close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

238.Экологическая токсикология Методические указания

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Министерство образования и науки Российской Федерации
Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова
Кафедра физиологии человека и животных
ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ТОКСИКОЛОГИЯ
Методические указания
Ярославль 2004
1
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ББК Е 081я73
Э 40
УДК 574+615.9
Составитель Е.В. Рябухина
Экологическая токсикология: Метод. указания / Сост. Е.В. Рябухина; Яросл. гос. ун-т. Ярославль, 2004. 47 с.
Предназначено для студентов факультета биологии и экологии,
обучающихся по специальности 013100 Экология (дисциплина "Экологическая токсикология", блок ОПД), очной формы обучения.
Табл. 3.
Рецензент: кафедра физиологии человека и животных Ярославского государственного университета им. П.Г. Демидова
 Ярославский государственный университет, 2004
 Е.В. Рябухина, 2004
2
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Растворы, необходимые для поддержания
жизнедеятельности препарата
Для сохранения жизнедеятельности препарата применяют изотонический раствор хлорида натрия (0,65 %-ный раствор для холоднокровных; 0,9 %-ный раствор для теплокровных). Такие растворы называются физиологическими. Для длительного поддержания жизнедеятельности препарата раствор должен содержать кроме хлорида
натрия и другие вещества (табл. 1).
Таблица 1
Растворы, необходимые для поддержания
жизнедеятельности препарата
Наименование
вещества
Физиологический
раствор
для холодно- для теплокровных
кровных
Дистиллирован100 мл
100 мл
ная вода
Хлорид натрия
0,65 г
0,9 г
Хлорид калия
Хлорид кальция
Гидрокарбонат
натрия
Глюкоза
Раствор
Рингера
для холоднокровных
100 мл
Раствор
Рингера - Локка
для теплокровных
100 мл
0,65 г
0,014 г
0,012 г
0,01 г
0,9 г
0,042 г
0,024 г
0,02 г
0,1 г
Способы обездвиживания животных
Чтобы произвести на лягушке острый опыт, ее необходимо прежде всего обездвижить. Обездвиживание достигается применением
наркотических веществ, миорелаксантов, или разрушением центральной нервной системы.
1. Применение наркоза
В качестве наркотических средств используют эфир или алкоголь. Наркотизацию проводят в небольшом эксикаторе, куда помещают лягушку и ватку, смоченную эфиром, либо наливают на дно эксикатора 2%-ный раствор эфира. В случае применения алкоголя 250 300 мл 10%-ного раствора спирта наливают непосредственно на дно
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
эксикатора и опускают животное в раствор на 10 - 15 минут. Миорелаксант (вещество, нарушающее передачу нервных импульсов с нерва на мышцу) в соответствующей дозе, зависящей от свойств выбранного обездвиживающего препарата, вводят в подкожный лимфатический мешок. Расслабление мускулатуры и отсутствие двигательной активности являются показателями действия наркоза.
2. Разрушение головного и спинного мозга
Для выполнения работ по нервно-мышечной физиологии и при
изучении деятельности сердечно-сосудистой системы целесообразно
обездвиживать лягушку разрушением ЦНС с помощью зонда. Это делают следующим образом. Лягушку берут за спинку большим и указательным пальцами правой руки. Завертывают ее в салфетку, оставляя открытой лишь голову. При этом передние лапки нужно плотно
прибинтовать к туловищу, а задние туго спеленать в вытянутом состоянии. Лягушку берут в левую руку спинкой вверх и указательным
пальцем нагибают ей голову. Концом препаровальной иглы (зонд)
проводят по средней линии головы сверху вниз. Проходя по затылочной кости, зонд соскальзывает в ямку. В этом месте под кожей расположена атлантоокципитальная мембрана. Прокалывают кожу и мембрану и, повернув конец иглы кверху, вводят ее (без усилия) через затылочное отверстие в полость черепа, маятникообразными движениями разрушают головной мозг, сначала одно полушарие, затем
другое. После этого слегка извлекают зонд, и, развернув его конец в
противоположном направлении, вводят в спинно-мозговой канал.
Признаком того, что конец зонда попал в мозг, является общее вздрагивание лягушки. Тщательно разрушают спинной мозг, вращая зонд,
несколько извлекая его из канала и снова погружая в него. Общее
расслабление мышц лягушки и отсутствие у нее рефлекторных реакций свидетельствует о полном разрушении головного и спинного
мозга. Спинной мозг должен быть разрушен особенно тщательно иначе нервно-мышечный препарат быстро перестанет реагировать на
раздражение нерва.
3. Декапитация с последующим разрушением спинного мозга
Можно разрушить ЦНС и другим способом. Для этого завернутую в салфетку лягушку держат в левой руке, вводят ей в рот тупую
браншу ножниц и отсекают верхнюю челюсть с черепной коробкой.
В открытый спинно-мозговой канал вводят зонд и вращательными
движениями разрушают мозг. При таком способе обездвиживания
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нервно-мышечный препарат сохраняет возбудимость более длительное время. Однако данный способ более травматичен, так как вызывает значительные потери крови, в связи с чем при работе с сердечнососудистой системой метод с декапитацией применяется редко.
Приготовление
физиологических препаратов
1. Приготовление препарата задних лапок лягушки
Обездвиженную лягушку держат за задние конечности и перерезают позвоночник на 1 см выше сочленения тазовых костей, отделяют всю свисающую часть туловища и большую часть внутренностей.
Захватив большим пинцетом остаток позвоночника, а свободной рукой - край кожи со спины, быстрым движением снимают кожу с обеих лапок, так чтобы она вывернулась наизнанку, подобно чулку. При
снятии кожи надо постараться не разорвать ее. Препарат укладывается на чистую сторону препаровальной доски. После этого необходимо тщательно вымыть руки и инструменты. Кожные железы лягушки
секретируют слизь, обладающую ядовитым действием на возбудимые
структуры. Попадая на мышцы и нервы, она способствует быстрой
потере их возбудимости. Поэтому нельзя допускать контакта обнаженных мышц и нервов с кожей и слизью.
После удаления внутренностей с обеих сторон от позвоночника
видны седалищные нервные сплетения, выходящие из позвоночника
тремя корешками каждый. Таким образом получают препарат двух
задних лапок лягушки.
2. Приготовление препарата изолированной задней лапки лягушки с седалищным нервом (физиологический реоскоп)
Пинцетом держат край позвоночника так, чтобы лапки висели
вниз под прямым углом к позвоночнику, и осторожно большими
ножницами вырезают копчиковую кость - уростиль, который при таком положении препарата выделяется кверху. Для этого осторожно
подрезают мышцы с обеих сторон уростиля до самого позвоночника.
Укладывают препарат на препаровальную доску, смоченную физиологическим раствором. Остаток позвоночника осторожно большими
ножницами рассекают по средней линии, разрезают тазовые кости,
затем в области тазобедренных суставов разъединяют лапки. Одну
лапку помещают в чашку Петри (влажная камера) на фильтроваль5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ную бумагу, смоченную физиологическим раствором (раствором
Рингера).
Вторая лапка подвергается дальнейшей обработке. Придерживая
лапку пинцетом за кусочки оставшихся позвонков, подводят кончики
маленьких ножниц под седалищное сплетение так, чтобы кусочки позвонков остались в соединении с нервом, и перерезают тазовую кость
около позвонков. Нерв отпрепаровывают до тазобедренного сочленения и препарат поворачивают на брюшную сторону. На бедре видны
полуперепончатая, двуглавая и треглавая мышцы. В бороздке между
полуперепончатой и двуглавой мышцами разрывают фасцию сустава
от тазобедренного сочленения до коленного. Двуглавую и полуперепончатую мышцы раздвигают стеклянными крючками. Между ними
лежит седалищный нерв и параллельно ему - бедренная артерия.
Пинцетом приподнимают нерв за кусочки позвоночника и отпрепаровывают его до коленного сустава. Нерв с кусочком позвоночника
отбрасывают на мышцы голени и стопы. Затем большими ножницами
срезают мышцы бедра и перерезают бедренную кость. Таким образом
получают изолированную заднюю лапку лягушки с седалищным нервом (физиологический реоскоп).
3. Приготовление нервно-мышечного препарата
Из изолированной лапки можно приготовить нервно-мышечный
препарат: седалищный нерв + икроножная мышца.
Для этого лапку берут за стопу и поворачивают икроножной
мышцей кверху, сгибают в голеностопном суставе, поверх которого
находится ахиллово сухожилие. Сухожилие подрезают ножницами у
места его прикрепления к кости (как можно дальше к стопе). Затем,
захватив его пинцетом, осторожно отделяют икроножную мышцу до
коленного сустава. Кости голени ниже коленного сустава перерезают
ножницами. Получился нервно-мышечный препарат: седалищный
нерв с половинкой позвоночника + икроножная мышца с ахилловым
сухожилием и коленным суставом.
4. Приготовление препарата изолированной икроножной
мышцы
Для приготовления препарата изолированной икроножной мышцы у обездвиженной лягушки делают круговой надрез кожи бедра
одной из задних лапок и, после снятия кожи, не препарируя нервов,
подсекают ахиллово сухожилие способом, описанным выше, отделяют мышцу и перерезают кости: голени - ниже коленного сустава,
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
бедренную - над коленным суставом, оставляя как можно меньше
мышечной ткани. Во избежание подсыхания мышц и нервов необходимо с помощью глазной пипетки периодически увлажнять их раствором Рингера для холоднокровных. Хранить препарат следует во
влажной камере. При выполнении всех указанных требований готовый препарат не теряет возбудимости достаточно длительное время.
5. Техника обнажения сердца лягушки
Обездвижить лягушку разрушением центральной нервной системы (способ 2). Зафиксировать животное на препаровальной доске булавками брюшком кверху. Захватить пинцетом кожу на середине
брюшка и подсечь ее ножницами. В отверстие ввести тупую браншу
ножниц и произвести разрезы, идущие от середины брюшка к плечевым суставам, а затем по краю нижней челюсти - к ее середине. Кожный лоскут срезать и вымыть инструменты и руки для предотвращения попадания кожного секрета на сердечную ткань. Пинцетом приподнять мечевидный отросток грудины и непосредственно у нижнего
его края сделать небольшой поперечный надрез. При этом не следует
повреждать переднюю брюшную вену, которая идет снизу по средней
линии и несколько ниже мечевидного отростка уходит вглубь к печени. Ввести в разрез браншу ножниц и рассечь справа и слева плечевой пояс. Кожно-мышечный лоскут приподнять и срезать. Под ним
откроется лежащее в перикарде и сокращающееся сердце. Осторожно
приподняв пинцетом перикард, рассечь его в продольном направлении, обнажая сердце.
Для удобства работы с сердцем следует взять на лигатуру его уздечку (физиологи называют уздечку "ручкой сердца"). Для этого надо
подвести стеклянный крючок под желудочек сердца ближе к его основанию. Если крючок прошел правильно, то, приподняв его, Вы
приподнимите и сердце. На крючке Вы обнаружите тончайшую связочку - уздечку. Набросить на кончик крючка нитку, протянуть ее под
уздечкой и перевязать возможно ближе к верхушке сердца. Перерезать уздечку между лигатурой и основанием желудочка, укоротить
один конец лигатуры. С помощью лигатуры можно повернуть сердце
в любую сторону.
7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Моделирование интоксикаций
и постановка токсикологического эксперимента.
Экспрессные методы определения токсичности
химических соединений
При экспрессной оценке токсичности первоначальная концентрация (доза) испытывается на 6 - 10 мелких лабораторных животных
(мышах, крысах); определяется концентрация (доза), вызывающая
гибель части животных, взятых в опыт. В дальнейшем по принципу
геометрической прогрессии или регрессии определяют среднесмертельную дозу или концентрацию (DL50; CL50). Токсический эффект
каждой дозы (концентрации) определяют на 5 - 6 животных, продолжительность наблюдений - две недели.
Условия определения токсичности следует максимально стандартизировать, так как на исход опыта может оказать существенное
влияние ряд факторов, в том числе и наполнение желудка. Поэтому
при определении энтеральной токсичности исследуемое вещество
вводят не ранее чем через 4 часа после лишения подопытных животных корма и питья.
При определении острой токсичности обычно ориентируются на
следующие показатели: внешний вид животного (состояние и блеск
шерстного покрова, опрятность, активность позы); общее состояние и
"поведение" (возбуждение или угнетение, подвижность, изменение
"походки"); изменение реакции на внешние раздражители или физиологических функций организма (дыхания, сердцебиения, веса тела,
характера выделений из носа, глаз, рта); наличие мышечных подергиваний, тремора, парезов и параличей; динамика развития интоксикации после введения яда, характер и ее исход (быстротечность или затянутость развития интоксикации, сроки гибели животных или восстановление нормальных функций). Регистрация макроскопически
видимых изменений внутренних органов с установлением весовых
коэффициентов позволяет оценить характер токсического действия
исследуемого вредного химического вещества.
При определении токсичности в качестве растворителя обычно
используются вода, а в случае плохой растворимости в ней - подсолнечное масло, реже другие растворители. Каждая из исследуемых
доз, как правило, вводится в объеме 0,2 мл на 20 г веса тела.
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Методы оценки токсичности химических соединений
В результате воздействия химических веществ на организм проявляются как специфический, так и общетоксический эффекты. Используемые для их выявления методы соответственно делятся на
специфические и неспецифические, последние получили в промышленной токсикологии название интегральных.
В основу интегральных методов положен принцип, сущность
которого состоит в том, что независимо от точки приложения действия яда нарушение общего состояния организма проявляется в ряде
неспецифических функциональных сдвигов.
Примером интегральных показателей может служить функциональное состояние центральной нервной системы, которое, учитывая
наличие прямых и обратных связей, будет изменяться при действии
любого фактора, в любой точке организма, если это действие имеет
достаточную силу.
В числе интегральных методов могут быть названы такие, как
метод условных рефлексов, способность центральной нервной системы к суммации подпороговых импульсов, определение двигательной активности, потребление кислорода, определение мышечной силы, вес тела животных, и др.
К их числу могут быть отнесены и функциональные пробы,
предъявляющие организму повышенные требования и позволяющие
выявить иногда еще скрытые изменения. Наиболее широко из таких
проб используются: продолжительность плавания животных; длительность восстановления прямолинейного движения мышей после
кратковременного вращения в центрифуге; ортостатическая проба
для кроликов.
Специфические методы направлены на выявление действия, которое характерно, точнее говоря специфично, для того или иного соединения или для класса соединений.
Угнетение активности ацетилхолинэстеразы, например, характерно для фосфорорганических соединений, нарушение кроветворения - для хронического действия бензола, нарушение порфиринового
обмена - для свинца, паралитическое действие - для орто-изомера
трикрезилфосфата, и т.д.
Для выявления специфического действия могут привлекаться физиологические, клинические, биохимические, гистологические и дру9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
гие методы, позволяющие характеризовать функциональные, обменные или структурные изменения, обусловленные действием яда.
Совершенно очевидно, что деление методов на специфические и
интегральные носит условный характер.
Для характеристики таких специфических эффектов, как раздражающий, сенсибилизирующий, гонадотропный, эмбриотропный, мутагенный, бластомогенный, используются специальные методические
приемы.
Так, для веществ, раздражающих слизистые оболочки, важно определение пороговых концентраций для животных, например по изменению частоты дыхания, а для человека - по субъективным ощущениям. Раздражающее действие при нанесении вещества на кожу
экспериментальных животных оценивается по местным реакциям, резорбтивное действие - по клинической картине или физиологическим
и биохимическим показателям функционального состояния органов и
систем. Для определения проникновения вещества через кожу с успехом используются соединения, меченные радиоактивными изотопами, методы гистохимии.
Выявление сенсибилизирующего действия проводится разными
методами, но все они предусматривают предварительную сенсибилизацию организма путем повторного накожного нанесения или внутрикожного введения вещества. Сенсибилизация выявляется после
введения разрешающей дозы. Оценка сенсибилизирующего эффекта
проводится по местным и общим реакциям.
Занятие 1. Интегральные методы оценки
токсичности химических соединений
Человек соприкасается с промышленными ядами, как правило,
выполняя одновременно большую или меньшую физическую работу.
Физическая нагрузка, оказывающая мощное и разностороннее влияние на все органы и функциональные системы организма, не может
не отразиться на условиях резорбции, распределения, превращения и
выделения ядов, а в конечном итоге - на течение интоксикации.
Важным аспектом данной проблемы является оценка влияния
промышленных ядов на способность выполнять физическую нагрузку, т.е. на работоспособность организма.
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В большинстве случаев острая и тем более хроническая интоксикация при действии некоторых инсектицидов, диэлдрина, стирола,
бутилацетата, окиси углерода, бензина, солей тяжелых металлов
снижает "работоспособность" животных в экспериментальных условиях (при плавании в воде, беге в третбане, висении на деревянных
стержнях, и других способах исследования). Охлаждение в сочетании
со взвешиванием и измерением мышечной силы (после одноминутного плавания белых мышей) позволяет градуированно оценивать степень токсического воздействия солей тяжелых металлов (хлориды
свинца, марганца, ртути).
Лабораторная работа № 1. Продолжительность
плавания животных как показатель интоксикации
(метод функциональных проб)
Задание: изучить влияние токсических веществ на мышечную
силу по продолжительности плавания лягушки.
Для работы необходимо: две лягушки, две стеклянные емкости
объемом 2 литра, шприцы на 2 мл - 2 шт, раствор фенола (50 мг/л),
раствор Рингера.
Методика исследования
Опытной лягушке ввести в подкожный лимфатический мешок
брюшка 2 мл раствора фенола с концентрацией 50 мг/л, контрольной 2 мл раствора Рингера. Через 15 минут контрольную (интактную) и
опытную лягушек посадить в эксикаторы, заполненные отстоянной
водой. Лапки лягушек при плавании не должны доставать до дна эксикатора. Отметить время начала эксперимента. Наблюдать за поведением лягушек и при первых признаках утомления, т.е. при опускании
животных на дно эксикатора, закончить эксперимент. Сравнить продолжительность плавания опытной и контрольной лягушек.
Оформить протокол. Сделать выводы.
Лабораторная работа № 2. Влияние
токсических веществ на показатели мышечной силы
по времени плавания (утомляемости) мышей
Задание: изучить влияние токсических веществ на мышечную
силу по времени плавания (утомляемости) мышей.
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Для работы необходимо: две белые мыши, две стеклянные емкости объемом 2 литра, шприцы на 2 мл – 2 шт., растворы хлорида
марганца или хлорида свинца с концентрацией 10 мг/л, корнцанг, зажим, пинцет, раствор пикриновой кислоты, стеклянная палочка.
Методика исследования
На спине одной мыши сделать пометку красителем и ввести ей
внутрибрюшинно 1 мл раствора хлорида марганца или хлорида свинца с концентрацией 10 мг/л (опытная мышь). Другой мыши ввести
внутрибрюшинно 1 мл раствора Рингера (контрольная мышь).
Чтобы ввести раствор, необходимо одному из студентов взять
мышь корнцангом за кожу холки и зажимом за хвост, перевернуть
животное вверх животом и удерживать в таком положении на столе.
Другому студенту (заранее приготовить шприц с исследуемым раствором), приподняв пинцетом кожу на брюшке животного, проколоть
иглой шприца брюшную стенку и медленно ввести раствор в брюшную полость. Заметить время с момента введения раствора и посадить мышь обратно в клетку.
Через 15 минут контрольную и опытную (с меткой) мышей с помощью корнцанга осторожно, не смачивая шерсть на голове и спине,
посадить в емкости с водой (следить, чтобы мыши не смогли выбраться из емкости). Отметить время начала эксперимента. Наблюдать за поведением мышей и при первых признаках утомления, т.е.
при погружении животных с головой под воду, закончить эксперимент. Сравнить продолжительность плавания опытной и контрольной
мышей. Проанализировать, для каких целей применяется метод
функциональных нагрузок.
Оформить протокол. Сделать выводы.
Лабораторная работа № 3. Изменение
мышечной силы при воздействии
химических веществ
Сократительную способность изолированной мышцы оценивают
совершенной ею работой. При анализе экспериментальных данных
необходимо учитывать особенности сокращений мышцы в связи с отсутствием кровотока и с ограниченными запасами энергии и кислорода, связанного с миоглобином мышцы (диффузия кислорода из
воздуха незначительна), а также с отсутствием ресинтеза ферментов
12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
аэробного и анаэробного гликолиза. Кроме того, в изолированной
мышце затруднено удаление углекислого газа и недоокисленных
продуктов обмена.
В модельном эксперименте усиление или ослабление метаболических процессов в работающей мышце происходит также при контакте мышечной ткани с токсическим агентом. Таким образом, изменение функционального состояния мышцы сказывается на выполняемой ею работе.
Задание: на изолированном нервно-мышечном препарате лягушки определить силу икроножной мышцы в контроле и при воздействии на нее токсических веществ. Рассчитать работу мышцы при поднятии различных грузов.
Для работы необходимо: лягушка, препаровальный набор, миограф, электростимулятор с раздражающими электродами, линейка,
набор грузов, раствор Рингера, раствор фенола (50 мг/л), приготовленный на растворе Рингера, чашка Петри ("влажная камера"), нитки,
вата, глазные пипетки – 2 шт.
Методика исследования
При динамическом движении мышцы выполняют внешнюю работу, которая характеризуется силой, умноженной на путь перенесения груза.
Приготовить два нервно-мышечных препарата задних лапок лягушки (следить, чтобы кожная слизь не попала на нерв или мышцу).
Препараты состоят из икроножной мышцы с сухожилием, коленным
суставом и седалищным нервом, заканчивающимся фрагментом
спинного мозга и позвоночника. Один препарат поместить во "влажную камеру" с раствором Рингера для повтора эксперимента, другой
укрепить в штативе, подцепив верхним крючком за коленный сустав,
а нижним - за сухожилие икроножной мышцы. Крючки раздвинуть до
умеренного натяжения мышцы. Бедренный нерв должен свисать свободно, причем дистальный конец - лежать на раздражающих электродах, а фрагмент позвоночника и спинного мозга - на держателе электродов. Икроножную мышцу обернуть тонким слоем ваты, смоченной раствором Рингера (контрольный раствор) и в процессе всего
эксперимента периодически увлажнять им нерв и мышцу.
Подготовка стимулятора к работе.
1. Включить тумблер "сеть", при этом загорается сигнальная
лампочка.
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. Установить режим раздражения (род работы – “пуск”) - одиночные импульсы от выносной кнопки.
3. Подсоединить раздражающие электроды к прибору.
4. Установить длительность стимула 1 мс.
5. Найти порог раздражения нерва, постепенно увеличивая силу
раздражения от нуля.
Подвешивая на нижний подвижный крючок миографа различной
величины грузы, найти наибольший вес, который может поднять икроножная мышца лапки лягушки. Сила мышцы равна этому весу в
граммах (г).
После этого на нижнем крючке оставить половину этого веса. Рядом закрепить линейку таким образом, чтобы ее нулевое деление
совпадало визуально с концом нижнего крючка. Это позволит замерить путь перемещаемого груза. Нанося раздражение от стимулятора,
каждый раз замерять путь. Раздражения повторять до тех пор, пока
мышца не перестанет перемещать груз. Умножив вес груза в граммах
на суммарный путь (в см), для чего следует сложить расстояния каждого отдельного перемещения), получают работу, выполненную икроножной мышцей в несистемной единице (г × см).
Аналогичным образом найти силу второй икроножной мышцы
лягушки, предварительно обернув ее тонким слоем ваты, смоченной
раствором фенола с концентрацией 50 мг/л (в процессе всего эксперимента периодически увлажнять препарат исследуемым раствором).
Оформить протокол. Сделать вывод о влиянии токсических веществ на силу и работу мышц. Проанализировать возможные механизмы действия исследуемого вещества.
Лабораторная работа № 4. Утомление мышцы
при воздействии токсических веществ
в модельном эксперименте
В нервно-мышечном препарате имеется промежуточное звено двигательная пластинка, имеющая относительно низкую лабильность.
Возникающее периферическое торможение предохраняет мышцу от
истощения.
Утомление мышцы характеризуется увеличением длительности
ее сокращения, уменьшением амплитуды сокращения и появлением
контрактуры, т.е. неполного расслабления мышцы после каждого со14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
кращения. Вследствие этого кривая сокращения мышцы (миограмма)
по мере развития ее утомления будет постепенно отходить от исходного уровня записи. При полном утомлении мышца перестает сокращаться.
Задание: изучить влияние токсических веществ на развитие
утомления нервно- мышечного препарата лягушки при непрямом
раздражении мышцы.
Для работы необходимо: лягушка, самописец Н-338, миограф,
фотопреобразователь с блоком питания, электронный стимулятор с
выносной кнопкой, универсальный штатив с лапками, препаровальный набор, раствор Рингера, раствор медного купороса с концентрацией 3 мг/л, приготовленный на растворе Рингера, вата, “влажная камера”, глазные пипетки – 2 шт.
Методика исследования
Перед началом работы проверить работу установки. Установка
готова к работе, если после подключения к сети блока питания и самописца перо самописца при легком нажатии на подвижный рычажок
миографа (имитация сокращения фиксированной на миографе мышцы) отклоняется от нулевой линии. Электронный стимулятор установить в следующем режиме:
- переключатель "род работ" в положение "пуск",
- частота - 1 гц,
- длительность стимула - 1,0 мс,
- амплитуда стимула - 5 V.
Подключить стимулятор к миографу.
Приготовить два нервно-мышечных препарата лягушки (следить,
чтобы кожная слизь не попала на нерв или мышцу). Препараты состоят из икроножной мышцы с ахилловым сухожилием, коленным
суставом и седалищным нервом, заканчивающимся фрагментом позвоночника.
Один препарат поместить во "влажную камеру" с раствором Рингера для повтора эксперимента, другой укрепить в штативе, подцепив
верхним крючком за коленный сустав, а нижним - за сухожилие икроножной мышцы. Крючки раздвинуть до умеренного натяжения
мышцы. Бедренный нерв должен свисать свободно, причем дистальный конец должен лежать на раздражающих электродах, а фрагмент
позвоночника и спинного мозга - на держателе электродов. Икроножную мышцу обернуть тонким слоем ваты, смоченной раствором Рин15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
гера (контрольный раствор) и в процессе всего эксперимента периодически увлажнять им нерв и мышцу. С помощью выносной кнопки
нанести на нерв одиночное раздражение с указанными выше параметрами. Растяжением мышечного волокна добиться максимальной
амплитуды отклонения пера самописца при максимальном одиночном сокращении мышцы. Установить на самописце скорость движения ленты 1 мм/сек. Поменять на стимуляторе частоту раздражения с
1 на 10 гц и перевести переключатель “род работ” в положение
“внутр.”. Мышца должна сокращаться в тетаническом режиме (гладкий тетанус).
Записать на самописце тетанические сокращения контрольной
мышцы до ее полного утомления. Повторить эксперимент с другим
(опытным) препаратом при орошении его раствором медного купороса (3 мг/л), при одинаковой скорости движения ленты самописца.
Проанализировать записи. Сравнить силу (в мм высоты записи) и
продолжительность (в сек.) обоих тетанусов. Оформить протокол.
Сделать выводы.
Занятие 2. Особенности
предварительной оценки и установления
расчетных ПДК веществ, обладающих запахом,
привкусом и раздражающим действием
В аспекте предварительной токсикологической оценки с расчетным прогнозированием ориентировочных ПДК (ВДК, ОБУВ) в первую очередь обращает внимание тот факт, что даже для воздушной
среды далеко не во всех случаях лимитирующим показателем является
общетоксическое действие. Например, для ряда производных меркаптана лимитирующим показателем оказался порог запаха. Для некоторых веществ характерно раздражающее действие, уровень которого
также может существенно отличаться от параметров общетоксического действия.
При прогнозировании ПДК в воде водоемов, естественно, непременным требованием должно быть определение возможности придания веществом воде характерного запаха, вкуса (горький, кислый, неприятный и т.д.) или окраски.
16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Учитывая экспрессный характер исследования, вкус и запах обследуемых веществ, а также появление окраски, вероятно, следует
определять на уровне теоретически ожидаемой (расчетной) ПДК по
токсикологическому показателю, что позволит в значительной мере
обеспечить безопасность проведения наблюдений на добровольцах.
Кроме того, при такой постановке эксперимента сразу определяется
лимитирующий показатель вредности (органолептический или токсикологический).
В настоящее время расчетный метод прогнозирования ПДК в воде водоемов можно распространять на те вещества, для которых есть
убедительные основания полагать лимитирующим санитарнотоксикологический показатель вредности. Если же приходится предполагать иные лимитирующие показатели вредности (органолептический, общесанитарный), то возникает необходимость постановки соответствующих экспериментов. Заключение в таких случаях возможно только после сопоставления расчетной ПДК по параметрам острой
токсичности или физико-химическим константам с результатами изучения влияния вещества на санитарный режим водоема и с показателями органолептических свойств.
Таким образом, в настоящее время расчет ориентировочных ПДК
(ОБУВ, ВДК) в воде водоемов по параметрам острой токсичности
нуждается в дополнении сведениями о влиянии на санитарный режим
водоемов, о порогах запаха и о придании воде привкуса или окраски.
Порог запаха химических веществ при установлении гигиенического норматива определяют в трех последовательно возрастающих
категориях. Минимальная из них определяется концентрацией, ощущаемой только отдельными и наиболее чувствительными к этому запаху лицами. Фактически этот порог позволяет ориентировочно
представить наличие контингента лиц, особенно чувствительных к
данному запаху. Вероятно, большее практическое значение имеет
средняя категория установления пороговой концентрации по ощущению специфического запаха большинством добровольцев. И, наконец, третья категория порога запаха, когда он становится непереносимым или сочетается уже с порогом раздражающего действия.
Критериями оценки всех трех категорий порога запаха обычно
признаются субъективные ощущения, которыми можно руководствоваться и при определении порога запаха у наиболее чувствительных
лиц, и у большинства добровольцев.
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Если теоретически ожидаемая расчетная ПДК обладает выраженным запахом или раздражающим действием, то следует установить
соответствующий порог. За пороговую концентрацию принимается
имеющая интенсивность ощущения в два балла, воспринимаемая хотя бы одним из добровольцев.
Лабораторная работа № 5. Методика
органолептического исследования воды
Орган обоняния у человека обладает большой чувствительностью, позволяющей определить по запахам ничтожно малые количества различных веществ, образующихся в результате химических
процессов (например, фенол и его производные, нефть и продукты ее
перегонки, смолы и дегти, канифоль, камфора, тимол, ментол, эфирные масла из хвои, смоляные кислоты). Большая группа соединений
из числа пестицидов также улавливаются органолептически, особенно фосфорорганические соединения.
Следует особо отметить, что концентрация большинства сильно
пахнущих веществ, определяемых органолептически, находится ниже
границы, при которой они действуют токсически.
Чувствительность, или острота обоняния, колеблется в широких
пределах и зависит от многих условий. Восприятие запаха значительно усиливается при повышении температуры и снижается при ее понижении. Уменьшение остроты обоняния может наблюдаться в случае утомления, при ряде заболеваний (ринит, грипп), в результате
адаптации к тому или иному запаху при длительном его воздействии.
В принятой классификации запахи воды характеризуются терминами:
- землистый - запах влажной почвы,
- болотный - запах торфа,
- аптечный - запах йодоформа,
- углеводородный - запах нефти,
- хлорный, гнилостный, навозный, рыбный, сероводородный, и т.д.
Иногда запахи воде придает почвенная микрофлора (чаще актиномицеты), особенно после пуска в эксплуатацию искусственных водоемов и каналов.
18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Запахи и вкусы воде могут придавать и представители фитопланктона, например:
Астерионелла - слабовыраженный землистый, при значительных
концентрациях - запах герани, при больших количествах - рыбный
запах;
Табеллярия - ароматический, гераневый, рыбный;
Пандорина - рыбный;
Анабена - запах плесени, настурции, при разложении - свиного
хлева;
Малломонас - фиалки, ароматный, рыбный.
При анализе воды определяют характер запаха, пользуясь терминами, указанными выше.
Интенсивность запаха выражается по пятибалльной системе, согласно следующей классификации:
Оценка интенсивности запаха воды в баллах
Балл
Термин
0 Никакого
1 Очень слабый
2
Слабый
3
Заметный
4
Отчетливый
5
Очень сильный
Описательное определение
Запаха не ощущается
Запах, не поддающийся определению потребителем,
но обнаруживаемый в лаборатории
Запах, поддающийся обнаружению потребителем, если обратить на него внимание, но сам по себе не привлекающий внимания
Запах, который легко замечается и может вызвать неодобрительные отзывы о воде
Запах, который легко замечается и может заставить
воздержаться от питья
Запах настолько сильный, что вода непригодна для
питья
Задание: установить пороговое разведение и пороговую концентрацию различных веществ по органолептическому показателю (по
характеру и интенсивности запаха).
Для работы необходимо: растворы: аммиака - 10%-ный, фенола - 0,5%-ный, карбофоса - 1%-ный; широкогорлые колбы емкостью
100 мл - 15 шт.; пипетки химические на 1 мл - 3 шт.; пипетки химические на 10 мл - 3 шт.; мерные цилиндры на 100 мл - 3 шт.; груши резиновые для пипеток – 3 шт.; дистиллированная вода – 1 литр; карандаш по стеклу, стекла - крышки для колб.
19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Методика исследования
Для определения запаха в широкогорлую колбу емкостью 100 мл
налить 10 мл испытуемого раствора. Колбу закрыть чистым стеклом,
встряхнуть, производя вращательные движения, отнять стекло и определить характер и интенсивность запаха по пятибалльной шкале
(соблюдать технику безопасности работы с химическими веществами!).
Установить пороговые разведения и пороговые концентрации
предлагаемых веществ, производя разведение маточных растворов
дистиллированной водой в 10, 100, 1 000 и большее количество раз
(т.е. в геометрической прогрессии с шагом 10 n, где n = 0, 1, 2, 3…),
с указанием исходной концентрации маточных растворов токсических веществ. Результаты оформить в виде таблицы:
Вещество, исходная концентрация
Разведение
Концентрация,
мг/л
Баллы
Оформить протокол опыта. Сделать выводы.
Лабораторная работа № 6. Методики оценки
порога раздражающего действия
химических веществ на верхние дыхательные пути
мелких лабораторных животных
Ведущим критерием ощущения запаха, естественно, на всех этапах токсиколого-гигиенических и гигиенических исследований остается ощущение запаха людьми. Однако определенное представление
о наличии запаха или раздражающего действия можно получить и в
экспериментах на животных.
Для оценки порога раздражающего действия на верхние дыхательные пути у мелких лабораторных животных учитываются интегральные показатели, рефлекторные реакции и функциональное состояние слизистых оболочек (Н.Г. Иванов и др., 1973). В качестве интегральных показателей, например, можно применять определение
времени сгибательного рефлекса у кроликов, спонтанную активность
белых мышей, показатель суммационной способности центральной
нервной системы. Многими учеными доказано, что при адекватных
20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
методиках регистрации порог раздражающего действия у крыс находится на уровне, близком таковому у человека.
Задание: установить пороговые разведения и пороговые концентрации токсических веществ по запаху и раздражающему действию
на лабораторных животных. На основании результатов исследования
сделать вывод о возможности экстраполяции данных, полученных на
животных, на человека.
Для работы необходимо: белые мыши и крысы, клетка для мелких лабораторных животных, корнцанги, чашки Петри – 3 шт., хлебные сухарики, мерные колбы на 100 мл - 3 шт., мерные цилиндры на
100 мл - 3 шт., пипетки химические на 1,0 и 10,0 мл – по 3 шт., дистиллированная вода, карандаш по стеклу, растворы: фенола - 0,5%ный, карбофоса - 1%-ный, аммиака - 10%-ный.
Методика исследования
Белым мышам и крысам предлагать хлеб, смоченный растворами
исследуемых веществ различных разведений (концентраций). Установить пороговые разведения и концентрации по запаху и раздражающему действию следующих веществ: фенола, аммиака и карбофоса, производя разведение исходных маточных растворов в геометрической прогрессии с шагом 10 n, где n = 0, 1, 2, 3… Наблюдать за
поведением животных, отмечая характер реакции на конкретную
концентрацию исследуемого вещества. За недействующую концентрацию принимается та, при которой животное сразу же начинает поедать корм.
По результатам наблюдений составить таблицу. Оформить протокол. Сделать выводы.
Занятие 3. Первичная оценка кожнорезорбтивного действия химических веществ
Выявление местного и раздражающего действия химических веществ в известной мере возможно уже при определении острой токсичности, но при этом требуется постановка специальных экспериментов. В системе предварительной токсикологической оценки при
постановке таких опытов можно ограничиваться мелкими лабораторными животными - белыми мышами и крысами.
21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Определение наличия раздражающего эффекта различных веществ (в том числе и новых) является серьезным основанием для рекомендации многообразных профилактических мероприятий, исключающих прямой контакт кожи и слизистых оболочек с таким химическим веществом. Одним из самых простейших приемов является
нанесение исследуемого вещества на слизистую глаз лабораторного
животного, а при наличии раздражающего действия - установление
концентраций растворов этого вещества, которые указанным действием не обладают.
Определение пороговой по раздражающему действию концентрации можно рассматривать как один из простых количественных
показателей, позволяющих характеризовать силу рассматриваемого
токсического свойства вещества.
Количественным показателем раздражающего действия на глаз
может быть изменение толщины роговицы в результате набухания,
интенсивность и площадь ее помутнения, а также суммарное в условных баллах поражение роговицы, конъюнктивы и радужной оболочки
(Burton, 1972). Для этих целей в конъюнктивальный мешок вводят в
зависимости от агрегатного состояния каплю или кристалл вещества
и наблюдают, как нарастает и стихает реакция раздражения, переходит ли она в воспаление или некроз тканей.
В качестве показателя местного раздражающего действия можно
рассматривать и изменение проницаемости сосудов к витальным красителям на месте внутрикожного введения растворов исследуемых
веществ в различных концентрациях. За показатель раздражающего
действия принимается время окраски кожи на месте инъекции исследуемого раствора, а также величина концентрации, которая этот эффект вызывает. В таких опытах кроликам в ушную вену за 5 минут до
опыта вводится краситель (5 мл 1%-ного водного раствора трипанового синего). Коэффициент корреляции между пороговыми концентрациями и силой раздражающего действия равен 0,97 (при Р < 0,01),
а между концентрациями, вызывающими рефлекторную остановку
дыхания и нарушающими проницаемость сосудов кожи, - 0,98 (при
Р < 0,01). Метод пригоден для веществ с растворимостью в воде до
0,1%.
Разносторонний характер наблюдаемых изменений позволил условно разделить вещества по силе местного и общего действия на три
группы:
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1) вещества, обладающие выраженным раздражающим действием: вызывают гиперемию с резкой инъекцией сосудов слизистой
оболочки и отечностью, слезотечение, а также помутнение роговицы
и некроз слизистой;
2) вещества, обладающие умеренным раздражающим действием: не вызывают видимых органических изменений тканей, таких,
как некроз и помутнение роговицы;
3) вещества со слабым раздражающим действием: могут вызывать лишь кратковременную слабую гиперемию слизистой оболочки
глаз или даже не вызывать у подопытных животных видимых изменений.
При исследовании чрезвычайно- или высокотоксичных веществ
даже при внесении в конъюнктивальный мешок лишь одной капли
может развиться картина общего отравления, вплоть до гибели животных. К работе с такими веществами следует проявлять особую осторожность.
Местное и кожно-резорбтивное действие химических веществ
может определяться в опытах на белых мышах и крысах. Степень
выраженности кожно-резорбтивного действия химических веществ,
как известно, зависит от физико-химических свойств вообще и от
растворимости в жирах и в воде в частности. Общепринято считать, что белые мыши вполне соответствуют требованиям при изучении кожно-резорбтивного действия, так как у них отношение поверхности тела к массе и объему является небольшим. Площадь хвоста
двадцатиграммовой мыши равна 4,5 см2, что составляет ~6% всей поверхности тела. Поверхность обеих кистей рук человека составляет от
всей поверхности тела 4,5%.
Конечно, нельзя безоговорочно переносить данные о кожнорезорбтивной токсичности с одного вида животных на другие без
дополнительных проверочных опытов, так как сама проницаемость
кожи и скорость всасывания веществ через кожу у разных видов лабораторных животных и человека неодинаковы. Еще большее значение, даже при одинаковой резорбции и при одной и той же величине
(в %) соприкасающейся поверхности кожи, имеет отношение всей
поверхности тела к его массе. Площадь поверхности тела человека
равна 2 м2, а масса - 70 кг, для мыши площадь поверхности тела 65,7 см2, при массе 20 г.
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рассчитывая отношения, имеем:
2 м2
20 000 см2
65,7 см2
––––– = ––––––––– ~ 0,3; –––––––– = 3,28.
70 кг
70 000 г
20 г
Таким образом, отношение поверхности кожных покровов к массе тела у человека приблизительно в 11 раз меньше, чем у мыши.
Концентрация яда, которую можно создать в организме мыши,
при проникновении вещества через кожу за единицу времени (при
поверхности соприкосновения, равной определенному проценту всей
поверхности тела), будет значительно выше, чем для человека при
тех же условиях.
Поэтому в случае отрицательного результата, полученного в
опытах с мышами, можно быть уверенным, что нет оснований ожидать опасного кожно-резорбтивного действия у человека. Вместе с
тем, если у белых мышей развивается кожно-резорбтивное действие,
то оно вполне возможно и у человека, но интенсивность и опасность
его в тех же условиях много меньше.
Кроме вышеуказанных методов, для качественной характеристики раздражающего и кожно-резорбтивного действия химических веществ уже давно используется функция мерцательного эпителия пищевода лягушки и трахеи крыс.
Лабораторная работа № 7. Влияние
токсических веществ на движение ресничек
мерцательного эпителия пищевода лягушки
Клетками мерцательного эпителия выстлана поверхность дыхательных, пищеварительных и половых путей разных животных. Движение ресничек мерцательного эпителия обеспечивает перемещение
жидкости и твердых частиц в соответствующем направлении. Гребное движение осуществляется распрямленной ресничкой, а возвратное - согнутой, чем достигается одностороннее перемещение среды
относительно закрепленной клетки. Ресничные движения - достаточно сложный процесс, сходный с механизмом мышечных сокращений,
и осуществляется специальными сократительными белками с АТФазной активностью. Кроме источника энергии АТФ здесь, как и в
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
мышце, играет роль пластификатора, так как в отсутствие АТФ реснички застывают в одном положении. Существенную роль в движениях ресничек играют ионы Mg2+ и Ca2+. При росте концентрации
Са2+ в среде происходит остановка движения ресничек.
Важной чертой работы мерцательных эпителиев является согласованность, координированность движения ресничек в пласте клеток - метахрональные волны, что делает гребные движения ресничек
высокоэффективными. Механизм этой координации сложен и недостаточно изучен. По-видимому, он основывается на клеточных взаимодействиях. Также на мерцательную активность влияют нейромедиаторы вегетативной нервной системы (ацетилхолин, адреналин и
т.д.). Их действие осуществляется через изменение кальциевой проницаемости клеток эпителия.
Задание: изучить влияние растворов фенола и ФОС на мерцательную активность ресничек эпителия пищевода лягушки.
Для работы необходимо: препаровальная дощечка, булавки,
препаровальный набор, нитки, толченый древесный уголь, секундомер, линейка, фильтровальная бумага, раствор Рингера, глазные пипетки; растворы: фенола с концентрацией 50 мг/л и ФОС (карбофос) с
концентрацией 250 мг/л.
Методика исследования
Лягушку обездвижить разрушением головного и спинного мозга
и закрепить на препаровальной дощечке спинкой вниз. Пинцетом
приподнять нижнюю челюсть, ввести тупую браншу ножниц в полость рта и разрезать по средней линии нижнюю челюсть и пищевод
вплоть до желудка. Расправить пищевод и укрепить в таком положении булавками. С помощью раствора Рингера и фильтровальной бумаги освободить поверхность слизистой пищевода от слизи и сгустков крови.
Регистрация движения ресничек проводится визуально. Для этого
нитками наметить верхнюю и нижнюю границы отрезка пищевода
длиной 10 мм и поместить у верхней границы крупинку древесного
угля. Следить за движением угля по мерцательному эпителию и отметить по секундомеру время, в течение которого будет достигнута
нижняя граница. Зная пройденное расстояние, рассчитать линейную
скорость (мм/сек) передвижения частиц мерцательным эпителием
пищевода.
25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Повторить измерение скорости движения уголька после смачивания поверхности пищевода сначала раствором ФОС, а затем раствором фенола, предварительно отмыв поверхность эпителия раствором
Рингера. Излишки жидкости осторожно удалять с помощью фильтровальной бумаги. Сравнить опытные данные с контрольными. Проанализировать результаты, используя данные литературы.
Оформить протокол опыта. Сделать выводы.
Лабораторная работа № 8. Исследование
раздражающего и кожно-резорбтивного действия
химических веществ (по изменению частоты
дыхания лягушки)
Частота дыхания у лягушки изменяется в широких пределах при
воздействии различных факторов, в том числе и антропогенных (химическое загрязнение окружающей среды). По частоте дыхательных
движений лягушки можно судить о реакции организма животного на
различные внешние воздействия.
Задание: изучить влияние токсических веществ на дыхательную
функцию лягушки, используя аппликацию вещества, обладающего
кожно-резорбтивным действием, на кожу передней лапки животного.
Проанализировать механизм действия токсиканта.
Для работы необходимо: лягушка, препаровальная дощечка с
булавками, бинт, почкообразный тазик, универсальный штатив, фотопреобразователь с серфинкой, блок питания, самопишущий регистратор Н-338, глазной скальпель, вата, пипетки глазные, стеклянная
трубочка, маленькая резиновая груша, отстоянная вода, растворы:
фенола (50 мг/л), карбофоса (250 мг/л).
Методика исследования
Установка для графической регистрации дыхательных движений
лягушки включает препаровальную доску, универсальный штатив с
фотопреобразователем, серфинку, закрепляющуюся на коже диафрагмы рта лягушки, самописец для регистрации дыхательных движений.
С целью обездвиживания у лягушки производится поперечная перерезка спинного мозга на уровне 4 – 5-го сегментов. Она осуществляется без наркоза уколом тонкого скальпеля в позвоночник животного
на 0,5 см выше тазового сочленения. Тщательность перерезки контролируется отсутствием рефлексов с задних конечностей на передние.
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
У оперированной лягушки перебинтовать место перерезки спинного мозга и зафиксировать животное булавками за бинт на препаровальной доске спинкой книзу. Серфинкой захватить диафрагму рта.
Наладить графическую регистрацию дыхательных движений лягушки. В течение 1 - 2 минут записать исходные дыхательные движения
диафрагмы (контроль), затем, не прекращая записи, нанести на одну
из передних лапок лягушки раствор исследуемого вещества и в течение 2 - 3 минут регистрировать дыхательные движения (отметить на
диаграммной ленте момент нанесения раствора, а также название и
используемую концентрацию вещества). Не допускать подсыхания
кожных покровов лягушки.
Повторить эксперимент с другим токсикантом, предварительно
промыв лапку большим количеством отстоянной воды и записав исходный ритм дыхания. Подсчитать частоту и амплитуду дыхательных
движений лягушки в контроле и через каждые 10 секунд после воздействия химического вещества. Проанализировать результаты,
обосновать изменение дыхательной функции при воздействии веществ на кожу лягушки.
Оформить протокол опыта. Сделать выводы.
Занятие 4. "Избирательная токсичность" ядов
Как при прямом контакте с покровными тканями, так и, особенно, после резорбции во внутренние среды организма яд может действовать на любые ткани (протоплазматические яды, наркотики) или
лишь на некоторые из них. В последнем случае речь идет об избирательном или элективном действии яда.
Избирательность действия может быть обусловлена химическим
сродством яда к определенным структурам, различной растворимостью в воде, жирах, липоидах, различиями в структуре и обмене в самих тканях, и т. д. Один и тот же яд может обладать разной "избирательностью" в зависимости от пути поступления, дозы и состояния
организма.
Избирательное действие яда на орган или систему органов определяет характерные черты клинической картины при той или иной
интоксикации.
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
По "избирательной токсичности" яды могут быть разделены на
вещества с преимущественным воздействием на ЦНС, сердце, желудочно-кишечный тракт, печень, кожные покровы. Так,
- кардиотоксическое действие (нарушение ритма и проводимости сердца) оказывают: сердечные гликозиды - дигиталис, диоксин;
растительные яды - аконит, чемерица, хинин; животные яды - тетродотоксин; соли бария, калия;
- нейротоксическое действие (нарушение психической активности, параличи) оказывают: психофармакологические средства (наркотические анальгетики (обезболивающие), транквилизаторы (успокаивающие), седативные (снотворные) средства; фосфорорганические
соединения, угарный газ, алкоголь и его суррогаты;
- гематотоксическое действие (гемолиз, метгемоглобинемия)
оказывают: анилин и его производные, нитриты, бензол, толуол, ксилол и др.
Однако для многих из них характерно токсическое действие одновременно на несколько органов или систем организма, например на
ЦНС и сердце (аконит), сердце и желудочно-кишечный тракт (чемерица, дигиталис), печень и почки (яды растений: гелиотропа, крестовника) и т.д. Тем не менее, избирательное токсическое действие на
определенный орган всегда проявляется раньше и при меньшей дозе
токсического начала ядовитого вещества, попавшего в организм.
Изменения в системе крови
Неспецифические изменения в морфологическом составе крови и
ее физико-химических свойствах наблюдаются при многих острых
интоксикациях промышленными ядами.
Большинство острых отравлений сопровождается также типичной стрессорной реакцией с характерными для нее проявлениями в
крови - лимфопенией, эозинопенией, гранулоцитозом. Кроме того,
есть яды, обладающие специфическим действием на гемопоэз и форменные элементы крови. К наиболее часто встречающимся проявлениям токсического поражения системы крови относится нарушение
деятельности кроветворных органов, проявляющееся в прогрессирующей лейкопении, тромбоцитопении и анемии. Нарушение гемопоэза наблюдается при длительном отравлении бензолом и его гомологами. Особое место среди токсических анемий занимает свинцовая
анемия, в основе патогенеза которой лежит нарушение синтеза гемоглобина.
28
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Первичное токсическое действие на костный мозг сопровождается повреждением митохондрий и рибосом эритробластов и выбросом
в кровь неполноценных эритроцитов (свинец, бензол, мышьяковистый водород, сероуглерод).
Специфическим свойством блокировать гемоглобин со всеми вытекающими отсюда клиническими проявлениями гипоксемии обладают карбоксигемоглобинообразователи (окись углерода - СО) и метгемоглобинообразователи (амидо- и нитросоединения бензола, нитрит натрия, сильные окислители: феррицианид, перманганат калия,
анилин, бертолетова соль и др.). Тяжесть интоксикации зависит в основном от количества образовавшегося мет- и карбоксигемоглобина.
Так, например, отмечают: при содержании в крови 10% карбоксигемоглобина - некоторое снижение работоспособности; при 30%
НbСО - возбуждение, спутанность сознания, головную боль; при 60 70% НbСО - потерю сознания.
Многие промышленные яды снижают иммуноустойчивость организма, о чем легче всего судить по изменениям в крови, например, по
уменьшению фагоцитарной активности лейкоцитов, устойчивости
эритроцитов к гемолизу, и т.п.
Лабораторная работа № 9.
Спектральный анализ физиологических
и патологических соединений гемоглобина
Дыхательные пигменты крови
Пигменты являются окрашенными веществами различной химической структуры. Цвет пигментов обусловлен наличием в их молекулах хромофорных групп, поглощающих свет определенной длины
волны в видимой части спектра. Основные физиологические функции - перенос и депонирование О2 и СО2, участие в тканевом дыхании в окислительно-восстановительных реакциях. Все пигменты являются белками, содержащими металл.
Гемоглобин, миоглобин, гемеритин, хлоркруорин содержат железо, гемоцианин - медь, гемованадин - ванадий. Важнейшими из пигментов являются хромопротеины. Это белки, молекула которых состоит из простого белка и окрашенной простетической группы небелкового характера. В качестве простетической группы многие
пигменты содержат металлопроизводные порфиринов.
29
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Порфирины привлекают особое внимание. Это связано с тем что
они входят как в основной пигмент крови – гемоглобин, так и в зеленый пигмент растений – хлорофилл.
Гемоглобин является наиболее распространенным кровяным
пигментом. Он содержится в эритроцитах всех позвоночных и некоторых беспозвоночных животных (черви, моллюски, членистоногие,
иглокожие), а также в корневых клубеньках некоторых бобовых растений. Молекула гемоглобина содержит четыре одинаковые группы
гема (небелковая пигментная группа) и простой белок глобин типа
альбумина. У животных он отличается по своему аминокислотному
составу, что определяет различие в свойствах гемоглобина. Строение
гема одинаково у всех видов животных и содержит двухвалентное
железо. Именно железо играет ключевую роль в деятельности гемоглобина, являясь его активной, так называемой простетической группой. Одна из валентностей железа реализуется при связывании гема с
глобином, ко второй присоединяется О2 или другие лиганды - вода,
СО2, азиды.
Количество гемоглобина в крови подвержено индивидуальным
колебаниям. Средней нормальной величиной у человека считают
14,0 г/100 см3 крови, что, например, для индивидуума массой 65 кг
составляет около 600 г.
Высчитано также, что 1 г гемоглобина содержит 3,5 мг железа, и,
таким образом, во всех эритроцитах организма его находится 2500 мг.
В процессе переноса кислорода гемоглобин превращается в оксигемоглобин (НbО2). Для того чтобы специально подчеркнуть, что при
этом соединении валентность железа не меняется, реакцию связывания кислорода с гемоглобином называют не окислением, а оксигенацией. Противоположный процесс именуют дезоксигенацией. В том
случае, когда необходимо акцентировать внимание на том, что гемоглобин не связан с кислородом, широко употребляют термин дезоксигемоглобин. Оксигемоглобин имеет ярко-алый цвет, что и определяет
цвет артериальной крови.
Гемоглобин, отдавший кислород, называют восстановленным,
или редуцированным, гемоглобином (Нb). Именно он определяет
вишневый цвет венозной крови.
Гемоглобин, связанный с СО2, называют карбаминогемоглобином, или карбогемоглобином. Гемоглобин особенно легко соединяется с угарным газом - оксидом углерода (II) – СО - с образованием
30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
карбоксигемоглобина. В этом случае закономерности его реакции те
же, что и для кислорода, но химическое сродство СО к гемоглобину
почти в 300 раз выше, чем к О2. Образовавшееся соединение и блокированный угарным газом гемоглобин уже не могут служить переносчиком кислорода. Слабые отравления угарным газом являются процессом обратимым: СО постепенно отщепляется и выводится при
дыхании свежим воздухом.
Гемоглобин, приведенный в соприкосновение с сильно действующими окислителями (перманганат калия, бертолетова соль, нейробензол, анилин), образует соединение метгемоглобин (НbОН),
имеющее коричневый цвет. При этом происходит окисление железа и
переход его в трехвалентную форму. В результате истинного окисления гемоглобин прочно удерживает кислород и в итоге перестает
быть его переносчиком.
Каждый дыхательный пигмент имеет характерный спектр поглощения, несколько варьирующий в зависимости от вида животного.
Производные дыхательных пигментов также имеют свои характерные
спектры поглощения.
Задание: проанализировать спектры поглощения оксигемоглобина, восстановленного гемоглобина и метгемоглобина. Обосновать использование данного метода.
Для работы необходимо: цитратная кровь, дистиллированная вода, спектроскоп, реактив Стокса или гидросульфит натрия, насыщенный раствор железосинеродистого калия, штатив с пробирками, мерный цилиндр на 25 мл, глазные пипетки - 4 шт., зажим типа "лапка".
Методика исследования
Для опыта пригоден спектроскоп прямого зрения, весьма простой
в обращении.
Укрепить спектроскоп в штативе, раскрыть щель коллиматора и
направить ее на достаточно яркий источник света. Уловив спектр, сузить щель для получения наиболее чистого и яркого его изображения.
Чистота и яркость находятся в обратном отношении.
1. Спектр поглощения оксигемоглобина (HbO2). В пробирку налить слабый водный раствор цитратной крови (3 капли крови + 5 мл
дистиллированной воды). Поместить пробирку между источником
света и щелью коллиматора. Определить отличие спектра поглощения оксигемоглобина от сплошного спектра. Картина спектра в значительной степени зависит от разведения крови и толщины ее слоя.
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Обычно видны две полосы поглощения в желто-зеленой части спектра между фраунгоферовыми линиями Д и Е.
2. Спектр востановленного (редуцированного) гемоглобина (Hb).
Для получения спектра редуцированного гемоглобина к раствору оксигемоглобина (повторить процедуру приготовления раствора крови
как указано в п. 1) добавить несколько капель восстанавливающего
вещества. Восстановителями могут служить 5%-ный раствор сернистого аммония, гидросульфита натрия или реактив Стокса.
Для приготовления реактива Стокса смешать равные объемы (по
1 мл) насыщенных растворов соли Мора и Сегнетовой соли, добавить
несколько капель концентрированного раствора аммиака до растворения осадка и разбавить водой до получения раствора зеленой (бутылочной) окраски.
Спектр поглощения редуцированного гемоглобина имеет одну
широкую полосу в той же части спектра (т.е. в желто-зеленой).
3. Спектр поглощения метгемоглобина (HbOH). Для получения
метгемоглобина к водному раствору крови (п. 1) добавить одну - две
капли насыщенного раствора железосинеродистого калия. Раствор
приобретет коричневую окраску.
Спектр поглощения состоит из одной полосы в красной части,
двух - в желто-зеленой части и одной широкой полосы - в синезеленой части спектра. Последнюю полосу видно при прозрачном
растворе и в хорошем спектроскопе.
Оформить протокол. Зарисовать спектры гемоглобина и его производных. Сделать выводы.
Лабораторная работа № 10.
Осмотическая резистентность эритроцитов
как качественный показатель интоксикации
Продолжительность жизни эритроцитов относительно постоянна,
и возраст эритроцитов крови животных в каждый конкретный момент
отражает динамическое равновесие систем кроветворения и кроверазрушения. Одной из общих защитных реакций организма на действие
неблагоприятных факторов является усиление эритропоэза. Молодые
эритроциты более резистентны к повреждающим агентам, чем старые.
Изменения в системе крови могут происходить при различных
интоксикациях вследствие изменения осмотического баланса в орга32
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
низме. До тех пор, пока равновесие между водой и растворенными
веществами (главным образом Na+) не нарушается, объем и осмотическая концентрация внеклеточной и внутриклеточной жидкости остаются постоянными. Распределение воды между вне- и внутриклеточным пространствами зависит от действия осмотических сил.
Разрушение оболочки эритроцитов, сопровождающееся выходом
из них гемоглобина в плазму крови, получило название гемолиза.
Осмотический гемолиз происходит при попадании эритроцитов
в растворы, осмотическое давление которых ниже, чем в плазме крови, - гипотонические растворы. При этом вода начинает поступать
через полупроницаемую мембрану внутрь эритроцита. Клетки сначала разбухают и затем разрываются.
Мерой осмотической стойкости (резистентности) эритроцитов
является концентрация NaCl, при которой начинается гемолиз. Эту
концентрацию принято обозначать, как границу осмотической резистентности эритроцитов. У человека гемолиз начинается в 0,4%-ном
растворе, а в 0,34%-ном растворе разрушаются все эритроциты.
Изменения соотношения между объемами внеклеточной и внутриклеточной жидкости имеют большое клиническое значение. Такие
изменения могут наблюдаться при целом ряде заболеваний (например, при поражениях сердца, печени - фенольная интоксикация или
почек - токсическая нефропатия, приводящая к отекам тканей, повышению артериального давления и т.д. Кроме того, они могут возникать при неправильной схеме терапевтических вливаний. Подобные
изменения объемов водных пространств называют гипергидратацией
(обводнение) или дегидратацией (обезвоживание).
Существует также химический гемолиз, возникающий вследствие попадания в организм химических веществ ("кровяные яды"), вызывающих разрушение белково-липидной оболочки эритроцитов
(эфир, хлороформ, алкоголь, бензол, сапонин и др.)
Таким образом, при некоторых заболеваниях осмотическая
стойкость эритроцитов уменьшается, и гемолиз наступает при
больших концентрациях NaCl в плазме.
О наличии гемолиза и его степени можно судить по появлению
окраски растворителя и наличию осадка эритроцитов. Отсутствие
осадка эритроцитов и окрашенный прозрачный раствор означают, что
произошел полный гемолиз. Наличие осадка и окрашенного непрозрачного раствора свидетельствует о частичном гемолизе. Окрашен33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ный осадок эритроцитов и неокрашенный раствор указывают на отсутствие гемолиза.
Различают минимальную и максимальную границы осмотической
стойкости. Минимальная граница означает концентрацию, при которой появляются первые признаки гемолиза (плазма начинает окрашиваться в розовый цвет, осадок эритроцитов уменьшается, на дне появляется более темный осадок – шкурки разрушившихся эритроцитов). Максимальная граница осмотической стойкости - это первая
концентрация раствора, при которой происходит полный гемолиз
(плазма крови при этом окрашивается в красный цвет и раствор становится прозрачным ("лаковая кровь").
Задание: установить границы осмотической стойкости эритроцитов крови лягушки, крысы, быка. Сравнить полученные результаты с
данными осмотической резистентности эритроцитов человека.
Для работы необходимо: 8 пробирок, карандаш по стеклу, 1%ный раствор хлористого натрия, дистиллированная вода, цитратная
кровь, пипетки химические на 10 мл - 2 шт, пипетка глазная, груша
резиновая.
Методика исследования
Пронумеровать пробирки и приготовить растворы хлористого натрия разных концентраций, используя таблицу 2.
Таблица 2
№
пробирок
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
1% р-р
NaCL, мл
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
Дистил.
вода, мл
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
Полученная концентрация
раствора NaCL, %
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
В каждую пробирку добавить по 3 капли дефибринированной или
стабилизированной цитратом натрия крови (можно не перемешивать). Пробирки оставить на 1 час в штативе или центрифугировать в
течение 5 минут.
34
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Через час просмотреть пробирки (не встряхивать!). Определить
наличие осадка эритроцитов и окраски раствора. Данные занести в
таблицу 3.
В последней графе таблицы отметить концентрации, соответствующие границам минимальной и максимальной осмотической резистентности эритроцитов.
Таблица 3
Концентрация
раствора, %
0.9
0.8
и т.д.
Окраска
раствора
Осадок
эритроцитов
Заключение
Границы
стойкости
Для получения более точных показателей осмотической резистентности эритроцитов готовятся растворы в концентрациях от 0,3
до 0,6% c интервалом 0,02%.
По результатам экспериментов сделать выводы.
Занятие 5. Изменения
в сердечно-сосудистой системе
Поражения сердечно-сосудистой системы при интоксикациях
промышленными ядами проявляется в вегетативно-сосудистой дисфункции, дистрофии миокарда, очаговых органических поражениях.
Некоторые этиленовые углеводороды вызывают спазм периферических сосудов (например, симптом "мертвого пальца"), для эфиров
азотистой кислоты типичен быстрый и резкий сосудорасширяющий
эффект, ведущий к быстрому падению кровяного давления. Дистрофии миокарда, обусловленные нарушением биохимических и биоэнергетических процессов в мышце сердца, нередки при отравлениях соединениями фосфора, мышьяка, динитробензола, эфирами фосфорной кислоты и др. Растворимые соли бария оказывают на миокард
действие, подобное препаратам наперстянки, что связывают с местными нарушениями минерального обмена. Известны инфарктоподобные изменения на ЭКГ при отравлении окисью углерода.
35
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Вторичные изменения миокарда могут быть следствием острого
или хронического поражения нервной системы и органов дыхания.
Так, бензол, органические соединения ртути, свинец снижают
резистентность капилляров, вызывают жировую дистрофию внутренней оболочки сосудов.
Мышьяк обладает выраженным капилляротоксическим действием; воздействуя через вегетативную нервную систему и непосредственно на стенку сосудов, он вызывает паралич капилляров и увеличение их проницаемости.
Дегенеративными изменениями в сосудах миокарда объясняется
избирательное действие на сердце соединений кобальта.
Лабораторная работа № 11. Работа сердца
при отравлениях алкалоидами и гликозидами
Алкалоиды - (<ap. al-qali – щелочь и гр. eidos - вид) - азотсодержащие органические соединения природного, преимущественно растительного происхождения, обладающие свойствами оснований и физиологической активностью; многие алкалоиды токсичны, некоторые
(напр., кофеин, резерпин) применяют в качестве лекарственных
средств.
Атропин - алкалоид, содержится в различных растениях семейства пасленовых: красавке (белладонне), белене, дурмане. Антихолинергическое (холинолитическое, холиноблокирующее) средство, блокирующее преимущественно периферические холинореактивные системы - антагонист холинорецепторов. Способность атропина связываться с холинорецепторами объясняется наличием в его структуре
фрагмента, роднящего его с молекулой эндогенного лиганда - ацетилхолина. Блокируя М-холинорецепторы, он делает их нечувствительными к ацетилхолину, образующемуся в области окончаний постганглионарных парасимпатических (холинергических) нервов. Эффекты действия атропина противоположны поэтому эффектам,
наблюдающимся при возбуждении парасимпатических нервов. Введение атропина в организм сопровождается учащением сердечных
сокращений, понижением тонуса гладкомышечных органов (бронхи,
органы брюшной полости и др.), уменьшением секреции слюнных,
желудочных, потовых и бронхиальных желез. Под влиянием атропина происходит сильное расширение зрачков. Мидриатический эффект
36
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
зависит от расслабления волокон круговой мышцы радужной оболочки, которая иннервируется парасимпатическими волокнами. В больших дозах атропин стимулирует кору головного мозга и может вызвать двигательное и психическое возбуждение, судороги, галлюцинации, иногда паралич дыхания (психотропное, нейротоксическое
действие). Атропин, как реактиватор холинэстеразы, является эффективным антидотом при отравлениях холиномиметическими и антихолинэстеразными веществами, в том числе ФОС.
Кофеин - алкалоид, содержащийся в листьях чая (около 2%), семенах кофе (1 - 2%), орехах кола. Получают также синтетическим путем. Средство, стимулирующее ЦНС (психостимулирующие средства). Сердечная деятельность под влиянием кофеина усиливается, сокращения миокарда становятся более интенсивными и учащаются.
Применяют кофеин при заболеваниях, сопровождающихся угнетением функций ЦНС и сердечно-сосудистой системы, при отравлениях
наркотиками и другими ядами, угнетающими ЦНС. В механизме действия кофеина большую роль играет его угнетающее влияние на фермент фосфодиэстеразу, который тормозит выработку циклического
аденозинмонофосфата (Ц-АМФ). Циклический АМФ, являясь вторичным медиатором, стимулирует метаболические процессы в разных органах и тканях, в том числе в мышечной ткани и в ЦНС.
Гликозиды - (<гр. glykys - сладкий, в сложных словах означает
"сладкий, сахар, глюкоза") - сложные органические соединения типа
эфиров, расщепляющиеся при гидролизе на сахара (гликоны) и бессахаристую часть (агликоны или генины). К растениям, содержащим
сердечные гликозиды, относятся разные виды наперстянки (дигиталис), горицвета, ландыш, разные виды желтушника, строфанта, морозник и т.д. В больших дозах сердечные гликозиды могут вызывать
рвоту (влияние на рвотный центр и хемочувствительные рецепторные
зоны), понос, нарушения деятельности ЦНС (головная боль, беспокойство, бессонница, депрессивные явления, нарушения зрения, резкая брадикардия, экстрасистолия, трепетание желудочков и остановка
сердца). Токсичные дозы вызывают угнетение Na+-K+- насоса, потерю внутриклеточного калия, следствием чего является аритмия.
Дигиталис - наперстянка (Digitalis purpurea), двулетнее травянистое растение, листья которого содержат сердечные гликозиды (дигитоксин и гитоксин), сапонины и другие вещества. Гликозиды наперстянки отличаются наибольшей стойкостью в организме по сравне37
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нию с другими сердечными гликозидами, медленно выводятся из организма и характеризуются высокой степенью кумуляции. Применяется при нарушениях ритма сердца. При передозировке могут приводить к резкой брадикардии, экстрасистолии. Токсические дозы могут
вызывать трепетание желудочков и остановку сердца. При отравлении препаратами дигиталиса назначают атропин, кофеин, калий хлорид, унитиол.
Ландыш - многолетнее травянистое растение сем. лилейных. Все
части растения содержат гликозиды, близкие по химическому строению к гликозидам наперстянки. Основные гликозиды ландыша - конваллятоксин и конваллязид - отличаются малой стойкостью и не обладают кумулятивным эффектом. При попадании в кровь препараты
ландыша оказывают быстрое и сильное влияние на сердечную деятельность.
Строфантин - зрелые семена тропических многолетних лиан
(строфанта гладкого) - содержат очень активный сердечный гликозид
строфантин. Характеризуется высокой эффективностью, быстротой
(эффект при внутривенном введении наблюдается через 5 - 10 минут)
и малой продолжительностью действия. Особенно выражено систолическое действие и относительно мало влияет на частоту сердечных
сокращений и проводимость по пучку Гиса. При передозировке строфантина могут появиться экстрасистолия, резкое замедление пульса.
Задание: установить влияние токсических доз алкалоидов (кофеина и атропина) и сердечных гликозидов (строфантина и настойки
ландыша) на сердечную деятельность лягушки.
Для работы необходимо: лягушка, препаровальный набор,
шприц на 2 мл, ампульные растворы кофеина 10%-ного - 1,0 мл и
строфантина 0,05%-ного - 1,0 мл, настойка ландыша и красавки, раствор Рингера, весы для взвешивания лягушек, установка для фотоэлектрической регистрации кардиограммы (штатив с фотопреобразователем и серфинкой, блок питания), самописец (регистратор Н 338), пипетки химические на 1 мл - 1 шт., стаканчики на 50 мл - 2 шт.,
глазные пипетки - 3 шт.
Методика исследования
Для выполнения работы у лягушки разрушить спинной и головной мозг зондом, поместить на препаровальную доску брюшной поверхностью вверх и зафиксировать за лапки булавками. Обнажить
38
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
сердце. Осторожно, чтобы не повредить сердце, срезать перикард, перерезать уздечку.
Верхушку сердца захватить серфинкой, которая ниткой соединяется с рычажком фотоэлектрического преобразователя (преобразователь укрепляется в штативе над сердцем). Отрегулировать усиление
на самописце и натяжение нити серфинки так, чтобы амплитуда отклонения пера самописца при полном нажатии рычажка фотопреобразователя была в пределах 1,5 - 2 см.
Наладить графическую регистрацию сокращений сердца при оптимальной скорости движения ленты. Записать исходную кардиограмму (контроль). Затем нанести на сердце несколько капель раствора кофеина определенной концентрации (ампульные растворы
разводить раствором Рингера в соотношении 1:10; 1:5; 1:1, начинать
эксперимент с малой концентрации), записать кардиограмму, отметить изменения частоты и силы сердечных сокращений, наличие
аритмий, и т.д.
Отмыть сердце раствором Рингера и спустя 5 минут повторить
эксперимент с другими веществами.
Оформить протокол. Сделать выводы.
Лабораторная работа № 12. Влияние
фосфорорганических соединений на работу сердца
Фосфорорганические вещества (ФОВ) широко применяются в
сельском хозяйстве в качестве инсектицидов, акарицидов, фунгицидов, гербицидов, дефолиантов, десикантов, родентицидов (средства
для борьбы с грызунами). ФОВ используются для обработки садов,
виноградников, овощебахчевых и технических зерновых и зерновобобовых культур, в животноводстве - для борьбы с эктопаразитами
животных.
Кроме того, к ФОВ относятся боевые отравляющие вещества из
группы "нервных ядов" (Ви-газы), имеющиеся на вооружении армий
многих стран мира.
Описание клинических проявлений отравлений, аналогичных воздействию ФОВ, впервые приведено еще в ХVII веке мореплавателем
Куком и английским путешественником Левингтоном. По свидетельству последнего в Калабаре (Нигерия) с древних времен было известно ядовитое действие бобов вьющегося растения Physostigma
39
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
venenosum. В его семенах содержится чрезвычайно ядовитый алкалоид физостигмин (эзерин). Эти бобы служили в Калабаре средством испытания людей, обвиненных в колдовстве, воровстве и других
пороках. При вершении суда (отсюда название -"судилищные бобы")
обвиненному публично предлагали съесть определенное их количество. Если он выживал, то обвиненного оправдывали, однако чаще он
умирал от постепенно нарастающего паралича дыхательных мышц.
Отравление эзерином было подробно описано в первом руководстве по токсикологии на русском языке (Е. Пеликан, 1878). Однако
механизм токсического действия эзерина был раскрыт только во
втором десятилетии ХХ века, которое ознаменовалось открытием
фермента холинзстеразы.
Установлено, что физостигмин блокирует зтот фермент и вызывает нарушение проведения нервных импульсов в центральной и периферической нервной системе. Такие яды получили название антихолинзстеразных веществ, а само открытие было использовано для
получения синтетических заменителей физостигмина.
Были обнаружены другие антихолинэстеразные яды группы ФОВ,
механизм действия которых аналогичен действию физостигмина.
В 1932 году в Берлинском университете доцент Ланге и его ассистентка занялись изучением химических свойств ФОВ и, неожиданно
испытав на себе их токсическое действие, впервые описали их. В результате многие ФОВ долго носили название "эфиры Ланге".
В период Второй мировой войны вновь вернулись к изучению
ФОВ в Германии, в лаборатории Шредера, которая занялась поиском
боевых отравляющих веществ. К концу 1942 года были получены табун, заман, в 1944 году - зарин.
После Второй мировой войны ФОВ попали в США, где эти препараты начали использоваться в качестве пестицидов. В 1949 году
появилось первое сообщение о случаях острых отравлений паратионом среди фермеров (в том числе 6 летальных). В 1954 году впервые
описаны отравления ФОВ среди сельскохозяйственных рабочих в
нашей стране. Начиная с 1950-х годов отравления фосфорорганическими пестицидами распространялись по всем странам мира.
В последние годы в РФ больные с острыми отравлениями ФОВ
составляют 5 - 10% общего числа больных, поступающих в специализированные токсикологические центры.
40
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
По химическому строению ФОВ относятся к следующим группам:
1) эфиры тиофосфорной кислоты - метафос (диметилпаратион),
метилэтилтиофос, метилнитрофос, трихлорметафос (ТХМ);
2) эфиры дитиофосфорной кислоты - карбофос (малатион), фосфамид, фталофос, фозалон;
3) амиды пирофосфорной кислоты - октаметиламид и др.;
4) эфиры фосфорной кислоты - хлорофос, дихлордивинилфосфон (ДДВФ), хлорет.
ФОВ представляют собой либо твердые кристаллические вещества, либо прозрачные желтовато-коричневые маслянистые жидкости,
имеющие неприятный специфический запах.
Большинство ФОВ обладают высокой летучестью, тяжелее воды,
хорошо растворимы в органических растворителях (кислота, толуол,
ацетон, хлороформ и т.д.) и плохо растворимы в воде. Однако некоторые препараты (хлорофос, метилацетофос и др.) растворимы в воде. Хорошая жирорастворимость ФОВ обусловливает их свободное
проникновение через неповрежденную кожу, различные биологические мембраны, гематоэнцефалический барьер.
Важным свойством ФОВ является их малая стойкость, обусловленная способностью быстро, в течение нескольких суток, гидролизоваться в щелочной среде (почве), а также при действии высокой
температуры. Однако в кислых почвах или при наличии слабокислой
среды в растениях и животных тканях некоторые ФОВ сохраняются
более длительно - до нескольких месяцев.
Под влиянием физических и химических факторов внешней среды ФОВ претерпевают своеобразные изменения - изомеризацию,
трансалкилирование, в процессе которых образуются более активные
и токсичные соединения. Эти реакции могут наблюдаться при хранении ФОВ в их водных растворах. Например, при температуре 35°С в
течение одного дня токсичность метилмеркаптофоса увеличивается в
30 раз. Летальная доза для человека при применении внутрь метафоса - 0,2 - 2,0 г, карбофоса, хлорофоса, трихлорметафоса - 5,0 - 10,0 г.
При ингаляционном поступлении наиболее токсичны меркаптофос,
метафос, смертельные концентрации которых меньше 20 мг/м3. Менее токсичны фосфамид, метилацетофос, хлорофос, карбофос. Смертельная концентрация этих препаратов - в пределах от 20 до
100 мг/м3, пороговая - от 3 до 30 мг/м3.
41
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ведущим звеном в механизме действия ФОВ на биологические
структуры, и в частности на организм человека, является нарушение
каталитической функции ферментов холинэстераз. Вследствие этого
возникает расстройство обмена ацетилхолина, выражающееся в характерных изменениях центральной и вегетативной нервной системы,
а также в нарушениях деятельности внутренних органов и скелетной
мускулатуры.
Ацетилхолин является медиатором ЦНС, участвует в передаче
импульсов с двигательных нервов на мышцы, во всех ганглиях (как
парасимпатических, так и симпатических). Ацетилхолин накапливается в окончаниях нервных волокон и под влиянием нервных импульсов вызывает деполяризацию мембран, изменение их проницаемости,
перераспределение ионов К+ и Nа+, которые лежат в основе передачи
нервного импульса. Эти процессы реализуются в течение доли миллисекунды, их прерывистость обусловлена быстрым гидролизом ацетилхолина ферментами холинэстеразы (ХЭ).
При взаимодействии ХЭ и ацетилхолина образуется ацетилированный фермент - непрочное соединение, быстро подвергающееся
гидролизу, в результате чего активные центры ХЭ освобождаются
для новых реакций с ацетилхолином.
При взаимодействии ХЭ с ФОВ образуется устойчивый к гидролизу фосфорилированный фермент, неспособный взаимодействовать
с молекулами ацетилхолина и утративший основную каталитическую
функцию.
Для работы необходимо: препаровальный набор, глазные ножницы, шелк, канюля Штрауба, штатив с лапками для крепления канюли,
пастеровская пипетка с резиновой грушей, установка для фотоэлектрической регистрации кардиограммы (универсальный штатив с фотопреобразователем и серфинкой, блок питания, регистратор Н-338), раствор Рингера, растворы фенола (50 мг/л) и карбофоса (50 мг/л).
Методика исследования
Работа выполняется на сердце, изолированном по методу Штрауба. У лягушки разрушить центральную нервную систему зондом. Закрепить животное на препаровальной дощечке брюшком вверх и обнажить сердце. Подвести лигатуры под аорту до ее разветвления (1-я
лигатура), под правую дугу аорты (2-я лигатура), под венозный синус
(3-я лигатура), под корни обоих легких (4-я и 5-я лигатуры) (4-ю и
5-ю лигатуры перевязать сразу).
42
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Лягушку повернуть головой к себе и, слегка натягивая лигатуру 2, сделать надрез дуги аорты примерно посередине между лигатурой и разветвлением аорты. Надрез делается под углом в 45° и не
больше чем на половину ширины сосуда. В разрез сосуда быстро ввести кончик канюли Штрауба, частично заполненный раствором Рингера. Кончик канюли осторожно продвинуть в полость желудочка
так, чтобы желобок ее тонкого конца пришелся под лигатуру 1. Попадание канюли в желудочек всегда сопровождается появлением в
растворе Рингера фонтанчика крови. Если при введении канюля
встречает препятствие, это означает, что ее кончик уперся в канал из
полулунных клапанов, в этом случае канюлю вытаскивают и во время
систолы сердца вводят вновь.
Осторожно, не изменяя положения канюли, завязать лигатуру 1
вокруг ее шейки (если канюля вставлена правильно, то при вертикальном положении препарата жидкость из канюли во время диастолы поступает в желудочек сердца, раздувает его, во время систолы
жидкость в канюле поднимается), перевязать правую дугу аорты (лигатура 2), венозный синус (лигатура 3) и сердце вырезать из организма. Для этого перерезать полые вены на уровне синуса, обе дуги аорты, сосуды обоих легких и другие ткани дистальнее мест наложения
лигатуры. Укрепить в штативе канюлю с сердцем и промыть его полость. Для этого с помощью пастеровской пипетки сменить несколько раз раствор Рингера в канюле (уровень жидкости в канюле должен
быть постоянным). Закрепить канюлю с сердцем на штативе. Серфинкой, прикрепленной к рычажку фотоэлектрического преобразователя, захватить верхушку сердца и наладить графическую регистрацию сокращений изолированного сердца на чернильнопишущем регистраторе Н-338.
Записать исходную кардиограмму. Заменить раствор Рингера в
канюле на раствор ФОС, приготовленный на растворе Рингера, и
вновь записать кардиограмму. Затем отмыть сердце раствором Рингера и спустя 10 минут повторить опыт с другими веществами. Во избежание подсыхания поверхности сердца периодически орошать его
раствором Рингера.
Проанализировать полученные кардиограммы (частота, амплитуда сердечных сокращений и т.д.).
Оформить протокол. Сделать выводы.
43
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Литература
1. Ершов Ю.А., Плетенева Т.В. Механизмы токсического действия неорганических соединений. М., 1989. 272 с.
2. Заугольников С.Д., Качанов М.М., Лойт А.О., Ставчанский И.И. Экспрессные методы определения токсичности и опасности
химических веществ. Л., 1978.
3. Лужников Е.А. Клиническая токсикология. М., 1994. 256 с.
4. Люблина Е.И., Минкина Н.А., Рылова М.Л. Адаптация к промышленным ядам как фаза интоксикации. Л., 1971.
5. Методы определения токсичности и опасности химических
веществ (токсикометрия) / Под ред. И.В. Саноцкого. М., 1970. С. 42 46.
6. Основы общей промышленной токсикологии (руководство)
/ Под ред. Н.А. Толоконцева и В.А. Филова. Л., 1976. 304 с.
7. Правдин Н.С. Методика малой токсикологии промышленных
ядов. М., 1974.
8. Харкевич Д.Д. Фармакология. М., 1993. 544 с.
9. Шицкова А.П., Рязанова Р.А. Гигиена и токсикология пестицидов. М., 1975. 192 с.
44
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Содержание
Растворы, необходимые для поддержания жизнедеятельности
препарата ......................................................................................... 3
Способы обездвиживания животных .................................................. 3
Приготовление физиологических препаратов ................................... 5
Моделирование интоксикаций и постановка токсикологического
эксперимента. Экспрессные методы определения
токсичности химических соединений .......................................... 8
Занятие 1. Интегральные методы оценки токсичности
химических соединений ................................................................. 10
Лабораторная работа № 1. Продолжительность плавания
животных как показатель интоксикации (метод
функциональных проб) ................................................................ 11
Лабораторная работа № 2. Влияние токсических веществ
на показатели мышечной силы по времени плавания
(утомляемости) мышей ................................................................ 11
Лабораторная работа № 3. Изменение мышечной силы
при воздействии химических веществ ...................................... 12
Лабораторная работа № 4. Утомление мышцы при воздействии
токсических веществ в модельном эксперименте..................... 14
Занятие 2. Особенности предварительной оценки
и установления расчетных ПДК веществ, обладающих
запахом, привкусом и раздражающим действием ................... 16
Лабораторная работа № 5. Методика органолептического
исследования воды........................................................................ 18
Лабораторная работа № 6. Методики оценки
порога раздражающего действия химических веществ
на верхние дыхательные пути мелких
лабораторных животных .............................................................. 20
45
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Занятие 3. Первичная оценка кожно-резорбтивного действия
химических веществ ....................................................................... 21
Лабораторная работа № 7. Влияние токсических веществ
на движение ресничек мерцательного эпителия
пищевода лягушки ........................................................................ 24
Лабораторная работа № 8. Исследование раздражающего
и кожно-резорбтивного действия химических веществ
(по изменению частоты дыхания лягушки) ............................... 26
Занятие 4. "Избирательная токсичность" ядов .............................. 27
Лабораторная работа № 9. Спектральный анализ
физиологических и патологических соединений гемоглобина 29
Лабораторная работа № 10. Осмотическая резистентность
эритроцитов как качественный показатель интоксикации ...... 32
Занятие 5. Изменения в сердечно-сосудистой системе ................... 35
Лабораторная работа № 11. Работа сердца при отравлениях
алкалоидами и гликозидами ........................................................ 36
Лабораторная работа № 12. Влияние фосфорорганических
соединений на работу сердца ...................................................... 39
Литература ............................................................................................ 44
46
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Учебное издание
Экологическая токсикология
Методические указания
Составитель Рябухина Елена Валерьевна
Редактор, корректор А.А. Антонова
Компьютерная верстка И.Н. Ивановой
Подписано в печать 04.10.2004 г. Формат 60х84/16.
Бумага тип. Усл. печ. л. 2,8.Уч.-изд. л. 2,12.
Тираж 50 экз. Заказ
Оригинал-макет подготовлен
в редакционно-издательском отделе ЯрГУ.
Отпечатано на ризографе.
Ярославский государственный университет.
150000 Ярославль, ул. Советская, 14.
47
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
48
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Экологическая токсикология
49
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
32
Размер файла
451 Кб
Теги
указания, методические, токсикология, 238, экологической
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа