close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

2379.Биохимия

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Оренбургский государственный университет»
А.В. Шамраев
БИОХИМИЯ
Рекомендовано
Ученым
советом
федерального
государственного
бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального
образования «Оренбургский государственный университет» в качестве
учебного пособия для студентов, обучающихся по программам высшего
профессионального образования по направлению подготовки 020400.62
Биология
Оренбург
2014
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
УДК 577.1(075.8)
ББК 28.072я73
Ш 19
Рецензент – профессор, доктор биологических наук Лебедев С.В.
Шамраев, А.В.
Ш 19 Биохимия : учебное пособие/ А.В. Шамраев; Оренбургский гос. ун-т. –
Оренбург : ОГУ, 2014. – 186 с.
Учебное пособие состоит из разделов, которые включают
теоретические знания, задания и руководство к выполнению
практических работ, которые позволяют расширить знания по
теоретическому курсу и приобрести навыки экспериментальных
исследований.
Учебное пособие предназначено для выполнения практических
работ по дисциплине «Биохимия» для студентов направления
подготовки 020400.62 Биология.
УДК 577.1(075.8)
ББК 28.072я73
© Шамраев А.В., 2014
© ОГУ, 2014
2
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Содержание
Введение…………………………………………………………………………6
1 Введение к работе в биохимической лаборатории ………………………...7
1.1 Техника безопасности при работе в биохимической лаборатории……..7
1.2 Работа со щелочами, кислотами и прочими
сильнодействующими и ядовитыми реактивами ………………………………8
2 Аминокислоты и белки ……………………………………………………..10
2.1 Классификация аминокислот ……………………………………………...11
2.2 Кислотно-основные свойства ……………………………………………..14
2.3 Стереохимия аминокислот ………………………………………………..17
2.4 Физико-химические свойства белков …………………………………….19
2.5 Хроматография аминокислот на бумаге ………………………………..33
2.6 Биуретовая реакция (Пиотровского) ……………………………………35
2.7 Реакция осаждения белков при нагревании ……………………………38
2.8 Осаждение белков органическими растворителями …………………..40
3 Фосфопротеины …………………………………………………………….42
3.1 Гидролиз казеина и открытие в гидролизате
белкового компонента и фосфорной кислоты ………………………..……..43
4 Гликопротеины ………………………………………………………..…….45
4.1 Выделение муцина из слюны и реакция на его белковую часть
(биуретовая реакция) и углеводную группировку
(нафтоловая проба) …………………………………..………………………..52
4.2 Реакция Адамкевича …………………………………………………..…..54
5 Ферменты …………………………………………………………………….56
5.1 Горизонты энзимологии ……………………………………………………61
5.2 Гидролиз крахмала α-амилазой слюны ………………………………….90
5.3 Термолабильность α-амилазы слюны ……………………………………93
5.4 Специфичность α-амизы слюны и сахарозы дрожжей …………………95
5.5 Влияние рН на активность α-амилазы слюны (определение
оптимума рН для действия амилазы)………………………………………...98
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5.6 Влияние активаторов и ингибиторов на активность
α-амилазы слюны ……………………………………………………………..99
5.7 Определение активности α-амилазы слюны по Вольгмуту …………..101
6 Витамины …………………………………………………………………...103
6.1 Реакция восстановления витамина В2 ………………………………….112
6.2 Реакция витамина В6 с хлорным железом ……………………………...113
6.3 Качественная реакция на никотиновую кислоту
с уксусной медью ……………………………………………………………114
6.4 Количественное определение аскорбиновой кислоты в продуктах
(шиповнике, хвое, картофеле, капусте, молоке)
с 2,6-дихлорфенолиндофенол ……………………………………………….115
6.4.1 Определение витамина С в шиповнике и хвое ………………………117
6.4.2 Определение витамина С в картофеле ……………………………….118
6.4.3 Определение витамина С в капусте …………………………………..118
6.4.4 Определение витамина С в молоке …………………………………..119
6.5 Открытие витамина А в рыбьем жире с
концентрированной серной кислотой ……………………………………...120
6.6 Обнаружение витамина D в рыбьем жире с
анилиновым реактивом ……………………………………………………...121
6.7 Качественная реакция на витамин Е с концентрированной
азотной кислотой …………………………………………………………….121
6.8 Качественная реакция на витамин К …………………………………...123
7 Гормоны …………………………………………………………………….123
7.1 Качественная реакция на адреналин с хлорным железом ……………135
7.2 Диазореакция на эстрон (фолликулин) ………………………………...136
8 Взаимосвязь обменных процессов ………………………………………..137
8.1 Гликогенолиз под влиянием ферментов мышечной ткани ….………..146
8.2 Спиртовое брожение глюкозы…………………………………………..149
8.3 Проба Гайнеса ……………………………………………………………152
8.4 Открытие непредельных жирных кислот в жире ……………………...153
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8.5 Эмульгирование жиров ………………………………………………….154
8.6 Влияние желчных кислот на активность
панкреатической липазы …………………………………………………….156
8.7 Переваривание белков пепсином ……………………………………….159
8.8 Определение активности аланинаминотрансферазы в сыворотки
крови динитрофенигидрозиновым методом
(метод Райтмана и Френкеля) ………………………………………………...162
Список использованных источников ………………………………………...167
Приложение А Инструкции приготовления рабочих реактивов…………....168
5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Введение
Биохи́мия (биологи́ческая, или физиологи́ческая хи́мия) — наука о
химическом составе живых клеток и организмов и о химических процессах,
лежащих в основе их жизнедеятельности. Термин "биохимия" эпизодически
употреблялся с середины XIX века, но в классическом смысле он был
предложен и введен в научную среду в 1903 году немецким химиком
Карлом Нейбергом (Carl Neuberg).
Биохимия находится на стыке нескольких наук, прежде всего —
биологии и химии.
Возникнув как наука о химии жизни в конце XIX век, чему
предшествовало
бурное
развитие
органической
химии,
биохимия
отличается от органической химии тем, что исследует только те вещества и
химические реакции, которые имеют место в живых организмах, прежде
всего в живой клетке. Согласно этому определению, биохимия охватывает
также многие области клеточной биологии и включает в себя молекулярную
биологию. После выделения последней в особую дисциплину, размежевание
между биохимией и молекулярной биологией в основном сформировалось
как методологическое и по предмету исследования. Молекулярные биологи
преимущественно
работают
с
нуклеиновыми
кислотами,
изучая
их
структуру и функции, в то время как биохимики сосредоточились на белках,
в особенности на ферментах, катализирующих биохимические реакции.
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1 Введение к работе в биохимической лаборатории
1.1.
Техника
безопасности
при
работе
в
биохимической
лаборатории
Прежде чем приступить к самостоятельной работе необходимо знать
некоторые обязательные правила, чтобы усвоить специфику биохимических
анализов, избежать несчастных случаев, возможных при работе с ядовитыми и
взрывчатыми веществами, концентрированными кислотами и щелочами.
Все работы в лаборатории проводить в рабочей одежде — халате. При
пользовании реактивами обращать внимание на надписи на этикетке. Не
пробовать на вкус или на ощупь неизвестные вещества. Не производить
смешивания веществ, результаты реакций между которыми неизвестны.
Работу с выделением ядовитых газов и с сильно пахнущими веществами
производить в вытяжном шкафу. Не следует вдыхать выделяющиеся газы
непосредственно из пробирки или направлять их в лицо. Ввиду того, что
водород, метан, этилен и ацетилен образуют с воздухом взрывчатые смеси,
нельзя поджигать их у отверстия газоотводной трубки, не убедившись
предварительно, что воздух полностью вытеснен из пробирки. Не
принимать
пищу
на
рабочем
месте
и
во
время
работы.
При
возникновении пожара в лаборатории тушить его, прикрыв пламя
тряпкой, асбестовым одеялом или засыпав песком. Ящики с песком
должны быть в каждой лаборатории. Знать места
расположения
огнетушителей. После работы поставить все реактивы на место, вымыть
посуду, убрать рабочий стол. В конце работы обязательно вымыть руки.
Любая
работа
заканчивается
протоколированием
произведенных исследований.
7
результатов
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1.2
Работа
со
щелочами,
кислотами
и
прочими
сильнодействующими и ядовитыми реактивами
В биохимических исследованиях растворы веществ готовят, используя
обычную стеклянную химическую посуду — мерные стаканы, цилиндры,
колбы. При выполнении биохимических анализов небольшие объемы
растворов
отмеривают
мерными
пипетками.
До
недавнего
времени
использовали стеклянные пипетки. Растворы в них насасывали ртом или
резиновым баллоном. В настоящее время чаще всего используют более
безопасные автоматические пипетки, (рисунок 1)
Рисунок 1 – Автоматическая пипетка с набором наконечников
Они работают по принципу поршневого насоса. Сама пипетка
представляет
собой
ручку,
заканчивающуюся
штоком,
на
который
надеваются сменные наконечники для жидкости. Сверху в ручку входит
толкатель поршня с операционной кнопкой. Большим пальцем нажимают на
операционную кнопку, опуская толкатель поршня внутрь ручки. При
этом в ручке сжимается пружина. Затем пипетку с наконечником
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
погружают в раствор и плавно отпускают толкатель поршня вверх в
исходное положение. Он выталкивается под действием пружины в ручке.
Происходит насасывание раствора в наконечник. Набранный раствор
переносят в соответствующую пробирку и выливают, нажимая до упора
толкатель поршня
Автоматические
мерные
пипетки
бывают
с
фиксированным
и
регулируемым объемом, в пределах от 0,5 до 5000 микролитров (0,0005—5,0мл).
Соответственно этому и наконечники пипеток разные (см. рисунок 1). У
регулируемых
пипеток
необходимый
объем
всасываемой
жидкости
устанавливается вращением операционной кнопки или шкалы в зависимости
от конструкции. При этом в специальном окне появляются цифры
необходимого объема. Наконечники пипеток вставляются вручную, а
снимаются либо вручную либо с помощью специального удалителя, входящего
в конструкцию пипетки (см. рисунок 1). Наконечники пипеток обычно
используют как одноразовое расходуемое оснащение, однако их можно
стерилизовать кипячением и применять многократно. Автоматические пипетки
обеспечивают
наибольшую
безопасность
при
работе
с
растворами,
содержащими кислоты, щелочи, ядовитые, радиоактивные вещества, а также
возбудителей опасных инфекций.
Независимо от типа используемой химической посуды и пипеток при
работе с сильно действующими реактивами необходимо придерживаться
следующих правил.
1. Набирать реактивы пипеткой из бутыли только в том случае, если
сосуд наполнен не меньше чем наполовину.
2. При заборе реактива погружать пипетку до самого дна склянки,
летучие кислоты не насасывать ртом, а пользоваться баллоном или
автоматической пипеткой.
3. Во время заполнения пипетки не отвлекаться — смотреть только на
пипетку.
4. После отмеривания реактива не класть использованную пипетку на
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
стол, а опустить ее в сосуд для промывания.
5. Все
работы
с
использованием
кислот,
щелочей
и
других
сильнодействующих реактивов производить чрезвычайно осторожно и
внимательно.
6. Если реактив попадает в рот или на кожу, промывать пораженное
место водой, а затем нейтрализовать 3 % раствором соды в случае кислоты
или 3 % раствором уксусной кислоты в случае щелочи.
7. Если реактивы прольются на стол, нейтрализовать кислоту содой, а
щелочь уксусной кислотой, а затем вымыть стол водой.
2 Аминокислоты и белки
Все встречающиеся в природе аминокислоты обладают общим
свойством – амфотерностью (от греч. amphoteros – двусторонний), т.е.
каждая аминокислота содержит как минимум одну кислотную и одну
основную группы. Общий тип строения α-аминокислот может быть
представлен в следующем виде (рисунок 2):
Рисунок 2 – Схематический вид аминокислоты
Как видно из общей формулы, аминокислоты будут отличаться друг от
друга химической природой радикала R, представляющего группу атомов в
молекуле
аминокислоты,
связанную
с
α-углеродным
атомом
и
не
участвующую в образовании пептидной связи при синтезе белка. Почти все
α-амино- и α-карбоксильные группы участвуют в образовании пептидных
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
связей белковой молекулы, теряя при этом свои специфические для
свободных
аминокислот
кислотно-основные
свойства.
Поэтому
все
разнообразие особенностей структуры и функции белковых молекул связано
с химической природой и физико-химическими свойствами радикалов
аминокислот. Именно благодаря им белки наделены рядом уникальных
функций, не свойственных другим биополимерам, и обладают химической
индивидуальностью.
2.1 Классификация аминокислот
Классификация аминокислот разработана на основе химического
строения радикалов, хотя были предложены и другие принципы. Различают
ароматические и алифатические аминокислоты, а также аминокислоты,
содержащие серу или гидроксильные группы. Часто классификация основана
на природе заряда аминокислоты. Если радикал нейтральный (такие
аминокислоты содержат только одну амино- и одну карбоксильную группы),
то они называются нейтральными аминокислотами. Если аминокислота
содержит избыток амино- или карбоксильных групп, то она называется
соответственно основной или кислой аминокислотой.
Современная рациональная классификация аминокислот основана на
полярности радикалов (R-групп), т.е. способности их к взаимодействию с
водой при физиологических значениях рН (близких к рН 7,0). Различают 5
классов аминокислот, содержащих следующие радикалы:
неполярные (гидрофобные, рисунок 3);
полярные (гидрофильные, рисунок 4);
ароматические (большей частью неполярные, рисунок 5);
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
отрицательно заряженные (рисунок 6);
положительно заряженные (рисунок 7).
Рисунок 3 – Неполярные, R-группы
Рисунок 4 – Полярные, незаряженные R-группы
Рисунок 5 – Отрицательно заряженные R-группы
12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 6 – Положительно заряженные R-группы
Рисунок 7 – Ароматические R-группы
Перечисленные аминокислоты присутствуют в разных количественных
соотношениях и последовательностях в тысячах белков, хотя отдельные
индивидуальные белки не содержат полного набора всех этих аминокислот.
Помимо наличия в большинстве природных белков 20 аминокислот, в
некоторых белках обнаружены производные аминокислот: оксипролин,
оксилизин, дийодтирозин, фосфосерин и фосфотреонин (см. рисунок 8):
Рисунок 8 – Производные аминокислот
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Первые две аминокислоты содержатся в белке соединительной ткани –
коллагене,
а
дийодтирозин
является
основой
структуры
гормонов
щитовидной железы. В мышечном белке миозине обнаружен также
ε-N-метиллизин; в состав протромбина (белок свертывания крови) входит
γ-карбоксиглутаминовая
кислота,
а
в
глутатионпероксидазе
открыт
селеноцистеин, в котором ОН-группа серина заменена на селен Se
(см. рисунок 8):
Рисунок 9 – Модификации аминокислот
Помимо указанных, ряд α-аминокислот выполняет важные функции в
обмене веществ, хотя и не входит в состав белков, в частности орнитин,
цитруллин,
гомосерин,
гомоцистеин,
цистеинсульфиновая кислота,
диоксифенилаланин и др.
2.2 Кислотно-основные свойства
Эти свойства аминокислот определяют многие физико-химические и
биологические свойства белков. На этих свойствах основаны, кроме того,
почти все методы выделения и идентификации аминокислот. Аминокислоты
легко растворимы в воде. Они кристаллизуются из нейтральных водных
растворов в форме биполярных (амфотерных) ионов (цвиттерионов), а не в
виде недиссоциированных молекул (последнюю структуру приводят для
удобства представления, однако все аминокислоты при физиологических
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
значениях рН имеют структуру цвиттериона, (см. рисунок 10)
Рисунок 10 – Структура цвиттерион
При растворении в воде кристаллическая аминокислота, например
аланин, может реагировать или как кислота (донатор протона),или как
основание (акцептор протона).
Если радикалы аминокислот нейтральные, то они почти не оказывают
влияния на диссоциацию α-карбоксильной группы или α-аминогруппы, и
величины рК (отрицательный логарифм константы диссоциации) остаются
относительно постоянными. Вследствие этого кривые диссоциации почти
всех нейтральных аминокислот накладываются друг на друга и могут быть
рассмотрены на примере аланина. Если к раствору аланина (например, 0,1 М)
в воде постепенно прибавлять сильную кислоту (0,1 М раствор НСl) или
сильную щелочь (0,1 М раствор NaOH), то получим кривую титрования
аланина, типичную для всех нейтральных аминокислот.
Кажущиеся величины рК' для α-карбоксильной группы и α-аминогрупп
(т.е. значения рН, при которых эти группы в среднем наполовину
диссоциированы) довольно сильно различаются, составляя pK1 = 2,34 и рК2 =
9,69. При низком значении рН (ниже pK1') почти все молекулы аланина
являются полностью протонированными и несут положительный заряд.
Другими словами, при высокой концентрации водородных ионов в растворе
тенденция к диссоциации водорода из структуры аланина оказывается
незначительной. Из кривой титрования видно, что точка перехода между
ветвями кривой располагается при рН 6,02. Это означает, что при данном
значении рН суммарный (или средний) электрический заряд молекулы
аланина равен нулю и она не перемещается в электрическом поле ни к аноду,
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ни к катоду (изоэлектрическое состояние). Такое значение рН получило
название изоэлектрической точки уравнение (1) и обозначается pI.
Изоэлектрическая точка аминокислот, не содержащих дополнительных NH2или СООН-групп, представляет собой среднее арифметическое между двумя
значениями рК:
pI = (pKCOOH + pKNH2) / 2
(1)
Изоэлектрическая точка ряда других аминокислот, содержащих
дополнительные
кислотные или основные
группы (аспарагиновая
и
глутаминовая кислоты, лизин, аргинин, тирозин и др.), зависит, кроме того,
от кислотности или основности радикалов этих аминокислот. Для лизина,
например, рI должна вычисляться из полусуммы значений рК' для α- и ε-NН2групп. Таким образом, в интервале рН от 4,0 до 9,0 почти все аминокислоты
существуют преимущественно в форме цвиттерионов с протонированной
аминогруппой и диссоциированной
карбоксильной группой.
Следует
отметить, что при физиологических значениях рН тканей и крови (7,1 и 7,4
соответственно) аминокислоты (за ислючением гистидина) не обладают
измеримой буферной емкостью. Эту способность они приобретают только
при значениях рН, близких к величинам их рК (т.е. при рН 1,7-3,2 и 8,6-10,8).
Рисунок 11 – Кривые, полученные при титровании 0,1 М раствора
аланина 0,1 М раствором НСl (а) и 0,1 М раствором NaOH (б).
16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2.3 Стереохимия аминокислот
Важнейшим свойством аминокислот, освобождающихся в процессе
гидролиза природных белков в условиях, исключающих рацемизацию,
является их оптическая активность. Будучи растворенными в воде (или в
НСl), они способны вращать плоскость поляризованного луча (исключение
составляет глицин). Это свойство связано с наличием в молекуле всех
природных
аминокислот
(за
ислючением
глицина)
в
α-положении
асимметрического атома углерода (т. е. атома углерода, все четыре
валентные связи которого заняты различными заместителями). Величины
удельного
вращения
вправо
или
влево
являются
количественной
характеристикой оптической активности, и для большинства аминокислот
[а]2р составляет от 10° до 30°. Примерно половина аминокислот белков
оказалась правовращающей, их обозначают знаком «+» (Ала, Иле, Глу, Лиз и
др.), а чуть меньше половины - левовращающей (Фен, Трп, Лей и др.), их
обозначают знаком «–». Все эти аминокислоты принадлежат к L-ряду, а
величина и знак оптического вращения зависят от природы радикалов
аминокислот и значения рН раствора, в котором измеряют оптическое
вращение.
Стереохимию аминокислот принято оценивать не по оптическому
вращению, а исходя из абсолютной конфигурации всех четырех замещающих
групп, расположенных вокруг асимметрического атома углерода в вершинах
модели тетраэдра. Абсолютную конфигурацию аминокислот принято
соотносить стереохимически с соединением, произвольно взятым для
сравнения, а именно с глицериновым альдегидом, также содержащим
асимметрический атом углерода. Ниже представлены L- и D-стереоизомеры
глицеринового альдегида. Рядом показаны пространственные конфигурации
L-и D-аланина (см. рисунок 12):
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 12 – L- и D-стереоизомеры
Все аминокислоты, образующиеся при гидролизе природных белков в
условиях, исключающих рацемизацию, принадлежит к L-ряду. Таким
образом, природные аминокислоты имеют пространственное расположение,
аналогичное конфигурации L-глицеринового альдегида. Следует еще раз
подчеркнуть, что символы L и D означают принадлежность данной
аминокислоты по своей стереохимической конфигурации к L- или D-ряду, в
то время как знак «+» или «–» указывает на направление изменения
плоскости поляризации светового луча. Среди белковых аминокислот
имеются две аминокислоты (треонин и изолейцин), которые содержат по два
асимметрических атома углерода. Следовательно, если не в природе, то, во
всяком случае, в лаборатории возможно получить четыре стереоизомерные
формы этих аминокислот . Для треонина известны все четыре изомера. Если
условно обозначить символом L выделенный из природных белков треонин,
то его зеркальное отображение называют D-треонином. Два других изомера,
получивших наименование диастереоизомеров, или аллоформ, также могут
иметь
L-
и
D-формы.
Структурные
конфигурации
всех
четырех
стереоизомеров треонина можно представить следующими формулами
(см. рисунок 13):
Рисунок 13 – Стереоизомеры треонина
18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Как отмечалось, в белковой молекуле D-аминокислоты не обнаружены,
однако в живой природе они широко распространены.
Так,
D-изомеры
глутаминовой
кислоты,
аланина,
валина,
фенилаланина, лейцина и ряда других открыты в клеточной стенке бактерий;
в
составе
некоторых
бацитрацина,
антибиотиков,
грамицидинов
А
и
S,
в
частности
содержатся
актиномицинов,
аминокислоты
D-
конфигурации.
На долю дикарбоновых аминокислот и их амидов в большинстве
белков приходится до 25 %–27 % всех аминокислот. Эти же аминокислоты
вместе с лейцином и лизином составляют около 50 % всех аминокислот. В то
же время на долю таких аминокислот, как цистеин, метионин, триптофан,
гистидин, приходится не более 1,5 %–3,5 %. В протаминах и гистонах
отмечено высокое содержание основных аминокислот аргинина и лизина,
соответственно 26,4 % и 85,2 %.
2.4 Физико-химические свойства белков
Наиболее характерными физико-химическими свойствами белков
являются
высокая
вязкость
растворов,
незначительная
диффузия,
способность к набуханию в больших пределах, оптическая активность,
подвижность в электрическом поле, низкое осмотическое давление и высокое
онкотическое давление, способность к поглощению УФ-лучей при 280 нм
(это
свойство,
обусловленное
наличием
в
белках
ароматических
аминокислот, используется для количественного определения белков).
Белки, как и аминокислоты, амфотерны благодаря наличию свободных
NH2- и СООН - групп. Для них характерны все свойства кислот и оснований.
В зависимости от реакции среды и соотношения кислых и основных
19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
аминокислот белки в растворе несут или отрицательный, или положительный
заряд, перемещаясь к аноду или катоду. Это свойство используется при
очистке белков методом электрофореза.
Белки обладают явно выраженными гидрофильными свойствами.
Растворы белков имеют очень низкое осмотическое давление, высокую
вязкость и незначительную способность к диффузии. Белки способны к
набуханию в очень больших пределах. С коллоидным состоянием белков
связан ряд характерных свойств, в частности явление светорассеяния,
лежащее
в
основе
количественного
определения
белков
методом
нефелометрии. Этот эффект используется, кроме того, в современных
методах микроскопии биологических объектов. Молекулы
белка не
способны проникать через полупроницаемые искусственные мембраны
(целлофан, пергамент, коллодий), а также биомембраны растительных и
животных тканей, хотя при органических поражениях, например, почек
капсула
почечного
клубочка
(Шумлянского-Боумена)
становится
проницаемой для альбуминов сыворотки крови и последние появляются в
моче.
Белки относятся к высокомолекулярным соединениям, в состав
которых
входят
сотни
и
даже
тысячи
аминокислотных
остатков,
объединенных в макромолекулярную структуру. Молекулярная масса белков
колеблется от 6000 (нижний предел) до 1000000 и выше в зависимости от
количества отдельных полипептидных цепей в составе единой молекулярной
структуры белка. Такие полипептидные цепи получили название субъединиц.
Их мол. масса варьирует в широких пределах – от 6000 до 100000 и более.
Аминокислотный состав и последовательность аминокислот выяснены
для многих тысяч белков. В связи с этим стало возможным вычисление их
молекулярной массы химическим путем с высокой точностью. Однако для
огромного количества встречающихся в природе белков химическое
строение
не
выяснено,
поэтому
основными
20
методами
определения
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
молекулярной
массы
все
(гравиметрические,
еще
остаются
физико-химические
осмометрические,
методы
вискозиметрические,
электрофоретические, оптические и др.). На практике наиболее часто
используются методы седиментационного анализа, гель-хроматография и
гель-электрофорез. Определение молекулярной массы белков методами
седиментационного анализа проводят в ультрацентрифугах, в которых
удается создать центробежные ускорения (g), превышающие в 200000 и
более раз ускорение земного притяжения. Обычно вычисляют молекулярную
массу по скорости седиментации молекул белка или седиментационному
равновесию. По мере перемещения молекул от центра к периферии
образуется
резкая
граница
растворитель-белок
(регистрируется
автоматически). Оптические свойства растворителя и белка используются
при определении скорости седиментации; последнюю выражают через
константу седиментации S уравнение (2), которая зависит как от массы, так и
от формы белковой частицы:
,
(2)
где v – скорость перемещения границы растворитель-белок, см/с;
ω – угловая скорость ротора, рад/с;
r – расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белка.
Константа седиментации имеет размерность времени (ее выражают в
секундах). Величина константы седиментации, равная 1•10–13 с, условно
принята за единицу и названа сведбергом (S). Значения констант
седиментации большинства белков лежат в пределах 1–50 S, хотя в ряде
случаев эти значения превышают 100 S.
Для
вычисления
седиментации,
молекулярной
необходимы
массы
дополнительные
М,
помимо
сведения
растворителя и белка и другие согласно уравнению Сведберга:
21
о
константы
плотности
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
,
(3)
где R – газовая постоянная, R=8,314 Дж/(К•моль);
Т – абсолютная температура (по шкале Кельвина);
s – константа седиментации;
ρ – плотность растворителя;
v – парциальный удельный объем молекулы белка;
D – коэффициент диффузии.
Определение
молекулярной
ультрацентрифугирования
требует
массы
много
белков
времени
и
методом
сложной
и
дорогостоящей аппаратуры. Поэтому в последние годы разработаны два
более
простых
использовании
метода
(гель-хроматография
гель-хроматографии
в
и
первую
электрофорез).
очередь
При
требуется
откалибровать колонку. Для этого через колонку с сефадексом пропускают
несколько белков с известными молекулярными массами и строят график,
откладывая
значения
логарифмов
молекулярной
массы
против
их
элюционных объемов, которые находят, как показано на рисунке 14.
Известно, что между логарифмом молекулярной массы белка,
имеющего сферическую форму, и элюционным объемом существует прямая
зависимость. Поэтому легко определить молекулярную массу исследуемого
белка, зная его объем элюции. Второй разновидностью этого метода является
тонкослойная гель-хроматография. Длина пробега белка (в миллиметрах)
через тонкий слой сефадекса находится в логарифмической зависимости от
молекулярной массы белка (см. рисунок 15).
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 14 – Измерение объема элюции (VЭ).
1 - рибонуклеаза; 2 - химотрипсиноген; 3 –яичный альбумин; 4 –
сывороточный альбумин; 5 - γ-глобулин; Х – белок с неизвестной
молекулярной массой.
Рисунок 15 – Зависимость между длиной пробега белковых частиц при
гель-хроматографии в тонком слое сефадекса Г-150 (сверхтонкого) и их
молекулярными массами (в полулогарифмической системе координат)
Гель-хроматография,
кроме
простоты
и
быстроты,
имеет
дополнительное преимущество: не требуется выделять белок в чистом виде,
так как примеси других белков не мешают определению, поскольку каждый
из
них проходит
определяемой
через
колонку со свойственной
молекулярной
массой.
Это
ему скоростью,
обстоятельство
широко
используется в энзимологии, когда оказывается возможным определение
молекулярной массы даже очень небольшого количества фермента в
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
присутствии других белков, не обладающих аналогичной каталитической
активностью.
При использовании диск-электрофореза в полиакриламидном геле для
определения молекулярной массы белков также строят график зависимости
между
логарифмом
молекулярной
массы
калибровочных
белков
и
подвижностью белковых частиц в полиакриламидном геле, а затем,
определив подвижность исследуемого белка, по графику находят его массу
(см. рисунок 16). Электрофорез проводят в присутствии детергента
додецилсульфата натрия, так как только в этом случае наблюдается прямая
пропорциональная
зависимость
между
молекулярной
массой
и
подвижностью белков. Белки с четвертичной структурой при этих условиях
распадаются на субъединицы, поэтому метод находит широкое применение
для определения молекулярной массы субъединиц белка.
1 – сывороточный альбумин; 2 – яичный альбумин; 3 - пепсин; 4 химотрипсиноген; 5 - миоглобин; 6 - цитохром с; Х – белок с неизвестной
молекулярной массой.
Рисунок
относительной
16
–
Зависимость
подвижностью
полиакриламидном
геле
в
между
белка
присутствии
полулогарифмической системе координат)
24
при
молекулярной
массой
диск-электрофорезе
додецилсульфата
натрия
и
в
(в
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Недавно
предложен
новый
масспектрометрический
метод
(так
называемый лазерный десорбционно-ионизационный метод), позволяющий
определять
молекулярную
массу
небольших
пептидов
(вазопрессин,
инсулин) и крупных биополимерных молекул и, кроме того, структуру
биомолекул.
О величине и форме белковых молекул раньше судили по данным
ультрацентрифугирования, двойного лучепреломления и диффузии. Эти
данные указывали на существование в природе глобулярных (шарообразных)
и
фибриллярных (нитевидных)
белков.
В
настоящее
время
общие
представления о форме белковых молекул в основном подтвердились, однако
только современные методы исследования позволили установить детали
пространственной конфигурации (трехмерной структуры) белковых молекул.
Благодаря применению сканирующей микроскопии и рентгеноструктурного
анализа (высокое разрешение, порядка от 0,2 до 0,3 нм) удалось в деталях
расшифровать не только полную пространственную структуру, форму, но и
степень асимметрии белковых молекул во всех трех измерениях. Оказалось,
что даже глобулярные белки крови (гемоглобин, альбумины и глобулины)
являются асимметричными в указанных измерениях. Следует отметить, что
не только физико-химические, но и биологические свойства белков (в
свободном или в связанном друг с другом или с другими биополимерами
состоянии) определяются их пространственной структурой.
Природные белковые тела наделены определенной, строго заданной
пространственной конфигурацией и обладают рядом характерных физикохимических и биологических свойств при физиологических значениях
температуры и рН среды. Под влиянием различных физических и
химических факторов белки подвергаются свертыванию и выпадают в
осадок, теряя нативные свойства. Таким образом, под денатурацией следует
понимать нарушение общего плана уникальной структуры нативной
молекулы белка, преимущественно ее третичной структуры, приводящее к
25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
потере характерных для нее свойств (растворимость, электрофоретическая
подвижность, биологическая активность и т.д.). Большинство белков
денатурирует при нагревании их растворов выше 50 °С – 60 °С.
Внешние проявления денатурации сводятся к потере растворимости,
особенно в изоэлектрической точке, повышению вязкости белковых
растворов, увеличению количества свободных функциональных SH-групп и
изменению характера рассеивания рентгеновских лучей (см. рисунок 17).
Наиболее характерным признаком денатурации является резкое снижение
или полная потеря белком его биологической активности (каталитической,
антигенной или гормональной). При денатурации белка, вызванной 8М
мочевиной или другим агентом, разрушаются в основном нековалентные
связи (в частности, гидрофобные взаимодействия и водородные связи).
Дисульфидные
связи
в
присутствии
восстанавливающего
агента
меркаптоэтанола разрываются, в то время как пептидные связи самого остова
полипептидной цепи не затрагиваются. В этих условиях развертываются
глобулы
нативных
белковых
молекул
и
образуются
случайные
и
беспорядочные структуры.
а - исходное состояние; б - начинающееся обратимое нарушение
молекулярной структуры; в - необратимое развертывание полипептидной
цепи.
Рисунок 17 – Денатурация белковой молекулы (схема)
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
При
непродолжительном
денатурирующих
агентов
действии
возможна
и
быстром
ренатурация
белка
удалении
с
полным
восстановлением исходной трехмерной структуры и нативных свойств его
молекулы, включая биологическую активность (см. рисунок 18). Таким
образом,
при
денатурации
белковая
молекула
полностью
теряет
биологические свойства, демонстрируя тем самым тесную связь между
структурой и функцией. Для практических целей иногда используют процесс
денатурации в «мягких» условиях, например при получении ферментов или
других биологически активных белковых препаратов в условиях низких
температур в присутствии солей и при соответствующем значении рН . При
лиофилизации белков (высушивание в вакууме путем возгонки влаги из
замороженного
пользуются
состояния)
химическими
для
предотвращения
веществами
(простые
денатурации
сахара,
часто
глицерин,
органические анионы).
а - развертывание (мочевина + меркаптоэтанол); б - повторное
свертывание.
Рисунок
18
–
Денатурация
и
ренатурация
рибонуклеазы
(по
Анфинсену)
В изоэлектрической точке суммарный заряд белков, обладающих
амфотерными свойствами, равен нулю и белки не перемещаются в
электрическом
поле.
Зная
аминокислотный
27
состав
белка,
можно
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
приближенно
определить
изоэлектрическую
точку
(pI);
pI
является
характерной константой белков. Изоэлектрическая точка большинства
белков животных тканей лежит в пределах от 5,5 до 7,0, что свидетельствует
о частичном преобладании кислых аминокислот. Однако в природе имеются
белки, у которых значения изоэлектрических точек лежат в крайних
значениях рН среды. В частности, величина рI пепсина (фермент
желудочного сока) равна 1, а сальмина (основной белок из молоки семги) –
почти 12.
В изоэлектрической точке белки наименее устойчивы в растворе и
легко выпадают в осадок. Изоэлектрическая точка белка в сильной степени
зависит от присутствия в растворе ионов солей; в то же время на ее величину
не влияет концентрация белка.
В химии белков существует понятие «изоионная точка белка». Раствор
белка называется изоионным, если он не содержит никаких других ионов,
кроме ионизированных остатков аминокислот белковой молекулы и ионов,
образующихся при диссоциации воды. Для освобождения белка от
посторонних ионов обычно его раствор пропускают через колонку,
наполненную смесью анионо- и катионообменников. Изоионной точкой
данного белка принято называть значение рН изоионного раствора этого
белка: [H]++ [Р]∙Z=[OH]где [Р] – молярная концентрация белка; Z – средний заряд молекулы.
Согласно этому уравнению, изоионная точка белка зависит от его
концентрации. Очевидно, поэтому белок, за исключением случая, когда рI
равно 7, не может быть одновременно изоэлектрическим и изоионным.
Выяснение структурной организации белков считается одной из
главных проблем современной биохимии. Оно имеет важное научнопрактическое значение для понимания огромного разнообразия функций
белков, выполняемых ими в живых организмах. Белковые молекулы
28
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
представляют собой продукт полимеризации 20 различных мономерных
молекул (аминокислот), соединенных не хаотично, а в строгом соответствии
с кодом белкового синтеза. Вопрос о том, каким образом соединяются между
собой многие десятки и сотни аминокислот в белковой молекуле, был
предметом пристального внимания многих лабораторий мира, занимавшихся
химией белка.
Впервые А.Я. Данилевский (1888), изучая биуретовую реакцию,
высказал предположение о существовании во всех белковых веществах
одинаковых групп атомов и связей, аналогичных биурету NH2—СО—NH—
СО—NH2. Тем самым А.Я. Данилевский первый указал на связь —NH—
СО— (позднее получившую название пептидной связи) как на наиболее
вероятный способ соединения аминокислот в белковой молекуле.
Однако только Э. Фишер (1902) сформулировал полипептидную
теорию строения. Согласно этой теории, белки представляют собой сложные
полипептиды, в которых отдельные аминокислоты связаны друг с другом
пептидными связями, возникающими при взаимодействии α-карбоксильных
СООН- и α-NН2-групп аминокислот (см. рисунок 19). На примере
взаимодействия аланина и глицина образование пептидной связи и
дипептида (с выделением молекулы воды) можно представить следующим
уравнением:
Рисунок 19 – Образование дипептида
Аналогичным способом к дипептиду могут присоединяться и другие
аминокислоты с образованием три-, тетра-, пентапептида и т.д. вплоть до
крупной
молекулы
полипептида
(белка).
29
Наименование
пептидов
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
складывается из названия первой N-концевой аминокислоты со свободной
NH2-группой
(с
окончанием
-ил,
типичным
для
ацилов),
названий
последующих аминокислот (также с окончаниями -ил) и полного названия Сконцевой
аминокислоты
пентапептид
из
5
со
свободной
аминокислот
СООН-группой.
может
быть
Например,
обозначен
полным
наименованием: глицил-аланил-серил-цистеинил-аланин, или сокращенно
Гли–Ала–Сер–Цис–Ала.
Образование пептидных связей, например, из трех разных аминокислот
может быть представлено в виде следующей схемы (см. рисунок 20):
Рисунок 20 – Образование трипептида (схема)
Химический синтез полипептидов и современные физико-химические
методы исследования белков полностью подтвердили существование
пептидных
связей
в
структуре
белка.
Получены
следующие
экспериментальные доказательства полипептидной теории строения белка.
1. В природных белках сравнительно мало титруемых свободных
СООН- и NH2-групп, поскольку абсолютное их большинство находится в
связанном состоянии, участвуя в образовании пептидных связей; титрованию
30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
доступны в основном свободные СООН- и NН2-группы у N- и С-концевых
аминокислот пептида.
2. В процессе кислотного или щелочного гидролиза белка образуются
стехиометрические количества титруемых СООН- и NH2-групп, что
свидетельствует о распаде определенного числа пептидных связей.
3. Под действием протеолитических ферментов (протеиназ) белки
расщепляются на строго определенные фрагменты, называемые пептидами, с
концевыми аминокислотами, соответствующими избирательности действия
протеиназ. Структура некоторых таких фрагментов неполного гидролиза
доказана последующим химическим их синтезом.
4. Биуретовую реакцию (сине-фиолетовое окрашивание в присутствии
раствора сульфата меди в щелочной среде) дают как биурет, содержащий
пептидную связь, так и белки, что также является доказательством наличия в
белках аналогичных связей.
5.
Анализ
рентгенограмм
кристаллов
белков
подтверждает
полипептидную структуру белков. Таким образом, рентгеноструктурный
анализ при разрешении от 0,15 до 0,2 нм позволяет не только вычислить
межатомные расстояния и размеры валентных углов между атомами С, Н, О
и N, но и «увидеть» картину общего расположения аминокислотных остатков
в полипептидной цепи и пространственную ее ориентацию (конформацию).
6. Существенным подтверждением полипептидной теории строения
белка
является
возможность
синтеза
чисто
химическими
методами
полипептидов и белков с уже известным строением: инсулина – 51
аминокислотный остаток, лизоцима – 129 аминокислотных остатков,
рибонуклеазы – 124 аминокислотных остатка. Синтезированные белки
обладали
аналогичными
природным
свойствами и биологической активностью.
31
белкам
физико-химическими
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Полипептидная теория строения не отрицает существования в
молекуле белка и других связей, включая ковалентные (например,
дисульфидные —S—S-связи) и нековалентные (например, водородные связи
и др.).
Пептидные связи играют исключительную роль как в «архитектуре»,
так и в функции белков. Поэтому следует указать на некоторые особенности
строения полипептидной цепи. Во-первых, это своеобразие расположения
атомов углерода и азота, находящихся примерно в одной плоскости, и атомов
водорода и радикалов, направленных к этой плоскости под углом 109°28'. Вовторых, это своеобразие петидной связи. Расстояние между атомами С и N в
пептидной связи (равное 0,132 нм) является промежуточным между простой
(ординарной) связью (связь —С—N—, равная 0,147 нм) и двойной связью
(связь —C=N—,
равная
0,125 нм).
Это создает предпосылки для
осуществления по месту двойной связи таутомерных перегруппировок и для
образования енольной (лактимной) формы (см. рисунок 22). Последняя в
свою
очередь
дает
молекуле
белка
ряд
преимуществ
(повышение
реакционной способности, возникновение дополнительных возможностей
вращения и др.):
Рисунок 22 – Формы пептидов (схема)
Наконец, следует указать на своеобразие радикалов, которые являются
полифункциональными, несущими свободные NH2-, СООН-, ОН-, SH-группы
и, как было
указано, определяют структуру (пространственную) и
многообразие функций молекул белка. Взаимодействуя с окружающими
молекулами растворителя (Н2О), функциональные группы (в частности, NH232
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
и СООН-группы) ионизируются, что приводит к образованию анионных и
катионных центров белковой молекулы. В зависимости от соотношения
ионов молекулы белка получают суммарный положительный (+) или
отрицательный (–) заряд с определенным значением изоэлектрической точки.
Получены доказательства предположения К. Линдерстрёма-Ланга о
существовании 4 уровней структурной организации белковой молекулы:
первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры. Техника
современной белковой химии разработана настолько хорошо, что позволяет в
принципе расшифровать структурную организацию любого белка.
2.5 Хроматография аминокислот на бумаге
Анализ аминокислот в гидролизатах белков, в сыворотке крови и моче
необходим для оценки функции пораженной печени и для бесспорного
доказательства
ряда
заболеваний,
возникающих
из-за
врожденного
нарушения обмена отдельных аминокислот.
Хроматография на бумаге является для этого наиболее простым и
доступным методом. Используют различные системы растворителей, например
фенол, насыщенный водой. Вода с примесью фенола адсорбируется на бумагу
и образует неподвижную фазу. Фенол, насыщенный водой, служит
подвижной фазой. Хроматографию для ускорения проводят при температуре
40 °С. Аминокислоты на хроматограммах выявляют реакцией с нингидрином.
Образуются пурпурные и фиолетовые пятна.
Реактивы
1. Раствор лейцина, аланина и глугаминовой аминокислоты, 0,04 М.
2. Фенол, насыщенный водой.
3. Нингидрин, 0,1 % - ный раствор в ацетоне.
33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оборудование
1. Термостат.
2. Сушильный шкаф, имеющий перекладины с крючками для
подвешивания хроматограмм.
3. Большие пробирки 2,4x18 см с плотными пробками.
4. Штативы для больших пробирок.
5. Полосы хроматографической бумаги «быстрая» 1,5x15 см.
6. Иглы с нитками.
7. Простые карандаши и линейки с делениями.
8. Калиброванные пастеровские микропипетки.
9. Чашки Петри или пульверизаторы.
10. Пипетки на 5 мл.
11. Пинцеты.
Техника
Стараться не касаться полосок бумаги руками, чтобы при обработке
нингидрином не образовались побочные пятна. Необходимо соблюдать
осторожность при работе с фенолом, он вызывает ожоги.
1. Один конец полоски прокалывают иглой с ниткой. Нитку
завязывают, чтобы получилась петля от 5 до 6 см длиной.
2. На расстоянии 2 см от другого конца полоски проводят
карандашом линию старта. В центре ее делают кружок диаметром 3 мм для
нанесения в это место раствора аминокислот.
3. Укладывают полоску на стеклянные пробирки и наносят 0,02 мл
раствора аминокислот последовательно порциями, подсушивая пятно, чтобы
оно не выходило за пределы кружка .
4. В сухую пробирку для хроматографии на дно пипеткой наливают
2 мл фенола, насыщенного водой, стараясь не смочить стенки пробирки.
Ставят пробирку в штатив строго вертикально.
5. Полоску опускают в пробирку, погружают на 0,5 см в фенол,
34
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
стараясь ни в коем случае не размыть нанесенные аминокислоты. Пробирку
плотно закрывают пробкой, прижимая петлю, чтобы полоска висела на
нужном уровне.
Ставят штатив с пробирками в термостат, нагретый до 40 °С на
1,5 часа.
После хроматографии полоску вынимают, подвешивают за петлю в
сушильном шкафу и высушивают 10 минут при 100 °С. В чашку Петри
наливают от 15 до 20 мл раствора нингидрина. Полоску, удерживая
пинцетами, проводят через раствор и вновь помещают в сушильный шкаф на
от 5 до 7 минут при 100 °С. На хроматограмме измеряют линейкой расстояния
от старта до середины пятен аминокислот и до фронта растворителя.
Вычисляют коэффициент распределения для каждой аминокислоты
Рекомендации к составлению протокола
В лабораторном журнале кратко описать принцип распределительной
хроматографии на бумаге и приемы работы. Зарисовать хроматографическую
систему. Хроматограмму подклеить в журнал и обозначить отдельные
аминокислоты. Сравнить полученные коэффициенты распределения со
стандартом.
2.6 Биуретовая реакция (Пиотровского)
Реакция обусловлена наличием в белках пептидных связей Н ~~ и
~~ N ~~' соединяющих остатки аминокислот в молекуле белка путем
отнятия элементов частицы воды из —СООН- группы одной аминокислоты
и —NH2-группой другой (см. рисунок 23):
35
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 23 - Образование пептидной связи
В сильно щелочной среде в присутствии сернокислой меди образуются
комплексные соединения меди с пептидной группировкой, окрашенные в
красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет.
Биуретовой реакцией обнаруживаются все без исключения белки, а
также продукты их неполного гидролиза — пептоны и полипептиды. Для два- и
трипептидов биуретовая реакция ненадежна. Оттенок окрашивания зависит от
длины пептидной цепочки. Пептоны при этой реакции дают розовое или
красное окрашивание. Биуретовая реакция положительна и с веществами
небелкового характера, имеющими в своем составе не менее двух —СО—
NH2-групп, к ним относятся, например, оксамид — H2N—СО—СО—NH2, биурет —H2N—CO—NH—CO—NH2, по которому и названа реакция.
Ион меди является центральным атомом фиолетового окрашенного
комплекса, который образуется только в присутствии пептидных связей или
двух групп —СО—NH2. Так как биуретовая реакция протекает в сильно
щелочной среде, образуются анионные комплексы (см. рисунок 24):
В сильно щелочной среде в присутствии сернокислой меди образуются
комплексные соединения меди с пептидной группировкой, окрашенные в
красно-фиолетовый или сине-фиолетовый цвет.
36
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 24 – Комплекс белка с медью (схема)
В тех же условиях аминокислоты присоединяют ионы меди Сu2+ по типу
хелатов без образования окрашенных комплексов (см. рисунок 25):
Рисунок 25 - Хелатный комплекс
Реактивы
1. Раствор яичного белка (приготовление см. приложение А, п. 59) или
разбавленная сыворотка крови лошади.
2. Едкий натр, 10 % - ный раствор.
3. Сернокислая медь, 1 % - ный раствор.
37
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Оборудование
1. Штатив с пробирками.
2. Капельницы или пипетки.
Техника
1. В пробирку наливают 5 капель раствора белка, 5 капель 10 % - ного
раствора едкого натра и по каплям, начиная с 1 капли, раствор сернокислой
меди до появления при взбалтывании розово-фиолетового или синефиолетового окрашивания. Надо избегать избытка CuSO4, так как при
дальнейшем его прибавлении все более усиливается нехарактерный синий
оттенок и, наконец, выпадает осадок гидрата окиси меди.
2. При малых концентрациях белка в растворе в пробирку наливают 20
капель 10 % - ного раствора едкого натра, добавляют 1—2 капли 1 % - ного
раствора сернокислой меди и перемешивают. Затем набирают в пипетку
разбавленный раствор белка и осторожно спускают его постенке пробирки
так, чтобы он наслаивался сверху и не смешивался со щелочным раствором
сернокислой меди. На границе двух слоев жидкости образуется фиолетовое
кольцо.
2.7 Реакции осаждения белков при нагревании
Реактивы
Раствор белка (приготовление см. приложение А, п. 52) или
разбавленная сыворотка крови лошади.
Уксусная кислота, 1 % - ный раствор.
Уксусная кислота, 10 % - ный раствор.
Хлористый натрий, насыщенный раствор.
Едкий натр, 10 % - ный раствор.
Оборудование
38
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Техника
В 5 пробирок наливают по 10 капель раствора белка. В первой
пробирке
нейтральный
раствор
белка
нагревают.
Опалесценция
усиливается еще до того, как жидкость закипит. При кипячении может
выпасть осадок. Растворы белков кипят неровно, толчками, так как белок
по стенкам свертывается и в этих местах происходит перегревание,
поэтому нагревание надо проводить осторожно, все время встряхивая
пробирку. Усиление опалесценции объясняется укрупнением взвешенных
частиц белка. Они удерживаются во взвешенном состоянии, так как эти
частицы несут заряд.
К нейтральному раствору белка во второй пробирке прибавляют 1 — 2
капли 1% - ного раствора уксусной кислоты (до слабокислой реакции на
лакмус), осадка при этом не образуется. При нагревании вначале появляется
опалесценция, а при дальнейшем нагревании и последующем кипячении
выпадает белый хлопьевидный осадок белка. Осадок появляется вследствие
того,
что
в
слабокислой
среде
исследуемые
белки
находятся
в
изоэлектрическом состоянии, денатурируясь при нагревании, легко теряют
свою растворимость в результате агрегации.
Нейтральный
раствор
белка
в
третьей
пробирке
подкисляют
10 % - ным раствором уксусной кислоты до сильно кислой реакции среды
(добавляют 1—3 капли) и нагревают до кипения. Осадок не выпадает,
поскольку
при
избытке
водородных
ионов
(по
сравнению
с
той
концентрацией их, которая нужна для достижения изоэлектрического
состояния) белки, имевшие в исходном растворе отрицательный заряд,
перезаряжаются и приобретают положительный заряд, что придает им
устойчивость.
Раствор белка в четвертой пробирке подкисляют 10% - ным раствором
39
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
уксусной кислоты до сильно кислой реакции среды, добавляют 2—3 капли
насыщенного раствора поваренной соли и кипятят. Появляется белый
хлопьевидный осадок белка, вследствие экранирования положительного
заряда перезаряженных частиц белка противоположно заряженными ионами
хлористого натрия путем адсорбции их. Кроме того, большое значение в
этой реакции имеет водоотнимающее действие ионов поваренной соли.
К раствору белка в пятой пробирке добавляют 2—4 капли 10 % - ного
раствора едкого натра (до щелочной реакции) и кипятят. Осадка не
образуется, так как в щелочной среде подавляется основная диссоциация
белка, усиливается кислотная и отрицательный заряд на коллоидных
частицах белка возрастает еще более.
2. В одну пробирку добавляют несколько капель (1—2 капли)
сульфосалициловой кислоты, а в другую такое же количество трихлоруксусной кислоты. Наблюдают выпадение осадка белка.
2.8 Осаждение белков органическими растворителями
При добавлении к раствору белка органических растворителей,
например спирта, выпадает осадок белка. В зависимости от природы белка
для его осаждения требуются различные концентрации спирта. Осаждение
наступает
только
слабокислой среде
из
нейтральных
заряд
на
или
слабокислых
растворов
(в
коллоидных частицах белка является
наименьшим) и более полно в присутствии электролитов, например
хлористого натрия, что связано с ослаблением внутримолекулярных
ионных связей ввиду конкуренции добавленных анионов и катионов. Если
осаждение производить при низкой температуре (от 0 °С до 15 °С) и
полученный осадок быстро отделить от спирта, то белок сохраняет свои
40
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
природные свойства и может быть вновь растворен в воде. Длительное
воздействие спирта приводит к необратимой денатурации белка.
Однако
некоторые
белки,
например,
проламины
растений,
растворимы в горячем от 70 % до 80 % спирте, гормон поджелудочной
железы — инсулин растворяется в подкисленном 60 % спирте. Это зависит
от особенностей их первичной структуры.
Реактивы
Раствор яичного белка (приготовление см. приложение А, п. 52) или
разбавленная сыворотка крови лошади.
Этиловый спирт, 96 °.
Ацетон.
Хлороформ.
Хлористый натрий, насыщенный раствор.
Уксусная кислота, 1 % - ный раствор.
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Техника
1. В пробирку наливают около 1 мл раствора белка, а затем при
взбалтывании этиловый спирт до появления осадка. При добавлении
1—2 капель 1 % -ного раствора уксусной кислоты образование осадка
усиливается. Еще большее осаждение наблюдается при добавлении нескольких
капель от 1 до 2 насыщенного раствора поваренной соли.
2. Проделывают ту же реакцию, взяв вместо этилового спирта ацетон.
3. В пробирку наливают около 1 мл раствора белка и добавляют равный
объем хлороформа. После встряхивания пробирки и последующего разделения
слоев воды и хлороформа в верхнем слое жидкости появляется осадок белка.
Денатурация белка хлороформом получила распространение при выделении
нуклеиновых кислот и их очистке.
41
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3 Фосфопротеины
К белкам этого класса относятся казеиноген молока, в котором
содержание фосфорной кислоты достигает 1 %; вителлин, вителлинин и
фосвитин, выделенные из желтка куриного яйца; овальбумин, открытый в
белке куриного яйца; ихтулин, содержащийся в икре рыб, и др. Большое
количество фосфопротеинов содержится в клетках ЦНС. Фосфопротеины
занимают особое положение в биохимии фосфорсодержащих соединений не
только в результате своеобразия структурной организации, но и вследствие
широкого диапазона функций в метаболизме. Характерной особенностью
структуры фосфопротеинов является то, что фосфорная кислота оказывается
связанной
сложноэфирной
связью
с
белковой
молекулой
через
гидроксильные группы β-оксиаминокислот (см. рисунок 26), главным
образом серина и в меньшей степени треонина. На одну молекулу белка
обычно приходится 2–4 остатка фосфата.
Рисунок 26 - Ионный тип связи между белками и фосфолипидами
Новые данные свидетельствуют о том, что в клетках фосфопротеины
синтезируются в результате посттрансляционной модификации, подвергаясь
фосфорилированию при участии протеинкиназ. Таким образом, уровень
42
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
фосфопротеинов в клетке зависит в значительной степени от регулирующего
действия ферментов, катализирующих фосфорилирование (протеин-киназы)
и
дефосфорилирование
(протеинфосфатазы).
Следует
отметить,
что
фосфопротеины содержат органически связанный, лабильный фосфат,
абсолютно необходимый для выполнения клеткой ряда биологических
функций. Кроме того, они являются ценным источником энергетического и
пластического материала в процессе эмбриогенеза и дальнейшего постнатального роста и развития организма.
Особо следует отметить,
регулирующие
процессы
что
некоторые
внутриклеточного
ключевые
обмена
ферменты,
веществ,
также
существуют как в фосфорилированной, так и в дефосфорилированной форме.
Этим подчеркивается значение фосфорилирования – дефосфорилирования в
процессах
химической
модификации
макромолекул,
участвующих
в
интегральных процессах метаболизма.
3.1 Гидролиз казеина и открытие в гидролизате белкового
компонента и фосфорной кислоты
Для анализа в качестве фосфопротеина можно использовать казеин
молока. При щелочном гидролизе казеин распадается на белок и фосфорную
кислоту. Белок открывают биуретовой реакцией, а фосфорную кислоту —
молибденовой пробой. Ион РО4~ дает с молибдатом аммония в кислой среде
фосфомолибдат аммония, который в результате восстановления гидрохиноном
и сульфитом натрия переходит в молибденовую синь. Синий цвет
пропорционален количеству молибдена в фосфомолибдате и, следовательно,
количеству фосфора.
Реактивы и материалы
Сухой казеин (порошок).
43
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Едкий натр, 10 % - ный раствор.
Медный купорос, 1 % ный раствор.
Азотная кислота, 25 % - ная или концентрированная.
Аммоний молибденовокислый, раствор в азотной кислоте (приготовление
см. Приложение, 5).
Гидрохинон, 2 % - ный раствор (приготовление см. приложение А, п. 13).
Раствор карбонат сульфита (приготовление см. приложение, п. 56).
Оборудование
Весы аптечные с разновесом.
Водяная баня.
Пипетки на 5 мл.
Стеклянные воронки с бумажным фильтром.
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Техника
К 100 мг сухого измельченного казеина прибавляют 5 мл 10 % - ного
едкого натра и помещают в кипящую водяную баню на 30 минут, помешивая
время от времени содержимое пробирки.
После охлаждения к 10 каплям гидролизата прибавляют 5 капель
10 % - ного раствора едкого натра и по каплям 1 % - ный раствор сернокислой
меди до появления красно-фиолетового или сине-фиолетового окрашивания.
Положительная биуретовая реакция доказывает белковую природу казеина.
Для открытия фосфорной кислоты к 20 каплям гидролизата
прибавляют 10 капель 25% - ной азотной кислоты (до кислой реакции) и 10
капель раствора молибденовокислого аммония в азотной кислоте. Оставляют
стоять на 5 минут.
Образующийся
осадок белка и высокомолекулярных продуктов
неполного гидролиза белков отфильтровывают с помощью бумажного
фильтра.
44
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
К фильтрату, содержащему фосфомолибденовокислый аммоний
прибавляют 10 капель 2 % - ного раствора гидрохинона и оставляют стоять на
5 минут.
К содержимому пробирки добавляют 20 капель раствора карбонат
сульфита медленно, по каплям, во избежание сильного образования пены. В
присутствии
фосфорной
кислоты
постепенно
развивается
синее
окрашивание раствора.
4 Гликопротеины
Гликопротеины – сложные белки, содержащие, помимо простого белка
или пептида, группу гетероолигосахаридов. В настоящее время их принято
называть гликоконъюгатами. В состав гликоконъюгата входит углеводный
компонент (гликановая фракция), ковалентно связанный с неуглеводной
частью
(агликановая
фракция),
представленной
белком,
пептидом,
аминокислотой или липидом.
Повышенный интерес к науке об углеводах – гликобиологии – в
настоящее время объясняется открытием существенной роли изменений
структуры
гликоконъюгатов
в
развитии
таких
болезней,
как
рак,
иммунодефицит человека, ревматоидные артриты, астма и др. Оказалось, что
нарушение
реакции
гликоконъюгатов
гликозилирования
(гликопротеинов
и
двух
ганглиозидов)
главных
приводит
классов
или
к
накоплению предшественников этих веществ, или к синтезу «укороченных»
сахарных цепей гликоконъюгатов. Более того, установлено, что во
взаимодействии
между некоторыми
вирусами
и
клетками-мишенями
главную роль играют углеводные компоненты. В частности, гликопротеин
gp120 вируса иммунодефицита человека (содержит большой процент
углевода) имеет высокое сродство к гликопротеину CD4 Т-лимфоцита. В этом
45
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
взаимодействии,
гликозилированные
узнавании,
фрагменты,
являющемся
вероятнее
высокоспецифичным,
всего,
играют
важную
патогенетическую роль. Известно также, что при ревматоидных артритах
часто синтезируются аномальные антитела (аномальные иммуноглобулины –
все гликопротеины) с необычайно короткими сахарными цепями, что
вызывает стимуляцию иммунной системы против самого организма. Из этих
примеров видно, что, помимо гликобиологии, наступило время признания и
таких наук, как гликопа-тология и гликотерапия.
Помимо гликопротеинов, различают также протеогликаны, состоящие
из белка и гликозаминогликанов; последние состоят из цепей сложных
углеводов: аминосахаров, уроновых кислот, серной кислоты и отдельных
моносахаридов. Типичными гликозаминогликанами являются гиалуроновая
кислота, хондроитинсерная кислота и гепарин.
К
типичным
гликопротеинам
относят
большинство
белковых
гормонов, секретируемые в жидкие среды организмавещества, мембранные
сложные белки, все антитела (иммуноглобулины), белки плазмы крови,
молока, овальбумин, интерфероны, факторы комплемента, группы крови,
рецепторные белки и др. Из этого далеко не полного перечня гликопротеинов
видно, что все они выполняют специфические функции: обеспечивают
клеточную адгезию, молекулярное и клеточное узнавание, антигенную
активность опухолевых клеток, оказывают защитное и гормональное, а также
антивирусное действие.
Химический состав гликопротеинов более или менее установлен,
структура определена только у ряда из них. К полипептиду присоединяются
гетероолигосахаридные цепи (см. рисунок 27), содержащие от 2 до 10, реже
15 мономерных остатков гексоз (галактоза и манноза, реже глюкоза), пентоз
(ксилоза, арабиноза) и конечный углевод, чаще всего представленный Nацетилга-лактозамином, L-фукозой или сиаловой кислотой; в отличие от
протеогликанов гликопротеины не содержат уроновых кислот и серной
кислоты.
46
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 27 – Гетеросахариды
Типы связей между углеводными компонентами и белками определены
только у ряда гликопротеинов, аминокислотный состав и структура которых
известны (иммуноглобулины, гормоны); они включают О-гликозидные связи
(с ОН-группами серина, треонина и оксилизина), N-гликозидные связи (с
амидными группами аспарагина, реже глутамина или ω-NH2-группами
лизина и аргинина) и эфирные гликозидные связи со свободными СООНгруппами глутаминовой и аспарагиновой кислот.
Синтез
гликопротеинов
осуществляется
в
рибосомах
эндоплазматического ретикулума (в цистронах), затем присоединяются
сахарные цепи (постсинтетическое гликозилирование), и далее белок
транспортируется до биомембран клетки и включается в состав мембранных
белков или секре-тируется.
Углеводные компоненты соединены ковалентно с азотом аспарагина
молекулы белка. Однако предварительно олигосахаридная часть соединяется
с липидным переносчиком – долихолфосфатом (липид, содержащий от 15 до
20 изопреновых остатков, см. рисунок 28) и переносится на полипептидную
цепь
в
эндоплазматическом
ретикулуме,
освобождается:
47
при
этом
транспортер
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 28 - Долихолфосфат (n = 15-30)
Синтезированные
гликопротеины
далее
переносятся
в
аппарат
Гольджи, где осуществляются окончательное гликозилирование и сортировка
по назначению.
Структура одного из нескольких гетероолигосахаридных остатков в
молекуле гликопротеинов, в частности иммуноглобулинов, может быть
представлена в виде следующей схемы (использованы сокращения: Глю –
глюкоза, NАцГлюА – N-ацетилглюкозамин; Гал – галактоза; Ман – манноза;
NАцНейр – N-ацетилнейраминовая кислота):
Рассмотрим известные к настоящему времени данные о синтезе,
строении (структуре) и свойствах ряда гликопротеинов.
Интерфероны. Интерфероны – это ингибиторы размножения многих
типов вирусов. Открыто несколько типов интерферонов (α, β и γ), некоторые
из них получены методами генетической инженерии. Это сравнительно
небольшие сложные белки с мол. массой у разных видов животных и
человека от 25000 до 38000–40000). Они образуются в клетке в ответ на
внедрение вирусной нуклеиновой кислоты, ограничивая вирусную агрессию
(инфекцию). Известно также, что группа видоспецифических α-интерферонов
синтезируется
макрофагами,
в
то
время
как
γ-интерферон
продуцируется Т-клетками и стимулируется интерлейкином-2 (см. «Лимфокины»). Показано также, что γ-интерферон в свою очередь повышает
цитотоксическую активность макрофагов, Т-клеток и естественных клетоккиллеров. Интерфероны наделены антипролиферативной активностью и
считаются основными защитными белками не только против вирусной
инфекции, но и при опухолевых поражениях.
Следует отметить, однако, что до сих пор не раскрыты молекулярные
48
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
механизмы, при помощи которых интерфероны тормозят размножение
вирусов. Известно только, что интерфероны ингибируют биосинтез всех
белков (и хозяйских, и вирусных), вероятнее всего, на уровне процесса
трансляции. Возможно, что интерферон индуцирует синтез особого белкаингибитора, который затем связывается с рибосомами и блокирует
трансляцию, или интерферон переводит один из активных эукариотических
белковых факторов инициации в неактивный фактор путем фосфорилирования.
Иммуноглобулины. Иммуноглобулины, или антитела, также относятся
к классу гликопротеинов, выполняют защитную функцию, обезвреживая
поступающие в организм чужеродные вещества – антигены любой
химической природы. Синтезируются иммуноглобулины плазматическими
клетками, образовавшимися из лимфоцитов. Учение об иммунитете
оформилось в самостоятельную науку – иммунологию , изучающую
структуру и функции антител вообще и иммуноглобулинов в частности. Мы
представим
современные
сведения
о
некоторых
физико-химических
свойствах и структуре иммуноглобулинов человека. Различают 5 классов
иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE. Детально изучены структура и
функция IgG.
Разные классы иммуноглобулинов сильно различаются не только по
молекулярной массе, но и по концентрации в крови; имеются данные, что
различаются они и по биологическим свойствам.
Подробно изучена структура IgG. Он имеет Y-образную форму и тетрамерное строение; состоит из двух идентичных легких L-цепей (от англ.
light) и двух идентичных тяжелых Н-цепей (от англ. heavy) с мол. массой
23000–24000 и 50000–70000 соответственно. Известно также, что каждая из
этих цепей имеет 2 типа доменов – вариабельные (V) участки, состоящие из
108 аминокислотных остатков, и константные (С) участки, состоящие из 110
и
350
аминокислотных
остатков
соответственно
(см. рисунок 29).
49
в
L-
и
Н-цепях
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Из
других
гликопротеинов,
выполняющих
ряд
важнейших
биологических функций, следует отметить все белки плазмы крови (за
исключением альбуминов), трансферрин, церулоплазмин, гонадотропный и
фолликулостимулирующие
гормоны,
некоторые
ферменты,
а
также
гликопротеиныв составе слюны (муцин), хрящевой и костной тканей и
яичного
белка
(овомукоид).
Углеводные
компоненты,
помимо
информативной функции, значительно повышают стабильность молекул, в
состав которых они входят, к различного рода химическим, физическим
воздействиям и предохраняют их от действия протеиназ, определяя тем
самым биологическую роль гликопротеинов. Являясь составной частью
клеточной
мембраны,
гликопротеины
участвуют,
кроме
того,
в
иммунологических реакциях, ионном обмене, процессах межклеточной
адгезии и т.д.
Показаны легкие (L) и тяжелые (Н) цепи, дисульфидные связи и
вариабельные V (темные) и константные С (светлые) участки.
Рисунок 29 - Структура IgG человека
У
некоторых
мукополисахаридами.
гликопротеинов
Они
углеводная
получили
50
часть
название
представлена
мукопротеинов.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Представителями мукопротеинов являются муцины. Они встречаются в
секретах слизистых желез. Муцины пищеварительного тракта предохраняют
слизистые оболочки от химических, механических, термических воздействий
и переваривания протеолитическими ферментами.
При гидролизе белковая часть муцинов распадается на аминокислоты,
а простетическая группа — на гексозы, гексозамины, нейраминовые кислоты
и другие компоненты. Для анализа удобно пользоваться муцином слюны.
Неэнзиматические макромолекулярные гликопротеины слюны (Mr 0,5—1,0 •
106, на белковую часть приходится ~ 40 %, на углеводную ~ 60 %) имеют
особое значение для вязкости ротовой жидкости и тем самым для скольжения
съеденных кусочков пищи. К тому же углеводные части несут анионные
группы, которые обусловливают сильную гидратацию. Вязкость слюны в
10—20 раз больше, чем у плазмы. Различают анионные (Мr 0,5 • 106,
белковая часть ~ 60 %, углеводная ~ 40 %) и катионные гликопротеины (Мr 4
• 104 , белковая часть ~ 60 %, углеводная ~ 40 %). Последние сецернируются
главным образом Gl. parotis. Основной характер возникает от высокой
пропорции основных аминокислот (лизин, аргинин, гистидин). Основной
характер этих белков придает им свойство покрывать поверхность
отрицательно заряженных молекул фосфатов на поверхности твердых тканей
зубов. Они составляют существенную часть Cuticula dentis на эмали.
Катионные белки претерпевают после связывания на зубе информационные
изменения, уменьшение растворимости в воде и тем самым более прочное
прилипание. Плохая растворимость ухудшается, когда бактериальные
гликозидазы разрушают углеводные цепи. Вклад в образование Cuticula
dentis вносят фосфатсодержащие гликопротеины (~ Mr 6 • 104, белковая
часть ~ 94 %, углеводная ~ 5 %, фосфаты ~ 1 %). У них, наоборот, кислые
фосфатные группы соединяют гликопротеины с кальцием апатитов, несущим
положительный заряд.
51
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4.1 Выделение муцина из слюны и реакции на его белковую часть
(биуретовая реакция) и углеводную группировку (нафтоловая проба)
Реактивы
Уксусная кислота, 1 % - ный раствор.
Едкий натр, 10 % - ный раствор.
Сернокислая медь, 1% - ный раствор.
α-Нафтол, 1 % - ный спиртовой раствор.
Серная кислота, концентрированная.
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Стеклянные палочки.
Техника
Для выделения муцина в пробирку собирают от 5 до 10 мл слюны и
добавляют такой же объем 1 % - ного раствора уксусной кислоты при
помешивании стеклянной палочкой. Муцин выпадает в осадок в виде
слизистого комочка.
Жидкость из пробирки осторожно сливают, задерживая муцин
стеклянной палочкой.
Осадок муцина промывают водой, разделяют на две части, с которыми
проделывают реакции на белок и углеводы.
Для открытия белка в пробирку помещают одну часть осадка муцина,
добавляют при помешивании 10 % - ный раствор едкого натра до растворения
сгустка и производят биуретовую реакцию. Положительный результат
реакции доказывает белковую природу муцина.
Углеводы
муцина
обнаруживают
52
нафтоловой
пробой
(реакция
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Подобедова—Молиша, см. рисунок 30). Реакция обусловлена взаимодействием
оксиметилфурфурола, образующегося из гексоз под влиянием серной
кислоты
с
а-нафтолом.
При
этом
образуется
конденсации.
Рисунок 30 - Конденсация углеводов муцина
53
окрашенный
продукт
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ко второй половине осадка муцина добавляют от 10 до 20 капель
1 % - ного спиртового раствора α-нафтола, перемешивают и по стенке
осторожно спускают равный объем концентрированной серной кислоты. На
границе раздела жидкостей постепенно появляется фиолетово-красное кольцо,
свидетельствующее о наличии углеводного компонента в составе муцина. Для
развития окраски содержимое пробирки оставляют стоять на 1 час.
Окрашенное кольцо хорошо заметно на белом фоне. Эта реакция дает
положительный результат с любым углеводом — как с простым, так и со
сложным, а также со всеми веществами, в состав которых входят углеводы.
4.2 Реакция Адамкевича
Реакция обусловлена присутствием в белке остатков аминокислоты
триптофана. Она основана на способности триптофана в кислой среде
вступать в реакцию с глиоксилевой кислотой, образуя при этом окрашенные
продукты конденсации (см. рисунок 31). В качестве источника глиоксилевой
кислоты обычно используют ледяную уксусную кислоту, содержащую
примесь глиоксилевой. Две молекулы триптофана, реагируя с глиоксилевой
кислотой, образуют соединение красно-фиолетового цвета:
54
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 31 - Продукт конденсации триптофана с глиокислевой кислотой
Реактивы
1. Белок куриного яйца неразбавленный или лошадиная сыворотка.
2. Уксусная кислота ледяная (в ней в виде примеси всегда содержится
глиоксилевая кислота).
3. Серная кислота, концентрированная.
Оборудование
1. Штатив с пробирками.
2. Капельницы, пипетки.
Техника
1. К 1 капле неразбавленного белка или от 5 до 10 каплям сыворотки
добавляют 10 капель ледяной уксусной кислоты (или глиоксилевой кислоты)
и слегка нагревают до растворения белка.
2. Содержимое пробирки охлаждают и, сильно наклонив пробирку,
очень осторожно,
по стенке
подслаивают из
пипетки около1 мл
концентрированной серной кислоты так, чтобы обе жидкости не смешались.
55
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
При стоянии на границе соприкосновения двух слоев жидкости возникает
красно-фиолетовое окрашивание в виде кольца. Окраска постепенно
распространяется на весь раствор. При нагревании в кипящей водяной бане
окрашивание развивается быстрее.
5 Ферменты
Ферменты,
или
энзимы,
представляют
собой
высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемый
живыми организмами для осуществления с высокой скоростью многих тысяч
взаимосвязанных
взаимопревращение
химических
огромного
реакций,
множества
включая
синтез,
разнообразных
распад
и
химических
соединений. Жизнь и многообразие ее проявлений – сложная совокупность
химических реакций, катализируемых специфическими ферментами. И.П.
Павлов считал ферменты «возбудителями всех химических превращений» у
живых существ. Как известно, важнейшим свойством живого организма
является обмен веществ, ускоряющим аппаратом, основой молекулярных
механизмов интенсивности которого являются ферменты. «Вся тайна
животной жизни,– писал Д.И. Менделеев,– заключается в непрерывных
химических превращениях веществ, входящих в состав животных тканей».
В настоящее время теоретические и практические достижения
энзимологии используются в решении многих проблем биохимии и
молекулярной биологии, включая их сравнительное и эволюционное
рассмотрение. «Под знаком молекулярной энзимологии,– говорил на III
Всесоюзном биохимическом съезде (1974) А.Е. Браунштейн,– развивается и
встречное течение – реконструкция или интеграция, восходящая от
молекулярного яруса к высшим уровням структурно-функциональной
организации живого и пронизывающая весь комплекс актуальных проблем
56
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
биологии и медицины».
Ферменты обеспечивают осуществление таких важнейших процессов
жизнедеятельности,
как
экспрессия
(реализация)
наследственной
информации, биоэнергетика, синтез и распад биомолекул (см. рисунок 32).
Изучение их способствует проникновению в суть и сокровенные тайны того
загадочного явления, которое мы называем жизнью. Этими обстоятельствами
может быть объяснено пристальное внимание исследователей к проблемам
структуры, функций и молекулярных механизмов действия ферментов.
Рисунок 32 - Области применения ферментов в биологии и медицине
(по Грину)
От неорганических катализаторов
характерных
особенностей.
Прежде
ферменты отличаются рядом
всего
ферменты
чрезвычайно
эффективны и проявляют в миллионы и миллиарды раз более высокую
каталитическую активность в условиях умеренной температуры (температура
тела), нормального давления и в области близких к нейтральным значениям
рН среды.
Ферменты
отличаются
высокой
специфичностью
действия
в
отношении как химической природы субстрата, так и типа реакции, т.е.
каждый фермент катализирует в основном только определенную химическую
57
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
реакцию.
Для
каждого
последовательность
фермента
расположения
характерны
специфическая
аминокислотных
остатков
и
пространственная конформация. Существенной особенностью ферментов
является также то, что их активность в клетках строго контролируется как на
генетическом уровне.
Так и посредством определенных низкомолекулярных соединений, в
частности субстратов и продуктов реакций, катализируемых этими же
ферментами, ингибиторов и др. Таким образом, молекула фермента
характеризуется
уникальностью
структуры,
которая
и
определяет
уникальность ее функции.
Учение
о
ферментах
выделено
в
самостоятельную
науку
–
энзимологию. Термин «энзим» (от греч. en zyme – в дрожжах), так же как и
«фермент» (от лат. fermentatio – брожение), означает процесс, связанный с
выделением газов, брожением.
В настоящее время учреждены научно-исследовательские институты
по изучению ферментов, издаются специальные журналы, созываются
национальные и международные симпозиумы и конференции, посвященные
проблемам энзимологии. Наука о ферментах интенсивно развивается в
тесной
связи
неорганической
со
и
многими
науками,
физической
в
химией,
частности
физиологией,
с
органической,
токсикологией,
микробиологией, генетикой, фармакологией и др. Таким образом, эта область
знаний находится на стыке химических, биологических и медицинских наук.
Энзимология в ее современном физико-химическом и молекулярном
понимании решает две главные, неразрывно связанные между собой
проблемы: определение
структурной
макромолекулярной
организации
ферментов и изучение природы химических взаимодействий, лежащих в
основе ферментативного катализа. Накопление экспериментальных данных и
развитие теоретических представлений происходят настолько быстро, что
любой учебник к моменту выхода в свет уже не отражает достаточно полно
современное состояние вопроса о структуре и функциях ферментов.
58
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Важно подчеркнуть, что изучение ферментов имеет огромное значение
для любой фундаментальной и прикладной области биологии, а также для
многих практических отраслей химической, пищевой и фармацевтической
индустрии,
занятых
приготовлением
катализаторов,
антибиотиков,
витаминов и многих других биологически активных веществ, используемых
в народном хозяйстве и медицине. В фармакологии действие многих
лекарственных препаратов основано на определенном, хотя часто еще не
выявленном, механизме взаимодействия их с ферментами. Успехи общей и
молекулярной энзимологии способствуют развитию новой ее ветви –
медицинской энзимологии, цели и задачи, методологические подходы
которой связаны с решением проблем энзимопатологии, энзимодиагностики
и энзимотерапии. Наука о питании базируется на точных знаниях поэтапного
расщепления
питательных
веществ
под
влиянием
ферментов
пищеварительного аппарата, на количественный и качественный состав
которых существенное влияние оказывает характер поступающих с пищей
веществ. Многие проблемы наследственной патологии человека, развитие
врожденных пороков обмена тесно связаны с дефектами или полным
отсутствием синтеза специфических ферментов. Проблемы клеточного роста
и развития, дифференцировки клеток высших организмов, физиологических
функций (движение, перемещение в пространстве, транспорт веществ и
ионов, процессы возбуждения и торможения и др.) определяются в большой
степени работой биокатализаторов, включая их биосинтез и инактивацию.
Таким образом, есть все основания для подтверждения положения, что не
только современная биология, как отмечает акад. А.Е. Браунштейн, но и
медицина «говорит на языке энзимологии».
Явления брожения и переваривания известны с незапамятных времен,
однако зарождение учения о ферментах (энзимология) относится к первой
половине XIX в. Первое научное представление о ферментах было дано еще
в 1814 г. петербургским ученым К.С. Кирхгофом, который показал, что не
только проросшие зерна ячменя, но и экстракты из солода способны
59
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
осахаривать крахмал с превращением его в мальтозу. Вещество, извлекаемое
из проросшего ячменя и обладающее способностью превращать крахмал в
мальтозу, получило название амилазы. Ю. Либих и Ф. Велер открыли агент,
расщепляющий амигдалин, содержащийся в эфирном масле горького
миндаля. Этот агент был назван эмульсином. В последующие годы были
описаны другие ферменты, в частности пепсин и трипсин, вызывающие
распад (гидролиз) белков в пищеварительном тракте.
Наибольшее внимание исследователей привлекали процессы окисления
в организме. Уже был известен феномен химического катализа, означающий,
что многие реакции in vitro протекают быстро и энергично в присутствии
ничтожных количеств примесей, как будто не участвующих в реакции. Так,
была установлена большая каталитическая роль ряда неорганических
веществ. Горение глюкозы на воздухе, например, протекает очень медленно,
а если добавить немного солей лития (или золы, также содержащей
ничтожные количества лития), то горение идет весьма интенсивно:
С6Н1206 + 602-> 6С02 + 6Н20.
Известно, что в живых организмах «горение» (а точнее, окисление)
углеводов также протекает быстро и до тех же конечных продуктов обмена,
т.е. СО2 и Н2О, с выделением (и накоплением) энергии. Однако это «горение»
происходит при относительно низкой температуре, без пламени и, что
особенно интересно, в присутствии воды. Разумеется, в этих необычных
условиях без действия ферментов, получивших наименование биологических
катализаторов, не было бы окисления углеводов. Забегая несколько вперед,
укажем, что в процессе превращения (окисления) глюкозы в организме до
СО2и Н2О участвует последовательно около 15 различных ферментов.
Биологические катализаторы, т.е. ферменты, как оказалось, не
вызывают в отличие от неорганических катализаторов каких-либо побочных
реакций и не участвуют в реакциях, невозможных по термодинамическим
условиям; и те, и другие катализаторы только ускоряют химические реакции,
обычно протекающие очень медленно. Примером может служить реакция
60
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
расщепления перекиси водорода на кислород и воду, медленно протекающая
в отсутствие катализатора. При добавлении мелкораздробленной платины
скорость этой реакции резко возрастает в соответствии с выражением (4).
(4)
Эта же реакция будет протекать намного быстрее в присутствии
фермента каталазы, содержащейся, в частности, в эритроцитах, причем
образуются те же конечные продукты распада перекиси водорода.
Таким образом, можно считать установленным, что ферменты
катализируют ряд химических реакций, аналогичных химическим реакциям,
катализируемым неорганическими веществами. Более того, считается
установленным, что любую из протекающих в живых организмах (или
клетках)
химическую реакцию можно в принципе осуществить вне
организма (или вне клетки), если экспериментатору удается выделить
соответствующий фермент (или систему ферментов), катализирующий
данную реакцию, и создать оптимальные условия для его действия.
5.1 Горизонты энзимологии
В литературе появляются работы, в которых делаются попытки
прогнозирования
дальнейшего
развития
энзимологии
на
ближайшее
десятилетие. Перечислим основные направления исследований энзимологии
будущего. Во-первых, это исследования более тонких деталей молекулярного
механизма и принципов действия ферментов в соответствии с законами
классической органической химии и квантовой механики, а также разработка
на этой основе теории ферментативного катализа. Во-вторых, это изучение
ферментов на более высоких уровнях (надмолекулярном и клеточном)
структурной организации живых систем, причем не столько отдельных
ферментов, сколько ферментных комплексов в сложных системах. В-третьих,
61
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
исследование механизмов регуляции активности и синтеза ферментов и
вклада химической модификации в действие ферментов. В-четвертых, будут
развиваться
исследования
низкомолекулярных
ферментов),
в
ферментов
наделенных
области
–
создания
синзимов
аналогично
искусственных
(синтетические
нативным
аналоги
ферментам
высокой
специфичностью действия и каталитической активностью, но лишенных
побочных антигенных свойств. В-пятых, исследования в области инженерной
энзимологии (белковая инженерия), создание «гибридных» катализаторов,
сочетающих свойства ферментов, антител и рецепторов, а также создание
биотехнологических реакторов с участием индивидуальных ферментов или
полиферментных комплексов, обеспечивающих получение и производство
наиболее ценных материалов и средств для народного хозяйства и медицины.
Наконец, исследования в области медицинской энзимологии, основной
целью которых является выяснение молекулярных основ наследственных и
соматических болезней человека, в основе развития которых лежат дефекты
синтеза ферментов или нарушения регуляции активности ферментов.
В природе существуют как простые, так и сложные ферменты. Первые
целиком
представлены
полипептидными
цепями
и
при
гидролизе
распадаются исключительно на аминокислоты. Такими ферментами (простые
белки) являются гидролитические ферменты, в частности пепсин, трипсин,
папаин, уреаза, лизоцим, рибонуклеаза, фосфатаза и др. Большинство
природных ферментов относится к классу сложных белков, содержащих,
помимо
полипептидных
цепей,
какой-либо
небелковый
компонент
(кофактор), присутствие которого является абсолютно необходимым для
каталитической активности. Кофакторы могут иметь различную химическую
природу и различаться по прочности связи с полипептидной цепью. Если
константа диссоциации сложного фермента настолько мала, что в растворе
все полипептидные цепи оказываются связанными со своими кофакторами и
не разделяются при выделении и очистке, то такой фермент получает
название холофермента (холоэнзим), а кофактор – простетической группы,
62
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
рассматривающейся
как
интегральная
часть
молекулы
фермента.
Полипептидную часть фермента принято называть апоферментом.
В литературе до сих пор употребляются и другие наименования
компонентов
«белковый
сложных
ферментов,
компонент»
в
частности
(апофермент),
«фермент-протеид»,
«кофермент»
«простетическая
группа».
Под
коферментом
дополнительную
группу,
легко
отделяемую
часто
от
(коэнзим)
и
подразумевают
апофермента
при
диссоциации. Предполагают, что простетическая группа может быть связана
с белком ковалентными и нековалентными связями. Так, в молекуле
ацетилкоэнзим-А-карбоксилазы кофактор биотин ковалентно связан с
апоферментом посредством амидной связи. С другой стороны, химические
связи между кофакторами и пептидными цепями могут быть относительно
слабыми (например, водородные связи, электростатические взаимодействия
и др.). В таких случаях при выделении ферментов наблюдается полная
диссоциация обеих частей, и изолированый белковый компонент оказывается
лишенным ферментативной активности, пока не будет добавлен извне
недостающий
кофактор.
низкомолекулярным
Именно
органическим
к
подобным
веществам
изолированным
применим
термин
«кофермент», типичными представителями которых являются витамины В1,
В2, В6, РР, содержащие кофер-менты. Известно также, что и простетические
группы, и коферменты активно включаются в химические реакции, выполняя
функции промежу-тоных переносчиков электронов, атомов водорода или
различных функциональных групп
(например, аминных, ацетильных,
карбоксильных). В подобных случаях кофермент рассматривают в качестве
второго субстрата, или косубстрата.
Субстрат подвергается окислению, отдавая электроны и протоны, а
КоЕ – восстановлению, принимая электроны и протоны. В следующей
полуреакции восстановленный КоЕН может отдавать электроны и протоны
на какой-либо другой промежуточный переносчик электронов и протонов
или на конечный акцептор.
63
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Роль кофермента (Ко) в качестве переносчика, например, атомов
водорода может быть представлена в виде схемы:
где SH – субстрат; КоЕ – холофермент; А – акцептор протона.
Рисунок 33 - Перенос атомов водорода
Коэнзим,
кофактор,
простетическая
группа
–
двусмысленный
биохимический жаргон. До сих пор продолжается терминологический спор,
поскольку часто определения «коэнзим», «кофактор» и «простетическая
группа» рассматриваются через призму их роли в реакциях энзиматического
(ферментативного) катализа. Следует, однако, считаться с тем неоспоримым
фактом, что во многих случаях небелковые органические молекулы, как и
ионы металлов, абсолютно необходимы белковому компоненту при
выполнении определенной биологической функции, не имеющей отношения
к биокатализу. Несомненно, имеют значение также тип и характер связи
небелкового компонента с молекулой белка. Поэтому очевидно, что
кофактором может служить любой фактор, абсолютно необходимый для
выполнения белком его каталитической или любой другой биологической
роли. С другой стороны, коферментом может быть любой небелковый
фактор, который непосредственно вовлечен в реакцию энзиматического
катализа. Кофактор, который непосредственно не участвует в акте катализа,
не является коэнзимом. В то же время простетическую группу (ковалентно
связанный небелковый компонент, необходимый для определенной функции)
можно назвать коферментом, если она непосредственно участвует в
энзиматической реакции. Простетическая группа, которая не вовлечена в акт
катализа, но функционально является существенным как для фермента, так и
для некаталитического белка, может быть названа кофактором. И наконец,
кофактор и кофермент, непрочно связанные (или слабо связанные) с
64
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ферментом или белком, тем не менее не классифицируются в качестве
простетических групп.
Многие двухвалентные металлы (Mg2+, Мn2+, Са2+), как будет показано
далее, также выполняют роль кофакторов, хотя они не относятся ни к
коферментам, ни к простетическим группам. Известны примеры, когда ионы
металлов прочно связаны с белковой молекулой, выполняя функции
простетической группы. В частности, очищенный фермент, катализирующий
окисление аскорбиновой кислоты (витамин С) в дезоксиаскорбиновую
кислоту, содержит 8 атомов меди на одну молекулу; все они настолько
прочно связаны с белковой молекулой, что даже не обмениваются с
ионообменными смолами и не отделяются методом диализа. Более того, с
помощью метода электронного парамагнитного резонанса показано участие
ионов меди в промежуточном переносе электронов. Интересно отметить, что
свободные ионы меди также наделены каталитической активностью при
окислении аскорбиновой кислоты, однако эта активность повышается во
многие тысячи раз, если ионы меди соединяются с апоферментом в единый
комплекс – холофермент.
Получены доказательства кофакторной функции в ферментативных
реакциях и ряда других биологически активных соединений, не относящихся
к витаминам: HS-глутатиона, АТФ, липоевой кислоты, производных нуклеозидов (уридинфосфат, цитидинфосфат, фосфоаденозинфосфосульфат),
порфиринсодержащих веществ и др. Сюда же могут быть отнесены тРНК,
которые
в
составе
ферментов
аминоацил-тРНК-синтетаз
принимают
активное участие в транспорте аминокислот в рибосоме, где осуществляется
синтез белка.
Следует
отметить
одну
отличительную
особенность
двухкомпонентных ферментов: ни кофактор отдельно (включая большинство
коферментов), ни сам по себе апофермент каталитической активностью не
наделены, и только их объединение в одно целое, протекающее не хаотично,
а в соответствии с программой их структурной организации, обеспечивает
65
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
быстрое протекание химической реакции.
При изучении механизма химической реакции, катализируемой
ферментами, исследователя всегда интересует не только определение
промежуточных и конечных продуктов и выяснение отдельных стадий
реакции, но и природа тех функциональных групп в молекуле фермента,
которые обеспечивают специфичность действия фермента на данный
субстрат (субстраты) и высокую каталитическую активность. Речь идет,
следовательно, о точном знании геометрии и третичной структуры фермента,
а также химической природы того участка (участков) молекулы фермента,
который
обеспечивает
высокую
скорость
каталитической
реакции.
Участвующие в ферментативных реакциях молекулы субстратов часто
имеют небольшие размеры по сравнению с молекулами ферментов, поэтому
было высказано предположение, что при образовании фермент-субстратных
комплексов в непосредственный контакт с молекулой субстрата, очевидно,
вступает ограниченная часть аминокислот пептидной цепи. Отсюда возникло
представление об активном центре фермента. Под активным центром
подразумевают уникальную комбинацию аминокислотных остатков в
молекуле фермента, обеспечивающую непосредственное связывание ее с
молекулой субстрата и прямое участие в акте катализа. Установлено, что у
сложных ферментов в состав активного центра входят также простетические
группы.
В активном центре условно различают так называемый каталитический
центр, непосредственно вступающий в химическое взаимодействие с
субстратом, и связывающий центр, или контактную («якорную») площадку,
которая обеспечивает специфическое сродство к субстрату и формирование
его комплекса с ферментом (см. рисунок 34, 35). В свою очередь молекула
субстрата также содержит функционально различные участки: например,
субстраты эстераз или протеиназ – одну специфическую связь (или группу
атомов), подвергающуюся атаке со стороны фермента, и один или несколько
участков, избирательно связываемых ферментом.
66
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Темные полосы - участки полипептидной цепи фермента; R аминокислотные остатки и их порядковые номера (с N-конца).
Рисунок 34 - Активный центр фермента в структурной модели
Рисунок 35 - Активный центр фермента (схема) (по Малеру и Кордесу)
Получены экспериментальные доказательства наличия в активном
центре
химотрипсина
схематически
двух
остатков
представленных
в
гистидина
трехмерной
и
остатка
серина,
структурной
модели
предшественника этого фермента (см. рисунок 36). Выявление химической
природы и вероятной топографии групп активного центра – проблема
первостепенной
важности.
Она
сводится
к
определению
природы
аминокислот, их последовательности и взаиморасположения в активном
центре. Для идентификации так называемых существенных аминокислотных
67
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
остатков используют специфические ингибиторы ферментов (часто это
субстрат подобные вещества или аналоги коферментов), методы «мягкого»
(ограниченного) гидролиза в сочетании с химической модификацией,
включающей избирательное окисление, связывание, замещение остатков
аминокислот и др.
Рисунок 36 - Гипотетическая модель третичной структуры молекулы
предшественника химотрипсина (по Нейрату). Цветом выделены остатки
серина и гистидина; стрелкой обозначено место отщепления N-концевого
участка полипептидной цепи
При помощи методов ингибиторного анализа были предприняты
попытки установить закономерности состава и структуры активных центров
у
ферментов,
относящихся
к
разным
группам.
В
частности,
при
использовании диизопропилфторфосфата (ДФФ), принадлежащего к так
называемым нервным ядам, наблюдается полное выключение активного
центра холинэстеразы – фермента, катализирующего гидролиз ацетилхолина
на холин и уксусную кислоту. Оказалось, что этот ингибитор имеет близкое
структурное сходство с ацетилхолином и подобно ему взаимодействует с
ОН-группой остатка серина в активном центре. Вызывая фосфорилирование
серина в активном центре ряда других ферментов, ДФФ также инактивирует
их действие (см. рисунок 37):
68
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 37 - Инактивация фермента диизопропилфторфосфатом
(схема)
Показано,
что
ДФФ
избирательно
фосфорилирует
в
каждом
чувствительном к нему ферменте только один остаток серина, наделенный
функциональной активностью. Учитывая этот механизм действия ДФФ,
сделаны
попытки
определения
природы
аминокислот
в
окружении
«каталитического» остатка серина у ряда ферментов.
Существенное значение ОН-группы серина для акта катализа было
доказано, химическим ее блокированием или удалением, когда эстеразы
полностью лишались ферментативной активности.
Предполагают,
что
формирование
активного
центра
фермента
начинается уже на ранних этапах синтеза белка-фермента на рибосоме, когда
линейная одномерная структура пептидной цепи превращается в трехмерное
тело
строго
приобретает
определенной
информацию
конфигурации.
совершенно
Образовавшийся
нового
типа,
а
белок
именно
функциональную (в частности, каталитическую). Любые воздействия,
приводящие к денатурации, т.е. нарушению третичной структуры, приводят к
искажению или разрушению структуры активного центра и соответственно
потере ферментом каталитических свойств. Если при подходящих внешних
условиях удается восстановить нативную трехмерную структуру белкафермента (ренатурировать его), то восстанавливается и его каталитическая
активность. Это было показано впервые на примере рибонуклеазы
поджелудочной железы.
69
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Помимо активного центра, в молекуле фермента может присутствовать
также аллостерический центр (или центры) (от греч. allos – другой, иной и
steros – пространственный, структурный), представляющий собой участок
молекулы фермента, с которым связываются определенные, обычно
низкомолекулярные, вещества (эффекторы, или модификаторы), молекулы
которых отличаются по структуре от субстратов. Присоединение эффектора
к аллостерическому центру изменяет третичную и часто также четвертичную
структуру молекулы фермента и соответственно конфигурацию активного
центра, вызывая снижение или повышение энзиматической активности.
Ферменты, активность каталитического центра которых подвергается
изменению под влиянием аллостерических эффекторов, связывающихся с
аллостерическим центром, получили название аллостерических ферментов
(см. рисунок 18):
S – субстрат; М1 – модификатор, связывающийся в активном центре;
М2 – модификатор, связывающийся в аллостерическом центре (эффектор).
Рисунок 38 - Схематическое изображение аллостерического фермента,
состоящего из двух протомеров, соединенных по типу гетерологической
(«голова»-«хвост») ассоциации (по Кошленду)
Отличительной
особенностью
ряда
аллостерических
ферментов
является наличие в молекуле олигомерного фермента нескольких активных
центров
и
нескольких
аллостерических
70
регуляторных
центров,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пространственно удаленных друг от друга. В аллостерическом ферменте
каждый из двух симметрично построенных протомеров содержит один
активный центр, связывающий субстрат S, и один аллостерический центр,
связывающий эффектор М2, т.е. 2 центра в одной молекуле фермента.
Получены доказательства, что для субстрата аллостерические ферменты,
помимо активного центра, содержат и так называемые эффекторные центры;
при связывании с эффекторным центром субстрат не подвергается
каталитическому превращению, однако он влияет на каталитическую
эффективность
центрами,
активного
связывающими
центра.
Подобные
лиганды
одного
взаимодействия
типа,
принято
между
называть
гомотропными взаимодействиями, а взаимодействия между центрами,
связывающими лиганды разных типов, – гетеротропными взаимодействиями.
Таким образом, приведенные сведения о химической природе
активного центра и аллостерических участках свидетельствуют о том, что в
энзиматическом катализе, как и в реакции связывания субстрата, участвует
не ограниченная и небольшая часть фермента, как предполагалось ранее, а
значительно
большая
часть
молекулы
белка-фермента.
Этими
обстоятельствами, вероятнее всего, можно объяснить большие размеры и
объемность
трехмерной
структуры
молекулы
фермента;
эти
же
обстоятельства следует учитывать в программах создания искусственных
низкомолекулярных
аналогов
ферментов
(синзимов),
обладающих
свойствами нативных ферментов.
Структура и функции ферментов, а также механизм их действия почти
ежегодно подробно обсуждаются на многих международных симпозиумах и
конгрессах. Важное место отводится рассмотрению структуры всей
молекулы фермента и ее активных центров, молекулярному механизму
действия различных типов ферментов, общей теории энзиматического
катализа. Тем не менее до сих пор нет полной ясности по двум кардинальным
проблемам энзимологии: чем вызваны специфичность действия и высокая
каталитическая эффективность ферментов?
71
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
До установления
химической природы ферментов гипотезы
о
механизме их действия опирались на исследования кинетики и модельные
опыты химического гомогенного катализа. Повышение скорости химических
реакций под действием ферментов объясняли следующим: а) активированием
субстрата в результате образования адсорбционных или молекулярных,
обратимо диссоциирующих фермент-субстратных комплексов; б) цепным
механизмом реакций с участием радикалов или возбужденных молекул.
Оказалось, что цепные механизмы реакции не играют существенной роли в
биологическом
катализе.
После
установления
химической
природы
ферментов подтвердилось представление, выдвинутое более 80 лет назад В.
Анри, Л. Михаэлисом и М. Ментен, о том, что при энзиматическом катализе
фермент Е соединяется (в принципе обратимо) со своим субстратом S,
образуя нестойкий промежуточный фермент-субстратный комплекс ES,
который в конце реакции распадается с освобождением фермента и
продуктов реакции Р.
Благодаря
высокому сродству связывания
и
образованию ES-комплекса резко возрастает число молекул субстрата,
вступающих в реакции. Эти представления легли в основу теории «ключазамка» Э. Фишера, которую иногда называют теорией «жесткой матрицы».
Таким
образом,
жесткая
структура
активного
центра
оказывается
комплементарной молекулярной структуре субстрата, обеспечивая тем
самым высокую специфичность фермента.
Л. Михаэлис не только постулировал образование промежуточного
фермент-субстратного ES-комплекса, но и рассчитал влияние концентрации
субстрата на скорость реакции. В процессе реакции различают несколько
стадий: присоединение молекулы субстрата к ферменту, преобразование
первичного
промежуточного
соединения
в
один
или
несколько
последовательных (переходных) комплексов и протекающее в одну или
несколько стадий отделение конечных продуктов реакции от фермента. Это
можно схематически проиллюстрировать следующими примерами (5):
E+S↔ES→…→E+P
72
(5)
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В реакциях анаболизма, например, А + В —> АВ, фермент может
соединяться как с одним, так и с другим субстратом или обоими субстратами
(см. рисунок 39)
Рисунок 39 – Реакции анаболизма (схема)
В реакциях катаболизма (см. рисунок 40), например АВ —> А + В:
Рисунок 40 – Реакции катаболизма
Фермент вступает во взаимодействие с субстратом на очень короткий
период, поэтому долгое время не удавалось показать образование такого
комплекса. Прямые доказательства существования фермент-субстратного
комплекса были получены в лабораториях Д. Кейлина и Б. Чанса. В
настоящее время экспериментальные и математические методы кинетики,
термодинамики и статической механики химических реакций позволяют
(см. рисунок 41):
Рисунок 41 - Образование нестойкого фермент-субстратного комплекса
согласно теории Э. Фишера «ключ-замок»
73
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Определить для ряда ферментативных реакций кинетические и
термодинамические
показатели,
в
частности
константы
диссоциации
промежуточных фермент-субстратных комплексов, константы скорости и
равновесия их образования (см. рисунок 42).
Рисунок 42 - Функция кофермента (по А. Кантарову и Б. Шепартцу)
В
образовании
фермент-субстратных
комплексов
участвуют
водородные связи, электростатические и гидрофобные взаимодействия, а в
ряде случаев также ковалентные, координационные связи. Информация о
природе связей между субстратом и связывающим участком активного
центра фермента может быть получена методами ЭПР и ЯМР, а также
методами УФ- и ИК-спектроскопии (см. рисунок 43):
74
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 43 - Образование нековалентных связей между ферментом и
субстратом (схема)
Для каталитической активности фермента существенное значение
имеет пространственная структура, в которой жесткие участки α-спиралей
чередуются
с
гибкими,
эластичными
линейными
отрезками,
обеспечивающими динамические изменения белковой молекулы фермента.
Этим изменениям придается большое значение в некоторых теориях
ферментативного катализа. Так, в противоположность модели Э. Фишера
«ключ-замок» Д. Кошлендом была разработана теория «индуцированного
соответствия»,
допускающая
высокую конформационную лабильность
молекулы белка-фермента и гибкость и подвижность активного центра. Эта
теория
была
основана
на
весьма
убедительных
экспериментах,
свидетельствующих о том, что субстрат индуцирует конформационные
изменения молекулы фермента таким образом, что активный центр
принимает необходимую для связывания субстрата пространственную
ориентацию. Иными словами, фермент только в присутствии (точнее, в
момент
присоединения)
субстрата
будет
находиться
в
активной
(напряженной) Т-форме в отличие от неактивной R-формы (см. рисунок 44).
75
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
На рисунке 44 видно, что присоединение субстрата S к ферменту Е, вызывая
соответствующие изменения конформации активного центра, в одних
случаях приводит к образованию активного комплекса, в других –
неактивного
комплекса
вследствие
нарушения
пространственного
расположения функциональных групп активного центра в промежуточном
комплексе.
А, В, С - функциональные группы активного центра; 1 - активный
комплекс; 2 - неактивный комплекс.
Рисунок 44 - Изменения структуры активного центра фермента,
вызванные субстратом, согласно модели «индуцированного соответствия» Д.
Кошленда
Получены экспериментальные доказательства нового положения о том,
что постулированное
Д.
Кошлендом
«индуцированное
соответствие»
субстрата и фермента создается не обязательно изменениями конформации
белковой
молекулы,
но
также
геометрической
и
электронно-
топографической перестройкой молекулы субстрата.
В каталитическом процессе существенное значение имеют точное
соответствие между ферментом и субстратом, а также термодинамические и
каталитические
преимущества
«индуцированного
соответствия»
подобного
предполагает
соответствия.
существование
Гипотеза
между
ферментом и субстратом не только пространственной или геометрической
компле-ментарности,
но
и
электростатического
соответствия,
обусловленного спариванием противоположно заряженных групп субстрата
76
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
и
активного
центра
фермента.
Точное
соответствие
обеспечивает
образование эффективного комплекса между субстратом и ферментом.
Подобно другим катализаторам, ферменты, с термодинамической
точки зрения, ускоряют химические реакции за счет снижения энергии
активации. Энергией активации называется энергия, необходимая для
перевода всех молекул моля вещества в активированное состояние при
данной температуре. Другими словами, это энергия, необходимая для
запуска химической реакции, без которой реакция не начинается несмотря на
ее термодинамическую вероятность. Фермент снижает энергию активации
путем увеличения числа активированных молекул, которые становятся
реакционно-способными
на
более
низком
энергетическом
уровне
(см. рисунок 45)
S – исходный субстрат; Р - продукт; ΔЕНФ -энергия активации
неферментативной реакции; ΔЕФ - энергия активации ферментативной
реакции; ΔG - стандартное изменение свободной энергии.
Рисунок
45
-
Энергетический
механизм
ферментативной
и
неферментативной химических реакций
На рисунке 45 видно, что ферментативная реакция имеет более низкую
энергию активации. Следует отметить, что как катализируемая ферментом,
77
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
так и не катализируемая им реакция независимо от ее пути имеет
одинаковую величину стандартного изменения свободной энергии (ΔG).
Действуя на скорость реакции, ферменты не изменяют равновесия между
прямой и обратной реакциями, как и не влияют на величину свободной
энергии реакции; они лишь ускоряют наступление равновесия химической
реакции.
Зависимость между константой равновесия и изменением свободной
энергии
реагирующих
веществ
математически
принято
выражать
уравнением (6):
,
(6)
где R – газовая постоянная;
Т – абсолютная температура в Кельвинах;
lnК – натуральный логарифм константы равновесия;
ΔG – стандартное изменение свободной энергии, Дж/моль.
Из представленного уравнения вытекает, что при высоком значении К
величина
ΔG
оказывается
отрицательной.
Подобные
реакции
сопровождаются уменьшением свободной энергии. При низком значении К
величина ΔG оказывается положительной. Если константа равновесия равна
единице, то изменение свободной энергии будет равно нулю и реакция легко
обратима.
Для измерения константы равновесия и величины свободной энергии
какой-либо химической реакции, например реакции взаимопревращения
глюкозо-1-фосфата
в
глюкозо-6-фосфат,
катализируемой
ферментом
фосфоглюкомутазой, определяют количество глюкозо-6- и глюкозо-1фосфата при достижении химического равновесия. В состоянии равновесия
содержание глюкозо-6-фосфата оказывается в 19 раз больше количества
глюкозо-1-фосфата. Отсюда константа равновесия К равна 19. Подставляя
эту цифру в уравнение, получаем ΔG = –7329 Дж/моль. Это означает, что при
превращении 1 моля глюкозо-1-фосфата в 1 моль глюкозо-6-фосфата при
температуре 25 °С происходит уменьшение свободной энергии системы на
78
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7329 Дж.
Таким образом, в механизме ферментативного катализа ведущую роль
играют промежуточные фермент-субстратные комплексы, образование
которых определяется как тонкой трехмерной структурой активного центра,
так и уникальной структурной организацией всей молекулы фермента,
обеспечивающими высокую каталитическую активность и специфичность
действия биокатализатора.
Одним из характерных проявлений жизни является удивительная
способность живых организмов кинетически регулировать химические
реакции,
подавляя
равновесия.
стремление
Ферментативная
к
достижению
кинетика
термодинамического
занимается
исследованием
закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ
(ферментов, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрация, рН
среды, температуры, присутствие активаторов или ингибиторов) на скорость
ферментативной
реакции.
Главной
целью
изучения
кинетики
ферментативных реакций является получение информации, которая может
способствовать выяснению молекулярного механизма действия фермента.
Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к
ферментативным реакциям. Известно, что любая химическая реакция
характеризуется
константой
термодинамического
равновесия
предсатвленной системой (7). Она выражает состояние химического
равновесия, достигаемого системой, и обозначается Кр:
(7)
Константа
равновесия
равна
произведению
концентраций
образующихся веществ, деленному на произведение концентрации исходных
веществ. Значение константы равновесия обычно находят из соотношения
констант скоростей прямой (k+1) и обратной (k –1) реакций, т.е. Кp = k+1/k–1.
79
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В состоянии равновесия скорость прямой реакции: v+1 = k + 1[ А ] • [ B ]
равна скорости обратной реакции: v–1=k–1[С] • [D], т. е. v+1= v–1
соответственно k+1[А]•[B] = k–1[С]•[D], или (см. рисунок 46)
а - реакция
первого порядка
(при [S]<Кm скорость реакции
пропорциональна концентрации субстрата); б - реакция смешанного порядка;
в – реакция нулевого порядка, когда v = Vmaxи скорость реакции не зависит от
концентрации субстрата.
Рисунок
46
-
Теоретический
график
зависимости
скорости
ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной
концентрации фермента
Таким образом, константа равновесия равна отношению констант
скоростей прямой и обратной реакций (8). Величину, обратную константе
равновесия, принято называть субстратной константой, или, в случае
ферментативной реакции, константой диссоциации фермент–субстратного
комплекса, и обозначать символом KS:
(8)
т.е. KS равна отношению произведения концентрации фермента и
субстрата к концентрации фермент-субстратного комплекса или отношению
констант скоростей обратной и прямой реакций. Следует отметить, что
80
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
константа KS зависит от химической природы субстрата и фермента и
определяет степень их сродства. Чем ниже значение KS, тем выше сродство
фермента к субстрату.
При изучении кинетики ферментативных реакций следует учитывать
одну важную особенность этих реакций (не свойственную обычным
химическим реакциям), связанную с явлением насыщения фермента
субстратом. При низкой концентрации субстрата зависимость скорости
реакции от концентрации субстрата является почти линейной и подчиняется
кинетике первого порядка. Это означает, что скорость реакции S —> Р прямо
пропорциональна концентрации субстрата S и в любой момент времени t
определяется следующим кинетическим уравнением (9):
(9)
где [S] – молярная концентрация субстрата S;
d[S]/dt – скорость убыли субстрата;
k' – константа скорости реакции, которая в данном случае имеет
размерность, обратную единице времени (мин–1 или с–1).
При высокой концентрации субстрата скорость реакции максимальна,
становится постоянной и не зависящей от концентрации субстрата [S] . В
этом случае реакция подчиняется кинетике нулевого порядка v = k" (при
полном
насыщении
фермента
субстратом)
и
целиком
определяется
концентрацией фермента. Различают, кроме того, реакции второго порядка,
скорость которых пропорциональна произведению концентраций двух
реагирующих
веществ.
В
определенных
условиях
при
нарушении
пропорциональности говорят иногда о реакциях смешанного порядка.
Изучая явление насыщения, Л. Михаэлис и М. Ментен разработали
общую теорию ферментативной кинетики. Они исходили из предположения,
что ферментативный процесс протекает в виде следующей химической
реакции (10):
81
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
(10)
т.е. фермент Е вступает во взаимодействие с субстратом S с
образованием промежуточного комплекса ES, который далее распадается на
свободный фермент и продукт реакции Р. Математическая обработка на
основе закона действующих масс дала возможность вывести уравнение,
названное в честь авторов уравнением Михаэлиса–Ментен (11), выражающее
количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью
ферментативной реакции:
(11)
где v – наблюдаемая скорость реакции при данной концентрации
субстрата [S];
KS– константа диссоциации фермент-субстратного комплекса, моль/л;
Vmax– максимальная скорость реакции при полном насыщении
фермента субстратом.
Из
уравнения
Михаэлиса–Ментен
следует,
что
при
высокой
концентрации субстрата и низком значении KS скорость реакции является
максимальной, т.е. v = Vmax(реакция нулевого порядка). При низкой
концентрации
субстрата,
напротив,
скорость
реакции
оказывается
пропорциональной концентрации субстрата в каждый данный момент
(реакция первого порядка).
Следует указать, что уравнение Михаэлиса–Ментен в его классическом
виде не учитывает влияние на скорость ферментативного процесса продуктов
реакции, и носит несколько ограниченный характер. Поэтому были
предприняты попытки усовершенствовать его. Так, было предложено
уравнение Бриггса-Холдейна (12):
(12)
где Кm представляет собой константу Михаэлиса, являющуюся
82
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
экспериментально определяемой величиной. Она может быть представлена
следующим уравнением (13):
(13)
Рисунок 47 - Кривая уравнения Михаэлиса-Ментен: гиперболическая
зависимость начальных скоростей катализируемой ферментом реакции от
концентрации субстрата
В числителе представлены константы скоростей распада комплекса ES
в двух направлениях (в сторону исходных Е и S и в сторону конечных
продуктов реакции Е и Р). Отношение k–1/k+1представляет собой константу
диссоциации фермент субстратного комплекса KS, тогда (14):
(14)
Отсюда вытекает важное следствие: константа Михаэлиса всегда
больше константы диссоциации фермент-субстратного комплекса KS на
величину (15):
k+2/k+1
(15)
Для определения численного значения Кm обычно находят ту
концентрацию субстрата, при которой скорость ферментативной реакции v
составляет половину от максимальной Vmax, т.е. если v =
значение v в уравнение Бриггса–Холдейна, получаем (16):
83
½
Vmaх. Подставляя
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
(16)
разделив обе части уравнения на Vmах, получим (17)
(17)
Таким образом, константа Михаэлиса численно равна концентрации
субстрата (моль/л), при которой скорость данной ферментативной реакции
составляет половину от максимальной.
Определение величины Кm имеет важное значение при выяснении
механизма действия эффекторов на активность ферментов и т.д. Константу
Михаэлиса
можно
соответствующий
вычислить
скорости,
по
равной
графику.
Отрезок
половине
на
абсциссе,
максимальной,
будет
представлять собой Кm.
Пользоваться
графиком,
построенным
в
прямых
координатах
зависимости начальной скорости реакции v0 от начальной концентрации
субстрата [S0], неудобно, поскольку максимальная скорость Vmax является в
данном случае асимптотической величиной и определяется недостаточно
точно.
Рисунок 45 -График Лайнуивера-Бэрка
Для более удобного графического представления экспериментальных
данных Г. Лайнуивер и Д. Бэрк преобразовали уравнение Бриггса–Хол-дейна
по методу двойных обратных величин исходя из того принципа, что если
существует равенство между двумя какими-либо величинами, то и обратные
84
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
величины также будут равны (18):
(18)
Или (19)
(19)
то после преобразования получаем уравнение (20):
(20)
которое
получило
название
уравнения
Лайнуивера–Бэрка.
Это
уравнение прямой линии: у = ах + b. Если теперь в соответствии с этим
уравнением построить график в координатах 1/v (y) от l/[S] (x), то получим
прямую линию, тангенс угла наклона который будет равен величине Km/Vmax;
отрезок,
отсекаемый
прямой
от
оси
ординат,
представляет
собой
l/Vmax(обратная величина максимальной скорости). Если продолжить прямую
линию
за
ось
ординат,
тогда
на
абсциссе
отсекается
отрезок,
соответствующий обратной величине константы Михаэлиса – 1/Кm (. Таким
образом, величину Кm можно вычислить из данных наклона прямой и длины
отрезка, отсекаемого от оси ординат, или из длины отрезка, отсекаемого от
оси абсцисс в области отрицательных значений.
Следует подчеркнуть, что значения Vmax, как и величину Кm, более
точно, чем по графику, построенному в прямых координатах, можно
определить по графику, построенному по методу двойных обратных величин.
Поэтому данный метод нашел широкое применение в современной
энзимологии.
Предложены
также
аналогичные
графические
способы
определения Кm и Vmax в координатах зависимости v от v/[S] и [S]/v от [S].
Следует отметить некоторые ограничения применения уравнения Михаэлиса–Ментен, обусловленные множественными формами ферментов и
аллостерической природой фермента (см. рисунок 49).
85
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 49 - Сигмоидная кинетическая кривая насыщения субстратом
В этом случае график зависимости начальной скорости реакции от
концентрации субстрата, кинетическая кривая имеет не гиперболическую
форму, а сигмоидный характер наподобие кривой насыщения гемоглобина
кислородом. Это означает, что связывание одной молекулы субстрата в
одном каталитическом центре повышает связывание субстрата с другим
центром, т.е. имеет место кооперативное взаимодействие, как и в случае
присоединения кислорода к 4 субъединицам гемоглобина. Для оценки
концентрации субстрата, при которой скорость реакции составляет половину
максимальной, в условиях сигмоидного характера кинетической кривой
обычно применяют преобразованное уравнение Хилла (21):
,
(21)
где, К' – константа ассоциации;
n – число субстрат связывающих центров.
Современные
классификация
и
номенклатура
ферментов
были
разработаны Комиссией по ферментам Международного биохимического
союза и утверждены на V Международном биохимическом конгрессе в 1961
г. в Москве.
Необходимость систематики номенклатуры диктовалась прежде всего
стремительным ростом числа вновь открываемых ферментов, которым
разные исследователи присваивали названия по своему усмотрению. Более
86
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
того, одному и тому же ферменту часто давали два или несколько названий,
что вносило путаницу в номенклатуру. Некоторые названия ферментов
вообще не отражали тип катализируемой реакции, а при наименовании
фермента исходили из названия субстрата, на который действует фермент, с
добавлением окончания -аза: в частности, амилазы (ферменты, гидролизирующие углеводы), липазы (действующие на липиды), протеиназы
(гидролизирующие белки) и т.д.
До 1961 г. не было и единой классификации ферментов. Трудности
заключались в том, что разные исследователи за основу классификации
ферментов брали различные принципы. Комиссией были рассмотрены 3
принципа, которые могли служить основой для классификации ферментов и
их обозначения. Первый принцип – химическая природа фермента, т.е.
принадлежность к флавопротеинам, пиридоксальфосфат протеинам, гемопротеинам, металлопротеинам и т. д. Однако этот принцип не мог служить
общей основой для классификации, так как только для небольшого числа
ферментов известны простетические группы, доступные идентификации и
прямому определению. Второй принцип – химическая природа субстрата, на
который действует фермент. По этому принципу трудно классифицировать
фермент, так как в качестве субстрата могут служить разнообразные
соединения внутри определенного класса веществ (белки, углеводы, липиды,
нуклеиновые
кислоты)
и
бесчисленное
множество
промежуточных
продуктов обмена. В основу принятой классификации положен третий
принцип – тип катализируемой реакции , который является специфичным для
действия любого фермента. Этот принцип логично использовать в качестве
основы для классификации и номенклатуры ферментов.
Таким образом, тип катализируемой химической реакции в сочетании с
названием субстрата (субстратов) служит основой для систематического
наименования
ферментов.
Согласно
Международной
классификации,
ферменты делят на шесть главных классов, в каждом из которых несколько
подклассов: 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы; 4) лиазы; 5)
87
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
изомеразы; 6) лигазы (синтетазы).
Оксидоредуктазы. К классу оксидоредуктаз относят ферменты,
катализирующие
с
участием
двух
субстратов
окислительно-
восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисления.
Систематические названия их составляют по форме «донор: акцептор
оксидоредуктаза».
Например,
НАД+
лактат:
оксидоредуктаза
для
лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
Различают
дегидрогеназы
следующие
или
основные
оксидазы,
оксидоредуктазы:
катализирующие
аэробные
перенос
протонов
(электронов) непосредственно на кислород; анаэробные дегидрогеназы,
ускоряющие перенос протонов (электронов) на промежуточный субстрат, но
не на кислород; цитохромы, катализирующие перенос только электронов. К
этому классу относят
также
гемсодержащие
ферменты
каталазу и
пероксидазу, катализирующие реакции с участием перекиси водорода.
К
Трансферазы.
классу
трансфераз
относят
ферменты,
катализирующие реакции межмолекулярного переноса различных атомов,
групп атомов и радикалов. Наименование их составляется по форме «донор:
транспортируемая группа – трансфераза».
Различают трансферазы, катализирующие перенос одноуглеродных
остатков,
ацильных,
гликозильных,
альдегидных
или
кетонных,
нуклеотидных остатков, азотистых групп, остатков фосфорной и серной
кислот и др. Например: метил- и формилтрансферазы, ацетилтрансферазы,
амино-трансферазы, фосфотрансферазы и др.
Гидролазы. В класс гидролаз входит большая группа ферментов,
катализирующих расщепление внутримолекулярных связей органических
веществ при участии молекулы воды. Наименование их составляют по форме
«субстрат-гидролаза».
катализирующие
К
реакции
ним
относятся:
гидролиза
и
зстеразы
синтеза
–
сложных
ферменты,
эфиров;
гликозидазы, ускоряющие разрыв гликозидных связей; фосфатазы и
пептидгидролазы,
катализирующие
88
гидролиз
фосфоангидридных
и
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пептидных связей; амидазы, ускоряющие разрыв амидных связей, отличных
от пептидных, и др.
Лиазы. К классу лиаз относят ферменты, катализирующие разрыв
связей С—О, С—С, С—N и других, а также обратимые реакции отщепления
различных групп от субстратов не гидролитическим путем. Эти реакции
сопровождаются образованием двойной связи или присоединением групп к
месту разрыва двойной связи. Ферменты обозначают термином «субстратлиазы». Например, фумарат-гидратаза (систематическое название «L-малатгидролаза») катализирует обратимое отщепление молекулы воды от
яблочной кислоты с образованием фумаровой кислоты. В эту же группу
входят декарбоксилазы (карбокси-лиазы), амидин-лиазы и др.
Изомеразы. К классу изомераз относят ферменты, катализирующие
взаимопревращения
оптических
и
геометрических
изомеров.
Систематическое название их составляют с учетом типа реакции: «субстрат –
цис-транс-изомераза». Если изомеризация включает внутримолекулярный
перенос группы, фермент получает название «мутаза».
К этому же классу относят рацемазы и эпимеразы, действующие на
амино- и оксикислоты, углеводы и их производные; внутримолекулярные
оксидоредуктазы, катализирующие взаимопревращения альдоз и кетоз;
внутримолекулярные трансферазы, переносящие ацильные, фосфорильные и
другие группы, и т.д.
Лигазы
(синтетазы).
К
классу
лигаз
относят
ферменты,
катализирующие синтез органических веществ из двух исходных молекул с
использованием энергии распада АТФ (или другого нуклеозидтрифосфата).
Систематическое название их составляют по форме «X:Y лигаза», где X и Y
обозначают исходные вещества. В качестве примера можно назвать Lглутамат:
аммиак
лигазу
(рекомендуемое
сокращенное
название
«глутаминсинтетаза»), при участии которой из глутаминовой кислоты и
аммиака в присутствии АТФ синтезируется глутамин.
89
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5.2 Гидролиз крахмала α-амилазой слюны
α-Амилаза слюны относится к классу гидролаз. Специфическими
субстратами α-амилазы являются полисахариды крахмал и гликоген. В слюне
имеется α-амилаза (КФ 3.2.1.1). Для исследования действия α-амилазы слюны в
качестве субстрата берут крахмал. Нерасщепленный крахмал образует с йодом
комплекс синего цвета и не обладает восстановительной способностью, так как
почти не имеет свободных альдегидных групп. Раствор крахмала опалесцирует
вследствие своего коллоидного состояния. α-Амилаза гидролизует α-1,4глюкановые
связи в крахмале,
гликогене
и олигосахаридах,
которые
разрываются без определенного порядка. При гидролизе крахмала образуются
последовательно промежуточные продукты: амилодекстрины (дают синее или
фиолетовое
окрашивание
с
йодом),
эритродекстрины
(красно-бурое
окрашивание с йодом), ахродекстрины (не дают окрашивания с йодом),
малътодекстрины (не дают окрашивания с йодом). В качестве конечного
продукта гидролиза под действием α-амилазы образуется смесь дисахарида
мальтозы и моносахарида глюкозы. И мальтоза и глюкоза имеют свободные
альдегидные группы, вследствие чего они обладают восстановительной
способностью и открываются пробой Троммера. Опалесценция в гидролизате
крахмала значительно меньше или отсутствует в сравнении с раствором
нерасщепленного крахмала.
90
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 50 – Взаимодействие α-амилазы с крахмалом (схема)
Реактивы и материалы
Разбавленная слюна: слегка ополаскивают рот дистиллированной
водой для очищения его от остатков пищи, набирают новую порцию воды
(примерно 15—20 мл) и ополаскивают рот в течение 1—2 мин. Собранную в
стаканчик или пробирку жидкость профильтровывают и употребляют для
анализа.
Крахмал, 1 % - ный раствор, свежеприготовленный.
Раствор йода в йодистом калии (приготовление см. приложение А, п. 54).
Едкий натр, 10 % - ный раствор.
Сернокислая медь, 1 % - ный раствор.
Оборудование
Штатив с пробирками.
Стаканчики.
Воронки с фильтром.
Пипетки.
Термостат или водяная баня, снабженная термометром.
91
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Стеклянные палочки.
Капельницы.
Техника
К 5—10 каплям 1 % - ного раствора крахмала добавляют 1—2 капли
раствора йода в йодистом калии и убеждаются в том, что крахмал с йодом дает
синее окрашивание.
Заготавливают 8—10 пробирок, куда наливают по 1—3 капли раствора
йода в йодистом калии.
В две другие пробирки помещают приблизительно по 5 мл
1 % - ного раствора крахмала. В одну из них добавляют около 3 мл
дистиллированной воды (контрольный опыт), а в другую около 3 мл
разбавленной слюны (основной опыт). Содержимое обеих пробирок
перемешивают стеклянной палочкой и ставят пробирки в термостат при
37 °С или держат в зажатой кисти руки. Замечают время.
Через несколько секунд (5—7) из контрольного и основного опытов
отливают по несколько капель жидкости в пробирки с раствором йода в
йодистом калии и наблюдают окрашивание. Отбор проб и реакцию с
раствором йода производят несколько раз через короткие интервалы. Сначала
синее окрашивание будет появляться от проб, взятых из обеих пробирок;
затем из пробирки, где есть амилаза, проба жидкости начнет давать с йодом
красно-бурое окрашивание. Вскоре отмечают, что пробы жидкости из
пробирки со слюной окрашивания с йодом более не дают. Эти различные
окраски от йода указывают на то, что идет постепенный гидролиз крахмала
с образованием декстринов. Когда последняя проба жидкости, взятая из
пробирки со слюной, не изменит желтого цвета раствора йода, гидролиз
считают завершенным и записывают время его окончания.
Пробы, взятые из контрольного опыта, все время дают синее
окрашивание, что свидетельствует о том, что в отсутствие амилазы гидролиз
крахмала не происходит.
92
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
С частью растворов основного и контрольного опытов производят
пробу Троммера. С раствором из пробирки со слюной проба Троммера
будет
положительная,
вследствие
образования
конечных
продуктов
ферментативного гидролиза крахмала. Раствор контрольного опыта пробу
Троммера не дает. Наблюдают, что в пробирке с основным опытом
опалесценция раствора в процессе гидролиза исчезает.
Рекомендации к составлению протокола
Результаты работы записать в таблицу 1. В выводах обратить
внимание на то, что гидролиз крахмала под влиянием а-амилазы идет
постепенно, через промежуточные продукты, при температуре тела или
близкой к ней, в течение короткого времени. Обосновать, почему конечные
продукты гидролиза дают положительную реакцию Троммера.
Таблица 1 - Гидролиз крахмала α-амилазой слюны
Название субстрата и
продуктов его
гидролиза
Окраска при
реакции с
йодом
Время,
затраченное на
гидролиз
Температурные
условия гидролиза
Реакция
Троммера
5.3 Термолабильность α-амилазы слюны
Ферменты
термолабильны,
т.
е.
чувствительны
к
высокой
температуре. Большинство ферментов разрушается при нагревании их до
60 °С—70 °С в течение часа. При воздействии более высокой температуры от
80 °С до 100 °С в течение нескольких минут ферменты обычно полностью
утрачивают свою каталитическую активность вследствие денатурации.
Свойство ферментов инактивироваться при кипячении можно показать на
примере а-амилазы слюны.
93
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Реактивы и материалы
Разбавленная слюна
Крахмал, 1 % - ный раствор, свежеприготовленный.
Раствор йода в йодистом калии (приготовление см. приложение А,
п. 54).
Едкий натр, 10 % - ный раствор.
Сернокислая медь, 1 % - ный раствор.
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Термостат или водяная баня (37 °С).
Техника
В пробирку отливают около 2 мл разбавленной слюны и кипятят в
течение 2—3 минут (следя за тем, чтобы образующаяся пена также
прогревалась), после чего охлаждают.
В две пробирки наливают по 10 капель 1 % - ного раствора крахмала.
В одну из них добавляют 10 капель разбавленной слюны, в другую —10
капель разбавленной слюны, предварительно прокипяченной и остуженной.
Содержимое обеих пробирок перемешивают и ставят в термостат при
37 °С на 10 минут.
После 10-минутного действия фермента на субстрат из каждой
пробирки отбирают по 3—5 капель жидкости в заранее заготовленные
пробирки с 1—2 каплями раствора йода в йодистом калии. Проба из
пробирки с непрокипяченной слюной окрашивания с йодом не дает.
Проба из пробирки с предварительно прокипяченной слюной дает с йодом
синее окрашивание.
94
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
С оставшейся жидкостью в обеих пробирках производят реакцию
Троммера. Она положительна там, где была непрокипяченная слюна, и
отрицательна в случае действия на крахмал предварительно прокипяченной
слюной.
В выводах указать, какое влияние оказывает высокая температура на
гидролитическую активность α-амилазы, чем оно обусловлено и как
доказывается.
5.4 Специфичность α-амилазы слюны и сахарозы дрожжей
Специфическими субстратами для амилазы являются полисахариды
крахмал
и
гликоген.
Субстратом
для
фермента
сахаразы
(α-D-
фруктофуранозидфруктогидролаза; КФ 3.2.1.26) служит дисахарид сахароза.
Сахароза не дает пробу Троммера, так как в ее молекуле нет свободной
альдегидной или кетонной группы вследствие дигликозидной связи между
остатками глюкозы и фруктозы. После гидролиза сахарозы освобождается
альдегидная группа глюкозы и кетонная группа фруктозы, которые и
обусловливают положительную реакцию Троммера. Поэтому с помощью пробы
Троммера можно выявить, произошел или не произошел гидролиз сахарозы.
Для
исследования
специфичности
действия
ферментов
пользоваться сахарозой, содержащейся в вытяжке из дрожжей.
95
удобно
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 51 – Действие Сахаразы на Сахарозу (схема)
Реактивы и материалы
Разбавленная слюна.
Сахароза, источником служит 20 % - ная профильтрованная взвесь
растертых сухих дрожжей.
Крахмал, 1 % - ный раствор, свежеприготовленный.
Сахараза, 2% - ный раствор.
Едкий натр, 10% - ный раствор.
Сернокислая медь, 1 % - ный раствор.
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Термостат или водяная баня, снабженная термометром.
Техника
96
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Производят пробу Троммера с раствором сахарозы и убеждаются в
том, что она отрицательная.
Наливают в одну пробирку 10 капель 1 % - ного раствора крахмала, в
другую — 10 капель 2 % - ного раствора сахарозы.
В обе пробирки добавляют по 5 капель разбавленной слюны,
перемешивают содержимое пробирок и ставят их в термостат при 37 °С на
10—15 минут.
Через 10—15 минут с жидкостью из обеих пробирок проделывают пробу
Троммера. Там, где в качестве субстрата был крахмал, наблюдается
восстановление гидрата окиси меди, что указывает на расщепление крахмала
под влиянием α-амилазы. В пробирке с сахарозой восстановления гидрата
окиси меди не происходит. Это свидетельствует о том, что сахароза не
гидролизовалась и, следовательно, она не является специфическим субстратом
для α-амилазы.
Для выявления специфичности сахаразы наливают в одну пробирку 10
капель 1 % - ного раствора крахмала, а в другую — 10 капель 2 % - ного
раствора сахарозы.
В обе пробирки добавляют по 5 капель сахаразы дрожжей,
перемешивают содержимое пробирок и ставят их в термостат при 37 °С на
10—15 минут.
Через 10—15 минут с жидкостью из обеих пробирок проделывают пробу
Троммера. Там, где в качестве субстрата была сахароза, наблюдается
восстановление гидрата окиси меди, что указывает на расщепление сахарозы
под влиянием сахаразы. В пробирке с крахмалом проба Троммера
отрицательная; следовательно, крахмал не является субстратом для сахаразы.
Рекомендации к составлению протокола
Результаты работы оформить в виде таблицы 2. В выводах записать, в
чем проявляется специфичность ферментов и чем она обусловлена.
97
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 2 - Специфичность действия амилазы и сахарозы
Фермент Субстрат Температура гидролиза Реакция Троммера
5.5 Влияние рН на активность α-амилазы слюны (определение
оптимума рН для действия амилазы)
Для каждого фермента имеется определенное значение рН среды, при
котором он является наиболее активным. Активность α-амилазы слюны наиболее
высокая при рН 6,8, т. е. при почти нейтральной реакции, и понижается в кислой
и щелочной среде. Для того чтобы исследовать влияние активной реакции среды
на каталитическое действие фермента, нужно приготовить ряд растворов с
различными значениями рН, добавить к ним субстрат, фермент и определить
после инкубации, в какой среде катализ идет с наибольшей скоростью.
Реактивы и материалы
Слюна, разведенная водой (1 мл воды + 1—2 капли слюны).
Фосфатный буфер, 1/15 М со следующими значениями рН: 5,4; 6,2;
6,8; 7,2; 8,0.
Крахмал, 0,5 % - ный раствор.
Раствор йода в йодистом калии (приготовление см. приложение А,
п. 54).
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Термостат или водяная баня, снабженная термометром.
Техника
98
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В 5 пробирок отмеривают по 10 капель фосфатного буфера 1/15 М со
следующими значениями рН: 5,4; 6,2; 6,8; 7,2; 8.0.
Во все пробирки прибавляют по 10 капель 0,5 % - ного раствора
крахмала и по 1 капле разведенной водой слюны.
Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, тотчас же
помещают их в термостат при 37 °С и отмечают время.
Для выявления скорости гидролиза через интервалы в 1—2 минуты
из всех 5 пробирок отбирают по 1 капле жидкости в другие пробирки и
проделывают реакции с раствором йода в йодистом калии. Гидролиз в
каждой пробирке проводят до стадии эритродекстрина, который дает
красно-бурое окрашивание с йодом.
Отмечают время (в минутах) появления эритродекстрина в каждой из
пяти пробирок.
Рекомендации к составлению протокола
Зависимость активности амилазы от рН среды представить графически,
откладывая по оси абсцисс значение рН среды, при котором проводился
гидролиз крахмала, а по оси ординат — время в минутах, необходимое для
гидролиза крахмала до стадии эритродекстрина. Сделать вывод, при каком
значении рН среды лежит оптимум действия α-амилазы слюны.
5.6 Влияние активаторов и ингибиторов на активность α-амилазы
слюны
Для оценки влияния активаторов или ингибиторов каталитическое
действие ферментов испытывается в присутствии указанных веществ.
Полученные
результаты
исследования
сопоставляются
с
данными,
полученными в контрольном опыте, проводившемся без добавления
99
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
активатора или ингибитора.
Реактивы и материалы
Слюна, разведенная водой (1 мл воды+1—2 капли слюны).
Хлористый натрий, 1 % - ный раствор.
Сернокислая медь, 1 % - ный раствор.
Крахмал, 0,5 % - ный раствор.
Раствор йода в йодистом калии (приготовление см. приложение А,
п. 54).
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Термостат или водяная баня, снабженная термометром.
Техника
Заготавливают три пробирки. В первую пробирку наливают 10 капель
1 % - ного раствора хлористого натрия, во вторую — 10 капель 1 % - ного
раствора сернокислой меди, в третью — 10 капель дистиллированной воды.
Во все пробирки добавляют по 20 капель 0,5 % - ного раствора
крахмала и по 1 капле разведенной водой слюны.
Содержимое пробирок перемешивают встряхиванием, тотчас же
помещают в термостат с температурой 37 °С и отмечают время.
Для выявления скорости гидролиза крахмала через интервалы в 1—2
минуты из пробирок с гидролизуемым крахмалом отбирают по 1 капле
жидкости в другие пробирки и проделывают с ней реакцию с раствором
йода в йодистом калии. Гидролиз проводят до стадии эритродекстрина.
Отмечают время (в минутах) появления эритродекстрина.
Рекомендации к составлению протокола
Сделанные наблюдения записать в виде таблицы 3.
100
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 3 - Влияние активаторов и ингибиторов на активность α-амилазы слюны
Исследуемый агент
Фермент
Субстрат
Время образования эритродекстрина
Время, затраченное на гидролиз крахмала до стадии эритродекстрина в
первых двух пробирках, сопоставить со временем гидролиза крахмала в
третьей пробирке (контрольной). На основании этого сопоставления сделать
вывод
об
активирующем
или
ингибирующем
действии
взятых
для
исследования веществ
5.7 Определение активности α-амилазы (КФ 3.2.1.1) слюны по
Вольгемуту
Количественное определение активности α-амилазы по этому методу
основано на установлении предельного разведения раствора α-амилазы, при
котором еще происходит в определенных условиях расщепление заданного
количества крахмала до эритродекстрина.
Реактивы и материалы
Слюна в разведении 1 : 10.
Крахмал, 0,1 % - ный раствор, свежеприготовленный.
Раствор йода в йодистом калии (приготовление см. приложение А,
п. 54).
Оборудование
Штатив с пробирками.
Пипетки на 1 мл.
Бюретки.
Карандаш для стекла.
Термостат или водяная баня, снабженная термометром (37 °С).
101
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Техника
Собирают в пробирку слюну, переносят 1 мл ее в другую пробирку,
куда добавляют из бюретки 9 мл дистиллированной воды и тщательно
перемешивают. Получается раствор слюны 1:10.
В 10 пронумерованных пробирок наливают по 1 мл воды. В первую
пробирку вносят 1 мл разбавленной в 10 раз слюны и перемешивают
путем трехкратного втягивания и выпускания жидкости из пипетки.
Затем 1 мл жидкости из первой пробирки переносят во вторую пробирку,
перемешивая содержимое таким же образом, как это делалось ранее. 1 мл
жидкости из второй пробирки переносят в третью, из третьей — в
четвертую и т. д. Из десятой пробирки после перемешивания 1 мл
жидкости
удаляют.
Таким
образом,
в
первой
пробирке
слюна
оказывается разбавленной в 20 раз, во второй — в 40, в третьей — в 80
раз и т. д.
Во все пробирки добавляют (начиная с десятой, где концентрация
фермента наименьшая) по 2 мл 0,1 % - ного раствора крахмала. Содержимое
всех пробирок перемешивают встряхиванием и помещают в термостат при
37 °С на 30 минут.
Через 30 минут пробирки охлаждают под краном и добавляют в каждую
по 1—2 капли раствора йода в йодистом калии. Отмечают пробирку с
наибольшим разведением слюны, при котором произошло расщепление
крахмала до эритродекстрина, дающего с йодом красно-бурое окрашивание.
Активность а-амилазы выражают количеством миллилитров 0,1 % - ного
раствора крахмала, которое может расщепить 1 мл неразведенной слюны при
37 °С в течение 30 минут до стадии эритродекстрина.
Например, если с красно-бурой окраской жидкость была отмечена в
четвертой пробирке, где слюна разбавлена в 160 раз и куда было прибавлено
2 мл 0,1 % - ного раствора крахмала, то 1 мл неразбавленной слюны расщепил
бы в 160 раз больше 0,1 % - ного раствора крахмала: 1/160 мл слюны расщепляет
2 мл — 0,1 % - ного раствора крахмала, 1мл слюны расщепляет х мл
102
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
0,1 % - ного раствора крахмала, т. е. х=2-1:1/160=320 мл 0,1 % - ного раствора
крахмала. Следовательно, 1 мл неразбавленной слюны расщепляет за 30 минут
при 37 °С 320 мл 0,1 % - ного раствора крахмала. Условно это принимают за
320 единиц α-амилазы по Вольгемуту. Результат принято изображать
следующим образом: А 37°/30' = 320 ед.
Методом Вольгемута можно пользоваться для определения α-амилазы в
панкреатическом соке, крови, моче и других жидкостях организма. Однако
данный метод позволяет учитывать только резкие различия в активности
α-
амилазы и пригоден лишь для ориентировочных определений.
Рекомендации к составлению протокола
Полученные данные практической работы занести в таблицу 4 по
предлагаемому образцу
Таблица 4 - Определение активности α-амилазы слюны по Вольгемуту
№пп
Разведение
слюны
Количество
0,1%
Время течения Реакция с йодом
Температура
раствора крахмала, мл
реакции мин.,
(окраска)
В выводах дать расчет активности амилазы в исследуемой слюне.
6 Витамины
Учение о витаминах – витаминология – в настоящее время выделено в
самостоятельную науку, хотя еще 100 лет назад считали, что для нормальной
жизнедеятельности организма человека и животных вполне достаточно
поступления белков, жиров, углеводов, минеральных веществ и воды.
Практика и опыт показали, что для нормальных роста и развития организма
человека
и
животных
одних
этих
103
веществ
недостаточно.
История
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
путешествий
и
мореплавании,
наблюдения
врачей
указывали
на
существование особых болезней, развитие которых непосредственно связано
с неполноценным питанием, хотя оно как будто содержало все известные к
тому времени питательные вещества. Некоторые болезни, вызванные
недостатком в пище каких-либо веществ, носили даже эпидемический
характер. Так, широкое распространение в XIX в. получило заболевание,
названное
цингой
(или
скорбутом);
летальность
достигала
70–80%.
Примерно в это же время большое распространение, особенно в странах
Юго-Восточной Азии и Японии, получило заболевание бери-бери. В Японии
около 30% всего населения было поражено этой болезнью. Японский врач К.
Такаки пришел к заключению, что в мясе, молоке и свежих овощах
содержатся какие-то вещества, предотвращающие заболевание бери-бери.
Позже голландский врач К. Эйкман, работая на о. Ява, где основным
продуктом питания был полированный рис, заметил, что у кур, получавших
тот же полированный рис, развивалось заболевание, аналогичное бери-бери у
человека. Когда К. Эйкман переводил кур на питание неочищенным рисом,
наступало выздоровление. На основании этих данных он пришел к выводу,
что в оболочке риса (рисовые отруби) содержится неизвестное вещество,
обладающее лечебным эффектом. И действительно, приготовленный из
шелухи риса экстракт оказывал лечебное действие на людей, больных берибери. Эти наблюдения свидетельствовали, что в оболочке риса содержатся
какие-то питательные вещества, которые необходимы для обеспечения
нормальной жизнедеятельности организма человека.
Развитие учения о витаминах, однако, справедливо связывают с именем
отечественного врача Н.И. Лунина, открывшего новую главу в науке о
питании. Он пришел к заключению, что, кроме белков (казеина), жиров,
молочного сахара, солей и воды, животные нуждаются в каких-то еще
неизвестных веществах, незаменимых для питания. В своей работе «О
значении минеральных солей для питания животных» (1880) Н.И. Лунин
писал: «Представляет большой интерес исследовать эти вещества и изучить
104
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
их значение для питания». Это важное научное открытие позже (1912) было
подтверждено
работами
Ф.
Гопкинса.
Поскольку
первое
вещество,
выделенное К. Функом (1912) в кристаллическом виде из экстрактов
оболочек риса, которое предохраняло от развития бери-бери, оказалось
органическим соединением, содержащим аминогруппу, К. Функ предложил
называть эти неизвестные вещества витаминами (от лат. vita – жизнь), т. е.
аминами
жизни.
Действительно,
витамины
оказались
обязательными
дополнительными пищевыми факторами, и, хотя некоторые из них не
содержат аминогруппы и вообще азот, термин «витамины» прочно
укоренился в биологии и медицине.
Таким образом, внимание исследователей первой трети нашего
столетия в области физиологической химии было сосредоточено вокруг
изолирования и идентификации витаминов – незаменимых для человека и
животных пищевых факторов, которые не могли быть синтезированы в
организме.
В определении понятия «витамины» до сих пор существуют
разногласия, поскольку имеется ряд примеров, когда витамины оказываются
незаменимыми факторами питания для человека, но не для некоторых
животных. В частности, известно, что цинга развивается у человека и
морских свинок, но не у крыс, кроликов и ряда других животных при
отсутствии в пище витамина С, т.е. в последнем случае витамин С не
является пищевым или незаменимым фактором. С другой стороны,
некоторые аминокислоты, как и ряд растительных ненасыщенных жирных
кислот (линолевая, линоленовая и др.), оказались незаменимыми для
человека, поскольку они не синтезируются в его организме. Однако в
последнем случае перечисленные вещества не относятся к витаминам, так
как витамины отличаются от всех других органических пищевых веществ
двумя характерными признаками: 1) не включаются в структуру тканей; 2) не
используются организмом в качестве источника энергии.
Таким образом, витамины – это пищевые незаменимые факторы,
105
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
которые, присутствуя в небольших количествах в пище, обеспечивают
нормальное развитие организма животных и человека и адекватную скорость
протекания биохимических и физиологических процессов. Нарушения
регуляции процессов обмена и развитие патологии часто связаны с
недостаточным поступлением витаминов в организм, полным отсутствием их
в потребляемой пище либо нарушениями их всасывания, транспорта или,
наконец, изменениями синтеза коферментов с участием витаминов. В
результате развиваются авитаминозы – болезни, возникающие при полном
отсутствии в пище или полном нарушении усвоения какого-либо витамина.
Известны так называемые гиповитамтозы, обусловленные недостаточным
поступлением витаминов с пищей или неполным их усвоением. Практически
у человека встречаются именно эти последние формы заболевания, т.е.
состояния относительной недостаточности витаминов. В некоторых районах
стран Азии, Африки и Южной Америки, где население употребляет
однообразную, преимущественно растительную, пищу, встречаются иногда
случаи полного авитаминоза. В литературе описаны также патологические
состояния, связанные с поступлением чрезмерно больших количеств
витаминов в организм (гипервитаминозы). Эти заболевания встречаются
реже, чем гиповитаминозы, однако описаны случаи гипервитаминозов A, D,
К и др.
Многие расстройства обмена веществ при авитаминозах обусловлены,
как теперь установлено, нарушениями деятельности или активности
ферментных систем,
поскольку многие
витамины
входят
в
состав
простетических групп ферментов. На связь витаминов с ферментами впервые
в 1922 г. указал акад. Н.Д. Зелинский. Он считал, что витамины регулируют
обмен веществ не непосредственно, а опосредованно через ферментные
системы, в состав которых они входят. Эта точка зрения в настоящее время
подтвердилась.
Открытие витаминов сыграло исключительную роль в профилактике и
лечении многих инфекционных заболеваний. Так как бактерии для своего
106
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
роста и размножения также нуждаются в присутствии многих витаминов для
синтеза коферментов, введение в организм структурных аналогов витаминов,
называемых антивитаминами, приводит к гибели микроорганизмов.
Антивитамины обычно блокируют активные центры ферментов, вытесняя из
него соответствующее производное витаминов (кофермент), и вызывают
конкурентное
ингибирование
ферментов.
К
антивитаминам
относят
вещества, способные вызывать после введения в организм животных
классическую картину гипо- или авитаминоза.
Причины гипо- и авитаминозов у человека и животных обычно делят
на
экзогенные
и
эндогенные.
К
первым
относится
недостаточное
поступление витаминов или полное отсутствие их в пище; следовательно,
недостаточное и неполноценное питание чаще всего является причиной
развития экзогенных авитаминозов. Эндогенными причинами, которые, повидимому, являются более
существенными, служат: а) повышенная
потребность в витаминах при некоторых физиологических и патологических
состояниях
(беременность,
лактация,
тиреотоксикоз,
кахексические
заболевания и др.); б) усиленный распад витаминов в кишечнике вследствие
развития в нем микрофлоры; в) нарушение процесса всасывания витаминов в
результате поражения секреторной и моторной функций кишечника при
заболеваниях
пищеварительного
тракта,
когда
относительная
недостаточность витаминов развивается даже при полноценном питании; г)
болезни печени, поджелудочной железы, вызывающие закупорку общего
желчного протока и сопровождающиеся нарушением всасывания жиров,
продуктов их распада – жирных кислот и соответственно жирорастворимых
витаминов; в этих случаях также развиваются вторичные, или эндогенные,
авитаминозы.
Таким
образом,
знания
закономерностей
развития
гипо-
и
авитаминозов, клинической картины этих состояний, как и знания
биологической роли витаминов в метаболизме, необходимы для каждого
лечащего врача. Они же определяют его тактику при разработке способов
107
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
предупреждения
и
лечения
гиповитаминозов.
Если
авитаминоз
(гиповитаминоз) развивается на экзогенной почве, то вводят недостающий
витамин с пищей или чистый его препарат. Если причина эндогенная, то,
помимо
лечения
основного
заболевания,
параллельно
вводят
соответствующий витамин парентерально, т.е. минуя пищеварительный
тракт.
Нельзя не согласиться с мнением ряда ведущих витаминологов (Р.
Гаррис, К. Скривер, В.Б. Спиричев и др.), что болезни, связанные с
недостаточным потреблением витаминов, стали в настоящее время благодаря
«рационализации питания» редкостью и являются проблемой скорее
социально-экономической, чем медицинской. В то же время в последние три
десятилетия описано большое число ранее неизвестных врожденных
заболеваний,
клиническая
картина
которых
напоминает
типичные
авитаминозы. Они развиваются в раннем детском возрасте независимо от
обеспеченности организма всеми известными витаминами. Иногда болезни
удается
излечить
мегавитаминной
терапией,
т.е.
введением
соответствующего витамина в количествах, в 50–100 раз превышающих
физиологические
потребности
(так
называемые
витаминзависимые
состояния). В других случаях болезнь не удается устранить даже путем
применения высоких доз витаминов (витаминорезистентные состояния).
Заболевания протекают очень тяжело и часто приводят к смерти больного.
Так, описаны случаи витамин-D-резистентного рахита, витамин-D-зависимого рахита, тиаминзависимой мегалобластической анемии, пиридоксинзависимого судорожного синдрома и пиридоксинзависимой анемии, пернициозной анемии и др.
Накопившиеся
фактические
клинические
данные
и
подробные
генетические и биохимические исследования позволили отнести подобные
заболевания к врожденным нарушениям обмена и функций витаминов,
которые уже описаны для тиамина, пиридоксина, биотина, фолиевой
кислоты, витамина В12, никотиновой кислоты, витаминов A, D, Е, К и др. В
108
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
настоящее время имеется достаточно оснований считать, что причиной
развития этих болезней являются генетические дефекты, связанные с
нарушениями или всасывания витаминов в кишечнике, или их транспорта к
органам-мишеням, или, наконец, с нарушениями превращений витаминов в
коферменты (или в активные формы – в случае витаминов группы D).
Имеются также доказательства наследственного дефекта синтеза белковой
части
фермента
расстройств
(апофермента)
обмена
и
в
функций
развитии
некоторых
витаминов,
а
также
врожденных
нарушения
взаимодействия (связи) кофермента (или активной формы витамина) со
специфическим белком – апоферментом, т. е. дефект формирования
холофермента.
Клиническая картина врожденных нарушений обмена и функций
витаминов мало или почти совсем не отличается от истинной картины
алиментарного авитаминоза и ряда наследственных дефектов обмена.
Поэтому своевременное проведение дифференциальной диагностики и
патогенетической
терапии
представляется
задачей
исключительной
важности. В зависимости от причины дефекта терапевтические подходы
включают заместительную терапию, парентеральное введение высоких доз
соответствующего витамина (мегавитаминная терапия), а при врожденном
нарушении его всасывания и транспорта – введение кофермента и т.д.
Современные
методы определения
витаминов
в биологических
объектах делят на физико-химические и биологические.
При взаимодействии витаминов с рядом химических соединений
наблюдаются характерные цветные реакции, интенсивность окраски которых
пропорциональна концентрации витаминов в исследуемом растворе. Поэтому
витамины можно определить фотоколориметрически, например витамин В1 –
при помощи диазореактива и т.д. Эти методы позволяют судить как о
наличии витаминов, так и о количественном содержании их в исследуемом
пищевом продукте или органах и тканях животных и человека. Для
выяснения обеспеченности организма человека каким-либо витамином часто
109
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
определяют соответствующий витамин или продукт его обмена в сыворотке
крови, моче или биопсийном материале. Однако эти методы могут быть
применены не во всех случаях. Встречаются трудности при подборе
специфического реактива для взаимодействия с определенным витамином.
Некоторые витамины обладают способностью поглощать оптическое
излучение только определенной части спектра. В частности, витамин А имеет
специфичную полосу поглощения при 328-330 нм. Измеряя коэффициент
поглощения спектрофотометрически, можно достаточно точно определить
количественное содержание витаминов в исследуемом объекте. Для
определения витаминов В1, В2 и других применяют флюорометрические
методы. Используют и титриметрические методы:
например, при определении витамина С применяют титрование
раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола.
Биологические методы основаны на определении того минимального
количества витамина, которое при добавлении к искусственной диете,
лишенной только данного изучаемого витамина, предохраняет животное от
развития авитаминоза или излечивает его от уже развившейся болезни. Это
количество витамина условно принимают за единицу (в литературе известны
«голубиные», «крысиные» единицы). Большое место в количественном
определении ряда витаминов: фолиевой, пара-аминобензойной кислот и др. –
в
биологических
жидкостях,
в
частности
в
крови,
занимают
микробиологические методы, основанные на измерении скорости роста
бактерий;
последняя
пропорциональна
концентрации
витамина
в
исследуемом объекте. Количество витаминов принято выражать, кроме того,
в миллиграммах, микрограммах, международных единицах (ME, или IU).
Современная классификация витаминов не является совершенной. Она
основана на физико-химических свойствах (в частности, растворимости) или
на химической природе, но до сих пор сохраняются и буквенные
обозначения. В зависимости от растворимости в неполярных органических
растворителях или
в водной среде
110
различают жирорастворимые
и
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
водорастворимые витамины. В приводимой классификации витаминов,
помимо буквенного обозначения, в скобках указан основной биологический
эффект, иногда с приставкой «анти», указывающей на способность данного
витамина
предотвращать
или
устранять
развитие
соответствующего
заболевания; далее приводится номенклатурное химическое название
каждого витамина.
Витамины, растворимые в жирах
1. Витамин А (антиксерофтальмический); ретинол
2. Витамин D (антирахитический); кальциферолы
3. Витамин Е (антистерильный, витамин размножения); токоферолы
4. Витамин К (антигеморрагический); нафтохиноны
Витамины, растворимые в воде
1. Витамин B1(антиневритный); тиамин
2. Витамин В2 (витамин роста); рибофлавин
3. Витамин В6 (антидерматитный, адермин); пиридоксин
4. Витамин B12(антианемический); цианкобаламин; кобаламин
5. Витамин РР (антипеллагрический, ниацин); никотинамид
6. Витамин Вc (антианемический); фолиевая кислота
7. Витамин В3 (антидерматитный); пантотеновая кислота
8. Витамин Н (антисеборейный, фактор роста бактерий, дрожжей и
грибков); биотин
9. Витамин С (антискорбутный); аскорбиновая кислота
10. Витамин Р (капилляроукрепляющий, витамин проницаемости);
биофлаво-ноиды
Помимо этих двух главных групп витаминов, выделяют группу
разнообразных химических веществ, из которых часть синтезируется в
организме, но обладает витаминными свойствами. Для человека и ряда
животных эти вещества принято объединять в группу витаминоподобных.
К ним относят холин, липоевую кислоту, витаминВ15 (пангамовая кислота),
оротовую кислоту, инозит, убихинон, парааминобензойную кислоту, кар111
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нитин, линолевую и линоленовую кислоты, витамин U (противоязвенный
фактор) и ряд факторов роста птиц, крыс, цыплят, тканевых культур.
Недавно открыт еще один фактор, названный пирролохинолинохиноном.
Известны его коферментные и кофакторные свойства, однако пока не
раскрыты витаминные свойства (см. далее «Витаминоподобные вещества»).
Поскольку типичные проявления авитаминозов встречаются довольно редко,
очевидно, нет необходимости в подробном описании клинической картины
гипо- и авитаминозов. Более подробно будут представлены сведения о
биологической роли тех витаминов, механизм действия которых уже
расшифрован.
6.1 Реакция восстановления витамина В2
Реакция основана на способности рибофлавина легко восстанавливаться
и вновь окисляться. При восстановлении водород присоединяется к азоту по
месту двойных связей в изоаллоксазиновом кольце. Источником водорода
служит реакция взаимодействия соляной кислоты с металлическим цинком.
Выделяющийся водород восстанавливает рибофлавин (раствор желтого цвета)
через розовый (или красный) родофлавин (промежуточный продукт) в
бесцветное соединение — лейкофлавин.
Рисунок 52 – Окислительно-восстановительные свойства рибофлавина
(схема)
112
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Реактивы
Витамин В2, 0,025 % -ный раствор.
Соляная кислота, концентрированная.
Цинк металлический.
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Техника
Отмеривают в пробирку 10 капель 0,025 % - ного раствора
рибофлавина, добавляют 5 капель концентрированной соляной кислоты и
небольшой кусочек металлического цинка. Тотчас же наступает бурное
выделение пузырьков водорода, жидкость постепенно окрашивается в
розовый или красный цвет, затем окраска бледнеет и, наконец, жидкость
обесцвечивается.
При
взбалтывании
обесцвеченного
раствора
с
воздухом
лейкосоединение вновь окисляется в рибофлавин.
Поскольку витамин В2 участвует в построении флавиновых ферментов,
описанная реакция демонстрирует механизм действия этих ферментов в
процессе тканевого дыхания.
6.2 Реакция витамина В6 с хлорным железом
При взаимодействии витамина В6 с хлорным железом образуется
комплексное соединение типа фенолята железа, окрашенное в красный цвет.
Реакция обусловлена наличием в молекуле витамина В6 фенольного
гидроксила в 3-м положении пиримидинового кольца. Аналогичная реакция с
113
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
такой же окраской получается при взаимодействии хлорного железа с
раствором пирогаллола.
Реактивы
Витамин В6, 5 % - ный раствор.
Хлорное железо, 5 % - ный раствор.
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Техника
В пробирку вносят 5—10 капель 5 % - ного водного раствора витамина
В6 и добавляют 1—2 капли 5 % - ного раствора хлорного железа. После
встряхивания смеси возникает красная окраска жидкости.
6.3 Качественная реакция на никотиновую кислоту с
уксуснокислой медью
Реакция основана на том, что никотиновая кислота, имея в своей
молекуле карбоксильную группу, образует соли. Медная соль никотиновой
кислоты является труднорастворимым веществом голубого или синего цвета.
Свинцовая соль имеет белый цвет.
Рисунок 53 – Образование соли никотиновой кислоты с медью
114
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Реактивы
Никотиновая кислота в порошке.
Уксусная кислота, 10 % - ный раствор.
Уксуснокислая медь, 5 % ный раствор или уксуснокислый свинец,
5 % - ный раствор.
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Техника
5—10 мг никотиновой кислоты растворяют при нагревании в 10—20
каплях 10 % - ного раствора уксусной кислоты.
К нагретому до кипения раствору добавляют равный объем
5 % - ного раствора уксуснокислой меди.
Жидкость становится мутной, окрашивается в голубой цвет, а при
стоянии выпадает осадок синего цвета медной соли никотиновой кислоты.
6.4 Количественное определение аскорбиновой кислоты в
продуктах (шиповнике, хвое, картофеле, капусте, молоке) с 2,6дихлорфенолиндофенолом
Содержание витамина С в пищевых продуктах может изменяться в
зависимости от качества продукта, условий его технологической обработки,
времени года, длительности и условий хранения и т. д. Сведения о содержании
аскорбиновой кислоты в продуктах необходимы для того, чтобы учесть
количество витамина С, поступающее с пищей.
Количественное определение основано на окислении аскорбиновой
115
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
кислоты
в
дегидроаскорбиновую
и
восстановлении
2,6-
дихлорфенолиндофенола в бесцветное соединение.
Витамин С экстрагируют из продукта разведенной кислотой, так как в
кислой среде он наиболее устойчив. Экстракт титруют раствором 2,6дихлорфенолиндофенола. После окисления всей имеющейся в экстракте
аскорбиновой кислоты индикатор уже не восстанавливается, и его избыток
окрашивает раствор в розовый цвет (окраска окисленной формы 2,6
дихлорфенолиндофенола в кислой среде розовая). Пользуясь изменением
окраски, по количеству реактива, израсходованного на окисление витамина С,
вычисляют его содержание в исследуемом продукте.
Реактивы и материалы
Ягоды шиповника.
Хвоя.
Картофель.
Капуста.
Молоко свежее.
Соляная кислота, 2 % - ный раствор.
Уксусная кислота, 5 % - ный раствор.
2,6-Дихлорфенолиндофенол, натриевая соль, 0,001 н. раствор.
Оборудование
Весы аптечные и разновесы.
Ступка с пестиком.
Битое стекло, мелко истолченное.
Пипетка на 10 мл с делениями.
Воронки с бумажными фильтрами.
Колбы конические на 25 и 100 мл.
Пипетки на 3 и 5 мл.
Бюретка на 10 мл.
Микробюретка.
116
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6.4.1 Определение витамина С в шиповнике и хвое
Отвешивают 0,1 г шиповника (или 1 г хвои).
Растирают навеску в ступке с щепоткой битого стекла, постепенно
добавляя 9,9 мл (или 9 мл в случае хвои) 2 % - ного раствора соляной
кислоты.
Полученный экстракт отфильтровывают в сухую колбочку.
В две конические колбочки отмеривают по 3 мл фильтрата и
отитровывают из бюретки 0,001 н. раствором натриевой соли 2,6дихлорфенолиндофенола до слабо-розовой окраски, удерживающейся около
30 секунд. Титрование ведут не более 2 минут. Результаты титрования
записывают и высчитывают среднее арифметическое.
Вычисляют содержание витамина С в 100 г продукта формулой (22).
Исходят из того, что 1 мл 0,001 н. раствора натриевой соли 2,6дихлорфенолиндофенола соответствует 0,088 мг аскорбиновой кислоты
(молекулярный вес аскорбиновой кислоты равен 176, а грамм-эквивалент =
88).
Расчет производят по формуле:
,
(22)
где х — содержание витамина С в 100 г продукта, мг;
v — объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедший на
титрование, мл;
0,088 — количество аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл л
001 н. раствора натриевой соли 2,6-дихлорфенолиндофенола, мг;
10 — общее количество вытяжки из навески, мл;
100 — коэффициент для пересчета на 100 г продукта;
3 — количество вытяжки, взятое для титрования, мл;
b — взятая навеска шиповника (хвои) в г. Среднее содержание
аскорбиновой кислоты в 100 г сухого шиповника: целые плоды красного
117
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
цвета — 1500 мг%, целые плоды темноокрашенные — 100 мг%.
Среднее содержание витамина С в хвое:
пихта (зимой)
— 250 мг%,
пихта (летом)
— 100 мг%,
сосна и ель (летом)
— 70 мг%,
сосна и ель (зимой) — 220 мг%.
6.4.2 Определение витамина С в картофеле
Отвешивают 5 г картофеля и растирают в ступке с 16 мл
2 % - ного раствора соляной кислоты.
Сливают содержимое ступки в коническую колбу на 100 мл и
несколько раз смывают ступку дистиллированной водой, перенося воду
затем в ту же колбу.
Смесь в колбе титруют 0,001 н. раствором натриевой соли
2,6-дихлорфенолиндофенола до розового цвета, не исчезающего в течение 30
секунд.
Вычисляют содержание витамина С в 100 г картофеля по формуле (23):
,
(23)
где 5 — взятая навеска картофеля, г. Остальные обозначения те же,
что и в предыдущей работе.
Среднее содержание витамина С в картофеле 10 мг%.
6.4.3 Определение витамина С в капусте
Отвешивают 2 г свежей капусты и растирают в ступке с 10 мл
118
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5 % - ного раствора уксусной кислоты и щепоткой битого стекла.
Полученный экстракт отфильтровывают в сухую колбу.
В две конические колбочки на 25 мл наливают по 3 мл экстракта и
титруют из микробюретки 0,001 н. раствором натриевой соли 2,6дихлорфенолиндофенола до розовой окраски, не исчезающей в течение 30
секунд.
Вычисляют содержание витамина С в 100 г капусты по формуле (24):
,
(24)
где 10 — объем экстракта, мл;
2 — взятая навеска, г;
3 — количество экстракта, взятое для титрования, мл. Остальные
обозначения те же, что и в предыдущем опыте. Среднее содержание
витамина С в белокочанной капусте 30 мг%.
6.5 Определение витамина С в молоке
5 мл коровьего молока разводят дистиллированной водой в
сотношении 1:2. При разведении молоко отмеривают пипеткой, а
дистиллированную воду наливают из бюретки.
5 мл полученного раствора вносят пипеткой в коническую колбу
емкостью 25 мл, куда заранее наливают 1 мл 2 % - ного раствора соляной
кислоты и дистиллированной воды до общего объема 15 мл.
Осторожно взбалтывая, содержимое колбы титруют из микробюретки
0,001 н. раствором натриевой соли 2,6-дихлорфенолиндофенола, приливая
последний
по
каплям
до
появления
слабо-розового
окрашивания,
удерживающегося от 0,5 до 1 мин. Для повторного титрования отбирают
пробу из той же порции разведенного молока.
119
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Содержание витамина С вычисляют по формуле (25):
,
(25)
где, х — количество аскорбиновой кислоты в 100 мл молока, мг;
С — число, выражающее разведение (например, при разведении
молока в соотношении 1:2 — разведение 3, при разведении молока в
соотношении 1:5 — разведение 6 и т.д.);
5 — количество разведенного молока, взятое для титрования, мл.
Остальные обозначения те же, что и в предыдущем опыте. Среднее
содержание витамина С в молоке: коровьем — 1 мг%, женском — 5 мг%,
кобыльем — 25 мг%.
6.6 Открытие витамина А в рыбьем жире с концентрированной
серной кислотой
Реактивы и материалы
Рыбий жир, свежий.
Хлороформ, сухой.
Серная кислота, концентрированная.
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Техника
В сухой пробирке растворяют 1—2 капли рыбьего жира в 10 каплях
хлороформа.
120
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Добавляют
1—2
капли
концентрированной
серной
кислоты,
встряхивая после каждой капли. Появляется голубое или фиолетовое
окрашивание, быстро переходящее в буро-красное. Реакция неспецифична.
6.7 Обнаружение витамина D в рыбьем жире с анилиновым
реактивом
Реактивы и материалы
Рыбий жир.
Анилиновый реактив (15 частей анилина и 1 часть концентрированной
соляной кислоты).
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Техника
Отмеряют
в
сухую
пробирку
10
капель
смеси
анилина
с
концентрированной соляной кислотой и прибавляют 5 капель рыбьего жира.
Содержимое пробирки осторожно при постоянном перемешивании
нагревают до кипения и кипятят в течение 30 секунд.
В присутствии витамина D желтая эмульсия приобретает вначале
грязно-зеленое, а затем буро-красное или красное окрашивание.
6.8 Качественная реакция на витамин Е с концентрированной
азотной кислотой
Витамин
Е
окисляется
при
121
действии
сильных
окислителей
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
(марганцовокислый калий, азотная кислота). Данная реакция обусловлена
окислением токоферолов под влиянием концентрированной азотной кислоты
в соединения, имеющие хиноидную структуру и окрашенные в красный цвет.
Рисунок 54 – Реакция токоферола с азотной кислотой
Реактивы и материалы
Токоферол, спиртово-сахарный раствор, 0,1 % - ный.
Азотная кислота, концентрированная.
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Техника
В сухую пробирку вносят 5 капель 0,1 % - ного спиртово-сахарного
раствора витамина Е и добавляют 10 капель концентрированной азотной
кислоты.
Содержимое пробирки встряхивают. Образуется эмульсия, которая
постепенно окрашивается в красный цвет.
Эмульсию оставляют стоять до расслоения. Окраска остается в верхнем
масляном слое.
122
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6.9 Качественная реакция на витамин К
Реактивы и материалы
Витамин К, насыщенный раствор в этаноле.
Диэтилдитиокарбамат натрия, 2 % - ный раствор в этаноле.
Едкий натр, 4 % - ный раствор в этаноле.
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Техника
В пробирку вносят 4 капли спиртового раствора витамина К, добавляют
8 капель раствора диэтилдитиокарбамата натрия и 4 капли спиртового раствора
едкого натра.
Содержимое пробирки встряхивают. Постепенно появляется красное
окрашивание жидкости.
7 Гормоны
Учение
о
эндокринологию.
гормонах
выделено
Современная
в
самостоятельную
эндокринология
изучает
науку
–
химическую
структуру гормонов, образующихся в железах внутренней секреции,
зависимость между структурой и функцией гормонов, молекулярные
механизмы действия, а также физиологию и патологию эндокринной
системы
.
институты,
Учреждены
лаборатории,
специализированные
издаются
123
научные
научно-исследовательские
журналы;
созываются
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
международные конференции, симпозиумы и конгрессы, посвященные
проблемам эндокринологии. В наши дни эндокринология превратилась в
одну из самых бурно развивающихся разделов биологической науки. Она
имеет свои цели и задачи, специфические методологические подходы и
методы исследования. В нашей стране головным научным учреждением,
объединяющим
исследования
по
этим
проблемам,
является
Эндокринологический научный центр РАМН.
Гормоны
относятся
к
биологически
активным
веществам,
определяющим в известной степени состояние физиологических функций
целостного организма, макро- и микроструктуру органов и тканей и скорость
протекания биохимических процессов. Таким образом, гормоны – вещества
органической природы, вырабатывающиеся в специализированных клетках
желез внутренней секреции, поступающие в кровь и оказывающие
регулирующее влияние на обмен веществ и физиологические функции. В это
определение необходимо внести соответствующие коррективы в связи с
обнаружением типичных гормонов млекопитающих у одноклеточных
(например, инсулин у микроорганизмов) или возможностью синтеза
гормонов
соматическими
клетками
в
культуре
ткани
(например,
лимфоцитами под действием факторов роста).
Одной из удивительных особенностей живых организмов является их
способность сохранять постоянство внутренней среды – гомеостаз – при
помощи механизмов саморегуляции, в которых одно из главных мест
принадлежит гормонам. У высших животных координированное протекание
всех биологических процессов не только в целостном организме, но и в
микропространстве отдельной клетки и даже в отдельном субклеточном
образовании (митохондрии, микросомы) определяется нейрогуморальными
механизмами, сложившимися в процессе эволюции. При помощи этих
механизмов организм воспринимает разнообразные сигналы об изменениях в
окружающей и внутренней средах и тонко регулирует интенсивность
процессов
обмена.
В
регуляции
этих процессов,
124
в
осуществлении
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
последовательности протекания множества реакций гормоны занимают
промежуточное звено между нервной системой и действием ферментов,
которые непосредственно регулируют скорость обмена веществ. В настоящее
время получены доказательства, что гормоны вызывают либо быструю
(срочную) ответную реакцию, повышая активность предобразованных,
имеющихся в тканях ферментов (это свойственно гормонам пептидной и
белковой природы), либо, что более характерно, например, для стероидных
гормонов, медленную реакцию, связанную с синтезом ферментов de novo.
Как будет показано далее, стероидные гормоны оказывают влияние на
генетический аппарат клетки, вызывая синтез соответствующей мРНК,
которая, поступив в рибосому, служит матрицей для синтеза молекулы белка
– фермента. Предполагают, что и другие гормоны (имеющие белковую
природу) опосредованно через фосфорилирование негистоновых белков
могут оказывать влияние на гены, контролируя тем самым скорость синтеза
соответствующих ферментов. Таким образом, любые нарушения синтеза или
распада гормонов, вызванные разнообразными причинными факторами,
включая
заболевания
эндокринных
желез
(состояние
гипо-
или
гиперфункции) или изменения структуры и функций рецепторов и
внутриклеточных посредников, приводят к изменению нормального синтеза
ферментов и соответственно к нарушению метаболизма.
Зарождение науки об эндокринных железах и гормонах относится к
1855 г., когда Т. Аддисон впервые описал бронзовую болезнь, связанную с
поражением
надпочечников
и
сопровождающуюся
специфической
пигментацией кожных покровов. Клод Бернар ввел понятие о железах
внутренней секреции, т.е. органах, выделяющих секрет непосредственно в
кровь. Позже Ш. Броун-Секар показал, что недостаточность функции желез
внутренней секреции вызывает развитие болезней, а экстракты, полученные
из этих желез, оказывают хороший лечебный эффект. В настоящее время
имеются бесспорные доказательства, что почти все болезни желез
внутренней секреции (тиреотоксикоз, сахарный диабет и др.) развиваются в
125
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
результате нарушения молекулярных механизмов регуляции процессов
обмена, вызванных недостаточным или, наоборот, избыточным синтезом
соответствующих гормонов в организме человека.
Термин «гормон» (от греч. hormao – побуждаю) был введен в 1905 г. У.
Бейлиссом и Э. Старлингом при изучении открытого ими в 1902 г. гормона
секретина,
вырабатывающегося
в
двенадцатиперстной
кишке
и
стимулирующего выработку сока поджелудочной железы и отделение желчи.
К настоящему времени открыто более сотни различных веществ, наделенных
гормональной
активностью,
синтезирующихся
секреции и регулирующих процессы обмена
в
железах
веществ.
внутренней
Установлены
специфические особенности биологического действия гормонов: а) гормоны
проявляют свое биологическое действие в ничтожно малых концентрациях
(от 10–6 до 10–12 М); б) гормональный эффект реализуется через белковые
рецепторы и внутриклеточные вторичные посредники (мессендже-ры); в) не
являясь ни ферментами, ни коферментами, гормоны в то же время
осуществляют свое действие путем увеличения скорости синтеза ферментов
de novo или изменения скорости ферментативного катализа; г) действие
гормонов в целостном организме определяется в известной степени
контролирующим влиянием ЦНС; д) железы внутренней секреции и
продуцируемые ими гормоны составляют единую систему, тесно связанную
при помощи механизмов прямой и обратной связей.
Под влиянием разнообразных внешних и внутренних раздражителей
возникают
импульсы
в специализированных,
весьма
чувствительных
рецепторах. Импульсы затем поступают в ЦНС, оттуда в гипоталамус, где
синтезируются первые биологически активные гормональные вещества,
оказывающие «дистантное» действие,– так называемые рилизинг-факторы.
Особенностью рилизинг-факторов является то, что они не поступают в
общий ток крови, а через портальную систему сосудов достигают
специфических клеток гипофиза, при этом стимулируют (или тормозят)
биосинтез и выделение тропных гормонов гипофиза, которые с током крови
126
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
достигают соответствующей эндокринной железы и способствуют выработке
необходимого
гормона.
специализированные
соответствующие
Этот гормон
органы
и
химические
и
затем
ткани
оказывает действие
(органы-мишени),
физиологические
ответные
на
вызывая
реакции
целостного организма.
Наименее изученным до недавнего времени оставался последний этап
этой своеобразной дуги – действие гормонов на внутриклеточный обмен. В
настоящее время получены доказательства, что это действие осуществляется
через так называемые гормональные рецепторы, под которыми понимают
химические структуры соответствующих тканей-мишеней, содержащие
высокоспецифические участки (углеводные фрагменты гликопротеинов и
ганглиозидов) для связывания гормонов. Результатом подобного связывания
является инициация рецепторами специфических биохимических реакций,
обеспечивающих реализацию конечного эффекта соответствующего гормона.
Рецепторы гормонов белковой и пептидной природы расположены на
наружной поверхности клетки (на плазматической мембране), а рецепторы
гормонов стероидной природы – в ядре. Общим признаком всех рецепторов
независимо от локализации является наличие строго пространственного и
структурного соответствия между рецептором и соответствующим гормоном.
Молекулярные механизмы передачи гормонального сигнала и роль
вторичных мессенджеров (посредников) в реализации гормонального
эффекта подробно изложены в конце данной главы.
Химическая природа почти всех известных гормонов выяснена в
деталях (включая первичную структуру белковых и пептидных гормонов),
однако до настоящего времени не разработаны общие принципы их
номенклатуры. Химические наименования многих гормонов точно отражают
их химическую структуру и очень громоздкие. Поэтому чаще применяются
тривиальные названия гормонов. Принятая номенклатура указывает на
источник гормона (например, инсулин – от лат. insula – островок) или
отражает его функцию (например, пролактин, вазопрессин). Для некоторых
127
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
гормонов
гипофиза
(например,
лютеинизирующего
и
фолликулостимулирующего), а также для всех гипоталамических гормонов
разработаны новые рабочие названия.
Аналогичное положение существует и в отношении классификации
гормонов. Гормоны классифицируют в зависимости от места их природного
синтеза, в соответствии с которым различают гормоны гипоталамуса,
гипофиза, щитовидной железы, надпочечников, поджелудочной железы,
половых желез, зобной железы и др. Однако подобная анатомическая
классификация недостаточно совершенна, поскольку некоторые гормоны или
синтезируются не в тех железах внутренней секреции, из которых они
секретируются в кровь (например, гормоны задней доли гипофиза,
вазопрессин и окситоцин синтезируются в гипоталамусе, откуда переносятся
в заднюю долю гипофиза), или синтезируются и в других железах (например,
частичный синтез половых гормонов осуществляется в коре надпочечников,
синтез простагландинов происходит не только в предстательной железе, но и
в других органах) и т.д. С учетом этих обстоятельств были предприняты
попытки создания современной классификации гормонов, основанной на их
химической природе. В соответствии с этой классификацией различают три
группы истинных гормонов:
1) пептидные и белковые гормоны;
2)гормоны – производные аминокислот;
3) гормоны стероидной природы.
Четвертую группу составляют эйкозаноиды – гормоноподобные
вещества, оказывающие местное действие.
Пептидные и белковые гормоны включают от 3 до 250 и более
аминокислотных остатков. Это гормоны гипоталамуса и гипофиза (тиролиберин, соматолиберин, соматостатин, гормон роста, кортикотропин, тиреотропин и др. – см. далее), а также гормоны поджелудочной железы
(инсулин, глюкагон). Гормоны – производные аминокислот в основном
представлены
производными
аминокислоты
128
тирозина.
Это
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
низкомолекулярные
синтезирующиеся
соединения
в
мозговом
адреналин
веществе
и
норадреналин,
надпочечников,
и
гормоны
щитовидной железы (тироксин и его производные). Гормоны 1-й и 2-й групп
хорошо растворимы в воде.
Гормоны стероидной природы представлены жирорастворимыми
гормонами
коркового
вещества
надпочечников
(кортикостероиды),
половыми гормонами (эстрогены и андрогены), а также гормональной
формой витамина D.
Эйкозаноиды, являющиеся производными полиненасыщенной жирной
кислоты (арахидоновой), представлены тремя подклассами соединений:
простагландины, тромбоксаны и лейкотриены. Эти нерастворимые в воде и
нестабильные соединения оказывают свое действие на клетки, находящиеся
вблизи их места синтеза.
Гипоталамус
служит
местом
непосредственного
взаимодействия
высших отделов ЦНС и эндокринной системы (см. рисунок 55). Природа
связей, существующих между ЦНС и эндокринной системой, стала
проясняться в последние десятилетия, когда из гипоталамуса были выделены
первые гуморальные факторы, оказавшиеся гормональными веществами с
чрезвычайно высокой биологической активностью. Потребовалось немало
труда и экспериментального мастерства, чтобы доказать, что эти вещества
образуются в нервных клетках гипоталамуса, откуда по системе портальных
капилляров достигают гипофиза и регулируют секрецию гипофизарных
гормонов, точнее их освобождение (возможно, и биосинтез). Эти вещества
получили сначала наименование нейрогормонов, а затем рилизинг-факторов
(от
англ.
release
–
освобождать),
или
либеринов.
Вещества
с
противоположным действием, т.е. угнетающие освобождение (и, возможно,
биосинтез) гипофизарных гормонов, стали называть ингибирующими
факторами, или статинами. Таким
образом, гормонам гипоталамуса
принадлежит ключевая роль в физиологической системе гормональной
регуляции многосторонних биологических функций отдельных органов,
129
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
тканей и целостного организма.
Рисунок 52 - Роль гормонов гипоталамуса
К настоящему времени в гипоталамусе открыто 7 стимуляторов
(либерины) и 3 ингибитора (статины) секрециигормонов гипофиза, а именно:
кортиколиберин, тиролиберин, люлиберин, фоллилиберин, соматолиберин,
пролактолиберин,
меланолиберин,
соматостатин,
пролактостатин
и
меланостатин. В чистом виде выделено 5 гормонов, для которых установлена
первичная структура, подтвержденная химическим синтезом.
Большие трудности при получении гормонов гипоталамуса в чистом
виде объясняются чрезвычайно низким содержанием их в исходной ткани.
Так, для выделения всего 1 мг тиролиберина потребовалось переработать 7 т
гипоталамусов, полученных от 5 млн овец.
Следует отметить, что не все гормоны гипоталамуса, по-видимому,
строго специфичны в отношении одного какого-либо гипофизарного
гормона. В частности, для тиролиберина показана способность освобождать,
помимо тиротропина, также пролактин, а для люлиберина, помимо лютеинизирующего гормона,– также фолликулостимулирующий гормон.
Гипоталамические
гормоны
не
имеют
твердо
установленных
наименований. Рекомендуется в первой части названия гормона гипофиза
130
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
добавлять окончание «либерин»; например, «тиролиберин» означает гормон
гипоталамуса,
стимулирующий
освобождение
(и,
возможно,
синтез)
тиротропина – соответствующего гормона гипофиза. Аналогичным образом
образуют названия факторов гипоталамуса, ингибирующих освобождение (и,
возможно, синтез) тропных гормонов гипофиза,- добавляют окончание
«статин». Например, «соматостатин» означает гипоталамический пептид,
ингибирующий освобождение (или синтез) гормона роста гипофиза соматотропина.
Установлено, что по химическому строению все гормоны гипоталамуса
являются низкомолекулярными пептидами, так называемыми олигопептидами необычного строения, хотя точный аминокислотный состав и первичная
структура выяснены не для всех. Приводим полученные к настоящему
времени данные о химической природе шести из известных 10 гормонов
гипоталамуса.
1.
Тиролиберин
представлен
трипептидом,
состоящим
из
пироглутаминовой (циклической) кислоты, гистидина и пролинамида,
соединенных пептидными связями. В отличие от классических пептидов он
не содержит свободных NH2- и СООН-групп у N- и С-концевых
аминокислот.
2.
Гонадолиберин
является
декапептидом,
состоящим
из
10
аминокислот в последовательности: Пиро-Глу–Гис–Трп–Сер–Тир–Гли–Лей–
Арг–Про–Гли-NН2. Концевая С-аминокислота представлена глицинамидом.
3. Соматостатин является циклическим тетрадекапептидом (состоит из
14 аминокислотных остатков). Отличается этот гормон от двух предыдущих,
помимо циклической структуры, тем, что не содержит на N-конце
пироглутаминовой кислоты: дисульфидная связь образуется между двумя
остатками цистеина в 3-м и 14-м положениях. Следует отметить, что
синтетический линейный аналог соматостатина также наделен аналогичной
биологической активностью, что свидетельствует о несущественности
дисульфидного мостика
природного
131
гормона.
Помимо гипоталамуса,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
соматостатин продуцируется нейронами центральной и периферической
нервных систем, а также синтезируется в S-клетках панкреатических
островков (островков Лангерганса) в поджелудочной железе и клетках
кишечника. Он оказывает широкий спектр биологического действия; в
частности, показано ингибирующее действие на синтез гормона роста в
аденогипофизе, а также прямое тормозящее действие его на биосинтез
инсулина и глюкагона в β- и α-клетках островков Лангерганса.
4. Соматолиберин недавно выделен из природных источников. Он
представлен 44 аминокислотными остатками с полностью раскрытой
последовательностью. Биологической активностью соматолиберина наделен,
кроме того, химически синтезированный декапептид: Н-Вал–Гис–Лей–Сер–
Ала–Глу–Глн–Лиз–Глу–Ала-ОН. Этот декапептид стимулирует синтез и
секрецию гормона роста гипофиза соматотропина.
5. Меланолиберин, химическая структура которого аналогична
структуре открытого кольца гормона окситоцина (без трипептидной боковой
цепи), имеет следующее строение: Н-Цис–Тир–Иле–Глн–Асн–Цис-ОН.
6. Меланостатин (меланотропинингибирующий фактор) представлен
или
трипептидом:
следующей
Пиро-Глу–Лей–Гли-NН2,
последовательностью:
или
пентапептидом
со
Пиро-Глу–Гис–Фен–Aрг–Гли–NН2.
Необходимо отметить, что меланолиберин оказывает стимулирующее
действие, а меланостатин, напротив, ингибирующее действие на синтез и
секрециюмеланотропина в передней доле гипофиза.
Помимо перечисленных гипоталамических гормонов, интенсивно
изучалась химическая природа другого гормона – кортиколиберина.
Активные препараты его были выделены как из ткани гипоталамуса, так и из
задней доли гипофиза; существует мнение, что последняя может служить
депо гормона для вазопрессина и окситоцина. Недавно выделен состоящий
из 41 аминокислоты с выясненной последовательностью кортиколиберин из
гипоталамуса овцы.
Местом
синтеза
гипоталамических
132
гормонов,
вероятнее
всего,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
являются нервные окончания – синаптосомы гипоталамуса, поскольку
именно там отмечена наибольшая концентрация гормонов и биогенных
аминов. Последние рассматриваются наряду с гормонами периферических
желез внутренней секреции, действующих по принципу обратной связи, в
качестве основных регуляторов секреции и синтеза гормонов гипоталамуса.
Механизм биосинтеза тиролиберина, осуществляющегося, скорее всего,
нерибо-собальным путем, включает участие SH-содержащей синтетазы или
комплекса ферментов, катализирующих циклизацию глутаминовой кислоты
в пироглутаминовую, образование пептидной связи и амидирование проли-на
в присутствии глутамина. Существование подобного механизма биосинтеза с
участием соответствующих синтетаз допускается также в отношении
гонадолиберина и соматолиберина.
Пути инактивации гормонов гипоталамуса изучены недостаточно.
Период полураспада тиролиберина в крови крысы составляет 4 мин.
Инактивация наступает как при разрыве пептидной связи (под действием
экзо-и эндопептидаз сыворотки крови крысы и человека), так и при
отщеплении амидной группы в молекуле пролинамида. В гипоталамусе
человека
и
ряда
животных
открыт
специфический
фермент
пироглутамилпептидаза, которая катализирует отщепление от тиролиберина
или гонадолиберина молекулы пироглутаминовой кислоты.
Гипоталамические гормоны непосредственно влияют на секрецию
(точнее, освобождение) «готовых» гормонов и биосинтез этих гормонов de
novo. Доказано, что цАМФ участвует в передаче гормонального сигнала.
Показано существование в плазматических мембранах клеток гипофиза
специфических аденогипофизарных рецепторов, с которыми связываются
гормоны гипоталамуса, после чего через систему аденилатциклазы и
мембранных комплексов Са2+–АТФ и Mg2+–АТФ освобождаются ионы Са2+ и
цАМФ; последний действует как на освобождение, так и на синтез
соответствующего гормона гипофиза путем активирования протеинкиназы.
Для выяснения механизма действия рилизинг-факторов, включая их
133
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
взаимодействие с соответствующими рецепторами, большую роль сыграли
структурные аналоги тиролиберина и гонадолиберина. Некоторые из этих
аналогов обладают даже более высокой гормональной активностью и
пролонгированным действием, чем природные гормоны гипоталамуса.
Однако предстоит еще большая работа по выяснению химического строения
уже открытых рилизинг-факторов и расшифровке молекулярных механизмов
их действия.
В гипофизе синтезируется ряд биологически активных гормонов
белковой и пептидной природы, оказывающих стимулирующий эффект на
различные физиологические и биохимические процессы в клетках-мишенях.
В зависимости от места синтеза различают гормоны передней, задней и
промежуточной долей гипофиза. В передней доле вырабатываются в
основном белковые и полипептидные гормоны, называемые тропными
гормонами, или тропинами, вследствие их стимулирующего действия на ряд
других эндокринных желез. В частности, гормон, стимулирующий секрецию
гормонов щитовидной железы, получил название «тиротропин».
В последние годы из ткани мозга животных было выделено более 50
пептидов,
получивших
название
нейропептидов
и
определяющих
поведенческие реакции. Показано, что эти вещества влияют на некоторые
формы поведения, процессы обучения и запоминания, регулируют сон и
снимают, подобно морфину, боль. Так, выделенный β-эндорфин (31
аминокислотный остаток с выясненной последовательностью) оказался
почти в 30 раз активнее морфина в качестве обезболивающего средства. Ряд
других пептидов оказывает снотворное действие, а 16-членный пептид,
вызывающий у крыс страх темноты, был назван скотофобином. Выделен
полипептид амелетин, который, наоборот, отучает крыс бояться резкого
звука электрического звонка. Работы в этом направлении интенсивно ведутся
во многих лабораториях. Вполне возможно, что скоро будут выделены и
соответственно синтезированы искусственно для каждой формы поведения
соответствующие нейропептиды, включая пептиды памяти.
134
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7.1 Качественная реакция на адреналин с хлорным железом
При взаимодействии адреналина с хлорным железом возникает
изумрудно-зеленое
окрашивание.
Реакция
обусловлена
наличием
пирокатехиновой группировки в молекуле адреналина. Образуется соединение
типа фенолята зеленого цвета.
Рисунок 56 – Взаимодействие адреналина с хлорным железом
Подобное окрашивание в присутствии хлорного железа получается с
пирокатехином.
Реактивы и материалы
Адреналин, 0,1 % - ный раствор.
Хлорное железо, 3 % - ный раствор.
Едкий натр, 10 % - ный раствор.
Пирокатехин, 0,05 % -ный раствор.
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Техника
В пробирку помещают 10 капель 0,1 % - ного раствора адреналина и
прибавляют 1 каплю 3 % - ного раствора хлорного железа. Жидкость
135
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
окрашивается в изумрудно-зеленый цвет.
К содержимому пробирки добавляют 1 каплю 10 % - ного раствора едкого
натра. Окраска переходит в винно-красную, а затем в коричневую.
Проделывают такую же пробу с 0,05 % - ного раствором пирокатехинаи
убеждаются в том, что она аналогична реакции с адреналином. Это доказывает
присутствие ядра пирокатехина в молекуле адреналина.
7.2 Диазореакция на эстрон (фолликулин)
При
взаимодействии
диазореактива
с
эстроном
образуется
соединение, окрашенное в желтый цвет.
Реактивы и материалы
Фолликулин, масляный раствор (в ампулах).
Сульфаниловая кислота, 1 % - ный раствор.
Азотистокислый натрий, 5% -ный раствор.
Углекислый натрий, 10% - ный раствор.
Оборудование
Штатив с пробирками.
Капельницы.
Техника
Получают диазореактив. Для этого в пробирке смешивают 3 капли
1% раствора сульфаниловой кислоты и 3 капли 5 % - ного раствора
азотистокислого натрия.
К диазореактиву добавляют 3 капли масляного раствора фолликулина
и 2 капли 10 % - ного раствора углекислого натрия.
Пробирку встряхивают и наблюдают постепенное окрашивание
136
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
жидкости в желтый цвет.
8 Взаимосвязь обменных процессов
Живой организм и его функционирование находятся в постоянной
зависимости от окружающей среды. Интенсивность обмена с внешней
средой
и
скорость
внутриклеточных
процессов
обмена
веществ
поддерживают постоянство внутренней среды и целостность организма.
Как было указано, обмен веществ в организме человека протекает не
хаотично; он интегрирован и тонко настроен. Все превращения органических
веществ, процессы анаболизма и катаболизма тесно связаны друг с другом. В
частности, процессы синтеза и распада взаимосвязаны, координированы и
регулируются нейрогормональными механизмами, придающими химическим
процессам нужное направление. В организме человека, как и в живой
природе вообще, не существует самостоятельного обмена белков, жиров,
углеводов и нуклеиновых кислот. Все превращения объединены в целостный
процесс метаболизма, подчиняющийся диалектическим закономерностям
взаимозависимости
и
взаимообусловленности,
допускающий
также
взаимопревращения между отдельными классами органических веществ.
Подобные взаимопревращения диктуются физиологическими потребностями
организма, а также целесообразностью замены одних классов органических
веществ другими в условиях блокирования какого-либо процесса при
патологии.
Еще Кребс и Корнберг отмечали, что, несмотря на огромное
разнообразие пищевых веществ (белки, жиры, углеводы), число химических
реакций, обеспечивающих их превращения (распад) и образование энергии,
«удивительно мало». Эти закономерности свойственны как организму
животных и человека, так и микроорганизмам и растениям.
В настоящее время экспериментально обосновано существование
четырех главных этапов распада молекул углеводов, белков и жиров,
137
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
которые
интегрируют
образование
энергии
из
основных
пищевых
источников. На I этапе полисахариды расщепляются до моносахаридов
(обычно гексоз); жиры распадаются на глицерин и высшие жирные кислоты,
а белки – на составляющие их свободные аминокислоты. Следует
подчеркнуть,
что
указанные
процессы
в
основном
являются
гидролитическими, поэтому освобождающаяся в небольшом количестве
энергия почти целиком используется организмами в качестве тепла.
На II этапе мономерные молекулы (гексозы, глицерин, жирные
кислоты и аминокислоты) подвергаются дальнейшему распаду, в процессе
которого образуются богатые энергией фосфатные соединения и ацетил-КоА.
В частности, при гликолизе гексозы расщепляются до пировиноград-ной
кислоты и далее до ацетил-КоА. Этот процесс сопровождается образованием
ограниченного
числа
богатых
энергией
фосфатных
связей
путем
субстратного фосфорилирования. На этом этапе высшие жирные кислоты
аналогично распадаются до ацетил-КоА, в то время как глицерин окисляется
по гликолитическому пути до пировиноградной кислоты и далее до ацетилКоА. Для аминокислот ситуация на II этапе несколько отлична. При
преимущественном использовании аминокислот в качестве источника
энергии (при дефиците углеводов или при сахарном диабете) некоторые из
них непосредственно превращаются в метаболиты лимоннокислого цикла
(глутамат, аспартат), другие – опосредованно через глутамат (пролин,
гистидин, аргинин), третьи – в пируват и далее в ацетил-КоА (аланин, серин,
глицин, цистеин). Наконец, ряд аминокислот, в частности лейцин, изолейцин, расщепляется до ацетил-КоА, а из фенилаланина и тирозина, помимо
ацетил-КоА, образуется оксалоацетат через фумаровую кислоту. Как видно,
II этап можно назвать этапом образования ацетил-КоА, являющегося по
существу
единым
(общим)
промежуточным
продуктом
катаболизма
основных пищевых веществ в клетках.
На III этапе ацетил-КоА (и некоторые другие метаболиты, например αкетоглутарат, оксалоацетат) подвергаются окислению («сгоранию») в цикле
138
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ди-
и
трикарбоновых
кислот
Кребса.
Окисление
сопровождается
образованием восстановленных форм НАДН + Н+ и ФАДН2.
На IV этапе осуществляется перенос электронов от восстановленных
нуклеотидов на кислород (через дыхательную цепь). Он сопровождается
образованием конечного продукта – молекулы воды. Этот транспорт
электронов сопряжен с синтезом АТФ в процессе окислительного фосфорилирования.
Необходимо отметить, что, помимо взаимных переходов между
разными классами веществ в организме, доказано существование более
сложных форм связи. В частности, интенсивность и направление любой
химической реакции определяются ферментами, т.е. белками, которые
оказывают непосредственное влияние на обмен липидов, углеводов и
нуклеиновых кислот. В свою очередь синтез любого белка-фермента требует
участия ДНК и всех 3 типов рибонуклеиновых кислот: тРНК, мРНК и рРНК.
Если к этому добавить влияние гормонов, а также продуктов распада какоголибо одного класса веществ (например, биогенных аминов) на обмен других
классов органических веществ, то становятся понятными удивительная
согласованность и координированность огромного разнообразия химических
процессов, совершающихся в организме. Многие из этих процессов были
подробно освещены при описании обмена отдельных классов веществ. В
данной главе кратко представлены примеры взаимных переходов отдельных
структурных элементов белков, жиров, углеводов и нуклеиновых кислот в
процессе их превращений и обмена.
Помимо прямых переходов метаболитов этих классов веществ друг в
друга, существует тесная энергетическая связь, когда энергетические
потребности могут обеспечиваться окислением какого-либо одного класса
органических веществ при недостаточном поступлении с пищей других.
Важность белков (в частности, ферментов, гормонов и др.) в обмене всех
типов
химических
соединений
слишком
очевидна
и
не
требует
доказательств. Ранее было отмечено большое значение белков и аминокислот
139
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
для
синтеза
пиримидиновые
ряда
специализированных
нуклеотиды,
порфирины,
соединений
биогенные
(пуриновые
амины
и
и
др.).
Кетогенные аминокислоты, образующие в процессе обмена ацетоуксусную
кислоту (ацетоацетил-КоА), могут непосредственно участвовать в синтезе
жирных кислот и стеринов. Аналогично могут использоваться гликогенные
аминокислоты через ацетил-КоА, но после предварительного превращения в
пируват. Некоторые структурные компоненты специализированных липидов,
в частности фосфоглицеринов, имеют своим источником аминокислоты и их
производные, например серин, этаноламин, сфингозин и холин. Необходимо
подчеркнуть, что превращение углеродных скелетов кетогенных или
гликогенных аминокислот в жирные кислоты является необратимым
процессом, хотя нельзя исключить возможности частичного синтеза
глутамата и опосредованно других аминокислот из продуктов распада
жирных кислот – ацетил-КоА – через цикл трикарбоновых кислот,
включающий α-кетоглутарат. В то же время из глицерина нейтральных
жиров через пируват полностью осуществляется синтез углеродных скелетов
некоторых гликогенных аминокислот.
Рисунок 57 - Взаимосвязь белков, жиров и углеводов
140
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Продукты гидролиза пищевых и тканевых триацилглицеролов, в
частности
высшие
жирные
кислоты,
участвуют
непосредственно
в
образовании сложных белков – липопротеинов плазмы крови. В составе
липопротеинов, являющихся, таким образом, транспортной формой жирных
кислот, они доставляются в органы-мишени, в которых жирные кислоты
служат
или
источником
энергии
(сердечная
и
поперечно-полосатая
мускулатура), или предшественниками синтеза тканевых триацилглицеролов
с последующим их отложением в клетках ряда органов (депо липидов).
Получены
доказательства
синтеза
глюкозы
из
большинства
аминокислот. Для некоторых аминокислот (аланин, аспарагиновая и
глутаминовая кислоты) связь с глюконеогенезом является непосредственной,
для других она осуществляется через побочные метаболические пути.
Следует особо подчеркнуть, что три α-кетокислоты (пируват, оксалоацетат и
кетоглутарат), образующиеся соответственно из аланина, аспартата и
глутамата, не только служат исходным материалом для синтеза глюкозы, но
являются своеобразными кофакторами при распаде ацетильных остатков
всех классов пищевых веществ в цикле Кребса для получения энергии.
Синтез незаменимых аминокислот из продуктов обмена углеводов и
жиров в организме животных отсутствует. Клетки животных не содержат
ферментных систем, катализирующих синтез углеродных скелетов этих
аминокислот. В то же время организм может нормально развиваться
исключительно при белковом питании, что также свидетельствует о
возможности синтеза углеводов из белков. Процесс синтеза углеводов из
аминокислот получил название глюконеогенеза. Он доказан прямым путем в
опытах на животных с экспериментальным диабетом: более 50% введенного
белка превращается в глюкозу. Как известно, при диабете организм теряет
способность
утилизировать
глюкозу,
и
энергетические
потребности
покрываются за счет окисления аминокислот и жирных кислот. Доказано
также, что исходными субстратами для глюконеогенеза являются те
141
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
аминокислоты, распад которых сопровождается образованием прямо или
опосредованно пировиноградной кислоты (например, аланин, серин, треонин
и цистеин). Более того, имеются доказательства существования в организме
своеобразного
циклического
процесса
–
глюкозоаланинового
цикла,
участвующего в тонкой регуляции концентрации глюкозы в крови в тех
условиях, когда в период между приемами пищи организм испытывает
дефицит глюкозы. Источниками пирувата при этом являются указанные
аминокислоты, образующиеся в мышцах при распаде белков и поступающие
в печень, в которой они подвергаются дезаминированию. Образовавшийся
аммиак в печени обезвреживается, участвуя в синтезе мочевины, которая
выделяется из организма. Дефицит мышечных белков затем восполняется за
счет поступления аминокислот пищи.
Энергетическая ценность пищи оказывает определенное влияние на
белковый
обмен,
контролируемый
азотистым
балансом.
Так,
если
потребляемая энергия пищи ниже минимального уровня, то наблюдается
увеличение экскреции азота, и, наоборот, при увеличении энергетической
ценности пищи экскреция азота с мочой снижается.
Между циклом лимонной кислоты и орнитиновым циклом мочевинообразования имеются сложные связи, определяющие в известной степени
скорость реакций, зависимую от энергетических потребностей клетки и
концентраций конечных продуктов метаболизма. Как было показано,
фумаровая кислота образуется в процессе распада аргинино-янтарной
кислоты, синтез которой в свою очередь требует наличия аминокислоты
аспартата.
Образовавшаяся
фумаровая
кислота
(из
предшественника
аминокислоты аспартата) далее вступает в цикл лимонной кислоты и под
действием двух ферментов этого цикла: фумаратгидратазы и малатдегидрогеназы – превращается в оксалоацетат, который при участии
специфической трансаминазы вновь превращается в аспартат, т.е. получается
своеобразный аспартат-аргининоянтарный шунт цикла лимонной кислоты,
соединенного с циклом мочевинообразования. Таким образом, при помощи
142
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
этого необычного сцепленного механизма происходит переплетение реакций
обоих циклов (мочевинообразования и ди- и трикарбоновых кислот).
С энергетической точки зрения, превращение углеводов в жиры
следует рассматривать как накопление и депонирование энергии, хотя синтез
жира сопровождается затратой энергии, которая вновь освобождается при
окислении
жиров
в
организме.
Глицерин,
входящий
в
состав
триацилглицеролов и фосфоглицеринов, может легко образоваться из
промежуточных метаболитов гликолиза, в частности из глицеральдегид-3фосфата. Следует, однако, подчеркнуть, что основным путем превращения
углеводов в жиры является путь образования высших жирных кислот из
ацетил-КоА, который образуется при окислительном декар-боксилировании
пирувата. Последняя реакция практически необратима, поэтому образования
углеводов из высших жирных кислот почти не происходит. Таким образом,
синтез углеводов из жиров в принципе может происходить только из
глицерина, хотя в обычных условиях реакция протекает в обратную сторону,
т.е. в сторону синтеза жиров из глицерина, образующегося при окислении
углеводов. Ацетил-КоА, образующийся в процессе обмена углеводов, жиров
и ряда аминокислот, служит пусковым субстратом как для синтеза жирных
кислот (а следовательно, и липидов вообще), так и для цикла трикарбоновых
кислот. Для окисления ацетил-КоА в этом цикле требуется оксалоацетат,
который
является
вторым
ключевым
субстратом
в
цикле
Кребса.
Оксалоацетат может синтезироваться из пировиноградной кислоты и
СО2 благодаря
реакции
карбоксилирования
или
образоваться
из
аспарагиновой кислоты в процессе трансаминирования с α-кетоглутаратом.
Две молекулы ацетил-КоА, конденсируясь, образуют ацетоуксусную кислоту
(ацетоацетат), которая является источником других кетоновых тел в
организме, в частности β-оксимасляной кислоты (β-оксибутирата) и ацетона
(см. главу 11). Следует подчеркнуть, что ацетоуксусная и β-оксимасляная
кислоты часто рассматриваются как транспортные формы активной уксусной
кислоты, доставляющие ее для окисления в цикле Кребса в периферических
143
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
тканях. Эти же реакции конденсации двух молекул ацетил-КоА составляют
начальные этапы синтеза холестерина, в свою очередь являющегося
предшественником гормонов стероидной природы, витамина D3, а также
желчных кислот. Последние в виде парных желчных кислот выполняют
важную функцию эмульгаторов при переваривании липидов пищи в
кишечнике, а также функцию транспортеров, способствуя всасыванию
высших жирных кислот. Следует указать также на использование галактозы
и частично глюкозы для биосинтеза цереброзидов и гликолипидов,
выполняющих важные и специфические функции в деятельности ЦНС. В
этом синтезе участвуют не свободные моносахариды, а гексозамины
(галактозамин и глюкозамин), биосинтез которых в свою очередь требует
доставки амидного азота глутамина, интегрируя тем самым обмен углеводов,
липидов и белков.
В последние годы накоплено немало экспериментальных данных,
свидетельствующих о существовании в живых организмах множества
регулирующих механизмов, осуществляющих метаболический контроль и
обеспечивающих как взаимопревращения белков, липидов и углеводов, так и
интеграцию энергии. Не отрицая значение других типов регуляции
метаболизма,
следует
подчеркнуть,
что
движущей
силой
во
взаимопревращениях веществ и интенсивности метаболизма, вероятнее
всего, является энергетическое состояние клетки, в частности уровень АТФ
(точнее, отношение АМФ/АТФ). Так, при низких концентрациях АМФ и
высоких концентрациях АТФ (состояние, которое принято обозначать
«энергонасыщенностью») в клетках происходит резкое снижение гликолитического распада глюкозы, обусловленное действием этих нуклеотидов
на ключевой фермент гликолиза – фосфофруктокиназу и на фосфатазу
фруктозо-6-фосфата. В результате в клетках накапливается не только
фруктозо-6-фосфат,
Последний,
но
являясь
и
его
предшественник
положительным
–
глюкозо-6-фосфат.
модулятором
фермента
гликогенсинтазы, стимулирует синтез полисахарида – гликогена. При низких
144
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
концентрациях АТФ (соответственно при высоком уровне АМФ) в клетках
отмечаются
стимулирование
гликолиза
и
окисление
пирувата
в
лимоннокислом цикле, что способствует обеспечению клеток энергией.
Однако при низких концентрациях АМФ имеет место снижение скорости
цикла трикарбоновых кислот, обусловленное торможением активности
изоцитратдегидрогеназы, соответственно наблюдается снижение скорости
синтеза АТФ и накопление изолимонной кислоты. Последняя, как известно,
повышает активность другого фермента – ацетил-КоА-карбоксилазы, которая
в свою очередь катализирует I стадию превращения ацетил-КоА в жирную
кислоту. Благодаря этим обстоятельствам клетка переводит образовавшуюся
при гликолизе молекулу ацетил-КоА с энергетического пути на путь синтеза
липидов и их отложения в депо. В то же время при восстановлении скорости
утилизации АТФ, что обычно наблюдается при синтезе жирных кислот,
соответствующее
повышение
уровня
АМФ
способствует
снижению
концентрации лимонной кислоты и соответственно торможению синтеза
липидов.
Перечисленными
примерами
абсолютно
не
исчерпывается
все
многообразие взаимопревращений органических веществ, которые постоянно
совершаются в живых организмах. Здесь приведены лишь главные,
магистральные каналы и пути превращения общих классов веществ и
указаны ключевые субстраты и ферментные системы, обеспечивающие
постоянство химических компонентов и тканей и динамичность живых
структур.
Таким образом, скорость распада одних питательных веществ и
биосинтеза других прежде всего определяется физиологическим состоянием
и
потребностями
организма
в
энергии
и
метаболитах.
Благодаря
динамичности и координации метаболической активности обеспечивается
макро- и микроскопическое постоянство всех форм живого. Выяснение
фундаментальных проблем структуры и функций отдельных биомолекул
может служить основой для раскрытия как молекулярных механизмов
145
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
химических процессов, лежащих в основе состава и функций отдельных
клеток и целостного организма, так и процессов, обеспечивающих
биологическую индивидуальность живых организмов. Любые нарушения
этого
динамического
статуса
организма
сопровождаются
развитием
патологии, тяжесть и продолжительность которой будут определяться
степенью повреждения структуры и функций отдельных молекулярных и
надмолекулярных компонентов клеток.
8.1 Гликогенолиз под влиянием ферментов мышечной ткани
Окисление
углеводов
в
тканях
с
выделением
энергии,
накапливающейся в фосфорных макроэргических соединениях, в основном
в АТФ, происходит под влиянием комплекса ферментов и идет главным
образом двумя путями: а) вне доступа кислорода — анаэробный распад —
гликолиз и гликогенолиз, б) с доступом кислорода — аэробный распад. Оба
пути обеспечивают клетки АТФ. Второй путь дает несравненно больше
энергии (на 1 остаток глюкозы I грамм-молекулы АТФ), чем первый (на 1
молекулу глюкозы при гликолизе 2 и при гликогенолизе 3 грамм-молекулы
АТФ). Если при анаэробном распаде исходным углеводом является гликоген,
то этот процесс в целом носит название гликогенолиза, а если глюкоза —
гликолиза.
О процессе гликогенолиза (и гликолиза) в мышцах судят по образованию
молочной кислоты, которое обусловлено наличием в мышечной кашице
комплекса ферментов, катализирующих расщепление гликогена через ряд
промежуточных этапов до молочной кислоты. Определение молочной
кислоты основано на превращении ее под влиянием концентрированной
серной кислоты в уксусный альдегид.
146
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 58 – Превращение молочной кислоты в уксусный альдегид
Уксусный альдегид открывают по цветной реакции при взаимодействии его с
вератролом (диметиловый эфир пирокатехина).
Реактивы и материалы
1. Мышцы от только что забитой крысы или кролика, быстро
измельченные ножницами на холоду (чашку ставят на лед).
2. Фосфатный буфер, рН 8,0 (приготовление см. приложение А, п.71).
3. Гликоген, 1 % - ный раствор (приготовление см. приложение А, п.
16). В случае необходимости гликоген можно заменить 1 % - ным раствором
крахмала или употребить 1 % - ный раствор глюкозы.
4. Трихлоруксусная кислота, 10 % - ный раствор.
5. Вазелиновое масло.
6. Сернокислая медь, 10 % - ный раствор.
7. Гидрат окиси кальция — Са(ОН)2, в порошке.
8. Серная кислота, концентрированная.
9. Вератрол, 0,1 % - ный раствор в этиловом спирте. Вератрол можно
заменить гваяколом (монометиловый эфир пирокатехина).
Оборудование
Штатив с сухими пробирками.
Капельницы.
Пипетки на 3 мл и 1 мл.
Весы аптечные с разновесами, часовые стекла.
Водяная баня, снабженная термометром, нагретая до температуры
тела или термостат (37 °С).
Водяная баня, кипящая.
147
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Воронки с бумажными фильтрами.
Стеклянные лопаточки.
Лед.
Техника
1. В две пробирки, обозначенные буквами «К» и «О» (контрольная
и опытная), отмеривают по 3 мл фосфатного буфера и по 1 мл
1 % - ного раствора гликогена (крахмала или глюкозы).
2. В контрольную пробирку тотчас же прибавляют 20 капель
10 % - ного раствора трихлоруксусной кислоты для осаждения белков и
активации ферментов мышечной ткани.
3. В обе пробирки вносят по 1 г свежеприготовленных на холоде
измельченных мышц, тщательно перемешивают и покрывают слоем 10
капель) вазелинового масла для разобщения от кислорода воздуха.
4. Обе пробирки инкубируют в водяной бане, нагретой до
темературы тела или в термостате при 37 °С 1—2 часа.
5. После инкубации в опытную пробирку добавляют 20 капель
10 % - ного раствора трихлоруксусной кислоты и перемешивают.
6. Содержимое пробирок фильтруют через бумажный фильтр в 2-ве
чистые пробирки, обозначенные буквами «К» и «О».
7. Отмеривают по 25 капель фильтрата каждой пробы в две чистые
сухие пробирки. Для осаждения углеводов, мешающих обнаружению
молочной кислоты, к фильтрату добавляют 3 — 4 капли 10 % - ного
раствора сернокислой меди, гидрата окиси кальция в порошке (половину
лопаточки),
хорошо
перемешивают
и
оставляют
на
10
минут,
периодически помешивая стеклянной палочкой.
8. Содержимое
обеих
пробирок
фильтруют
через
маленький
бумажный фильтр, смоченный водой. Осадок на фильтре отбрасывают.
9. Пробирки с фильтратом помещают в воду со льдом и при
осторожном встряхивании добавляют по каплям 20 капель концентрированной
148
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
серной кислоты (сильное перегревание может привести к обугливанию
молочной кислоты), после чего ставят в кипящую водяную баню на 4
минуты.
10. По истечении указанного времени жидкость тотчас охлаждают и в
каждую пробирку прибавляют по 1 капле 0,1 % - ного раствора
вератрола, осторожно встряхивают и оставляют стоять 20 минут.
11. Наблюдают развитие красного (или розового) окрашивания в
опытной пробирке, где ферменты гликогенолиза мышечной ткани не были
инактивированы
10%
трихлоруксусной
кислотой,
и
появление
значительно менее интенсивной красной (или розовой) окраски в
контрольной пробе, где ферментативные процессы были прекращены
добавлением 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Слабая окраска в
контрольной пробе обусловлена пред образованной молочной кислотой,
содержащейся в мышце до начала опыта.
8.2 Спиртовое брожение глюкозы
Спиртовое брожение глюкозы происходит под влиянием ферментов
дрожжей и заканчивается образованием этилового спирта и двуокиси углерода.
Процесс брожения не требует кислорода, т. е идет анаэробным путем, и в этих
условиях обеспечивает дрожжевую клетку всей необходимой энергией.
Реакция распада глюкозы при брожении в дрожжевых клетках и при гликолизе
в мышцах протекают одинаково, начиная от глюкозо-6-фосфата и кончая
образованием пировиноградной кислоты. Различие между ними связано с
дальнейшим превращением пировиноградной кислоты При гликолизе
пировиноградная кислота в присутствии лактатдегидрогеназы взаимодействует
с восстановленным никотинамидадениндинуклеотидом (НАДН + Н+) с
образованием
молочной
кислоты
149
и
окисленного
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
никотинамидадениндинуклеотида
пировиноградная
кислота
(НАД+).
сначала
При
спиртовом
де-карбоксилируется
до
брожении
уксусного
альдегида, а затем последний восстанавливается НАДН + Н+ в этиловый
спирт.
Помимо глюкозы дрожжами сбраживаются и все другие природные
гексозы, а также дисахариды — мальтоза и сахароза, которые способны
ферментами дрожжей гидролизоваться до моносахаридов.
Рисунок 59 - Переход молочной кислоты в этанол
Спиртовое брожение проводится в специальных бродильных приборах,
называемых бродильными сахариметрами или бродильными аппаратами (рис.
34). Углекислый газ собирается в запаянном конце трубки и распознается по
поглощению его щелочью. Наличие этанола в бродильной жидкости
доказывается с помощью реакции (26) получения йодоформа:
С2Н 5ОН + 4J 2 + 6NaOH→CHJ 3 + 5NaJ + HCOONa + 5Н2О
Реактивы и материалы
1 Свежие или сухие пекарские дрожжи.
2. Глюкоза, 5 % - ный раствор.
150
(26)
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3. Виннокаменная кислота, 1 % - ный раствор.
4. Едкий натр, 10 % - ный раствор.
5. Раствор йода в йодистом калии (приготовление см. приложение А,
п. 54).
Оборудование
1. Весы аптечные с разновесами.
2. Ступка с пестиком.
3. Мерный цилиндр на 50 мл.
4. Стаканы на 50 мл.
5. Два прибора для брожения.
6. Термостат.
7. Небольшие воронки с бумажными фильтрами.
8. Штатив с пробирками.
9. Капельницы.
Техника
1. Один грамм свежих или 0,5 г сухих пекарских дрожжей растирают в
ступке (или в пробирке стеклянной палочкой) с 5 мл 5% - ного раствора
глюкозы до получения однородной мутной жидкости без комочков.
2. Полученную смесь смывают в стакан 30 мл того же раствора
глюкозы, перемешивают и добавляют 1 % - ный раствор виннокаменной
кислоты до слабокислой реакции на лакмус.
3. Смесь переносят в бродильный прибор. Заполняют сначала доверху
трубку с запаянным концом при легком наклонении и медленном поднятии
прибора, стараясь при этом избегнуть проскакивания пузырьков воздуха; затем
доливают бродильной смесью до основания расширенной части прибора.
4. Учитывая, что в самих дрожжах может содержаться некоторое
количество сбраживаемых Сахаров, ставят контроль, который готовят так же,
как и основной опыт, но вместо раствора глюкозы берут подкисленную
виннокаменной кислотой дистиллированную воду.
151
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5. Оба прибора (с опытной и контрольной смесями) помещают в
термостат при температуре 37 °С на 1—2,5 часа (в зависимости от активности
дрожжей), закрыв ватной пробкой открытый конец трубки.
6. В приборе с глюкозой наблюдают за выделением пузырьков газа
(СО2), которые собираются в верхней части трубки с запаянным концом. В
контрольном опыте газ не образуется или появляется в небольших
количествах (если сами дрожжи не содержат сахаров, способных к
брожению).
7. Доказывают,
что
газ,
собравшийся
в
трубке,
является
действительно углекислым газом. Для этого в расширенную часть трубы;
осторожно добавляют до краев 10 % - ный раствор едкого натра, плотно
закрывают
отверстие
большим
пальцем
и
перевертывают
прибор.
Углекислый газ, взаимодействуя со щелочью, поглощается, возникает вакуум,
и мякоть пальца втягивается в отверстие прибора. Палеи осторожно снимают с
краев трубки. Едкую щелочь можно ввести в узкую часть прибора изогнутой
крючком пипеткой.
8. Для обнаружения этанола в пустую пробирку отфильтровывают из
бродильной трубки 20 капель жидкости. Добавляют по каплям раствор йода в
йодистом калии до желтого окрашивания и нагревают на слабом огне.
Появляется
запах
йодоформа,
образующегося
из
этилового
спирта.
Необходимо следить за тем, чтобы жидкость имела щелочную реакцию. Проба
брожением может быть использована для открытия глюкозы в моче.
8.3 Проба Гайнеса
Проба Гайнеса основана на способности глюкозы при нагревании в
щелочной среде окисляться и восстанавливать гидрат окиси меди синего цвета
в гидрат закиси меди желтого цвета и в закись меди красного цвета. Во
152
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
избежание образования из гидрата окиси меди при нагревании черного осадка
окиси меди, мешающей открытию глюкозы, к реактиву Гайнеса добавляют
глицерин. Гидроксильные группы глицерина связывают избыток гидрата окиси
меди.
Реактивы
1. Реактив Гайнеса (приготовление см. приложение А, п. 61).
Оборудование
1. Штатив с пробирками.
2. Пипетки на 5 мл с делениями.
3. Капельницы.
Техника
1. К 3—4 мл реактива Гайнеса прибавляют 8—12 капель мочи и нагревают
верхнюю часть содержимого пробирки до начала кипения.
При наличии сахара наблюдают переход цвета жидкости из синего в
желтый или красный и появление желтого — Сu(ОН)2 или красного — Сu2О
осадка. Нижняя не подогреваемая часть пробирки является контролем.
8.4 Открытие непредельных жирных кислот в жире
Непредельные жирные кислоты легко присоединяют галогены по месту
двойных
связей,
образуя
галогенпроизводные
жирных
кислот,
что
доказывается обесцвечиванием раствора брома или йода
Рисунок 60 – Взаимодействие непредельной жирной кислоты с йодом
(схема)
153
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Реактивы и материалы
1. Растительное масло или рыбий жир, раствор в хлороформе
2. Бром или йод, раствор в хлороформе.
Оборудование
1. Штатив с пробирками.
2. Капельницы.
Техника
1. К 15 - 20 каплям раствора жира в хлороформе прибавляют при
взбалтывании по одной капле хлороформного раствора брома или йода
(окрашен).
2. Вначале наблюдают обесцвечивание растворов брома или йода
вследствие присоединения галоидов по месту двойных связей в молекулах
жирных кислот. После насыщения всех непредельных связей дальнейшее
добавление растворов брома или йода обесцвечивания их не вызывает.
О содержании непредельных жирных кислот в жире можно судить по его
«йодному числу», показывающему количество граммов йода, присоединенных
к 100 г жира.
Рекомендации к составлению протокола
Записать
ход
и
химизм
реакции.
Сделать
вывод
о
наличии
ненасыщенных жирных кислот в исследованном жире.
8.5 Эмульгирование жиров
Эмульгирование жиров необходимо для ускорения переваривания жиров
пищи в полости кишечника ферментом липазой, так как это вызывает
увеличение поверхности соприкосновения жира с водным раствором липазы.
154
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Эмульгаторами являются поверхностно активные вещества — белки, соли
желчных кислот, мыла. Наибольшей эмульгирующей активностью обладают
щелочно-реагирующие соли желчных кислот, которые вместе с желчью
изливаются в двенадцатиперстную кишку через желчный проток. Они
адсорбируются на поверхности жировых капель, образуя тончайший слой,
причем гидрофильные группы желчных кислот обращены в сторону водной
фазы, а гидрофобные радикалы направлены к жиру. При этом происходит
уменьшение поверхностного натяжения на разделе двух фаз вода/жир, что
приводит к распаду капелек жира на более мелкие.
Реактивы и материалы
1. Растительное масло (или рыбий жир).
2. Желчь, разведенная в 2 раза.
3. Раствор белка (приготовление см. приложение А, п. 52).
4. Натриевое мыло, 1 % - ный раствор.
5. Натрий углекислый, 1 % - ный раствор.
Оборудование
1. Штатив с пробирками.
2. Капельницы.
Техника
1. Берут 5 пробирок. В первую наливают 15 капель дистиллированной
воды, во вторую — 15 капель разведенной желчи, в третью —15 капель
раствора белка, в четвертую — 15 капель 1 % - ного раствора мыла и в пятую —
15 капель 1 % - ного раствора соды.
2. В каждую пробирку добавляют по 3—4 капли растительного масла,
одновременно взбалтывают содержимое всех пробирок и готовят их по
порядку в штатив.
3. Наблюдают в первой пробирке расслоение неустойчивой эмульсии на
жир и воду, а во второй, третьей, четвертой и пятой — образование эмульсии.
Эмульгирование жира содой обусловлено образованием мыла в
155
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
результате взаимодействия углекислого натрия с присутствующими в жире
свободными жирными кислотами.
В выводах указать, в присутствии каких эмульгаторов получалась
наиболее стойкая эмульсия. Отметить сравнительную значимость разных
физиологических эмульгаторов жиров для процесса переваривания их в
кишечнике.
8.6 Влияние желчных кислот на активность панкреатической
липазы
Расщепление жиров в кишечнике на глицерин и высшие жирные кислоты
совершается
главным
образом
при
участии
липазы,
секретируемой
поджелудочной железой, и, в меньшей степени, липазы, выделяемой железами
слизистой кишечника. Липаза отщепляет сначала остатки жирных кислот от
триглицеридов,
преимущественно
в
α-положениях.
Образующийся
β-
моноглицерид изомеризуется в α-моноглицерид, после чего также может
быть расщеплен липазой на глицерин и жирную кислоту. В итоге триглицерид
распадается на глицерин и три молекулы жирных кислот:
Рисунок 61 –Действие липазы на глицерин
Для действия липазы на жир необходимо присутствие желчных кислот
образующихся в печени. Они вызывают эмульгирование жиров, приводящее
к увеличению поверхности соприкосновения жира с липазой. Удобным
156
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
материалом для исследования является молоко, где жир находится уже в
эмульгированном состоянии. В качестве источника липазы используют
вытяжку из поджелудочной железы или препарат панкреатина.
Опыт основан на расщеплении жира молока под воздействием липазы
на глицерин и жирные кислоты. Последние сдвигают реакцию среды в кислую
сторону и обнаруживаются титрованием щелочью. Опыт предусматривает три
варианта воздействия на молочный жир:
1) липазой без желчи;
2) липазой вместе с желчными кислотами;
3) желчью без липазы;
Реактивы и материалы
1. Молоко прокипяченное.
2. Фенолфталеин, 1 % - ный раствор в этиловом спирте.
3. Едкий натр, 10 % - ный раствор.
4. Едкий натр, 0,1 н. раствор.
5. Панкреатин — препарат поджелудочной железы, содержащий липазу
(навески по 100 мг).
6. Желчь.
Оборудование
1. Мерный цилиндр.
2. Конические колбочки на 25 и 50 мл.
3. Бюретки.
4. Пипетки на 5 мл.
Техника
1. В колбочку наливают 20 мл молока и нейтрализуют его кислотность,
обусловленную присутствием кислых солей. Для этого в колбу приливают 2
капли 1 % - ного раствора фенолфталеина и 4 капли 10 % - ного раствора
едкого натра (избегать избытка), после чего при тщательном перемешивании
содержимого колбы осторожно добавляют 0,1 н. раствор едкого натра до
157
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
слаборозовой окраски.
2. Из нейтрализованного молока готовят в конических колбочках
опытные пробы по следующей схеме (таблица 5).
3. Пробы тщательно перемешивают и оставляют при комнатной
температуре.
Таблица 5 - Гидролиз жира молока липазой
№
пробы
Молоко,
мл
Панкреатин,
мг
Желчь
,мл
Вода,
мл
1
2
3
5
5
5
100
100
---
--1
1
1
-----
Результаты титрования в мл 0,1 н.
раствора NaOH через
15 мин 30 мин 45 мин 60 мин
4. Через 15 минут от начала инкубации пробы титруют из бюретки 0,1 н.
раствором NaOH до слабо-розовой окраски, после чего вновь оставляют при
комнатной температуре. Количество израсходованной щелочи фиксируют в
таблице 5.
5. Титрование проб повторяют через 30, 45 и 60 минут от начала
инкубации. Каждый раз от титровывается то количество жирных кислот,
которое освобождается из жира молока при его гидролизе липазой за данный
отрезок времени (15 минут).
Рекомендации к составлению протокола
Изобразить графически динамику расщепления жира липазой для
каждой пробы, откладывая на оси абсцисс время в минутах, а на оси ординат
— количество 01 н. раствора NaOH (в мл), израсходованного на
нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся за данное время (15, 30, 45,
60 минут).
Выразить активность липазы как концентрацию карбоксильных групп
жирных кислот, образовавшихся в 100 мл молока за все время исследования,
158
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пользуясь следующей формулой (27):
(27)
где х — концентрация СООН-групп, образующихся в 100 мл молока;
0,1 — нормальность раствора NaOH;
А — количество 0,1 н. раствора NaOH, израсходованного на титрование 5
мл молока за все время инкубации (сумма всех титрований), мл;
5 — количество молока в титруемой пробе, мл.
На основании хода кривых на графике и полученных данных
концентрации
карбоксильных
групп
сделать
вывод
о
зависимости
активности липазы от присутствия желчных кислот. Отметить зависимость
количества
образовавшихся
свободных
жирных
кислот
от
продолжительности ферментативного действия.
8.7 Переваривание белков пепсином
Переваривание белков начинается в желудке под влиянием желудочного
сока. Желудочный сок, выделяемый железами слизистой оболочки стенок
желудка, представляет собой жидкость, содержащую 99 % - тов воды,
свободную соляную кислоту, кислореагирующие фосфаты, хлористый натрий,
протеолитический фермент — пепсин, липолитический фермент — липазу
(расщепляет только эмульгированный жир) и другие вещества. Пепсин
выделяется главными клетками желез слизистой желудка в виде неактивного
профермента — пепсиногена. Под влиянием соляной кислоты от пепсиногена
отщепляются полипептиды, в результате чего пепсиноген превращается в
активный фермент пепсин, способный к гидролитическому расщеплению
пептидных связей белков. Оптимальное значение рН для пепсина человека
159
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1,5—2,5. В нейтральной и щелочной среде пепсин неактивен. Соляная кислота
не только участвует в активации пепсиногена и создании оптимального
значения рН, но и способствует набуханию и денатурации белков, что
создает более благоприятные условия для действия пепсина.
Пепсин является эндопептидазой, так как действует преимущественно на
внутренние пептидные связи. Однако под влиянием пепсина разрываются
также и некоторые пептидные связи, находящиеся на конце полипептидной
цепи, что сопровождается появлением свободных аминокислот. В результате
гидролиза белков пепсином образуются пептоны — смесь более или менее
сложных полипептидов, а также в небольшом количестве свободные
аминокислоты.
Реактивы и материалы
1. Фибрин.
2. Желудочный сок или 0,1 % - ный раствор пепсина в 0,2 % - ного
раствора соляной кислоты (приготовление см. приложение А, п. 21).
3. Натрий углекислый, 2 % - ный раствор.
4. Едкий натр, 0,4 % - ный раствор.
5. Соляная кислота, 0,2 % - ный раствор.
6. Едкий натр, 10 % -ный раствор.
7. Сернокислая медь, 1 % - ный раствор.
Оборудование
1. Штатив с пробирками.
2. Лакмусовая бумага.
3. Капельницы.
4. Термометр.
5. Водяная баня или термостат на 38 °С— 40 °С.
Техника
1. В одну пробирку наливают 20 капель желудочного сока или 0,1 %
раствора пепсина в 0,2 % соляной кислоты.
160
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. В другую пробирку помещают 20 капель желудочного сока
или 0,1 % раствора пепсина в 0,2 % соляной кислоте, нейтрализованных
содой.
3. В третью пробирку вливают 20 капель желудочного сока или 0,1 %
раствор пепсина в 0,2 % соляной кислоте, предварительно подщелоченных
0,4 % раствором NaOH.
4. В четвертую пробирку закапывают 20 капель желудочного сока или
0,1 % раствора пепсина в 0,2 % соляной кислоте, предварительно
подвергнутых кипячению.
5. В пятую пробирку отмеривают 20 капель 0,2 % раствора НС1.
6. Во все пять пробирок добавляют одинаковые небольшие кусочки
фибрина, и пробирки помещают в термостат при 38 °С — 40 °С.
7. После переваривания (растворения) фибрина в первой пробирке
(примерно через 30 минут от начала опыта) все пробирки вынимают из
термостата и наблюдают за изменениями фибрина.
Переваривание фибрина в первой пробе указывает на то, что пепсин
действует в присутствии соляной кислоты. Фибрин во второй и третьей пробах
остается неизмененным, так как пепсин в нейтральной и щелочной среде
неактивен. В четвертой пробе, где фермент был инактивирован кипячением, и
в пятой пробе, в которой пепсина не было, может произойти лишь набухание
фибрина под влиянием соляной кислоты.
8. Содержимое каждой пробирки фильтруют и с фильтратом производят
биуретовую реакцию. Положительная реакция обнаруживается только в
первой пробе, где был активный пепсин, соляная кислота, фибрин, что
указывает на присутствие в фильтрате продуктов переваривания белка.
161
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8.8 Определение активности аланинаминотрансферазы в
сыворотке
крови
динитрофенилгидразиновым
методом
(метод
Райтмана и Френкеля)
Большую роль в синтезе и распаде аминокислот играют реакции
трансаминирования (переаминирования), которые заключаются в обратимом
переносе аминогруппы между аминокислотами и кето-кислотами, без
промежуточного образования аммиака. Этот процесс катализируют ферменты
аминотрансферазы
(трансаминазы),
коферментом
которых
является
фосфопиридоксаль, обратимо превращающийся в процессе реакции в
фосфопиридоксамин. В результате трансаминирования образуются новая аминокислота и новая кетокислота.
Наибольшее клинико-диагностическое значение имеют две трансаминазы:
аспартатаминотрансфераза (КФ 2.6.1.1) и аланинаминотрансфераза (КФ
2.6.1.2). Аланинаминотрансфераза (АлАТ) катализирует обратимый перенос
аминогруппы между α-кетоглютановой кислотой и аланином.
Рисунок 62 – Взаимодействие аланина и альфа-кетоглутаровой кислоты
Аспартатаминотрансфераза
катализирует
обратимый
перенос
аминогруппы между α-кетоглютаровой и аспарагиновой кислотами. В тканях
ряда органов (сердце, печень и др.) количество аспартатаминотрансферазы
(АсАТ) и АлАТ в сотни и тысячи раз превышает уровень их активности в
162
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
сыворотке крови. Однако при некоторых заболеваниях, связанных с
некробиотическими процессами сердечной мышце (инфаркт миокарда) или с
поражением паренхимы печени (инфекционный гепатит и др.), а также при
интенсивных травматических повреждениях мышц содержание одного или
обоих указанных ферментов в сыворотке
крови может значительно
увеличиваться в результате поступления ферментов из тканей. При обширном
остром инфаркте миокарда содержание АсАТ увеличено весьма значительно,
активность же АлАТ остается в пределах нормы или повышается в меньшей
степени, чем АсАТ. Возрастание активности АсАТ наступает через 4—6 часов,
достигает максимума спустя 24—36 часов после инфаркта миокарда и на 3— 7й день при благоприятном течении заболевания снижается до нормального
значения. При заболеваниях, связанных с поражением паренхимы печени, в
крови увеличивается активность обоих ферментов, но более значительно
выражена активность АлАТ. Особенно резко возрастает активность АлАТ при
инфекционном гепатите, обнаруживая максимум повышения на 6—10-й день
заболевания и постепенно возвращаясь к норме к 15—20-му дню.
Принцип
происходящей
метода.
под
пировиноградная
В
результате
действием
кислота.
АлАТ
реакции
сыворотки
Последняя,
реагируя
трансаминирования.
крови,
с
образуется
2,4-динитрофе-
нилгидразином, создает динитрофенилгидразон, дающий в щелочной среде
окрашенное
соединение.
Интенсивность
окраски
пропорциональна
количеству полученной пировиноградной кислоты.
Рисунок
63
–
Взаимодействие
динитрофинилгидразином (схема)
163
пировиноградной
кислоты
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Реактивы и материалы
1. Сыворотка крови или водные экстракты тканей сердца и печени
(навески тканей растирают в ступке или гомогенизаторе Поттера со 100—200кратным объемом воды и отстаивают).
2. Раствор
субстрата
для
определения
аланинаминотрансферазы,
содержащий аланин и а-кетоглютаровую кислоту (приготовление см.
приложение А, п. 57).
3. 2,4-Динитрофенилгидразин,
раствор
в
1н.
соляной
кислоте
(приготовление см. приложение А, п. 18)
4. Натр едкий, 0,4 н. раствор, свободный от карбонатов (приготовление
см. приложение А, п. 36).
5. Стандартный раствор пировиноградной кислоты, содержащий
в 1 мл 110 мкг пирувата натрия, что соответствует 88 мкг пировиноградной
кислоты (приготовление см приложение А, п. 67).
Оборудование
1. Штатив с пробирками.
2. Пипетки емкостью 0,5 мл с делениями и 5 мл.
3. Микропипетка.
4. Термостат на 37 °С.
Техника
1.
В пробирку наливают 0,5 мл субстратного раствора для
определения АлАТ (аланинокетоглютаровая смесь), нагревают 5 мин при
37 °С. Затем приливают 0,1 мл сыворотки крови, смешивают раствор легким
встряхиванием и ставят в термостат при 37 °С на 30 минут.
2. К
содержимому
2,4-динитрофенилгидразина
пробирки
в
соляной
добавляют
кислоте
0,5
мл
(добавление
раствора
кислого
раствора останавливает энзиматический процесс) и выдерживают 20 минут
при комнатной температуре для образования гидразона.
3. К смеси прибавляют 5 мл 0,4 н. раствора едкого натра, тщательно
164
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
перемешивают и оставляют для развития окраски на 10 минут при
комнатной температуре.
4. Оптическую
плотность
раствора
измеряют
на
ФЭКе
при
500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против
контроля.
5. Контрольную пробу (два параллельных определения) ставят
одновременно
с
опытной,
но
раствор
2,4-динитрофенилгидразина
добавляют до инкубации. Перед фотометрическим определением обе
контрольные пробы смешивают и разливают в две кюветы. Расчет
активности
ферментов
в
сыворотке
крови
производят
по
калибровочному графику
6. Построение калибровочного графика. Из стандартного раствора
пирувата натрия готовят ряд разведений.
В каждую пробирку приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина в соляной кислоте и выдерживают 20 минут при
комнатной температуре.
Контрольная проба (два параллельных определения) ставится как
стандартная, но вместо стандартного раствора пирувата натрия добавляют
дистиллированную воду.
Строят калибровочный график. На оси ординат откладываю: найденную
величину оптической плотности, на оси абсцисс — соответствующее ей
содержание пировиноградной кислоты в микрограммах.
Активность фермента выражают в микромолях пировиноградной
кислоты, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки крови в течение 1
часа при 37 °С. Пересчет на микромоли производят по следующей
формуле (28):
,
(28)
где 10—коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки;
С — пировиноградная кислота, в мкг, найденная по калибровочному
165
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
графику;
88 — вес 1 микромоля пировиноградной кислоты, в мкг;
2 — коэффициент пересчета на 1 час инкубации.
Нормальные показатели активности АлАТ, выраженные в микромолях
пировиноградной кислоты, образовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки
крови в течение 1 часа при 37 °С, колеблются от 0,1 до 0,68 микромоль
Примечания
1. Сыворотка не должна быть гемолизированной. При хранении
сыворотки в холодильнике активность фермента не снижается в течение 1—
2 дней.
2. Начиная с величины экстинкции 0,30, график, как правило,
отклоняется от прямой. В целях соблюдения прямой пропорциональности
между концентрацией вещества и оптической плотностью при получении
экстинкции
выше
0,3
сыворотки
следует
разводить
какой-либо
инактивированной сывороткой или 5 % - ным раствором альбумина,
приготовленным на физиологическом растворе. Результаты умножить на
коэффициент разведения.
Рекомендации к составлению протокола
Сделать расчет. Полученные при анализе данные сопоставить с
нормальными показателями активности АлАТ.
166
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Список использованных источников
1. Руководство к лабораторным работам по биоорганической химии:
пособие для вузов / Н.Н. Артемьева [и др.]; под ред. Н.А. Тюкавкиной. – 3-е
изд., перерраб. и доп. – М.: Дрофа, 2006. – 318с.
2.. Березов, Т. Т Биологическая химия: учебник/ Т. Т. Березов, Б. Ф.
Коровкин. - 3-е изд., перераб. И доп.– М.: Медицина, 1998.– 704 с.
3. Варфоломеев, С.Д. Химическая энзимология: учебник / С.Д.
Варфоломеев.- М.: Академия, 2005. – 480 с.
4. Зубаиров, Д.М. Руководство к лабораторным занятиям по
биологической химии: / Д.М. Зубаиров, В.Н. Тимербаев, В.С. Давыдов. – М.:
ГЭОТАР-Медиа, 2005. 392 с.
167
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Приложение А
(Справочное)
Рекомендации по изготовлению рабочих растворов
1. Аммиачный буферный раствор. 20 г химически чистого
хлористого аммония растворяют в дистиллированной воде, добавляют 100 мл
25 % - ного раствора аммиака и доводят до 1 л дистиллированной водой.
2. Аммиачный раствор азотнокислого серебра. К 2 % - ному
раствору азотнокислого серебра добавляют концентрированный раствор
аммиака до растворения выпадающего осадка.
3. Аммоний молибденовокислый, 4 % - ный раствор. Растворяют 4 г
измельченного
химически
чистого
молибдата
аммония
в
100
мл
дистиллированной воды. Раствор хранят в холодильнике. Стоек в течение
нескольких недель.
4. Аммоний молибденовокислый, 2,5 % - ный раствор в 5 н.
растворе серной кислоты. В мерную колбу на 0,5 л вносят 12,5 г молибдата
аммония, наливают туда 250 мл 10н. серной кислоты и растворяют молибдат.
Доводят водой до метки.
5. Аммоний молибденовокислый, раствор в азотной кислоте. 7,5 г
молибденовокислого аммония растворяют в 100 мл воды и добавляют 100 мл
32 % - ной азотной кислоты (удельного веса 1,2). Полное растворение
молибденовокислого
аммония
происходит после
добавления
азотной
кислоты.
6. Биуретовый реактив, рабочий раствор, приготовленный из
основного раствора А. Основной биуретовый реактив. 4,5 г сегнетовой
соли растворяют в 40 мл 0,2н. раствора едкого натра, свободного от
углекислого газа. Затем прибавляют 1,5 г сернокислой меди (CuSO4 • 5Н2О)
и 0,5 г йодистого калия. Раствор доливают до 100 мл. раствором 0,2 н. едкого
натра. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стоек.
168
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Б. 0,5 % - ный раствор йодистого калия в 0,2 н. растворе едкого
натра.
Хранят в посуде из темного стекла не более двух недель.
В. Рабочий раствор биуретового реактива. 20 мл основного
биуретового реактива смешивают с 80 мл раствора йодистого калия. Раствор
стоек.
7. Бромная вода. К 500 мл воды добавляют под тягой 5 мл брома
8. Бромноватистая щелочь. Каждый раз перед употреблением
отмеривают в пробирку 10 мл 33 % - ного раствора едкого натра и
прибавляют 20 капель чистого брома (под тягой); смешивают, переливая
смесь несколько раз из одной пробирки в другую.
9. Викасол, 0,05 % - ный раствор. В большой ступке растирают 20
таблеток викасола, содержащих по 15 мг названного витамина, добавляя
500 мл воды. Полученный раствор фильтруют.
10.
Вытяжка
из
поджелудочной
железы.
Свежую
или
свежезамороженную поджелудочную железу (свиньи, быка или другого
животного) очищают от жира, пропускают через мясорубку и тщательно
растирают в ступке с тройным количеством воды Полученный экстракт
процеживают через 2 - 3 слоя марли.
11. Гваяковая смола, спиртовой раствор. 2 - 3 г гваяковой смолы
растирают в 100 мл 95 % - ного этилового спирта.
12. Гидразинсульфат, насыщенный раствор. 2,5 г сернокислого
гидразина растворяют в 100 мл бидистиллированной воды. Хранят при
комнатной температуре в посуде из темного стекла.
13. Гидрохинон, 2 % - ный раствор. К 100 мл 2 % -ного раствора
гидрохинона прибавляют 1 каплю концентрированной серной кислоты.
Раствор должен быть почти бесцветным; при стоянии он становится
коричневым и тогда не пригоден (готовить небольшие количества).
14. Гипобромитный раствор. Гипобромитный раствор состоит из
смеси реактивов А и В. Раствор А состоит из растворов А1 А2, A3
169
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Раствор A1: 84,5 г борной кислоты и 25,6 г едкого натра растворяют в
500 мл воды, кипятят в течение 30 минут и после охлаждения доливают
дистиллированной водой до 1 л.
Раствор А2 — насыщенный раствор фтористого натрия (5 % - ный):
5 г фтористого натрия растворяют в 100 мл горячей воды и горячий раствор
фильтруют через бумажный фильтр.
Раствор А3: 27 % - ный раствор едкого натра.
Раствор А. 250 мл раствора А1 смешивают с 150 мл раствора А2 и с
50 мл раствора А3, т е. в соотношении 5:3:1. Смесь стойкая.
Борная кислота связывает сахар в крови, редуцирующие свойства
которого мешали бы опыту. В присутствии ионов борной кислоты
гипобромит не действует на глюкозу.
Раствор Б: в колбе емкостью 1 л растворяют 20 г бромистого калия
приблизительно в 500 мл воды, прибавляют 8 г (2,5 мл) брома, взбалтывают
до растворения и доливают до 1 л дистиллированной водой.
Гипобромитный раствор получают непосредственно перед опытом,
смешивая 9 частей раствора А и 1 часть раствора Б.
15. Гипосульфит натрия (Na2S2O3 5Н2О), 0,005 н. раствор. Готовят
перед работой из 0,1 н. раствора гипосульфита натрия разведением в 20 раз
(5 мл 0,1 н. раствора гипосульфита натрия и 9,5 мл воды). 0,1 н. раствор
готовят из фиксонала или из кристаллического гипосульфита натрия: 25 г
гипосульфита натрия доводят до 1 л свежепрокипяченной и охлажденной до
комнатной температуры дистиллированной водой. Раствор хранят в посуде
из темного стекла с притертой пробкой. Через 2 недели устанавливают титр
раствора гипосульфита натрия. Для этой цели можно использовать точный
0,1 н. раствор двухромовокислого калия. При расчете учитывают фактор
поправки. Проверка титра 0,1 н. раствора гипосульфита натрия. Готовят
0,1 н. раствор двухромовокислого калия. 4,9037 г двухромовокислого калия
растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят
объем до 1 л дистиллированной водой. Раствор стоек. В колбу на 100 мл
170
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
моровской пипеткой отмеривают 10 мл 0,1 н. раствора К2Сr2О4, 40 мл воды,
10 мл 20 % - ного раствора серной кислоты и 10 мл 10 % -ного раствора
йодистого калия, хорошо перемешивают, колбу закрывают и оставляют
стоять 3—5 минут до полного выделения йода. Раствор в колбе титруют
гипосульфитом натрия до светло-желтого цвета. Затем добавляют 4 капли
1 % - ного раствора крахмала и титруют гипосульфитом натрия вновь до
исчезновения синего оттенка. Раствор получается зеленовато-голубоватого
цвета. Титр 0,005 н. раствора гипосульфита натрия можно проверять по
точному
0,005
н.
раствору
йодноватокислого
калия.
0,1783
г
йодноватокислого калия, предварительно высушенного до постоянного веса,
растворяют
в
мерной
колбе
на
1
л
в
небольшом
количестве
дистиллированной воды и доводят до метки дистиллированной водой. Для
проверки титра гипосульфита натрия берут 2 мл 0,005 н. раствора
йодноватокислого калия, прибавляют 2 мл хлорцинкйодистого раствора, 2 мл
3 % - ной уксусной кислоты и полученную смесь титруют раствором
гипосульфита натрия до слабо-желтого цвета. Затем добавляют 2 капли
1 % - ного раствора крахмала и титруют до обесцвечивания. Рассчитывают
фактор поправки путем деления взятого для титрования объема 0,005 н
раствора КJO3 (2 мл) на количество мл (а) гипосульфита, пошедшего на
титрование: f = 2,00 : а.
16. Гликоген. Животному (например, кролику) дают обильную
порцию углеводной пищи (картофель, морковь и т. п.). Через 6—8 часов
животное убивают, быстро вырезают печень и тотчас, разрезав на куски,
растирают с отмытым песком. Продолжая растирать, добавляют 1,5 объема
3 % - ной трихлоруксусной кислоты и отсасывают. Фильтрат собирают в
стакан. Остаток вторично экстрагируют равным объемом 3 % - ной
трихлоруксусной кислотой. К соединенному фильтрату добавляют равный
объем 95% спирта при подмешивании. Осадок гликогена отделяют
центрифугированием. Полученный осадок растворяют, взбалтывая с 2-3
объемами воды, и снова осаждают равным (по отношению к воде) объемом
171
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
спирта. Эту операцию повторяют 3 — 4 раза. Далее гликоген дважды
промывают 95 % - ным спиртом и высушивают в эксикаторе над хлористым
кальцием.
17. Диазосмесь. Диазореактив I. 5 г сульфаниловой кислоты
растворяют при нагревании в 300—400 мл дистиллированной воды,
прибавляют 15 мл концентрированной соляной кислоты уд. веса 1,19. Если
сульфаниловая кислота полностью не растворяется, колбу помещают в
теплую
воду
и
помешивают.
Только
после
полного
растворения
сульфаниловой кислоты и охлаждения раствора доливают дистиллированной
водой до 1 л. Реактив стойкий, хранится н посуде из темного стекла.
Диазореактив II. 0,5 % - ный раствор азотистокислого натрия
(NaNO2). Реактив хранится в посуде из темного стекла 2—3 недели. Первый
признак его непригодности — желтоватый оттенок.
Перед работой смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл
диазореактива II.
18. 2,4-Динитрофенилгидразин, раствор в 1 н. соляной кислоте.
19,8 мг 2,4-ДНФГ растворяют в небольшом количестве 1 н. раствора соляной
кислоты при нагревании на водяной бане. После того как раствор остынет,
доводят объем соляной кислотой до 100 мл. На следующий день реактив
фильтруют. Раствор хранят в посуде из темного стекла в холодильнике.
Годен в течение 1 года.
19. 2,6-Дихлорфенолиндофенол, натриевая соль, 0,001 н. раствор.
Для приготовления этого реактива применяют буферную фосфатную смесь
по Серенсену, так как индикатор в водном растворе довольно быстро
разрушается. Для этого берут водные растворы КН2РО4 — 9,078 г в 1 л и
Na2HPO4-2H2O — 11,867 г в 1 л. Растворы хранят отдельно.
Затем их смешивают в отношении КН2РО4: Na2HPO4— 2:3, тогда рН
будет 6,9-7,0.
Отвешивают 0,25 г красителя, приливают 700 мл дистиллированной
воды, взбалтывают и добавляют 300 мл буферной смеси. На следующий день
172
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
раствор отфильтровывают и тщательно перемешивают. В приготовленном
таким способом растворе определяют титр по титрованному раствору соли
Мора. Точно отмеривают в маленькую коническую колбочку 10 мл
индикатора, добавляют 5 мл насыщенного раствора щавелевокислого
аммония и титруют из микробюретки раствором соли Мора до тех пор, пока
голубой цвет индикатора не сменится на соломенно-желтый. Для получения
0,01 н. раствора соли Мора 3,92 г соли растворяют в 1 л 0,02 н. серной
кислоты.
Титр
соли
Мора
устанавливают
по
0,01
н.
раствору
марганцовокислого калия.
20. Железистосинеродистый калий, щелочной 0,005 н. раствор.
Отвешивают на аналитических весах 1,65 г химически чистого K3Fe(CN)6.
Препарат необходимо проверить на отсутствие: а) солей трехвалентного
железа и б) железистосинеродистых соединений. Это делается так: а) к 5 мл
5% раствора испытуемого препарата прибавляют одну каплю 10 % - ного
раствора
серной
кислоты и
одну каплю
10
%
- ного
раствора
железистосинеродистого калия; в присутствии трехвалентного железа
получится синее окрашивание; б) к 1 мл 5 % - ного раствора испытуемого
препарата прибавляют несколько капель 1 % - ного раствора FeCl3 и
несколько
капель
нормального
раствора
соляной
кислоты;
при
положительной реакции наблюдается синее окрашивание. Навеску переносят
в мерную колбу на 1 л, растворяют в дистиллированной воде, прибавляют в
колбу 10,6 г предварительно прокаленного безводного углекислого натрия и
доливают колбу дистиллированной водой до отметки. Раствор хранят в
темной склянке, предварительно выщелоченной водяным паром. Реактив
стоек в течение 2 месяцев.
21. Желудочный сок или 0,1 % - ный раствор пепсина в 0,2 % - ном
растворе соляной кислоты. Слизистую оболочку желудка промывают
физиологическим раствором (37 °С), измельчают в мясорубке и добавляют
равный объем 0,4 % соляной кислоты. Через сутки жидкость фильтруют
через
складчатый
бумажный
фильтр.
173
Можно
использовать
также
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
коммерческий препарат пепсина, который растворяют в количестве 1 г в 1 л
0,2 % - ной соляной кислоты и через несколько часов фильтруют. Хранят в
холодильнике.
22. Желудочный сок, не содержащий свободную соляную кислоту.
3 г однозамещенного фосфорнокислого натрия растворяют в воде и доводят
объем раствора водой до 1 л.
23. Желудочный сок, содержащий свободную соляную кислоту. 3 г
однозамещенного фосфорнокислого натрия растворяют в литровой колбе в
6 мл соляной кислоты удельного веса 1,1, прибавляют 40 мл лошадиной
сыворотки и доводят объем раствора водой до 1 л.
24. Индикагор-флюорексон. Флюорексон смешивают с азотнокислым
калием 1:100.
25. Калибровочный график по готовому набору реактивов
билирубин — эталон лиофилизированный, выпускаемый фирмой
«Лахема» (Чехия). Набор Био-Ла-Тест «Билирубин-эталон» состоит из: 1)
билирубина
лиофилизированного
(а
мг/100
мл)
и
2)
альбумина
лиофилизированного.
Приготовление рабочих растворов. Эталонный раствор билирубина. С
бутылочки снимают металлическую крышку и тонкой инъекционной иглой
впускают в бутылочку воздух. Потом осторожно вынимают резиновую
пробку и приливают точно 4,0 мл дистиллированной воды. Бутылочку снова
закрывают
и,
осторожно
встряхивая,
растворяют
весь
лиофилизат.
Приготовленный таким образом эталонный раствор содержит точно такое
количество
билирубина,
которое
указано
на
этикетке
препарата
соответствующей производственной серии (а мг/100 мл). Раствор билирубина
неустойчив, необходимо предохранять его от прямого действия света. Раствор должен быть использован не позднее чем через 2 часа со времени его
приготовления. Раствор альбумина для разбавления. В бутылочку с
лиофилизированным альбумином впускают воздух при помощи тонкой
инъекционной иглы, после чего вынимают резиновую пробку и приливают
174
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8 мл дистиллированной воды. Бутылочку снова закрывают и, осторожно
перемешивая, растворяют лиофилизат. Приготовленный таким образом
раствор для разбавления содержит 2 г альбумина на 100 мл. Раствор хранят в
холодильнике. Если при растворении лиофилизата образуется пена, в раствор
добавляют каплю эфира или октилового спирта.
Приготовление разбавленных эталонных растворов: разбавленные
эталонные растворы билирубина для калибровки приготовляют согласно
приведенной таблице.
Из полученных разбавленных эталонных растворов берут по 0,5 мл,
прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. Через
20 минут проводят измерение на ФЭКе при длине волны от 500 до 560 нм
(зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против воды.
Таблица А. 1 - Соотношение растворов с концентрацией
Стандартный раствор билирубина
Раствор
Концентрация* билирубина в
в мг/100мл
альбумина, мл
мг/100мл
0,10
1,90
0,050∙а
0,25
1,75
0,125∙а
0,50
1,50
0,250∙а
0,75
1,25
0,375∙а
1,00
1,00
0,500∙а
* а — концентрация билирубина, указанная на этикетке бутылочки.
26. Комплексов III (трилон Б), раствор. 38 мг комплексона III
растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе на 200 мл. Раствор
стоек 2 месяца.
27. Кофеиновый реактив. 5 г чистого кофеина, 7,5 г бензойно-кислого
натрия, 12,5 г уксуснокислого натрия (C2H3O2Na-3H2O) растворяют в 90 мл
дистиллированной
воды,
нагревают
до 50
°С
—
60
°С, хорошо
перемешивают. После охлаждения доводят дистиллированной водой до
100 мл. Срок хранения — 2 недели.
175
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
28. Крахмал растворимый. 1 % - ный раствор в насыщенном растворе
хлористого
натрия.
Приготовленный
заранее
насыщенный
раствор
хлористого натрия наливают в мерную колбу емкостью 100 мл более чем до
половины; 1 г растворимого крахмала растворяют в пробирке в нескольких
миллилитрах дистиллированной воды при нагревании, выливают в ту же
колбу и доливают тем же раствором хлористого натрия до метки. Раствор
неограниченно стоек; с йодом он должен давать чисто синее окрашивание.
29. Ксантгидрол. 10 % - ный раствор в метаноле приготовляют из
ампулированного ксантгидрола. При отсутствии его проводят синтез. Для
этого 150 г едкого натра растворяют в 1200 мл спирта. Прибавляют 45 г
ксантона и 45 г цинковой пыли (мелкими порциями, при взбалтывании).
Получается синяя окраска, переходящая в зеленую и при стоянии — в
желтую. Когда добавлена вся цинковая пыль, смесь продолжают взбалтывать
в течение 3 часов. Затем смесь отфильтровывают через складчатый фильтр в
большой объем воды от 8 до 10 л. Выпадает желтоватый осадок
ксантгидрола. Осадок отсасывают, промывают водой и сушат в темном
эксикаторе над сер- ной кислотой. В сухом виде ксантгидрол нестоек,
поэтому раствор следует готовить вскоре после получения препарата.
30. Метилрот, 0,2 % - ный спиртовой раствор. 10 мг метилового
красного (порошка) растворяют в 30 мл спирта и добавляют 20 мл
дистиллированной воды.
31. Моча, содержащая гомогентизиновую кислоту. При отсутствии
гомогентизиновой кислоты в мочу добавляют гидрохинон в количестве 10 г
на 500 мл.
32. Мурексид, раствор. Отвешивают 200 мг мурексида и 5 г
хлористого натрия. Смешивают. Сухая смесь стойкая. Из нее отвешивают
40 мг и навеску растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Раствор может
храниться в темном месте 2—3 дня.
33. Мышечная кашица отмытая. Около 100 г мышц кролика или
другого лабораторного животного пропускают через мясорубку, промывают
176
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
на марле водой и отжимают. Отмытые мышцы заливают физиологическим
раствором.
34.
Насыщенный
солевой
раствор
сернокислого
калия
и
хлористого натрия. 150 г сернокислого калия и 350 г хлористого натрия
кипятят в 1 л воды и по охлаждении фильтруют.
35. Натр едкий, растворы. В фарфоровый стакан вносят 600 г едкого
натра и 500 мл воды. Перемешивают содержимое стеклянной палочкой до
растворения. Полученный раствор сливают в бутыль и оставляют стоять на
несколько дней. На дне образуется осадок нерастворившегося едкого натра и
соды, нерастворимой в насыщенном едком натре. После осаждения всей
соды раствор делается прозрачным. Этот раствор (уд. вес 1,525 при 20 °С)
используют
для
приготовления
растворов
едкого
натра
меньшей
концентрации. В приведенной таблице указаны объемы концентрированного
раствора едкого натра в миллилитрах, которые нужно довести водой до 1 л,
чтобы получить раствор требуемой концентрации. Титр примерно 0,05 н.
раствора устанавливают путем титрования 0,1 н. серной или щавелевой
кислотой.
Таблица А. 2 - Объем концентрированного едкого натра необходимый для
требуемого раствора
Удельный
вес, г/см3
1,525
30 %
393
20 %
262
Нужная концентрация
10 %
2%
0,4 %
131
26
5,24
0,05 %
2,64
36. Натр едкий, 0,4 н. раствор, свободный от карбонатов.
Приготовляют из приблизительно 50 % - ный раствора едкого натра,
выдержанного в течение нескольких дней для осаждения карбонатов в
хорошо закрытом сосуде. Этот раствор прибавляют к дистиллированной
воде, свежепрокипяченной и затем охлажденной в колбе с поглотительной
трубкой, наполненной натронной известью гидроокисью бария, до получения
раствора, имеющего удельный вес при 20 °С 1,016 и 1,018 при 15 °С. Раствор
следует сохранять в хорошо закупоренной склянке во избежание поглощения
СО2.
177
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
37.
Обработка
ваты
и
фильтров.
Вату
кладут
в
чистую
эмалированную кастрюлю или в большую фарфоровую чашку, заливают
дистиллированной водой и кипятят в течение часа (вата все время должна
быть покрыта водой). После этого воду сливают, заливают вату вторично
дистиллированной водой и кипятят еще час, затем отжимают ее и сушат в
термостате. Хранят отмытую вату в банке, которую следует плотно
закрывать. Если нет отмытой ваты, можно пользоваться обыкновенными
фильтрами, предварительно хорошо промыв их горячей дистиллированной
водой. Фильтры заливают горячей водой, которую после охлаждения
сливают, и снова заливают их горячей водой. Так повторяют до тех пор, пока
вода не станет прозрачной. Затем сушат их как вату.
38. Орциновый реактив. 1 г орцина растворяют в 500 мл 30 % - ной
соляной кислоты (уд. вес 1,15) и добавляют от 4 до 5 мл 10 % - ного раствора
хлорного железа. Реактив хранят плотно закупоренным в темной склянке.
39. Осаждающий белки раствор. В мерную колбу емкостью 1 л
наливают 44,8 мл 10 % - ного вольфрамовокислого натрия, добавляют 2 г
лимоннокислого
натрия
и
5,4
г
сернокислого
натрия.
Растворяют
приблизительно в 800 мл воды, добавляют 44,8 мл 1 н. раствора серной
кислоты и 2 г сернокислого кадмия и доводят до 1 л дистиллированной
водой. Осадитель можно готовить и без кадмия, но результаты будут менее
точны, так как кадмий осаждает серные соединения крови, которые в
противном случае связали бы часть брома.
40. Основной стандартный раствор билирубина, 80 мг%. Препараты
кристаллического билирубина отличаются по своим свойствам. Не каждый
препарат может быть использован для построения калибровочного графика.
Допустимым является лишь тот билирубин, 1 мг% раствор которого при
растворении в хлороформе (для наркоза при 25 °С) дает на спектрофотометре
абсорбцию от 1,01 до 1,07 при длине волны 453 нм в кювете с толщиной слоя
1 см. В колбе емкостью 50 мл растворяют 40 мг (80 мг%) билирубина
(находящийся в продаже билирубин является непрямореагирующим) в
178
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
30— 35 мл 0,1 М раствора углекислого натрия (10,6 г безводного NaCO,
доводят до 1 л дистиллированной водой). Хорошо взбалтывают, не допуская
образования пузырьков. Доводят до 50 мл 0,1 М раствором Na2CO3 и
несколько раз перемешивают. Раствор стоек только в течение 10 минут от
начала приготовления. В дальнейшем происходит окисление билирубина.
41. Основной стандартный раствор креатинина. 100 мг креатинина
доводят до 100 мл 0,1 н. раствором соляной кислоты. Хранят в холодильнике,
в посуде с притертой пробкой.
42. Основной стандартный раствор холестерина. 100 мг холестерина
растворяют при нагревании на кипящей водяной бане в 70—80 мл ледяной
уксусной кислоты. Охлажденный раствор доводят до 100 мл в мерной колбе
ледяной уксусной кислотой. 1 мл раствора содержит 1 мг холестерина.
Хранят при комнатной температуре. Годен к употреблению в течение
6 — 7 дней.
43. Пара-оксидифенил, 1,5 % - ный раствор в 0,5% - ном растворе
едкого натра. Отвешивают 1,5 г пара-оксидифенила, растворяют его в 10 мл
5
%
- ного
раствора
х.
ч.
едкого натра
и
приливают 90 мл
свежепрокипяченной воды. Раствор стоек и течение 2—4 недель.
44.
Пикриновая
кислота,
насыщенный
раствор.
Товарная
пикриновая кислота содержит от 15 % до 20 % влажности; кислоту не
сушить! Взрывоопасно! 2 г пикриновой кислоты растворяют в 100 мл воды
при нагревании в горячей бане. После этого раствор оставляют стоять на 24
часа, периодически помешивая. Затем раствор фильтруют. Реактив стоек.
Хранят в темной посуде.
45. Проверка чистоты ледяной уксусной кислоты. Для проверки
чистоты уксусной кислоты проводят следующую пробу: в пробирку,
содержащую от 7 до 8 мл ледяной уксусной кислоты, помещают несколько
кристалликов марганцовокислого калия, перемешивают и оставляют стоять
40 минут при комнатной температуре. Если цвет уксусной кислоты не
изменится, такая кислота годна к употреблению. Для сравнения такое же
179
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
количество кристалликов марганцовокислого калия можно добавить к такому
же объему воды (вода при этом окрашивается в розовый цвет).
46.
Рабочий
раствор
аминонафтолсульфоновой
кислоты
—
эйконогена, приготовленный из основного. Для приготовления основного
раствора 30 г кислого сернистокислого натрия (бисульфита- натрия) NaHSO3
растворяют полностью в 100—150 мл дистиллированной воды, после чего в
раствор добавляют 0,5 г эйконогена. Эйконоген растворяется медленно при
помешивании стеклянной палочкой. Отдельно в небольшом количестве воды
растворяют 6 г безводного сернистокислого натрия (сульфита натрия)
Na2SO3. Оба раствора смешивают и объем доводят водой до 250 мл. Через
2—3 часа раствор фильтруют. Хранят в холодильнике в посуде из темного
стекла. Реактив стоек в течение месяца. Перед определением готовят рабочий
раствор: 10 мл основного раствора разводят дистиллированной водой в
2,5 раза.
47. Рабочий раствор билирубина (0,1 мг/мл) и компенсационная
жидкость. К 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового
человека добавляют 2,0 мл свежеприготовленного 80 мг% раствора
билирубина и 0,1 мл 4 н. раствора уксусной кислоты (25 мл ледяной
уксусной кислоты доводят до 100 мл дистиллированной водой). Хорошо
перемешивают. При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий
раствор стоек в течение нескольких дней. Этот раствор содержит точно на
10 мг% билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления
раствора.
Чтобы
исключить
при
расчетах
количество
билирубина,
содержащегося в этой сыворотке, при измерении на ФЭКе из величин
экстинкции
стандартных
соответствующих
проб
разведений
вычитают
величины
компенсационной
экстинкции
жидкости.
Для
приготовления компенсационной жидкости смешивают 13,9 мл той же
сыворотки,
которая
использовалась
для
приготовления
стандарта
билирубина, 2,0 мл 0,1 М раствора Na2CO3 и 0,1 мл 4 н. раствора уксусной
кислоты.
180
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
48.
Рабочий раствор
хлорного железа,
приготовленный
из
основного. Основной раствор хлорного железа: 2,5 г хлорного железа
(FeCl • 6Н2О) растворяют при нагревании в 80 мл концентрированной
ортофосфорной кислоты. Охлажденный раствор доливают до 100 мл
ортофосфорной кислотой. Рабочий раствор хлорного железа: 8 мл основного
раствора хлорного железа осторожно смешивают с 80 мл концентрированной
серной кислоты для пробы Саваля, Охлажденную смесь доливают до 100 мл
серной кислотой. Хранят в посуде из темного стекла.
49.
Рабочий
стандартный
раствор
однозамещенного
фосфорнокислого калия, содержащй в 1 мл 0,01 мг фосфора. Для
приготовления основного стандартного раствора 4,39 г однозамещенного
фосфорнокислого калия (КН2РО4), высушенного до постоянного веса при
температуре 120 °С, доводят до 1 л дистиллированной водой, добавляют
1 каплю хлороформа в качестве консерванта. 1 мл раствора содержит 1 мг
фосфора. Рабочий стандартный раствор готовят разведением основного
стандартного раствора дистиллированной водой в 100 раз. 1 мл рабочего
стандартного раствора содержит 0,01 мг фосфора. Растворы хранят в
холодильнике.
50.
Рабочий
стандартный
раствор
однозамещенного
фосфорнокислого калия, содержащий 0,02 мг фосфора в 1 мл. Основной
стандартный
раствор
однозамещенного
фосфорнокислого
калия,
высушенного до постоянного веса при 120°С: 0,4389 г соли растворяют в
дистиллированной воде в мерной колбе на 100 мл. 1 мл раствора содержит
1 мг фосфора. Рабочий стандартный раствор: 2 мл основного стандартного
раствора доливают в мерной колбе до 100 мл дистиллированной водой. 1 мл
рабочего раствора содержит 0,02 мг фосфора. Растворы хранят в
холодильнике.
51.
Раствор азотнокислой ртути.
2,0 г
азотнокислой ртути
Hg(NO3)2∙l/2H2O (x.ч.) растворяют в 200 мл дистиллированной воды,
добавляют точно 20 мл 2н. азотной кислоты и доводят до 1 л. Реактив
181
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
стойкий. 2 н. азотная кислота: 14 мл концентрированной азотной кислоты
доводят до 100 мл дистиллированной водой.
52. Раствор белка для реакций осаждения (не высаливанием).
Белки куриных яиц отделяют от желтков, смешивают с 19—20-кратным
объемом воды и фильтруют через несколько слоев марли.
53. Раствор бензидина. К 1 г основного бензидина прибавляют 40 мл
ледяной уксусной кислоты и доводят до 100 мл дистиллированной водой.
54. Раствор йода в йодистом калии. В 100 мл воды растворяют 20 г
йодистого калия и 10 г йода Для реакции с крахмалом полученный раствор
разводят в 5 раз водой
55.
Раствор
йодной
ртути
в
йодистом
калии.
В
50
мл
дистиллированной воды растворяют 5 г йодистого калия. Насыщают раствор
12 г йодной ртути и доводят объем водой до 100 мл.
56. Раствор карбонат-сульфита. К 20 мл 15 % - ного раствора
сернокислого натрия (Na2SO4) добавляют 100 мл 20 % - ного раствора
углекислого натрия (сухая безводная соль). Вместо сернокислого натрия
можно использовать сернистокислый натрий (Na2SO3). Раствор нестоек,
лучше готовить реактивы по отдельности и перед употреблением смешивать.
57. Раствор субстрата для определения аланин-аминотрансферазы.
29,2 мг α-кетоглютаровой кислоты и 1,78 мг DL-аланина (если берется
вместо DL-аланина L-аланин, то навеска уменьшается вдвое)
отвешивают на аналитических весах и растворяют в 1 н. растворе
едкого натра. Едкий натр следует прибавлять осторожно, небольшими
порциями, до полного растворения составных частей и до получения рН 7,4
(универсальная индикаторная бумага с небольшими интервалами измерения).
Раствор переливают количественно в мерную колбу емкостью 100 мл,
ополаскивая 0,1 М фосфатным буфером рН 7,4. Доливают буфер в колбу до
метки, тщательно перемешивают, прибавляют 1 каплю хлороформа и
сохраняют в холодильнике в замороженном виде. Перед употреблением
замороженный раствор должен полностью оттаять. Помутнение растворов
182
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
указывает на их непригодность.
58. Раствор эйконогена (аминонафтолсульфоновой кислоты). 6 г
кислого сернистокислого натрия (бисульфита NaHSO3) или метабисульфита
натрия растворяют полностью в 20—25 мл воды, после чего в раствор
добавляют 0,1 г эйконогена. Эйконоген растворяется медленно, необходимо
помешивать стеклянной палочкой. Отдельно в небольшом количестве воды
растворяют 1,2 г безводного сернистокислого натрия (сульфита натрия
Na2SO3).
Оба
раствора
смешивают
и
объем
доводят
до
50
мл
дистиллированной водой. Через 2—3 часа раствор фильтруют. Хранят в
холодильнике в посуде из темного стекла.
59. Раствор яичного белка. 1-2 белка куриных яиц отделяют от
желтков, взбалтывают с 1 л воды.
60. Раствор яичного белка, 10 % - ный, содержащий около 1,2% - та
сухого белка. 50 мл яичного белка переносят в мерный цилиндр на 500 мл,
добавляют воду до указанного объема, перемешивают содержимое и
фильтруют через марлю.
61. Реактив Гайнеса. 13,3 г кристаллической сернокислой меди
(CuSO4 • 5Н2О), х.ч., растворяют в 400 мл дистиллированной воды. 50 г
едкого натра растворяют в 400 мл дистиллированной воды. 15 г глицерина (ч
или чда) растворяют в 200 мл дистиллированной воды. Смешивают первый и
второй растворы и тотчас же приливают третий раствор. Реактив стоек.
62. Реактив Ларионовой. 20-30 г хлористого натрия растворяют при
нагревании в 100 мл дистиллированной воды, дают остыть, фильтруют.
К 99 мл фильтрата прибавляют 1 мл концентрированной азотной кислоты.
63. Реактив Ниландера. 2 г основного азотнокислого висмута и 4 г
сегнетовой соли растворяют (нагревая на кипящей водяной бане) в 100 мл
10 % - ного раствора едкого натра, охлаждают и отфильтровывают от
выпавшего осадка.
64. Соевая мука и экстракт из соевой муки. Соевые бобы
размельчают в ступке или мельнице и верхнюю кожуру отделяют
183
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
просеиванием через сито. Из полученной муки готовят 2 % - ный экстракт.
Для реакции употребляют также 1 % — 2 % - ную суспензию соевой муки. В
качестве источника уреазы можно использовать еще арбузные семечки. В
этом случае арбузные семечки (1—2) очищают от кожуры, зерна растирают в
ступке с 2—3 мл воды и фильтруют. В опыте можно использовать не только
фильтрат, но и растертую кашицу арбузного зерна.
65. Соляная кислота, 18 % - ный раствор. Концентрированную
соляную кислоту уд. веса 1,19 разводят дистиллированной водой 1:1.
66. Стандартный раствор глюкозы, 200 мг%. В мерной колбе на 100
мл растворяют 500 мг высушенной до постоянного веса при t = +100 °С
глюкозы в 0,2 % - ном растворе бензойной кислоты. Получают 500 мг%
раствор глюкозы. Раствор бензойной кислоты готовят следующим образом:
0,2 г кристаллической бензойной кислоты растворяют в небольшом
количестве воды, нагревая на водяной бане до полного растворения. После
охлаждения до комнатной температуры переносят в мерную колбу на 100 мл
и доливают до метки дистиллированной водой. Бензойная кислота
увеличивает стабильность стандартного раствора глюкозы. Можно также
пользоваться водным раствором глюкозы, однако время хранения такого
стандарта значительно меньше. Экстинкция стандарта не должна давать
резких колебаний, в противном случае необходимо приготовить новый
стандарт. Хранить в холодильнике.
Таблица А. 3 - Приготовление разбавленных эталонных растворов
Разбавленный
стандартный
раствор
1
2
3
4
5
Отмерить
стандартного
раствора
500мг/100мл, мл
5,0 мл
4,0 мл
3,0 мл
2,0 мл
1,0 мл
Добавить
дистиллированной
воды, мл
0 мл
1,0 мл
2,0 мл
3,0 мл
4,0 мл
184
Результирующая
концентрация
глюкозы на 100 мл,
мг
500 мг
400 мг
300 мг
200 мг
100 мг
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
67.
Стандартный
раствор
пировинограднокислого
натрия
(CH3COCOONa). 11 мг кристаллического пирувата натрия (белого цвета)
растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, переносят в
мерную колбу емкостью 100 мл и доводят объем раствора до метки водой.
1,0 мл раствора содержит 110 мкг пирувата натрия, что соответствует 88 мкг
пировиноградной кислоты.
68. Стандартный раствор сернокислого (или хлористого) аммония.
Для приготовления стандартного раствора могут быть использованы
сернокислый аммоний или хлористый аммоний. Лучше использовать
сернокислый аммоний. Раствор сернокислого аммония готовят из химически
чистого
перекристаллизованного
сернокислого
аммония
[(NH4)2SO4]:
0,2357 г сернокислого аммония доводят до 1 л дистиллированной водой. 1 мл
такого раствора содержит 0,05 мг азота. 0,191 г химически чистого
перекристаллизованного хлористого аммония (NH4C1) доводят до 1 л
дистиллированной водой. I мл такого раствора также содержит 0,05 мг азота.
69.
Формалин,
нейтрализованный
раствором
едкого
натра.
Готовится перед употреблением. К 50 мл 40 % - ного формалина добавляют
1 мл 0,5 % - ного водно-спиртового (1:1) раствора фенолфталеина и титруют
0,2 н. раствором едкого натра до слаборозовой окраски.
70. Фосфатный буфер, 0,1 М, рН 7,4. 17,8 г двузамещенного
фосфорнокислого натрия (Na2HPO4∙2H2O) доводят до 1 л дистиллированной
водой. 13,6 г однозамещенного фосфорнокислого калия (КН2РО4) доводят до
1 л дистиллированной водой. Двузаме-щенный фосфорнокислый натрий,
содержащий две молекулы воды, получают путем выветривания на воздухе
до постоянного веса кристаллической соли, содержащей обычно 12 молекул
воды. Соль предварительно растирают в ступке в порошок и насыпают
тонким слоем на стекло. Для получения буферного раствора рН 7,4 смешивают 840 мл 0,1 М раствора Na2HPO4 • 2Н2О и 160 мл 0,1 М раствора КН2РО4.
Контролируют рН-метром. В случае необходимости добиваются нужного рН
с помощью 1 н. NaOH и 1 н. НС1. Полученный раствор с индикатором
185
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
бромтимоловым
синим
(0,04
%)
должен
давать
голубую
окраску.
К приготовленному раствору в качестве консерванта можно добавить от 5 до
10
мл
хлороформа.
Для
приготовления
0,04
%
-
ного
раствора
бромтимолового синего 100 мг индикатора растворяют в ступке с 3,2 мл
0,05 н. раствора едкого натра. После растворения смывают водой в мерную
колбу емкостью 250 мл и доводят водой до метки.
71. Фосфатный буфер 0,1 М, рН 8,0. Растворяют 6,55 г Na2HPO412H2O и 0,265 г NaH2PО4∙2H2O в 700-800 мл дистиллированной воды, после
чего добавляют к раствору воду до общего объема 1000 мл.
72.
Хлорцинкйодистый
раствор.
50
г
сернокислого
цинка
(ZnSO4∙7H2O) и 250 г хлористого натрия растворяют в небольшом количестве
дистиллированной воды, переносят в мерную колбу на 1 л, доводят до метки
дистиллированной водой и фильтруют. Реактив стоек. Перед употреблением
к части раствора прибавляют такую навеску йодистого калия, чтобы
получился 2,5 % - ный раствор.
186
Документ
Категория
Химические науки
Просмотров
352
Размер файла
2 091 Кб
Теги
биохимии, 2379
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа