close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Пиросеквенирование

код для вставки
Пиросеквенирование: сочетание
секвенирования и количественного
анализа
Пиросеквенирование — это метод секвенирования ДНК (определение последовательности нуклеотидов в
молекуле ДНК), основанный на принципе «секвенирование путем синтеза».
Метод «секвенирования путем синтеза» позволяет секвенировать одну цепь ДНК путем синтеза комплементарной
цепи, при этом регистрируется присоединение каждого нуклеотида. В ходе реакции матрица ДНК иммобилизована,
растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются и отмываются последовательно после каждого цикла секвенирования.
Метод пиросеквенирования основан на детекции активности фермента ДНК-полимеразы с
другим хемилюминесцентным ферментом. Последовательность подачи реагентов в
реакционную смесь, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить
последовательность анализируемого участка ДНК.
Последовательность реакций пиросеквенирования
В реакции пиросеквенирования участвуют четыре фермента. Схема и основные этапы
реакции представлены на рис. 1.
Рисунок 1. Схема реакции пиросеквенирования.
Пиросеквенирование включает в себя следующие этапы:
Этап 1
Амплификация фрагмента ДНК и биотинилирование цепи, которая послужит матрицей
для пиросеквенирования. Денатурация биотинилированного одноцепочечного ПЦРампликона, его изоляция и гибридизация с праймером для секвенирования.
Этап 2
Инкубация праймера и одноцепочечной матрицы в присутствии ДНК-полимеразы, АТФсульфурилазы, люциферазы, апиразы, и субстратов: аденозин - 5’- фосфосульфата (APS) и
люциферина.
Этап 3
Добавление первого дезоксирибонуклеотид трифосфата (dNTP) в реакцию. ДНКполимераза катализирует добавление dNTP к праймеру для секвенирования, если он
комплементарен к последовательности матрицы ДНК. Каждое присоединение к цепи
сопровождается выделением пирофосфата (PPi) в количестве, эквимолярном количеству
встроившихся нуклеотидов.
Этап 4
АТФ-сульфурилаза превращает пирофосфат в АТФ в присутствии аденозин-5’фосфосульфата. Образовавшаяся АТФ запускает люциферазо-опосредованную реакцию
окисления люциферина в оксилюциферин, в результате чего происходит образование
видимого света в количестве, пропорциональном количеству АТФ. Свет детектируется
CCD-камерой и отображается на пирограмме в виде пиков. Высота пиков
пропорциональна количеству нуклеотидов, встроившихся в матрицу.
Этап 5
В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и
избыток АТФ. После завершения деградации нуклеотидов, не встроившихся в цепь ДНК,
добавляется новый нуклеотид.
Этап 6
Добавление нуклеотидов осуществляется последовательно. Следует отметить, что
дезоксиаденозин-альфа-тио-фосфат используется в роли заместителя дезоксиаденозин-3фосфата (дАТФ), так как он эффективно распознается ДНК-полимеразой, но не
распознается люциферазой. В течение реакции комплементарная цепь ДНК
достраивается, и последовательность нуклеотидов определяется согласно пикам на
пирограмме.
Пиросеквенаторы PyroMark (QIAGEN)
Объединяя секвенирование и количественную оценку генетических изменений в одной
мощной системе, приборы серии PyroMark превосходят все другие системы
секвенирования при целевом анализе небольших фрагментов ДНК. Это, в свою очередь,
приводит к уменьшению временных и денежных вложений при использовании PyroMark в
разнообразных областях применения.
Отличительные преимущества пиросеквенирования PyroMark:






Секвенирование de novo коротких фрагментов ДНК (до 180 п.о.)
Ресеквенирование любого участка генома человека, модельных объектов,
микроорганизмов или вирусов
Количественный анализ частот аллельной встречаемости
Мутационный анализ: идентификация точечных однонуклеотидных замен, вставок и
делеций
Количественный анализ метилирования ДНК. Анализ метилирования может быть
совмещен с SNP типированием
Верификация и валидация результатов полногеномного анализа
На сегодняшний день линейка секвенаторов PyroMark представлена следующими
моделями:
Система
секвенирова
ния
PyroMark PyroMark Q24 PyroMark Q96
Q24
Advanced
ID
Описание
Наличие
регистрацион
ного
PyroMark
Q48
Autoprep
Секвенатор с
Секвенато
Секвенатор с
интегрирова
р для
Секвенатор с
полной
Модернизиров
нным
лаборатор
высокой
автоматизаци
анная модель
самоукладчи
ной
пропускной
ей
PyroMark Q24
ком
диагности
способностью
пробоподгото
микропланш
ки
вки
ет
Длина чтения
до 80 п.о.
ДНК
Количество
образцов/зап
уск
PyroMark
Q96 MD
24
Наличие
до 180 п.о.
до 80 п.о.
до 80 п.о.
до 180 п.о.
24
96
96
48
Отсутствует
Отсутствует
Отсутствует
Отсутствует
удостоверени
ФСЗ
я
2010/0854
4 от
3.12.2010
г.
Области применения пиросеквенирования
Генетическое тестирование



Генетическая паспортизация и выявление генетических полиморфизмов,
ассоциированных с развитием мультифакториальных заболеваний.
Генетический анализ «сложных» областей генома (транслокации, повторы, делеции).
Верификация и валидация результатов полногеномного анализа.
Онкология



Выявление активирующих соматических мутаций в генах EGFR, RAS, BRAF, PI3K и др.
Анализ метилирования генов-супрессоров опухолевого роста: MGMT, MLH1, p16 и др.
Поиск новых генетических маркеров злокачественных новообразований.
Микробиология и генная инженерия






Генотипирование штаммов.
Ресеквенирование генов: обнаружение новых генетических вариантов, островков
патогенности, вирулентности и т.д.
Идентификация мутаций, обуславливающих устойчивость вирусов к антиретровирусной
терапии.
Идентификация мутаций, обуславливающих устойчивость бактерий и грибов к
антибиотикам.
Проверка результатов клонирования: секвенирование ПЦР-ампликонов, плазмид, ДНКкассет.
Разработка уникальных ПЦР тест-систем.
Дополнительная информация:
- PyroMark Q24
- PyroMark Q24 Advanced
- PyroMark Q48 Autoprep
Скачать брошюру QIAGEN о технологии пиросеквенирования
Список использованной литературы
1. К.О. Миронов, Е.А. Дунаева, О.П. Дрибноходова, В.Г. Дедков, Г.А. Шипулин. Детекция генетических полиморфизмов с использованием
системы генетического анализа на основе пиросеквенирования PyroMark Q24 // Справочник заведующего КДЛ. 2011. N 4. С. 39-48
2. К.О. Миронов, Е.А. Дунаева, О.П. Дрибноходова, Г.А. Шипулин. Детекция генетических полиморфизмов с помощью систем генетического
анализа на основе пиросеквенирования // Современные медицинские технологии. 2011. С. 39-41
3. Dunker J., Larsson U., Petersson D. et al. Parallel DNA template preparation using a vacuum filtration sample transfer device // Biotechniques. 2003.
Vol. 34, N 4. P. 862–866, 868.
4. King C.R., Scott-Horton T. Pyrosequencing: a simple method for accurate genotyping // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 373. P. 39–56.
5. Ronaghi M., Uhlen M., Nyren P. A sequencing method based on real-time pyrophosphate // Science. 1998. Vol. 17, N 281 (5375). P. 363–365.
6. Royo J.L., Galan J.J. Pyrosequencing for SNP genotyping // Methods Mol. Biol. 2009. Vol. 578. P. 123–133.
7. Tsiatis A.C., Norris-Kirby A., Rich R.G. et al. Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS
mutations: diagnostic and clinical implications // J. Mol. Diagn. 2010. Vol. 12, N 4. P. 425–432.
Автор
kolia.le2015
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
118
Размер файла
202 Кб
Теги
интерлабсервис
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа