close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

6

код для вставкиСкачать
ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСТИТЕТ ИМЕНИ Н.И.ПИРОГОВА
МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
На правах рукописи
МАРКОВА ЭЛЕОНОРА АЛЕКСАНДРОВНА
ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННАЯ ФОТОМОДИФИКАЦИЯ КРОВИ В
ЛЕЧЕНИИ ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У
ПАЦИЕНТОК С ПРИВЫЧНЫМ НЕВЫНАШИВАНИЕМ
БЕРЕМЕННОСТИ В АНАМНЕЗЕ
14.01.01 - Акушерство и гинекология
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Научные руководители:
доктор медицинских наук,
профессор А.З. Хашукоева
доктор медицинских наук
О.А. Свитич
Москва - 2014
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ …………………………………………………….. 4
ВВЕДЕНИЕ ……………………………………………………………………... 5
Глава 1.
СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ
ПРИВЫЧНОГО НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ
У ЖЕНЩИН С ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) ………………………………………... 13
1.1.
Клинико-патогенетические аспекты привычного
невынашивания беременности на фоне герпесвирусной
инфекции ……………………………………………...……
1.2.
13
Особенности иммунной системы в норме, при
привычном невынашивании беременности, при
герпесвирусной инфекции и у женщин с носительством
герпесвирусной инфекцией и привычным
невынашиванием беременности ………………………….
1.3.
19
Методы лечения привычного невынашивания
беременности на фоне герпесвирусной инфекции…...….. 28
1.3.1. Медикаментозная терапия (химиопрепараты, индукторы
интерферонов, иммуномодуляторы,
вакцинопрофилактика) ……………………………………. 28
1.3.2. Эфферентные методы терапии ………………………...…. 32
1.4.
Принципы ФДТ. Фотосенсибилизированная
фотомодификация крови – новый подход к лечению….... 36
Глава 2.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ…………...... 43
2.1.
Описание клинических групп …………………………..… 43
2.2.
Методические аспекты проведения
фотосенсибилизированной фотомодификации крови …... 46
2.3.
Описание материалов и методов исследования …………. 49
2
Глава 3.
ОБЩАЯ КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ОБСЛЕДОВАННЫХ ПАЦИЕНТОК ………………………….. 55
Глава 4.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННОЙ
ФОТОМОДИФИКАЦИИ КРОВИ У ПАЦИЕНТОК С
ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ В
АНАМНЕЗЕ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ………………………...… 70
4.1.
Исследование противовирусного эффекта
фотодинамической терапии (экспериментальные
исследования) .……………………………………..………
4.2.
70
Терапия хронической герпесвирусной инфекции
методом фотосенсибилизированной фотомодификации
крови .......…………………………………………………...
4.3.
81
Оценка показателей клинико-лабораторного
мониторинга обследованных пациенток при проведении
фотосенсибилизированной фотомодификации крови ......
4.4.
82
Анализ экспрессии гена ФНО-α при
фотосенсибилизированной фотомодификации крови у
обследованных пациенток ………………...………………
4.5.
90
Определение содержания цитокинов (ФНО-α, ИФН-α,
ТФР-β1) в сыворотке крови при
фотосенсибилизированной фотомодификации крови ......
4.6.
94
Клиническая эффективность фотосенсибилизированной
фотомодификации крови у пациенток с хронической
герпесвирусной инфекцией и привычным
невынашиванием беременности в анамнезе ………….…. 103
ЗАКЛЮЧЕНИЕ …………………………………………...........................…... 107
ВЫВОДЫ …………………………………………………………...………….. 112
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ………………………………......... 114
ЛИТЕРАТУРА ………………………………………………………………… 115
3
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВЛОК – внутривенное лазерное облучение крови
ВПГ – вирус простого герпеса
ГВИ – герпесвирусная инфекция
ГГ – генитальный герпес
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ИЛ - интерлейкин
ИФН – интерферон
МНК – мононуклеарные клетки
НБ – невынашивание беременности
ПНБ – привычное невынашивание беременности
ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
РНК – рибонуклеиновая кислота
ТЦД – токсическая цитопатическая доза (тканевая цитопатогенная доза,
вызывающая гибель 50% клеток монослоя)
ТФР – трансформирующий фактор роста
ФМК – фотомодификация крови
ФДТ – фотодинамическая терапия
ФНО – фактор некроза опухоли
ФС – фотосенсибилизатор
ЦМВ – цитомегаловирус
ЦМВИ – цитомегаловирусная инфекция
ЦПД – цитопатическое действие вируса
Ig– иммуноглобулин
HLA – Human leukocyte antigen (человеческий лейкоцитарный антиген) система генов тканевой совместимости человека
TLR – Toll-like receptor (Toll-подобный рецептор)
4
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования. Проблема невынашивания беременности (НБ)
чрезвычайно актуальна в медицинском и социальном аспектах, что
обусловлено высокой частотой этой патологии, достигающей, по данным
ВОЗ, 15-20% исходов всех беременностей [55, 79, 153], протекающей с
тяжелыми последствиями для общего состояния здоровья женщины, ее
репродуктивной функции, семейных взаимоотношений и психологического
здоровья.
Этиология НБ чрезвычайно разнообразна. В последние годы одно из
ведущих мест в генезе преждевременного прерывания беременности
занимают инфекционные заболевания, среди которых доминируют вирусные
инфекции [18, 21, 74]. При НБ наибольшее значение имеют герпетические
инфекции [56, 87, 122], бессимптомная персистенция которых в организме
женщины приводит к изменениям в иммунной системе и патологическому
иммунному ответу на беременность [80]. Вирус простого герпеса (ВПГ)
оказывает негативное влияние на организм женщины во время беременности,
особенно при первичном инфицировании, так как следствием могут быть
уродство плода, самопроизвольный выкидыш или тяжелое неонатальное
заболевание, приводящее к смерти и инвалидизации ребенка. Доказана
этиологическая роль герпесвирусной инфекции (ГВИ), в частности,
обусловленной вирусом простого герпеса (ВПГ-2) и цитомегаловирусом
(ЦМВ), в привычном невынашивании беременности (ПНБ) [80, 87].
По мнению ряда авторов основным патогенетическим звеном
самопроизвольных выкидышей является дисбаланс в иммунной системе и,
как следствие этого, активизация репликационной активности ВПГ и
генерализация инфекции с поражением плаценты и плода [74]. Известно, что
клеточные реакции противовирусного иммунитета осуществляют макрофаги,
моноциты и Т-лимфоциты, продуцирующие большое число цитокинов в
ответ на антигенную стимуляцию [87]. У пациенток с тяжелым течением
рецидивирующей
герпесвирусной
инфекции
наблюдается
вторичный
5
иммунодефицит,
угнетение
незавершенность
фагоцитоза
местного
и
других
клеточного
показателей
иммунитета,
[20,
51,
62].
Герпесвирусная инфекция у пациенток с привычным невынашиванием
беременности
часто
протекает в субклинической
форме, не имеет
характерных клинических проявлений, что затрудняет ее диагностику, хотя
при этом проведение противовирусного лечения необходимо.
В настоящее время существует целый ряд химиотерапевтических
препаратов, обладающих противогерпетической активностью
34, 37 .
Клинический опыт их применения показал, что они способны быстро и
эффективно купировать острые проявления простого герпеса, но при этом не
предотвращают рецидивов проявления хронической ГВИ 34 . Жизненно
важным стал поиск новых эффективных методов лечения.
В связи с этим в последние годы внимание специалистов привлекают
другие подходы к терапии хронической рецидивирующей ГВИ. Одной из
таких методик является метод фотодинамической терапии (ФДТ), который
нашел широкое применение в лечении как онкологических, так и других
заболеваний [94]. Фотосенсибилизированное лазерное облучение крови
(фотомодификация
крови)
–
частный
случай
ФДТ.
Методика
предусматривает фотомодификацию крови (ФМК) за счет взаимодействия
оптического излучения и препарата фотосенсибилизатора (ФС) [24].
Введенные в организм молекулы ФС избирательно фиксируются на
мембранах патологических клеток, оболочках вирусов и митохондриях [90].
При
фотодинамическом
воздействии
в
тканях
происходит
каскад
фотохимических реакций с образованием активных форм кислорода, которые
оказывают сильное цитотоксическое действие, вызывая повреждение
мембран и органелл патологических клеток.
Метод фотосенсибилизированной ФМК впервые был применен М.Л.
Гельфондом и соавт. (2005) в терапии диссеминированных форм опухолей
легких, желудка, толстого кишечника [26]. Были изучены эффекты как
прямого фототоксического повреждения опухолевых клеток в культурах, так
и воздействие фотохимических реакций на кровь и ее компоненты.
6
Полученные
данные
убедительно
показали,
что
метод
фотосенсибилизированной ФМК является эффективным и способствует
усилению лечебной активности проводимой медикаментозной терапии,
улучшению показателей клеточного иммунитета и индукции медиаторов
иммунного ответа [22].
Недавно было показано, что фотодинамическая терапия воздействует
на
вирусные
частицы
[53,
141],
что
указывает
о
потенциальном
использовании ФДТ в терапии ГВИ. Учитывая, что герпесвирусная инфекция
- одна из причин ПНБ, целесообразно проведение ФДТ в качестве
предгравидарной подготовки к беременности. В литературе нет данных о
том, как ФДТ воздействует на герпесвирусы, на иммунную систему и
реакции противовирусного иммунитета. Принимая во внимание факт
существующего дисбаланса в иммунной системе у пациенток с ПНБ на фоне
герпесвирусной инфекции, в последние годы в научном и клиническом мире
существует повышенный интерес к изучению цитокинов при осложненной
беременности [7, 18, 83]. Цитокиновый профиль при ПНБ на фоне ГВИ и
лечении
фотосенсинсибилизиованной
ФМК
не
изучен.
Остаются
неизученными механизмы взаимодействия лазерного излучения с вирусами,
а также
воздействие фотосенсибилизированной фотогематерапии на
состояние иммунной системы у женщин с ПНБ, не найдено данных о
влиянии
фотосенсибилизированной
фотомодификации
крови
на
цитокиновый профиль при хронической ГВИ.
В связи с этим представляет научный и практический интерес изучение
механизмов фотодинамического воздействия на герпесвирусную инфекцию,
а также исследование влияния метода фотосенсибилизированной ФМК на
цитокиновый профиль у женщин с привычными потерями беременности на
фоне ГВИ и стойкой неэффективностью ранее проводимых лечебных
мероприятий. Все вышесказанное и послужило основанием для проведения
данного исследования.
7
Цель исследования
Изучение
противовирусного
фотосенсибилизированной
привычным
и
иммуномодулирующего
фотомодификации
невынашиванием
крови
беременности
у
вирусного
эффекта
пациенток
генеза
с
для
оптимизации тактики ведения.
Задачи исследования
1.
Проанализировать
частоту
выявления
и
особенности
течения
герпесвирусной инфекции у женщин с привычным невынашиванием
беременности.
2. На экспериментальном этапе изучить механизм противовирусного
фотодинамического
действия
in
vitro
для
обоснования
применения
фотосенсибилизированной фотомодификации крови при ГВИ у пациенток с
ПНБ в анамнезе.
3. Определить особенности состояния основных показателей периферической
крови, гемостаза, динамику титра антител у пациенток с хронической
рецидивирующей герпетической инфекцией и привычном невынашивании
беременности при фотосенсибилизированной ФМК.
4.
Оценить
клиническую
эффективность
фотосенсибилизированной
фотомодификации крови путем изучения экспрессии гена ФНО-α и
цитокинового профиля (ФНО-α, ИФН-α, ТФР-β1) для предгравидарной
подготовки
пациенток
с
привычным
невынашиванием
беременности
вирусного генеза.
Научная новизна
Впервые научно обоснован и подтвержден на экспериментальных
моделях in vitro метод фотосенсибилизированной ФМК у пациенток с
вирусным генезом привычного невынашивания беременности.
На основании полученных результатов получена приоритетная справка
на изобретение: «Способ оценки эффективности противогерпетического
действия фотодинамического воздействия на вирус простого герпеса in vitro»
№ 2013112489 от 20.03.2013г.
8
Впервые показана значимость оценки в динамике уровней экспрессии
гена ФНО-α с продукцией сывороточного провоспалительного цитокина
ФНО-α и про- (ФНО-α, ИФН-α) и противовоспалительными цитокинами
(ТФР-β1)
в
сыворотке
крови
при
фотосенсибилизированной
фотомодификации крови у пациенток с ПНБ на фоне рецидивирующей
герпесвирусной инфекции.
Практическая значимость
Разработана
схема
эксперимента
для
изучения
механизмов
противовирусного действия ФДТ in vitro. Создана модель in vitro,
позволяющая изучать механизмы противовирусного действия ФДТ на
различные типы вирусов, а также механизмы действия других ФС при
использовании различных источников лазерного облучения для обоснования
применения метода фотосенсибилизированной фотомодификации крови.
Проведена
оценка
клинической
эффективности
метода
фотосенсибилизированной ФМК у пациенток с привычным невынашиванием
беременности
вирусного
генеза.
Полученные данные об
изменении
цитокинового профиля у пациенток с рецидивирующей ГВИ расширяют
представление
о
патогенезе
ПНБ
вирусного
генеза
и
показывают
необходимость изучения нового метода терапии фотосенсибилизированной
ФМК при данной патологии.
На основании полученных результатов в клиническую практику
внедрен метод фотосенсибилизированной ФМК для лечения пациенток с
привычным невынашиванием беременности и рецидивирующей ГВИ в
анамнезе. Отмечено нормализующее влияние фотосенсибилизированной
ФМК на показатели цитокинового профиля у пациенток с герпесвирусной
инфекцией и привычным невынашиванием беременности в анамнезе.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты диссертационного исследования внедрены в практику
работы
гинекологических отделений ГБУЗ «ГКБ №55» Департамента
здравоохранения г. Москвы (главный врач к.м.н. Куликова О.Е.), ГБУЗ
«Медико-санитарная часть №33 Департамента здравоохранения города
9
Москвы» (главный врач д.м.н. Иманалиев М.Р.). Результаты исследования
используются для обучения студентов, врачей-интернов, ординаторов,
аспирантов на кафедре акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета
ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.
Апробация диссертации
Апробация
диссертации
состоялась
на
совместной
научно-
практической конференции коллектива сотрудников кафедры акушерства и
гинекологии №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И.
Пирогова
и
врачей
гинекологических
отделений
ГБУЗ
«Городская
клиническая больница №55 Департамента здравоохранения города Москвы»
28 мая 2013 г., протокол № 9.
Список опубликованных работ по теме диссертации
По результатам исследования опубликовано 18 работ, из них 6 – в
журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Основные положения работы представлены на: Международном
конгрессе «Лазер Хельсинки 2012» (Laser Helsinki International Congress,
Хельсинки, Финляндия, 2012); XIII и XIV Всероссийском научном форуме
«Мать и дитя» (Москва, 2012, 2013); VII и VIII Международном конгрессе по
репродуктивной медицине (Москва, 2013, 2014); VI Международной
конференции молодых ученых «Современные вопросы акушерства и
гинекологии» (Москва, 2013); ХХVI Международном конгрессе c курсом
эндоскопии «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических
заболеваний» (Москва, 2013); Объединенном иммунологическом форуме
(Нижний Новгород, 2013); Российской (итоговой) научно-практической
конкурс-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2014»
(Новосибирск, 2014).
10
Положения, выносимые на защиту:
1. Пациентки с ПНБ и герпесвирусной инфекцией имеют более высокую
частоту прерывания беременности, рецидивирующий характер генитального
герпеса в отсутствии эффективности проводимой противовирусной терапии,
что обуславливает необходимость поиска новых методов лечения с целью
предгравидарной подготовки к беременности.
2. На экспериментальном этапе исследования in vitro создана модель,
позволяющая изучать эффективность фотодинамического действия на
герпесвирусную инфекцию.
3. У пациенток с ПНБ на фоне рецидивирующей герпесвирусной инфекции
установлено повышение уровня экспрессии гена ФНО-α в МНК клетках
крови, повышение продукции
провоспалительного
цитокина ФНО-α,
снижение противовоспалительного цитокина ТФР-β1 и уровня ИФН-α в
сыворотке крови, что является прогностически неблагоприятным для
планирования беременности у пациенток с данной патологией.
4. Включение в комплексную терапию рецидивирующей герпесвирусной
инфекции фотосенсибилизированной фотомодификации крови нормализует
экспрессию
гена
ФНО-
α,
баланс
и
уровни
про-
(ФНО-α)
и
противовоспалительных (ТФР-β1) цитокинов у пациенток с ПНБ, что
является обоснованным и позволяет повысить процент благоприятного
исхода беременности.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 134 страницах печатного текста и состоит из
введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
общей клинической характеристики обследованных пациенток, результатов
собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов,
практических
рекомендаций
и
списка
использованной
литературы,
включающего 180 источников, из них - из них 101 – отечественных, и 79 –
зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами, 21
рисунком и графиками.
11
Автор
выражает
искреннюю
благодарность
заведующему
кафедрой
акушерства и гинекологии №1 лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ
имени Н.И. Пирогова Заслуженному врачу РФ, д.м.н, профессору Олегу
Васильевичу Макарову, научным руководителям - д.м.н. профессору Асият
Зульчифовне Хашукоевой, д.м.н., заведующей лабораторией молекулярной
иммунологии ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН Оксане
Анатольевне Свитич; руководителю центра персонализированной медицины,
и.о. заведующей кафедрой иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И.
Пирогова, д.м.н., профессору Людмиле Викторовне Ганковской; главному
врачу ГБУЗ «ГКБ №55» Департамента здравоохранения г. Москвы к.м.н.
О.Е. Куликовой; руководителю ООО «Вета-Гранд» В.В. Ашмарову, а также
всем сотрудникам кафедры акушерства и гинекологии №1 лечебного
факультета
ГБОУ
гинекологических
ВПО
РНИМУ
отделений
имени
ГБУЗ
Н.И.
«ГКБ
Пирогова
№55»
и
врачам
Департамента
здравоохранения г. Москвы.
12
Глава 1. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПРОБЛЕМЫ ПРИВЫЧНОГО
НЕВЫНАШИВАНИЯ БЕРЕМЕННОСТИ У ЖЕНЩИН С ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Клинико-патогенетические аспекты привычного невынашивания
беременности на фоне герпесвирусной инфекции
Невынашивание беременности (НБ) определяют как самопроизвольное
прерывание беременности в сроки от момента зачатия до 37 полных недель,
считая с первого дня последней менструации [78]. Прерывание беременности
в сроки от зачатия до 22 недель – называют самопроизвольным абортом
(выкидышем).
Привычный
выкидыш
-
привычное
невынашивание
беременности (ПНБ) – самопроизвольное прерывание беременности два и
более раз подряд.
Несмотря на достигнутые в последние годы успехи в профилактике и
лечении данной патологии, частота самопроизвольных выкидышей остается
стабильной
и
достаточно
высокой
и
составляет
10-25%
всех
диагностированных беременностей, при этом на долю первого триместра
приходится до 75-80%. По данным Всемирной организации здравоохранения
(ВОЗ) частота НБ составляет 15-20% исходов всех беременностей [80]. В
России 10-25% всех желанных беременностей заканчивается прерыванием.
Частота ПНБ колеблется в структуре невынашивания от 5 до 20%. Риск
прерывания беременности в России после первого выкидыша составляет 1317%, что соответствует частоте спорадического выкидыша в популяции,
тогда как после двух предшествующих самопроизвольных прерываний, риск
потери желанной беременности возрастает более чем в 2 раза и составляет
36-38% [89]. Таким образом, частота НБ остается стабильно высокой. У
пациенток
с
ПНБ
беременности,
что
заболеваемости
и
отмечается
неблагоприятный
обуславливает
смертности.
высокий
Поэтому
для
уровень
проблема
плода
исход
перинатальной
невынашивания
беременности не вызывает сомнения, так как является наиболее частым ее
осложнением. Помимо акушерско-гинекологической проблемы, ПНБ носит и
13
социальный аспект, т.к. в супружеских парах зачастую возникает ситуация
хронического стресса, которая нередко приводит к внутрисемейным
конфликтам и распаду семьи.
Привычное невынашивание беременности – полиэтиологическое
осложнение беременности [55, 87, 153]. Причины ПНБ чрезвычайно
разнообразны:
генетические,
анатомические
-
патология
иммунологические,
матки
(пороки
тромбофилические,
развития),
эндокринные
нарушения и инфекционные факторы. Одно из лидирующих мест занимают
инфекционные
инфекциям,
заболевания.
среди
которых
Особое
при
внимание
НБ
уделяется
наибольшее
вирусным
значение
имеют
герпетические инфекции [80, 89, 112]. Европейское региональное бюро ВОЗ
относит ГВИ к группе болезней, определяющих будущее инфекционной
патологии [62]. Заболеваемость ГВИ крайне высока и по статистике ВОЗ
занимает 2-е место среди вирусных поражений человека, уступая лишь
гриппу [93]. Несколько лет назад экспертами ВОЗ была представлена общая
эпидемиологическая картина, свидетельствующая о практически 100%
инфицировании населения планеты ВПГ. Имеющиеся данные указывают на
прогрессирующий рост инфицированности и заболеваемости ВПГ во всем
мире [76, 137].
При наличии у женщины ГВИ существенно возрастает риск
прерывания беременности [74, 103]. По данным проф. Макарова О.В.,
Бахаревой И.В. и соавт. в этиологии ПНБ ведущую роль играют ГВИ – в
частности, обусловленные вирусом простого герпеса 2 типа (ВПГ-2) и
цитомегаловирусом (ЦМВ) [56, 57, 112].
Известно, что среди пациенток с ПНБ наблюдается значительное число
женщин с рецидивирующей ГВИ. В 61% случаев у пациенток с ПНБ
обнаруживается вирусная инфекция, при этом абсолютно доминирует ГВИ
до 75% [70]. По данным Brown Z.A. и соавт., 22% беременных женщин
инфицированы ВПГ-2 и 2% беременных приобретают его во время
беременности [112]. Вирусные заболевания во время беременности могут
приводить
к
анэмбрионии,
неразвивающейся
беременности,
14
самопроизвольным выкидышам, антенатальной гибели плода, к порокам
развития плода, внутриутробной инфекции, проявляющейся в постнатальный
период [56, 74].
Большинство исследователей полагают, что истинная частота ГВИ у
женщин, в том числе и с ПНБ, не известна, так как высока доля асимптомных
форм и вирусоносительства, а также вследствие отсутствия в нашей стране
обязательной регистрации заболеваемости ГВИ [59].
Возбудителем герпетических заболеваний является вирус простого
герпеса, ДНК-содержащий вирус, принадлежащий к семейству Herpesviridae,
подсемейству Alphaherpesvirinae. Основные возбудители герпетических
заболеваний, ассоциированных с ПНБ - ВПГ преимущественно 1 и 2 типов и
ЦМВ-инфекция [57, 105]. ВПГ 1 типа в этиологической структуре ПНБ
занимает 24%, ВПГ 2 типа - 76% [65]. По мнению Сухих Г.Т., генитальная
герпетическая инфекция (ВПГ-2) - серьезная социальная проблема для
репродуктивного здоровья женщин, приводит к ПНБ
и перинатальной
патологии новорожденного [87, 147]. Известно, что в 10-13% случаев
причиной ПНБ, по данным гистологических исследований последа и
погибшего плода, является ВПГ [74].
Единственным резервуаром ВПГ являются зараженные люди, которые
распространяют его среди населения. Проникая в организм через кожные
покровы и слизистые оболочки (губы, конъюнктива глаз и гениталий), ВПГ
достигает регионарных лимфатических узлов, затем попадает в кровь и
внутренние органы. ВПГ-2 в большей степени, чем ВПГ-1, ответственен за
возникновение случаев генитального герпеса (ГГ) [36, 51, 173]. Для
герпетический инфекции характерно быстрое распространение возбудителя
по периферическим нервным волокнам с переходом болезни в латентную
форму.
Принимая во внимание, что носительство ГГ повышает риск НБ,
большая роль отводится изучению особенностей клинических вариантов и
течению этой оппортунистической инфекций.
15
У пациенток с ПНБ в анамнезе на фоне ГВИ (ВПГ-2) вне беременности
не существует специфических клинических признаков инфекции, поэтому
клиническая картина ГВИ у данной категории пациенток по течению сходна
с течением ГВИ у пациенток без ПНБ.
Различают первичный эпизод ГГ и рецидивирующее течение [35, 96,
103]. К первичному относят пациенток с серонегативными результатами,
которые ранее не были инфицированы каким-либо типом вируса, что
неблагоприятно для планирования и вынашивания беременности, поскольку
инфицирование
способствует
происходит
в
ранние
самопроизвольному
сроки
выкидышу.
беременности,
Как
при
то
это
первичном
инфицировании женщины ВПГ-2, так и в дальнейшем при наступлении
беременности, следствием инфекции может быть уродство плода, или
тяжелое неонатальное заболевание, приводящее к смерти и инвалидизации
ребенка. ГГ отличается вариабельностью клинической картины и тенденцией
к упорному рецидивирующему течению. После 3-9 дневного инкубационного
периода наступает острый период. Он характеризуется эрозивно-язвенными
высыпаниями на слизистой больших и малых половых губ, промежности,
влагалища, шейки матки [87, 29, 175]. Через 1-2 дня везикулы вскрываются,
образуя мокнущие эрозии и язвочки, эпителизирующиеся под коркой или без
ее образования. Длительность острого периода не превышает 8-10 дней, но в
некоторых случаях отмечается длительный характер высыпаний. Острому
периоду всегда предшествует продромальный, который сопровождается
болями,
чувством
изнурительного
зуда,
жжением,
отечностью,
дискомфортом во влагалище (вульводиния), парестезиями в области
гениталий, а также общей симптоматикой – недомоганием, ознобом,
лихорадкой и т.д. [3, 80]. После первичного эпизода заболевания под
влиянием провоцирующих факторов (стресс, менструации, переохлаждение,
переутомление), в результате иммунодефицита возникают рецидивы ГГ
[174]. Таким образом, существует несколько вариантов клинического
течения ГГ [74, 87]:
16
1. Первичная генитальная ГИ (первый клинический эпизод первичного
генитального герпеса). Пациент никогда не отмечал у себя симптомов ГГ, в
его крови отсутствуют антитела IgG и IgM ни к одному из типов ВПГ.
Лабораторные критерии первичного эпизода первичной инфекции –
появление
и
нарастание
титров
IgМ
анти-ВПГ
при
отсутствии
противовирусных IgG.
2. Вторичная генитальная ГИ (первый клинический эпизод непервичной
ВПГ-инфекции). Происходит на фоне циркулирующих антител классов IgG,
IgM
к ВПГ. В этом случае при наличии антител к ВПГ одного типа и
отсутствии
в
анамнезе
эпизодов
генитального
герпеса
происходит
суперинфекция ВПГ другого типа. Симптоматика при этом случае менее
интенсивна, чем при первом клиническом эпизоде первичного ГГ.
3. Рецидивирующая ГВИ – активация латентной инфекции (наличие антител
IgG, IgM к ВПГ и эпизодов генитального герпеса (ГГ) в анамнезе).
Реактивация происходит обычно в первые несколько месяцев после
первичного эпизода заболевания.
4. Бессимптомная ГВИ – реактивация ВПГ без клинических проявлений.
Каждый клинический вариант ГГ может протекать в типичной, атипичной
или
бессимптомной
форме
(вирусоносительство)
[87].
Наиболее
неблагоприятными считаются атипичная и бессимптомная формы ГГ [63].
Исследования в США показали, что примерно 55 млн. людей являются
носителями ГГ, из них только 20-25% знают об этом, еще меньшее число
больных получают терапию по поводу заболевания [60]. Поэтому ГГ
представляет значительную опасность для репродуктивного здоровья
женщин,
поскольку
тяжелое
течение
заболевания
обусловлено
персистенцией и частыми рецидивами инфекции, которые могут привести к
анатомическим изменениям в маточных трубах, яичниках, матке в
последующем с развитием бесплодия [80].
Помимо ГГ немаловажная роль в этиологии и патогенезе ПНБ также
принадлежит ЦМВ – инфекции (ЦМВИ) [39, 67, 161], возбудителем которой
является
вирус
Cytomegalovirus
hominis,
принадлежащий
семейству
17
подсемейству
Herpesviridae,
Согласно
Bethaherpesvirinae.
эпидемиологическим исследованиям, 65-70% женщин с ПНБ инфицированы
ЦМВ [87]. По данным Сидельниковой В.М., ЦМВ методом определения
вирусурии был выявлен у 60,8% женщин с ПНБ [80]. Инфекционный процесс
при ЦМВИ реализуется в виде бессимптомной латентной инфекции,
клинически манифестной или генерализованной формы [37]. Для ЦМВИ
характерно поражение плаценты и развитие плацентарной недостаточности,
гипоксия и задержка внутриутробного развития плода, НБ. Инфицирование
ЦМВИ происходит в различные сроки жизни через биологические жидкости,
вертикальным путем с мужскими гаметами, трансплацентарно. Патогенез
ЦМВИ недостаточно изучен. По мнению Исакова В.А. и соавт., входными
воротами для ЦМВ в анте- и интранатальном периоде могут быть
повреждения плаценты, плодных оболочек и внешних покровов плода [37].
Проникший в кровь ЦМВ репродуцируется в лейкоцитах, лимфоцитах и
моноцитах или персистирует в лимфоидных органах. Известно, что
беременность вызывает активацию ЦМВИ, повышающей риск НБ в ранние
сроки. Беременные, являющиеся носителями ЦМВ в латентном состоянии,
могут родить детей с бессимптомной или умеренно выраженной ЦМВИ,
которую обнаруживают на 2-5 году жизни ребенка в виде отставания в
умственном
развитии,
наличии
нейромышечных
нарушений
и
соматосенсорной недостаточности [39].
Характер клинической картины ЦМВИ при ПНБ разнообразен и
зависит от формы инфекции: первичного заражения, реинфекции или
реактивации латентного вируса [176]. У иммунокомпетентных лиц первичное
инфицирование ЦМВ не сопровождается клиническими симптомами.
Формируется бессимптомное вирусоносительство. У 5% пациенток при
первичном
инфицировании
симптоматикой,
иногда
ЦМВИ
развивается
проявляется
гриппоподобной
мононуклеозоподобный
синдром:
лихорадка, катаральные явления, увеличение шейных и подчелюстных
лимфоузлов, сиалоаденит. У иммунонекомпетентных лиц при первичном
инфицировании ЦМВИ поражаются легкие, почки, желудочно-кишечный
18
тракт, печень, ЦНС, надпочечники, селезенка, лимфатические узлы. При
ЦМВИ у женщин имеет место поражение урогенитального тракта
(вульвовагиниты, кольпиты, эктопии шейки матки, цервициты). На фоне
беременности
латентная
инфекция
обостряется,
что
приводит
к
гестационным осложнениям: самопроизвольный выкидыш, неразвивающаяся
беременность и др. [67, 176].
Активность клинических проявлений ГВИ напрямую связана с
состоянием иммунной системы организма, которая непосредственно влияет
на развитие инфекционного процесса. Многочисленные исследования
демонстрируют,
что
повторные
обострения
ГВИ
сопровождаются
изменениями в иммунной системе, рассматриваемыми как вторичный
иммунодефицит [18, 55, 70, 83, 89]. При ГВИ, как и при других хронических
заболеваниях с персистенцией вируса, развиваются иммунодефицитные
состояния, обусловленные недостаточностью различных звеньев иммунной
системы и ее неспособностью элиминировать вирус из организма. Важная
роль в механизмах реактивации инфекции отводится состоянию как
локального, так и периферического звеньев иммунитета, при угнетении
которого возникают условия для репродукции вируса.
Далее
будут
рассмотрены
иммунологические
механизмы
при
беременности в норме, при ПНБ, при герпесвирусной инфекции и у женщин
с ВПГ на фоне ПНБ.
1.2. Состояние иммунной системы в норме, при герпесвирусной
инфекции и у женщин с привычным невынашиванием беременности
вирусного генеза
1.2.1. Особенности иммунной системы у небеременных женщин и при
физиологически протекающей беременности.
Изменения
материнского
организма
обеспечивающие
нормальное
развитие
во
время
плода,
беременности,
характеризуются
морфологическими изменениями в месте имплантации и функциональными
изменениями иммунной системы беременной [29].
19
Для объяснения иммунных механизмов сохранения беременности в
настоящее время существуют различные теории, большинство из которых
подразумевает изменение баланса цитокинов с развитием супрессивного
иммунного ответа матери [75, 128]. Хорошо известны работы, посвященные
особенностям иммунных механизмов при беременности. Физиологическая
беременность характеризуется постоянным присутствием клеток врожденной
иммунной системы в зоне контакта мать/плод: в I триместре беременности
70% децидуальных лейкоцитов представлены NK-клетками, 20-25% макрофагами, 1,7% - дендритными клетками [148]. Таким образом, при
нормальном течении имплантации, росте и развитии эмбриона, в эндометрии
матери создается состояние локальной иммуносупрессии, что ведет к
формированию защитного барьера и предотвращает отторжение наполовину
чужеродного плода [56, 48]. Баланс между супрессорными и активирующими
иммунный ответ сигналами зависит от дифференцировки Т-хелперов.
Согласно мнению S.A. Robertson и соавт. [159] при нормально протекающей
беременности, начиная с ранних сроков, в иммунной системе матери в крови
преобладают цитокины Th2-типа, которые блокируя реакции клеточного
иммунитета, способствуют развитию и инвазии трофобласта за счет
ограничения цитолитической и апоптогенной активности децидуальных
клеток. [121, 128, 158, 160]. Особая роль отводится способности клеток Th2,
образующихся фетоплацентарным комплексом на протяжении всех трех
триместров беременности, продуцировать противовоспалительные цитокины
ИЛ-5, ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-2, влияющие на дифференцировку Т-хелперов в
направлении Th2 [80, 158, 159]. По данным Посисеевой Л.В. и соавт. с
наступлением беременности продукция провоспалительных цитокинов резко
усиливается для активации иммунной системы и сдерживания иммунного
ответа [75]. В исследованиях Сотниковой Н.Ю. и Верясова В.Н., было
показано, что при беременности образуются белки семейства ТФР (ТФР-β),
факторы
иммуносупрессии,
способные
блокировать
ИЛ-2,
ИФН-γ
выделяемые клетками Th1 и регулирующие процессы инвазии трофобласта
[17, 84, 88]. Механизм супрессии опосредован взаимодействием Th1 клеток с
20
CD4+CD25-Т-лимфоцитами и усилением локального синтеза ИЛ-10 и ТФР-β.
Оптимальное
соотношение
Th1-
и
Th2-цитокинов
обеспечивает
резистентность к развивающемуся эмбриону на этапе инвазии трофобласта
[17, 178]. Нормальное течение беременности во многом определяется
соотношением иммуномодулирующих и иммуносупрессивных эффектов, в
регуляции которых непосредственно участвуют компоненты цитокиновой
системы,
которые
в
литературных
источниках
упоминаются
как
блокирующие факторы (ассоциированные с беременностью антитела против
антигенов отца, связанных с комплексом HLA) [170]. Блокирующие антитела
угнетают
индуцированную
аллоантигенами
активность Т-хелперов
и
цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), продукцию ИЛ-2 и транскрипцию
генов для ИЛ-2-рецепторов. Эти факты позволили предположить, что
блокирующие антитела опосредуют один из механизмов защиты плода
иммунной системой матери.
Другая особенность, которую отметил Говалло В.И., - это изменения
органов
лимфатической
системы
на
фоне
беременности.
Он
продемонстрировал, что, начиная с 5-8 недель беременности, происходит
уменьшение процента малых лимфоцитов и увеличение процента больших
лимфоцитов,
характеризующихся
супрессорной
активностью,
которые
тормозят иммунный ответ, угнетая активацию других эффекторных клеток
[29]. В течение последних двадцати лет выполнено большое количество
исследований, посвященных анализу изменений в субпопуляционном составе
лимфоцитов у беременных [129, 143, 155, 166, 169]. Авторы отмечают, что
физиологическое течение беременности сопровождается супрессорной
активностью лимфоцитов, тогда как у женщин с риском ее прерывания, она
может отсутствовать полностью.
Однако, несмотря на обилие работ в этой области, иммунные
механизмы,
поддерживающие
беременность,
остаются
до
конца
нераскрытыми.
21
1.2.2. Состояние иммунной системы у женщин с невынашиванием
беременности различного генеза.
По мнению многих исследователей, учитывая многообразие факторов
ПНБ, сформировать единое мнение о патогенезе данной патологии не
представляется
возможным.
Иммунные
причины
самопроизольного
прерывания беременности составляют до 40-50% случаев и проявляются в
виде изменений на различных уровнях иммунной системы [31, 91].
Среди иммунологических факторов, участвующих в патогенезе
прерывания беременности, отмечают недостаточность иммуносупрессивных
механизмов: наличие антифосфолипидных антител (антифосфолипидный
синдром). Показано, что антитела к отдельным фосфолипидам реагируют с
клетками трофобласта и повреждают их, вызывая тромбоэмболические
нарушения (инфаркт плаценты) и приводя к спонтанному выкидышу [123].
Значимым фактором в патогенезе ПНБ являются нарушения в
эндокринной регуляции. Формирование недостаточности лютеиновой фазы
вследствие низкого содержания прогестерона приводит к дисбалансу
биологически
активных
медиаторов
иммунных
и
межклеточных
взаимоотношений – цитокинов [91]. Повышается продукция цитокинов Th1типа (ИЛ-1β, ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-α, ИФН-γ), которые обладают прямым
эмбриотоксическим эффектом и ограничивают инвазию трофобласта, тем
самым способствуют самопроизвольному выкидышу ранних сроков. [89, 130,
145]. В ряде исследований показано, что прогестерон в значительной степени
блокирует и подавляет активацию клеток Th1, а также выработку
вышеуказанных цитокинов [80].
Генез другого фактора ПНБ, обусловленный совместимостью супругов
по системе HLA (аллоиммунные причины НБ), связан с высоким уровнем
NK-клеток
в
периферической
крови,
повышенным
уровнем
провоспалительных цитокинов и отсутствием блокирующих факторов в
сыворотке крови матери [45, 58, 69, 79, 80]. Известно, что активация NKклеток способствует прерыванию беременности у тех женщин, абортусы
которых имеют нормальный хромосомный набор. В крови таких пациенток
22
наблюдается увеличение в субпопуляции агрессивных CD16+, CD56+, CD356+, 16+-клеток [69].
Другой аллоиммунный механизм прерывания беременности основан на
эмбриотоксическом влиянии цитокинов Th1-типа, таких как ИФН-γ и ФНОα, ИЛ-2, ИЛ-12 и преобладании лимфоцитарной реакции Th1 над
лимфоцитарным защитным ответом Th2 в организме матери [130].
При идиопатических причинах ПНБ исследователями установлено, что
на фоне хронического эндометрита происходят изменения в системе
локального иммунитета, что может приводить к нарушению процессов
плацентации, инвазии и развития хориона с исходом в прерывание
беременности [56, 66, 78].
Таким образом, иммунные аспекты ПНБ ассоциируются с нарушением
регулирующей роли иммунной системы на разных этапах формирования
системы
мать-плацента-плод
[87].
В
настоящее
время
доминирует
предположение, что при ПНБ отмечается смещение цитокинового баланса в
сторону активации Th1 – опосредованного иммунного ответа (ИЛ-1β, ИЛ-8,
ФНО-α, ИНФ-γ) и подавление Th2 – опосредованного иммунного ответа со
снижением уровня регуляторных цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ГМКСФ),
что
свидетельствует
о
нарушениях
эффекторных
функций
иммунокомпетентных клеток [18, 49, 57].
1.2.3. Механизмы иммунной защиты при герпесвирусной инфекции вне
беременности и особенности иммунитета в организме женщин с
герпесвирусной инфекцией и ПНБ.
Длительной персистенции ВПГ в организме противостоит система
защиты, включающая в себя цитотоксические Т-лимфоциты, NK-клетки,
мононуклеарные фагоциты, интерфероны, антитела, систему комплемента.
Учитывая большое разнообразие факторов, участвующих в механизмах
защиты от ГВИ, трудно сделать заключение о вкладе каждого из них [62, 87].
Состояние иммунной системы при ГВИ обусловлено двумя типами
иммунного ответа на инфекцию: 1) врожденный иммунитет, включающий
23
клеточные и гуморальные компоненты и 2) приобретенный (специфический
или
адаптивный)
иммунный
ответ,
повышающий
эффективность
врожденных защитных механизмов [51, 87, 122, 167]. Оба типа иммунного
ответа
взаимно
дополняют
друг
друга.
Приобретенный
иммунитет
характеризуется специфичностью и иммунологической памятью, функции
которой принадлежат лимфоцитам [2, 52, 73]. Считается, что при ГВИ, в
связи с внутриклеточным расположением вируса, значительную роль играет
клеточное звено иммунитета [87]. Участвующие в реакциях факторы
врожденного иммунитета, не формируются под воздействием антигена в
процессе иммунного ответа, они являются врожденными и защищают
организм на ранних этапах борьбы с вирусом, когда реакции приобретенного
иммунитета еще не могут быть реализованы [51]. В систему врожденного
иммунитета включены гуморальные факторы: молекулы комплемента, белки
острой фазы воспаления, цитокины, противомикробные пептиды, природные
антитела. В реакциях врожденного иммунитета участвуют клетки макрофаги,
моноциты, нейтрофилы, NK-клетки, продуценты медиаторов иммунного
ответа (тучные клетки, базофилы, эозинофилы) и др. [42, 51, 117, 180].
Механизм иммунной защиты при ГВИ – механизм врожденного
иммунного ответа на ВПГ, который состоит из двух фаз – раннего
неспецифического ответа и специфического иммунного воздействия. Ранний
неспецифический ответ включает активацию и приток фагоцитирующих
клеток – лейкоцитов и моноцитов, поглощающих и разрушающих ВПГ,
препятствуя инфицированию окружающих тканей. Герпесвирус подвергается
атаке различных белков: комплемент, природные антитела класса М (IgM) и
противомикробные пептиды. Далее в ранней фазе врожденного иммунного
ответа
зараженными
эпителиальными
и
дендритными
продуцируются интерфероны (ИФН) 1 типа (ИФН-α/β)
клетками
[64, 97, 144].
Отмечаются высокие уровни ИФН-α/β, вырабатываемые лейкоцитами и
фибробластами, которые индуцируют возникновение резистентности клеток
хозяина
к
вирусной
инфекции
-
происходит
запуск
механизмов
противовирусной защиты [42, 81]. Противовирусный эффект ИФН приводит
24
к 1000-кратному снижению содержания ВПГ-1 и ВПГ-2 в клетках эпителия
[117, 118]. ИФН также увеличивает продукцию молекул I и II классов МНС,
что вызывает активацию клеточного и гуморального иммунитета. Затем
вступает в действие фаза специфического иммунного воздействия, где
противовирусную активность проявляют клетки-эффекторы: нейтрофилы,
макрофаги
и
NK-клетки.
Происходит
активация
и
взаимодействие
иммунорегуляторных клеток. Нейтрофилы секретируют противовирусные
цитокины ФНО-α и противомикробные пептиды (дефенсины) [139],
уничтожающие поврежденные эпителиальные клетки. ФНО-α угнетает
размножение ВПГ, уничтожает вирус путем лизиса инфицированных клеток
[140]. Противомикробные пептиды встраиваются в липидную оболочку
вируса, разрушают фагоцитированные вирионы [41, 131]. Макрофаги
невосприимчивы к герпетической инфекции, поглощают вирионы и
пораженные
вирусом
клетки.
Макрофаги
и
дендритные
клетки
экспрессируют на своей поверхности специальные сигнальные рецепторы
TLR (Toll-подобные рецепторы или молекулы, предназначенные для
распознавания патоген-ассоциированных молекул) [55, 125]. Эти рецепторы
– проводники специфических сигналов, индуцируют синтез цитокинов,
необходимых для активации Т-клеток [68]. Дендритные клетки, проводя
сигнал через TLR-9 при ВПГ-2-инфекции, способствуют продукции
значительных количеств ИФН-α [69, 144]. NK-клетки продуцируют ИФН-γ и
разрушают инфицированные клетки. Таким образом, активация и репликация
ВПГ контролируется различными факторами клеточного и гуморального
звеньев иммунитета [49].
Мельниченко А.В. проведены исследования по оценке показателей
интерферонового, иммунного и цитокинового статуса у пациентов с ГВИ.
Было показано, что показатели ИФН-α, ИФН-γ были снижены у 51% человек
наряду с высокими титрами антител к ВПГ; оценка цитокинового профиля
пациентов выявила активацию экспрессии генов ИФН-α, ИЛ-2, ИЛ-8, ИЛ-10,
ИЛ-18 у большинства пациентов [62].
25
Таким образом, система ИФН имеет особое значение в патогенезе ГВИ
[49], а иммунные реакции и молекулярные механизмы играют существенную
роль в развитии и реактивации генитальной герпетической инфекции.
Во многих исследованиях показано неблагоприятное влияние ГВИ на
течение беременности и родов, патологию плода и новорожденных [18, 56,
74], поэтому рассмотрение механизмов иммунитета в патогенезе НБ на фоне
ГВИ имеет большое значение.
Иммунная система строго контролирует зону контакта «мать-плацентаплод». Принимая во внимание факт герпетического поражения эндометрия c
формированием хронического эндометрита при длительной персистенции
ВПГ в эндометрии и при чрезмерно сильном иммунном ответе, возникает
патологическое течение беременности и ее прерывание [7, 16, 28, 56].
Учитывая, что система врожденного иммунитета имеет большое значение
при ГВИ, за последние годы получены данные о роли механизмов
врожденного иммунитета в патогенезе ПНБ на фоне ГВИ [21, 57, 94].
Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. и соавт. изучали систему Tollподобных
рецептов
у
беременных
с
высоким
риском
реализации
внутриутробной инфекции. Было выявлено, что клетки трофобласта
способны распознавать и отвечать на патогены посредством экспрессии Tollподобных рецептов [156]. Ими выделены группы трансмембранных
протеинов (TLR) в зависимости от их полиморфизма, активация которых
приводила
к
продукции
цитокинов
(TLR4),
обладающих
мощными
противоинфекционными свойствами (ФНО-α, ИЛ-6, ИЛ-8 и др.) и к
индукции апоптоза и гибели клеток трофобласта (TLR2) [21, 124, 167]. Таким
образом, один из иммунологических механизмов ПНБ при ГВИ, - это
нарушение регуляции иммунного ответа в плаценте и недостаточность
факторов врожденного иммунитета.
По мнению других исследователей при ПНБ на фоне ГВИ
немаловажная роль принадлежит цитокиновой регуляции, определяющей
процесс инвазии трофобласта и дальнейшее прогрессирование беременности
[18, 57, 79, 87]. Система цитокинов – единая и целостная сеть, нарушения в
26
которой могут приводить к изменению направленности иммунного ответа,
что особенно важно на ранних этапах развития плода. [88].
Данные Бахаревой И.В. и соавт. доказывают прямую корреляционную
зависимость между повышенным уровнем цитокина ИЛ-1α и снижением
уровня
рецепторного
антагониста
ИЛ-1
в
сыворотке
крови
и
невынашиванием беременности у беременных со смешанной вирусной
инфекцией [6].
Соловьева А.С. и Луценко М.Т. изучали механизмы цитокиновой
регуляции системного иммунного ответа при обострении ГВИ у беременных.
Было получено, что повышение провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ИЛ-8,
ФНО-α) приводило к нарушению механизмов иммунологической регуляции
и снижению иммуносупрессивной активности, баланс цитокинов смещался в
строну Th1 – пути развития иммунологического ответа матери на обострение
ГВИ [87].
Гаджиевой
Ф.Р.
было
показано,
что
повышение
уровня
провоспалительных цитокинов ИЛ-2 и ФНО-α в слизи цервикального канала
у женщин с ПНБ и носительством смешанной вирусной инфекцией –
критерий риска НБ инфекционного генеза [18].
Тетруашвили
Н.К.
и
соавт.
проведены
исследования
уровней
цитокинов Th1 типа (ИФН-γ, ИЛ-1β,) и их естественных антагонистов,
синтезируемых Th2 (ИЛ-4, ИЛ-10), а также ФНО-α у женщин с ПНБ в
анамнезе на фоне носительства ГВИ [80, 89]. Имело место преобладание
провоспалительных
цитокинов
ИФН-γ,
ИЛ-1β,
ФНО-α,
ИЛ-6
над
регуляторными ИЛ-4, ИЛ-10 во всех случаях неразвивающейся или
прервавшейся беременности I триместра.
Сухих Г.Т. и Ванько Л.В. предполагают, что блокирующие антитела
(ассоциированные с беременностью антитела против антигенов отца,
связанных с комплексом HLA) опосредуют один из механизмов защиты
плода иммунной системой матери от герпесвирусной инфекции. Потеря
беременности может происходить тогда, когда у беременных определяется
снижение содержания в крови блокирующих факторов [41, 80, 87].
27
Данные отечественных исследователей подтверждаются данными,
полученными зарубежными авторами. Jean Calleja-Agius и соавт. получены
высокие уровни экспрессии ФНО-α у пациенток с ГВИ и ранними потерями
беременности [113]. Jana Hanzlikova и соавт. изучали активность иммунного
ответа
Th1/Th2
при
ПНБ.
Было
показано,
что
у
пациенток
с
репродуктивными потерями в анамнезе при наличии в генитальном тракте
ВПГ-2 и ЦМВ наблюдалась гипоактивность Th2 иммунного ответа, что
характеризовалось низкой продукцией CD4+/ИЛ-4, возможно, по причине
прогестерондефицитного состояния. Значимых изменений в Th1 иммунном
ответе выявлено не было [52].
Таким образом, врожденный и приобретенный иммунные ответы
имеют немаловажное значение в противовирусной защите от ГВИ при
привычном
невынашивании
беременности.
Диагностика
иммунных
нарушений и своевременная коррегирующая терапия герпесвирусной
инфекции необходимы при данной патологии беременности.
1.3.
Особенности
и
принципы
методов
лечения
привычного
невынашивания беременности на фоне герпесвирусной инфекции
1.3.1.
Медикаментозная
терапия
(химиопрепараты,
индукторы
интерферонов, иммуномодуляторы, вакцинопрофилактика)
В настоящее время существует широкий спектр методов лечения ПНБ
на фоне хронической рецидивирующей герпесвирусной инфекции. Все
существующие методики лечения данной патологии условно можно
разделить на медикаментозные и другие немедикаментозные (физические)
методы воздействия.
Медикаментозная терапия достаточно разнообразна, но в настоящее
время не существует препаратов, способных элиминировать ВПГ из
организма, поэтому лечение герпесвирусной инфекции
может быть
направлено только на блокаду репродукции вируса и одновременно на
стимуляцию иммунитета для формирования полноценной иммунной защиты
с целью блокирования реактивации ВПГ в очагах персистенции [32, 33, 164].
28
Среди всех медикаментозных препаратов выделяют несколько групп:
химиопрепараты, интерфероны (ИФН), индукторы ИНФ, иммуномодуляторы
[33].
В настоящее время к основным противогерпетическим препаратам
относятся химиопрепараты - аномальные нуклеозиды (Ацикловир, Валтрекс,
Диданозин, Изопринозин) [33, 63, 102, 119, 150, 171]. Механизмы действия
этих соединений основаны на избирательном подавлении отдельных звеньев
репродукции ВПГ и блокировании синтеза ДНК реплицирующего вируса
путем ингибирования фермента ДНК-полимеразы, обратной транскриптазы.
Некоторые
химиопрепараты
селективно
активируются
вирусной
тимидинкиназой и обладают широким спектром действия, существенно не
нарушая жизнедеятельность клеток макроорганизма [33]. В многочисленных
исследованиях показано, что эти препараты эффективно купируют острые
проявления ГВИ, но не предотвращают рецидивы заболевания, так как не
влияют на вирусы, которые находятся в латентном состоянии [32, 50, 63]. В
последние годы все чаще появляются сообщения о резистентности
герпесвирусов к ацикловиру и его аналогам [79, 101, 174]. Все это требует
применения комплексной и длительной терапии в отношении больных ГВИ.
При низкой терапевтической эффективности химиопрепаратов назначают
лекарственные средства с другим механизмом противовирусного действия.
Препараты
происхождения
интерферона,
(Генферон,
прежде
Виферон,
всего
Реаферон),
генно-инженерного
получили
широкое
распространение в лечении рецидивирующей ГВИ. Система интерферона главный барьер на пути вирусных инфекций и важное звено реакций
врожденного иммунитета [33, 122]. ИФН – важнейший защитный белок,
образующийся в ответ на проникновение вируса в клетки организма. ИФН
осуществляет распознавание и элиминацию чужеродной генетической
информации [9, 33, 84]. Основной механизм действия ИФН заключается в
подавлении любого этапа размножения вируса (транскрипции – трансляции –
сборки
–
выхода
потомства
вирионов)
путем
индукции
синтеза
протеинкиназы, которая фосфорилирует один из инициирующих факторов
29
трансляции, который не может обеспечить образование инициирующего
комплекса.
Таким
образом,
механизм
действия
ИФН
объясняется
блокированием стадии инициации трансляции и разрушением иРНК вируса.
Способность
ИФН
подавлять
репродукцию
вируса,
оказывать
иммуномодулирующий эффект позволяет применять препараты интерферона
и его индукторы в лечении обострений ГВИ, а также в целях профилактики
рецидивов [106, 132, 138].
Среди противовирусных препаратов особое место занимают индукторы
интерферона (Амиксин, Циклоферон, Неовир, Аллокин-альфа) – соединения,
стимулирующие
выработку
эндогенного
интерферона,
что
более
физиологично для организма. Механизм действия индукторов ИФН
заключается в синтезе ИФН-α, ИФН-β, ИФН-γ в разных пропорциях и
индукции
образования
провоспалительных
и
противовоспалительных
цитокинов [33, 79, 80]. Индукторы интерферона имеют как преимущества,
так и недостатки. К преимуществам относят меньшее количество побочных
эффектов от терапии, длительная продукция ИФН в терапевтических дозах,
меньшая
стоимость
курса
лечения.
С
другой
стороны,
иммуномодулирующий эффект зависит от функционального состояния
клеток, которые активируются в ответ на терапию. На фоне приема возможно
развитие гипореактивности и иммуносупрессии.
Исследования, проведенные Ершовым Ф.И. и соавт., показали, что у
пациенток с рецидивирующим ГГ после курса индукторов ИФН происходила
нормализация
показателей
интерферонового
статуса
(повышение
циркулирующего и спонтанно вырабатываемого ИФН) и цитокинового
статуса (тенденция к снижению ИФН-γ, ИЛ-1β, ИЛ-4 в сыворотке крови и
угнетение способности мононуклеаров периферической крови к выработке
ИФН-α, ИФН-γ, ИЛ-1β, ИЛ-4). Также после курса лечения индукторами ИФН
выявлены
изменения
экспрессии
цитокиновых
генов:
сохранилась
активность мРНК ИФН-α, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-18 [107].
Другая
группа
противогерпетических
препаратов
–
иммуномодуляторы. В России для лечения ГВИ используют Имунофан,
30
Галавит,
Полиоксидоний,
Иммуномакс,
Ликопид
и
др.
[108,
109].
Иммуномодуляторы назначают в комплексной терапии одновременно с
противовирусными средствами. Главной мишенью иммуномодулирующих
препаратов являются вторичные иммунодефициты, вызванные вирусами
вследствие дисфункции мононуклеарных фагоцитов, NK-клеток и нарушения
регуляции цитокиновой продукции [33]. Учитывая большой
спектр
препаратов данной группы, определить единый механизм действия не
представляется возможным, т.к. каждый представитель имеет свой спектр
антивирусной активности и иммуномодулирующей способности.
Среди наиболее эффективных иммуномодулирующих лекарственных
средств
в
лечении
рецидивирующей
ГВИ
выделяют
препараты
иммуноглобулинов для внутривенного введения (Интраглобин Ф, Октагам,
Габриглобин, Пентаглобин, Иммуноглобулин нормальный человека для
внутривенного введения) [79]. Механизм иммуностимулирующего действия
(достигается на стадии вирусемии) – нейтрализация антигена за счет
имеющегося в препарате естественного титра антител против стандартного
набора патогенов и вырабатываемых ими цитокинов [34]. У женщин с ГВИ и
ПНБ применение иммуноглобулинов способствует смещению баланса
Th1/Th2 в сторону активации клеточного ответа. В ряде исследований
показано, что применение иммуноглобулинов эффективно у женщин с ПНБ,
так как у них определяется высокий уровень NK-клеток [98, 99]. Важное
свойство этих биопрепаратов – способность влиять на разные виды клеток
[109]. По мнению Сидельниковой В.М., показания для введения препаратов
иммуноглобулинов определяются повышенным уровнем NK-клеток и
провоспалительных цитокинов в периферической крови и/или в слизи
цервикального канала, а также обострением ГВИ у женщин с привычной
потерей беременности, наличием хронического эндометрита и истмикоцервикальной недостаточности [79].
Также существует специфическая иммунотерапия, которая состоит в
применении инактивированной герпетической вакцины (Витагерпавак, РФ).
Вакцина содержит инактивированные антигены вирусов ВПГ I и II
31
серотипов, полученных путем репродукции в культуре Vero B. Лечебный
эффект герпетической вакцины связан со стимуляцией специфической
реакции противовирусного иммунитета, усилением активности лимфоцитов,
сохраняющейся в течение нескольких месяцев после вакцинации [5, 48].
Подводя итог выше изложенному, следует отметить, что в настоящее
время
арсенал
противогерпетических
средств
разнообразен,
но
максимальный клинический эффект у пациенток с ГВИ и ПНБ может быть
получен только при комплексном применении лекарственных средств с
различным механизмом действия. Поэтому в последнее десятилетие все
большее внимание специалистов клинической медицины привлекают
физические эфферентные методы лечения ГВИ.
1.3.2. Эфферентные методы терапии
К данным методикам относят плазмаферез (ПА), внутривенное
лазерное
облучение
крови
(ВЛОК),
применение
низкоинтенсивного
лазерного излучения (квантовая гематерапия), озонотерапия и другие. Они
позволяют удалять из организма патологические элементы с целью
коррекции клеточного, белкового, электролитного, коллоидного и водного
баланса и могут быть использованы для лечения хронической ГВИ –
патологического состояния, связанного с появлением в крови вирусных
частиц (ВПГ) и продуктов, отсутствующих в здоровом организме. Данные
методики
в
последнее
время
широко
применяются
в
акушерско-
гинекологической практике, в том числе и при рецидивирующей ГВИ у
женщин с ПНБ в анамнезе [1].
Одним
из
рецидивирующей
современных
ГВИ
немедикаментозных
является
лечебный
методов
плазмаферез,
терапии
который
представляет собой операцию по избирательному удалению плазмы
периферической крови больного с целью лечебной коррекции ее белкового
или клеточного состава. Возможность удаления и снижения скорости
образования иммунных комплексов, циркулирующих антител методом
лечебного плазмафереза явилась предпосылкой для применения процедуры в
32
ряде
патологических
состояний,
характеризующихся
иммунными
нарушениями. Данный метод использовала Цахилова С.Г. (1999г.) при
лечении пациенток с рецидивирующей ГВИ на фоне беременности. У
женщин с ГГ и ЦМВИ была достигнута стойкая ремиссия вирусной
инфекции [96]. Лечебные эффекты плазмафереза с целью лечения ГВИ
обусловлены
сочетанным
детоксикационного
воздействием
(элиминация
различных
токсических
механизмов:
субстанций),
рео-
и
коагулирующего (снижение агрегационных характеристик клеток крови),
иммунокорригирующего
(элиминация
антигенов
ВПГ,
антител,
циркулирующих иммунных комплексов, иммунокомпетентных клеток,
изменение
направленности
иммунного
ответа)
[32].
В
литературе
рассматривается несколько механизмов реализации иммунокоррекции при
ГВИ после курса лечебного плазмафереза. При механическом удалении из
кровеносного
русла
антигенов
специфические
иммунные
механизмы
разгружаются, и на какое-то время надежность функционирования этих
систем
повышается.
Адекватный
эффект
после
экстракорпоральной
разгрузки сохраняется до нескольких месяцев.
Даниловым С.И. и соавт. проводились исследования по влиянию
плазмафереза на динамику гуморального и клеточного иммунитета у
пациентов с тяжелой формой рецидивирующего генитального герпеса,
резистентных к обычной противовирусной терапии. Были получены
положительные результаты
в
динамике гуморального
и
клеточного
иммунитета на фоне лечения методом плазмафереза [32].
Квантовая гемотерапия – совокупность методов, в основе которых
лежит внутрисосудистое или экстракорпоральное воздействие на кровь
лучевой энергии [14, 38, 61, 95]. Метод квантовой гемотерапии – трансфузия
крови,
облученной
вне
организма
ультрафиолетовыми
лучами
или
эндоваскулярное (внутривенное) лазерное облучение крови (ВЛОК), при
котором световод вводят в просвет сосуда (кубитальной вены). Лечебный
эффект последнего достигается за счет воздействия лазерного излучения на
форменные элементы крови, белковые структуры плазмы и антиоксидантную
33
систему. В результате облучения крови отмечается активация ферментов в
эритроцитах, улучшение реологических и снижение коагуляционных свойств
крови, изменения в иммунной системе, нормализация процессов перикисного
окисления липидов, достигается противовирусный эффект. С развитием
квантовых терапевтических аппаратов в сторону повышения их мощности
для достижения терапевтического эффекта в настоящее время нет
необходимости в проведении внутривенного облучения крови. Метод
чрескожного лазерного облучения крови сменил инвазивные методики.
Данная терапия способствует иммунокоррекции путем нормализации
межклеточных взаимоотношений субпопуляции Т-лимфоцитов и увеличения
количества иммунокомпетентных клеток в крови, что усиливает иммунный
ответ [14, 179].
Абубакирова А.М. и соавт. сообщают о положительных результатах
при лечении ГГ у супружеских пар. После трех сеансов плазмафереза и семи
сеансов ВЛОК стойкая ремиссия наступила у 76% пролеченных пар [1].
Поэтому эфферентные методы лечения и фотомодификация крови могут
быть использованы для профилактики и лечения ГВИ у пациенток с ПНБ в
анамнезе.
Мамедова С.Ю. и соавт. изучали иммунологические показатели у
женщин с ГГ на фоне ВЛОК (гелий-неоновое излучение). Результаты
проведенного исследования
показали, что применение НИЛИ
было
эффективным: улучшались показатели интерферонового статуса [64].
В настоящее время большой интерес представляет озонотерапия –
метод внутривенного введения изотонического раствора хлорида натрия,
насыщенного озонокислородной газовой смесью. Исследования Полюбиной
Е.В. и соавт. показали, что механизмы иммуномодулирующего действия
медицинского озона основаны на нормализации индивидуальных исходно
измененных показателей Т-лимфоцитов, снижении активированных CD71+
лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов [72]. Бойко Е.Л. проведены
исследования
по
изучению
влияния
медицинского
озона
на
иммунологические показатели крови пациенток с ПНБ инфекционного
34
генеза: отмечалось снижение уровня цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ)
[11]. Выявленные изменения, возможно, отражают процессы, связанные с
мобилизацией иммунной системы и активацией адаптивного иммунного
ответа на фоне неадекватного иммунного ответа у пациенток с вирусным
генезом НБ. Таким образом, было показано, что включение озонотерапии в
комплексное лечение женщин с ПНБ способствовало благоприятному исходу
последующей беременности у 80,4% женщин, при этом по сравнению с
традиционным лечением в 3 раза снижалась частота спонтанных абортов [11,
119]. Другими исследователями также показана эффективность данного
метода при ПНБ инфекционного генеза: было отмечено снижение
содержания цитокинов (ФНО-α, ИЛ-1) в крови и цервикальной слизи (ИЛ-6),
что в дальнейшем способствовало пролонгированию беременности с
благоприятным исходом [6, 20, 30].
К другим немедикаментозных методам лечения относят СКЭНАРтерапию – терапевтическое неинвазивное электроимпульсное воздействие на
кожный покров человека с использованием импульсного биполярного тока
без постоянной составляющей. Боровковой Л.В. и соавт. показан механизм
лечебного действия данного метода: иммуномодулирующий эффект терапии
достигается за счет снижения уровней провоспалительных цитокинов в крови
[12, 13], что показано в работе по оценке эффективности СКЭНАР-терапии в
лечении пациенток с ПНБ инфекционного генеза [12].
Таким образом, несмотря на расширение диапазона клинических
исследований по разработке оптимальных способов лечения ГВИ у
пациенток с ПНБ, частота выявления данной патологии неуклонно растет в
связи с трудностями в элиминации ВПГ из организма. Продолжается поиск
альтернативных и наиболее эффективных методов лечения ПНБ на фоне
рецидивирующей ГВИ.
35
1.4. Принципы фотодинамической терапии. Фотосенсибилизированная
фотомодификация крови – новый подход к лечению
В настоящее время во всем мире в клинической практике интенсивно
развивается новая медицинская технология - фотодинамическая терапия
(ФДТ). Данный метод основан на использовании фотодинамического
повреждения клеток в ходе фотохимических реакций. Один из частных
методов ФДТ - фотосенсибилизированное лазерное облучение крови. Метод
заключается во введении в организм раствора ФС (биохимически инертного
в темноте вещества), который под действием лазерного облучения приводит
к образованию активных форм кислорода (синглетный кислород, пероксиды
и т.п.) [25]. При фотодинамической терапии активные формы кислорода
обладают цитотоксическим действием [25, 133]. Механизмы, лежащие в
основе ФДТ, являются предметом многочисленных исследований, однако до
конца не изучены [86, 90].
В механизме ФДТ можно выделить четыре этапа: введение в организм
фотосенсибилизатора,
последующую
фотодинамическую
реакцию,
развивающуюся во время лазерного воздействия, фотодинамический процесс
и отдаленные реакции, сопровождающиеся цитотоксическим эффектом [86].
При поглощении кванта света после лазерного воздействия молекула ФС
переходит из основного состояния в возбужденное синглетное состояние,
дезактивация которого может происходить различными путями: ФС может
вернуться
в
основное
состояние,
либо
перейти
в
долгоживущее
возбужденное триплетное состояние. Далее существуют два пути развития
событий. Первый путь включает фотохимические реакции, при которых
возбужденная молекула ФС реагирует с субстратами окисления. Второй путь
включает процессы, в которых первичным является взаимодействие
возбужденной молекулы ФС с кислородом. В возбужденном триплетном
состоянии молекула ФС может передать энергию на молекулярный кислород,
растворенный в тканях. В результате такого переноса образуется синглетный
молекулярный
кислород,
который
является
сильным
окислителем,
36
вступающим в реакцию с различными биологическими молекулами, окисляя
их с образованием свободных радикалов и перекисей (Рис. 1.).
Переход в основное состояние,
выделение кванта светафлюоресценция
Триплетное состояние
фотосенсибилизатора
Лазерное облучение
Λ=650-680нм
·О -
Молекула
фотосенсибилизатора
Разрушение клеточной
мембраны
+
2
Короткоживущее
синглетное состояние
фотосенсибилизатора
Субстрат окисления
+
О2
Активные формы кислорода
·О -
2
1О
2
Рис. 1. Схема механизма действия фотодинамической терапии
В результате этих процессов активируется каскад фотодинамических
повреждений мембран, приводящих в результате к гибели клеток [85]. После
передачи энергии возбуждения молекулярному кислороду молекула ФС
возвращается
в
стабильное
повреждению
мембран
и
состояние.
других
В
дополнение
клеточных
структур
к
прямому
свободными
радикалами происходит выработка цитокинов (ИЛ-6, ИЛ-2, ФНО-α, ГКСФ и
др.). Они запускают процессы, ответственные за развитие цитотоксического
эффекта. Иммунная система реагирует на ФДТ. Воспалительный процесс при
ФДТ
может
послужить
инициатором
формирования
эффективного
иммунитета, в том числе и противовирусного [100, 127].
Несмотря на известные факты о механизмах ФДТ, в настоящее время
остается много вопросов, до конца не решенных. В понимании механизмов
действия ФДТ важную роль играет ряд факторов: доза препарата
фотосенсибилизатора, способ его введения, временной интервал между
введением фотосенсибилизатора и лазерным облучением. Но, несмотря на
37
ряд открытых вопросов, ФДТ применяется в повседневной практике с
высокой эффективностью в различных областях медицины [86, 177].
Данный метод нашел широкое применение в лечении различных
заболеваний, в том числе ассоциированных с вирусной инфекцией:
цервикальная дисплазия эпителия шейки матки и вульвы, остроконечных
кондиломах и др. [4, 9, 15, 16, 44, 50, 54, 68, 82]. Проводились работы по
фотодинамической
лазерному
терапии
облучению
опухолей
крови
у
и
пациентов
фотосенсибилизированному
с
диссеминированными
опухолевыми процессами, оценке состояния иммунной системы на фоне
лечения [47, 101, 136].
Гельфонд
М.Л.
фотомодификации
показал
крови
при
эффективность
сенсибилизированной
распространенных
злокачественных
новообразованиях различной локализации (рак легких, рак желудка, рак
толстой кишки) [25].
Кудинова Н.В. представила механизм иммунной реакции в ответ на
ФДТ опухолей: гибель опухолевых клеток достигается путем некроза и
апоптоза. Под действием ФДТ происходит разрушение эндотелиальных
клеток в ткани опухоли, что приводит к вазоконстрикции/дилатации,
агрегации тромбоцитов, освобождению тромбоксана интерлейкинов (ИЛ-1β,
ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-α) и инфильтрации опухоли нейтрофилами, моноцитами и
другими клетками [47, 115, 127].
В настоящее время все более активно рассматривается возможность
применения ФДТ не только в онкологии, но и в других областях медицины.
Такие идеи появились после того, как в литературе были опубликованы
сообщения
о
фотодинамической
инактивации
микроорганизмов
(простейшие), возбудителей инфекционных заболеваний [77, 85, 135, 152].
Был
показан
фотодинамический
эффект
на
микроорганизмы
с
использованием в качестве фотосенсибилизатора акридинового красителя
для их фотодинамической инактивации и солнечного света в качестве
источника энергии [157]. Данный факт послужил к развитию антимикробной
фотодинамической терапии. Z. Malik и соавт. сообщили о бактерицидном
38
действии ФДТ на грамотрицательные бактерии и дрожжевые грибы [146]. В
экспериментах была показана эффективность метода антимикробной
фотодинамической терапии, что в дальнейшем также было неоднократно
подтверждено в клинических исследованиях в различных областях медицины
[134, 141, 142, 151].
Позднее
эффективность
ФДТ
при
вирусной
инфекции
экспериментально была показана многими учеными. Очередным шагом
вперед было изучение метода ФДТ в терапии вирусной инфекции [134].
Предпосылкой к проведению научных работ в этом направлении стал факт
фотодинамической инактивации вирусных частиц [104, 110, 141, 149, 172]. В
литературе упоминается о медленном развитии исследований по этой теме,
т.к. часто публиковались данные о случаях побочных эффектов ФДТ, что
также тормозило исследовательский процесс в этой области. Поэтому,
несмотря на то, что фотодинамический противовирусный эффект был
показан в начале прошлого века, исследования по этому вопросу долго не
предпринимались.
Только в конце XX столетия появились реальные научные работы, т.к.
пути решения данного вопроса стали возможными ввиду совершенствования
как оптоволоконной техники и лазерных технологий, так и химического
производства по разработке и созданию новых фотосенсибилизаторов.
Помимо бактерицидного действия ФДТ изучалось действие на вирусы.
Накоплен материал доклинических исследований: Kasermann F. и Kempf C.
показали противовирусное действие на вирус лихорадки Денге, вирус
японского энцефалита [145]; Moor A.C. и Wagenaars-van-Gompel A.E. – на
вирус везикулярного стоматита [149]; M.Pechere, Yerly S. и др. – сообщили
об инактивации вируса иммунодефицита человека [108]. Убедительно
доказан стерилизующий эффект ФДТ при обработке крови и ее компонентов,
инфицированных ВИЧ и вирусом кошачьей лейкемии [148, 149].
Группа
исследователей
под
руководством
Фиалкиной
С.В.
продемонстрировала влияние лазерного облучения без использования ФС на
репликацию клебсиеллезного бактериофага. Было выявлено, что облучение
39
вирулентного фага приводило к 1000-кратному снижению количества
вирионов в тест - культуре K. pneumoniae 296 [92].
С 2004 по 2006гг. в Институте лазерной физики РАН выполнялась
работа, основной целью которой была разработка методик инактивации
оболочечных
вирусов
фотосенсибилизаторов
при
на
помощи
основе
соединения
фуллеренов
обладают
проявлении
противовирусной
нерастворимых
фуллеренов.
Было
и
воде
показано,
мембранотропными
активности
в
эффектами
практически
что
в
полностью
подавляют репликацию оболочечных вирусов. Механизм противовирусного
действия фуллеренов связан с их влиянием на оболочку вирусов. При
исследовании действия этих соединений на оболочечные вирусы Dengue-2
(сем. Togaviridae, род Flavivirus) вируса лихорадки Денге, вирус японского
энцефалита и двух безоболочечных вирусов: энтеровируса 71 и вируса
коксаки В3 (сем. Picornaviridae, род Enterovirus), было обнаружено, что
фуллерены эффективно ингибируют только оболочечных вирусы и не
активны в отношении безоболочечных вирусов, что подтверждает вывод о
связывании фуллеренов с липидной оболочкой вируса для его последующей
инактивации [97].
Установлено, что фуллерены действуют на репродукцию вирусов, при
этом не наблюдается ингибирования синтеза вирусных белков. При
воздействии фуллеренов (на основе комплекса С60/ПВП) с помощью
электронной микроскопии было выявлено много дефектных вирионов и
повреждений в вирусных оболочках. Анализируя результаты, можно
заключить, что главная мишень противовирусного действия – последняя
стадия цикла репликации оболочечных вирусов [71].
В
зарубежной
литературе
имеются
данные
о
том,
что
фотосенсибилизатор на основе фуллеренов C60 в виде водорастворимого
комплекса с поливинилпирролидоном (ПВП) в дозах от 250 до 1000 мкг/мл
способен
ингибировать
репродукцию
вирусов
гриппа
А/Виктория
35/72(Н3N2), не проявляя при этом цитотоксического и генотоксического
40
эффектов. В высоких дозах эффективность комплекса на основе С60/ПВП
была сравнима с действием ремантадина [116].
Мак А.А. и соавт. показали противовирусное фотодинамическое
воздействие углеродного фотосенсибилизатора астралена на вирус гриппа
A/PR/8/34 (H1N1). Отмечено изменение морфологии вирусных частиц, что
проявлялось в появлении дефектов вирусной оболочки и разрушении
поверхностных гликопротеидов. Дефектные вирионы были не способны к
полноценной репликации [154].
Tao JN и соавт. проводили экспериментальные исследования по
фотодинамической инактивации ВПГ на in vivo моделях герпесвирусной
инфекции ВПГ-1 и ВПГ-2, полученных от морских свинок. В экспериментах
при использовании фотосенсибилизатора 5-аминолевуленовой кислоты был
получен
противогерпетический
эффект,
сопоставимый
с
эффектом
ацикловира [165].
Квачевой З.Б. и соавт. также проводились экспериментальные работы
по
фотодинамическому
использованием
в
ингибированию
качестве
ФС
герпесвирусной
порфиринов,
инфекции
индуцируемых
с
5-
аминолевуленовой кислотой. Установлена повышенная способность клетокмишеней
накапливать
эндогенные
индуцируемые
порфирины,
что
5-аминолевуленовой
обусловило
кислотой
избирательность
их
фотоповреждения. Получены вирусингибирующие эффекты ВПГ-1 [40, 141].
Таким образом, было показано противогерпетическое действие порфиринов.
В
настоящее
время,
учитывая
актуальность
проблемы
роста
заболеваемости вирусными инфекциями, в частности герпесвирусной
инфекцией, ее доказанную связь с ПНБ, установлена возможность
фотодинамической инактивации оболочечных вирусов [8, 143, 157]. В
литературе также имеются данные об экспериментальных и клинических
испытаниях
способности
ФДТ
инактивировать
вирусы,
такие
как
папилломавирус, вирус гепатита С и вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)
[129, 149, 159, 160, 161].
41
Факт о наличии противовирусного фотодинамического эффекта
способствует углублению научных исследований в этом направлении и
создает предпосылки для расширения клинического использования этой
методики в различных отраслях медицины.
Изучение противогерпетического эффекта ФДТ представляет собой
значительный интерес, в том числе и в качестве терапии ГВИ, как важной
проблеме для пациенток с ПНБ в анамнезе (учитывая высокий процент
заболеваемости,
как
правило,
пожизненное
течение
и
отсутствие
специфического лечения). Обобщая приведенные литературные данные,
необходимо дальнейшее изучение действия ФДТ на механизмы врожденного
и адаптивного иммунитета. Возможно, решение этого вопроса будет
достигнуто в ближайшее время.
История развития и внедрения ФДТ насчитывает многие годы. В
последнее время детальное изучение механизмов действия показало, что,
помимо
прямого
цитотоксического
действия,
ФДТ
имеет
иммуностимулирующий эффект, которых, безусловно, требует дальнейшего
изучения. Понимание механизмов фотодинамического воздействия на
вирусную
инфекцию
и
развития
иммунного
ответа
при
фотосесибилизированной ФМК у пациенток с носительством хронической
ГВИ, позволит повысить процент наступления и благоприятный исход
беременности
у
женщин
с
инфекционным
генезом
невынашивания
беременности.
В связи с этим представляет научный и практический интерес изучение
механизмов фотодинамического воздействия на ВПГ, а также исследование
влияния метода фотосенсибилизированной ФМК на цитокиновый профиль у
женщин с привычными потерями беременности на фоне ГВИ и стойкой
неэффективностью ранее проводимых лечебных мероприятий.
42
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Клиническая работа выполнена на кафедре акушерства и гинекологии
№1 ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова (зав. каф. д.м.н., проф. Макаров
О.В.) на базе ГБУЗ «Городская клиническая больница №55 Департамента
здравоохранения города Москвы» (главный врач - к.м.н. О.Е. Куликова).
Весь объем экспериментальной работы был проведен в ФГБУ «НИИВС
им. И.И. Мечникова» РАМН, г. Москва в лаборатории молекулярной
иммунологии, заведующая лабораторией, д.м.н. Свитич О.А., и в ЦНИЛ
ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России на кафедре
иммунологии
медико-биологического
факультета,
и.о.
заведующего
кафедрой д.м.н., профессор Ганковская Л.В.
2.1. Описание клинических групп
Нами было проведено комплексное клинико-лабораторное обследование
134 небеременных женщин, из них: 74 пациентки (основная группа) с
рецидивирующей герпесвирусной инфекцией (ВПГ-2, ЦМВ) - 36 пациенток
без невынашивания беременности в анамнезе (1 подгруппа) и 38 пациенток с
ПНБ вирусной этиологии (2 подгруппа), в анамнезе которых отмечено
прерывание беременности в I триместре. Пациенткам основной группы (22
женщины) проводилась фотосенсибилизированная ФМК.
Группу сравнения (2 группа) составили 30 пациенток с ПНБ в анамнезе и
рецидивирующей
ГВИ,
получавших
препараты
иммуноглобулинов
(внутривенно) с целью лечения рецидивирующей ГВИ и в качестве
предгравидарной подготовки.
Группу контроля составили условно здоровые женщины – 30 человек
без клинических проявлений инфекций, вызванных ВПГ-2 и ЦМВ, в
анамнезе по данным ретроспективного анализа (группа контроль).
43
Критериями отбора пациенток основной группы были:
1. рецидивирующая герпетическая инфекция по данным ретроспективно
собранного анамнеза: клинические проявления ГГ во время предыдущих
беременностей и вне беременности (жалобы на зуд и жжение вульвы,
перенесенные кольпиты и эктопии шейки матки, а также рецидивирующее
герпетическое
поражение
орофациальной
области
и
другие
экстрагенитальные поражения);
2. лабораторно подтвержденный диагноз герпетической инфекции методом
полимеразной
цепной
реакции
в
твердофазного
иммуноферментного
реальном
анализа
времени
(ИФА)
с
(ПЦР-РВ)
и
определением
специфических антител классов IgG и IgM к ВПГ-2 и к ЦМВ;
3. непереносимость и неэффективность применения противовирусных
препаратов в анамнезе;
4. подписание информированного согласия на обследование и проведение
фотосенсибилизированной ФМК.
Критерии исключения пациенток из группы:
1. наличие генетических, эндокринологических, тромбофилических причин
НБ, истмико-цервикальная недостаточность, наличие патологии матки
(пороки
развития,
генитальный
инфантилизм,
гипоплазия
матки,
обострения
других
внутриматочные синехии);
2.
острые
респираторные
вирусные
инфекции,
воспалительных заболеваний экстрагенитальной локализации и инфекций,
передающихся половым путем на момент исследования;
3. пациентки, проходившие по программе вспомогательных репродуктивных
технологий (ВРТ) в анамнезе.
На каждую пациентку заводили специально разработанную карту, в
которую вносили данные анамнеза и обследования, характер проведенной
терапии и ее результаты.
Сбор анамнеза проводили по традиционной схеме: изучали жалобы
пациенток,
перенесенные
заболевания
(детские и
общие
инфекции,
гинекологические заболевания); сопутствующие заболевания желудочно44
кишечного тракта, легких, печени, почек, аллергические реакции на
различные препараты. Анализировали наследственность и условия жизни в
различные возрастные периоды, характер становления менструальной и
репродуктивной функций, начало половой жизни, число партнеров. При
изучении репродуктивной функции уточняли количество беременностей,
родов, число самопроизвольных абортов, неразвивающихся беременностей,
преждевременных родов, характер и сроки их прерывания, мертворождение
детей с пороками развития. Большое внимание уделяли анализу жалоб:
уточняли характер локальных проявлений герпетической инфекции, наличие
продромальных симптомов, характер рецидивов заболевания.
После
выяснения
жалоб
и
анамнеза
проводили
объективное
обследование и специальное гинекологическое исследование, которое
включало осмотр наружных половых органов, оценку состояния слизистых
влагалища, шейки матки, оценивали их окраску, наличие трофических
изменений, высыпаний и язвенных поражений, а также количество и
качество выделений; также проводилось определение положения, размеров,
консистенции, болезненности матки и придатков.
Все
пациентки
прошли
клинико-лабораторное
обследование,
включавшее общеклинические методы исследования: определение групповой
принадлежности и резус-фактора крови, клинический и биохимический
анализы крови, анализ крови на ВИЧ, антитела к Trepanema pallidum, HBsантиген, антитела к HCV, коагулограмма, общий анализ мочи, гормональный
профиль крови, стероидный профиль мочи, проводилось бактерископическое
исследование отделяемого из цервикального канала и влагалища на степень
чистоты, цитологическое исследование из экто- и эндоцервикса, ПЦР диагностика инфекций, передающихся половым путем на наличие ВПГ-2,
ЦМВ, хламидий, уреаплазм, микоплазм, определение в крови антител к ВПГ
и ЦМВ (IgG и IgM); флюорография, ультразвуковое исследование органов
малого таза.
С целью уточнения состояния внутренних половых органов на
диагностическом этапе применяли ультразвуковое исследование органов
45
малого таза трансабдоминальным и трансвагинальным датчиком. Процедуру
проводили в положении пациентки лежа на спине. Ультразвуковое
сканирование проводили на аппарате General Electric Voluson E8 («General
Electric», USA) с использованием трансабдоминального (2-6 МГц) и
трансвагинального конвексных датчиков (3,7-9,3 МГц). При исследовании
путем продольного и поперечного сканирования оценивали топографию
органов малого таза: размеры матки, толщину и структуру эндометрия,
состояние миометрия, внимание также уделяли структуре и размерам
яичников, наличию патологических образований.
После выполнения полного спектра диагностических мероприятий
пациенткам проводили фотосенсибилизированную фотомодификацию крови.
2.2.
Методические
аспекты
проведения
фотосенсибилизированной
фотомодификации крови
Основанием для проведения фотосенсибилизированной ФМК у
пациенток с ГВИ явилось разрешение этического комитета ГБОУ ВПО
РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава РФ. Всем пациенткам до начала
исследования была предоставлена письменная информация о препарате,
разъяснена суть, цель исследования и необходимость динамического
клинико-лабораторного обследования в ходе лечения. Пациентка подробно
информировалась относительно способа введения препарата «Фотодитазин»,
профилактических мер по предотвращению побочных реакций, связанных с
кожной фототоксичностью (соблюдение светового режима в течение 24
часов). В информации для пациенток содержались все сведения о
планируемом клиническом исследовании. Перед началом исследования
пациентка
подписывала
форму
информированного
согласия,
подтверждающую ее добровольное участие. Учитывая, что в данное
исследование было невозможно включить семейные пары, на время
проведения
терапии
воздерживались
от
все
пациентки,
половых
актов
участвующие
или
в
исследовании,
использовали
барьерную
46
контрацепцию для предотвращения реинфицирования ГВИ или заражения
инфекциями, передающимися половым путем.
Фотосенсибилизированная фотомодификация крови была проведена 22
пациенткам. Методика проведения процедуры включала в себя несколько
этапов. Первоначально пациентке внутривенно струйно вводили ФС на
основе хлорина Е6, коммерческое название препарата «Фотодитазин» (ООО
«Вета-гранд», РФ) 1 мл (концентрация 0,5 мг/мл) в разведении на 10 мл
физиологического
раствора
(ОАО
«Биохимик»,
РФ)
в
затемненном
помещении. На втором этапе через 5-10 мин. после инъекции препарата
пациентке
проводилось
транскутанное
8-минутное
облучение
крови
лазерным излучением. Облучение осуществляли в области мочки уха,
учитывая наиболее близко расположенную и хорошо развитую подкожную
сосудистую сеть в этой области (Рис. 2.1.). Для облучения использовали
полупроводниковый лазерный аппарат «Аткус-2» («Полупроводниковые
приборы», РФ), имеющего соответствующий сертификат и регистрационный
номер в Государственном реестре медицинской аппаратуры. Доза лазерного
облучения была составляла 200-350 Дж/см² (длина волны 662 нм, плотность
мощности на выходе 1,85-2 Вт).
Во
время
проведения
сеанса
фотосенсибилизированной
ФМК
пациентка находилась в положении сидя. Лазерное световое воздействие
осуществляли транскутанно на указанную область без применения анестезии.
Курс проведения фотосенсибилизированной ФМК составил 8 процедур.
Процедура проводилась согласно графику 1 раз в 3 дня.
47
Рис. 2.1. Схема проведения фотосенсибилизированной фотомодификации
крови
На фоне проводимой терапии в динамике осуществлялся клиниколабораторный мониторинг пациенток для оценки влияния данного метода
терапии на состояние всего организма. У всех пациенток проводили забор
периферической крови в нескольких временных точках: до процедуры; через
1 час после процедуры; через 1 сутки после процедуры; после 3-й процедуры
(9-10 сутки) и после завершения курса лечения (18-20 сутки) для
исследования иммунологических показателей.
В
динамике
на
фоне
фотосенсибилизированного
лазерного
чрескожного облучения крови пациенток проводили анализ титра антител
IgG к ВПГ-2 и IgG к ЦМВ, у пациенток основной группы методом ИФА
исследовали иммунологические показатели: экспрессию гена ФНО-α в
мононуклеарных клетках крови (МНК) методом обратной транскрипции и
ПЦР-РВ; определяли цитокиновый профиль (ФНО-α, ИФН-α, TФР-β1)
методом ИФА. Все показатели исследовали по указанным временным точкам
в динамике на протяжении всего курса лечения.
48
Для выполнения поставленной цели и задач данной работы, нами на
первом этапе проведены доклинические экспериментальные исследования по
оценке противовирусной активности фотодинамической терапии in vitro, на
втором этапе проведено комплексное клинико-лабораторное обследование и
терапия
пациенток
с
герпесвирусной
инфекцией
методом
фотосенсибилизированного лазерного чрескожного облучения крови.
2.3. Описание материалов и методов исследования
Культура клеток. Использовали перевиваемую культуру клеток почки
африканской зеленой мартышки – Vero (Институт им. Пастера, г. СанктПетербург).
Вирусы. Использовали штаммы ВПГ-1 (штамм VR-3) и ВПГ-2 (штамм MS),
полученные из национальной вирусной коллекции Великобритании.
Фотосенсибилизатор.
В
качестве
фотосенсибилизатора
использовали
препарат «Фотодитазин» (ООО «Вета-Гранд», РФ) – фотосенсибилизатор II
поколения, который содержит в качестве основного компонента производное
соли N – диметилглюкаминовой соли хлорина Е6. Препарат ФС разводили
физиологическим раствором NaCl 0,9% (ОАО «Биохимик», РФ).
Источники лазерного излучения.
1. В качестве источника светового воздействия в экспериментальной части
работы для осуществления лазерного облучения применяли аппарат
физиотерапевтический «АФС» (ООО «Полироник», РФ) с длиной волны 662
нм и максимальной мощностью излучения на выходе 180 мВт (Рис. 2.2.).
Рис. 2.2. Аппарат физиотерапевтический «АФС» (ООО «Полироник», РФ)
49
2. В качестве лазерной аппаратуры в клинической части исследования для
облучения использовали полупроводниковый лазерный аппарат «Аткус-2»
(«Полупроводниковые приборы», РФ). Рабочие параметры диодного лазера
«Аткус-2»: выходная мощность 0,1-2 Вт, длина волны излучения 662 нм.
2.3.1. Работа с культурой клеток. Пересев клеток Vero проводили на 3-4
сутки. Для проведения опытов использовали 96-луночные плоскодонные
стерильные планшеты («Costar», США). В каждую лунку вносили по 200 мкл
клеточной суспензии (концентрация 200 тыс. клеток в 1 мл). Через 24ч (48ч)
инкубации при 37оС в атмосфере СО2 в лунках формировался монослой
клеток. При проведении экспериментов использовали среду DMEM
(«ПанЭко»», РФ) с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки
крови («HyClone», США).
2.3.2. Работа с вирусами (заражение культуры клеток). Монослой клеток
заражали вирусом (ВПГ-1, ВПГ-2) в дозе 0,1 ТЦД50/кл. Клетки инкубировали
в культуральной среде при 37 С в атмосфере СО2 до появления
вирусиндуцированного цитопатического эффекта. Через 5 суток определяли
титр вируса с помощью метода Рида и Менча [10]. До начала экспериментов
вирусы прошли 5-7 последовательных пассажей на культуре клеток Vero.
При оценке результатов экспериментальных исследований также применяли
способ Рида и Менча.
Значимым результатом считается, когда титр
полученного после обработки вируса отличается от исходного значения на
1,5-2 и более lg ТЦД50/0,1мл.
2.3.3. Методы иммунной диагностики.
Выделение мононуклеарных клеток (МНК). МНК клетки выделяли в
модификации метода Boyum (1968) [43]. Разведенную в 3 раза культуральной
средой гепаринизированую кровь наслаивали на градиент фиколл-пак
(Histopaque-1077, «Sigma Chemical Co.», США). Клетки крови задерживались
над фиколлом, не смешиваясь с ним. Пробирки центрифугировали в течение
30 минут при 1500 оборотов (центрифуга ОС-6М, Польша). Эритроциты и
гранулоциты опускались на дно пробирки, а лимфоциты и моноциты (МНК
50
клетки) оставались в интерфазном кольце, которое собирали и переносили в
стерильную пробирку, отмывали средой RPIM-1640 («ПанЭко», РФ) и
двукратно центрифугировали. В последующем МНК клетки хранили при
минус 70˚С, они были использованы для выделения РНК.
Выделение РНК из МНК клеток периферической крови. Для выделения
использовали «Набор для выделения РНК» («Rneasy Protect Cell Mini Kit»,
«Qiagen», Германия), строго соответствуя протоколу фирмы-производителя.
В состав набора входил лизирующий раствор (Buffer RLT Plus), растворы для
отмывки (Buffer RW1, Buffer RPE), сорбент и РНК-элюент. Лизирующий
раствор и раствор для отмывки Buffer RW1 предварительно прогревали при
60-65 0С до полного растворения кристаллов.
Для выделения РНК в пробирки с лизатом клеток культуры Vero (100
мкл) добавляли по 350 мкл лизирующего раствора. Пробы тщательно
перемешивали на вортексе («Premed», Польша) и центрифугировали в
течение 15 с при 8000 об/мин. Затем сорбент ресуспендировали на вортексе.
В каждую пробирку отдельным наконечником добавляли по 25 мкл
ресуспендированного сорбента. Перемешивали дважды на вортексе и затем
оставляли в штативе на 5 мин. Для осаждения сорбента пробирки
центрифугировали 15 с при 10 000 об/мин, после чего супернатант удаляли,
используя отдельный наконечник для каждой пробы. На следующем этапе в
пробирки добавляли по 700 мкл раствора для отмывки Buffer RW1,
перемешивали на вортексе до полного ресуспендирования сорбента и
центрифугировали 1 мин. при 10 000 об/мин, после чего удаляли
супернатант. Затем в пробирки добавляли по 500 мкл раствора для отмывки
Buffer RPE, ресуспендировали сорбент на вортексе, центрифугировали 1
мин. при 10 000 об/мин и удаляли супернатант. Отмывку раствором Buffer
RPE повторяли дважды, после чего перемешивали на вортексе и
центрифугировали 1 мин. при 10 000 об/мин и полностью удаляли
супернатант. Открытые пробирки помещали в термостат (Термит, ДНКТехнологии, РФ) 60 оС на 5-10 мин для подсушивания сорбента. После этого
в пробы добавляли по 50 мкл РНК-элюента, перемешивали на вортексе и
51
помещали в термостат 60 оС на 2-3 мин, затем снова перемешивали на
вортексе и центрифугировали на максимальных оборотах (12 000-13 000
об/мин) в течение 1 мин. Супернатант, содержащий нуклеиновые кислоты,
сливали в отдельные пробирки, в них добавляли H2ODEPC до 50 мкл. На
полученных пробах проводили реакцию обратной транскрипции.
Реакция обратной транскрипции. Для получения кДНК гена ФНОα на
матрице РНК, выделенной из МНК клеток периферической крови
клинических образцов, была поставлена реакция обратной транскрипции на
исследуемый ген. Использовали «Набор реагентов для проведения реакции
обратной транскрипции» («Синтол», РФ). Реакцию обратной транскрипции
проводили в два этапа. На первом этапе реакции проводили отжиг праймеров
на РНК, для этого готовили смесь следующего состава: 1 мкл Random
праймеров (1 ое/мл); 3 мкл обратного праймера ФНОα (1 ое/мл); 2 мкл мРНК.
В отрицательный контроль вместо мРНК добавляли 2 мкл Н2ОDEPC.
Полученную смесь инкубировали и отжиг праймера-затравки проводили в
термостате «Термит» («ДНК-технология», РФ) при 70˚С в течение 5 минут,
затем образцы охлаждали при 8˚С в течение 20 минут. Далее к образцам
добавляли реакционную смесь: 3 мкл 10-кратного буфера для обратной
транскриптазы
(10Х
Reverse
Transcriptase
Buffer),
2
мкл
dNTP
(дезоксинуклеотидтрифосфатов), 19 мкл Н2ОDEPC, 0,05 мкл фермента обратной транскриптазы (M-Mult Reverse Transcriptase). После добавления
второй смеси пробирки помещали в амплификатор «Терцик» («ДНКтехнология», РФ) с заданной программой инкубации: 42˚С в течение 20 мин.,
92˚С в течение 10 мин. Полученную кДНК хранили при минус -70˚С.
Для
контроля прохождения реакции обратной транскрипции на
исследуемый ген проводили реакцию на β-актин с использованием randomпраймеров. Это ген экспрессируется всеми клетками на постоянном уровне и
необходим для нормального функционирования клеток.
Подбор обратных праймеров для реакции обратной транскрипции
проводился по нуклеотидным последовательностям мРНК ФНОα (получены
52
в базе данных Gene Bank) с помощью программы Vector NTI 8. Праймеры,
используемые в работе, были синтезированы фирмой «Синтол» (РФ).
Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. В данной работе
был
использован
метод
ПЦР-РВ,
особенностью
которого
является
мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной
цепной реакции. Для постановки ПЦР-РВ использовали реактивы из «Набора
для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR
Green I» («Синтол», РФ) согласно рекомендациям фирмы-производителя.
Реакционная смесь содержала 2,5 мкл - 10Х ПЦР буфер Б; 1,5 мкл - MgCl2, 25
мМ; 2,5 мкл – dNTP, 2,5 мМ; 2 мкл – зонд (1 ое/мл); 1 мкл - прямой праймер
(1 ое/мл); 1 мкл - обратный праймер (1 ое/мл); 0,2 мкл - Taq ДНК-полимераза,
5 Е/мкл; 11,5 мкл – H2ODEPC; 2 мкл - образец кДНК, полученной в ходе
реакции обратной транскрипции. В отрицательный контроль реакции
добавляли 2 мкл воды вместо кДНК. После приготовления реакционной
смеси пробирки помещали в амплификатор для ПЦР-РВ ДТ-96 («ДНКтехнология», РФ), позволяющий анализировать образцы ДНК/РНК в
динамическом диапазоне от 1 до 109 копий и одновременно детектировать
четыре флуоресцентных красителя (FAM/SYBR Green, ROX, R6G, CY5) с
заданной программой (95˚С – 20 сек, 62˚С – 40 сек) с числом циклов 40. По
полученным
данным
определяли
специфичность
амплифицированных
фрагментов и производили расчет количества копий кДНК исследуемых
генов. Изучение экспрессии гена проводили относительно экспрессии гена βактина: количество копий кДНК исследуемых генов пересчитывали на 106
копии гена β-актина [20].
Иммуноферментный анализ (ИФА). ИФА использовали для определения
титра специфических антител IgG к ВПГ-2 и IgG к ЦМВ в сыворотке крови с
помощью
«Набора
реагентов
для
иммуноферментного
выявления
иммуноглобулинов класса G к ВПГ-2 и к ЦМВ» («Вектор Бест», РФ). Также
методом ИФА определяли цитокиновый профиль (ФНО-α, ИФН- α, TФР-β1)
в сыворотке крови с использованием трех иммуноферментных «Наборов для
количественного определения человеческого TNF-α, IFN-α, TGF-β1 в
53
человеческой сыворотке, плазме, моче, других биологических жидкостях и
супернатанте культур клеток» («eBioscience», США) согласно протоколам
для постановки иммуноферментного анализа от фирмы-производителя.
Регистрацию результатов ИФА проводили на аппарате ридер «Reader
ELx800» при длине волны 450 нм, длина волны сравнения 620 нм (Universal
Microplate Reader, ЗАО ФинБио, Санкт-Петербург). Интенсивность окраски,
измеренная при указанной длине волны, была прямо пропорциональна
содержанию концентрации определяемого иммуноглобулина или цитокина в
образцах.
Статистический метод исследования
При обработке полученных данных мы использовали стандартные
методы математической статистики [27]. Статистическую обработку данных
проводили на персональном компьютере в программной среде Microsoft
Excel 10.0 и Statistica 7.0. с использованием встроенного «Пакета анализа»,
предназначенного специально для этих целей.
Для результатов, полученных в ходе экспериментов, рассчитывали
среднее значение и стандартное отклонение от среднего. Результаты
представлены в виде «среднее значение ± стандартное отклонение от
среднего». При нормальном распределении выборок для определения
достоверности различий между ними применен критерий Стьюдента (t) для
независимых переменных. Различия между сравниваемыми группами
считались достоверными при уровне значимости p<0,05.
Учитывая
качественный
характер
изучаемых
признаков,
статистический анализ полученных данных производился с помощью
непараметрического критерия Манна-Уитни-Вилксона для сравнения двух
групп данных. Данные обеих групп объединяли и упорядочивали по
возрастанию. Каждому значению приписывали ранг. Для меньшей группы
вычисляли сумму рангов (T). Полученное значение T сравнивали с
критическими значениями из таблицы критических значений. Если T меньше
или равно первому из них или больше или равно второму, то выборки
считались достоверными [27].
54
Глава 3. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
ОБСЛЕДОВАННЫХ ПАЦИЕНТОК
Результаты
диссертационной
работы
основаны
на
данных
комплексного клинико-лабораторного обследования и лечения методом
фотосенсибилизированной ФМК женщин с носительством хронической
смешанной герпесвирусной инфекции (ВПГ-2, ЦМВ), рецидивирующего
течения.
В исследование были включены 104 небеременных пациенток в
возрасте от
18 до 35 лет, из которых 74 пациентки, страдающие
рецидивирующей ГВИ в течение от двух до десяти лет и ЦМВИ, они
включены в основную группу: 36 пациенток без ПНБ в анамнезе (1
подгруппа) и 38 пациенток с ПНБ в анамнезе (2 подгруппа). Группу
сравнения составили 30 женщин с ПНБ в анамнезе и рецидивирующей ГВИ,
получавшие препараты иммуноглобулинов (внутривенно) с целью лечения
рецидивирующей ГВИ и в качестве предгравидарной подготовки - 30 человек
(2 группа).
Контрольную группу составили 30 практически здоровых доноров –
женщины без ПНБ и без каких либо типичных проявлений ГГ в анамнезе и
лабораторно подтвержденным отсутствием антител классов IgG и IgM к
ВПГ-2 и к ЦМВ, сопоставимые с исследуемыми группами по возрасту.
Все пациенты были обследованы общеклинически и иммунологически до
начала проведения терапии, а также в динамике на фоне проводимого
лечения.
На каждую пациентку заводили специально разработанную карту, в
которую вносили данные анамнеза и обследования, характер проведенного
лечения, динамику состояния пациентки на фоне лечения и его результаты.
Это позволило провести анализ анамнестических данных пациенток: возраст,
социальное положение, наследственность, экстрагенитальная и генитальная
патология, течение герпесвирусной инфекции, характер менструальной и
55
репродуктивной функции, исходы предыдущих беременностей на фоне
носительства хронической смешанной герпесвирусной инфекции.
Клинический диагноз герпетической инфекции ставился на основании
клинической
картины
по
данным
ретроспективного
анамнеза
и
верифицировался при исследовании отделяемого половых путей по
результатам
ПЦР-РВ
и
обнаружению
в
диагностическом
титре
специфических антител к герпесвирусам ВПГ-1 и ВПГ-2, и ЦМВ методом
ИФА.
Возраст обследованных женщин колебался от 18 до 35 лет и в среднем
составил 25,75±3,99 лет, что соответствовало наиболее активному периоду
репродуктивной функции женщин. Распределение пациенток по возрасту
представлено в табл. 3.1., из которой следует, что 86,5% пациенток основной
группы и 90% группы сравнения относились к возрастной категории 21-34
года, что позволило нам считать пациенток всех групп исследования
сопоставимыми по возрасту.
Таблица 3.1.
Распределение пациенток по возрасту в исследуемых группах
Группы обследованных пациенток (n= 134)
Возраст
(лет)
Группа
сравнения
(n=30)
Основная группа (n=74)
Контрольная
группа
(n=30)
18-20
1 подгруппа n=36 2 подгруппа n=38
Абс.
Абс.
Отн.
Абс.
Отн.
(%)
(%)
3
8,3
4
10,5
1
21-24
13
36,1
10
26,3
8
26,7
9
30
25-29
12
33,4
16
42,1
15
50
13
43,3
30-34
7
19,4
6
15,9
4
13,3
5
16,7
Старше 35
1
2,8
2
5,2
2
6,7
1
3,3
Отн.
(%)
Абс.
Отн.
(%)
3,3
2
6,7
Все обследованные пациентки с ПНБ на момент проведения
исследования жалоб не предъявляли. Проводя ретроспективный сбор
анамнеза, было выявлено, что 70 (94,5%) женщин основной группы
56
предъявляли жалобы на зуд, жжение, парестезии в области гениталий.
Пациентки отмечали в области малых и больших половых губ везикулярные
и/или эрозивно-язвенные высыпания различной степени выраженности.
Женщины также указывали на перенесенную лихорадку, общее недомогание,
головную боль, увеличение регионарных лимфоузлов, слабость. У остальных
4 (5,5%) пациенток основной группы были жалобы на обильные бели,
стойкий зуд и жжение вульвы в отсутствие жалоб на характерные высыпания
в области гениталий. Таким образом, мы предположили, что у 94,5%
пациенток, участвовавших в исследовании, ГВИ протекает в типичной
форме, а у 5,5% - в атипичной.
Нами был проведен анализ эпидемиологического анамнеза у пациенток
с ГВИ, представленный в табл. 3.2.
Таблица 3.2.
Эпидемиологическая характеристика обследованных пациенток
Основная группа (n=74)
Показатель
1 подгруппа (n=36) 2 подгруппа (n=38)
Абс.
Отн.(%)
Абс.
Отн. (%)
Длительность
заболевания
(годы)
от 2-х до 4-х лет
от 4-х до 6 лет
от 6-ти до 9 лет
более 9 лет
Длительность
обострения (дни)
Частота
рецидивов в год
Группа
сравнения
(n=30)
Абс.
Отн. (%)
19
9
4
4
52,8
25
11,1
11,1
13
11
9
5
34,2
28,9
23,7
13,2
16
9
4
1
53,3
30
13,3
3,4
4,9±1,9
-
5,5±1,7
-
5,6±1,5
-
2,9±1,1*
-
5,4±1,2
-
5,8±1,3
-
Примечание:
* - достоверность различий р<0,05 при сравнении 1 подгруппы со 2 подруппой и группой
сравнения.
Длительность заболевания (на основании вышеуказанных жалоб) у
пациенток в основной группе колебалась от 2-х до 10 лет: от 2-х до 4-х лет –
32 (43,2%) пациентки, от 4-х до 6 лет – 20 (27%), от 6-ти до 9 лет – 13
57
(17,6%), более 9 лет – 9 (12,2%). В группе сравнения данный показатель был
сопоставим с данными в основной группе. Частота рецидивов ГВИ в год у
пациенток 1 подгруппы
была достоверно ниже, чем у женщин во 2
подгруппе и в группе сравнения.
Все обследованные пациентки проживали в одинаковых климатогеографических условиях, преимущественно в г. Москве и Московской
области, относились к среднему социально-экономическому классу, имели
среднее, среднее специальное или высшее образование.
Анализ профессиональной деятельности показал, что только у одной
пациентки из 2 подгруппы работа была связана с профессиональными
вредностями (химик-лаборант по работе с кислотами в лаборатории НИИ).
Однако, профессии с повышенным риском инфицирования (медицинский
работник, воспитатель детского сада, учитель) были у 45 (43,3%) женщин, в
том числе у 12 (26,7%) женщин в 1 подгруппе, у 27 (60%) женщин во 2
подгруппе, в группе сравнения – 6 (13,3%).
Вредные привычки (курение, злоупотребление алкоголем) были
отмечены у 31 (29,8%) женщины, в том числе у 25 (80,65%) в основной
группе и у 6 (19,35%) женщин из группы сравнения. В целом, 2/3
обследованных женщин не злоупотребляли алкоголем и курением.
Анализ семейного анамнеза и наследственности показал, что частота
выявления
у
родственников
сердечно-сосудистых,
онкологических,
заболеваний, туберкулеза, психических нарушений, генетических пороков не
превышали среднепопуляционные данные. Однако, пациентки в 1 подгруппе
- 9 женщин (25%), и во 2 – 17 (44,7%) и в группе сравнения – 14 (46,7%)
имели
отягощенную
наследственность
по
репродуктивной
функции:
самопроизвольные выкидыши на разных сроках беременности, нарушения
менструальной функции, эндометриоз, доброкачественные опухоли матки и
яичников. Детальный анализ наследственности показал, что достоверно чаще
(р<0,05) у матерей и ближайших родственников пациенток 2 подгруппы
встречалось
самопроизвольное
прерывание
беременности
(34%).
У
58
пациенток в 1 подгруппе и группе сравнения данный показатель составил 8%
и 15% соответственно.
Все пациентки, вошедшие в исследование, имели инфекционновоспалительные
заболевания
в
анамнезе
и
сопутствующую
экстрагенитальную патологию различной степени выраженности, а также
отягощенный акушерско-гинекологический анамнез (Таб. 3.3., 3.4.).
Таблица 3.3.
Инфекционные заболевания, перенесенные обследованными
пациентками
Группы обследованных пациенток (n=134)
Перенесенные
заболевания
ОРВИ
Основная группа (n=74)
1 подгруппа
n=36
Абс.
Отн.
(%)
34
94,5
2 подгруппа
n=38
Абс.
Отн.
(%)
38
100
Группа
сравнения
(n=30)
Контрольная
группа
(n=30)
Абс.
Отн.
(%)
Абс.
Отн.
(%)
29
96,7
28
93,3
Корь
11
30,6
23
60,5*
17
56,7
9
30
Ветряная оспа
21
58,3
29
76,3
19
63,3
19
63,3
Краснуха
22
61,1*
29
76,3
11
36,7
24
80
Инфекционный
паротит
Пневмония
2
5,6#
7
18,4*
4
13,3
1
3,4
4
11,1
5
13,6
4
13,3
3
10
Гайморит
5
13,8#
8
21*
9
30
4
13,7
Коклюш
2
5,6
3
7,9
2
6,7
2
6,7
Грипп
20
55,6*
28
73,7
25
83,3
24
80
Дизентерия
1
2,8
1
2,6
0
0
0
0
Болезнь
Боткина
(гепатит А)
3
8,3#
5
13,6*
1
3,3
1
3,4
Примечание:
* - достоверность различий р<0,05 при сравнении 1 и 2 подгрупп с контрольной группой и
# - с группой сравнения.
59
Из табл. 3.3. следует, что все пациентки в детском и юношеском
возрасте перенесли различные инфекционные и воспалительные заболевания.
Нами выявлено, что большинство пациенток основной группы (94,7%)
перенесли более трёх инфекционных заболеваний в детском и пубертатном
возрасте. ОРВИ перенесли 97,3% пациенток, грипп – 64,9%, краснуху –
68,9%, ветряную оспу – 67,6%, коклюш – 6,8%, корь - 46%, инфекционный
паротит – 12,1%, пневмонию – 12,1%, гайморит – 17,6%, болезнь Боткина
(гепатит А) – 10,8%,
дизентерию – 2,7%. Таким образом, почти каждая
вторая пациентка независимо от группы исследования имела в детстве
ОРВИ,
грипп,
ветряную
оспу,
краснуху,
хронический
тонзиллит.
Аналогичные заболевания были выявлены и в группах сравнения и в
контрольной группе, но в контрольной группе они встречались в достоверно
меньшем проценте случаев (р<0,05). Значительная частота вирусных
инфекций может способствовать снижению защитных механизмов и
обуславливать исходный относительный иммунодефицит у пациенток,
принимавших участие в исследовании.
Данные
о
перенесенных
экстрагенитальных
заболеваниях
представлены в таблице 3.4.
60
Таблица 3.4.
Экстрагенитальные заболевания у обследованных пациенток
Группы обследованных пациенток (n=104)
Нозологическая
форма
Основная группа (n=74)
1 подгруппа
n=36
Абс.
Отн.
(%)
2 подгруппа
n=38
Абс.
Отн.
(%)
Группа
сравнения
(n=30)
Абс.
Отн.
(%)
Контрольная
группа
(n=30)
Абс.
Отн.
(%)
Хронический
23
63,9*
29
76,3*
22
73,3
12
40
гастрит
Язвенная болезнь 1
2,8
3
7,9*/**
1
3,3
1
3,3
желудка и 12 п.к.
Хронический
4
11,1*
9
23,7*
8
26,7
2
6,7
бронхит
Бронхиальная
2
5,6
3
7,9*/**
1
3,3
1
3,3
астма
Синдром
4
11,1*
5
13,2*/**
2
6,7
2
6,7
раздраженного
толстого
кишечника
Хронический
2
5,6
4
10,5*/**
1
3,3
1
3,3
холецистит
Хронический
3
8,3
3
7,9**
0
0
2
6,7
панкреатит
Заболевания ССС 8
22,2*
9
23,7*/**
2
6,7
4
13,3
(ВСД, ПМК)
Хронический
9
25*
14
36,8*
12
40
3
10
пиелонефрит
Мочекаменная
1
2,8
3
7,9*
2
6,7
1
3,3
болезнь
Хронический
7
19,4*
11
28,9*
5
16,7
4
13,3
цистит
Заболевания
6
16,7
9
23,7*/**
4
13,3
4
13,3
щитовидной
железы
Заболевания
3
8,3*
2
5,3
3
10
1
3,3
молочных желез
Черепно-мозговые 2
5,6
1
2,6
0
0
1
3,3
травмы
Железо2
5,6
3
7,9**
6
20
2
6,7
дефицитная
анемия
Примечание:
* - достоверность различий р<0,05 при сравнении 1 и 2 подгрупп с контрольной группой;
** - достоверность различий р<0,05 при сравнении 1 и 2 подгрупп с группой сравнения.
61
Таким образом, из табл. 3.4. следует, что у обследованных женщин
наиболее часто отмечались заболевания желудочно-кишечного тракта,
сердечно-сосудистой
и
мочевыделительной
систем.
При
анализе
сопутствующей экстрагенитальной патологии в основной группе пациенток
хронический гастрит встречался в 70,3%, синдром раздраженного толстого
кишечника в 12,2%, хронический холецистит и хронический панкреатит в
8,1% и 8,1%
соответственно. В основной группе женщин встречалась
патология органов дыхания: хронический бронхит – в 17,6% и бронхиальная
астма – в 6,6%. Сердечно-сосудистые заболевания были отмечены у 23%
пациенток
системы
основной группы. Также заболевания мочевыделительной
были
выявлены:
хронический
пиелонефрит
–
у
31,1%,
мочекаменная болезнь – у 5,4%, хронический цистит – у 24,3% пациенток
основной группы. Патология щитовидной железы встречалась у пациенток в
20,3%, молочных желез в 6,8% случаев. У всех пациенток, как основной
группы, так и группы сравнения наблюдалось сочетанная хроническая
экстрагенитальная патология.
В анамнезе оперативные вмешательства по поводу экстрагенитальной
патологии перенесли 29,7% женщин основной группы и 36,7% из группы
сравнения и 29,5% - из контрольной группы, среди которых - операция
аппендэктомия была произведена у 72,7% пациенток основной и у 61,8%
групп сравнения и у 56% контрольной; тонзиллэктомия - у 18,1%, 10,1% и
9,1%; фиброаденомэктомия - у 9,1%, 6,2% и 5,4% пациенток соответственно.
У
обследованных
женщин
с
рецидивирующей
ГВИ
изучали
становление и функционирование репродуктивной системы. Средний возраст
менархе существенно не отличался, колебался от 10 до 17 лет и у пациенток в
обследованных группах в среднем составил 13,75 ± 1,5 года.
Во 2 подгруппе у 39,8% пациенток с ПНБ в анамнезе было отмечено
позднее наступление менархе (15-17 лет). В 1 подгруппе этот показатель
составил 13,9%. В группе сравнения данный показатель составил 43,2% и
достоверно не отличался от 2 подгруппы. У всех пациенток в контрольной
группе наблюдалось своевременное менархе. Таким образом, у пациенток с
62
ПНБ частота позднего наступления менархе была достоверно (р<0,05) выше,
чем у пациенток из 1 подгруппы и группы сравнения.
В
основной
группе
менструальный
цикл
был
регулярным
длительностью 28-30 дней у 66,2% пациенток, в группе сравнения - у 57,4%,
а в контрольной группе – у 86,7% женщин. Однако, изучая анамнез у
обследованных пациенток, были выявлены нарушения менструального цикла
у женщин с ПНБ во 2 подгруппе: постпонирующий цикл отмечен у 21,1%, в
группе сравнения – 23,3%; меноррагии – в 10,5%, в группе сравнения – 8,7%;
олигоменорея – в 5,3%, в группе сравнения – 6,3%; альгодисменорея – в
13,2%, в группе сравнения – 8,4%; нерегулярные менструации – в 7,9%, в
группе сравнения – 6,3%. В контрольной группе данные показатели были
ниже, но достоверно не отличались.
Начало половой жизни в группах исследования было преимущественно
в возрасте от 15 до 22 лет и в среднем составило 16,2±1,5 лет. Количество
половых партнеров у женщин в 1 подгруппе и в контрольной группе
колебалось от 1 до 3 человек, у женщин во 2 подгруппе и в группе сравнения
- от 2 до 6 человек, при этом у превалирующего числа женщин - 32 (84,2%)
пациентки из 2 подгруппы и у 24 (80,0%) - из группы сравнения сексуальная
жизнь началась до брака. При сборе анамнеза у пациенток 2 подгруппы
удалось выяснить, что у 9 половых партнеров имелись герпетические
высыпания на половом члене, и только у 6 из них проводилось лечение. Рост
сексуально-трансмиссивных заболеваний при недостаточном использовании
мер защиты от инфекции параллелен промискуитету и взаимосвязан с
нарушениями репродуктивной функции.
У обследованных женщин мы проводили ретроспективный анализ
исходов
предыдущих
беременностей.
Исходы
беременностей
у
обследованных женщин представлены в табл. 3.5.
63
Таблица 3.5.
Исходы предыдущих беременностей у обследованных пациенток
Показатели
репродуктивной
функции
Общее количество
беременностей
Роды
срочные
преждевременные
осложненные
Перинатальные потери
антенатальная
гибель плода
интранатальная
гибель плода
Самопроизвольные
выкидыши:
до 12 недель
12-22 недель
1 выкидыш
2 выкидыша
3 выкидыша
Более 3-х выкидышей
Неразвивающаяся
беременность
Эктопическая
беременность
Искусственные аборты
Группы обследованных пациенток (n=104)
Контрольна
Группа
я
Основная группа (n=74)
сравнения
группа
(n=30)
(n=30)
1 подгруппа
2 подгруппа
n=36
n=38
Абс. Отн. Абс. Отн.
Абс. Отн.
Абс.
Отн.
(%)
(%)
(%)
(%)
58
100
161
100
152
100
22
100
43
38
5
7
-
74,1*
88,4*
11,6*
16,3*
-
65
26
39
42
40,3*
40*
60*/**
64,6*/**
71
37
21
13
46,7
52,1
29,6
18,3
17
17
-
77,3
100
-
2
3,1
1
1,4
1,5
59,6*
0
81
0
53,3
-
-
5
8,6*
1
96
5
5
1
8,6*
8,6
1,7
66
3
60
27
9
7
68,7*
31,3
63
28**
9
4,3
65
16
67
10
4
5
80,3
19,7
82,7
12,3
5
3,3
-
-
1
1,7
5
3,1
2
1,3
-
-
8
13,8
28
17,4
22
14,5
5
22,7
Примечание:
* - достоверность различий р<0,05 при сравнении между 1 и 2 подгруппами
** - достоверность различий р<0,05 при сравнении между 2 подгруппой и группой
сравнения.
При анализе нарушений репродуктивной функции у обследованных
пациенток было отмечено, что у женщин 1 подгруппы из общего количества
родов 43 (74,1%), роды были срочными у 38 (88,4%) пациенток. Во 2
64
подгруппе из 65 (40,3%) родов - своевременных было лишь 26 (40%), что
является достоверным показателем при сравнении 1 и 2 подгрупп.
Количество преждевременных родов во 2 подгруппе - 39 (60%) достоверно
выше, чем у женщин в 1 подгруппе - 5 (11,6%), тогда как в группе контроля
их не было вовсе.
Неблагополучные исходы беременности - анте- и интранатальная
гибель плода была в анамнезе у пациенток во 2 подгруппе и в группе
сравнения в небольшом проценте случаев.
Обращает
на
себя
внимание
высокая
частота
невынашивания
беременности у пациенток во 2 подгруппе и в группе сравнения. Известно,
что частота спорадического выкидыша в популяции составляет до 20-25%
[9]. Самопроизвольные выкидыши отмечены у 59,6% женщин во 2 подгруппе
и только в 10,3% случаев в 1 подгруппе. Достоверно чаще самопроизвольное
прерывание беременности у пациенток основной группы происходило на
сроке до 12 недель. У всех пациенток 2 подгруппы было ПНБ, которое в
68,7% случаев закончилось прерыванием беременности в I триместре и в
31,3%
-
во
II
триместре.
Ретроспективный
анализ
количества
самопроизвольных выкидышей выявил, что 2 выкидыша в анамнезе было у
63% пациенток, 3 выкидыша - у 28%, 3 и более выкидыша – у 9%, тогда как в
1 подгруппе у 5 (8,6%) пациенток в анамнезе был 1 выкидыш на сроке до 12
недель, что достоверно меньше, чем у пациенток 2 подгруппы. Кроме того, у
пациенток основной группы и группы сравнения в анамнезе были
неразвивающиеся беременности (3,7% и 3,3%) и внематочные беременности
(2,7% и 1,3%) в небольшом проценте случаев. У пациенток в контрольной
группе данные патологии не были выявлены.
Изучение
особенностей
течения
предыдущих
беременностей
у
пациенток основной группы выявило, что у пациенток 1 подгруппы из 12
беременностей с неблагоприятным исходом (преждевременные роды и
самопроизвольные выкидыши) в 44% случаев имели место угроза
прерывания беременности и клиническая картина начавшегося выкидыша, по
поводу которых женщины проходили неоднократное стационарное лечение
65
для пролонгирования беременности. При сопоставлении данного показателя
с пациентками 2 подгруппы, мы получили, что из 147 беременностей с
репродуктивными
потерями
в
83%
случаях
у
пациенток
были
госпитализации.
Также при сборе анамнеза, женщины указывали на клинические
симптомы
ГВИ
во
время
беременности,
но
определение
титра
специфических антител к группе герпесвирусов во время предполагаемых
обострений ГВИ не проводилось. Данный факт позволил предположить, что
возможной причиной репродуктивных потерь и преждевременных родов у 67
(90,5%) пациенток основной группы было обострение ГВИ во время
беременности на различных сроках. При этом у 43 (64,2%) пациенток на
фоне возможного обострения ГВИ произошел преждевременный разрыв
плодных оболочек. Также мы определили, что только 14% женщин основной
группы перенесли обострение острой респираторной вирусной инфекции во
время беременности, что также могло повлиять на ее неблагоприятный
исход.
Обследуемые пациентки ранее наблюдались и лечились по поводу
различных гинекологических заболеваний (табл. 3.6.).
66
Таблица 3.6.
Генитальная патология у обследованных пациенток
Группы обследованных пациенток (n=104)
Основная группа (n=74)
Генитальная
патология
Миома матки
1 подгруппа
n=36
Абс. Отн.
(%)
5
13,9
2 подгруппа
n=38
Абс.
Отн.
(%)
9
23,7**/#
Группа
сравнения
(n=30)
Контрольная
группа
(n=30)
Абс.
Отн.
(%)
Абс.
Отн.
(%)
7
23,3
2
6,7
Эндометриоз
3
8,3**
11
28,9*
9
30
0
0
Хронический
сальпингоофорит
Хронический
эндометрит
Цервицит
7
19,4
14
36,8#
11
36,7
5
16,7
1
2,8**
6
15,8*
2
6,7
0
0
11
30,5#
14
36,8#
16
53,3
4
13,3
17
47,2
21
55,3
19
63,3
6
20
9
25
15
39,5
14
46,7
6
20
8
22,2
11
28,9
8
26,7
3
10
4
11,1
9
23,7*/#
5
16,7
2
6,7
Рецидивирующий
кольпит
Эктопия шейки
матки
Дисфункция
яичников
Операции на
органах малого
таза
Примечание:
* - достоверность различий р<0,05 при сравнении между 1 и 2 подгруппами;
** - достоверность различий р<0,05 при сравнении 1 и 2 подгрупп с группой сравнения и
# - с контрольной группой.
Таким образом, во 2 подгруппе и в группе сравнения у пациенток с
рецидивирующей ГВИ и ПНБ наиболее часто, по сравнению с 1 подгруппой
и контрольной группой встречались воспалительные заболевания рецидивирующий кольпит, эктопия шейки матки, цервицит, хронические
воспалительные процессы придатков матки.
Терапия пациенток с рецидивирующей ГВИ и ПНБ в анамнезе
представляет определенные трудности, поэтому мы провели анализ методов
лечения, которые применяли пациентки вне беременности при рецидиве
герпетической инфекции и в межрецидивный период. Почти все
67
обследованные женщины в анамнезе использовали медикаментозную
терапию (химиопрепараты, индукторы интерферонов, иммуномодуляторы),
представленную в табл. 3.7.
Таблица 3.7.
Характеристика проводимой медикаментозной терапии герпесвирусной
инфекции у обследованных пациенток
Основная группа (n=74)
Название препарата
1 подгруппа (n=36)
Абс.
Отн. (%)
2 подгруппа (n=38)
Абс.
Отн. (%)
Химиопрепараты (ациклические нуклеозиды, пирофосфаты и др.)
Ацикловир (зовиракс)
36
100
38
100
Валацикловир (валтрекс)
19
52,8
31
81,6
Фамцикловир
22
61,1
29
76,3
Препараты интерферонов
Виферон
34
94,4
38
100
Генферон
27
75
33
86,8
Индукторы интерферона
Циклоферон
11
30,5
19
50
Неовир
6
16,7
41
10,5
Аллокин-альфа
2
5,6
11
28,9
Иммуномодуляторы
Галавит
8
22,2
18
47,4
Полиоксидоний
4
11,1
7
18,4
Препараты иммуноглобулинов для внутривенного введения
Человеческий
иммуноглобулин
Интраглобин Ф
19
52,8
28
73,7
4
11,1
6
15,8
Октагам
2
5,6
5
13,2
Гомеопатические средства
(Антигерпес)
8
22,2
11
28,9
Немедикаментозная
терапия, другие методы
лечения
1
2,8
4
10,5
68
При анализе методов лечения у обследованных пациенток, мы
выявили, что у большинства женщин был комплексный подход в лечении
ГВИ, включавший иммунотерапию в сочетании с противовирусной терапией.
Основное место в противовирусной терапии отводилось ациклическим
нуклеозидам, в первую очередь ацикловиру.
В последние годы появились сообщения, указывающие на возможность
формирования резистентных штаммов ВПГ при использовании ацикловира
[79,
174,
176],
что
обуславливает
возможную
недостаточную
неэффективность различных схем лечения ацикловиром пациенток с
рецидивирующей ГВИ, а также не предотвращает рецидивов ГВИ и не
оказывает существенного влияния на их частоту.
Таким образом, анализ клинической характеристики обследуемых
пациенток с рецидивирующей герпесвирусной инфекцией выявил ряд
значимых факторов, сопутствующих вирусной инфекции и приводящих к
привычным репродуктивным потерям: высокая частота инфекционной и
экстрагенитальной
патологии, хронические воспалительные заболевания
матки и придатков, отягощенный акушерско-гинекологический анамнез:
самопроизвольные выкидыши, преждевременные роды и осложненное
течение предыдущих беременностей.
69
Глава 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННОЙ ФОТОМОДИФИКАЦИИ КРОВИ
У ПАЦИЕНТОК С ХРОНИЧЕСКОЙ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ
ИНФЕКЦИЕЙ В АНАМНЕЗЕ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В
данной
главе
представлены
результаты
экспериментальных
исследований противовирусного эффекта фотодинамической терапии и
результаты клинического применения метода фотосенсибилизированной
фотомодификации крови у пациенток с привычными репродуктивными
потерями в анамнезе на фоне рецидивирующей ГВИ.
Исследование
4.1.
противовирусного
эффекта
фотодинамической
терапии (экспериментальные исследования)
Учитывая, что показания к применению фотосенсибилизированной
фотомодификации крови в гинекологии определены еще не окончательно, а
механизмы, лежащие в основе противовирусного эффекта данного метода,
остаются до конца не ясными, существовала необходимость в проведении
экспериментальной работы в этом направлении. Поэтому первоначально
целесообразно было оценить противовирусный эффект ФДТ in vitro.
Целью экспериментальной работы явилась оценка противовирусного
эффекта ФДТ in vitro непосредственно на вирус простого герпеса (ВПГ) и на
вирус инфицированные клетки, а также отработка оптимальных условий для
реализации фотодинамического эффекта с использованием нетоксичного
фотосенсибилизатора
на
примере
ФС
«Фотодитазин»,
и
изучение
противовирусных механизмов ФДТ на примере герпетической инфекции.
Для выполнения поставленной цели нами был сформулирован ряд
задач:
1. Оценить прямой эффект препарата ФС «Фотодитазин» (в комплексе с
лазерным облучением) на вируссодержащую жидкость (ВПГ-1 и ВПГ-2
типов).
70
2. Изучить действие ФДТ на культуру клеток, не инфицированную и
инфицированную ВПГ-1 и ВПГ-2.
3.
Оценить
пролиферацию
и
гибель
клеток
при
исследовании
цитотоксического действия ФДТ с ФС «Фотодитазин» in vitro на модели
герпес-вирусной инфекции ВПГ- 1 (опосредованное действие).
Определение
цитотоксического
действия
лазерного
излучения
и
препарата фотосенсибилизатора на культуру клеток
При исследовании цитотоксического действия лазерного излучения и
препарата фотосенсибилизатора на культуру клеток проводился подбор дозы
лазерного облучения и дозы препарата фотосенсибилизатора.
Сначала проводился подбор оптимальной дозы лазерного излучения.
Для этого образцы культуры клеток по 200 мкл были распределены на
плашке. Все образцы были облучены изолированно друг от друга лазерным
светом в дозах 0,285, 0,57, 1,8, 3,42, 10,62 Дж/см2. Затем после облучения
были помещены на 24-часовой монослой клеток. Инкубацию культуры
клеток проводили при температуре +37ºC в атмосфере 5% СО2 в течение 48
часов. Монослой культуры клеток анализировался на световом микроскопе.
Было установлено, что максимальная доза лазерного облучения, при которой
не наблюдалось значительных изменений в культуре клеток, составила 1,8
Дж/см2. При других дозах лазерного облучения (3,42 Дж/см2 и 10,62 Дж/см2)
наблюдалась деградация клеточного монослоя.
Затем проводился подбор оптимальной нетоксичной концентрации
препарата
ФС,
при
которой
изменения
в
культуре
клеток
были
незначительными. Для эксперимента были взяты разведения препарата ФС в
концентрациях 0, 10, 25, 50, 100, 200 мкг/мл (табл. 4.1.), которые были
добавлены в пробирки с культурой клеток в объеме 200 мкл в условиях
темноты. Последовательно после инкубации препарата ФС в культуре клеток
в
течение
30
минут
проводилось
лазерное
облучение
образцов
экспериментальными дозами облучения 0, 0,285, 1,8, 3,42 Дж/см 2.
Инкубацию культуры клеток проводили при температуре +37ºC в атмосфере
71
5% СО2 в течение 48 часов. Анализ монослоя культуры клеток проводился
при световой микроскопии. Было получено, что при концентрации ФС 100 и
200 мкг/мл наблюдалась полная деградация клеток, следовательно, такие
концентрации губительны для культуры клеток. Дозы лазерного облучения
никак не влияли на полученный результат.
Таблица 4.1.
Жизнеспособность клеток Vero (%) после воздействия ФС и лазерного
облучения
Доза лазерного
облучения Дж/см2
Концентрация ФС «Фотодитазин» мкг/мл
0
10
50
100
0
100*
87,5
25
25
0,285
100
87,5
25
25
1,8
100
75
25
25
3,42
100
50
25
25
* - в таблице % живых клеток в образцах
Были определены оптимальные дозы лазерного облучения и препарата
ФС, при которых значительных изменений в культуре клеток не наблюдалось
(Рис.4.1.А,Б.). На Рис. 4.1.В,Г. представлено токсическое действие ФС на
культуру клеток.
72
А. концентрация ФС 0 -10 мкг/ мл
А
.
к
о
н
ц
е
н
т
р
а
ц
и
я
Ф
С
м
к
г
м
л
В. концентрация ФС 100 мкг/ мл
В
.
к
о
н
ц
е
н
т
р
а
ц
и
я
Ф
С
м
к
г
м
л
Б. концентрация ФС 50 мкг/ мл
Б
.
к
о
н
ц
е
н
т
р
а
ц
и
я
Ф
С
м
к
г
м
л
Г. концентрация ФС 200 мкг/мл
Г
.
к
о
н
ц
е
н
т
р
а
ц
и
я
Ф
С
м
к
г
м
л
Рис. 4.1. Изучение токсического действия ФС «Фотодитазин» на культуру
клеток в зависимости от концентрации препарата (А,Б - оптимальные дозы
лазерного облучения и ФС); (В,Г - токсическое действие ФС на культуру
клеток).
При концентрации ФС 10 мкг/мл были незначительные изменения в
культуре клеток, поэтому можно считать эту концентрацию и выбранную
экспериментальную дозу облучения - 1,8 Дж/см2 условно оптимальными для
последующих экспериментов.
Оценка прямого эффекта ФДТ на вируссодержащую жидкость
(ВПГ-1 и ВПГ-2 типов)
На первом этапе работы был проведен анализ прямого эффекта
препарата ФС «Фотодитазин» (в комплексе с лазерным облучением) на
вируссодержащую
жидкость
ВПГ-1
и
ВПГ-2.
Схема
проведения
эксперимента представлена на рис.4.2.
73
Предварительная
инкубация до
облучения
HSV I
Инкубация после
облучения
0ч
30 мин
+
1,5 ч
ВПГ 1 тип
Лазерное облучение
Концентрации раствора
ФС 0, 10, 20, 50, 100, 200
мкг/мл
Определение
титра вируса
и цитопатического
действия ВПГ-1
Инкубация в термостате
при Т +37ºC
в атмосфере
5% CO2 в течение 7 дней
0ч
1ч
3ч
Культура
клеток Vero
Рис. 4.2. Оценка прямого эффекта ФДТ на вируссодержащую жидкость
(ВПГ-1 и ВПГ-2 типов).
В данном эксперименте использовали образцы препарата ФС в таких
же концентрациях, как и в эксперименте по подбору оптимальной дозы ФС.
В эти образцы была добавлена вируссодержащая жидкость ВПГ-1 и ВПГ-2.
Часть образцов была незамедлительно облучена лазерным светом в
оптимальной дозе, полученной ранее - 1,8 Дж/см2. Другие группы образцов
были облучены позже той же дозой после предварительной инкубации,
которая составила 30 и 90 минут соответственно. После облучения часть
образцов сразу же была перенесена на 24-часовой монослой культуры
клеток. Другие образцы были вторично инкубированы в течение 1-го и 3-х
часов. Затем также все образцы были перенесены на 24-часовой монослой
культуры клеток. В качестве ростовой среды применяли питательную среду
DMEM с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки. Инкубацию
культуры клеток проводили при Т +37ºC в атмосфере 5% СО2 в течение 7
дней. Вирусингибирующую активность фотодинамического воздействия на
ВПГ-1 и ВПГ-2 оценивали по ингибированию их цитопатического действия в
74
культуре
клеток.
Цитопатическое
действие
вируса
выражали
в
цитопатических дозах (lg ТЦД50/мл).
В
результате
эксперимента
было
получено,
что
оптимальная
концентрация ФС составила не более 50 мкг/мл и доза лазерного облучения
1,8 Дж/см2. Оптимальные условия эксперимента - соблюдение инкубации до
и после облучения не менее 30 минут. Вирус ВПГ-1 был инактивирован
препаратом ФС после лазерного облучения и на фоне инкубации до и после
облучения в концентрациях от 50 до 200 титр ВПГ-1 составил >1 ТЦД50 /0,1
мл. Дозы ФС более 50 мкг/мл приводили к снижению титра вируса ВПГ-1 в
1000 и более раз (1,5-2,5 порядка). При анализе прямого эффекта препарата
ФС
«Фотодитазин»
в
комплексе
с
лазерным
облучением
на
вируссодержащую жидкость ВПГ-2 было получено, что дозы ФС более 50
мкг/мл приводили к снижению титра вируса ВПГ-2 в 10 и более раз (1,5
порядка) несмотря на то, что ВПГ-2 дает ЦПД медленнее.
Титр ВПГ-2
составил > 0,5-1 ТЦД50 /0,1 мл.
Учитывая внутриклеточное расположение вируса простого герпеса,
необходимо изучение фотодинамического воздействия на культуру клеток,
инфицированную ВПГ.
Анализ опосредованного эффекта после фотодинамического воздействия
на культуру клеток Vero, инфицированную ВПГ-1 и ВПГ-2
Для
изучения
механизмов
фотодинамического
воздействия
на
инфицированную ВПГ культуру клеток и изучения опосредованных
эффектов
после
определенная
фотодинамического
схема
проведения
воздействия
была
разработана
экспериментов
(Рис.4.3.).
Экспериментальный титр ВПГ-1 составлял 6,0 ТЦД50/0,1мл, а ВПГ-2 – 4,5
ТЦД50/0,1мл.
Проводили инфицирование культуры клеток Vero ВПГ-1 (дозы
заражения 6,0, 5,0, 4,0 ТЦД50/0,1мл) и ВПГ-2 (дозы заражения 4,5, 3,5, 2,5
ТЦД50/0,1мл).
Затем
в
полученную
систему
вводили
раствор
ФС
«Фотодитазин» в концентрациях 1 и 10 мкг/мл и осуществляли лазерное
75
облучение в дозе 1,8 Дж/см2. Также изменяли время инкубации до и после
облучения, которое составило 0 и 30 мин. Были подобраны оптимальные
условия,
при
которых
был
реализован
противогерпетический
фотодинамический эффект in vitro (концентрация ФС «Фотодитазин» 10
мкг/мл, оптимальная доза лазерного облучения 1,8 Дж/см2 (время облучения
30 сек), оптимальные условия экспериментов соблюдение инкубации до и
после облучения не менее 30 мин).
Предварительная
инкубация 30 мин
+
+
Культура клеток
Vero
Фотосенсибилизатор
«Фотодитазин»
Лазерное облучение
10 мкг/мл
1,8 Дж/cm2
ВПГ-1
Инкубация после
облучения 30 мин
Оценка результата после инкубации
Рис. 4.3. Оценка опосредованного действия ФДТ на вирусы (ВПГ 1 и 2 типа)
Затем было изучено комплексное воздействие лазерного облучения и ФС на
культуру клеток, инфицированных ВПГ-1 и ВПГ-2 после ее раститровки, т.е.
на «потомство» вновь продуцируемого вируса. Нами было получено, что
после раститровки культуральной жидкости в образцах, не подверженных
обучению и действию препарата ФС, определяли цитопатическое действие
вируса, титр которого составил 2-3 ТЦД50/0,1 мл в зависимости от исходного
разведения
вируссодержащего
материала.
Под
действием
лазерного
облучения титр вновь продуцируемого вируса снижался на 1 ТЦД50 /0,1 по
сравнению с контрольными образцами. Таким образом, доза облучения 1,8
Дж/см2 обладает противогерпетическим действием. Препарат ФС (без
воздействия
лазерного
облучения)
обладает
противогерпетическим
действием, при этом титр «вирусного потомства» снижается на 2 ТЦД 50/0,1.
При комплексом воздействии лазерного облучения и ФС на культуру клеток,
76
инфицированных ВПГ-1, титр вновь продуцируемого вируса снижался более,
чем на 2 ТЦД50/0,1 (т.е. в 100-1000 раз). Под действием лазерного облучения
в сенсибилизированных образцах с оптимальной концентрацией ФС 10
мкг/мл и наименьшей концентрацией вновь продуцируемого вируса 4,0
ТЦД50/0,1мл наблюдалось 25% ЦПД с применением инкубации до и после
облучения, т.е. титр вновь продуцируемого вируса снижался на 2 ТЦД 50/0,1.
В таких же образцах без предварительной инкубации ЦПД составило 50%,
т.е. в эксперименте с 30 минутной инкубацией после действия ФС (до
действия лазерного облучения) на систему «вирус-клетка» титр ВПГ-1
достоверно снижался, но не столь значимо, как в экспериментах без
инкубации (1 ТЦД50/0,1) (Таб. 4.2.).
Таблица 4.2.
Противовирусное действие на вновь образовавшийся ВПГ-1 после
воздействия ФС «Фотодитазин» без лазерного облучения и после
фотодинамического воздействия на инфицированную ВПГ-1 культуру клеток
(инкубация образцов до и после облучения 30 минут)
Образцы без облучения
Концентрация ФС «Фотодитазин» мкг/мл
в культуре клеток
4,0 ТЦД50/0,1мл
5,0 ТЦД50/0,1мл
6,0 ТЦД50/0,1мл
0
3,75
3,25
3,5
1
3,5*
3,5*
3,25*
10
3,5*
3,25
3,0*
Концентрация вируса ВПГ-1
Образцы после облучения
Концентрация ФС «Фотодитазин» мкг/мл
в культуре клеток
4,0 ТЦД50/0,1мл
5,0 ТЦД50/0,1мл
6,0 ТЦД50/0,1мл
0
3,25
3,25
3,0
1
3,0*
3,0*
2,75*
10
2,75*
2,75*
2,5*
Концентрация вируса ВПГ-1
Примечание:
* - достоверность различий р<0,05 при сравнении между показателями в группах со
значением исходного титра
77
Титр вновь продуцируемого вируса ВПГ-1 после фотодинамического
воздействия с ФС «Фотодитазин» in vitro на модели герпес-вирусной
титр вновь продуцируемого вируса (ТЦД50/0,1мл)
инфекции ВПГ- 1 отражен на графике (Рис. 4.4.).
3,5
3
концентрация
вируса
2,5
исход.
2
0,1 исход
0,01 исход
1,5
*
1
*
** * **
0,5
0
контроль ВПГ-1
ВПГ-1+Л.О.
ВПГ-1+ФС
ВПГ-1+ФС+Л.О.
ВПГ-1+ФС
(30мин) +Л.О.
Примечание:
По оси ординат – титр вновь продуцируемого вируса (ТЦД50/0,1мл);
по оси абсцисс – модификации экспериментов
Значения столбцов:
1. контроль ВПГ-1
2. культура клеток, инфицированная ВПГ-1 при воздействии лазерного облучения
3. культура клеток, инфицированная ВПГ-1 после введения фотосенсибилизатора
4. культура клеток, инфицированная ВПГ-1 при фотодинамическом воздействии и
соблюдении инкубации в течение 30 мин до и после облучения
5. культура клеток, инфицированная ВПГ-1 при фотодинамическом воздействии и
соблюдении только первичной инкубации до облучения
* - р<0,05 уровень значимости различий по критерию Стьюдента по сравнению с
контрольной группой с исходной концентрацией ВПГ-1
** - р<0,05 уровень значимости различий по критерию Стьюдента по сравнению с
контрольной группой с концентрацией ВПГ-1 0,01
Рис. 4.4. Оценка пролиферации и гибели клеток при исследовании
цитотоксического действия ФДТ с ФС «Фотодитазин» in vitro на модели
герпес-вирусной инфекции ВПГ- 1
78
Результаты по ВПГ-2, полученные в данной схеме эксперимента при
соблюдении таких же условий, показали достоверное снижение титра вируса
на полтора порядка (в 10 и более раз) [Рис. 4.5.].
ВПГ-1
ВПГ-2
ВПГ-1 + ФДТ
ВПГ-2 + ФДТ
Рис. 4.5. Цитопатическое действие ВПГ после ФДТ в культуре клеток
Таким образом, в проведенной экспериментальной работе по оценке
эффективности фотодинамических воздействий на ВПГ использовалась
разработанная
схема
эксперимента
для
определения
прямого
и
опосредованного действия ФДТ на вирус, на инфицированную ВПГ-1 и ВПГ2 культуру клеток Vero, на потомство вновь продуцируемого вируса in vitro.
Одновременное использование всех трех подходов необходимо для оценки
механизмов противогерпетического действия ФДТ, которые заключаются в
действии представленной терапии. Полученные данные в дальнейшем,
возможно, помогут подобрать адекватную схему ФДТ для пациентов с
рецидивирующим течением герпесвирусной инфекции.
79
Таким образом, нами впервые был получен противогерпетический
эффект фотодинамического воздействия в культуре клеток с использованием
препарата ФС на основе хлорина Е6. В доступной нам литературе мы не
нашли сведений об использовании производных хлорина Е6 («Фотодитазин»)
для фотодинамического ингибирования герпесвирусной инфекции. Известно,
что у оболочечных вирусов после обработки их рядом ФС и облучения
светом видимого диапазона или лазерным светом происходит разрушение
оболочки [108, 172]. Хлорины, как и другие ФС, при поглощении кванта
света генерируют синглетный кислород и образование свободных радикалов,
которые окисляют клеточные компоненты, и, возможно, компоненты
мембраны вируса, вызывая гибель клеток и повреждение внутри- и
внеклеточных
вирусных
исследований
определены
частиц.
В
результате
условия
проведенных
вирусингибирующего
нами
эффекта
фотодинамического воздействия на культуру клеток, инфицированную ВПГ
1 и 2 типов, при использовании ФС «Фотодитазин». Несмотря на
экспериментальное обоснование противогерпетической ФДТ, это попытка
исследования
механизмов
противовирусной
ФДТ.
Исследования
продолжаются в этом направлении. У разработанной нами схемы проведения
эксперимента по противовирусной ФДТ на примере герпесвирусной
инфекции существует практический выход: возможное изучение точек
действия ФС при фотодинамическом воздействии на вирус герпеса
(механизм действия ФДТ на вирус); на созданной модели могут быть
изучены
механизмы
действия
других
ФС
при
моделировании
фотодинамической терапии герпесвирусной инфекции.
Таким образом, полученные результаты способствуют дальнейшему
изучению противогерпетических механизмов ФДТ на модели in vitro и
открывают
подходы
для
разработки
фотодинамической
терапии
герпесвирусной инфекции in vivo, а также для разработки метода лечения
хронической герпесвирусной инфекции, в том числе и у пациенток с ПНБ в
анамнезе. Данный метод может быть использован как в комбинированной
80
терапии хронической герпесвирусной инфекции, так и как отдельный метод
лечения.
Отдельновой О.Б. и соавт. при исследовании фармакокинетики,
спектральных свойств и лечебной активности ФС «Фотодитазин» на
животных моделях NMRI и CBA с Карциномой Эрлиха, был выявлен
иммунологический феномен ФДТ в эксперименте, который заключался в
иммунологическом ответе организма на фотоповреждение клеток и тканей
[94].
Фотосенсибилизированная стимуляция иммунных реакций была
связана с фотомодификацией иммунокомпетентных клеток (повышение
продукции ФНО-α, увеличение количества NK-клеток) крови во время
облучения опухоли и экспрессией на поверхности клеток опухольассоциированных антигенов. Полученные результаты стали предпосылками к
проведению нами клинического этапа научной работы.
4.2. Терапия рецидивирующей герпесвирусной инфекции методом
фотосенсибилизированной фотомодификации крови
Фотосенсибилизированная ФМК была проведена 22 пациенткам с
рецидивирующей ГВИ после клинико-лабораторного обследования.
Показаниями к проведению фотосенсибилизированной ФМК явились
стойкий характер рецидивирующей ГВИ и ПНБ в анамнезе, неэффективность
противовирусной терапии. К началу курса лечения общее состояние всех
обследованных пациенток оценивалось как удовлетворительное, течение
экстрагенитальной
патологии
по
данным
клинико-лабораторного
обследования было в стадии ремиссии.
Первоначально на первом этапе процедуры фотосенсибилизированной
ФМК проводилось внутривенное струйное введение ФС «Фотодитазин» в
дозе 1 мл (концентрация 0,5 мг/мл) в разведении на физиологическом
растворе. Переносимость препарата у большинства пациенток была хорошая.
На втором этапе через 5-10 мин. после инъекции проводили транскутанное 8минутное облучение крови лазерным излучением. Лазерное световое
воздействие осуществляли на область мочки уха без применения анестезии.
81
Во время проведения процедур обострений экстрагенитальной патологии не
отмечалось. Полный курс фотосенсибилизированной ФМК составил 8
процедур. Процедура проводилась амбулаторно согласно графику 1 раз в 3
дня.
Во всех случаях применения фотосенсибилизированной ФМК был
отмечен положительный клинический эффект.
4.3.
Оценка
показателей
клинико-лабораторного
мониторинга
обследованных пациенток при проведении фотосенсибилизированной
фотомодификации крови
На фоне проводимой терапии в динамике осуществлялся клиниколабораторный мониторинг всех пациенток для оценки влияния данного
метода
лечения
на
состояние
всего
организма.
Эффективность
фотосенсибилизированной ФМК оценивали по клиническим данным,
лабораторному
мониторингу:
коагулограмме,
изменениям
биоценоза
влагалища (по данным бактериологического посева из цервикального канала
и
ПЦР-диагностике),
анализу
титра
специфических
антител
в
периферической крови, показателям цитокинового профиля.
4.3.1. Объективная оценка жалоб пациенток (побочных эффектов) на фоне
ФМК
Нами проведена оценка жалоб (побочных эффектов), которые
предъявляли пациентки, как во время, так и после проведения процедуры.
Пациентки жаловались на гиперемию и зуд в области облучения, отмечали
невыраженную гипотензию и брадикардию до 50 ударов в минуту, а также
головную боль после процедуры; у некоторых женщин в месте введения
препарата была отмечена аллергическая реакция (гиперемия, незначительная
инфильтрация и отек); у 6 пациенток было повышение температуры тела до
37,2-37,6ºС через 2 часа после первой процедуры. Весь спектр жалоб,
встречавшихся у пациенток на фоне проведения терапии, и их частота
представлены на рис. 4.6.
82
Рис.
4.6.
Частота
жалоб
пациенток
на
фоне
проведения
фотосенсибилизированной ФМК
зуд в области облучения
25,7%
33,8%
10,8%
гиперемия области
облучения
гипотензия
брадикардия
8,1%
14,9%
головная боль
21,6%
аллергические реакции в
месте введения ФС
повышение Т тела
5,4%
После появления жалоб у пациенток проводился клинико-лабораторный
мониторинг (клинический анализ крови, общий анализ мочи) в режиме citoдиагностики, при котором выраженных изменений ни у одной пациентки
выявлено не было, что не потребовало госпитализации в стационар.
4.3.2. Показатели гемостаза у пациенток с рецидивирующей ГВИ на фоне
проведения фотосенсибилизированной ФМК
Известно, что вирусная инфекция является одним из пусковых
факторов, участвующих в патогенезе заболеваний, связанных с нарушениями
в системе гемостаза [23, 130]. Вирусы простого герпеса обладают прямым
повреждающим действием на эндотелий сосудов, приводят к запуску
цитокинового каскада с преобладанием медиаторов провоспалительного
действия, которые также вызывают повреждение эндотелия. На этом фоне
развиваются нарушения в системе свертывания крови [168]. Поэтому был
интерес проанализировать показатели коагулограммы у пациенток с ГВИ.
Результаты
исследования
системы
гемостаза
у
обследованных
и
проходивших терапию пациенток представлены в табл. 4.3.
83
Таблица 4.3.
Показатели системы гемостаза у пациенток с ГВИ в динамике на фоне
терапии фотосенсибилизированной ФМК
Группы обследованных пациенток (n= 102)
Основная группа (n=74)
Параметры
1 группа (n=36)
2 группа (n=38)
Контрольная
группа
(n=30)
Норма
2,4±0,5
2-4
до ФМК
3,9±0,1*/#
после ФМК
3,14±0,2#
до ФМК
4,47±0,4*/#
после ФМК
3,5±0,5#
Протромбиновый
индекс (ПТИ) (%)
МНО
95,6±1,6#
93,8±0,5#
103,4±3,4*/#
95,9±1,9#
94,0±1,2
93-107
0,96±0,1
0,91±0,14
1,04±0,13
0,89±0,08
0,87±0,09
0,8-1,15
АЧТВ (сек)
27,7±2,3
25,0±0,8
34,6±1,1*/#
26,4±2,0#
25,4±1,0
24-35
Фибриноген (г/л)
Примечание:
* - достоверность различий р<0,05 при сравнении данных до ФМК между основной и
контрольной группами;
# - достоверность различий р<0,05 при сравнении данных до и после ФМК между собой в
группах.
Представленные
данные
показателей
гемостаза
до
начала
терапии
свидетельствуют о наличии незначительной гиперкоагуляции и повышенной
функции тромбоцитов у пациенток основной группы. В динамике при
сравнении показателей в группах до ФМК и после последней процедуры
было отмечено достоверное (р<0,05) снижение содержания фибриногена и
ПТИ у пациенток в основной группе, а также достоверное снижение АЧТВ у
женщин во 2 подгруппе. Таким образом, у пациенток 1 и 2 подгрупп
отмечалась тенденция к нормализации показателей коагулограммы.
Достоверных различий показателя МНО в системе свертывания крови у
пациенток основной группы в сравнении с контрольной группой и нормой
нами не выявлено.
4.3.3. Характер микрофлоры влагалища у пациенток обследуемых групп при
фотосенсибилизированной ФМК
При лабораторном мониторинге пациенток основной и контрольной
групп было проведено бактериологическое исследование микробиоценоза
влагалища. Мы проанализировали состав вагинального содержимого, взятого
из цервикального канала, до и после проведения фотосенсибилизированной
84
ФМК (табл. 4.4.). Нами получен широкий спектр видовой принадлежности
микроорганизмов, что подтверждает мнение большинства исследователей о
роли сочетанной урогенитальной инфекции в генезе ПНБ [74, 96, 124, 130].
Таблица 4.4.
Результаты бактериологического исследования содержимого влагалища
до фотосенсибилизированной ФМК
Группы обследованных пациенток (n= 102)
Параметры
Контрольная
группа (n=30)
Основная группа (n=74)
1 подгруппа
(n=36)
Абс.
%
2 подгруппа
(n=38)
Абс.
%
Абс.
%
Staphylococcus epidermidis
12
33,3*
19
50*
21
70
Staphylococcus aureus
5
13,9
10
26,3*
4
13,3
Streptococcus β-hemolytic
13
36,1*
21
55,3*
5
16,7
Bacteroides sp.
11
30,6
34
89,5*
9
30
Peptostreptococcus sp.
18
50*
29
76,3*
6
20
Corynebacterium
7
19,4
6
15,8
4
13,3
Enterobacterum sp.
5
13,9
4
10,5
0
0
Candida albicans
3
8,3
7
18,4*
1
3,3
Gardnerella vaginalis
16
44,4*
22
57,9*
1
3,3
Lactobacillus sp.
7
19,4*
6
15,8*
30
100
Bifidobacterium sp.
2
5,6*
0
0
19
63,3
Примечание:
* - достоверность различий р<0,05 при сравнении между основной и контрольной
группами.
Оценка микробного состава выявила, что у пациенток основной группы
наиболее часто встречались анаэробные микроорганизмы (гарднереллы,
пептострептококки и бактероиды), при этом количество лактобактерий и
бифидобактерий было снижено по сравнению с контрольной группой, где
доминировали молочнокислые бактерии. Был проведен сравнительный
анализ частоты выявления разных видов условно патогенной микрофлоры у
пациенток с ПНБ и без НБ. Достоверно реже у пациенток без ПНБ
85
встречались β-гемолитический стрептококк, бактероиды, пептострептококки,
грибковая инфекция рода кандида.
При анализе микробиоценоза влагалища после завершения курса
процедур
фотосенсибилизированной
ФМК
достоверных
различий
и
изменений в составе микрофлоры у пациенток получено не было.
Также у обследованных пациенток была проведена ПЦР-диагностика
соскоба из цервикального канала на урогенитальную инфекцию, как до
начала курса лечения, так и после его завершения. В результате
проведенного обследования была выявлена персистенция ИППП в основной
группе до начала терапии (табл. 4.5.).
Таблица 4.5.
Частота ИППП, выявленных при ПЦР-диагностике
Группы обследованных пациенток (n= 102)
Параметры
Контрольная
группа (n=30)
Основная группа (n=74)
1 подгруппа
(n=36)
Абс.
%
2 подгруппа
(n=38)
Абс.
%
Абс.
%
Herpes virus hominis тип 2
0
0
38
100
0
0
Cytomegalovirus
29
80,6
32
84,2
0
0
Trichomonas vaginalis
1
2,8
2
5,3
0
0
Mycoplasma hominis
2
5,6
5
13,2*
2
6,7
Mycoplasma genitalium
6
16,7
7
18,4
0
0
Ureaplasma urealyticum
7
19,4
10
26,3*
4
13,3
Candida albicans
4
11,1*
7
18,4*
1
3,3
Gardnerella vaginalis
16
44,4*
24
63,2*
2
6,7
Clamydia trachomatis
3
8,3
9
23,7
0
0
Примечание:
* - достоверность различий р<0,05 при сравнении между основной и контрольной
группами.
Спектр сопутствующей урогенитальной микрофлоры у пациенток 1 и 2
подгрупп различался: у женщин без ПНБ вирус простого герпеса 2 типа не
86
был обнаружен ни у одной пациентки, при этом во 2 подгруппе у женщин с
ПНБ в анамнезе ВПГ-2 был выявлен у 38 (100%) пациенток. Процент
обнаружения ЦМВ-инфекции у пациенток 1 и 2 подгрупп достоверно не
отличался. При анализе бактериальной микрофлоры цервикального канала у
пациенток 2 подгруппы достоверно чаще по отношению к 1 подгруппе
преобладали Gardnerella vaginalis (63,2%), Clamydia trachomatis (23,7%).
Полученные результаты свидетельствуют о существовании дисбиотических
процессов в микроэкосистеме влагалищного тракта у пациенток 2 подгруппы
с ПНБ на фоне ГВИ. Следовательно, длительной персистенции вирусной
инфекции, способствуют изменения состава вагинального микроценоза,
результатом которого являются изменения локального иммунитета.
После проведенной терапии мы вновь оценивали характер выявляемых
возбудителей при ПЦР-диагностике. Нам не удалось выявить какой-либо
значимой и достоверной разницы по данным возбудителей ИППП после
завершения курса лечения.
4.3.4. Анализ динамики титров специфических иммуноглобулинов класса G
против ВПГ-2 и ЦМВ на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК у
пациенток с рецидивирующей ГВИ
Первоначально для диагностики клинического варианта течения
герпесвирусной инфекции у пациенток исследуемых групп было проведено
определение в крови антител классов IgG и IgМ к ЦМВ и ВПГ 1 и 2 типов
методом ИФА (Рис. 4.7.).
87
132,4
140
120
97,6
100
80
1 группа
43,2
60
2 группа
26,8
40
0
20
6,5
0
Ig G ЦМВ
Ig G ВПГ-1
Ig G ВПГ-2
0,74
0,67
0,8
0,7
0,53
0,6
0,5
0,34
0,35
1 группа
0,4
2 группа
0,3
0,2
0
0,1
0
Ig M ЦМВ
Ig М ВПГ-1
Ig M ВПГ-2
Рис. 4.7. Анализ титров специфических иммуноглобулинов классов G и M
против ЦМВ, ВПГ 1 и 2 типов до начала терапии.
На представленной гистограмме средние значения IgG к ЦМВ в
основной группе колебались от 97,6 до 132,4 IU/ml (при нормативных
показателях от 0 до 15 IU/ml), к ВПГ-1 от 26,8 до 43,2 IU/ml, к ВПГ-2 во
второй группе не более 6,5 IU/ml (при нормативных показателях от 0 до 1,1
IU/ml). Средние показатели IgM к ЦМВ, ВПГ-1 и ВПГ-2 не превышали 0,74
IU/ml (при норме до 1,1 IU/ml).
Таким образом, было установлено, что по клиническому течению у
пациенток основной группы на момент проведения исследования была
выявлена рецидивирующая герпесвирусная инфекция, вне обострения
(наличие антител IgG к ВПГ (у пациенток основной группы) и эпизодов ГГ в
анамнезе (у пациенток 2 подгруппы с ПНБ)). Первичных эпизодов первичной
ГВИ у обследованных пациенток выявлено не было.
88
С целью изучения влияния фотосенсибилизированной ФМК на
динамику титра специфических антител крови нами был проведен анализ
титров специфических иммуноглобулинов класса G против ВПГ-2 и ЦМВ до
и после терапии фотосенсибилизированной ФМК. Было выявлено, что титры
иммуноглобулинов IgG к ВПГ-2 и к ЦМВ достоверно не менялись на фоне
проводимой терапии у пациенток обоих групп. Результаты представлены на
графиках (Рис. 4.8.).
Анализ тиров антител Ig G к ВПГ-2
10
IU/ml
8
6
1 группа
4
2 группа
2
0
до терапии
через 1 час
через 1 сутки
через 10 дней после терапии
временные точки забора крови
Анализ титров антител Ig G к ЦМВ
10
IU/ml
8
6
1 группа
4
2 группа
2
0
до терапии
через 1 час
через 1 сутки
через 10 дней после терапии
временные точки забора крови
Рис. 4.8. Динамика титров иммуноглобулинов IgG к ВПГ-2 и к ЦМВ на фоне
фотосенсибилизированной ФМК у пациенток с ГВИ
Таким
образом,
иммуноглобулинов
исследование
класса
динамики
G
для
титров
оценки
специфических
эффективности
фотосенсибилизированной ФМК не информативно.
89
4.4. Анализ экспрессии гена ФНО-α при фотосенсибилизированной
фотомодификации крови у обследованных пациенток
У всех пациенток на фоне проведения терапии проводили забор
периферической крови: до процедуры; через 1 час после процедуры; через 1
сутки после процедуры; после 3-й процедуры (9-10 сутки) и после
завершения
курса
иммунологических
лечения
показателей,
(18-20
как
сутки)
объективных
для
исследования
критериев
оценки
эффективности проводимой терапии.
При НБ на фоне ГВИ большое значение имеет ряд цитокинов,
выработка которых стимулируется инфекционными, в том числе и
вирусными антигенами. Существует ряд цитокинов, имеющих особый
интерес в связи с тем, что они актуальны для изучения и служат маркерами
осложнений беременности [19,21]. Цитокиновый профиль при ПНБ на фоне
ГВИ и лечении фотосенсибилизированной ФМК не изучен.
Для изучения воздействия проводимой терапии на иммунную систему
пациенток мы провели комплексное определение экспрессии гена ФНО-α в
мононуклеарных клетках периферической крови, а также определение
уровня провоспалительного цитокина ФНО-α в сыворотке крови.
Фактор некроза опухолей (ФНО-α) - мультипотентный модулятор
иммунного ответа, участвует в воспалительных реакциях, играет важную
роль в осуществлении реакций врожденного иммунитета [18]. Известно, что
уровень ФНО-α коррелирует с тяжестью течения инфекционного процесса
[18, 42], что позволяет использовать его в качестве диагностического
критерия, в том числе и при ГВИ. По данным ряда авторов показано, что
повышенная продукция ФНО-α - один из фактов, способствующих ПНБ [57].
К примеру, при повышении уровня ФНО-α при апоптозе клеток плаценты,
оценка уровня ФНО-α у пациенток с ПНБ в ранние сроки беременности
необходима особенно на фоне ГВИ [74, 113, 121].
Результаты определения экспрессии гена ФНО-α в МНК представлены
в табл. 4.6.
90
Таблица 4.6.
Экспрессия гена ФНО-α в МНК у пациенток обследуемых групп
Экспрессия
гена ФНО-α
(х 105 копий
гена)
Группы обследованных пациенток (n= 104)
Основная группа (n=74)
1 подгруппа n=36
2 подгруппа n=38
до терапии
36,18±9,81
40,18±10,0
через 1 час
36,99±13
33,64±7,72
через 1 сутки
25,88±18*
36,87±9,62#
10-е сутки
8,23±2,65*#
43,35±14#
18-20 сутки
4,79±2,63*#
17,93±10,5*#
Примечание:
* - достоверность различий р<0,05 при сравнении между показателями в группах с
фоновым уровнем до начала терапии;
# - достоверность различий р<0,05 при сравнении показателей между собой в
группах.
Как следует из данных, представленных в таблице 4.6. у пациенток
обоих подгрупп фоновый уровень экспрессии гена ФНО-α (до начала
лечения) достоверно не отличался. В динамике на фоне проведения терапии
через 10 суток после начала лечения у пациенток 1 подгруппы без ПНБ
отмечалось достоверное по отношению к фоновому уровню снижение
экспрессии гена ФНО-α у 60% пациенток, что составляло 8,23±2,65х105
копий гена (p<0,05) (Рис.4.8.). У остальных 40% пациенток была другая
динамика: через сутки от начала лечения отмечалось недостоверное
повышение экспрессии гена ФНО-α, что соответствовало 36,89±13х105 копий
гена, но на фоне проводимой терапии было выявлено достоверное снижение
экспрессии гена ФНО-α до 5,34±2,44х105 копий гена (p<0,05) (Рис.4.8.).
Таким образом, у 100% пациенток 1 подгруппы без ПНБ отмечалась
достоверная динамика снижения экспрессии гена ФНО-α на фоне терапии
после проведения всех процедур. После завершения курса лечения тенденция
снижения экспрессии гена ФНО-α в динамике у всех пациенток сохранялась.
91
количество копий генов ФНО-а
в мононуклеарных клетках
периферической крови
60
50
*
40
60%
30
40%
20
10
*
0
до терапии
через 1 час
через 1 сутки
*
через 10 дней
**
после терапии
временные точки забора крови
- диапазон показателя в группе здоровых доноров
Примечание: * - Уровень значимости по критерию Манна-Уитни p<0,05 по сравнению с
фоновым уровнем экспрессии гена ФНО-α.
Рис. 4.8. Экспрессия гена ФНО-α мононуклеарными клетками у пациенток 1
подгруппы без ПНБ на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК
Во 2 подгруппе женщин с ПНБ в анамнезе на фоне лечения было
выявлено, что фоновый уровень экспрессии гена ФНО-α до проведения
терапии составил 40,18±10,0х105 копий гена (p<0,05). У всех пациенток в
этой группе уровень экспрессии ФНО-α до начала лечения был сопоставим
со средними значениями данного показателя у пациенток в подгруппе 1. На
фоне терапии в данной группе пациенток экспрессия гена ФНО-α уже через 1
час после первой процедуры снизилась и составляла 33,64±7,72х105 копий
гена (p<0,05). Такая динамика наблюдалась у 75% пациенток (Рис. 4.9.).
Значения экспрессии гена ФНО-α через 10 дней после процедуры в среднем
составляли 43,35±14 х 105 копий гена (p<0,05) – показатели экспрессии гена
ФНО-α вновь вернулись на исходный уровень, как до проведения терапии у
33,4% пациенток с динамикой снижения экспрессии гена ФНО-α через сутки
после 1-й процедуры. Но, несмотря на такую неоднозначную динамику
экспрессии гена ФНО-α на фоне терапии, после проведения курса процедур
фотосенсибилизированной
ФМК
достоверная
динамика
снижения
92
экспрессии гена ФНО-α была выявлена у 62,5% пациенток подгруппы 2 с
ПНБ и составляла 17,93±10,5 х 105 копий гена (p<0,05).
количество копий генов ФНО-а в
мононуклеарах клетках
периферической крови
60
50
40
30
20
* *
10
0
до терапии
через 1 час
через 1 сутки
через 10 дней
после терапии
62,50%
25%
12,50%
временные точки забора крови
- диапазон показателя в группе здоровых доноров
Примечание: * - Уровень значимости по критерию Манна-Уитни p<0,05 по сравнению с
фоновым уровнем экспрессии гена ФНО-α.
Рис. 4.9. Динамика экспрессии гена ФНО-α мононуклеарными клетками у
пациенток
2
подгруппы
с
ПНБ
на
фоне
проведения
фотосенсибилизированной ФМК
У 25% пациенток 2 подгруппы на 10-е сутки от начала лечения
отмечалось повышение экспрессии гена ФНО-α, как стимулирующий эффект
в ответ на фотосенсибилизированную ФМК. К завершению курса процедур
наблюдалось достоверное снижение экспрессии гена ФНО-α(p<0,05) (Рис.
4.9.).
Данную
динамику
противогерпетическим
можно
иммунитетом.
объяснить
изначально
Проводимая
терапия,
сниженным
возможно,
способствовала стимуляции иммунного ответа на длительную персистенцию
ВПГ, истощающего иммунную систему у данной категории пациенток.
У остальных 12,5% пациенток 2 подгруппы была «синусоидальная»
динамика: недостоверное снижение экспрессии гена ФНО-α после первой
процедуры через 1 сутки, затем нарастание экспрессии после 10-х суток, а
после завершения курса лечения значения
экспрессии гена ФНО-α
вернулись на исходный уровень (Рис.4.9.).
93
Таким образом, у пациенток 2 подгруппы мы наблюдали различную
динамику экспрессии гена ФНО-α на фоне проводимого лечения.
4.5. Определение содержания цитокинов (ФНО-α, ИФН-α, ТФР-β1) в
сыворотке
крови
у
обследованных
пациенток
при
фотосенсибилизированной фотомодификации крови
Известно,
что
нормальное
течение
беременности
во
многом
определяется соотношением иммуномодулирующих и иммуносупрессивных
эффектов, в регуляции которых участвуют врожденный и адаптивный
иммунитет матери, механизмы которых, в том числе, реализуются
посредством системы цитокинов. Поэтому,
учитывая,
что
метод
фотосенсибилизированной ФМК был направлен на изменение цитокинового
баланса, необходимого для создания условий, способствующих имплантации
у пациенток с ГВИ: формированию равновесия между врожденным и
адаптивным иммунитетом матери, для достоверной оценки эффективности
проводимой терапии мы исследовали продукцию провоспалительного
цитокина ФНО-α, уровень которого сопоставляли с экспрессией гена ФНО-α.
Было получено, что у пациенток 1 подгруппы без ПНБ средний уровень
ФНО-α
до
проведения
терапии
составил
6,16±4,1
пк/мл.
Анализ
индивидуальных данных показал, что недостоверный рост продукции ФНО-α
на фоне терапии был у 40% пациенток и составлял 10,03±2,8 пк/мл после
курса лечения. Следует отметить, что повышение продукции ФНО-α в
сыворотке крови пациенток с хронической ГВИ является следствием того,
что ФНО-α участвует в защите организма от ГВИ. У остальных 60%
пациенток наблюдалось снижение продукции ФНО-α на фоне терапии, что
составило 3,9±1,6 пк/мл после проведения курса процедур (Рис. 4.10.).
94
16
ФНО-а пк/мл
14
12
10
*
8
6
*
*
4
2
60%
40%
0
до терапии
через 1 час
через 1 сутки
через 10 дней
после терапии
временные точки забора крови
- диапазон показателя в группе здоровых доноров
Примечание: * - Уровень значимости по критерию Манна-Уитни p<0,05 по сравнению с
фоновым уровнем ФНО-α.
Рис. 4.10. Динамика продукции ФНО-α в сыворотке крови у пациенток
1 подгруппы без ПНБ на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК
Таким образом, у большинства пациенток с ГВИ и без ПНБ в анамнезе
на фоне проводимой терапии динамика продукции ФНО-α повторяла
динамику экспрессии гена ФНО-α, тем самым, можно утверждать, что
фотосенсибилизированная ФМК приводила к нормализации показателей.
Полученные результаты продукции ФНО-α были сопоставлены с
данными ретроспективного анализа в группе сравнения, где фоновый
уровень ФНО–α в среднем составлял 2,4±0,8 пк/мл [18], 3,3±0,25 пк/мл [19] и
был достоверно ниже в 2 раза фонового уровня продукции ФНО-α у
пациенток 1 подгруппы.
При анализе результатов уровней продукции прововоспалительного
ФНО-α во 2 подгруппе пациенток с ПНБ в анамнезе было выявлено, что
концентрация сывороточного ФНО–α до начала терапии составляла
7,35±3,95
пк/мл
(p<0,05),
что
было
достоверно
выше
нормальных
показателей в группе сравнения [18, 19], но сопоставимо со средними
значениями у пациенток в 1 подгруппе.
Известно, что предрасположенность к гиперсекреции ФНО-α может
служить одним из факторов, способствующих привычному выкидышу и
95
бесплодию «неясного генеза» [6]. По мнению ряда авторов, у женщин с
прервавшейся беременностью в анамнезе концентрация ФНО-α более чем в 2
раза превышает показатели у пациенток с физиологически протекавшей и
сохраненной беременностью [57]. Снижение продукции ФНО–α наблюдалось
у 62,5% пациенток, данный показатель изменялся достоверно (Рис. 4.11.),
при этом у 80% из этих пациенток наблюдалось повышение продукции
ФНО–α в начале и середине курса процедур. В ответ на проводимую терапию
повышение продукции ФНО–α наблюдалось у 37,5% пациенток через 1 час
ФНО-а пк/мл
после 1-й процедуры.
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
*
62,50%
37,50%
до терапии
через 1 час
через 1 сутки
через 10 дней
после терапии
временные точки забора крови
- диапазон показателя в группе здоровых доноров
Примечание: * - Уровень значимости по критерию Манна-Уитни p<0,05 по сравнению с
фоновым уровнем ФНО-α.
Рис. 4.11. Динамика продукции ФНО-α в сыворотке крови у пациенток
2 подгруппы с ПНБ на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК
В исходе после проведенного курса лечения продукция ФНО–α
достоверно снизилась у женщин 2 подгруппы. Концентрация сывороточного
ФНО–α после завершения курса лечения у пациенток 2 подгруппы
составляла в среднем у большинства 3,45±2,2 пк/мл (p<0,05) и достоверно
отличалось от значений, полученных до начала лечения и недостоверно - от
нормальных показателей в группе сравнения [18, 19].
Несмотря
на
провоспалительного
то,
что
цитокина
во
многих
ФНО-α
в
исследованиях
сыворотке
повышение
крови
является
прогностическим признаком спонтанного прерывания беременности [74, 80,
96
114], точка в этом вопросе еще не поставлена. Поэтому изучение характера
динамики только противовоспалительного цитокина ФНО-α на фоне терапии
было не целесообразным.
Другой показатель, который мы исследовали, уровень ИФН-α, который
определяли
у
пациенток
на
фоне
проводимой
терапии
фотосенсибилизированной ФМК также в динамике. При вирусной инфекции
вырабатываются интерфероны I типа (ИФН-α и ИФН-β), которые являются
противовирусными цитокинами [102, 105, 111]. Aboagye-Mathiesen G. и
соавт. показали, что при беременности ИФН-α продуцируется тканями
трофобласта, что может приводить к гиперактивации иммунных механизмов,
что является следствием нарушения функционирования трофобласта и
патологии беременности [102]. Результаты определения ИНФ-α в сыворотке
крови представлены в табл. 4.7.
Таблица 4.7.
Показатели продукции ИНФ-α в сыворотке крови у пациенток с ГВИ на
фоне фотосенсибилизированной ФМК
ИНФ-α
пк/мл
1 подгруппа без ПНБ
2 подгруппа с ПНБ
время забора крови
до начала терапии
11,06±3,54
12,85±1,96
через 1 сутки
14,1±2,57
13,3±2,65
через 10 суток
14,3±2,58
12,63±1,89
после терапии
13,7±1,3
12,97±1,7
Фоновый уровень сывороточного ИФН-α до проведения терапии у всех
пациенток 1 подгруппы без ПНБ в анамнезе был равен 11,06±3,54 пк/мл и
был примерно на одном уровне у всех женщин. Данный показатель
достоверно не отличался от значений, полученных у пациенток во 2
подгруппе с ПНБ, который составил 12,85±1,96 пк/мл. При сопоставлении с
нормальными популяционными показателями 20-120 пг/мл в группе
сравнения [33], был выявлен достоверно сниженный фоновый уровень ИФНα у всех пациенток с ГВИ. На фоне проведения терапии у пациенток 1 и 2
97
подгрупп отмечалась недостоверная динамика подъема уровня ИФН-α.
Таким образом, после проведения терапии уровень ИФН-α у всех пациенток
вернулся к исходному значению (Рис. 4.12.).
продукция ИФН-а в сыворотке
крови пк/мл
20
диапазон показателя в группе здоровых доноров
18
16
14
12
10
8
6
1 группа
4
2
2 группа
0
до терапии
через 1 час
через 1 сутки
через 10 дней
после терапии
временные точки забора крови
Рис. 4.12. Продукция ИФН-α в сыворотке крови у пациенток с
герпесвирусной инфекцией
Среди
других
цитокинов,
влияющих
на
функционирование
трофобласта, выделяют трансформирующий фактор роста β1 (TФР-β1),
который регулирует дифференцировку и функциональную активность клеток
трофобласта [126, 159]. По данным Jana Skrzypczak и соавт. продукция TРФβ1 играет важную роль в подготовке эндометрия к имплантации плодного
яйца и способствует адгезии клеток трофобласта [163]. Снижение экспрессии
TРФ-β1, приводит нарушению процесса имплантации [55, 178].
Мы проводили оценку уровней противовоспалительного цитокина
TФР-β1 в сыворотке крови в динамике на фоне фотосенсибилизированной
ФМК. Установлено, что выявление в динамике цитокина TФР-β1 у
пациенток исследуемых групп может иметь определенное значение в оценке
эффективности проводимой терапии.
Результаты определения в сыворотке крови TФР-β1 на фоне
проводимой терапии представлены в табл. 4.8.
98
Таблица 4.8.
Показатели продукции TФР-β1 в сыворотке крови у пациенток с
ГВИ на фоне фотосенсибилизированной ФМК
TФР-β1
пк/мл
1 подгруппа без ПНБ
время забора
крови
до начала терапии
140,94±39,9#
2 подгруппа с ПНБ
391,86±48,1#
через 1 сутки
168,2±54,77#
323,7±122,2#
через 10 суток
302,1±158*
287,8±165
после терапии
534,4±197,5*/#
342,13±129,9#
Примечание:
* - достоверность различий р<0,05 при сравнении между показателями в группах с
фоновым уровнем.
# - достоверность различий р<0,05 при сравнении показателей между собой в
группах.
Как следует из данных, представленных в табл. 4.8. при определении
уровней TФР-β1 на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК у
пациенток исследуемых групп, было получено, что до проведения терапии у
пациенток 1 подгруппы без ПНБ уровень исходного TФР-β1 составлял
140,94±39,9 пк/мл (p<0,05) и был достоверно ниже в сравнении с
ретроспективно полученным значением концентрации TФР-β1 в сыворотке
крови здоровых доноров 243,0±6,5 пк/мл [46]. В динамике на фоне терапии у
пациенток в данной группе отмечался достоверный рост уровня TФР-β1 и в
конце курса лечения составлял 534,4±197,5 пк/мл (Рис. 4.13.).
99
1 группа
700
продукция ТФР-b1 в
сыворотке крови
600
*
значение нормы ТФР-b1
500
400
*
300
200
100
0
до терапии
через 1 час
через 1 сутки
через 10 дней
после терапии
временные точки забора крови
Примечание: * - Уровень значимости по критерию Манна-Уитни p<0,05 по сравнению с
фоновым уровнем TФР-β1 до начала терапии
Рис. 4.13. Продукция TФР-β1 в сыворотке крови у пациенток 1 подгруппы
без ПНБ на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК
Анализируя результаты уровней TФР-β1 в сыворотке крови на фоне
проведения терапии у пациенток 2 подгруппы с ПНБ, мы получили, что
исходный уровень TФР-β1 в этой группе составлял 391,86±48,1 пк/мл и был в
1,6 раз выше, чем в группе сравнения. На фоне фотосенсибилизированной
ФМК отмечалось 2 тенденции по динамике продукции TФР-β1. У 62,5%
пациенток этой группы вначале курса процедур наблюдалось не достоверное
снижение продукции TФР-β1, но к середине (10-е сутки) и к завершению
курса процедур (18-20-е сутки) продукция TФР-β1 имела тенденцию к
нарастанию (Рис. 4.14.). У остальных 37,5% пациенток в данной группе на
фоне проводимой терапии в динамике отмечался достоверный рост TФР-β1 в
сравнении с аналогичными показателями в 1 подгруппе (Рис. 4.14.), что
способствует подготовке эндометрия к имплантации плодного яйца и адгезии
клеток трофобласта.
100
600
62,50%
37,50%
нижняя граница нормы ТФР-b1
ТФР-b1 пк/мл
500
400
*
300
200
100
0
до терапии
через 1 час
через 1 сутки
через 10 дней после терапии
временные точки забора крови
Примечание: * - Уровень значимости по критерию Манна-Уитни p<0,05 по сравнению с
фоновым уровнем TФР-β1
Рис. 4.14. Продукция TФР-β1 в сыворотке крови у пациенток 2 подгруппы с
ПНБ на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК
В результате проведенного исследования нам удалось показать, что у
пациенток с ГВИ и ПНБ в анамнезе равновесие между врожденным и
адаптивным иммунитетом отсутствует по причине длительной персистенции
ВПГ.
Было выявлено, что у пациенток основной группы (1 и 2 подгруппы)
установлен достоверно повышенный фоновый уровень ФНО–α (6,16±4,1 и
7,35±3,95 пк/мл) по сравнению с группой контроля (2,4±0,8 пк/мл), который,
возможно, индуцируется хронической ГВИ.
Фоновый уровень сывороточного TФР-β1 у пациенток 1 подгруппы
(140,94±39,9 пк/мл) не достоверно снижен по сравнению с группой контроля
(243,0±6,5 пк/мл), что свидетельствует об ослаблении специфического
иммунитета вследствие персистенции ГВИ.
Проведение
фотосенсибилизированной
ФМК
способствовало
снижению экспрессии гена ФНО–α у пациенток 1 подгруппы, несмотря на
динамику роста продукции ФНО–α, что благоприятно для терапии ГВИ, и
отсроченную динамику роста TФР-β1, что благоприятно для планирования
беременности на фоне ГВИ.
101
Фотосенсибилизированная
ФМК
у
пациенток
2
подгруппы
способствовала отсроченному снижению экспрессии гена ФНО–α (на 10
сутки) и снижению продукции ФНО–α, что можно считать положительной
динамикой данной терапии с целью предгравидарной подготовки.
Разнонаправленная динамика продукции TФР-β1 у пациенток 2
подгруппы получилась, возможно, вследствие наличия в организме данной
группы пациенток с ПНБ состояния иммуносупрессии и слабого иммунного
ответа на ГВИ.
Полученные
результаты
у
пролеченных
пациенток
методом
фотосенсибилизированной ФМК свидетельствуют об эффективности данной
терапии.
Проведение
фотосенсибилизированной
ФМК
способствовало
снижению экспрессии гена ФНО–α и продукции сывороточного ФНО–α, а
также тенденции к повышению уровня TФР-β1, что благоприятно для
планирования беременности на фоне ГВИ. Определение экспрессии гена
ФНО-α и цитокинового профиля (ФНО-α, ИФН-α,
TФР-β1) позволяет
отслеживать эффективность проводимой терапии ФМК и доказывает
целесообразность ее применения в составе комплексной противовирусной
терапии с целью предгравидарной подготовки. Отсутствие динамики
продукции ИФН-α в основной группе на фоне проводимой терапии
подтверждает
факт
снижения
ИФН
-
продуцирующей
способности
лейкоцитов при рецидивирующей ГВИ у данной категории пациенток.
Поэтому на фоне проведения фотосенсибилизированной ФМК с целью
предгравидарной подготовки для компенсации системы интерферона в
лечение необходимо включать препараты интерферона.
102
4.6.
Клиническая
эффективность
фотосенсибилизированной
фотомодификации крови у пациенток с хронической герпесвирусной
инфекцией и привычным невынашиванием беременности в анамнезе
Эффективность проведенного лечения оценивали как на основании
контрольных исследований экспрессии гена ФНО-α, цитокинового профиля
(ФНО-α, ИНФ-α,
TФР-β1), так и клинически по данным наступления
беременности, вынашиванию (срокам гестации) и количеству рецидивов ГВИ
после терапии фотосенсибилизированной ФМК.
Основную
группу
пациенток
(22
женщины
с
носительством
рецидивирующей ГВИ) мы наблюдали в динамике после лечения в течение
10 месяцев. В 1 подгруппе пациенток без ПНБ беременность планировали
52,7% (19) женщин, из них в беременность вступили 41,7% (15) пациенток, 8
женщинам из которых была проведена ФМК, у 3 (45,4%) пациенток
наступила беременность. Во 2 подгруппе женщин все пациентки были
заинтересованы в наступлении беременности. Процент забеременевших
женщин составил 63,1% (24), из которых 14 пациенток были после курса
фотосенсибилизированной ФМК, у 9 (64,2%) женщин наступила и
прогрессировала беременность. Срок гестации на момент проведения анализа
в
обеих
группах
составил
более
20
недель,
что
можно
считать
положительным эффектом от проведенного лечения (Рис. 4.15.).
2 группа с ПНБ
процент женщин, вступивших в
беременность после терапии
(срок гестации на момент
проведения анализа более 20
нед)
36,90%
63,10%
процент женщин, не
забеременевших после терапии
Рис. 4.15. Клиническая эффективность после фотосенсибилизированной
ФМК во 2 подгруппе пациенток с ПНБ в анамнезе
103
Мы
провели
сравнение
клинической
эффективности
фотосенсибилизированной ФМК у пациенток основной группы (1 и 2
подгруппы) и группы сравнения (женщины, имевшие репродуктивные
потери в анамнезе по инфекционным причинам, получавшие внутривенно
препараты иммуноглобулинов с целью лечения рецидивирующей ГВИ и в
качестве предгравидарной подготовки). Нами получены данные, что во 2
подгруппе
женщин
с
ПНБ
процент
наступления
и
вынашивания
беременности был достоверно выше по сравнению с группой сравнения, и
составил 63,1% (24) против 53,3% (16) (Рис. 4.16.).
*
70,0%
60,0%
*
50,0%
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0%
1 группа
Рис.
4.16.
Частота
2 группа
3 группа
наступления
беременности
после
фотосенсибилизированной ФМК в сравнении с терапией препаратами
иммуноглобулинов у пациенток с герпесвирусной инфекцией через 10
месяцев.
По оси ординат – процент наступивших беременностей, доношенных до срока гестации 20
недель и более
* - Уровень значимости по критерию Манна-Уитни p<0,05 по сравнению с группой
сравнения
104
Эффективность метода фотосенсибилизированной ФМК в отношении
количества рецидивов ГВИ в установленный срок наблюдения (10 месяцев)
характеризуется снижением частоты и длительности обострений (Рис. 4.17).
4,9+1,9
1 группа
5
4,5
4
2,9+1,1
3,5
2,9+1,6
3
1,9+1,0
2,5
2
длительность
обострений ГВИ
частота рецидивов
ГВИ в год
1,5
1
0,5
0
до терапии
6
5,5+1,7
2 группа
после терапии
2 группа
5,4+1,2
5
3,9+1,5
4,0+1,1
4
длительность
обострений ГВИ
3
частота рецидивов ГВИ
в год
2
1
0
до терапии
после терапии
Рис. 4.17. Эффективность метода фотосенсибилизированной ФМК в
отношении эпидемиологических показателей.
Таким
образом,
резюмируя
вышеизложенное,
пациентки
с
рецидивирующей ГВИ и ПНБ в анамнезе, заслуживают внимания, так как в
патологический процесс вовлечены многие системы организма. Полученные
результаты свидетельствуют о том, что фотосенсибилизированная ФМК
105
является специфическим методом воздействия и оказывает положительное
влияние на организм женщины, что выгодно отличает данный метод лечения
рецидивирущей ГВИ от стандартных схем терапии противовирусными
препаратами.
Несмотря
на
то,
фотосенсибилизированной
что
ФМК
у
показания
пациенток
к
с
применению
привычным
не
вынашиванием беременности на фоне рецидивирующей ГВИ в качестве
предгравидарной
накопленные
подготовки
данные
к
беременности
свидетельствуют
о
еще
не
значительных
определены,
перспективах
экспериментальных и клинических исследований в этом направлении.
106
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Среди важнейших проблем практического акушерства одно из первых
мест занимает невынашивание беременности, частота которого составляет
10-25% всех диагностированных беременностей [55, 79] и не имеет
тенденции к снижению, несмотря на многочисленные и эффективные методы
диагностики и лечения. В настоящее время НБ представляет собой
полиэтиологический симптомокомплекс, но среди всего разнообразия
причин данной патологии доминируют инфекционные факторы и иммунные
нарушения. Ведущее место в генезе преждевременного прерывания
беременности
занимают
инфекционные
заболевания,
среди
которых
доминируют герпесвирусные инфекции [75, 80, 105, 120]. Терапия ГВИ при
невынашивании беременности представляет собой большие трудности.
Существующий
спектр
противовирусных
противогерпетической активностью
препаратов,
обладающих
34, 103, 107, 119, 150 , быстро и
эффективно купирует острые проявления простого герпеса, но при этом, к
сожалению, не предотвращая появление рецидива хронической ГВИ.
Поэтому,
наиболее
часто
применяемые
на
первом
этапе
лечения
химиотерапевтические препараты, безусловно, эффективны, но лишь
отчасти. В нашем исследовании у пациенток группы сравнения, получавших
терапию препаратами иммуноглобулинов, была показана эффективность
данного лечения, но эта терапия связана с высокими экономическими
затратами. Поэтому существует актуальность поиска и разработки новых
методов лечения ГВИ при ПНБ.
Повседневная
высокотехнологичной
практика
и
требовала
эффективной
создания
современной,
медицинской
технологии,
позволяющей применять ее у пациенток с рецидивирующей ГВИ и ПНБ при
неэффективности ранее проводимой противовирусной терапии и наличии
побочных эффектов при применении медикаментозного лечения. Таким
методом
стало
фотосенсибилизированное
(фотомодификация
крови)
–
частный
лазерное
случай
облучение
ФДТ.
крови
Методика
107
предусматривает
фотомодификацию
крови
за
счет
взаимодействия
оптического излучения и препарата фотосенсибилизатора (ФС) [24, 25].
Введенные в организм молекулы ФС избирательно фиксируются на
мембранах патологических клеток, оболочках вирусов и митохондриях [134,
172]. При фотодинамическом воздействии в тканях происходит каскад
фотохимических реакций с образованием активных форм кислорода, которые
оказывают сильное цитотоксическое действие, вызывая повреждение
мембран и органелл патологических клеток.
В
ходе
нашего
исследования
проведена
экспериментальная
и
клиническая разработка метода лечения ГВИ у пациенток с ПНБ в анамнезе
инфекционного генеза. Были получены результаты, указывающие на
принципиальную возможность использования ФС «Фотодитазин» для
фотосенсибилизированной ФМК при рецидивирующей герпесвирусной
инфекции у пациенток с ПНБ.
Клиническому этапу исследования предшествовал экспериментальный
этап. Совместно с сотрудниками ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова»
РАМН, г. Москва в лаборатории молекулярной иммунологии были
проведены
доклинические
экспериментальные
исследования
по
противовирусной активности фотодинамической терапии in vitro.
Получены результаты, доказывающие наличие противовирусного
эффекта ФДТ in vitro. По результатам экспериментальной работы получена
приоритетная справка № 2013112489 с приоритетом от
"Способ
оценки
эффективности
20.03.2013 на
противогерпетического
действия
фотодинамического воздействия на вирус простого герпеса in vitro".
После
экспериментального
обоснования
противовирусной
ФДТ
проводили клинический этап исследования, который включал комплексное
клинико-лабораторное обследование и лечение пациенток с герпесвирусной
инфекцией и ПНБ в анамнезе методом фотосенсибилизированного лазерного
чрескожного облучения крови. Фотосенсибилизированная фотомодификация
крови была проведена 22 пациенткам.
108
Учитывая, что в литературе нет данных о воздействии ФДТ на
герпесвирусы, на иммунную систему и на реакции противовирусного
иммунитета, мы провели исследование по изучению цитокинового профиля
при осложненной беременности: ПНБ на фоне ГВИ. Цитокиновый профиль
при ПНБ на фоне ГВИ и лечении фотосенсинсибилизиованной ФМК ранее
не был изучен. Механизмы взаимодействия лазерного излучения с вирусами,
а
также
воздействие
фотосенсибилизированной
фотогематерапии
на
состояние иммунной системы у женщин с ПНБ не было показано в
предшествующих научных работах. Не было найдено данных о влиянии
фотосенсибилизированной
фотомодификации
крови
на
цитокиновый
профиль при хронической ГВИ. Поэтому, безусловно, впервые проведенное
исследование представляло большой научный и практический интерес.
Проведена попытка изучения механизмов фотодинамического воздействия
на ВПГ. Метод фотосенсибилизированной ФМК и оценка цитокинового
профиля у женщин с привычными потерями беременности на фоне ГВИ и
стойкой неэффективностью ранее проводимых лечебных мероприятий
показали свою эффективность применения.
Изучение
цитокиновый
исследованием,
влияния
метода
профиль при
учитывая
фотосенсибилизированной
ФМК
на
ПНБ на фоне ГВИ
было
повышение
самопроизвольных
частоты
актуальным
выкидышей [161]. Проведенные исследования по оценке экспрессии гена
ФНО–α и цитокинового профиля (ФНО–α, ИФН-α, TФР-β1) на фоне
фотосенсибилизированной ФМК установили, что наиболее достоверными
показателями оценки эффективности проводимой терапии явились ФНО–α и
TФР-β1.
На основании вышеприведенных данных мы выявили, что у
большинства пациенток с ГВИ 1 подгруппы без ПНБ в анамнезе динамика
продукции ФНО–α повторяла динамику снижения экспрессии гена ФНО–α.
Во 2 подгруппе пациенток с ГВИ и ПНБ в анамнезе наблюдалась динамика
снижения экспрессии гена ФНО–α и отсроченное до 10-х суток снижение
продукции ФНО–α в сыворотке крови. В данном случае, учитывая состояние
109
иммунной дисфункции на фоне хронической ГВИ, отсроченная продукция
ФНО-α была индуцирована, возможно, проводимой терапией.
При
исследовании
уровней
TФР-β1
на
фоне
проведения
фотосенсибилизированной ФМК у пациенток исследуемых групп отмечалась
преимущественная динамика роста данного показателя. Поддержание
высоких уровней TФР-β1, возможно, способствует торможению репликации
ВПГ, что благоприятно для планирования и вынашивания беременности. Ball
E. и соавт. доказано, что TФР-β1 и другие его изоформы не являются
патологическими факторами роста в процессе формирования трофобласта,
тем самым не могут способствовать привычному выкидышу [106, 163].
Поэтому, принимая во внимание данный факт, можно сказать, что
полученная нами положительная динамика роста данного показателя у
пациенток с ГВИ и ПНБ, в дальнейшем, возможно, благоприятно скажется на
исходе последующей беременности.
Анализ титров специфических иммуноглобулинов класса G против
ВПГ-2 и ЦМВ и реакции системы интерферонов (ИФН-α) на проведение
фотосенсибилизированной
ФМК
не
был
показательным
в
нашем
исследовании. Мы получили отсутствие динамики титров антител и уровня
ИНФ-α на фоне проведения терапии. По данным Ершова Ф.И. и соавт. при
хронической
герпесвирусной
инфекции
ИФН-статус
характеризуется
практически полным отсутствием ИФН - продуцирующей способности
лейкоцитов [35, 138].
Таким образом, у пациенток всех обследованных групп уровни
сывороточного ИФН-α, несмотря на проведение фотосенсибилизированной
ФМК, оставались в пределах фоновых значений, что характеризует глубокое
подавление
интерфероногенеза
–
интерферондефицитное
состояние.
Фотосенсибилизированная ФМК не повлияла на показатели сывороточного
ИФН-α и нам не удалось показать эффект фотосенсибилизированной ФМК
на примере исследования уровней сывороточного ИФН-α. Отсутствие ответа
на проводимую терапию со стороны системы интерферона требует
проведения комбинированной терапии рецидивирующей ГВИ.
110
Изучение
клинической
фотосенсибилизированной
эффективности
ФМК
показало,
что
при
метода
дальнейшем
динамическом наблюдении в течение 1 года за пролеченными пациентками
эпизодов рецидива ГВИ не было зарегистрировано ни у одной пациентки.
Беременность наступила у 7 (19,4%) женщин 1 подгруппы и у 24 (63,2%)
женщин 2 подгруппы. На момент проведения анализа 15 женщин с ПНБ в
анамнезе находились во втором триместре беременности. Рецидивов ГВИ во
время беременности также не было зарегистрировано.
Таким образом, результаты проведенных исследований позволяют
сделать
вывод,
что
фотосенсибилизированная
ФМК
может
стать
эффективным методом предгравидарной подготовки или присутствовать в
составе комплексной противовирусной терапии у пациенток с ГВИ и ПНБ в
анамнезе. Определение экспрессии гена ФНО-α и цитокинового профиля
(ФНО-α,
TФР-β1)
позволяет
фотосенсибилизированной
ФМК
и
отслеживать
доказывает
эффективность
целесообразность
ее
применения. Проведение оценки изучаемых показателей возможно для
определения эффективности других методов терапии ГВИ при ПНБ.
Внедрение метода фотосенсибилизированной ФМК в клиническую
практику может дать существенный экономический эффект, так как
проводится амбулаторно и не требует стационарного лечения, при этом
стоимость лечения невысока.
111
ВЫВОДЫ
1.
Пациентки
с
ПНБ
имеют
предрасполагающие
факторы
риска
репродуктивных потерь в сравнении с группой условно здоровых женщин:
наличие рецидивирующей герпесвирусной инфекции в сочетании с высокой
частотой хронических инфекционных заболеваний, экстрагенитальных
очагов инфекции, хронических воспалительных заболеваний генитального
тракта и отягощенного репродуктивного анамнеза.
2. На экспериментальном этапе исследования создана модель герпесвирусной
инфекции in vitro для изучения механизмов противовирусного действия
ФДТ, позволяющая изучать прямое и опосредованное действие ФДТ,
оптимизировать дозу препарата фотосенсибилизатора и дозу лазерного
облучения для получения противогерпетического эффекта ФДТ, который
был реализован in vitro при концентрации ФС «Фотодитазин» 10-50 мкг/мл и
воздействии лазерного облучения в дозе 1,8 Дж/см2 (время облучения 30 сек),
при соблюдении инкубации до и после облучения не менее 30 мин. При
данных условиях эксперимента титр вируса достоверно снижался на 1,5-2
порядка.
3. У пациенток с ПНБ до начала терапии фотосенсибилизированной ФМК
выявлены достоверные изменения иммунологических показателей:
- повышенный фоновый уровень экспрессии гена ФНО–α в МНК клетках
периферической крови в 50 раз по сравнению со здоровыми донорами;
- повышение концентрации провоспалительного цитокина ФНО–α в 3 раза по
сравнению со здоровыми донорами;
- снижение фонового уровня ИФН-α в сыворотке крови в 1,6 раз по
сравнению с группой здоровых женщин;
4. Комплексный анализ экспрессии гена ФНО–α и цитокинового профиля
(ФНО–α, ИФН-α, ТФР-β1) у пациенток с ПНБ и рецидивирующей формой
герпесвирусной
инфекции
(2
подгруппа)
показал,
что
фотосенсибилизированная ФМК приводит к изменениям иммунологических
показателей: отсроченному (до 10 суток) достоверному снижению уровня
112
экспрессии
гена
ФНО–α
до
17,93±10,5
пк/мл;
снижению
уровня
провоспалительного цитокина ФНО–α до 3,45±2,2 пк/мл и индукции
секреции противовоспалительного цитокина ТФР-β1 до 342,13±129,9 пк/мл в
сыворотке крови, что можно считать положительной динамикой данной
терапии с целью предгравидарной подготовки у данной категории женщин.
5. Фотосенсибилизированная фотомодификация крови у пациенток с ПНБ на
фоне рецидивирующей ГВИ не влияет на систему интерферонов и уровни
титров специфических иммуноглобулинов класса G против ВПГ-2 и ЦМВ,
поэтому
в
комплексную
предгравидарной
терапию
подготовки
герпесвирусной
целесообразно
инфекции
добавить
для
препараты
рекомбинантного интерферона в сочетании с иммунотерапией.
113
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Повышение концентрации провоспалительного ФНО-α и экспрессии гена
ФНО-α в МНК клетках периферической крови, снижение фонового уровня
ИФН-α могут быть использованы для прогнозирования невынашивания
беременности, ассоциированного с ГВИ и определения показаний к
проведению фотосенсибилизированной ФМК.
2. Для оценки эффективности фотосенсибилизированной ФМК у пациенток с
ПНБ
и
рецидивирующей
определять
экспрессию
герпесвирусной
гена
ФНО-α
в
инфекцией
целесообразно
мононуклеарных
клетках
и
цитокиновый профиль (ФНО-α, TФР-β1) в сыворотке крови на протяжении
всего курса лечения, а также после окончания терапии до момента
наступления беременности.
3.
Использование
ФС
«Фотодитазин»
при
транскутанной
фотосенсибилизированной ФМК является оптимальным и безопасным для
получения
благоприятного
эффекта
и
достижения
оптимального
иммунологического баланса для наступления беременности у пациенток с
герпесвирусной инфекцией и ПНБ в анамнезе.
4. Учитывая отсутствие необходимости в проведении обезболивающей
терапии,
почасового
мониторинга
за
состоянием
пациентки
после
процедуры, низкого риска развития побочных эффектов и осложнений
терапии,
фотосенсибилизированная
ФМК
может
быть
применена
в
амбулаторных условиях, либо в стационаре одного дня.
114
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Абубакирова, А.М. Эфферентные методы терапии и фотомодификации
крови в акушерстве и гинекологии / А.М. Абубакирова, Т.А. Федорова, И.И.
Баранов // Акушерство и гинекология. – 1997. - №6. – С. 57-60.
2. Ада, Г. Вакцины, вакцинация и иммунный ответ / Г. Ада, А. Рамсей. // М.:
Медицина. – 2002. – С. 12-17.
3. Архипова, Т.У. Герпесвирусная инфекция: диагностика и лечение / Т.У.
Архипова //Методические рекомендации. Под ред. Т.У. Архиповой. М., 2010. С. 7-11.
4.
Аполихина,
И.А.
Фотодинамическая
терапия
у
женщин
с
папилломавирусной инфекцией / И.А. Аполихина, Е.Д. Денисова, Н.Н.
Булгакова
//
Материалы
всероссийского
конгресса
«Амбулаторно-
поликлиническая практика – новые горизонты» - М. – 2010. - С.19-20.
5. Баринский, И.Ф. Иммунопрофилактика рецидивирующего генитального
герпеса инактивированной специфической вакциной "Витагерпавак" / И.Ф.
Баринский, Ф.Р. Махмудов // Герпес. Баку: Азербайджанский медицинский
университет. - 2009.
6. Бахарева, И.В. Роль механизмов врожденного иммунитета в реализации
внутриутробной инфекции при беременности высокого инфекционного
риска: автореф. дис. ... д-ра мед. наук : 14.00.14, 14.00.36 / Бахарева Ирина
Викторовна. – М., 2009. – 50 с.
7. Бахарева, И.В. Экспрессия генов молекул врожденного иммунитета (TLR2,
TLR4,
HBD1)
при
беременности
с
высоким
риском
реализации
внутриутробной инфекции / И.В. Бахарева, Л.В. Ганковская, Л.В. Ковальчук
и др. // Лечение и профилактика. – 2012. - №1(2). – С. 44-50.
8. Белоусова, И.М. Твердофазные фотосенсибилизаторы на основе фуллерена
С60 для фотодинамической инактивации вирусов в биологических жидкостях
/ И.М. Белоусова, О.Б.Данилов // Оптический журнал, СПб. – 2009. – 76(4). С. 97-107.
115
9. Белый, Ю.А. Лечение хориоидальной неоваскуляризации методом
фотодинамической терапии / Ю.А. Белый, А.В. Терещенко // Лазерная
медицина. – 2011. – 15(2). - С. 60.
10. Биргер, М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим
методам исследования / М.О. Биргер // Изд. Медицина. – 1982. - с. 464.
11.
Бойко,
Е.Л.
Применение
озона
в
лечении
женщин
после
самопроизвольного прерывания беременности ранних сроков / Е.Л. Бойко,
Л.В. Посисеева, Е.В. Полюбина и др. // Нижегородский медицинский журнал.
Приложение: «Озонотерапия». - 2003. - С. 145-146.
12. Боровкова, Л.В. Эффективность СКЭНАР-терапии в комплексном
лечении невынашивания беременности инфекционного генеза / Л.В.
Боровкова, С.О. Колобова // Вестник РУДН. – 2009. - №6. – С. 317-325.
13. Боровкова, Л.В. Влияние СКЭНАР-терапии на протекание беременности
самок белых беспородных крыс / Л.В. Боровкова, Т.Г. Щербатюк, Д.В.
Козлов и др. // Ремедиум Приволжье, спецвыпуск для врачей. Охрана
здоровья матери и ребенка. Н. Новгород. – 2006. – С. 50—51.
14. Бурдулин, Н.М. Влияние внутривенного лазерного облучения крови на
функцию эндотелия сосудов и систему цитокинов у больных с хроническими
вирусными гепатитами / Н.М. Бурдулин, А.С. Крифариди // Лазерная
медицина. – 2012. - №16(2). – С. 51.
15.
Васильев,
Е.В.
Фотодинамическая
терапия
заболеваний
двенадцатиперсной кишки, ассоциированных с Helicobacter pylori / Е.В.
Васильев // Лазерная медицина. – 1999. – 3(3-4). - С. 16-20.
16. Васильченко, С.Ю. Оптическая диагностика и фотодинамическая терапия
атеросклеротических бляшек / С.Ю. Васильченко // Лазерная медицина. –
2011. – 15(2). - С. 61.
17. Верясов, В.Н. Роль Т-регуляторных клеток при беременности / В.Н.
Верясов, Л.В. Ванько, Г.Т. Сухих // Акушерство и гинекология. – 2010. - №1.
– С. 6-11.
18.
Гаджиева,
воспалительного
Ф.Г.
Цитокины
процесса
при
как
патогенетические
невынашивании
маркеры
беременности
116
инфекционного генеза / Ф.Г. Гаджиева // Проблемы репродукции. – 2011. №17 (1). – С. 110-113.
19. Гайдарова, Н.Ф. Оценка метаболического резерва фагоцитов при
привычном невынашивании у беременных с энтеровирусной инфекцией /
Н.Ф. Гайдарова // Женская консультация. – 2012. - №1. – С. 66-70.
20. Ганковская, О.А. Исследование экспрессии генов TLR9, NF-kB, ФНОα в
клетках слизистой цервикального канала беременных с герпесвирусной
инфекцией / О.А. Ганковская, И.В. Бахарева, Л.В. Ганковская // Журнал
микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2009. -№2. – С. 61-65.
21. Ганковская, Л.В. Оценка уровней цитокинов у беременных женщин с
вирусной инфекцией // Л.В. Ганковская, Л.В. Ковальчук, И.В. Бахарева //
Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. – 2007. – том 6, №2. – С.
11-13.
22. Гафтон, Г.И. Фотодинамическая терапия в хирургическом лечении
больных меланомой кожи / Г.И. Гафтон, Ю.В. Семилетова, В.В. Анисимов //
Сибирский онкологический журнал. – 2013. - №4(58). – С.23-27.
23. Гафурова, Д.Н. Изменения системы гемостаза у беременных женщин с
хронической герпетической (ВПГ I, II) инфекцией / Д.Н. Гафурова, Н.К.
Вереина, В.А. Тупиков, Н.В. Уразова, Е.В. Первушина // Уральский
медицинский журнал. - 2008. - №2. - С. 68-71.
24. Гейниц, А.В. Фотодинамическая терапия. История создания метода и ее
механизмы / А.В. Гейниц, А.Е. Сорокатый, Д.М. Ягудаев и др. // Лазерная
медицина. – 2007. - №11(3). – С. 42-46.
25.
Гельфонд,
М.Л.
химиосенсибилизированной
Предварительные
фотомодификации
клинические
результаты
крови
препаратом
с
фотодитазин при распространенных злокачественных новообразованиях
различной локализации / М.Л. Гельфонд, А.С. Барчук // Российский
биотерапевтический вестник. – 2005. - Том 4, №1. - С. 33-34.
26. Гельфонд, М.Л. Фотодинамическая терапия в комбинированном лечении
злокачественных новообразований: настоящее и будущее / М.Л. Гельфонд,
117
А.И. Арсеньев, Е.В. Левченко и др. // Лазерная медицина. – 2012. - Т. 16. – №
2. - С. 25-30.
27. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц // М.: Практика,
1999. – с. 462.
28. Гнипова В.В. Оптимизация патогенетической терапии у женщин с
привычным невынашиванием беременности I триместра на основании
исследования состояния эндометрия: автореф. дис. … канд. мед. наук:
14.00.01 / Гнипова Виктория Викторона. - М.: 2003. - 22 с.
29.
Говалло,
В.И.
Иммунизация
беременных
женщин
аллогенными
лимфоцитами мужа как метод профилактики самопроизвольного выкидыша /
В.И. Гавалло, В.М. Сидельникова // Акушерство и гинекология. – 1983. – №2.
– С. 25-26.
30.
Гречканев,
Г.О.
Эффективность
озонотерапии
при
привычном
невынашивании беременности аутоиммунного генеза / Г.О. Гречканев, И.В.
Терешкина, Х.М. Клементе и др. // Рос. вестник акушера – гинеколога. 2009. №4. – С. 41-46.
31. Гузов, И.И. Иммунобиология и иммунопатология беременности / И.И.
Гузов // Новости прикладной иммунологии и аллергологии. – 2003. -№7. – С.
3-6.
32. Данилов, С.И. Опыт применения плазмафереза у больных тяжелыми
формами рецидивирующего генитального герпеса / С.И. Данилов,
Д.Г. Борухович, Л.Н. Жарков // Российский журнал кожных и венерических
болезней. - 2005. -№3. - С. 50-53.
33. Ершов, Ф.И. Система интерферонов в норме и при патологии / Ф.И.
Ершов // М.: Медицина. – 1996. – 239 с.
34. Ершов, Ф.И. Антивирусные препараты / Ф.И. Ершов // Справочник. 2-е
издание, М.: Гэотар-Медиа. - 2006. – С. 10-14.
35. Ершов, Ф.И. Методические указания по изучению специфической
активности интерферонов и индукторов интерферона. Руководство по
экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических
веществ / Ф.И. Ершов, В.В. Парфенов. М. – 2000. - с. 281-286.
118
36. Исаков, В.А. Герпесвирусные инфекции человека / В.А. Исаков, Е.И.
Архипова Е.И. // Рук. для врачей. СПб.: Спецлит. - 2006. С. 25-30.
37.
Исаков,
В.А.
Иммунопатогенез
и
терапия
простого
герпеса:
Рекомендации для врачей / В.А. Исаков, Г.Ю. Кнорринг, И.Ю. Стернин и др.
// Санкт-Петербург. – 2008. – 88 с.
38. Капустина, Г.М. Внутрисосудистое облучение крови, механизмы
клинической
эффективности,
побочные
действия,
показания
и
противопоказания / Г.М. Капустина, Г.Н. Максюшина, В.В. Малахов //
Материалы Международной конференции «Новые направления лазерной
медицины». М. - 1996. - С. 230-231.
39. Карахалис, Л.Ю. Оценка эффективности использования панавира в
различных
формах
у
пациенток
репродуктивного
возраста
с
цитомегаловирусной ифнецией / Л.Ю. Карахалис, В.А. Кучеров, С.В.
Стовбун и др. // Российский вестник ак-гин. – 2011. - №4. – С. 90-93.
40. Квачева, З.Б. Фотодинамическое ингибирование инфекции, вызванной
вирусом простого герпеса типа 1 в культуре клеток, при использовании
порфиринов, индуцируемых 5 –аминолевуленовой кислотой / З.Б. Квачева,
Е.С. Лобанюк, В.И. Вотяков и др. // Вопросы вирусологии. – 2005. - №4. - С.
44- 47.
41. Ковальчук, Л.В. Противомикробные пептиды иммунной системы:
клинические аспекты / Л.В. Ковальчук, Л.В. Ганковская, А.Ф. Мороз и др. //
Аллергология и иммунология. – 2003. - №4(2). – С. 20-26.
42. Ковальчук, Л.В. Клиническая иммунология и аллергология с основами
общей иммунологии / Л.В. Ковальчук, Л.В. Ганковская, Р.Я. Мешкова //
Учебник. - М.: Геотар. - 2011. – С. 640.
43. Ковальчук Л.В., Игнатьева Г.А., Ганковская Л.В. Иммунология.
Практикум. Учебное пособие. М.: Гэотар-Медиа. – 2012. - 174с.
44. Красновский, А.А. Фотодинамическое действие и синглетный кислород /
А.А. Красновский // Биофизика. – 2004. - 49 №2 .- С. 305-322.
45. Кречетова, Л.В. Блокирующий эффект аутологичной сыворотки женщин
с привычным невынашиванием беременности / Л.В. Кречетова, М.А.
119
Николаева, Л.В. Ванько и др. // Акушерство и гинекология. - 2013. -№3. — С.
38-42.
46. Кубанова, А.А. Динамика трансформирующего фактора роста-b при УФтерапии с длиной волны 311 нм у больных псориазом / А.А. Кубанова, М.М.
Бутарева, М.В. Саватеева, Л.И.
и др. //
Вестник дерматологии и
венерологии. – 2006. -№5. –С. 53-55.
47. Кудинова, Н.В. Фотодинамическая терапия опухолей: иммунологический
аспект лечения / Н.В. Кудинова, Т.Т. Березов // Рос. биотерапевтический
журнал. – 2010. - Т.9, №1 .- С. 69-76.
48. Кузьмин, В.Н. Современный взгляд на клиническое течение, диагностику
и терапию генитального герпеса у женщин/ В.Н. Кузьмин // Лечащий врач. 2009. - №3. - С. 42-47.
49. Кунгуров, Н.В. Лечение и профилактика рецидивирующей генитальной
герпетической инфекции у пациенток с бесплодием и привычным
невынашиванием беременности / Н.В. Кунгуров, Н.М. Герасимова, Ю.Н.
Кузнецова и др. // Вопр. Гин. Акуш. и Перин. – 2010. - Т.9, №3. –С. 30-36.
50. Кучеров, А.Г. Антимикробная и противоспалительная фотодинамическая
терапия в неотоложной отоларингологии / А.Г. Кучеров, А.С. Лапченко, А.А.
Лапченко
//
Материалы
научно-практической
конференции
с
международным участием, посвященной 25-летию ФГУ «ГНЦ лазерной
медицины ФМБА России», М. - 2011г. Лазерная медицина. – 2011. – 15(2). С.113.
51. Лавров, В.Ф. Естественный иммунитет и герпетическая инфекция / В.Ф.
Лавров, Л.В. Ковальчук, Л.В. Ганковская и др. // Вопр. вирусологии. – 2006. №3. - С. 4-9.
52. Лавров, В.Ф. Механизмы формирования иммунологической памяти и
вакцинация
/
В.Ф.
Лавров,
С.Н.
Кузин
//
Эпидемиология
и
вакцинопрофилактика. – 2004. - №4. – С. 39-41.
53. Лазовская, Н.В. Влияние физических и химических методов на степень
инактивации вируса иммунодефицита человека / Н.В. Лазовская, З.И.
120
Барисенко, Е.Л. Гасич и др. // Журнал «Медицинские новости». – 2007. №13. - С. 7-11.
54. Макаров, В.И. Разработка баллонных волоконно-оптических катетеров
для внутрисосудистой флуоресцентной диагностики и фотодинамической
терапии / В.И. Макаров, С.Ю.Васильченко, С.Г. Кузьмин и др. // Лазерная
медицина. – 2011. – 15(2). - С. 68.
55.
Макаров,
О.В.
Молекулярные
механизмы
инфекционного
невынашивания беременности / О.В. Макаров, Л.В. Ганковская, И.В.
Бахарева, В.В. и др. // РМЖ. – 2009. - №2. – С. 24-29.
56. Макаров, О.В. Невынашивание беременности и врожденный иммунитет /
О.В. Макаров, Л.В. Ковальчук, Л.В. Ганковская и др. // Невынашивание
беременности инфекционного генеза. - М.: Гэотар-Медиа, 2007. – С. 12-16.
57. Макаров, О.В. Изменение показателей иммунитета у пациенток с
невынашиванием беременности инфекционного генеза в I триместре / О.В.
Макаров, Л.А. Озолиня, Т.Н. Сумеди // Рос.вестник акушера-гинеколога. –
2008. -№6. –С. 28-32.
58. Макацария, A.Д. Вирусные инфекции, тромбофилия и синдром потери
плода / А.Д. Макацария, Н.В. Долгушина // АГ-инфо. – 2008. – №2. – С. 7-12.
59. Марченко, Л.А. Генитальный герпес: новые грани проблемы /
Л.А.Марченко, И.П. Лушкова // Проблемы репродукции. - 2006. -№3. - С.15.
60. Марченко, Л.А. Дифференцированная тактика ведения больных с
генитальным герпесом / Л.А. Марченко, И.П. Лушкова // Гинекология. - 2005.
- том 7, №3. – С. 159- 163.
61. Махарадзе, Н.А. Квантовая терапия. Применение аппаратов АФС в
терапии различных заболеваний. Методическое пособие / Н.А. Махарадзе //
М.: Под. ред. канд. физико-математических наук Б.В. Зуева. – 2010. – С. 7-15.
62. Мельниченко, А.В. Сравнительная оценка показателей интерферонового,
иммунного и цитокинового статуса при комплексном исследовании больных
с герпесвирусными инфекциями / А.В. Мельниченко, М.В. Мезенцева, И.М.
Шаповал и др. // Вопр. вирусологии. – 2011. - №6. – С. 33-36.
121
63. 100. Молочков, В.А. Генитальные вирусные инфекции. Руководство для
венерологов / В.А. Молочков, Т.Б. Семенова, В.И. Киселев и др. // М.:
Бинорм. – 2009. – с. 207.
64. Мамедова, С.Ю. Влияние эндоваскулярного лазерного облучения крови
на иммунологические показатели у женщин с генитальным герпесом / С.Ю.
Мамедова, Н.К. Матвеева, Н.С. Логинова и др. // Материалы конференции
«Критические состояния в акушерстве, гинекологии и неонатологии». – М. –
2003. – С. 84-85.
65. Нагоев, Б.С. Состояние клеточного иммунитета у больных генитальным
герпесом / Б.С. Нагоев, З.А. Камбачокова // Сборник материалов IV
междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные
инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и
терапия», Москва. – 2011. – С. 55-56.
66. Оразмурадов А.А. Особенности плацентарного ложа матки при
осложнениях беременности и экстрагенитальных заболеваниях: автореф. дис.
… д-ра мед. наук: 14.00.01 / Оразмурадов Агамурад Акмамедович. - М.: 2003.
- 47 с.
67. Орджоникидзе, Н.В. Цитомегаловирусная инфекция и беременность /
Н.В. Орджоникидзе, В.Л. Тютюнник // Акушерство и гинекология. - 2002. №3. — С. 59-63.
68.
Пальчун,
В.Т.
Современный
взгляд
на
антимикробную
фотодинамическую терапию / В.Т. Пальчун, А.С. Лапченко, А.А. Лапченко и
др. // Вестник отоларингологии. – 2009. - №3. - С. 4-6.
69.
Петросян,
Л.А.
Иммунологические
аспекты
привычной
потери
беременности (обзор литературы) / Л.А. Петросян // Проблемы репродукции.
- 2008. - №2. - с.62-67.
70. Подзолкова, Н.М. Применение препарата Панавир у женщин с
привычным
невынашиванием
беременности,
ассоциированным
с
цитомегаловирусной инфекцией / Н.М. Подзолкова, В.Б. Осадчев, И.Б.
Жислина // Пособие для врачей. М.: Министерство здравоохранения и
122
социального развития Российской Федерации; НИИ физико-химической
медицины. - 2009. – С. 26.
71. Подольский, И.Я. Фуллерены помогут восстановит нарушения памяти? /
И.Я. Подольский, Е.В. Кондратьева, И.В. Щеглов // Перс Ттм . -2002. – 9(22). –
С. 6-7.
72.
Полюбина,
Е.В.
Озонотерапия
в
реабилитации
женщин
при
невынашивании беременности ранних сроков / Е.В. Полюбина, Е.Л. Бойко,
А.А. Мартенова и
др. // Реаниматология и интенсивная терапия.
Анестезиология, приложение «Озон и методы эфферентной терапии в
медицине». - Нижний Новгород, 2000. -№4. - С.101-102.
73. Попов, Н.Н. Клиническая иммунология и аллергология: Учебное пособие
для врачей / Н.Н. Попов, В.Ф. Лавров, Э.Н. Солошенко Э.Н. // М.: Медицина.
– 2004. – С.34-40.
74. Попова, А.Ф. Клинические и лабораторные аспекты герпетической
инфекции у пациенток в невынашиванием беременности / А.Ф. Попова, В.Л.
Пастушенков // Журнал акушерства и женских болезней. – 2010. - №LIX (6).
– С. 58-68.
75. Посисеева, Л.В. Иммунология беременности / Л.В. Посисеева //
Акушерство и гинекология. – 2007. - №5. – С. 42-45.
76. Рахманова, А.Г. Герпес-вирусные инфекции и ВИЧ-инфекциии / А.Г.
Рахманова, В.л. Пригожина, В.А. Неверов // Санкт-Петербург. – 1995. – С. 50.
77. Романов, В.П. Фотоинактивация микроорганизмов in vitro в присутствии
фотосенсибилизаторов / В.П. Романов, Т.А. Терещенко, Н.И. Назарикова //
Сибирский медицинский журнал. - 2001. -№1. - С. 33-35.
78. Савельева, Г.М. Акушерство / Г.М. Савельева, Р.И. Шалина, Л.Г.
Сичинава и др. // Невынашивание беременности. – М.: Гэотар-Медиа, 2008. –
С. 297-298.
79. Сидельникова, В.М. Подготовка и ведение беременности у женщин с
привычным невынашиванием / В.М. Сидельникова // Методические пособия
и клинические протоколы.- М.: МЕДпресс-информ, 2011. - С. 7.
123
80.
Сидельникова,
В.М.
Привычная
потеря
беременности
/
В.М.
Сидельникова // М.: «Триада –Х», 2005. - С. 49-58.
81. Соловьева, А.С. Цитокиновая регуляция системного иммунного ответа у
беременных с герпес-вирусной инфекцией / А.С. Сольвьева, М.Т. Луценко //
Дальневосточный медицинский журнал. – 2009. -№ 2. - С. 42-44.
82. Сорокатый А.Е. Фотодинамическая терапия в урологии / А.Е. Сорокатый,
Д.М. Ягудаев, М.В. Маркова // Лазерная медицина. - 2006. – 10(3). - С. 58-61.
83. Соснова, Е.А. Предгравидарная подготовка пациенток с вирусными
инфекциями / Е.А. Соснова // Вопросы гинекологии, акушерства и
перинатологии. – 2011. - №10(5). – С. 72-78.
84. Сотникова, Н.Ю. Иммунные аспекты беременности / Н.Ю. Сотникова //
Рос. журнал иммунологии. – 2005. - №10(2). – С. 79-83.
85. Странадко, Е.Ф. Фотодинамическое воздействие на патогенетические
микроорганизмы
(Современное
состояние
проблемы
антимикробной
фотодинамической терапии) / Е.Ф. Странадко, И.Ю. Кулешов, Г.И.
Караханов // Лазерная медицина. – 2010. - №14(2). - С. 52-56.
86. Странадко, Е.Ф. Механизмы действия фотодинамической терапии / Е.Ф.
Странадко // Российский онкологический журнал. – 2000. - №4. - С. 52-56.
87. Сухих, Г.Т. Генитальный герпес / Г.Т. Сухих, Л.В. Ванько // М.: Миклош,
2010. - С. 7-8., 53-54.
88. Сухих, Г.Т. Механизмы иммунной защиты при острых и хронических
заболеваниях органов репродуктивной системы / Г.Т. Сухих, Л.В. Ванько //
Акушерство и гинекология. – 2006. – приложение. – С. 17-24.
89. Тетруашвили, Н.К. Клинико – анамнестический анализ и структура
причин привычных ранних потерь беременности / Н.К. Тетруашвили // Врач.
– 2008. - №7. – С. 4-7.
90. Узденский, А.Б. Клеточно-молекулярные механизмы фотодинамической
терапии / А.Б. Узденский // М.: Наука. – 2010. – С. 35-38.
91. Усова, А.В. Состояние иммунной системы во II триместре беременности
у женщин с ее невынашиванием и на фоне коррекции / А.В. Усова, Т.М.
124
Соколова, И.М. Поздняков и др. // Рос. вест. ак. и гин. – 2012. - №1, том 12. –
С. 13-15.
92. Фиалкина, С.В. Подавляющее действие лазерного облучения длиной
волны 1270 нм на репликацию вирионов бактриофага / С.В. Фиалкина //
Материалы научно-практической конференции с международным участием,
посвященной 25-летию ФГУ «ГНЦ лазерной медицины ФМБА России»,
Москва, 2011г. Лазерная медицина. - 2011. – 15(2). - С.113.
93. Халдин, А.А. Дифференцированный подход к лечению и вторичной
профилактике рецидивов простого герпеса / А.А. Халдин, М.А. Самгин //
Рос. журн. кож. и вен. бол. - 2004. - № 4. - С. 36-39.
94. Хашукоева, А.З. Фотодинамическая терапия – противовирусная терапия?
История вопроса. Перспективы применения / А.З. Хашукоева, О.А. Свитич,
Э.А. Маркова и др. // Лазерная медицина. – 2012. -№16(2). – С. 63-67.
95. Хосровян, А.М. Внутривенное лазерное облучение крови у пациентов в
послеоперационном периоде – динамика показателей микроциркуляции /
А.М. Хосровян, Л.В. Мусихин, В.С. Ширяев // Лазерная медицина. – 2011. №15(1). – С. 4-12.
96. Цахилова, С.Г. Плазмаферез и фотомодификация крови при лечении
беременных женщин с вирусной инфекцией : автореф. дис. ... д-ра мед. наук :
14.00.01 / Цахилова Светлана Григорьевна. – М., 1999. – 45 с.
97.
Ширинкин,
С.В.
Монография.
Медицинские
нанотехнологии.
Перспективы использования фуллеренов в терапии болезней органов
дыхания [отв.ред. докт. мед. наук, проф. М.В.Покровский] / С.В. Ширинкин,
Т.О. Волкова, Н.Н. Немова // Петрозаводск: Карельский научный центр РАН.
- 2009. – С. 52-53, 113-114.
98. Шульженко, А.Е. Герпетические инфекции человека. Перспективы
диагностики и противовирусной терапии / А.Е. Шульженко // С-Пб. –
Цитокины и воспаление. – 2005. - №4(3). – С. 76-81.
99. Шульженко, Е.А. Подходы к иммунотерапии рецидивирующего простого
герпеса / Е.А. Шульженко, И.Н. Зуйкова // Эффективная фармакотерапия в
акушерстве и гинекологии. - 2010. - №3. – с. 1-4.
125
100. Ягудаев, Д.М. Современный взгляд на механизм фотодинамической
терапии. Фотосенсибилизаторы и их биодоступность / Д.М. Ягудаев, А.Е.
Сорокатый, А.В. Гейниц и др. // Урология. – 2006. - №5. - С.94-98.
101. Якубовская, Р.И. Влияние фотодинамической терапии на состояние
иммунной системы и антиоксидантный статус у онкологических больных /
Р.И. Якубовская, В.В.Соколов, Е.Р. Немцова // Рос. онкологический журнал.
– 1997. - №2. - С. 27-32.
102. Aboagye-Mathiesen, G. Human trophoblast interferons: production and
possible roles in early pregnancy / G. Aboagye-Mathiesen, F.D. Tóth, M.
Zdravkovic et. al. // Early Pregnancy. – 1995. - №1(1). – Р. 41-53.
103. Anzivino, E. Herpes simplex virus infection in pregnancy and in neonate:
status of art of epidemiology, diagnosis, therapy and prevention / Е. Anzivino, D.
Fioriti, M. Mischitelli et. al. // Virol. Journal. – 2009. - №6. – Р. 40-50.
104. Bachmann B., Knuver-Hopf J., Lambrecht B. // J. med. Virology. – 1995. –
Vol. – P. 172-178.
105. Baker, DA. Consequences of herpes simplex virus in pregnancy and their
prevention / D.A. Baker // Curr. Opin. Infect Dis. – 2007. -№20. – Р. 73–76.
106. Ball, E. Expression of TGF beta in the placental bed is not altered in sporadic
miscarriage / E. Ball, S.C. Robson, S. Ayis et. al. // Placenta. – 2007. - №28(8-9). –
Р. 965-971.
107. Baran, S. The interferons. Mechanisms of action and clinical applications / S.
Baran, S.K. Tyring et al. // JAMA. – 1991. - №266(10). – Р. 1375-1383.
108. Ben-Hur, E. Potodynamic inactivation of retroviruses by phthalocyanines: the
effect of sulfonaction, metal ligand and fluorid / Ben-Hur Е., R.S. Hoeben, H.
Ormondt et al. // J. Potochem. Photobiol. - 1992. - Vol. 13. - P. 145-152.
109. Biron, C.A. Natural killer cells in antiviral defense: function and regulation by
innate cytokines / C.A. Biron, K.B. Nguyen, G.C. Pien // Annu. Rev. Immunol. –
1999. – Vol. 17. – P. 189-220.
110. Bolhassani, A. Different specter of therapeutic vaccine development against
HPV infections / А. Bolhassani, Е. Mohit, S. Rafati // Hum. Vaccine. – 2009. –
Vol. 28. – Р. 5-10.
126
111. Brojeni, P.Y. A systematic review of the fetal safety of interferon alpha /
P. Yazdani Brojeni, I. Matok, F. Garcia Bournissen et. al. // Journal of
Reproductive Toxicology. – 2012. -№33. – Р. 265–268.
112. Brown, ZA. Genital herpes complicating pregnancy / Z.A. Brown, C.
Gardella, A. Wald et. al. // Obstet Gynecol. – 2005. – Vol. 106. - Р. 845–856.
113. Calleja-Agius J. Placental villous expression of TNFα and IL-10 and effect of
oxygen tension in euploid early pregnancy failure / J. Calleja-Agius, Е. Jauniaux,
S. Muttukrishna // Am. J. Reprod. Immunol. – 2012.- №67(6). – Р. 515-25.
114. Carpentier Pamele A. Placental TNF-α signaling in illness-induced
complications of pregnancy / Pamele A. Carpentier, Dingman Andra L., Theo D.
Palmer // Am. J. of Pathology. – 2011. - №178(6). – Р. 2802-2810.
115. Castano A. Photodynamic therapy and anti-tumor immunity / А. Castano, Р.
Мroz, М. Hamblin // Nature Rev. Cancer. – 2006. – Vol.6. – P. 535-545.
116. Cataldo, F. Medicinal Chemistry and Pharmacological Potential of Fullerenes
and Carbon Nanotubes / F. Cataldo, T. Da Ros et.al. // Photodiagnosis and
Photodynamic Therapy. - 2008 -. P. 107-121.
117. Chan, T. Innate and adaptive immunity against herpes simplex virus type 2 in
the genital mucosa / Tiffany Chan, Nicole G. Barra, Amanda J. Lee et. al. //
Journal of Reproductive Immunology. – 2011. - №88. – Р. 210–218.
118. Chen, S. Synergistic anti-herpes effect of TNF-alpha and IFN-gamma in
human corneal epithelial cells compared with that in corneal fibroblasts / S. Chen,
J.E. Oakes, R.N. Laushch // Antiviral Res. – 1994. – Vol. 25. – P. 201-213.
119. Corey, L. Once-daily valacyclovir to reduce the risk of transmission of genital
herpes / L. Corey, A. Ward, R. Patel et. al. // Engl. J. Med. – 2004. - Vol. 350. – P.
11-20.
120. Cousins, E. Molecular biology of human herpesvirus 8: novel functions and
virus-host interactions implicated in viral pathogenesis and replication / Е.
Cousins, J. Nicholas // Recent Results Cancer Res. – 2014. - №193. –Р. 227-268.
121. Das, C. Network of cytokines, integrins and hormones in human trophoblast
cells / C. Das, V. Kumar, S. Gupta et al. // J. Reprod Immunol. – 2001. - Vol. 53,
№1-2. – P. 257-268.
127
122. Duerst, R. Innate immunity to herpes simplex virus type 2 / R Duerst // Viral
Immunol. – 2003. – Vol. 16, №4. – P. 475-490.
123. Ernest, J.M. Obstetric antiphospholipid syndrome: an update on
pathophysiology and management / J.M. Ernest, P.B. Marshburn, W.H. Kutteh
et.al. // Semin. Reprod. Med. – 2011.- №29(6). – Р. 522-539.
124. Gankovskaia, O.A. Role of Toll-like receptors and defensins in antimicrobial
protection of urogenital tract in females / L.V. Koval'chuk, L.V. Gankovskaia, V.F.
Lavrov et. al. // Zh. Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. – 2008. - №1. –Р. 46-50.
125. Gankovskaia, O.A. Study of expression of TLR9, NF-kappaB, TNFalpha
genes in cells of cervical canal mucosa in pregnant women with herpesvirus
infection / О.А. Gankovskaia, I.V. Bakhareva, L.V. Gankovskaia et. al. // Zh.
Mikrobiol. Epidemiol. Immunobiol. – 2009/ - №(2). – Р. 61-64.
126. Gao, M.Z. Effects of EG-VEGF, VEGF and TGF-β1 on pregnancy outcome
in patients undergoing IVF-ET treatment / M.Z. Gao, X.M. Zhao, Y. Lin et. al. // J.
Assist. Reprod. Genet. – 2012. - №29(10). – Р. 1091-1096.
127. Gollnick, Sandra O. Expression of Interleukin 6 and Interleukin 10 As a
Result of Photodynamic Therapy in vivo / Sandra O. Gollnick, Liu Xiaonan,
Owczarczak Barbara et. al. // Cancer research. – 1997. - №15, Р. 3904-3909.
128. Hanzlikova, J. Th1-Th2 response and the atopy risk in patients with
reproduction failure / J. Hanzlikova, Z. Ulcova-Gallova, I. Malkusova et. al. //
American J. of Repr. Immun. – 2009. - №61. – Р. 213-220.
129. He, Y.Y. The decidual stromal cells-secreted CCL2 induces and maintains
decidual leukocytes into Th2 bias in human early pregnancy / Y.Y. He, X.J. He,
P.F. Guo et. al. // Clin. Immunol. – 2012. -№145(2). – Р. 161-173.
130. Hill, J.A. Maternal immunological aspects of pregnancy success and failure /
J.A. Hill, B.C. Choi // In: Human implantation: recent advances and clinical
aspects. Eds: C. Simon, A. Pellicer, C. Doberska // J. Reprod. Fertil. – 2000. –
Vol.55. – P. 91-97.
131. Hristova, K. Critical role of lipid defensins / K. Hristova, M.E. Selsted, S.H.
White et. al. // J. Biol. Chem. – 1997. – Vol. 272. – P. – 24224-24233.
128
132. Jones, С.А. Vertical Transmission of Genital Herpes. Prevention and
Treatment Options / Сheryl A. Jones // Drugs. – 2009. - №69(4). –Р. 421-434.
133. Juarranz, A. Photodynamic therapy of cancer. Basic principles and
applications / А. Juarranz, Р. Jaen, F. Sanz-Rodriguez et. al. // Clin. Transl. Oncol.
– 2008.- Vol.10(3). - P.148-154.
134. Kasermann, F. Buckministerfullerene and Photodynamic Inactivation of
viruses / F. Kasermann, C. Kempf // Rev. in Med. Virology. - 1998. -Vol. 8. - P.
143-151.
135. Kashiwabuchi, R.T. Antimicrobial susceptibility of photodynamic therapy
(UVA/riboflavin) against Staphylococcus aureus / R.T. Kashiwabuchi, Y. Khan,
F.R. Carvalho et. al. // Arq. Bras. Oftalmol. – 2012. - №75(6). – Р. 423-426.
136. Kim S.Y. Tumor necrosis factor blockade and the risk of viral infection / S.Y.
Kim, D.H. Solomon // Nat. Rev. Rheumatol. – 2010.- №6(3). – Р. 165–174.
137. Kim, I.D. Herpes simplex virus 2 infection rate and necessity of screening
during pregnancy: a clinical and seroepidemiologic study / I.D. Kim, H.S. Chang,
K.J. Hwang // Yonsei Med J. – 2012. – Vol. 53(2). –Р. 401-407.
138. Klimova, R.R. The effect of viral infections on the cytokine profile in
pregnant women with obstetric complications and immunotherapy with human
alpha2b interferon / R.R. Klimova, V.V. Malinovskaia, O.V. Parshina et. al. //
Vopr. Virusol. – 2013. -№58(1). –Р. 18-23.
139. Kovalchuk, L.V. Herpes simplex virus: treatment with antimicrobial peptides
/ L.V. Kovalchuk, L.V. Gankovskaya, O.A. Gankovskaya et.al. // Adv. Exp. Med.
Biol. – 2007. - №601. –Р. 369-376.
140. Kruse, M. Mature dendritic cells infected with herprs simplex virus type I,
exhibit inhibited T-cell stimulatory capacity / M. Kruse, O. Rosorius, F. Kratzer et
al. // J. Virol. – 2000. – Vol. 74. – P. 7127-7136.
141. Kvacheva, Z.B. Photodynamic inhibition of infection caused by herpes
simplex virus type 1 in the cultured cells, by using 5-aminolevulinic acid-induced
porphyrins / Z.B. Kvacheva, E.S. Lobanok, V.I. Votiakov et. al. // Vopr. Virusol.
– 2005. - №50(4). – P. 44-47.
129
142. Lim, K.J. Profile of cytokine mRNA expression in peri-implantation human
endometrium / K.J. Lim, О.А. Odukoya, R.A. Ajjan et al. // Mon. Hum. Reprod. –
1998. – Vol. 4, №1. – P. 77-81.
143. Lissauer, D. Profile of maternal CD4 T-cell effector function during normal
pregnancy and in women with a history of recurrent miscarriage / D. Lissauer, O.
Goodyear, R. Khanum et. al. // Clin. Sci. – 2014. - №126(5). –Р. 347-54.
144. Lund J., Sato A., Akira S. Et al. Toll-like-receptor 9-mediated recognition of
herpes simplex virus-2 by plasmacytoid dendritic cells // J. Exp. Med. – 2003. –
Vol. 198. – P. – 513-520.
145. Makhseed, M. Th1 and Th2 cytokine profiles in recurrent aborters with
successful pregnancy and with subsequent abortions / M. Makhseed, R.
Raghupathy, F. Azizieh et al. // Hum. Reprod. – 2001. – Vol. 16, №10. – P. 22192226.
146. Malik, Z. Bacterial effect of photoactivated porphyrins – an alternative
approach to antimicrobal drugs / Z. Malik, J. Hanania, Y. Nitzan // J. Photochem.
Photobiol. B: Biology. - 1990. - Vol.5. - P. 281-293.
147. Meerbach, A. Fatal outcome of herpes simplex virus type 1-induced necrotic
hepatitis in a neonate / A. Meerbach, A. Sauerbrei, W. Meerbach et. al. // Med.
Microbiol. Immunol. – 2006. -№195. – Р.101–105.
148. Moffett, A. The immunological paradox of pregnancy: a reappraisal / A.
Moffett, Y. W. Loke // Placenta. – 2004. -№1. – Р. 1-8.
149. Moor, A.C. Primary targets for fotoinactivation of vesicular stomatitis virus
by AIPcS4 or Pc4 and red light / A.C. Moor, A.E. Wagenaars-van-Gompel, A.
Brand et. al. // Photochem. Photobiol. – 1997/ - №65(3). – Р. 465-470.
150. Mujugira, A. Daily acyclovir to decrease herpes simplex virus type 2 (HSV-2)
transmission from HSV-2/HIV-1 coinfected persons: a randomized controlled trial
/ А. Mujugira, A.S. Magaret, C. Celum et. al. // J. Infect. Dis. – 2013. - №208(9). –
Р. 1366-1374.
151. Nafee, N. Antibiotic-free nanotherapeutics: hypericin nanoparticles thereof
for improved in vitro and in vivo antimicrobial photodynamic therapy and wound
130
healing // N. Nafee, A. Youssef, H. El-Gowelli et.al. // Int. J. Pharm. -2013. -№15;
454 (1). – Р. 249-258.
152. North, J. Photodynamic inactivation of free and cell-associated HIV-1 using
the photosensitizer, benzoporphyrin derivative / J. North, R. Coombs, J. Levy // J.
Acquir. Immune Defic. Syndr. – 1994. - №7(9). – Р. 891–898.
153. Ocak Z.
Association of recurrent pregnancy loss with chromosomal
abnormalities and hereditary thrombophilias / Z. Ocak, T. Özlü, O. Ozyurt // Afr.
Health Sci. – 2013. - № 13(2). – P. 447-52.
154. Paz-Bailey, G. Herpes simplex virus type 2: epidemiology and management
options in developing countries / G. Paz-Bailey, M. Ramaswamy, S.J. Hawkes et.
al. // Sex. Transm. Infect. – 2007.- №83. – Р. 16–22.
155. Quinn, K.H. Decidual regulatory T cells in placental pathology and pregnancy
complications / K.H. Quinn, М.М. Parast // Am. J. Reprod. Immunol. – 2013. №69(6). –Р. 533-538.
156. Qureshil, S.T. Toll-like receptors and their role in experimental models of
microbal infection / S.T. Qureshil, I.R. Medzhitov // Genes and Immun. – 2003. –
Vol. 4. – P. 87-94.
157. Raab, O. Uber die wirkung fluoresziender stoffen Infusoria / О. Raab // Z.
Biol. - 1900. - Bd.39. - P. 524-546.
158. Raghupathy, R. The immunology of unexplained recurrent spontaneous
abortion: cytokines as key mediators / Raj Raghupathy // Bulletin of the kuwait
institute for medical specialization.- 2003. - №2.- Р. 32-38.
159. Robertson, S.A. The role of cytokines in gestation / S.A. Robertson, R.F.
Seamark, L.J. Guilbert et. al. // Crit. Rev. Immunol. – 1994. -№14 (3-4). – Р. 23992.
160. Saito, S. Th1/Th2/Th17 and Regulatory T-Cell Paradigm in Pregnancy /
S. Saito, A. Nakashima, T. Shima, M. Ito // American Journal of Reproductive
Immunology. – 2010. -№63. – Р. 601–610.
161. Saraswathy, T.S. Seroprevalence of cytomegalovirus infection in pregnant
women and associated role in obstetric complications: a preliminary study / T.S.
131
Saraswathy, A. Az-Ulhusna, R.N. Asshikin et. al. // Southeast Asian J. Trop. Med.
Public Health. – 2011. - №42(2). – Р. 320-322.
162. Shurshalina, A.V. The ratio of cytokine levels in genital herpes during various
phases of infection / A.V. Shurshalina, V.N. Veryasov, G.T. Sukhikh // Bull. Exp.
Biol. Med. – 2001. - №132(1). – Р. 660-662.
163. Skrzypczak, J. TGF superfamily and MMP2, MMP9, TIMP1 genes
expression in the endometrium of women with impaired reproduction / J.
Skrzypczak, P. Wirstlein, M. Mikolajczyk et. al. // Folia Histochem.
Cytobiologica. – 2007. - 45 Suppl. 1. – Р. 143-148.
164. Tan, D.H. Herpes simplex virus type 2 and HIV disease progression: a
systematic review of observational studies / D.H. Tan, K. Murphy, P. Shah et. al. //
BMC Infect Dis. – 2013. - №28;13(1). – Р. 502.
165. Tao, J.N. Experimental studies on treatment of HSV infections with
photodynamic therapy using 5-aminolevulinic acid / J.N. Tao, S.M. Duan, J. Li //
Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi. – 2007. - №21(1). –Р. 7982.
166. Tilburgs, T. CD8+ effector T cells at the fetal-maternal interface, balancing
fetal tolerance and antiviral immunity / T. Tilburgs, J.L. Strominger // Am. J.
Reprod. Immunol. – 2013. - №69(4). –Р. 395-407.
167. Trzonkowski, P. CD4+CD25+ T regulatory cells inhibit human cytotoxic
activity of CTL and NK cells in humans – impact of immunosense / P.
Trzonkowski, E. Szmit, J. Mysliwska // Clin. Immunol. – 2006. – Vol. 119. – Р.
307-316.
168. Tsakhilova, S.G. Detoxication affect of plasmapheresis in patients with
chronic pid / S.G. Tsakhilova, T.A. Fedorova, T.R Anikina // XY FIGO, Congr.
Obst. Gynecol. Copengagen. – 1997. – Vol. 76, №167. – Р. 38.
169. Vacca, P. Natural killer cells in human pregnancy / P. Vacca, M.C. Mingari,
L. Moretta // J. Reprod. Immunol. – 2013. - №97(1). – Р. 14-19.
170. Van der Meer, A. Membrane–bound HLA–G activates proliferation and
interferon–g production by uterine natural killer cells / А. Van der Meer, H.G.M.
132
Lukassen, M.J.C. van Lierop et al. // Mol. Hum. reprod. - 2004. - Vol. 10, № 3. - P.
189–195.
171. Vibholm, L. Antiviral and Immunological Effects of Tenofovir
Microbicide in Vaginal Herpes Simplex Virus 2 Infection / Line Vibholm, Line S.
Reinert, Ole S. Søgaard // Aids research and human retroviruses. – 2012. – Vol. 28,
№ 11. – Р. 1-8.
172. Wainwright, M. Photoinactivation of viruses / М. Wainwright // Photomed.
Laser Surgery. – 2009. - №27(2). – Р. 357-363.
173. Wald, A. Corey L. Persistence in the population: epidemiology, transmission.
In: Arvin A, Campadelli-Fiume G, Mocarski E, Moore PS, Roizman B, Whitley R,
Yamanishi K (ed) Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis //
Cambridge: Cambridge University Press. - 2007. - Chapter 36.
174.
Watson-Jones,
D.
Use
of
acyclovir
for
suppression
of
human
immunodeficiency virus infection is not associated with genotypic evidence of
herpes simplex virus type 2 resistance to acyclovir: analysis of specimens from
three phase III trials / D. Watson-Jones, A. Wald, C. Celum et. al. // J. clin.
Microbiol. - 2010. - T. 48. № 10. - P. 3496–3503.
175. Weiss, H. Epidemiology of herpes simplex virus type 2 infection in the
developing world / Н. Weiss // Herpes. – 2004. - №11. – Р. 24A–35A.
176. 40. Wilson S. S. Novel approaches in fighting herpes simplex virus infections
/ S. S. Wilson, E. Fakioglu, B.C. Herold // Expert Rev. Anti. Infect. Ther. – 2009. Vol. 7(5). – Р. 559–568.
177. Yang, Y.G. Photodynamic therapy of condyloma acuminata in pregnant
women / Y.G. Yang, X. B. Zou, H. Zhao et. al. // Chin. Med. J. – 2012. №125(16). – Р. 2925-2928.
178. Zenclussen, A.C. Adaptive immune responses during pregnancy / A.C.
Zenclussen // Am. J. Reprod. Immunol. – 2013. - №69(4). – Р. 291-303.
179. Zhao F.X. Effect of blockage of costimulatory signal on murine abortionprone model / F.X. Zhao, Y.Y. Zhang, R.H // Chinese medical Journal. – 2007. №120(14). – Р. 1247-1250.
133
180. Zingoni, A. NK cell regulation of T cell-mediated responses / A. Zingoni, T.
Sornasse, B.G. Cocks et. al. // Immunology. – 2005. – Vol. 42(4). – Р. 451-454.
134
Документ
Категория
Биологические науки
Просмотров
18
Размер файла
1 648 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа