close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

1235.Методы иммунологических исследований

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Оренбургский государственный университет»
Кафедра микробиологии
Д.Г. ДЕРЯБИН, Н.А. РОМАНЕНКО
МЕТОДЫ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАHИЯ К ЛАБОРАТОРНОМУ ПРАКТИКУМУ
ПО ИММУНОЛОГИИ
Рекомендовано к изданию Редакционно-издательским советом
государственного образовательного учреждения
высшего профессионального образования
«Оренбургский государственный университет»
Оренбург 2009
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
УДК 557.27(07)
ББК 28.074я7
Д 36
Рецензент
доктор медицинских наук, Ю.А. Брудастов
Д 36
Дерябин, Д.Г.
Методы иммунологических исследований: методические
указания к лабораторному практикуму по иммунологии /
Д.Г. Дерябин, Н.А. Романенко. – Оренбург: ГОУ ОГУ, 2009. –
44 с.
Методические указания предназначены для выполнения
лабораторных занятий по курсу «Иммунология» как специальной
дисциплины и дисциплины специализации в 7-ом семестре по
специальности 020209 – Микробиология и общепрофессиональной
дисциплины по специальностям 011600 – Биология, 013500 –
Биоэкология
ББК 28.074я7
© Дерябин Д.Г.,
Романенко Н.А., 2009
© ГОУ ОГУ, 2009
2
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Содержание
Введение ................................................................................................................. 4
1 Реакции «антиген-антитело» ............................................................................................ 5
1.1 Реакция агглютинации..................................................................................... 7
1.1.1 Реакция агглютинации для выявления антител (реагинов) в сыворотке
крови при диагностике сифилиса ......................................................................... 8
1.1.2 Реакция агглютинации на стекле для выявления антигена при
определении серотипа кишечной палочки (Escherichia coli) ............................. 9
1.1.3 Реакция гемагглютинации при определении группы крови человека .... 11
1.1.4 Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации при определении титра
антител к возбудителю кори для оценки напряженности противокоревого
иммунитета ........................................................................................................... 14
1.2. Реакция преципитации.................................................................................. 17
1.2.1 Реакция преципитации для определения токсигенности Corynebacterium
diphteriae ............................................................................................................... 17
1.2.2
Реакция
преципитации
для
определения
концентрации
иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови человека ................... 19
1.3 Реакции «антиген-антитело» с использованием «метки»........................... 22
1.3.1 Реакция иммунохроматографии для выявления хорионического
гонадотропина в моче .......................................................................................... 23
1.3.2 Реакция иммунофлюоресценции для выявления Chlamydia trachomatis в
пробах из цервикального канала (у женщин) или уретры (у мужчин) ............ 24
1.3.3 Неконкурентный иммуноферментный анализ для количественного
определения альфа-фетопротеина в сыворотке крови человека ...................... 25
1.3.4 Конкурентный иммуноферментный анализ для количественного
определения кортизола в сыворотке крови человека........................................ 28
1.3.5 Иммуноферментный анализ для определения индекса авидности
иммуноглобулинов класса G к вирусу краснухи в сыворотке крови
человека ................................................................................................................ 30
1.4 Многокомпонентные иммунологические реакции...................................... 32
1.4.1 Реакция связывания комплемента ............................................................. 33
1.4.2 Опсонно-фагоцитарная реакция................................................................. 35
2 Реакции, направленные на выявление и оценку функциональной активности
клеток иммунной системы................................................................................... 37
2.1 Реакция розеткообразования для обнаружения Т- и В-лимфоцитов ......... 37
2.2 Реакция бласттрансформации лимфоцитов ................................................. 39
Список использованных источников.................................................................. 41
Приложение А Вопросы для подготовки к экзамену по дисциплине
«Иммунология» .................................................................................................... 42
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Введение
Дисциплина «Иммунология» изучается студентами специальности
020209 – Микробиология в 7-ом семестре как специальная дисциплина и
дисциплина специализации (Федеральный компонент ДС.Ф.06), студентами
специальностей 011600 – Биология, 013500 – Биоэкология как
общепрофессиональная дисциплина (Федеральный компонент ОПД.Ф.02).
Дисциплина изучается в соответствии с учебными планами
специальностей с учетом ГОС ВПО (раздел 4 «Общие требования к
обязательному минимуму содержания основной образовательной программы
по направлениям подготовки дипломированного специалиста), введенными в
действие Министерством образования Российской Федерации.
Основной целью преподавания дисциплины является формирование
развернутых и современных представлений о механизмах функционирования
иммунной системы, условиях развития иммунологических реакций и их
использовании для диагностики инфекционных и иных заболеваний, оценки
иммунного статуса.
В органической связи с получением фундаментальных знаний по
данной проблеме важной целью изучения дисциплины является
формирование практических навыков выполнения иммунологических
исследований, опыта постановки, регистрации и интерпретации результатов
иммунологических реакций.
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1 Реакции «антиген-антитело»
В иммунологии применяется целый ряд экспериментальных методов из
других областей биологии. Так, выделение антигенов и антител производят с
помощью биохимических методов фракционирования белков, гены
иммунологически важных молекул секвенируют обычными молекулярногенетическими методами. Вместе с тем, прогресс современной иммунологии
гораздо больше, чем развитие других биологических дисциплин связан с
эволюцией своих специальных методов исследования, основанных на
взаимодействии антиген-антитело. Эти иммунологические методы в свою
очередь нашли применение в различных областях науки и промышленного
производства. В настоящее время существуют сотни разнообразных
иммунологических методов; наиболее широко применяемые из них описаны
в этой главе.
Основными преимуществами иммунологических методов являются
следующие:
1) с помощью таких методов можно выявлять как антитела, так и
антигены;
2) определение может быть качественным и количественным;
3) эта группа методов не требует большого количества материала для
анализа;
4) большая чувствительность.
Реакции взаимодействия между антителом (АТ) и соответствующим
ему антигеном (АГ) протекают в две фазы:
1-ая фаза – специфическая – определяется взаимодействием между
вариабельными антигенсвязывающими участками, расположенными в Fabфрагментах антител, и детерминантными группами на поверхности антигена.
2-ая фаза – неспецифическая – в ходе нее образовавшийся комплекс
«антиген-антитело» взаимодействует с неспецифическими факторами среды,
в которой происходит реакция.
В зависимости от природы данных неспецифических факторов
взаимодействие АГ-АТ ведет к формированию различных по своему
проявлению реакций (таблица 1).
Соответственно, по данному признаку все иммунологические реакции
могут быть классифицированы на:
- двухкомпонентные реакции, участие в которых принимают только
антитела и антигены – реакции агглютинации и преципитации;
- реакции с использованием «метки», присоединяемой к одному из
компонентов реакции и облегчающих ее регистрацию оптическими или
иными приборами, – реакции иммунофлюоресценции, радиоиммунный,
иммуноферментный анализ и др.;
5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- многокомпонентные реакции, включающие факторы, позволяющие
оценить биологические эффекты образующегося комплекса «антигенантитело», – реакция комплементзависимого лизиса и реакция связывания
комплемента, опсонно-фагоцитарная реакция, реакция нейтрализации и др.
Таблица 1 – Разновидности реакции «антиген-антитело»
Специфические
компоненты
Неспецифические
компоненты
Происходящие реакции
Антиген,
Антитело
Электролиты
Агглютинация, преципитация
То же
Флюоресцеины
Иммунофлюоресценция
То же
Ферменты
Иммуноферментная реакция
То же
Радиоактивные изотопы Радиоиммунная реакция
То же
Комплемент
Иммунный лизис, реакция связывания
комплемента
То же
Фагоциты
Опсонно-фагоцитарная реакция
То же
Культура клеток,
лабораторное животное
Реакция нейтрализации
Названные выше реакции «антиген-антитело» выполняются для
определения наличия или отсутствия неизвестного компонента по известному
(таблица 2) и могут использоваться:
1) для поиска антител – в качестве источника АТ в данном случае
используется сыворотка человека или животного; в качестве АГ выступают
молекулы или клетки с известной антигенной характеристикой
(диагностикумы);
2) для идентификации макромолекул, про- или эукариотических
клеток – в качестве источника АТ служит сыворотка содержащая антитела
известной специфичности (д и а г н о с т и ч е с к а я
с ы в о р о т к а ); в
качестве АГ – анализируемые молекулы или частицы.
Кроме того, методы иммуноанализа можно классифицировать по
способу осуществления:
1) жидкофазные или твердофазные;
2) ручные, полуавтоматические или автоматические;
3) с разделением (гетерогенные) или без разделения (гомогенные);
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4) с экстракцией или без экстракции.
Таблица 2 – Применение реакции «антиген-антитело»
Цель
исследования
Антиген
Антитело
Положительный результат
реакции
Поиск антител
(серодиагностика)
Известный
(диагностикум)
Неизвестное
(исследуемая
сыворотка)
В сыворотке есть антитела к
известному антигену
Определение
антигена
(идентификация)
Неизвестный
Известное
(диагностическая
сыворотка)
Изучаемый антиген
соответствует антителам
известной специфичности
Дальнейшее развитие методик иммуноанализа необходимо для решения
следующих задач:
1) расширение круга определяемых соединений;
2) повышение чувствительности;
3) расширение рабочего диапазона концентраций;
4) сокращение времени проведения анализа;
5) развитие внелабораторных и домашних диагностикумов;
6) разработка методик одновременного определения нескольких
веществ или объектов;
7) производство реагентов и наборов с большим сроком хранения в
неблагоприятных условиях;
8) государственная и межгосударственная стандартизация.
1.1 Реакция агглютинации
Реакция агглютинации (РА) – это слипание и выпадение в осадок
крупных корпускулярных антигенов (обычно про- или эукариотических
клеток) под действием специфических антител в присутствии электролита
(изотонического раствора хлорида натрия). Образовавшийся в результате РА
осадок называют а г г л ю т и н а т о м .
Реакция агглютинации может проводиться в двух вариантах:
качественном – результат оценивается по принципу (+) или (-); или
количественном – результат оценивается последним титром (кратностью
разведения) антител, еще способным вызывать реакцию агглютинации.
7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1.1.1 Реакция агглютинации для выявления антител (реагинов) в
сыворотке крови при диагностике сифилиса
Введение. В ответ на микробную инвазию в макроорганизме
происходит выработка специфических антител, направленных на
инактивацию его структурных и секретируемых антигенов. В частности, в
динамике развития сифилиса в организме больного наблюдается появление
антителоподобных веществ – «реагинов», взаимодействующих с
кардиолипином, холестерином и лецитином. Соответственно, для быстрого
выявления подобных веществ в сыворотке/плазме обследуемых лиц
проводится
серологическое
исследование
с
использованием
«кардиолипиновых» диагностикумов, одним из которых являются
корпускулярные частицы, состоящие из 0,003 % кардиолипина, 0,09 %
холестерола, 0,020-0,022 % лецитина, а также стабилизирующих добавок,
консерванта и красителя толуидинового красного, облегчающего визуальную
регистрацию результатов реакции (тест-система TRUST – Toluidine Red
Unheated Serum Test, США, Universal HealthWatch Inc.).
Цель работы: Изучить реакцию агглютинации для выявления антител
на примере серодиагностики сифилиса.
Методика выполнения работы.
1) Одноразовой пипеткой осуществите взятие исследуемого материала
(сыворотки крови) из пробирки. Для этого пипетку зажмите между большим
и указательным пальцем около запечатанного конца; опустите ее в пробирку
до тех пор, пока открытый конец пипетки не окажется ниже поверхности
пробы; при разжимании пальцев необходимый объем анализируемой
сыворотки крови оказывается в пипетке.
2) Исследуемую сыворотку нанесите на испытательную карточку. Для
этого, держа пипетку в вертикальном положении над поверхностью
испытательной карточки, нажмите на пипетку, выдавив одну каплю
(приблизительно 50 мкл) в границах кружка.
3) Таким же образом в соседние кружки внесите заведомо отрицательную и заведомо положительную контрольные сыворотки.
4) В соответствии с внесенными пробами рядом с кружками на
карточке поставьте обозначения: О (опыт); К- (отрицательный контроль); К+
(положительный контроль).
5) К флакону, содержащему TRUST-антиген, прикрепите дозирующую
иглу; аккуратно взболтайте флакон с целью равномерного распределения
окрашенных частиц во всем объеме реагента; повернув флакон в
вертикальном положении иглой вниз, выдавите на каждый содержащий
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пробу испытательный кружок по две капли TRUST-антигена. Внимание! Не
позволяйте игле флакона контактировать с пробами.
6) Запечатанным концом одноразовых пипеток (отдельных для каждой
пробы) плавными круговыми движениями осуществляйте смешивание
исследуемых сывороток и TRUST-антигена в течение 3-5 минут.
7) После этого оцените результат реакции:
- положительный – характеризуется агрегацией TRUST-антигена под
действием реагинов сыворотки крови с формированием красноокрашенных
хлопьев на белом фоне карточки тестирования;
- отрицательный – характеризуется равномерным оттенком пробы от
розового до светло-красного без агрегации.
Результат реакции зарисуйте и оформите в виде таблицы 3.
Таблица 3 – Реакция агглютинации при серодиагностике сифилиса
Выявление реагинов с
использованием
TRUST-антигена
Тестируемые сыворотки
Исследуемая
сыворотка
Положительный
контроль
Отрицательный
контроль
Результаты реакций
(рисунок)
В заключение следует отметить, что использованная реакция в силу
низкой специфичности кардиолипинового антигена может давать
ложноположительные результаты при некоторых болезнях и состояниях,
таких как мононуклеоз, лепра, малярия, красная волчанка, некоторые
аутоиммунные болезни, беременность и др. В этой связи реакция на
выявление реагинов с использованием TRUST-антигена служит лишь
первичным и ориентировочным тестом, после которого положительные
сыворотки должны стать предметом дальнейшего изучения.
1.1.2 Реакция агглютинации на стекле для выявления антигена при
определении серотипа кишечной палочки (Escherichia coli)
Введение. При идентификации многих бактериальных культур
окончательное решение об их таксономическом положении может быть
вынесено только после изучения их антигенного строения. При этом
диагностические реакции могут быть направлены на выявление в и д о в ы х
антигенов (т.е. позволяющих отнести исследуемый микроорганизм к
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
определенному виду) или т и п о в ы х антигенов (т.е. позволяющих
проводить
внутривидовую
идентификацию
микроорганизмов
с
установлением их серотипов). Вид и серотип с диагностическими целями
определяют у сальмонелл, шигелл, стрептококков, менингококков и
некоторых других бактерий.
Подобное исследование проводят в реакции агглютинации с чистой
культурой выделенного микроорганизма (антиген) и диагностическими
сыворотками (антитела известной специфичности). При выяснении тонких
деталей антигенного строения исследуемого микроорганизма (антигена)
используют монорецепторные адсорбированные или моноклональные
диагностические сыворотки.
Цель работы: Изучить метод агглютинации на стекле для выявления
бактериальных антигенов на примере определения серотипа кишечной
палочки (Escheriсhia coli).
Методика выполнения работы.
1) На обезжиренное предметное стекло одноразовыми пипетками
нанесите по две капли диагностических сывороток ОКВ, ОКС, ОКД и ОКЕ к
различным группам О- и К-антигенов кишечной палочки и каплю
изотонического раствора хлорида натрия так, чтобы между каплями было
достаточное расстояние, исключающее возможность их смешивания.
2) Маркером отметьте на стекле специфичность каждой из нанесенных
сывороток и контрольную зону – изотонический раствор хлорида натрия –
контроль антигена на исключение спонтанной агглютинации исследуемой
культуры.
3) Бактериологической петлей снимите исследуемую культуру с
плотной питательной среды, внесите ее в каплю изотонического раствора
хлорида натрия и в одну из капель типовой диагностической сыворотки,
после чего тщательно размешайте ее до образования гомогенной взвеси.
Внимание!
После
каждой
подобной
манипуляции
прожигайте
бактериологическую петлю над огнем спиртовки, что должно исключить
перенос даже следовых количеств одной типовой диагностической сыворотки
к другой, а также к контролю антигена.
4) Через 1-3 минуты учтите результат реакции агглютинации. При
правильной постановке реакции в капле с контролем антигена наблюдается
равномерная муть. Результат считают положительным, если в капле, где
культура смешана с сывороткой, появились белый хлопья агглютината на
прозрачном фоне. При отрицательном результате реакции в капле будет
равномерная муть как в контроле антигена.
Результат реакции зарисуйте и оформите в виде таблицы 4.
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица
4
Определение
серотипа
кишечной
палочки
Результаты
реакций
(рисунок)
–
Реакция агглютинации при определении
характеристики Escherichia coli
Контроль
антигена
антигенной
Использованные диагностические сыворотки
ОКВ
ОКС
ОКД
ОКЕ
1.1.3 Реакция гемагглютинации при определении группы крови
человека
Введение. Обусловленное реакцией АГ-АТ видимое слипание
эритроцитов называется г е м а г г л ю т и н а ц и е й (ГА). Механизм ГА
определяется первичным связыванием специфических АТ с антигенными
детерминантами на поверхности эритроцитов, что вызывает деформацию их
клеточных мембран и исчезновение дзета-потенциала, в норме
препятствующего спонтанной агрегации данных клеток. Эритроциты
сближаются так, что поли- или бивалентные АТ образуют перекрестные связи
с различными эритроцитами (рисунок 1а). Опосредованное АТ образование
множественных поперечных связей между эритроцитами приводит к
формированию их крупных конгломератов и макроскопически выражается
как гемагглютинация. С использованием ГА можно выявлять антитела к
различным антигенам мембраны эритроцитов и, соответственно, сами
эритроцитарные антигены.
В частности, реакция гемагглютинации лежит в основе определения
групп крови человека по наличию агглютиногенов (антигенов) системы АВО
на мембране эритроцитов, а также агглютининов (антител) – белков
глобулярной фракции плазмы/сыворотки крови. Различные комбинации
агглютининов и агглютиногенов формируют четыре группы крови (таблица
5).
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 1 – Принципиальная схема формирования реакции гемагглютинации
(а) и непрямой гемагглютинации (б). Обозначение: большие
заштрихованные круги – эритроциты, квадраты – собственные
антигены эритроцитов, маленькие черные круги – антигены иной
специфичности, фиксированные на поверхности эритроцитов
Таблица 5 – Эритроцитарные агглютиногены и сывороточные агглютинины
разных групп крови человека
Группы крови
Агглютиногены
Агглютинины
I
-
αβ
II
А
β
III
В
α
IV
АВ
-
Цель работы: Изучить метод гемагглютинации для определения групп
крови человека.
Методика выполнения работы.
1) На планшет для определения групп крови в два ряда
соответствующих (обозначенных) лунок внесите по одной капле стандартных
гемагглютинирующих сывороток из двух разных серий.
Примечания
1 Сыворотка, содержащая изогемагглютинины α и β, окрашена в
желтый; только α – в красный; только β – в зеленый цвет.
2 Сыворотки, хранящиеся в холодильнике, должны быть
предварительно прогреты до комнатной температуры.
12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2) Исследуемую гепаринизированную или цитратную кровь нанесите
по капле рядом с гемагглютинирующими сыворотками, не допуская
возможности контакта пипетки с кровью с каплями сывороток. Объемное
соотношение гемагглютинирующей сыворотки и исследуемой крови должно
составлять 10:1.
3) Стеклянной палочкой смешайте сыворотку и кровь в каждой
лунке, тщательно протирая ее после каждого смешивания.
4) Плавно покачивая планшет проинкубируйте его при комнатной
температуре в течение 5 минут, после чего в те капли, где произошла
гемагглютинация (выпали крупные хлопья эритроцитов) добавьте по одной
капле физиологического раствора NaCl для исключения случаев ложной ГА.
5) Учтите результат реакции гемагглютинации, сделайте вывод о
группе исследуемой крови, используя рисунок 2.
Рисунок
2
–
Определение группы
агглютинации
крови
по
результатам
реакции
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Внимание! В случае если с использованием сывороток из двух разных
серий получены различные результаты ГА, исследование признается
ошибочным. Исследование необходимо повторить.
В случае если гемагглютинация произошла во всех лунках (кровь
предположительно относится к IV группе) необходимо в нижнюю, ранее
незадействованную лунку планшета внести сыворотку IV группы и
исследуемую кровь отнести к IV группе только, если и в этом случае реакция
гемагглютинации даст отрицательный результат. Если результат ГА
положителен, исследование признается ошибочным.
Результат реакции зарисуйте и оформите в виде таблицы 6.
Таблица 6 – Использование реакции гемагглютинации для определения
группы крови
Сыворотки, содержащие
гемагглютинины
αβ
β
α
Выявленные
антигены
эритроцитов
Группа крови
1 серия
2 серия
1.1.4 Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации при
определении титра антител к возбудителю кори для оценки
напряженности противокоревого иммунитета
Введение. Реакция непрямой агглютинации (РНГА), называемая иногда
также реакцией пассивной гемагглютинации (РПГА), основана на
способности эритроцитов, адсорбировавших на своей поверхности
растворимый антиген (т.н. эритроцитарные диагностикумы), вступать в
реакцию
агглютинации
при
взаимодействии
с
антителами
к
адсорбированному антигену (рисунок 1б). Таким образом, специфичность
данной
реакции
определяется
взаимодействием
адсорбированных
(неэритроцитарных) антигенов и соответствующих им антител. В то же время
видимым результатом реакции является склеивание и осаждение
эритроцитарного диагностикума, что существенно облегчает ее визуальную
регистрацию.
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
РНГА обычно проводят в количественном варианте, результат которого
оценивается последним титром (кратностью разведения – 1:10; 1:20 и т.д.)
антител, еще способным вызывать реакцию непрямой гемагглютинации. Для
этого исследуемую сыворотку прогревают 30 мин при 56 ºС для инактивации
белков системы комплемента, истощают эритроцитами использованными для
создания диагностикума в течение 1 часа при 37 ºС для удаления
неспецифических гемагглютининов и затем разводят изотоническим
раствором хлорида натрия до концентрации от 1:10 до 1:1280 от исходного,
создавая серию последовательных разведений в U-образных лунках
титрационной пластины. К каждому разведению сыворотки добавляют
равный объем 1 % эритроцитов с адсорбированным на их поверхности
антигеном. Учет результата проводят через 2 часа инкубации при 37 ºС и
вторично через 16-20 часов инкубации при комнатной температуре.
Наиболее часто реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации
используется для выявления специфических антител в сыворотке крови при
оценке напряженности поствакцинального иммунитета к ряду инфекций, для
которых разработаны методы плановой иммунизации: столбняке, дифтерии,
кори, эпидемическом паротите и др. Выявляемые титры антител в данном
случае позволяют оценить уровень защищенности вакцинированного
организма от действия возбудителей этих инфекционных заболеваний или их
токсинов.
Цель работы: Изучить реакцию непрямой (пассивной) гемагглютинации
на примере определения титра антител к возбудителю кори.
Методика выполнения работы (демонстрация).
1) Рассмотрите планшет для постановки реакции РHГА и оцените
результат реакции в отдельных лунках. Оценка результата зависит от
характера осадка эритроцитов (рисунок 3). При резко положительной реакции
(3 плюса) эритроциты равномерно покрывают всю лунку пластины в виде
«зонтика» с неровными краями; при реакции на 2 плюса на фоне склеившихся
эритроцитов в центре имеется небольшое кольцо из осевших под действием
силы тяжести, но несклеившихся эритроцитов; несколько меньшую степень
агглютинации с большим количеством несклеившихся эритроцитов
оценивают как положительную реакцию на 1 плюс; при отрицательной
реакции скопление эритроцитов имеет вид маленького диска («пуговки»).
Контролем специфичности реакции служит результат РПГА с заведомо
иммунными сыворотками с установленным титром (положительный
контроль). Контролем спонтанной агглютинации эритроцитов служат лунки
со взвесью сенсибилизированных эритроцитов в неиммунной «нормальной»
сыворотке (отрицательный контроль). Титром РНГА считается последнее
разведение исследуемой сыворотки, еще вызывающей склеивание
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
сенсибилизированных эритроцитов на 1 плюс при полном просветлении
надосадочной жидкости.
Рисунок 3 – Результат реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации
2)
Учтите результат РНГА и внесите полученные данные в таблицу 7.
Таблица 7 – Результат реакции непрямой (пассивной) гемагглютинации при
определении титра антител к возбудителю кори
Результат РHГА в титре
Исследуемые сыворотки
1:10
1:20
1:40
1:80
1:160
1:320
1:640 1:1280
Контроль(+)
Контроль(-)
Обследуемый А
Обследуемый В
Обследуемый С
3) Дайте оценку результату РНГА, если известно, что титр антител к
возбудителю кори 1:10 и менее оценивается как «ниже защитного»; при титре
от 1:20 до 1:40 констатируется низкий уровень защищенности; средний – при
титре от 1:80 до 1:160, а высокий уровень специфической защиты
устанавливается при регистрации титра антител на уровне 1:320 и более.
16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1.2 Реакция преципитации
Реакция п р е ц и п и т а ц и и (РП), будучи сходной с реакцией
агглютинации по механизму своего формирования (специфическое
взаимодействие детерминантных групп антигенов и активных центров
антител в присутствии электролита с формированием нерастворимого
комплекса
«антиген-антитело»,
в
данном
случае
называемого
п р е ц и п и т а т о м ), в то же время отличается от нее размером частиц
антигена. Как уже было указано в п.1.1, антигеном в реакции агглютинации
являются крупные корпускулярные частицы – обычно про- или
эукариотические клетки; в реакции же преципитации антиген представлен
одиночными молекулами – растворимыми веществами белковой или
липополисахаридной природы – полными антигенами или даже гаптенами.
В силу того обстоятельства, что преципитат в растворе оказывается
плохо различим, реакцию преципитации обычно проводят в агаре/геле, что
обеспечивает фиксацию образующегося комплекса в зоне эквимолярного
соотношения антиген-антитело и облегчает его последующую визуальную
регистрацию. Основными методами проведения реакции преципитации
являются встречная преципитация (качественный анализ) и радиальная
иммунодиффузия (количественный анализ).
1.2.1 Реакция преципитации для определения токсигенности
Corynebacterium diphteriae
Введение. Возбудитель дифтерии (Corynebacterium diphteriae) обладает
способностью к образованию экзотоксина – термолабильного белка,
являющегося основным фактором его патогенности. Биосинтез токсина
находится под контролем tox-генов, ассоциированных с умеренным
профагом. Соответственно, феномен токсинообразования является частным
примером лизогенной конверсии и наблюдается не у всех представителей
данного бактериального вида. В силу данного обстоятельства определение
способности к токсинообразованию является важным диагностическим
тестом, позволяющим дифференцировать патогенные и непатогенные
биовары C.diphteriae.
Классическим методом определения способности C.diphteriae к
токсинообразованию in vitro является реакция встречной преципитации в
геле. Метод основан на взаимодействии антигена (токсина) с антителом
(антитоксической сывороткой) в агаризованной среде, одновременно
являющейся питательной средой для C.diphteriae.
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
При постановке данной реакции на питательную среду, разлитую по 1215 мл в чашки Петри (необходимое условие – среда должна быть абсолютно
прозрачной!) укладывают полоски фильтровальной бумаги размером 1,5*8
см, которые в дальнейшем равномерно смачивают противодифтерийной
антитоксической сывороткой (125 антитоксических единиц – АЕ в объеме
0,25 мл). Испытуемые культуры коринебактерий засевают полосками или
бляшками на расстоянии друг от друга 0,8-1,0 см и от края полоски
фильтровальной бумаги на расстоянии 0,5-0,7 см. Между двумя бляшками
испытуемых культур засевают бляшки заведомо токсигенного штамма
(положительный контроль реакции). Учет результата реакции проводят через
24 и 48 часов после инкубации в термостате при 37 ºС. Образующийся
преципитат фиксируется в среде в виде мутных полос по бокам от
токсигенной культуры – так называемые «усы» преципитации (рисунок 4).
Рисунок
4
–
Результат реакции преципитации
токсигенности C.diphteriae
при
определении
Цель работы: Изучить реакцию преципитации в агаре на примере
определения токсигенности Corynebacterium diphteriae.
Методика выполнения работы.
1) Рассмотрите чашку Петри с посевом C.diphteriae, исследуемых на
токсигенность методом встречной преципитации в агаре, и учтите результат
реакции у различных культур. Испытуемую культуру оцените как
токсигенную, если линии преципитации четки и сливаются с линиями
контрольного (токсигенного) штамма. Если линии преципитации отсутствуют
или перекрещиваются с линиями контрольного штамма, испытуемую
культуру считают нетоксигенной (рисунок 5).
18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 5 – Результат реакции преципитации в зависимости от степени
идентичности антигенов
2) Зарисуйте результат реакции и дайте следующие обозначения:
- полоска фильтровальной бумаги, пропитанная антитоксической
сывороткой;
- линии преципитации;
- контрольные (токсигенные) культуры C.diphteriae;
- испытуемые культуры C.diphteriae, в том числе tox+ и tox-.
1.2.2 Реакция преципитации для определения концентрации
иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови человека
Введение. В основе данного исследования лежит метод радиальной
иммунодиффузии (РИД), базирующийся на измерении диаметра колец
преципитации, образующихся при внесении исследуемых образцов антигена
в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована
соответствующая моноспецифическая антисыворотка (рисунок 6). Диаметр
образующегося кольца преципитации прямо пропорционален концентрации
исследуемого антигена, что позволяет проводить его количественный анализ
в исследуемых пробах. В качестве антигенов в данной реакции могут
использоваться и сами иммуноглобулины разных классов, выступающие в
данном случае как белковые молекулы с определенной антигенностью. При
этом сыворотки против тяжелых цепей (Н) IgG, IgM и IgA всегда
19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
взаимодействуют только с иммуноглобулинами соответствующего класса,
что позволяет проводить их количественный анализ в сыворотке крови.
Рисунок 6 – Результат реакции радиальной иммунодифузии для определения
концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови человека
При проведении данной реакции на стеклянные пластины или на
специальные чашки для постановки РИД наносят смесь 3 % агара в 0,1М
веронал-мединаловом
буфере
рH=8,56
с
равным
объемом
моноспецифической сыворотки, в которой концентрация антител в два раза
превышает рабочий титр в РИД, указанный на ампуле. В слое агара
пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от
другой. На пластине делают несколько рядов лунок, после чего в лунки
первого ряда с помощью микрошприца вносят по 2 мкл стандартной
сыворотки с известным содержанием отдельных классов иммуноглобулинов
– неразведенной, а также в разведениях 1:2; 1:4 и 1:8. Лунки следующих
рядов заполняются исследуемыми сыворотками (также в объеме 2 мкл). При
определении концентрации IgG и IgA пластины инкубируют во влажной
камере в течение 24 часов при плюс 4 ºС, а при определении IgM – в течение
48 часов. По окончанию инкубации измеряют диаметры колец преципитации.
Цель работы: Изучить реакцию преципитации (радиальной
определения
содержания
иммунодиффузии)
для
количественного
иммуноглобулинов разных классов в сыворотке крови человека.
Методика выполнения работы.
1) С использованием специальной лупы с делениями ценой 0,1 мм на
темном фоне при косом освещении проведите замер диаметров
20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
образовавшихся колец преципитации вокруг контрольных и опытных лунок.
Определенные значения внесите в таблицу 8.
2) На полулогарифмической бумаге постройте калибровочную
прямую,
выражающую
зависимость
между
концентрацией
иммуноглобулинов и диаметрами колец преципитации. Для этого по оси
абсцисс отложите определенные значения диаметров колец преципитации,
сформированных различными разведениями стандартной сыворотки, а по оси
ординат – известное количество иммуноглобулина (в МЕ/мл или мг/мл),
содержащееся в каждом разведении стандартной сыворотки. Образовавшиеся
точки соедините прямой.
Пример построения калибровочной прямой приведен на рисунке 7.
Рисунок 7 – Калибровочная прямая для определения концентрации
иммуноглобулинов в сыворотке крови человека. По оси
абсцисс – диаметр колец преципитации; по оси ординат –
концентрация иммуноглобулинов в мг/мл (Y1) или МЕ/мл
(Y2)
3) Для определения концентрации иммуноглобулинов в исследуемой
сыворотке на оси абсцисс отложите диаметр сформированного ей кольца
преципитации, после чего восстановите из нее перпендикуляр до пересечения
с калибровочной прямой и точку пересечения спроектируйте на ось ординат.
21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Полученное значение соответствует концентрации иммуноглобулина
определяемого класса, выраженной величинами МЕ/мл или мг/мл.
4) После проведения подобных вычислений внесите определенные
значения концентрации иммуноглобулинов в таблицу 8.
Таблица 8 – Результат определения концентрации иммуноглобулинов класса
G в сыворотке крови методом радиальной иммунодиффузии
Изученные пробы
Диаметры колец
преципитации (мм)
Концентрация иммуноглобулинов
МЕ/мл
мг/мл
Стандарт
Стандарт 1:2
Стандарт 1:4
Стандарт 1:8
Обследуемый А
Обследуемый В
Обследуемый С
5) Дайте оценку полученным результатам, если известно, что в норме
содержание иммуноглобулинов класса G 6-16 мг/мл.
1.3 Реакции «антиген-антитело» с использованием «метки»
Для повышения четкости и объективизации результата реакции
«антиген-антитело» предложено осуществлять связывание ее компонентов с
«метками», позволяющими проводить учет результата реакции не только
визуально, но и с помощью специально созданных для этого оптических или
иных приборов. При этом коньюгирование «метки» может проводиться как с
основными компонентами реакции «антиген-антитело», так и с
дополнительными
выявляющими
компонентами,
например,
с
антииммуноглобулиновыми антителами.
В зависимости от природы используемых «меток», в качестве которых
могут выступать флюоресцирующие вещества, радиоактивные изотопы,
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ферменты и т.д., в настоящее время разработаны соответственно
иммунофлюоресцентный, радиоиммунный, иммуноферментный и другие
методы исследования.
В свою очередь, среди ряда реакций (например, радиоиммуная,
иммуноферментная) выделяют к о н к у р е н т н ы й и н е к о н к у р е н т н ы й
методы исследования.
1.3.1
Реакция
иммунохроматографии
хорионического гонадотропина в моче
для
выявления
Введение. Хорионический гонадотропин (ХГЧ) – гонадотропный
гормон плаценты, по химическому строению являющийся гликопротеином с
молекулярной массой 36700 Д, вырабатывается клетками хориона (оболочки
зародыша). На основании анализа крови на β-ХГЧ можно определить
присутствие в организме хориальной ткани, а значит – беременность
женщины. Диагностировать беременность можно и по содержанию ХГЧ в
моче с помощью домашних тестов определения беременности, в основе
которых лежит метод иммунохроматографии.
Используемая
при
проведении
данного
исследования
хроматографическая полоска имеет область иммобилизированных на твердой
фазе антител к ХГЧ (опытная зона) и область иммобилизированных антител к
моноклональным иммуноглобулинам, коньюгированным с коллоидным
золотом (контрольная зона). При прохождении тестируемой пробы через
специальную адсорбирующую прокладку, коньюгированные (меченые)
антитела связываются с ХГЧ, образуя комплекс «антиген-антитело». Данный
комплекс движется под воздействием капиллярных сил вдоль
хроматографической полоски и формирует окрашенную полосу в опытной
зоне за счет связывания входящего в комплекс «антиген-антитело» ХГЧ с
фиксированными здесь антителами. Если антиген отсутствует, полоса не
образуется. В контрольной зоне происходит связывание коньюгированных
антител с иммобилизированными антителами к ним, что указывает на
правильность проведенного исследования – полоса должна образовываться и
при положительном и при отрицательном результате анализа (рисунок 8).
Цель работы: Изучить метод иммунохроматографии для выявления
хорионического гонадотропина в моче.
Методика выполнения работы.
1) Вскройте пакетик и достаньте тест-полоску.
2) Поместите тест в мочу до уровня, обозначенного стрелками.
3) Достаньте тест из мочи и положите его на ровную сухую
поверхность.
4) Оцените результат через 1-5 минут, но не позднее 10 минут.
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5) Произведите учет результатов. Отрицательным считается результат
при появлении одной окрашенной полосы в контрольной зоне
хроматографической полоски (рисунок 8а). Положительным считается
результат при появлении двух окрашенных полос в опытной и контрольной
зонах хроматографической полоски (рисунок 8б).
а
б
Рисунок 8 – Отрицательный (а) и положительный (б) результаты реакции
иммунохроматографии при выявлении ХГЧ
6) Результат реакции зарисуйте и оформите в виде таблицы 9.
Таблица 9 – Выявление хорионического гонадотропина в моче
Исследуемый
материал
Используемый
метод
Hаличие окрашенных полос
в контрольв опытной
ной зоне
зоне
Результат
реакции
Пациентка А
Пациентка В
1.3.2 Реакция иммунофлюоресценции для выявления Chlamydia
trachomatis в пробах из цервикального канала (у женщин) или уретры (у
мужчин)
Введение. Выявление облигатного внутриклеточного паразита
Chlamydia trachomatis в пробах из цервикального канала (у женщин) или
уретры (у мужчин) возможно методом иммунофлюоресценции с
использованием моноклональных мышиных антител, специфичных к
белковым антигенам всех серотипов данного паразита, меченных
флюоресцеинизотиоционатом (ФИТЦ).
Для проведения реакции на фиксированный мазок наносят 30 мкл
раствора хламидийных антител, полностью покрывая 8 мм лунку
предметного стекла, и помещают его во влажную камеру при температуре
37 ºС на 15-20 минут. Затем мазок промывают. Препарат полностью
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
высушивают при комнатной температуре, наносят каплю монтирующей
жидкости, покрывают обезжиренным покровных стеклом и удаляют лишнюю
монтирующую жидкость.
Цель работы: Изучить метод иммунофлюоресценции для выявления
Chlamydia trachomatis в пробах из цервикального канала (у женщин) или
уретры (у мужчин).
Методика выполнения работы.
1) Исследуйте мазок в люминесцентном микроскопе при увеличении
× 600- × 1000 с системой фильтров, обеспечивающих возбуждающий свет с
длиной волны не более 490 нм и эмиссию со средней длиной волны не более
590 нм.
2) Оцените результат реакции, учитывая, что результат считают
положительным, если во всем препарате определяется не менее 10 яркозеленых элементарных (в виде точки) или ретикулярных (в виде овала) телец
хламидий, четко выделяющихся на красном фоне контрастно окрашенных
клеток или на темном фоне препарата. Результат считают отрицательным,
если в мазке не выявляются хламидийные тельца при наличии не менее 15-20
эпителиальных клеток.
3) Зарисуйте препараты, содержащие положительный и отрицательный
результаты реакции, указав на них тельца хламидий и клетки животного
происхождения.
для
1.3.3
Неконкурентный
иммуноферментный
анализ
количественного определения альфа-фетопротеина в сыворотке крови
человека
Введение. Альфа-фетопротеин (АФП) – гликопротеин с молекулярной
массой около 70000 Д, повышение концентрации которого в сыворотке крови
наблюдается при беременности, а также при некоторых онкологических
заболеваниях, что позволяет использовать АФП в качестве «онкомаркера»,
являющегося ранним признаком злокачественного роста и позволяющего
осуществлять контроль эффективности противоопухолевой терапии.
Для количественного определения АФП в сыворотке крови широкое
применение нашел твердофазный метод иммуноферментного анализа (ИФА),
использующий принцип «сендвича». Анализ проводится в несколько стадий
(рисунок 9). На первой стадии калибровочные пробы с известной
концентрацией АФП и исследуемые образцы инкубируются в лунках
планшета с иммобилизированными на их дне высокоспецифичными
антителами к АФП, после чего планшет отмывается от непрореагировавших
антител. На следующей стадии связавшийся в лунках планшета АФП
25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
обрабатывают коньюгатом антител к АФП с пероксидазой. После отмывания
несвязавшегося коньюгата образовавшиеся иммунные комплексы «антителоАФП-коньюгат» выявляют в ферментативной реакции пероксидазы с
перекисью водорода в присутствии хромогена орто-фенилендиамина,
изменяющего свой цвет при окислении. Итоговая интенсивность окраски
хромогена, учитываемая фотометрически, пропорциональна концентрации
АФП в анализируемом образце.
Цель работы: Изучить метод твердофазного иммуноферментного
анализа для количественного определения альфа-фетопротеина в сыворотке
крови человека.
Методика выполнения работы (демонстрация).
1) Проведите регистрацию результатов анализа фотометрически при
длине волны 450 нм. (Измерение оптической плотности (ОП) проводят в один
прием во всех лунках не более чем через 30 минут после остановки реакции).
Определенные значения ОП внесите в таблицу 10.
Таблица 10 – Результаты количественного определения альфа-фетопротеина в
сыворотке крови человека методом ИФА
Исследованные пробы
Значения ОП450
Концентрация АФП
МЕ/мл
Контроль
10МЕ/мл
X
Контроль
50МЕ/мл
X
Контроль
100МЕ/мл
X
Контроль
200МЕ/мл
X
Контроль
400МЕ/мл
X
нг/мл
Пациент А
Пациент В
Пациент С
2) На основе определенных значений в контрольных лунках постройте
калибровочный график в координатах: ось абсцисс – концентрация АФП
(МЕ/мл); ось ординат – оптическая плотность (ОП450) в диапазоне от 0 до
400 МЕ/мл; последовательно соедините отмеченные точки отрезками прямой.
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1.
2.
3. отмывка
4.
5. отмывка
6.
Обозначения:
Рисунок
9
-
антитела
- пероксидаза
-
АФП
- хромоген не окисленный
-
антиген иной специфичности
- хромоген окисленный
–
Этапы выполнения иммуноферментного анализа при
определении альфа-фетопротеина в сыворотке крови
человека
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3) Определите концентрацию АФП в исследуемых образцах, нанеся
полученные значения ОП на калибровочный график. Для выражения
результатов в нг/мл значения, полученные по шкале МЕ/мл необходимо
умножить на коэффициент 1,25.
4) Дайте оценку полученным результатам, учитывая, что в норме у
мужчин и небеременных женщин концентрация АФП в крови составляет от 0
до 12,5 нг/мл. Концентрация АФП более 100 нг/мл является достоверным
лабораторно-диагностическим признаком наличия гепатом и тератокарцином,
при этом у 72% больных гепатоцеллюлярным раком уровень АФП может
достигать 1000 нг/мл.
иммуноферментный
анализ
для
1.3.4
Конкурентный
количественного определения кортизола в сыворотке крови человека
Введение. Кортизол – стероидный гормон с молекулярной массой
362 Д, является одним основных представителей глюкокортикоидов –
гормонов позвоночных животных и человека, вырабатываемых корой
надпочечников и регулирующих углеводный и белковый обмен в организме.
Глюкокортикоиды увеличивают отложение гликогена в печени и повышают
концентрацию глюкозы в крови, тормозят синтез белка в лимфоидной ткани,
мышцах, соединительной ткани, но стимулируют образование белка в печени.
Секреция глюкокортикоидов надпочечниками увеличивается под влиянием
неблагоприятных воздействий (стресс), таким образом обеспечивается
адаптация организма к изменившимся условиям внешней среды.
Для количественного определения кортизола в сыворотке крови
широкое применение нашел твердофазный метод конкурентного
иммуноферментного анализа (ИФА) (рисунок 10). Первым этапом в этом
случае будет внесение строго определенного количества меченого антигена и
различных количеств немеченого антигена в лунки планшета с
иммобилизированными на их дне высокоспецифичными антителами к
кортизолу, после чего планшет отмывается от избытка антигена.
Образовавшиеся иммунные комплексы «антитело-кортизол меченый»
выявляют в ферментативной реакции пероксидазы с перекисью водорода в
присутствии хромогена орто-фенилендиамина, изменяющего свой цвет при
окислении. Итоговая интенсивность окраски хромогена, учитываемая
фотометрически, обратно пропорциональна концентрации кортизола в
анализируемом образце.
28
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Цель работы: Изучить метод твердофазного иммуноферментного
анализа для количественного определения кортизола в сыворотке крови
человека.
Методика выполнения работы (демонстрация).
1) Проведите регистрацию результатов анализа фотометрически при
длине волны 450 нм. (Измерение оптической плотности (ОП) проводят в один
прием во всех лунках не более чем через 30 минут после остановки реакции).
Определенные значения ОП внесите в таблицу 11.
1.
2.
3. отмывка
4.
Обозначения:
-
антитела
- пероксидаза
-
кортизол
- хромоген не окисленный
- хромоген окисленный
Рисунок 10 – Этапы выполнения иммуноферментного анализа при
определении кортизола в сыворотке крови человека
29
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2) На основе определенных значений в контрольных лунках постройте
калибровочный график в координатах: ось абсцисс – концентрация кортизола
(нмоль/л); ось ординат – оптическая плотность (ОП450) в диапазоне от 0 до
1200 нмоль/л; последовательно соедините отмеченные точки отрезками
прямой.
3) Определите концентрацию кортизола в исследуемых образцах,
нанеся полученные значения ОП на калибровочный график.
4) Дайте оценку полученным результатам, учитывая, что в норме у
здоровых лиц концентрация кортизола в крови составляет от 180 до 650
нмоль/л.
Таблица 11 – Результаты количественного определения кортизола в
сыворотке крови человека методом ИФА
Исследованные пробы
Значения ОП450
Концентрация кортизола,
нмоль/л
Контроль
50 нмоль/л
X
Контроль
150 нмоль/л
X
Контроль
400 нмоль/л
X
Контроль
700 нмоль/л
X
Контроль
1200 нмоль/л
X
Пациент А
Пациент В
Пациент С
1.3.5 Иммуноферментный анализ для определения индекса
авидности иммуноглобулинов класса G к вирусу краснухи в сыворотке
крови человека
Краснуха (лат. rubella) – эпидемическое вирусное заболевание с
инкубационным периодом около 15 дней. После инкубационного периода
появляется умеренная температура с головной болью, фарингитом, шейной
аденопатией, конъюнктивитом. Высыпание появляется через 48 часов. Сыпь
преобладает на лице, в области поясницы и ягодиц, разгибательных
30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
поверхностях рук, ног. Это обычно неопасное заболевание, затрагивающее в
основном детей, но оно может спровоцировать серьёзные врожденные
пороки, если женщина заражается в начале беременности. Заболевание
краснухой обуславливает врожденные уродства у будущего ребенка в 60 %
случаев. Это – задержка в развитии, поражения зрения и слуха, врожденные
пороки сердца, поражения костей конечностей, черепа и др. Поэтому
рекомендуется проведение систематического серологического анализа у
женщин репродуктивного возраста для выявления группы риска (с
отсутствием антител к вирусу краснухи).
Выявление иммуноглобулинов класса G к вирусу краснухи с высокой
константой связывания вирусного антигена (высокой авидностью) и
иммуноглобулинов класса G с низкой константой связывания (низкой
авидностью) путем определения индекса авидности (ИА) может быть
использовано с целью диагностики острой или ранее перенесенной инфекции.
Оценка индекса авидности проводится методом неконкурентного
иммуноферментного анализа (рисунок 9). Внесение исследуемых сывороток
для взаимодействия с иммобилизованными на дне лунок планшета
антигенами производится в двух параллельных рядах и, после образования
комплекса «антиген-антитело», в один из них вносится белокдиссоциирующий агент (8М мочевина) для диссоциации комплексов
«антиген-антитело», включающих IgG с более низкими константами
связывания (низкой авидностью). Таким образом, в данном опыте проводится
одновременно прямой и диссоциирующий иммуноферментный анализ.
Цель работы: Определение индекса авидности иммуноглобулинов
класса G к вирусу краснухи в сыворотке крови человека методом
иммуноферментного анализа.
Методика выполнения работы (демонстрация).
1) Проведите регистрацию результатов анализа фотометрически при
длине волны 450 нм. (Измерение оптической плотности (ОП) проводят в один
прием во всех лунках не более чем через 30 минут после остановки реакции).
Определенные значения ОП внесите в таблицу 12.
2) На основе определенных значений рассчитайте индексы авидности
исследуемых антител по следующей формуле:
ИА =
ОП диссоц.ИФА
ОП прям.ИФА
× 100% ,
где ОП диссоц.ИФА – значения оптической плотности в лунках с внесенным
дисоциирующим агентом;
ОП прям. ИФА – значения оптической плотности в лунках без внесения
дисоциирующего агента.
Вычисленные значения ИА внесите в таблицу 12.
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3) Сделайте вывод о примерном сроке перенесенной инфекции,
учитывая, что, если индекс авидности менее 50 %, то сыворотка содержит
низкоавидные антитела, что указывает на недавно перенесенную первичную
инфекцию (заболевание первичной краснухой было 2-3 месяца назад). Если
индекс авидности более 70 %, то сыворотка содержит высокоавидные
антитела, что указывает на ранее перенесенную (более пяти месяцев назад)
инфекцию. «Серая» зона – индекс авидности IgG 50-70 %.
Таблица 12 – Результаты определения индекса авидности иммуноглобулинов
класса G к вирусу краснухи в сыворотке крови человека
Исследуемые
сыворотки
ОПдиссоц. ИФА
ОПпрям. ИФА
ИА
Примерный срок
перенесенной
инфекции
Обследуемый А
Обследуемый В
Обследуемый С
Обследуемый D
1.4 Многокомпонентные иммунологические реакции
Многокомпонентные
иммунологические
реакции,
наряду
со
специфической системой «антиген-антитело», включают дополнительные
факторы, позволяющие оценить биологические эффекты образующегося
комплекса АГ-АТ. При этом контакт данных факторов с комплексом АГ-АТ
происходит не в зоне специфического взаимодействия между
детерминантными группами антигена и активными центрами Fab-фрагментов
антител, но наиболее часто в зоне константного Fc-фрагмента
иммуноглобулинов. Подобные взаимодействия in vivo играют важную роль в
развитии многих иммунологических феноменов, в случае же их
воспроизведения in vitro проявляются в виде двух основных типов реакций:
- реакция комплементзависимого лизиса и ее вариант – реакция
связывания комплемента, в качестве дополнительного фактора включающие
систему С1-С9 компонентов комплемента сыворотки (плазмы) крови,
активируемую в данном случае по «классическому» пути;
- опсонно-фагоцитарная реакция, в качестве дополнительного
компонента включающая несущие на своей поверхности Fc-рецепторы.
32
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1.4.1 Реакция связывания комплемента
Введение. Реакция связывания комплемента (РСК) относится к
многокомпонентным иммунологическим реакциям, в которых помимо
антигенов и антител присутствуют еще дополнительные факторы – система
комплемента
и
эритроциты,
обработанные
специфическими
антиэритроцитарными антителами (вместе два последних компонента
формируют т.н. «гемолитическую систему»). Соответственно, реакция
связывания комплемента протекает в две фазы: первая – взаимодействие
антигена и антитела с участием комплемента; вторая – выявление степени
связывания комплемента с использованием гемолитической системы.
Если в исследуемой сыворотке содержатся антитела, гомологичные
использованному
при
постановке
реакции
антигену
известной
специфичности, то образующийся комплекс антиген-антитело связывает
комплемент, истощение концентрации которого делает невозможным лизис
эритроцитов в гемолитической системе (положительный результат РСК). В
случае же отсутствия в сыворотке антител, соответствующих
использованному антигену, комплемент останется свободным и принимает
участие в процессе лизиса эритроцитов (отрицательный результат РСК).
Схема постановки типичной реакции связывания комплемента
приведена в таблице 13.
Таблица 13 – Этапы постановки реакции связывания комплемента и
используемые при этом ингредиенты
Этапы
1
2
Ингредиенты
Количество, мл
Испытуемая сыворотка (инактивированная при 56°С, 30
0,5
мин) в двукратных разведениях, начиная с 1:10
Антиген в рабочей дозе
0,5
Комплемент в рабочей дозе
0,5
Встряхивание, инкубация в термостате при 37 °С в течение 1 часа
Гемолитическая система
1,0
Встряхивание, инкубация в термостате при 37 °С в течение 1 часа
Отличиями РСК при диагностике вирусных инфекций является то, что
все ингредиенты используются в уменьшенном объеме (конечный объем
пробы 1 мл = 0,2+0,2+0,2+0,4 мл), а также то, что реакцию проводят на
холоде (18 часов при 40 ºС). В частности, с использованием подобного
подхода проводится ретроспективная диагностика гриппа, основанная на
выявлении прироста титра антител в крови больного в период
реконвалесценции по сравнению с началом заболевания. В качестве
антигенов в РСК в этом случае используют вируссодержащие аллантоисные
33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
жидкости куриных эмбрионов, зараженных эталонными штаммами разных
серологических типов вируса гриппа (А, В, С и т.д.) или стандартные
диагностикумы. Парные сыворотки больного исследуют одновременно с
вирусами всех типов.
Цель работы: Изучить реакцию связывания комплемента для определения титра антител при ретроспективной диагностике гриппа.
Методика выполнения работы (демонстрация).
1) Учтите результат РСК по четырехплюсовой системе: 4 плюса –
отсутствие гемолиза эритроцитов; 3 плюса – гемолиз 25 %; 2 плюса – 50 %; 1
плюс – 75 %; полный гемолиз – отрицательная реакция (минус). Титром
испытуемой сыворотки считают наибольшее ее разведение, давшие задержку
гемолиза.
Контролями к основному опыту служат: контроль сыворотки без
антигена (0,5 мл сыворотки в наименьшем разведении + 0,5 мл комплемента
+ 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия + 1 мл гемолитической
системы); контроль антигена без сыворотки (0,5 мл антигена + 0,5 мл
комплемента + 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия + 1 мл
гемолитической системы). В данных контролях результат должен быть
отрицательным, т.е. происходит полный лизис эритроцитов.
2) Занесите полученные данные в таблицу 14.
Таблица 14 – Результат реакции связывания комплемента при определении
нарастания титра антител к различным типам вируса гриппа
Использованные
сыворотки и
диагностикумы
Результат РСК в титре
1:10
1:20
1:40
1:80
1:160
1:320
1:640
1:1280
3 день болезни/тип А
21 день болезни/тип А
3 день болезни/тип В
21 день болезни/тип В
3 день болезни/тип С
21 день болезни/тип С
контроль сыворотки
контроль антигена А
контроль антигена В
контроль антигена С
34
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3) Дайте оценку результату РСК, если известно, что четырехкратное и
более высокое нарастание титра антител во второй сыворотке по сравнению с
первой к одному из типов вируса свидетельствует о том, что заболевание
было вызвано именно данным типом вируса гриппа.
1.4.2 Опсонно-фагоцитарная реакция
Введение. Опсонно-фагоцитарная реакция (ОФР) относится к
многокомпонентным иммунологическим реакциям, в которых помимо
антигенов и антител присутствует еще дополнительный фактор – фагоцит,
осуществляющий поглощение антигенов и выполняющий, таким образом,
функцию «индикаторной системы». Несмотря на тот факт, что фагоциты
способны к спонтанному поглощению бактериальных антигенов, в иммунном
организме под влиянием антител (в данном случае обозначаемых как
что
определяется
«опсонины»)
фагоцитоз
протекает
активнее,
взаимодействием Fc-фрагментов антител с соответствующими им Fcрецепторами на мембране фагоцита. Соответственно, опсонно-фагоцитарная
реакция протекает в две фазы: первая – взаимодействие антигенов и антител;
вторая – поглощение опсонизированных бактерий фагоцитами.
Цель работы: Изучить опсонно-фагоцитарную реакцию при
диагностике бруцеллеза.
Методика выполнения работы.
1) С помощью микропипетки в пробирки внесите по 0,05 мл 2 %
цитрата натрия (антикоагулянт); 0,1 мл исследуемой крови, содержащей
антитела и фагоциты; 0,05 мл антигена – взвеси микроорганизмов (в данном
случае инактивированных бактерий рода Brucella в изотоническом растворе
хлорида натрия без консерванта), содержащей 109 клеток в 1 мл.
Внимание! Для каждого ингредиента должна быть использована
отдельная микропипетка.
2) Перемешайте содержимое пробирок, после чего проинкубируйте их
при 37 ºС в течение 30 мин. По окончании инкубации из содержимого
пробирок приготовьте мазки на предметных стеклах, которые зафиксируйте
смесью Hикифорова или метанолом и окрасьте по Романовскому-Гимзе.
3) Учтите результат ОФР. Для этого с использованием иммерсионной
микроскопии (микроскоп МБИ-12; окуляр × 10; объектив × 90) в разных полях
зрения проведите подсчет 25 нейтрофильных фагоцитов, определяя в каждом
из них количество захваченных микроорганизмов. Для исключения
повторного счета клеток просмотр препарата необходимо осуществлять по
направлению, показанному на рисунке 11.
35
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 11 – Направление движения объектива при микроскопии мазка
4) Результаты подсчета оформите в виде таблицы 15.
Таблица 15 – Результат опсонно-фагоцитарной реакции при диагностике
бруцеллеза
NN фагоцитов
Количество
захваченных
бактерий
1
2
3
4
5
6
7
8
…..
25
ПОФР
X
Группа
фагоцитов: a,b,c
или d
5) Рассчитайте показатель опоснно-фагоцитарной реакциии (ПОФР) по
формуле:
ПОФР = 3a + 2b + 1c + 0d,
где a – число фагоцитов, содержащих свыше 41 бактерии;
b – число фагоцитов, содержащих от 21 до 40 бактерий;
c – число нейтрофилов, содержащих от 1 до 20 бактерий;
d – число фагоцитов, не содержащих бактерии.
6) Оцените результат реакции по следующей схеме: при ПОФР от 50
до 75 – резкоположительный; при ПОФР от 25 до 49 – ясновыраженный; при
ПОФР от 1 до 24 – слабоположительный; у здоровых людей ПОФР
составляет 0-1, редко поднимаясь до 4-5.
Резкоположительный и ясновыраженный результаты реакции говорят о
высоком опсонизирующем действии сыворотки обследуемого с выраженной
активностью фагоцитов крови.
36
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2 Реакции, направленные на выявление и оценку
функциональной активности клеток иммунной системы
За генерацию гуморальных и клеточных механизмов иммунного ответа
ответственны соответственно В- и Т-лимфоциты. В свою очередь Тлимфоциты делятся на Т-хелперы, принимающие участие в антителогенезе и
Т-киллеры, ответственные за развитие иммунного ответа клеточного типа.
Взаимодействие данных типов клеток через пространственный контакт и
интерлейкиновые стимулы обеспечивает развитие целого спектра
иммунологических феноменов. Соответственно, оценка количественного
состава и функциональной активности лимфоцитов является важным
инструментом изучения состояния иммунной системы и выявления ее
возможных нарушений.
2.1 Реакция розеткообразования для обнаружения Т- и Влимфоцитов
Введение. В основе дифференциации и количественного определения
Т- и В-лимфоцитов в пробах крови лежат различия в рецепторном аппарате
этих клеток, расположенном на их поверхности и выявляемом с
использованием ряда методик. Классическими методами определения Т- и Влимфоцитов являются реакции розеткообразования. При этом под «розеткой»
понимается микроскопически регистрируемый комплекс, состоящий из
лимфоцита, фиксирующего вокруг себя три или более эритроцитов (рисунок
12).
Рисунок 12 – Розеткообразующие клетки
37
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Варианты реакции розеткообразования представлены в таблице 16.
Таблица 16 – Различия Т- и В- лимфоцитов крови человека по реакциям
розеткообразования
Варианты реакции розеткообразования
Т -лимфоциты
В-лимфоциты
1) Розеткообразование с эритроцитами барана (Ерозетки)
+
-
2) Розеткообразование с эритроцитами, несущими
комплекс антиген-антитело (ЕА-розетки)
-
+
3) Розеткообразование с эритроцитами, несущими
комплекс антиген-антитело-комплемент (ЕАСрозетки)
-
+
1) Метод розетокообразования с интактными эритроцитами (Е) барана
используется для определения Т-лимфоцитов. Метод основан на способности
CD-2 рецепторов Т-лимфоцитов человека спонтанно связывать эритроциты
барана с образованием Е-розеток.
2) Метод розеткообразования с эритроцитами, несущими на своей
поверхности комплекс антиген-антитело (ЕА), используется для определения
В-лимфоцитов. В основе метода лежит наличие на поверхности Влимфоцитов Fc-рецепторов к Fc-фрагментам антител, через которые
происходит непрямая фиксация эритроцитов на поверхности В-лимфоцитов с
образованием ЕА-розеток.
3) Метод розеткообразования с эритроцитами, несущими на своей
поверхности комплекс антиген-антитело-комплемент (ЕАС), используется
для определения В-лимфоцитов. В основе метода лежит существование на
поверхности В-лимфоцитов рецепторов к комплементу, через которые
происходит непрямая фиксация эритроцитов на поверхности В-лимфоцитов с
образованием ЕАС-розеток.
Цель работы: Изучить метод розеткообразования и провести подсчет
розеткообразующих лимфоцитов в препарате крови человека.
Методика выполнения работы.
1) С использованием иммерсионной микроскопии (микроскоп МБИ12; окуляр × 10; объектив × 90) проводится подсчет общего количества
лимфоцитов и отдельно – количества розеткообразующих клеток в мазке
крови человека в 100 полях зрения (один студент проводит подсчет в 10
полях зрения, после чего результаты суммируются). Для исключения
повторного счета клеток просмотр препарата осуществляйте по направлению,
показанному на рисунке 11 (см. выше).
2) Результаты подсчета оформите в виде таблицы 17.
38
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 17 – Результат подсчета розеткообразующих лимфоцитов в
препарате крови человека
Результаты подсчета
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Итого
Общее количество
лимфоцитов
Из них розеткообразующих
Процент
розеткообразующих
клеток
3) Зная, что в периферической крови человека в норме 55-60 %
составляют Т-лимфоциты и 25-30 % В-лимфоциты, попытайтесь определить,
какой из вариантов реакции розеткообразования был использован.
В заключение следует отметить, что обязательным является расчет не
только относительного, но и абсолютного количества розеткообразующих
лимфоцитов в 1 мкл крови, так как вычисление только их процента среди
всех лимфоцитов может привести к ошибке, особенно при некоторых формах
лейкозов.
2.2 Реакция бласттрансформации лимфоцитов
Введение. Реакция бласттрансформации основана на чувствительности
Т- и В-лимфоцитов к лектинам растительного происхождения, в ответ на
воздействие которых лимфоциты переходят на стадию деления и,
увеличиваясь в размерах, превращаются в «бласты» (рисунок 13). Таким
образом, при постановке данных реакций лектины выполняют функцию
поликлональных митогенов, а сами эти реакции позволяют судить о
функциональной активности лимфоцитов.
Относительная специфичность данных реакций определяется тем, что
Т-лимфоциты проявляют преимущественную чувствительность к лектину –
фитогемагглютинину (ФГА), а В-лимфоциты к лектину – митогену лаконоса
(PWM).
Цель работы: Изучить метод бласттрансформации лимфоцитов in vitro
под влиянием ФГА.
Методика выполнения работы (демонстрация).
39
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1) С использованием иммерсионной микроскопии (микроскоп МБИ12; окуляр × 10; объектив × 90) в краевой зоне препарата найдите крупные
округлые клетки, отличающиеся от интактных лмфоцитов почти вдвое
увеличенными размерами ядра, разреженностью хроматина в ядре, а также
широким слоем цитоплазмы вокруг ядра.
2) Зарисуйте препарат, указав на нем интактные лимфоциты и
лимфоциты, трансформировавшиеся в бласты.
Рисунок 13 – Бласттрансформация лимфоцитов, индуцированная митогеном
40
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Список использованных источников
1 Албертс, Б. Молекулярная биология клетки: в 3-х т. / Б. Албертс [и
др.]: пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 3 т.
2 Бурместер, Г.-Р. Наглядная иммунология / Г.-Р. Бурместер, А.
Пецутто: пер. с англ. – Бином. Лаборатория знаний, 2009. – 320 с.
3 Галактионов, В.Г. Эволюционная иммунология: учеб. пособие / В.Г.
Галактионов. – М.: ИКЦ «Академкнига», 2005. – 408 с. – ISBN 5-94628-103-8
4 Иммунологические методы / под ред. Г. Фримеля: пер. с нем. – М.:
Медицина, 1987. – 472 с.
5 Плейфер, Дж. Наглядная иммунология / Дж. Плейфер: пер с англ. –
М.: Гэотар медицина, 1998. – 95 с.
6 Ройт, А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл: пер. с англ.
– М.: Мир, 2000. – 592 с. – ISBN 5-03-003305-X
медицинской
7 Руководство
к
практическим
занятиям
по
микробиологии, вирусологии и иммунологии / под ред. акад. РАМН О.В.
Бухарина. – М.: Медицина; УрО РАН, 2002. – 342 с.
41
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Приложение А
(справочное)
Вопросы для подготовки к экзамену по дисциплине «Иммунология»
1 Иммунология как наука. История иммунологии, этапы ее развития.
2 Теории иммунитета.
3 Факторы неспецифической резистентности.
4 Организация и признаки иммунной системы.
5 Понятие об антигенах. Свойства антигенов.
6 Свойства антигенов. Специфичность. Виды эпитопов.
7 Свойства антигенов. Иммуногенность. Типы антигенов по
способности вызывать иммунный ответ.
8 Структурные основы антигенной специфичности.
9 Типы антигенной специфичности.
10 Принципиальные представления о структуре антител. Цепи,
фрагменты, домены. Понятие об авидности и аффинитете.
11 Антигенсвязывающая область антител. Силы, принимающие
участие во взаимодействии антиген-антитело.
12 Особенности строения и функции иммуноглобулинов класса G.
13 Особенности строения и функции иммуноглобулинов класса М.
14 Особенности строения и функции секреторных иммуноглобулинов
класса А.
15 Особенности строения и функции иммуноглобулинов класса E.
16 Особенности строения и функции иммуноглобулинов класса D.
17 Представления о субклассах иммуноглобулинов класса G.
18 Функции иммуноглобулинов.
19 Организация и рекомбинация генов, кодирующих легкие цепи
иммуноглобулинов.
20 Организация и рекомбинация генов, кодирующих тяжелые цепи
иммуноглобулинов.
21 Комбинационное разнообразие как механизм обеспечения
разнообразия антител.
22 Соматическое гипермутирование.
23 Генетические механизмы переключения биосинтеза классов
иммуноглобулинов. Образование растворимых иммуноглобулинов.
24 Лимфопоэз. Этапы дифференцировки Т- и В-лимфоцитов.
25 Общая характеристика Т-лимфоцитов. Локализация, рецепторы,
продолжительность жизни, функции.
26 Т-клеточный рецептор (ТКР). Структура, локализация и функции.
Особенности организации генных сегментов, кодирующих ТКР.
42
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
27 Общая характеристика В-лимфоцитов. Локализация, рецепторы,
продолжительность жизни, функции.
28 Методы обнаружения Т- и В-лимфоцитов.
29 Главный комплекс гистосовместимости. Классы, структура молекул,
локализация, функции.
30 Начальные этапы антителообразования. Процессинг антигена в Аклетках и его взаимодействие с ГКГС-II.
31 Взаимодействие А-клеток и Т-хелперов при распознавании
антигена. Пространственный контакт и интерлейкиновые стимулы.
32 Пролиферация и дифференцировка CD4-лимфоцитов. Механизмы
активации В-лимфоцитов Т-хелперами. Пространственный контакт и
интерлейкиновые стимулы.
33 Супрессия иммунного ответа. Система «идиотип-антиидиотип».
Концепция «сети» Иерне.
34 Иммунный ответ клеточного типа. Процессинг эндогенного
антигена и его взаимодействие с ГКГС I типа.
35 Иммунный ответ клеточного типа. Распознавание комплекса «ГКГС
I-антиген» CD8-лимфоцитами. Механизм разрушения клеток мишеней.
36 Реакция отторжения трансплантата. Понятие о толерантности.
37 НК-клетки. Рецепторы, функции, особенности взаимодействия с
клетками-мишенями.
38 Нежелательные формы проявления иммунитета. Аллергические
реакции немедленного и замедленного типа. Свойства аллергенов.
39 Основные характеристики гиперчувствительности I типа.
Десенсибилизация.
40 Основные характеристики гиперчувствительности II типа.
41 Основные характеристики гиперчувствительности III типа.
42 Основные
характеристики
гиперчувствительности
IV
(замедленного) типа. Туберкулиновая проба.
43 Основные характеристики гиперчувствительности V типа.
44 Комплемент. Определение, классификация компонентов, функции.
45 Классический путь активации комплемента. Этапы, регуляция.
46 Альтернативный путь активации комплемента. Этапы, регуляция.
47 Участие комплемента в развитии воспалительной реакции.
48 Реакция комплементзависимого лизиса и реакция связывания
комплемента: механизм, практическое использование.
49 Фагоцитоз. Этапы процесса и методы его оценки. Понятие об
опсонизации и опсонофагоцитозе.
50 Методы иммунологических исследований. Разновидности реакций
антиген-антитело.
51 Взаимодействие
антиген-антитело.
Реакции
агглютинации,
преципитации, гемагглютинации, непрямой гемагглютинации и тест Кумбса.
43
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
52 Диагностические реакции «антиген-антитело» с использованием
«метки».
53 Прикладные
аспекты
иммунологии:
диагностика,
вакцинопрофилактика, иммунотерапия и иммунокоррекция.
54 ВИЧ-инфекция: этиология, эпидемиология, патогенез, клиника,
диагностика, профилактика и лечение.
44
Документ
Категория
Физико-математические науки
Просмотров
65
Размер файла
799 Кб
Теги
метод, 1235, исследование, иммунологических
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа