцбург. А.Л., Романова Ю.М. Некультивируемые формы
бактерий и их роль в сохранении возбудителей сапрофитов
во внешней среде // Журн. микробиол., эпидемиол. и имму­
нобиол. 1997. № 3. С. 116–121.
85
2. Давыдова В.Н., Ермак И.М., Горбач В.И. и др. Взаимодейс­
твие бактериальных эндотоксинов с хитозаном. Влияние
структуры эндотоксина, молекулярной массы хитозана и
ионной силы раствора на процессы комплексообразования
// Биохимия. 2000. Т. 65, № 9. С. 1278–1287.
3. Демкина Е.В., Соина В.С., Эль-Регистан Г.И. и др. Ре­
продуктивные покоящиеся формы Artrobakter globiformis //
Микробиология. 2000. Т. 57, № 1. С. 366–372.
4. Лисенков А.Н. Математические методы планирования
многофакторных медико-биологических экспериментов.
М.: Медицина, 1979. 314 с.
5. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н. и др. Образо­
вание покоящихся форм и автолизирующихся суспензий
микроорганизмов // Микробиология. 1997. Т. 66, № 1.
С. 42–49.
6. Плехова Н.Г., Сомова Л.М. Способ определения биологи­
ческой активности вещества (варианты). Патент на
изобретение РФ № 2270251 от 20.02.2006.
7. Полякова А.М., Кравченко А.В., Ермак И.М. и др. Влияние
хитозана на биологические свойства эндотоксинов грам­
отрицательных бактерий // Бюл. эксп. биол. мед. 1995.
№ 8. С. 169–172.
8. Соловьева Т.Ф. Хитозаны и каррагинаны – модуляторы
эндотоксического действия липополисахаридов и потен­
циальные препараты для терапии эндотоксемии и эндо­
токсического шока. Фундаментальные науки – медици­
не: материалы научной сессии общего собрания ДВО РАН.
Владивосток, 2006. С. 52–72.
9. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / под
ред. Х.Г. Скрябина и др. М., 2002. 368 с.
10. Amiji M.M. Purene fluorescence study of chitosan selfassocia­
tion in aquqoussolution // Carbohydrate Polimers. 1995. Vol. 26.
P. 211–213.
11. Deacon M.P., McGurK S., Roberts C.J. et al. Atomis force mi­
croscopy of gastrin mucin and chtosan mucoadhesive systems //
Biochem. J. 2000. Vol. 348. P. 557–563.
12. Ito S., Karnovsky M.J. Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives
containing trinitrocompounds. // J. Cell Biol. 1968. Vol. 39.
P. 168A.
13. Kelly A. Millera, E.V.K. Suresh Kumarb, Stewart J. Wooda et
al. Lipopolysaccharide Sequestrants: Structural Correlates of
Activity and Toxicity in Novel Acylhomospermines // J. Med.
Chem. 2005. Vol. 48, No. 7. P. 2589–2599.
14. Nishimura K., Nishimura S., Nishi N. et al. Immunological chi­
tozan and its derivatives // Vaccine. 1984. Vol. 2. P. 93–99.
Поступила в редакцию 10.04.2009.
ANTIBACTERIAL AND ANTITOXIC PROPERTIES
OF CHITOSAN AND ITS DERIVATIVES
L.A. Ivanushko1, T.F. Soloviova2, T.S. Zaporozhets1,
L.M. Somova1, V.I. Gorbatch2
1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the
RAMS, Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087
Russia), 2 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS (159,
100‑Anniversary Av. Vladivostok 690022 Russia)
Summary – The paper discusses antibacterial and antitoxic prop‑
erties of chitosan and its derivatives (low molecular weight chi‑
tosan, acidified chitosan, chitooligosaccharides, and carboxy‑
propyl chitosan) derived as a result of chemical or enzymatic
degradation of the parent substance. As seen, the low molecular
weight acidified and deacetylated chitosans that are capable of
better dissolving in neutral and alkaline solutions and being bet‑
ter absorbed from the gastro-intestinal tract proved to exhibit
more noticeable antibacterial and antitoxic effects, compared to
the parent high-molecular chitosan.
Key words: chitosan, antibacterial activity, endotoxemia, electron
microscopy.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 76–79.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
86
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
УДК [616.831-002-022:578.833]-085.281.322:582.26/27
Н.В. Крылова1, Г.Н. Леонова1, А.М. Попов2, А.А. Артюков2, О.С. Майстровская1, Э.П. Козловская2
НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 Тихоокеанский институт
биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159)
1 ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА РОЗМАРИНОВОЙ КИСЛОТЫ,
ПОЛУЧЕННОЙ ИЗ ZOSTERA ASIATICA, В ОТНОШЕНИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА
Ключевые слова: розмариновая кислота, лютеолин, противовирусная активность, клещевой энцефалит.
На экспериментальных моделях клещевого энцефалита in
vivo и in vitro изучен комплексный препарат розмариновой
кислоты из Zostera asiatica, созданный на основе раститель‑
ного полифенольного соединения розмариновой кислоты
и биофлавоноидов (лютеолина, апигенина и др.). Показа‑
но, что препарат при пероральном применении (наиболее
эффективном способе его введения), повышает выжи‑
ваемость мышей, инфицированных высокопатогенным
штаммом вируса клещевого энцефалита, и увеличивает
продолжительность их жизни. Он не вызывает деструкции
культуры клеток почек эмбриона свиньи и подавляет ин‑
фекционную активность вируса.
До настоящего времени лечение клещевого энцефа‑
лита (КЭ), как и других вирусных инфекций, пред‑
ставляет собой сложную и до конца не решенную про‑
блему. Низкая эффективность и высокая токсичность
противовирусных препаратов, применяемых при ле‑
чении КЭ, не оставляют сомнения в актуальности
поиска новых более эффективных и малотоксичных
соединений, обладающих антивирусной активнос‑
тью. Попытки использовать иммуномодуляторы для
предупреждения и лечения вирусных заболеваний
имеют длительную историю, так как постоянным
спутником вирусных инфекций являются вторичные
иммунодефициты, требующие адекватной коррек‑
ции [1, 3].
В Тихоокеанском институте биоорганической хи‑
мии ДВО РАН постоянно ведется поиск и разработка
технологий производства биополимеров из морских
гидробионтов, обладающих широким спектром био‑
логического действия. В последние годы был выде‑
лен комплекс низкомолекулярных полифенольных
соединений из морской травы Zostera asiatica «Люро‑
марин», содержащий розмариновую кислоту и био­
флавоноиды (лютеолин, апигенин и др.).
Ранее установлено, что розмариновая кисло‑
та – растительный полифенол из Melissa officinalis и
био­флавоноид лютеолин, входящий в состав многих
растений, являются биологически активными вещес‑
твами с разносторонним спектром действия [5, 9, 13].
Эти препараты обладают активностью в отношении
вирусов герпеса, гриппа, кори и болезни Ньюкастла
[6, 7]. Исследования J. Ghosh et al. [8], выполненные
на экспериментальной модели мышей, инфициро‑
ванных вирусом японского энцефалита, показали,
что розмариновая кислота обладает высокой проти‑
Крылова Наталья Владимировна – канд. биол. наук, в.н.с. лабо‑
ратории клещевого энцефалита НИИЭМ СО РАМН; тел.: 8 (4232)
44-26-04; e-mail: krylovanatalya@gmail.com.
вовирусной активностью. Кроме того, установлено,
что розмариновая кислота и лютеолин характери‑
зуются выраженной противовоспалительной и ан‑
тиоксидантной активностью [10, 12], их противоал‑
лергическое действие было исследовано N. Osakabe
et al. [11] и H. Ueda et al. [13]. С учетом важной роли
иммунной системы в противоинфекционной защите,
развитии воспалительных, аллергических и иммуно‑
дефицитных заболеваний становится очевидным и ее
участие в реализации эффектов вышеуказанных пре‑
паратов, включая их иммуномодулирующую и про‑
тивовирусную активность.
Целью настоящего исследования явился анализ
противовирусной активности комплексного препара‑
та розмариновой кислоты, выделенной из Z. asiatica,
в сравнении с коммерческими препаратами розмари‑
новой кислоты и лютеолина в отношении вируса КЭ
на экспериментальных моделях in vivo и in vitro.
Материал и методы. Использовали вирус КЭ даль‑
невосточного субтипа, штамм Р-73, выделенный из
мозга человека, умершего от очаговой формы этой ин‑
фекции. Неинбредные мыши-самцы массой 14–16 г
содержались в стандартных условиях вивария с соб‑
людением правил и международных рекомендаций
Европейской конвенции по защите позвоночных
животных. Экспериментальные исследования про‑
ведены с разрешения комитета по биомедицинской
этике НИИЭМ СО РАМН.
В работе использовали однодневный монослой
перевиваемой культуры клеток почек эмбриона сви‑
ньи. Клетки культивировали в 24-луночных пласти‑
ковых панелях с использованием среды 199 и RPMI
(в равных соотношениях) с добавлением 10% сыво‑
ротки эмбрионов коров и 100 ЕД/мл гентамицина.
В эксперименте для клеточной культуры использова‑
ли поддерживающую среду с 1% сыворотки и гента‑
мицином.
Исследованы 3 вида препаратов: «Люромарин» –
комплексный препарат розмариновой кислоты, вы‑
деленный из Z. asiatica (РКз), содержащий 90–95%
розмариновой кислоты и 5–10% биофлавоноидов, а
также коммерческие препараты – розмариновая кис‑
лота (РКк) и флавон лютеолин производства фирмы
Sigma (США).
Мышей инфицировали вирусом КЭ однократно
подкожно в дозе 10 ЛД50/0,1 мл (исходный инфек‑
ционный титр вируса 6,0 lg ЛД50/0,1 мл). Препараты
РКз и РКк в дозах 12,5, 25, 50 и 100 мг/кг вводили
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
интраперитонеально или перорально через 1 час
после заражения вирусом и в дальнейшем на протя‑
жении 7 дней дважды в сутки. В качестве контролей
послужили группа неинфицированных мышей, по‑
лучавших испытуемые препараты, а также группа ин‑
фицированных вирусом КЭ мышей, не получавших
препаратов. В группах было по 10 животных (опыты
повторялись трижды). Наблюдали за животными 21
день, рассчитывая показатели летальности. Эффек‑
тивность препаратов оценивали по выживаемос‑
ти, защите и по средней продолжительности жизни
(СПЖ) мышей.
Цитотоксические свойства исследуемых биопо‑
лимеров изучали после воздействия их различных
концентраций (1, 10, 100 и 1000 мкг/мл) на незара‑
женную культуру клеток почек эмбриона свиньи. Ре‑
зультаты учитывали по появлению цитодеструктив‑
ных изменений культуры через 7 суток после внесе‑
ния препаратов.
Для инфицирования клеток использовали ци‑
топатогенный вирус КЭ штамм Р-73 (инфекцион‑
ный титр – 107 ТЦИД50/0,2 мл). Разные дозы био‑
полимеров (1, 10, 100 и 1000 мкг/мл) соединяли с
вируссодержащим материалом (в соотношении 1:1)
и инкубировали в течение 1 часа при 23–25°С. За‑
тем клеточный монослой заражали смесью вируса с
препаратом и оставляли на 1 час при 37°С, после че‑
го инокулят сливали, добавляли поддерживающую
среду и инкубировали в углекислотном инкубаторе 7
суток. Контролем являлись инфицированные клет‑
ки почек эмбриона свиньи, не обработанные препа‑
ратами. Опыты проводились трехкратно, вирусин‑
гибирующее действие биополимеров оценивали по
разнице титров вируса в контрольных и опытных
образцах культуры.
Статистическую обработку данных проводили с
использованием пакета программ GeoStat и Bio­sta­tis­
tics 4.03. Различие двух сравниваемых величин счита‑
ли достоверным, если вероятность их тождества была
меньше 5% (p<0,05).
Результаты исследования и обсуждение полученных
данных. При оценке протективного действия уста‑
новлено, что РКз оказывала дозозависимое защитное
действие и увеличивала среднюю продолжительность
жизни инфицированных животных. Наибольший
эффект был зарегистрирован при интраперитонеаль‑
ном применении в дозе 25 мг/кг и при пероральном –
в дозе 50 мг/кг. Летальность мышей в контрольной
группе к 21-му дню (срок наблюдения) составила
23,3±11,5%, СПЖ – 12,4±1,0 дней. У инфицирован‑
ных животных, получавших РКк, к концу срока на‑
блюдения выживаемость была несколько выше, чем
в контроле, и составила 43,3±5,8%, СПЖ – 14,8±1,1
дней, протективный эффект по сравнению с контро‑
лем – 21,7%. В то же время среди мышей, получав‑
ших РКз, выживаемость и СПЖ были достоверно
выше, чем в контроле, – 63,3±5,8% и 16,3±0,9 дней,
протективный эффект – 40% (рис. 1).
87
Рис. 1. Влияние перорального введения 50 мг/кг препара‑
тов РКз и РКк на выживаемость животных, инфицирован‑
ных вирусом КЭ.
На первом этапе исследований оценили цитоток‑
сическое действие розмариновой кислоты из Z. asia­
ti­ca и коммерческих препаратов (розмариновой кис‑
лоты и лютеолина) на культуру клеток. Установлено,
что РКз и РКк в концентрациях от 1 до 1000 мкг/мл не
обладали цитопатическим действием. В связи с тем,
что лютеолин плохо растворим в воде, его предвари‑
тельно растворяли в минимальном объеме спирта и
готовили разведения необходимой концентрации на
соответствующей питательной среде. Оценка цито‑
токсичности выявила, что лютеолин в максимальной
концентрации (1000 мкг/мл) приводил к появлению
зернистости в цитоплазме клеток, а меньшие его кон‑
центрации не оказывали токсического влияния.
В следующей серии экспериментов оценивали не‑
посредственное действие вышеуказанных препаратов
на вирус КЭ. Ранее рядом авторов было показано, что
условная величина, позволяющая дифференцировать
вирусингибирующие свойства препаратов, составля‑
ет 1,78 lg [2, 4]. Вещества, оказывающие ингибирую‑
щее действие выше этой величины, являются эффек‑
тивными в отношении вирусов.
Исследованные препараты в разной степени про‑
являли вирусингибирующую активность. Так, при эк‑
спозиции РКк титр вируса КЭ снижался на 2,33±0,58 lg
только при максимальной концентрации препарата
(1000 мкг/мл), в меньших концентрациях РКк не ока‑
зывала вирусингибирующего действия. В то же время
при экспозиции вируса со 1000 мкг/мл РКз его титр
снижался на 3,0±0,29 lg, и в более низких концентра‑
циях ингибирующее действие препарата было выше
условной величины (1,78 lg). Однако достоверные
различия при сравнении РКз и РКк отмечались толь‑
ко при применении их в дозе 10 мкг/мл. Необходимо
отметить, что другой коммерческий препарат – лю‑
теолин – обладал наиболее выраженной способнос‑
тью подавлять инфекционную активность: при кон‑
центрациях 100 и 10 мкг/мл наблюдалось снижение
титра вируса на 4,33±1,04 lg, а при минимальной
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
88
Рис. 2. Вирусингибирующее действие различных концентраций исследуемых препаратов.
концентрации (1 мкг/мл) – на 3,17±1,61 lg. При этом
вирусингибирующее действие лютеолина было досто‑
верно выше такового РКк практически во всех кон‑
центрациях, а по сравнению с РКз – лишь в дозах 100
и 10 мкг/мл (рис. 2).
Таким образом, на экспериментальной модели
КЭ, показано, что розмариновая кислота из Z. asiatica
при пероральном применении (наиболее эффектив‑
ном способе введения препарата) увеличивает выжи‑
ваемость животных и СПЖ. Кроме того, этот ком‑
плексный препарат по сравнению с розмариновой
кислотой (Sigma, США) обладает более выраженным
протективным и вирусингибирующим действием в
отношении высокопатогенного штамма вируса КЭ
и не вызывает цитодеструкцию культуры. Получен‑
ные результаты свидетельствуют о целесообразнос‑
ти дальнейшего изучения комплекса розмариновой
кислоты из Z. asiatica, обладающего антивирусной и
потенциальной иммуномодулирующей активностью,
для его возможного применения в качестве биологи‑
чески активного препарата в терапии КЭ.
Литература
1. Беседнова Н.Н., Леонова Г.Н., Запорожец Т.С. Иммуно­
корректоры в комплексном лечении вирусных инфекций //
ЖМЭИ. 2006. № 3, прил. С. 111–117.
2. Вотяков В.И., Чижов Н.Н., Тазулахова Э.Б. // Методи­
ческие вопросы научной разработки противовирусных ве­
ществ. Минск, 1977. С.10–14.
3. Ершов Ф.И. Использование иммуномодуляторов при ви­
русных инфекциях // Антибиотики и химиотерапия. 2003.
№ 6. С. 27–33.
4. Руководство по экспериментальному (доклиническому)
изучению новых фармакологических веществ. М.: Мин­
здрав РФ, 2005. С. 532–558.
5. Debersac P., Vernevaut M.F., Amiot M.J., et al. Effects of a
water-soluble extract of rosemary and its purified component
rosmarinic acid on xenobiotic-metabolizing enzymes in rat liver
// Food Chem. Toxicol. 2001. Vol. 39, No. 2. P. 109–117.
6. Dimitrova Z., Dimov B., Manolova N. et al. Antiherpes effect
of Melissa officinalis L. extracts // Acta Microbiol. Bulg. 1993.
Vol. 29. P. 65–72.
7. Herrmann E.C., Kucera L.S. Antiviral substances in plants of
the mint family (labiatae). II. Nontannin polyphenol of Melissa
officinalis // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1967. Vol. 124, No. 3.
P. 869–874.
8. Ghosh J., Ghosh S., Saxena A., Basu A. Antiviral and anti-in­
flammatory effects of rosmarinic acid in an experimental murine
model of Japanese encephalitis // Antimicrob. Agents Chemo­
ther. 2007. Vol. 51, No. 9. P. 3367–3370.
9. Van Kessel K.P., Kalter E.S., Verhoef J. Rosmarinic acid in­
hibits external oxidative effects of human polymorphonuclear
granulocytes // Agents Actions. 1986. Vol. 17. P. 375–376.
10. Lee J., Jung E., Kim Y. et al. Rosmarinic acid as a downstream
inhibitor of IKK-beta in TNF-alpha-induced upregulation of
CCL11 and CCR3 // Br. J. Pharmacol. 2006. Vol. 148. P. 366–375.
11. Osakabe N., Takano H., Sanbongi C. et al. Anti-inflammatory
and anti-allergic effect of rosmarinic acid (RA); inhibition of
seasonal allergic rhinoconjunctivitis (SAR) and its mechanism
// Biofactors. 2004. Vol. 21, No. 1–4. P. 127–131.
12. Sroka Z., Fecka I., Cisowski W. Antiradical and anti-H2O2
properties of polyphenolic compounds from an aqueous pep­
permint extract // Z. Naturforsch. 2005. Vol. 60, No. 11–12.
P. 826–832.
13. Ueda H., Yamazaki C., Yamazaki M. Luteolin as an anti-in­
flammatory and anti-allergic constituent of Perilla frutescens //
Biol. Pharm. Bull. 2002. Vol. 25, No. 9. P. 1197–1202.
Поступила в редакцию 08.04.2009.
ANTIVIRAL ACTIVITY OF COMBINED MEDICATION
ZOSTERA ASIATICA-DERIVED ROSMARINIC ACID
AGAINST TICK-BORNE ENCEPHALITIS PATHOGEN
N.V. Kryilova1, G.N. Leonova1, A.M. Popov2, A.A. Artyukov2,
O.S. Maistrovskaya1, E.P. Kozlovskaya2
1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the
RAMS, Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087
Russia), 2 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS (159
100‑Anniversary Av. Vladivostok 690022 Russia)
Summary – Experimental tick-borne encephalitis models al‑
lowed in vivo and in vitro researches into combined medication
Zostera asiatica-derived rosmarinic acid created on the basis of
plant polyphenol compound of rosmarinic acid and bioflavo‑
noids (luteolin, apigenin, etc.). As shown, when introduced oral‑
ly (the most efficient mode of administration) this medication
increased survival rate of mice infected with highly pathogenic
strain of the tick-born encephalitis virus and prolonged their life.
It did not cause a pig embryo kidney cell culture destruction and
suppressed viral infection activity.
Key words: rosmarinic acid, luteolin, antiviral activity, tick-born
encephalitis.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 80–82.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
89
УДК [616.831-002-022:578.833]-085.322:582.272:577.114
И.Д. Макаренкова1, Н.В. Крылова1, Г.Н. Леонова1, Н.Н. Беседнова1, Т.Н. Звягинцева2, Н.М. Шевченко2
НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 Тихоокеанский институт
биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159)
1 ПРОТЕКТИВНОЕ ДЕЙСТВИЕ ФУКОИДАНА ИЗ МОРСКОЙ БУРОЙ ВОДОРОСЛИ LAMINARIA
JAPONICA ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ КЛЕЩЕВОМ ЭНЦЕФАЛИТЕ
Ключевые слова: вирус, клещевой энцефалит, фукоидан, протективное действие, выживаемость.
Проведено исследование протективного действия сульфа‑
тированного полисахарида – фукоидана из морской бурой
водоросли Laminaria japonica при инфицировании мышей
высокопатогенным штаммом вируса клещевого энцефали‑
та in vivo. Установлено, что эффективность действия пре‑
парата зависит от дозы, кратности введения и способствует
формированию защиты у зараженных животных. Широ‑
кий биологический спектр действия сульфатированных
полисахаридов из морских бурых водорослей, низкая ток‑
сичность и экологически чистые технологии производства
открывают перспективу применения фукоиданов для про‑
филактики и лечения вирусных инфекций.
Среди природно-очаговых вирусных нейроинфек‑
ций клещевой энцефалит (КЭ) до настоящего време‑
ни является актуальной проблемой для здравоохра‑
нения в связи с эпидемической значимостью и ши‑
роким распространением на территории Российской
Федерации [3]. Способность вируса КЭ длительное
время сохраняться в активном состоянии в клетках
центральной нервной системы даже после адекват‑
ного лечения острых форм заболевания и опасность
перехода инфекционного процесса в прогредиен‑
тную форму обосновывают необходимость поиска
новых противовирусных препаратов, обладающих
лечебным и профилактическим действием. Большой
интерес в этом направлении представляют сульфа‑
тированные полисахариды – фукоиданы из морских
бурых водорослей, обладающие иммуномодулирую‑
щим, противовоспалительным, противовирусным,
антиадгезивным, антикоагулянтным и противоопу‑
холевым действием [2, 5, 7, 8, 11]. Согласно данным
литературы, фукоиданы обладают выраженной ак‑
тивностью в отношении вирусов иммунодефицита
человека, простого герпеса 1-го и 2-го типов, вези‑
кулярного стоматита, цитомегаловируса, хантавиру‑
са [4, 9, 12, 13]. Установлено, что антивирусное дейс‑
твие фукоиданов зависит от метода экстрагирования,
структуры, молекулярной массы, степени сульфати‑
рования и моносахаридного состава [5, 9, 11].
Целью настоящего исследования был анализ про‑
тективного действия фукоидана из морской бурой
водоросли Laminaria japonica при эксперименталь‑
ном КЭ у мышей.
Материал и методы. Выделение, изучение хими‑
ческого состава и структуры фукоидана проведено в
Тихоокеанском институте биоорганической химии
Макаренкова Илона Дамировна – канд. мед. наук, старший
научный сотрудник лаборатории иммунологии НИИЭМ СО РАМН;
тел.: 8 (4232) 44-24-46; e-mail: ilona_m@mail.ru.
ДВО РАН [14]. Фукоидан, выделенный из бурой во‑
доросли Laminaria japonica (молекулярная масса 10–
30 кДа), является α-L-фуканом, сульфатированным
в основном по С-4 остаткам фукозы, и отличается
высоким содержанием галактозы. Моносахаридный
состав представлен галактозой, маннозой, ксилозой
и глюкозой в соотношении 65:20:8:4:3.
В эксперименте использовали вирус КЭ дальне‑
восточного субтипа, штамм Р-73, выделенный из
мозга человека, умершего от очаговой формы инфек‑
ции. Неинбредных мышей-самцов массой 14–16 г
(по 20 в группе) инфицировали подкожно однократ‑
но в дозе 10 LD50/0,2 мл (инфекционный титр вируса
7,5 lg LD50/0,2 мл). При профилактической схеме вво‑
дили различные дозы фукоидана из L. japonica за 24
часа до заражения. При лечебной схеме инфициро‑
ванным животным вводили фукоидан через 1 час
после заражения. Под наблюдением в течение 21 дня
находились следующие группы животных:
1-я группа: контроль (зараженные мыши, не получав‑
шие препарат);
2-я группа: мыши, которым вводили фукоидан одно‑
кратно или ежедневно в течение 5 дней внутрибрю‑
шинно в дозе 100 и 400 мкг на особь за 24 часа до за‑
ражения;
3-я группа: мыши, получавшие фукоидан однократ‑
но или ежедневно в течение 5 дней внутримышечно в
дозе 100 и 400 мкг на особь за 24 часа до заражения;
4-я группа: мыши, которым вводили фукоидан еже‑
дневно в течение 5 дней внутрибрюшинно в дозе 100
и 400 мкг на особь через 1 час после заражения;
5-я группа: мыши, получавшие фукоидан однократно
или ежедневно в течение 5 дней внутримышечно в до‑
зе 100 и 400 мкг на особь через 1 час после заражения.
Проводили визуальное наблюдение за животными.
Признаками заболевания считали вялость, ограниче‑
ние подвижности, взъерошенность шерсти, отсутс‑
твие аппетита, парезы и параличи конечностей. В каж‑
дой группе рассчитывали показатели летальности на
каждый день наблюдения. Результаты оценивали по
защите, выживаемости и средней продолжительнос‑
ти жизни (СПЖ) животных. Мыши содержались в
стандартных условиях вивария с соблюдением правил
и международных рекомендаций Европейской кон‑
венции по защите позвоночных животных. Мышей
выводили из опыта эфирным наркозом. Эксперимен‑
тальные исследования проведены с разрешения коми‑
тета по биомедицинской этике НИИЭМ СО РАМН.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
90
Рис. 1. Эффективность действия фукоидана из L. japonica на
выживаемость мышей, инфицированных вирусом КЭ при
внутрибрюшинном введении (профилактическая схема).
Статистическая обработка полученных результа‑
тов проведена с использованием программ GeoStat и
Biostatistics 4.03.
Результаты исследования. Летальность мышей в
контрольной группе составила 100% на 11-й день на‑
блюдения, СПЖ – 9,98±0,38 дня. Наибольший про‑
тективный эффект зарегистрирован при профилак‑
тическом однократном внутрибрюшинном введении
препарата в дозе 400 мкг (2-я группа). Данная доза
и способ введения обеспечивали защиту 45±5% жи‑
вотных на 11–13-й день. К 21-му дню выживаемость
мышей в этой группе составила 30±10% при СПЖ
12,62±0,63 дня. Следует отметить, что протективный
эффект фукоидана наблюдался на протяжении всего
срока эксперимента, а СПЖ увеличивалась до 26,65%
(рис. 1).
При профилактическом внутримышечном введе‑
нии (3-я группа) наибольшее протективное действие
зарегистрировано при дозе 100 мкг на особь в течение
всего срока наблюдения. Однократное применение
фукоидана способствовало защите 45±5% животных
на 11-й день и 40±10% – на 12-й день, а выживае‑
мость в группе составила 20%, при СПЖ 12,75±0,42
дня с ее увеличением на 27,55%. При введении пре‑
парата в течение 5 дней были получены аналогичные
результаты: к концу срока наблюдения выживаемость
животных составила 25±5%, СПЖ – 12,6±0,23 дня с
ее увеличением на 26,25%. Внутримышечное введе‑
ние фукоидана в дозе 400 мкг на особь не оказывало
защитного действия (рис. 2).
Исследование протективного действия при вве‑
дении фукоидана через 1 час после заражения (ле‑
чебная схема) показало, что наиболее эффективно
было внутрибрюшинное применение препарата в
течение 5 дней в дозе 400 мкг на особь (4-я группа).
На 11–12‑й день выжило 40±10% животных. На 21-й
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
Рис. 2. Эффективность действия фукоидана из L. japonica
на выживаемость мышей, инфицированных вирусом КЭ
при внутримышечном введении (профилактическая схема).
Рис. 3. Выживаемость мышей, инфицированных вирусом
КЭ при внутримышечном введении фукоидана из L. ja­po­ni­
ca (лечебная схема).
день выживаемость в группе составила 25±15%, при
СПЖ – 12,44±1,31 дня с ее увеличением на 24,64%.
Внутримышечное введение фукоидана через 1 час
после заражения показало эффективность 5‑дневного
применения обеих доз препарата (100 и 400 мкг, 5-я
группа). При дозе 100 мкг на особь выживаемость к
концу срока наблюдения составила 20±10%, СПЖ –
11,59±0,57 дня при ее увеличении на 16,3%. Протек‑
тивное действие фукоидана в дозе 400 мкг способс‑
твовало защите 45±5% животных на 11–12-й день. На
21‑й день выживаемость равнялась 25±5%, СПЖ –
12,14±0,11 дня при ее увеличении на 21,64% (рис. 3).
Обсуждение полученных данных. Исследование
протективного действия сульфатированного поли‑
сахарида – фукоидана из морской бурой водоросли
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
L. ja­po­ni­ca при инфицировании мышей высокопато‑
генным штаммом вируса клещевого энцефалита по‑
казало, что он способствует защите мышей, инфи‑
цированных этим вирусом на 11–13-е сутки при
100% гибели животных в контроле. При этом эф‑
фективность действия препарата зависела от дозы,
кратности и схемы введения.
Исследования B. Mytar [10] и Т.С. Запорожец
[2] показали, что в механизме иммуномодулирую‑
щей активности сульфатированных полисахаридов
особая роль принадлежит их способности индуци‑
ровать синтез и секрецию провоспалительных ци‑
токинов клетками моноцитарно-макрофагального
ряда. Это способствует экспрессии молекул адгезии,
активации нейтрофилов, макрофагов и NK-клеток,
усилению фагоцитоза, пролиферации лимфоцитов
и увеличению синтеза γ-интерферона NK-клетка‑
ми, что обеспечивает их участие в антиинфекцион‑
ной защите [2, 10]. Увеличение выживаемости жи‑
вотных, зараженных вирусом КЭ, при однократном
введении фукоидана, по-видимому, обусловлено
активацией факторов врожденного иммунитета и
секрецией провоспалительных цитокинов. Форми‑
рование защиты против вируса при многократном
введении полисахарида, на наш взгляд, связано с
активацией гуморальных и клеточных факторов
адаптивного иммунитета.
В свою очередь, противовирусная активность
фукоиданов, по мнению ряда авторов [4, 9, 11, 13],
может быть обусловлена ингибированием адсорб‑
ции и последующей репликации вирусов в клетках
макроорганизма за счет их связывания с определен‑
ными мембранными молекулами на клеточной по‑
верхности. Известно, что за адсорбцию вируса кле‑
щевого энцефалита, взаимодействие с рецепторами
клеток и слияние вирусной и клеточной мембран
отвечает экспонированный на поверхности вири‑
онов гликопротеин Е [6]. Рецепторами для вируса
клещевого энцефалита на поверхности клеток яв‑
ляются гликопротеины, гепарансульфаты и лами‑
нинсвязывающий белок.
Высказано предположение, что на поверхности
гликопротеина Е вируса существует участок, который
может взаимодействовать с разными типами рецепто‑
ров для ламинина: интегринами, сульфатированными
полисахаридами, гликолипидами, а также неинтегри‑
новыми мембранными протеинами, в состав которых
входит ламининсвязывающий белок [6]. Это позволя‑
ет предположить, что сульфатированные полисахари‑
ды наряду с гепарансульфатами и ламининсвязываю‑
щим белком могут являться одними из ко-рецепторов
для вируса клещевого энцефалита. Возможно, что в
результате конкурентного лиганд-рецепторного взаи‑
модействия происходит связывание фукоидана с гли‑
копротеином вируса, что препятствует слиянию кле‑
точной и вирусной мембран, ведет к ингибированию
адсорбции вируса и способствует созданию защиты у
инфицированных мышей.
91
Одним из важнейших требований к противови‑
русным препаратам является создание защиты и
способность удлинять инкубационный период ин‑
фекционного процесса [1]. Результаты исследова‑
ния показали, что фукоидан способствует увеличе‑
нию СПЖ и выживаемости мышей, инфицирован‑
ных вирусом КЭ.
Таким образом, полученные результаты показали,
что фукоидан из бурой водоросли L. japonica облада‑
ет защитным действием на модели эксперименталь‑
ного клещевого энцефалита, которое наблюдается
на протяжении всего эксперимента. Мы предпола‑
гаем, что протективное действие фукоидана может
быть непосредственно связано как с его воздейс‑
твием на факторы врожденного и адаптивного им‑
мунитета, так и с противовирусной активностью,
обусловленной конкурентным углеводспецифичес‑
ким взаимодействием с мембранными рецепторами
клеток-мишеней.
Широкий биологический спектр действия суль‑
фатированных полисахаридов из морских бурых во‑
дорослей, низкая токсичность и экологически чистые
технологии производства открывают перспективы для
дальнейшего исследования и применения фукоида‑
нов для профилактики и лечения вирусных инфекций.
Литература
1. Грибенча С.В., Холмс Р.Д., Атауллаханов Р.И., Баринс­
кий И.Ф. Противовирусная активность пептидного им­
муномодулятора «Гепон» в экспериментах на модели улич­
ного вируса бешенства // Вопросы вирусологии. 2003. № 4.
С. 40–44.
2. Запорожец Т.С. Клеточные и молекулярные механизмы
иммуномодулирующего действия биополимеров морских
гидробионтов: дис. … докт. мед. наук. г. Владивосток.
2006. 352 с.
3. Клещевой энцефалит / под ред. Г.Н. Леоновой, Л.М. Сомо­
вой-Исачковой. Владивосток: Приморский полиграфком­
бинат, 2002. 192 с.
4. Макаренкова И.Д., Компанец Г.Г., Беседнова Н.Н. и др.
Ингибирующее действие фукоиданов на адсорбцию вируса
Хантаан на модели перитонеальных макрофагов // Вопр.
вирусол. 2008. № 3. С. 12–15.
5. Шевченко Н.М. Строение, биологическая активность по­
лисахаридов некоторых бурых водорослей и продуктов их
ферментативной трансформации: дис. … канд. хим. наук.
Владивосток. 2001. 93 с.
6. Романова Л.Ю., Гмыль Л.В. Локтев В.Б. и др. Изменение
антигенной структуры поверхностного гликопротеи­
на Е вируса клещевого энцефалита при его адаптации к
клещам и млекопитающим // Вопросы вирусологии. 2006.
№ 6. С. 31–34.
7. Berteau O., Mullou B. Sulfated fucans, fresh perspectives:
structures, functions and biological properties of sulfated fucans
and an overview of enzymes active toward this class of polysac­
charide // Glycobiology. 2003. Vol. 13, No. 6. P. 29–40.
8. Cumashi A., Ushakova N.A., Preobrazhenskaya M.E. et al.
A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant,
antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different
fucoidans from brown seaweeds // Glycobiology. 2007. Vol. 17,
No. 5. P. 541–552.
9. Mandal P., Mateu C.G., Chattopadhyay K. et al. Structural fea­
tures and antiviral activity of sulphated fucans from the brown
seaweed Cystoseira indica // Antivir. Chem. Chemother. 2007.
Vol. 18, No. 3. P. 153–162.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
92
10. Mytar B., Gawliska M., Szatanek R. et al. Induction of intra­
cellular cytokine production in human monocytes/macrophages
with ligands of pattern recognition receptors // Inflamm. Res.
2004. Vol. 101, No. 3. P. 100–106.
11. Ponce N.M., Pujol C.A., Damonte E.B. et al. Fucoidans from
the brown seaweed Adenocystis utricularis: extraction methods,
antiviral activity and structural studies // Carbohydr. Res. 2003.
Vol. 338, No. 2. P. 153–165.
12. Preeprame S., Hayashi K., Lee J.B. et al. A novel antivirally
active fucan sulfate derived from an edible brown alga, Sar­
gassum horneri // Chem. Pharm. Bull. 2001. Vol. 49, No. 4.
P. 484–485.
13. Zhu W., Chiu L.C., Ooi V.E. et al. Antiviral property and mode
of action of a sulphated polysaccharide from Sargassum patents
against herpes simplex virus type 2 // Int. J. Antimicrob. Agents.
2004. Vol. 24, No. 3. P. 279–283.
14. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Chizhov A.O. et al. Wa­
ter-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds.
Distribution, structure, and their dependence on the develop­
mental conditions // J. Exp. marine Biol. Ecol. 2003. Vol. 294,
Is. 1. P. 1–13.
Поступила в редакцию 07.04.2009.
PROTECTIVE EFFECTS OF FUCOIDAN DERIVED
FROM BROWN ALGAE LAMINARIA JAPONICA UNDER
EXPERIMENTAL TICK-BORNE ENCEPHALITIS
I.D. Makarenkova1, N.V. Kryilova1, G.N. Leonova1,
N.N. Besednova1, T.N. Zvyagintseva2, N.M. Shevchenko2
1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the RAMS,
Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087 Russia),
2 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS
(159 100-Anniversary Av. Vladivostok 690022 Russia)
Summary – The paper provides experimental study into the pro‑
tective effects of sulphated polysaccharide fucoidan derived from
the sea brown algae Laminaria japonica after in vivo infecting
mice with highly pathogenic strain of tick-borne encephalitis vi‑
rus. As reported, the drug efficiency depends on dose and dosing
regimen, and it allows obtaining adequate protection in infected
animals. A wide range of biological effects produced by the sul‑
phated polysaccharides extracted from the sea brown algae, low
toxicity and environmentally friendly production technologies
offer great opportunities of applying fucoidans in an effort to
prevent and treat viral infections.
Key words: virus, tick-borne encephalitis, fucoidan, protective ef­
fects, survival rate.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 83–86.
УДК 616-006-085.322:582.272:577.14
О.С. Вищук1, С.П. Ермакова2, Фам Дюк Тин3, Н.М. Шевченко2, Буи Минг Ли3, Т.Н. Звягинцева2
Дальневосточный государственный университет (690950 г. Владивосток, ул. Октябрьская, 27), 2 Тихоокеанский институт
биоорганической химии ДВО РАН, Россия (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159), 3 Нячангский
институт технологических исследований и применений ВАНТ (Вьетнам г. Нячанг, ул. Хунгвонг, 02)
1 ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ ФУКОИДАНОВ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ
Ключевые слова: фукоиданы, бурые водоросли, противоопухолевая активность.
Противоопухолевое действие фукоиданов из 9 видов бурых
водорослей исследовано на модели мягких агаров. Показа‑
но, что фукоиданы нетоксичны к клеткам DLD-1 и HT-29 в
концентрациях до 200 мкг/мл. Установлено, что фукоидан
из Laminaria cichorioides, состоящий из 1,3-связанных моле‑
кул α-L-фукозы, ингибирует рост колоний раковых клеток
кишечника, а низкосульфатированные фукогалактаны из
Sar­gassum swartzii, S. mcClurei, S. denticarpum практически не
обладают противоопухолевой активностью. Полученные
результаты демонстрируют, что использование фукоиданов
бурых водорослей дальневосточных морей может оказаться
перспективным для предотвращения и лечения онкологи‑
ческих заболеваний.
В настоящее время большое внимание уделяет‑
ся изучению полисахаридов, выделенных из таких
природных источников, как бактерии, грибы, водо‑
росли и растения. Полисахариды бурых водорослей
представлены альгиновыми кислотами, ламинара‑
нами и фукоиданами, проявляющими различную
биологическую активность. Так, альгинат натрия
является самым активным и безвредным природ‑
ным сорбентом, а также повышает фагоцитарную
активность клеток животных и человека [10]. Лами‑
нараны (1,3- и 1,6‑β‑D-глюканы) известны как про‑
тивораковые вещества, радио- и криопротекторы,
активаторы иммунной системы [3, 15]. Фукоиданы
Ермакова Светлана Павловна – канд. хим. наук, старший науч‑
ный сотрудник лаборатории химии ферментов ТИБОХ ДВО РАН,
тел: 8 (4232) 31-07-05, добавочный.4; e-mail: swetlana_e@mail.ru.
проявляют чрезвычайно широкий спектр биологи‑
ческой активности, что является причиной повы‑
шенного интереса к ним. Так, в литературе имеются
сообщения о противоопухолевых и противовоспа‑
лительных свойствах фукоиданов [11, 12]. Особый
интерес вызывает антикоагулянтное действие фу‑
коиданов [2, 6]. Кроме того, эти соединения, как
правило, являются иммуностимуляторами [13]. По
этой причине их можно отнести к так называемым
«поливалентным биомодуляторам». Однако интен‑
сивность изучения биологической активности фу‑
коиданов значительно опережает исследования их
химической структуры.
Имеется небольшое количество данных о связи
структуры и биологической активности этих поли‑
сахаридов. Считается, что биологическая активность
фукоиданов обусловлена в первую очередь степенью
сульфатирования, наличием фрагментов определен‑
ной структуры. Кроме того, она может быть связана
с моносахаридным составом, степенью разветвлен‑
ности, типом связи, молекулярно-массовым распре‑
делением [1, 9, 14]. С определенной уверенностью
установить структурный мотив, который отвечает за
проявление той или иной биологической активности
фукоиданов, пока так и не удалось.
Целью настоящей работы явился анализ про‑
тивоопухолевой и антиметастатической активнос‑
ти фукоиданов, выделенных из различных бурых
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
водорослей и имеющих разную структуру, на модели
мягких агаров.
Материалы и методы. Реагенты и материалы:
DEAE – целлюлоза и мембраны 3 кДа – коммерчес‑
кие препараты фирмы Sigma и Millipore (США) соот‑
ветственно; органические растворители, неоргани‑
ческие кислоты и соли – коммерческие препараты
фирмы «Диаэм» (Россия); клеточные линии HT-29,
DLD-1 были предоставлены Hormel Institute Uni­
versity of Minnesota (Austin, MN США). Среда RPMI1640 – 10% фосфатный буфер с добавлением пени‑
циллина (100 Ед/л) и стрептомицина (100 мкг/л).
Фосфатный буфер, пенициллин, стрептомицин,
L‑глутамин, трипсин, этилендиаминтетрауксусная
кислота, эмбриональный бычий альбумин, гидро‑
карбонат натрия, агар – коммерческие препараты
фирмы «Биолот» (Россия). Водоросли: бурая водо‑
росль Fucus evanescens была собрана в экспедиции
НИС «Академик Опарин» в июле 2003 г. на побережье
острова Большой Шантар Охотского моря; Laminaria
ja­po­ni­ca, Undaria pinatifida, L. cichorioides были собра‑
ны в июле 2005 г. в бухте Троица Японского моря на
Морской экспериментальной станции ТИБОХ ДВО
РАН; Sargassum sp. были собраны в Южно-Китайс‑
ком море у побережья Вьетнама в мае–июне 2007 г.
Полисахариды: фукоиданы были выделены по моди‑
фицированному методу [4].
Определение содержания общих углеводов в выде‑
ленных образцах полисахаридов проводили коло‑
риметрически с помощью феноло-сернокислотно‑
го метода [8]. Определение содержания сульфатных
групп в полисахаридах проводили с помощью тит‑
риметрического метода [7]. Кислотный гидролиз полисахаридов: образец фукоидана (5 мг) растворяли в
0,5 мл 2M трифторуксусной кислоты; реакционную
смесь нагревали при 100°C в течение 6 часов. Мо‑
носахаридный состав определяли на углеводном
анализаторе Biotronik IC-5000 (Германия), исполь‑
зуя колонку Shim-pack ISA-07/S2504 (0,4×25 см);
элюировали калиево-боратным буфером, скорость
элюции – 0,6 мл/мин; обнаружение проводили би‑
цинхонинатным методом; интегрирующая система
Shimadzu C-R2 AX.
13
C-ЯМР-спектроскопия: спектры 13C-ЯМР для
растворов веществ в D2O были получены на ядерномагнитно-резонансном спектрометре Bru­ker Avance
DPX-300 NMR с рабочей частотой 75,5 МГц при тем‑
пературе 60°C.
Культивирование клеток: клетки рака кишечника
человека HT-29 и DLD-1 культивировали в питатель‑
ной среде RPMI-1640, 10% FBS с добавлением пени‑
циллина (100 Ед/л) и стрептомицина (100 мкг/л) в
инкубаторе MCO-18AIC, SANYO (Япония) при тем‑
пературе 37°С, содержание СО2 – 5%.
Определение цитотоксичности фукоиданов. Клетки
рака кишечника человека HT-29 и DLD-1 (5×104/мл)
рассевали в 96-луночные планшеты и культивирова‑
ли в 200 мкл 10% RPMI-1640 в CO2-инкубаторе при
93
температуре 37°С в течение 24 часов. Затем клетки
обрабатывали фукоиданами различной концентра‑
ции (10, 50, 100 и 200 мкг/мл) и инкубировали в тече‑
ние 24 часов. После инкубации добавляли по 15 мкл
3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолин
бромида (MTS-реагент) и инкубировали 4 часа (37°С,
5% CO2). Оптическую плотность измеряли на спект‑
рофотометре Bio-Tek Instruments (США), при длине
волны 490/630 нм (А490/630).
Неопластическая трансформация клеток (метод
мягких агаров). Действие фукоиданов бурых водо‑
рослей на формирование и рост колоний клеток рака
кишечника человека определяли с помощью мето‑
да мягкого агара [5]. Клетки рака кишечника (8×103
клеток) обрабатывали фукоиданами из бурых водо‑
рослей L. ci­chorioides, F. evanescens, U. pinnatifida, L. ja­
po­ni­ca, Sar­gassum swartzii, S. oligocystum, S. denticarpum,
S. mcClurei, S. polycystum. (50, 100 мкг/мл). Клетки
культивировали при 37°С (5% СО2) в течение 30 дней.
Колонии клеток были оценены с использованием
обратимого микроскопа Motic AE 20 (Китай) и про‑
граммы Mo­tic Image Plus.
Статистическая обработка данных проведена с
использованием t-критерия Стьюдента в условиях
заданной доверительной вероятности, равной 95%
(программа SigmaPlot 2000, вер. 6, SPSS Inc., США).
Результаты исследования. Фукоиданы бурых водо‑
рослей были очищены при помощи описанной выше
комбинации методов. Фукоиданы, выделенные из
бурых водорослей дальневосточных морей, являются
высокосульфатированными полисахаридами, тогда
как фукоиданы из бурых водорослей Южно-Китай‑
ского моря – низкосульфатированные, за исключе‑
нием фукоидана из S. polycystum. Содержание суль‑
фатов в фукоиданах из L. cichorioides и U. pinnatifida
составляет 38 и 36% соответственно. Фукоиданы из
F. eva­nes­cens, L. japonica и S. polycystum содержат около
30% сульфатов. В остальных полисахаридах из сар‑
гассовых водорослей содержание сульфатных групп
составляет менее 12%.
Анализ моносахаридного состава исследуемых
соединений позволяет разделить их на фуканы, фу‑
когалактаны и галактофуканы. Фуканами являются
сульфатированные полисахариды из F. evanescens,
L. ci­cho­rioides. Фукогалактан выделен из L. japonica,
галактофукан – из U. pinnatifida. Все полисахариды
из саргассовых водорослей являются фукогалактана‑
ми (табл.).
По структуре главной цепи фукоиданы разделя‑
лись на три группы:
1. Полисахариды, молекулы которых содержат в глав‑
ной цепи 1,3-связанные α-L-фукопиранозные остат‑
ки (L. cichorioides);
2. Полисахариды, молекулы которых построены из
чередующихся 1,3- и 1,4-связанных остатков α-L-фу‑
копиранозы (F. evanescens);
3. Полисахариды, в главной цепи которых чередуют‑
ся 1,3-; 1,4-связанные остатки α-L-фукопиранозы
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
94
му, особенностями их структуры. Исследуемые
соединения отличаются друг от друга по типу
гликозидных связей, моносахаридному составу,
Моносахаридный состав, мольные %
степени сульфатирования, молекулярной мас‑
се. Ранее на клеточной линии JB6 Cl41 нами
Водоросль
было показано, что фукоиданы из L. ci­cho­rioi­des
и L. gu­ria­no­vae обладают более сильным инги‑
бированием процесса трансформации клеток
F. evanescens
20–40 31,0 94,9 0,2 1,93
2,8
0,0
мыши JB6 Cl41 под действием эпидермально‑
L. japonica
20–30 26,0 59,4 5,2 43,4
2,2
9,6
го фактора роста по сравнению с фукоиданом
из F. eva­nes­cens. Возможно, для проявления
L. cichorioides
60–80 38,0 91,8 3,5 4,6
0,0
0,0
превентивного действия фукоиданов необхо‑
U. pinnatifida
30–50 36,0 33,8 2,0 61,1
0,9
2,2
димо присутствие 1,3‑связанной α-L-фукозы.
S. swartzii
н/о 5,9 35,8 19,2 32,3
9,9
2,8
В настоящем исследовании фукоиданы из L. ci­
S. oligocystum
н/о 9,1 41,3 8,9 38,3
7,1
3,4
cho­rioi­des и L. japonica проявили наиболее вы‑
раженное
противоопухолевое действие. Другие
S. denticarpum
н/о 11,2 40,1 15,9 38,7
5,3
0,0
соединения, такие как фукоиданы из S. swartzii,
S. mcClurei
н/о 2,8 38,5 4,2 33,1
3,6
20,6
S. denticarpum и S. mcClurei, практически не об‑
S. polycystum
н/о 32,1 32,4 12,6 35,3
8,5
11,2
ладали противоопухолевой активностью.
1
Вероятно, противоопухолевая активность
н/о – не определяли.
фукоиданов зависела от строения главной цепи
и галактозы (U. pinnatifida, S. swartzii, S. oligocystum, молекулы. Об этом говорит тот факт, что фукоидан
S. den­ti­car­pum, S. mcClurei, S. polycystum).
из L. ci­cho­rioides, проявивший наибольшую актив‑
Обработка клеток DLD-1 и HT-29 фукоиданом из
ность, содержал главную цепь, построенную только
L. cichorioides в концентрации до 200 мкг/мл не при‑ из α‑1,3‑связанной фукозы. Фукоиданы из F. eva­nes­
водила к торможению их роста и не сопровождалась
cens и U. pin­na­ti­fi­da, активность которых была мень‑
массовой гибелью (рис. 1). Аналогичные результаты
ше, построены из 1,3- и 1,4-связанных остатков
получены при использовании и других фукоиданов. α‑L‑фукопиранозы и чередующихся 1,3- и 1,4-связан‑
В дальнейших экспериментах все препараты фукои‑ ных остатков α-L-фукопиранозы и галактозы соот‑
данов использовали в дозе 50 мкг/мл.
ветственно.
Торможение роста колоний в клетках DLD-1,
Таким образом, все исследованные полисахари‑
обработанных фукоиданом в дозе 50 мкг/мл, со‑ ды были нетоксичны в концентрации до 200 мкг/мл.
ставило более 50% для фукоиданов, выделенных из
В наших экспериментах на модели мягких агаров
L. cichorioides, L. japonica. Фукоиданы из F. evanescens, впервые показано, что фукоиданы из F. evanescens,
U. pinnatifida, S. polycystum и S. oligocystum ингибирова‑ L. ja­po­ni­ca, L. cichorioides, U. pinnatifida, S. oligocystum и
ли рост колоний от 50 до 70%. Слабое ингибирование
S. po­ly­cys­tum обладают противоопухолевой активнос‑
до 20% показали фукоиданы из S. swartzii, S. mcClurei, тью по отношению к клеткам рака кишечника чело‑
S. den­ti­car­pum (рис. 2, а).
века DLD-1 и HT-29.
Наиболее значительные показатели торможения
Полученные данные могут представлять несом‑
роста колоний для клеточной линии НТ-29 были
ненный интерес, поскольку соединения, обладаю‑
получены при обработке их фукоиданами из L. ci­cho­ щие низкой токсичностью и проявляющие биологи‑
rioi­des и S. polycystum: в 2 раза по сравнению с кон‑ ческую активность, находят применение в медицине
тролем. Слабое ингибирование роста колоний фу‑ [13]. Использование фукоиданов как ингибиторов
коиданами из S. swartzii, S. mcClurei, S. denticarpum
роста колоний в нетоксических дозах может оказаться
было аналогично их действию на клетки DLD-1. Об‑
работка фукоиданами из S. oligocystum, F. evanescens,
U. pinnatifida и L. japonica клеточной линии НТ-29
приводила к снижению количества колоний от 60 до
70% (рис. 2, б). Сопоставление противоопухолевой
активности 9 исследованных фукоиданов, собранных
в разных регионах, позволило выявить среди них как
высокоактивные ингибиторы роста колоний клеток
рака кишечника, так и фукоиданы, практически не
проявляющие противоопухолевого действия.
Обсуждение полученных данных. Различия в про‑
тивоопухолевой активности между фукоиданами из
Рис. 1. Жизнеспособность клеток DLD-1 и HT-29,
различных источников обусловлены, по-видимо‑
обработанных фукоиданом.
глюкоза
ксилоза
галактоза
манноза
фукоза
Сульфаты, %
Молекулярная
масса, кДа1
Таблица
Структурные характеристики фукоиданов бурых водорослей
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
95
а
б
Рис. 2. Ингибирующее действие фукоиданов на рост колоний клеток рака кишечника человека DLD-1 (а) и HT-29 (б).
перспективным для предотвращения и лечения рако‑
вых заболеваний. Задачами нашей дальнейшей рабо‑
ты является исследование взаимосвязи между струк‑
турными особенностями фукоиданов и их противо‑
опухолевым действием.
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ
№ 09-04-00761-а, № 09-04-90312-Вьет_а и программы
«Молекулярная клеточная биология».
Литература
1. Кузнецова Т.А., Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н. и др.
Биологическая активность фукоиданов из бурых водорос­
лей и перспективы их применения // Антибиотики и хими­
отерапия. 2004. Т. 49, № 5. С. 24–27.
2. Лапикова Е.С., Дрозд Н.Н., Толстенков А.С. и др. Инги­
бирование тромбина и фактора Ха фукоиданом из Fucus
evanescens и его модифицированными аналогами // Бюл.
эксп. биол. и мед. 2008. Т. 146, № 9. С. 304–309.
3. Чертков К.С., Давыдова С.А., Нестерова Т.А. и др. Эффек­
тивность полисахарида транслама как средства раннего
лечения острой лучевой болезни // Радиационная биология.
Радиоэкология. 1999. Т. 39. С. 572–577.
4. Шевченко Н.М., Кусайкин М.И., Урванцева и др. Способ
комплексной переработки бурых водорослей с получением
препаратов для медицины и косметологии // Патент RU
2240816. 2004. БИ 33. С. 444–445.
5. Colburn N.H., Wendel E.J., Abruzzo G. Dissociation of mitogen­
esis and late-stage promotion of tumor cell phenotype by phorbol
esters: mitogen-resistant variants are sensitive to promotion //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. Vol. 78. P. 6912–6916.
6. Cumashi A., Ushakova N.A., Preobrazhenskaya M.E et al. A com­
parative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, antiangio­
genic, and antiadhesive activities of nine different fucoidans from
brown seaweeds // Glycobiology. 2007. Vol. 17. P. 541–552.
7. Dodgson K.S., Price, R.G. A note on the determination of the
ester sulphate content of sulphated polysaccharides // Biochem.
J. 1962. Vol. 84. P. 106–110.
8. Dubois M., Gilles K., Hamilton J.K., Rebers P.A. et al. A colo­
rimetric method for the determination of sugars // Nature. 1951.
Vol. 168. P. 167.
9. Haroun-Bouhedja F., Ellouali M., Sinquin C. et al. Relation­
ship between sulfate groups and biological activities of fucans //
Braz. J. Med. Biol. 2000. Vol. 100. P. 453.
10. Kikunaga S., Miyata Y., Ishibashi G. et al. The bioavailability
of magnesium from Wakame (Undaria pinnatifida) and Hijiki
(Hijikia fusiforme) and the effect of alginic acid on magnesium
utilization of rats // Plant Foods Hum. Nutr.1999. Vol. 53.
P. 265–274.
11. Lee N.Y., Ermakov, S.P., Zvyagintsev, T.N. et al. Inhibitory
effects of fucoidan on activation of epidermal growth factor re­
ceptor and cell transformation in JB6 Cl41 cells // Food Chem.
Toxicol. 2008. Vol. 46. P. 1793–1800.
12. Lee N.Y., Ermakova S.P., Choi H.K. et al. Fucoidan from Lam­
inaria cichorioides inhibits AP-1 transactivation and cell trans­
formation in the mouse epidermal JB6 cells // Mol. Carcinog.
2008. Vol. 47. P. 629–637.
13. Li B., Lu F., Wei X., Zhao R. Fucoidan: structure and bioactivi­
ty // Molecules. 2008. Vol. 13. P. 1671–1695.
14. Nishino T., Aizu Y., Nagumo, T. The influence of sulfate con­
tent and molecular weight of a fucan sulfate from the brown sea­
weed Ecklonia kurome on its antithrombin activity // Thromb.
Res. 1991. Vol. 64. P. 723–731.
15. Zhongcun P., Kodo O., Taкashi M. Structure of b-glucan oligo­
mer from laminarin ang its effect on human Monocytes to inhibit
the proliferation of U937 cells // Biosci. Biotechnol. Biochem.
2005. Vol. 69. P. 553–558.
Поступила в редакцию 06.04.2009.
ANTICANCER ACTIVITY OF BROWN ALGAE-DERIVED
FUCOIDANS
O.S. Vischuk1, S.P. Ermakova2, Fam Dyuk Tin3,
N.M. Shevchenko2, Bui Ming Li3, T.N. Zvyagintseva2
1 Far Eastern National University (27 Oktyabrskaya St.
Vladivostok 690950 Russia), 2 Pacific Institute of Bioorganic
Chemistry, FEB RAS (159 100-Anniversary Av. Vladivostok
690022 Russia), 3 Nha Trang Institute of Technological Studies
and VANT Application (2 Hungvuong St. Nha Trang Vietnam)
Summary – The authors have studied anticancer activities of fu‑
coidans derived from nine brown algae species using the soft agaragar model. As shown, the fucoidans are non-toxic to DLD-1
and HT-29 cells in concentrations of up to 200 µg/mL. The fu‑
coidan extracted from Laminaria cichorioides and composed of
1.3-tie molecules α-L-fucose tends to inhibit growth of cancer
cell colonies in bowels. The low sulphated fucogalactans derived
from Sargassum swartzii, S. mcClurei and S. denticarpum do not
really exhibit anticancer properties. The findings allowed con‑
sidering application of the brown algae-derived fucoidans (Far
Eastern seas) as very promising in effort to prevent and treat on‑
cological diseases.
Key words: fucoidans, brown algae, anticancer activity.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 86–89.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
96
УДК 616-006.04-085.322:582.272:577.14
С.Я. Жанаева, Т.В. Алексеенко, Т.А. Короленко, Т.Н. Звягинцева
НИИ физиологии СО РАМН (630117 г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 4)
ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ И АНТИМЕТАСТАТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ СУЛЬФАТИРОВАННОГО
ПОЛИСАХАРИДА ФУКОИДАНА БУРОЙ ВОДОРОСЛИ ОХОТСКОГО МОРЯ FUCUS EVANESCENS
Ключевые слова: экспериментальная опухоль, фукоидан, циклофосфан, катепсины.
На модели экспериментальной перевиваемой аденокарци‑
номы легких Льюиса у мышей линии C57BL/6J исследова‑
на противоопухолевая и антиметастатическая активность
сульфатированного полисахарида фукоидана, выделенного
из бурой водоросли Охотского моря Fucus Evanescens. По‑
казано, что выраженность антиметастатического действия
зависит от дозы препарата. При однократном или повтор‑
ном введении в дозе 10 мг/кг фукоидан оказывал самостоя‑
тельное умеренное антиметастатическое действие, а также
потенцировал антиметастатическую, но не противоопухо‑
левую активность циклофосфана. В меньших и больших до‑
зировках (5 и 25 мг/кг) фукоидан заметного влияния на рост
и метастазирование аденокарциномы не оказывал. В дозе
25 мг/кг фукоидан при совместном применении с цикло‑
фосфаном усиливал токсическое действие цитостатика.
Фукоиданы представляют собой класс полианион‑
ных разветвленных гомо- и гетерополисахаридов, со‑
стоящих преимущественно из остатков сульфатиро‑
ванной α-L-фукозы [11–13]. Основным источником
фукоиданов являются все виды бурых водорослей,
однако в наибольших концентрациях они присутс‑
твуют в двух видах – Fucales и Laminares [6]. В крас‑
ных, зеленых и золотистых водорослях фукоиданы не
обнаружены [6, 14]. Кроме бурых водорослей фукои‑
даны встречаются также в тканях некоторых морских
беспозвоночных [6, 13, 14].
Впервые сульфатированный полисахарид «фуко‑
идан» из морских бурых водорослей был выделен еще
в 1913 г. [6], и длительное время он рассматривался
главным образом в качестве источника L-фукозы.
В настоящее время интерес к этому классу полиса‑
харидов значительно возрос в связи с полученными
в последние десятилетия сведениями о их биологи‑
ческой активности: антикоагулянтной, антитром‑
бической, противовоспалительной, антивирусной,
иммуностимулирующей и противоопухолевой, что
связывают со способностью этих полисахаридов вза‑
имодействовать с рядом белков и влиять на свойства
клеточной поверхности [1–4, 6, 12–14].
Противоопухолевая и антиметастатическая ак‑
тивность фукоиданов из различных источников была
продемонстрирована на моделях мышиных опухолей
in vivo и в экспериментах in vitro [4, 12]. Было пока‑
зано, что фукоиданы участвуют в таких клеточных
процессах, как миграция, адгезия, рост и апоптоз
клеток, играющих важную роль в механизмах не‑
отрансформации [1, 4, 12]. Противоопухолевая ак‑
Жанаева Светлана Яковлевна – канд. биол. наук, ведущий
научный сотрудник НИИ физиологии СО РАМН; тел.: 8 (383)
334-89-56; e-mail: djsja@mail.ru.
тивность фукоиданов может быть опосредована их
иммуностимулирующими свойствами. Кроме того, в
экспериментах in vitro выявлена прямая цитотокси‑
ческая активность некоторых фукоиданов в отноше‑
нии ряда опухолевых клеток [4].
Использованный нами полисахарид фукоидан из
бурых водорослей Охотского моря в настоящее вре‑
мя структурно охарактеризован и стандартизован [1].
Показано, что он обладает низкой токсичностью, хо‑
рошей растворимостью и возможностью для парен‑
терального и перорального введения [1, 3]. Исследо‑
ваны иммуностимулирующие и антикоагулянтные
свойства фукоидана [1, 3]. В экспериментах in vivo и
in vitro установлена его способность стимулировать
фагоцитоз и кислородзависимые механизмы бак‑
терицидности нейтрофилов, усиливать продукцию
провоспалительных цитокинов, взаимодействовать с
поверхностными рецепторами макрофагов и влиять
на их активность. Получены данные о противовирус‑
ной активности препарата [1]. Показана способность
фукоидана индуцировать апоптоз в клетках злокачес‑
твенных лимфом и повышать их чувствительность к
индукции апоптоза стандартными индукторами in
vit­ro [1, 12].
В настоящей работе на модели эксперименталь‑
ной опухоли мышей – аденокарциномы легких Лью‑
иса – мы продолжили исследования противоопухо‑
левой и антиметастатической активности фукоидана,
выделенного из бурой водоросли Охотского моря Fu­
cus evanescens.
Материал и методы. Эксперименты проведены
на 2–3-месячных самцах и самках мышей линии
C57BL/6J, полученных из вивария Института цито‑
логии и генетики СО РАН (Новосибирск). Живот‑
ных содержали по 8–10 особей в клетке при естес‑
твенном освещении и свободном доступе к воде и
пище (гранулированный комбикорм ПК 120-1 для
лабораторных крыс и мышей, сбалансированный по
аминокислотному составу, минеральным веществам
и витаминам; ООО «Лабораторснаб», Москва). Все
экспериментальные процедуры выполняли в соот‑
ветствии с международными правилами работы с
животными (European Communities Council Directive
86/609/EEC). Опыты проводили в осенне-зимний
период.
Опухоль индуцировали трансплантацией клеток
аденокарциномы в мышцы бедра (2–5×106 клеток на
мышь). Опухоль развивалась в виде солидного узла в
мышцах бедра и метастазировала преимущественно
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
97
Кратность
введения
Таблица 1
в легкие. Использованный в работе суль‑
Влияние
фукоидана
на
массу
печени
и
селезенки
у
мышей
с
фатированный полисахарид фукоидан c
аденокарциномой
легких
Льюиса
молекулярной массой 20–40 кДа был вы‑
делен из бурой водоросли Fucus evanescens
Относительный вес, %
методом горячей экстракции [3].
Группа
Проведено 2 серии экспериментов.
печени
селезенки
В первой через 9 суток после перевивки
опухоли животным однократно вводили
Контроль
1
5,60±0,22 1,80±0,17
фукоидан в дозе 25 мг/кг или фукоидан сов‑ Фукоидан (25 мг/кг)
1
5,80±0,24 1,70±0,08
местно с циклофосфаном (ЦФ) – 100 мг/кг.
Фукоидан (25 мг/кг) + ЦФ (100 мг/кг)
1
6,90±0,361 2,20±0,041
Во второй серии фукоидан применяли од‑
Контроль
3
5,10±0,11 0,80±0,03
но- или трехкратно в дозе 5 или 10 мг/кг
Фукоидан (5 мг/кг)
3
5,50±0,05 1,20±0,041
через 5, 8 и 12 суток после трансплантации
Фукоидан (10 мг/кг)
3
5,30±0,28 1,00±0,101
опухоли, а ЦФ (100 мг/кг) – однократно
1
4,70±0,29 1,10±0,25
на 12-е сутки после перевивки опухоли. Фукоидан (10 мг/кг) + ЦФ (100 мг/кг)
Фукоидан
(10
мг/кг)
+
ЦФ
(100
мг/кг)
3
6,20±0,151 2,00±0,101
Препараты растворяли в физиологичес‑
ком растворе и вводили внутрибрюшинно
ЦФ (100 мг/ кг)
3
5,10±0,33 1,50±0,111
в объеме 0,1 мл на 10 г массы тела.
1
Разница с соответствующим контролем статистически значима.
За животными наблюдали в течение
20 суток, после чего их декапитировали, задние ко‑ мой на 3–5%. Относительный вес селезенки при трех‑
нечности отсекали и по разности их веса определяли
кратном применении фукоидана в дозах 5 и 10 мг/кг
массу опухоли. Легкие фиксировали в 10% формали‑ увеличивался в 1,3–1,5 раза. Влияние однократного
не и под бинокулярной лупой подсчитывали в них
введения полисахарида совместно с ЦФ на печеноч‑
количество метастазов. Противоопухолевый и анти‑ ный и селезеночный индексы было сравнимо с дейс‑
метастатический эффекты препаратов оценивали по
твием одного ЦФ, однако трехкратное применение
снижению массы опухоли по сравнению с контролем
фукоидана совместно с ЦФ приводило к существен‑
и среднему количеству метастазов в легких.
ному – в 1,2 и 2,5 раза соответственно – увеличению
В гомогенатах опухоли определяли активность
относительного веса печени и селезенки (табл. 1).
катепсинов В и L по методу Barrett и Kirschke [5].
При трехкратном применении в дозах 5 и 10 мг/кг
В качестве субстратов использовали соответственно
фукоидан проявлял выраженную самостоятельную
Z-L-Phe-L-Arg-MCA и Z-L-Arg-L-Arg-MCA (Sigma, антиметастатическую активность и способность по‑
USA). Для определения активности катепсина L при‑ тенцировать антиметастатический эффект ЦФ. При
меняли селективный ингибитор катепсина В СА-074
этом наиболее значительное торможение метастази‑
(Sigma, USA). Флуоресценцию растворов определяли
рования было показано в группе мышей, получав‑
при помощи спектрофотометра Perkin Elmer 650-10S, ших фукоидан в дозе 10 мг/кг совместно с ЦФ в дозе
результаты выражали количеством освобожденного 100 мг/кг (табл. 2). Введение одного ЦФ приводило к
в результате ферментативной реакции метилкумари‑ 4‑кратному снижению количества метастазов в лег‑
ламида в минуту в расчете на белок. Активность ка‑ ких мышей, а у животных, получавших одновремен‑
тепсина D определяли спектрофотометрическим ме‑ но с ЦФ одно- и трехкратно фукоидан, количество
тодом [15], используя в качестве субстрата азоказеин
метастазов было соответственно в 11 и 8 раз меньше
(Sigma, USA) и выражали в условных единицах.
(табл. 2). При повторном введении одного фукоида‑
Статистическую обработку полученных дан‑ на в дозе 10 и 5 мг/кг количество метастазов в легких
ных проводили с использованием пакета программ
было соответственно в 1,4 и 1,2 раза меньше по срав‑
Statistica 6.0, достоверность различий оценивали с
нению с контролем (табл. 2).
помощью непараметрического U-критерия Манна–
Заметного противоопухолевого эффекта фукои‑
Уитни.
дана выявлено не было. Следует отметить, что в отде‑
Результаты исследования и обсуждение полученных
льных наблюдениях был получен выраженный само‑
данных. Наиболее эффективным оказалось повтор‑ стоятельный противоопухолевый эффект этого по‑
ное применение фукоидана в расчете 10 мг/кг. В этой
лисахарида при трехкратном введении в дозе 10 мг/кг.
дозировке препарат удовлетворительно переносился
При этом торможение роста опухоли в терминальном
животными, не влиял на продолжительность жизни
периоде жизни мышей (на 20-е сутки после перевив‑
мышей с опухолью и на относительный вес печени, ки опухоли) составило 33%. Однако в дальнейших
что является косвенным свидетельством низкой ток‑ исследованиях подобного эффекта получить не уда‑
сичности препарата и его незначительного влияния
лось. Также не было обнаружено потенцирующего
на метаболические процессы в гепатоцитах. Тем не
влияния фукоидана на эффект ЦФ: торможение рос‑
менее следует отметить, что при внутрибрюшинном
та первичных опухолей при однократном введении
введении фукоидан вызывал кратковременное (в те‑ фукоидана составило 51%, при трехкратном – около
чение суток) снижение веса мышей с аденокарцино‑ 40%, а при действии одного ЦФ – 56% (табл. 2).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
98
Таблица 2
Влияние фукоидана и циклофосфана на рост внутримышечных трансплантатов опухоли Льюиса и количество метастазов в
легкие у мышей
Масса опухоли
Кол-во метастазов
Группа
Доза фукои‑
дана, мг/кг
абс., г
%2
абс.
%2
Контроль
Фукоидан на 9-е сутки1
Фукоидан + ЦФ (100 мг/кг) на 9-е сутки1
Контроль
Фукоидан на 5, 8 и 12-е сутки1
Фукоидан + ЦФ (100 мг/кг) на 12-е сутки1
Фукоидан на 5, 8 и 12-е сутки + ЦФ (100 мг/кг) на 12-е сутки1
ЦФ (100 мг/ кг) на 12-е сутки1
Контроль
Фукоидан на 5, 8 и 12-е сутки1
Фукоидан на 5, 8 и 12-е сутки + ЦФ (100 мг/кг) на 12-е сутки1
ЦФ (100 мг/кг) на 12 сутки1
–
25
25
–
по 10
10
по 10
–
–
по 5
по 5
–
4,20±0,41
5,20±0,50
4,20±0,40
4,30±0,44
2,90±0,203
2,10±0,293
2,60±0,253
1,90±0,403
4,20±0,43
5,10±0,313
3,40±0,26
2,80±0,35
100,0
123,8
100,0
100,0
67,4
48,8
60,5
44,2
100,0
121,0
80,9
66,7
0
0
0
34,6±3,12
24,6±3,333
3,2±1,543
4,1±0,923
8,8±2,453
9,3±2,43
7,6±1,39
0,1±0,083
0,3±0,213
0
0
0
100,0
71,1
9,2
11,6
25,4
100,0
81,7
1,1
3,2
После перевивки опухоли.
Процент от контроля.
3
Разница по сравнению с соответствующим контролем статистически значима.
1
2
Однократное применение фукоидана в дозе 25
мг/кг в комбинации с 100 мг/кг ЦФ оказалось ток‑
сичным – к 20-му дню после перевивки опухоли из
10 мышей погибло 7. Из 10 мышей, получавших толь‑
ко фукоидан в дозе 25 мг/кг, погибли 3, тогда как в
контрольной группе животных (без лечения), а также
в группе животных, получавших только ЦФ, гибели
не наблюдалось. Кроме того, однократное введение
фукоидана в дозе 25 мг/кг тормозящего влияния на
рост опухоли не оказывало (табл. 2).
Для изучения одного из возможных механизмов
действия фукоидана в тканях аденокарциномы у мы‑
шей исследовали активность цистеиновых протеаз
лизосом – катепсинов В и L, а также аспартильной
протеазы катепсина D. Известно, что протеазы лизо‑
сом наряду с другими протеазами клеток (сериновые
протеазы, активаторы и ингибиторы плазминогена,
матриксные металлопротеазы) играют важную роль в
регуляции опухолевого роста, а также участвуют в ре‑
ализации апоптотический или некротической гибели
опухолевых клеток [3, 7–10]. Трехкратное примене‑
ние фукоидана в дозе 10 мг/кг самостоятельно или
в сочетании с ЦФ приводило к достоверному сни‑
жению активности катепсина L в ткани опухоли, но
не влияло на активность катепсина В. Исключение
составил катепсин D – его активность была повыше‑
на у мышей, леченых ЦФ в сочетании с трехкратным
введением фукоидана (рис.). В последнем случае
имело место выраженное потенцирующее воздейс‑
твие фукоидана на эффект ЦФ.
Таким образом, на модели перевиваемой адено‑
карциномы легких Льюиса у мышей впервые пока‑
зано, что фукоидан обладает в определенной мере
самостоятельной антиметастатической активностью,
а также способностью к потенцированию антимета‑
статической, но не противоопухолевой активности
цитостатического препарата (циклофосфан). Бо‑
лее эффективным является повторное применение
полисахарида в умеренных дозах. В высокой дози‑
ровке (25 мг/кг) фукоидан оказывает токсическое
действие и приводит к гибели части животных. Ме‑
ханизм действия фукоидана на опухоль неизвестен:
возможно, он связан со способностью этого поли‑
сахарида усиливать выработку макрофагами факто‑
ра некроза опухолей и стимулировать фагоцитарную
активность макрофагов и нейтрофилов [6, 10, 13,
14]. Для выяснения этих вопросов требуются даль‑
нейшие исследования.
Литература
Рис. Изменение удельной активности катепсинов L и D
в ткани опухоли у мышей при лечении фукоиданом и ЦФ
(«звездочка» – разница с контролем статистически значима).
1. Беседнова Н.Н., Запорожец Т.С. Фундаментальные и при­
кладные аспекты изучения биополимеров из гидробионтов
Тихого океана // Бюлл. СО РАМН. 2008. № 4. С. 16–21.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
2. Галебская Л.В., Рюмина Е.В., Богомаз Т.А. и др. Меха­
низмы воздействия фукоидана на комплемент человека //
Биомедицинская химия. 2001. Т. 49, № 6. С. 24–27.
3. Кузнецова Т.А., Беседнова Н.Н., Мамаев А.Н. и др. Анти­
коагулянтная активность фукоидана из бурой водоросли
Охотского моря Fucus evanescens // Бюлл. экспер. биол. и
мед. 2003. Т.136, № 1. С. 532–534.
4. Куэрос К., Ассис К., Медейрос В. и др. Цитотоксический
эффект полисахридов, выделенных из водорослей, на HL
60 клетки // Биохимия. 2006. Т. 71, № 12. С. 1613–1617.
5. Barrett A. Kirschke H. Cathepsin B, cathepsin H and cathepsin
L // Methods Enzymol. 1981. Vol. 80. P. 535–561.
6. Berteau O., Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: struc­
tures, functions, and biological properties of sulfated fucans and
an overview of enzymes active toward this class of polysaccha­
ride // Glycobiol. 2003. Vol. 13, No. 6. P. 29R–40R.
7. Fehrenbacher N., Jaattela M. Lysosomes as targets for cancer
therapy // Cancer Res. 2005. Vol. 65. P. 2993–2995.
8. Lah T.T., Calaf G., Kalman E. et al. Cathepsins D, B, and L in
transformed humen breast epithelial cell // Breast Cancer Res.
Treatment. 1996. Vol. 39. P. 221–233.
9. Laurent-Matha V., Maruani-Herrmann S., Prebois C. et al.
Catalytically inactive human cathepsin D triggers fibroblast in­
vasive growth // J. Cell Biol. 2005. Vol. 168, No. 3. P. 489–499.
10. Patankar M.S., Oehninger S., Barnett T. et al. A revised struc­
ture for fucoidan may explain some of its biological activities // J.
Boil. Chem. 1993. Vol. 268, No. 29. P. 21771–21776.
11. Pereira M.S., Mulloy B., Mourao A.S. Structure and antico­
agulant activity of sulfated fucans // J. Biol. Chem. 1999. Vol.
274, No. 12. P. 7656–7667.
12. Philchenkov A., Zavelevich M., Imbs T. et al. Sensitization of
human malignant lymphoid cells to etoposide by fucoidan, a
brown seaweed polysaccharide // Exp. Oncol. 2007. Vol. 29,
No. 3. P. 181–185.
13. Pomin V.H., Pereira M.S., Valente A-P. et al. Selective cleav­
age and anticoagulant activity of a sulfated fucans: stereospe­
99
cific removal of a 2-sulfate ester from the polysaccharide by mild
acid hydrolysis, preparation of oligosaccharides, and heparin
cofactor II-dependent anticoagulant activity // Glycobiol. 2005.
Vol. 15, No. 4. P. 369–381.
14. Pomin V.H., Mourao P.A.S. Structure, biology, evolution, and
medical importance of sulfatede fucans and galactans // Glyco­
biol. 2008. Vol. 18, No. 12. P. 1016–1027.
15. Wiederanders B., Oelke B. Accumulation of inactive cathep­
sin D in old rats // Mech. Ageing Dev. 1984. Vol. 24, No. 3.
P. 265–271.
Поступила в редакцию 10.04.2009.
ANTICANCER AND ANTIMETASTATIC ACTIVITY
OF SULPHATED POLYSACCHARIDE FUCOIDAN
DERIVED FROM THE OKHOTSK SEA BROWN ALGAE
FUCUS EVANESCENS
S.Ya. Zhanaeva, T.V. Alekseenko, T.A. Korolenko,
T.N. Zvyagintseva
Research Institute of Physiology of the RAMS, Siberian Branch
(4 Academian Timakov St. Novosibirsk 630117 Russia)
Summary – In vitro model of transplantable Lewis’s pulmonary
adenocarcinoma in C57BL/6 mice allowed to study anticancer
and antimetastatic effect of the sulphated polysaccharide fucoi‑
dan derived from the Okhotsk Sea brown algae Fucus evanescens.
As shown, the intensity of antimetastatic effects depended on the
dose of the drug. Single or repeated introduction of the drug in
the dose of 10 mg/kg induced spontaneous moderate antimeta‑
static effect and potentiated antimetastatic but not anticancer
activity of cyclophosphan. The smaller and larger doses (5 and
25 mg/kg) did not result in any noticeable effects on the growth
and dissemination of adenocarcinoma. Combined with cyclo‑
phosphan, the fucoidan applied in the dose of 25 mg/kg intensi‑
fied toxic action of the cytostatic drug.
Key words: experimental tumor, fucoidan, cyclophosphan,
cathepsins.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 90–93.
УДК 616.24-001.18/19-085.23
А.Л. Шутикова1, С.С. Целуйко2, Т.С. Запорожец1, Л.М. Эпштейн3, Н.Н. Беседнова1
НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 Амурская государственная
медицинская академия (675000 г. Благовещенск, ул. Горького, 95), 3 Тихоокеанский научно-исследовательский
рыбохозяйственный центр (690950 г. Владивосток, пер. Шевченко, 4)
1 ВЛИЯНИЕ МОЛЛЮСКАМА НА МУКОЦИЛИАРНУЮ СИСТЕМУ ВОЗДУХОНОСНОГО ОТДЕЛА ЛЕГКИХ
И СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ ПРИ ГИПОТЕРМИИ
Ключевые слова: слизистая оболочка трахеи, биологически активные вещества, моллюскам, гипотермия.
В эксперименте изучено влияние моллюскама – комплек‑
са аминокислот и дипептидов – на мукоцилиарную систе‑
му воздухоносного отдела легких и свободнорадикальные
процессы при гипотермии. Работа выполнена на 60 крысахсамцах, 40 из которых охлаждали в климатокамере (в т.ч.
20 животных, получавших моллюскам). Проведены элек‑
тронно-микрокопическое и биохимическое исследования.
Показано, что введение биологически активной добавки
оказывало защитное действие, предупреждая как измене‑
ния слизистой оболочки трахеи, так и усиление процессов
липопероксидации.
Проблема экологической детерминированности фун‑
кционального состояния дыхательной системы и фор‑
мирования патологии органов дыхания является осо‑
Шутикова Анна Леонидовна – мл. науч. сотрудник лаборатории
иммунологии НИИЭМ СО РАМН; тел.: 8 (4232) 44-24-46; e-mail:
shutikova79@mail.ru.
бенно актуальной в условиях Дальнего Востока. В этом
регионе в структуре заболеваемости населения веду‑
щее место занимают неспецифические болезни лег‑
ких. Показатель заболеваемости населения Дальнего
Востока данной патологией превышает показатели по
России на 40% [2]. Главными неблагоприятными кли‑
матическими факторами региона являются холод и
влажность. Адаптация к холодовому воздействию мо‑
жет продолжаться до 5–7 лет и сопровождается целым
рядом функциональных нарушений и морфологичес‑
ких изменений, в большей степени затрагивающих
органы дыхания и кожу [4]. Морфологические изме‑
нения при холодовой адаптации обусловлены наруше‑
нием целостности клеточных мембран, активировани‑
ем перекисного окисления липидов, нарушением ан­
тиоксидантной защиты, напряжением кислородного
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
100
режима, изменением реологических свойств крови,
нарушением моторики ресничек мерцательного эпи‑
телия и ослаблением факторов местного иммунитета
слизистой оболочки дыхательных путей [4].
В последнее время при поиске новых криопротек‑
торов, используемых для профилактики заболеваний
органов дыхания, особенно в холодное время года,
исследователи все больше внимания уделяют биоло‑
гически активным веществам и разработанным на их
основе биологически активным добавкам к пище, об‑
легчающим адаптацию к холоду и предназначенным
для коррекции иммунных нарушений и свободнора‑
дикальных процессов, инициированных влиянием
низких температур. К числу таких препаратов отно‑
сится моллюскам – комплекс свободных аминокис‑
лот и гистидинсодержащих дипептидов, выделенный
из двустворчатых и головоногих моллюсков. Ранее
было показано, что моллюскам обладает иммуномо‑
дулирующими и антиоксидантными свойствами [8].
Целью настоящей работы явилось эксперимен‑
тальное обоснование применения моллюскама для
облегчения адаптации к холоду воздухоносного от‑
дела легких.
Материал и методы. Работа выполнена на 60 неин‑
бредных крысах-самцах массой 200 г, находившихся
на стандартной диете в боксированных помещениях с
соблюдением всех правил и международных рекомен‑
даций Европейской конвенции по защите позвоноч‑
ных животных, используемых в экспериментальных
работах [9]. Разброс по массе тела животных – не бо‑
лее 10%. Экспериментальные исследования проведе‑
ны с разрешения Комитета по биомедицинской этике
НИИЭМ СО РАМН (протокол № 3/2 от 14.07.2004 г.).
Для формирования холодового воспаления крыс
помещали в климатокамеру Foentron (ГДР), создаю‑
щую постоянный режим охлаждения при –15°С в ус‑
ловиях относительной влажности окружающего воз‑
духа от 70 до 80%. В камере предусматривалась подача
воздуха для предупреждения гипоксии, световой ре‑
жим, нахождение животных в свободном состоянии.
В работе использовали биологически активное
вещество – моллюскам [5]. Химический состав мол‑
люскама: свободные аминокислоты (таурин, аспа‑
рагиновая кислота, треонин, глутаминовая кислота,
пролин, глицин, аланин, цистеин, валин, метионин,
изолейцин, лейцин, тирозин, фенилаланин, β-ала‑
нин, орнитин, лизин, гистидин, аргинин) – 56–71%,
липиды – менее 1%, белки – 19–25%, углеводы – ме‑
нее 1%, минеральные вещества – 7,9–8,5%, гисти‑
динсодержащие дипептиды – 2–14,3%. Все живот‑
ные были разделены на 3 группы по 20 особей:
1. Контрольная группа – интактные животные, кото‑
рых содержали в стандартных условиях вивария при
температуре +18–20°С;
2. Группа «холод» – животных охлаждали в течение 28
дней по 3 часа ежедневно при температуре –15°С.
3. Опытная группа – животные, которые ежедневно
в течение 14 дней получали перорально моллюскам
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
в дозе 10 мг/кг, после чего их охлаждали в течение 28
дней по 3 часа ежедневно при температуре –15°С на
фоне введения биологически активного вещества (за
30 мин до охлаждения).
По окончании эксперимента у крыс под эфирным
наркозом извлекали трахею. Кусочки ее слизистой
оболочки фиксировали в охлажденном 2,5% глютар­
альдегиде на какодилатном буфере, трижды отмывали
фосфатным буфером (рН 7,3–7,4), дофиксировали 1%
раствором OsO4, обезвоживали в растворах этанола
возрастающей концентрации (до 100%) и готовили
для электронно-микроскопического исследования по
Б. Уикли [7]. Полутонкие срезы окрашивали толуиди‑
новым синим или тионином. Микроскопирование и
фотографирование осуществляли на фотомикроскопе
Microphot-FXA (Nikon, Япония). Для контрастирова‑
ния ультратонких срезов использовали насыщенный
раствор уранилацетата и цитрат свинца (Serva). Сре‑
зы просматривали в электронном микроскопе JEM100CXII (Jeol, Япония). Для сканирующей электрон‑
ной микроскопии материал готовили по соответс‑
твующей методике [6]. Обезвоживание осуществляли
на аппарате НСР-2 (Япония). Вакуумное напыление
проводили углеродом и золотом на установке УВ-3,
НИЦ-5В (Япония). Микроскопирование выполняли
на электронном растровом микроскопе Hitachi-520
(Япония) при ускоряющем напряжении 25 кВ. У всех
экспериментальных животных исследовали также по‑
казатели перекисного окисления липидов и антиокси‑
дантной защиты. Содержание малонового диальдеги‑
да и витамина Е в периферической крови определяли
согласно общепринятым методикам [1, 3].
Статистическую обработку полученных данных
проводили с помощью пакета программ «Биостат»
и Excel. Использовали следующие методы: проверку
нормальности распределения количественных при‑
знаков при малом числе наблюдений (W-критерий
Шапиро–Уилка), t-критерий Стьюдента (для неза‑
висимых выборок).
Результаты исследования и обсуждение полученных
данных. По данным трансмиссионной электронной
микроскопии клеточный состав слизистой оболочки
трахеи интактных крыс был представлен шестью ви‑
дами клеток: реснитчатыми (52,3±4,3%), бокаловид‑
ными (11,53±1,1%), промежуточными (10,57±0,9%),
базальными (21,3±1,8%), мигрирующими тучными
(2,3±0,8%) и щетинчатыми (2,0±0,6%). Апикальная
поверхность реснитчатой клетки покрыта регулярно
расположенными ресничками (от 80 до 100. В про‑
межутке между ними помещаются микроворсинки.
Основное количество митохондрий располагается
ближе к апикальному полюсу клетки. Митохондрии
имеют плотный матрикс и большое количество крист,
расположенных перпендикулярно их длиннику. Эн‑
доплазматическая сеть представлена гранулярным
ретикулумом. В надъядерной зоне часто встречается
комплекс Гольджи и единичные лизосомы. Ядро кле‑
ток овальное, содержит одно ядрышко.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
101
Рис. Поверхность слизистой
оболочки трахеи крыс.
а
б
в
г
Бокаловидные клетки у интактных крыс сгруп‑
пированы по 5–20 штук, имеют развитый комплекс
Гольджи, способный секретировать гранулы гли‑
копротеидов (рис., а). У клеток, не имеющих секре‑
та, микроворсинки мелкие, напоминающие шарики,
прикрепленные к поверхности в большом количестве
(более 200 штук). По мере созревания и скапливания
секрета под апикальной мембраной наблюдается уве‑
личение высоты микроворсинок с одновременным
уменьшением апикальной поверхности клетки с
последующим появлением на поверхности ресничек
гранул диаметром 0,1–0,5 мкм. Соотношение бока‑
ловидных клеток к реснитчатым составляет 1:4,54.
При длительном вдыхании охлажденного воздуха
наблюдалась перестройка эпителия слизистой обо‑
лочки трахеи, сопровождающаяся нарушением регу‑
лярного расположения ресничек. В одних случаях они
образовывали скопления по 20–60 штук, в других – на‑
правление ресничек в различные стороны приводило
к исчезновению поперечных волн движения, хорошо
различимых у интактных животных (рис., б). В рес‑
нитчатых клетках регистрировались дегенеративные
изменения: на апикальном полюсе значительно уве‑
личивалось количество разветвленных митохондрий
и рибосом, отчетливо выявлялись тонофибриллы.
Часть реснитчатых клеток имела в апикальном полюсе
расширенные каналы эндоплазматического ретику‑
лума. Образующиеся вакуоли сливались, формируя
значительные скопления секрета. В этих клетках об‑
наруживались разбухшие митохондрии, расширенные
цистерны эндоплазматического ретикулума. Матрикс
митохондрий приобретал значительную плотность,
нередко маскируя кристы.
а – интактные крысы: островки, со­
стоящие из бокаловидных клеток
(стрелки); б, в – крысы, подвергнутые
охлаждению: нарушение мукоцилиар­
ного транспорта в результате «скле­
ивания» ресничек (б) и скопления слизи
на их поверхности (в); г – крысы, под­
вергнутые охлаждению на фоне введе­
ния моллюскама: нормальный рельеф:
между ресничками выделяются апи­
кальные полюса бокаловидных клеток
с большим количеством микроворсинок.
Сканирующая электронная микроско­
пия; а – ×2000, б – ×1000, в – ×5000,
г – ×5000.
В слизистой оболочке трахеи крыс, подвергнутых
охлаждению, значительно увеличивалось содержание
мигрирующих тучных клеток, отличаясь от такового
у интактных животных. Содержание бокаловидных
клеток также увеличивалось (табл. 1). Отдельные бо‑
каловидные клетки содержали в апикальной части
значительные скопления гликопротеидов. Апикаль‑
ная поверхность клеток выступала над ресничками,
образуя купола, лишенные микроворсинок. Увеличе‑
ние содержания бокаловидных и мигрирующих туч‑
ных клеток приводило к гиперсекреции слизи, что
подтверждалось как увеличением ее количества на
поверхности слизистой оболочки, так и изменением
соотношения реснитчатых и бокаловидных клеток
(1:3,59). Характер слизи при этом был различным.
В ряде случаев наблюдали слизистый мелкопористый
материал, располагающийся на поверхности ресничек.
Однако в ряде наблюдений объем этого секрета значи‑
тельно увеличивался, формировались сложные поли‑
меризованные структуры мукополисахаридов (рис. в).
При холодовом воздействии снижался регенерацион‑
ный потенциал эпителия слизистой оболочки трахеи
за счет уменьшения количества промежуточных и ба‑
зальных клеток (табл. 1).
Таким образом, при действии холода нарушает‑
ся регулярное расположение ресничек, снижается
регенерационный потенциал эпителия слизистой
оболочки трахеи за счет уменьшения количества про‑
межуточных и базальных клеток, содержание бока‑
ловидных и мигрирующих тучных клеток увеличива‑
ется, что приводит к увеличению выработки слизи.
Пероральное введение моллюскама эксперимен‑
тальным животным оказывало выраженное защитное
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
102
Таблица 1
Сравнительная характеристика морфометрических показателей
слизистой оболочки трахеи экспериментальных животных
Показатель
Клетки покровно‑
го эпителия
реснитчатые, %
бокаловидные, %
промежуточные, %
базальные, %
щетинчатые, %
мигрирующие тучные, %
Ширина базальной пластины,
мкм
Высота эпителиального
пласта, мкм
1
Группа
1-я
2-я
3-я
52,3±4,3
11,53±1,1
10,57±0,9
21,3±1,8
2,0±0,6
2,3±0,8
52,6±4,4
14,7±1,3
4,4±0,41
15,5±1,31
2,0±0,7
10,3±0,91
52,4±4,3
10,8±1,2
11,1±0,92
21,8±1,9
2,0±0,6
2,6±0,7
3,2±0,2
4,0±0,3
3,4±0,2
18,3±1,0
20,1±1,6
1
действие на эпителий слизистой оболочки, предуп‑
реждая изменения, характерные для холодового воз‑
действия. Реснитчатый покров у крыс, получавших
моллюскам, сохранял характерный волнообразный
рельеф, хотя на поверхности ресничек в небольшом
количестве выявлялись клеточные элементы и слизь.
При сканирующей электронной микроскопии повер‑
хность бокаловидных клеток не отличалась от таковой
интактных крыс. Бокаловидные клетки встречались
чаще группами (по 5–10), на поверхности выявлялось
большое количество мелких микроворсинок (рис., г).
По данным трансмиссионной электронной микроско‑
пии, бокаловидные клетки имели обычные размеры.
Секреторная активность этих клеток характеризова‑
лась обилием гранул секрета у апикального полюса и
отсутствием его на поверхности. При ультраструктур‑
ном анализе органоидов реснитчатых клеток отмечено
их нормальное строение. Клеточный состав и морфо‑
метрические показатели слизистой оболочки при со‑
четанном действии моллюскама и холода значимых
отличий от интактных животных не имели (табл. 1).
У этих же животных были исследованы показатели
перекисного окисления липидов и антиоксидантной
системы в плазме крови при действии холода. Было
установлено, что общее охлаждение крыс в течение 28
дней вызывает значимое повышение содержания вто‑
ричного продукта перекисного окисления липидов –
малонового диальдегида и снижение уровня витами‑
на Е. Введение крысам моллюскама предупреждало
усиление процессов перекисного окисления липидов
и перерасход витамина Е при холодовом стрессе: кон‑
центрация этих соединений оставались на уровне по‑
казателей контрольной группы (табл. 2).
Таким образом, предварительное (перед холодовым
воздействием) и последующее введение крысам мол‑
люскама предупреждало как изменения слизистой обо‑
лочки трахеи, характерные для холодового воздействия,
так и усиление процесса липопероксидации, снижая
расход природных антиоксидантов, в частности, вита‑
мина Е. На основании полученных экспериментальных
Группа
Малоновый диаль‑
дегид, нмоль/л
1-я
2-я
3-я
4,90±0,37
6,06±0,341
4,97±0,24
Витамин Е, мкг/мл
43,38±4,30
32,48±2,291
39,77±2,15
1
Различия статистически значимы по сравнению с
контролем.
данных можно рекомендовать моллюскам для
профилактики заболеваний органов дыхания,
особенно в холодное время года.
Литература
1. Бородин Е.А., Арчаков А.И. Стабилизация и реак­
тивация цитохрома Р-450 фосфатидилхолином при
перекисном окислении липидов // Биол. мембраны. 1987. № 7.
С. 719–728.
2. Иванов Е.М. Здоровье населения Приморья, состояние и
прогноз // Мед.-фарм. вести Приморья. 1998. № 5. С. 7–9.
3. Кисилевич Р.Ш., Скварко С.И. Об определении витамина Е
в крови // Лаб. дело. 1972. № 8. С. 473–475.
4. Пастухов Ю.Ф., Максимов В.В., Хаскин А.Л. Адаптация
к холоду и условиям Субарктики: проблемы термофизиоло­
гии. Магадан: СВНЦ ДВО РАН, 2003. Т.1. 373 с
5. Пивненко Т.Н., Давидович В.В., Позднякова Ю.М. и др.
Продукт, обогащенный свободными аминокислотами, и
способ его получения: патент РФ № 2171066 от 22.03.2000.
Владивосток, 2000.
6. Ровенский Ю.А. Растровая электронная микроскопия нор­
мальных и опухолевых клеток. М.: Медицина, 1979. 150 с.
7. Уикли Б. Электронная микроскопия для начинающих / пер.
с англ. М.: Мир, 1975. 310 с.
8. Шутикова А.Л. Иммуномодулирующие и антиоксидантные
свойства биологически активных веществ из морских гид­
робионтов и их использование в гериатрической практике:
автореф. дис. … канд. мед. наук. Владивосток, 2009. 25 с.
9. Europen Convention for the Protection of Vertebrate Animals
used for Experimental and Other Scientific Purposes Strasbourg,
18. III. 1986 - URL: http://convention.coe.Int/Treaty/rus/
Treaties/Html/123.htm (последнее обращение 2.03.2009).
Поступила в редакцию 02.04.2009.
MOLLUSKAM’S EFFECT ON MUCOCILIARY SYSTEM
OF AIR-BEARING PART OF LUNGS AND FREE
RADICAL PROCESSES UNDER HYPOTHERMIA
A.L. Shutikova1, S.S. Tseluyiko2, T.S. Zaporozhets1, L.M. Epstein3,
N.N. Besednova1
1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the RAMS,
Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087 Russia),
2 Amursky State Medical Academy (95 Gorkiy St. Blagoveshchensk
675000 Russia), 3 Pacific Research Fishery Centre (4 Shevchenko
Lane, Vladivostok 690950 Russia)
Summary – The paper provides detailed information about in
vitro researching into the effects of molluskam being a complex
of amino acids and dipeptides on the mucociliary system of airbearing part of lungs, and free radical processes under hypother‑
mia. All the researches were performed on sixty male-rates, the
forty ones being cooled in the climatic chamber (including those
twenty animals that had been receiving molluskam). Electron
microscopic and biochemical studies allowed to see this dietary
supplement having protective effect, preventing any changes in
the mucous tunic of trachea and intensifying lipoperoxidation.
Key words: mucous tunic of trachea, biologically active substances,
molluskam, hypothermia.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 93–96.
18,7±1,1
Различия статистически значимы по сравнению с контролем.
Таблица 2
Показатели перекисного окисления липидов
и антиоксидантной системы в плазме крови крыс
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
103
УДК 616.13-004.6-085.37:615.322:582.272
К.В. Майстровский1, Т.С. Запорожец1, Л.Н. Федянина2, Т.К. Каленик2, Е.В. Моткина2, Т.И. Имбс3
НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 Тихоокеанский
государственный экономический университет (690091 г. Владивосток, Океанский пр-т, 19), 3 Тихоокеанский институт
биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159)
1 ВЛИЯНИЕ ИММУНОМОДУЛЯТОРА ФУКОИДАНА ИЗ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ FUCUS EVANESCENS
НА ПОКАЗАТЕЛИ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ, ЛИПИДНОГО И УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА У МЫШЕЙ
Ключевые слова: фукоидан, обмен липидов и углеводов, эксперимент.
На моделях алиментарной гиперхолестеринемии и аллок‑
санового диабета у мышей изучено влияние иммуномоду‑
лятора фукоидана из бурых водорослей Fucus evanescens на
состояние антиоксидантной системы, липидный и угле‑
водный обмен. Установлена способность данного поли‑
сахарида снижать уровень глюкозы и общего холестерина,
нормализовать распределение холестерина между фрак‑
циями липопротеидов, снижать коэффициент атероген‑
ности и стабилизировать уровень продуктов перекисного
окисления липидов.
Нарушения липидного и углеводного обмена лежат
в основе патогенеза многих заболеваний, и в первую
очередь атеросклероза. К настоящему времени так‑
же получены доказательства патогенетической свя‑
зи между изменениями обмена липидов, углеводов
и системным воспалением, являющимся одним из
важнейших и неотъемлемых компонентов атероге‑
неза [8–10]. В этой связи эффективность профилак‑
тических и лечебных мероприятий на всех стадиях
атеросклероза во многом связана с коррекцией дис‑
липидемий, нормализацией углеводного обмена и
оксидантного статуса.
Основными гиполипидемическими препаратами
на сегодняшний день являются ингибиторы синтеза
холестерина (статины), фибраты, производные ни‑
котиновой кислоты. Постоянный или длительный
прием этих препаратов замедляет процесс прогрес‑
сирования атеросклероза, однако высокая стоимость
лечения и побочные эффекты диктуют поиск альтер‑
нативных решений. Одним из возможных подходов
здесь может явиться использование биокорректоров,
в том числе сульфатированных полисахаридов, обла‑
дающих многокомпонентным действием.
В экспериментах на животных показана способ‑
ность фукоидана из Laminaria japonica значительно
снижать уровень общего холестерина, триглицери‑
дов и липопротеидов низкой плотности, увеличи‑
вать содержание липопротеидов высокой плотности
в сыворотке крови при гиперхолестеринемии и ги‑
перлипидемии, нормализовать процессы перекис‑
ного окисления, а также эффективно предотвращать
формирование экспериментальной гиперхолестери‑
немии [11–13]. Результаты клинических испытаний
Федянина Людмила Николаевна – д-р. мед. наук, профессор
кафедры товароведения и экспертизы продовольственных товаров
ТГЭУ; тел.: 8 (4232) 40-66-38; e-mail: fedyanina52@mail.ru.
фукоидана у больных с гиперлипидемией [11] также
свидетельствуют о гиполипидемических свойствах
данного полисахарида.
Ранее мы показали, что фукоидан из бурой во‑
доросли Охотского моря Fucus evanescens обладает
иммуномодулирующими, противовоспалительными,
антикоагулянтными свойствами [1]. Установлено
также корригирующее влияние биологически ак‑
тивной добавки «Фуколам» на основе фукоидана из
F. evanescens на систему гемостаза (снижение гипер‑
когуляционного потенциала крови) и степень выра‑
женности воспалительного процесса у пациентов с
атеросклерозом сосудов нижних конечностей [3].
Целью настоящей работы явился анализ влияния
фукоидана из F. еvanescens на показатели антиокси‑
дантной системы, липидного и углеводного обмена у
мышей с экспериментальным аллоксановым диабе‑
том и алиментарной гиперхолестеринемией.
Материал и методы. Объектом исследования явил‑
ся фукоидан, выделенный из бурой водоросли F. eva­
nes­cens оригинальным способом [2]. Эксперимент
проведен на неинбредных мышах массой тела 18–20 г,
полученных из питомника РАМН «Столбовая» (по 20
животных в каждой из нижеописанных групп). Ра‑
бота выполнена с соблюдением всех правил и меж‑
дународных рекомендаций Европейской конвенции
по защите позвоночных животных, используемых в
экспериментальных работах.
Для исследования влияния фукоидана на состоя‑
ние антиоксидантной системы и липидного обмена
использовали модель алиментарной гиперхолестери‑
немии. Животных 1-й группы (интактный контроль)
содержали на стандартном рационе вивария. Мыши
2-й группы (контроль гиперхолестеринемии) в тече‑
ние 4 недель получали атерогенную диету: пшенич‑
ная каша, сливочное масло – 5% и свиное сало – 25%
от веса пищи, а также эмульсию холестерина в расти‑
тельном масле (через зонд) из расчета 0,4 г/кг массы
тела. Мыши 3-й группы (опыт) на фоне атерогенной
диеты в течение 4 недель получали перорально фуко‑
идан (50 мг/кг массы).
В сыворотке крови, полученной при пункции
сердца под эфирным наркозом, биохимическим ме‑
тодом с помощью набора реактивов фирмы «Оль‑
векс Диагностикум» (Россия) определяли содержа‑
ние общего холестерина (ХС), триглицеридов, ХС
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
104
липо­протеидов низкой, очень низкой и высокой плот‑
ности (ЛПНП, ЛПОНП и ЛПВП). Суммарную фрак‑
цию (ХС ЛПНП и ЛОНП) вычисляли из разницы кон‑
центраций общего ХС и ХС ЛПВП. Индекс атероген‑
ности рассчитывали как отношение разности суммар‑
ной фракции ХС и ХС ЛПВП к ХС ЛПВП. Показатели
перекисного окисления липидов оценивали, измеряя
содержание малонового диальдегида в эритроцитах
крови экспериментальных животных [4].
Исследование влияния фукоидана на уровень
глюкозы проводили на модели диабета, индуциро‑
ванного у мышей однократным внутрибрюшинным
введением диабетогенной дозы аллоксана (17 мг/100 г
массы). 1-я группа животных (интактный контроль)
содержалась на стандартном рационе вивария; 2‑я
группа – мыши с аллоксановым диабетом; 3‑я груп‑
па – мыши с аллоксановым диабетом, получавшие
перорально в течение 3 недель фукоидан (50 мг/кг
массы). Содержание глюкозы в сыворотке крови из‑
меряли с помощью ферментативного колориметри‑
ческого метода.
Статистическую обработку полученных данных
проводили с помощью пакета программы Biostat и
Exel. Для оценки значимости различий при нормаль‑
ном распределении количественных признаков ис‑
пользовали t-критерий Стьюдента.
Результаты исследования. У мышей контрольной
группы, получавших атерогенную диету, в сыворотке
крови статистически значимо увеличивалось содер‑
жание триглицеридов и ХС в атерогенных классах
(ЛПНП и ЛПОНП), а также увеличивался коэффи‑
циент атерогенности по сравнению с показателями у
интактных животных. У мышей, получавших фукои‑
дан, уровень общего ХС в сыворотке крови снижался,
что приводило к увеличению относительного содер‑
жания липопротеидов высокой плотности и обеспе‑
чивало снижение коэффициента атерогенности кро‑
ви (табл.).
При определении промежуточных продуктов пе‑
рекисного окисления липидов у животных, содер‑
жавшихся на атерогенной диете, статистически зна‑
чимо увеличивалось содержание малонового диаль‑
дегида в эритроцитах по сравнению с показателями
у интактных животных (10,3±0,4 и 8,3±0,2 мкмоль/г
гемоглобина соответственно). Была установлена спо‑
собность препарата в условиях атерогенной нагрузки
снижать уровень промежуточных продуктов пере‑
кисного окисления липидов. У мышей, получавших
фукоидан, отмечена тенденция к уменьшению кон‑
центрации малонового диальдегида в эритроцитах
(8,9±0,5 мкмоль/г гемоглобина).
При экспериментальном аллоксановом диабете
прием фукоидана способствовал стабилизации уг‑
леводного обмена. Так, в сыворотке крови у мышей
с аллоксановым диабетом наблюдалось увеличение
уровня глюкозы по сравнению со здоровыми живот‑
ными (12,1±1,2 и 7,9±0,3 ммоль/л соответственно).
Таблица
Влияние фукоидана из F. evanescens на показатели липидного
обмена у мышей с экспериментальной холестеринемией (M±m)
Показатель
1-я группа
2-я группа
3-я группа
Общий ХС,
ммоль/л
2,8±0,1
4,9±0,21
4,0±0,22
ХС ЛПНП,
ммоль/л
0,66±0,06
1,80±0,271
1,01±0,12
ХС ЛПОНП,
ммоль/л
0,37±0,03
0,54±0,031
0,43±0,042
ХС ЛПВП,
ммоль/л
1,70±0,10
2,40±0,201
2,60±0,24
Триглицериды,
ммоль/л
0,83±0,06
1,20±0,061
0,94±0,242
КА3
0,64±0,05
1,06±0,201
0,53±0,242
Различие с 1-й группой статистически значимо.
Различие со 2-й группой статистически значимо.
3
Коэффициент атерогенности.
1
2
У мышей с аллоксановым диабетом, получавших
фукоидан, отмечена тенденция к уменьшению этого
показателя (9,6±0,2 ммоль/л).
Обсуждение полученных данных. Ключевым мо‑
ментом в атеросклеротическом воспалении являет‑
ся снижение рецепторного поглощения клетками
ХС ЛПНП и, как следствие, накопление его в кро‑
ви и тканях с гликозилированием, ацетилированием
и оксидацией, а также с деградацией апопротеина в
другие химические соединения [9, 10]. Модифициро‑
ванные ЛПНП обладают выраженными провоспали‑
тельными и проатерогенными свойствами: стимули‑
руют синтез молекул адгезии, хемокинов, факторов
роста, увеличивают пролиферацию гладкомышечных
клеток и деградацию коллагена, повышают коагуля‑
ционную способность крови.
По мнению В.В. Тертова и др. [7], изменение
структуры ЛПНП происходит из-за снижения их со‑
держания в составе сиаловых кислот, являющихся
полифункциональными соединениями с сильными
кислотными свойствами. В норме сиаловые кислоты
в свободном виде не встречаются, а входят в состав
различных углеводсодержащих веществ (гликопроте‑
ины, гликолипиды, олигосахариды). Занимая в их
молекулах концевое положение, сиаловые кислоты
оказывают значительное влияние на физико-хими‑
ческие свойства и биологическую активность этих
соединений. B. Li et al. [11] полагают, что фукоида‑
ны, действуя подобно сиаловым кислотам, увеличи‑
вают отрицательный заряд клеточной поверхности,
способствуя связыванию холестерина и желчных
кислот, ответственных за транспорт жиров из кишеч‑
ника в кровь. Связывание желчных кислот в кишеч‑
нике приводит к стимуляции их образования в пече‑
ни за счет деградации холестерина, поступающего
сюда в виде атерогенных липопротеидов. В свою оче‑
редь снижение уровня общего холестерина и липо­
протеидов низкой плотности в крови способствует
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
поступлению в нее холестерина из тканей, в том чис‑
ле из артерий [5].
Гипохолестеринемический эффект фукоидана
может быть также обусловлен способностью поли‑
сахаридов слабее связывать гидрофильные желчные
кислоты, способствуя увеличению в плазме относи‑
тельного содержания гидрофобных желчных кислот,
которые сильнее ингибируют активность холесте‑
рин-7-гидроксилазы в печени [9, 14]. Полученные
результаты подтверждают и данные М.Я. Розкина
и др. [6], показавших способность фукоиданов сти‑
мулировать липолиз путем активации фермента ли‑
попротеидлипазы.
Возможные механизмы гипогликемического эф‑
фекта фукоидана также могут быть связаны с замед‑
лением всасывания глюкозы из кишечника в кровь,
стимуляцией ферментов, ответственных за утилиза‑
цию глюкозы, а также стимуляцией высвобождения
инсулина. Кроме того, липидопонижающий эффект
фукоидана может обусловливать увеличение погло‑
щения глюкозы периферическими тканями.
Таким образом, результаты исследования показы‑
вают, что фукоидан, полученный из F. evanescens, не
только является иммуномодулятором, но и обладает
уникальной многокомпонентной биологической ак‑
тивностью, обусловленной его структурными осо‑
бенностями. Сочетание ранее обнаруженных проти‑
вовоспалительных и иммуномодулирующих свойств
фукоидана из F. evanescens с антикоагулянтной ак‑
тивностью, а также установленные в настоящей ра‑
боте гиполипидемические, гипогликемические и ан‑
тиоксидантные свойства делают перспективным его
использование для улучшения гемореологии, мик‑
роциркуляции и снижения склонности к тромбозам,
а также для нормализации липидного и углеводного
обмена при атеросклерозе.
В современной мировой практике известны био‑
препараты, по общему механизму действия анало‑
гичные фукоидану, однако ограниченное присутс‑
твие на отечественном рынке и высокая стоимость
делает их малодоступными для потребителей. В то же
время уникальность химических структур, наличие
сырьевой базы в Дальневосточном регионе, экологи‑
чески чистые и экономичные технологии производс‑
тва создают предпосылки для использования пред‑
ставленного выше биополимера в качестве основы
для лекарственных препаратов и более широкого его
применения в клинической практике.
Литература
1. Запорожец Т.С. Клеточные и молекулярные механизмы
иммуномодулирующего действия биополимеров морских
гидробионтов: автореф. дис. … д-ра мед. наук. Владивос­
ток, 2006. 350 с.
2. Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М., Попивнич И.Б. и др.
Способ получения водорастворимых полисахаридов бурых
водорослей // Патент РФ № 2135518. Бюллетень. 1999.
№ 24. 3 с.
3. Майстровский К.В., Запорожец Т.С., Раповка Ю.В. и
др. Коррекция гемостаза у больных облитерирующим
105
атеросклерозом сосудов нижних конечностей сульфа­
тированным полисахаридом из бурой водоросли Fucus
evanescens: материалы IV Всероссийской конференции по
клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечнососудистой хирургии (с международным участием). М.,
2009. С. 246.
4. Новгородцева Т.П., Эндакова Э.А., Янькова В.И. Руко­
водство по методам исследования параметров системы
«перекисное окисление липидов–антиоксидантная защи­
та» в биологических жидкостях. Владивосток: Изд-во
Дальневосточного ун-та, 2003. 80 с.
5. Пискун Р.П., Пентюк А.А., Серкова В.К. и др. Энтеросор­
бенты в лечении атеросклероза // Эксперим. и клин. фар­
макол. 1998. Т. 61, № 2. С. 69–74.
6. Розкин М.Я., Левина М.Н., Ефимов В.С., Усов А.И. Анти­
коагулянтная и стимулирующая липолиз активность по­
лисахаридов из бурых морских водорослей // Фармакол. и
токсикол. 1991. Т. 54, № 5. С. 40–42.
7. Тертов В.В., Собенин И.А., Лазарева В.Л. и др. Взаимо­
действие множественно-модификационных (десиалиро­
ванных) ЛПНП, выделенных из крови больных атероскле­
розом, с клеточными рецепторами. // Бюлл. экспер. биол.
и мед. 1994. № 1. С. 53–55.
8. Титов В.Н. Общность атеросклероза и воспаления: специ­
фичность атеросклероза как воспалительного процесса //
Биохимия. 2000. № 4. С. 3–10.
9. Хотимченко Ю.С., Ермак И.М., Бедняк А.Е. и др. Фарма­
кология некрахмальных полисахаридов // Вестник ДВО
РАН. 2005. № 1. С. 72–82.
10. Epstein F.H. Atherosclerosis – an inflammatory disease // N.
Engl. J. Med. 1999. Vol. 340, No. 2. P. 115–126.
11. Li B., Lu F., Wei X., Zhao R. Fucoidan: Structure and Bioacti­
vity // Molecules. 2008. No. 13. P. 1671–1695.
12. Li D.Y., Xu Z., Huang L.M. et al. Effect of fucoidan of L. ja­
ponica on rats with hyperlipidemia // Food. Sci. 2001. Vol. 22.
P. 92–95.
13. Li D.Y., Xu Z., Zhang S.H. Prevention and cure of fucoidan
of L. japonica on mice with hypercholesterolemia. // Food. Sci.
1999. Vol. 20. P. 45–46.
14. Sagawa T.I.H., Kato I. Fucoidan as functional foodstuff. Struc­
ture and biological potency // Japan J. Phycol. 2003. Vol. 51.
P. 19–25.
Поступила в редакцию 14.04.2009.
EFFECTS OF IMMUNE RESPONSE MODULATING
AGENT “FUCOIDAN” DERIVED FROM FUCUS
EVANESCENS BROWN ALGAE ON THE PARAMETERS
OF ANTIOXIDATIVE SYSTEM, LIPID AND
CARBOHYDRATE METABOLISM IN MICE
K.V. Maistrovskiy1, T.S. Zaporozhets1, L.N. Fedyanina2,
T.K. Kalenik2, E.V. Motkina2, T.I. Imbs3
1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the
RAMS, Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087
Russia), 2 Pacific State University of Economics (19 Okeanskiy
Av. Vladivostok 690091 Russia), 3 Pacific Institute of Bioorganic
Chemistry, FEB RAS (159 100-Anniversary Av. Vladivostok
690022 Russia)
Summary – The models of alimentary hypercholesterolemia
and alloxan diabetes in mice allowed to study effects of the
immune response-modulating agent fucoidan derived from
the brown algae Fucus evanescens on the state of antioxidative
system, as well as identify capability of this polysaccharide to
decrease levels of glucose and total cholesterol, normalize dis‑
sipation of this cholesterol between lipoprotein fractions, re‑
duce atherogenicity factor, and stabilize lipid peroxidation level
of the derivatives.
Key words: fucoidan, lipid and carbohydrate metabolism,
experiment.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 97–99.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
106
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
УДК 616.24-002-078.73:612.017
В.А. Невзорова1, Т.Ф. Боровская2, Т.Б. Дмитриева3, Л.Д. Скребкова3, С.А. Пазыч1
1 Владивостокский государственный медицинский университет (690950 г. Владивосток, пр-т Острякова, 2), 2 Хабаровский
филиал РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (680042 г. Хабаровск, Воронежское шоссе, 164), 3 Южно-Сахалинская городская
больница имени Ф.С. Анкудинова (693000 г. Южно-Сахалинск, бульвар Анкудинова, 1)
СОСТОЯНИЕ МЕСТНОГО И СИСТЕМНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ
ПНЕВМОНИИ У ЛИЦ МОЛОДОГО ВОЗРАСТА
Ключевые слова: пневмония, иммуноциты, мокрота, кровь.
На основании обследования 216 пациентов с внебольничной
пневмонией оценивалась рецепторная активность иммуно‑
цитов в периферической крови, индуцированной мокроте
(ИМ) и слизистой оболочке крупных бронхов (СОБ). Для
идентификации клеток использовались моноклональные
антитела. В остром периоде заболевания в периферичес‑
кой крови снижалось количество клеток CD3+, CD4+, CD8+
и CD25+, в ИМ уменьшалось количество клеток CD11b+,
CD18+, CD4+, CD16+, CD25+ и HLA-DR+. В период рекон‑
валесценции в крови снижалось только число клеток CD3+,
тогда как в отдаленные сроки заболевания низкая числен‑
ность иммуноцитов наблюдалась в популяциях CD3+, CD4+,
CD8+, CD25+ и HLA-DR+. Содержание клеток CD4+, CD25+,
CD16+, CD22+, CD11b+, CD18+ и HLA-DR+ на 20-е сутки и
через 6 месяцев в ИМ не достигало контрольных значений.
В СОБ только в отдаленные сроки зарегистрировано повы‑
шение уровня CD11b+-клеток. Достоверных отличий между
показателями различных биологических сред не выявлено.
Клинические особенности внебольничной пневмонии
(ВП) определяются как характером возбудителя, так и
особенностями иммунного ответа [7, 9]. Существует
мнение о разнонаправленной активности системных
и местных иммунных реакций, формирующихся при
инфекционном поражении легких [12]. Системный
иммунитет здесь характеризуется признаками вторич‑
ной иммунологической недостаточности: снижением
численности Т- и В-лимфоцитов, изменением их функ­
циональных характеристик, дисбалансом в соотноше‑
нии популяций лимфоцитов и иммуноглобулинов [6].
В слизистых оболочках дыхательных путей наблюда‑
ется инфильтрация лимфоцитами и плазмоцитами,
которые концентрируются под покровным эпителием,
что отражает напряжение механизмов местной иммун‑
ной защиты [1]. Поскольку существует тесная связь
между компонентами иммунной реакции, знание со‑
става иммуноцитов на ее различных этапах в норме
и при патологических состояниях является особенно
важным для идентификации нарушений в различных
звеньях иммунной системы. Решение этого вопро‑
са может позволить целенаправленно формировать
адекватный локальный и системный иммунный от‑
вет и улучшать исход заболевания.
Цель исследования – определить функциональ‑
ное состояние иммуноцитов у больных ВП в пери‑
ферической крови, индуцированной мокроте (ИМ)
и слизистой оболочке крупных бронхов (СОКБ) в
динамике заболевания.
Невзорова Вера Афанасьевна – д-р мед. наук, профессор, заве‑
дующая кафедрой терапии ФПК и ПП ВГМУ; тел.: 8 (4232) 45-63-67;
e-mail: nevzorova@inbox.ru.
Материал и методы. Были обследованы пациен‑
ты в возрасте до 40 лет с ВП: 123 – в остром периоде
(в среднем на 3-и сутки), 64 – в периоде реконвалес‑
ценции (в среднем на 20-е сутки) и 29 – в отдален‑
ные сроки после перенесенного заболевания (спустя
90–120 суток). В группу сравнения (контроль) были
включены 12 человек, госпитализированных по по‑
воду удаления инородных тел бронхов. Фенотип им‑
муноцитов определяли в периферической крови, ИМ
и СОКБ. Для идентификации иммуноцитов с опре‑
делением кластеров дифференцировки (CD) – CD3+,
CD4+, CD8+, CD16+, CD22+, CD25+, CD11b+, CD18+
и HLA-DR+ – были использованы соответствующие
моноклональные антитела фирмы Caltag (Burlingame).
Исследование клеточного звена иммунитета осущест‑
влялось методом проточной цитофлюорометрии на
приборе FACSkan фирмы Beckton Dickin­son (США).
Результаты исследования и обсуждение полученных
данных. На поверхности иммуноцитов здоровых лиц
присутствовали все виды рецепторов. При этом уро‑
вень иммуноцитов в различных биологических сре‑
дах имел отличительные особенности только по трем
показателям. Так, доля CD3+-клеток в перифери‑
ческой крови оказалась в 1,5 раза выше, чем в ИМ и
СОКБ. Напротив, максимальное количество CD18+- и
CD11b+-клеток, имевших на своей мембране маркеры
клеточной адгезии, зарегистрировано в ИМ, а мини‑
мальное – в СОКБ. Число остальных маркеров в пе‑
риферической крови, ИМ и СОКБ находилось прак‑
тически на одном уровне. Сравнительный анализ па‑
раметров системного и местного иммунитета у паци‑
ентов с ВП показал, что в острый период заболевания
имела место выраженная вариабельность показателей
в двух средах: периферической крови и ИМ. В СОКБ
показатели иммунного ответа оставались стабильны‑
ми и не отличались от группы сравнения (табл. 1).
Основными эффекторными клетками любого
воспалительного процесса являются Т-лимфоци‑
ты, экспрессирующие на своей мембране CD3- и
CD4‑рецепторы [2]. В периферической крови паци‑
ентов в остром периоде болезни число CD3+-клеток
(зрелые Т-лимфоциты) достоверно снижалось, а в
ИМ и СОКБ практически не изменялось. Очевид‑
но, снижение числа зрелых Т-лимфоцитов в пе‑
риферической крови можно связать с их активной
миграцией в дыхательные пути в острый период
пневмонии. Рекрутирование зрелых Т-хелперов и
моноцитов, представленных клетками с фенотипом
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
107
Таблица 1
Сравнительная характеристика показателей системного и местного иммунитета у больных ВП в остром периоде болезни, %
Рецептор
Слизистая оболочка
пневмония
контроль
CD3
CD22
CD4
CD8
CD25
CD16
HLA-DR
CD18
CD11b
25,80±1,85
25,09±2,69
25,30±1,93
23,84±2,12
23,26±1,87
21,34±1,69
25,35±2,25
23,11±1,76
19,24±1,37
1
33,55±4,21
24,53±3,51
29,26±3,14
23,73±3,86
24,70±4,01
26,06±3,60
25,21±3,41
17,70±3,11
13,41±2,71
Периферическая кровь
пневмония
контроль
28,77±2,331
21,77±1,95
21,63±1,921
20,63±1,881
19,00±1,721
18,70±1,78
22,66±2,54
18,77±1,77
19,66±1,88
50,06±4,21
27,67±3,15
39,33±3,76
32,17±3,76
29,58±3,64
20,86±3,72
30,52±2,34
19,40±2,66
23,86±4,98
Мокрота
пневмония
контроль
32,05±3,84
25,34±1,92
20,43±1,871
21,04±1,77
19,96±1,851
18,16±2,111
15,30±1,781
21,17±1,371
19,36±1,881
36,57±2,35
36,07±1,87
42,07±1,76
23,87±3,54
31,35±2,89
34,32±3,78
38,12±3,56
41,54±3,08
34,43±2,87
Здесь и в табл. 2 и 3 – различия по сравнению с контролем статистически значимы.
CD4+, в очаг воспаления для участия в реализации
клеточно-опосредованного и гуморального иммун‑
ного ответа может приводить к снижению их цир‑
кулирующего пула [3]. Действительно в остром пе‑
риоде заболевания в периферической крови и ИМ
выявлено уменьшение числа CD4+-клеток – в 1,8 и
в 2 раза ниже группы сравнения (табл. 1).
Полученные результаты объясняются участием
Т‑хелперов в специфическом ответе, направленном на
киллинг микробов макрофагами, продукцию антител
и клональную экспансию цитотоксических Т-лимфо‑
цитов. Взаимодействие между пептидами антигенов,
белками поверхности антигенпрезентирующих клеток
и рецепторами Т‑клеток приводит к активации пос‑
ледних [5]. Однако, результаты нашего исследования
демонстрируют отсутствие напряжения локального
иммунного ответа в СОКБ в данный период заболе‑
вания. Можно предположить, что это обусловлено
временем, которое необходимо для запуска местной
иммунной реакции в дыхательных путях, с одной сто‑
роны, и объектом исследования (СОКБ) – с другой, в
то время как все процессы разыгрываются на уровне
респираторных отделов дыхательных путей. Попу‑
ляции цитотоксических и киллерных клеток, а также
мутировавших собственных клеток, имеют рецепторы
CD8+ и CD16+ [11]. В остром периоде болезни в пери‑
ферической крови число CD8+-клеток уменьшалось
в 1,5 раза. В ИМ и слизистой оболочке их уровень по
отношению к группе сравнения не менялся (табл. 1).
В остром периоде ВП происходило двухкратное
снижение содержания CD16+-клеток в ИМ. В пери‑
ферической крови и СОКБ достоверного изменения
экспрессии CD16+-рецепторов не наблюдалось. Сте‑
пень присутствия данной популяции клеток в раз‑
личных биологических средах, как в группе сравне‑
ния, так и при воспалении, была одинаковой.
Установлено, что клетки маркируемые CD16,
имеют свойства натуральных киллеров, участвующих
в продукции γ-интерферона [4]. Взаимодействие меж‑
ду ними и макрофагами, возможно, является ключе‑
вым моментом для активации последних в процессе
ответа системы врожденного иммунитета. Вероятно,
снижение активности CD16+-рецепторов в ИМ обус‑
ловлено незначительной микробной нагрузкой или
воздействием низковирулентных патогенов.
Сила и характер иммунного ответа детерминиру‑
ется HLA-DR+-антигенпрезентирующими клетками.
В периферической крови и СОКБ в остром периоде
болезни их численность оставалась прежней, а в ИМ
уменьшалась более чем в 2 раза (табл. 1). Данные из‑
менения, возможно, обусловлены частичной мигра‑
цией HLA-DR+-клеток в дыхательные пути.
Иммунный ответ организма на антигенное воз‑
действие проявляется активацией CD25+-клеток. Как
известно, рецептор CD25 определяется на поверхност­
ной мембране активированных Т-, В-лимфоцитов и
макрофагов и дополнительно имеет цепь интерлей‑
кин-2Rµ и Тас-рецептор, которые являются марке‑
рами поздней стадии лимфоцитарной активации [6].
В остром периоде болезни в ИМ и периферической
крови содержание CD25+-клеток снижалось в 1,5 раза,
а в СОКБ не изменялось (табл. 1). Данный феномен
частично может быть объяснен дисрегуляцией иммун‑
ного ответа на воздействие инфекционных патогенов
или ингалируемых инородных частиц.
Миграции иммуноцитов из кровеносного русла
в слизистые оболочки дыхательных путей способс‑
твуют клетки, экспрессирующие на своей поверх‑
ности рецепторы CD18 и CD11b [13]. Достоверные
изменения активности данных клеток наблюдались
только в мокроте: их содержание в острый период
болезни уменьшалось почти в 2 раза. Одной из при‑
чин уменьшения данного пула клеток в ИМ могла
быть их рекрутизация в центральные органы имму‑
ногенеза: тимус, селезенку или костный мозг. Суб‑
популяция CD22+-клеток принимает активное учас‑
тие в реализации гуморального иммунного ответа.
Их численность в острый период болезни не была
подвержена изменениям ни в одной из изучаемых
биологических сред (табл. 1).
Таким образом, у пациентов в остром периоде ВП
регистровалось снижение уровня иммуноцитов в пе‑
риферической крови. При этом по четырем показате‑
лям из девяти изученных (CD3, CD4, CD8 и CD25)
наблюдались достоверные отличия по отношению
к контролю. Изменения же местного иммунитета
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
108
Таблица 2
Сравнительная характеристика показателей системного и местного иммунитета у больных ВП в период реконвалесценции, %
Рецептор
Слизистая оболочка
пневмония
контроль
CD3
CD22
CD4
CD8
CD25
CD16
HLA-DR
CD18
CD11b
24,32±3,52
25,40±2,00
23,19±3,41
24,00±1,78
22,98±2,81
21,18±3,11
22,46±2,45
21,79±2,71
21,42±2,91
33,55±4,21
24,53±3,51
29,26±3,14
23,73±3,86
24,70±4,01
26,06±3,60
25,21±3,41
17,70±3,11
13,41±2,71
Периферическая кровь
пневмония
контроль
33,45±1,871
32,13±2,45
27,21±3,12
22,34±1,78
21,13±2,45
20,23±1,67
24,56±1,57
22,34±2,35
19,98±1,75
имели неоднозначный характер, причем в мокроте
число популяций, подвергшихся колебаниям, было
максимальным: зафиксировано достоверное сниже‑
ние численности клеток в шести субпопуляциях:
CD11b+, CD18+, CD4+, CD16+, CD25+, HLA-DR+.
В то же время в СОКБ не наблюдалось изменений ре‑
цепторной активности ни одной из популяций кле‑
ток. По-видимому, в процессе воспаления происхо‑
дит рекрутирование иммуноцитов из периферичес‑
кой крови. По данным ряда авторов, на фоне бакте‑
риальной агрессии у больных пневмонией
формируется супрессия иммунного ответа, особенно
выраженная в остром периоде. Снижаются количест‑
во и функциональная активность клеток-индукто‑
ров/хелперов, сохраняются или повышаются содер‑
жание и функциональная активность киллеров/ци‑
тотоксических клеток, регистрируется уменьшение
числа ранних Т-клеток [8, 10].
Снижение в ИМ численности клеток ряда субпо‑
пуляций, возможно, обусловлено их миграцией в цен‑
тральные органы иммуногенеза и/или рекрутизацией
в респираторные отделы легких, где происходит пре‑
зентация антигена, их дифференцировка и дальней‑
шее поступление в очаг воспаления клеток с уже изме‑
ненным фенотипом. Следовательно, иммуномодули‑
рующие препараты должны назначаться с учетом мест­
ных иммунных реакций, местом развития которых
могут быть слизистые оболочки бронхиального дерева
и, согласно нашим исследованиям, в большей степе‑
ни – ИМ. В период реконвалесценции и в отдаленные
сроки после перенесенной пневмонии регистрирова‑
лось снижение рецепторной активности иммуноцитов
в двух биологических средах: периферической крови и
ИМ (табл. 2, 3). На 20-е сутки от начала заболевания в
периферической крови больных достоверные измене‑
ния наблюдались только в отношении CD3+-субпопу‑
ляции: уровень этих клеток оставался ниже в 1,5 раза
по сравнению с контролем. Количество CD4+- и CD8+клеток имело тенденцию к снижению, но достовер‑
но не отличалось от показателей в группе сравнения
(табл. 2). В отдаленные сроки заболевания (через 6 ме‑
сяцев) в периферической крови было достоверно ниже
содержание лимфоцитов, маркированных антигенами
CD3, CD4, CD8, CD25 и HLA-DR (табл. 3).
50,06±4,21
27,67±3,15
39,33±3,76
32,17±3,76
29,58±3,64
20,86±3,72
30,52±2,34
19,40±2,66
23,86±4,98
Мокрота
пневмония
контроль
35,80±2,70
26,00±3,411
27,81±2,311
21,54±2,71
18,19±3,611
18,88±2,451
17,0±3,851
20,87±2,021
15,89±1,921
36,57±2,35
36,07±1,87
42,07±1,76
23,87±3,54
31,35±2,89
34,30±3,78
38,12±3,56
41,54±3,08
34,43±2,87
Изменения содержания иммуноцитов в ИМ в пе‑
риод реконвалесценции и в отдаленные сроки болез‑
ни выявлены в семи субпопуляциях (табл. 2, 3). При
этом достоверно низкий уровень численности кле‑
ток регистрировался в субпопуляциях CD4+, CD25+,
CD16+, CD22+, CD11b+, CD18+, HLA-DR+. В эти пе‑
риоды заболевания число CD4+-клеток оставалось в
1,5 и 2 раза ниже по отношению к контрольной груп‑
пе. Наряду с уменьшением количества CD4+-клеток
происходило снижение содержания иммуноцитов,
несущих HLA-DR+-рецепторы, – в 2,2 и 1,7 раза ни‑
же контрольных значений (табл. 2, 3). В отличие от
CD4+, антиген HLA-DR+ является поздним актива‑
ционным маркером. Его низкая экспрессия в ИМ у
больных ВП в период реконвалесценции и в отдален‑
ные сроки болезни может быть следствием наруше‑
ния в системе памяти лимфоцитов, которая необхо‑
дима для формирования быстрого ответа при повтор‑
ном воздействии соответствующего антигена.
Количество иммуноцитов, экспрессирующих на
своей мембране второй маркер поздней стадии акти‑
вации – CD25, также оставалось в 1,7 и 1,4 раза ниже,
чем в контроле (табл. 2, 3). Детерминанта CD25 явля‑
ется рецептором для интерлейкина‑2, участвующего
в стимуляции пролиферации лимфоцитов, и сниже‑
ние ее экспрессии в ИМ в период реконвалесценции
связано с супрессией локального иммунного ответа.
В период реконвалесценции регистрировалось до‑
стоверное снижение (примерно в 2 раза) содержания
CD11b+- и CD18+-клеток. В отдаленные сроки после
перенесенной пневмонии численность этих элементов
продолжала оставаться низкой. Аналогичные измене‑
ния наблюдались в популяции клеток с фенотипом
CD16+ (табл. 3). Характер распределения иммуноци‑
тов в СОКБ в период реконвалесценции имел тот же
диапазон, что и в остром периоде заболевания и до‑
стоверно не отличался от показателей в группе срав‑
нения. Однако в отдаленные сроки результаты нашего
исследования впервые продемонстрировали повыше‑
ние в 1,7 раза числа CD11b+-клеток в СОКБ (табл. 3).
Между тем достоверных отличий между показателями
в различных биологических средах как в период ре‑
конвалесценции, так и в отдаленные сроки после ВП
мы не наблюдали.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
109
Таблица 3
Сравнительная характеристика показателей системного и местного иммунитета у больных ВП в отдаленные сроки, %
Рецептор
CD3
CD22
CD4
CD8
CD25
CD16
HLA-DR
CD18
CD11b
Слизистая оболочка
пневмония
контроль
28,11±3,81
21,34±3,34
28,87±4,12
24,22±1,54
19,23±1,88
22,00±3,31
21,23±1,35
22,77±2,72
22,86±2,501
33,55±4,21
24,53±3,51
29,26±3,14
23,73±3,86
24,70±4,01
26,06±3,60
25,21±3,41
17,70±3,11
13,41±2,71
Периферическая кровь
пневмония
контроль
27,68±1,341
19,00±2,33
21,65±2,001
20,97±3,501
17,75±2,711
23,11±3,72
15,98±3,511
22,19±2,73
18,78±1,87
Выводы
1. Системный и локальный иммунный ответ в ос‑
трый период ВП характеризуется развитием вторич‑
ной иммунной недостаточности. При этом снижается
рецепторная активность клеток CD3+, CD4+, CD8+,
CD25+ в периферической крови и клеток CD11b+,
CD18+, CD4+, CD16+, CD25+, HLA-DR+ в ИМ.
2. В различные периоды ВП характер распределе‑
ния клеток лимфоидного ряда в периферической кро‑
ви, ИМ и СОКБ не имеет достоверных отличий.
3. Различия рецепторной активности клеток пе‑
риферической крови в период реконвалесценции
регистрируются только в CD3+-популяции, тогда как
в отдаленные сроки заболевания низкая численность
иммуноцитов наблюдается в CD3+-, CD4+-, CD8+-,
CD25+- и HLA-DR+-популяциях.
4. Содержание иммуноцитов CD4+, CD25+, CD16+,
CD22+, CD11b+, CD18+ и HLA-DR+ у больных ВП на
20-е сутки и через 6 мес. от начала заболевания в ИМ
не достигает контрольных значений.
5. Состояние рецепторного аппарата клеток СОКБ
на всех этапах заболевания достоверно не отличается
от показателей здоровых лиц за исключением числа
CD11b+-иммуноцитов, регистрируемых в отдален‑
ные сроки после перенесенной ВП.
6. Исследование ИМ при ВП является высокоин‑
формативным, неинвазивным и доступным методом
оценки местного иммунного статуса пациентов.
Литература
1. Боровская Т.Ф., Курпас Э.Х., Гориславец С.Н. и др. Ди­
намика иммунного ответа слизистой оболочки долевого
бронха у больных пневмонией // Пульмонология. 2003. № 4.
С. 22–25.
2. Воробьев А.А., Быков А.С., Караулов Ф.В. Иммунология и
аллергология. М.: Практическая медицина, 2006. 288 с.
3. Кетлинский С.А. Роль Т-хелперов типов 1 и 2 в регуляции
клеточного и гуморального иммунитета // Иммунология.
2002. № 2. С. 77–79.
4. Маянский А.Н. Лекции по иммунологии. Н. Новгород: Издво НГМА, 2003. 272 с.
5. Cинопальников А.И., Козлов Р.С. Внебольничные инфекции
дыхательных путей. М.: Премьер МТ; Наш Город, 2007. 352 с.
6. Фрейдлин И.С., Тотолян А.А. Клетки иммунной системы.
Т. III–IV. СПб.: Наука, 2001. 267 с.
7. Черешнев В.А., Юшков Б.Г., Климин В.Г., Лебедева Е.В.
Иммунофизиология. Екатеринбург: УрО РАН, 2002. 257 с.
50,06±4,21
27,67±3,15
39,33±3,76
32,17±3,76
29,58±3,64
20,86±3,72
30,52±2,34
19,40±2,66
23,86±4,98
Мокрота
пневмония
контроль
27,67±1,43
19,0±2,231
20,97±3,511
17,76±2,74
23,12±1,761
15,91±2,541
22,14±2,751
18,78±1,871
21,22±2,311
36,57±2,35
36,07±1,87
42,07±1,76
23,87±3,54
31,35±2,89
34,32±3,78
38,12±3,56
41,54±3,08
34,43±2,87
8. Ярилин А.А. Контактные межклеточные взаимодействия при
иммунном ответе // Иммунология. – 1999. № 1–2. С. 37–46.
9. Dear K., Holden J., Andrews R., Tatham D. Vaccines for pre­
venting pneumococcal infection in adults // Cochrane Database
Syst. Rev. 2003. Vol. 4. CD-ROM 000422.
10. Fereira C., Barthold T., Garcia S. et al. Differential survival
CD4 and CD8 T-cells // Ibid. 2000. Vol. 165. P. 3689–3694.
11. Frasca L., Piazza C., Piccolella E. CD4+ T-cells orchestrate
both amplification and deletion of CD8+ T-cells // Crit. Rev.
Immunol. 1998. Vol. 18. P. 569–594.
12. Mason C.M., Weinacker A.B., Shellito J.E. Host defence net­
works in the lung: an overview // Respiratory infections / Nie­
derman M.S., Sarosi G.A., Glassroth J. eds. Philadelphia: Lip­
pincott Williams Wilkins, 2001. P. 3–12.
13. Metso T., Venge P., Haahtela T.et al. Cell specific markers for
eosinophils and neutrophils in sputum and bronchoalveolar la­
vage fluid of patients with respiratory conditions and healthy
subjects // Thorax. 2002. Vol. 57, No. 5. P. 449–451.
Поступила в редакцию 04.06.2008.
LOCAL AND SYSTEM IMMUNE RESPONSE IN CASE
OF COMMUNITY-ACQUIRED PNEUMONIA IN YOUNG
PATIENTS
V.A. Nevzorova, T.F. Borovskaya, T.B. Dmitrieva,
L.D. Skrebkova, S.A. Pazyich
Vladivostok State Medical University (2 Ostryakova
Av. Vladivostok 690950 Russia), Khabarovsk branch of RORC
named after N.N. Blokhin RAMS (164 Voronezhskoe Shosse
Khabarovsk 680042 Russia), Yuzhno-Sakhalinsk Municipal
Hospital named after F.S. Ankudinov (1 Ankudinov Av. YuzhnoSakhalinsk 693000 Russia)
Summary – The examinations of 216 patients with communi‑
ty-acquired pneumonia allowed estimating receptor activity of
immunocytes contained in peripheral blood, induced sputum
and mucous tunic of large bronchi. Homogenous antibodies
were used for cell differentiation. The acute phase of the disease
leaded to a decreasing number of cells CD3+, CD4+, CD8+ and
CD25+ contained in peripheral blood. There was a decreasing
number of cells CD11b+, CD18+, CD4+, CD16+, CD25+, and
HLA-DR+ found in induced sputum. The recovery period was
characterized by decreasing number of cells CD3+ contained
in blood. Low number of immunocytes was observed in popu‑
lations CD3+, CD4+, CD8+, CD25+ and HLA-DR+ during the
follow-up period. The quantity of cells CD4+, CD25+, CD16+,
CD22+, CD11b+, CD18+ and HLA-DR+ found in the induced
sputum after 20-day and 6-month periods did not reach control
values. The follow-up period was characterized by increasing val‑
ues of CD11b+-cells found in mucous tunic of large bronchi. No
reliable differences were observed between the indices of various
biological environments.
Key words: pneumonia, immunocytes, sputum, blood.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 106–109.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
110
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
УДК 616.137-004.6-085.232:582.272.46
Т.С. Запорожец1, К.В. Майстровский2, В.Г. Раповка2, А.К. Гажа1, Т.П. Смолина1, Т.Н. Звягинцева3
НИИ эпидемиологии и микробиологии Сибирского отделения РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1),
Владивостокский государственный медицинский университет (690600 Владивосток, ул. Острякова, 2), 3 Тихоокеанский
институт биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159)
1 2 РОЛЬ Т-КЛЕТОЧНОЙ ДИСФУНКЦИИ В РАЗВИТИИ АТЕРОСКЛЕРОЗА СОСУДОВ НИЖНИХ
КОНЕЧНОСТЕЙ И ВОЗМОЖНОСТИ ЕЕ КОРРЕКЦИИ
Ключевые слова: атеросклероз, активационные антигены, субпопуляции лимфоцитов, фукоиданы.
На материале 40 клинических наблюдений изучена роль
Т‑клеточной дисфункции в развитии атеросклероза сосудов
нижних конечностей. Установлено, что показатели структу‑
ры основных субпопуляций лимфоцитов периферической
крови находятся в границах значений, констатирующих
удовлетворительную функцию иммунной системы. В то же
время увеличение числа циркулирующих лимфоцитов, а
также усиление экспрессии рецептора к интерлейкину-2,
антигенов главного комплекса гистосовместимости II клас‑
са и апоптотического маркера на поверхности лимфоцитов
свидетельствуют о том, что активация Т-клеток не ограни‑
чивается зоной атеросклеротической бляшки. Параметры,
характеризующие соотношение субпопуляций лимфоцитов
и выраженность активационных процессов, подтверждают
участие циркулирующих активированных Т-лимфоцитов
в патогенезе атеросклероза. Установлено корригирующее
влияние биологически активной добавки «Фуколам» на ос‑
нове фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens на сте‑
пень выраженности воспалительного процесса у больных с
атеросклерозом сосудов нижних конечностей.
В настоящее время атеросклеротические пораже‑
ния сосудов рассматриваются как воспалительный
и репаративный ответы на хроническое и эпизо‑
дическое повреждение интимы артерий, в котором
принимают участие лимфоциты, моноциты/макро‑
фаги, цитокины, молекулы межклеточной адгезии,
белки острой фазы, компоненты комплемента, ак‑
тивные формы кислорода, оксид азота и другие фак‑
торы, формирующие пролиферативный пул в месте
повреждения [3, 4, 8, 15]. Участие Т-лимфоцитов
в атерогенезе обусловлено их ролью в антигенном
распознавании, клональной экспансии, инициации
клеточно-опосредованного воспалительного ответа
и подтверждено результатами клинико-иммуноло‑
гических исследований, демонстрирующих сопря‑
женность манифестации клинических симптомов
атеросклероза и процессов Т‑клеточной активации
[4]. Полагают, что активация Т‑лимфоцитов и, ско‑
рее всего, CD4+-Т-лимфоцитов происходит в Т-зо‑
не лимфатических узлов, регионарных к повреж‑
денным участкам сосудов, откуда активированные
Т-клетки мигрируют в соответствующие участки со‑
судистой стенки [3]. Уже на ранних стадиях атероге‑
неза в бляшках иммуногистохимически выявляются
CD25+-Т-лимфоциты, свидетельствующие об ак‑
тивации и функциональной полноценности клеток
[14]. Отражением активационных процессов в зоне
Запорожец Татьяна Станиславовна – д-р мед. наук, заведую‑
щая лабораторией иммунологии НИИЭМ СО РАМН; тел.: 8 (4232)
44-24-46; e-mail: niiem_vl@mail.ru.
повреждения сосуда могут быть количественные из‑
менения циркулирующих лимфоцитов, экспресси‑
рующих активационные антигены. В исследованиях
ряда авторов показано, что хроническая Т-клеточ‑
ная активация, сопровождающаяся увеличением
количества лимфоцитов, которые экспрессируют
активационные антигены, наблюдается не только
в зоне повреждения, но и в периферической крови
и встречается у пациентов с различными формами
атеросклероза [4]. Однако данные о количествен‑
ном и функциональном состоянии циркулирующих
Т-лимфоцитов при атеросклерозе сосудов нижних
конечностей немногочисленны и противоречивы.
Современный тактический подход к лечению
больных с атеросклеротическим поражением сосудов
нижних конечностей должен обеспечивать рацио‑
нальное сочетание комплекса методов, направленных
в числе прочего на снижение процессов Т-клеточной
активации, подавление гиперпродукции цитокинов и
свободных радикалов, коррекцию гемостаза, норма‑
лизацию липидного и углеводного обмена.
Реализация указанных направлений лечения в
настоящее время стала возможной благодаря по‑
явлению новых эффективных фармакологических
средств, обладающих, как правило, многокомпо‑
нентным действием. Одним из вероятных подходов
к эффективной коррекции обменных процессов,
тромбоцитарного гемостаза и иммунных нарушений
у больных с атеросклеротическим поражением сосу‑
дов нижних конечностей может явиться включение в
комплексную терапию биокорректоров.
В последнее время опубликовано много работ,
посвященных терапевтическому потенциалу фуко‑
иданов – сульфатированных гомо- и гетерополиса‑
харидов из бурых водорослей, обладающих широ‑
ким спектром биологической активности [1, 10, 11].
Многообещающими являются исследования фуко‑
идана в качестве индуктора ангиогенеза для стиму‑
лирования реваскуляризации в ишемизированных
областях [5].
Ранее мы показали, что фукоидан из бурой во‑
доросли Охотского моря Fucus evanescens обладает
иммуномодулирующими, противовоспалительны‑
ми, антикоагулянтными свойствами [1]. Включе‑
ние биологически активной добавки «Фуколам» на
основе фукоидана из F. evanescens в схему консер‑
вативной терапии пациентов с атеросклерозом со‑
судов нижних конечностей приводило к снижению
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
гиперкогуляционного потенциала крови, нормали‑
зации липидного и углеводного обмена [2].
Целью настоящей работы явилось исследование
уровня экспрессии активационных маркеров лим‑
фоцитами периферической крови пациентов с ате‑
росклерозом сосудов нижних конечностей и оценка
эффективности использования низкомолекулярного
фукоидана из бурой водоросли Fucus evanescens (в со‑
ставе биологически активной добавки «Фуколам») в
качестве средства профилактики прогрессирования
атеросклеротических поражений сосудов.
Материал и методы. В исследование было вклю‑
чено 40 пациентов от 40 до 60 лет с окклюзионными
заболеваниями сосудов и ишемией конечностей IIa–
IIIa стадий по Фонтену–Покровскому, находившие‑
ся на лечении в краевой клинической больнице № 1
г. Владивостока. Критерии исключения: острые ин‑
фекции, сахарный диабет, сердечная недостаточность
III–IV функционального класса по NYHA, органные
дисфункции, которые могли воздействовать на вос‑
палительный статус. Всех пациентов рандомизирова‑
ли методом случайной выборки (централизованный
компьютерный метод) на однородные, сопоставимые
по возрасту и клинической картине группы. Перед
началом лечения было проведено комплексное об‑
следование, включавшее клинические анализы крови
и мочи, биохимический анализ крови, коагулограмму,
допплеро- и ангиографию, исследование тканевого
кровотока. Иммунологические исследования прово‑
дили до начала приема «Фуколама» и на вторые сут‑
ки после завершения терапии (21-е сутки лечения).
Все пациенты были разделены на 2 группы. Боль‑
ные 1-й группы получали традиционную, адекватную
форме и тяжести заболевания терапию, которая вклю‑
чала назначение дезагрегантов, средств, улучшающих
реологические свойства крови, и противовоспали‑
тельных средств. Пациенты 2-й группы в дополне‑
ние к традиционной терапии получали биологически
активную добавку «Фуколам» на основе фукоидана
из F. eva­nes­cens1 по 1 капсуле (500 мг) 2 раза в день в
течение 21 дня. Группа контроля состояла из 20 здоро‑
вых доноров без очевидных факторов риска развития
атеросклероза.
Методы исследования, план, этические нормы,
критерии отбора и исключения из протокола, а также
протокол исследования утверждены комитетом по био‑
медицинской этике (протокол № 2 от 06.11.2007 г.).
Для иммунологических исследований использо‑
вали лимфоциты, выделенные из периферической
крови больных. Кровь забирали в равных условиях:
утром, натощак, в объеме 5–7 мл. Иммунофеноти‑
пирование лимфоцитов проводили методом проточ‑
ной цитометрии (цитофлуориметр FACSсan, Bec­ton
Di­ckin­son) с использованием моноклональных ан‑
тител к кластерам дифференцировки (Claster of Dif­fe­
ren­tia­tion – CD) с двойной меткой CD3-FITC/CD41 Свидетельство Федерального центра гигиены и эпидемиологии
Роспотребнадзора № 77.99.23.3.У.739.1.06 от 30.01.2006 г.
111
PE, CD3-FITC/CD8-PE, CD3-FITC/CD56+16-PE,
CD3-FITC/CD19-PE (Becton Dickinson, США), CD3FITC/CD25-PE, CD3-FITC/CD95-PE, CD3-FITC/
HLA-DR-PE (Bekman Coulter, Франция).
Статистический анализ результатов проводил‑
ся с использованием прикладного пакета Statistica 6.
Применялись следующие методы: проверка нормаль‑
ности распределения количественных признаков при
малом числе наблюдений (W-критерий Shapiro–Wilk),
парный и непарный t-критерий, непараметрические
критерии Mann–Whitney и Wilkokson.
Результаты исследования. При оценке параметров
нормирования иммунограммы для основных показа‑
телей, характеризующих субпопуляционный состав
лимфоцитов периферической крови, было установ‑
лено нормальное распределение. В группе здоровых
доноров при нормальном распределении показателей
норму определяли как интервал признака, включаю‑
щего по одному и двум средним квадратическим от‑
клонениям от среднего значения (M±1SD, M±2SD),
при ненормальном распределении – как интервал
значений между установленными произвольно ниж‑
ними и верхними процентилями общего диапазона –
25–75 и 5–95% (табл. 1).
Проведенный анализ выявил увеличение абсо‑
лютного количества лимфоцитов у пациентов обеих
групп, значимо не изменявшегося в динамике ле‑
чения. Показатели, характеризующие структуру ос‑
новных субпопуляций лимфоцитов периферической
крови, также значимо не отличались у пациентов 1-й
и 2-й групп и находились в границах значений, кон‑
статирующих удовлетворительную функцию иммун‑
ной системы (табл. 2).
В то же время до лечения как в 1-й, так и во 2‑й
группе были выявлены признаки хронической Т‑кле‑
точной активации, сопряженной с увеличением ко‑
личества лимфоцитов, экспрессирующих ранние и
поздние активационные антигены – рецептор к ин‑
терлейкину-2 (CD25), антигены главного комплекса
гистосовместимости II класса (HLA-DR), апоптоти‑
ческий маркер CD95/Fas. Так, до начала лечения час‑
тота выявления рецептора к интерлейкину-2 у паци‑
ентов 1-й и 2-й групп значимо отличалась от показа‑
теля у здоровых доноров. После окончания лечения
уровень экспрессии CD25 в 1-й группе не изменялся,
а во 2-й статистически достоверно снижался, хотя и
не достигал значений нормы (табл. 3).
Аналогичная динамика активационных процес‑
сов была выявлена при анализе экспрессии CD25
на Т-лимфоцитах: медиана значений относительно‑
го содержания CD3+CD25+-лимфоцитов до лечения
у пациентов с атеросклерозом была повышенной и
значимо отличалась от показателя у здоровых лиц.
После лечения и в 1-й, и во 2-й группах экспрессия
CD25 на Т-лимфоцитах оставалась повышенной, од‑
нако у пациентов, получавших в комплексе лечения
«Фуколам», значимо снижалась, не достигая, впро‑
чем, нормальных значений (табл. 3).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
112
Экспрессия антигенов главного комплекса гис‑
тосовместимости II класса, играющих ключевую
роль в антигенной стимуляции CD4+-клеток, на
всех лимфоцитах у пациентов с атеросклерозом бы‑
ла выше нормы до начала лечения и значимо не из‑
менялась при повторном исследовании. Следует
отметить, что относительное и абсолютное содержа‑
ние CD3+HLA‑DR+-лимфоцитов у представителей
1-й группы увеличивалось в динамике обследования,
тогда как во 2-й группе значимо не изменялось. Зна‑
чения проапототического маркера CD95/Fas после
окончания лечения в 1-й группе оставались повы‑
шенными, тогда как у пациентов 2-й группы статис‑
Таблица 1
Диапазоны иммунологических норм здоровых доноров
Показатель
M±1SD1
M±2SD1
W2
Лимфоциты, кл./мкл
%
CD3+
кл./мкл
%
CD3+CD4+
кл./мкл
%
CD3+CD8+
кл./мкл
3
ИРИ
%
CD19+
кл./мкл
%
CD3–CD16+CD56+
кл./мкл
%
CD3+CD16+CD56+4
кл./мкл
%
CD25+
кл./мкл
%
CD3+CD25+
кл./мкл
%
CD95+
кл./мкл
%
CD95+CD3+
кл./мкл
%
HLA-DR+
кл./мкл
%
HLA-DR+CD3+
кл./мкл
Иммуноглобулин G, г/л
Иммуноглобулин M, г/л
Иммуноглобулин A, г/л
Фагоцитарный показатель, %
Фагоцитарное число
1833–2527
67,9–78,7
1479–1715
42,0–50,2
984–1160
21,1–31,3
464–688
1,6–2,0
10,2–15,2
224–334
7,5–15,3
164–292
1,30–4,40
28,6–96,8
8,2–13
180–286
5–8,8
109–200
16,4–26
363–573
3,8–8,8
83–143
12,5–19,5
275–429
1,7–5,1
38–112
9,0–12,8
1,3–1,9
1,3–2,7
75–86
4,0–5,2
1486–2874
62,5–84,1
1361–1833
37,9–54,3
896–1248
16,0–36,4
352–700
1,4–2,2
7,7–17,7
169–389
4,6–16,2
100–356
0,50–7,30
11–159
5,8–15,4
127–339
3,1–10,7
67–242
11,6–30,8
258–678
1,3–11,3
28–198
9–23
198–506
0–6,8
0–149
7,1–14,7
1,0–2,2
0,6–3,4
70–90
3,4–5,8
0,97
0,94
0,94
0,96
0,94
0,92
0,94
0,94
0,96
0,96
0,96
0,95
0,715
0,705
0,96
0,94
0,91
0,92
0,94
0,92
0,95
0,90
0,96
0,94
0,93
0,90
0,96
0,94
0,96
0,95
0,89
1 Средние квадратические отклонения (SD) от средней ариф‑
метической (М).
2 Критерий Shapiro–Wilk.
3 Иммунорегуляторный индекс: CD4+/CD8+.
4 Указан интерквантильный размах от 5-го до 95-го перцентиля
и от 25-го до 75-го перцентиля.
5 p<0,05 – уровень значимости, соответствующий данному кри‑
терию W (при p <0,05 параметр имеет отклонение от нормального
распределения).
тически достоверно снижались, но не достигали по‑
казателей в группе здоровых доноров (табл. 3).
К настоящему времени доказано, что уровень
риска как появления атеросклероза, так и его про‑
грессирования и осложненного течения находится в
прямой зависимости от выраженности воспаления
[14, 15]. Получены факты, которые позволяют счи‑
тать, что Т-клетки могут выступать инициаторами
иммунного воспаления при атерогенезе в ответ на
модифицированные липопротеиды низкой плотнос‑
ти, а их медиаторы – как растворимые, так и контак‑
тзависимые – играть решающую роль в формирова‑
нии атеросклеротических бляшек [7, 12].
Принимая во внимание ключевую роль CD4+‑лим‑
фоцитов в развитии активного воспаления в зоне
повреждения интимы [3, 4, 6], а также данные об уве‑
личении активированных Т-лимфоцитов и уровня
растворимых форм активационных антигенов в пери‑
оды манифестации в периферической крови [11], мы
провели сравнение показателей клеточного иммуни‑
тета в зависимости от степени тяжести заболевания.
Было установлено, что у 14 пациентов с поражением
IIIa стадии относительное содержание CD4+-лимфо‑
цитов было выше по сравнению с таковым у 26 чело‑
век с заболеванием IIa стадии (45,5±3,7 и 41,3±4,8%
соответственно, p=0,007). Выраженность активации
Т-лимфоцитов также увеличивалась по мере про‑
грессирования атеросклероза: в IIIa стадии CD25
экспрессировался на 18,6±4,7% лимфоцитов, в том
числе на 17,3±6,4% Т-лимфоцитов, а в IIa стадии –
на 14,5±4,8 и 11,4±4,4% лимфоцитов соответственно.
В то же время у больных с сопутствующими диагно‑
зами ишемической болезни сердца (I и II степени) и ги‑
пертонической болезни (I и II степени) регистрирова‑
лось значимое увеличение относительного количества
CD8+-лимфоцитов (30,8±5,6%) по сравнению с пациен‑
тами без сопутствующих заболеваний (23,5±3,9%). Это
может являться отражением индуцирующих свойств
липопротеидов низкой плотности в отношении цито‑
токсических лимфоцитов и свидетельством выражен‑
ности процесса атерогенеза [7]. Относительное содер‑
жание CD4+-лимфоцитов у этих больных составляло
40,3±4,9 и 44,8±6,0% соответственно.
Обсуждение полученных данных. Выполненные
нами исследования позволили установить, что у па‑
циентов с атеросклерозом сосудов нижних конечнос‑
тей IIa–IIIa стадии по Фонтейну–Покровскому по‑
казатели, характеризующие структуру основных суб‑
популяций лимфоцитов периферической крови, на‑
ходятся в границах значений, констатирующих
удовлетворительную функцию иммунной системы.
В то же время увеличение абсолютного количества
циркулирующих лимфоцитов, а также усиление экс‑
прессии рецептора к интерлейкину-2 (CD25), антиге‑
нов главного комплекса гистосовместимости II класса
(HLA-DR), апоптотического маркера CD95/Fas на
поверхности лимфоцитов свидетельствуют о том,
что активация Т-клеток при атеросклерозе сосудов
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
113
Таблица 2
Характеристика основных субпопуляций лимфоцитов у пациентов с атеросклерозом сосудов нижних конечностей
Лимфоциты и суб‑
популяции
Лимфоциты
CD3+
CD3+CD4+
CD3+CD8+
CD19+
CD3–CD16+CD56+
Под‑
группа1
W2
M±σ, %
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
0,97
0,89
0,91
0,97
0,97
0,90
0,92
0,90
0,90
0,94
0,89
0,92
0,94
0,88
0,96
0,91
0,89
0,91
0,90
0,92
0,92
0,94
0,89
0,89
0,96
0,90
0,88
0,92
0,89
0,96
32,2±6,7
32,9±5,9
32,2±6,2
28,8±6,3
30,2±3,6
71,7±9,2
71,2±8,1
70,9±6,6
70,2±6,0
73,3±5,4
43,3±5,5
43,6±4,6
43,9±4,6
44,9±7,9
46,1±4,1
27,4±7,2
27,6±6,7
27,1±4,8
27,0±5,0
26,2±5,1
12,3±6,4
12,3±5,3
12,6±3,9
13,6±3,6
12,7±3,3
11,7±4,9
11,5±5,0
10,4±4,9
11,4±4,1
10,4±4,9
T-test
подгруппы
сравнения
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
p
M±σ, кл./
мкл
0,247
0,089
0,220
0,394
–
0,506
0,341
0,134
0,091
–
0,081
0,082
0,121
0,550
–
0,547
0,462
0,569
0,619
–
0,805
0,766
0,931
0,415
–
0,407
0,467
1,000
0,488
–
2365±147
2279±112
2308±89
2252±101
2180±126
1696±217
1622±186
1636±152
1580±135
1597±118
1024±130
994±104
1013±106
1011±178
1004±89
648±170
629±152
625±110
608±112
571±111
290±151
280±127
291±90
306±81
276±71
276±115
262±114
240±113
263±92
226±106
T-test
подгруппы
сравнения
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
p
0,000
0,012
0,000
0,005
–
0,081
0,615
0,370
0674
–
0,574
0,746
0,797
0,693
–
0,096
0,097
0,131
0,301
–
0,710
0,903
0,562
0,221
–
0,163
0,644
0,600
0,246
–
1 – 1-я группа до лечения, 2 – 1-я группа после лечения, 3 – 2-я группа до лечения, 4 – 2-я группа после лечения, 5 – здоровые.
Критерий Shapiro–Wilk; для всех значений W – p>0,05 (параметры имеют нормальное распределение).
1 2 нижних конечностей не ограничивается зоной бляш‑
ки. Количественные параметры, характеризующие
соотношение субпопуляций лимфоцитов и выражен‑
ность активационных процессов, которые зависят от
степени тяжести основного и сопутствующих заболе‑
ваний, подтверждают участие циркулирующих акти‑
вированных Т-лимфоцитов в патогенезе атероскле‑
роза сосудов нижних конечностей.
Накопленные к настоящему времени данные до‑
казывают, что программируемая клеточная смерть
является главным событием патофизиологии ате‑
росклероза, имеющим отношение к нестабильности
бляшки, ее разрыву и образованию тромба. Следу‑
ет подчеркнуть, что существуют фундаментальные
различия между последствиями апоптоза эндотели‑
альных и воспалительных клеток (макрофагов/мо‑
ноцитов и лимфоцитов) в зоне повреждения сосуда.
Если апоптоз эндотелиоцитов и гладкомышечных
клеток является пусковым механизмом разрыва ате‑
росклеротической бляшки, то гибель активирован‑
ных Т‑лимфоцитов и макрофагов, ограничивающая
количество воспалительных клеток в зоне поврежде‑
ния, стабилизирует процесс [13].
Большое значение в деструкции атеросклероти‑
ческой бляшки занимают и процессы деградации
экстрацеллюлярного матрикса, также связанные с
активностью Т-клеток: γ-интерферон, вырабатывае‑
мый Т-лимфоцитами, активирует синтез матричных
металлопротеиназ макрофагами и подавляет синтез
коллагена гладкомышечными клетками, тем самым
препятствуя укреплению фиброзной капсулы [12].
В этой связи определенную значимость приобрета‑
ет терапия, направленная на коррекцию клеточных
нарушений в стенке сосуда и в сосудистом русле, со‑
пряженных с развитием воспалительной реакции и
деструктивных процессов.
Проведены исследования, демонстрирующие, на‑
пример, способность статинов ингибировать γ-ин‑
терферониндуцированную экспрессию HLA-DR
на лимфоцитах периферической крови, подавлять
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
114
Таблица 3
Модуляция уровня экспрессии активационных антигенов на лимфоцитах периферической крови пациентов с атеросклерозом
сосудов нижних конечностей
Субпопуляция
CD25+
CD3+CD25+
CD95+
CD3+CD95+
HLA–DR+
CD3+HLA–DR+
Под‑
группа1
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
W2
M±σ (LQ–UQ)3
Подгруппы
cравнения
p
M±σ (LQ–UQ)3
Подгруппы
cравнения
p
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
0,506
0,341
0,134
0,091
–
0,008
0,000
0,000
0,002
–
0,034
0,001
0,050
0,550
–
0,000
0,000
0,000
0,000
–
0,035
0,001
0,024
0,038
–
0,009
0,000
0,000
0,000
–
468±182
478±143
505±145
385±1136
231±52
235,50 (200,00–425,50)
339±1075
330,00 (265,00–400,00)
225,00 (200,00–360,00)6
148±78
570,00 (350,00–685,00)
545,00 (455,00–640,00)
550,00 (330,00–640,00)
430,00 (240,00–560,00)6
523±154
240,00 (210,00–320,00)
350,00 (240,00–380,00)5
313±76
256±926
150±41
445±106
445±141
443±110
403±67
337±88
168±85
232±885
106±99
130±38
74±39
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
1–5
2–5
3–5
4–5
–
0,000
0,000
0,000
0,000
–
0,005
0,000
0,000
0,009
–
0,361
0,587
0,559
0,069
–
0,000
0,000
0,000
0,000
–
0,002
0,000
0,002
0,011
–
0,000
0,000
0,000
0,000
–
0,90
19,8±7,7
0,99
21,0±6,3
0,99
21,9±6,3
0,89
17,1±5,66
0,96
10,6±2,4
0,834 10,00 (9,00–18,00)
0,90
14,9±4,75
4
0,87 15,00 (12,00–18,00)
0,85 10,00 (9,00–16,00)6
0,91
6,9±1,9
0,874 24,00 (15,00–29,00)
0,854 24,00 (20,00–28,00)
0,864 25,00 (15,00–29,00)
0,884 20,00 (11,00–26,00)6
0,89
20,4±7,1
0,824 10,00 (9,00–13,50)
0,884 15,50 (10,50–17,00)5
0,88
13,6±3,3
0,94
11,4±4,16
0,90
6,9±1,9
0,95
18,8±4,3
0,90
19,5±3,8
0,90
19,2±4,8
0,92
17,9±3,0
0,96
15,5±4,0
0,89
7,1±3,6
0,91
10,2±3,95
0,88
4,6±2,2
0,95
5,8±1,7
0,88
3,4±1,8
Распределение групп по подгруппам, как и в табл. 2.
Критерий Shapiro–Wilk.
3 В скобках – значения интерквантильного размаха.
4 Для данных значений W – p<0,05 (параметр имеет отклонение от нормального распределения).
5 Различие между показателями 1-й и 2-й подгрупп статистически значимо.
6 Различие между показателями 3-й и 4-й подгрупп статистически значимо.
1 2 клеточный ответ и предотвращать апоптоз эндотели‑
альных клеток [6, 11].
Однако на практике у большинства пациентов с
атеросклерозом сосудов нижних конечностей, как
правило, используются препараты, направленные
на улучшение микроциркуляции (трентал, актове‑
гин) и на коррекцию гемостаза (гепарин, фраксипа‑
рин). За рамками лечения остается иммунотерапия,
направленная на подавление активации Т-лимфо‑
цитов, гиперпродукции цитокинов и свободных ра‑
дикалов. В числе прочих факторов одной из причин
такого положения является высокая стоимость фар‑
макологических средств. Например, в последние го‑
ды в лечебной практике появились препараты про‑
стагландинов, в частности вазапростан, имеющие
выраженную противовоспалительную активность.
Вместе с тем вазапростан – относительно дорогой
препарат, что является основным препятствием для
его широкого использования в клинической прак‑
тике. Учитывая вышесказанное, одним из возмож‑
ных подходов, направленных на подавление вос‑
палительного процесса, эффективную коррекцию
липидного и углеводного обмена, тромбоцитарного
гемостаза и иммунных нарушений у больных с ате‑
росклерозом сосудов нижних конечностей, может
явиться включение в комплексную терапию атеро­
склероза биологически активных веществ природ‑
ного происхождения, обладающих многокомпо‑
нентным действием, в том числе сульфатированных
полисахаридов из бурых водорослей.
Показано, что фукоиданы являются мощными
ингибиторами пролиферации гладкомышечных кле‑
ток сосудов, уменьшают гиперплазию интимы [10].
Они подавляют синтез белка и коллагена V типа,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
препятствуют адгезии клеток к фибронектину и сни‑
жают миграцию нейтрофилов к очагу воспаления,
блокируя сайты, которые распознаются лигандами
воспалительных клеток [7, 9]. Фукоиданы также сни‑
жают экспрессию и предотвращают ядерную транс‑
локацию фосфорилированных митогенактивирован‑
ных протеинкиназ в макрофагах, стимулированных
модифицированными липопротеидами низкой плот‑
ности [12].
Ранее мы показали, что фукоидан из F. evanescens
in vitro индуцирует апоптоз лимфоцитов перифе‑
рической крови, обладает иммуномодулирующи‑
ми, противовоспалительными, антикоагулянтными
свойствами [1]. Установленная в настоящей рабо‑
те способность «Фуколама» уменьшать экспрессию
HLA-DR и CD25 на клетках периферической крови,
является отражением процессов, способствующих
подавлению активации Т-лимфоцитов, дифферен‑
циации Т-хелперов 1-го типа, что в конечном итоге
приводит к снижению воспалительного ответа. Учи‑
тывая полученные нами ранее данные о способности
фукоидана индуцировать in vitro апоптоз лимфоцитов,
снижение относительного содержания HLA-DR+-,
CD25+- и CD95+-Т-лимфоцитов в группе больных,
получавших «Фуколам», может быть связано с усиле‑
нием апоптоза активированных лимфоидных клеток,
обусловленного потенциальными проапоптотичес‑
кими свойствами фукоидана.
Таким образом, полученные в настоящей работе
данные о корригирующем влиянии «Фуколама» на
степень выраженности воспалительного процесса у
больных с атеросклерозом сосудов нижних конечнос‑
тей, подтвержденные снижением экспрессии актива‑
ционных маркеров лимфоцитами периферической
крови, позволяют рекомендовать эту биологически
активную добавку в качестве средства профилактики
прогрессирования атеросклеротических поражений
сосудов.
Литература
1. Запорожец Т.С. Клеточные и молекулярные механизмы
иммуномодулирующего действия биополимеров морских
гидробионтов: дис. … д-ра мед. наук. Владивосток, 2006.
356 с.
2. Майстровский К.В., Раповка Ю.В., Запорожец Т.С. и
др. Коррекция липидного и углеводного обмена у больных
облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних ко­
нечностей сульфатированными полисахаридами из бурой
водоросли Fucus evanescens // Материалы объединенного
иммунологического форума. СПб., 2008. С. 323.
3. Пигаревский П.В. Морфометрическое исследование кле­
ток иммунорегуляторного и эффекторного звеньев имму­
нитета в аорте и парааортальных лимфатических узлов
при атерогенезе у человека // Цитокины и воспаление.
2002. Т.1, № 4. С. 21–26.
4. Czyz A., Kołacz E., Angerer D.et al. Expression of activation
antigens on lymphocyte surface and circulating platelet-leuko­
cyte aggregates in ischaemic heart disease // Kardiol. Pol. 2005.
Vol. 62, No. 3. P. 189–200.
5. Lake A.C, Vassy R., Di Benedetto M. et al. Low molecu­
lar weight fucoidan increases VEGF165-induced endothe­
lial cell migration by enhancing VEGF165 binding to VEG­
115
FR-2 and NRP1 // J. Biol. Chem. 2006. Vol. 281, No. 49.
P. 37844–37852.
6. Laufs U., La Fata V., Plutzky J. et al. Upregulation of endothe­
lial nitric oxide synthase by HMG CoA reductase inhibitors //
Circulation. 1998. Vol. 97. P. 1129–1135.
7. Libby P., Ridker P.M., Maseri A. Inflammation and athero­
sclerosis // Circulation. 2002. Vol. 105. P.1135–1143.
8. Logeart D., Letourneur D., Jozefonvicz J. et al. Collagen syn­
thesis by vascular smooth muscle cells in the presence of an­
tiproliferative polysaccharides // J. Biomed. Mater. Res. 1996.
Vol. 30, No. 4. P. 501–508.
9. Logeart D., Prigent-Richard., Jozefonvicz J. et al. Fucans, sul­
fated polysaccharides extracted from brown seaweeds, inhibit
vascular smooth muscle cell proliferation. I. Comparison with
heparin for antiproliferative activity, binding and internaliza­
tion // Eur. J. Cell Biol.1997. Vol.74, No. 4. P. 376–384.
10. Palinski W. Immunomodulation: a new role for statins? // Na­
ture Medicine. 2000. Vol. 6. P. 1311 – 1312.
11. Porsch-Oezcueruemez M., Kunz D., Kloer H.U. et al. Evalua­
tion of serum levels of solubilized adhesion molecules and cyto­
kine receptors in coronary heart disease //J. Am. Coll. Cardiol.
1999. Vol. 34, No. 7. P. 1995–2001.
12. Religa P., Kazi M., Thyberg J. et al. UFucoidan inhibits smooth
muscle cell proliferation and reduces mitogen-activated protein
kinase activity // Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 2000. Vol. 20,
№ 5. P. 419–426.
13. Stoneman V.E., Bennett M.R. Role of apoptosis in atheroscle­
rosis and its therapeutic implications // Clinical Science. 2004.
Vol. 107. P. 343–354.
14. Van der Wal A.C., Das P.K., Bentz van der Berg D. et al. Athero­
sclerotic lesions in humans. In situ immunophenotypic analysis
suggesting an immune mediated response // Lab. Invest. 1989.
Vol. 61, № 2. P.166–170.
15. Wu R. Induction of human cytotoxic T lymphocytes by oxidized
low density lipoproteins // Scand. J. Immunol. 1996. Vol. 43.
P.381–384.
Поступила в редакцию 27.03.2009.
ROLE OF T-CELL DYSFUNCTION IN THE
DEVELOPMENT OF LOWER LIMB ATHEROSCLEROSIS
AND TREATMENT OPPORTUNITIES
T.S. Zaporozhets1, K.V. Maistrovskiy2, V.G. Rapovka2,
A.K. Gazha1, T.P. Smolina1, T.N. Zvyagintseva3
1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the
RAMS, Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087
Russia), 2 Vladivostok State Medical University (2 Ostryakov
Av. Vladivostok 690950 Russia), 3 Pacific Institute of Bioorganic
Chemistry, FE RAS (159 100-Anniversary Av. Vladivostok 690022
Russia)
Summary – Forty clinical observations performed by authors al‑
lowed studying the role of T-cell dysfunctions in the develop‑
ment of lower limb atherosclerosis and finding out that peripher‑
al lymphocyte subpopulation indices were within the value range
indicating satisfactory immune system functions. Increasing
number of circulating lymphocytes and intensified expression
of interleukin-2 receptor, class II major histocompatibility anti‑
gens and apoptosis marker on the lymphocyte surface indicated
that the T‑cell activation was not restricted to the atheroscle‑
rotic plaque area. The parameters which characterized relation
of lymphocyte subpopulations and intensity of activation pro‑
cesses confirmed participation of activated T-lymphocytes in the
pathogenesis of atherosclerosis. As reported, biological dietary
supplement “Fucolam” created on the basis of the Fucus eva­
nescens brown algae fucoidan exhibited corrective effect on the
intensity of inflammatory process in patients with lower limb
atherosclerosis.
Key words: atherosclerosis, activation antigens, lymphocyte
subpopulations, fucoidans.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 100–105.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
116
УДК 616.24-002.2-053.2-085.324:593.95
В.К. Козлов1, М.В. Козлов1, О.Е. Гусева1, О.А. Лебедько1, Н.В. Морозова2
1 Хабаровский филиал Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН – НИИ
охраны материнства и детства (680022 г. Хабаровск, ул. Воронежская, 49, корп.1), 2 Дальневосточный государственный
медицинский университет (680000 г. Хабаровск, ул. Муравьева-Амурского, 35)
АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ ЭХИНОХРОМА А ПРИ ХРОНИЧЕСКИХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЛЕГКИХ У ДЕТЕЙ
Ключевые слова: легкие, воспаление, дети, свободнорадикальное окисление.
В клиническом эксперименте у 12 детей 7–12 лет с хро‑
ническими воспалительными заболеваниями легких в
стадии ремиссии, возникшими на фоне пороков развития
респираторной системы, изучено влияние эхинохрома А
на процессы свободнорадикального окисления. Показано,
что исследуемый препарат повышает антиоксидантную ан‑
тирадикальную защиту организма и эффективно снижает
интенсивность свободнорадикального окисления, в том
числе на этапе пероксидации липидов.
Одной из актуальнейших задач современной детской
пульмонологии является оптимизация методов про‑
филактики и коррекции хронических воспалитель‑
ных заболеваний легких (ХВЗЛ) у детей. Ранее нами
было показано, что ХВЗЛ чаще всего формируются
на фоне врожденной патологии (бронхолегочной
дисплазии и гипоплазии легких) и имеют непрерыв‑
но-рецидивирующий характер течения: короткие ре‑
миссии сменяются продолжительными периодами
обострения [1].
Известно, что радикальные дериваты кислоро‑
да являются триггерами воспалительных процессов
в респираторной системе, регулируют клеточный и
гуморальный иммунитет, активируя редокс-чувстви‑
тельные факторы транскрипции и каскады стресс-ки‑
наз [11, 13, 14]. Генерацией кислородных метаболитов
радикальной и нерадикальной природы обеспечива‑
ются защитные микробицидный и цитотоксический
эффекты, а также иммунорегуляторное действие ак‑
тивированных фагоцитов [8, 12]. В наших предыду‑
щих исследованиях было установлено, что у детей с
ХВЗЛ в стадии ремиссии на фоне пороков развития
дыхательной системы нарушается окислительный
метаболизм гранулоцитов (снижается функциональ‑
ный резерв при гиперпродукции супероксид-аниона и
гидроксил-радикалов) [3]. Установлено также наличие
оксидативного стресса на организменном и клеточномембранном уровнях. Выявленные изменения в сис‑
теме «продукция – детоксикация свободных радика‑
лов» свидетельствовали о необходимости применения
в данной клинической ситуации препаратов, облада‑
ющих антиоксидантным антирадикальным эффектом.
Эхинохром А (2,3,5,7,8-пентагидрокси-6-этилна‑
фталиндион-1,4) является одним из самых распро‑
страненных спинохромов – хиноидных пигментов
морских беспозвоночных. Сотрудниками Тихоокеан‑
Козлов Владимир Кириллович – член-корр. РАМН, д-р мед.
наук, профессор, директор НИИ охраны материнства и детства;
тел.: 8 (4212) 35-65-91; е-mail: iomid@yandex.ru.
ского института биоорганической химии ДВО РАН
установлено наличие у этого вещества выраженных
антиоксидантных антирадикальных свойств, на ос‑
нове которых реализуются его противовоспалитель‑
ный, антимикробный и антивирусный, иммуномо‑
дулирующий эффекты [4–6]. Высокая активность
эхинохрома А обусловлена его способностью играть
роль перехватчика свободных радикалов (в том числе
супероксид-аниона), а также хелатировать ионы пе‑
ременно-валентных металлов, инициирующих сво‑
боднорадикальное окисление [2, 9, 10]. Эти свойства
эхинохрома А послужили основой для разработки ле‑
карственного препарата «Гистохром» [4].
Целью настоящей работы явился анализ влияния
эхинохрома А на процессы свободнорадикального
окисления в сыворотке крови детей с ХВЗЛ в стадии
ремиссии на фоне пороков развития дыхательной
системы.
Материал и методы. На базе клиники филиала
ДНЦ физиологии и патологии дыхания СО РАМН –
НИИ охраны материнства и детства проведено ис‑
следование, в которое были включены 12 пациентов
7–12 лет с ХВЗЛ, которые развились на фоне врож‑
денных пороков дыхательной системы, в периоде
ремиссии. Контрольную группу составили 12 здоро‑
вых детей, сопоставимые по возрастно-половому со‑
ставу. После комплексного клинико-лабораторного
обследования пациенты получали 5-дневный курс
эхинохрома А в виде внутримышечных ежедневных
инъекций 0,5 мл раствора гистохрома 0,02%. Забор
сыворотки крови проводили дважды: до и после мо‑
нотерапии эхинохромом А. На проведение работы
было получено разрешение этического комитета
НИИ охраны материнства и детства. Родители всех
пациентов дали информированное согласие на учас‑
тие детей в исследовании.
С помощью хемилюминесцентного анализа оце‑
нивали свободнорадикальный статус сыворотки
крови [7]. Определяли интенсивность свободнора‑
дикального окисления, содержание гидроперекисей
липидов, скорость накопления перекисных радика‑
лов, обратную перекисную резистентность и обрат‑
ную активность антиоксидантной антирадикальной
защиты. Интенсивность хемилюминесценции, изме‑
ренную в милливольтах, рассчитывали на 1 мл сыво‑
ротки крови и выражали в относительных единицах.
Полученные данные обработаны статистически с ис‑
пользованием t-критерия Стьюдента.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
117
Таблица 1
Результаты исследования и обПараметры хемилюминесценции сыворотки крови у детей с ХВЗЛ на фоне
суждение полученных данных. Ана‑
применения эхинохрома А (M±m)
лиз хемилюминограмм у детей с
ХВЗЛ свидетельствовал о том, что
Показатель, отн. ед.2
Группа1
все исследуемые параметры до‑
Ssp
h
Sind-1
H
Sind-2
стоверно превышали контрольные
Контроль 0,047±0,003 0,055±0,004 0,104±0,007 0,131±0,007 0,180±0,010
значения. Интенсивность свобод‑ Опыт 13
0,127±0,005 0,161±0,008 0,297±0,008 0,410±0,010 0,451±0,016
норадикального окисления была
4
Опыт 2
0,087±0,005 0,096±0,008 0,182±0,010 0,221±0,009 0,290±0,008
увеличена в 2,7 раза, концентрация
1 «Опыт 1» – до применения и «Опыт 2» – после применения эхинохрома А.
гидроперекисей липидов – в 2,9
2 Ssp – интенсивность свободно-радикального окисления, h – содержание гидроперекисей
раза, скорость образования пере‑ липидов, Sind-1 – скорость накопления перекисных радикалов, H – обратная перекисная
Sind-2 – обратная активность антиоксидантной антирадикальной защиты.
кисных радикалов – в 2,8 раза. При резистентность,
3 Разница с контролем по всем показателям статистически значима.
этом активность антиоксидантной
4 Разница с группой «Опыт 1» и контролем по всем показателям статистически значима.
антирадикальной защиты и пере‑
мической биологии и биотехнологии: тезисы докладов II
кисная резистентность были снижены в 2,5 и 3,1 раза
Региональной научной конференции. Владивосток, 2006.
соответственно. После монотерапии эхинохромом А
С. 133.
все параметры хотя и сохраняли статистически значи‑ 7. Приезжева Е.Ю., Лебедько О.А., Рыжавский Б.Я. и др.
мые отличия от контрольных, достоверно снижались
Влияние введения нитрата свинца беременным крысам
по сравнению с показателями до применения препа‑
на почки их потомства // Дальневосточный мед. журнал.
2007. № 3. С. 30–32.
рата. Так, уровни обратной активности антиоксидант‑
8. Fialkow L., Wang Y., Downey G.P. Reactive oxygen and nitro­
ной антирадикальной защиты и обратной перекисной
gen species as signaling molecules regulating neutrophil function
резистентности снизились в 1,6 и 1,9 раза, что свиде‑
// Free Radic. Biol. Med. 2007. Vol. 42, No. 2. P. 153–164.
тельствовало о повышении активности антирадикаль‑ 9. Lebedev A.V., Ivanova M.V., Levitsky D.O. Echinochrome, a
ной защиты и перекисной резистентности. На этом
naturally occurring iron chelator and free radical scavenger
in artificial and natural membrane systems // Life Sci. 2005.
фоне интенсивность свободнорадикальных процессов
Vol. 76, No. 8. P. 863–875.
снизилась в 1,5 раза, концентрация гидроперекисей
10. Lebedev A.V., Ivanova M.V., Levitsky D.O. Iron chelators and
липидов – в 1,7 раза, скорость образования перекис‑
free radical scavengers in naturally occurring polyhydroxylated 1,4ных радикалов – в 1,6 раза (табл.).
naphthoquinones // Hemoglobin. 2008. Vol. 32, No. 1. P. 165–179.
Таким образом, результаты хемилюминесцентно‑ 11. Matsuzawa A., Ichijo H. Redox control of cell fate by MAP kinase:
physiological roles of ASK1-MAP kinase pathway in stress signaling
го анализа динамики показателей свободнорадикаль‑
// Biochim. Biophys. Acta. 2008. Vol. 178, No. 11. P. 1325–1336.
ного статуса сыворотки крови на фоне применения
12. Rada B., Leto T.L. Oxidative innate immune defenses by Nox/
эхинохрома А у детей с ХВЗЛ в стадии ремиссии с по‑
Duox family NADPH oxidases // Contrib. Microbiol. 2008.
роками развития легких свидетельствуют о том, что в
Vol. 15. P. 164–187.
данной клинической ситуации препарат эффективно 13. Rahman I. Oxidative stress, chromatin remodeling and gene
transcription in inflammation and chronic lung diseases // J.
реализует свои антиоксидантные антирадикальные
Biochem. and Mol. Biol. 2003. Vol. 36, No. 1. P. 95–109.
свойства и значительно снижает интенсивность сво‑
14. Tsukahara H.Current status of redox markers in immunologi­
боднорадикального окисления, в том числе на этапе
cal and inflammatory diseases // Rinsho Byori. 2005. Vol. 53,
пероксидации липидов.
No. 8. P. 759–767.
Литература
1. Козлов В.К., Рыжавский Б.Я., Лебедько О.А. и др. Этиопа­
тогенетические и клинические особенности формирования
хронических обструктивных болезней легких у детей При­
амурья // Бюлл. физиол. и патол. дыхания СО РАМН. 2007.
№ 24. С. 11–12.
2. Лебедев А.В., Иванова М.В., Красновид Н.И. и др. Кислот­
ные свойства и взаимодействие с супероксид-анион-ради­
калом эхинохрома А и его структурных аналогов // Вопро­
сы мед. химии. 1999. Т. 45, № 2. С. 123–130.
3. Лебедько О.А., Гусева О.Е., Козлов В.К. Нарушения окси­
дативного метаболизма при хронических бронхобструк­
тивных заболеваниях легких у детей // Бюлл. физиол. и
патол. дыхания СО РАМН. 2007. № 27. С. 12–13.
4. Мищенко Н.П., Федореев С.А., Багирова В.Л. Новый ори­
гинальный отечественный препарат гистохром // Хим.фармацевт. журнал. 2003. Т. 37, № 1. С. 49–53.
5. Мищенко Н.П., Федореев С.А., Догадова Л.П. Препарат
гистохром для офтальмологии // Вестник ДВО РАН. 2004.
№ 3. С. 111–119.
6. Попов А.М., Ли И.А., Артюков А.А. Общее протективное
действие БАД «Эхиазан» и «Тимарин» при эксперимен­
тальном стрессе // Исследования в области физико-хи­
Поступила в редакцию 20.04.2009.
ANTIOXIDATIVE ACTIVITY OF ECHINOCHROME
A IN CASE OF CHRONIC INFLAMMATORY LUNG
DISEASES IN CHILDREN
V.K. Kozlov1, M.V. Kozlov1, O.E. Guseva1, O.A. Lebedko1,
N.V. Morozova2
1 Khabarovsk Branch of the Far Eastern Research Centre of
Physiology and Respiration Pathology, RAMS, Siberian Branch –
Research Centre of Motherhood and Childhood Protection
(1 Building 49 Voronezhskaya St. Khabarovsk 680022 Russia),
2 Far Eastern State Medical University (35 Muraviyov-Amurskiy
St. Khabarovsk 680000 Russia)
Summary – Clinical experiment conducted by authors in respect
of 12 children aged 7 to 12 with chronic inflammatory lung dis‑
eases in the remission period occurred as a result of the respira‑
tory system malformations allowed to study effect produced by
the echinochrome A on the free radical oxidation processes. This
drug increased antioxidative antiradical protection of an organ‑
ism and efficiently decreased intensity of the free radical oxida‑
tion processes, including during the lipid peroxidation.
Key words: lungs, inflammation, children, free radical oxidation.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 106–107.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
118
УДК 616.366-003.7-085.37:615.324
Л.Т. Гильмутдинова1, А.Р. Гильмутдинов1, Р.Р. Кудаярова1, Л.С. Минеева2
Башкирский государственный медицинский университет (450000 Республика Башкортостан, г. Уфа, ул. Ленина, 3),
санаторий «Юматово» (450022 Республика Башкортостан, пос. Юматово)
1 2 ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ ЭФФЕКТЫ КУМЫСОЛЕЧЕНИЯ В САНАТОРНОЙ РЕАБИЛИТАЦИИ
БОЛЬНЫХ, ОПЕРИРОВАННЫХ ПО ПОВОДУ ЖЕЛЧНО-КАМЕННОЙ БОЛЕЗНИ
Ключевые слова: кумыс, желчно-каменная болезнь, послеоперационный период, санаторное лечение.
Оценена эффективность кумысолечения в условиях специа‑
лизированного санатория на материале обследования 215 па‑
циентов, оперированных по поводу желчно-каменной болез‑
ни. Показано, что применение кумыса способствует восста‑
новлению иммунного статуса, снижению концентрации цир‑
кулирующих иммунных комплексов и иммуноглобулинов на
фоне регресса послеоперационных клинических симптомов.
Распространенность желчно-каменной болезни в Рос‑
сии составляет в среднем 25,4%, в связи с чем увеличи‑
вается число операций по поводу холелитиаза – до
100 000 в год [2, 6]. У оперированных по поводу холе‑
литиаза послеоперационный период характеризуется
пост­холецистэктомическими расстройствами, кото‑
рые во многом определяются нарушениями функци‑
онального состояния органов гепатопанкреатодуоде‑
нальной зоны в дооперационном периоде. Сохраня‑
ются или усугубляются проявления болевого, диспеп‑
тического, астеноневротического синдромов, у поло‑
вины пациентов отмечаются нарушения деятельности
желудочно-кишечного тракта и иммунной системы [6,
7]. Учитывая высокую распространенность патологии,
своевременная коррекция этих нарушений в раннем
послеоперационном периоде является весьма актуаль‑
ной. Здесь особую значимость имеет восстановитель‑
ное лечение с применением природных и преформи‑
рованных лечебных физических факторов, рацио‑
нального лечебного питания. В санаторно-курортной
практике Башкортостана широко используется кумыс
из натурального кобыльего молока. Основанием к его
применению послужили данные о противовоспали‑
тельных, антибактериальных, иммуномодулирующих,
антиоксидантных, желчегонных эффектах [1, 4, 5, 8].
Однако до сих пор малоизученной остается возмож‑
ность применения, а также лечебная эффективность
кумыса в санаторном лечении после холецистэктомии,
его влияния на состояние гепатобилиарной системы и
на иммунологическую реактивность.
Целью настоящего исследования явилась оценка
иммуномодулирующей эффективности применения
кумыса в восстановительном лечении пациентов,
оперированных по поводу желчно-каменной болезни.
Материал и методы. Наблюдали 215 человек (в т.ч.
165 женщин), оперированных по поводу желчно-ка‑
менной болезни, которые проходили санаторное до‑
лечивание в кумысолечебном санатории «Юматово».
Средний возраст пациентов составил 43,2±5,1 года.
Гильмутдинова Лира Талгатовна – д-р мед. наук, профессор,
завкафедрой и директор НИИ восстановительной медицины и ку‑
рортологии БГМУ; тел.: 8 (347) 228-43-78; e-mail: vmk-ufa@mail.ru.
В санаторий они были направлены из хирургических
стационаров на 12–14-й день после операции. В зави‑
симости от проводимого лечения больные разделены
на 2 группы. 1-я группа (123 человека) получали ком‑
плексы восстановительного лечения с применением
кумыса [3]. Во 2-ю группу (сравнения) вошли 92 паци‑
ента, которые получали комплексное санаторное ле‑
чение без кумыса. Группы больных были сопоставимы
по клиническим, биохимическим и иммунологичес‑
ким параметрам, а также видам операций. Контроль‑
ная группа состояла из 23 практически здоровых лиц,
находившихся в санатории на отдыхе.
Методика кумысолечения состояла из приема ку‑
мыса слабого вида с созреванием через 5–8 часов при
60–81°С (по Тернеру). Питьевой режим был анало‑
гичен режиму приема минеральных вод и зависел от
состояния секреторно-моторной и эвакуаторной фун‑
кций системы пищеварения. В начале курса разовая
доза составляла от 50 до 100 мл с постепенным увели‑
чением до 250 мл три раза в день. Продолжительность
санаторного лечения – 18–24 дня. Всем больным про‑
водилось комплексное обследование с анализом кли‑
нических, лабораторных и инструментальных данных
при поступлении, при выписке из санатория и через 6
и 12 месяцев после санаторного лечения.
Состояние гуморального иммунитета оценивали
по концентрации иммуноглобулинов (Ig) А, М, G в
сыворотке крови, определяемой методом турбиди‑
метрии на биохимическом анализаторе «Хитачи-912»
(Япония), циркулирующих иммунных комплексов
(ЦИК) – стандартным методом преципитации 3,75%
раствором полиэтиленгликоля. Содержание сыворо‑
точных цитокинов – интерлейкинов (ИЛ) и факто‑
ра некроза опухоли-α (ФНОα) исследовали методом
твердофазового иммуноферментного анализа с ис‑
пользованием тест-систем ООО «Протеиновый кон‑
тур» (Санкт-Петербург). Статистическую обработку
полученных данных выполняли с помощью пакета
программ Statistika 6.0.
Результаты исследования. У большинства опериро‑
ванных при поступлении в санаторий была отмечена
избыточная масса тела различной степени. Послеопе‑
рационный период в большинстве случаев протекал с
нарушением моторно-эвакуаторной функции желу‑
дочно-кишечного тракта, проявлявшимся желудоч‑
ной и кишечной диспепсией. Признаки желудочной
диспепсии (тошнота, отрыжка) отмечали 125 больных
(58,1%). Синдром кишечной диспепсии в виде метео‑
ризма наблюдался у 58 (27%), запоров – у 48 (22,3%)
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
119
Таблица
Влияние кумысолечения на цитокиновый профиль крови больных с мезенхимально-воспалительным синдромом (М±m)
Показатель, пг/мл
ИЛ-1β
ИЛ-6
ФНОα
ИЛ-4
ИЛ-10
1
2
Контроль
425,90±20,78
199,01±12,70
294,63±13,73
190,90±12,27
102,42±6,78
1-я группа
2-я группа
до лечения
после лечения
до лечения
после лечения
727,64±30,11
304,12±12,08
473,56±19,65
98,65±9,12
59,32±6,02
426,69±29,371, 2
221,05±10,441, 2
317,71±17,121, 2
180,82±9,431, 2
82,14±4,031
726,72±30,14
304,22±10,14
472,63±18,43
97,45±10,12
58,28±6,51
58,28±6,511
259,49±12,411
352,19±19,271
143,27±11,141
71,84±5,07
Разница с показателями до лечения статистически значима.
Разница с аналогичными показателями 2-й группы статистически значима.
и диареи – у 12 человек (5,6%). Практически у всех па‑
циентов диагностирован астеноневротический синд‑
ром (слабость, головная боль, повышенная утомляе‑
мость). Исследование биохимических параметров
крови показало наличие клинико-патохимических
синдромов – преимущественно холестатического, ци‑
толитического и мезенхимально-воспалительного.
Практически у всех обследованных в ранний восста‑
новительный период зарегистрированы фоновые рас‑
стройства иммунной системы. Сравнительный их ана‑
лиз позволил выявить вариабельность показателей у
здоровых и больных, а также зависимость от ведущего
патохимического синдрома.
Наиболее значимые изменения иммунного стату‑
са выявлены у лиц с мезенхимально-воспалительным
синдромом: сдвиги показателей иммуноглобулинов
в сторону превышения уровня контроля составили:
для IgA – 74,8%, для IgG – 19,4%, для IgM –23,6%.
Концентрация ЦИК превышала норму на 59,7%.
Цитокиновый статус крови характеризовался по‑
вышением уровней провоспалительных цитокинов:
ИЛ‑1β – на 69,08%, ИЛ-6 – на 52,4%, ФНОα – на
60,2%, при снижении уровней противовоспалитель‑
ных цитокинов: ИЛ-4 – на 48,2%, ИЛ-10 – на 42,6%.
Анализ иммунного статуса больных с цитолитичес‑
ким синдромом показал значимое увеличение уровней
IgA и ЦИК. Сдвиги параметров цитокинового профи‑
ля носили менее выраженный характер, чем при ме‑
зенхимально-воспалительном синдроме, но значимо
отличались от таковых у больных с холестатическим
синдромом. На фоне применения кумыса отмечена
нормализация иммунологических показателей у опе‑
рированных пациентов (табл.). Наиболее значимые
сдвиги зарегистрированы у больных с мезенхимальновоспалительным синдромом: снижение от исходных
значений уровней IgM (на 36,4%), IgА (на 29,8%) при
менее значимых сдвигах IgG и ЦИК. При этом вы‑
явлено значимое снижение концентраций ИЛ-1β (на
40,05%), ИЛ-6 (на 26,2%) и ФНОα (на 32,9%) при росте
значений ИЛ-4 (на 82,8%) и ИЛ-10 (на 42,1%). У боль‑
ных с преимущественно цитолитическим и холеста‑
тическим синдромами динамика иммунологических
параметров носила аналогичный характер при менее
значимых сдвигах. Показатели врожденного имму‑
нитета на фоне кумысолечения имели тенденцию к
нормализации преимущественно у лиц с синдромом
мезенхимального воспаления. Выявлена статистичес‑
ки значимая активация системы фагоцитоза с возрас‑
танием фагоцитарного показателя на 28,9% и фагоци‑
тарного числа – на 19,3% от исходных значений.
Обсуждение полученных данных. В раннем периоде
после холецистэктомии у больных зарегистрированы
изменения в виде напряженности гуморального им‑
мунитета и дисбаланса цитокинового профиля. Сдви‑
ги иммунологических показателей более выражены
у лиц с мезенхимально-воспалительными и цитоли‑
тическими проявлениями. Нарушения иммунного
статуса в послеоперационном периоде, вероятно, свя‑
заны с длительностью и выраженностью желчно-ка‑
менной болезни, патологическими изменениями со
стороны органов гепатопанкреатодуоденальной зоны
в дооперационном периоде. Кроме того, известно, что
хирургическое вмешательство само по себе является
предиктором дисбаланса цитокинового профиля, в
том числе вследствие послеоперационных воспали‑
тельных изменений органов пищеварения [6, 7].
Динамика иммунологических показателей на фоне
кумысолечения показывает, что кумыс способствует
нормализации уровня иммуноглобулинов, ЦИК, ста‑
билизации цитокинового статуса, что свидетельствует
о его иммуномодулирующих свойствах. Кумыс уни‑
кален по химическому составу, представляет собой
продукт молочнокислого и алкогольного брожения
кобыльего молока, содержит белки и аминокислоты,
углекислоту, молочную кислоту, различные ферменты,
витамины, микроэлементы, антибиотические вещес‑
тва, молочнокислые бактерии, ряд гормонов, поли‑
ненасыщенные жирные кислоты и др. [1]. Известно
благотворное влияние кумыса на окислительно-вос‑
становительные и биохимические процессы, на пере‑
кисное окисление липидов и антиоксидантные свойс‑
тва плазмы крови, на процессы воспаления и иммуно‑
логические параметры [5, 8].
Оценка эффективности санаторного восстанови‑
тельного лечения после холецистэктомии показала,
что достоверно положительные результаты отмечены в
группе лиц, получавших кумыс. Из них 23,4% больных
выписаны со значительным улучшением, 76,6% – с
улучшением. При изучении отдаленных результатов
(через 6 и 12 мес.) отмечено, что среди принимавших
кумыс не регистрировались пациенты с ухудшением
состояния.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
120
Таким образом, иммунологический статус у опе‑
рированных по поводу желчно-каменной болезни
при поступлении на санаторный этап реабилитации
характеризуется напряженностью гуморального звена
с увеличением уровней иммуноглобулинов А, М, G и
ЦИК, дисбалансом цитокинового профиля с гипер‑
продукцией провоспалительных и депрессией проти‑
вовоспалительных цитокинов, сопряженным с выра‑
женностью биохимических изменений. Применение
кумысолечения способствует восстановлению имму‑
нологической реактивности, существенному улучше‑
нию клинических показателей, а также улучшению
биохимических параметров.
Литература
1. Валиев А.Г., Валиева Т.А. Влияние полиненасыщенных жирных
кислот кобыльего молока на показатели иммунной системы
организма // Актуальные вопросы курортологии и физиоте­
рапии: матер. науч.-практ. конф. Уфа, 1999. С. 170–171.
2. Галеев М.А., Тимербулатов В.М. Желчно-каменная болезнь
и холецистит. Уфа. 1997. 252 с.
3. Гильмутдинов А.Р., Разумов А.Н., Хасанов А.Г., Минеева Л.С.
Биохимические аспекты реабилитации больных, опериро­
ванных по поводу желчно-каменной болезни // История
науки и техники. 2006. № 1. С. 106–109.
4. Гильмутдинов А.Р. Применение кумыса в санаторной реабили­
тации больных, оперированных по поводу язвенной болезни //
Вестник восстановительной медицины. 2007. № 1. С. 45–47.
5. Гильмутдинова Л.Т., Хабибрахманов М.М., Ахмадуллин Р.В.
Реабилитация и комплексное лечение больных в кумысоле­
Тихоокеанский медицинский журнал, 2009, № 3
чебном санаторий «Юматово». Уфа, 2004. 162 с.
6. Ильченко А.А. Желчно-каменная болезнь // Лечащий врач.
2004. № 4. С. 27–32.
7. Лазебник Л.Б., Царегородцева Т.М., Парфенов А.И. Им­
мунная система и болезни органов пищеварения // Тер. ар­
хив. 2004. № 1. С. 5–8.
8. Назифуллин В.Л., Ахмадуллин Р.В., Загидуллин Ш.З. Кобы­
лье молоко и кумыс – источники лактогенных гормонов и
терапевтические средства коррекции иммунного гомеоста­
за // Акт. вопр. кумысоделия и кумысолечения: мат. республ.
конф. Уфа. 2000. С. 71–74.
Поступила в редакцию 10.04.2009.
IMMUNOMODULATING EFFECTS OF KOUMISS
TREATMENT DURING SANATORIUM
REHABILITATION OF PATIENTS OPERATED FOR
CHOLELITHIASIS
L.T. Gilmutdinova1, A.R. Gilmutdinov1, R.R. Kudayarova1,
L.S. Mineeva2
Bashkir State Medical University (3 Lenin St. Ufa 450000
Republic of Bashkortostan), Sanatorium “Yumatovo” (settlement
Yumatovo 450022 Republic of Bashkortostan)
Summary – The paper provides estimation of efficiency of ad‑
ministering koumiss treatment in specialized sanatorium. Ana‑
lyzing the examination of 215 patients operated for cholelithiasis
allows to conclude that the koumiss is conductive to restoration
of immune status, decrease of concentrations of circulating im‑
mune complexes and immunoglobulins associated with a regress
of post-operative clinical symptoms.
Key words: koumiss, cholelithiasis, post-operative period, sanato­
rium treatment.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 108–110.
УДК 616.24-033.3-036.12-06:612.017.1
М.Ф. Киняйкин1, Г.И. Суханова1, И.В. Наумова1, Т.А. Кузнецова2, А.Я. Овчинников1, И.М. Полетаева1, В.М. Безнис1
Владивостокский государственный медицинский университет (690950 г. Владивосток, пр-т Острякова, 2),
НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1)
1 2 РОЛЬ ГИПОКСЕМИИ В ФОРМИРОВАНИИ НАРУШЕНИЙ ИММУНИТЕТА И ГЕМОСТАЗА У БОЛЬНЫХ
ХРОНИЧЕСКОЙ ОБСТРУКТИВНОЙ БОЛЕЗНЬЮ ЛЕГКИХ
Ключевые слова: хроническая обструктивная болезнь легких, цитокины, гемостаз, гипоксия.
Обследовано две группы больных хронической обструк‑
тивной болезнью легких: без гипоксемии (24 человека) и с
гипоксемией (17 человек). Установлена взаимосвязь между
уровнем гипоксемии и показателями системного воспале‑
ния и гемостаза. У пациентов с явлениями гипоксемии уро‑
вень маркеров системного воспаления, гиперкоагуляции и
депрессии фибринолитической системы был существенно
выше, чем у больных с нормальными показателями насыще‑
ния артериальной крови кислородом, что свидетельствует о
значимой роли гипоксемии в патогенезе воспалительной
реакции при хронической обструктивной болезни легких.
Гипоксемии отводится важная роль в патогенезе хро‑
нической обструктивной болезни легких (ХОБЛ).
В ответ на местную альвеолярную гипоксию развива‑
ется легочно-артериальный рефлекс Эйлера–Лиль‑
естранда [12]. Он приводит к спазму ветвей легочной
артерии с развитием легочной гипертензии и форми‑
рованием хронического легочного сердца, декомпен‑
Киняйкин Михаил Федорович – канд. мед. наук, доцент кафед‑
ры госпитальной терапии с курсом фтизиопульмонологии ВГМУ;
тел.: 8 (4232) 40-08-46; е-mail: 589014@bk.ru.
сация которого является второй по частоте причиной
смерти в структуре общей смертности больных ХОБЛ,
уступая лишь дыхательной недостаточности [13]. До‑
казана прямая зависимость между тяжестью легочной
гипертензии и степенью артериальной гипоксемии
[11]. В ряде исследований показано, что гипоксемия
является одним из основных факторов повреждения
миокарда желудочков при ХОБЛ. Она вызывает раз‑
витие гипоксической миокардиодистрофии с форми‑
рованием хронической сердечной недостаточности [3].
В последние годы активно обсуждается роль гипоксе‑
мии в развитии системного воспаления и дисфункции
эндотелия легочных сосудов при ХОБЛ. Динамика
уровня цитокинов в бронхиолоальвеолярном лаваже
и сыворотке крови больных является определяющим
показателем при оценке степени активности воспали‑
тельного процесса и критерием эффективности про‑
водимой терапии [1, 5, 6]. Совсем недавно были пред‑
ставлены данные о взаимосвязи маркеров системно‑
го воспаления и легочной гипертензии у больных
ХОБЛ. Обнаружено, что уровни С-реактивного белка
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оригинальные исследования
и фактора некроза опухоли-α (ФНОα) существенно
выше у больных с легочной гипертензией [8