close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

ИЛС представляет пиросеквенирование

код для вставки
Пиросеквенирование: сочетание секвенирования и количественного анализа от ИнтерЛабСервис
Пиросеквенирование: сочетание секвенирования и
количественного анализа
Пиросеквенирование — это метод
секвенирования ДНК (определение
последовательности нуклеотидов в молекуле
ДНК), основанный на принципе
«секвенирование путем синтеза».
Метод «секвенирования путем синтеза»
позволяет секвенировать одну цепь ДНК путем
синтеза комплементарной цепи, при этом
регистрируется присоединение каждого
нуклеотида. В ходе реакции матрица ДНК
иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и
T добавляются и отмываются последовательно
после каждого цикла секвенирования.
Метод пиросеквенирования основан на детекции активности фермента ДНК-полимеразы с
другим хемилюминесцентным ферментом. Последовательность подачи реагентов в
реакционную смесь, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить
последовательность анализируемого участка ДНК.
Последовательность реакций пиросеквенирования
В реакции пиросеквенирования участвуют четыре фермента. Схема и основные этапы
реакции представлены на рис. 1.
Рисунок 1. Схема реакции пиросеквенирования.
Пиросеквенирование включает в себя следующие этапы:
Этап 1
Амплификация фрагмента ДНК и биотинилирование цепи, которая послужит матрицей для
пиросеквенирования. Денатурация биотинилированного одноцепочечного ПЦР-ампликона,
его изоляция и гибридизация с праймером для секвенирования.
Этап 2
Инкубация праймера и одноцепочечной матрицы в присутствии ДНК-полимеразы, АТФсульфурилазы, люциферазы, апиразы, и субстратов: аденозин - 5’- фосфосульфата (APS) и
люциферина.
Этап 3
Добавление первого дезоксирибонуклеотид трифосфата (dNTP) в реакцию. ДНК-полимераза
катализирует добавление dNTP к праймеру для секвенирования, если он комплементарен к
последовательности матрицы ДНК. Каждое присоединение к цепи сопровождается
выделением пирофосфата (PPi) в количестве, эквимолярном количеству встроившихся
нуклеотидов.
Этап 4
АТФ-сульфурилаза превращает пирофосфат в АТФ в присутствии аденозин-5’фосфосульфата. Образовавшаяся АТФ запускает люциферазо-опосредованную реакцию
окисления люциферина в оксилюциферин, в результате чего происходит образование
видимого света в количестве, пропорциональном количеству АТФ. Свет детектируется CCDкамерой и отображается на пирограмме в виде пиков. Высота пиков пропорциональна
количеству нуклеотидов, встроившихся в матрицу.
Этап 5
В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и
избыток АТФ. После завершения деградации нуклеотидов, не встроившихся в цепь ДНК,
добавляется новый нуклеотид.
Этап 6
Добавление нуклеотидов осуществляется последовательно. Следует отметить, что
дезоксиаденозин-альфа-тио-фосфат используется в роли заместителя дезоксиаденозин-3фосфата (дАТФ), так как он эффективно распознается ДНК-полимеразой, но не распознается
люциферазой. В течение реакции комплементарная цепь ДНК достраивается, и
последовательность нуклеотидов определяется согласно пикам на пирограмме.
Пиросеквенаторы PyroMark (QIAGEN)
Объединяя секвенирование и количественную оценку генетических изменений в одной
мощной системе, приборы серии PyroMark превосходят все другие системы секвенирования
при целевом анализе небольших фрагментов ДНК. Это, в свою очередь, приводит к
уменьшению временных и денежных вложений при использовании PyroMark в
разнообразных областях применения.
Отличительные преимущества пиросеквенирования
PyroMark:
 Секвенирование de novo коротких фрагментов ДНК (до 180 п.о.)
 Ресеквенирование любого участка генома человека, модельных объектов,
микроорганизмов или вирусов
 Количественный анализ частот аллельной встречаемости
 Мутационный анализ: идентификация точечных однонуклеотидных замен, вставок и
делеций
 Количественный анализ метилирования ДНК. Анализ метилирования может быть
совмещен с SNP типированием
 Верификация и валидация результатов полногеномного анализа
На сегодняшний день линейка секвенаторов PyroMark представлена следующими
моделями:
Система
секвенирован
ия
PyroMark
Q24
Описание
PyroMark
Q24 Advanced
PyroMark
Q96 ID
PyroMark
Q96 MD
PyroMark
Q48 Autoprep
Секвенатор с
Секвенатор с
интегрирован
Секвенатор
Секвенатор с
полной
Модернизиров
ным
для
высокой
автоматизацие
анная модель
самоукладчик
лабораторной
пропускной
й
PyroMark Q24
ом
диагностики
способностью
пробоподгото
микропланше
вки
т
Длина чтения
ДНК
до 80 п.о.
до 180 п.о.
до 80 п.о.
до 80 п.о.
до 180 п.о.
Количество
образцов/запу
ск
24
24
96
96
48
Отсутствует
Отсутствует
Отсутствует
Отсутствует
Наличие
Наличие
регистрацион
ФСЗ
ного
2010/08544 от
удостоверения
3.12.2010 г.
Области применения пиросеквенирования
Генетическое тестирование
 Генетическая паспортизация и выявление генетических полиморфизмов,
ассоциированных с развитием мультифакториальных заболеваний.
 Генетический анализ «сложных» областей генома (транслокации, повторы, делеции).
 Верификация и валидация результатов полногеномного анализа.
Онкология
 Выявление активирующих соматических мутаций в генах EGFR, RAS, BRAF, PI3K и
др.
 Анализ метилирования генов-супрессоров опухолевого роста: MGMT, MLH1, p16 и
др.
 Поиск новых генетических маркеров злокачественных новообразований.
Микробиология и генная инженерия
 Генотипирование штаммов.
 Ресеквенирование генов: обнаружение новых генетических вариантов, островков
патогенности, вирулентности и т.д.
 Идентификация мутаций, обуславливающих устойчивость вирусов к
антиретровирусной терапии.
 Идентификация мутаций, обуславливающих устойчивость бактерий и грибов к
антибиотикам.
 Проверка результатов клонирования: секвенирование ПЦР-ампликонов, плазмид,
ДНК-кассет.
 Разработка уникальных ПЦР тест-систем.
Автор
vladilen.ho
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
32
Размер файла
446 Кб
Теги
пиросеквенирование, ИЛС, интерлабсервис, статья
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа