close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

914.Методы оценки оксидативного статуса

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ»
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ
ОКСИДАТИВНОГО СТАТУСА
Учебно-методическое пособие для вузов
Издательско-полиграфический центр
Воронежского государственного университета
2009
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного
факультета 13 мая 2009 г., протокол № 9
Составители: Т.И. Рахманова, Л.В. Матасова, А.В. Семенихина,
О.А. Сафонова, А.В. Макеева, Т.Н. Попова
Рецензент доцент, канд. биол. наук И.М. Фалеева
Учебное пособие подготовлено на кафедре медицинской биохимии и микробиологии биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.
Рекомендуется для студентов IV курсов очной и очно-заочной
форм обучения биолого-почвенного факультета в качестве основной
литературы по дисциплине «Свободнорадикальные процессы в биосистемах», а также для студентов III–V курсов очной и IV–VI курсов
очно-заочной форм обучения биолого-почвенного факультета в качестве основной литературы по дисциплине «Большой практикум», а
также для магистрантов I года обучения биолого-почвенного факультета в качестве основной литературы по дисциплине «Молекулярные
механизмы развития свободнорадикальных патологий».
Для специальности 020201 – Биология; направления 020200 –
Биология
2
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Методы оценки интенсивности протекания процессов
свободнорадикального окисления
Определение параметров биохемилюминесценции
Определение уровня первичных продуктов
пероксидного окисления липидов
Определение уровня вторичных продуктов
пероксидного окисления липидов
Оценка окислительной модификации белков
Оценка степени фрагментации ДНК
Определение активности аконитатгидратазы
Методы оценки активности антиоксидантной системы
организма
Определение активности супероксиддисмутазы
и каталазы
Определение функциональной активности
глутатионовой антиоксидантной системы
Определение активности ферментов – основных
поставщиков НАДФН для работы глутатионовой
антиоксидантной системы
Определение уровня цитрата и активности
цитратсинтазы
Оценка уровня токоферола
Некоторые подходы для оценки степени развития
патологических процессов
Определение активностей ферментов – показателей
цитолиза гепатоцитов и кардиомиоцитов
Оценка состояния энергетического обмена в ткани
головного мозга: определение уровня лактата и пирувата
Список литературы
Приложение. Некоторые экспериментальные модели
патологических состояний
3
5
6
6
7
9
10
13
16
18
19
22
28
30
34
37
37
46
51
60
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ
АГ – аконитатгидратаза
АлАТ – аланинаминотрансфераза
АОС – антиоксидантная система
АсАТ – аспартатаминотрансфераза
АФК – активные формы кислорода
БХЛ – биохемилюминесценция
Г6ФДГ – глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа
ГП – глутатионпероксидаза
ГР – глутатионредуктаза
ГР/ГП – глутатионредуктазная/глутатионпероксидазная система
2,4-ДНФГ – 2,4-динитрофенилгидразин
ДК – диеновые коньюгаты
ИДГ – изоцитратдегидрогеназа
КК – креатинкиназа
ЛДГ – лактатдегидрогеназа
МДА – малоновый диальдегид
НАД(Н) – никотинамидадениндинуклеотид окисленный (восстановленный)
НАДФ(Н) – никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный (восстановленный)
ПОЛ – пероксидное окисление липидов
ПОЛ – пероксидное окисление липидов
ПФП – пентозофосфатный путь
СДГ – сукцинатдегидрогеназа
СОД – супероксиддисмутаза
СР – свободные радикалы
СРО – свободнорадикальное окисление
ТХУ – трихлоруксусная кислота
6ФГДГ – 6-фосфоглюконатдегидрогеназа
ЦС – цитратсинтаза
ЭДТА – этилендиаминтетраацетат
GSH – глутатион восстановленный
GSSG – глутатион окисленный
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ВВЕДЕНИЕ
На данный момент накоплен фактический материал о взаимосвязи развития многих патологических состояний с интенсивностью процессов свободнорадикального окисления (СРО) биомолекул. Известно,
что СРО является метаболическим процессом, протекающим в организме млекопитающих в условиях физиологической нормы на стационарном уровне за счет функционирования согласованной системы антиоксидантной защиты (АОЗ), осуществляющей главным образом контроль
за содержанием активных форм кислорода (АФК) и связыванием ионов Fe2+. Однако при нарушении этой стационарности происходит развитие оксидативного стресса, который можно определить как возникновение дисбаланса между интенсивностью процессов СРО и функциональной активностью антиоксидантной системы (АОС).
При чрезмерной интенсификации СРО служит одним из ведущих механизмов клеточной патологии, включая аутоиммунные болезни, хронические воспаления, сердечно-сосудистые, нейродегенеративные заболевания и другие.
Необходимо отметить, что последние годы в развитии представлений о механизмах регуляции СРО характеризуются системным
подходом к рассмотрению АОС, включающей, как известно, ферментативное и неферментативное звенья. АОС рассматривается как неотъемлемая многоуровневая метаболическая система живых организмов, в которой функционирование отдельных компонентов рассматривается не изолированно, а с учетом их взаимодействия с другими компонентами АОС и системой клеточного метаболизма в целом. Согласно этой концепции практически на всех уровнях АОЗ имеет место система тонкой метаболической регуляции, благодаря которой эффективность функционирования каждой последующей линии защиты определяется функциональным состоянием предыдущего рубежа. Имеются
данные, свидетельствующие о том, что некоторые ферменты окислительного метаболизма также могут оказывать опосредованное, но вместе с тем существенное влияние на образование активных форм кислорода (АФК).
Современный подход состоит в рассмотрении АОС не как аддитивной суммы отдельных компонентов специфического действия, а
как взаимосвязанной метаболической системы, мобилизации которой
предшествуют триггерные перестройки метаболизма.
5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ИНТЕНСИВНОСТИ ПРОТЕКАНИЯ
ПРОЦЕССОВ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ
Определение параметров биохемилюминесценции
Метод биохемилюминесценции (БХЛ) может применяться в клинической биохимии для выявления нарушений липидного обмена (гипо- и
гиперлипопротеинемий), воспалительных заболеваний, инфекционных и
онкологических заболеваний [Азизова О.А., 2001]. В клинических условиях определение БХЛ может быть применено в нескольких направлениях:
– определение формы заболевания. При острой форме заболевания уровень БХЛ в 5 и более раз превышает значения нормы, при
хронической только в 2–3 раза;
– оценка интенсивности СРО для системной антиоксидантной терапии;
– определение степени тяжести болезни по динамике значений БХЛ;
– оценка степени завершенности патологического процесса по
нормализации показателей БХЛ;
– выявление возможности летального исхода послеоперационных больных (происходит резкое снижение интенсивности БХЛ);
– оценка безопасности проведения лазеро-, фото- и озонотерапии.
Для определения интенсивности свободнорадикальных процессов применяют метод индуцированной БХЛ. БХЛ индуцируют пероксидом водорода с сульфатом железа.
Принцип метода основан на том, что в представленной системе
происходит каталитическое разложение перекиси ионами металла с
переходной валентностью – Fe2+, по реакции Фентона. Образующиеся
при этом свободные радикалы (R*, ОН*, RO*, RO2*, O2*) вступают в
процесс инициации свободнорадикального окисления в исследуемом
биологическом субстрате. Рекомбинация радикалов RO2* приводит к
образованию неустойчивого тетроксида, распадающегося с выделением кванта света. Интенсивность свободнорадикальных процессов определяют на биохемилюминометре с программным обеспечением. Кинетическую кривую БХЛ регистрируют в течение 30 с и определяют
следующие параметры: светосумму хемилюминесценции (S), интенсивность вспышки (Imax), характеризующие интенсивность свободнорадикальных процессов, а также величину тангенса угла наклона кривой (tg α2), характеризующую общую антиоксидантную активность
[Кузьменко Д.Н., 1999]. Антиоксидантный потенциал обследуемой
пробы также коррелирует с коэффициентом К, определенным по от6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ношению Imax/S. На интенсивность исследуемого процесса оказывает
влияние полный комплекс соединений, обладающих как антиоксидантными, так и прооксидантными действиями, то есть метод дает
возможность оценить уровень компенсаторных механизмов свободнорадикального процесса в организме.
Среда для определения интенсивности БХЛ имеет следующий
состав: 0,4 мл 0,02 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7,5), 0,4 мл
0,01 мМ FeSO4, 0,2 мл 2%-го раствора пероксида водорода (вносимого
непосредственно перед измерением). Исследуемый материал вносят в
количестве 0,1 мл непосредственно перед измерением до внесения
пероксида водорода.
Определение уровня первичных продуктов
пероксидного окисления липидов
Принято считать, что важнейшую роль в организме млекопитающих играет свободнорадикальное (пероксидное) окисление липидов. По-видимому, это связано с тем, что АФК имеют наиболее высокую константу взаимодействия с полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК), являющимися основным структурным компонентом
фосфолипидов мембран (Владимиров Ю.А., 1972).
Пероксидное окисление липидов (ПОЛ) представляет собой
процесс непосредственного переноса кислорода на субстрат с образованием перекисей, кетонов, альдегидов и других соединений. Отличительной чертой этой реакции является ее цепной, самоиндуцирующийся характер. Реакция протекает в несколько стадий, которые получили название «инициирование», «продолжение», «разветвление» и
«обрыв» цепи (табл. 1).
Таблица 1
Основные этапы пероксидного окисления липидов
Стадия процесса
Химические реакции
Инициация
НО• + LH → Н2О + L•
Продолжение
L• +О2 → LOO•
LOO• + LH → LOOН + L•
Разветвление
Fe2+ + LOOH → Fe3+ + HO- + LO•
LO• + LH → LOH + L•; L• + O2 → LOO• и т.д.
Обрыв
LOO• + Fe2+ + H+ → LOOH
LOO• + AnH → An•
LOO• + LOO• → молекулярные продукты
7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Биологические последствия ПОЛ связаны с повреждением белковых структур (мембранных белков) и липидного бислоя мембран в
целом. Для оценки интенсивности процессов ПОЛ в биосубстратах
используют методы определения ряда его продуктов. Так, к первичным продуктам ПОЛ относят диеновые коньюгаты. Поскольку наиболее легко отрывается атом водорода от углерода, находящегося в альфа-положении по отношению к двойной связи в молекуле ненасыщенной жирной кислоты, то при делокализации неспаренного электрона в
молекулах жирнокислотных остатков появляется система сопряженных двойных связей, т. е. возникают конъюгированные диены. Данные
соединения легко взаимодействуют с кислородом с образованием перекисных радикалов, а в дальнейшем и гидроперекисей. Содержание
диеновых коньюгатов определяют спектрофотометрическим методом.
Принцип метода состоит в том, что образование в молекуле полиненасыщенных жирных кислот сопряженных двойных связей (конъюгированных диенов) сопровождается появлением в спектре их поглощения максимума в области 232–234 нм с плечом в области 260–280 нм,
соответствующим сопряженным кетодиенам (Стальная И.Д., 1977).
Ход работы. 0,25 мл исследуемого материала растирают в течение 15 мин в гомогенизаторе Поттера–Эльвегейма с 9 мл экстрагирующей смеси гептана с изопропиловым спиртом в соотношении 1 : 1. Полученную суспензию помещают в плотно закрывающиеся полиэтиленовые пробирки. Пробы центрифугируют при 4000g в течение 10 мин.
Надосадочную жидкость переносят в градуированные пробирки и добавляют 1/10 объема дистиллированной воды. После двукратного
встряхивания и расслаивания фаз отбирают гептановую фазу. К равным
объемам по 0,5 мл приливают этиловый спирт в объемном отношении
1 : 5 – 1 : 10. Измеряют экстинкцию при 233 нм. В качестве контроля
используют пробы, содержащие только экстрагирующую фазу или вместо 1 мл супернатанта 1 мл 0,1 моль/л фосфатного буфера (рН 7,6). Содержание диеновых коньюгатов рассчитывают по следующей формуле:
V ×D
,
[ ДК ] = общ
L × E × Vвнес
где [ДК] – концентрация диеновых коньюгатов, мкМ/г; Vобщ – объем
полученного образца, мл; D – величина оптической плотности, ед.;
L – длина оптического пути, см; Е – коэффициент молярной экстинкции, равный 2,2 × 105 М–1с–1; Vвнес – объем вносимой пробы, мл.
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Определение уровня вторичных продуктов
пероксидного окисления липидов
Ко вторичным продуктам ПОЛ относят такие кислородосодержащие соединения, как спирты, альдегиды и диальдегиды, лактоны, эпоксиды и другие вещества, которые образуются в результате распада липидных пероксидов, наиболее интенсивно протекающего в присутствии катализаторов – ионов металлов переменной валентности. В биологических
системах эти продукты находятся обычно в достаточно высоких стационарных концентрациях и принимают участие в различных биохимических процессах. В связи с этим их общее содержание не всегда отражает
реальную интенсивность течения процессов ПОЛ. Метод определения
карбонильных продуктов ПОЛ при нагревании образца в присутствии
2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК) при кислых рН и измерении концентрации образовавшегося продукта при 532 нм получил достаточно широкое распространение. Продуктом, взаимодействующим с ТБК, является
малоновый диальдегид (МДА) или его производные. Кроме того, некоторые соединения – глюкоза, желчные пигменты, простагландины – могут
взаимодействовать с ТБК подобно МДА и давать начало комплексу, также поглощающему вблизи 532 нм. Данный метод не может служить надежным критерием оценки интенсивности ПОЛ в модельных системах и
биологических объектах, однако может использоваться как отдельный
компонент при комплексной оценке, включающей определенную совокупность методов [Стальная И.Д., 1977; Minara M. et al., 1980].
Принцип метода. При высокой температуре в кислой среде
МДА реагирует с ТБК, образуя окрашенный триметиловый комплекс с
максимумом поглощения при 532 нм.
Ход работы. Для проведения анализа 1 мл биологической пробы
помещают в центрифужные пробирки и осаждают балластные белки
добавлением 0,4 мл 17%-го раствора трихлоруксусной кислоты с конечной концентрацией 5 %. Образующийся осадок отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 4000 g на центрифуге типа
Т-62. Надосадочную жидкость по 1 мл количественно переносят в пробирки, добавляют по 0,5 мл 0,8%-го водного раствора тиобарбитуровой кислоты и помещают пробы на 10 минут в кипящую водяную баню. В качестве контроля используют пробы, содержащие вместо надосадочной жидкости 0,05 М трис-НCl буфер (рН 7,8).
Количество МДА рассчитывают по формуле:
[МДА] =
D ⋅ Vг
(моль/г),
l ⋅ m ⋅ ε ⋅ Vп
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
где Vг – объем гомогената, мл;
D – величина оптической плотности, отн. ед.;
l – длина оптического пути, см;
m – масса навески, г;
ε – коэффициент молярной экстинции, равный 1,36 ⋅ 10–5 М–1см–1;
Vn – объём вносимой пробы, мл [Стальная И.Д., 1977].
Оценка окислительной модификации белков
Рядом авторов было показано, что в состоянии окислительного
стресса атаке АФК подвергаются в первую очередь не липиды, а белки
плазматических мембран [Packer L. et al., 1992]. Свободнорадикальной
модификации подвергаются как полипептидная цепь, так и боковые
части аминокислотных остатков, что может приводить к разрывам
пептидной цепи и образованию различных стабильных метаболитов
аминокислот. В таблице 2 показаны продукты окисления некоторых
аминокислотных остатков белков, которые являются следствием их
прямого взаимодействия с АФК. Остатки ароматических аминокислот
особенно чувствительны к окислению активными формами кислорода.
Фенилаланин может превращаться в моно- и дигидроксипроизводные,
а тирозин – в 3,4-дигидроксипроизводное. Соединения данного типа
могут подвергаться обратимому окислению/восстановлению и генерировать радикалы, которые способны взаимодействовать между собой с
образованием дитирозинов, что может приводить к внутри- и межмолекулярным сшивкам пептидов. Поэтому наличие 2,2'-бифенильных
производных считается надежным маркером индуцированных АФК
повреждений белков [Schuessler H., 1984]. Атака тирозиновых остатков активными формами азота и хлора является причиной образования
соответственно нитро- и хлорпроизводных.
Окисление остатков лизина, аргинина, гистидина, пролина, треонина, глутаминовой и аспарагиновой кислот в полипептидной цепи
приводит к образованию карбонильных групп. Помимо этого, карбонильные группы могут быть введены в белки в результате их взаимодействия с углеводами-восстановителями и/или продуктами окисления
углеводов (реакции гликозилирования и гликооксидации) или продуктами окисления липидов (малоновый диальдегид, 2- и 3-ненасыщенные альдегиды) [Berlett B.S., 1997].
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 2
Аминокислотные остатки, наиболее подверженные окислению
Аминокислота Продукт окисления
Цистеин
дисульфиды, цистеиновая кислота
Метионин
метионин сульфоксид, метионин сульфон
Триптофан
2-, 4-, 5-, 6-, и 7-гидрокситриптофан, нитротриптофан, кинуринин, 3-гидроксикинуринин, формилкинуринин
Фенилаланин
2,3-дигидроксифенилаланин, 2-, 3-, и 4гидроксифенил-аланин
Тирозин
3,4-дигидроксифенилаланин, связи тирозинтирозин, Tyr-O-Tyr, нитротиразин
Гистидин
2-оксогистидин, аспарагин, аспартат
Аргинин
глутамовый семиальдегид
Лизин
α- аминоадиповый семиальдегид
Пролин
2-пирролидон, 4- и 5-гидроксипролин пироглутамат, глутамовый семиальдегид
Треонин
2-амино-3-кетобуторат
Глутамил
Оксалоацетат, пируват
Известно, что внутриклеточный уровень окисленных белков определяется балансом между скоростью окисления белков с одной стороны и скоростью деградации окисленных белков с другой. Этот баланс является сложной функцией множества факторов, которые приводят к генерации АФК и факторов, которые определяют концентрации и активность протеаз, разрушающих поврежденные молекулы.
Однако эта способность зависит от концентрации ферментных и неферментных антиоксидантов, которые снижают образование АФК или
превращают их в неактивные производные. Накопление окисленных
белков отражает не только скорость окисления белков, но также скорость деградации модифицированных белков. Например, окисленные
формы некоторых белков и белки, модифицированные при гликозилировании или продуктами ПОЛ не только являются стабильными для
протеолиза, но могут ингибировать протеолиз окисленных форм других белков [Berlett B.S., 1997]. Процесс накопления модифицированных белков представлен схемой на рис. 1.
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Антиоксиданты
Прооксиданты
Белки и ферменты
СОД, каталаза, ГП,
феретин
Метаболиты и витамины
вит. С, Е, А, билирубин,
GSH/GSSG , NAD(P)H/NAD(P ),
липоевая кислота
RН2
оксидазы
ПОЛ
Продукты
глиоксилирования
Облучение
УФ
Воспаление
нейтрофилы
макрофаги
Белки (ферменты)
-
АФК
Белки, устойчивые
к протеолизу
Регуляторные
факторы
Протеазы
+
-
Окисленные белки
RC=O
Аминокислоты,
пептиды
Рис. 1. Схема накопления модифицированных белков в клетке
[Berlett B.S., 1997]
Принцип метода. Метод оценки окислительной модификации
белков основан на взаимодействии окисленных аминокислотных
остатков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенил-гидразонов. В работе используется метод
Reznick et al. [Reznick A.Z., 1994] с некоторыми модификациями
[Окислительная…, 1995].
Ход работы. Для регистрации спонтанной окислительной модификации белков к 0,1 мл плазмы или 0,3 мл тканевого гомогената
добавляют 100 мМ фосфатный буфер, рН 7,4 до конечного объема пробы 1 мл. Пробу инкубируют при 37 °С в течение 15 минут. В контрольную пробу затем добавляют 4 мл 2,5 М НС1. В опытную пробу вносят
4 мл 10 мМ 2,4-ДНФГ в 2,5 М НСl. Инкубацию контрольной и опытной
проб осуществляют при комнатной температуре в течение 1 часа,
в темноте, с перемешиванием каждые 15 минут. Затем в каждую пробу
добавляют по 5 мл холодной 20%-й трихлоруксусной кислоты (ТХУ) для
осаждения белка и помещают на холод на 15 минут. После этого пробы
центрифугируют 15 минут при 3000 об/мин для формирования белкового осадка. Супернатант удаляют. Осадок белка дополнительно
промывают 4 мл 10%-й ТХУ и центрифугируют.
Для экстракции липидов и удаления 2,4-ДНФГ, который не
прореагировал с карбонильными группами окисленных белков,
12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
осадки механически разрушают, промывают 3 раза, добавляя каждый
раз по 4 мл смеси этанол : этилацетат (1 : 1). После этого осадок белка растворяют в 2 мл 8 М мочевины и оставляют на 1 час при 37 °С
с постоянным перемешиванием. Оптическую плотность опытной пробы измеряют при 370 нм относительно контрольной пробы, обработанной 2,5 М НСl, на спектрофотометре СФ-56.
Расчет. Содержание карбонильных групп (нМ) рассчитывают с использованием коэффициента молярной экстинкции ξ = 22,000 см–1 × М–1.
Поскольку до 10–15 % белка теряется на всех этапах промывания, для
определения фактического уровня карбонильных групп значения пересчитывают в нМ/мг белка. Содержание белка определяют методом Лоури. Для построения калибровочной кривой используют лиофилизированный бычий сывороточный альбумин, растворенный в 8 М мочевине.
Оценка степени фрагментации ДНК
Апоптоз – это энергозависимый процесс, посредством которого
удаляются нежелательные и дефектные клетки организма. Ведущим
проявлением апоптоза является деградация хроматина в результате
ферментативного расщепления ДНК. Данный процесс происходит поэтапно. Сначала образуются фрагменты, включающие 700, 200–250,
50–70 тыс. пар оснований, затем – фрагменты, содержащие 30–50 тыс.
пар оснований. На последней стадии наблюдается конденсация хроматина, инвагинации ядерной мембраны и процесс становится необратимым. Очередным этапом деградации, который обычно используют как
маркер апоптоза, является межнуклеосомная дезинтеграция ДНК, т. е.
разрывы нитей ДНК, находящихся между нуклеосомами. При этом
образуются фрагменты, кратные по величине 180–190 парам оснований, что соответствует протяженности нити ДНК в пределах одной
нуклеосомы. Этот тип деградации обычно завершается в течение суток. Различные этапы деградации ДНК катализируются разными формами эндонуклеаз, отличающимися субстратной специфичностью и
условиями проявления активности. Предполагают, что гибель клетки
наступает из-за энергетического голода, вызванного расходованием
АТФ на работу по репарации поврежденной ДНК [Kroemer G. et al.,
1998; Beltran B. et al., 2000]. Имеются литературные данные, что индукция апоптоза может происходить как при участии АФК, которые
генерируются митохондриями клетки, так и за счет АФК, поступающих извне. Из литературных источников известно, что свобoдные радикалы могут непосредственно пoвpеждать ДНК и тем самым ини13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
циировать апоптоз [Лю Б.Н., 2001; Залесский В.Н., 2003; Apoptosis and
free radicals, 1996], а также служить посредниками в передаче сигнала
к запуску апоптоза [Carmody R.J., 2001].
Первым этапом определения степени фрагментации ДНК является выделение ДНК из ткани. Есть ряд способов выделения ДНК,
из них фенольно-хлороформный требует больше времени и более
трудоемок, чем другие методы, однако дает лучшие результаты
[Калинина Т.С., 2002].
Реагенты. Для выделения ДНК фенольно-хлороформным методом используют следующие реагенты:
1. Буфер для выделения: (Digestion buffer DB). Для приготовления 5 мл раствора смешивали: 0,1 мл 5 М NaCl, 0,05 мл 1 М трис-НСl
буфера, рН 8,0, 0,25 мл 5 мМ EДТА, 0,25 мл 10% доцедилсульфата
натрия, 25 мкл протеинкиназы К, 4,35 мл стерильной дистиллированной воды.
2. Раствор протеинкиназы К: растворяют лиофилизованную
протеинкиназу в стерильной дистиллированной воде в концентрации
20 мг/мл, и хранят при –20 °С.
3. Насыщенный буфером фенол: расплавляют фенол при 65 °С в
присутствии равного объема 0,5 М трис-НСl буфера, рН 8,0, содержащего 0,2 % 2-меркаптоэтанола. После полного расплавления фенола
тщательно перемешивают смесь, отбирают водную фазу и еще дважды
экстрагируют фенол 0,1 М трис-НСl буфером, рН 8,0, содержащим
0,2 % 2-меркаптоэтанола. После последней экстракции водную фазу
не удаляют, а оставляют ее в сосуде с фенолом. В таком виде насыщенный фенол может хранится при 4 °С до одного месяца.
4. Буфер трис-EДТА (ТE): для приготовления 10 мл раствора
смешивают 0,1 мл 1 М трис-НCl буфера, рН 7,4, и 20 мкл 0,5 М ЭДТА,
рН 8,0, и доводят объем водой до 10 мл. Готовый раствор хранят в холодильнике при 4 °С.
Ход работы. Выделение ДНК проводят следующим образом.
Взвешивают 250 мг ткани и растирают в 1 мл буфера для выделения в
пробирке типа Эппендорф. Добавляют к каждому образцу протеинкиназу К и тщательно перемешивают. Инкубируют образцы при 55 °С в
течение 3 часов, или при 37 °С в течение ночи (до 16 часов).
Затем добавляют к каждому образцу по 400 мкл насыщенного
буфером фенола, тщательно перемешивают до образования гомогенной эмульсии. Продолжают экстракцию супернатанта путем встряхивания при комнатной температуре в течение 5 мин. Разделяют водную
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
и органическую фазы центрифугированием при 5000 g в течение
5 мин. После разделения фаз ДНК находится в верхней водной фазе, в
фенольной фазе – РНК, а на интерфазе – белки.
Водную фазу переносят в другую пробирку с помощью пипетки,
к ней добавляют 400 мкл смеси фенол : хлороформ (1 : 1) и перемешивают при комнатной температуре в течение 5 мин. Центрифугируют
5 мин. при 5000 g и переносят водную фазу в новую пробирку пипеткой.
К ней добавляют 400 мкл хлороформа и перемешивают при комнатной
температуре в течение 5 мин. Центрифугируют 5 мин при 5000 g.
Водную фазу переносят в новую пробирку пипеткой и к ней добавляют 800 мкл (два объема) охлажденного 96%-го этанола и 40 мкл
3М ацетата натрия (0,1 объема). Наблюдают преципитацию ДНК. Собирают ДНК центрифугированием при 12 000 g в течение 10 мин. Отбирают супернатант и промывают ДНК 20 мл 70%-го этанола. Вторично
промывают ДНК 1 мл 70%-го этанола и переносят ее в эппендорф. Высушивают ДНК на воздухе в течение 2,5 мин. Растворяют ДНК в ТE
буфере до концентрации примерно 1 мг/мл. Хранят при –20 °С.
Фрагментацию ДНК выявляют путем проведения электрофореза
образца ДНК в агарозном геле с использованием буфера трис-ацетатEДТА (ТАE) [Калинина Т.С., 2002]. Буфер ТАE (50-кратный) готовят
следующим образом: для приготовления 100 мл раствора смешивают
24,22 г триса, 1,862 г EДТА, ~73,3 мл стерильной дистиллированной
воды. Уксусной кислотой (~8,96 мл или 9,4 г) доводят рН до 7,6. Буфер для нанесения содержит 0,25 % бромфенолового синего, 40 % сахарозы в 1-кратном ТАЕ. В качестве маркеров молекулярной массы
используют набор «MassRuler» производства «Fermentas», включающий маркеры от 1500 до 10 000 нуклеотидных пар.
Электрофорез проводят следующим образом. Готовят однократный ТАE в объеме, достаточном для заполнения камеры для электрофореза (примерно 250 мл), к нему добавляют 120 мкл 0,1%-го раствора бромистого этидия. Подготавливают к электрофорезу образцы
исследуемой и маркерной ДНК, для чего их смешивают с буфером для
нанесения. Готовят 1,5%-й раствор агарозы в однократном ТАE
(450 мг агарозы на 30 мл буфера). Раствор нагревают до полного расплавления агарозы. Охлаждают смесь до примерно 60 °С, добавляют
1,5 мкл 2%-го раствора бромистого этидия и осторожно перемешивают, избегая появления в геле пузырьков воздуха.
Теплую агарозу выливают в кювету для геля и равномерно распределяют ее по кювете. Вертикально вставляют гребенки так, чтобы
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
зубцы не доставали до дна примерно 1,5 мм. Оставляют кювету с агарозным гелем на 30 мин., затем осторожно удаляют гребенки. Кювету
с гелем помещают в электрофоретическую камеру, содержащую необходимое количество буфера.
Осторожно вносят в лунки исследуемую и маркерную ДНК.
Чтобы получить четкий сигнал, в лунку достаточно внести 10 мкл.
Электрофорез проводят при 100 В в течение 1–2 часов. Просматривают гель в УФ-свете на трансиллюминаторе и фотографируют его.
ДНК, полученная из образцов тканей, в которых происходит
апоптоз, значительно фрагментирована, и фрагменты ДНК образуют
характерную «апоптозную лестницу». По мнению ряда исследователей, подобные фрагменты возникают при действии апоптозспецифических нуклеаз [Muller K., 1992.; Neurobiologie der Haut:
Apoptose, 1995]. Часто одновременно наблюдается также высокоподвижная полоса в области низких молекулярных масс, соответствующая деградированной ДНК, наличие которой характерно для процесса
некроза [Ярилин А.А., 1998]. ДНК из интактных тканей представлена
всего одной высокомолекулярной полосой. Величина нефрагментированной ДНК лежит в диапазоне 4000–10 000 пар нуклеотидов.
Определение активности аконитатгидратазы
Аконитатгидратаза (аконитаза, К.Ф. 4.2.1.3, АГ) катализирует реакцию обратимой изомеризации цитрата в изоцитрат. Существуют
цитоплазматическая и митохондриальная АГ. Они различаются по физико-химическим и структурным свойствам. Оба изофермента АГ
имеют [4Fe-4S]2+ кластер, связанный с остатками цистеина Cys437,
Cys503 и Cys506 [Hirling, 1994; Modification of a free…, 1993]. Предполагается, что изоферменты АГ, катализируя одну и ту же реакцию, выполняют разнонаправленные физиологические функции в клеточном
метаболизме, отражающие работу фермента на окислительные и биосинтетические процессы. Так, реакция, катализируемая митохиндриальной АГ, является одним из начальных этапов ЦТК, в то время как
функционирование цитоплазматической АГ в основном направлено на
регуляцию накопления и утилизации цитрата в процессах липогенеза.
Имеются данные о том, что в физиологических условиях регуляция активности, скорость синтеза и распада АГ находятся под контролем внутриклеточного содержания Fe2+. Этот контроль осуществляется
посредством
Fe-чувствительных
цитозольных
РНКсвязывающих белков (iron regulatory proteins, IRP), которые регулиру16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ют трансляцию и стабильность мРНК, кодирующей АГ [Kennedy,
1993; Zheng, 1992; Melefors, 1996].
В большинстве работ показано, что для активности АГ необходимы ионы Fe2+ [Ramsay, 1984; Robbins, 1985; Emptage, 1991; Kennedy,
1991], в то время как другие двухвалентные катионы металлов оказывают ингибирующее воздействие на активность АГ из многих источников [Uecyama, 1990]. Активность фермента также снижают многие
органические кислоты: 2-оксоглутарат, оксалоацетат, оксаломалат,
оксалосукцинат и другие.
Общеизвестен факт индуцируемого супероксидным анионрадикалом подавления активности АГ, что позволяет рассматривать
данный фермент в качестве чувствительной и критической мишени
действия АФК в условиях окислительного стресса [Gardner, 1994;
Gardner, 1995; Murakami, 1997]. В зависимости от величины и продолжительности окислительного стресса, АГ может подвергаться обратимому ингибированию вследствие окисления остатков цистеина, а в
дальнейшем необратимой инактивации через разборку [4Fe-4S]2+ кластера, карбонилирование и ATP-зависимую деградацию. При этом из
Fe-S кластера высвобождается ион Fe2+, являющийся прооксидантом.
Накапливающийся при ингибировании АГ цитрат, связывая ионы железа, способствует ограничению образования гидроксильного радикала в реакции Фентона и защищает при этом АГ от инактивации [Матасова Л.В., 2008]. В настоящее врeмя в ряде работ определение активности аконитазы используется для оценки уровня окислительного
стресса [Oxygen..., 2003; Effects..., 2005; Pramipexole..., 2004].
Принцип метода. Измерение активности аконитазы проводят в
среде, содержащей 50 мМ трис-НСl-буфер (рH 7,8), 4 мМ цитрат. Регистрируют увеличение экстинкции при 235 нм вследствие образования промежуточного продукта реакции – цис-аконитата, имеющего двойную
связь. Распространены также методы определения активности аконитазы
в среде, содержащей вместо цитрата изоцитрат или цис-аконитат.
Ход работы. В кювету спектрофотометра вносят 2 мл среды для
определения активности и 0,4 мл сыворотки или тканевого гомогената.
Контролем служит среда определения активности. Измеряют экстинкцию за 3 мин. Активность выражают в ферментативных единицах или в
виде удельной активности. За единицу ферментативной активности (Е)
принимают количество фермента, катализирующее образование
1 мкмоль продукта реакции за 1 мин при температуре 25 °С.
Расчет активности аконитазы производят по следующей формуле:
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
D × 2,0 × V
,
ΔV × τ × 3,09
где D – прирост оптической плотности при 235 нм за определенное
время; 2,0 – объем раствора в кювете, мл; V – общий объем ферментного раствора, мл; ∆V – объем внесенной для измерения пробы, мл;
τ – время измерения, мин; 3,09 – коэффициент экстинкции, соответствующий величине поглощения, которую дает 1 мкмоль цис-аконитата,
находящийся в 1 мл исследуемой смеси при измерении на спектрофотометре, когда толщина слоя измеряемого раствора 1 см.
E=
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ
АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ОРГАНИЗМА
Проявлению негативного повреждающего действия свободных
радикалов и перекисных соединений препятствует многокомпонентная антиоксидантная система, обеспечивающая связывание и рекомбинацию радикалов, предупреждение образования или разрушение
перекисей. Понятие «антиоксидантная система» (или антирадикальная
система) происходит от английского слова «scavengers» («скэвенджеры») – мусорщики.
В состав антиоксидантной системы входят: гидрофильные и
гидрофобные органические вещества с редуцирующими свойствами;
ферменты, поддерживающие гомеостаз этих веществ; антиперекисные
ферменты [Соколовский В.В., 1988]. Ряд ученых подчеркивает, что
антиоксидантная система возникла вместе с живыми организмами и
эволюционировала с кислородным режимом обеспечения биохимических процессов. В организме человека и животных, а также и в более
простых организмах существует иерархическая соподчиненность систем антиоксидантной защиты, включение которых регулируется на
генном уровне [Хочачка П. и др., 1988]. Регуляция свободнорадикального гомеостаза реализуется как в жидкостных средах организма
(кровь, лимфа, межклеточная и внутриклеточная жидкость), так и в
структурных элементах клетки, прежде всего в мембранах.
Система антиоксидантной защиты организма в ее современном
представлении состоит из двух основных звеньев: ферментативного и
неферментативного (низкомолекулярного) [Кожевников Ю.Н., 1985].
Неферментативное звено представлено водо- и жирорастворимыми
веществами экзогенного и эндогенного происхождения [Кулин18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ский В.И. и др., 1990]. Согласованное действие ферментативного и
неферментативного звеньев АОС обеспечивает неспецифическую резистентность организма и адаптивные возможности к воздействию
разнообразных по своей природе стрессовых факторов. Функция антиоксидантных ферментов в организме заключается в поддержании
стационарной концентрации перекисей и кислородных радикалов.
Ферментативное звено АОС разделяется на две группы: ферменты,
инактивирующие супероксид анион-радикал, – супероксиддисмутаза
(СОД) и ферроксидаза (церулоплазмин); ферменты, разрушающие неорганические и органические перекиси, – каталаза, глутатионзависимые пероксидазы и трансферазы. К антиоксидантным ферментам относится также глутатионредуктаза, обеспечивающая восстановление
компонента неферментативного звена АОЗ – глутатиона.
Определение активности супероксиддисмутазы и каталазы
Исключительно важным моментом эффективности ферментативного звена АОС является сбалансированность активности СОД, каталазы и пероксидазы. Подавление активности одного из ферментов антиоксидантной системы может привести к избыточному накоплению АФК и
деструкции клеток.
В 1968 г. Фридович и МакКорд впервые показали, что ранее открытый белок гемокупреин (эритрокупреин) способен катализировать превращение супероксидных радикалов в Н2О2. Этот белок оказался ферментом, играющим ключевую роль в утилизации свободных радикалов и предотвращении оксидативного повреждения клетки. В настоящее время известно, что супероксиддисмутаза (супероксид'супероксид оксидоредуктаза, СОД, КФ 1.15.1.1) представлена семейством металлоферментов, катализирующих реакцию дисмутации супероксидных радикалов:
2 О2•- + 2 Н+ → О2 + Н2О2.
Различные формы СОД различаются по первичной структуре и по
природе металлов, входящих в состав активного центра. Cu,Zn-СОД (состоит из двух субъединиц, содержащих 1 атом меди и 1 атом цинка)
можно рассматривать как эукариотический цитозольный фермент, FeСОД и Mn-СОД – как прокариотические ферменты, однако Mn-СОД
содержится в митохондриальном матриксе эукариот. Mn-СОД локализована в митохондриях печени и миокарда эукариот, вблизи анионных каналов и состоит из 4 субъединиц с молекулярной массой 20 кДа каждая.
В организме животных СОД присутствует практически во всех
органах и тканях. Наивысшая активность фермента обнаружена в пече19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ни и эритроцитах [Sandstrom J. et al., 1993]. СОД характеризуется высокой структурной стабильностью и является одним из наиболее термостабильных глобулярных белков. Стабильность СОД связывают с тем,
что в ее состав входит небольшое количество сульфгидрильных групп.
Считают, что основным регулятором активности СОД в клетке
является уровень О2•- , который выступает по отношению к ферменту
в качестве индуцирующего фактора. Причем индукция СОД при повышении генерации О2•- связана с усилением синтеза фермента в
клетке de novo. Многие соединения, содержащие сульфгидрильные
группы (глутатион, цистеин) способствуют повышению активности
СОД [Nohl H., 1990].
Следует принимать во внимание, что, несмотря на существенное
ускорение дисмутации супероксидного анионрадикала под действием
СОД и высокую специфичность фермента, при определенных условиях
Cu-СОД может взаимодействовать с Н2О2 и выступать в качестве прооксиданта, инициируя образование радикалов О2•- и ОН• [Рудько И.А.
и др., 1995].
Активность данного фермента обычно оценивают с помощью методов, в которых СОД тормозит появление окрашенного продукта, образующегося в реакции с О2•-. Источником О2•--радикалов обычно служат
системы: ксантин + ксантиноксидаза, феназинметосульфат + НАДН.
Вторым звеном защиты от АФК служат ферменты, удаляющие
Н2О2: каталаза и пероксидазы. Эти ферменты, используя в качестве
донора электронов H2O2 в случае каталазы или различные органические соединения в случае пероксидазы, катализируют двухэлектронное восстановление до H2O:
2Н2О2 → 2Н2О + О2;
Н2А + Н2О2 → А + 2Н2О.
Принцип метода. Активность СОД определяют по ингибированию скорости восстановления нитросинего тетразолия (НСТ) в неэнзиматической системе феназинметасульфата (ФМС) и НАДН [Матюшин Б.Н. и др. , 1991].
Ход работы. Среда спектрофотометрирования состоит из следующих компонентов: 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,8), 0,33 мМ
ЭДТА, 0,41 мМ НСТ, 0,01 мМ ФМС, 0,8 мМ НАДН. Исследуемый образец вносят в количестве 0,03 мл на 1 мл среды инкубации. Реакцию
запускают добавлением НАДН. Регистрируют прирост оптической
плотности за 5 мин. при длине волны 540 нм.
20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
За единицу активности СОД принимают количество фермента,
необходимого для 50%-го ингибирования восстановления НСТ.
Расчет ведут по формуле:
⎛
E 0 × 100 ⎞
⎜ 100 −
⎟
Ek
⎝
⎠
50 × мг белка = усл. ед. на 1 мг белка ,
где E0 и Ek – среднее значение прироста экстинции за 1 мин. (E/5 мин.)
соответственно в опытной и контрольной пробах.
Каталаза (КФ 1.11.1.6) – двухкомпонентный фермент, состоящий
из белка и соединенной с ним простетической группы. Это хромопротеид
с молекулярной массой около 240 кДа, состоит из 4-х субъединиц,
имеющих по одной группе гемма [Мелик-Адамян В.Р. и др., 1997].
Каталазная активность в клетках животных и растений сосредоточена в основном в пероксисомах, которые содержат также ферменты, образующие Н2О2: глюкозооксидазу, уратоксидазу и флавопротеиндегидрогеназу. Частично каталаза локализуется в микросомах и в меньшей мере –
в цитозоле. Полагают, что каталаза не имеет высокого сродства к Н2О2 и
не может эффективно обезвреживать это соединение при низких концентрациях, имеющихся в цитозоле. В пероксисомах, где концентрация Н2О2
высока, каталаза, напротив, активно разрушает ее.
Каталаза присутствует практически во всех тканях организма, но
наибольшая каталазная активность обнаружена в эритроцитах, печени,
почках [Rost M. et al., 1998]. В эритроцитах, где активность каталазы
максимальна, фермент находится в комплексе с НАДФН. НАДФН не
является необходимым для проявления каталитической активности, но
предотвращает инактивацию фермента [Крутикова Г.О. и др., 1976].
Она относится к ферментам, которые наиболее длительно сохраняют высокую активность, а скорость реакции разложения пероксида
лимитируется лишь скоростью диффузии субстрата к активному центру
каталазы [Lu G. et al, 1998]. Одна молекула каталазы способна разложить 44 000 молекул Н2О2 в минуту. Ингибиторами каталазы являются
синильная кислота, сероводород, фторид.
Принцип метода. Метод определения активности каталазы основан на способности пероксида водорода образовывать с молибдатом
аммония стойкий окрашенный комплекс. Активность исследуемого
фермента определяют спектрофотометрически при длине волны 410 нм.
Ход работы. В ходе определения активности каталазы используют следующие реактивы: буферно-субстратная смесь, содержащую
10 мл трис-НСl-буфера (рН 7,4) и 30 мл 0,08% пероксида водорода;
4,5%-й раствор аммония молибденовокислого (табл. 3).
21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 3
Реактивы
Буферносубстратная
смесь
Гомогенат
Молибдат
аммония
Гомогенат
Ход определения активности каталазы
Контроль
Опыт
Примечание
2 мл
2 мл
10 минут при 37 °С
–
0,1 мл
2 мл
2 мл
–
0,1 мл
-
–
3 минуты при
37 °С
В качестве раствора сравнения используют: 1 мл буфера, 3 мл
дистиллированной воды и 0,1 мл гомогената.
Расчет результатов производят по следующей формуле:
(Ек − Еоп) × 12 × 103 × 4,1 × 106
A=
,
22, 2 × 106 × 3
где А – активность каталазы, Е/мл; 12 × 103 – фактор разведения;
106 – коэффициент пересчета на мкм; 22,2 × 106 – коэффициент молярной экстинции пероксида водорода; 3 – время инкубации, соответствующее 3 мин.
Определение функциональной активности
глутатионовой антиоксидантной системы
Другая группа ферментов, способных удалять Н2О2 из биологических сред, – это пероксидазы, из которых особо следует остановиться на
глутатионпероксидазе (ГП, КФ 1.11.1.9), катализирующей реакцию
восстановления гидроперекиси с помощью глутатиона. ГП обладает
широкой субстратной специфичностью по отношению к гидроперекисям, но абсолютно специфична к восстановленному глутатиону (GSH),
который в ходе реакции переходит в окисленную форму (GSSG):
ROOH + 2GSH→ROH + GSSG + H2O.
ГП является Se-содержащим ферментом с молекулярной массой
84–88 кДа, состоящим из 4-х идентичных субъединиц, каждая из которых включает 1 атом Se [Кулинский В.И. и др., 1993]. Изоэлектрическая точка ГП 5,0-6,5, оптимум pH 8,5-8,8, однако активность фермента измеряют обычно при рН 7,0-7,5, так как при высоких значениях рН
ГП становится нестабильной [Jones D.P. et al., 1973].
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В большинстве клеток млекопитающих около 70 % ГП локализовано в цитоплазме и около 30 % – в митохондриях [Cheng W.H.
et al., 1998]. Таким образом, пероксид водорода, образующийся при
действии пероксисомальных ферментов, удаляется содержащейся в
пероксисомах каталазой, а в митохондриях и эндоплазматическом ретикулуме Н2О2 разрушается преимущественно под действием ГП.
ГП обладает в 1000 раз большим сродством к пероксиду водорода по
сравнению с каталазой. В этой связи ГП рассматривают в качестве
антиоксидантного фермента, имеющего первостепенное значение в
защите клетки от постоянно образуемой перекиси водорода. Наряду с
этим, ГП способна восстанавливать гидроперекиси жирных кислот,
перекиси белкового и нуклеиновокислотного происхождения.
По данным большинства исследователей активность ГП наиболее
высока в печени, надпочечниках, хрусталике, эритроцитах, поджелудочной железе, затем следуют почки; средние значения характерны для
сердца, легких, селезенки, жира, головного мозга, низкие – для семенников, спермы, желудочно-кишечного тракта, островков поджелудочной железы, мышц, соединительной ткани [Герасимов А.И. и др., 1986].
Активность селенсодержащей ГП напрямую зависит от уровня
селена в организме. Снижение активности фермента при недостаточности селена взаимосвязано с уменьшением количества мРНК этого
белка [Sunde R.A. et al., 2005].
Помимо Se-зависимой ГП в организме животных обнаружена
ГП, не содержащая селена, молекулярная масса данной формы фермента 39–46 кДа. Она имеет другие физико-химические и каталитические свойства [Петрович Ю.А. и др., 1981].
ГП, не содержащая селена, катализирует восстановление гидроперекисей органических соединений, в том числе и полиненасыщенных жирных кислот, но её эффективность в отношении Н2О2 чрезвычайно низка. Существует мнение, что не содержащая селена ГП идентична ферментам семейства глутатион-S-трансфераз, которые в большей степени связаны с детоксикацией продуктов ПОЛ, генерируемых
в эндоплазматическом ретикулуме при метаболизме ксенобиотиков.
Бесселеновая ГП локализована в митохондриальных мембранах
печени, почек, сердца [Avissar N. et al., 1996]. Видовые и органные
особенности активности селеннезависимой ГП, в частности, значительное превалирование ее активности в печени у большинства животных над активностью Se-содержащей ГП, свидетельствуют об антиоксидантной функции селеннезависимой ГП. Полагают, что этим
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
может объясняться относительная толерантность некоторых видов
животных к дефициту селена.
В целом антиоксидантный эффект ГП проявляется в том, что
они предотвращают продолжение цепей ПОЛ, с одной стороны, обезвреживая уже образовавшиеся гидроперекиси жирных кислот и предупреждая их образование путем расщепления Н2О2 – с другой.
Функционирование ГП тесно сопряжено с работой глутатионредуктазы, регенерирующей GSH из GSSG. Они образуют единую глутатионовую антипероксидную систему, осуществляющую глутатионовый редокс-цикл [Ченас Н.К. и др., 1989].
Принцип метода. Активность фермента определяют при длине
волны 340 нм на СФ. О скорости ГП-реакции судят по уменьшению оптической плотности в результате окисления НАДФН, протекающего за
счет осуществления сопряженных ферментативных реакций: образования
окисленного глутатиона под действием ГП и его последующего восстановления, взаимосвязанного с окислением НАДФН под действием ГР.
Ход работы. Измерение активности ГП проводят в среде: 0,05 М
калий-фосфатный-буфер (рН 7,4), содержащий 1 мМ ЭДТА, 0,12 мМ
НАДФН, 0,85 мМ восстановленного глутатиона, 0,37 мМ Н2О2,
1 ед/мл ГР. Контрольная проба не содержит восстановленный глутатион. Реакцию начинают добавлением ферментного препарата.
Расчет. За единицу активности (Е) принимают количество фермента, катализирующее образование 1 мкмоля продукта реакции за
1 мин. при температуре +25 °С.
Количество ферментативных единиц (Е) рассчитывают по формуле:
Е = ∆D × Vк × V/∆V × T × 6,22,
где ∆D – уменьшение оптической плотности при λ = 340 нм за определенное время;
Vк – объем раствора в кювете, мл;
V – общий объем ферментного раствора, мл;
∆V – объем внесенный для измерения пробы, мл;
T – время измерения, мин;
6,22 – коэффициент экстинции, показывающий изменение оптической
плотности при 340 нм, происходящее при окислении или восстановлении 1 мкмоля кофермента, находящегося в 1 мл исследуемой смеси.
Глутатионредуктаза (ГР, КФ 1.6.4.2) осуществляет регенерацию GSH из GSSG путем НАДФН-зависимого восстановления:
GSSG + HAДФН + Н+ → 2GSH + HAДФ+.
ГР выделена из источников животного, растительного и микробного происхождения [Ченас Н.К. и др., 1989]. Биологическое значение
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ГР заключается в возможности обеспечения клеток восстановленной
формой глутатиона без повышения его синтеза [Oshino N. et al., 1977].
В большинстве случаев для ферментативной реакции постулирован кинетический «пинг-понг» механизм. ГР представляет собой флавопротеид, состоящий из 2 субъединиц, содержащих по одной молекуле ФАД.
Молекулярная масса фермента варьирует от 102 до 250 кДа в зависимости от источника выделения. Субъединицы содержат по 4 структурных
домена. На одном конце каждой из них расположен остаток коферментной формы рибофлавина – флавинадениндинуклеотида, на другом –
НАД(Ф)Н – связывающие участки. При недостаточном поступлении
рибофлавина с пищей активность фермента снижается.
ГР обладает высокой специфичностью к глутатиону, однако с
низкой скоростью может катализировать восстановление ряда других
соединений, содержащих дисульфидную связь. Кроме основной, глутатионвосстанавливающей, активности фермент способен проявлять
трансгидрогеназную, электронтрансферазную и диафоразную активности, хотя и в значительно меньшей степени.
Активность глутатионредуктазной/глутатионпероксидазной (ГР/ГП)
системы существенно зависит от концентрации GSH, а, следовательно,
от активности ГР и уровня НАДФН в клетке. Содержание последнего
определяется активностью пентозофосфатного пути, а также активностью некоторых ферментов, обеспечивающих альтернативное продуцирование НАДФН (например, НАДФ-изоцитратдегидрогеназы). Так, для
обеспечения потребности в эритроцитах в НАДФН до 10 % от общего
потребления глюкозы может быть метаболизировано через пентозофосфатный путь. У людей мутация гена, кодирующего первый фермент пентозофосфатного пути – глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, может приводить к гемолитической анемии, сопровождающейся усиленным гемолизом эритроцитов. Клинические проблемы возникают в том случае, когда
эти люди принимают некоторые лекарственные препараты, что приводит
к высокому уровню пероксидов. В данной ситуации потребность в
НАДФН начинает превосходить возможности мутантных клеток метаболизировать глюкозу через пентозофосфатный путь.
Наибольшая активность глутатионредуктазы обнаружена в почках, в тонком кишечнике, эритроцитах [Дубинина Е.Е., 1992]. Небольшая активность ГР по сравнению с другими тканями обнаружена
в скелетных мышцах человека [Aushin R. et al., 1988].
Активность ГР в сыворотке крови повышается при инфаркте
миокарда, онкологических заболеваниях и гепатитах, что позволяет
использовать ГР в диагностических целях [Beffencown S., 1991].
25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Принцип метода. Активность фермента определяют при длине волны 340 нм на СФ. О скорости ГР-реакции судят по уменьшению оптической плотности в результате окисления НАДФН, протекающего за счет
осуществления реакции восстановления глутатиона под действием ГР.
Ход работы. Измерение активности ГР проводят в среде: 0,05 М
калий-фосфатный-буфер (рН 7,4), содержащий 1мМ ЭДТА, 0,16 мМ
НАДФН, 0,8 мМ окисленного глутатиона. Реакцию начинают добавлением ферментного препарата.
Расчет проводят по той же схеме, что и для ГП.
В настоящее время в качестве агентов ферментативной АОС также рассматривают глутатионтрансферазы (ГSТ) – семейство мультифункциональных белков, использующих GSH для конъюгации с гидрофобными веществами, их восстановления или изомеризации. Физиолого-биохимическая роль ГSТ в организме заключается, во-первых, в биотрансформации ксенобиотиков в соответствии с реакцией:
RХ + GSH → RSG + НХ,
где Х – «уходящая» нуклеофильная группа.
Во-вторых, они вносят значительный вклад в обезвреживание
токсических продуктов ПОЛ (например, эпоксидов холестерина):
R + GSH → НRSG.
В-третьих, обеспечивают восстановление гидроперекисей липидов:
ROOH + 2GSH → ROH + GSSG + Н2О.
Важно, что один из изоферментов ГSТ находится прямо в хроматине и восстанавливает ROOH ДНК в ядре.
Ход работы. Активность ГТ определяют при длине волны
340 нм на СФ в среде следующего состава: 0,1 М калий-фосфатныйбуфер (рН 6,5), содержащий 10 мМ GSH и 1 мМ 1-хлор-2,4динитробензена (25 °C). Реакцию начинают добавлением ферментного
препарата [Turella P. et al., 2003].
Глутатионовая АОС включает в себя восстановленный глутатион (GSH) – небелковый тиол, трипептид, образованный аминокислотами: цистеином, глутаминовой кислотой и глицином.
В присутствии глутатионпероксидазы и Н2О2 сульфгидрильные
группы двух молекул глутатиона взаимодействуют с образованием
дисульфида глутатиона (GSSG).
Глутатион имеет почти универсальное распространение в тканях
животных, растений и микроорганизмов. Он присутствует в организме
как в восстановленной, так и в окисленной форме и представляет собой
основной клеточный фонд мобильных сульфгидрильных групп.
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Данный тиол обладает полифункциональными свойствами и играет важную роль во многих внутриклеточных процессах, включая
синтез белка, регуляцию и экспрессию генов клеточного цикла, детоксикацию различных ксенобиотиков [DeLeve L. et al., 1991; Горожанская Э.Г. и др., 2001]. Глутатион также участвует в транспорте аминокислот, обмене дисульфидов, связывании тяжелых металлов, поддержании сульфгидрильных групп белков в восстановленном состоянии
[Дубинина Е.Е., 1992].
Уровень GSH поддерживается как синтезом de novо, так и восстановлением окисленного глутатиона с помощью ГР, использующей
в качестве восстановителя НАДФН [Hwavg C. et al., 1992]. Cкорость
образования восстановленного глутатиона в реакции, катализируемой
глутатионредуктазой, зависит в основном от уровня НАДФН. Концентрация GSH в клетках достигает у млекопитающих до 12 мМ.
Глутатион является хорошим акцептором ОН•-радикалов. Кроме
непосредственного взаимодействия с радикалами кислорода глутатион,
являясь косубстратом глутатионпероксидазы, участвует в удалении клеточных пероксидов. Обеспечивая обезвреживание перекисей и гидроксильных радикалов, GSH является одним из важнейших компонентов
системы антиоксидантной защиты клетки (Ookhtens M. et al., 1998).
GSH играет существенную роль в повышении резистентности
клеток и повышении адаптивных возможностей метаболизма при воспалении и иммунных реакциях [Woods J.S. et al., 1995]. Эфиры глутатиона увеличивают концентрацию GSH в результате проникновения в
клетки многих органов, где они подвергаются гидролизу под действием эстераз [Колесниченко Л.С. и др., 2003]. В частности, глутатион
вносит важный вклад в формирование антиоксидантного потенциала в
эритроцитах, кроветворных клетках, поддержание пула восстановительного аскорбата [Ghibelli L. et al., 1995].
Принцип метода. Сульфгидрильная группа восстановленного глутатиона вступает в реакцию с 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойной) кислотой
(реактив Эллмана) в результате чего в эквимолярных количествах образуется окрашенный в желтый цвет тионитрофенильный анион (ТНФА),
имеющий максимум поглощения при 412 нм [Бузлама В.С. и др., 1997].
Ход работы.
1. В химическую пробирку наливают 0,5 мл супернатанта, 3,5 мл
0,1 М калий-фосфатного-буфера рН 7,4 и хорошо перемешивают.
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. 2,0 мл разведенного в 8 раз супернатанта переносят в центрифужную пробирку и приливают к ней 1,0 мл 20%-й ТХУ. Пробу тщательно перемешивают и оставляют в холодильнике на 15–20 мин.
3. Пробы вынимают из холодильника и центрифугируют 15 мин.
при 3000 об/мин при 0 …+4 °С.
4. В химические пробирки наливают по 0,5 мл фосфатного буфера и в каждую добавляют по 1,0 мл надосадочной жидкости.
5. В опытную пробирку № 1 приливают 0,05 мл реактива Эллмана, а в контрольную пробирку № 2 – 0,05 мл метанола. Содержимое
пробирок хорошо перемешивают.
6. Измеряют оптическую плотность опытной и контрольной
проб против фосфатного буфера при λ 412 нм в 10 мм-й кювете.
Расчет. Концентрация восстановленного глутатиона рассчитывается по формуле:
Еоп − Ек
С=
× 72,6 × 103,
13,1 × 103
где С – содержание восстановленного глутатиона, мМ;
13,1×103 – коэффициент молярной экстинкции ТНФА при 412 нм;
72,6 – фактор разведения.
Определение активности ферментов – основных поставщиков
НАДФН для работы глутатионовой антиоксидантной системы
Для функционирования ГР/ГП системы необходим постоянный
приток кофермента – НАДФН. Кроме того, НАДФН необходим также
для поддержания активной конформации каталазы в условиях интенсификации СРО при развитии многих патологических состояний. Основными поставщиками данного кофермента являются глюкозо-6фосфатдегидрогеназная (Г6ФДГ-) и НАДФ-изоцитратдегидрогеназная
(НАДФ-ИДГ)-реакции.
Изоцитратдегидрогеназы (ИДГ) катализируют окислительное
декарбоксилирование D,L – трео-Ds-изоцитрата (ИЦ) в 2-оксоглутарат
(2-ОГ).
Фермент имеет две формы коферментной специфичности: НАДзависимая изоцитратдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.41; НАД-ИДГ) и
НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогеназа (К.Ф. 1.1.1.42; НАДФ-ИДГ)
[Попова Т.Н., 1993].
Реакция, катализируемая НАД-ИДГ, является этапом ЦТК и
представляет собой важную реакцию окислительного катаболизма.
28
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Функцией НАДФ-ИДГ является преимущественно участие в
биосинтетических процессах клетки [Popova et al., 1998]. Окисление
изоцитрата в 2-оксоглутарат, катализируемое НАДФ-ИДГ, теснейшим
образом связано с ферментативными превращениями окисленного и
восстановленного глутатиона (2GSH = GSSG + 2H+), катализируемыми глутатионредуктазой.
Продукт реакции, катализируемой ИДГ, 2-ОГ, имеет важное
значение в процессах образования аминокислот в реакциях переаминирования. 2-ОГ является предшественником глутамата, центрального
метаболита обмена аминокислот. Таким образом, на уровне 2-ОГ,
происходит пересечение основных путей углеродного и азотного обмена [Popova et al., 1998].
Принцип метода. О скорости протекания НАДФ-ИДГ-реакции
судят по возрастанию оптической плотности опытных образцов в результате восстановления НАДФ в ходе катализируемого ферментом
превращения изоцитрата в 2-оксоглуторат.
Ход работы. Определение активности НАДФ-зависимой изоцитратдегидрогеназы проводят спектрофотометрически при длине 340 нм в
среде следующего состава: 50 мМ трис-НС1-буфер (рН 7,6–7,8), содержащий 1,5 мМ изоцитрат, 2 мМ МnСl2, 0,25 мМ НАДФ, 0,1 мМ ЭДТА.
Реакцию начинают внесением фермента в среду спектрофотометрии.
Расчет проводят по той же формуле, что и для ГП.
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.49; Г6ФДГ) катализирует реакцию превращения глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконо-σлактон. Акцептором электронов служит при этом НАДФ+. 6-Фосфоглюконо-σ-лактон, образующийся в качестве продукта данной реакции,
гидролизуется затем до свободной кислоты (6-фосфоглюконата) под
действием специфичной лактоназы. Равновесие суммарной реакции
сильно смещено в сторону образования НАДФН.
НАДФ-зависимая 6-фосфоглюконатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.44;
6ФГДГ) катализирует окислительное декарбоксилирование 6-фосфоглюконата до рибулозо-5-фосфата, углекислого газа и восстановленного
НАДФН.
Ранее в наших исследованиях было показано, что в условиях оксидативного стресса происходит увеличение активности Г6ФДГ и
снижение 6ФГДГ активности, что может быть вызвано окислением
аминокислотных остатков в молекуле белка [Левенкова М.В. и др.,
2004; Свиридов и др., 2006]. Таким образом, очевидно, что 6ФГДГ не
может играть существенной роли в лимитировании интенсивности
29
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
протекания свободнорадикальных процессов путем поставки восстановительных эквивалентов для ГР/ГП АОС. Вместе с тем нельзя исключить, что снижение скорости 6ФГДГ-реакции может быть взаимосвязано с необходимостью снижения уровня ряда сахаров, в частности, эритрозы, рибозо-5-фосфата и других, которые, согласно литературным данным, могут являться дополнительным фактором усиления
окислительного стресса [Benov L., 1998].
Принцип метода. О скорости протекания глюкозо-6фосфатдегидрогеназной реакции судят по возрастанию оптической
плотности опытных образцов при 340 нм в результате восстановления
НАДФ в ходе катализируемого ферментом превращения глюкозо-6фосфата в 6-фосфоглюконолактон. О скорости 6ФГДГ-реакции судят
по увеличению оптической плотности при 340 нм в результате восстановления НАДФ, в ходе окислительного декарбоксилирования 6фосфоглюконата до рибулозо-5-фосфата.
Ход работы. Среда спектрофотометрирования Г6ФДГ имеет следующий состав: 0,05 мМ трис-НСl-буфер (pH 7,8), содержащий 3,0 мМ
глюкозо-6-фосфат, 0,25 мМ НАДФ, 1,0 мМ МnCl2.
Измерение активности 6ФГДГ проводят в среде: 0,05 М трисНСl-буфер (рН 8,0), содержащий 1 мМ 6-фосфоглюконата и 0,12 мМ
НАДФ. Реакции начинают добавлением ферментного препарата.
Расчет проводят по той же формуле, что и для ГП.
Определение уровня цитрата и активности цитратсинтазы
Ионы Fe2+ необходимы во всех системах генерации АФК из О2
(митохондриальной, микросомальной, ксантиоксидазной и др.) и особенно при образовании наиболее агрессивной и высокотоксичной АФК
в клетках млекопитающих – ОН● – в реакции Фентона. Кроме того, от
уровня ионов металлов переменной валентности, в частности Fe2+, концентрация которых значительно увеличивается в условиях оксидативного стресса за счет высвобождения из вне- и внутриклеточных депо, в
значительной мере зависит интенсивность процессов ПОЛ.
Снижение внутриклеточного уровня Fe2+ может достигаться за
счет увеличения содержания цитрата. Так, после выхода из трансферрина ионы Fe2+ хелатируются цитратом, который осуществляет их
доставку в различные клеточные компартменты [Non-transferrin-bound
iron…, 1989]. При взаимодействии комплекса «цитрат3--Fe2+» с О2
происходит автоокисление Fe2+ в Fe3+ [Осипов, 1990; Скулачев, 1998;
Skulachev, 1996]. Цитрат оказывает влияние на связывание и высвобо-
30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ждение железа из трансферрина и ферритина [Aisen, 1968; Treffry,
1979]. В этой связи в условиях интенсификации СРО интерес вызывает определение содержания цитрата и изучение особенностей функционирования ферментов, ответственных за его накопление и утилизацию, в частности, аконитатгидратаза (АГ) и цитратсинтаза (ЦС).
Лимонная кислота (цитрат) – трёхосновная органическая оксикислота, имеющая следующее строение:
Лимонная кислота является интермедиатом цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), играющего центральную роль в окислительном метаболизме клетки. В ходе первой реакции данного цикла цитрат образуется при присоединении ацетил-СоА к оксалоацетату (ОА) под действием ЦС. Под действием АГ происходят превращения цитрата в
цис-аконитат, а затем в изоцитрат. Реакция, катализируемая аконитазой, обратима. Так как образование цитрата – это первая реакция, то
она играет важную роль в регуляции цикла в целом. Цитрат может
участвовать в ЦТК, ингибируя ЦС. Показана также важная роль цитрата в регуляции ряда метаболических процессов в клетке. Так, цитрат, ингибируя гексокиназу, фосфофруктокиназу и пируваткиназу,
участвует в регуляции гликолиза. Цитрат также является промежуточным метаболитом глиоксилатного цикла, играющего важную роль в
качестве связующего звена в метаболизме жиров и углеводов. Являясь
эффективным активатором ацетил-СоА-карбоксилазы и источником
ацетильных групп, цитрат играет значительную роль в регуляции биосинтеза жирных кислот. Лимонная кислота в животных тканях служит
также эндогенным регулятором активности ключевых ферментов цикла Эмбдена–Мейергофа – фосфофруктокиназы и транскетолазы [Ленинджер, 1977; Жеребцов, 2002]. В настоящее время существует мнение, что цитрат является эффективным антиоксидантом благодаря наличию у него диссоциирующих карбоксильных групп, способных хелатировать прооксиданты ионы Fe2+.
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Изменение содержания цитрата наблюдается при ряде патологических состояний. Так, в цитоплазматической фракции миокарда и
мозга крыс при гипоксии ингибируется утилизация цитрата [Rafalowska, 1975; Freminet, 1981]. Показано, что в активной фазе атеросклероза наблюдается существенное возрастание содержания в крови
данного соединения [Изменения некоторых…, 1979].
Принцип метода определение содержания цитрата по Нательсону
состоит в образовании из цитрата при помощи бромного реактива и
перманганата калия пентабромацетона, его экстракции петролейным
эфиром и определения поглощения окрашенного комплекса с тиомочевиной при длине волны 430 нм [Афанасьев, 1973]. Расчёт концентрации
цитрата производят по калибровочной прямой.
Ход работы. К 1 мл исследуемой жидкости добавляют 1 мл 17%-го
раствора трихлоруксусной кислоты, перемешивают и центрифугируют
образцы 10 мин. при 4000 g. В пробирку с притёртой пробкой к 0,5 мл
надосадочной жидкости добавляют 0,25 мл 50%-го раствора H2SO4,
0,1 мл 1 М бромистого калия и 0,05 мл насыщенного раствора перманганата калия. Образцы встряхивают и охлаждают в течение 20 мин. в холодильнике. Избыток перманганата калия устраняют прибавлением по каплям 6%-го Н2О2. Для экстрагирования образовавшегося пентабромацетата
добавляют петролейный эфир по частям: сначала 0,5 мл, затем 0,5 мл и
ещё 0,3 мл. После добавления каждой порции петролейного эфира пробирки встряхивают в течение 5 мин. Для проведения цветной реакции
1 мл экстракта в петролейном эфире (из верхней фазы) переносят в пробирку с притёртой пробкой, куда предварительно вносят 3,5 мл 2%-го
раствора тиомочевины в буре. Пробирку встряхивают в течение 5 мин.,
для лучшего расслаивания фаз центрифугируют 5 мин. при 3000 g; после
расслоения фаз окрашенный в светло-жёлтый цвет нижний слой осторожно отсасывают с помощью пипетки Пастера с оттянутым концом в
кварцевую кювету. Интенсивность окраски определяют на спектрофотометре СФ-56 при 430 нм. Фотометрирование проводят против контроля –
раствора тиомочевины в буре.
Цитратсинтаза (КФ 4.1.3.7; ЦС) катализирует начальную стадию ключевого метаболического пути – ЦТК, а также глиоксилатного
цикла. Фермент имеет универсальное распространение среди живых
организмов и локализован в митохондриях. Кроме того, в клетках растений и некоторых бактерий он имеется также в глиоксисомах. Полностью установлена аминокислотная последовательность данного
фермента из ряда организмов. Так, ЦС из сердца свиньи состоит из
32
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
437 аминокислот и в 368 положении содержит модифицированную
аминокислоту – триметиллизин [Primary structure of…, 1981]. В активном центре фермента наибольшее значение имеют остатки Arg, Asp и
His [The effect of replacing…, 1994]. ЦС из разных организмов имеет
различную четвертичную структуру, однако чаще всего, особенно в
клетках эукариот, она является димером. Так, фермент ЦС из дрожжей
Yarrowia lipolytica имеет молекулярную массу порядка 70 кДа и состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой около
40 кДа [Выделение, очистка и…, 1994]. ЦС из митохондрий фасоли
имеет молекулярную массу около 100 кДа [Greenblall, 1973]. Фермент
из томата, сердца свиньи и человека является димером и имеет молекулярную массу 104, 49 и 100 кДа соответственно [Jeffery, 1988; Citrate synthase…, 1987; Human heart…, 1979].
Реакция, катализируемая ЦС из большинства организмов, подчиняется кинетике Михаэлиса–Ментен. Значения KM по ОА и ацетилСоА
довольно сильно варьируют для фермента из разных источников. Так, для
ЦС из дрожжей Yarrowia lipolytica данные параметры составляют 5 и
10 мкМ [Выделение, очистка и…, 1994], из сердца цыпленка – 5,9 и 4,3
мкМ [Beeckmans, 1983], из сердца человека – 250 и 400 мкМ [Human
heart…, 1979], из томата – 19 и 18 мкМ [Jeffery, 1988] соответственно.
Оптимальной для действия фермента из Tetrahymena pyriformis,
Yarrowia lipolytica, Agave americana является температура 50 °С. Максимальная активность ЦС из этих организмов проявлялась при значениях рН 8,0, 8,5 и 7,5–8,0 соответственно [Fabregat, 1983; Выделение, очистка и…, 1994; Characteristics of citrate synthase…, 1979].
В регуляции активности ЦС могут участвовать ди- и трикарбоновые кислоты, ацетил-СоА, ингибиторами фермента из различных
организмов выступают АТФ и НАДН. Основным фактором, регулирующим активность цитратсинтазы, является АТР, который можно
рассматривать как конечный продукт ЦТК [Wiegand, 1986; Boulton,
1980; Kleber, 1974].
Активность ЦС в клетках живых организмов зависит от условий
окружающей среды и играет важную роль в адаптации к холоду. Так, в
сердечной и скелетных мышцах антарктических рыб активность ЦС
выше по сравнению с теми же тканями тепловодных рыб. Активность
данного фермента в мышцах полосатого окуня возрастает при длительной температурной акклиматизации (t = 5 °С) [Jones, 1982].
У белоногих мышей в зимний период также значительно повышена
33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
активность ЦС в скелетных мышцах и бурой жировой ткани, участвующих в терморегуляции у грызунов [Wickler, 1981].
Принцип метода. Активность ЦС определяют спектрофотометрически при длине волны 412 нм. О скорости каталитической реакции судят
по увеличению оптической плотности в результате образования жёлтого
окрашивания в ходе восстановления 2-нитробензойной кислоты при образовании коэнзима А под действием ЦС. Измерение активности ЦС
проводят в среде 0,05 М трис-HCl буфера (pH = 7,8), содержащего
0,01 мМ ацетил-СоА, 0,2 мМ оксалоацетат и 0,25 мМ дитио-бис-2-нитробензойную кислоту. Реакцию начинают внесением ферментативного препарата в среду спектрофотометрирования [Matsuoka, 1973]. За единицу
ферментативной активности (Е) принимают количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоль продукта за 1 мин. при 25 °С.
Количество ферментативных единиц рассчитывают по формуле:
ΔD ⋅ 1,0 ⋅ V
Е=
,
v ⋅t ⋅ε
где ΔD – прирост оптической плотности при 412 нм за время t;
1,0 – объём раствора в кювете, мл;
V – общий объём ферментного раствора, мл;
v – объём внесённой для измерения пробы, мл;
t – время измерения, мин.;
ε – 13,6 М–1см–1 – коэффициент молярной экстинкции, показывающий
изменение оптической плотности при 412 нм, происходящее при превращении 1 мкмоля субстрата, находящегося в 1 мл исследуемой смеси.
Оценка уровня токоферола
Центральное место в нефементативном звене антиоксидантной
защиты организма животных занимают токоферолы. Термином «витамин Е» обозначают группу токоферолов и токотриенолов. Структурный анализ показал, что молекулы, обладающие антиоксидантной
активностью витамина Е, включают 4 токоферола (α, β, γ, δ) и 4 токотриенола (α, β, γ, δ), среди которых α-токоферол обладает наиболее
высокой биологической активностью [Brigellius-flohe R. et al., 1999].
Витамин Е в основном локализован в гидрофобном слое биологических мембран и инактивирует, главным образом, радикалы жирных
кислот. Около 50 % клеточного токоферола находится в ядре, 30 % –
в мембранах митохондрий, 20 % – в микросомальной мембране. Витамин Е – мощный антимутаген, в физиологических концентрациях
является регулятором тканевого дыхания. Кроме того, он способен
34
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
защищать другие растворимые жирами витамины от разрушения кислородом, в частности, способствует защите и усвоению витамина А
[Уклистая Е.А. и др., 1998].
Антиоксидантную функцию α-токоферол может осуществлять
тремя способами: 1) создавая компактную мембранную архитектуру,
предотвращающую атаку АФК на ненасыщенные жирные кислоты
мембранных фосфолипидов; 2) локально разрушая образующиеся липидные пероксидные радикалы; 3) разрушая кислородные радикалы в
полярных участках мембран, где функционируют белки электронтранспортной цепи [Tappel A. L., 1962].
Витамин Е является эффективным «тушителем» синглетного
кислорода, акцептором анион-радикала кислорода и «перехватчиком»
свободных радикалов, непосредственно реагируя с ними на стадии
обрыва цепи. Антиоксидантную активность витамина Е связывают,
главным образом, с взаимодействием с пероксидными окислениями
органической природы [Patra R.C. et al., 2001]. Образующиеся фенольные радикалы токоферола стабильны и не взаимодействуют с ненасыщенными жирными кислотами, поэтому они не участвуют в продолжении цепных реакций ПОЛ. С другой стороны, они могут осуществлять обрыв цепи при взаимодействии с пероксидными радикалами
жирных кислот. Активно реагировать с пероксидными радикалами
может только восстановленная (фенольная) форма витамина Е, имеющая свободную гидроксильную группу. Хинонная (окисленная) форма
и ацетат токоферола практически не реагируют с пероксидными радикалами. Вещества, способные восстанавливать хинонную форму в фенольную, регенерируют антирадикальную активность витамина Е и
являются, поэтому его синергистами. Как правило, роль синергистов
выполняют вещества, имеющие невысокий уровень окислительновосстановительного потенциала и легко переходящие из окисленной
формы в восстановленную (например, аскорбиновая и лимонные кислоты) [Березов Т.Т. и др., 1998].
Принцип метода. Концентрацию α-токоферола определяют методом, основанным на фотометрировании хромогенного комплексного
соединения Fe2+ и ортофенотролина [Бузлама В.С. и др., 1997].
Ход работы. См. табл. 4.
Расчет содержания α-токоферола осуществляют по следующей
формуле:
С = (Еоп. – Ек.) × k × 3/2,
где С – концентрация α-токоферола, мкмоль/л;
35
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Еоп. – оптическая плотность опытной пробы;
Ек. – оптическая плотность контрольной пробы;
k – коэффициент, равный количеству α-токоферола, найденному по
калибровочной кривой (0,0099 ммоль/л);
3/2 – отношение общего количества гексанового экстракта к объему
выпаренного гексанового экстракта.
Этап
1
2
3
4
5
6
Таблица 4
Ход определения содержания токоферола
Действие
Примечание
В 2 стеклянные центрифужные про- Тщательно перемешать стеклянной пабирки с крышками вносят по 1 мл
лочкой
пробы и приливают по 1 мл спирта
В пробирки приливают по 3 мл гек- Энергично встряхисана
вать в течение 2 мин.
Центрифугирование
в теч. 10 мин. При
2500–3000 g
Отобрать 2 мл верхнего гексанового Выпарить гексан на
слоя в чистые стеклянные пробирки водяной бане при
t ≤ 50 °С
Выдержать при ком1) К сухому остатку прилить по 1 мл
натной температуре
бензола и по 1 мл раствора хлорного
в теч. 5 мин.
железа
2) Приготовить контроль: 1 мл бензола + 1 мл раствора хлорного железа
К пробам и контролю приливают по
1 мл 0,05 % раствора ортофенантролина и ровно через 2 мин. измеряют
оптическую плотность при λ = 510 нм
против пробы сравнения, содержащей
1 мл бензола и 2 мл этанола
36
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
НЕКОТОРЫЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ОЦЕНКИ РАЗВИТИЯ
ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ
Определение активностей ферментов –
показателей цитолиза гепатоцитов и кардиомиоцитов
Аспартатаминотрансфераза (КФ 2.6.1.1. L-аспартат:2оксоглутаратаминотрансфераза, АСТ или АсАТ или более редкое название глутаматоксалоацетаттрансаминаза (ГОТ).
Аланинаминотрансфераза
(КФ
2.6.1.2.
L-аланин:2оксоглутаратаминотрансфераза, АЛТ или АлАТ или более редкое название глутаматпируваттрансаминаза (ГТП).
Аминотрансферазы катализируют процессы трансаминирования, они распределены по всем органам и тканям. АлАТ – энзим цитоплазматический, АсАТ имеет изоферменты, локализованные как в цитозоле, так и в митохондриях. Роль кофермента в трансаминазных реакциях играет пиридоксальфосфат (витамин В6).
АсАТ в высоких концентрациях присутствует в клетках сердечной и скелетных мышц, печени, почках, поджелудочной железе и
эритроцитах. Поражение любого из этих органов и тканей может привести к существенному повышению АсАТ в сыворотке крови. Наиболее резкие изменения АсАТ наблюдаются при поражении сердечной
мышцы. Так, при инфаркте миокарда активность АсАТ в сыворотке
крови может повышаться в 4–5 раз. При остром инфаркте миокарда ее
активность повышается у 93–98 % больных и имеет такую же динамику, как и МВ изофермент креатинкиназы, но степень увеличения активности АсАТ несколько меньшая. Считается, что между размерами
очага инфаркта и активностью АсАТ в сыворотке имеется тесная корреляция. Если в течение нескольких дней не происходит нормализация
активности фермента, это свидетельствует о расширении зоны инфаркта. У лиц моложе 60 лет активность АсАТ, как правило, выше,
чем у лиц более пожилого возраста, поэтому высокая активность
АсАТ у пожилых людей может быть расценена как проявление обширного инфаркта миокарда и является плохим прогностическим признаком. Повышение активности АсАТ характерно также для печеночных патологий. Так, значительное повышение активности фермента
имеет место при остром вирусном и токсических гепатитах. Умеренное повышение может иметь место при циррозе печени (в 2–3 раза),
механической желтухе, метастазах опухоли в печень. Это может наблюдаться при поражении скелетной мускулатуры, например при про-
37
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
грессирующей мышечной дистрофии; при панкреатите; выраженном
внутрисосудистом гемолизе. Следует иметь в виду, что у новорожденных активность примерно в 1,5 раза выше, чем у взрослых.
Снижение активности АсАТ имеет место при недостаточности
пиридоксина (витамина В6), при почечной недостаточности, при беременности.
АлАТ в высоких концентрациях присутствует в клетках печени
и в меньшей степени в скелетных мышцах, почках и сердце. Повышение активности АлАТ наиболее часто отмечается при острых заболеваниях печени и желчных путей. Активность АлАТ резко повышается
у больных острыми вирусными гепатитами в ранние сроки болезни:
приблизительно у 50 % больных она увеличивается за 5 дней до появления желтухи и гепатомегалии, у 90 % больных – за 2 дня до появления этих симптомов. Пик ферментативной активности опережает максимальный уровень билирубина в крови на 7–10 дней и совпадает с
появлением желтухи, т. е. периодом максимальной тяжести болезни
(превышение нормы в 20–50 раз). В неосложненных случаях уровень
активности как АлАТ, так и АсАТ снижается до нормальных значений
к исходу 8 недели болезни примерно у 75–80 % больных. У небольшой
части больных после нормализации наблюдается второй пик повышения активности аминотрансфераз, это сопровождается клиническим
рецидивом болезни. Длительное повышение активности аминотрансфераз или увеличение ее в поздние сроки болезни может означать развитие печеночного некроза. Длительное незначительное увеличение
ферментативной активности в части случаев свидетельствует о хронизации процесса (хронический гепатит, цирроз).
Повышение активности трансаминаз возможно при воспалительных заболеваниях различных органов и тканей (например, поджелудочной железы, при мышечных дистрофиях и т. д.). Подобные гиперферментемии не имеют, разумеется, самостоятельного диагностического значения, но должны учитываться при трактовке трансаминазного теста.
Снижение активности АлАТ может иметь место при тех же условиях, что и уменьшение активности АсАТ.
Принцип метода. АлАТ катализирует обратимый перенос аминогруппы с L-аланина на 2-оксоглутарат:
АлАТ
L-аланин + 2-оксоглутарат ↔ пируват + L-глутамат.
38
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
АсАТ катализирует обратимый перенос аминогруппы с Lаспартата на 2-оксоглутарат:
АсАТ
L-аспартат + 2-оксоглутарат ↔ оксалоацетат + L-глутамат.
Оксалоацетат в процессе ферментативной реакции превращается в пировиноградную кислоту (пируват).
При добавлении 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ) в щелочной среде образуется окрашенный гидразон пировиноградной кислоты в обоих случаях.
Реактивы: 1. Субстратные смеси: для определения АсАТ (DLаспартат и 2-оксоглутарат) и для определения АлАТ (DL-аланин и 2оксоглутарат), фосфатный буфер (рН 7,4) 0,1 моль/л. 2. 2,4-ДНФГ,
1 ммоль/л раствор в HCl 1моль/л. 3. Натрия гидроксид (16 г). 4. Калибровочный раствор пирувата натрия (0,11 г/л). Условия хранения: +2…+8 °С.
Приготовление рабочих растворов. Приготовление 0,4 М раствора гидроксида натрия: в мерную колбу на 1000 мл поместить 16 г
NaOH и довести прокипяченной дистиллированной водой до метки.
Хранить в полиэтиленовой посуде. Раствор устойчив.
Ход работы представлен в таблицах 5, 6.
Таблица 5
Схема определения активности ферментов
Поместить в пробирки, мл
Опытная Холостая
проба
проба
1. Соответствующий субстратно-буферный
0,25
0,25
раствор
Прогреть в водяной бане при 37 °С в течение 5 минут
2. Сыворотка крови, свободная от гемолиза
0,05
–
Инкубировать в водяной бане при 37 °С в течение 30 минут
3. Раствор 2,4-ДНФГ
0,25
0,25
Выдержать при 18–25 °С в течение 20 минут
4. 0,4 М Раствор NaOH
2,5
2,5
5. Сыворотка крови, свободная от гемолиза
–
0,05
Выдержать при 18–25 °С в течение 10 минут и фотометрировать
опытную пробу против холостой пробы в интервале длин волн
500–560 нм (λopt = 537 нм) в кюветах с толщиной слоя 1 см
39
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 6
Схема построения калибровочного графика
№ пробирок
1
2
3
4
5
6
7
Поместить в проКалибровочные пробы
Конбирки, мл
троль
0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
–
1. Калибровочный
раствор пирувата
натрия
2. Дистиллирован0,55 0,50 0,45 0,40 0,35 0,30 0,60
ная вода
3. Раствор 2,40,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
ДНФГ
Выдержать при 18–25 °с в течение 20 минут
4. 0,4 м раствор
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
5,0
NaOH
Выдержать при 18–25 °С в течение 10 минут и фотометрировать
калибровочные пробы против контроля в интервале длин волн
500–560 нм (λopt = 537 нм) в кюветах с толщиной слоя 1 см
–
Активность фермен- 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30
та, соответствующая
содержанию пирувата, мкмоль
АлАТ
мкмоль/ 0,278 0,556 0,834 1,112 1,390 1,668
–
(с×л)
ммоль/
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
–
(ч×л)
АсАТ
мкмоль/ 0,139 0,278 0,417 0,556 0,695 0,834
–
(с×л)
ммоль/
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
–
(ч×л)
Построить калибровочный график, откладывая по оси абсцисс содержание пировиноградной кислоты, а по оси ординат – величины экстинкций.
Расчет активности ферментов. Расчет активности фермента в
сыворотке крови производят по калибровочному графику.
Ферментативная активность АсАТ и АлАТ рассчитывается в
мкмоль/(с×л) или ммоль/(ч×л) по формуле:
40
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
мкмоль/(с×л) или ммоль/(ч×л) = (Епр – ЕК)k,
где k – коэффициент, рассчитанный по калибровочному графику:
k = С/Е, Епр – экстинкция пробы, ЕК – экстинкция контроля.
При активности АлАТ, превышающей 3ммоль/(ч×л) или
(0,834 мкмоль/(с×л), а активности АлАТ, превышающей 1,5 ммоль/(ч×л)
или 0,417 мкмоль/(с×л) сыворотку крови следует развести физиологическим раствором. При расчете активности учесть степень разведения, в
ряде случаев может отсутствовать пропорциональность между степенью разведения и активностью ферментов в разведенной сыворотке.
Определение активности креатинкиназы-МВ в сыворотке крови
Креатинкиназа (КК) катализирует обратимый перенос фосфатного остатка между АТФ и креатином с образованием АДФ и креатинфосфата. КК играет важную роль в энергетическом обмене мышечной, нервной и других тканей. Наиболее богаты ею скелетная мускулатура, миокард и мозг, поэтому определение общей активности КК
требуется в основном для диагностики миопатий, инфаркта миокарда,
заболеваний центральной нервной системы. КК существует в виде
изоформ: ММ, ВВ, МВ. Активность фермента и распределение его
изоформ органоспецифичны, поэтому определение активности изоформ КК полезно для диагностики и прогноза заболевания. Определение КК используется в диагностике и лечении инфаркта миокарда, а
также является наиболее чувствительным маркером повреждения
мышц. Повышение активности КК в крови может быть следствием
травмы, переохлаждения или перегревания, голодания, бактериальной
интоксикации, отравления угарным газом. В настоящее время диагностика ишемии миокарда базируется на 3-х составляющих: клинической картине, изменениях на электрокардиограмме и повышении
уровня специфических ферментов в крови. К основным маркерам повреждения миокарда относят: аспартатаминотрансферазу (АсАТ),
креатинкиназу (КК-МВ), лактатдегидрогеназу (ЛДГ-1), соотношение
ЛДГ-1/ЛДГ-2, миоглобин (МГ), соотношение КК-МВ/МГ.
Принцип метода. Активность КК-МВ определяется с помощью
оптического теста:
1) фосфокреатин + АДФ ↔ креатин + АТФ;
2) АТФ + глюкоза ↔ АДФ + глюкозо-6-фосфат;
3) глюкозо-6-фосфат + НАДФ ↔ 6-фосфоглюконат + НАДФН.
Скорость восстановления НАДФ в НАДФН пропорциональна активности КК в пробе. В реакционную смесь введены специфические
антитела против М-субъединицы, полностью ингибирующие ее актив-
41
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ность. Таким образом, антитела блокируют активность КК-ММ изоэнзима и половину активности, приходящейся на долю КК-МВ изоэнзима.
В тесте определяется только активность КК-МВ, составляющая
половину активности КК. Фотометрирование осуществляют против
воздуха при длине волны – 340 нм.
Ход работы. Соотношение рабочий реагент/сыворотка – 25 : 1
(например: 0,5 мл рабочего реагента + 0,02 мл сыворотки). Ввести
анализируемый материал в рабочий реагент, перемешать и через пять
минут считывать изменения экстинкции с интервалом 1 минута (или
через другие равные промежутки времени) в течение последующих
5 минут (25 °С) или 3 минут (37 °С). Вычислить среднее изменение
экстинкции за 1 минуту (∆Е/мин).
Расчет активности (А) производят по формуле:
А = 8254 × ∆Е340 нм/мин.
Определение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ; КФ 1.1.1.27) катализирует обратимое восстановление пирувата до лактата, в качестве кофермента используется НАДН. ЛДГ имеет молекулярную массу около 134 кДа, это
тетрамер, состоящий из двух субъединиц – М (muscle – мышечная) и Н
(heart – сердечная). В сыворотке присутствуют 5 изоферментов, различающиеся составом субъединиц. В порядке снижения их электорофоретической подвижности (движения по направлению к аноду) их
обозначают как ЛДГ-1 (Н4), ЛДГ-2 (Н3М), ЛДГ-3 (Н2М2), ЛДГ-4
(Н1М3), ЛДГ-5 (М4). Избыток как пирувата, так и лактата, используемых в качестве субстрата, подавляет активность фермента, при этом
эффект пирувата выше. Норма (варьирует в разных методах): 240–
480 МЕ/л (по Назаренко Г.И. и др., 2002).
ЛДГ присутствует во всех клетках организма, это цитозольный
фермент. В печени, сердце, почках, скелетной мышце и эритроцитах
активность ЛДГ более чем в 500 раз выше, чем в сыворотке, поэтому
повреждение любого из этих органов сопровождается увеличением
ЛДГ в сыворотке. Повышение показателя имеет место при некрозе
тканей, особенно при остром повреждении сердца, повреждении эритроцитов, почек, скелетных мышц, печени, легких и кожи. Значительное повышение сопровождает гемолитические анемии, связанные с
дефицитом витамина В12 и фолиевой кислоты. Медленное повышение
в течение 3–4-х дней с последующим снижением за 5–7 дней может
свидетельствовать об инфаркте миокарда (необходимо, однако, ис-
42
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ключить инфаркт легкого, опухоль, мегабластную анемию). Повышение уровня ЛДГ характерно для острой фазы инфекционного гепатита,
между тем при хронических заболеваниях печени активность фермента редко оказывается повышенной. Циррозы, обтурационные желтухи,
различные заболевания почек и скелетных мышц, застойная сердечная
недостаточность дают средние цифры активности. Незначительное
повышение активности фермента отмечается при любых повреждениях клеток, сопровождающихся увеличением проницаемости мембран,
(инфаркт миокарда и легкого), при лейкозах, лимфомах, хронических
гепатитах. Таким образом, общая активность ЛДГ в сыворотке крови
не является специфическим тестом для определенной патологии. Поэтому необходимо разделять изоферменты ЛДГ и, затем, оценивать
вклад каждого в общую активность, т. к. они органоспецифичны.
ЛДГ в моче может повышаться в 3–6 раз при хроническом гломерулонефрите, системной красной волчанке с поражением почек,
диабетическом нефросклерозе, опухолях почек и мочевого пузыря.
Однако определение ЛДГ в моче не практикуется из-за ингибирующего действия на фермент кислой среды, мочевины и некоторых короткоцепочечных пептидов мочи.
Нормальное соотношение изоферментов ЛДГ в сыворотке составляет: ЛДГ1 – 15–30 %; ЛДГ2 – 22–50 %; ЛДГ3 – 15–30 %; ЛДГ4 – 0–
15 %; ЛДГ5 – 0–15 %. Количество изоферментов можно определить с
помощью электрофоретических, иммунологических, кинетических методов или путем хроматографии. Наиболее распространен метод электрофореза на геле агарозы или на ацетатцеллюлозных пленках. Наибольшей
разделяющей способностью и чувствительностью обладает метод ионообменной хроматографии, он используется в качестве референтного по
отношению к электрофорезу. Предложен также метод иммунопреципитации с использованием антител против всех изоферментов, содержащих
М субъединицу (ЛДГ2–ЛДГ5). В этом случае активность этих изоферментов не проявляется, остается активной только ЛДГ1. Результаты определения ЛДГ1 этим методом тесно коррелируют с результатами электрофореза и хроматографии, а диагностическая специфичность метода
для инфаркта миокарда составляет 94 %. Другим сравнительно новым
метом выявления активности ЛДГ1 является использование смеси, подавляющей активность всех изоферментов, содержащих М субъединицу.
Такой смесью является: 1,6 гексанедиол (700 мМ), перхлорат натрия
(825 мМ) и хинидинтиоцианат (190 мМ). Результаты также тесно коррелируют с данными электрофореза и иммуноингибирования.
43
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ЛДГ1 наиболее быстро продвигается к аноду при электрофорезе,
термостабилен, ингибируется высокими концентрациями пирувата и в
меньшей степени мочевиной и оксалоацетатом. Реакция превращения лактата в пируват, катализируемая ЛДГ1, протекает в органах с преимущественно аэробным метаболизмом, где лактат является субстратом окисления. Из него образуется пируват, который затем через ацетил-СоА окисляется до СО2 и Н2О, при этом энергия аккумулируется в виде молекул АТФ
в процессе окислительного фосфорилирования. ЛДГ1 присутствует в высоких концентрациях в сердце, почках, мозге, много ЛДГ1 в эритроцитах.
Поэтому недопустим гемолиз при определении активности ЛДГ1.
Поскольку ЛДГ может может окислять также α-гидроксибутират
до α-оксибутирата (в этом случае принято говорить об αгидроксибутират-дегидрогеназной активности (α-ГБДГ)), то в качестве
аналога ЛДГ1 часто рекомендуется определение α-ГБДГ, хотя активность α-ГБДГ несколько выше, чем ЛДГ1, что связано с тем, что
α-ГБДГ-активностью обладают все без исключения изоферменты ЛДГ.
При диагностике инфаркта миокарда увеличение активности ЛДГ
является достоверным тестом в сроки от 12 до 32 часов после болевого
приступа. Она остается повышенной в течение 8–14 дней. Однократное
исследование ЛДГ1 обладает клинической специфичностью в отношении
инфаркта миокарда в 66 % случаев, а определение ее в динамике (через
каждые 4–6 часов в течение суток) в 86 %. Если в сроки от 8 до 24 часов
после приступа ангиозных болей нет нарастания активности ЛДГ (а также КК-МВ и АсАТ), то нет и инфаркта. У части больных наблюдается
корреляция между уровнем ЛДГ и обширностью инфаркта. В некоторых
случаях дополнительную информацию дает коэффициент ЛДГ1/ЛДГ2,
который в норме составляет 0,6–0,7. При остром инфаркте миокарда он
становится выше 1,0 и возвращается к норме через 2–3 недели.
ГБДГ при инфаркте миокарда повышается в те же временные
интервалы, как ЛДГ, достигает максимума на 2–3 день и восстанавливается до нормы на 10–20 день.
Повышение ЛДГ1 отмечается также при опухолях репродуктивных органов: тератома, семинома яичка, дисгерминома яичника.
ЛДГ2, ЛДГ3 и ЛДГ4 обладают промежуточными свойствами.
Активность этих изоферментов повышается при массивном разрушении тромбоцитов (эмболия легочной артерии, массивные гемотрансфузии) и вовлечении в патологический процесс лимфатической системы. При нелимфоцитарных лейкозах увеличивается активность ЛДГ3
и ЛДГ4, причем степень увеличения зависит от количества незрелых
44
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
клеток. Увеличение ЛДГ3 иногда наблюдается при острых панкреатитах. Активность ЛДГ4 возрастает при поражении печени вирусного,
токсического или травматического характера и обострении хронических гепатитов, в активную фазу ревматизма, при кардиосклерозе с
нарушением гемодинамики, остром нефрите, при поражениях почек,
опухолях печени, предстательной железы, шейки матки, молочной
железы, кишечника, при тяжелых формах диабета.
ЛДГ 5 при электрофорезе продвигается к аноду медленнее других изоферментов, термолабилен, более чувствителен к ингибирующему влиянию мочевины и оксалоацетата и обладает самым малым
сродством к α-кетобутирату (в сравнении с другими изоферментами
ЛДГ). Наибольшее содержание этого изофермента характерно для
скелетных мышц, печени, кожи, слизистых оболочек, а также клеток
некоторых злокачественных опухолей. Значительное увеличение содержания ЛДГ5 отмечается при травмах, воспалительных и дегенеративных заболеваниях мышц и многих болезнях печени (гепатиты,
циррозы и др.). Онкологические заболевания (например, лимфолейкозы) могут также сопровождаться увеличением ЛДГ5. Активность
ЛДГ5 повышается в активную фазу ревматизма, глубоких поражениях
почек, сопровождающихся их гипоксией, опухолях почек и отторжении пересаженной почки, а также при тяжелых формах диабета.
Принцип метода. Активность ЛДГ определяется с помощью оптического теста:
Пируват + НАДН + H+ → Лактат + НАД+
Cкорость окисления НАДН в НАД+ пропорциональна активности ЛДГ. Активность фермента в сыворотке снижается после 3 дней
хранения при 4 °С – на 8 %, при 18–25 °С – на 2 %.
Ход работы. Рабочий реагент: смешать требуемое количество
реагентов № 1(буфер) и № 2 (стартовый реагент) в соотношении 4 : 1.
Реагент стабилен 24 часа при температуре хранения 2–8 °С или 3 часа
при 18–25 °С.
Непосредственно в кювете с длиной оптического пути 1 см
смешать рабочий реагент и исследуемый материал в соотношении
50 : 1, если температура проведения исследования 25 °С или 30 °С,
100 : 1, если температура проведения исследования 37 °С.
Через 1 мин. измерить исходную величину экстинции при длине
волны 340 нм (334 или 365 нм) против воздуха. Повторить измерения
точно через 1,2 и 3 мин. Вычислите среднее изменение экстинции за
1 минуту (∆Е/мин).
45
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Расчет активности фермента (МЕ/л) производят по формуле:
25 °С / 30 °С
37 °С
МЕ/л = 15000 ´∆Е 365 нм/мин
МЕ/л = 29705 ´∆Е 365 нм/мин
МЕ/л = 8095 ´∆Е 340 нм/мин
МЕ/л = 16030 ´∆Е 340 нм/мин
МЕ/л = 8250 ´∆Е 334 нм/мин
МЕ/л = 16345 ´∆Е 334 нм/мин
Если активность ЛДГ в сыворотке превышает 1200 МЕ/л, необходимо развести исследуемый образец 0,9%-м раствором NaCl в 10
раз, повторить анализ, а результат умножить на 10.
Нормальные величины в сыворотке крови человека:
25 °С
120–240 МЕ/л
30 °С
160–320 МЕ/л
37 °С
225–450 МЕ/л
Оценка состояния энергетического обмена
в ткани головного мозга:
определение уровня лактата и пирувата
Одной из первых реакций ткани мозга на снижение мозгового
кровотока является развитие лактат-ацидоза. Снижение содержания
АТР в ишемизированной зоне приводит к активации анаэробного гликолиза и усилению образования лактата и ионов Н+, что обусловливает
формирование метаболического ацидоза. Значительное нарастание
концентраций лактата в первые часы развития ишемического инсульта
вызывает снижение рН до 6,4–6,7 и является неблагоприятным прогностическим признаком. Снижение рН внутри- и внеклеточной среды
оказывает и непосредственное цитотоксическое действие, вызывая
«разрыхление» клеточных мембран, изменяя их физико-химические
свойства, способствуя повышенной проницаемости нейронов и эндотелия сосудов, и кроме того, усугубляет энергетические нарушения,
изменения ионного транспорта, глутаматную «эксайтотоксичность»,
изменения регуляторных свойств вторичных мессенджеров и т. д.
Комплексное повреждающее действие ацидоза является важным компонентом разворачивающихся процессов острой церебральной ишемии и развития инфаркта мозга [Боголепов Н.К., 1971].
Состояние энергетического обмена в ткани мозга оценивают по
содержанию молочной кислоты.
В тканях животных молочная кислота играет особую роль в
связи с тем, что этот субстрат представляет собой своеобразный метаболический тупик: действительно, основным путем обмена лактата
является легко обратимая лактатдегидрогеназная реакция. Скорость
46
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
других реакций образования или использования молочной кислоты
несравненно ниже, чем скорость взаимопревращения лактата и пирувата. Таким образом, лактат можно рассматривать как определенный
тканевый резерв активно метаболирующего пирувата. Обратимость
лактатдегидрогеназной реакции и высокая активность фермента позволяют паре субстратов лактат-пируват играть важную роль в контроле над отношением окисленных и восстановленных форм НАД.
Для определения количества молочной кислоты в тканях животных и
биологических жидкостях существует несколько методов. В лабораторной практике широко применяется колориметрический метод Баркера и Саммерсона, однако более простыми, чувствительными и быстрыми являются энзиматические методы. В основу предлагаемого метода положен метод Хохорста (1970 г.).
Принцип метода. В присутствии лактатдегидрогеназы молочная
кислота переходит в пировиноградную, причем связывание образующегося в ходе реакции пирувата гидразин-глициновым буфером способствует полному окислению лактата:
ЛДГ
L-лактат + НАД+ + гидразин → гидразон-пируват + НАДН + Н+ + Н2О
Образование восстановленной формы НАД, эквимолярное количеству окисленного лактата, регистрируют спектрофотометрически
при длине волны 340 нм [1].
Реактивы. 1) 6%-й раствор HClO4 (готовят непосредственно перед использованием); 2) 5 М раствор K2CO3; 3) гидразин-глициновый
буфер (0,4 М гидразин, 1 М глицин, рН 9,5; готовят на 0,2%-м растворе
натриевой соли ЭДТА); 4) 5×10–2 М раствор НАД (готовят непосредственно перед использованием); 5) лактатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.27)
(хранящийся в холодильнике коммерческий препарат фермента перед
использованием разводят дистиллированной водой так, чтобы содержание белка составляло около 5,0 мг/мл).
Ход работы. Навеску замороженной в жидком азоте и растертой
ткани (около 250–300 мг) помещают в центрифужную пробирку, находящуюся во льду, куда предварительно налит 1,0 мл 6%-й HClO4.
После перемешивания к пробе добавляют HClO4 до конечного соотношения ткань : кислота = 1 : 4 (на 1 г ткани 4 мл кислоты), ещё раз
тщательно перемешивают и оставляют на 10 мин во льду. Осадок белка отделяют центрифугированием в течение 15 мин при 3000 g.
Для удаления избытка хлорной кислоты к надосадочной жидкости, не содержащей белка, добавляют 5 М K2CO3 из расчета 0,05 мл на
47
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1 мл пробы, перемешивают и помещают на лед до полного прекращения выделения СО2. Осадок перхлората калия отделяют фильтрованием
или центрифугированием в течение 5 мин при 3000 g. Для проведения
энзиматической реакции используют 0,2 мл нейтрализованного тканевого экстракта, предварительно нагретого до комнатной температуры.
В кювету спектрофотометра (1 см) наливают 2,2 мл инкубационной среды, состоящей из 2,0 мл гидразин-глицинового буфера и 0,2 мл
раствора НАД; добавляют 0,2 мл нейтрализованного тканевого экстракта
и измеряют исходную величину оптической плотности (Е1) при длине
волны 340 нм. Щель прибора при этом устанавливают по гидразинглициновому буферу. К пробе добавляют 0,05 мл раствора лактатдегидрогеназы, перемешивают и после окончания ферментативной реакции
измеряют конечное значение оптической плотности (Е2). Об окончании
реакции судят по прекращению нарастания оптической плотности пробы.
Обычно время протекания реакции составляет 3–5 мин. и зависит от активности использованного препарата лактатдегидрогеназы.
Для внесения поправки на изменение оптической плотности,
связанное с добавлением ферментативного препарата, в контрольную
пробу вместо 0,2 мл тканевого экстракта вносят 0,2 мл воды и проводят аналогичные измерения. Получают Ек.
Расчет. Содержание лактата (в молях на 1 г ткани) вычисляют
по формуле: Х = ΔЕVК/6,22; где ΔЕ – изменение оптической плотности пробы за время реакции: ΔЕ = (Е2 – Е1) – Ек; V – конечный объем
пробы (2,45); 6,22 – коэффициент микромолярной экстинкции восстановленной формы пиридиновых нуклеотидов при длине волны 340 нм;
К – фактор разведения пробы по отношению к 1 г ткани, в данном случае равный 22,5.
Описанный метод высокоспецифичен, прост и дает хорошо воспроизводимые результаты. Средние данные (из 20–25 определений) по
содержанию молочной кислоты в тканях взрослых крыс представлены
ниже (мкмоль на 1 г ткани):
Головной мозг…………………….1,41 ± 0,23
Печень……………………………..1,83 ± 0,40
Сердце……………………………..2,01 ± 0,47
Почки………………………………1,65 ± 0,39
Принцип метода № 2 определения лактата:
лактатоксидаза
Молочная кислота +О2 ⎯⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯→ пируват + Н2О2
48
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пероксидаза
Н2О2 + ААП + п-хлорфенол ⎯⎯ ⎯ ⎯ ⎯ ⎯
⎯→ хинониминовый
окрашенный продукт + Н2О
Ход работы. Содержимое пробирок (табл. 7) перемешивают и
инкубируют 15 минут при 20–25 °С. Пробы фотометрируют против
контрольной пробы при длине волны 505 нм в кювете с толщиной поглощающего слоя 1,0 см. Окраска стабильна не менее 20 минут после
окончания инкубации.
Таблица 7
Ход определения концентрации молочной кислоты
Реактивы
Опытная Калибровочная Контрольная
проба, мл
проба, мл
проба, мл
Супернатант
0,2
–
–
Контрольный раствор
–
–
0,2
(среда выделения)
Рабочий реагент
2,0
2,0
2,0
Калибровочный раствор
–
0,2
–
Расчет проводят по формуле:
(Епр / Екал) × 3,3 ммоль/л,
где Епр – экстинкция опытной пробы;
Екал – экстинкция калибратора;
3,3 – концентрация молочной кислоты в калибраторе в моль/л.
Принцип метода определения пирувата. В присутствии лактатдегидрогеназы пируват восстанавливается до лактата по реакции
[Прохорова М.И., 1982]:
пируват + НАДН + Н+ ↔ лактат + НАД+
Количество использованного в реакции пирувата эквивалентно
количесвту НАДН, убыль которого регистрируют спектрофотометрически при длине волны 340 нм.
Реактивы:
1) 0,6 н. раствор хлорной кислоты (готовят перед использованием);
2) 5 М раствор K2CO3;
3) 0,5 М триэтаноламиновый буфер с 5 мМ ЭДТА, рН 7,6 (готовят накануне эксперимента, перед использованием контролируют значение рН);
4) 6 мМ раствор NADH (готовят непосредственно перед проведением ферментативной реакции);
49
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5) препарат лактатдегидрогеназы (ЛДГ) (продажный препарат, хранящийся в холодильнике, разводят бидистиллированной водой так, чтобы
полученный раствор содержал около 0,5 мг ферментативного белка в 1 мл).
Ход работы. Навеску замороженной в жидком азоте ткани мозга
(300 мг) помещают в центрифужную пробирку, стоящую во льду, куда
предварительно внесено 2 мл 0,6 н. HClO4. Пробы перемешивают, добавляют перхлорную кислоту до общего соотношения 9 : 1 (9 мл кислоты на 1 г ткани) и оставляют во льду на 15 мин. для более полной экстракции пирувата. Осажденные белки ткани отделяют центрифугированием в течение 10 мин. при 3000 g. Безбелковую надосадочную жидкость переносят в центрифужную пробирку и удаляют избыток хлорной
кислоты, добавляя 0,2 мл 5 М раствора K2CO3. Пробу перемешивают и
оставляют на 10 мин. во льду для более полного осаждения перхлората
калия, после чего осадок отделяют фильтрованием или центрифугированием в течение 10 мин. при 3000 g. Нейтрализованный таким образом
безбелковый экстракт нагревают до комнатной температуры и используют для проведения ферментативной реакции.
В кювету спектрофотометра (1 см) наливают 1,2 мл триэтаноламинового буфера и 0,8 мл тканевого экстракта. Пробу перемешивают и
устанавливают «нуль» спектрофотометра. Затем в кювету вносят
0,05 мл раствора NADH, снова перемешивают и измеряют исходное
значение оптической плотности (Е1). После этого к пробе добавляют
0,05 мл препарата ЛДГ, перемешивают и через 5–10 мин. после прекращения ферментативной реакции, о котором судят по установившейся
величине оптической плотности, измеряют величину Е2.
Чтобы учесть изменение оптической плотности пробы, связанное
с добавлением ферментативного белка, к одной из проб после окончания лактатдегидрогеназной реакции добавляют еще 0,05 мл препарата
фермента, перемешивают и сразу измеряют оптическую плотность (Е3).
Расчет. Содержание пировиноградной кислоты (в мкмолях на
1 г ткани) рассчитывают по формуле:
Х = ΔЕVK/6,22,
где ΔЕ – изменение оптической плотности пробы в ходе ферментативной реакции восстановления пирувата;
ΔЕ = (Е1 – Е2) – (Е3 – Е2);
V – конечный объем пробы в кювете (2,1 мл);
6,22 – коэффициент микромолярной экстинкции восстановленной формы
пиридиннуклеотидов при длине волны 340 нм и кювете шириной 1 см;
K – коэффициент разведения по отношению к 1 г ткани, в данном случае он составляет 12,44.
50
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Список литературы
1. Aisen P. The stability constants of the Fe3+ conalbumin complexes / P. Aisen, A. Leibman // Biochem. Biophys. Res. Commun. –
1968. – V. 30, № 4. – P. 407–413.
2. Apoptosis and free radicals / I. Stoian [et al.] // Biochem. and Mol.
Med. – 1996. – № 59. – P. 93–97.
3. Aushin R. Micromethods in single muscle fibus. Determinatione
of grand glutathione reductase / R. Aushin, H. Arthur, M. Deniese [et al.] //
Anal. Biochem. – 1988. – V. 174, № 2. – P. 575–579.
4. Avissar N. Extracellular glutathione peroxidase in human lung
epithelial lining fluid and in lung cells / N. Avissar, J.N. Finkelstein,
S. Horowits [et al.] // Am. J. Physiol. – 1996. – V. 270. – P. L173–L182.
5. Beeckmans S. Purification and physicochemical characterization
of chicken heart citrate synthase / S. Beeckmans, L. Kanarek // Int. J. Biochem. – 1983. – V. 15, № 4. – P. 469–478.
6. Beffencown S. Analis quantitative da glutatiao-reductase eda glutatiao-peroxidase em plasma e eritrocytas humanos / S. Beffencown // Rev.
port. farm. – 1991. – V. 41, № 3. – P. 9–14.
7. Benov L. Superoxide dependence of the toxity of short chain sugars / L. Benov, I. Fridovich // J. Biol. Chem. – 1998. – V. 273. – P. 25741–
25744.
8. Berlett B.S. Protein oxidation in aging, disease, and oxidative
stress / B.S. Berlett, E.R. Stadtman // J. Biol. Chem. – 1997. – V. 272,
№ 33. – Р. 20313–20316.
9. Boulton C.A. Regulatory studies on citrate synthase in Candida
107, an oleaginous yeast / C.A. Boulton, C. Ratledge // Microbiology. –
1980. – V. 121. – P. 441–447.
10. Brigellius-Flohe R. Vitamin E: function and metabolism /
R. Brigellius-Flohe, G. Traben // Faseb J. – 1999. – V. 13. – P. 1145–1155.
11. Carmody R.J. Signaling apoptosis a radical approach / R.J. Carmody, T.G. Cotter // Redox Rep. – 2001. – № 6. – P. 77–90.
12. Characteristics of citrate synthase from Agave americana /
M.J. Alejandre, J.L. Segovia, M.F. Zafra [et al.] // L. Leaves. Z. Pflavzenphysiol. – 1979. – V. 94, № 1. – P. 85–93.
13. Cheng W.H. Knockout of cellular glutathione peroxidase affects
selenium-dependent parameters similarly in mice fed adequate and excessive dietary selenium / W.H. Cheng, G.F. Combs, X.G. Lei // BioFactors. –
1998. – V. 7. – P. 311–321.
14. Citrate synthase: an immunochemical study / M.J. Danson,
D.M. Brennand, A. Daham [et al.] // Biochem. Soc. Trans. – 1987. – V. 15,
№ 5. – P. 836–837.
51
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
15. DeLeve L. Glutathione metabolism and its role in hepatotoxicity / L. DeLeve, N. Kaplowitz // Pharmacol. Ther. – 1991. – № 52. –
Р. 287–305.
16. Koo H.C. Effects of transgene expression of superoxide dismutase and glutathione peroxidase on pulmonary epithelial cell growth in hyperoxia / H.C. Koo [et al.] // Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. –
2005. – V. 288, № 4. – P. L718–L726.
17. Emptage M.H. Inactivation of aconitase and similar Fe-S
containing enzymes by divalent metals M.H. Emptage // 5th Intern. Conf.
Bioinorg. Chem. : Inorg. Chem. – 1991. – V. 43, № 2–3. – P. 255.
18. Fabregat I. Citrate synthase of Tetrahymena pyriformis: evolutionary and regulatory aspects / I. Fаbregat, J. Satrustegui, A. Machado //
Arch. Biochem. and Biophys. – 1983. – V. 220, № 2. – P. 354–360.
19. Freminet A. Carbohydrate and acid metabolism during acute hypoxia in rats blood and heart metabolites / A. Freminet // Comp. Biochem.
And Physiol. – 1981. – V. 70, № 3. – P. 427–430.
20. Gardner P.R. Aconitase is a sensitive and critical target of oxygen poisoning in cultured mammalian cells and rat lungs / Paul R. Gardner,
D.M. Nguyen, C.W. White // Proc. Nat. Acad. Sci. – 1994. – V. 91, № 25. –
P. 12248–12252.
21. Gardner P.R. Superoxide radical and iron modulated aconitase
achtivity in mammalian cells / P.R. Gardner, J. Raineri // J. Biol. chem. –
1995. – V. 270, № 22. – P. 11399–13405.
22. Ghibelli L. Non-oxidative loss of glutathione in apoptosis via
GSH extrusion / L. Ghibelli, S. Coppola, G. Ratilio // Biochem. Biophys.
Res. Commun. – 1995. – V. 216. – P. 313–320.
23. Greenblall G. A. Purification and partial characterization of citrate synthase from Rhaseolus vulgaris mitochondria / G.A. Greenblall,
J.V. Sarkission // Phytochemistry. – 1973. – V. 12, № 6. – P. 1249–1254.
24. Hirling H. Mutational analysis of the [4Fe-4S]-cluster converting
iron regulatory factor from its RNA-binding form to cytoplasmic aconitase /
H. Hirling, B.R. Henderson, L.C. Kühn // EMBO J. – 1994. – V. 13. –
P. 453–461.
25. Human heart citrate synthase: purification, properties, kinetic
and immunologic studies / T.C. Smitherman, A. Mukherjee, J.B. Robinson
[et al.] // J. Mol. and Cell Cardiol. – 1979. – V. 11, № 2. – P. 149–160.
26. Hwavg C. Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum / C. Hwavg, A.J. Sinsky, H.F. Lodish // Science. – 1992. –
№ 257. – Р. 1496–1502.
52
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
27. Jeffery D. Citrate synthase and malate dehydrogenase from tomato fruit / D. Jeffery, P.W. Goodenough, P.D.J. Weitzman // Phytochemistry. – 1988. – V. 27, № 1. – P. 41–44.
28. Jones D.P. Metabolism of Hydrogen peroxide in islated hepatocites / D.P. Jones, L. Erlow, H. Thor // Arch. Biochem. and Biophys. –
1973. – V. 15, № 4. – P. 92–115.
29. Jones P.L. Metabolic responses of striped bass (Morone saxatilis) to temperature acclimation. Alterations in metabolic carbon sources
and distributions of fiber types in locomotory muscle / P.L. Jones,
B.D. Sidell // J. Exp. Zool. – 1982. – V. 219, № 2. – P. 163–171.
30. Kennedy M.C. Purification and characterization of cytosolic aconitase from beef liver and its relationship to the iron-responsive element
binding protein / M.C. Kennedy, L. Mende-Mueller, G.A. Blondin // Proc
Nat. Acad. Sci. – 1993. – V. 90, № 6. – P. 2556–2560.
31. Kennedy М.C. Studies on aconitase by spectroscopy, crystallography and mutagenesis / М.C. Kennedy, H. Beinert, H. Lauble // J. Jnorg.
Chem. – 1991. – V. 43, № 2–3. – P. 234–240.
32. Kleber H.-P. Regulation of citrate synthase activity in Acinetobacter calcoaceticus / H.-P. Kleber, H. Tauchert // Acta Biol. Med. Ger. –
1974. – V. 32, № 6. – P. 575–584.
33. Lu G. Reactive oxygen species are critical in the oleic acidmediated mitogenic signaling pathway in vascular smooth muscle cells /
G. Lu, E.L. Greene, T. Nagai [et al.] // Hypertansion. – 1998. – V. 32,
№ 6. – Р. 1003–1010.
34. Matsuoka Y. Kinetic studies of citrate synthase from rat kidney
and rat brain / Y. Matsuoka, P.A. Srere // J. Biol. Chem. – 1973. – V. 248,
№ 23. – P. 8022–8030.
35. Melefors O. Translational regulation in vivo of the Drosophila
melanogaster mRNA encoding succinate dehydrogenase iron protein via
iron responsive elements / O. Melefors // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1996. – V. 221, № 2. – P. 437–441.
36. Minara M. Thiobarbituric acid value on fresh homogenate of rat
as a parameter of lipid peroxidation in aging, CCl4 intoxication, and vitamin E deficiency / M. Minara, M. Uchiyamata, K. Fubuzawa // Biochem.
Med. – 1980. – V. 23 (3). – P. 302–311.
37. Modification of a free Fe-S cluster cysteine residue in the active
iron- responsive element-binding protein prevents RNA binding /
C.C. Philpott, D. Haile, T.A. Rouault [et al.] // J. Biol. Chem. – 1993. –
V. 268. – P. 17655–17658.
53
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
38. Muller K. Gpl20 of HIV-1 induces apoptosis in rat cortical cell
cultures: prevention by memantine / К. Muller // Eur. J. Pharmacol. –
1992. – Vol. 226, № 6. – P. 209–214.
39. Murakami K. Inactivation of aconitase in yeast exposed to oxidative stress / K. Murakami, M. Yoshino // Biochem. Mol. Biol. Int. – 1997. –
V. 41, № 3. – P. 481–486.
40. Neurobiologie der Haut: Apoptose / R. Paus [et al.] // Hautarzt. –
1995. – Bd. 46, № 3. – P. 285–303.
41. Nohl H. Generation of activated oxygen species as side products
of cell respiration / H. Nohl // Free radic. Boil. And med. – 1990. – Suppl.
№ 1. – P. 141.
42. Non-transferrin-bound iron in plasma or serum from patients
with idiopathic hemochromatosis. Characterization by high performance
liquid chromatography and nuclear magnetic resonance spectroscopy /
M. Grootveld, J.D. Bell, B. Halliwell [et al.] // J. Biol. Chem. – 1989. –
V. 264. – P. 4417–4422.
43. Ookhtens M. Role of the liver in interorgan homeostasis of glutatione and cystine / M. Ookhtens, N. Kaplowitz // Sem. Liver Dis. – 1998. –
№ 18. – Р. 313–329.
44. Oshino N. Properties of glutathione release observed during reduction of organic hydroperoxide demetilation of aminopirini and oxidation
of same substances in perfused rat liver and their implication for the physiological function of catalase / N. Oshino, B. Chance // Biochem. J. – 1977. –
V. 162. – P. 509–525.
45. Oxygen free radical release in human failing myocardium is associated with increased activity of rac1-GTPase and represents a target for
statin treatment / C. Maack [et al.] // Circulation. – 2003. – V. 108. –
P. 1567–1574.
46. Packer L. Free Radicals in the Brain / L. Packer, L. Prilipko,
Y. Christen // Aging. Neurological and Mental Disorders. – Berlin ; New
York : SpringerVerlag, 1992. – P. 21–41.
47. Patra R.C. Antioxidant effects of alpha-tocopherol, ascorbic acid
and L-methionine on lead induced oxidative stress to the liver, kidney and
brain in rats / R.C. Patra, D. Swarup, S.K. Dwivedi // Toxiciligy. – 2001. –
V. 162. – P. 81–88.
48. Popova T.N. Citrate and isocitrate in plant metabolism /
T.N. Popova, M.A.A. Pinheiro de Carvalho // Biochim. et Biophys. – Acta,
1998. – V. 1364. – P. 307–325.
49. Pramipexole protects against apoptotic cell death by nondopaminergic mechanisms / M. Gu [et al.] // J. Neurochem. – 2004. –
V. 91. – P. 1075–1081.
54
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
50. Primary structure of porcine heart citrate synthase / D.C. Bloxham, D.C. Parmelee, S. Rumar [et al.] // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. Biol.
Sci. – 1981. – V. 78, № 9. – P. 5381–5985.
51. Rafalowska U. The effect of aspartate on citrate metabolism in
the cytosolic fraction of brain under conditions of normoxia, hypoxia and
anesthesia / U. Rafalowska, M. Erecinska, B. Chance // J. Neurochem. –
1975. – V. 25, № 4. – P. 497–501.
52. Ramsay R.R. Molecular forms of aconitase and their interconversions / R.R. Ramsay, N.P. Signer // Biochem. J. – 1984. – V. 221,
№ 2. – P. 489–497.
53. Reznick A.Z. Oxidative damage to proteins: Spectrophotometric
method for carbonyl assay / A.Z. Reznick, L. Packer // Meth. Enzimol. –
1994. – Vol. 233. – P. 357–363.
54. Robbins A.H. Iron-sulfer cluster in aconitase. Crystalografic evidence for a three-iron center // Arthur H. Robbins, Charles David Stout //
J. Biol. Chem. – 1985. – V. 260, № 4. – P. 2328–2333.
55. Rost M. Luminol and lucigenin amplified chemiluminescence
and lipid-peroxidation with brain microsomes from rats during ontogenic
development / M. Rost, E. Karge, W. Klinger // Experimental and Toxicol.
Pathol. – 1998. – V. 50, № 3. – Р. 253–255.
56. Sandstrom J. Heparin-affinity patterns and composition of extracellular superoxide dismutase in human plasma and tissues /
J. Sandstrom, K. Karlsson, T. Edlund [et al.] // Biochem. J. – 1993. –
V. 294. – P. 853–857.
57. Schuessler H. Oxygen effect in the radiolysis of proteins. Part 2.
Bovine Serum album / H. Schuessler, K. Schilling // Int. J. Radiat. Biol.
Relat. Stud. Phys. Chem. Med. – 1984. – V. 45, № 3. – P. 267–281.
58. Skulachev V.P. Role of uncoupled and non-coupled oxidations in
maintenance of safely low levels of oxygen and its one-electrone reductants /
V.P. Skulachev // Quant. Rev. Biophys. – 1996. – V. 29. – P. 169–203.
59. Sunde R.A. Dietary selenium requirements based on glutathione
peroxidase-1 activity and mRNA levels and other Se-dependent parameters
are not increased by pregnancy and lactation in rats / R.A. Sunde,
J.K. Evenson, K.M. Thompson [et al.] // J. Nutr. – 2005. – V. 135, № 9. –
P. 2144–2150.
60. Tappel A.L. Vitamin E as the biological lipid antioxidant /
A.L. Tappel // Vitam. Horm. – 1962. – № 20. – Р. 493–510.
61. Man W.Z. The effect of replacing the conserved active-site residues His-264, Asp-312 and Arg-314 on the binding and catalytic properties
of Escherichia coli citrate synthase / W.Z. Man, J. Li, C.D. O’Connor [et
al.] // Biochem J. – 1994. – V. 300, № 3. – P. 765–770.
55
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
62. Treffry A. The binding of ferric iron by ferritin / A. Treffry,
P.M. Harrison // Biochem. J. – 1979. – V. 181, № 3. – P. 709–716.
63. Turella P. Glutathione Transferase Superfamily Behaves Like
Storage Proteins for Dinitrosyl-Diglutathionyl-Iron Complex in Heterogeneous Systems / P. Turella, J.Z. Pedersen, A.M. Caccuri [et al] // The journal of biological chemistry. – 2003. – V. 278, № 43. – P. 42294–42299.
64. Uecyama N. Мetalloenzymes and synthetic polymer complexes.
Catalytic reaction by multielectron transfer / N. Uecyama, A. Nakamura //
High Polym. – 1990. – V. 39, № 3. – P. 198–201.
65. Wickler S.J. Seasonal changes in enzymes of aerobic heat production in the white-footed mouse / S.J. Wickler // Amer. J. Physiol. –
1981. – V. 240, № 5. – P. 289–293.
66. Wiegand G. Citrate synthase: structure, control, and mechanism /
G. Wiеgand, S.J. Remington // Annu. Rev. Biophys. and Biophys. Chem. –
1986. – V. 15. – P. 97–117.
67. Woods J.S. Up-regulation of glutathione synthesis in rat kidney
by methyl mercury / J.S. Woods, M.E. Ellis // Biochem. Pharmacol. –
1995. – № 50. – Р. 1719–1724.
68. Zheng L. Binding of cytosolic aconitase to the iron responsive element of porcine mitochondrial aconitase mRNA / L. Zheng, M.C. Kennedy,
G.A. Blondin // Arch. Biochem. Biophys. – 1992. – V. 299. – P. 356–360.
69. Азизова О.А. Хемилюминесцентная оценка антиоксидантного
статуса больных атеросклерозом / О.А. Азизова, А.П. Пирязев,
М.П. Шерстнев // Бюлл. эксп. биол. и мед. – 2001. – Т. 131. – С. 524–526.
70. Антиоксиданты и антигипоксанты в комплексном лечении
больных хроническим бронхитом / Е.А. Уклистая [и др.] // Южнороссийский журнал. – 1998. – № 4. – С. 94–98.
71. Афанасьев В.Г. К микрометоду определения лимонной кислоты в сыворотке крови с помошью фотоэлектроколориметра /
В.Г. Афанасьев, В.С. Зайцев, Т.И. Вольфсон // Лаб. дело. – 1973. –
№ 4. – С. 115–116.
72. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М. : Медицина, 1998. – 704 с.
73. Боголепов Н.К. Церебральные кризисы и инсульт / Н.К. Боголепов. – М. : Медицина, 1971. – 392 с.
74. Буреш Я. Методики и основные эксперименты по изучению
мозга и поведения / Я. Буреш, О. Бурешова, Д.П. Хьюстон. – М. : Медицина, 1991. – 167 с.
75. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.И. Арчаков. – М. : Наука,
1972. – С. 252.
56
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
76. Владимиров Ю.А. Свечение, сопровождающее биохимические реакции / Ю.А. Владимиров // Соросовский Образовательный
Журнал. – 1999. – № 6. – С. 25–32.
77. Выделение, очистка и некоторые свойства цитратсинтазы
дрожжей Yarrowia (Candida) lipolytica – продуцентов лимонной кислоты / И.Г. Моргунов, А.А. Шарышев, О.В. Микулинская [и др.] // Биохимия. – 1994. – Т. 59, № 9. – С. 1320–1328.
78. Герасимов А.И. Биохимическая диагностика в травматологии и ортопедии / А.И. Герасимов, Л.Н. Фурцева. – М. : Медицина,
1986. – 236 с.
79. Горожанская Э.Г. Роль глутатионзависимых пероксидаз в
регуляции утилизации липопероксидов в злокачественных опухолях /
Э.Г. Горожанская, В.Б. Ларионова, Г.Н. Зубрихина [и др.] // Биохимия. – 2001. – Т. 66, вып. 2. – С. 273–278.
80. Дубинина Е.Е. Антиоксидантная система плазмы крови /
Е.Е. Дубинина // Укр. биохим. журн. – 1992. – Т. 64, № 2. – С. 3–15.
81. Жеребцов Н.А. Биохимия : учебник / Н.А. Жеребцов,
Т.Н. Попова, В.Г. Артюхов. – Воронеж : Изд-во Воронеж. гос. ун-та,
2002. – 696 с.
82. Залесский В.Н. Механизмы цитотоксических эффектов
активных молекул кислорода и развитие апоптоза / В.Н. Залесский,
Н.В. Великая // Соврем. пробл. токсикол. – 2003. – № 1.
(http://www.medved.kiev.ua/arhiv_mg/st_2003/03_1_2.htm.)
83. Изменения некоторых метаболитов цикла трикарбоновых
кислот и гликолиза в различные стадии атеросклероза / В.И. Рубин
[и др.] // Лаб. дело. – 1979. – № 7. – С. 434–435.
84. Калинина Т.С. Уровень мРНК фермента апоптоза-каспазы-3
в стволе и коре головного мозга крыс в постнатальном онтогенезе /
Т.С. Калинина, А.В. Баннова, Н.Н. Дыгало // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2002. – Т. 134, № 12. – C. 641–644.
85. Колесниченко Л.С. Влияние направленного изменения концентрации глутатиона на температуру тела и толерантность к ишемии
головного мозга / Л.С. Колесниченко, В.И. Кулинский // Биохимия. –
2003. – Т. 68, вып. 5. – С. 659–663.
86. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии /
Г.А. Кочетов. – М. : Высш. шк., 1980. – 272 с.
87. Кузьменко Д.Н. Оценка резерва липидов сыворотки крови
для перекисного окисления стресс у крыс / Д.Н. Кузьменко, Б.И. Лаптев // Вопр. мед. химии. – 1999. – № 1. – С. 52–57.
57
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
88. Кулинский В.И. Биологическая роль глутатиона / В.И. Кулинский, Л.С. Колесниченко // Успехи современной биологии. –
1990. – Вып. 114. – С. 20–33.
89. Кулинский В.И. Структура, свойства, биологическая роль и регуляция глутатионпероксидазы / В.И. Кулинский, Л.С. Колесниченко //
Успехи современной биологии. – 1993. – Т. 113, № 1. – С. 107–123.
90. Левенкова М.В. Некоторые регуляторные свойства глюкозо6-фосфатдегидрогеназы из печени крыс в норме и при экспериментальном токсическом гепатите / М.В. Левенкова, Т.Н. Попова,
А.В. Семенихина // Вестник ВГУ. – 2004 – № 1. – С. 134–138.
91. Ленинджер А. Биохимия / А. Ленинджер. – М. : Мир, 1977. –
957 с.
92. Лю Б.Н. Кислородно-перекисная концепция апоптоза и возможные варианты его механизма / Б.Н. Лю // Усп. совр. биологии. –
2001. – Т. 121, № 5. – С. 488–501.
93. Матасова Л.В., Попова Т.Н. Аконитаза млекопитающих при
окислительном стрессе // Биохимия. – 2008. – Т. 73, вып. 9. – С. 1189–
1198.
94. Матюшин Б.Н. Определение супероксиддисмутазной активности в материале пункционной биопсии печени при ее хроническом
поражении / Б.Н. Матюшин, А.С. Логинов, В.Д. Ткачев // Лаборат. дело. – 1991. – С. 16–19.
95. Мелик-Адамян В.Р. Пространственная структура белков /
В.Р. Мелик-Адамян, Э.Г. Арутюнян, К.М. Поляков // Природа. –
1997. – № 7. – С. 61–63.
96. Методическое пособие по изучению процессов перекисного
окисления липидов и системы антиоксидантной защиты организма у
животных / В.С. Бузлама [и др.] – Воронеж, 1997. – С. 19–21.
97. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен) / М.И. Прохорова. – Л. : Изд-во Ленингр. гос. ун-та,
1982. – 272 с.
98. Окислительная модификация белков плазмы крови больных
психическими расстройствами (депрессия, деперсонализация) / Е. Дубинина [и др.] // Вопр. мед. химии. – 1995. – Т. 46, № 4. – С. 398–410.
99. Осипов А.Н. Активные формы кислорода и их роль в организме / А.Н. Осипов, О.А. Азизова, Ю.А. Владимиров // Успехи биологической химии. – 1990. – Т. 31, № 2. – С. 180–208.
100. Петрович Ю.А. Селеноэнзимы и другие селенопротеины,
их биологическое значение / Ю.А. Петрович, Р.П. Подорожная // Успехи биологической химии. – 1981. – Т. 91, № 1. – С. 127–144.
58
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
101. Попова Т.Н. Изоцитратдегидрогеназы: формы, локализация, свойства и регуляция / Т.Н. Попова // Биохимия. – 1993. – Т. 58,
№ 12б. – С. 1861–1879.
102. Рудько И.А. Состояние прооксидантной и антиоксидантной
систем эритроцитов у больных с хронической почечной недостаточностью / И.А. Рудько, Т.С. Балашова, А.А. Кубатиев [и др.] // Тер. арх. –
1995. – Т. 67, № 8. – С. 7–9.
103. Свиридов М.М. Каталитические свойства 6-фосфоглюконатдегидро-геназы из печени крысы в норме и при токсическом гепатите / М.М. Свиридов, А.В. Семенихина, Т.Н. Попова // Биомед. химия. – Вып. 5, т. 52. – 2006. – С. 479–488.
104. Скулачев В.П. Возможная роль активных форм кислорода в
защите от вирусных инфекций / В.П. Скулачев // Биохимия. – 1998. –
Т. 63, № 12. – С. 1691–1694.
105. Соколовский В.В. Тиоловые антиоксиданты в молекулярных механизмах неспецифичекой реакции организма на экстремальные воздействия / В.В. Соколовский // Вопросы мед. химии. – 1988. –
Т. 34, № 6. – С. 2–11.
106. Стальная И.Д. Метод определения диеновой коньюгации
ненасыщенных высших жирных кислот / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии / под ред. В.Н. Ореховича. – М. : Медицина, 1977. – C. 63–64.
107. Стальная И.Д. Метод определения малонового диальдегида
с помощью 2-тиобарбитуровой кислоты / И.Д. Стальная, Т.Г. Гаришвили // Современные методы в биохимии / под ред. В.Н. Ореховича. – М. : Медицина, 1977. – С. 66–68.
108. Хочачка П. Биохимическая адаптация / П. Хочачка,
Дж. Сомеро. – М. : Мир, 1988. – 568 с.
109. Ченас Н.К. Соотношение между глутатионредуктазной и
диафоразной активностью глутатионредуктазы из Sacharomyces cerevisiae / Н.К. Ченас, Р.К. Ракаускенс, Ю.Ю. Кулис // Биохимия. – 1989.–
Т. 54, № 7. – С. 1090–1097.
110. Ярилин А.А. Апоптоз. Природа феномена и его роль в целостном организме / А.А. Ярилин // Патол. физиол. эксп. терап. –
1998. – T. 2. – C. 38–48.
59
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Приложение
Некоторые экспериментальные модели патологических состояний
Объект исследования: белые крысы-самцы (Rattus rattus L.)
массой 150–200 г.
Создание модели ишемии головного мозга
Индуцирование ишемии-реперфузии головного мозга у животных осуществляют путем 30-минутной окклюзии обеих общих сонных
артерий. Реперфузия достигается снятием окклюзоров, восстановлением кровотока контролируется визуально. Спустя трое суток у животные под наркозом извлекают головной мозг из полости черепа по
стандартной методике: рассечение брашнами ножниц костей черепа
по границе между ее основанием и сводом. После отделения свода
черепа вместе с твердой мозговой оболочкой перерезают черепные
нервы. Мозг извлекают, замораживают в жидком азоте и гомогенизируют путем растирания замороженной ткани в фарфоровой ступке.
Контрольную группу составляют ложнооперированные животные.
Источник: Коррекция последствий постишемического реперфузного повреждения головного мозга цитофлавином / В.В. Бульон
[и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. –
2000. – Т. 129, № 20. – С. 345–348.
Создание модели хронической алкогольной интоксикации
Хроническую алкогольную интоксикацию создавают путем добавления к стандартному рациону 15 % этанола регулярно в течение месяца.
Источник: Бардина Л.Р. Метаболическая адаптация к алкоголю
у крыс, различающихся по предпочтению этанола воде / Л.Р. Бардина,
В.И. Сатановская // Вопросы медицинской химии. – 1999. – № 2. –
(http://medi.ru/pbmc/8890203.htm).
Создание модели токсического гепатита при помощи четыреххлористого углерода
Для создания модели экспериментального токсического гепатита используют четыреххлористый углерод, являющийся органоспецифичным токсином, обладающий гепатотропным действием. После суточной пищевой депривации животным однократно вводят четыреххлористый углерод в дозе 0,064 мл в виде раствора в 1 мл вазелиново-
60
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
го масла на 100 г веса животного. Забор материала производят на
4 сутки, когда наблюдается максимальный цитолиз гепатоцитов.
Источник: Сидорова В.Ф. Регенерация печени у млекопитающих / В.Ф. Сидорова, З.А. Рябинина, Е.М. Лейкина. – М. : Медицина,
1966. – 240 с.
Создание модели гипертиреоза
Для индуцирования экспериментального тиреотоксикоза животным вводят внутрибрюшинно трийодтиронин в дозе 100 мкг на
100 г массы тела в виде раствора в 0,9% NaCl, инъекции осуществляют
трижды в течение 6 дней [Fernandez V. et al, 1991].
Источник: Fernandez V. Effects of hyperthyroidism on rat liver glutathione metabolism: Related enzymes’activities, efflux, and turnover /
V. Fernandez, K. Simizu, S.B.M. Barros // Endocrinology. – 1991. –
V. 129. – P. 85–91.
Создание модели инфаркта миокарда
Экспериментальный инфаркт миокарда моделируют введением
подкожно 0,1 % раствора адреналина в дозе 0,15 мл / 100 г массы тела.
Забор материала производят через сутки после введения адреналина.
Источник: Паренхиматозно-стромальные отношения в миокарде: альтернативная недостаточность кардиомиоцитов и морфогенез
очагового кардиосклероза / Л.М. Непомнящих [и др.] // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины. – 2002. – Т. 134, № 8. –
С. 219–226.
Модель индукции апоптоза при введении фактора некроза
опухоли-α
Индукция ФНО-зависимого апоптоза в клетках печени требует
сенситизации гепатоцитов, например ингибиторами транскрипции и
облегчена более высоким кислородным потенциалом. Для индукции
апоптоза животным вводили актиномицин D (actD) внутрибрюшинно
в дозе 20 мкг на килограмм веса животного, через 20 минут вводили
ФНО-α (1 мкг/кг). Забор материала производят на 12 час после введения ФНО.
Источник: Effect of hepatocyte apoptosis induced by TNF-α on
acute severe hepatitis in mouse models / Guo Qing Zang [et al.] // World J.
Gastroenterology. – 2000. – V. 6, № 5. – P. 688–692.
61
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Учебное издание
МЕТОДЫ ОЦЕНКИ
ОКСИДАТИВНОГО СТАТУСА
Учебно-методическое пособие для вузов
Составители:
Рахманова Татьяна Ивановна,
Матасова Лариса Владимировна,
Семенихина Анастасия Владимировна,
Сафонова Ольга Анатольевна,
Макеева Анна Виталиевна,
Попова Татьяна Николаевна
Редактор Волынкина И.Г.
Подп. в печ. 26.11.2009. Формат 60×84/16. Усл. печ. л. 3,54.
Тираж 50 экз. Заказ 1707.
Издательско-полиграфический центр
Воронежского государственного университета.
394000, г. Воронеж, пл. им. Ленина, 10. Тел. (факс): +7 (4732) 598-026
http://www.ppc.vsu.ru; e-mail: pp_center@ppc.vsu.ru
Отпечатано в типографии
Издательско-полиграфического центра
Воронежского государственного университета.
394000, г. Воронеж, ул. Пушкинская, 3. Тел. 204-133
62
Документ
Категория
Химические науки
Просмотров
404
Размер файла
627 Кб
Теги
914, оценки, оксидативного, метод, статус
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа