close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

1690.ПРАКТИКУМ ПО БИОХИМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПРОДУКЦИИ

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ДЕПАРТАМЕНТ КАДРОВОЙ ПОЛИТИКИ И ОБРАЗОВАНИЯ
РЯЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
АГРОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. П.А. КОСТЫЧЕВА
О. В.САВИНА, А.С. ЕМЕЛЬЯНОВА
ПРАКТИКУМ
ПО БИОХИМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПРОДУКЦИИ
Под общей редакцией О.В. Савиной
Рекомендовано Учебно-методическим объединением вузов Российской Федерации по агрономическому образованию в качестве
Учебного пособия для бакалавров по направлению 110900 «Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции».
Р Я З А Н Ь 2010
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
УДК 581.19 : 664.8
Авторы:
О.В.Савина – доктор сельскохозяйственных наук, профессор
А.С.Емельянова – кандидат биологических наук, доцент
Под общей редакцией О.В. Савиной
Рецензенты:
Н.Н. Новиков - профессор кафедры биохимии Московской сельскохозяйственной академии имени К.А. Тимирязева, доктор биологических наук
М.Н. Павлова - доцент кафедры технологии общественного питания Рязанского государственного агротехнологического университета имени П.А. Костычева, кандидат технических наук
В практикуме Савиной О.В, Емельяновой А.С. рассмотрены важнейшие биохимические методы исследования сельскохозяйственного сырья и
продукции. Каждая работа содержит краткие теоретические положения по
теме исследования, описание методики проведения анализов и обработки их
результатов. В лабораторных работах приведен перечень необходимых реактивов, показаны схемы записи и расчета результатов анализов. Для более
глубокого о полного изучения каждой темы указаны контрольные вопросы,
которые студент должен проработать для защиты лабораторных работ.
В конце практикума приведен краткий словарь биохимических терминов, а также список основной и дополнительной литературы, рекомендованной для изучения дисциплины «Биохимия сельскохозяйственной продукции».
Теоретический материал и методики, изложенные в практикуме, могут
быть широко использованы студентами, аспирантами, научными сотрудниками, изучающими производство, хранение и переработку сельскохозяйственной продукции.
2
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ВВЕДЕНИЕ
Учебная дисциплина «Биохимия сельскохозяйственной продукции»
входит в базовую часть профессионального цикла ООП подготовки бакалавров по направлению 110900 «Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции».
В соответствии с государственным стандартом, процесс изучения
дисциплины направлен на формирование следующих компетенций:
- использование основных законов естественнонаучных дисциплин в
профессиональной деятельности, применение методов математического
анализа и моделирования, теоретического и экспериментального исследования (ПК-1);
- готовность оценивать качество сельскохозяйственной продукции с
учётом биохимических показателей и определять способ её хранения и переработки (ПК-5);
- готовность оценивать качество и безопасность сельскохозяйственного сырья и продуктов его переработки в соответствии с требованиями
ГОСТов (ПК-12).
Наряду с усвоением теоретических положений, курс биохимии призван привить студентам навыки аналитической работы по определению биохимических показателей, используемых при оценке качества, безопасности и
технологических свойств сельскохозяйственной продукции. В связи с этим
курс включает следующие виды учебной работы: лекции, семинары, лабораторные занятия, самостоятельная работа студентов.
Цель лабораторного практикума – ознакомление студентов с основными группами соединений, входящими в состав сельскохозяйственного сырья и продуктов и овладение современными методами, применяемыми в
биохимических исследованиях.
На лабораторных занятиях по «Биохимии сельскохозяйственной продукции» студенты определяют активность важнейших ферментов, от которых зависит качество продукции при хранении и технологической переработке, количество биологически активных веществ и запасных соединений
сельскохозяйственного сырья и продуктов, формирующих их потребительские свойства и пищевую ценность, изучают основные биохимические процессы, протекающие в продукции при хранении и переработке.
В практикуме приведен перечень необходимых реактивов, показаны
схемы записи и расчета результатов анализов.
Для более глубокого о полного изучения каждой темы указаны контрольные вопросы, которые студент должен проработать для защиты лабораторных работ.
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Основные требования техники безопасности при выполнении
лабораторных работ по биохимии
К выполнению лабораторных работ по биохимии студенты допускаются только после прохождения инструктажа по технике безопасности и
противопожарным правилам и соответствующего оформления допуска к работе в специальном журнале.
Студенты несут личную ответственность за несоблюдение правил и
требований по технике безопасности и правил противопожарной безопасности.
Особое внимание при выполнении лабораторных работ по биохимии
студенты должны обращать на выполнение следующих требований и рекомендаций:
1. Никаких веществ в лаборатории не пробовать на вкус. Нюхать какие
бы то ни было вещества в лаборатории осторожно, не вдыхая полной грудью,
направляя движением руки к себе пары или газ. Категорически запрещается
пользоваться лабораторной посудой для еды или питья.
2. не проводить никаких опытов в грязной посуде. Посуду мыть тотчас
же после опыта.
3. Не оставлять никаких веществ в посуде без этикеток и надписей. Не
брать вещества из посуды без этикеток и надписей. Беря вещество, внимательно читать этикетку и при малейшем сомнении наводить справку у преподавателя.
4. Нельзя набирать концентрированные кислоты, щелочи и другие
вредные реактивы в пипетку ртом. Отмерять концентрированные растворы
щелочи или кислоты только цилиндрами.
5. При разбавлении серной кислоты вливать осторожно кислоту в воду, а не наоборот, во избежание разбрызгивания или даже взрыва.
6. Нельзя выливать в раковину крепкие растворы кислот, щелочей; использовать для этой цели специальные стаканы для слива.
7. Пробирку с жидкостью для нагревания нужно держать наклонно в
сторону от себя и соседа.
8. При работе с эфиром, ацетоном и другими легко воспламеняющимися веществами соблюдать крайнюю осторожность.
9. Все опыты с воспламеняющимися органическими веществами производить под тягой. Категорически воспрещается в это время пользоваться
огнем в лаборатории.
10. Категорически воспрещается отгонять эфир и другие воспламеняющиеся вещества на открытом огне. Пользоваться для этой цели либо колбонагревателями с закрытой спиралью, либо водяными банями.
11. При работе на центрифуге не открывать крышку до полной остановки ротора.
12. К выполнению лабораторных работ студенты допускаются только
при наличии защитной одежды – халата.
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Первая помощь при несчастных случаях
Первую помощь пострадавшему при несчастном случае до прибытия
врача должны оказать коллеги по работе. Здоровье и жизнь пострадавшего
очень часто зависит от того, насколько быстро и правильно была оказана ему
первая помощь. Поэтому каждый работающий в лаборатории обязан знать
практические приемы первой помощи.
Наиболее частыми при выполнении лабораторных работ по биохимии
являются термические и химические ожоги рук и порезы.
1.
При попадании на кожу крепкой щелочи пораженное место
нужно обмыть большим количеством воды, а затем ополоснуть слабым раствором уксусной кислоты.
2.
При попадании крепкой кислоты на кожу её нужно смыть водой, а затем слабым раствором соды или аммиака.
3.
При ранениях стеклом нужно удалить его осколки тз ранки и,
убедившись, что там их больше нет, смазать рану йодом и перевязать пораженное место.
4.
При термических ожогах первой степени обожженное место
можно присыпать питьевой содой, рисовым или картофельным крахмалом или тальком либо сделать примочки из свежеприготовленных растворов 2%-го питьевой соды или 5%-го
перманганата калия. Лучшее средство для примочки – 96%-й
этиловый спирт, который оказывает одновременно и обеззараживающее и обезболивающее действие.
5.
В случае пореза рану следует обработать раствором йода или
перекиси водорода.
5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ГЛАВА 1
ВИТАМИНЫ
Витаминами называют биологически активные органические соединения со сравнительно низким молекулярным весом. Они широко распространены в живой природе и играют большую роль в процессах обмена веществ.
Витамины - это не химическое, а физиологическое понятие, оно имеет
чисто физиологический смысл. Эти вещества относятся к незаменимым жизненным факторам, обеспечивающим нормальное функционирование любой
клетки. Растения способны к самостоятельному биосинтезу витаминов, поэтому они не ощущают недостатка в них, тогда как многие животные и человек не синтезируют для себя большинство витаминов и должны получать их
с пищей. Недостаток их в рационе или нарушение способности организма
усваивать их ведёт к нарушению обмена веществ и вызывает заболевания,
называемые гипо - и авитаминозами. При этом в начале проявляются общие
для всех форм авитаминозов признаки: потеря аппетита, утомляемость, похудение, у молодых организмов задержка роста и т.д., а затем возникают
симптомы, специфические для каждого авитаминоза. Предупредить или излечить авитаминозы можно только введением в организм соответствующего
витамина, дефицит которого ощущался в рационе.
В настоящее время известно свыше 40 различных витаминов. Химическая природа их весьма различна, поэто4му нет строгой классификации витаминов. Чаще всего их классифицируют на основании растворимости в воде
или в жирах. К жирорастворимым витаминам относят витамины А, D, Е, К, а
к водорастворимым - В1, В2, РР, В6, Р, Н, В12, С и д.р. вначале, когда химическая природа витаминов была ещё недостаточно изучена, их называли
начальными буквами латинского алфавита. В настоящее время эти обозначения заменяют названиями химических соединений.
Содержание витаминов в различных продуктах определяют в мг% количество мг витамина на 100 г сырой массы продукта.
1.1
Жирорастворимые витамины
1.1.1. Определение содержания каротина в растительном сырье
колориметрическим методом
Цель работы: Освоение метода хроматографического выделения каротина из растительного сырья на адсорбционной колонке и колориметрического определения его содержания
Основные теоретические положения
Каротин – широко распространенный в природе желто-оранжевый
пигмент растений. Наиболее богаты им зеленые части растений, а также корнеплоды моркови, откуда каротин был впервые выделен и получил свое
название (от латинского carоta – морковь). В растениях каротин существует
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
в форме трех изомеров, называемых -, - и -каротинами, имеющих общую
химическую формулу С40Н56. Помимо красящих свойств эти вещества обладают провитаминной активностью, так как, распадаясь в живом организме,
легко превращаются в витамин А. Витаминозные свойства каротина обусловлены наличием -иононового кольца:
Н3С
СН3
С
H2С
ССН= ....


H2С
ССН3
СН2
-каротин содержит два таких кольца, а - и -каротины - по одному,
поэтому биологическая активность -каротина в два раза выше, чем у - и каротинов, т.к. из одной молекулы -каротина может образоваться две молекулы витамина А, а из - и -каротинов - только по одной молекуле. В зеленых растениях до 90% всех каротиноидов представлено -каротином.
В живой клетке каротины находятся в комплексе с липопротеидами,
поэтому достаточно устойчивы, несмотря на свою полиненасыщенную
структуру. Поэтому при хранении корнеплодов моркови в оптимальных
условиях практически не происходит потери каротина. Но как только нарушается структура клетки, каротины теряют свою устойчивость и быстро разрушаются под действием света и кислорода воздуха. Это происходит при
обезвоживании растительной ткани. При варке овощей под слоем воды без
доступа воздуха каротин достаточно хорошо сохраняется.
Из других каротиноидов следует отметить ликопин - изомер каротина,
обусловливающий красную окраску плодов помидоров, шиповника и многих
других растений; из окисленных каротиноидов - ксантофилл - диоксипроизводное -каротина, наряду с каротином содержащийся в хлоропластах листьев; зеаксантин - диоксипроизводное -каротина - желтый пигмент, обусловливающий окраску семян кукурузы и ряда цветов и плодов. Эти пигменты в
отличии от каротина не содержат -иононового кольца и провитаминной активностью не обладают.
Методика проведения анализов
Принцип метода
Каротин относится к липоподобным веществам, извлекаемым из растений с помощью неполярных растворителей.
Каротин экстрагируют из исследуемого материала бензином. Бензиновый экстракт пропускают через адсорбционную колонку, содержащую адсорбент, для поглощения других пигментов, растворившихся в бензине. Таким образом, интенсивность окраски вытяжки зависит только от содержания
в ней каротина. Количество каротина в очищенном бензиновом экстракте
определяют колоримерически по интенсивности желтой окраски путем срав7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нения опытного раствора с раствором бихромата калия, стандартизованного
по каротину.
Реактивы
1. Растворитель: бензин. Важно, чтобы растворитель был прозрачным и
не имел оттенков желтого цвета. Этим требованиям удовлетворяет авиационный бензин марки Б-70 (температура кипения 70-80° С).
2. Адсорбенты: углекислый магний (МgСОз) или окись алюминия(А12О3). Адсорбенты для хроматографии должны быть подготовлены.
Продажный чистый углекислый магний нагревают до 200° С в течении 1 часа, затем рассыпают на стекле и оставляют на воздухе на 17 часов. Окись
алюминия берут заводского приготовления в виде воздушно сухого порошка.
Адсорбционную способность проверяют путем пропускания через неё ( в адсорбционной колонке) раствора пигментов зеленых листьев или полученных
из моркови. Хлорофилл и ксантофилл задерживаются в адсорбционной колонке, а каротин легко проходит в приемник при промывании её бензином.
Если необходимо, то адсорбционную способность окиси алюминия усиливают путем подсушивания при 90 -100 0С. Испытанный адсорбент хранят в
герметично закрытых банках.
3. Прокаленный сернокислый натрий (Nа2S04).
4. Стандартный раствор бихромата калия: 720 мг K2Cr2O7 растворяют
в мерной колбе на 100 см3 дистиллированной водой и доводят до метки. Оптическая плотность раствора соответствует содержанию 0,00416 мг каротина
в 1 см3.
5. Стекло битое.
Приборы и оборудование: 1) адсорбционная колонка длиной 30 см и
внутренним диаметром 1 см; 2) ступки фарфоровые с пестиком; 3)цилиндр
мерный на 100 мл; 4)фотоколориметр электрический; 5)весы лабораторные.
Подготовка проб к анализу
Три грамма тщательно измельченного растительного материала растирают в фарфоровой ступке с большим количеством кварцевого песка или битого стекла. Весь процесс измельчения и растирания ведут не более 30 мин.
Если используется влажное сырьё, то для обезвоживания в ступку насыпают
прокаленный Nа2S04 (2 г на 1 г сырого растительного материала) .
Стекло добавляют постепенно небольшими порциями, тщательно растирая массу в ступке. К растертой массе приливают 3-5 мл бензина и продолжают растирать до получения гомогенной кашицы.
Подготовка адсорбционной колонки
Нижний конец колонки плотно заполняют ватой, сверху засыпают
окись алюминия слоем 1,5-2 см. Слегка утрамбовывают чистой стеклянной
палочкой.
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ход анализа
Растертую однородную массу осторожно переносят в колонку, утрамбовывая стеклянной палочкой, чтобы экстракт протекал через адсорбент
медленно. Колонку вставляют в мерный цилиндр и обрабатывают растительный материал бензином порциями по 5-10 мл. Пестик и ступку тщательно
промывают бензином, вылив смыв в колонку.
Экстракцию бензином продолжают до тех пор, пока объём вытяжки в
мерном цилиндре будет равен 50 см3. Сначала вытекающий из колонки раствор имеет интенсивную желтую окраску из-за значительно содержания каротина, последние капли раствора должны быть бесцветными. Если цвет
фильтрата в мерном цилиндре зеленый, то его следует ещё раз пропустить
через колонку.
Содержание каротина определяют на фотоэлектроколориметре при
длине волны 440 нм (синий светофильтр), сравнивая со стандартным раствором бихромата калия.
Обработка и обсуждение результатов
Количество каротина вычислят по следующей формуле:
Х 
а  Д 1  V  100
,
Д2  н
где Х содержание каротина, мг%;
а – количество мг каротина в 1 см3 стандартного раствора (для бихромата калия 0,00416 мг);
Д1 – оптическая плотность исследуемого раствора;
Д2 - оптическая плотность стандарта;
V – объем раствора каротина, мл (в данном случае 50 см3);
н – навеска растительного материала, г
Каждая бригада анализирует один образец, в котором определяет содержание каротина в соответствии с вышеизложенной методикой. На основании проведенных исследований составляется сводная таблица
(табл. 1), в которую вносятся результаты анализов, выполненных всеми бригадами для разных видов сырья.
Таблица 1 - Содержание каротина в растительном сырье
№ п/п
Вид
сырья
Масса
навески, г
(н)
Оптическая плотность опытного
раствора (Д1)
Оптическая плотность контрольного раствора (Д2)
Содержание
каротина,
мг%
После обсуждения результатов делаются выводы о зависимости содержания каротина от сорта, вида и возраста растений, способов и сроков хранения растениеводческой продукции, способов переработки и т.д.
Контрольные вопросы
1. Содержание и биологическая роль каротина в растениях.
2. Физиологическая роль витамина А в организме человека.
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3. Строение и химические свойства каротина.
4. Принцип колориметрического метода определения каротина.
5. Влияние возраста и условий выращивания на содержание каротина в
растениях.
6. Изменение содержания каротина в растительном сырье в процессе хранения и переработки.
1.2. Водорастворимые витамины
1.2.1. Определение аскорбиновой кислоты ( витамина С )
в растительном сырье
Цель занятия: Освоение метода определения витамина С в растительном сырье. Изучение влияния сорта и условий выращивания растений на
содержание аскорбиновой кислоты
Основные теоретические положения
Аскорбиновая кислота - антицинготный витамин. Количество аскорбиновой кислоты в растениях существенно зависит от сортовых особенностей и условий выращивания растений. Обычно овощи, плоды и ягоды, выращенные в северных и высокогорных районах, накапливают больше аскорбиновой кислоты, чем в южных и равнинных зонах.
В растениях витамин С может существовать в двух формах: восстановленной - в форме аскорбиновой кислоты, и окисленной - в форме дегидроаскорбиновой кислоты. В сбалансированном окислении и восстановлении
витамина С заключена его биологическая роль в живой клетке как промежуточного переносчика водорода. Соотношение окисленной и восстановленной
формы в растении сильно варьирует в зависимости от возраста растения. Незрелые плоды и овощи обычно больше содержат дегидроаскорбиновой кислоты, в то время как в хорошо вызревших плодах о овощах равновесие значительно смещено в сторону восстановленной формы. Так, в картофеле после
уборки восстановленная форма составляет 85-100%.
О
О
С
С


НОС
-- 2 Н О = С

О 

О
НОС
 О = С

+ 2Н

НС
Н С


НОСН
НОСН


СН2ОН
СН2ОН
Н2О

аскорбиновая дегидроаскорбикислота
новая кислота
СООН

О= С

О=С

НСОН

НОСН

СН2ОН
2,3-дикетогулоновая
кислота
Обратимое окисление аскорбиновой кислоты до дегидроаскорбиновой
происходит под действием фермента аскорбатоксидазы и само по себе не
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
приводит к потере витамина С: и та и другая форма биологически активна.
Однако потеря витамина может происходить при дальнейшем необратимом
превращении дегидроаскорбиновой кислоты в биологически неактивную
форму - 2,3-дикетогулоновую кислоту. Именно так происходит потеря витамина С при хранении и переработке растениеводческой продукции.
Скорость этой реакции в значительной степени зависит от рН среды:
она идет медленно в кислой среде и очень быстро в щелочной. Поэтому клеточная среда более благоприятна для сохранения витамина С в плодах цитрусовых ( у апельсинов рН=34, у лимонов рН=2 ), чем в картофеле ( рН=6 ).
При обычных условиях хранения картофеля за 6 месяцев теряется 5070% от
исходного количества витамина С в клубнях. Потери возрастают с ростом
температуры хранения.
Еще значительнее потери витамина С при переработке растениеводческой продукции, особенно связанной с длительным воздействием на сырье
повышенных температур. В присутствии кислорода воздуха витамин С начинает разрушаться уже при 500С. Без доступа воздуха, особенно в кислой среде, восстановленная форма аскорбиновой кислоты гораздо лучше переносит
нагревание.
Кратковременная тепловая стерилизация, направленная на удаление
воздуха из продукта и разрушение ферментов, окисляющих витамины, способствует лучшему сохранению витамина С. Положительно сказывается на
сохранении витамина С кратковременная обработка сырья токами высокой
частоты, под действием которой его потери в продукте в 2 раза ниже, чем
при обычной тепловой стерилизации.
Скорость потери витамина С в плодах и овощах при хранении и переработке зависит и от наличия в реакционной системе веществ, катализирующих распад витаминов либо действующих на них как стабилизаторы. Так,
присутствие ионов меди способствует распаду витамина С. Это связано с
тем, что ионы меди ускоряют реакции, связанные с переносом водорода. Поэтому медь уже в концентрации 3-5 мг на 1 кг продукта способствует быстрому разрушению витамина С. Особенно сильно действие меди сказывается
в некислой среде. Стабилизаторами витамина С являются вещества, образующие с медью комплексные соли, в которых медь мало ионизирована, - белки, аминокислоты. Стабилизирующее действие оказывают также поваренная
соль, сахара, крахмал, жиры. Тормозят переход аскорбиновой кислоты в дегидроформу каротиноиды.
Разные растения при хранении теряют витамин С с разной скоростью.
В овощах, листья которых неплотно прижаты к друг другу, как например, в
шпинате, содержание витамина С быстро снижается после уборки, в то время
как в плотном кочане капусты оно в течении длительного времени поддерживается на исходном уровне. Следует отметить, что в свежей капусте витамин С сохраняется лучше, чем в других овощах. Дело здесь не только в плотном расположении листьев в кочане и изоляции их от доступа воздуха, но
ещё и в том, что аскорбиновая кислота в капусте находится в связанной форме - в виде аскорбигена. Аскорбиген - индольное производное аскорбиновой
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
кислоты довольно сложного строения, сохраняющее витаминозную активность. Квашение капусты не затрагивает витамина С, напротив, образующаяся молочная кислота повышает его стабильность. Содержание витамина С в
квашенной капусте зависит в основном от доступа воздуха к продукту.
Методика проведения анализов
Принцип метода
Метод определения аскорбиновой кислоты основан на её редуцирующих свойствах, в частности, способности восстанавливать йодат калия до
свободного йода, появление которого определяют по реакции с крахмалом.
Реактивы
1. 2%-ный раствор НCl (на 1 л раствора берется 45,5 мл НCl удельным весом 1,19);
2. 1%-ный раствор KJ (1 г йодистого калия в мерной колбе на 100 см3
довести дистиллированной водой до метки);
3. 0,001 Н раствор KJО3 (0,3568 г KJО3 довести дистиллированной водой до 1 дм3. Полученный раствор развести в 10 раз);
4. 0,5%-ный раствор крахмала (0,5 г крахмала развести в 20 см3 холодной воды, влить тонкой струйкой при помешивании в 80 см3 кипящий воды);
5. дистиллированная вода.
Приборы и оборудование: 1)ступки фарфоровые с пестиком;. 2)терка
пластмассовая; 3)колбы мерные на 100 см3; 4)воронки; 5)колбы конические на 100 см3; 6)цилиндры мерные на 25 см3; 7)пипетки на 1 см3,
2 см3, 5 см3; 8)стаканы стеклянные на 100 см3.
Ход определения
Растительный материал размельчают на пластмассовой терке и берут
для анализа 2-10 г . Навеску тщательно растирают в фарфоровой ступке, экстрагируют аскорбиновую кислоту водой и количественно переносят в мерную колбу на 100 см3. Ступку несколько раз смывают водой, сливая в колбу,
после чего раствор доводят до метки. Затем раствор фильтруют через сухой
фильтр в сухой стаканчик или колбу.
Отбирают в конические колбочки емкостью 100 см3 10 см3фильтрата,
приливают 1 см3 2%-ной НCl, 0.5 см3 1%-ного раствора KJ и 2 см3 0,5%-ного
раствора крахмала. Смесь разбавляют водой примерно до 20 см3, перемешивают и титруют из микробюретки 0.001 Н раствором KJО3 до устойчивого
синего окрашивания. Все операции по определению аскорбиновой кислоты
следует проводит быстро (в течение 10 мин). параллельно ведут контрольное
титрование смеси применявшихся реактивов (вместо 10 см3 фильтрата берут
10 см3 воды).
12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Обработка и обсуждение результатов
Содержание аскорбиновой кислоты в мг% (Х) вычисляют по формуле,
исходя из положения, что 1 мл 0,001 Н раствора йодата калия соответствует
0,08806 мг аскорбиновой кислоты.
(а - в ) К  0,08806  1000
Х =
с
где
(а - в) - разность между количеством мл 0,001 Н йодата калия, пошедшего на титрование опытного и контрольного образца;
К - поправка к титру раствора йодата калия;
с - масса исследуемого материала, отобранного на анализ.
Каждая бригада анализирует один образец, в котором определяет содержание аскорбиновой кислоты в соответствии с вышеизложенной методикой. На основании проведенных расчетов составляется сводная таблица
(табл.1), в которую вносятся результаты анализов, выполненных всеми бригадами для разных видов сырья.
Таблица 1 - Содержание аскорбиновой кислоты в растительном сырье.
№ п/п
Вид растительного сырья
Масса
навески,
г (с)
Кол-во KJО3 на
титрование
опытного раствора, см3 (а)
Кол-во KJО3 на
титрование контрольного раствора, см3 (в)
Содержание
витамина С,
мг%
После обсуждения результатов сделать выводы о зависимости содержания аскорбиновой кислоты от сорта, способов и сроков хранения растениеводческой продукции, способов переработки и т.д.
Контрольные вопросы
1. Функции витамина С в живых организмах.
2. Свойства витамина С.
3. Физиологическая роль витамина С в организме человека.
4. Влияние возраста и условий выращивания растений на содержание витамина С.
5. Изменение содержания витамина С в растительном сырье при хранении и
переработке.
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1.2.2. Определение содержания витамина Р в растительном сырье
Цель работы: Изучение биологической функции витамина Р в живых
клетках. Освоение метода определения витамина Р в растительном сырье.
Основные теоретические положения
Витамин Р (рутин) объединяет группу биологически активных веществ
(биофлавоноидов), обладающих способностью нормализовывать проницаемость капилляров, способствовать снижению проницаемости сосудистой
стенки, повышая её прочность. В группу веществ, обладающих свойствами
витамина Р, входит около 150 биофлавоноидов: гесперидин, кумарины, антоцианы, катехины и др. В растениях биофлавоноиды всегда сопровождают витамин С, т.к. стабилизируют его работу.
В биологическом действии витамина Р много общего с витамином С.
Эти два витамина взаимно усиливают свое биологическое действие в организме человека.
Суточная потребность здорового человека в витамине Р точно не установлена, хотя необходимость поступления биофлавоноидов с пищей не вызывает сомнения. Ориентировочная потребность витамина Р составляет половину суточной нормы витамина С, т.е. 35-50 мг в сутки.
Недостаточность поступления витамина Р в организм человека сочетается с недостаточностью витамина С и характеризуется болями в мышцах
плеч и ног, усиливающимися при ходьбе, общей слабостью, вялостью, быстрой утомляемостью. К более специфическим проявлениям авитаминиза Р относятся мелкие внутрикожные кровоизлияния (петехии), возникающие спонтанно, и исчезающие после назначения биофлавоноидов.
Биофлавоноиды содержатся только в продуктах растительного происхождения, вместе с которыми поступают в организм человека. В животных
тканях они не накапливаются, а подвергаются окислительному распаду.
Методика проведения анализов
Принцип метода
Метод количественного определения витамина Р основан на способности рутина и других биофлавоноидов окисляться перманганатом калия. В
качестве индикатора применяется индигокармин, который вступает в реакцию с перманганатом после того, как окислится весь рутин.
Реактивы
1. 0,01 М раствор КМnО4 (0,32 г KMnO4 довести в мерной колбе на 1
дм3 дистиллированной водой до метки);
2. Раствор индигокармина: 1 г индигокармина растворяют в 50 см 3
концентрированной серной кислоты и доводят до 1 дм3, постепенно вливая раствор в дистиллированную воду, а затем фильтруют
через бумажный фильтр;
3. Дистиллированная вода.
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Приборы и оборудование: 1)терка пластмассовая; 2) колбы конические термостойкие на 100 см3; 3)воронки; 4)цилиндры мерные на 100 см3, на
25 см3; 5)стаканы стеклянные на 100 см3; 6)бюретка; 7)весы лабораторные;
8)плитка электрическая.
Ход определения
Растительный материал размельчают на пластмассовой терке и берут
для анализа 1 г . Навеску помещают в коническую термостойкую колбу, заливают 50 см3 горячей дистиллированной воды и кипятят в течение 5 мин.
Полученный экстракт охлаждают, фильтруют, отбирают 10 см3 фильтрата в другую колбу, куда добавляют еще 10 см3 дистиллированной воды и
5 капель индигокармина (появляется синее окрашивание).
Титруют при тщательном перемешивании раствором перманганата до
появления устойчивой желтой окраски.
Обработка и обсуждение результатов
Экспериментально установлено, что 1 мл 0,01 М раствора КМnО4 окисляет 6,4 мкг рутина. Для расчета содержания (мкг/г) витамина Р используют
следующую формулу:
6,4  А  V1
Х 
; где
V2  m
Х – содержание витамина Р, мкг/г;
6,4 – пересчетный коэффициент титрования;
А – объем КМnО4, пошедший на титрование, мл;
V1 – объем, в котором растворена взятая для анализа навеска, мл;
V2 – объем раствора, взятый для титрования;
m – масса навески, г
Каждая бригада анализирует один образец, в котором определяет содержание рутина в соответствии с вышеизложенной методикой. На основании проведенных расчетов составляется сводная таблица (табл.1), в которую
вносятся результаты анализов, выполненных всеми бригадами для разных
видов сырья.
Таблица 1- Содержание витамина Р в растительном сырье
№
п/п
Вид растительного сырья
Масса навески, г (m)
V1,
мл
V2, мл
Объем КМnО4,
пошедший на титрование, мл (А)
Содержание
витамина Р,
мкг/г
После обсуждения результатов сделать выводы о наиболее богатых источниках рутина.
1.
2.
3.
4.
Контрольные вопросы
Что такое авитаминоз, гиповитаминоз, гипервитаминоз.
Какие важнейшие водорастворимые витамины Вы знаете.
Что представляет собой витамин Р, его распространение в природе и
биологическая роль в живых клетках.
Суточная потребность и изменения в организме человека при недостатке в витамине Р
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ГЛАВА 2
ФЕРМЕНТЫ
Ферменты ( от латинского слова fermentum - закваска ) или энзимы
(от греческого en zyme - в дрожжах ) - это биологические катализаторы, лежащие в основе всех жизненных процессов. Они играют исключительно
важную роль в обмене веществ любого организма, так как регулируют практически все биохимические реакции в живой клетке.
В основе строения молекулы фермента лежит белок. Различают однокомпонентные ферменты, состоящие исключительно из белка, и двухкомпонентные, состоящие из белка, называемого апоферментом, и небелковой части, называемой простатической группой или кофактором. Простатическая
группа может быть представлена атомом металла с переменной валентностью ( например, железа, меди и т.д.) или молекулярной группировкой
небелковой природы ( например, витаминами или их производными ). Они-то
и выполняют роль активного центра двухкомпонентного фермента. У однокомпонентных ферментов роль активных центров выполняют определённые
химические группировки, входящие в состав молекулы белка. Активный
центр - это часть молекулы фермента, с помощью которой фермент соединяется с субстратом и от которой зависят каталитические свойства фермента.
При нарушении активного центра фермент теряет каталитическую активность, в то время как другие части молекулы фермента могут быть разрушены или удалены без её потери.
К настоящему времени изучено свыше 2000 тысяч ферментов, и число
их непрерывно возрастает. Согласно классификации Международного биохимического союза их подразделяют на шесть классов:
1. Класс оксидорекдуктаз включает ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции. Субстрат, подвергающийся окислению, рассматривается как донор водорода. Класс насчитывает 17 подклассов в зависимости от природы той группы в молекуле субстрата, которая
подвергается окислению (спиртовая, альдегидная, кетонная и т. д.).
2. Класс трансфераз объединяет ферменты, катализирующий реакции переноса групп (метильных, гликозильных, аминных и др.) от одного соединения (донора) к другому (акцептору). Класс подразделяется на 8 подклассов в зависимости от природы переносимых групп.
3. К классу гидролаз принадлежат ферменты, катализирующие гидролитическое расщепление различных соединений; он разделяется на 11 подклассов в зависимости от типа гидролизуемой связи - сложноэфирной, пептидной, гликозидной и т. д.
4. Класс лиаз - ферменты, отщепляющие от субстрата ту или иную группу
негидролитическим путем с образованием двойных связей, или наоборот,
присоединяющие группы к двойным связям. Включает 6 подклассов в зависимости от типа подвергающейся разрыву связи (углерод-углерод, углерод-кислород и т. п.)
16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5. К классу изомераз относят ферменты, катализирующие реакции изомеризации, т.е. структурные или геометрические изменения в пределах одной
молекулы. Этот класс разделяется на 5 подклассов в зависимости от типа
катализируемой реакции.
6. Класс лигаз (или синтетаз) объединяет ферменты, которые катализируют
соединение двух молекул друг с другом, сопряженное с гидролизом пирофосфатной связи в молекуле аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ)
или аналогичного трифосфата. Лигазы разделяются на 5 подклассов по
типу образуемой связи.
Об активности ферментов судят по силе их действия на определенные
вещества - субстраты. Количество продуктов распада или синтеза, образующихся при действии фермента на субстрат, служит критерием для определения степени активности его.
При сравнительном определении степени активности тех или иных
ферментов пользуются строго определенной методикой, так как незначительное отклонение от нее сопровождается значительными расхождениями
полученных результатов. Данные, определяющие степень активности фермента, выражают в относительных единицах, зависящих от принятого времени инкубации, реакции среды, температуры, характера субстрата, на который действует фермент, и от ряда других факторов.
Таким образом, исследование активности ферментов является одной
из сложных задач.
Наибольшее практическое значение в технологии производства и переработки сельскохозяйственной продукции имеют два класса ферментов –
оксидоредуктазы и гидродлазы. Среди оксидоредуктаз важнейшая роль принадлежит пероксидазе и каталазе; среди гидролаз важную роль играют амилолитические ферменты и липаза.
2.1. Определение активности каталазы в зерновом сырье
Цель работы: Освоение метода определения активности каталазы по
Баху и Опарину. Изучение влияния степени прорастания зерна на активность
каталазы в нем
Основные теоретические положения
Каталаза (1.11.1.6) относится к классу оксидоредуктаз. Систематическое название фермента - Н2О2 : Н2О2 – оксидоредуктаза. Она участвует в
процессе дыхания растениеводческой продукции. Это двухкомпонентный
фермент, состоящий из белка и простетической группы – гематина. В последний входит трехвалентное железо. Предполагают, что одна белковая молекула связана с четырьмя молекулами гематина.
В процессе окисления ряда веществ при дыхании живой клетки образуется перекись водорода:
АН2 + О2
А + Н2О2
где АН2 – восстановленный субстрат; А – окисленный субстрат.
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Перекись водорода в повышенных концентрациях оказывает токсическое действие на цитоплазму клеток.
Роль каталазы заключается в том, что она защищает организм от вредного влияния пероксида водорода, образующегося при дыхании. Это происходит в соответствии с уравнением:
каталаза
Н2О2 + Н2О2 

 О2 + 2Н2О
Таким образом, фермент окисляет одну молекулу пероксида водорода
с одновременным восстановлением второй молекулы пероксида водорода до
волы. Вместо пероксида водорода фермент может использовать в качестве
субстрата и органические перекиси.
Методика проведения анализов
Принцип метода
Метод определения активности каталазы в исследуемом материале
основан на измерении количества оставшегося неразложенным пероксида
водорода, оттитрованным 0,1 М раствором перманганата калия. Реакция протекает следующим образом:
5Н2О2 + 2КМnО4 + 4Н2SО4 = 5О2 + 2КНSО4 + 8 Н2О + 2МnSО4
Реактивы
1.
Водные экстракты фермента из зернового сырья. Для анализа
используют сухие (размолотые) и проросшие семена злаковых
растений. Навеску исследуемого образца массой 2 г растирают в
фарфоровой ступке с 10 см3 дистиллированной воды, без потерь
переносят в мерную колбу на 100 см3, ступку и пестик ополаскивают 20 см3 воды, которую переносят в эту же мерную колбу.
Колбу хорошо перемешивают, добавляют 2-3 капли толуола,
доводят водой до метки и настаивают 2 часа при комнатной
температуре. После настаивания жидкость центрифугируют 15
мин при 4000 об/мин и в центрифугате определяют активность
каталазы.
2.
Свежеприготовленный 1%-ный раствор пероксида водорода
3.
10 %-й раствор серной кислоты (на 1 дм3раствора берется 61 см3
концентрированной серной кислоты удельным весом 1,84)
4.
0,1 М раствор КМnО4 (3,16 г KMnO4 довести в мерной колбе на
1 дм3 дистиллированной водой до метки);
5.
Дистиллированная вода.
Приборы и оборудование: 1)колбы конические термостойкие на 100
3
см ; 2)цилиндры мерные на 25 см3, на 10 см3; 3)бюретка; 4)электроплитка.
Ход определения
Из центрифугатов, полученных после настаивания навески, отбирают
по две пробы по 20 мл – опытная и контрольная. В контрольных колбах учитывают количество пероксида водорода, которое присутствует в инкубаци18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
онной смеси и не подвергается действию каталазы. Для ингибирования фермента контрольные колбы кипятят 5 мин на электроплитке.
К опытной и прокипяченной контрольной колбам прибавляют по 20 мл
дистиллированной воды, по 3 мл 1 %- ного раствора перекиси водорода и
оставляют на 30 мин при комнатной температуре.
Через 30 мин к колбам прибавляют по 5 мл 10 %- ного раствора серной
кислоты для инкубации фермента и оттитровывают оставшийся пероксид водорода 0,1 М раствором перманганата калия.
Об активности каталазы судят по количеству миллиграммов пероксида
водорода, которое разрушилось в течение 30 мин ферментом, содержащимся
в 1 г исследуемого материала.
Обработка и обсуждение результатов
Активность каталазы определяют по формуле:
А
1,7  ( а  в )V1
, где
V2  m
А – активность каталазы, мг Н2О2 на 1 г навески;
а - количество 0,1 М раствора КМnО4, израсходованное на титрование
контрольной колбы, мл;
в – количество 0,1 М раствора КМnО4 , израсходованное на титрование
опытной колбы, мл (1 мл 0,1 М раствора КМnО4 эквивалентен 1,7 мг Н2О2);
V1 – объем, в котором растворена взятая для анализа навеска, мл;
V2 – объем раствора, взятый для титрования;
m – масса исследуемого образца, г.
Каждая бригада анализирует один образец, в котором определяет активность каталазы в соответствии с вышеизложенной методикой. На основании проведенных расчетов составляется сводная таблица (табл.1), в которую
вносятся результаты анализов, выполненных всеми бригадами для разных
видов сырья.
Таблица 1 – Определение активности каталазы
№
п/п
Вид зернового сырья,
время прорастания
Масса
навески,
г (m)
V1,
мл
V2,
мл
Объем КМnО4,
на титрование
контрольного
раствора, мл (а)
Объем КМnО4,
на титрование
опытного раствора, мл (в)
Активность
каталазы, мг
Н2О2/г
Построить график зависимости активности каталазы от времени прорастания семян и сделать вывод.
19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1.
2.
3.
4.
5.
Контрольные вопросы
Классификация ферментов.
Строение и механизм действия ферментов.
Строение каталазы.
Механизм действия каталазы.
Зависимость активности каталазы от времени прорастания семян.
2.2. Изучение влияния количества пероксидазы на её активность
Цель работы: Освоении фотоколориметрического метода определения
активности пероксидазы. Сравнение активности пероксидазы в различном
сырье. Изучение влияния количества пероксидазы на её активность
Основные теоретические положения
Пероксидаза широко распространена в живых организмах и играет
важную роль в окислительно-восстановительных процессах.
Систематическое название фермента пероксидазы (1.11.1.7) – донор:Н2О2 –оксидоредуктаза. Она катализирует реакцию:
RООН + АН2 → Н2О + RОН + А
где в качестве RООН может быть пероксид водорода НООН или органические пероксиды, т.е. она высокоспецифична в отношении акцептора водорода
и совсем не специфична в отношении донора водорода. Подвергаться окислению могут многочисленные полифенолы в свободном виде или в виде разнообразных производных – гликозидов, дубильных веществ, а также ароматические амины и некоторые аминокислоты. Вышеуказанные соединения пероксидаза окисляет с помощью пероксида водорода или любых органических
пероксидов, в том числе пероксидов ненасыщенных жирных кислот и каротина.
Пероксидаза – это двухкомпонентный фермент, простетическая группа
которого содержит гемм. Механизм действия пероксидазы может быть описан следующим образом:
Пероксидаза-FеОН + Н2О2 → Пероксидаза- FеООН + Н2О
Пероксидаза- FеООН + АН2 → Пероксидаза- FеОН + Н2О + А
где FеОН – железо (II), входящее в состав активной группы
пероксидазы;
АН2 – субстрат, окисляемый пероксидазой.
Пероксидаза играет важную роль в дыхании растениеводческой продукции. При ферментации чая и табака пероксидпаза наряду с полифенолоксидазой способствует образованию окрашенных и ароматизирующих компонентов.
20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Методика проведения анализов
Принцип метода
Метод определения активности пероксидазы основан на окислении пирогалолла в присутствии пероксида водорода до пурпурогаллина, интенсивность окраски которого определяют на фотоэлектроколориметре.
Реактивы
1. Водные экстракты фермента из растительного сырья. Навеску исследуемого образца массой 2 г растирают в фарфоровой ступке с 5
см3 фосфатного буфера с рН 7,0, переносят в коническую колбу на
50 мл, ступку и пестик ополаскивают 20 см3 того же раствора буфера, который переносят в эту же колбу. Колбу хорошо перемешивают, настаивают 30 мин при комнатной температуре. После настаивания жидкость центрифугируют 15 мин при 4000 об/мин и в центрифугате определяют активность пероксидазы.
2. Буферный раствор с рН 7,0:
3. 1 %-ный раствор пирогаллола.
4. 10 %-ный раствор серной кислоты: (на 1 дм3 раствора берется 61 см3
концентрированной серной кислоты удельным весом 1,84)
5. Свежеприготовленный 1 %-ный раствор пероксида водорода.
Приборы и оборудование: 1)пробирки на 20 см3; 2)мерные цилиндры
на 10 см3; 3)термостат; 4)фотоэлектроколориметр.
Ход определения
Для определения влияния количества пероксидазы на окисление пирогаллола берут три пробирки, в которые вносят по 5 мл пирогаллола и 1 мл 1
%-ного раствора пероксида водорода. В первую пробирку прибавляют 3 мл
дистиллированной воды, во вторую – 2 мл, в третью воду не приливают. Содержимое пробирок перемешивают и в каждую вносят вытяжку фермента: в
первую пробирку – 1 мл, во вторую – 2 мл, в третью – 4 мл центрифугата исследуемого образца.
Пробирки встряхивают и помещают в термостат с температурой 25 0С
на 15 мин. Через указанное время прекращают действие фермента, добавив 5
мл раствора серной кислоты.
Активность фермента определяют с учетом интенсивности окраски образовавшегося пурпурогаллина на фотоэлектроколориметре, используя зеленый светофильтр, в кювете толщиной 5 мм.
Колориметрирование проводят против фона, который учитывает
окраску исходных реактивов и ту, которая может образоваться в результате
неферментативной реакции. Приготовление фона проводят одновременно с
опытными образцами, для чего в отдельную пробирку приливают 5 мл пирогаллола, 1 мл 1 %-ного раствора пероксида водорода и 4 мл дистиллированной воды. Пробирку встряхивают и выдерживают с опытными образцами в
термостате при температуре 25 0С. После этого добавляют, как и в опытную
пробирку, 5 мл раствора серной кислоты.
21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Обработка и обсуждение результатов
Для сравнения активности пероксидазы берут экстракты из различных
видов растительного сырья. Каждая бригада изучает влияние количества
фермента на его активность в индивидуальном образце. Полученные данные
оптической плотности заносят в сводную таблицу.
Таблица 1 – Активность пероксидазы в зависимости от количества фермента
Вид растиОптическая плотность в зависимости от количества фермента
тельного сырья
1 мл
2 мл
4 мл
По данным оптической плотности сделать вывод о сравнительной активности фермента в различных образцах. Для каждого образца нарисовать
график зависимости активности пероксидазы от её количества и сделать вывод
1.
2.
3.
4.
Контрольные вопросы
Что такое апофермент, простетическая группа, ферментсубстратный комплекс, активный центр фермента, кофактор?
Какова роль белковой части фермента и его небелковой части
(простетической группы) в процессе катализа?
Строение и механизм действия пероксидазы. К какому классу
ферментов она относится?
Как влияет количество пероксидазы на её активность?
2.3. Определение активности амилолитических ферментов
в различном сырье
Цель работы: Освоение фотоколориметрического метода определения
активности амилолитических ферментов. Сравнение активности амилаз в
зерновом сырье и препаратах микробного происхождения
Основные теоретические положения
Амилазы относятся к классу гидролаз, подклассу карбогидролаз
(3.2.1.). Они катализируют гидролиз высокомолекулярных полисахаридов –
крахмала и гликогена. Установлено, что амилазы – это однокомпонентные
ферменты, активным центром которых являются сульфгидрильные и аминные группы, входящие в состав белка.
Под действием ферментов амилаз крахмал расщепляется с образованием декстринов и мальтозы. Декстрины - это высокомолекулярные вещества,
являющиеся промежуточными продуктами расщепления крахмала. Декстрины бывают различного состава и молекулярного веса. При действии амилаз
на крахмал сначала образуются декстрины с очень большим молекулярным
весом - амилодекстрины, которые окрашиваются йодом в синий цвет. Затем
образуются декстрины с меньшим молекулярным весом - эритродекстрины,
дающие с йодом красно-бурую окраску. При дальнейшем действии амилаз
образуются ахродекстрины, имеющие ещё меньший молекулярный вес и не
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
окрашивающиеся йодом. Наконец, образуются мальтодекстрины - декстрины
со сравнительно низким молекулярным весом, близкие к мальтозе; йодом
они также не окрашиваются. В конечном итоге образуется мальтоза. Таковы
этапы расщепления крахмала амилазами.
В растениях содержатся два вида амилаз, различающихся по характеру
действия на крахмал: -амилаза (3.2..1.1), называемая ещё декстриногенамилазой, и -амилаза (3.2.1.2) или сахарогенамилаза. Обе амилазы расщепляют
в крахмале связь 1,4, но -амилаза обладает более мощным действием. При
действии на крахмал она быстро дробит молекулы амилозы и амилопектина
на крупные декстрины, которые затем расщепляет до мальтозы. -амилаза
действует иначе: последовательно отщепляет от конца цепи полисахарида
одну за другой молекулы мальтозы. При этом -амилаза способна действовать и на нативный крахмал, разрушая крахмальное зерно, а -амилаза на нативный крахмал не действует.
Наиболее важным источником амилаз является зерно злаковых культур, причем - и  - амилазы могут встречаться в зерне вместе и раздельно. В
нормальном зерне пшеницы и ячменя содержится только -амилаза; амилазы там нет, но она образуется при прорастании. В нормальном зерне
ржи и овса встречаются обе амилазы, а в непроросших семенах сорго находится главным образом  - амилаза. Таким образом, зерно разных культур
отличается по содержанию - и  - амилазы. В различных частях зерновки
злаков амилазы проявляют разную активность: наиболее высока она в зародыше, а в эндосперме значительно ниже.
Амилазы имеют очень большое значение в оценки качества зерна и
пшеничной муки: процесс накопления сахара во время брожения теста и сам
процесс брожения зависят от скорости накопления в тесте мальтозы, что в
свою очередь зависит от действия этого фермента. Амилазы также важны в
спиртовой и пивоваренной промышленности, где применяется солод, представляющий собой проросшее и осторожно высушенное зерно злаков, которое является источником активной -амилазы.
Применяемый в бродильных производствах зерновой солод выполняет
задачу гидролиза нативного крахмала зернового сырья до сахаров, сбраживаемых дрожжами. Однако, эффективность солода как осахаривающего агента
достаточно низка, по сравнению с амилолитическими препаратами микробного происхождения. Для бродильного производства, перерабатывающего
крахмалосодержащее сырье, представляет интерес применение ферментов
микробного происхождения, обладающих высокой осахаривающей способностью. Высокая активность препаратов микробного происхождения объясняется тем, что помимо -амилазы они содержат еще один вид амилолитических ферментов – глюкоамилазу (3.2.1.3), расщепляющую крахмал, декстрины и мальтозу до глюкозы.
В настоящее время разработаны достаточно точные методы оценки активности амилолитических ферментов, в частности колориметрический метод определения декстриногенной активности (метод ВНИИПрБ).
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
За единицу декстриногенной активности (ДАк) принимают такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г крахмала до декстринов
за 60 мин при температуре 300С и рН среды 4,8-4,9 (для зерновых и солодовых препаратов), 4,7 (для мицелиальных препаратов) и 6,0 (для бактериальных препаратов). Количество прогидролизованного крахмала устанавливают
фотоколориметрически по иодной пробе.
Этот метод дает воспроизводимые результаты, позволяет определять активность амилолитических ферментов различного происхождения, полученных с применением таких продуцентов, как микромицеты и бактерии, а также солод и нормальное зерно различных злаковых культур.
Методика проведения анализов
Принцип метода
Субстратом для определения активности амилаз служит раствор
крахмала. В крахмал добавляют раствор фермента различного происхождения, выдерживают определенное время для проведения гидролиза крахмала,
после чего определяют декстриногенную активность амилаз фотоколориметрическим методом.
Реактивы
1. Солодовые экстракты различных злаковых культур.
5 г свежепроросшего солода растереть в ступке пестиком, перенести
без потерь в коническую колбу на 200 см3, добавить 90 см3 дистиллированной воды и 10 см3 фосфатного буфера с рН 4,8. Выдержать при
температуре 30 0С не менее 1 час при периодическом помешивании
стеклянной палочкой. Хранить в холодильнике. В 5 см3 такого раствора содержится 250 мг фермента.
2. Растворы ферментных препаратов микробного происхождения.
0,1 г ферментного препарата помещают в мерную колбу на 100 см3 и
доводят до метки дистиллированной водой. Раствор хранят до 24 час
при температуре от 2 до -4 0С. В связи с высокой активностью ферментных препаратов, перед проведением анализа готовят рабочий
раствор ФП, разбавляя основной раствор в 10-20 раз. В 5 см3 рабочего
раствора ФП при этом будет содержаться, соответственно, 0,5 и 0,25
мг фермента.
3. 1 %-ный раствор крахмала.
К 10 г крахмала добавить 250 см3 холодной дистиллированной воды,
перемешать, добавить еще 250 см3 горячей воды (t=50-60 0С) и поместить на водяную баню на 20 мин, непрерывно помешивая. Охладить,
перелить в мерную колбу на 1 дм3 через слой ваты, добавить 100 см3
фосфатного буфера (рН 4,8) и довести дистиллированной водой до
метки.
4.
0,1 н. раствор НСl – 8,2 см3 концентрированной соляной кислоты развести в мерной колбе на 1 см3 дистиллированной водой до метки (кислоту лить в воду!)
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5.
6.
1)
2)
3)
4)
5)
0,25 %-ный раствор йода в КI – 0,25 г кристаллического иода и 2,5 г
йодистого калия поместить в мерную колбу на 100 см3, развести в небольшом количестве дистиллированной воды (около 40 см3) и довести
водой до метки. Хранить в темноте. Из него готовить рабочий раствор
йода в соляной кислоте – 10 см3 основного раствора в мерной колбе на
500 см3 довести до метки 0,1 н. раствором соляной кислоты. При этом
определяют оптическую плотность рабочего раствора на ФЭК-56 М
при длине волны 453 нм (фильтр №4) в кювете с длиной рабочей грани 1 см: она должна быть 0,220±0,01
Фосфатный буферный раствор с рН 4,7-4,9.
5,938 г Na2НРО4 развести дистиллированной водой мерной колбе на
500 см3 до метки (раствор 1). 4,540 г КН2РО4 аналогично развести в
мерной колбе на 500 см3 (раствор 2). Для получения буферного раствора с рН 4,85 перед анализом растворы 1 и 2 смешивают в соотношении 1:1.
Приборы и оборудование: 1)стаканы на 50 см3; 2)цилиндры мерные
на 50 см3, на 100 см3; 3)пипетки на 5 см3; на 2 см3; 4)колбы конические
на 100 см3; 5)таз пластмассовый с водой температурой 30 0С;
6)фотоэлектроколориметр ФЭК-56 М.
Ход определения
В стеклянный стакан объемом 50 см3 налить 10 см3 раствора крахмала и
поместить в водяную баню при t 30 0С на 10 мин.
Не вынимая стакана, добавить пипеткой 5 см3 рабочего раствора фермента. Одновременно выполняется контрольный опыт (один на всю
подгруппу). В контрольную пробу добавить вместо фермента 5 см3 дистиллированной воды. смеси быстро перемешать и выдержать при 30
0
С в течение 10 мин.
В коническую колбу на 100 см3 добавить 25 см3 рабочего раствора йода,
приготовленного на соляной кислоте.
Спустя 10 мин стаканы вынуть из бани, отобрать пипеткой 0,25 мл
прогидролизованного раствора и добавить в колбу с иодом. Быстро перемешать. Соляная кислота сразу прерывает действие ферментов. полученные растворы приобретают различную окраску: контрольный
имеет синий цвет, а опытный – фиолетовый различной степени интенсивности в зависимости от степени прогидролизованного крахмала.
Определить оптическую плотность опытного и контрольного растворов
по отношению к дистиллированной воде. Для работы используют кюветы с длиной рабочей грани 1 см и красный светофильтр (№8). значение оптической плотности контрольного раствора (D1) должно быть не
менее 0,690.
25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Обработка и обсуждение результатов
Количество прогидролизованного крахмала С (в г) вычисляют по формуле:
С=0,1(D1-D2):D1, (1)
где 0,1 – количество крахмала, введенного в реакцию; D1 и D2, соответственно, оптическая плотность контрольного и опытного растворов. С не должно
быть меньше 0,02 или больше 0,07 г.
Активность фермента (ед./г) вычисляют по формулам (2-4), в зависимости от происхождения ферментного препарата:
Для зерна и свежепроросшего солода: ДАк= (6,889С – 0,029388)1000 : mф (2)
Для мицелиальных препаратов: ДАк= (7,264С – 0,03766)1000 : mф (3)
Для бактериальных препаратов: ДАк= (5,885С – 0,001671)1000 : mф (4)
Где mф – масса ферментного препарата, введенного в реакцию; С - количество прогидролизованного крахмала, г
Полученные данные занести в таблицу 2 (для всех ферментных препаратов).
Таблица 2 - Декстриногенная активность ферментов различного
происхождения
№
п/п
Ферментный
препарат
Масса фермента, участвующего в реакции, мг (mф)
Оптическая
плотность
опытного
раствора (D1)
Оптическая
плотность
контрольного раствора (D1)
Кол-во
прогидролизован.
крахмала
(С)
Декстриногенная активность
фермента
(ДАк), ед./г
Сравните активность ферментных препаратов различного происхождения и сделайте вывод.
Контрольные вопросы
1.
Амилолитические ферменты; различия в характере их действия на крахмал.
2.
Значение амилаз в хлебопечении; в бродильных производствах.
3.
Какие ферментные препараты применяются в бродильных
производствах и что они из себя представляют.
4.
Как оценивают активность амилолитических ферментов и в
чем ее выражают.
2.4. Определение оптимальных условий действия амилолитических
ферментных препаратов
Цель работы: Исследование влияния температуры и активной кислотности среды на активность амилолитических ферментов
Основные теоретические положения
Исследования показали, что амилазы различных источников обладают
аналогичными, но не идентичными свойствами. Все амилазы подвержены
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ингибированию тяжелыми металлами. Напротив, кальций обеспечивает максимальную устойчивость амилаз к денатурации и разрушению протеолитическими ферментами.
Активность ферментов в сильной степени зависит от условий их действия. Факторами, влияющими на работу ферментов, является температура,
активная кислотность среды, присутствие ионов металлов и т.д. Оптимальные условия действия ферментов, полученных их различных источников, не
всегда совпадают. Так, оптимумы действия -амилаз различного происхождения проявляются при разных величинах рН. Для действия грибной амилазы оптимальная величина рН составляет 4,5-4,8, для солодовой 5,3, а
для бактериальной – 6,0-7,0. Таким образом, бактериальные амилазы, например -амилазы Bac. subtilis, в отличии от амилаз плесневых грибов и солода,
активны в нейтральной и щелочной среде.
Отличаются амилазы из различных источников и по рН-стабильности.
Полная инактивация солодовой -амилазы происходит при рН 3,6 при 00 С в
течение 15-30 мин. Полная инактивация -амилазы плесневых грибов
наблюдается при рН 2,5 в течение часа.
Так как при осахаривании сырья в спиртовом производстве используется повышенная температура, очень важно знать отношение амилаз к действию высоких температур. Следует отметить, что оптимальный температурный предел активности бактериальных амилаз очень высок по сравнению с
установленными для грибных и солодовых амилаз. Так, -амилаза Bac. subtilis сохраняет активность длительное время при 85 0С и более высокой температуре. В то же время амилазы плесневых грибов активнее действуют при
температурах 55-60 0С.
Различия в свойствах амилаз разного происхождения по оптимуму температуры и рН раскрывают возможности целенаправленного их применения
в различных технологических процессах получения пищевых продуктов, таких как производство спирта, хлебопечение и др.
Методика проведения анализов
Принцип метода
Определение активности амилолитических ферментов проводят фотоколориметрическим методом, описанным в работе № 4. Для изучения зависимости активности ферментов от величины рН среды, в стаканчик с крахмалом одновременно с ферментом добавляют 5 мл соответствующего буферного раствора. Определение зависимости работы ферментов от температуры
проводят при оптимальном для данного фермента значении рН (4,6 для грибного ферментного препарата, 5,6 - для солода; 6,6 – для бактериального препарата).
Реактивы.
1.
Солодовые экстракты различных злаковых культур.
5 г свежепроросшего солода растереть в ступке пестиком, перенести
без потерь в коническую колбу на 200 см3, добавить 100 см3 дистиллированной воды и выдержать при температуре 30 0С не менее 1 час
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2.
3.
4.
5.
6.
при периодическом помешивании стеклянной палочкой. Хранить в
холодильнике. В 5 см3 такого раствора содержится 250 мг фермента.
Растворы ферментных препаратов микробного происхождения.
0,1 г ферментного препарата помещают в мерную колбу на 100 см3 и
доводят до метки дистиллированной водой. Раствор хранят до 24 час
при температуре от 2 до -4 0С. В связи с высокой активностью ферментных препаратов, перед проведением анализа готовят рабочий
раствор ФП, разбавляя основной раствор в 10-20 раз. В 5 см3 рабочего
раствора ФП при этом будет содержаться, соответственно, 0,5 и 0,25
мг фермента.
1 %-ный раствор крахмала.
К 10 г крахмала добавить 250 см3 холодной дистиллированной воды,
перемешать, добавить еще 250 см3 горячей воды (t=50-60 0С) и поместить на водяную баню на 20 мин, непрерывно помешивая. Охладить,
перелить в мерную колбу на 1 дм3 через слой ваты и довести дистиллированной водой до метки.
0,1 н. раствор НСl – 8,2 см3 концентрированной соляной кислоты развести в мерной колбе на 1 дм3 дистиллированной водой до метки (кислоту лить в воду!)
0,25 %-ный раствор йода в КI – 0,25 г кристаллического йода и 2,5 г
йодистого калия поместить в мерную колбу на 100 см3, развести в небольшом количестве дистиллированной воды (около 40 мл) и довести
водой до метки. Хранить в темноте. Из него готовить рабочий раствор
йода в соляной кислоте – 10 см3 основного раствора в мерной колбе на
500 см3 довести до метки 0,1 н. раствором соляной кислоты. При этом
определяют оптическую плотность рабочего раствора на ФЭК-56 М
при длине волны 453 нм (фильтр №4) в кювете с длиной рабочей грани 1 см: она должна быть 0,220±0,01
Цитратно-фосфатные буферные растворы в интервале рН 2,2-8,0.
Для приготовления исходных растворов 10,5 г (0,1 М) лимонной кислоты развести дистиллированной водой в мерной колбе на 500 см 3 до
метки (раствор А). Раствор В: 17,81 г (0,2 М) Na2НРО4 аналогично
развести в мерной колбе на 500 см3 (раствор В). Для получения буферных растворов с различным значением рН перед анализом растворы А и В смешивают в мерной колбе на 100 см3 в следующих соотношениях:
рН
V р-ра А,см3
V р-ра В,см3
2,6
10,9
89,1
3,6
32,2
67,8
4,6
48,2
51,8
5,6
58,0
42,0
6,
72,7
27,3
Приборы и оборудование: 1)стаканы на 50 см3; 2)цилиндры мерные
на 50 см3, на 100 см3; 3)пипетки на 5 см3; на 2 см3; 4)колбы конические
на 100 см3; 5)таз пластмассовый с водой температурой 30 0С;
28
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1)
2)
3)
4)
5)
6)фотоэлектроколориметр ФЭК-56 М с кюветами с рабочей толщиной
10 мм.
Ход определения
В стеклянный стакан объемом 50 см3 налить 10 см3 раствора крахмала и
поместить в водяную баню при t 30 0С ( или при 70 0С при изучении
влияния температуры) на 10 мин.
Не вынимая стакана, добавить пипеткой 5 см3 рабочего раствора фермента и 5 см3 соответствующего буферного раствора. Одновременно
выполняется контрольный опыт (один на всю подгруппу). В контрольную пробу добавить вместо фермента 5 см3 дистиллированной воды.
Буферный раствор не добавляют. Смеси быстро перемешать и выдержать при 30 0С в течение 10 мин.
В коническую колбу на 100 см3 добавить 25 см3 рабочего раствора йода,
приготовленного на соляной кислоте.
Спустя 10 мин стаканы вынуть из бани, отобрать пипеткой 0,25 см 3
прогидролизованного раствора и добавить в колбу с иодом. Быстро перемешать. Соляная кислота сразу прерывает действие ферментов. полученные растворы приобретают различную окраску: контрольный
имеет синий цвет, а опытный – фиолетовый различной степени интенсивности в зависимости от степени прогидролизованного крахмала.
Определить оптическую плотность опытного и контрольного растворов
по отношению к дистиллированной воде. Для работы используют кюветы с длиной рабочей грани 1 см и красный светофильтр (№8). Значение оптической плотности контрольного раствора (D1) должно быть не
менее 0,690.
Обработка и обсуждение результатов
Количество прогидролизованного крахмала С (в г) вычисляют по формуле:
С=0,1(D1-D2):D1, (1)
Где 0,1 – количество крахмала, введенного в реакцию; D1 и D2, соответственно, оптическая плотность контрольного и опытного растворов. С не должно
быть меньше 0,02 или больше 0,07 г.
Активность фермента (ед./г) вычисляют по формулам 2-4, в зависимости
от происхождения ферментного препарата:
Для свежепроросшего солода:
Для мицелиальных препаратов:
Для бактериальных препаратов:
ДАк= (6,889С – 0,029388)1000 : mф
ДАк= (7,264С – 0,03766)1000 : mф
ДАк= (5,885С – 0,001671)1000 : mф
(2)
(3)
(4)
Где mф – масса ферментного препарата, введенного в реакцию; С - количество прогидролизованного крахмала, г.
Полученные данные занести в таблицу 1 (для всех вариантов).
29
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Нарисуйте график зависимости активности фермента от рН и сделайте
вывод об оптимальной рН среды для данного ферментного препарата.
Сравните эффективность работы фермента при двух температурах и
сделайте вывод.
Таблица 1 - Изучение условий действия амилолитических ферментов
№
п/п
Ферментный
препарат,
вариант
опыта (рН и
t)
Масса фермента, участвующего в
реакции, мг
(mф)
Оптическая
плотность
опытного
раствора
(D2)
Оптическая
плотность
контрольного
раствора (D1)
Кол-во прогидролизован. крахмала (С)
Декстриногенная
активность фермента (ДАк),
ед./г
Контрольные вопросы.
1. Роль амилолитических ферментов в производстве спирта. На каких
стадиях технологического процесса их применяют.
2. Факторы, влияющие на работу амилолитических ферментов.
3. Оптимальные условия действия амилолитических ферментных препаратов разного происхождения: солодовых; мицелиальных; бактериальных.
2.5. Определение активности липаз в семенах злаковых
и масличных культур
Цель работы: Исследование активности липаз в нормальных и проросших семенах злаковых и масличных культур и в зависимости от сроков
хранения
Основные теоретические положения
Липазы (триацилглицерол-липазы) являются весьма важными представителями эстераз, имеющими большое практическое значение. Под действием липаз происходит гидролиз жиров с образованием свободных жирных
кислот и трехатомного спирта глицерина по уравнению:
О
СН2  О  С  R1

О
СН  О  С  R2

О
СН2  О  С  R3
+ 3Н2О
липаза
- 3Н2О
СН2  О Н + R1СООН

СН  О Н + R2СООН

СН2  ОН + R3СООН
Липазы играют большую роль при прорастании масличных семян, а
также участвуют в процессах порчи масличных семян и продуктов переработки зерна при хранении. Образующиеся при их участии свободные жирные
кислоты, и прежде всего ненасыщенные подвергаются дальнейшему окислению под действием ферментов липоксигеназ. Окисление происходит в результате присоединения кислорода по месту двойных связей с образованием
циклических перекисей:
30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
R1CH2CH = CHCH2R2 + O2  R1CH2CH  CHCH2R2


O  O
Кислород может присоединяться также и к углеродному атому, соседнему с двойной связью с образованием гидроперекисей:
R1CH2CH = CHCH2R2 + O2  R1CH2CH = CHCHR2

О  ОН
Перекиси и гидроперекиси - очень неустойчивые активные соединения,
которые быстро распадаются с образованием кетонов, альдегидов и кислот с
короткими цепями, обладающих неприятным запахом.
Последовательность ферментативного прогоркания растительного жира
можно изобразить в виде следующей схемы:
Триацилглицерины
 Триацилглицерол-липаза
Жирные кислоты и глицерин
 Липоксигеназа
Перекиси и гидроперекиси жирных кислот

Различные альдегиды и кетоны
Липазы содержатся во всех семенах зерновых и масличных культур,
но особенно их много в семенах клещевины. При переработке растениеводческого сырья они переходят в продукты переработки – муку, крупу, растительные масла, вызывая их порчу при длительном хранении.
Методика проведения анализов
Принцип метода
Субстратом для определения активности липаз в семенах масличных
и злаковых культур служит растительное масло. В масло добавляют навеску
муки из семян, выдерживают определенное время для проведения гидролиза
жира, после чего определяют жирорасщепляющую активность липаз методом титрования свободных жирных кислот, образующихся при гидролизе.
Реактивы
1. Подсолнечное или оливковое масло;
2. Фосфатный буфер рН 7,4: смешивают 800 см3 1/15 М раствора
Na2HPO4 c 200 см3 1/15 М раствора КН2РО4 . Для приготовления
1/15 М растворов Na2HPO4 и КН2РО4 необходимо взять, соответственно, 9,48 г Na2HPO4 и 9,07 г КН2РО4 и развести дистиллированной водой до 1 л;
3. 0,05 н водный раствор КОН (2,8 г КОН развести дистиллированной
водой до 1 дм3);
4. Дистиллированная вода.
5. 0,5% раствор фенолфталеина.
Приборы и оборудование: 1)колбы конические на 100 см3 с пробками; 2)цилиндры мерные на 10 см3, 25 см3; 3)весы лабораторные; 4)бюретка.
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ход определения
В коническую колбу емкостью 100 см3 отвешивают 3,00 г (с точностью до 0,01 г) масла, 2 см3 фосфатного буфера, сильно встряхивают, добавляют 1 г размолотых семян и 3 см3 воды температурой 200С, закрывают плотно пробкой и умеренно взбалтывают в течение 1 ч. По истечении этого времени смесь титруют 0,05 н раствором КОН с 2 -3 каплями фенолфталеина.
Параллельно ставят контрольный опыт: в колбу насыпают 1 г муки из семян
и наливают 3 см3 воды, смесь хорошо перемешивают и нагревают 5 мин на
кипящей водяной бане. Затем охлаждают, добавляют 3 см3 масла и далее поступают как и в рабочем опыте.
Обработка и обсуждение результатов.
Активность липазы выражают в мл 0,1 Н раствора щелочи, необходимой для нейтрализации жирных кислот, образующихся при ферментативном
гидролизе, в 1 г жира. Активность ( Х ) вычисляют по формуле:
(а - в)
Х=
, где
2н
(а - в)
- разница между количеством 0,05 Н раствора КОН, израсходованного на титрование рабочего и контрольного опыта;
н - навеска жира.
2 – поправочный коэффициент для перевода 0,05 н раствора КОН в
0,1 н.
Для исследования берутся несколько образцов проросших и нормальных семян злаковых и масличных культур с различными сроками хранения.
Каждая бригада анализирует один образец и результаты исследований вносит
в сводную таблицу.
Таблица 1. Активность липаз в семенах различного качества.
№ п/п Семена Кол-во КОН в
Кол-во КОН в
Активность Примечание
рабочем опы- контрольном опылипаз
те, мл (а)
те, мл (в)
После обсуждения результатов сравнивают активность липаз в семенах различных культур и делают выводы о влиянии на неё качества семян и
сроков их хранения.
Контрольные вопросы
1. Какова роль гидролитических ферментов и как их классифицируют.
2. Ферментативный гидролиз растительных жиров под действием липаз.
3. Прогоркание растительных жиров.
4. Изменение активности липаз в семенах при прорастании и длительном
хранении.
ГЛАВА 3
УГЛЕВОДЫ
32
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Углеводы - наиболее распространенные вещества в органическом мире.
Особенно много углеводов содержится в растениеводческой продукции. Доля их в отдельных частях растений может достигать 90% и более сухого вещества.
В растениях углеводы являются главными продуктами фотосинтеза и
основным дыхательным субстратом. Они в большом количестве накапливаются в корнях, клубнях, семенах и используются затем в качестве запасных
питательных веществ. Стенки клеток и растительные волокна состоят главным образом из углеводов; в плодах и ягодах также преобладают углеводы.
Велика роль углеводов в питании человека и кормлении сельскохозяйственных животных. Они представляют собой наиболее доступный энергетический материал - основной источник калорий.
УГЛЕВОДЫ
Моносахариды
пентозы ( С5H10O5)
полисахариды
Гексозы (С6H12O6)
альдозы
Кетозы
Альдозы
кетозы
арабиноза
ксилоза
рибоза
рибулоза
ксилулоза
глюкоза
манноза
галактоза
Фруктоза
олигосахариды
дисахариды
(С12H22O11)
сахароза
мальтоза
полиозы
крахмал
гликоген
клетчатк
трисахарид
(С18H32O16)
раффиноза пентозаны, гемицеллюлозы,слизи,
камеди,
пектины
Рис. 1. Важнейшие углеводы растительного пищевого сырья
Сахара играют важную роль как основной субстрат брожения во многих процессах переработки растениеводческого сырья: хлебопечении, пивоварении, виноделии, силосовании кормов и др. Многие углеводы находят
широкое техническое применение.
По физиологической роли в растении углеводы можно разделить на
такие группы: а) метаболиты ( сахара и олигосахариды); б) запасные вещества ( полисахариды, реже сахара ); в) структурные ( высшие полисахариды).
Важнейшие углеводы, встречающиеся в растительном пищевом сырье,
представлены в виде схемы на рис. 1.
33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Очень часто простые сахара вступают в соединение с другими веществами, образуя так называемые гликозиды. Моносахариды входят также в
состав нуклеиновых кислот.
Моносахариды
3.1.1. Определение глюкозы в картофеле йодометрическим методом
Цель работы: Освоение йодометрического метода определения альдоз в растительном сырье ( по Вильштеттеру и Шудлю). Изучение влияния
сорта и условий хранения картофеля на количество глюкозы в клубнях
Основные теоретические положения
Содержание свободных сахаров в свежеубранных клубнях картофеля
невелико и не превышает 0,5 % на сырой вес. Основные сахара в клубнях –
сахароза, глюкоза и фруктоза. В период хранения клубней при низких положительных температурах (2-40С и ниже), в них может происходить значительное накопление сахаров, в основном в виде фосфорных эфиров глюкозы
(глюкозо-6-фосфат), и клубни приобретают не свойственный им сладкий
вкус. Это особенно важно при использовании картофеля для переработки на
сухие и обжаренные картофелепродукты. Качество сушеного картофеля и
картофельной крупки, а ещё в большей мере хрустящего картофеля (чипсов),
как правило, тем выше, чем ниже содержание сахаров в исходном сырье.
Причиной ухудшения качества сушеного и особенно хрустящего картофеля
является происходящий при изготовлении этих продуктов процесс взаимодействия между редуцирующими сахарами и аминокислотами с образованием меланоидинов. С появлением меланоидинов в продукте из картофеля происходит не только его потемнение, но и ухудшение всех его свойств (вкуса,
развариваемости, набухаемости, хруста, витаминной активности).
Заметное ухудшение качества продуктов переработки картофеля
наступает уже при содержании в нем 5-6% сахаров на сухое вещество, в то
время как сладкий вкус в картофеле начинает ощущаться, как только уровень
сахаров превысит 7-8% сухого вещества. Разные сорта картофеля отличаются по содержанию сахаров и интенсивности их накопления во время хранения. В одних сортах уровень сахаров возрастает медленнее, в других быстрее. Сортовые различия особенно проявляются при хранении картофеля в
условиях низких температур, способствующих быстрому накоплению в
клубнях сахаров.
Накопление в картофеле сахаров при низких температурах, равно как
и их исчезновение при смене холодного хранения на теплое, обусловлено
различной скоростью отдельных превращений крахмала и сахаров. При хранении картофеля в нем одновременно происходят следующие реакции: крахмалсахар; сахаркрахмал; потребление сахара на дыхание. При снижении
температуры заметно уменьшается скорость всех трех реакций. Однако
больше всего ослабляется ресинтез крахмала, и в этом основная причина
накопления сахаров в клубнях при низкой температуре. С повышением температуры скорость этой реакции возрастает снова сильнее других, и поэтому
34
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
именно она в первую очередь ответственна за исчезновение сахаров в картофеле при выдерживании клубней в тепле после холодного хранения.
Для того, чтобы освободиться от сахаров, образующихся в клубнях
при распаде крахмала в условиях низких температур, необходимо выдержать
клубни при повышенных температурах. Однако, на скорость превращения
сахаров в крахмал большое влияние оказывает не только температура, при
которой картофель ранее хранился, но и как долго он находился при низкой
температуре: чем дольше картофель хранится при низкой температуре, тем
больше времени требуется для ресинтеза крахмала. Так, для снижения содержания сахаров в картофеле, находившемся 7-8 месяцев при температуре
около 00С, его надо выдержать при 200С в течении недели и более, но при
этих условиях картофель может испортиться еще до снижения сахаристости.
Методика проведения анализов
Принцип метода
В основу метода положен процесс окисления альдегидной группы
глюкозы йодом до глюконовой кислоты. Реакция протекает по следующему
уравнению:
СН2OH(СНОН)4С
О
+ J2 + 2NaOH
СН2OH(СНОН)4СOONa
Н
+ 2NaJ
+ H2O
В этих условиях кетозы не окисляются .
Реактивы
1. 0,1 н раствор йода : 12,7 г йода и 30 г КJ растворяют в малом объёме дистиллированной воды и разбавляют до 1 дм3 ;
2. 0,1 н раствор гипосульфита: 25 г Na2S2O3  5H2O растворяют в 1
дм3 свежепрокипяченной и охлажденной дистиллированной воды,
добавляют 0,1 г Na2СO3, выдерживают 1-2 дня; хранят в темном
сосуде. Концентрация не меняется 2-3 месяца;
3. 0,1 н раствор NaOН: 4 г NaOН растворить в дистиллированной воде, охладить и разбавить до 1 дм3;
4. 1 н раствор Н2SO4: 28 мл концентрированной Н2SO4 влить в 0,5 дм3
воды, разбавить до 1 дм3.
5. 0,5%-ный раствор крахмала.
6. Вода дистиллированная.
Приборы и оборудование: 1)колбы мерные на 100 см3; 2)воронки; 3)
колбы конические на 250 см3 с резиновыми пробками; 5)цилиндры
мерные на 10 см3, 25 см3, 50 см3; 6)бюретка; 7)весы лабораторные
35
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ход определения
Клубни картофеля измельчают на мелкой терке, берут навеску 1 г и
помещают в мерную колбу емкостью на 100 см3. Экстрагируют водой и доводят до метки. Содержимое колбы фильтруют и из прозрачного раствора
отбирают 10 см3, соответствующие 0,1 г картофеля, в коническую колбу на
250 см3 для исследования.
В колбу добавляют 25 см30,1 н. раствора йода и через 2-3 мин при
энергичном помешивании медленно наливают 35 см3 0,1 н. раствора NaOН
до исчезновения окраски йода. Колбу закрывают хорошо пригнанной резиновой пробкой и ставят на 20 мин в темное место. После этого в колбу добавляют 5 см3 1 н. раствора Н2SO4 и оттитровывают выделившийся йод 0,1 н.
раствором гипосульфита, добавляя к концу титрования раствор крахмала в
качестве индикатора. Одновременно ставят контрольный опыт с 10 см3 дистиллированной воды.
Обработка и обсуждение результатов
Количество глюкозы (в %) вычисляют по формуле:
(а - в) 0,009V1  100
X =
, где
n V2
(а - в ) - количество гипосульфита, пошедшего на титрование контрольного и рабочего опыта;
0,009 - титр глюкозы по йоду ( молекулярная масса глюкозы 180, эквивалент 90, титр 0,1 н. раствора 0,009);
n - навеска ;
V1 - объём растворения навески;
V2 - объём, взятый для титрования.
Для анализа отбираются клубни различных сортов картофеля, хранившиеся при разных температурах . Каждая бригада анализирует один образец и результаты вносит в сводную таблицу.
Таблица 1 - Содержание глюкозы в клубнях картофеля.
№ п/п
Сорт,
условия
хранения
Масса
навески, г
(n)
Кол-во Na2S2O3
на
титрование
контрольного
раствора, мл (а)
Кол-во Na2S2O3 Содержание
на
титрование глюкозы, %
опытного
раствора, мл (в)
После обсуждения делаются выводы о влиянии сорта и условий хранения картофеля на содержание глюкозы в клубнях картофеля.
Контрольные вопросы
1. Функции углеводов растении.
2. Общее строение моносахаридов.
3. Превращение простых сахаров в процессе переработки растениеводческой
продукции.
36
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4. Особенности углеводного обмена в клубнях картофеля при хранении.
5. Влияние простых сахаров на качество продуктов переработки клубней
картофеля.
3.2 Полисахариды
3.2.1. Определение происхождения растительного крахмала
Цель работы: Изучить под микроскопом строение крахмальных зерен
различных злаковых культур и картофеля. По форме и размеру крахмальных
зерен научиться определять происхождение растительного крахмала
Основные теоретические положения
Крахмал - главный полисахарид растений, играющий роль запасного
вещества. Крахмал всегда содержится в зеленых листьях, где он образуется в
процессе фотосинтеза, но основными органами растений, в которых накапливается наибольшее количество крахмала, являются семена, клубни, луковицы и др. особенно много крахмала в зерне злаковых культур - 60-80 %, в
семенах бобовых (кроме сои) - 34-44 %, в клубнях картофеля - до 30%.
Крахмал - это смесь двух полисахаридов: амилозы и амилопектина, которые различаются по химическому строению. Амилоза представляет собой
длинную неразветвленную цепь остатков -D-глюкозы, соединенных 1,4связями:
Н
О
СН2ОН

О Н
Н
ОН Н


Н
ОН
Н
СН2ОН

О Н
Н
ОН
Н


Н
ОН
Н
СН2ОН

О Н
Н
ОН
Н
О


Н
ОН
Амилоза
Каждая молекула амилозы включает 200 - 500 остатков глюкозы и
имеет молекулярную массу 100-600 тыс. Длинная цепь молекулы амилозы
закручена в спираль, причем каждый виток спирали состоит из шести глюкозных остатков.
В отличии от амилозы молекула амилопектина имеет разветвлённую
структуру; в точках ветвления остатки -D-глюкозы соединены 1,6-связями.
Молекулярная масса амилопектина достигает 1 млн. Точки ветвления ( связи
1,6 ) встречаются в среднем через 20-25 глюкозных звеньев. По аналогии из
ботаники молекула амилопектина напоминает срубленное дерево, ствол и
ветви которого имеют одинаковую толщину и представляют собой спирально
закрученную цепь глюкозных остатков:
37
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Н

О
Н

О
СН2ОН
О Н
Н
Н ОН


Н ОН
СН2ОН

О
Н
ОН Н
Н
ОН
Н
Н

СН2ОН

О Н
Н
ОН
Н
О
Н
ОН
СН2ОН
Н

О
Н
Н

ОН
Н


Н
ОН
Н

СН2

О Н
Н
Н


ОН Н
О


Н
ОН
СН2ОН

О Н
Н
ОН
Н
О


Н
ОН
Амилопектин
Родственным растительному крахмалу веществом является животный
крахмал - гликоген, который содержится в различных тканях и органах животных, а также в некоторых растениях: в зерне сахарной кукурузы, дрожжах
и грибах. По строению гликоген близок к амилопектину, но отличается от
него большей разветвленностью молекулы ( одно ответвление на каждые 1018 остатков глюкозы ) и более высокой молекулярной массой( до 10 7-109).
В растениях крахмал содержится в виде крахмальных зерен различного
размера (от 0,002 до 0,15 мм). Наиболее крупными являются зёрна картофельного крахмала. Крахмальные зерна напоминают линзы сферической,
овальной или неправильной формы с характерной слоистостью.
Каждая культура имеет свои характерные для неё форму и размеры
крахмальных зерен. Крахмальные зерна пшеницы, ржи и ячменя простые, в
то время как у кукурузы, овса и риса сложные, состоящие из отдельных, как
бы склеенных между собой крахмальных зернышек. У картофеля крахмальные зерна крупные, неправильной овальной формы со смещенным центром
слоистости.
Размер крахмальных зерен оказывает большое влияние на технологические свойства клубней картофеля. От этого также зависит консистенция
картофельного клубня и рассыпчатость после варки, которая так высоко ценится потребителем. При нагревании зерна крахмала набухают, и поэтому
клетки, содержащие зерна, округляются, начинают легче отделяться одна от
другой, что и создает рассыпчатую консистенцию. Слишком сильное набухание крахмальных зерен вызывает разрыв клеток, и такой картофель при
варке дает полужидкую массу. Чем мельче зерна, тем чаще наблюдается разрыв клеток, особенно если они меньше 0,02 мм.
Принцип метода
Этот метод пригоден для исследования муки зерна различных злаковых культур. Опытный технолог легко может определить примесь ржаной
муки в пшеничной, изучив под микроскопом форму и размер крахмальных
зерен.
Происхождение растительного крахмала сравнительно легко можно
установить при сравнении с известными образцами, рисунками или микрофотографиями.
Реактивы и оборудование.
38
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1. Образцы крахмала различных злаковых культур и картофеля.
2. Предметные и покровные стекла.
3. Микроскоп.
Ход анализа
Полученный образец муки или крахмала детально изучают под микроскопом при разных увеличениях, зарисовывают и сравнивают с известными
образцами. По известным образцам определяют происхождение растительного крахмала.
Контрольные вопросы
Роль крахмала в растениях.
Строение крахмала.
Влияние размера крахмальных зерен на технологические свойства картофеля.
3.2.2. Выделение и количественное определение растворимого пектина
Цель работы: Освоение метода определения количества пектина по
пектату кальция. Изучение его желеобразующей способности
Основные теоретические положения
Одним из важнейших направлений повышения эффективности современного производства является создание малоотходных и безотходных технологий, использование вторичных сырьевых ресурсов. В наибольшей степени этим требованиям отвечает производство пектина и пектинопродуктов из
вторичных сырьевых ресурсов.
Пектиновые вещества, как один из самых распространенных полисахаридов растительного пищевого сырья, в достаточном количестве содержатся в плодах, ягодах, корнеплодах, растительных волокнах, а также входят в
состав клеточных стенок. В присутствии кислот и сахара пектиновые вещества образуют желе и студни, на чём основано их широкое применение в
кондитерской промышленности.
В основе строения пектиновых веществ лежит цепь из остатков -Dгалактуроновой кислоты, соединенной 1,4 - связями. Эту цепь называют пектиновой или полигалактуроновой кислотой. Часть карбоксильных групп цепи
может быть связана с метиловым спиртом или ионами металлов. Все эти соединения относятся в группу пектиновых веществ. Они хорошо растворимы
в воде. Фрагмент молекулы пектиновых веществ имеет вид:
СООR

O
O  OH H
H
H 

H
OH
 - R = Н, СН3 или ион металла.
39
H
 O
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Молекулярная масса пектиновых веществ доходит до нескольких сотен тысяч. Желирующие свойства пектина тем выше, чем длиннее цепочка
полигалактуроновой кислоты и больше метильных групп она содержит.
Протопектины - нерастворимые в воде вещества, в которых пектиновая кислота связана с другими веществами - крахмалом, целлюлозой, гемицеллюлозами и т.д. Протопектины как бы цементируют растительные волокна между собой. От соотношения пектиновых веществ и протопектина в растительной клетке зависит степень зрелости и консистенция плода. В недозрелых плодах содержится преимущественно протопектин. По мере созревания
плодов происходит распад части протопектина до растворимого в воде пектина. Этот процесс идет под действием фермента протопектиназы, а также
органических кислот, содержащихся в плодах.
Пектиновые вещества, обладающие хорошими коллоидными свойствами, имеют лечебное значение. Пища, богатая пектинами, связывает соли
желчных кислот и снижает уровень холестерина в крови, а также обладает
способностью адсорбировать из организма вредные токсины.
Пектиновые вещества оказывают существенное влияние на консистенцию плодов и их развариваемость при консервировании, застудевание
фруктовой продукции с сахаром, осветление плодовых соков, величину отходов при протирании томатов и т.д. В сахарном производстве пектиновые
вещества, входящие в состав корнеплодов сахарной свёклы, являются одним
из наиболее вредных «несахаров» из-за коллоидных свойств, создавая затруднения при фильтровании и при кристаллизации сахара.
На брожении пектиновых веществ основана биологическая обработка
волокна льна. При мочке льна пектин разрушается ферментами, и тем освобождается волокно.
В пищевой промышленности пектин получают из яблочных и цитрусовых выжимок, свекловичного жома, соцветий подсолнечника, створок плодов хлопчатника. В зависимости от вида сырья пектин имеет различные органолептические и физико-химические свойства.
Высокоэтерифицированные пектины применяют в качестве студнеобразователей при производстве кондитерских и консервных изделий, в качестве стабилизаторов при производстве молочных напитков, майонеза, маргарина, соусов, мороженого, рыбных консервов и в качестве загустителей при
производстве фруктовых соков и киселей.
Низкоэтерифицированные пектины применяют при приготовлении
овощных желе, паштетов, студней, сыров и пищевых продуктов детского, лечебного и профилактического питания.
Методика проведения анализов
Принцип метода
Растворимый пектин выделяют из растертой навески растительного
материала с помощью горячей воды. Пектин, перешедший в раствор, переводят в свободную полигалактуроновую кислоту последовательным взаимодействием с гидроксидом натрия и уксусной кислотой. Полигалактуроновую
40
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
(пектиновую) кислоту осаждают из раствора в виде пектата кальция, по количеству которого рассчитывают содержание растворимого пектина в исходном материале.
Реактивы
1. 0,1 н. раствор гидроксида натрия: 4,0 г NаОН растворяют в мерной колбе на 1 дм3 в 400-500 см3 дистиллированной воды и доводят
водой до метки;
2. 1 н. раствор уксусной кислоты (для приготовления 1 дм3 раствора
нужно 57 см3 ледяной уксусной кислоты);
3. 2 н. раствор хлорида кальция (111 г СаСl2 довести до метки дистиллированного водой в мерной колбе на 1 дм3);
4. Вода дистиллированная;
5. 0,1 н. раствор нитрата серебра (1,7 г АgNO3 довести до метки дистиллированной водой в мерной колбе на 100 см3);
6. 0,4 н. раствор винной кислоты.
Приборы и оборудование: 1)ступки фарфоровые с пестиком; 2) колбы
конические на 200 см3 с резиновыми пробками, на 500 см3; 3) воронки;
4)цилиндры мерные на 100 см3, 50 см3; 5)пипетки Мора на 25 см3;
6)сушильный шкаф; 7)шуттель-аппарат; 8)центрифуга; 9)баня водяная; 10)
весы лабораторные.
Ход определения
25 г свежего растительного материала (яблок, жома сахарной свеклы)
растирают в ступке до однородной массы и переносят в коническую колбу
на 200 см3, заливают 100 см3дистиллированной воды, нагретой до 45 0С (не
выше), выдерживают на водяной бане такой же температуры 30 мин при периодическом взбалтывании. Затем колбу закрывают пробкой и энергично
взбалтывают 15 мин в шуттель-аппарате. После этого содержимое колбы
центрифугируют и собирают прозрачный раствор пектина.
В коническую колбу вместимостью 500 см3отмеряют пипеткой Мора
25 см3фильтрата и приливают 100 см30,1 н. раствора гидроксида натрия,
оставляют на 30 мин. За это время происходит омыление пектина, который
переходит в натриевую соль пектиновой кислоты. Затем добавляют 5 см3 1 н.
раствора уксусной кислоты и получают свободную пектиновую (полигалактуроновую) кислоту.
Через 5 мин в опытную колбу добавляют 50 см3 2 н. раствора хлорида
кальция и оставляют на 1 час. За это время выпадает осадок пектата кальция,
который промывают водой (60 0С) на взвешенном фильтре до тех пор, пока
не исчезнет реакция на ион хлора с каплей нитрата серебра. Осадок вместе с
41
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
фильтром помещают в бюкс и доводят по постоянной массы в сушильном
шкафу при 105 0С.
Изучение желеобразующей способности пектина
20 см полученного выше раствора пектина нагревают на водяной
бане до 70-80 0С. Отдельно в небольшом стакане готовят сахарный сироп,
для чего смешивают 30 г сахарозы с 100 см3 воды, 10 см3 0,4 н. винной кислоты и нагревают на кипящей водяной бане до полного растворения сахара и
получения однородной массы. В горячий пектиновый препарат прибавляют
горячий свежеприготовленный сироп, тщательно размешивают и оставляют
стоять на 3 часа. Если содержится достаточное количество пектина, то образуется плотный студень, напоминающий мармелад. По плотности желе судят
о желеобразующей способности препарата.
3
Обработка и обсуждение результатов
Содержание пектиновой кислоты (х) в исследуемом образце вычисляют по формуле:
х
а  V  92
, где
n  V1
а – количество определенного пектата кальция, г;
92 – коэффициент прересчета, % (с поправкой на содержание кальция
в пектате);
V – объем водного фильтрата пектина (начальный объем водной вытяжки), мл (V=100 мл);
n – навеска исследуемого материала, г;
V1 – объем фильтрата, отобранный для анализа (V1=25 мл)
Результаты определений для всех образцов внести в таблицу 1.
Таблица 1 - Определение содержания пектина
№ п/п Вид сырья
Масса навески, г Кол-во пектата Содержание пек(n)
кальция, г (а)
тина, %
Сделать вывод о сравнительном содержании пектина и его желеобразующей способности в различных растительных образцах.
1.
2.
3.
4.
Контрольные вопросы
Функции пектиновых веществ в растительной клетке.
Строение пектиновых веществ.
Получение и применение пектина в пищевой промышленности.
Принцип метода выделения и количественного определения растворимого пектина в растительном сырье.
42
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ГЛАВА 4
ОРГАНИЧЕСКИЕ АЗОТИСТЫЕ ВЕЩЕСТВА
Основную массу органических азотистых веществ клетки составляют
белки. Кроме белков в сельскохозяйственном сырье и продукции содержатся
и другие азотистые вещества: свободные аминокислоты и их амиды, свободные нуклеиновые кислоты, некоторые пептиды ( например, глутатион ) и ряд
других соединений. Общее содержание небелкового азота значительно ниже,
чем белков, и редко превышает 1% сухого веса, но они оказывают определенное влияние на пищевую и кормовую ценность, а также на качество продукции при хранении и переработке.
Аминокислоты
Аминокислоты являются основой молекулы белка. По химическому
строению аминокислоты являются производными кислот жирного или ароматического рядов и содержат одновременно аминную -NH2 и карбоксильную -СООН группы. У большинства природных аминокислот аминогруппа
расположена в -положении по отношению к карбоксильной группе ( в состав белков входят только -аминокислоты).
В настоящее время известно свыше 200 аминокислот. Но постоянно
встречаются в составе всех белков как животных, так и растительных клеток
только 20 аминокислот и 2 амида. В зависимости от строения радикала R их
можно подразделить на следующие классы :
Аминокислоты
Алифатические

Моноаминомонокарбоновые
кислоты
Глицин
Аланин
Серин
Цистеин
Цистин
Треонин
Метионин
Валин
Лейцин
Изолейцин

Моноаминодикарбоновые
кислоты

Диаминомонокарбоновые
кислоты
Аспарагиновая
Глутаминовая
Аспарагин
Глутамин
Лизин
Аргинин
 -незаменимые аминокислоты
 - частично заменимые аминокислоты
43
Циклические
Фенилаланин
Тирозин
Триптофан
Гистидин
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Кроме того, в составе белков найдены две иминокислоты, содержащие
в своем составе не аминную, а иминогруппу =NH - пролин и оксипролин.
4.1.1. Определение свободных аминокислот а растительном сырье
методом формального титрования
Цель работы: Освоение химического метода определения аминокислот в растительном сырье. Изучение влияния сроков хранения растениеводческой продукции на содержание в ней свободных аминокислот
Основные теоретические положения
Аминокислоты являются основой молекулы белка. Кроме того, они самостоятельно выполняют ряд жизненно важных функций. В растительном
сырье всегда содержится некоторое количество аминокислот и их амидов в
свободном состоянии, повышая их пищевую и кормовую ценность.
В отличии от растений человек и животные синтезируют не все аминокислоты, необходимые для их жизни, Существует группа незаменимых аминокислот, которые человек и животные должны получать с нишей. В случае
отсутствия или недостатка в пище этих аминокислот нарушается нормальное
функционирование организма. К незаменимым относится восемь аминокислот: треонин, метионин, валин, лейцин, изолейцин, лизин, фенилаланин и
триптофан. Кроме того, две аминокислоты - гистидин и аргинин относят к
частично заменимым, так как скорость их синтеза в организме человека недостаточна для обеспечения всей потребности в этих аминокислотах, особенно у детей.
Свободные аминокислоты и их амиды составляют основную массу
небелковых азотистых соединений клетки. При хранении и переработке
сельскохозяйственной продукции их содержание может увеличиваться а результате гидролиза белков. Накопление аминокислот может явиться причиной образования ряда соединений, влияющих на вкус и аромат пищевых продуктов. Производными аминокислот являются такие соединения, как меланоидины, меланины, сивушные масла и др., которые в значительной мере
определяют качество получаемых пищевых продуктов.
Меланоидины - темно-окрашенные соединения со специфическим ароматом. Образуются в результате неферментативного взаимодействия аминокислот с простыми сахарами в процессе термической обработки растениеводческою сырья. Меланоидиновая реакция наблюдается, например, при выпечке хлеба. Образующиеся при этом меланоидины оказывают влияние на
цвет и аромат корки хлеба. А вот при сушке и переработке овощей реакция
меланоидинообразования является нежелательной, т. к. приводит к потемнению и ухудшению аромата продукта. Причем, меланоидины могут образоваться не сразу после подогрева, а в процессе хранения полученного продукта.
Нежелательное изменение цвета продукции при хранении и переработке может произойти в результате образования других темно-окрашенных соединений - меланинов. Меланины - продукты ферментативного окисления
аминокислот тирозина и фенилаланина под действием фермента тирозиназы.
В результате этого происходит, например, интенсивное потемнение ма44
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
каронных изделий, особенно при сушке. Образование меланинов является
одной из причин почернения клубней картофеля при хранении. Это заболевание проявляется через 2-3 месяца после уборки и совпадает по времени с
накоплением в клубнях тирозина за счет распада белков.
Аминокислоты являются причиной образования нежелательных побочных продуктов в бродильном производстве - сивушных масел. Сивушные
масла представляют собой маслянистую жидкость крайне неприятного запаха и очень ядовитую. В значительных количествах накапливаются в спиртесырце, вызывая его отравляющее действие. Содержание сивушных масел
свыше 0.3% в спиртных напитках считается недопустимым. Важнейшей составной частью сивушных масел является изоамиловый, изобутиловый и
н-пропиловый спирты, которые составляют примерно 90-95% сивушного
масла. Источниками их образования являются аминокислоты треонин, валин,
лейцин и изолейцин.
Аминокислоты при определенных условиях могут оказывать влияние
на ход технологического процесса. Например, в сахарном производстве они
являются мелассообразователями и увеличивают потери сахара.
По этой причине определение свободных аминокислот в пищевом сырье представляет большой практический интерес.
Методика проведении анализов
Принцип метода
Сущность реакции формольного титрования заключается в том, что
аминные группы аминокислот взаимодействуют с формальдегидом (также.
как и с другими альдегидами) и образуют метиленовые производные. При
этом аминогруппы теряют свои основные свойства, свободная же карбоксильная группа оттитровывается едкой щелочью. Реакция с формальдегидом идет по следующей схеме:
RH
R
|
О
|
Н—С—NН2 +
Н—С
Н —С —N=СН2
|
Н
|
СООН
СООН
Метиленаминокислота
Полученную метиленаминокислоту оттитровывают щелочью:
R
R
|
|
Н—С—N=СН2 + NаОН
Н —С —N=СН2 + Н2О
|
|
СООН
СООNа
При этом условно считают, что количество титруемых карбоксильных
трупп эквивалентно количеству связанных формальдегидом аминных групп
(верно в основном для моноаминомонокарбоновых кислот). Чтобы ввести поправку для дикарбоновых аминокислот (глютаминовой, аспарагиновой), раствор предварительно нейтрализуют до рН 7,0.
45
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Подготовка проб для анализа
1.Приготовление водной вытяжки: 5-10 г размолотого высушенного
растительного материала помещают в колбу на 100-200 см3, приливают 50100 см3 дистиллированной воды, плотно закрывают пробкой и взбалтывают в
шуттель-аппарате. Осадок отфильтровывают через складчатый бумажный
фильтр или центрифугируют.
2. Клубни, корнеплоды и другие виды растительного сырья, содержащего много воды, предварительно тщательно измельчают и извлекают сок
отжатием и фильтрацией.
В водных вытяжках не должно содержаться взвешенных веществ. Это
же требование предъявляют и к жидким продуктам. Если цвет растворов
очень темный, то их разбавляют водой.
Реактивы
1. Титрованный 0,05 н.раствор NаОН: 2 г NаОН растворить в дистиллированной воде в мерной колбе на 1 дм3. Титр раствора проверить титрованием стандартным раствором янтарной кислоты.
2. 0,05 н. раствор НС1 (для приготовления 1 дм3 раствора нужно 4,1 см3
концентрированной НС1 удельным весом 1,19).
3. 0,5%-ный раствор фенолфталеина.
4. 0,04%-ный раствор бромтимола синего: 0,1г бромтимола синего растирают в ступке с 3,2 см3 0,05 н NаОН. Смесь переносят количественно
дистиллированной водой в мерную колбу ёмкостью 250 см3 и доводят
водой до метки.
5. Формольная смесь: смешивают 50 см3 40 %-ного формалина с 2 см3
0,5%-ного фенолфталеина, полученную смесь титруют 0,2 н NаОН до
слабо-розового окрашивания (обычно достаточно 3-5 капель). Формалин с повышенной кислотностью использовать для анализа не рекомендуется. Его следует предварительно обработать мелом в течение
суток. Формольную смесь готовят каждые 2-3 дня , после приготовления её фильтруют. В случае исчезновения розовой окраски перед использованием смеси добавляют 1-2 капли 0,2 н. NаОН до появления
слабо-розовой окраски.
6. Буферный раствор с рН 9,2: 50 см3 смеси 0,2 М Н3ВОз·КС1. (т.е.
12,4048 г Н3ВОз и 14,912 г КС1 в одном литре воды) и 26,70 см3 0,2 М
Nа0Н доводят водой до объёма 200 см3.
7. Буферный раствор с рН 7: 50 см3 0,2 М КН2РО4 и 29,63 см3 0,2 М Nа0Н
доводят водой до объёма 200 см3.
Приборы и оборудование: 1)химические стаканы на 100 см3; 2)цилиндры
мерные на 25 см3, на 10 см3; 3)микробюретка
Ход анализа
Берут 2 стаканчика каждый ёмкостью 100 см3 (№ 1 и №2) одинакового
диаметра. В первый стаканчик наливают 20 см3 буферного раствора с рН 9,2,
во второй - 20 см3 раствора с рН 7,0. В оба стаканчика прибавляют но 5 ка46
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пель бромтимола синего. В первый стаканчик добавляют 3 капли 0,5% -ного
фенолфталеина. При этом в первом стаканчике жидкость окрасится в синефиолетовый цвет, во втором - в слабо-зеленый. Если эталоны герметически
закрыть, то они могут храниться, не изменяя цвета, до 15 дней.
Формольное титрование проводят следующим образом: 2 см3 исследуемой вытяжки аминокислот смешивают с 18 см3 воды и 5 каплями бромтимола синего. Смесь нейтрализуют: если она синяя, осторожно по каплям добавляют О 05 н НС1, если желтая - 0,05 н Nа0Н до образования желто-зеленой
окраски ( рН 7.0). Титруемый раствор сравнивают с эталоном (стаканчик
№2). Окраски растворов сравнивают при титровании их на белом листе бумаги. Цвет, толщина стекла и диаметр сравниваемых стаканчиков должны быть
одинаковыми.
После доведения опытного раствора до рН 7,0 добавляют из мерного
цилиндра ( но не пипеткой) 2 см3 формольной смеси и титруют (из микробюретки от нуля ) 0,05 н NаОН, сравнивая с эталоном ( стаканчик №1 с рН 9,2),
до хорошо выраженной сине-фиолетовой окраски. Желаемый цвет раствора
обычно появляется от прибавления одной избыточной капли щелочи. Для
введения поправки в таких же условиях титруют дистиллированную воду
(контрольный опыт).
Если раствор аминокислот прозрачный и бесцветный, то для повышения точности определения берут не 2 см3 вытяжки, как указано выше, а значительно больше.
При выработке навыка можно пренебречь сравнением титруемых растворов с эталонами (стаканчики № 1 и 2), так как желаемое изменение цвета
титруемого раствора наступает от одной капли раствора щелочи.
Обработка и обсуждение результатов
Разность между количеством 0,05 н. NаОН, пошедшего на титрование
опытного и контрольного раствора, умноженная на 0,7, соответствует количеству миллиграммов азота аминокислот в 2 см3 исследуемой жидкости. При
определении содержания азота аминокислот в 100 см3 вытяжки или гидролизата полученный результат умножают на 50. При необходимости определения азота в мг% полученный результат пересчитывают на 100 г исследуемого
продукта.
Для исследования берутся несколько видов растительного сырья, различающихся сроками и способами хранения. Каждая бригада анализирует
один образец и результаты исследований вносит в сводную таблицу. После
обсуждения результатов делаются выводы о влиянии вида сырья и способов
хранения растениеводческой продукции на содержание свободных аминокислот в ней.
Таблица 1 - Содержание свободных аминокислот в растениеводческой
продукции.
№ п/п
Образец
Срок и способ
хранения
Количество аминокислот
Мг а 100 г вытяжки
Мг%
1.
2 и т.д.
47
Примечание
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1.
1.
2.
3.
4.
Контрольные вопросы
Роль аминокислот в растениях.
Строение и классификация аминокислот .
Незаменимые аминокислоты.
Изменение содержания аминокислот при хранении и переработке
растениеводческой продукции.
Влияние свободных аминокислот на качество растениеводческой
продукции при хранении и переработке.
4.2.Белки
Наибольшую часть органических азотистых веществ растительной и
животной клетки составляют белки. Белки - это сложные высокомолекулярные соединения, находящиеся в организме в коллоидном состоянии. По химическому строению белки - самые сложные из соединений, имеющихся в
природе. Молекула белка состоит из остатков аминокислот, связанных пептидными связями в полипептидные звенья, которые могут быть соединены
между собой дисульфидными, эфирными, водородными и другими связями.
Каждому белку при нормальных физиологических условиях свойственна определенная пространственная конформация, образованная в результате вторичной, третичной и иногда четвертичной структуры и называемая нативной. Изменение её ведет к изменению свойств самого белка и к
нарушению выполняемых им функций. Так, нарушение нативной конформации белка, лежащего в основе фермента, может привести к потере ферментативной активности соединения.
Белковая молекула очень лабильна, легко денатурирует, в результате
чего изменяются её биологические и химические свойства. Под действием
ферментов, а также кислот белки расщепляются, образуя ряд промежуточных
продуктов дезагрегации ( протеозы, пептоны, пептиды ) и конечные продукты гидролиза - аминокислоты.
Белковые вещества играют выдающуюся роль в построении живой материи и в осуществлении процессов жизнедеятельности как животных, так и
растительных клеток. Почти все реакции в клетке протекают с участием белков. С ними связаны все процессы роста и развития живой клетки.
Количество белков, их аминокислотный состав имеют важнейшее
значение для биологической, пищевой и кормовой ценности любого продукта. Содержание белков в растительном сырье, как правило, ниже, чем в животном. В вегетативных органах растений количество белков обычно не превышает 5-15 % сухой массы. Наибольшее количество белков в растительном
сырье отмечается в семенах. Например, в семенах бобовых культур оно может достигать 25-35 % и более сухой массы. В мышечной ткани животных
белки составляют 40-50 % сухой массы; среднее содержание белков в молоке
составляет 3,2 %.
48
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4.2.1. Выделение отдельных белковых фракций из семян бобовых
и масличных культур
Цель работы: Освоение методов фракционирования белков из растений.
Определение фракционного состава белков семян бобовых и масличных
культур
Основные теоретические положения
По степени сложности белки подразделяют на две большие группы:
протеины - простые белки, построенные только из остатков аминокислот, и
протеиды - сложные белки, содержащие в своем составе кроме собственно
молекулы белка связанную с ним группу небелковой природы, называемую
простетической.
Протеины в зависимости от их растворимости в различных растворителях делят на следующие группы ( классификация Осборна ):
1. Альбумины - растворимые в воде белки с относительно небольшим
молекулярным весом. Встречаются во всех животных и растительных тканях,
но особенно их много в эмбриональных тканях. В семенах растений составляют 4 - 27% от общего количества белков. Отдельными представителями
альбуминов являются лейкозины пшеницы, ржи и ячменя, легумелины семян
сои и гороха, рицин семян клещевины ( ядовит ) и др.
2. Глобулины - белки, нерастворимые в воде, но растворимые в слабых
растворах нейтральных солей ( обычно используют 5-10 % растворы NaCl
или KCl ). Очень широко распространены в растениях, а в семенах бобовых и
масличных культур составляют основную массу белков, где на их долю приходится 85 - 97 % от общего количества белков. Хорошо изучены следующие глобулины: эдестин семян конопли, фазеолин семян фасоли, глицинин
семян сои, конглютин семян люпина, вицилин семян гороха и др.
3. Проламины - белки, нерастворимые в воде, но растворимые в 60-80
% этаноле. Являются характерной фракцией белков семян злаковых культур,
где они составляют 30-40 % общего количества белков ( в зерне кукурузы
около 40 %, проса - около 60 % ). Практически отсутствуют в растениях других семейств. К проламинам относится глиадин из зерна пшеницы и ржи ( составная часть клейковины ); гордеин - ячменя; зеин - кукурузы; авенин - овса
и др.
4. Глютелины - белки, нерастворимые в воде, солевых растворах, этиловом спирте, но растворимые в слабых растворах щелочей ( 0.2 - 2.0 %).
Наиболее хорошо изучены глютенин зерна пшеницы ( вторая составляющая
клейковины, на его долю приходится примерно 30 - 45 % всех белков в
зерне) и оризенин, на долю которого приходится большая часть белков семян
риса ( около 70 %).
Такое распределение протеинов на фракции носит весьма условный характер. Современными методами установлена гетерогенность отдельных
фракций. Каждая из них состоит из нескольких, во многих случаях более 10
различных белков, хотя и имеющих некоторые общие свойства.
49
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Семена бобовых отличаются самым высоким среди растениеводческой продукции содержанием белка – 20-40 %. Наиболее высокобелковой
культурой семейства бобовых является соя, в семенах которой содержится до
40 % белка. Содержание белковых веществ в семенах масличных культур
также достаточно высоко – от 16 до 28 %. Белки семян бобовых и масличных
культур состоят в основном из глобулинов, на долю которых приходится 85 97%. Остальную часть белков составляют альбумины ( 6-12%). Глютелинов
содержится незначительное количество, а фракция проламинов практически
отсутствует.
Методика проведения анализов
Принцип метода
Для суммарного выделения белков из семян бобовых и масличных
культур их как можно тоньше размалывают, так как от этого в значительной
степени зависит полнота извлечения белков. Если семена содержат повышенное количество жира или много пигментов, то для удаления этих веществ
муку предварительно экстрагируют бензином или ацетоном и высушивают в
вакуум- эксикаторе или под тягой при комнатной температуре.
Экстракцию белков из муки проводят слабым раствором NaCl ( 1М).
Полученный экстракт содержит альбумины и глобулины. Глобулины осаждаются из экстракта насыщенным раствором NaCl и отфильтровываются
или центрифугируются. При добавлении к фильтрату нескольких капель 1%ного раствора уксусной кислоты выпадают в осадок альбумины.
Реактивы
1. 1М раствор NaCl ( 58,5 г NaCl растворяют в дистиллированной воде и доводят до 1 л);
2. Тонко измельченный в ступке NaCl;
3. 1%-ный раствор трихлоруксусной кислоты.
Ход работы
1. Выделение суммарных белков из семян.5 г подготовленной тонко
размолотой муки насыпают в коническую колбу, заливают 25 см3 1М раствора NaCl, взбалтывают в течение 1ч и ставят в холодильник при температуре 00С на 15-18 часов.
После выдерживания в холодильнике надосадочную жидкость аккуратно сливают в большой стакан. К осадку добавляют 25 см3 1М NaCl и
взбалтывают в течение 30 мин. после этого содержимое колбы центрифугируют и раствор белков сливают в тот же стакан. Такую экстракцию с последующим центрифугированием повторяют ещё 2 раза. При правильно проведенном анализе в раствор переходит 95-97 % всех белков семян бобовых и
масличных культур.
50
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2.Фракционирование белков хлористым натрием.
В полученный раствор белков добавляют порошок NaCl до полного
насыщения раствора, т.е. до прекращения его растворения ( на 200 см3 экстракта белков при 200С требуется около 60 г NaCl). В стакане появляется
осадок глобулинов, который отфильтровывают через предварительно взвешенный бумажный фильтр. В оставшийся фильтрат, содержащий альбумины,
добавляют несколько капель 1%-ного раствора трихлоруксусной кислоты.
При этом выпадает осадок альбуминов, который также отфильтровывают через взвешенный бумажный фильтр.
Фильтры высушивают, взвешивают и определяют вес выделенных
белков. Результат выражают в процентах к массе взятой навески муки и вычисляют фракционный состав белков.
Обсуждение результатов
На основании проведенных исследований, выполненных каждой бригадой, составляется сводная таблица, в которую вносятся результаты анализов для разных видов семян. После обсуждения результатов делаются выводы о фракционном составе белков семян бобовых и масличных культур.
Таблица 1 -Фракционный состав белков семян бобовых и масличных культур
Альбумины
Глобулины
№ п/п Семена г % % от суммы белков
г
%
% от суммы белков
1и
т.д.
Контрольные вопросы
1. Функции белков в растениях.
2. Строение белковой молекулы.
3. Свойства белков.
4. Классификация протеинов.
5. Биологическая ценность белков семян бобовых и масличных культур.
4.2.2. Выделение белков из зерна злаков и изучение их свойств
Цель работы: Изучение фракционного состава белков злаков. Фракционирование белков из зерна злаков и изучение их свойств
Основные теоретические положения
Количество белка в зерне злаковых культур составляет от 7 до 16 %.
Больше всего белков в зерне пшеницы – в среднем около 13,5 %; наиболее
низким их количеством отличаются семена риса –около 7 %. Содержание
белков в зерне злаков подвержено сильной изменчивости в зависимости от
сортовых особенностей, климатических факторов, условий выращивания и
51
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пр. Так, в зерне пшеницы количество белков может колебаться в широких
пределах – от 9 до 26 % (табл. 1).
Таблица 1 - Содержание белка в зерне злаковых культур (%)*.
Культура
Колебания
Среднее содержание
Пшеница
9,2 - 25,8
13,5
Рожь
7,2 -19,4
11,8
Тритикале
13,6 -16,3
14,8
Ячмень
7,0 -25,0
12,0
Овес
9,0 -19,5
12,0
Кукуруза
4,9 -23,6
11,7
Просо
8,8 -19,3
13,7
Рис
5,4 -10,4
7,2
* - по данным Плешкова Б.П. (1984).
В зерне злаков представлены все фракции белков, но в разном количестве - альбумины, глобулины, проламины и глютелины. Распределение белков различных злаковых культур по фракциям приведено в таблице 2.

Таблица 2 - Распределение белков зерна злаков по фракциям, %.
Культура
Альбумины
Глобулины
Проламины Глютелины
Пшеница
6,6
22,0
33,0
38,4
Рожь
27,2
29,9
30,4
18,5
Ячмень
14,6
14,6
40,5
30,3
Овес
11,1
21,0
11,2
56,7
Кукуруза
20,5
14,8
38,6
26,1
Просо
13,6
9,0
62,5
14,9
Рис
13,8
10,0
7,4
68,8
* - по данным Казакова Е.Д., Кретовича В.Л. (1980)
Основная масса белков злаков – запасные белки, представляющие собой смесь проламинов и глютелинов, содержащихся в эндосперме. Они характеризуются узким аминокислотным составом, несбалансированным по
незаменимым аминокислотам (особенно по лизину) и потому имеют пониженную биологическую ценность. Глобулины и альбумины находятся в основном в алейроновом слое и зародыше зерновки. Эти белки более полноценны по аминокислотному составу, однако при производстве муки большая
часть из них удаляется вместе с отрубями.
При переработке зерна пшеницы особо важную роль играет комплекс
двух белков, содержащихся в эндосперме, – глиадина (проламина) и глютенина (глютелина), известный под названием «клейковина». Отмытая из кусочка теста под струей воды сырая клейковина представляет собой сильно
набухший белковый гель, содержащий 200-250 % воды к массе сухого вещества. В зависимости от условий пшеница накапливает от 16 до 52 % клейковины (в среднем – 20-28 %). Количество и качество сырой клейковины в
52
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
зерне пшеницы является одним из основных показателей, характеризующих
её технологическое достоинство (нормируется стандартами).
Методика проведения анализов
Принцип метода
Выделение и разделение белков из зерна злаков основано на их избирательной растворимости в различных растворителях.
В размолотом шроте последовательно проводят экстракцию различных фракций белков с помощью соответствующих растворителей: дистиллированной воды, слабого раствора нейтральной соли (NaCl), 70 %-ного этилового спирта, 0,1 н раствора щелочи. С выделенными экстрактами белков проводят качественные реакции: биуретовую реакцию, высаливание насыщенным раствором NaCl, осаждение трихлоруксусной кислотой и др.
Биуретовая реакция является специфической качественной реакцией на
белок, т.к. её дают полипептидные связи. Она получила свое название от
производной мочевины – биурета, который образует в щелочном растворе
медного купороса комплексное соединение фиолетового цвета. Биуретовую
реакцию дают все белки, пептоны и полипептиды, начиная с тетрапептидов,
независимо от характера аминокислот и природы их связи между собой в молекуле белка. Интенсивность окрашивания пропорциональна содержанию
пептидных связей, а следовательно, и концентрации белка в растворе.
Высаливание – это процесс выделения белка из раствора под влиянием солей щелочных или щелочноземельных металлов. Поскольку молекулы
солей более гидрофильны, чем белковые глобулы, они снимают с белка водную оболочку, в результате чего молекулы белка агрегатируются и выпадают
в осадок. При этом денатурации белка не происходит.
Осаждение белка из раствора с помощью трихлоруксусной кислоты
основано на денатурации белковых глобул. Денатурация белка – это внутримолекулярная перегруппировка его молекулы, сопровождающаяся частичной
или полной потерей вторичной и третичной структуры белка. При этом не
происходит расщепление пептидных связей и изменения последовательности
аминокислот в молекуле белка.
Реактивы
1. 10%-й раствор NaCl;
2. Насыщенный раствор хлорида натрия (растворить NаСl в горячей дистиллированной воде до полного насыщения раствора. После охлаждения и выпадения избытка соли раствор процедить);
3. 70%-й раствор этилового спирта;
4. 0,1 н. раствор гидроксида натрия;
5. 1 %-й раствор сульфата меди;
6. 10 %-й раствор гидроксида натрия;
7. 6%-й раствор трихлоруксусной кислоты;
8. Дистиллированная вода.
53
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Приборы и оборудование: 1)колбы конические на 100 см3;
2)цилиндры мерные на 50 см3, 25 см3и 10 см3; 3)стаканы химические на 100
см3 ; 4)воронки; 5)пробирки; 6)весы лабораторные.
Ход определения
Для суммарного выделения белков из семян злаковых культур их как
можно тоньше размалывают, так как от этого в значительной степени зависит
полнота извлечения белков. Из размолотого шрота отвешивают навеску массой 3 г в химический стакан.
Для выделения альбуминовой фракции навеску залить 30 см3 дистиллированной воды, стакан поместить на водяную баню температурой 35 0С и
экстрагировать белки, периодически взбалтывая, в течение 30 мин. По
окончанию экстрагирования надосадочную жидкость осторожно отфильтровать в коническую колбу, а оставшуюся кашицу сохранить для последующей
солевой экстракции. С экстрактом альбуминов провести следующие качественные реакции.
В три пробирки налить по 2 см3 полученного экстракта. В первой пробирке провести биуретовую реакцию. Для этого в пробирку с экстрактом
белка добавить 3 см310 %-ного раствора гидроксида натрия. Затем по каплям
прилить 1 %-ный раствор сульфата меди, встряхивая смесь после каждой
капли. Раствор окрашивается сначала в розовый, затем в фиолетовый цвет.
Следует избегать избытка сульфата меди, т. к. в этом случае фиолетовая
окраска маскируется синей.
Во вторую пробирку добавить равный объем насыщенного раствора
хлорида натрия, при этом раствор мутнеет, т.к. альбумины в присутствии солей теряют растворимость. В третью пробирку прибавить несколько капель
раствора трихлоруксусной кислоты. Пробирку встряхнуть и наблюдать осаждение белка.
Для выделения глобулиновой фракции в стакан с осадком растительной ткани после экстракции водой налить 30 см3 10%-ного раствора хлорида
натрия и экстрагировать при встряхивании в течение 30 мин, поместив стакан на водяную баню при температуре 350С. Солевой экстракт осторожно
отфильтровать в коническую колбу. Провести с ними следующие реакции.
В три пробирки налить по 2 см3 полученного солевого экстракта. В
первой пробирке установить наличие белка с помощью биуретовой реакции.
Во вторую пробирку добавить 2 см3 насыщенного раствора хлорида натрия и
наблюдать выпадение осадка белков. К экстракту в третьей пробирке добавить дистиллированную воду до появления осадка нерастворимых в воде
глобулинов.
Для выделения проламинов остаток растительного материала залить
3
30 см 70%-ного этилового спирта. Провести экстракцию белков в течение 30
мин при 350С при периодическом помешивании. Надосадочную жидкость
отфильтровать в коническую колбу, из которой в две пробирки налить по 2
см3 полученного экстракта.
54
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В первой пробирке обнаруживают белок по биуретовой реакции. Во
вторую пробирку прибавляют 2 см3 воды. При этом концентрация спирта
резко падает и проламины теряют растворимость. Раствор мутнеет.
Для выделения глютелинов остаток растительного материала от
предыдущего опыта залить 30 см3 0,1 н. раствора гидроксида натрия. экстракцию ведут аналогично предыдущим опытам. Через 30 мин надосадочную
жидкость отфильтровать. Проверить наличие белка в фильтрате по битуретовой реакции.
Обсуждение результатов
Каждая бригада анализирует образец из одного вида злаков. Результаты анализов занести в таблицу 3. После обсуждения результатов сделать вывод о преобладающих фракциях белков в зерне злаковых культур.
Таблица 3 - Фракционирование белков злаков
Фракционирование
Водная
Солевая
Спиртовая
экстракция Экстракция экстракция
Выделенные фракции белков
Проведенные реакции и их результаты
1.
2.
3.
4.
5.
Щелочная
экстракция
Контрольные вопросы
Содержание и фракционный состав белков злаковых культур.
Биологическая ценность белков злаков – суммарных и по отдельным фракциям.
Какие качественные реакции на белки вы знаете.
Что такое высаливание, осаждение белков.
Что такое денатурация белка и какие факторы её вызывают.
4.2.3. Изучение и количественное определение белков в молоке
Цель работы: Изучение фракционного состава белков молока. Определение массовой доли белка методом формольного титрования.
Основные теоретические положения
В молоке содержится в среднем около 3,2 % белка. Белки, входящие в
состав молока, имеют сложный состав, разнообразны по строению, физикохимическим свойствам и биологическим функциям.
Белки молока можно разделить на две группы: казеин и сывороточные
белки. Казеин составляет 80 %, сывороточные белки – 20 % от массовой доли
белков в молоке. Казеин является фосфопротеидом и представляет собой
смесь нескольких фракций, различающихся по химическому составу, находящихся в молоке в виде коллоидного раствора. Важным свойством казеина
55
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
является способность к коагуляции, при которой происходит разрушение его
коллоидного состояния. При выработке молочных продуктов коагуляцию
осуществляют с помощью кислот, сычужного фермента и хлорида кальция.
Казеин нерастворим в воде, но легко растворяется в растворах щелочей.
После удаления из молока казеина получается молочная сыворотка, в
которой содержатся сывороточные белки, а также лактоза и минеральные соли. Основную часть сывороточных белков составляют β-лактоглобулин (5054 % белков сыворотки или 7-12 % всех белков молока) и α-лактальбумин
(20-25 % сывороточных белков или 2-5 % общего количества белков), содержащиеся в молоке в тонкодиспергированном состоянии. Помимо них в состав сывороточных белков входят иммуноглобулины (около 16 % сывороточных белков) и альбумин сыворотки крови (около 8 % сывороточных белков).
Биологические функции белков молока разнообразны. Так, казеин является собственно пищевым белком, выполняющим в организме новорожденного структурную функцию. Кроме того, казеин транспортирует в составе
своих частиц кальций, фосфор и магний. Транспортные функции выполняет
также β-лактоглобулин, участвуя в транспорте ряда веществ, например витамина А. Регуляторными функциями обладает α-лактальбумин. Он является
специфическим белком , необходим для синтеза лактозы из галактозы и глюкозы. Иммуноглобулины выполняют защитную функцию, обладая свойствами антител. При введении в организм различных чужеродных белков иммуноглобулины нейтрализуют их действие. Например, они вызывают склеивание и выпадение в осадок микробов и других клеточных элементов. В обычно молоке иммуноглобулинов мало, в молозиве они составляют до 90 % сывороточных белков.
Белки молока имеет высокую пищевую ценность благодаря значительному содержанию незаменимых аминокислот. Особенно богаты незаменимыми аминокислотами сывороточные белки, в которых содержание таких
дефицитных аминокислот как лизин, триптофан, метионин и треонин, наиболее высоко. Вследствие высокого содержания незаменимых аминокислот сывороточные белки имеют важное промышленное значение. Из сыворотки их
выделяют в нативном состоянии с помощью ультрафильтрации и применяют
для обогащения различных пищевых продуктов. Казеин содержит помимо
незаменимых кислот, кальций и фосфор в оптимальном соотношении, и поэтому хорошо усваивается организмом. Усвояемость белков молока очень
высока и составляет 95-96 %.
От количества белка в молоке зависит в значительной мере выход молочных продуктов. Например, выход творога, сыров определяется содержанием казеина. Поэтому содержание белка в молоке, полуфабрикатах его переработки и готовых молочных продуктах является важным показателем их
качества. В настоящее время наиболее распространенными методами определения белка в молоке является метод формольного титрования и рефрактометрический.
56
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ход занятия
1. Изучить теоретические положения и заполнить таблицу 1.
Таблица 1 - Фракционный состав белков молока
Фракции белков
Примерное соБиологические
держание в молофункции
ке, г/100мл
Казеин
Сывороточные
белки:
α-лактальбумин
и т.д.
Всего белков
Использование в
пищевой промышленности
2. Провести определение содержания белков в различных образцах
молока методом формольного титрования.
Методика проведения анализов
Принцип метода
Сущность реакции формольного титрования заключается в том, что
аминные группы аминокислот взаимодействуют с формальдегидом (также.
как и с другими альдегидами) и образуют метиленовые производные. При
этом аминогруппы теряют свои основные свойства, свободная же карбоксильная группа оттитровывается щелочью. Реакция с формальдегидом
идет по следующей схеме:
RH
R
|
О
|
Н—С—NН2 +
Н—С
Н —С —N=СН2
|
Н
|
СООН
СООН
Метиленаминокислота
Полученную метиленаминокислоту оттитровывают щелочью:
R
R
|
|
Н—С—N=СН2 + NаОН
Н —С —N=СН2 + Н2О
|
|
СООН
СООNа
При этом условно считают, что количество титруемых карбоксильных
трупп эквивалентно количеству связанных формальдегидом аминных групп
(верно для моноаминомонокарбоновых кислот). Чтобы ввести поправку для
дикарбоновых аминокислот (глютаминовой, аспарагиновой), а также нейтрализовать присутствующие в молоке кислоты, образец предварительно оттит57
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ровывают щелочью без добавления формальдегида в присутствии фенолфталеина.
Метод формольного титрования можно применять только для анализа
свежего сырого молока кислотностью не выше 22 0Т, нельзя контролировать
данным методом консервированные пробы.
Реактивы
1. 1%-ный раствор фенолфталеина;
2. 0,1 н раствор гидроксида натрия;
3. 40%-ный раствор формалина.
Приборы и оборудование: 1)колбы конические на 100
2)цилиндры мерные на 50 см3и на 25 см3; 3)бюретка.
см3;
Ход определения
В колбу вместимостью 100 мл отмерить цилиндром 10 см3 молока, добавить 10-12 капель фенолфталеина и титровать из бюретки 0,1н раствором
гидроксида натрия до слабо-розовой окраски. Затем добавить цилиндром 2
см3 формалина и вновь тировать раствором щелочи до слабо-розовой окраски, аналогичной окраске пробы после первого титрования.
Обработка и обсуждение результатов.
По данным титрования произвести провести расчет общего количества
белка, казеина и сывороточных белков.
Общее количество белков в образце устанавливают, умножая количество щелочи, пошедшее на титрование пробы после добавление формалина,
на коэффициент 1,94. При подсчете количества казеина умножают объем щелочи после добавление формалина на коэффициент 1,51. При определении
содержания сывороточных белков в образце вычитают из общего количества
белков содержание казеина.
Результаты занести в таблицу 2.
Таблица 2 - Определение содержания белков в молоке
Кол-во NaОН, израсходованное до
прибавления формалина, мл (V1)
Общее
кол-во
NaОН, израсходованное после
прибавления
формалина, мл
(V2)
Кол-во NaОН,
пошедшее на
нейтрализацию
карбоксильных
групп, мл
(V2 - V1)
Общее колво белка в
молоке, %
(V2V1)×1,94
В
том Кол-во сывочисле
роточных
казеина, белков, %
%
(4 – 5)
(V2 -V1)
×1,51
Сравнить исследованные пробы молока и сделать вывод.
Контрольные вопросы.
6. Содержание и фракционный состав белков молока.
7. Биологическая ценность белков молока.
8. Биологическая роль белков молока.
Сущность метода определения белка формольным титрованием
58
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4.2.4. Дестабилизация мицелл казеина
Цель работы: Изучение механизма коагуляции казеиновых мицелл под
воздействием различных реагентов. Изучение характера сгустка, полученного
различными способами дестабилизации казеина.
Общие теоретические положения
В свежем молоке мицеллы казеина обладают относительной устойчивостью - не коагулируют при механической обработке и нагревании молока
до высоких температур.
Это связано с тем, что нативные мицеллы казеина имеют на поверхности
двойной электрический слой, а также хорошо развитую гидратную оболочку.
Этого электрического заряда достаточно, чтобы преодолеть силы межмолекулярного притяжения между частицами казеина при их сближении.
Таким образом, в свежем молоке силы электростатического отталкивания
между мицеллами казеина превалируют над силами молекулярного притяжения, и коллоидная система молока находится в устойчивом состоянии.
Следовательно, для того чтобы вызвать соединение и коагуляцию мицелл казеина, необходимо снизить их отрицательный заряд, т.е. перевести мицеллы в
изоэлектрическое или близкое к нему состояние, и разрушить гидратные
оболочки. В практике коагуляцию казеина осуществляют, снижая рН молока
или добавляя кислоты (кислотная коагуляция), внося хлорид кальция при нагревании (термокальциевая коагуляция) и сычужный фермент (сычужная коагуляция).
Методика проведения анализов
1. КИСЛОТНАЯ КОАГУЛЯЦИЯ КАЗЕИНА
При добавлении кислоты наблюдается постепенное снижение отрицательного заряда казеиновых мицелл и при рН 4,6-4,7 переход их в изоэлектрическое состояние, характеризующееся равенством отрицательных и положительных зарядов. В изоэлектрической точке снижается устойчивость и
растворимость частиц казеина.
В результате их столкновений образуются агрегаты и длинные нити, которые затем соединяются в единую пространственную сетку, т.е. формируется
белковый каркас сгустка. Образующийся сгусток обладает способностью
уплотняться с выделением сыворотки (синерезис).
Реактивы и оборудование: 1) Пробирки на 10 см3; 2) градуированные пипетки на 5 см3; 3)молоко, 4)10% - раствор уксусной кислоты.
Ход определения
В пробирку отмерить 5 см3 молока. Затем добавить несколько капель уксусной кислоты.
Выпавшие в осадок хлопья представляют собой коагулирующий казеин.
Сывороточные белки остаются в сыворотке.
59
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. ТЕРМОКАЛЬЦИЕВАЯ КОАГУЛЯЦИЯ КАЗЕИНА
Термокальциевая коагуляция белков была предложена русским ученым П.Ф.
Дьяченко. Для коагуляции используют 40% хлорид кальция. А для осаждения сывороточных белков – действие высоких температур (950).
Механизм действия кальция заключается в снижении отрицательного заряда белковых частиц, вследствии присоединения его к отрицательно заряженным группам. В результате электронейтральные частицы казеина агрегируют с помощью ионов кальция и выпадают в осадок. Вместе с казеином осаждаются и денатурируют сывороточные белки.
Реактивы и оборудование: 1) Градуированные пипетки на 5 см3; 2) водяная
баня; 3) молоко 4) 40 %-ный раствор хлорида кальция.
Ход определения
К 5 см молока прилить 1 см хлорида кальция, затем поместить в горячую
водяную баню на 5 мин. Наблюдать выпадение казеина и сывороточных белков молока.
3
3
3. СЫЧУЖНАЯ КОАГУЛЯЦИЯ КАЗЕИНА
Механизм сычужной коагуляции проходит в две стадии.
На первой стадии фермент действует на молекулы %-казеина, стабилизирующие частицы казеина. В нем разрываются определенные пептидные связи, что вызывает отщепление довольно крупных пептидов -макропептидов. В
результате в мицеллах остается не %-казеин , а пара-х-казеин, который уже неспособен, защищать частицы казеина от слипания. Таким образом, в сгусток
переходит не казеин молока ( казеинкальцийфосфатный комплекс), а параказеин
( параказеинкальцийфосфатный комплекс). Параказеин отличается от казеина
тем, что имеет меньшую молекулярную массу и изоэлектрическую точку в менее кислой среде - при рН 5-5,2.
На второй стадии неустойчивые (дестабилизированные) мицеллы казеина коагулируют. Сначала они собираются в небольшие агрегаты (до 2-5
частиц) и длинные нити (5-20 и более частиц), которые затем соединяются
между собой, образуя сгусток.
Реактивы и оборудование1)Мерные колбы на 100 см3;
2)градуированные пипетки на 1 см3; 3) термостат; 4) молоко; 5)сычужный
фермент (готовится за 30 минут до начала проведения реакции - 2,5 гр. сухого
фермента растворяется в 100 см3 воды и выдерживается в термостате при
температуре, оптимальной для активности фермента (36-370С).
Ход определения
3
Отмерить 100 см молока, доведенного до температуры активности
фермента (37оС). Добавить 1 см3 фермента. Через 3 мин образуется сгусток,
60
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
что говорит о коагуляции казеина. При отделении сыворотки белки остаются в
ней.
Обсуждение результатов
Результаты исследований занести в таблицу 1. В таблице отметить превращения, претерпеваемые белками молока при различных видах коагуляции, описать характер сгустка, полученного различными способами дестабилизации казеина. После обсуждения сделать вывод о том, какой способ коагуляции обеспечивает максимальное использование белков
Таблица 1 – Коагуляция белков молока
БЕЛОК
Вид коагуляции
Казеин
Сывороточные белки
Кислотная
Термокальциевая
Действие сычужного
фермента
Контрольные вопросы
1. Чем обусловлена устойчивость коллоидных частиц казеина в молоке.
Какие способы коагуляции казеина применяют при выработке кисломолочных продуктов.
Что такое копреципитат.
Какой способ коагуляции обеспечивает максимальное использование
белков.
Какие фракции казеина не осаждает сычужный фермент.
При каких условиях дестабилизируются сывороточные белки.
4.2.5. Качественное определение альбумина в молоке
Цель работы: Изучение условий дестабилизации сывороточных белков. Визуальное определение молочного альбумина. в фильтрате сыворотки.
Методика проведения анализов
Принцип метода
Казеинаткальций-фосфатный комплекс молока разрушается уксусной
кислотой, освобождая казеин, который в сыворотке не растворяется и выпадает в виде хлопьев. Альбумин молока в свободном состоянии растворим и
61
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
под воздействием уксусной кислоты не выпадает в осадок, вместе с казеином.
Однако он легко осаждается при нагревании свыше 75°С при кипячении.
Реактивы и оборудование: 1) Пробирки на 10 см3; 2) градуированные пипетки на 5 см3; 3)молоко, 4)10% - ный раствор уксусной кислоты.
Ход определения
В пробирку отмеривают пипеткой 5мл молока и нагревают его до 4050 °С. Второй пипеткой вносят несколько капель раствора 10 % уксусной
кислоты, слегка перемешивая молоко до прекращения выпадения хлопьев.
Выпавшие хлопья представляют собой казеин молокаю.
После этого 2-3 см сыворотки отфильтровывают в другую чистую
пробирку. Фильтрат в пробирке нагревают до кипения (держа пробирку специальными деревянными зажимами или обернув полотенцем); в жидкости
появляются мелкие хлопья – молочный альбумин.
Контрольные вопросы
1. Какой процент от общего белкового состава приходится на сывороточные белки.
2. Какие белки относятся к сывороточным.
3. Охарактеризуйте биологическую роль сывороточных белков.
4. Какой белок является самой термостабильной частью сывороточных
белков.
5. Что такое «молочный камень». При каких условиях происходит его образование.
4.2.6. Влияние кислотности на устойчивость белков молока
Цель работы: Определения свежести молока методом кислотнокипятильной пробы
Общие теоретические положения
Метод используют для определения степени свежести молока. Считается, что чем больше добавленной кислоты выдерживает молоко при кипячении без гелеобразования, тем ниже его титруемая кислотность.
Мицеллы казеина в молоке с повышенной кислотностью имеют меньший
заряд, что связано с нейтрализацией белка молочной кислотой, накапливающейся в результате сбраживания лактозы микроорганизмами, меньшую степень дисперсности, чем мицеллы казеина свежего молока, более тонкую гидратную оболочку, однако наличие заряда и гидратной оболочки препятствует
гелеобразованию.
62
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
На рис. 5 представлены фрагменты поверхности мицелл казеина свежего
молока и молока с повышенной кислотностью.
Рис. 5. Фрагменты поверхности мицелл казеина:
а) свежего молока; б) молока с повышенной кислотностью.
Нагревание молока до 35...40°С вызывает полную дегидратацию белковых частиц, а дальнейшее повышение температуры приводит к усилению
гидрофобных и ионных взаимодействий, активирует кальций-индуцированное осаждение казеина.
Кроме того, под действием добавленной к молоку кислоты происходит
снижение заряда казеиновых мицелл. Если заряд снижается до нуля, то
наступает гелеобразование.
Методика проведения анализов
Реактивы и оборудование: 1) пробирки вместимостью 20 см3; 2)пипетки
вместимостью 10 см3; 3)бюретка вместимостью 25 см3 с ценой деления 0.1
см3;4) водяная баня; 5)электроплитка 6)образцы молока; 7)0,1 н. раствор соляной кислоты
Ход определения
В 3 пронумерованные пробирки вместимостью 20 см3 вносят пипеткой по
10 см3 исследуемых образцов молока. Добавляют из бюретки 0,1 н. раствор
соляной кислоты: во вторую пробирку - 0.5см3, в третью - 1.0 см3, в первую
пробирку кислоту не добавляют. Содержимое пробирок тщательно перемешивают. Пробирки помещают в кипящую водяную баню. Уровень воды в
бане должен быть выше уровня жидкости в пробирках.
Через 3 мин пробирки вынимают, охлаждают и определяют изменение
консистенции молока.
Обсуждение результатов
Изменение консистенции молока зависит от его исходной кислотности.
Если гелеобразование не произошло ни в одной из пробирок, то кислотность
молока ниже 19°Т. Молоко свежее.
Если сгусток образовался только в третьей пробирке, его кислотность
19…20°Т, а если во второй и третьей пробирке, то кислотность более 20°Т.
Результаты исследований занести в таблицу
63
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица Определение свежести молока методом кислотно-кипятильной пробы
1
2
3
Титруемая
Качество
Образцы
молока
пробирка
пробирка
пробирка
кислотность
молока
1 и т.д.
После обсуждения результатов сделать выводы об исходной кислотности
и свежести исследованных образцом молока.
Контрольные вопросы
1. Чем обусловлена повышение кислотности молока в процессе хранения.
2. Какие нежелательные изменения свойств молока для технологической
переработки происходят при повышении кислотности.
3. Охарактеризуйте кислотность свежевыдоенного молока.
4.2.7. Выделение белков из мышечной ткани и изучение их свойств.
Цель работы: Изучение фракционного состава белков мяса. Фракционирование белков из мышечной ткани и изучение их свойств.
Основные теоретические положения
Содержание белка в мясных продуктах колеблется от 11 до 22 %. Более
40 % массы тела животного приходится на долю мышечной ткани, состоящей
из поперечно-полосатой скелетной и гладкой мускулатуры. Важнейшей составной частью мышечной ткани являются белки, которые подразделяются
на саркоплазматические, миофибриллярные и белки стромы (склеропротеины). На долю белков саркоплазмы приходится около 10 % всех белков мышцы. Основную массу саркоплазматических белков составляют миоглобин,
миоген и глобулин Х.
Водорастворимый хромопротеид миоглобин имеет в качестве простетической группы гем – циклический тетрапиррол, присутствием которого
объясняется красный цвет этого белка. Биологическая функция миоглобина
заключается в транспортировании и запасании кислорода в мышечной ткани.
В условиях кислородного голодания (например, при физической нагрузке)
кислород высвобождается из комплекса с миоглобином и поступает в митохондрии мышечных клеток, где осуществляется синтез АТФ. Окраска мясопродуктов зависит от содержания миоглобина, состояния гемма и белковой
части макромолекулы. Окисление Fе2+ в миоглобине до Fе3+ приводит к изменению окраски пигмента от ярко-красного до темно-коричневого, т.к. образующийся метмиоглобин теряет способность связывать молекулярный
кислород. Тепловая денатурация глобина также приводит к потере способности гемового пигмента связывать кислород и ухудшает цвет изделий.
Миоген входит в состав ферментов гликолиза (альдолазу), а глобин Х
играет важную роль в качестве поставщика различных аминокислот в синтезе белка. К числу саркоплазматических белков также относятся миоальбумины и нуклеопротепротеиды, входящие в состав рибосом и ядер.
64
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В группу миофибриллярных белков входят миозин, актин и тропомиозин. Это главные белки мышечной ткани, биологическая функция которых
заключается в обеспечении механизма мышечного сокращения и расслабления при участии АТФ. Миозин по массе составляет 55 % мышечного белка,
на долю актина приходится 25 % общей массы мышечного белка.
Белки стромы или опорные белки (склеропротеины) составляют около
10 % всех белков мышцы. Группа этих белков представлена в основном белками соединительной ткани - коллагеном и эластином. Мясо, содержащее
много соединительной ткани, остается жестким и после тепловой обработки;
усвояемость коллагена и эластина в нем очень низкая.
Ход занятия
1. Изучить теоретические положения и заполнить таблицу.
Таблица Фракционный состав белков мышечной ткани
Фракции белков
Среднее содерК какой группе
Биологические
жание, %
относится по
функции
строению или
растворимости
Всего белков
2. Провести фракционирование белков мышечной ткани и изучить их
свойства.
Методика проведения анализов.
Принцип метода.
Выделение и разделение белков мяса основано на их избирательной
растворимости в различных растворителях: воде (альбумины), вводносолевых растворах (глобулины). В остатке мышечной ткани после экстракции водными и солевыми растворами остаются нерастворимые склеропротеины.
С выделенными фракциями белков последовательно проводится ряд
специфических качественных реакций, основанных на их свойств. – биуретовая, высаливание из растворов с помощью насыщенных растворов солей,
осаждение раствором трихлоруксусной кислоты.
Биуретовая реакция является специфической качественной реакцией на
белок, т.к. её дают полипептидные связи. Она получила свое название от
производной мочевины – биурета, который образует в щелочном растворе
медного купороса окрашенное комплексное соединение. Биуретовую реакцию дают все белки, пептоны и полипептиды, начиная с тетрапептидов, независимо от характера аминокислот и природы их связи между собой в молекуле белка. Интенсивность окрашивания пропорциональна содержанию пептидных связей, а следовательно, и концентрации белка в растворе.
Высаливанием называется осаждение белков из растворов солями.
Принцип высаливания заключается в следующем. Молекула белка удержива65
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ется в растворе вследствие действия на нее стабилизирующих факторов:
электрического заряда и водной оболочки (гидросферы). соли щелочных и
щелочноземельных металлов несут заряд, противоположный заряду белковой
мицеллы, и обладают большей гирофильностью, чем белок. Поэтому при добавлении соответствующего количества солей в раствор белка белковые молекулы теряют аряд и водную оболочку т.е. оба стабилизирующих фактора;
при этом дегидротированные белковые мицеллы выпадают в осадок.
Осаждение белков трихлоруксусной кислотой применяется для полного удаления их из раствора; при этом не осаждаются продукты гидролиза
белков пептиды, аминокислоты и др.
Реактивы:
1)10 %-й раствор гидроксида натрия;
2)1 %-й раствор сульфата меди;
3)сульфат аммония крислаллический;
4) 6 %-й раствор трихлоруксусной кислоты;
5) насыщенный раствор хлорида натрия;
6) 1 М раствор хлорида натрия.
Приборы и оборудование: 1)колбы конические на 100 см3;
2)цилиндры мерные на 50 см3 и на 25 см3; 3)стаканы химические на 100 см3;
4)воронки; 5)пробирки; 6)плитка электрическая; 7)весы лабораторные.
Ход определения
Свежую мышцу освобождают от жира и тщательно измельчают на часовом стекле ножницами, после чего отвешивают навеску массой 10 г в химический стакан.
Для выделения альбуминовой фракции (белки саркоплазмы) измельченную мышцу залить 30 мл дистиллированной воды и экстрагировать белки, периодически взбалтывая в течение 20 мин. Вытяжку отделить фильтрованием через три слоя марли в коническую колбу, а оставшуюся мышечную
кашицу сохранить для последующей солевой экстракции. Отметить в таблице 2 белки саркоплазмы, перешедшие в водный экстракт. Провести с ними
следующие качественные реакции.
В три пробирки налить по 2 мл полученного экстракта. В первой пробирке провести биуретовую реакцию.
Для проведения биуретовой реакции в пробирку с экстрактом белка
добавить 3 мл 10 %-ного раствора гидроксида натрия. Затем по каплям прилить 1 %-ный раствор сульфата меди, встряхивая смесь после каждой капли.
Раствор окрашивается сначала в розовый, затем в фиолетовый цвет. Следует
избегать избытка сульфата меди, т. к. в этом случае фиолетовая окраска маскируется синей.
66
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Во вторую пробирку добавить сульфат аммония до насыщения (около
г), при этом выпадает осадок альбуминов. В третью пробирку прибавить несколько капель раствора трихлоруксусной кислоты. Пробирку встряхнуть и
наблюдать осаждение белка.
Для выделения глобулиновой фракции остаток мышечной кашицы после экстракции водой поместить в стакан, залить 20 мл 1 М раствором хлорида натрия и экстрагировать при встряхивании в течение 30 мин. Солевой
экстракт отфильтровать через три слоя марли в коническую колбу. Отметить
в таблице 2 миофибриллярные белки, перешедшие в солевой раствор. Провести с ними следующие реакции.
В три пробирки налить по 2 мл полученного солевого экстракта. В первой пробирке установить наличие белка с помощью биуретовой реакции. Во
втору. пробирку добавить 2 мл насыщенного раствора хлорида натрия и
наблюдать выпадение осадка белков. К экстракту в третьей пробирке добавить дистиллированную воду до появления осадка нерастворимых в воде
глобулинов.
В остатке мышечной ткани после экстракции водными и солевыми растворами содержатся склеропротеины. Этот остаток поместить в коническую
колбу, залить 30 мл воды и кипятить в течение 20 мин, сохраняя объем жидкости в колбе периодическим добавлением горячей воды. При кипячении
коллаген, подвергаясь неглубокому гидролизу, превращается в растворимый
в воде желатин. Горячий раствор отфильтровывают в пробирку и в фильтрате
определяют желатин с помощью биуретовой реакции. На фильтре остаются
тонкие волокна и пленки эластина.
Обсуждение результатов.
Опишите в таблице 2 результаты проведенного фракционирования
белков мяса, отмечая фракции белков, перешедших в водную, солевую вытяжку и нерастворимых. Отметьте проведенные вами реакции с каждой
фракцией белков и их результаты.
Таблица 2 - Фракционирование белков мышечной ткани
Фракционирование Водная экстракция Солевая экстракция Кипячение
Выделенные фракции белков
Проведенные реакции и их результаты
Сделайте вывод о преобладающей фракции белков в мышечной ткани.
1.
2.
3.
4.
Контрольные вопросы.
Содержание и фракционный состав белков мяса.
Биологическая ценность белков мяса.
Биологические функции белков мяса.
Какие качественные реакции на белки вы знаете
67
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ГЛАВА 5
ЛИПИДЫ
Липидами называются неоднородные в химическом отношении вещества, общим свойством которых является гидрофобность, т.е. нерастворимость в воде, но хорошая растворимость в неполярных органических растворителях: эфире, ацетоне, хлороформе, бензине и т. д.
До настоящего времени отсутствует строгая классификация липидов.
В соответствии с химическим составом липиды растений можно подразделить на следующие группы:
1. Простые: нейтральные жиры и воски.
2. Сложные: фосфолипиды.
3. Циклические: стероиды.
4. Терпены.
Перечисленные соединения входят в состав так называемого сырого
жира, извлекаемого из высушенных растительных тканей эфиром.
Липиды являются обязательным компонентом живых клеток, хотя
большинство растений накапливает сравнительно немного липидов. Содержание сырого жира в тканях, где нет специальных отложений жиров, составляет около 2 %. Наряду с этим в настоящее время известна большая группа
растений различных ботанических семейств, у которых в тканях отдельных
органов - плодов, семян, корневищ и т. д. - откладываются значительные количества липидов. Эта группа растений получила название масличной.
Функции этого класса соединений важны и разнообразны:
1. Энергетическая - являются запасными веществами и энергетическим материалом организма. Эту функцию выполняют нейтральные жиры.
Они легко извлекаются из тканей и являются «свободными» липидами. При
окислении 1 г жира выделяется 39 кДж энергии, что в два раза больше, чем
при расщеплении 1 г углеводов.
2. Структурная - эту функцию выполняют трудно извлекаемые «связанные» и «прочно связанные» липиды. К ним относятся прежде всего фосфолипиды, которые в комплексе с белками образуют липопротеидные мембраны, регулирующие поступление в клетку и её органоиды разнообразных
веществ. Липопротеиды создают основу тела органоидов клетки (ядра, пластид, митохондрий и рибосом). К структурным относятся также биологически активные липиды, имеющие витаминную и провитаминную активность каротиноиды, стероиды и др. соединения.
Структурные липиды содержатся во всех органах и тканях растений и
животных в постоянных, но значительно меньших количествах, чем запасные жиры. Например, содержание фосфолипидов в клетках обычно составляет 0.1-0.5% сырого веса.
3. Защитная - образуют химически инертные структуры покровных
тканей семян и плодов, защищая их от избыточного испарения и проникновения микроорганизмов. Эту функцию выполняют воски и их производные.
68
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5.1. Определение сырого жира в масличном сырье
Цель работы: Ознакомление с методами определения жира. Определение содержания жира в масличном сырье рефрактометрическим методом.
Общие теоретические положения
Растительные жиры или масла представляют собой смеси сложных
эфиров глицерина и жирных высокомолекулярных кислот (ацилглицерины).
Они имеют следующую общую формулу:
О
СН2  О  С  R1

О
СН  О  С  R2

О
СН2  О  С  R3
где R1, R2, R3 - радикалы жирных кислот. Они могут быть одинаковыми, но
чаще всего разными, насыщенными или ненасыщенными.
В состав жиров входят жирные кислоты с четным числом атомов С
(чаще всего с С16 или С18 ).
Наиболее часто в составе масел растений средних и северных широт
встречаются пять жирных кислот, две из которых насыщенные – пальмитиновая и стеариновая; и три ненасыщенные - олеиновая, имеющая одну двойную связь; линолевая с двумя двойными связями; и линоленовая с тремя
двойными связями.
Растительные масла не являются индивидуальными веществами, а
представляют собой смеси триацилглицеринов (триглицеридов), которые могут быть однокислотными или разнокислотными. Однокислотные гриацилглицерины, т.е. такие, в состав которых входит одна кислота, встречаются
сравнительно редко, лишь в немногих растительных маслах. Так, например, в
оливковом масле содержится до 80% олеиновой кислоты, в касторовом - до
86% рицинолевой кислоты. Подавляющее большинство растительных масел
состоит из смеси разнокислотных триацилглицеринов, причем в их состав
входят как насыщенные, так и ненасыщенные жирные кислоты при значительном преобладании последних (70 -80%).
Простейшей задачей анализа растительных масел является определение
их общего содержания в семенах или других органах растений и установление характерных констант данного масла.
Методы определения содержания жира чаще всего основаны на способности его растворяться в различных органических веществах. При количественных определениях проводят полную экстракцию жира из растительного материала каким-либо растворителем и учитывают количество экстрагированного жира. Так как под действием органического растворителя обычно извлекаются не только нейтральные жиры, но и свободные жирные кислоты, эфирные масла, а также другие липиды (лецитины, стеролы и т.д.), то полученный препарат называют сырым жиром.
Существует несколько методов определения содержания жира, различающиеся длительностью, аппаратурным обеспечением, применяемыми рас69
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
творителями и т.д. Наиболее точным классическим методом среди существующих является метод Сокслета, в котором жир извлекают из предварительно обезвоженного растительного материала в специальном аппарате с
помощью этилового или петролейного эфира. Экстракцию продолжают в течение нескольких часов, после чего извлеченный сырой жир освобождают от
растворителя и взвешивают. Полученный препарат сырого жира можно использовать для последующего фракционирования и детального изучения химических свойств отдельных компонентов.
В тех случаях, когда достаточно знать лишь общее содержание жира в
изучаемом материале, используют метод определения жира по массе обезжиренного остатка, предложенный С.В. Рушковским. При этом из обезвоженной растительной навески жир извлекают эфиром и по массе оставшегося
растительного материала вычисляют количество сырого жира.
Описанные методы довольно трудоемки, сложны в технике исполнения и длительны. Этих недостатков лишен ускоренный рефрактометрический метод.
Методика проведения анализов
Принцип метода
Метод основан на извлечении жира из навески изделия нелетучим растворителем, показатель преломления которого значительно выше, чем у извлекаемого жира. Как правило в этом методе используют следующие растворители: α-бромнафталин с коэффициентом преломления 1,66 и αхлорнафталин с коэффициентом преломления 1,63. При растворении жира
в растворителе коэффициент преломления смеси понижается пропорционально количеству извлеченного жира. Массовую долю жира в изделии
определяют по разности между показателями преломления чистого растворителя и смеси масла с растворителем. Поскольку в этом методе содержание жира рассчитывается по разности показателей преломления, то калибровка рефрактометра на ноль по дистиллированной воде и введение
температурной поправки необязательны.
Реактивы и оборудование: 1)растворитель α-бромнафталин; 2)ступки с
пестиком; 3)фильтры бумажные диаметром 8 см; 4)воронки стеклянные
диаметром 6 см; 5)весы технические; 6)рефрактометр лабораторный ИРФ22.
Ход определения
1. Перед началом работы проверить правильность установки рефрактометра
на нуль по дистиллированной воде и рассчитать температурную поправку.
Для этого определить показатель преломления дистиллированной воды и
вычесть из полученного результата 1.3330.
2. Определить коэффициент преломления растворителя α-бромнафталина,
нанося 2-3 капли растворителя на призму рефрактометра.
70
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3. Определить коэффициент преломления исследуемого жира аналогичным
способом. Если нет возможности непосредственно определить данный
показатель, то можно воспользоваться следующими справочными данными: n 20D для подсолнечного масла 1,4736; для горчичного масла 1,4730; для
соевого масла 1,4722. Данные значения коэффициентов преломления соответствуют температуре 20 0С. Для пересчета коэффициента преломления жира на условия определения необходимо к данному справочному
значению добавить температурную поправку, определенную в пункте 1.
4. Отвесить навеску измельченного растительного материала (семена подсолнечника, горчицы и т.д.) массой около 2 г с точностью до 0,01 г, поместить в маленькую ступку и прилить 4 см3 растворителя α-бромнафлалина
с помощью пипетки с грушей или микробюретки.
5. Содержимое ступки энергично растереть в течение 3 мин, затем перенести
на маленький складчатый фильтр. Первые 2-3 капли фильтрата отбросить,
а последующие 2-3 капли поместить на призму рефрактометра и определить коэффициент преломления.
6. Определения проводить не менее трех раз, принимая за окончательный результат среднее арифметическое значение из трех определений. После
каждого определения промыть дистиллированной водой или растворителем поверхность измерительной и осветительной призм, удалить следы
жидкости фильтровальной бумагой.
Обработка и обсуждение результатов
Содержание жира в растительном материале при фактической влажности
вычисляют по формуле:
Х
Vp
m
 Пр  Прж 

  100 ,
 Прж  Пж 
где Х – содержание жира, %; Vp – объём растворителя, взятый для извлечения жира см3;  - относительная плотность жира при 200С, г/см3 (относительная плотность подсолнечного масла 0,924 г/см3); Пр – коэффициент
преломления растворителя; Прж – коэффициент преломления раствора
жира в растворителе; Пж – коэффициент преломления жира; m – масса
навески анализируемого материала, г.
Для исследований берутся несколько видов масличных семян, различающихся исходным качеством, условиями и сроками созревания и пр.
Каждая бригада анализирует один образец. Результаты всех определений
заносятся в сводную таблицу 1.
71
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 1 - Определение содержания жира в масличном сырье
Образец
Масса
навески, г
Плотность
жира, г/см3
Коэффициент
преломления
растворителя
Коэффициент
преломления
чистого жира
Коэффициент
преломления
раствора жира
Массовая
доля жира, %
После обсуждения сделать вывод о влиянии вида и качества масличного сырья на содержание жира.
1.
2.
3.
4.
5.
Контрольные вопросы
Какие вещества относят к липидам, их классификация.
Роль и функции липидов в живых организмах.
На чем основаны методы определения липидов.
Принцип рефрактометрического метода определения содержания липидов.
От каких факторов зависит накопление липидов в масличных семенах.
5.2. Определение жировых чисел растительных масел
Цель работы: Освоение методов определения жировых чисел растительных масел. Исследование влияние вида и качества масла на физикохимические показатели.
Основные теоретические положения
Качество масла, его происхождение определяют путём исследования
физико-химических показателей, характеризуемых жировыми числами,
главными из которых являются кислотное число, число омыления и йодное
число.
Кислотное число - это количество мг едкого кали, необходимое для
нейтрализации свободных жирных кислот, содержащееся в 1 г жира. Кислотное число указывает на количество свободных жирных кислот, оставшихся
неиспользованными при биосинтезе масла во время созревания семян, или
начавшуюся порчу масла, которая сопровождается увеличением содержания
свободных жирных кислот.
В жирах почти всегда имеются свободные жирные кислоты, причем в
растительных жирах их обычно больше, чем в животных. Особенно много
свободных жирных кислот в масле их недозрелых семян. При созревании их
количество уменьшается и соответственно понижается кислотное число. Содержание свободных жирных кислот может увеличиваться при длительном
хранении семян масличных культур или полученного из них масла и резко
72
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
повышается при прорастании семян в результате гидролиза жира. Таким образом, величина кислотного числа непостоянна.
Число омыления - это количество мг едкого кали, необходимое для
нейтрализации свободных и связанных с глицерином жирных кислот, содержащихся в 1 г жира. Характеризует среднюю величину молекулярного веса
триацилглицеринов, входящих в состав жира. В зависимости от условий выращивания масличного сырья число омыления может заметно изменяться.
Йодное число - количество мг йода, связываемое 100 г жира. Характеризует степень непредельности жирных кислот, входящих в состав жира, т.к.
присоединение йода идёт по месту двойных связей:
НС = СН + 2J  СН  СН


J
J
Йодное число – важная константа жира, так как от него зависят физические и химические свойства жира и его биологическая ценность. Чем выше йодное число, тем более жидким является жир, тем легче он окисляется и
скорее прогоркает, т.к. окисление идет по месту двойных связей. По величине йодного числа растительные масла делят на высыхающие - с йодным
числом 130 и выше (льняное, конопляное, тунговое, перилловое), невысыхающие - с йодным числом меньше 85 (касторовое, арахисовое) и полувысыхающие (подсолнечное, соевое, рапсовое др.). Следует заметить, что чем
больше йодное число масла, тем выше его биологическая ценность, но тем
легче оно окисляется при хранении и при использовании его в пищевых производствах, связанных с термическими воздействиями на масло.
Наиболее подвержено колебаниям из трёх чисел кислотное число, связанное с условиями созревания и хранения семян. У свежего растительного
масла, полученного из полностью вызревших семян, оно находится на самом
низком уровне.
Методика проведения анализов
Кислотное число
Принцип метода. Масло нейтрализуют титрованным раствором КОН,
в результате чего между едким кали и находящимися в масле свободными
жирными кислотами происходит следующая реакция:
RCOOK + KOH
→ RCOOK + H2O
По количеству раствора КОН, затраченного на нейтрализацию кислот, судят
о величине кислотного числа.
Реактивы
1. Образцы различных растительных масел.
2. Насыщенный раствор NаС1 (растворить NаСl в горячей дистиллированной воде до полного насыщения раствора. После охлаждения и выпадения избытка соли раствор процедить).
3. 0,1н водный раствор КОН (5,7 г КОН развести дистиллированной водой до 1 л).
4. 0,5%-ный раствор фенолфталеина.
5. Дистиллированная вода.
Оборудование: 1)конические колбы на 100 см3; 2)пипетки Мора на 5
3
см ; 3)мерный цилиндр на 50 см3; 4)бюретка для титрования.
73
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ход определения
В коническую колбу емкостью 100 см3пипеткой Мора наливают 5 см3
растительного масла (предварительно определив его вес), приливают 50 см3
насыщенного раствора NаС1 и 10 капель раствора фенолфталеина. Колбу закрывают крышкой и хорошо встряхивают. Полученную смесь титруют 0,1 н
раствором КОН до появления устойчивого розового окрашивания. Для его
достижения после прибавления каждой порции раствора щелочи (4-5 капель)
колбу закрывают пробкой и сильно встряхивают. Окраска не должна исчезать в течении 0,5-1 мин.
Обработка результатов
Кислотное число (X) вычисляют по формуле:
с - навеска масла, г; У - кол-во 0,1н. раствора КОН, израсходованного на титрование масла, мл;
Х
5,61
V , где
с
с – навеска масла, г;
V–количество 0,1 н раствора КОН, израсходованное на титрование масла, мл;
5,61 - коэффициент пересчета объема 0,1н раствора КОН в миллиграммы, т.е.
в 1 мл 0,1 н раствора КОН содержится 5,61 мг КОН;
Содержание свободных жирных кислот в масле можно выражать также
не кислотным числом, а процентом свободных жирных кислот от веса масла.
Условный расчет ведут на свободную олеиновую кислоту, широко распространенную в большинстве растительных масел. Для этого кислотное число
умножают на коэффициент 0,503, который получают из следующего расчета:
% свободных кислот =
к.ч.  282 ,3  100
 0,503  к.ч
56 ,11  1000
где к.ч. - кислотное число; 282,3 - молекулярный вес олеиновой кислоты;
56.11 - молекулярный вес КОН; 100 - пересчет на процентное содержание;
1000 - пересчет мг в г.
Число омыления
Принцип метода. Масло кипятят с избытком титрованного раствора едкого
кали, в результате чего происходит гидролиз триглицеридов:
О
СН2  О  С  R1

О
СН  О  С  R2 + 3 Н2О →

О
СН2  О  С  R3
СН2  ОН

СН  ОН +

СН2  ОН
3 RСООН
Освободившиеся кислоты реагируют с едким кали:
RСООН + КОН → RСООК + Н2О
74
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
По этой же схеме реагируют и свободные жирные кислоты, содержащиеся в масле. Избыток щелочи, которая не прореагировала с жирными кислотами, оттитровывают соляной кислотой:
КОН + НCl → КCl + Н2О
Число омыления рассчитывают по количеству щелочи, затраченной на
связывание всех кислот масла.
Реактивы
1.
0,5 н спиртовой раствор КОН (30 г химически чистого КОН растворяют в 1 дм3очищенного спирта при нагревании с обратным холодильником.
Раствор отстаивают сутки, фильтруют и сохраняют в склянке темного стекла, в хорошо закупоренном виде);
2. 0,5 н. раствор НС1 (на 1 дм3 раствора нужно 41 см3 концентрированной соляной кислоты удельным весом 1,19);
3. 1 %-ный раствор фенолфталеина.
Оборудование: 1)конические колбы на 250 см3с обратным холодильником; 2)пипетке Мора или цилиндры на 25 см3; 3)водяная баня
Ход определения
В коническую колбу на 250 см3помещают навеску около 2г масла и
прибавляют пипеткой Мора 25 см3 0,5н спиртового раствора КОН. Колбу соединяют с обратным холодильником, охлаждаемым водой и нагревают на
слабо кипящей водяной бане. Омыление считается законченным, когда жидкость и колбе станет прозрачной. Затем смесь титруют в теплом виде 0,5 н
раствором НС1 с прибавлением 10-15 капель 1%-ного раствора фенолфталеина. Параллельно проводят контрольное определение с таким же количеством КОН, но без масла (кипятят на бане, затем оттитровывают соляной
кислотой).
Обработка результатов
Число омыления вычисляют по формуле:
К .О. 
(а  в)  28,055
,
с
где (а - в) - разность результатов титрования контрольного и опытного
образцов, мл 0,5 н раствора НС1;
28,055 - коэффициент пересчета результатов титрования в мг КОН, ч .с.
1 мл 0,5 Н раствора НС1 эквивалентен 28.055 мг КОН;
юс - навеска исследуемого масла,г
Определение эфирного числа
Эфирным числом называют количество мг едкого кали, необходимое
для нейтрализации жирных кислот, находящихся в связанном состоянии в I г
масла. Это число определяют путем вычитания кислотного числа из числа
омыления.
75
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Определение количества глицерина в масле
По эфирному числу можно подсчитать примерное содержание глицерина в масле, учитывая, что для отщепления одной молекулы глицерина
необходимо три молекулы едкого кали. Количество глицерина (%) вычисляют по формуле:
Х
92 ,06 а  100
, где
56 ,11  3  1000
92,06 - молекулярная масса глицерина;
56,11 - молекулярная масса едкого кали;
а - эфирное число.
Йодное число
Принцип метода. Определение основано на способности йода реагировать с водой в присутствии ненасыщенных соединений:
J2 + H2O → HJ + HOJ
Йодноватистая кислота
Ненасыщенные соединения поглощают выделяющуюся йодиоватистую
кислоту, присоединяя ее но месту двойных связей:
RCH=CHRCOOH + HOJ → RCH – CHRCOOH
│
│
OH J
Избыток йода, который не прореагировал с жирными кислотами, оттитро-вывается раствором гипосульфита:
Na2S2O3 + J2 → 2NaJ + Na2S4O6
Реактивы
Спирт этиловый 96%;
0,2 спиртовой раствор йода (25 г кристаллического йода развести в
500 см3 96%-ного этилового спирта);
3.
0,1 н водный раствор гипосульфита (24 г Na2S2O3 развести в 1 дм3
дистиллированной воды);
4.
0,5%-ный раствор крахмала;
5.
Дистиллированная вода.
Оборудование: 1)колбы на 500 см3 с пробками; 2)пипетки Мора или цилиндры на 25 см3; 3)бюретки для титрования.
1.
2.
Ход определения
В коническую колбу емкостью 500 см3 с хорошо пришлифованной
пробкой отвешивают 0,2-0,3 г масла и добавляют 30 см3 спирта для растворения навески. Затем отмеряют пипеткой Мора 25 см3 0,2 н. спиртового раствора йода, смешивают, приливают 200 см3 дистиллированной воды и хорошо
встряхивают, закрыв пробкой. Параллельно проводят контрольный опыт без
масла. Колбы с исследуемым маслом и контрольную оставляют стоять в те76
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
чении 15 мин, после чего титруют 0,1 н раствором гипосульфита до слабожелтого цвета. Затем добавляют 1 см3раствора крахмала и продолжают титрование при сильном взбалтывании до исчезновения голубой окраски. Обесцвечивание раствора наступает обычно от одной последней капли раствора
гипосульфита.
Обработка результатов
Йодное число вычисляют по формуле:
Х
(а  в)  0,01269  100
, где
с
(а - в ) - разность результатов титрования контрольного и опытного
образцов в мл 0,1 н раствора гипосульфита;
0,01269 - коэффициент пересчета израсходованного раствора гипосульфита в йод в г , т. с. 1 мл 0,1 н раствора гипосульфита эквивалентен
0,01269 г йода;
с - навеска масла.
Обсуждение результатов
Для исследования берутся несколько образцов растительных масел раз
различающиеся йодными числами - высыхающие, полувысыхающие и невысыхающие, а также сроками и способами хранения. Каждая бригада анализирует один образец и результаты исследований вносит в сводную таблицу.
После обсуждения результатов делаются выводы о влиянии вида и качества
масла па жировые числа.
Таблица 1 - Жировые числа растительных масел
№
п/п
Вид
масла
Срок и Кислотное число
Число
Эфирное число
Йодное
способ
Мг
% олеи- омыления, Мг
% глице- число,
хранения КОН
мг КОН
мг J2
новой
КОН
рина
кислоты
1
2 и
т.д.
1.
2.
3.
4.
5.
Контрольные вопросы
Состав и строение растительных масел.
Жирные кислоты, наиболее часто встречающиеся в составе жиров растений средних и северных широт.
Кислотное число и его изменение при созревании масличных культур и
при хранении растительных масел.
Йодное число и его изменение при созревании масличных культур и
при хранении растительных масел.
Классификация растительных масел в зависимости от значения йодного числа.
77
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5.3.Определение перекисного числа животного жира
Цель работы: Освоение методики количественного определения перекисного числа жира.
Общие теоретические положения
Перекисное число служит показателем окислительных изменений, происходящих в жирах при их прогоркании и порче, а также при длительной
термической обработке.
Совершенно свежие жиры не содержат перекисей. Они являются первичными продуктами окисления жиров в присутствии кислорода и под действием ферментов. Перекиси могут появиться в жире в процессе технологической переработки и во время хранения. Высокая температура и присутствие кислорода при вытопке, нарушение условий хранения могут привести к
быстрому росту перекисей. При некоторой величине перекисного числа жир
становится непригодным в пищу из-за плохой органолептики, выраженной в
испорченном прогорклом вкусе и запахе. Кроме того, перекиси способствуют
разрушению витаминов и образованию плохо усваиваемых организмом комплексных соединений с аминокислотами и белками.
Под действием кислорода воздуха происходит перекисное прогоркание, при котором изменением подвергаются в первую очередь ненасыщенные жирные кислоты. Причем их превращения могут идти как с разрывом
двойной связи, так и без- по свободно-радикальному механизму. Насыщенные кислоты реагируют медленно и только по свободнорадикальному механизму. Теория свободнорадикальных цепных реакций окисления липидов
разработана академиком Н.Н. Семеновым на основе теории перекисного
окисления Баха-Энглера. Для характеристики перекисного прогоркания
определяют перекисное число. Количественно перекисное число выражают в
граммах йода, восстановленного 100г жира. Перекисное число может быть
определено с точностью до 0,01, в то время как органолептически прогоркание обнаруживается при перекисном числе 0,08-0,09, качественными реакциями- при перикисном числе 0,03.
Методика проведения анализов
Принцип метода
Определение перекисного числа основано на том, что перекиси жира в
кислой среде способны реагировать с йодистым калием, выделяю из него
йод. Схематически эта реакция может быть представлена так:
R1CH2CH —CHCH2R2 + 2KJ + 2CH3COOH
О ─ О
R1CH2CH -- CHCH2R2
+
2CH3COOK + H2O + J2
О
78
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Выделяющийся йод оттитровывают раствором гипосульфита:
Na2S2O3 + J2
2NaJ + Na2S4O6
Реактивы
1.Образцы животных жиров, отличающиеся степенью свежести.
2. Хлороформ.
3. Ледяная уксусная кислота.
4. Насыщенный на холоде раствор йодида калия.
5. 1 % -ный раствор крахмала.
6. 0,01 н. водный раствор гипосульфита Na2S2O3 (приготовить из фиксанала 1
дм3 0,1 н. раствор Na2S2O3 , взять 100 мл этого раствора в мерную колбу
на 1 дм3 и довести дистиллированной водой до метки).
7. Дистиллированная вода.
Оборудование: 1)конические колбы на 100 см3с притертыми пробками;
2)пипетка градуированная вместимостью 1 и 5 см3; 3)микробюретка вместимостью 5 см3; 4)центрифужная пробирка градуированная вместимостью
10 см3 ; 5)весы лабораторные.
Ход определения
Берут две колбы вместимостью 100 см3 с притертыми пробками. В одну отвешивают 1.0±0.1 г расплавленного и профильтрованного жира (опытная проба), другую оставляют пустой (контрольная проба). В обе колбы центрифужной пробиркой вносят по 6 см3 смеси хлороформа с ледяной уксусной
кислотой (в соотношении 2:1). Колбы закрывают пробками. В опытной растворяют жир, покачивая колбу круговыми движениями.
Затем в обе колбы пипетками добавляют по 1 см3 водного раствора йодида калия, насыщенного на холоде, и по 3 см3 дистиллированной воды. Колбы
закрывают пробками и выдерживают в течение 3 мин при постоянном несильном перемешивании.
После этого в обе колбы вносят по 3...5 капель 1%-ного раствора крахмала. При наличии перекисей раствор принимает буро-фиолетовое окрашивание. Выделившийся йод оттитровывают из микробюретки 0,01 н. раствором
тиосульфата натрия до обесцвечивания реакционной смеси.
79
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Обработка и обсуждение результатов
Данные опыта записать в лабораторном журнале в следующем виде:
Вид жира
Масса пустой колбы
г
Масса колбы с жиром
г
Масса навески жира (М)
г
Количество 0,01 н. раствора Na2S2O3, пошедшее на
титрование йода в контрольном опыте (а)
мл
Количество 0,01 н. раствора Na2S2O3, пошедшее на
титрование йода в основном опыте (в)
мл
0,001269 - титр 0,01 н. раствора Na2S2O3 по йоду
Расчет перекисного числа осуществляют по формуле:
П .ч. 
( а  в ) К  0,001269 100
,
М
где а – количество 0,01 н. раствора Na2S2O3, израсходованного на титрование выделившегося йода в контрольном опыте, мл; в- количество 0,01 н.
раствора Na2S2O3, израсходованного на титрование выделившегося йода в
основном опыте, мл; К – поправка к титру 0,01 н. раствора Na2S2O3;
0,001269 – количество йода, соответствующее 1 мл 0,01 н. раствора
Na2S2O3, г; М – навеска жира.
После обсуждения результатов сделать вывод о степени окислительного
прогоркания исследованных образцов жира.
Контрольные вопросы
1Что характеризует перекисное число и какова его роль в оценке качества
жира.
2Как происходит образование перекисей в жирах и пути их дальнейших превращений.
3 Что такое индукционный период и от каких факторов зависит его продолжительность
4Охарактеризуйте роль свободных радикалов в образовании перекисей.
5 В чем заключается принцип метода определения перекисного числа растительных масел.
80
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ГЛАВА 6
МЕТАБОЛИТЫ ВТОРИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Метаболизм или совокупность химических реакций в живом организие, обеспечивающих его исходными веществами и энергией для жизнедеятельности, подразделяется на первичный и вторичный. В соответствии с этим
делением различают первичные и вторичные метаболиты.
К первичным метаболитам относят вещества основного, или первичного, синтеза – белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты, а также все
ферменты и часть витаминов, например, аскорбиновую кислоту.
К вторичным метаболитам относят вещества вторичного происхождения – алкалоиды, фенольные соединения, фитогормоны и родственные им
соединения. Термин «вторичные» не связан со значением веществ этой группы в жизнедеятельности клетки. Многие из этих веществ являются важнейшими биологически активными соединениями.
Присутствие некоторых из вторичных метаболитов в растительном сырье в значительной мере определяет биологическую ценность, вкус и аромат
получаемых пищевых продуктов. Некоторые вторичные метаболиты могут
влиять на усвояемость продуктов растительного происхождения организмом
человека и животных, часто являясь веществами, которые относят к группе
антипитательных или даже токсичных.
6.1. Определение содержания таннина в чае
Цель работы: Изучение и количественное определение дубильных
веществ в различных сортах чая перманганатным методом.
Основные теоретические положения
Чай обладает лечебными и диетическими свойствами. Листья чайного
куста содержат кофеин, дубильные вещества, флавоноиды, следы эфирного
масла и витамины С, В1, В2, В3, РР. Среди веществ, входящих в состав чайного листа и готового чая, особое место занимает комплекс дубильных веществ, называемый чайным таннином.
Дубильные вещества или таннин – это сложная смесь органических соединений, которые являются производными многоатомных фенолов и представляют собой вещества очень разнообразной химической природы. Основная масса их представлена катехинами и их производными. Общее содержание дубильных веществ в сырье из молодых двух- и трехлистных побегов в
среднем составляет 25-30 %. Отдельные элементы побега содержат различные количества дубильных веществ. Наиболее богаты танином почка и первый лист, затем второй и третий листья. Меньше всего содержится таннина в
стебле. Дубильные вещества чайного листа при изготовлении чая подвергаются глубоким и разнообразным превращениям, составляющим основу технологического процесса чайного производства.
Почти все свойства готового чая – его цвет, вкус и аромат – прямо или
косвенно связаны с превращениями дубильных веществ. Они обусловливают
81
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
вяжущий вкус и золотисто-красную окраску напитка, поэтому чем больше
танина в чае, тем выше его качество. Таннин, а также флавоноиды чая обладают капиляроукрепляющим действием. Сочетание с ними витаминов и кофеина обеспечивает чайному напитку свойства ценного лекарственного средства и противоядия при отравлениях.
Дубильные вещества чая служат сырьем для производства лекарственных препаратов типа теальбина (комплексное соединение с белком молока
казеина), применяемых в качестве вяжущего средства. Чайный танин обладает Р-витаминным действием, поэтому добавление в чай лимона, клюквы или
черной смородины, богатых витамином С, весьма оправдано, т.к. дубильные
вещества чая усиливают благоприятное действие витамина С.
Методика проведения анализов
Принцип метода
В основу перманганатного метода определения танина в чае положен
принцип окисления дубильных веществ перманганатом калия с использованием в качестве индикатора индигокармина. Метод широко применяется в
лабораторной практике как наиболее простой и не требующий большой затраты времени. Недостатком его является то, что одновременно с дубильными определяются и красящие вещества.
Реактивы
1. Раствор индигокармина: 1 г индигокармина растворяют в 50 см 3 концентрированной серной кислоты и доводят до 1 дм3, постепенно вливая раствор в дистиллированную воду, а затем фильтруют через бумажный
фильтр;
2. 0,1 н раствор перманганата калия (3,16 г KMnO4 довести в мерной колбе
на 1 дм3дистиллированной водой до метки);
3. Вода дистиллированная.
Приборы и оборудование:
1)колбы конические на 100 см3;
2)цилиндры мерные на 50 см3 и на 25 см3;
3)колбы мерные на 100 см3;
4)воронки;
5)пипетки на 10 см3;
6)баня водяная;
7)плитка электрическая;
8)бюретка;
9)весы лабораторные;
10)фильтры;
11)стаканы стеклянные на 100 мл.
82
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ход определения
Образец чая массой 1 г поместить в коническую колбу вместимостью
100 см3, залить 50 см3 кипящей дистиллированной воды и поставить на водяную баню на 45 мин.
Полученный экстракт слить через воронку в мерную колбу вместимостью 100 см3 вместе с чаем, смывая частицы чая, приставшие к колбе. Содержимое колбы довести дистиллированной водой до метки, взболтать и
фильтровать через бумажный фильтр в сухой стакан.
В коническую колбу на 100 см3 влить пипеткой или цилиндром 10 см3
дистиллированной воды и 2 см3 раствора индигокармина. Затем в колбу добавить 10 см3 фильтрата чая.
Полученный раствор титровать 0,1 н раствором перманганата калия
при постоянном помешивании. При этом синяя окраска индикатора постепенно переходит через сине-зеленую, светло-зеленую в желтую золотистого
оттенка. Окончание титрования определяют по исчезновению зеленого оттенка и появлению чистого желтого цвета.
Аналогично провести контрольное титрование раствора воды и индигокармина (без фильтрата чая).
Обработка и обсуждение результатов.
Расчет количества таннина ведут по формуле:
Х = (а – а1) ×0,004157 × V × 100 / V1× n
где Х – количество таннина, % ; а – количество раствора KMnO4, пошедшее на титрование рабочего раствора, мл; а1 - количество раствора
KMnO4, пошедшее на титрование контрольного раствора, мл; 0,004157 - количество танина, окисляемое 1 мл 0,1 н раствора KMnO4, г; V – объем мерной колбы, взятой для экстракции (100 мл); V1 – объем эстракта чая, отобранный для титрования (10 мл); n – навеска сухого чая, г.
Полученные данные занести в таблицу 1.
Таблица 1 - Определение таннина в чае
Образец чая Расход KMnO4 на титРасход KMnO4 на
Содержание
рование рабочего раститрование контанина в чае,
твора (а)
трольного раствора
%
(а1)
В таблицу вносят данные анализов всех образцов чая, исследованных
подгруппой и делают вывод о содержании танина в исследуемых сортах чая.
Контрольные вопросы.
1. Что представляют из себя дубильные вещества и их содержание в
различных частях чайного растения.
2. Пищевое и технологическое значение таннина в чае.
3. Принцип перманганатного метода определения танина в чае.
83
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ГЛАВА 7
ДЫХАНИЕ
Главная особенность растениеводческой продукции, принципиально
отличающая её от продукции животноводства, заключается в том, что мы
имеем дело с живыми органами растений, в которых и после уборки не прекращается течение биологических процессов. После отделения органов от
материнского растения, в них продолжается обмен веществ, направленный на
сохранение жизнедеятельности клетки и растительного организма в целом.
Источником энергии для поддержания обмена веществ в растениеводческой
продукции при хранении является дыхание.
Дыхание - это процесс ферментативного окисления углеводов или
других органических веществ, протекающий с выделением энергии. В растении, в зависимости от того, в каких условиях оно находится, процесс диссимиляции органических веществ может осуществляться двумя путями: аэробным (с участием кислорода) и анаэробным (без участия кислорода). Если доступ воздуха достаточен, то в растительных клетках происходит процесс
аэробного дыхания. Если растениеводческая продукция хранится без доступа
воздуха, она переходит на процесс анаэробного дыхания или брожения.
Суммарное уравнение аэробного дыхания имеет вид:
С6Н12О6 + 6О2  6СО2 + 6Н2О + Q
Кроме углекислого газа и воды в процессе дыхания выделяется ещё и
тепло: при аэробном дыхании оно составляет 674 ккал (2821,9 кДж) на 1
моль (180 г) израсходованной глюкозы.
Приведенное суммарное уравнение дыхания показывает лишь баланс
веществ при дыхании, т. е. начальные и конечные вещества. Оно не дает
представления о многочисленных промежуточных реакциях, происходящих в
сложном процессе дыхания, и о тех веществах, которые возникают и исчезают на различных этапах этого процесса. Образующиеся при окислении углеводов в процессе дыхания многочисленные промежуточные продукты играют очень важную роль в обмене веществ растения. Механизм дыхания подробно изложен в курсах общей биохимии растений.
Дыхание вызывает большие изменения в растениеводческой продукции при хранении. Прежде всего в результате расхода органического вещества происходит уменьшение сухой массы продукции. Потери массы на дыхание растениеводческой продукции называются естественной убылью.
Во-вторых, как это видно из приведенного выше уравнения, в результате дыхания меняется состав окружающего воздуха - потребляется кислород
и накапливается углекислый газ. Это может привести к переходу продукции
на анаэробный тип дыхания, что не всегда желательно. Например, если в таких условиях хранятся семена, то образующийся при анаэробном дыхании
этиловый спирт отравляет зародыш, и семена теряют всхожесть.
84
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Наконец, в результате усиленного дыхания выделяется вода. Это особенно важно при хранении зерновой продукции: выделяющиеся водяные пары будут повышать влажность зерна. Чрезвычайно важное следствие дыхания - тепловыделение. Как известно, все виды растениеводческой продукции
обладают плохой теплопроводностью. Поэтому тепло, образующееся в результате интенсивного дыхания, будет как бы аккумулироваться в продукции, что в свою очередь будет способствовать усилению процесса дыхания и
возникновению самосогревания.
По этим причинам интенсивность дыхания при хранении растениеводческой продукции стремятся свести к минимуму.
7.1. Исследование зависимости интенсивности дыхания
от температуры
Цель работы: Освоение метода определения интенсивности дыхания
по количеству выделяемой углекислоты. Изучение влияния температуры на
интенсивность дыхания растениеводческой продукции
Основные теоретические положения
Интенсивность дыхания зависит от многих факторов и прежде всего
от вида продукции, её качества, физиологического состояния, а также условий хранения. Сочная продукция, к которой относятся картофель, плоды и
овощи, дышит значительно интенсивнее, чем зерновая. По этой причине
естественная убыль при хранении плодоовощной продукции значительно
выше, чем зерновой. Так, при хранении картофеля в буртах в течении 9 месяцев убыль массы за счет дыхания составит 7,4%, в то время как зерно пшеницы, хранящееся насыпью в стационарном хранилище, потеряет за аналогичный период всего лишь 0,11% своей массы. Кроме того, интенсивность дыхания плодоовощной продукции меняется в зависимости от периода хранения: плоды и овощи дышат наиболее интенсивно сразу после уборки, затем в
основной период хранения (период покоя у двулетних овощей, и дозревания
у плодов и плодовых овощей) интенсивность дыхания устанавливается на
минимальном уровне, в весенний период снова отмечается резкий подъём
дыхания. Поэтому нормы естественной убыли плодоовощной продукции
определяются ежемесячно.
Интенсивность дыхания зерновой продукции, в отличии от плодоовощной, не зависит от сроков хранения и после прохождения периода послеуборочного дозревания устанавливается на одном уровне. Поэтому нормы
естественной убыли зерна и семян определяются за весь период хранения.
На интенсивность дыхания растениеводческой продукции существенное влияние оказывают факторы внешней среды и в первую очередь температура.
85
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
С повышением температуры до оптимального значения, которое находится в интервале от 40 до 60 0С, интенсивность дыхания возрастает. В интервале температур от 00 до 40 0С зависимость между интенсивностью дыхания и температурой подчиняется правилу Вант Гоффа, согласно которому
при увеличении температуры на 10 0С скорость реакции возрастает в два раза.
При температуре выше оптимальной происходит денатурация белков ферментативных систем, в результате чего интенсивность дыхания снижается.
Величина оптимальной температуры очень сильно зависит от влажности хранящегося сырья. С повышением влажности оптимум температуры,
соответствующей максимальной величине интенсивности дыхания, смещается в сторону более низких температур.
Методика проведения анализов
Принцип метода
В данном методе интенсивность дыхания учитывается по количеству
выделившегося диоксида углерода, который поглощается гидроксидом бария
в соответствии со следующей реакцией:
Ва(ОН)2 + СО2 = ВаСО3↓ + Н2О
Раствор непрореагирующего гидроксида бария оттитровывается щавелевой кислотой.
1 мл щавелевой кислоты, пошедшей на титрование, соответствует 1 мг СО2.
Реактивы
1. 0,1 н раствор гидроксида бария: 10,3 г Ва(ОН)2 растворяют в дистиллированной воде и доводят водой до метки в мерной колбе на 1 дм3;
2.0,1 н раствор щавелевой кислоты (приготовить из фиксанала);
3. Фенолфталеин.
Приборы и оборудование:
1)колбы конические на 250 см3 с хорошо притертыми резиновыми
пробками;
2)цилиндры мерные на 10 см3;
3)бюретка;
4)весы лабораторные.
Ход определения
Установкой для определения интенсивности дыхания служат конические колбы с пробками вместимостью на 250 см3 с пробками: одна контрольная и 4 опытных (по количеству вариантов опыта). На нижней стороне пробки находится проволочный крючок.
5 г хорошо проросшего зерна помещают в марлевый мешочек (неплотно) и подвешивают к крюку на пробке. Во все колбы, включая контрольную,
одновременно наливают по 10 см3 раствора гидроксида бария и быстро закрывают их пробками с прикрепленными к ним марлевыми мешочками с
86
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
навесками исследуемых образцов. Мешочек с образцом не должен касаться
раствора. В контрольную колбу образец не помещают.
Опытные колбы термостатируют при температурах +70, 200, 400 и 800С
в течение 1 часа. Для этого одну колбу помещают на нижнюю полку холодильника (+7 0С), вторую оставляют на лабораторном столе при комнатной
температуре, третью и четвертую колбы помещают в термостаты с температурой +40 0С и +80 0С. Контрольную колбу без мешочка оставляют на лабораторном столе.
Во время опыта колбы с раствором Ва(ОН)2 необходимо через каждые
10 мин осторожно покачивать, чтобы нарушить образующуюся пленку с
ВаСО3, мешающую дальнейшему поглощению углекислого газа. Пробки на
колбах не открывать вплоть до момента титрования.
Через 1 час после начала опыта во всех колбах оттитровывают непрореагировавший гидроксид бария щавелевой кислотой. В контрольной колбе
учитывается количество углекислоты, находящееся в объеме колбы. Титрование ведется в присутствии 2-3 капель фенолфталеина до обесцвечивания
раствора.
Обработка и обсуждение результатов
Интенсивность дыхания 100 г растительного материала за 1 час вычисляют по формуле:
Х 
(У к  У о )  100
, где
nt
Х – количество мг СО2, выделившееся при дыхании 100 г вещества за 1 час
(мг СО2/100 г  час);
Ук – количество щавелевой кислоты, затраченное на титрование контрольной
колбы, мл;
Уо – количество щавелевой кислоты, затраченное на титрование опытной
колбы, мл;
n – масса навески, г;
t – время опыта, час.
Результаты определений интенсивности дыхания для всех температур
занести в таблица 1.
Таблица 1 – Зависимость интенсивности дыхания от температуры
Температура, 0С
7
20
40
80
Интенсивность дыхания,
мг СО2/100 г  час
По данным таблицы 1 построить график зависимости интенсивности
дыхания растительного материала от температуры и сделать вывод.
1.
2.
Контрольные вопросы
Что такое дыхание. Какие пути диссимиляции органических веществ существуют в растительной клетке.
Как вы понимаете взаимосвязь процессов брожения и дыхания.
87
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3.
4.
5.
К каким изменениям в окружающей среде приводит дыхание растениеводческой продукции.
Какие факторы влияют на интенсивность дыхания растениеводческой продукции при хранении.
Как влияет температура на интенсивность дыхания растениеводческой продукции.
КРАТКИЙ СЛОВАРЬ БИОХИМИЧЕСКИХ ТЕРМИНОВ
Автолиз. Распад содержащихся в растительном материале веществ под действием собственных ферментов после механического или какого-либо другого воздей ствия на материал, разрушивший его клеточную структуру.
Автотроф. Организм, способный синтезировать органические вещества из
неор ганических путем фото- или хемосинтеза.
Активный транспорт. Энергозависимый транспорт растворенного вещества
через биомембрану в направлении его повышенной концентрации (против
градиента концентрации).
Активный центр. Участок поверхности фермента, в котором молекула субстрата связывается и превращается в продукты реакции.
Акцептор электронов. Вещество, присоединяющее электроны в окислительно-восстановительной реакции.
Алейроновые зерна. Цитоплазматические гранулы, окруженные мембраной
и содержащие запасные белки в клетках основных тканей семян. Другое
название — белковые тела:
Алкалоиды. Азотсодержащие циклические соединения, синтезируемые растениями и оказывающие физиологическое воздействие на человека и животных. Примеры: никотин, кофеин, стрихнин.
Альдоза. Простой сахар, в котором карбонильная группа расположена на
конце углеродной цепи.
Аминокислоты. Алифатические, ароматические или гетероциклические карбо-новые кислоты с аминогруппой в а-положении; мономеры белков.
Аномеры. Два стереоизомера одного сахара, отличающиеся только по расположению разных атомов и групп относительно карбонильного (аномерного) атома углерода.
Антоцианы. Пигменты из группы флавоноидов красного, фиолетового и голубого цвета.
Ауксин. Вещество, регулирующее рост растений, контролирует удлинение
клеток проростка.
Белок. Сложное органическое соединение, полимер, состоящий из одной или
нескольких полипептидных цепей, каждая из которых содержит 100 и более
аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями. Для каждого
белка характерны определенная последовательность аминокислотных остатков в полипептидных цепях и молекулярная масса.
Брожение. Ферментативное разложение органических веществ на более простые соединения под влиянием микроорганизмов без участия кислорода, со88
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
провождающееся высвобождением энергии. По конечному продукту различают брожение спиртовое, уксуснокислое, молочнокислое и др. Начальные
фазы дыхательного метаболизма (гликолиза) в растениях совпадают с брожением.
Витамины. Органические вещества различной химической природы, присутствие которых в пищевых продуктах в следовых количествах обязательно:
большинство витаминов является составной частью коферментов.
Водородный показатель (рН). Показатель относительной концентрации
протонов в растворе; рН изменяется в диапазоне от 0 до 14: у нейтрального
раствора рН равен 7, у кислого — менее 7, у щелочного — более 7.
Вторичная структура белка. Регулярная конформация остова полипептидной цепи.
Ген. Единица наследственного вещества, которая представлена в виде участка хромосомы, содержащей ДНК. Последняя кодирует первичную структуру
белка, тРНК или рРНК и регулирует транскрипцию таких последовательностей, обусловливая передачу генетической наследственной информации.
Гетеротроф. Организм, не способный синтезировать органические вещества
из неорганических, поэтому потребляет органику, образованную другими
растениями и животными [см. Автотроф].
Гиббереллины. Растительные гормоны, стимулирующие удлинение стебля
растения.
Гидролиз. Расщепление молекул сложных веществ на более простые под
действием воды и присоединения ионов Н+ и ОН~.
Гидрофобные взаимодействия. Связывание (сближение) неполярных групп
друг с другом в водных системах, обусловленное стремлением молекул
окружающей воды достичь наиболее стабильного состояния.
Гистоны. Группа из пяти основных белков, входящих в состав хромосом
всех эукариотических клеток. Гистоны образуют в комплексе с ДНК нуклеосомы — структурные единицы хроматина клеточных ядер.
Гликолиз. Анаэробный распад глюкозы с образованием двух молекул пирови-ноградной кислоты и двух молекул АТР.
Глобулярный белок. Белок, полипептидная цепь которого свернута в пространстве с образованием глобулы.
Гормон. Химическое вещество, синтезируемое в небольших количествах в
одной части организма, переносимое в другую его часть и оказывающее там
специфическое действие.
Дегидрогеназы. Ферменты, катализирующие перенос (удаление) и присоединение к субстрату двух атомов водорода.
Дезоксирибоза. Пятиуглеродный сахар, имеющий на один атом кислорода
меньше, чем рибоза; входит в состав ДНК.
Дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). Носитель генетической информации в клетке; состоит из цепей молекул, включающих фосфат, сахар дезоксирибозу, пу-риновые и пиримидиновые основания. Способна самоудваиваться и направлять синтез РНК.
89
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Денатурированный белок. Белок, утративший свою природную конформацию под воздействием какого-либо внешнего фактора, например при нагревании.
Дисахариды. Углеводы, состоящие из двух ковалентно связанных моносахаридов.
Дисульфидный мостик. Ковалентная поперечная связь между цистеиновыми остатками двух полипептидных цепей или двух участков одной полипептидной цепи.
Дыхание. Внутриклеточный процесс окисления молекул, в первую очередь
пи-рувата в цикле лимонной кислоты с вьщелением энергии. Полный распад
Сахаров и других органических молекул до диоксида углерода и воды называется аэробным дыханием, хотя начальные этапы этого процесса (гликолиз)
являются анаэробными.
Жирная кислота. Органическая кислота с длинной углеродной цепью (число атомов углерода более 6), как правило, неразветвленной.
Жиры. Обобщенное название веществ, являющихся сложными эфирами
глицерина и трех молекул жирных кислот (ацилов). Жидкие жиры называют
маслами.
Заменимые аминокислоты. Аминокислоты белков, которые могут синтезироваться организмом человека из более простых предшественников.
Изоэлектрическая точка. Значение рН, при котором растворенное вещество
не имеет суммарного электрического заряда.
Индолилуксусная кислота. Растительный гормон, ауксин, ИУК.
Йодное число. Количество мг йода, связываемое 100 г жира. Характеризует
степень непредельности жирных кислот, входящих в состав жира.
Каротиноиды. Жирорастворимые пигменты — желтые, красные и оранжевые каротины и желтые ксантофиллы, выполняющие функции вспомогательных пигментов при фотосинтезе. Образуются из изопреновых остатков. Являются провитаминами витамина А.
Кислотное число. Количество мг едкого кали, необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащееся в 1 г жира. Указывает
на количество свободных жирных кислот, оставшихся неиспользованными
при биосинтезе масла во время созревания семян, или начавшуюся порчу
масла.
Ковалентная связь. Химическая связь между атомами, возникающая за счет
образования общей пары электронов.
Копреципитат. Белковый продукт, полученный на основе комплексного
осаждения казеина и сывороточных белков.
Кофактор. Один или более небелковых компонентов, необходимых для течения ферментативной реакции; многие из кофакторов представляют ионы
металлов, другие называются коферментами.
Кофермент. Органическая молекула небелковой природы, выполняющая
вспомогательную функцию в ферментативных процессах; часто кофермент
является донором или акцептором электронов, например NAD+ и FAD, часто
кофермент в качестве составной части содержит витамин.
90
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Кофермент А (СоА). Кофермент, содержащий пантотеновую кислоту, выполняющую роль переносчика ацильных групп в ряде ферментативных реакций.
Крахмал. Нерастворимый полисахарид, состоящий из амилозы и амилопектина, включает более тысячи мономеров глюкозы; запасной углевод растений.
Кребса цикл. Цепь реакций, в ходе которых пировиноградная кислота окисляется с образованием диоксида углерода, водородных атомов (протонов) и
электронов; затем электроны проходят через систему электронпереносящих
молекул, цепь ферментов окислительного фосфорилирования и заключительную стадию окисления.
Лигнин. Компонент клеточной стенки растений; наиболее распространенный (после целюлозы) полимер, образующий клеточную стенку.
Липиды. Обширная группа неполярных органических соединений, нерастворимых в воде и хорошо растворимых в неполярных органических растворителях — гексане, диэтиловом эфире, бензине и др.
Макроэлементы. Неорганические химические элементы, необходимые в
больших количествах для роста растений; к ним относят N, К, Р, Са, Mg, S.
Металлофермент. Фермент, содержащий в качестве простетической группы
ион металла.
Микроэлементы. Неорганические химические элементы, необходимые растениям в малых количествах; к ним относятся Fe, Си, Mn, Zn, Mo, В, С1.
Моносахарид. Сахар, который не может быть гидролизован на более простые сахара.
Незаменимые аминокислоты. Аминокислоты, которые не могут синтезироваться организмом человека и должны поступать только с пищей.
Незаменимые жирные кислоты. Группа полиненасыщенных жирных кислот растительного происхождения, которые обязательно должны содержаться в пище человека.
Никотинамидадениндинуклеотид (NAD+). Кофермент, служащий акцептором электронов во многих окислительных реакциях, чаще всего связанных с
дыханием.
Никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP+). Отличается от NAD+
только наличием фосфатной группы.
Нуклеиновая кислота. Органическая кислота, состоящая из соединенных
между собой нуклеотидных остатков; известно два типа нуклеиновых кислот
— ДНК и РНК.
Нуклеотид. Структурный блок нуклеиновой кислоты, состоящий из остатка
фосфорной кислоты, пятиуглеродного сахара (рибозы или дезоксирибозы),
пури-новых или пиримидиновых оснований.
Окислительное фосфорилирование. Ферментативное образование АТР из
ADP и фосфата; осуществляется в митохондриях, сопряжено с переносом
электронов от субстрата к молекулярному кислороду.
Олигомерный белок. Белок, состоящий из двух или нескольких полипептидных цепей.
91
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оптимум рН. Значение рН, при котором фермент проявляет максимальную
активность.
Оптическая активность. Способность вещества вращать плоскость поляризованного луча света.
Пассивный транспорт. Перенос растворенных веществ через мембрану по
концентрационному или электрохимическому градиенту, не требующий затрат энергии.
Пептид. Две или более аминокислоты, соединенные пептидными связями.
Пептидная связь. Связь, образующаяся между карбоксильной группой одной аминокислоты и аминогруппой другой с выделением воды.
Переносчик электронов. Белок типа флавопротеинов или цитохромов, который способен приобретать или терять электроны, выполняя роль переносчика электронов от органических субстратов к кислороду.
Полисахарид. Полимер, состоящий из множества моносахаридов, соединенных гликозидными связями, например крахмал, целлюлоза.
Простетическая группа. Ион металла или термостабильное неорганическое
соединение (группа), связанные с белком-ферментом и выполняющие функцию его активного центра.
Простой белок. Белок, при гидролизе которого образуются только аминокислоты.
Сахароза. Дисахарид, состоящий из остатков глюкозы и фруктозы, является
транспортной формой углеводов, образующихся при фотосинтезе.
Сложный белок. Белок, содержащий в качестве простетической группы металл, органическое соединение или и то и другое.
Стероиды. Класс липидов, содержащих циклопентанфенантреновую кольцевую структуру.
Суберин. Жироподобное вещество, откладывающееся в клеточных оболочках.
Субстрат. Вещество, на которое действует фермент.
Терпен. Углеводород, состоящий из повторяющихся остатков изопрена.
Токоферолы. Группа соединений, представляющих собой формы витамина
Е.
Третичная структура белка. Пространственное расположение полипептидной цепи глобулярного белка в нативной свернутой форме.
Триацилглицерол. Сложный эфир глицерола с тремя молекулами жирных
кислот.
Трикарбоновых кислот цикл [см. Кребса цикл].
Трипсин. Протеолитический фермент, синтезируемый клетками поджелудочной железы в форме неактивного предшественника — трипсиногена; гидролизует полипептидные цепи белков по остаткам аминокислот лизина и аргинина.
Фермент. Биологический катализатор, обязательным структурным компонентом которого является белок.
92
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Фибриллярные белки. Нерастворимые белки, у которых полипептидная
цепь вытянута или скручена в продольном направлении; выполняют защитную структурную роль.
Флавинмононуклеотид (FMN). Рибофлавинфосфат, кофермент ряда окислительно-восстановительных ферментов.
Флавиновые нуклеотиды. Коферменты FAD и FMN, содержащие рибофлавин.
Фосфорилирование. Образование фосфатного производного молекулы за
счет переноса фосфатной группы от АТР.
Хлорофилл. Зеленый пигмент растительных клеток.
Хроматин. Нитевидный комплекс ДНК и белков, образующий основу хромосомы.
Хромосома. Одна большая молекула ДНК, ядерная структура, содержащая
гены.
Целлюлоза. Полисахарид, образованный микрофибриллами из линейно расположенных остатков глюкозы; является основным компонентом клеточной
оболочки растений.
Цитохром. Гемсодержащий белок, служащий переносчиком электронов при
дыхании и фотосинтезе.
Четвертичная структура белка. Пространственное расположение субъединиц олигомерного белка.
Денатурация- необратимые реакции осаждения с потерей первоначальных
свойств белка.
Число омыления. Количество мг едкого кали, необходимое для нейтрализации свободных и связанных с глицерином жирных кислот, содержащихся в 1 г жира. Характеризует среднюю величину молекулярного веса
триацилглицеринов, входящих в состав жира
93
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Список рекомендуемой литературы
а) Основная литература:
1. Новиков Н.Н. Биохимия растений. – М.: КолосС, 2010, – 679 с.
2. Жарова Т.В. Биохимия мяса и молока. – М.: Изд. РГАУ – МСХА
имени К.А.Тимирязева, 2005, – 283 с.
б) Дополнительная литература:
Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина,
2002, – 528 с.
Бриттон Г. Биохимия природных пигментов. – М.: Мир, 1986, –
422 с.
Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У.,Джонс К. Справочник биохимика. – М
.: Мир, 1991, – 453 с.
Запромётов М.Н. Фенольные соединения и их роль в жизни растений.
– М.: Наука, 1996, – 45 с.
5. Казаков Е.Д., Карпиленко Г.П. Биохимия зерна и хлебопродуктов. –
СПб.: Гиорд, 2005, – 510 с.
6. Кислухина О.В. Витаминные комплексы из растительного сырья. –
М.: ДеЛи принт, 2004, – 308 с.
7. Кретович В.Л. Биохимия растений. –М.: Высшая школа, 1986, –503 с.
8. Надиров Н.К. Токоферолы и их использование в медицине и сельском хозяйстве. – М.: Наука, 1991, – 336 с.
9. Панников В.Д., Минеев В.Г. Почва, климат, удобрение и урожай. –
М.: Агропромиздат, 1987, – 512 с.
10. Пищевая химия. Под ред. Проф. Нечаева П.А. – С.-Петербург: ГИОРД, 2001. – 486 с.
Плешков Б.П. Биохимия сельскохозяйственных растений. – М.: Агропромиздат, 1987, – 494 с.
11. Румянцев Е.В., Антина Е.В., Чистяков Ю.В. Химические основы
жизни. – М.: КолосС, 2007, – 560 с.
12. Румянцева Э.Р., Долматова И.Ю. Биохимия молока и мяса. – Уфа,
2002, – 160 с.
13. Савина О.В. Биохимия растениеводческой продукции. - Рязань, 2001,
- 110 с.
14. Скурихин И.М. Все о пище с точки зрения химика. – М.: Высшая
школа, 1991. – 228 с.
Татарченко И.И., Мохначёв И.Г., Касьянов Г.И. Химия субтропических и
пищевкусовых продуктов. – М.: Академия, 2003, – 256 с.
14. Щербаков В.Г., Лобанов В.П. Биохимия и товароведение масличного сырья. – М.: КолосС, 2003, – 360 с.
94
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
СОДЕРЖАНИЕ
Стр
ВВЕДЕНИЕ ………………………………………………………………….
Основные требования техники безопасности при выполнении
лабораторных работ по биохимии …………………………………………
Первая помощь при несчастных случаях………………………………….
3
ГЛАВА 1. ВИТАМИНЫ…………………………………………………….
1.1. Жирорастворимые витамины………………………………………..
1.1.1. Определение содержания каротина в растительном сырье
колориметрическим методом…………………………………..
1.2. Водорастворимые витамины ……………………………………….
1.2.1. Определение аскорбиновой кислоты ( витамина С )
в растительном сырье…………………………………………….
1.2.2. Определение содержания витамина Р в растительном сырье
6
6
4
5
6
10
10
14
ГЛАВА 2. ФЕРМЕНТЫ……………………………………………………...
2.1. Определение активности каталазы в зерновом сырье……………...
2.2. Изучение влияния количества пероксидазы на её активность…….
2.3. Определение активности амилолитических ферментов
в различном сырье……………………………………………………..
2.4. Определение оптимальных условий действия амилолитических ферментных препаратов ……………………………………………..
2.5. Определение активности липаз в семенах злаковых и масличных
культур…………………………………………………………………
16
17
20
ГЛАВА 3. УГЛЕВОДЫ……………………………………………………...
3.1. Моносахариды……………………………………………………..
3.1.1. Определение глюкозы в картофеле йодометрическим методом
3.2. Полисахариды………………………………………………………
3.2.1. Определение происхождения растительного крахмала………..
33
34
34
37
37
3.2.2. Выделение и количественное определение растворимого
пектина…………………………………………………………….
22
26
30
39
ГЛАВА 4. ОРГАНИЧЕСКИЕ АЗОТИСТЫЕ ВЕЩЕСТВА РАСТЕНИЙ...
4.1. Аминокислоты………………………………………………………..
43
43
4.1.1. Определение свободных аминокислот а растительном сырье
методом формального титрования……………………………….
44
4.2. Белки…………………………………………………………………...
48
95
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4.2.1. Выделение отдельных белковых фракций из семян бобовых
и масличных культур………………………………………………
49
4.2.2. Выделение белков из зерна злаков и изучение их свойств………
4.2.3. Изучение и количественное определение белков в молоке………
4.2.4. Дестабилизация мицелл казеина……………………………………...
4.2.5. Количественное определение альбумина в молоке……………….
51
55
59
61
4.2.6. Влияние кислотности на устойчивость белков молока…………
4.2.7. Выделение белков из мышечной ткани и изучение их свойств
62
64
ГЛАВА 5. ЛИПИДЫ…………………………………………………………
68
5.1. Определение сырого жира в масличном сырье……………………..
69
5.2. Определение жировых чисел растительных масел…………………
5.3.Определение перекисного числа животного жира ………………….
72
78
ГЛАВА 6. МЕТАБОЛИТЫ ВТОРИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ………
81
6.1. Определение содержания таннина в чае……………………………..
82
ГЛАВА 7. ДЫХАНИЕ………………………………………………………
84
Исследование зависимости интенсивности дыхания
от температуры……………………………………………………..
КРАТКИЙ СЛОВАРЬ БИОХИМИЧЕСКИХ ТЕРМИНОВ
85
88
Список рекомендуемой литературы ……………………………………..
94
7.1.
96
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Сведения об авторах
Савина Ольга Васильевна
доктор сельскохозяйственных наук, профессор кафедры товароведения и
экспертизы товаров Рязанского государственного агротехнологического университета имени П. А. Костычева
Емельянова Анна Сергеевна
кандидат биологических наук, доцент кафедры технологии производства и
переработки продукции животноводства Рязанского государственного агротехнологического университета имени П. А. Костычева.
97
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать ризографическая.
Усл. печ. л.6,1 Тираж 40 экз. Заказ № 430
Федеральное государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Рязанский государственный агротехнологический университет
имени П.А. Костычева
390044 г. Рязань, ул. Костычева, 1
Отпечатано в издательстве учебной литературы и
учебно-методических пособий
ФГОУ ВПО РГАТУ
390044 г. Рязань, ул. Костычева, 1
98
Документ
Категория
Химические науки
Просмотров
527
Размер файла
945 Кб
Теги
биохимии, практикум, сельскохозяйственных, продукции, 1690
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа