close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

1252.Основы современных методов изучения нуклеиновых кислот

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ф Е Д Е РАЛ Ь Н О Е АГ Е Н Т С Т В О П О О БРАЗО В АН И Ю
М И Н И С Т Е РС Т В О О БРАЗО В АН И Я И Н АУ КИ РО С С И ЙС КО Й
Ф Е Д Е РАЦИ И
В оронеж ский государственный университет
О С Н О В Ы С О В РЕ М Е Н Н Ы Х М Е Т О Д О В И ЗУ Ч Е Н И Я
Н У КЛ Е И Н О В Ы Х КИ С Л О Т
У ч ебное п особи е
п осп ец и а льност и 020201 (011600) –Би ологи я
и на п ра в лени ю 020200 (510600) – Би ологи я
для ст удент ов 3,4 курсов д/о
и 1 курса ма ги ст ра т уры
В О РО Н Е Ж
2006
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2
У тверж дено научно-м етодическим советом б иолого-почвенного ф акультета
18 января 2006 г, протокол № 1.
У чеб ное пособ ие подготовлено на каф едре ф изиологии и б иохим ии
растений б иолого-почвенного ф акультета В оронеж ского государственного
ф акультета.
Реком ендовано для студентов1 курса м агистратуры б иолого-почвенного
ф акультета и 3 курса дневного об учения б иолого-почвенного ф акультета.
П о спец иальности 020201 (011600) – Биология и направлению 020200
(510600) – Биология для студентов3,4 курсовд/о и 1 курса м агистратуры
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3
О главление
П о лимер аз н ая ц епн ая р еакц ия
1.1 М еханизм полим еразной ц епной реакц ии
1.2 Д етекц ия продуктовП ЦР
1.3 П одготовка проб б иологического м атериала
1.4 О птим изац ия П ЦР-реакц ии
1.5 П роб лем ы контам инац ии при использовании П ЦР
1.6 П ЦР вреальном врем ени (Real Time PCR
1.7 Ам плиф икац ия РН К
1.8 П рим енениеП ЦР
4
4
10
12
14
16
17
20
20
К ло н ир о ван иеД Н К
2.1 П лазм идныевекторы
22
22
С еквен ир о ван иеД Н К
3.1 М етод полим еразного копирования (м етод С энгера)
3.2 Х им ическоесеквенирование(по М аксам у-Г илб ерту)
3.3 Автом атическоесеквенирование
29
29
31
34
Б ло т ин г н уклеин о вы х кисло т
4.1 В иды м олекулярной гиб ридизац ии
4.2 М етоды проведения гиб ридизац ии
4.3 Зонды, используем ыепри гиб ридизац ии
36
36
41
42
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4
П ОЛИ М Е РАЗН АЯ ЦЕ П Н АЯ РЕ АК ЦИ Я
Поли мера зна я ц еп на я реа кц и я (П ЦР) - это м етод ам плиф икац ии
ф рагм ентов нуклеиновых кислот in vitro, с пом ощ ью которого м ож но
достаточно б ыстро (втечение нескольких часов) получить м иллионы копий
определенных нуклеотидных последовательностей. М етод б ыл предлож ен в
1983 г. К. М ю ллисом и получил ш ирокое распространение с 1985 г., когда Р.
С айки с соавторам и б ыла опуб ликована основополагаю щ ая раб ота по теории
П ЦР и ее оптим изац ии. М етод П ЦР, названный «изоб ретением века» и очень
скоро, в1993 г. отм еченный Н об елевской прем ией.
1.1 М ехан из мпо лимер аз н о й ц епн о й р еакц ии
Копирование Д Н К при П ЦР осущ ествляется спец иальным ф ерм ентом ДНК -п оли мера зой, каки вклетках ж ивых организм ов. Д Н К-полим ераза двигаясь по одиночной ц епи Д Н К (м атриц е), синтезирует ком плем ентарную ей
последовательность Д Н К. В аж но, что Д Н К-полим ераза не м ож ет начать
синтез ц епи Д Н К «с нуля» , ей необ ходим а короткая затравочная ц епь РН К
или Д Н К к3'-конц у которой она м ож ет начать присоединять нуклеотиды. Е е
преим ущ еством является терм остаб ильность, а недостатком - отсутствие 3'-5'
экзонуклеазной активности, что приводит к появлению
ош иб ок в
синтезированной Д Н К, около 0.25 % вконечном продукте.
Т ермо ст а б ильны е Д Н К п о лимера зы
Т ерм остаб ильные Д Н К-полим еразы м огут б ыть разделены на две
группы: с3′-5′ эндонуклеазной активностью (Pfu Д Н К-полим ераза), и б ез этой
ф ункц ии (Taq Д Н К-полим ераза). Э ти две группы им ею т важ ные различия.
Корректирую щ ие Д Н К-полим еразы б олее точны, чем полим еразы б ез 3′-5′
экзонуклеазной активности, которые не м огут удалить неправильный
нуклеотид в синтезируем ой ц епи Д Н К. Когда продукт ам плиф икац ии
необ ходим о клонировать или использовать ванализем утац ий, использование
Pfu Д Н К-полим еразы нам ного удоб нее. О днако для об ычной П ЦР, когда
необ ходим о простое об наруж ение нуклеотидной последоваткльности или ее
увеличение, наиб олеечасто используется Taq полим ераза.
Ам плиф икац ия с использованием некорректирую щ их Д Н К-полим ераз
оканчивается дополнением отдельного нуклеотида к3′-конц у П ЦР-продукта,
тогда как использование корректирую щ их полим ераз окончивется
тупозаконченным
П ЦР-продуктам и.
Е динственный дополнительный
нуклеотид м ож етупростить проц ессклонирования.
В настоящ ееврем я для приведения П ЦР используется м нож ество видов
полим ераз.
Taq ДНК -Поли мера за
Taq Д Н К-полим ераза выделена из б актерий Thermus aquaticus и катализирует
удлинениенуклеотидной ц епи вприсутствии прайм еровв5′-3′-направлении в
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5
присутствии Mg2+. Ф ерм ент не об ладает 3′-5′ экзонуклеазной активностью .
Taq Д Н К-полим ераза является подходящ им для б ольш инства П ЦР, которые
не треб ую т ф ерм ента высокой спец иф ичности. Н орм а ош иб ки Taq Д Н Кполим еразы - приб лизительно 10-5 ош иб ок/основание. С пец иф ичность
повыш ается при низких pH, б олее низких конц ентрац иях м агния и при
относительно низкой конц ентрац ии дН Т Ф . С корость раб оты Taq Д Н Кполим еразы 60 нуклеотидов/секунд при 70°C. Ф ерм ент им еет период
полуинактивац ии равный 40 м инутам при 95°C, при этом он теряетполовину
своей активности.
Tfl ДНК -п оли мера за
Tfl Д Н К-полим ераза катализирует ам плиф икац ию Д Н К вприсутствии
прайм ерови Mg2+. В присутствии Mn2+, Tfl Д Н К-полим ераза катализирует
полим еризац ию нуклеотидоввД Н К, используя РКН как ш аб лон. Tfl Д Н К
полим ераза не 3′-5′ экзонуклеазной активностью . Э тот ф ерм ент об ычно
используется воб ычной П ЦР и при П ЦР вреальном врем ени.
Tth ДНК -п оли мера за
Tth Д Н К-полим ераза катализирует полим еризац ию нуклеотидов в
двойную Д Н К в 5′-3′ направлении в присутствии MgCl2. Ф ерм ент такж е
способ ен катализировать полим еризац ии Д Н К, используя вкачестве ш аб лона
РКН . Tth Д Н К-полим ераза об ладает 5′-3′ экзонуклеазной активностью . Tth
Д Н К-полим ераза об ычно используется для об ычной П ЦР и П ЦР вреальном
врем ени. Д ля П ЦР в реальном врем ени и синтеза кД Н К, использую тся
м атриц а РКН со слож ной вторичной структурой, высокая тем пература
реакц ии Tth полим еразы Д Н К является преим ущ еством перед об ычно
используем ым и об ратным и транскриптазам и, типа AMV и М -MLV.
Tli ДНК -п оли мера за
Tli Д Н К-полим ераза копирует ам плиф икац ию Д Н К 5′-3′ направлении в
присутствии Mg2+. Д анный ф ерм ентоб разуетб олее95 % продуктовступым и
конц ам и. Tli Д Н К-полим ераза используется для об ычного П ЦР и П ЦР в
реальном врем ени.
Pfu ДНК -п оли мера за
Pfu Д Н К-полим ераза им еетодну из сам ых низких проц ентовош иб окиз
всех известных Д Н К-полим ераз. Pfu Д Н К-полим ераза используется для
получения П ЦР продуктов, используем ых вдальнейш ем для клонирования.
Pfu Д Н К-полим ераза м ож етсинтезировать продукты Д Н Кдо 5 КБ.
Klenow fragment
Cуб ъединиц а Д Н К-полим еразы I, разм ером 68 кД а. О б ладает
полим еразной активностью и 3'-5' экзонуклеазной активностью , 5'-3'
экзонуклеазная активность отсутствует. И спользуется для достройки
выступаю щ их 5'-конц ов с радиоактивно м еченным и или простым и дН Т Ф ;
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6
секвенирования; получения одноц епочечной кД Н К; получения "тупых" 3'конц ов.
О сновной принц ип П ЦР состоит в том , что реакц ия полим еризац ии
(синтеза полим ерной ц епи Д Н К из м оном ерных нуклеотидных звеньев) иниц иируется спец иф ическим и п ра ймера ми
в каж дом из м нож ества
повторяю щ ихся ц иклов. П райм еры - искусственно синтезированные
олигонуклеотиды, им ею щ ие, какправило, разм ер от15 до 30 п.н., идентичные
соответствую щ им участкам Д Н К-м атриц ы.
С пец иф ичность П ЦР определяется способ ностью прайм еров"узнавать"
строго определенный участокД Н К и связываться с ним согласно принц ипу
м олекулярной ком плем ентарности. В реакц ии П ЦР используется пара
прайм еров, которые ограничиваю т ам плиф иц ируем ый участокс двух сторон,
связываясь спротивополож ным и ц епям и Д Н К-м атриц ы.
П ри создании П ЦР-тест-систем ы одной из основных задач является
правильный подб ор прайм еров, которыедолж ны отвечать рядукритериев:
1. Д лина прайм ера долж на б ыть 15 - 30 нуклеотидов. У м еньш ениедлины
м ож етпривести ксниж ению спец иф ичности связывания прайм ера и м атриц ы.
Д линные прайм еры увеличиваю т спец иф ичность систем ы, но вних сильно
возрастаетвероятность об разования вторичных структур.
2. П райм еры долж ны б ыть спец иф ичны. О соб ое вним ание уделяю т 3'конц ам прайм еров, т.к. им енно с них Taq-полим ераза начинает достраивать
ком плем ентарную ц епь Д Н К. Е сли их спец иф ичность недостаточна, то,
вероятно, что впроб ирке с реакц ионной см есью б удут происходить синтез
неспец иф ической Д Н К (коротких или длинных ф рагм ентов). Э то значительно
услож няет оц енку результатовреакц ии, т.к. легко перепутать спец иф ический
продукт ам плиф икац ии с синтезированной посторонней Д Н К. Ч асть
прайм еров и дН Т Ф расходуется на синтез неспец иф ической Д Н К, что
приводиткзначительной потеречувствительности;
3. П райм еры не долж ны об разовывать дим еры и петли, т.е. не долж но
об разовываться устойчивых двойных ц епей врезультате отж ига прайм еров
сам их на себ я или друг сдругом ;
4. О б ласть отж ига прайм еров долж на находиться вне зон м утац ий,
делец ий или инсерц ий в пределах видовой или иной, взятой в качестве
критерия при выб оре прайм еров, спец иф ичности. П ри попадании на такую
зону, отж ига прайм еров происходить не б удет, и как следствие лож ноотриц ательный результат.
5. С одерж ании Г Ц-пар впрайм ередолж но б ыть около 50 %. Ч ем ниж есодерж аниеГ Ц-пар впрайм ере, тем длиннееон долж ен б ыть.
Эт а п ы П Ц Р
Д ля м ногократного увеличения количества копий исходной Д Н К нуж на
ц икличность реакц ии. Как правило, каж дый из последовательно
повторяю щ ихся ц икловП ЦР состоитиз трех этапов:
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7
1) дена т ура ц и и , или "плавления" Д Н К, когда двух ц еп очечная Д Н К под
действием высокой тем пературы переходитводноц епочечноесостояние;
2) связывания (от ж и га ) прайм еровсм атричной Д Н К;
3) элонга ц и и , или удлинения ц епи.
Н а стадии терм ической денатурац ии (расщ епления) двуц епочечной
м олекулы Д Н К при 93 – 95оС , происходит разделение ком плем ентарных
ц епей. Затем проб ы охлаж даю тдо 45 - 60оС , что даетвозм ож ность связаться
прайм ерам и одноц епочечным дезоксиолигонуклеотидам . П осле отж ига
прайм еров Taq-полим ераза начинает достраивание второй ц епи Д Н К с 3'конц а прайм ера, при этом тем пература реакц ионной см еси вновь повыш ается
до 70 - 72оС , что необ ходим о для раб оты Taq-полим еразы. С м ена этапов
каж дого ц икла осущ ествляется путем изм енения тем пературы реакц ионной
см еси.
С начала прайм еры м огут связаться только с определенной
последовательностью исходной Д Н К, но в последую щ их ц иклах они
связываю тся с копиям и этой последовательности, синтезированным и в
предыдущ их ц иклах. П ри этом количество основного продукта П ЦР (копии
последовательности Д Н К, ограниченной прайм ерам и) теоретически
удваивается в каж дом ц икле, то есть растет с числом ц иклов
экспоненц иально.
С ледует зам етить, что проц есс накопления спец иф ических продуктов
ам плиф икац ии по геом етрической прогрессии идетлиш ь ограниченноеврем я,
а затем его эф ф ективность критически падает. Э то связано с такназываем ым
«эф ф ектом плато» . Т ерм ин «эф ф ект плато» использую т для описания
проц есса накопления продуктовП ЦР на последних ц иклах ам плиф икац ии,
когда количество ам пликоновдостигает0.3 - 1 пм олей.
В зависим ости отусловий и количества ц икловреакц ии ам плиф икац ии,
на м ом ент достиж ения «эф ф екта плато» влияю т: утилизац ия суб стратов
(дН Т Ф и прайм еров); стаб ильность реагентов(дН Т Ф и ф ерм ента); количество
ингиб иторов, вклю чая пироф осф аты и Д Н К-дуплексы; неспец иф ические
продукты или прайм ер-дим еры, конкурирую щ ие за прайм еры, дН Т Ф и
полим еразу; конц ентрац ия спец иф ического продукта и неполная денатурац ия
при высокой конц ентрац ии продуктовам плиф икац ии. Ч ем м еньш е начальная
конц ентрац ия Д Н К-м иш ени, тем выш е рисквыхода реакц ии на плато. Э тот
м ом ент м ож ет наступить до того, какколичество спец иф ических продуктов
ам плиф икац ии б удет достаточно, чтоб ы их м ож но б ыло проанализировать.
И зб еж ать этого позволяю тлиш ь хорош о оптим изированныетест-систем ы.
Ч тоб ы ум еньш ить риск об разования неспец иф ических продуктов
реакц ии ам плиф икац ии, использую т подход, получивш ий название «горячий
старт» (отангл. «hotstart » ). С уть его состоитвпредотвращ ении возм ож ности
начала реакц ии до м ом ента достиж ения впроб иркеусловий, об еспечиваю щ их
спец иф ический отж иг прайм еров.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8
Д ело втом , что взависим ости отГ Ц-состава и разм ера прайм еры им ею т
определенную тем пературу плавления (Tm), при которой об разование
водородных связей нестаб ильно. Е сли тем пература систем ы превыш ает Т m,
прайм ер не всостоянии удерж иваться на ц епи Д Н К и денатурирует. П ри
соб лю дении оптим альных условий, т.е. тем пературы отж ига, б лизкой к
тем пературе плавления, прайм ер об разует двухц епочечную м олекулу только
при условии его полной ком плем ентарности и, таким об разом , об еспечивает
спец иф ичность реакц ии. С ущ ествую т различные варианты реализац ии
«горячего старта» :
1. внесение вреакц ионную см есь Taq-полим еразы во врем я первого
ц икла послепрогрева проб ирки до тем пературы денатурац ии;
2. разделение ингредиентовреакц ионной см еси прослойкой, наприм ер,
параф ина или воска на части (в ниж ней - прайм еры, в верхней - Taqполим ераза и Д Н К-м иш ени), которые см еш иваю тся при достиж ении
тем пературы плавления м атериала прослойки (~45 - 85ºС );
3. использование м оноклональных антител кTaq-полим еразе. Ф ерм ент,
связанный м оноклональным и антителам и, становится активным лиш ь после
стадии первой денатурац ии, когда м оноклональные антитела необ ратим о
денатурирую ти освоб ож даю тактивныец ентры Taq-полим еразы.
В о всех перечисленных случаях, даж е если неспец иф ический отж иг
произош ел до начала тем пературного ц иклирования, элонгац ии не
происходит, а при нагревании ком плексы прайм ер-Д Н К денатурирую т,
поэтом у неспец иф ические продукты не об разую тся. В дальнейш ем
тем пература в проб ирке не опускается ниж е тем пературы плавления, что
об еспечиваетоб разованиеспец иф ического продукта ам плиф икац ии.
Амп лифика ция
С тандартная П ЦР осущ ествляется автом атически в терм оц иклере в
одной проб ирке, содерж ащ ей около 1 м кг Д Н К, 20 пиком олей каж дого
прайм ера, по 50 м км олей каж дого дезоксинуклеозидтриф осф ата и две
единиц ы терм остаб ильной Taq Д Н К-полим еразы.
П роб а со м есью пом ещ аю тся в м еталлический б лок, тем пература
которого изм еняется с пом ощ ью элем ента П ельтье. Э лем ент П ельтье
позволяет изм енять тем пературу б лока с б ольш ой скоростью , что сокращ ает
продолж ительность каж дого ц икла П ЦР.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
9
Рисунок1. С хем а полим еразной ц епной реакц ии (П ЦР).
С оврем енные терм оц иклеры приспособ лены для использования
спец иальных тонкостенных пластиковых проб ирок для реакц ионной см еси,
что позволяет ускорить теплооб м ен м еж ду б локом приб ора и реакц ионной
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
10
см есью и в конечном итоге дополнительно сократить врем я проведения
реакц ии.
Т аким об разом , стандартная П ЦР м ож ет б ыть осущ ествлена за 1 - 3 ч.
М ногие приб оры позволяю т програм м ировать спец иальные услож ненные
тем пературные проф или, необ ходим ые для спец иф ических м одиф икац ии
проц есса П ЦР.
Каквидно из рисунка 1, П ЦР им еет ц иклический характер. В первом и
частично во втором ц иклах об разую щ иеся копии (а мп ли коны) Д Н К не
соответствую т границ ам ам плиф иц ируем ого гена (все ам пликоны впервом
ц иклеи часть ам пликоновво втором ц иклеI получаю тся б олеепротяж енным и
в тех участках, где ещ е не произош ло связывание второго —
«антисм ыслового» прайм ера). О днако, начиная уж е с третьего ц икла длина
ам пликонов становится стандартной, т.е. соответствует числу пар
нуклеотидов ф рагм ентов Д Н К-м атриц ы м еж ду 3'-конц ам и прайм еров.
Ам пликоны накапливаю тся в геом етрической прогрессии и начинаю т
дом инировать среди продуктов ам плиф икац ии. П роц есс им еет ц епной
характер, так как синтезированные ф рагм енты Д Н К в дальнейш ем сам и
служ ат м атриц ей, на которой идет синтез. П ри м ногократном повторении
ц иклов синтеза число копий спец иф ических ф рагм ентов Д Н К
экспоненц иально увеличивается, что позволяет из неб ольш ого числа
им ею щ ихся ф рагм ентовполучить б ольш оеколичество копии, которыем ож но
идентиф иц ировать м етодом электроф ореза.
1.2 Д ет екц ия пр о дукт о в амплификац ии
Д ля правильной оц енки результатовП ЦР важ но поним ать, что данный
м етод не является количественным . Т еоретически продукты ам плиф икац ии
единичных м олекул Д Н К-м иш ени м огут б ыть об наруж ены с пом ощ ью
электроф ореза уж епосле30 - 35 ц иклов. О днако на практикеэто выполняется
лиш ь вслучаях, когда реакц ия проходит вусловиях, б лизких кидеальным .
О соб енно б ольш ое влияние на эф ф ективность ам плиф икац ии оказывает
степень чистоты препарата Д Н К, т.е. наличие вреакц ионной см еси тех или
иных ингиб иторов, откоторых изб авиться внекоторых случаях б ываеткрайне
слож но. И ногда из-за их присутствия не удается ам плиф иц ировать даж е
десятки тысяч м олекул Д Н К-м иш ени. Т аким об разом , прям ая связь м еж ду
исходным количеством Д Н К-м иш ени и конечным количеством продуктов
ам плиф икац ии часто отсутствует.
Мет од гори зонт а льногоэлект рофореза
Д ля визуализац ии результатов ам плиф икац ии использую т различные
м етоды. Н аиб олее распространенным на сегодняш ний день является м етод
электроф ореза, основанный на разделении м олекул Д Н К по разм еру. Д ля
этого готовят пластину агарозного геля, представляю щ его соб ой застывш ую
послерасплавления вэлектроф орезном б уф ереагарозувконц ентрац ии 0.8 – 2
% с доб авлением спец иального красителя Д Н К, - наприм ер, б ром истого
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
11
этидия. Застывш ая агароза об разует пространственную реш етку. П ри заливке
с пом ощ ью греб енок в геле ф орм ирую т спец иальные лунки, в которые в
дальнейш ем вносят продукты ам плиф икац ии. П ластину геля пом ещ аю т в
аппарат для горизонтального гель-электроф ореза и подклю чаю т источник
постоянного напряж ения. О триц ательно заряж енная Д Н К начинает двигаться
вгелеотм инуса кплю су. П ри этом б олее короткие м олекулы Д Н К движ утся
б ыстрее, чем длинные. Н а скорость движ ения Д Н К в геле влияет
конц ентрац ия агарозы, напряж енность электрического поля, тем пература,
составэлектроф орезного б уф ера и, вм еньш ей степени, Г Ц-составД Н К. В се
м олекулы одного разм ера движ утся с одинаковой скоростью . Краситель
встраивается плоскостным и группам и в м олекулы Д Н К. П осле окончания
электроф ореза, продолж аю щ егося от 10 м ин до 1 часа, гель пом ещ аю т на
ф ильтр трансиллю м инатора, излучаю щ его свет в ультраф иолетовом
диапазоне(254, 310 нм ). Э нергия ультраф иолета, поглощ аем ая Д Н Квоб ласти
260 нм , передается на краситель, заставляя его ф луоресц ировать воранж евокрасной об ласти видим ого спектра (590 нм ). Яркость полос продуктов
ам плиф икац ии м ож ет б ыть различной. Кром е того, использую т способ ы
детекц ии: Cresol red, Tetrazine dye yellow food coloring (Schilling Brand),
ксилен ц ианол, б ром ф еноловый синий, м етод гиб ридизац ионных зондов.
Рисунок2. Э лектроф орез нуклеиновых кислотвагарозном геле.
Мет од в ерт и ка льногоэлект рофореза
М етод вертикального электроф ореза принц ипиально схож
с
горизонтальным электроф орезом . И х отличиезаклю чается втом , что вданном
случае вм есто агарозы использую т полиакрилам ид. Е го проводят в
спец иальной кам ере для вертикального электроф ореза. Э лектроф орез в
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
12
полиакрилам идном геле им еет б ольш ую разреш аю щ ую способ ность по
сравнению с агарозным электроф орезом и позволяет различать м олекулы
Д Н К разных разм еров с точностью до одного нуклеотида. П риготовление
полиакрилам идного геля несколько слож нее агарозного. Кром е того,
акрилам ид является токсичным вещ еством .
Рисунок3. Э лектроф орез нуклеиновых кислотвполиакрилам идном геле
ввертикальной кам ере.
Мет од ги бри ди за ц и онных зондов
И спользование гиб ридизац ии с внутренним и Д Н К-зондам и позволяет в
рядеслучаевзначительно повысить чувствительность и спец иф ичность детектирования П ЦР-продуктов. Благодаря отсутствию
необ ходим ости в
подготовке и проведении электроф оретического разделения, возм ож ности
автом атизац ии для анализа б ольш ого количества об разц ови использования
нерадноактивного ф орм ата детектирования, этот м етод становится все б олее
распространенным . В некоторых случаях прим енение спец иальных
ф луоресц ентных "м аркеров" позволяет контролировать проведение
ам плиф икац ии или детектирование конечных продуктов П ЦР непосредственно вреакц ионной проб ирке.
1.3 П о дг о т о вка пр о бы био ло г ическо г о мат ер иала
Н е м енее важ ным для получения качественного результата при
проведении П ЦР играети качество используем ой м атриц ы, еечистота.
Д ля подготовки проб ы к постановке П ЦР использую т различные
м етодики в зависим ости от поставленных задач. И х суть заклю чается в
экстракц ии (извлечении) Д Н К или РН К из об разц а и удалении или
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
13
нейтрализац ии посторонних прим есей для получения препарата с чистотой,
пригодной для постановки реакц ии ам плиф икац ии.
П ри использовании в качестве м атриц ы для П ЦР Д Н К, необ ходим о
получить чистый ее препарат, готовы вам плиф икац ии. В случае раб оты с
РН К необ ходим о произвести ряд дополнительных м ероприятий для
получения кД Н К, поскольку Д Н К-полим ераза не м ож ет использовать в
качествем атриц ы РН К.
С ущ ествует м нож ество м етодик, используем ых для экстракц ии Д Н К из
различных ж ивых об ъектов. И ногда б ываетдостаточно прокипятить об разец в
течение 5 - 10 м инут, однако в б ольш инстве случаев треб ую тся б олее
трудоем кием етоды.
Больш инство классических м етодик основаны на ф ерм ентативный
протеолизе клетокс последую щ ей депротеинизац ией (изб авление б елков) и
переосаж дением Д Н К спиртом . О днако это м етод довольно трудоем ок и
предполагает раб оту с таким и агрессивным и и им ею щ им и резкий запах
вещ ествам и, какф енол и хлороф орм .
О дним из популярных внастоящ ее врем я является м етод выделения
Д Н К, основанный на использовании для лизиса клетоксильного хаотропного
агента - гуанидина тиоц ионата (GuSCN) и последую щ ей сорб ц ии Д Н К на
носителе (стеклянные б усы, диатом овая зем ля, стеклянное «м олоко» и т.д.).
П ослеотм ывоквпроб еостается Д Н К, сорб ированная на носителе, скоторого
она легко сним ается с пом ощ ью элю ирую щ его б уф ера. М етод удоб ен,
технологичен и пригоден для подготовки об разц а кам плиф икац ии. О днако
данный м етод не лиш ен недостатков, такдаж е неб ольш ие количества GuSCN
м огутингиб ировать П ЦР.
Д ругая группа м етодов проб оподготовки основана на использовании
ионооб м енников, которые, в отличие от стекла, сорб ирую т не Д Н К, а,
наоб орот, прим еси, м еш аю щ ие реакц ии. Как правило, эта технология
вклю чаетдве стадии: кипячение об разц а, врезультате чего клеточные стенки
разруш аю тся, а нуклеиновыекислоты выходятвраствор; и сорб ц ия прим есей
на ионооб м еннике. М етод отличается простотой использования. В некоторых
случаях необ ходим о введение дополнительных стадий об раб отки об разц а,
посколькукипячениеневсегда способ но экстрагировать Д Н Киз клеток.
В случае, когда необ ходим о использовать РН К, м етодика подготовки
м атериала претерпевает некоторые изм енения. В данном случае необ ходим о
б олее тщ ательно следить за соб лю дением стерильности всех ком понентови
м атериалов, используем ых при выделении. Т акого рода м ероприятия связаны
с тем , что РН К м енее устойчива, чем Д Н К. Д аж е непродолж ительное
выдерж ивание об разц а при ком натной тем пературе м ож ет привести к
значительной ее деградац ии. С терильность м атериала – главное условие при
выделении РН К, поскольку на поверхности рукчеловека находится б ольш ое
количество РН Каз – ф ерм ентов разруш аю щ их РН К. П оэтом у растворы и
используем ыем атериалы необ ходим о автоклавировать перед использованием .
М етоды выделения сум м арной РН К из клеток ж ивых организм ов
сходны см етодам и, используем ым и для экстракц ии Д Н К. О днако впоследнее
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
14
врем я появились м етоде даю щ ие возм ож ность получать чистую м РН К б ез
прим еси. Э ти м етоды как правило основаны на использовании различных
ионооб м енных см ол с ковалентно связанным и поли-Т последовательностям и.
И спользование таких ионоб м енниковпозволяет чистые препараты, где нет
прим есей посторонних вещ еств, но изб авиться отдругих видовРН К.
П осле получения качественного препарата сум м арной РН К проводится
об ратная транскрипц ия. В основе этого м етода леж ит способ ность ф ерм ента
РН К-зависим ая-Д Н К-полим еразы (об ратной транскриптазы, ревертазы)
синтезировать ц епь Д Н К на основе риб онуклеиновой м атриц ы, используя
принц ип ком плим ентарности. П ри этом вреакц ии используется несум м арная
РН К см еси, а только м РН К, что об условлено особ енностью ф ерм ента,
способ ного узнавать м РН К по ее поли-А хвосту. Д ля иниц иац ии реакц ии
синтезирования Д Н К ревертазе, необ ходим о наличие всм еси спец иальной
затравки – олиго-дТ прайм ера. П рисоединяясь к поли-А хвосту м РН К, он
об еспец иваетвозм ож ность присоединения ф ерм ента см атриц ей и построения
ком плим ентарной Д Н К. Кром е того в реакц ионной см еси долж ны
присутствовать дН Т Ф
для построения кД Н К и РН азин – б елок,
ингиб ирую щ ий раб отуРН Каз.
Э ф ф ективность проц есса об ратной транскрипц ии не высока – около 10
%. О днако открывает дополнительные возм ож ности визучении м етаб олизм а
нуклеиновых кислот клетки. П озволяет определить интрон-экзонный состав
исследуем ого об разц а, определить степень экспрессируем ости определенного
гена и м ногоедругое.
1.4 Опт имиз ац ия П ЦР-р еакц ии
К онц ент ра ц и я Ма гни я
М агний - необ ходим ый коф актор для Д Н К-полим ераз и конц ентрац ия
м агния. Конц ентрац ия Д Н К-м атриц ы, агентоввоб разц е(наприм ер, Э Д Т А или
соли лим онной кислоты), конц ентрац ия дН Т Ф и присутствие б елковм ож ет
влиять на количество своб одного м агния в реакц ии. В отсутствии
необ ходим ого своб одного м агния, Taq полим ераза не способ на осущ ествлять
реакц ию . И зб ытоксвоб одного м агния ум еньш аетспец иф ичность ф ерм ента и
м ож ет увеличить уровень неспец иф ического продукта вреакц ии. П оэтом у,
необ ходим о опытным путем определить оптим альную конц ентрац ию м агния
для каж дой реакц ии. Конц ентрац ии м агния оптим ального диапазона
конц ентрац ии м ож ет зависеть от Д Н К-полим еразы. Н априм ер, раб ота Pfu
Д Н К-полим еразы, м енее зависит от конц ентрац ии м агния, но оптим альная
конц ентрац ия находится об ычно вдиапазоне 2 - 6 м M, для раб оты Taq Д Н Кполим ераза оптим альной является конц ентрац ия 1 - 3 м М .
Н а основепроведенных исследований по подб ору конц ентрац ии м агния
для увеличения спец иф ичности реакц ии, показано, что при увеличении
конц ентрац ии м агния в реакц ионной см еси происходит увеличение доли
неспец иф ического продукта.
К онц ент ра ц и я фермент а
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
15
Реком ендуется использование 1 - 1.25 единиц ы Taq Д Н К-полим еразы в
50 м л реакц ионной см еси. В б ольш инстве случаев такая конц ентрац ия
ф ерм ента достаточна для стаб ильной реакц ии и доб авление б ольш его
количества ф ерм ента не приводит к увеличению продуктов реакц ии.
Ф актически, увеличенные количества ф ерм ента увеличиваю т вероятность
получения «ш ум ов», связанных со свойствам и активности Taq-Д Н Кполим еразы.
К а ч ест вои коли ч ест в ома т ри ц ы
У спеш ная ам плиф икац ия зависит от количества м атриц ы Д Н К и ее
качества. Реактивы, об ычно используем ые в очистке нуклеиновых кислот
(соли, гуанидинтиоц ианат, протеазы, органические растворители и др.) м ощ ные инактиватор Д Н К-полим ераз.
П оэтом у для
увеличения
производительности ам плиф икац ии необ ходим о проводить дополнительные
ш аги, чтоб ы очистить Д Н К-м атриц у, для этого м ож но использовать
извлечениеф енол/хлороф орм ом или осаж дения этанола.
Количество м атриц ы, треб уем ой для успеш ной ам плиф икац ии зависит
от слож ности об разц а Д Н К. Реакц ии со слиш ком м аленьким количеством
Д Н Кб удутим еть низко выход, вто врем я каквреакц ии со слиш ком б ольш им
количеством Д Н К-м атриц ы м ож но получить неувеличениепродукта реакц ии,
а наоб орот, сниж ениевыхода ам плиф икац ии.
У си ли в а ющ и е а гент ы ПЦ Р
Д ополнение спец иф ических агентоввреакц ионную П ЦР-см есь м ож ет
увеличить выход ож идаем ого П ЦР-продукта или ум еньш ить об разование
неспец иф ических продуктов. С ущ ествует б ольш ое количество агентов
усиливаю щ их продуктивность П ЦР, которые м огут действовать через
м нож ество различных м еханизм ов. Э ти реактивы не б удут увеличивать все
П ЦР реакц ии, их необ ходим о подб ирать опытным путем для каж дого случая.
Н екоторыеиз таких вещ ествприведены ниж е.
Д об авление б етаина, дим етилсульф оксида и ф орм ам ида м ож ет б ыть
полезно при использовании «грязных» м атриц и м атриц , которые ф орм ирую т
вторичные структуры. Г рязные м атриц ы м огут б ыть неэф ф ективны из-за
слаб ого разделения двух ц епей Д Н К или тенденц ии ф орм ировать
м еж м олекулярные вторичные структуры, которые конкурирую т с отж игом
прайм еров. Бетаин ум еньш ает количество энергии, треб уем ой для разрыва
ц епей Д Н К. Д им етилсульф оксид и ф орм ам ид действуя аналогичным об разом ,
способ ствую разруш ению вторичных об разований вД Н К-м атриц е.
Т аким об разом некоторые реакц ии, которые им ею т неб ольш ой выход
при об ычных условиях, дадут б олее высокий проц ент выхода П ЦР-продукта
при использовании соответствую щ их усиливаю щ их реагентов.
В некоторых случаях стаб илизирую щ ие агенты, такие как б ычий
сывороточный альб ум ин (0.1 м г/м л), ж елатин (0.1 - 1.0 %) и неионогенные
детергенты (0 - 0.5 %) м огут такж е усиливать ам плиф икац ию Д Н К. Э ти
доб авки м огутувеличить стаб ильность полим еразы Д Н Ки ум еньш ить потерю
реактивовиз-за адсорб ц ии на стенки проб ирки.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
16
1.5 П р о блемы ко н т амин ац ий пр и испо льз о ван ии П ЦР
П олим еразная ц епная реакц ия является очень чувствительным м етодом
детекц ии, об еспечивая возм ож ность об наруж ения единственной м олекулы
нуклеиновой кислоты в см еси. Т акая чувствительность м етода создает и
определенные проб лем ы, связанные с загрязнением исследуем ого об разц а
посторонним и вещ ествам и (конт а ми на ц и я), тем сам ым затрудняя корректно
интерпретировать результат.
Контам инац ия - попадание из внеш ней среды в реакц ионную см есь
спец иф ических и неспец иф ических м олекул Д Н К, способ ных служ ить
м иш еням и в реакц ии ам плиф икац ии и давать лож нополож ительные или
лож ноотриц ательныерезультаты.
Т аким и м иш еням и м огут б ыть продукты реакц ии, попадаю щ ие во
внеш ню ю среду на этапе детекц ии из проб ирок, вкоторых успеш но прош ла
ам плиф икац ия, либ о спец иф ическая Д Н К из об разц ов на этапе
проб оподготовки.
С ущ ествует несколько способ овб орьб ы с этим неприятным явлением .
О дним из них является использование ф ерм ента N-урац ил-гликозилазы (У Г ).
В основе этого м етода леж ит способ ность У Г расщ еплять м олекулы Д Н К со
встроенным урац илом . Реакц ию ам плиф икац ии проводят с использованием
см еси дН Т Ф , в которой дТ Т Ф зам енен на дУ Т Ф (урац ил), и после
терм оц иклирования все об разую щ иеся в проб ирке ам пликоны б удут
содерж ать урац ил. Е сли до ам плиф икац ии вреакц ионную см есь доб авить У Г ,
то попавш ие вреакц ионную см есь ам пликоны б удут разруш ены, тогда как
нативная Д Н К останется ц елой и б удет вдальнейш ем служ ить м иш енью для
ам плиф икац ии.
Д ругим способ ом инактивац ии ам пликонов служ ит ф отохим ическое
воздействие на м олекулы Д Н К. Д ля этого использую т псорален или
изопсорален, которые активирую тся кратковрем енным
об лучением
ультраф иолетовым светом . М одиф иц ированные этим и соединениям и
м олекулы Д Н Кнем огутучаствовать вреакц ии ам плиф икац ии.
О б а эти м етода лиш ь внекоторой степени позволяю тустранить источник
контам инац ии и не гарантирую т от лож нополож ительных
и
лож ноотриц ательных результатов.
Е сть третий способ
б орьб ы с результатам и контам инац ии,
рассм атриваем ый скореекакказусный - значительноеум еньш ениеколичества
ц иклов реакц ии (до 25 - 30 ц иклов). Н о даж е при таком подходе риск
получения лож нополож ительных и лож ноотриц ательных результатоввелик.
В се реактивы реком ендуется хранить разлитым и на отдельные порц ии
(аликвоты).
П ом им о стандартной реакц ии ам плиф икац ии Д Н К, впоследнее врем я
стали ш ироко использоваться и другие м етоды на основе полим еразной
ц епной реакц ии, которые дали возм ож ность не только получать огром ные
количества необ ходим ой нуклеотидной последовательности, но и
количественную и качественную проводить оц енку используем ой м атриц ы.
Т икам и м етодам и являю тся П ЦР вреальном врем ени, ам плиф икац ия РН К.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
17
1.6 П ЦР в р еальн о мвр емен и (Real Time PCR)
Д ля б олееточной оц енки количества Д Н К-м иш ени вреакц ионной см еси
предприним аю тся спец иальные подходы, известные под об щ им названием
полуколичественного П ЦР-анализа или П ЦР вреальном врем ени (РТ -П ЦР).
П риставка «полу» им еет принц ипиальное значение из-за условной точности
результатовэтого анализа.
К таким подходам следует отнести использование спец иального
приб орного об еспечения всочетании с препаратам и спец иф ической Д Н К с
известной конц ентрац ией. К приб орном у об еспечению , позволяю щ ем у
получать полуколичественные результаты П ЦР анализа, следует отнести
м одели ам плиф икаторовкоторыепозволяю тследить за кинетикой накопления
продуктовам плиф икац ии. Э то достигается введением вреакц ионную см есь
гиб ридизац ионные зонды, всоставкоторых входят нуклеотиды, м еченные
особ ым и реактивам и - ф луороф ором и туш ителем .
Т ипы П ЦР вреальном врем ени различаю тся по способ ам генерац ии
репортерной ф луоресц енц ии. Д ва основных принц ипа - это:
1.
П рим енениеин т ер калир ующ их флуо р есц ен т н ы х аг ен т о в,
ф луоресц енц ия которых значительно возрастаетпри связывании с
двуц епочечной Д Н К;
2.
И спользованиемечен ы х флуо р есц ен т н ы ми аг ен т ами
о лиг о н уклео т идн ы х пр о б, ком плим ентарных участкуП ЦР-продукта.
В качестве интеркалирую щ его красителя наиб олее часто использую т
SYBR Green. В технологиях TaqMan, Molecular Beacons и LightCycler
использую тм еченыеолигонуклеотидныепроб ы.
SYBR Green об еспечивает сам ый простой и сам ый эконом ичный способ
для П ЦР вреальном врем ени. SYBR Green связывает двуц епочечной Д Н К, и
возб уж даясь, испускает свет. Т аким об разом , поскольку П ЦР продукт
накапливается, увеличивается ф лю оресц енц ия. П реим ущ ества SYBR Green
состоят в том , что это является недорогим , удоб ным , и чувствительным .
Н еудоб ство - то, что SYBR Green связывается с лю б ой двуц епочечной Д Н К в
реакц ии, вклю чая прайм ер-дим ер и другие неспец иф ические продукты
реакц ии. Д ля отдельных П ЦР реакц ий разраб отанны прайм еры SYBR Green
которыем огутраб отать хорош о вприсутствии неспец иф ического ф она.
TaqMan П ЦР основан на использовании 5'-экзонуклеазной активности
полим еразы. В реакц ионную см есь доб авляю т Д Н К-проб ы, м еченные на 5'конц е ф луоресц ентным красителем , а на 3'-конц е - ф осф атной группой и
гасителем ф луоресц енц ии. П роб ы ком плим ентарны участку ам плиф иц ируем ой
об ласти. Г аситель поглощ ает испускаем ое ф луоресц ентной м еткой излучение,
а ф осф атная группа в 3'-полож ении б локирует полим еразу. П ри отж иге
прайм еров проб а количественно связывается с ком плем ентарным участком
Д Н К. В о врем я стадии элонгац ии полим ераза синтезирует ком плем ентарную
ц епь Д Н К и, дойдя до участка, гиб ридизованного с проб ой, начинает
расщ еплять проб у за счет 5'-экзонуклеазной активности. В результате
ф луоресц ентная м етка отделяется от гасителя, и ее свечение м ож ет б ыть
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
18
детектировано. Т аким об разом , увеличение ф луоресц енц ии б удет прям о
пропорц ионально количествунараб отанного П ЦР-продукта.
Рисунок4. П ринц ип TaqMan. А – зонд связан см атриц ей, свечения нет;
Б – отрывзонда отм атриц ы по действием полим еразы, свечения ф лю ороф ора.
Molecular Beacons отличается от TaqMan тем , что конц ы проб ы (на
которых находятся соответственно м етка и туш итель ф луоресц енц ии)
ком плем ентарны друг другу. В результате, при тем пературе отж ига
прайм еров они соединяю тся и об разую т структуру где зона
ком плим ентарности проб ы с м атриц ей находится впетле. П ри гиб ридизац ии
проб ы с м атриц ей вторичная структура разруш ается, ф луоресц ентная м етка и
туш итель расходятся вразные стороны, и ф луоресц енц ия от м етки м ож ет
б ыть детектирована.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
19
Рисунок 5. П ринц ип Molecular Beacons. С вечение ф лю ороф ора
начинается послеего гиб ридизац ии см атриц ей.
В
м етодике LightCycler используется две проб ы, м еченые
ф луоресц ентной м еткой. П ринц ип м етода заклю чается впереносе энергии от
одного ф луороф ора, находящ егося на 3'-конц е первой проб ы, ко втором у
ф луороф ору, находящ ем уся на 5'-конц е второй проб ы, который происходитв
том случае, когда расстояние м еж ду ф луороф орам и составляет 1 - 3
нуклеотида.
П ри исследовании об разц ов каж дая
серия
эксперим ентов
сопровож дается постановкой ам плиф икац ии с контрольным и об разц ам и в
которых заведом о известно количество копий Д Н К. С равнение кинетики
накопления продуктов ам плиф икац ии в реакц ионных см есях в
эксперим ентальном и контрольных об разц ах позволяет полуколичественно
оц енить конц ентрац ию Д Н Квдиапазонеразведений контрольных препаратов
Д Н К.
Рисунок6. П ринц ип LightCycler. С вечение ф лю ороф ора происходит за
счетэнергии донора.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
20
1.7 Амплификац ия РН К
В озм ож ность использования РН К в качестве м иш ени для П ЦР
сущ ественно расш иряет спектр прим енения этого м етода. П ри выявлении
РН К необ ходим о впервую очередь перевести ее вф орм у Д Н К. Д ля этого
использую т ф ерм ент об ратную транскриптазу, который выделяю т из двух
различных вирусов: Аvian myeloblastosis virus и Moloney murine leukemia virus.
И спользование этих ф ерм ентовсвязано с некоторым и трудностям и. П реж де
всего, они терм олаб ильны и поэтом у м огут б ыть использованы при
тем пературе не выш е 42°С . Т аккакпри такой тем пературе м олекулы РН К
легко об разую т вторичные структуры, то эф ф ективность реакц ии зам етно
сниж ается и по разным оц енкам приб лизительно равна 5 %. Д анную проб лем у
возм ож но об ойти, используя в качестве об ратной транскриптазы
терм остаб ильную
полим еразу,
полученную
из
терм оф ильного
м икроорганизм а Thermus Thermophilus (Tth Д Н К-полим ераза), проявляю щ ую
транскриптазную активность в присутствии Mn2+. Э то единственный
известный ф ерм ент, способ ный проявлять как полим еразную так и
транскриптазную активность.
Д ля проведения реакц ии об ратной трансрипц ии вреакц ионной см еси
такж е, каки вП ЦР, долж ны присутствовать прайм еры вкачествезатравки и
см есь 4-х дН Т Ф как«строительный м атериал» и соответствую щ ую б уф ерную
систем у. П осле проведения реакц ии об ратной транскрипц ии полученные
м олекулы кД Н Км огутслуж ить м иш енью для проведения П ЦР.
1.8 П р имен ен иеП ЦР
Результаты, достигаем ые с пом ощ ью П ЦР, позволили этом у м етоду
занять ведущ ее м есто в м олекулярной б иологии как по популярности
использования внаучных исследованиях ф ундам ентального характера, таки
практическом уприм енению вм едиц инских ц елях.
П олим еразная ц епная реакц ия в настоящ ее врем я является наиб олее
соверш енным
диагностическим
м етодом
м олекулярной б иологии,
м олекулярной генетики и клинической лаб ораторной диагностики,
позволяю щ им выявлять в тканях и б иологических ж идкостях организм а
единичные клетки возб удителей м ногих инф екц ионных заб олеваний,
выявлять и идентиф иц ировать даж еоднонуклеотидныеизм енения вструктуре
генов. Т аким об разом , основным достоинством м етода П ЦР является
чрезвычайно высокая чувствительность.
И спользуем ые в м едиц инской практике тест-систем ы, основанные на
принц ипе ам плиф икац ии Д Н К, позволяю т об наруж ивать патогенные для
человека б актерии и вирусы даж е втех случаях, когда другим и способ ам и
(им м унологическим , б актериологическим ) их выявление невозм ож но.
В озм ож ности, залож енныевм етодеП ЦР, позволяю тдостигать м аксим альной
спец иф ичности анализа, т.е. способ ности выявлять Д Н К конкретного
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
21
инф екц ионного агента вприсутствии Д Н К других м икроорганизм ови Д Н К
организм а-хозяина.
Д ругим достоинством м етода является то, что для П ЦР-диагностики
практически всех инф екц ионных заб олеваний, а такж е наследственных
заб олеваний человека, м ож ет б ыть использован один наб ор об орудования,
универсальные проц едуры проб о-подготовки и постановки анализа, а такж е
однотипные (отличаю щ иеся в основном структурой прайм еров) наб оры
реактивов. У ниф иц ированный м етод об раб отки б иом атериала и детекц ии
продуктов реакц ии, и автом атизац ия проц есса ам плиф икац ии даю т
возм ож ность провести полноеисследованиевтечение4 - 5 часов.
О соб енно эф ф ективен м етод П ЦР для диагностики труднокультивируем ых, некультивируем ых ф орм м икроорганизм ов, поскольку этот
м етод позволяет изб еж ать слож ностей, связанных с выращ иванием таких
м икроорганизм оввлаб ораторных условиях. П рим енение П ЦР-диагностики
такж е крайне эф ф ективно вотнош ении возб удителей с высокой антигенной
изм енчивостью и внутриклеточных паразитов. С ледуетотм етить, что м етодом
П ЦР возм ож но выявление возб удителей не только вклиническом м атериале,
полученном отб ольного, но и вм атериале, получаем ом из об ъектоввнеш ней
среды (вода, почва), и впродуктах питания.
В ысокая чувствительность и спец иф ичность, непосредственное
об наруж ение инф екц ионного агента и возм ож ность проведения
генотипирования лю б ого гена человека определяю т ш ирокую об ласть
прим енения м етода П ЦР вклинической диагностикеи м едиц инской практике.
М етод П ЦР вреальном врем ени (Real-Time PCR) позволяет проводить
детекц ию продуктовам плиф икац ии впроц ессе реакц ии и вести м ониторинг
кинетики накопления ам пликонов. Д анный способ детекц ии является
альтернативой электроф оретическом у м етоду и им еет ряд сущ ественных
преим ущ еств:
- высокая спец иф ичность детекц ии об условленная прим енением
гиб ридизац ионной схем ы
с использованием
высокоспец иф ичных
олигонуклеотидных зондов;
- высокая производительность;
- возм ож ность проведения реакц ии ам плиф икац ии и детекц ии водном
приб оре, что сущ ественно сниж ает риск контам инац ии ам пликонам и и
значительно сокращ аетрискош иб ки оператора;
- возм ож ность количественной оц енки исходной Д Н К м атриц ы (анализ
экспресси генов, хром осом ных транслокац ий, трансгенный анализ);
- возм ож ность анализа точечных м утац ий;
- регистрац ия и учетданных вэлектронном ф орм ате.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
22
К ЛОН И РОВ АН И Е Д Н К
М етодом клонирования ф рагм енты Д Н К лю б ого вида, полученные с
пом ощ ью рестриктаз, м ож но ввести вплазм иду или вб актериоф аг, получив
таким об разом , вектор м олекулярного клонирования, а затем разм нож ить эти
генетическиеэлем енты вклетках б актерии или дрож ж ей, увеличивая их число
вм иллионы раз.
В страиваниеф рагм ента Д Н Квплазм иду осущ ествляется in vitro,а затем
рекомби на нт на я ДНК вводится вклетки б актерии-хозяина. Н аиб олее часто в
роли хозяина выступает детально изученный ш там м Е. coli К12, а вроли
вектора - плазм иды или ф аги этой б актерии.
В ц елом б актерии м огут приоб ретать новый генетический м атериал
трем я путям и: т ра нсформа ц и ей, конъюга ц и ей или т ра нсдукц и ей.
Т ра нсформа ц и я представляет соб ой изм енение генотипа клетки путем
внесения внее Д Н К из культуральной среды. В м олекулярной б иологии этот
терм ин об означает стаб ильное изм енение генотипа и ф енотипа клетки.
К онъюга ц и я об означает прям ой перенос Д Н К из одной клетки (донора) в
другую клетку (рец ипиент) через особ ый б елковый м остик (канал),
возникаю щ ий м еж ду клеткам и. У Е. coli этот перенос заним ает прим ерно 90
м ин. У становив врем я, необ ходим ое для переноса определенных генов в
проц ессе конъю гац ии, удается построить генет и ч ескую ка рт у б актерии.
Т ра нсдукц и я происходит с участием б актериоф агов, которые вводят вД Н К
клетки новыегенетическиеэлем енты.
П ри использовании ф агов в генетической инж енерии носителем
реком б инантной Д Н К является
популяц ия
ф аговых
частиц , и
реком б инантный ф аговый геном м ож но клонировать непосредственно (в
чаш ках П етри) на газоне клеток-хозяев, где об разую тся ф аговые б ляш ки.
Затем их м ож но ввести в клетки б актерий в виде изолированной Д Н К
(трансф екц ия) либ о ввиде реконструированных ф аговых частиц (инф екц ия).
П роц едура получения реком б инантных Д Н К и их клонирования основана на
тех ж е принц ипах, что и трансдукц ия. П ом им о б актериоф аговвней использую тся плазм иды.
2.1 П л аз ми дн ы ев ек т о р ы
П лазм иды - это внехром осом ные автоном но реплиц ирую щ иеся
ц вухц епочечные кольц евые м олекулы Д Н К. П лазм иды есть практически у
всех б актерий. О дни из них содерж ат инф орм ац ию , об еспечиваю щ ую их
соб ственный перенос из одной клетки вдругую (F-плазм иды), другие несут
гены устойчивости кантиб иотикам (R-плазм иды) или спец иф ические наб оры
генов, ответственных за утилизац ию необ ычных м етаб олитов (плазм иды
деградац ии). Е сть плазм иды, вкоторых не об наруж ены гены, выполняю щ ие
какие-то определенные ф ункц ии (критические плазм иды; от англ, cryptic -
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
23
скрытый, латентный). Разм еры плазм ид варьирую т от м енее 1 до б олее 500
т.п.н. Каж дая из них содерж ит сайт начала репликац ии (ori), б ез которого
репликац ия плазм иды вклетке-хозяинеб ыла б ы невозм ож на.
Н екоторые плазм иды представлены в клетке 10 - 100 копиям и; они
называю тся высококопийным и. Н изкокопийные плазм иды присутствую т в
клеткевчисле1 - 4 копий. Н а долю плазм идной Д Н К об ычно приходится 0.1
– 5.0 % сум м арной клеточной Д Н К. Е сли две или б олее плазм иды не м огут
сосущ ествовать водной и той ж е клетке, то говорят, что они принадлеж ат к
одной группе несовм естим ости. П лазм иды, относящ иеся к разным группам
несовм естим ости, б еспрепятственно сущ ествую т водной клетке, независим о
от числа копий. У некоторых м икроорганизм ов в одной клетке б ыло
об наруж ено до 8 - 10 разных плазм ид, при этом каж дая из них выполняла свои
ф ункц ии, б ыла представлена характерным для неечислом копий и относилась
к своей соб ственной группе несовм естим ости. О дни плазм иды несут
спец иф ичный сайт иниц иац ии репликац ии и м огут реплиц ироваться только в
клетках одного вида. У других плазм ид этот сайт м енее спец иф ичен, и они
реплиц ирую тся в сам ых разных б актериальных клетках. С оответственно
различаю тплазм иды сузким и сш ироким спектром хозяев.
Как автоном но реплиц ирую щ иеся генетические элем енты плазм иды
об ладаю т всем и основным и свойствам и, которые позволяю т использовать их
в качестве вектора для переноса клонируем ой Д Н К. Н о довольно часто
природные (нем одиф иц ированные, несконструированные) плазм иды б ываю т
лиш ены некоторых об язательных для вектора свойств. К таким важ ным
свойствам относятся: 1) неб ольш ой разм ер, поскольку эф ф ективность
переноса экзогенной Д Н К в Е. coli значительно сниж ается при длине
плазм иды б олее 15 т.п.н.; 2) наличие уникального сайта рестрикц ии, в
который м ож ет б ыть осущ ествлена вставка; 3) наличие одного или б олее
селективных генетических м аркеров для идентиф икац ии рец ипиентных
клеток, несущ их реком б инантную Д Н К. П оэтом у плазм идные векторы в
основном созданы спом ощ ью генной инж енерии.
П ла змидны й вект о р pBR322
П лазм идный вектор pBR322 один из универсальных векторов. О б ычно
об означение плазм идного вектора вклю чает строчную б укву p (от англ,
plasmid) и ещ енесколько б укв, им ею щ их отнош ение кописанию вектора или
к истории его создания. Т ак, б уквы BR в об означении плазм иды pBR322
указываю т на авторство Ф . Боливара и Р. Родригеса, сконструировавш их эту
плазм иду, а число 322 —
ц иф ровое об означение, взятое из их
исследовательских протоколов. Д лина плазм иды pBR322 — 4361 п.н. О на
несет два гена устойчивости к антиб иотикам , ам пиц иллину (Amp) и
тетрац иклину(Tet), a такж еуникальныесайты для BamHI, HindIII и SalI вгене
Т еt, один PstI-сайт в гене Аmр, один сайт для EcoRI, находящ ийся за
пределам и кодирую щ их последовательностей, и сигнал начала репликац ии,
об еспечиваю щ ий репликац ию
исклю чительно в E. coli. П лазм ида
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
24
реплиц ируется с об разованием б ольш ого
б актериальныеклетки переносится струдом .
числа
копий,
в другие
Рисунок 7. С хем а строения плазм идного вектора pBR322. ori – точка
начала репликац ии, стрелкой об означено направлениерепликац ии; Amp и Tet
– гены устойчивости уам пиц иллинуи тетрац иклину.
Как раб отает клонирую щ ий вектор pBR322? Е сли очищ енную
кольц евую плазм иду pBR322 об раб отать рестриктазой, расщ епляю щ ей ее в
единственном сайте, располож енном водном из геновустойчивости ктом у
или другом у антиб иотику, то об разуется линейная м олекула с липким и
конц ам и. Т акие м олекулы см еш иваю т с донорной Д Н К, содерж ащ ей нуж ный
ген и предварительно об раб отанной такой ж ерестриктазой. П осколькулипкие
конц ы этих двух Д Н К взаим но ком плем ентарны, они спариваю тся с
об разованием гиб ридных м олекул. Д алее см есь об раб атываю т Д Н К-лигазой
ф ага Т 4 вприсутствии АТ Р, врезультате чего об разуется м нож ество разных
ком б инац ий ф рагм ентов, а такж е неж елательные продукты, в частности
об ъединивш иеся м еж ду соб ой ф рагм енты донорной Д Н К и исходные
плазм идные Д Н К. Ч тоб ы ум еньш ить количество последних, об раб атываю т
рестриц ированную плазм идную Д Н Кщ елочной ф осф атазой, отщ епляю щ ей от
линеаризованной м олекулы 5'-ф осф атные группы: Д Н К-лигаза не м ож ет
сш ить конц ы деф осф орилированной линейной плазм идной Д Н К. Ч то касается
соб ственно реком б инантных м олекул Д Н К, то хотя в них и им ею тся два
одноц епочечных разрыва, ее ф рагм енты удерж иваю тся вм есте двум я
ф осф одиэф ирным и связям и, об разовавш им ися спом ощ ью Д Н К-лигазы м еж ду
деф осф орилированной плазм идной Д Н К и рестриц ированной донорной Д Н К.
П осле репликац ии втрансф орм ированной клетке одноц епочечные разрывы
устраняю тся систем ой лигирования клетки-хозяина.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
25
А
Б
Рисунок 8. А) об разованием липких конц ов рестриктазой EcoRI. Б)
С хем а об разования гиб ридной плазм иды.
Т ра нс фо рма ция и о т б о р
Т еперь необ ходим о ввести реком б инантную Д Н К в клетку-хозяина.
Э тот проц есс называется трансф орм ац ией. Д ля его осущ ествления
использую т спец иально разраб отанные прием ы, наприм ер подвергаю тклетки
высокотем пературном у воздействию и об раб атываю тих хлористым кальц ием
(С аС 12), О днако эф ф ективность трансф орм ац ии все ж е остается невысокой,
об ычно трансф орм ируется не б олее одной клетки из тысячи. Т аким об разом ,
б ольш инство клеток после проведения трансф орм ац ии не содерж ат
реком б инантной Д Н К. В некоторых из них появляется воссоединивш аяся
кольц евая плазм идная Д Н К, изб еж авш ая деф осф орилирования щ елочной
ф осф атазой, вдругих - неплазм идная Д Н К и лиш ь внекоторых - плазм ида со
встроенным ф рагм ентом чуж еродной Д Н К(гиб ридная плазм ида).
Как м ы уж е говорили, внехром осом ная Д Н К, не содерж ащ ая точки
начала репликац ии, нем ож етреплиц ироваться вб актериальной клетке. Т аким
об разом , проникновение вклетку экзогенной Д Н К, ещ е не означает, что она
б удет поддерж иваться в хозяйской клетке. Д алее, для сохранения
реком б инантной Д Н К вклетке-хозяине впервоначальном виде необ ходим о,
чтоб ы вклетке отсутствовали гены, кодирую щ ие синтез рестриктаз, которые
м огут привести кее деградац ии, и чтоб ы клетка им ела ф енотип RecA– (такие
клетки неспособ ны коб щ ей реком б инац ии, такчто экзогенная Д Н К не б удет
м одиф иц ироваться врезультатегом ологичной реком б инац ии).
Затем
необ ходим о
идентиф иц ировать
клетки,
содерж ащ ие
реком б инантную Д Н К. С пособ идентиф икац ии долж ен б ыть какм ож но б олее
простым , поскольку приходится проверять огром ное число клеток. В систем е
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
26
pBR322, в которой чуж еродная Д Н К встраивается в сайт В а mHI,
спец иф ическая идентиф икац ия состоит из двух этапов. С начала клетки после
трансф орм ац ии высеваю тна питательную среду, содерж ащ ую ам пиц иллин. В
таких условиях м огут вырасти только те клетки, в которых присутствует
интактный ген Аmр — или всоставе интактной плазм иды pBR322, или в
составегиб ридной плазм иды; нетрансф орм ированныеклетки чувствительны к
ам пиц иллину. С айт BamHI располож ен в гене Tet плазм иды pBR322;
встраивание в этот ген ф рагм ента Д Н К прерывает кодирую щ ую
последовательность, и устойчивость к тетрац иклину утрачивается. Т аким
об разом , клетки, несущ иегиб ридную плазм иду, устойчивы кам пиц иллину, но
чувствительны к тетрац иклину, а клетки, получивш ие интактную плазм иду
pBR322, несутген Tet и устойчивы каккам пиц иллину, таки ктетрац иклину.
Н а втором этапе проводят разделение этих двух вариантов. Клетки,
выросш ие на среде с ам пиц иллином , переносят на среду с тетрац иклином
м етодом перепечатки. Клетки, об разую щ ие колонии на чаш ках с
тетрац иклином , содерж ат интактную плазм иду pBR322, поскольку, как м ы
уж еговорили, они устойчивы и кам пиц иллину, и ктетрац иклину. Клетки, не
выросш ие на чаш ках с тетрац иклином , чувствительны кэтом у антиб иотику,
значит, они содерж атгиб ридную плазм идуpBR322.
С реди колоний, выросш их на среде с ам пиц иллином , выделяю т те,
которые оказались чувствительны к тетрац иклину, и из каж дой колонии
получаю т индивидуальные клеточные клоны или об ъединяю т все колонии,
устойчивые к ам пиц иллину и чувствительные к тетрац иклину, и
культивирую т их вм есте. Д алее м ож но провести дополнительный скрининг и
идентиф иц ировать те клетки, которые несут гиб ридную плазм иду pBR322 со
спец иф ической вставкой. П рисутствиесайтовHindIII и SalI в генеTet и сайта
PstI в гене Аmрr плазм иды pBR322 позволяет изм енить локализац ию
клонированных ф рагм ентов чуж еродной Д Н К. Е сли для встраивания
используется сайт PstI, то отб ор проводится по той ж е схем е, но вдругом
порядке, т. е. сначала высеваю т клетки на среду с тетрац иклином , а затем - с
ам пиц иллином .
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
27
Рисунок 9. Клонирование Д Н К вб актериальную клетку и наращ ивание
м ассы культуры.
Д руг
ие п ла змидны е вект о ры
И дея использовать pBR322 как вектор для клонирования б ыла вполне
удачной, но эта плазм ида содерж ит лиш ь несколько сайтоврестрикц ии, а
отб ор трансф орм ированных клетокзаним ает м ного врем ени. Э то привело к
необ ходим ости разраб отки альтернативных систем клонирования. Н априм ер,
плазм ида pBluescript SK (+/-) длиной 3 т.п.н. содерж ит: ген устойчивости к
ам пиц иллину; регулируем ый сегм ент гена β-галактозидазы (lacZ') лактозного
оперона E. coli, ген lacI, кодирую щ ий репрессор, который контролирует
экспрессию гена lacZ'; полилинкер - короткую последовательность с
м нож еством уникальных сайтов узнавания для эндонуклеаз; точку начала
репликац ии плазм иды pUC 19.
П ри отб оре трансф орм ированных клетокруководствую тся следую щ им и
сооб раж ениям и. Е сли клетки, содерж ащ ие нем одиф иц ированную плазм иду
pBluescript SK (+/-), выращ ивать в присутствии изопропил-β-Dтиогалактопиранозида (И П Т Г ), который является индуктором lac-оперона, то
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
28
продукт гена lad не см ож ет связаться с пром оторно-операторной об ластью
гена lacZ', и как следствие б удут происходить транскрипц ия и трансляц ия
плазм идного ф рагм ента гена lacZ'. П родукт этого ф рагм ента свяж ется с
б елком , кодируем ым хром осом ной Д Н К, и врезультате об разуется активная
ß-галактозидаза. П оследовательность с м нож еством сайтов рестрикц ии
(полилинкер) встроена в ген lacZ' так, что она не влияет на продукц ию
ф ункц иональной β-галактозидазы, и если всреде присутствует ее суб страт 5б ром -4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозид (X-Gal), то он б удет
гидролизоваться под действием этого ф ерм ента с об разованием продукта
синего
ц вета,
окраш иваю щ его
колонии
клеток,
содерж ащ их
нем одиф иц ированную плазм идуpBluescript SK (+/-).
Рисунок10. С хем а строения плазм идного вектоар pBluescript. LacZ – ген,
кодирую щ ий ф ерм ентß-галактозидазу.
Д ля клонирования вpBluescript SK (+/-) донорную Д Н К расщ епляю т
одной из рестриктаз, чей сайт находится вполилинкере; плазм идную Д Н К
гидролизую т такой ж е рестриктазой, а затем об раб атываю т щ елочной
ф осф атазой. О б е Д Н К см еш иваю т в присутствии Д Н К-лигазы Т 4 и
использую т об разовавш ийся продукт для трансф орм ац ии клеток, которые
м огутсинтезировать ту часть ß-галактозидазы (LacZα), которая соединяется с
продуктом гена lacZ с об разованием активного ф ерм ента. О б раб отанные
клетки высеваю тна питательную среду сам пиц иллином , И П Т Г и суб стратом
для ß-галактозидазы. Н етрансф орм ированные клетки не м огут расти в
присутствии ам пиц иллина, а клетки, несущ ие интактную плазм иду, об разую т
на среде с ам пиц иллином колонии синего ц вета. Клетки-хозяева, несущ ие
гиб ридную плазм иду, об разую тна той ж есам ой средеб елыеколонии.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
29
С Е К В Е Н И РОВ АН И Е Д Н К
В аж ность определения нуклеотидных последовательностей Д Н К уж е
давно не вызывала никаких сом нений. В озм ож ность получения б лагодаря
разраб отанным м етодам секвенирования Д Н Кпринц ипиально новых сведений
в виде генетических текстов, ранее недоступных, оказала значительное
влияниена дальнейш ееразвитиенетолько сам ой м олекулярной б иологии, но
и об щ ей б иологии и других см еж ных об ластей знаний.
Классические м етоды секвенирования Д Н К хим ической деградац ией и
ф ерм ентативным
построением
ком плем ентарной ц ели в условиях
спец иф ической терм инац ии кардинально различаясь в своих подходах,
треб ую т разделения м еченых ф рагм ентовД Н К, отличаю щ ихся но длине на
один нуклеотид, в полиакрилам идном гель-электроф орезе высокого
разреш ения. В сесоставляю щ иепроц есса секвенирования Д Н К об оих м етодов
значительно различается и подвергается постоянной м одиф икац ии.
3.1 М ет о д по лимер аз н о г о ко пир о ван ия (мет о д С э н г ер а)
Ф ерм ентативный синтез олиго(поли)дезоксириб онуклеотидов с пом ощ ью Д Н К-полим ераз, заклю чаю щ ийся в копировании м атричного полинуклеотида наш ел б лестящ ее прим енение в качестве одного из двух
наиб олее эф ф ективных м етодов установления первичной структуры Д Н К.
М етод состоит в получении б локов-копий полидезоксириб онуклеотида,
структура которого изучается. П ри этом об язательным является выполнение
двух условий. В о-первых, копирование долж но проводиться, начиная с
определенного м оном ерного звена. В о-вторых, синтез копий следует
осущ ествлять четырераза, каж дый раз останавливая его поочередно на каком либ о одном из четырех м оном ё рных звеньев(A, Г , Ц или Т ). О пределение
длины каж дой копии позволяет установить полож ение данного м оном ерного
звена в ц епи исследуем ого полинуклеотида. Д лина копии определяется
ф ракц ионированием вполиакрилам идном геле. Э тот м етод, таким об разом ,
такж е каки м етод, основанный на м одиф икац ии оснований позволяет получать инф орм ац ию о полож ении определенного м оном ерного звена в ц епи
полинуклеотида прям о послеф ракц ионирования.
Д ля получения копии исследуем ого полинуклеотида в последнем
выб ираю т точку отсчета, что достигается введением в систем у ф ерм ентативного синтеза в качестве нуклеозидного ком понента олигонуклеотидазатравки. Т акой олигонуклеотид во всех копиях, об разую щ ихся врезультате
достраивания его ф ерм ентативным путем , остается постоянным 5'-конц евым
ф рагм ентом , т. е. является точкой отсчета. Копирование с пом ощ ью Д Н Кполим еразы в присутствии всех четырех дезоксириб онуклеозид-5'пироф осф атов (один из них б ерется 32Р-м еченным ) проводят в течение
ограниченного врем ени. Цель этого этапа - проведение статистически
ограниченного синтеза для получения всех возм ож ных копий, начиная с
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
30
затравки, достроенной на одно, два и т. д. звеньев, и вклю чая полную копию
изучаем ого полинуклеотида. В идеалесм есь долж на вклю чать всевозм ож ные
полинуклеотиды, синтез которых статистически прекращ ается где-то в
середине м атричного полинуклеотида в районе ATГ ЦTГ м атричной
последовательности. Н а практикеразличныеком поненты см еси присутствую т
вразных количествах. Е сли такую см есь далее подвергнуть электроф орезу в
полиакрилам идном геле вопределенных условиях, когда скорость движ ения
пропорц иональна длине ц епи, на электроф ореграм м е об наруж ивается серия
полос,
представляю щ их
различные
олигонуклеотиды.
Т акое
ф ракц ионирование об ычно не проводят, хотя оно м ож ет использоваться
для контроля на заверш аю щ ем этапеанализа.
Рисунок
11.
И спользование
ф ерм ентативного
синтеза
олиго(поли)дезоксириб онуклеотидовдля определения первичной структуры
Д Н К.
И нкуб ац ионную см есь 32Р-м еченных олигонуклеотидов различной
длины ввиде ком плексовс м атричным полинуклеотидом подвергаю т гельф ильтрац ии для удаления дезоксириб онуклеозид-5'-триф осф атови аликвоты
реакц ионной см еси реинкуб ирую тсД Н К-полим еразой вразличных условиях.
В случае"м инус-систем ы" реинкуб ац ию проводятвприсутствии только
трех дезоксириб онуклеозид-5'-три-ф осф атов. Н априм ер, в «- А-систем е»
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
31
отсутствует дATP и каж дая копия всм еси достраивается с пом ощ ью Д Н Кполим еразы до м еста, в котором следую щ им м оном ерным звеном долж ен
б ыть остатокpдA (т.е. Т вм атричном полинуклеотиде). О б разую щ ую ся см есь
ф ракц ионирую т
с
пом ощ ью
электроф ореза
и
об наруж иваю т
(ауторадиограф ически) ограниченное количество полос (их количество равно
количеству Т в м атричном полинуклеотиде). Аналогично проводят
копированиевотсутствиедругих суб стратов: - дГ TФ , - дЦTФ или - дTTФ ( Г -, - Ц- и - Т -систем ы соответственно). В се четыре ионоф ореза проводят в
полиакрилам идном геле параллельно. П олученные ауторадиограм м ы
позволяю т сразу написать нуклеотидную последовательность, причем чтение
ц епи снизу вверх соответствует 5' → 3'-полярности ц епи копии. Н априм ер,
полож ениесам ого короткого олигонуклеотида (в" - Т -систем е") указываетна
то, что следую щ ий за ним по длине олигонуклеотид заканчивается на Т , т. е.
что противполосы, располож енной выш е(это полоса в - А-систем е), следует
записать б укву Т . Т аким ж е об разом записываю т далее впоследовательности
б укву А (на основании полож ения следую щ его по длине олигонуклеотида,
который оказался в "- А-систем е") и т. д. Д ля проверки этих данных
использую т результаты анализа с пом ощ ью "плю с-систем ы". В этом случае
дополнительное копирование (после первого этапа) проводят вприсутствии
Д Н К-полим еразы, выделенной из б актериоф ага Т 4, которая проявляет 3'экзонуклеазную активность, т. е. отщ епляетм ононуклеотиды один за другим с
3'-конц а. В то ж еврем я вприсутствии суб стратовееполим еразная активность
во м ного раз превосходит экзонуклеазную . Т ак, если вреакц ионной см еси
присутствует хотя б ы один дезоксириб онуклеозид-5'-триф осф ат (дATФ в"
+А-систем е"), деградац ия каж дой копии, об разовавш ейся на первой стадии
анализа, б удет проходить вплоть до м еста полож ения А. С м еси параллельно
подвергаю т электроф орезу, как и в предыдущ ем случае, и получаю т
ауторадиограм м ы, из которых сразу считывается последовательность 5' → 3'направление, считывается такж е снизу вверх). И з сравнения ф ореграм м
"плю с-" и "м инус-систем " делается однозначный вывод о нуклеотидной
последовательности вкопиях и, следовательно, вм атричном полинуклеотиде.
П рим еним ость м етода С энгера зависит от возм ож ности получения
одноц епочечных копий клонированных Д Н К. Д ля этой ц ели м ож но
использовать векторы на основе б актериоф ага М 13. Д вухц епочечную
чуж еродную Д Н К м ож но клонировать в двухц епочечной репликативной
ф орм еф аговой Д Н К.
3.2 Х имическо есеквен ир о ван ие(по М аксаму-Г илбер т у)
Н есм отря на относительно низкую производительность м етода секвенирования Д Н К путем хим ической деградац ии по М аксам у-Г илб ерту в
сравнении с ф ерм ентативным м етодом секвенирования Д Н К по С энгеру, этот
м етод внастоящ ее врем я все ж е продолж ает использоваться и вотдельных
случаях почти незам еним . Т ак, м етод хим ической деградац ии прим еняется
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
32
для секвенирования синтетических олигонуклеотидоввтех случаях, когда это
необ ходим о. О соб о "трудные" участки с сильной вторичной структурой не
всегда б ывает возм ож но секвенировать с пом ощ ью ф ерм ентативного
построения новой ц епи Д Н К и тогда использую тданный м етод. Кром еэтого,
с пом ощ ью
секвенирую щ его гельэлектроф ореза возм ож но выявление
Д Н К/б елковых взаим одействий послетого, какисследуем ая Д Н Квком плексе
с б елком б ыла подвергнута хим ической м одиф икац ии по М аксам у-Г илб ерту.
К некотором у преим ущ еству м етода секвенирования Д Н К хим ической деградац ией м ож но отнести то, что здесь определяется последовательность
ф рагм ента Д Н К, или геном ного, или клонированного, в каком -либ о
подходящ ем
векторе (т.е. реплиц ировавш егося in vivo), а не
новосинтезированная in vitro копия, как в ф ерм ентативном м етоде с
дидезокситерм инаторам и. Е щ е одно отличие м етода секвенирования Д Н К по
М аксам у-Г илб ерту от м етода С энгера заклю чается в том , что его осущ ествление м ож ет начаться практически с лю б ого сайта узнавания какойниб удь рестрикц ионной эндонуклеазы, присутствую щ его во вставке и
поэтом у не треб уется предварительного знания даж е неб ольш ого участка
нуклеотидной последовательности, окруж аю щ его данное м есто. В этой связи
м етод секвенирования Д Н Кпутем хим ической деградац ии иногда выступаетв
качестве стартового при выполнении крупном асш таб ных проектов по
определению нуклеотидных последовательностей протяж енных ф рагм ентов
Д Н К. В то ж е врем я нельзя не отм етить серьезный недостаток м етода
секвенирования Д Н К по М аксам у-Г илб ерту, заклю чаю щ ийся в высокой
токсичности б ольш инства используем ых реагентов, об ращ ение с которым и и
их дальнейш ая утилизац ия треб ую тсоб лю дения определенных правил.
В основе м етода секвенирования Д Н К путем хим ической деградац ии
леж ит ограниченное расщ епление м еченого ф рагм ента Д Н К под действием
спец иф ических
реагентов.
Н епрем енным
условием
проведения
секвенирования этим м етодом является наличие ф рагм ента Д Н К, м еченного
только по одном у конц у. Разделение продуктов деградац ии по разм еру с
пом ощ ью
высоковольтного электроф ореза в полиакрилам идном геле
высокого разреш ения, способ ного разделять ф рагм енты Д Н К, различаю щ иеся
м еж ду соб ой по длине всего на один нуклеотид в достаточно ш ироком
диапазоне, и последую щ ая радиоавтограф ия геля позволяет определить
нуклеотидную последовательность секвенированного участка Д Н К.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
33
Рисунок12. С еквенированиеД Н Км етодом хим ической деградац ии.
П ервым этапом при проведении реакц ии хим ической деградац ии
является ограниченная м одиф икац ия определенных нуклеотидов под
действием различных хим ических агентов. Конц ентрац ия агента и продолж ительность его воздействия на м олекулы Д Н К подб ирается с таким
расчетом , чтоб ы вкаж дой м олекуле произош ла м одиф икац ия только одного
нуклеотида, а поскольку в реакц ионной см еси присутствует огром ное
количество таких м олекул, то, согласно теории вероятности, все основания
данного
типа
в секвенируем ом
ф рагм енте
ДНК
окаж утся
м одиф иц ированным и. С ледую щ ие этапы удаления м одиф иц ированных
оснований и элим инац ии об оих ф осф атов, окруж аю щ их дезоксириб озу, и
разрыва ц епи долж ны проходить уж е количественно. Д ля каж дого типа
нуклеотидовили их ком б инац ии проводят отдельные реакц ии ограниченной
м одиф икац ии и количественного расщ епления. Т аким об разом , врезультате
четырех (или иногда трех, пяти или даж е ш ести) типовреакц ий об разуется
см есь олигонуклеотидных м олекул, различаю щ ихся по разм еру на один
нуклеотид и несущ их на одном из конц ов м етку, об ычно радиоактивную .
С ледует отм етить, что кром е м еченых м олекул вреакц ионной см еси б удут
представлены, и олигонуклеотидные ф рагм енты, не несущ ие м етки, но на
этапе радиоавтограф ии они окаж утся невидим ым и и поэтом у для данного
м етода они как б ы не сущ ествую т. П осле разделения продуктовреакц ии в
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
34
соседних дорож ках секвенирую щ его денатурирую щ его полиакрилам идного
геля и этапа радиоавтограф ии на рентгеновской пленке б удетвидна лестниц а
из полос Д Н К на соседних дорож ках, "чтение" которой позволяет
восстановить последовательность нуклеотидов секвенируем ого ф рагм ента
Д Н К.
3.3 Авт о мат ическо есеквен ир о ван ие
В последнее врем я ш ироко прим еняю тся спец иализированные приб оры
для проведения и считывания результатов секвенирования. И спользование
данных приб оровпозволило увеличить качество считывания инф орм ац ии с
аутограм м ы, а такж езначительно об легчить сам упроц едуру подготовки Д Н К.
Т ак, для секвенирования м олекулы Д Н К стало не об язательным ее
клонирование,
появилась
возм ож ность
определять
нуклеотидную
последовательность П ЦР-продукта. Ам плиф икац ия определенных ф рагм ентов
Д Н К с пом ощ ью спец иф ических прайм еров, приводящ ая за короткий
пром еж утокврем ени кнараб отке значительных количествнуж ных участков
Д Н К, явилась альтернативой м етоду клонирования. П оэтом у удельный вес
П ЦР-секвенирования
в
об щ ем
определении
нуклеотидных
последовательностей различных Д Н К внастоящ ее врем я б ыстро возрастает.
П рям ое секвенирование ф рагм ента Д Н К, полученного в результате
ам плиф икац ии, взначительной м ересним ало проб лем уош иб очно встроенных
Taq Д Н К-полим еразой нуклеотидов, поскольку вэтом случае секвенируется
сразувесь пул полученных вП ЦР м олекул.
Автом атическое секвенирование использует ф луоресц ентные м етки на
ддН Т Ф (для каж дого нуклеотида используется свой ц вет). Э то позволяетвсем
четырем реакц иям (дГ Т Ф , дАТ Ф , дЦТ Ф и дТ Т Ф ) проходить в одной
проб ирке. Д ля проведениеавтом атического секвенирования сначала проводят
ам плиф икац ию с неизвестной м атриц ы с использованием ф лю орисц ентно
м еченым и нуклеотид ф осф атам и, такж е как и в м етоде С енгера. В
реакц ионной см еси присутствую т как об ычные нуклеотиды, так и
дидезоксинуклеотиды, несущ ие ф лю орисц ентую группу. П осле проведения
капиллярного электроф ореза, производится ком пью терная детекц ия
результата. П оследовательное считывание отличаю щ ихся по ц вету ф ракц ия,
дает возм ож ность выстроить последовательность нуклеотидоввсекверуем ом
ф рагм енте.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
35
Рисунок13. С хем а автом атического секвенирования.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
36
Б ЛОТ И Н Г Н У К ЛЕ И Н ОВ Ы Х К И С ЛОТ
О дним из основных эксперим ентальных подходов при изучении
структурно-ф ункц иональной организац ии геном а и м еханизм ов генной
экспрессии является м етод м олекулярной гиб ридизац ии нуклеиновых кислот.
О н основан на возм ож ности об разования двуц епочечных гиб ридов м еж ду
искусственно создаваем ым и на основе одноц епочечных последовательностей
(риб о- или дезоксириб о-, олиго- или полинуклеотидных) м еченым и зонда ми и
ком плем ентарным и им последовательностям и в ми ш енях – анализируем ых
м олекулах Д Н К или РН К. Зонд м етится какой-либ о реп орт ерной груп п ой:
радиоактивным изотопом , ф луорохром ом , ф ерм ентом , даю щ им окраш енный
или лю м инесц ирую щ ий продукт и т.д. В ыявляя гиб рид б лагодаря наличию в
зонде репортерной группы, исследователь м ож ет оц енить число генов,
кодирую щ их определенный вид РН К, определить долю нетранскриб ируем ой
Д Н К вгеном е, установить сц епление определенных геновдруг сдругом и их
точное располож ение на хром осом ах. В ысокая чувствительность, то есть
возм ож ность выявить очень м алое количество (10-15 - 10-19 М ) м еченого зонда
и соответственно ком плем ентарной ем у последовательности в м иш ени, а
такж е б ыстрота анализа (от нескольких часов до трех дней) позволяю т
использовать м етод м олекулярной гиб ридизац ии не только в
исследовательской деятельности, но и для диагностики наследственных и
инф екц ионных заб олеваний вм едиц ине, ветеринарии и растениеводстве.
4.1 В иды мо лекуля р н о й г ибр идиз ац ии
Т ехника б лотинга различна для разных источниковнуклеиновых кислот.
Блот по С аузерну (Southern blot) и Н озерн б лот (nothern blot) использую т,
соответственно, для извлечения Д Н К или РН К из геля, а В естерн б лотинг –
для б елков.
Са узерн б ло т инг
.
С аузерн предлож ил оригинальную идею по переносу ф рагм ентовД Н Киз
агарозного геля на гиб ридизац ионную м ем б рану. Г ель пом ещ аю т на
ф ильтровальную б ум агу, находящ ую ся в контакте с б уф ером . М ем б рану
накладываю т на гель, а сверху укладываю т несколько слоевф ильтровальной
б ум аги, легко аб сорб ирую щ ей влагу. Бум ага служ ит своеоб разным
капиллярным насосом , способ ствуя вым ыванию ф рагм ентов Д Н К током
б уф ера из геля и переносу их на м ем б рану. Д алее Д Н К денатурирую т
щ елочью , а м ем б рану выдерж иваю т при 80оС или об лучаю т У Ф -светом , что
позволяет ф иксировать Д Н К на м ем б ране. Затем м ем б рану пом ещ аю т в
раствор с м еченым зондом , вкотором и происходит гиб ридизац ия. П осле отм ывки несвязавш ейся радиоактивности результат выявляю т с пом ощ ью
радиоавтограф ии или иных
способ ов в случае использования
нерадиоактивных м еток.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
37
Рисунок14. С хем а б лотинга по С аузерну.
Н о зерн б ло т инг
.
С тандартные условия б лотинга по С аузерну не прим еним ы кРН К, так
как она не связывается с об ычным и нитроц еллю лозным и и нейлоновым и
м ем б ранам и. Д ля им м об илизац ии РН К вначале б ыл предлож ен спец иальный
вид б ум аги с диазоб ензилоксим етилом (DMB-ц еллю лоза), а затем б ыли
найдены условия для нековалентного связывания РН К с нитроц еллю лозой
(предварительная денатурац ия РН К дим етилсульф оксидом , ф орм альдегидом
и др.) и разраб отаны для этого подходящ иенейлоновыеф ильтры. П о аналогии
с б лотингом по С аузерну (southern — ю ж ный) этот вид б лотинга б ыл назван
нозерн (nothern — северный).
М етод основан на анализе РН К, при которым определяется об щ ее
количество м РН К вденатурирую щ ем агарозном геле и идентиф иц ируется по
м еченом у об разц у в высуш енном геле непосредственно или на м ем б ране.
И спускаем ый сигнал пропорц ионален сум м е иском ой РН К в об щ ей м ассе
РН К.
С равнение сигналов от двух или б ольш е анализов показывает
относительные различия в уровнях выраж ения гена. Аб солю тный
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
38
соотнош ение м ож ет б ыть определено, сравнивая сигнал со стандартной
проб ой, используя известные количества стандартной РН К. И спользование
контрольных об разц ов позволяет норм ализовать результаты и исклю чить
влияние различных технических ф акторовна конечный результат, устраняя
лю б ые очевидные различия, вызванные неравной передачей РН К км ем б ране
или неравной погрузкеРН Кна геле.
В аж ным этапом при проведении Н озерн б лотинга является выделение
чистой, неповреж денной РН К. П оскольку даж е частично деградированные
об разц ы РН К сниж аю т интенсивность сигнала, который см азывается или
распределяется внесколько полосах или приводит кполной потери сигнала.
Риб онуклеазы (РН Казы) - ф ерм енты, которые полностью и б езвозвратно
инактивирую т РН К. П ри изоляц ии РН К, необ ходим о использовать РН азин в
течение или после проц едуры изоляц ии, чтоб ы создавать б ез РН Казную
окруж аю щ ую средудля изоляц ии РКН .
Д Н К -чип ы
О дно из сам ых б ольш их ограничений Н озерн анализа и - неспособ ность
анализировать б ольш е чем несколько предотоб ранных геноводноврем енно.
И спользование б иочиповсним ает это ограничение и позволяет исследовать
тысячи геновводном эксперим енте, давая б олеевсестороннеепредставление
о экспрессии геноввопределенных условиях.
Д Н К-чип представляет соб ой пластину площ адью около 1 см 2,
на которой в строго определенном порядке разм ещ ены ячейки,
каж дая из которых содерж ит одноц епочечные полинуклеотиды одной
определенной
последовательности
оснований.
Количество
таких
полинуклеотидных ячеек, а следовательно, и количество различных
нуклеотидных последовательностей м ож ет превыш ать 1 м лн на 1 см 2, их
длина варьируется от9 - 10 до 1000 нуклеотидов.
С ущ ествую т два основных направления создания Д Н К-чипов.
И сторически первым и б ыли м етоды разм ещ ения на чипах предварительно
хим ически синтезированных олигонуклеотидовили полученных с пом ощ ью
П ЦР одноц епочечных ф рагм ентов Д Н К. С ам ым главным преим ущ еством
является высокая гиб кость этих м етодов, позволяю щ ая создать чип слю б ым и
треб ую щ им ися последовательностям и, но этот подход им еет недостатки,
сильно ограничиваю щ ие его использование. П реж де всего, это огром ные
затраты труда, врем ени и средствна синтез треб уем ого количества различных
олигонуклеотидовили Д Н К. П лотность разм ещ ения Д Н К на таких чипах не
м ож етпревыш ать десятковтысяч на 1 см 2.
Д ругим б олее перспективным направлением является прим енение
разраб отанных для нуж д м икроэлектроники литограф ических технологий с
использованием ультраф иолетового излучения. Т акая технология позволяет
синтезировать олигонуклеотиды непосредственно на поверхности чипа. П ри
этом плотность их составляет несколько м иллионовна 1 см 2. Н едостатком
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
39
этой технологии является необ ходим ость литограф ических м асок, что
ограничивается трудоем ким и технологиям и.
Рисунок 15. Д Н К-чип
ф лю орисц ентной м етки.
после проявления
с
использованием
Г отовый чип гиб ридизируется с м еченным различным и способ ам и
Д Н К-суб стратом , представляю щ им соб ой об ычно кД Н К, синтезированную с
пом ощ ью об ратной транскрипц ии с м РН К изучаем ых тканей. Каж дый пул
кД Н К, приготовленный из двух разных об разц ов, делится на дверавныечасти
м олекул, в которые вводятся м еченые ф луоресц ентным и группировкам и
нуклеотиды (прям оеили непрям оевклю чение). О б ычно это зеленый Cyanine3
(Cy3) и красный Cyanine5 (Cy5). О б а м еченых об разц а об ъединяю тся для
совм естной конкурентной гиб ридизац ии. Д алее производится детекц ия
м еченных нуклеотидов с пом ощ ью спец иальных устройств, при этом
учитываю тся те олигонуклеотиды или Д Н К ф рагм енты, с которым и
гиб ридизировалась м еченая Д Н К и интенсивность сигнала, отраж аю щ ую
количество м еченых м олекул вданной ячейке чипа. Т аким об разом , м ож но
получить инф орм ац ию о последовательности исследуем ых Д Н К (так как
каж дой определенной последовательности исследуем ой Д Н К соответствует
известная последовательность им м об илизованной на чипе Д Н К) и о
количествекаж дой исследуем ой последовательности.
У никальные возм ож ности Д Н К-чипов, как новой универсальной
исследовательской платф орм ы делаю т особ енно привлекательным
использование на их основе сам ых разнооб разных ранее разраб отанных
м етодовф ерм ентативной и неф ерм ентативной трансф орм ац ии Д Н К, таких как
лигазныеи полим еразныереакц ии.
Благодаря своим особ енностям технология Д Н К-чипов находит все
б олееш ирокоеприм енениевф ундам ентальных и прикладных исследованиях.
Г лавной отличительной чертой этой технологии является возм ож ность
одноврем енного анализа огром ного количества различных Д Н К-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
40
последовательностей. П оявилась ранее недоступная возм ож ность изучать
геном как ц елое. Э то новое направление получило название "геном ика".
П рим енение Д Н К-чипов позволяет количественно определить уровень
экспрессии всех генов лю б ого геном а. О соб енно важ ным является
установление ф ункц иональной роли генов - ф ункц иональная геном ика.
У становление ф ункц ий геновпозволяет разраб отать м етоды этиологической
диагностики патологических состояний, наприм ер злокачественного роста и
способ ы управления ф ункц ией генов, которыеответственны за их развитие, в
том числе и с пом ощ ью такого наиб олее перспективного м етода какгенная
терапия. Количественном у определению экспрессии и ф ункц иональной
геном икепосвящ ены соответствую щ иеразделы наш его сайта.
Благодаря появлению Д Н К-чиповпоявилась возм ож ность производить
анализ м утац ий во всех генах геном а одноврем енно.
П роц есса анализа при пом ощ и м икрочипа м ож ет б ыть разделен на две
главных части. С начала необ ходим о приш ить известные последовательности
гена на стеклянные планш еты или другую твердую подлож ку. Д алее
происходит скрещ иванием ф луоресц ентно пом еченного кД Н К (содерж ащ ий
неизвестные последовательности, которые б удут определены) к известным
генам , приш итым на стеклянном планш ете. П осле скрещ ивания, м икрочипы
идентиф иц ирую тся,
используя
ф луоресц ентный
сканер.
Анализ
относительной ф луоресц ентной интенсивности различных геновоб еспечивает
различиеввыраж ении гена.
Как только изоб раж ения получены, данные долж ны б ыть
проанализированы. С начала, второстепенная ф лю оресц енц ия долж на б ыть
вычтена из ф лю оресц енц ии каж дого пятна. Д анные тогда норм ализованы к
последовательности контроля, вспом огательного гена, чтоб ы об ъяснять лю б ое
неопределенное скрещ ивание. О сторож ность долж на б ыть предпринята при
выб оре соответствую щ его вспом огательного гена; недавние изучения
показали, что некоторые гены, которые ранееиспользовались какм аркерные,
м огут ф актически им еть изм еняю щ иеся уровни экспрессии при некоторых
условиях.
Вест ерн б ло т инг
В естерн б лотинг (Western blotting) - соврем енный высокочувствительный
м етод идентиф икац ии б елков, в том числе вирусных антигенов. М етод
основан на ком б инац ии гель-электроф ореза и реакц ии антиген-антитело.
В ысокая степень разреш ения достигается за счет электроф оретического
разделения б елков, глико- и липопротеинови м аксим альной спец иф ичностью
детектирую щ их им м унных сывороток или м оноклональных антител. В
оптим ально отраб отанных условиях им м уноб лотингом м ож но об наруж ивать
антиген в количествах м енее 1 нг в испытуем ом об ъем е. Т ехнически
им м уноб лотинг выполняется втри прием а:
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
41
1) подлеж ащ ие анализу б елки подвергаю тся разделению
в
полиакрилам идном геле в присутствии денатурирую щ их вещ еств:
додец илсульф ата натрия или м очевины (SDS-PAGE); разделенные б елки
м огут визуализироваться после окраш ивания и сравниваться с эталонным и
об разц ам и;
2) разделенныеб елки переносятся сгеля путем налож ения (б лотинга) на
нитроц еллю лозный ф ильтр и ф иксирую тся на нем ; во м ногих случаях, но не
всегда, при переносесохраняю тся количественныесоотнош ения б елков;
3) на ф ильтры наносятся детектирую щ ие поли- или м оноклональные
антитела, содерж ащ ие радиоизотопную или ф ерм ентную м етку; для
об наруж ения связавш ихся антител прим еняю т такж е антивидовую м еченую
сыворотку, иным и словам и, на заклю чительном этане б лотинг аналогичен
твердоф азным им м унологическим тестам .
С ледует им еть ввиду, что вданной постановке им м уноб лотинга б елки
находятся вденатурированном состоянии, и поэтом у м огутнераспознаваться
антителам и, спец иф ическим и по отнош ению
к нативном у б елку.
И м м уноб лотинг достаточно ш ироко используется висследованиях строения
вирусовгепатитов, вчастности, для установления антигенного родства м еж ду
отдельным и ш там м ам и. В ысокая разреш аю щ ая способ ность им м уноб лотинга
позволяетполучать хорош иерезультаты и вдиагностической практике, когда
треб уется идентиф иц ировать вирусвтканях или экскретах б ольного.
В описанных видах б лотинга для переноса Д Н К, РН Ки б елковчерез гель
км ем б ране пом им о капиллярных сил (влаж ный перенос) использую т такж е
электроф орез и вакуум (полусухой и сухой перенос). П ри вестерн б лотинге,
какправило использую тсухой перенос.
4.2 М ет о ды пр о веден ия г ибр идиз ац ии
М етод м олекулярной гиб ридизац ии вклю чает следую щ ие этапы:
подготовку анализируем ого об разц а, получение м еченого зонда, сам у
проц едуругиб ридизац ии, выявлениеи анализ еерезультатов.
С пособ ы выделения и подготовки анализируем ого об разц а нуклеиновых
кислот и б елковкгиб ридизац ии м ногооб разны и определяю тся пом им о ц ели
и конкретной задачи исследователя спец иф икой изучаем ого об ъекта.
Е сли м еткой является радиоактивный изотоп, то результат гиб ридизац ии
выявляю т а вт ора ди огра фи ей под световым м икроскопом после проявления
прозрачной ф отоэм ульсии. В случае использования ф луоресц ентно м еченых
зондов см отрят свечение хром осом под лю м инесц ентным м икроскопом .
С ущ ествую т две м одиф икац ии ф луоресц ентной гиб ридизац ии in situ: п ряма я
флуоресц ент на я in situ ги бри ди за ц и я (direct fluorescence in situ hybridization
и ли DFISH) и неп ряма я – FISH. В последнем варианте ф луорохром ы несетне
сам зонд, а б елок, им ею щ ий высокое сродство крепортерной группе зонда.
Г иб ридизац ия in situ позволяет устанавливать локализац ию вопределенном
районе хром осом ы того или иного ма ркера . В качестве последнего м огут
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
42
выступать отдельный ген или его часть, не кодирую щ ая б елокнуклеотидная
последовательность,
нетранскриб ируем ые
повторяю щ иеся
последовательности различной длины, м об ильные генетические элем енты и
т.д.
Ч асто использую т м етод дот -ги бри ди за ц и и (от англ. dot – точка). Э тот
м етод прим еняется, когда необ ходим о установить ф актналичия определенной
нуклеотидной последовательности в исследуем ых об разц ах и оц енить ее
количество. И з подходящ ей ткани исследуем ого организм а выделяю тсум м арную Д Н К. О б разц ы Д Н К наносятна м икропористую (нитроц еллю лозную или
нейлоновую ) м ем б рану, денатурирую т и им м об илизую т об лучением
ультраф иолетом , послечего инкуб ирую тф ильтр см еченым зондом . П ри этом
на один ф ильтр м огут б ыть нанесены десятки об разц овнуклеиновых кислот,
выделенных из разных б иологических об ъектов.
В некоторых случаях, когда треб уется б олее детальная инф орм ац ия о
располож ении выявляем ой последовательности вгеном е, прим еняется другая
м одиф икац ия м етода м олекулярной гиб ридизац ии – блот -ги бри ди за ц и я (от
англ. to blot – пром акать ф ильтровальной б ум агой). В этом случае
расщ епляю т об разец Д Н К на ф рагм енты подходящ им и рестриктазам и и
разделяю тф рагм енты спом ощ ью электроф ореза вгеле. П ослечего переносят
разделенные ф рагм енты на м икропористый ф ильтр, налож енный на гель,
им м об илизую т перенесенные и денатурированные ф рагм енты об лучением
ультраф иолетом и инкуб ирую т с м еченым зондом . П осле отм ывания ф ильтра
от несвязавш егося зонда выявляю т результат гиб ридизац ии. С пособ
выявления определяется тем , какую им енно репортерную группу несет зонд.
Е сли взонде содерж ится радиоактивная м етка, ф ильтр втем ноте накрываю т
рентгеновской пленкой, а по прош ествии определенного врем ени (от
нескольких часов до нескольких суток) ее проявляю т и по засвеченным
полосам определяю т вф рагм ентах какой длины находится ком плем ентарная
зонду нуклеотидная последовательность. Е сли зонд несет ф луоресц ентную
м етку, ф ильтр ф отограф ирую твультраф иолетовом свете.
В некоторых случаях иском ая нуклеотидная последовательность
присутствует в недостаточном для об наруж ения количестве. С одерж ание
отдельных уникальных последовательностей в геном е м ож ет б ыть недостаточным для выявления гиб ридизац ией in situ. В этом случае перед
нанесением об разц а на ф ильтр приб егаю т к проц едуре ам плиф икац ии
нуклеотидного м атериала с пом ощ ью полим еразной ц епной реакц ии (П ЦР).
П оследняя возм ож на, если известна первичная структура хотя б ы неб ольш ого
участка (порядка сотни нуклеотидов) анализируем ой Д Н К-м иш ени.
4.3 Зо н ды , испо льз уемы ев г ибр идиз ац ии
С ущ ествует несколько м етодом получения зондов для проведения
гиб ридизац ии. С реди м етодовнерадиоактивного м ечения полинуклеотидных
зондовнаиб ольш ее распространение получили хорош о отраб отанные ранее
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
43
для радиоактивного м ечения проц едуры удлинения затравки, ник-трансляц ии,
или полим еразной ц епной реакц ии. В сеэти способ ы основаны на способ ности
Д Н К-полим ераз
синтезировать
полинуклеотидную
ц епочку,
ком плем ентарную одноц епочечной м атриц е.
У длинение за т ра вки. Х им ическим путем синтезирую т олигонуклеотид
(м енее 20 звеньев), ком плем ентарный каком у-либ о известном у участку
анализируем ой Д Н К, гиб ридизую т его с денатурированной Д Н К, по м атриц е
которой синтезируется зонд, после чего в реакц ионную см есь доб авляю т
Д Н К-полим еразу и наб ор всех четырех дезоксириб онуклеозидтриф осф атов
(дН Т Ф ), один из которых несет м етку. И спользуя олигонуклеотид вкачестве
затравки, полим ераза удлиняет его, встраивая в растущ ую ц епь м еченый
нуклеотид. В результатеоб разуется полинуклеотидный м еченый зонд.
П о лимера зна я цеп на я реа кция. П ЦР предусм атривает наличие двух
олигонуклеотидных затравок, ком плем ентарных участкам , ф ланкирую щ им
выб ранный район Д Н К. П осле денатурац ии двуц епочечной м атриц ы и
гиб ридизац ии олигонукдеотидов с каж дой из двух однонитевых ц епей
проводится полим еразная реакц ия, результатом которой является удвоенное
количество последовательностей Д Н К, заклю ченных м еж ду затравкам и. П ри
повторении проц едуры денатурац ии, гиб ридизац ии и полим еризац ии получаю т четыре копии, а за 30 ц иклов м ож но получить несколько м иллионов
м еченых полинуклеотидов, используем ых вкачествезондов.
Н ик-т ра нс ляция.
Е сли
последовательность
нуклеотидов в
анализируем ой Д Н К неизвестна, то м еченый зонд получаю т проц едурой,
называем ой ни к-т ра нсляц и ей (отангл. nick – разрез). В Д Н Квносятнекоторое
количество одноц епочечных разрывовпутем об раб отки ф ерм ентом Д Н Казой.
О б разую щ иеся вм естах разрезовсвоб одные3'-О Н конц ы использую тся Д Н Кполим еразой для их наращ ивания. Ф ерм ент двигается, удаляя дН М Ф с 5'конц а стоящ его рядом ф рагм ента Д Н К. П ри этом он вклю чает врастущ ую
ц епочку м еченые нуклеотиды, идентичные только что отщ епленным
нем еченым . В результате получаю т м еченые полинуклеотиды, которые м огут
служ ить зондам и для выявления Д Н К, первичная структура которой
неизвестна.
В том случае, когда нуж но получить б ольш оеколичество нерадиоактивно
м еченого зонда, наприм ер, для проведения м ассовой диагностики, приб егаю т
кхим ическим , а неф ерм ентативным способ ам вклю чения м етки. В Д Н К- или
РН К-полинуклеотиды вводят реакц ионноспособ ные группы, к которым
присоединяю т тот или иной репортер. Х им ический способ б олее
воспроизводим , так как не зависит от удельной активности лаб ильных
ф ерм ентов;
он
не
треб ует
такж е
синтеза
дорогостоящ их
нуклеозидтриф осф атов, несущ их сигнальноесоединение.
Н есм отря на высокую чувствительность, использование радиоактивно
м еченых зондовограничено, впервую очередь вприкладных об ластях для
диагностических ц елей. Э то связано с возм ож ностью радиолиза каксам ого
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
44
зонда, так и м иш ени, коротким (8 - 14 дней) врем енем полураспада б ольш инства радионуклидов, а такж е связанной с ним и опасностью для здоровья
персонала. В связи с этим впоследние врем я уделяется б ольш ое вним ание
разраб отке различных м етодоввведения волиго- и полинуклеотидные зонды
нерадиоактивных репортерных групп и их выявления. П оэтом у внастоящ ее
врем я ш ироко использую тся нерадиоактивный способ м ечения нуклеотидных
последовательностей. Д анные м етки позволяю т проводить гиб ридизац ия в
б олее м ягких условиях не повреж дая структуру иском ой Д Н К. Е щ е
преим ущ ествам и нерадиоактивного м ечения зондов является простота
использования (не треб уется спец иальных условий связанных с радиац ией) и
м еньш ее врем я проявления м етки (до нескольких часов). С реди
нерадиоактивных способ ов м ечения чащ е всего использую т б иотин,
дигоксигенин, ф луорохром ы и ф ерм енты.
Био т ин. Н аиб олее распространенной нерадиоактивной репортерной
группой, вклю чаем ой всоставолиго- и полинуклеотидных зондов, является
витам ин би от и н (природный коф актор группы ф ерм ентов – карб оксилаз).
Биотинилированное производное дУ Т Ф (б ио-У Т Ф ) вклю чается воб разуем ые
Д Н К-полим еразам и ц епи вм есто тим ина и способ но к ком плем ентарным
взаим одействиям с аденином . Биотин об ладает чрезвычайно высоким
сродством к содерж ащ ем уся вкурином яйц е б елку а в и ди ну, а такж е к его
б актериальном у аналогу – ст реп т а в и ди ну. Э ти б елки ковалентно сш иваю т
(конъю гирую т)
либ о с ф луорохром ам и,
либ о с ф ерм ентам и,
катализирую щ им и об разование окраш енных продуктов. Как ф луорохром ы,
так и ф ерм енты м ож но сш ивать и с антителам и к стрептавидину. Т акие
конъю гаты, прочно связываясь с б иотином , введенным в олиго- или
полинуклеотидный зонд, позволяю твыявлять до 0.1 пг (1 пикограм м = 10-12 г)
Д Н К-м иш ени. Н аличиевб иотинекарб оксильной группы, не участвую щ ей во
взаим одействии со стрептавидином , позволяет легко присоединять его
ковалентно к различным м олекулам , в том числе к м ононуклеотидам и
синтетическим олигонуклеотидам .
П ом им о использования Д Н К-полим еразы есть и другиеспособ ы введения
б иотина взонд. Э то м ож ет б ыть осущ ествлено при пом ощ и т ерми на льной
дезокси нуклеот и ди лт ра нсфера зы. Э тот ф ерм ент, подоб но Д Н К-полим еразе,
удлиняет олигонуклеотид, однако осущ ествляет это при отсутствии м атриц ы.
Кром е того, разраб отаны способ ы хим ического введения б иотина в
полинуклеотиды, содерж ащ ие м одиф иц ированные гетероц иклические
основания. Е го присоединяю т по таким полож ениям оснований, которые не
приним аю т непосредственного участия воб разовании водородных связей с
ком плем ентарным и нуклеотидам и.
Д иг
о кс иг
енин. П одоб но б иотину, нерадиоактивной репортерной группой
м ож ет служ ить ди гокси гени н – стероид из растения наперстянки (Digitalis
purpurea). О сновной способ введения взонд дигоксигенина такой ж е, какдля
б иотина, – вклю чение дН Т Ф , несущ его это соединение, вполинуклеотид в
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
45
ходе полим еразной реакц ии. И дигоксигенин и б иотин являю тся га п т ена ми ,
то есть антигенным и детерм инантам и, с которым и спец иф ично и прочно
связываю тся соответствую щ ие антитела, конъю гированные с ф ерм ентом ,
об разую щ им окраш енный продукт, или скаким -либ о ф луорохром ом .
Ф луо ро хро мы . В отличиеотб иотина и дигоксигенина флуорохромы сам и
по себ е являю тся сигнальным и соединениям и. О ни способ ны излучать свет
определенной длины волны при возб уж дении их б олее коротковолновым
светом . Т ак, флуоресц еи н, один из наиб олее распространенных красителей,
при возб уж дении ультраф иолетом с длиной волны 485 нм им еет м аксим ум
испускания ввидим ой об ласти – 515 нм и светится зеленым . Т от ф акт, что
одна м олекула ф луоресц ентного красителя способ на м ногократно
претерпевать ц икл “возб уж дение–излучение” , об еспечивает высокую чувствительность зондов, м еченных ф луорохром ам и.
И спользование нескольких зондов, несущ их ф луорохром ы с
отличаю щ им ися
спектрам и
испускания,
позволяет одноврем енно
локализовать в хром осом ах разные нуклеотидные последовательности
гиб ридизац ией in situ. Э то невозм ож но проделать с радиоактивно м еченым и
зондам и, выявляем ым и авторадиограф ией. В качестве аналогии сравните
ц ветную и черно-б елую ф отограф ии радуги.
Ф ермент ы , ис п о льзуемы е в ка чест ве реп о рт ерны х г
руп п . В качестве
репортерной группы использую т такж е некоторые ф ерм енты, способ ные
катализировать об разование б ольш ого числа м олекул окраш енного продукта.
Ш ироко прим еняю т, наприм ер, п ерокси да зу и щ елоч ную фосфа т а зу. П ервый
ф ерм ентвприсутствии перекиси водорода окисляетнекоторыеаром атические
соединения до нерастворим ых вводе тем ноокраш енных продуктов. В торой
способ ен деф осф орилировать органические соединения, которые при этом
превращ аю тся вокисленные кислородом сильноокраш енные продукты. Е сли
эти ф ерм енты конъю гированы с синтетическим и олигонуклеотидам и, то они
выступаю т непосредственно как нерадиоактивные м етки. О днако их чащ е
использую т для непрям ого выявления зондов, м еченных б иотином или
дигоксигенином . П ри дот-гиб ридизац ии тем ноокраш енные продукты видны
невооруж енным глазом , при гиб ридизац ии in situ – всветовом м икроскопе.
Е сли нуж на количественная оц енка об разовавш егося продукта, то проводят
колорим етрическую детекц ию на ф отоколорим етреили денситом етре.
Н аиб ольш ая
чувствительность (до 10-19
М )
достигается
с
нерадиоактивным и зондам и, выявляем ым и с пом ощ ью щ елочной ф осф атазы,
вварианте хеми люми несц енц и и . С уб страт щ елочной ф осф атазы адам антил1,2-диокситанф осф ат после деф осф орилирования распадается с испусканием
света при длине волны 470 нм . Д етекц ия осущ ествляется экспозиц ией
ф отопленки отнескольких м инутдо нескольких часов.
Н ерадиоактивно м еченые зонды для м олекулярной гиб ридизац ии
нуклеиновых кислот являю тся важ ным инструм ентом изучения структурноф ункц иональной организац ии геном а, позволяя выявлять нуклеотидные
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
46
последовательности с б ольш ей точностью , скоростью и надеж ностью , чем их
радиоактивно м еченыеаналоги. П ри картировании хром осом , когда детальное
пространственное разреш ение является необ ходим ым треб ованием , зонды,
несущ ие б иотин, дигоксигенин или ф луорохром ы, вгиб ридизац ии in situ не
м огут б ыть зам енены на м еченные радиоактивным и изотопам и. М ассовая
диагностика инф екц ионных заб олеваний человека, ж ивотных и растений
сегодня не об ходится б ез нерадиоактивных тест-систем , вклю чаю щ их Д Н Кили РН К-зонды. О писание диагностики некоторых наследственных
патологий, выявляем ых с пом ощ ью м етода м олекулярной гиб ридизац ии ещ е
до рож дения реб енка на основе анализа геном а в клетках ам ниотической
ж идкости, м ож етсоставить м атериал отдельной статьи.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
47
ЛИ Т Е РАТ У РА
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)
10)
11)
12)
Г лик Б. М олекулярная б иотехнология. П ринц ипы и прим енение / Б.
Г лик, Д ж . П астернак. - М . : М ир, 2002. - 589 с.
Рыб чин В .Н . О сновы генетической инж енерии: учеб . / В .Н . Рыб чин. С П б . : И зд-во С П б Г Т У , 2002. - 522 с.
Коничев А.С . М олекулярная б иология: учеб . / А.С . Коничев, Г .А.
С евастьянова. – М . : Академ ия, 2005. – 400 с.
Ч ем ерис А.В . С еквенирование Д Н К / А.В . Ч ем ерис, Э .Д . Ахунов, В .А.
В ахитов. - М . : Н аука, 1999. - 429 с.
Клонирование Д Н К. М етоды / под ред. Д . Г ловера. - М . : М ир, 1988. 538 с.
С трайер Л . Биохим ия: в3-х т. / Л . С трайер. - М . : М ир, 1985. - Т . 3. - 400
с.
Анализ геном а. М етоды / под. ред. К. Д ейвиса. – М . : М ир, 1990. - 246 с.
М олекулярная клиническая диагностика. М етоды / под ред. С .
Х еррингтона, Д ж . М акги. – М . : М ир, 1999. – 558 с.
С ингер М . Г ены и геном ы: в2-х т. / М . С ингер, П . Берг. - М . : М ир,
1998. – Т . 2. - 391 с.
Щ елкунов С .Н . Г енетическая инж енерия: учеб . пособ ие / С .Н .
Щ елкунов. - Н овосиб ирск: С иб . унив. изд-во, 2004. - 496 с.
АлексеевВ .И . П рикладная м олекулярная б иология / В .И . Алексеев, В .А.
Кам инский. - М . : URSS: Ком Книга, 2005. - 196 с.
П атруш евЛ .И . Э кспрессия генов/ Л .И . П атруш ев. – М . : Н аука, 2000. –
830 с.
С оставители:
П оповВ .Н .,
Е принц евА.Т .,
Ф едорин Д .Н .
Редактор: В оронина А.П .
__________________________________________________________________________
С дано внаб ор 14.04.2006. П одписано впечать 21.04.2006. Бум ага оф сетная 70г/м 2.
Ф орм ат60х84/16. Г арнитура Times New Roman. П ечать траф аретная. У сл. п. л. 3.
Т ираж 50. Н ом ер заказа 230.
О тпечатано влаб оратории оперативной полиграф ии
И здательско-полиграф ического ц ентра В Г У
г. В оронеж , У ниверситетская площ адь, 1, ком .43, тел.208-853.
Документ
Категория
Журналы и газеты
Просмотров
21
Размер файла
811 Кб
Теги
современные, кислоты, методов, нуклеиновые, 1252, изучения, основы
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа