close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

608.Лабораторные работы по биофизике Жандарев В В

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное агентство по образованию
Ярославский государственный университет им. П.Г. Демидова
Кафедра общей и биоорганической химии
В.В. Жандарев, И.И. Дигурова
Лабораторные работы
по биофизике
Методические указания
Рекомендовано
Научно-методическим советом университета
для студентов специальности Биология
Ярославль 2006
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
УДК 577.3
ББК Е 071я73
Л 12
Рекомендовано
Редакционно-издательским советом университета
в качестве учебного издания. План 2006 года
Рецензент
кафедра общей и биоорганической химии
Ярославского государственного университета им. П.Г. Демидова
Л 12
Жандарев, В.В., Дигурова, И.И. Лабораторные работы по биофизике / В.В. Жандарев, И.И. Дигурова ; Яросл. гос. ун-т. – Ярославль : ЯрГУ, 2006. – 48 с.
Лабораторные работы предназначены для студентов, обучающихся по специальности 011600 Биология (дисциплина «Биофизика», блок ОПД), очной и заочной форм обучения.
УДК 577.3
ББК Е 071я73
© Ярославский государственный университет, 2006
©В.В. Жандарев. И.И. Дигурова, 2006
2
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Кинетика биологических процессов
Вещества, поступающие в организм, вступают в сложную сеть
химических превращений. Скорость химических превращений в
клетках и тканях организма играет основную роль в регулировании
жизненного процесса. В связи с этим большое значение приобретает изучение закономерностей протекания во времени химических
процессов. В отличие от биохимии, описывающей конкретные химические реакции в организме, кинетика изучает механизмы химических превращений в зависимости от различных факторов (температуры, концентрации реагирующих веществ, давления, рН, наличия катализаторов и пр.).
Важнейшей количественной характеристикой химической
реакции является скорость. Под скоростью понимают возрастание
или убывание концентрации реагирующего вещества во времени.
Если вещество А превращается в В:
А
В,
то скорость реакции υ – первая производная от концентрации любого из веществ по времени:
υ=
dB
dA
.
=−
dt
dt
(1)
Скорость химической реакции зависит в основном от трех факторов: концентрации реагирующих веществ, температуры и наличия катализаторов. Согласно кинетической теории реакций, их
скорость определяется количеством столкновений молекул друг с
другом в единицу времени.
Если скорость реакции зависит от концентрации одного вещества, то такая реакция называется реакцией первого порядка. В
случае приведенной мономолекулярной реакции А
В по закону
действующих масс (2)
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
dA
= k ⋅A
dt
,
(2)
где k – коэффициент, называемый константой скорости реакции.
−
Если А=1, то
dA
=k
dt
,
(3)
т.е. константа скорости – это скорость реакции при концентрациях
реагирующих веществ, равных единице.
Если скорость реакции зависит от концентрации двух реагирующих веществ, то это реакция второго порядка. Например, при
реакции А+В С
−
dA
= k ⋅A ⋅B
dt
.
(4)
Порядок и молекулярность реакции не всегда совпадают. Так,
бимолекулярная реакция может быть реакцией первого порядка,
если одно из реагирующих веществ находится в избытке и его концентрация заметным образом не меняется. Например, гидролиз
СН3СООК может определяться только концентрацией СН3СООК,
если вода находится в избытке. Мономолекулярная реакция может
быть реакцией нулевого порядка, когда скорость реакции не зависит от концентрации реагирующего вещества. Обычно так протекают реакции с участием ферментов в условиях избытка реагирующего вещества. В условиях нулевого порядка скорость постоянна и определяется скоростью распада фермент-субстратного
комплекса. В процессе реакции может наступить переход от реакции первого порядка к реакции нулевого порядка. Если процесс
протекает в клетке, куда реагирующие вещества поступают через
клеточные оболочки, то в начальный момент, когда концентрация
реагирующего вещества небольшая, реакция может протекать по
типу реакций первого порядка, а при насыщении всех молекул
фермента переходит на нулевой порядок.
Помимо зависимости от концентрации субстрата, имеется зависимость скорости ферментативного катализа от ряда других фак4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
торов: наличия ингибиторов или активаторов, рН среды, давления,
температуры и пр., поэтому в биологических системах скорости
реакций меняются в очень широких пределах.
Одним из наиболее существенных факторов, оказывающих
влияние на кинетику, является температура. В условиях целостного
организма изменение температуры может влиять на скорость реакций как непосредственно, так и косвенным образом. Так, понижение температуры организма, как и в любой неживой системе, замедляет химические реакции. На этом основано применение гипотермии в медицине. Но вместе с тем оно может ввести в действие
механизмы терморегуляции, ускоряющие реакции. В отличие от
реакций, протекающих в неживых системах, большинство биологических процессов имеют температурный оптимум – интервал
температур, в котором реакция протекает с максимальной скоростью. Это объясняется ферментативным характером большинства
биологических процессов. В случае ферментативной реакции одновременно действуют два различных фактора, определяющих
влияние температуры: с одной стороны, увеличение скорости самой реакции; с другой – повышение скорости деструкции фермента при нагревании, что обусловливает непрерывное уменьшение
концентрации активного фермента. Оптимальная температура зависит от соотношения между влиянием температуры на скорость
реакции самой ферментативной реакции и ее влиянием на скорость
инактивации фермента.
Влияние температуры на скорость биологических процессов
часто оценивают с помощью температурного коэффициента Q10
Вант-Гоффа. Он показывает, во сколько раз ускоряется процесс
при повышении температуры на 10оС:
Q10 =
υT
υT
2
1
,
(5)
где υT1 – скорость процесса при определенной температуре, о C;
υT2 – скорость процесса при температуре выше предыдущей на
о
10 С.
Живые организмы не всегда выдерживают изменение температуры на 10оС. Поэтому для определения температурного коэффи5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
циента часто берут меньший температурный интервал и пересчитывают полученные результаты на 10оС.
По величине температурного коэффициента биологического
процесса можно судить о природе протекающих реакций. Так,
А.Ф. Самойлов установил, что процесс возбуждения в нерве имеет
Q10 = 1,7, что характерно для ферментативных реакций (для химических процессов он равен 2 – 4).
Зная температурный коэффициент, можно определить энергию
активации, которая связана с ним соотношением:
Ea = 0,46 · T1 · T2 · lgQ10 .
(6)
Из уравнения следует, что энергия активации и логарифм температурного коэффициента связаны линейной зависимостью. Следовательно, реакции, имеющие более высокую энергию активации,
будут иметь более выраженную температурную зависимость.
Энергии активации большинства биологических процессов –
того же порядка, что и для химических реакций – 8 – 20 ккал/моль.
Благодаря наличию ферментов, в клетках протекают такие реакции, которые в технике или вообще невозможно осуществить,
или можно осуществить в жестких условиях – при высокой температуре и высоком давлении. Ферменты уменьшают энергетический
барьер, который необходимо преодолеть реагирующим молекулам,
и благодаря этому в организмах реакции протекают в мягких условиях – при нормальном давлении и при невысокой температуре.
Рассмотренной формулой пользуются и для вычисления энергии активации биологических процессов, в том числе секреции желез, пульсации сократительных вакуолей простейших, сокращений
мышц, и т.д.
Для вычисления энергии активации какого-либо процесса необходимо:
1. Определить его скорость при двух температурах – Т1 и Т2.
2. Разделив величину скорости, полученную при Т2, на величину Т1, вычислить величину lg Q10.
3. Найти десятичный логарифм, подставить в формулу (6) его
значение и произведение численных значений показаний температуры, выраженных в градусах абсолютной шкалы.
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Пример. В опыте определения активности каталазы установлено, что при температуре 15 о С, вследствие разложения добавленной перекиси водорода ферментом каталазой, через 2 мин. выделяется 2,6 мл кислорода (целесообразно использовать значение
скорости выделения кислорода в начальный период – через одну
или две минуты после начала реакции, поскольку именно эта характеристика освобождена от осложнений, вызванных влиянием
продуктов реакции, изменением активности катализатора в ходе
процесса), при 25о С (Т = 273 + 25 = 298 К) – 5,0 мл кислорода.
Подставляя количество кислорода, выделенное при начальной
температуре и при температуре выше на 100С, в формулу (5), получаем температурный коэффициент:
Q
10
=
5 ,0 мл
≈ 1,9
2 ,6 мл
.
Находим по таблице логарифмов значение lgQ10, равное
0,27875, и, выражая показания температуры в кельвинах, получаем
численное значение энергии активации из формулы (6):
Е=0,46 . (273 + 15) . (273 + 26) . 0,27875 =
= 10781 ккал/моль = 10,78 ккал/моль.
Для поддержания постоянной температуры обычно используют водяной термостат с автоматической регулировкой подаваемого
извне тепла (ультратермостат, который обеспечивает точность
температуры до 0,20С).
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 1
Определение температурного коэффициента
и вычисление энергии активации
сокращения сердца лягушки
Необходимые принадлежности: термостат; широкогорлые
стаканы (большой и малый); термометр; секундомер; набор препаровальных инструментов; раствор Рингера для холоднокровных
животных.
Лягушку обездвиживают обычным способом, разрушив зондом
спинной и головной мозг. Затем ее прикалывают к препаровально7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
му столику брюшком кверху, обнажают сердце. При помощи глазного пинцета под обе дуги аорты подводят общую лигатуру, дуги
аорты перетягивают и перевязывают дистальнее. Сердце вырезают,
обильно промывают раствором Рингера, температура которого
снижена до +5… + 10оС.
Сердце подвешивают на лигатуре, и оно свободно плавает в
растворе. Стаканчик, температура раствора которого измеряется
термометром, погруженным в раствор, ставят в эксикатор или сосуд
большого объема, заполненный водой. Температура воды в эксикаторе поддерживается постоянной (добавляется снег, лед, подогретая
вода) за счет его большего объема и не изменяется во время измерения числа сокращений сердца. Затем температуру в эксикаторе поднимают за счет добавления подогретой воды. Когда она достигнет
нужной температуры (выше на 10о С), подсчитывают число сокращений, затем температуру повышают ещё на 10о С. Опыт необходимо начинать с низкой температуры и повышать её постепенно,
так как в противном случае сердце может остановиться.
Расчет производится по формулам (5) и (6), как описано выше.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 2
Влияние температуры на активность каталазы
дрожжевых клеток
Необходимые принадлежности: газометрический прибор;
водяная баня с плиткой; перекись водорода (H2O2); сахароза; пипетки на 10 и 20 мл; свежие пекарские дрожжи и растения.
Активность каталазы определяют по выделению кислорода:
2 Н2О2
каталаза
2 Н2О + О2 ↑ .
Газометрический прибор представлен на рисунке 1.
Берут навеску (0,045 г) сухих пекарских дрожжей и помещают
в 30 мл 8%-ного раствора сахарозы при комнатной температуре
(200С). Через 10 – 15 мин. после того как дрожжи будут тщательно
размешаны и взболтаны, 10 мл взвеси дрожжей помещают в каталазник, находящийся в водяной бане при первоначальной температуре T1 (15 – 170С). Одновременно в каталазник помещают стакан8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
чик с 2 мл 2 %-ного раствора
Н2О2, а пробку колбы-каталазника плотно закрывают (для
лучшей герметичности пробку
можно слегка смазать водой).
Затем открывают кран 4 и, вертикально
перемещая
стеклянную грушу 6 до тех пор, пока
столб воды в бюретке не поднимется (или опустится) до нулевой отметки. Фиксируют положение груши. Закрывают кран
4 и определяют герметичность
всей системы газометрического
прибора. Затем взбалтывают содержимое каталазника в течение
3 с, смешивая Н2О2 со взвесью
дрожжевых клеток, и через каждые 30 с снимают показания выделившегося О2 по бюретке (в Рис. 1. Газометрический прибор:
мл). По прошествии 30 с ката1 – каталазник; 2 – вставная
склянка для перекиси водорода;
лазник с содержимым вновь
встряхивают, а по истечении 3 – тройник; 4 – винтовой зажим
или кран; 5 – бюретка с делевторого интервала времени
ниями; 6 – стеклянная груша
вновь снимают показания прибора по делениям бюретки. Эту
операцию повторяют до тех пор,
пока не прекратится выделение
О2. Подобную операцию и в той же последовательности проводят
при температуре Т2, помещая каталазник в водяную баню. Т2 отличается от Т1 на 10 K в сторону увеличения. Для каждой температуры (Т1 и Т2) проводят по три повторности, строго соблюдая навеску
дрожжей постоянной, объем 8%-ного раствора сахарозы и объем
Н2О2. Полученные данные заносят в таблицу 1.
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 1
№
п/п
1.
Материал
Температура, 0С
Объем выделившегося О2
за 1 мин.
0,5 1
1,5 2
2,5 и т.д.
Дрожжи + Н2О2
На основании табличных данных строят график с кривыми для
обеих температур. Рассчитывают согласно формулам (1) и (2) температурный коэффициент – Q10 и энергию активации данной реакции – Е.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 3
Влияние температуры на активность каталазы
растительных объектов
Работу проводят на газометрическом приборе (рис. 1) с растительным объектом. Листья комнатных растений (3 – 4 г) тщательно
растирают в ступке стеклянным пестиком с 1 – 2 г мела. Количественно переносят в стеклянную колбу 40 мл 0,85%-ного раствора
NaCl. После инкубации при изучаемой температуре (Т1 и Т2) берут
10 мл взвеси и помещают в каталазник. Дальнейшие манипуляции
производят в той же последовательности, что и с дрожжевыми
клетками. Полученные результаты заносят в таблицу, аналогичную
таблице 1. Строят график, рассчитывают Q10 и Е данной реакции.
Вопросы
1. Скорость химических реакций.
2. Закон действующих масс. Константа скорости.
3. Молекулярность и порядок реакции.
4. Кинетическое уравнение 1-го порядка.
5. Кинетическое уравнение 2-го порядка.
6. Влияние температуры на скорость химических реакций.
Температурный коэффициент. Правило Вант-Гоффа.
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ингибирование ферментативной функции
тяжелыми металлами
Известно, что одним из свойств тяжелых металлов является их
способность к лигандообразованию по отношению к некоторым
функциональным группам, особенно к сульфгидрильным группам
с образованием меркаптидов металлов. Предполагается, что этот
процесс лежит в основе денатурации белков тяжелыми металлами
и их подавляющего действия на ферменты. В частности, изменяя
нативное конформационное состояние белкового каркаса каталазы,
ионы свинца опосредовано снижают активность гематина, приводят к аллостерическому ингибированию каталазной реакции.
Снижение функции каталазы приводит к развитию такого заболевания, как акаталаземия, которое является следствием окисления
гемоглобина избыточным пероксидом водорода в неактивную
форму – метгемоглобин. В итоге происходит ослабление дыхательной функции крови.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 4
Влияние нитрата свинца
на активность каталазы дрожжевых клеток
Берут навеску (0,09 г) сухих пекарских дрожжей и помещают в
60 мл 8%-ного раствора сахарозы при комнатной температуре
(200С). Через 10 – 15 мин. после того как дрожжи будут тщательно
размешаны, 10 мл взвеси дрожжей помещают в каталазник и проводят каталазную реакцию по методике, описанной в лабораторной
работе 2. Это контрольный опыт. Его повторяют три раза. В оставшиеся 30 мл взвеси вносят 0,03 г нитрата свинца (II) и перемешивают с помощью магнитной мешалки в течение 10 – 15 мин. Затем, отбирая по 10 мл взвеси, трижды проводят каталазную реакцию. Через каждую минуту и в контроле и в опыте (присутствие
свинца) определяют количество выделившегося в реакции кислорода. По средним значениям строят графики зависимости объема
выделившегося газа от времени. Для времени 1 мин. определяют
скорости реакции в контроле и опыте. Рассчитывают, во сколько
раз скорость в опыте меньше скорости в контроле.
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Вопросы
1. Ферментативные промоторы. Активирование и ингибирование ферментативных процессов.
2. Типы ингибирования: изостерические и аллостерические ингибиторы.
3. Механизм влияния тяжелых металлов на белки-ферменты.
Гемолиз
Мембрана, окружающая клетку, на 70% состоит из двойного
липидного слоя толщиной приблизительно 75Å. Толщина межлипидного углеводородного слоя 30Å. Он ведет себя как изолятор
(диэлектрик). Липиды и углеводороды мембран препятствуют прохождению ионов. Но в матрицу липидов включены интегральные
белки, пронизывающие все слои мембраны, и периферические (ассоциированные), «плавающие» на поверхности мембраны. Интегральные белки формируют ионные каналы, избирательно проницаемые для ионов. Различные неблагоприятные факторы могут
привести к свободнорадикальному перекисному окислению липидов мембран клеток, например эритроцитов. Это сопровождается
отдачей электронов липидами, повышается вязкость мембран, нарушается транспортная функция. В норме эритроциты в потоке
плазмы окружены отрицательным статическим электричеством,
уменьшение его (потеря мембранами электронов) способствует
аутоагглютинации, а также агрегации – скучиванию. В итоге
прогрессирует затруднение в отдаче гемоглобином кислорода
клеткам и тканям. Развивается гипоксия.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 5
Определение времени 50-процентного гемолиза,
вызываемого НСl
Для начала работы эритроциты трехкратно отмывают от сывороточных белков центрифугированием с физраствором (по 5 мин.
при 3000 об/мин.). В качестве гемолитика используют HCl с первоначальной концентрацией 0,04 М на физиологическом растворе.
12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Гемолиз проводится в кювете регистрирующего прибора, в качестве которого используется спектрофотометр СФ-26. Левую кювету наполняют дистиллированной водой, правую – физиологическим раствором. Все определения проводят с зелёным светофильтром при длине волны 576.
В правой кювете готовят смесь с экстинкцией 0,7, добавив в
физиологический раствор каплю густой взвеси эритроцитов. Показания прибора снимают по шкале экстинкции взвеси эритроцитов.
Взвесь с экстинкцией 0,7 принимают за стандартную. В правой
кювете обирают 2 мл стандартной смеси и прибавляют 2 мл HCl.
Определяют время, в течение которого происходил гемолиз.
Затем подбирают такую концентрацию HCl (разведение готовят на физрастворе), чтобы гемолиз шел 5 мин. Перед каждым
опытом кювету прополаскивают физраствором не менее пяти раз.
Строят график зависимости «экстинкция – время». В результате получается S-образная кривая гемолиза, по которой можно определить время 50%-ного гемолиза. Для этого определяют высоту
кривой, делят её пополам – это точка 50-процентного гемолиза. Из
этой точки опускают перпендикуляр на ось абсцисс. По точке пересечения перпендикуляра с осью абсцисс находят время 50%-ного
гемолиза.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 6
Влияние токсических веществ липидной природы
на скорость гемолиза, вызываемого HCl
При окислении ненасыщенных жирных кислот образуются продукты: перекиси, кетоны, альдегиды, эпоксиды, обладающие гемолитическим действием. В данной работе изучается влияние окисленной олеиновой кислоты на скорость гемолиза, вызываемого HCl.
Для этого окисленную олеиновую кислоту омыляют КОН при
комнатной температуре в течение 2 – 3 мин. (на 0,6 мл окисленной
олеиновой кислоты добавляют 0,6 мл 0,05 М КОН и 0,9 мл воды).
Затем к 2 мл указанной смеси добавляют 2 мл 1,7%-ного раствора
HCl и 4 мл фосфатного буфера с pH = 7,2 (7,2 мл 1/15 М Na2HPO4 +
2,8 мл 1/15 М KH2PO4) и из этой омыленной и забуференной олеиновой кислоты в разведении 1:8 и 1:16 на физрастворе готовят
взвесь с экстинкцией 0,7. В указанных смесях проводят гемолиз,
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
используя ту же рабочую концентрацию HCl, что и в лабораторной
работе 5. Определяют, насколько возрастает скорость гемолиза
эритроцитов.
Вопросы
1. Строение клеточных мембран.
2. Методы исследования проницаемости биомембран.
3. Функции мембран. Модели искусственных мембран.
4. Простая диффузия. Уравнение диффузии.
5. Транспорт неэлектролитов. Растворимость проникающих
веществ в воде и липидах. Значение размеров молекул для проницаемости.
6. Облегченная диффузия. Транспорт веществ с помощью переносчиков.
7. Проницаемость биомембран для ионов. Доннановское распределение.
8. Активный транспорт.
Липофильность биологически активных
соединений и мембранный транспорт
Коэффициенты распределения привлекли внимание при изучении свойств химических соединений разных классов. Была установлена корреляция между биологическим действием и тенденцией веществ распределятся в системе масло-вода преимущественно
в липидном слое. Зависимость между коэффициентом распределения (log P) и биологическим действием может носить параболический характер, т.е. после достижения оптимума липофильности
дальнейшее ее повышение приводит к снижению биологической
активности вещества. Даже если коэффициент распределения играет второстепенную роль, им не следует пренебрегать, так как соблюдение определенного баланса между липофильными и гидрофильными свойствами лекарственных веществ обеспечивает их
доставку к рецептору.
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Коэффициенты распределения твердых и жидких веществ
удобно измерять в плотно закрытых центрифужных стаканах объемом 250 мл, куда помещают навеску изучаемого вещества и оба
растворителя (октанол, вода) в соответствии, установленном ранее
для других подобных соединений или определенном в предварительных опытах. Стакан закрывают и интенсивно встряхивают 100
раз в течение 5 мин (хотя равновесие вполне может установиться
уже в первые 2 мин). Смесь центрифугируют, дают отстояться и
проверяют, не образовались ли хотя бы следы эмульсии (если она
образуется, опыт проводят заново). После этого в обеих фазах определяют количество растворенного вещества.
Коэффициенты распределения можно определить также расчетными методами: суммированием фрагментарных констант, а
также используя компьютерную программу Log P, входящую в
комплекс программ ACD Labs. В таблице 2 представлены фрагментарные константы (f), рассчитанные из значений коэффициентов
распределения в системе октанол – вода. Константы для сложных
молекул могут быть вычислены суммированием приведенных в
таблице значений для более простых фрагментов. Константы выбраны из 100 значений, рассчитанных по результатам 1000 измерений log P.
Из данных таблицы видно, что введение углеводородного радикала в молекулу повышает ее липофильность. Наличие двойной или
тройной связи повышает гидрофильность, но вклад последней существенно выше (–0,55 и –1,42 соответственно). Для алифатических
соединений величина вклада фенильной группы лежит между величинами вкладов этильной и пропильной групп, тогда как вклады
нафтильной и метильной групп примерно одинаковы. Наличие неподеленной пары электронов обычно придает соединению гидрофильный характер, что отчетливо видно из данных для азот- и кислородсодержащих групп. В ряду общих анестетиков для млекопитающих максимальный биологический эффект достигается при
значении log P 2.
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 2
А. Фрагменты, не содержащие
углерода и водорода
АлифаАроматитические ческие
1,43
-I
0,56
1,21
-Br
0,26
0,93
-Cl
0,06
0,38
-F
0,49
-0,91
-N<
-2,07
-0,07
-NO2
-0,93
-0,43
-1,59
-O-2,39
-SO2N
-2,05
-2,75
-SO-1,87
-SO2 0,11
-0,51
-SБ. Фрагменты, имеющие атомы
водорода и не содержащие углерода
0,17
-H
0,17
-0,95
-NH-1,82
-0,31
-OH
-1,47
-0,85
-NH2
-1,42
0,62
0,00
-SH
-1,94
-1,48
-SO2NH2
Г. Фрагменты, содержащие атомы
углерода и водорода
Алифати- Ароматические
ческие
-CH3
0,69
-CH20,53
-CH
0,33
-CH=CH2
0,91
1,84
-C6H5
1,66
-C6H4
-1,56
-CONH
-1,34
-2,43
-O-CONH-0,08
-1,92
-CO2H
-1,10
-0,94
-CONH2
1,22
-1,97
-NHSO2CF3
В. Фрагменты с атомом углерода,
не содержащие водорода
АлифатиАроматические
ческие
-C0,18
-CN
0,19
-1,5
-CON<
-2,02
-2,88
-CO-0,81
-1,67
-CO2 –
-0,41
-1,27
-4,14
-5,00
-CO2 -0,34
-SCN
2,09
-CCl3
1,33
0,75
-CF3
-0,99
-0,41
-O-C(=O)-
Д. Гетероциклические фрагменты
Имидазолин=
Пирролил=
Пиридил=
Хинолил=
Акридинил=
Индолил=
Бензимидазолил=
Урацилил=
Барбитурил=
16
-0,10
0,60
0,53
1,82
3,11
1,89
1,19
-1,31
-1,55
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 7
Определение коэффициента распределения
органических соединений расчетными методами
В таблице 2 представлены фрагментарные константы (f), рассчитанные из значений коэффициентов распределения в системе
октанол – вода. Константы для сложных фрагментов могут быть
вычислены суммированием приведенных в таблице значений для
более простых фрагментов. Отрицательные значения констант f
(также log P) характеризуют гидрофильные, а положительные –
гидрофобные свойства фрагментов (веществ). Для компьютерных
расчетов log P необходимо войти в комплекс программ ACD Labs,
программу Log P, нарисовать требуемую структуру исследуемого
вещества (см. табл. 3) и произвести расчет выделением курсором
одноименной команды log P.
Задание 1. Определение коэффициентов распределения суммированием фрагментарных констант, а также с использованием
компьютерной программы ACD Labs.
Результаты расчетов занести в таблицу 3.
Таблица 3
Структура
Log P*
Log P**
СН3 – СН3
CH3
СН3 – ОН
OH
NH 2
COOH
CH 3
NH 2
* – рассчитать суммированием фрагментарных констант.
** – рассчитать при помощи компьютерной программы ACD Labs.
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Распределить вещества в порядке убывания гидрофильности и
соответственно возрастания липофильности.
Задание 2. Определение коэффициентов распределения природных алкалоидов с использованием компьютерной программы
ACD Labs.
Рассчитать log P с помощью программы для следующих алкалоидов:
N
CH3
CH3
N
Кониин
O
N
Никотин
O
CH3
N
H
N
CH3
N
N
N
Анабазин
CH3
CH3
NH
N
CH3
CH3
OH
Кофеин
Эфедрин
Распределить вещества в порядке убывания гидрофильности,
возрастания липофильности.
Вопросы
1. Коэффициент распределения и его биологическая роль.
2. Способы определения коэффициента распределения.
3. Значение гидрофильных (липофильных) свойств веществ
для трансмембранного транспорта.
Электропроводность биосистем
В настоящее время метод измерения электропроводности довольно широко применяется в биологических и медицинских исследованиях. Удобство в применении данного метода заключается
в том, что используемые напряжения (менее 50 мВ) не вносят су18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
щественных изменений в физико-химические процессы, происходящие в биологическом объекте, и тем более не повреждают его.
Метод нашел широкое применение при изучении процессов,
происходящих в живых тканях при изменении физиологического
состояния, при патологических состояниях, при действии повреждающих факторов: температуры, излучения, ультразвука и т.д. Методом электропроводности измеряют сопротивление вещества
электрическому току. Это сопротивление будет зависеть от состава
вещества и от его структуры. Величина сопротивления вещества
определяется количеством зарядов, способных к передвижению.
Уменьшение силы тока при прохождении его через ткань происходит за счет возникновения вторичной (обратной) электродвижущей силы, т.е. за счет поляризации. Возникновение поляризации связывают с наличием в живых клетках и тканях полупроницаемых мембран, по обеим сторонам которых находятся свободные
ионы. При этом предполагается, что клеточная мембрана проницаема для одних ионов и непроницаема для других. Не проходящие
через мембрану ионы накапливаются около нее, что приводит к
возникновению заряда – поляризации. Поляризационная емкость
представляет собой конденсатор, заряжающийся при прохождении
тока через живую ткань. Сопротивление живой ткани складывается
из большого числа омических и емкостных сопротивлений. Суммарное сопротивление ткани называют эффективным сопротивлением или импедансом. Нетрудно предположить, что импеданс будет возрастать пропорционально количеству клеток в ткани (например, концентрации эритроцитов в крови), пропорционально
росту емкостной составляющей (увеличению площади мембран).
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 8
Определение сопротивления
однородных клеточных взвесей
Необходимые принадлежности: кондуктометр ОК 102/1;
кондуктометрическая ячейка; гематокриты; центрифуга; центрифужные весы; центрифужные пробирки; пастеровские пипетки;
дистиллированная вода; физиологический раствор; цельная кровь.
Для определения сопротивления отдельных клеточных взвесей,
содержащих клетки сферической формы, используется формула
19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Максвелла, которая устанавливает зависимость между общим сопротивлением взвеси (R), сопротивлением взвешенных клеток (R2),
сопротивлением среды (R1) и объемом клеток (ρ ) во взвеси:
R / R −1
R / R −1
1
=ρ 1 2
R /R +2
R /R +2
1
1 2
.
(7)
В том случае, когда удельное сопротивление клеток бесконечно велико по сравнению с удельным сопротивлением среды, отношение R1/R2 будет стремиться к нулю и формула (7) примет вид:
2(R − R )
1
ρ=
2R + R
1 .
(8)
Таким образом, для определения относительного объема плохо
проводящих частиц, называемого объемным индексом, вычисленных по формуле (8) необходимо знать только удельное сопротивление взвеси и среды. Для неповрежденных клеток (эритроцитов)
характерно хорошее совпадение величин объемных индексов, вычисленных по формуле (8) и определенных с помощью гемотокрита. У гемолизированных эритроцитов величины непроводящего
пространства, вычисленные по формуле (8), отличаются от величин объемных индексов, определенных с помощью гематокрита.
Это может свидетельствовать о появлении у поврежденных клеток
способности проводить низкочастотный электрический ток.
Задание 1. Определение объемного индекса крови.
Объемный индекс крови определяют методом электропроводности с помощью кондуктометра ОК 102/1, к которому подключена кондуктометрическая ячейка. Ячейка представляет собой стеклянный сосуд без дна с двумя электродами, прочно укрепленными
на фиксированном расстоянии друг с другом. Электроды выполнены из платиновой черни. Ячейку погружают в сосуд с исследуемой
жидкостью таким образом, чтобы уровень жидкости был несколько
выше верхнего края ячейки. По показаниям потенциометра прибо20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ра определяют удельную электропроводность, которая представляет собой величину, обратную удельному сопротивлению. Вначале
определяют удельную электропроводность концентрированной
взвеси эритроцитов, цельной крови, а затем удельную электропроводность плазмы, отделенной от форменных элементов крови центрифугированием в течение пяти минут при 2000 – 3000 об/мин.
Рассчитывают удельное сопротивление исследуемых объектов и,
подставив полученные величины в формулу (8), вычисляют объем
так называемого непроводящего пространства эритроцитов. Объемные индексы крови, концентрированных эритроцитов, полученные методом электропроводности, сравнивают с объемными индексами, определенными с помощью гематокритов. Последние определяют следующим образом. Набирают небольшую порцию
крови в пастеровскую пипетку, конец которой осторожно вводят в
просвет трубочки гематокрита до его дна и медленно сливают
кровь. Затем гематокриты уравновешивают и центрифугируют при
5000 об/мин. в течение 10 мин. Далее по линейке определяют высоту столба эритроцитов h1 и высоту столба всей крови h2. Вычисляют объемный индекс крови. Формула:
h
ρ = 1
h
2 .
(9)
Результаты измерений заносят в таблицу 4.
Таблица 4
1
Исследуеλ
λ
R=
λ
взвеси
мая
жид- взвеси
срекость
ды
1
R =
1 λ
среды
1. Цельная
кровь
2. Плазма
(среда)
3. Эритроциты
21
Объемный индекс
Вчисл. Эл.измеметр.
рен.
гематокр.
Процент
расхождения
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Задание 2. Определение объемного индекса взвеси эритроцитов.
Такие же измерения производят и с концентрируемой взвесью
эритроцитов.
Результаты заносят в таблицу.
Вопросы
1. Электропроводность. Уравнение Максвелла. Явление поляризации.
2. Импеданс клетки. Модели, имитирующие электропроводность клетки.
3. Влияние частоты тока на электропроводность клеток. Дисперсия электропроводности.
Вязкость биологических объектов
Реологическое исследование слабоструктурированных жидкостей. Вязкость (внутреннее трение) – это свойство газов, жидкостей и твердых тел оказывать сопротивление их течению при действии внешних сил. Вязкость имеет размерность кг . м-1 . с-1 или
измеряется в пуазах (Пз) или в сотых долях пуаза – сантипуазах
(сПз). Вода при 20оС обладает вязкостью, равной 1 сПз, или 0,01
Пз. При растворении в жидкостях каких-либо веществ вязкость
жидкостей увеличивается. 1 Пз = 0,1 кг . м-1 . с-1.
При перемещении жидкости (например, при движении её по
тонкой трубке), отдельные слои передвигаются с различными скоростями, возрастающими от стенок к центру, образуя фронт скоростей в форме параболы (рис. 2). В результате разности скоростей
по закону Ньютона между слоями возникает сила внутреннего
трения (F):
F =η
du
S
dx ,
(10)
где F – сила внутреннего трения;
S – площадь поверхности соприкосновения трущихся слоев;
du
– градиент скорости, или деформации;
dx
η – коэффициент пропорциональности.
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 2. Движение жидкости в капилляре:
А, В, С – распределение скоростей слоев жидкости
Если разделить обе части уравнения (10) на S, то получим
Р =η
du
,
dx
(11)
где Р – напряжение, т.е. сила, отнесенная к площади поверхности.
du
= 1,
При dx
η принимает физический смысл напряжения при
градиенте скорости, равном единице, и носит название коэффициента внутреннего трения, или динамической вязкости.
Пуазейлем было показано, что при истечении жидкости из узких капиллярных трубок объемная скорость течения пропорциональна деформации жидкости. Следовательно, в уравнении (11) веdu
личину dx , которую экспериментально определить довольно
сложно, можно заменить объемным расходом (V/t), тогда уравнение (11) примет следующий вид:
Р = К ⋅η
V
t ,
(12)
где К – константа прибора, связанная с параметрами капилляра
следующим образом:
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
К =
π ⋅ r4
8l
,
(13)
где r и l – радиус и длина капилляра соответственно.
Закону Ньютона подчиняются системы, не обладающие внутренней структурой (чистые жидкости, истинные растворы). Их
вязкость не зависит от типа и размеров вискозиметра и от скорости
движения жидкости, являясь постоянной величиной. Такие жидкости называются ньютоновскими, или неструктурированными.
Растворы высокомолекулярных соединений, золи, суспензии и
эмульсии имеют непостоянную вязкость, зависящую от скорости
движения жидкости в вискозиметре и от условий опыта. Такие
жидкости называются неньютоновскими, или структурированными. Наличие структуры у данных систем требует дополнительного усилия для её разрушения, течение подобных жидкостей может быть описано уравнением Бингама:
Р = Ро +η
du
,
dx
(14)
где Ро – предельное напряжение на сдвиг, т.е. то напряжение, при
котором происходит сдвиг слоев относительно друг друга: структура, удерживающая слои, разрушается при напряжении Ро.
Уравнение (14) можно также представить в следующем виде:
Р
V
Р
= о +
,
t Кη Кη
(15)
V
тогда при t = 0, Р = Ро, т.е. для структурированных жидкостей за-
висимость между скоростью их истечения и напряжением выражается прямой, отсекающей на оси абсцисс отрезок, равный предельному напряжению на сдвиг (рис. 3).
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
0,3
0,25
0,2
I
0,15
II
0,1
0,05
0
0
50
100
200
300
Рис. 3. Реологические кривые (V/t – P): I – для неструктурированной
жидкости; II – для слабо структурированной жидкости
С помощью реологических кривых можно определить вязкость
системы. Из уравнения
V
Р
=К
η
t
(16)
следует, что вязкость представлена котангенсом угла наклона прямой к оси абсцисс. Пользуясь законом Пуазейля, можно написать:
t ⋅ ΔР
η =
⋅К,
V
(17)
где V – объем вытекающей жидкости за время t,
ΔР – разность давлений, под которой происходит истечение
жидкости.
Взяв отношение вязкостей испытуемой жидкости к стандартной, при условии равенства или очень близких значений плотностей получим:
η
t
= ,
η о tо
η = ηо
25
t
.
tо
(18)
(19)
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Этот прием упрощает определение вязкости исследуемой жидкости, поскольку при условии использования одной и той же установки позволяет избежать определения константы прибора.
Структурная вязкость. Вязкость коллоидных растворов обладает рядом характерных черт, отличающих ее от вязкости обычных жидкостей, а также молекулярно- и ионно-дисперсных растворов. Прежде всего коэффициент вязкости коллоидных растворов не
является постоянной величиной, а уменьшается с возрастанием
градиента скорости течения. Иначе говоря, коллоидные растворы
не подчиняются закону Пуазейля, согласно которому:
π⋅r 4 ⋅ΔP
,
V=
8⋅η⋅
(20)
где V/t – скорость истечения данного объёма жидкости в капилляре
(м3 . с-1) – объёмная скорость;
r – радиус капилляра (м);
ΔP – разность давлений, при которой происходит истечение
(Па);
η – коэффициент вязкости (кг · м-1 · с-1);
 – длина капилляра (м).
Для коллоидных растворов характерно возрастание градиента
скорости не в прямой пропорциональности от величины силы, вызывающей смещение, а значительно быстрее.
Однако при достижении определенного предела градиента
скорости коэффициент вязкости перестает изменяться и зависимость между величиной силы, действующей на жидкость и смещением, вызываемым силой, приобретает линейный характер.
Вторая аномалия поведения коллоидов заключается в том, что
их вязкость, в отличие от вязкости истинных растворов, возрастает
по времени.
Указанные особенности аномального поведения гидрофильных
коллоидов и биополимеров объясняются структурным характером
их вязкости. В таких системах частицы склеиваются в агрегаты,
образуя более или менее прочные структуры, оказывающие пре26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пятствия току жидкости. При увеличении градиента скорости подобные структуры разрушаются и смещение раствора становится
пропорциональным действующей силе, подобно тому, как это имеет место для истинных растворов.
Исходя из вышеизложенного, нетрудно понять и последнюю из
аномалий вязкости коллоидных растворов: оказывая значительное
сопротивление течению жидкости, структура не препятствует движению молекул и ионов, которые диффундируют по каналам, расположенным между вытянутыми нитями структур.
Приводим некоторые данные, характеризующие вязкость (сПз)
протоплазмы и других жидкостей: плазмодии миксомицетов 15 –
18, амеба 5, яйца морского ежа 2,2, вода 1,0, серная кислота 24,
этанол 1,2, глицерин 1069.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 9
Определение вязкости сыворотки крови
Для исследования структурной вязкости раствора ВМС определяют время истечения определенного объема раствора при различных давлениях Р, пользуясь капиллярным вискозиметром
Убеллоде (рис. 4).
Рис. 4. Вискозиметр
Вискозиметр представляет собой U-образную трубку, в каждом колене которой расположены на одном уровне одинаковые по
объему небольшие резервуары (шарики). В нижней части одного из
этих колен находится капилляр, через который жидкость под давлением перетекает из одного шарика в другой.
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В левое колено наливают 3 – 4 мл испытуемой жидкости. Через каучуковую трубку, надетую на конец колена 3, засасывают
жидкость выше метки «а».
Необходимо, чтобы при заполнении шарика 5 в шарике 4 жидкости не было. Затем включают систему вакуума и наблюдают
время истечения жидкости от метки «а» до метки «б». Как только
жидкость прошла метку «б», тотчас же вискозиметр поворотом
крана 4 выключают из системы вакуума. Установка для определения скорости истечения жидкости в зависимости от давления изображена на рисунке. 5. Вакуум в системе создается с помощью вакуум-насоса 1 и регистрируется манометром 3. Для более плавного
изменения давления в систему включен моностат 2. В начале работы в моностате создается нужное напряжение и он отключается от
насоса поворотом крана 4. К нему присоединяется вискозиметр 7.
Истечение жидкости в вискозиметре происходит только под действием вакуума, установившегося в моностате. Вискозиметр может
быть либо включен в вакуумную систему, либо соединен с атмосферой с помощью трехходового крана 5. Определение скорости
истечения жидкости производится следующим образом: исследуемый раствор заливают в вискозиметр.
Затем вискозиметр присоединяют к системе с помощью резинового шланга, при этом кран 5 и кран 6 переводят в положение «к
вискозиметру».
Рис. 5. Установка для определения скорости истечения жидкости
28
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Жидкость в вискозиметре начинает течь. В момент прохождения ее границы через верхнюю метку включают секундомер и начинают отсчет времени. Как только верхняя граница жидкости
пройдет через нижнюю метку, секундомер выключают, а кран 6
переводят в положение «закрыт». Краном 4 вискозиметр соединяют с атмосферой. Определения производят при разностях между
показаниями правого и левого колен манометра, равных 50, 100,
150, 200, 250 и 300 мм. рт. ст.
В начале работы опыт проводят с дистиллированной водой, а
затем с сывороткой крови. При измерениях скорости истечения
сыворотки надо начинать с меньших давлений. Измерения ведут
при температуре 20 – 25оС. Результаты опыта записывают в таблицу 5.
Таблица 5
Р (мм. рт. ст.)
Вода
t(сек)
Сыворотка крови
Р (мм. рт. ст.) t (сек)
1/ t
1/ t
На основании полученных данных строят график для воды и
сыворотки в координатах (1/t) и Р, по графику находят значение
Р0 – предельного напряжения на сдвиг, по формуле рассчитывают
вязкость сыворотки:
ctgα
° ctgα
°,
η =η ⋅
где
αο – угол наклона реологической кривой для воды;
α – угол наклона реологической кривой для сыворотки;
(21)
ηο – вязкость воды при температуре опыта.
Вопросы
1. Понятие вязкости.
2. Методы измерения вязкости.
3. Отличие структурированной жидкости от неструктурированной. Понятие предельного напряжения.
29
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Поверхностное натяжение
Наличие поверхностного натяжения становится ясным из сопоставления молекул, расположенных на поверхности раздела, и
молекул, находящихся в толще жидкой фазы. Молекулы, находящиеся в толще жидкости, испытывают действие сил взаимного
притяжения со стороны других частиц (молекула В, рис. 6). Силы
притяжения, действующие между молекулами, уравновешивают
друг друга: равнодействующая этих сил равна нулю. Совершенно
иное положение имеет место в отношении молекул, расположенных на поверхности жидкости. В этом случае молекулы жидкости
испытывают притяжение только со стороны молекул, находящихся
под поверхностью раздела. В итоге равнодействующая молекулярных сил на поверхности раздела не равна нулю и оказывается направленной внутрь жидкой фазы. Вот почему молекулы из внутренних слоев жидкости при переходе на ее поверхность (т.е. для
увеличения поверхности) должны преодолеть силы взаимного притяжения, действующие между молекулами поверхностного слоя.
Рис. 6. Суммарное действие сил, обусловливающих поверхностное
натяжение (А) и внутримолекулярное давление (В)
Предположим, А – молекула поверхностного слоя жидкости.
F1, F2, F3,…Fi, Fn – силы, действующие на молекулу А со стороны других молекул жидкости. Эти силы раскладываем на два
взаимоперпендикулярных направления (см. рис. 6);
30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»

 F xi – сумма сил, направленных в положительном направ-
лении Оx; 
−  F xi – сумма сил, направленных в отрицательном на-
правлении
 Оx;
F
yi
– сумма сил, направленных в положительном направ-
лении Оy.
Суммарное действие касательных к поверхности жидкости сил
называется силами поверхностного натяжения. Эти силы действуют на молекулу А и уравновешивают друг друга
(
)

 +
 −
F
=
F
+
 xi  xi F xi = 0 .
Суммарное действие сил, перпендикулярных к свободной поверхности жидкости  F yi , обусловливает внутримолекулярное
давление и называется силами внутримолекулярного давления. Они
уравниваются силами взаимного отталкивания между молекулами.


 F yi = F – силы внутримолекулярного давления.
Силы поверхностного натяжения направлены по касательной к
свободной поверхности жидкости, силы внутримолекулярного
давления – перпендикулярно.
Коэффициентом поверхностного натяжения жидкости α
называется сила поверхностного натяжения F, приходящаяся на
единицу длины контура l, ограничивающего свободную поверхность жидкости, и определяется по формуле:
σ=
F

Η 
 m 
.
(22)
Явление закупорки кровеносных сосудов при попадании в них
воздуха (газа) называется газовой эмболией.
Рассмотрим кровеносное русло с пузырьком воздуха или газа
при наличии внешнего давления Ро ≠ 0 и без него Ро = 0 (рис. 7).
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 7. Механизм газовой эмболии
Если Ро = 0, то радиусы кривизны пузырька одинаковы:
R1 = R2.
Силы поверхностного натяжения направлены по касательной к
поверхности жидкости и действуют как на левую, так и на правую
поверхности.

 Они равны между собой, так как жидкость одна и та
же: | F 1 |=| F 2 |.


F 1,0 =  F 1 – суммарное действие сил поверхностного на-
тяжения
 на левую
 поверхность,
F 2,0 =  F 2 – суммарное действие сил поверхностного на-
тяжения на правую поверхность.
Эти силы уравновешивают друг друга, следовательно, со стороны пузырька газа нет действия на жидкость (жидкость неподвижна).
 
F1,0 = F2,0 , так как R1 = R 2 .
Если Ро > 0, то R1 > R2, так как жидкость одна и та же (жидкость течет):
F2,0


F 1,0 =  F 1 ;


F 2,0 =  F 2
F1,0 Fо


F 1,0 < F 2,0 , так как при сложении сил по правилу параллелограмма
 имеет
 значение угол между складываемыми векторами.
F 1,0 – F 2,0 – она направлена против внешнего давления и препятствует течению жидкости.
32
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Такие биологически важные объекты, как плазма и сыворотка
крови, обладают свойствами восстанавливать исходную величину
поверхностного натяжения, уменьшающуюся в результате добавления поверхностно активных веществ (ПАВ). Это очень важное
свойство, необходимое для поддержания гомеостаза крови. Такая
способность растворов восстанавливать исходную величину поверхностного натяжения называется поверхностной буферностью.
Как показали Д.Л. Рубинштейн, Ю.Л. Кузьмина, поверхностная
буферность сыворотки крови объясняется наличием в ней ионов
кальция. Последние, реагируя с поверхностно-активными жирными кислотами, образуют с ней нерастворимые соли, не способные
уже изменять величину поверхностного натяжения.
Немалую роль в поддержании постоянства поверхностного натяжения плазмы и сыворотки крови играют содержащиеся в них
белки, которые адсорбируют ПАВ.
Таким образом, благодаря наличию белков и ионов кальция
плазма и сыворотка крови сохраняют относительное постоянство
величины поверхностного натяжения, резко изменяющейся только
в случаях тяжелых заболеваний (например, при желтухе, вследствие попадания большого количества желчных кислот в кровяное
русло).
При изучении поверхностной буферности системы необходимо
проследить кинетику перехода динамического поверхностного натяжения в статическое после добавления к раствору ПАВ.
Любой раствор, обладающий поверхностной буферностью,
должен постепенно восстанавливать исходную величину поверхностного натяжения, понизившегося под влиянием ПАВ. Следовательно, для построения кривой, характеризующей поверхностную
буферость раствора, необходимо измерить его поверхностное натяжение до прибавления ПАВ, немедленно после прибавления и
через некоторые промежутки времени, вплоть до установления
равновесия (пока значение поверхностного натяжения не перестанет изменяться).
Приводим некоторые значения поверхностного натяжения различных жидкостей (Н/м) при +20оС: белок (куриный) – 0,05269,
вода – 0,07275, глицерин – 0,06340, уксусная кислота – 0,02763,
ртуть – 0,465.
33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 10
Определение поверхностного натяжения
методом отрыва кольца
Работа на торзионных весах. Измерение поверхностного натяжения производится при помощи так называемых крутильных,
или торзионных, весов которые предназначены для быстрого и
точного взвешивания. С помощью двух опорных регулируемых весов производится правильная установка весов по уровню, находящемуся в передней части корпуса (пузырек уровня должен быть в
середине).
Диапазон взвешивания устанавливается с помощью регулировочной головки «Pzzelaeznik Larrari» (черную правую головку поворачивать только по часовой стрелке). С правой стороны корпуса
внизу находится головка, позволяющая блокировать подвижный
рычаг. Если красная точка стоит на «z», это означает «закрыто», а
на «О» – «открыто». Устанавливают указатель равновесия точно по
красной черте с помощью левой нижней головки.
На крючок коромысла с помощью пинцета подвешивают кольцо и освобождают подвижный рычаг (положение «О»). Затем подвижный рычаг ставят в положение красной точки на «z» (зажато).
На крючок коромысла с помощью пинцета подвешивают кольцо и снова освобождают арретир – рычаг в положение красной
точки «О».
После этого левой верхней головкой вращают шкалу до тех
пор, пока подвижная стрелка не займет положение на красной черте.
Массу взвешенного предмета отсчитывают на подвижной шкале в том месте, куда указывает неподвижная стрелка, таким образом, когда к числу, указанному в окошке, прибавляют величину,
указанную на шкале. Арретир ставят в положение «зажато», записывают полученные показатели.
Калибровка кольца. На предварительно тщательно вымытое
сухое часовое стекло наливают воды в количестве 0,5 – 1,0 мл.
Стекло помещают на подъемный столик. При помощи кремельеры
подъемного столика поднимают часовое стекло до тех пор, пока
поверхность жидкости не коснется кольца (следует затоплять
кольцо в жидкости). Затем освобождают коромысло весов и мед34
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ленно поворачивают рычаг натяжения, пока кольцо не оторвется от
жидкости. В течение этой операции необходимо постоянно следить
за положением кольца и прекратить движение рычага в момент отрыва кольца от поверхности жидкости. Быстро отодвигают в сторону подъемный столик и взвешивают кольцо с прилипшей к нему
жидкостью. Определяют истинную силу отрыва кольца по формуле:
Pвода = P1 − P2
,
(23)
где Р вода – истинная сила отрыва кольца для воды;
Р 1 – сила отрыва, найденная в опыте;
Р 2 – вес кольца с прилипшей к нему жидкостью.
Поверхностное натяжение воды вычисляется по формуле:
σН О =
2
Р ⋅ 0,981 −3
⋅10 H / м,
πD
(24)
где σн2о – коэффициент поверхностного натяжения;
Р – истинная сила отрыва кольца;
D – диаметр кольца в сантиметрах, найденный как средняя величина результатов 3-4 измерений, проведенных в различных направлениях. Учитывая зависимость поверхностного натяжения от
температуры, значение последней обязательно записывать при
проведении измерений.
Зависимость поверхностного натяжения воды от температуры
(Н/м) представлена в таблице 6.
Таблица 6
о
C
σ⋅10-3
16
73,34
17
73,19
18
73,05
19
72,90
20
72,75
22
72,44
24
72,13
26
71,82
Определение константы кольца. Для определения константы
кольца устанавливают силу отрыва кольца от воды и от какой-либо
другой жидкости, поверхностное натяжение которой находят из
35
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
таблиц (например, 96-градусный этиловый спирт – 22,27⋅10-3 Н/м
при +20оС),
К =
σх
−1
σН О
2
Рх
−1
Р Н 2О
(25)
Определение поверхностного натяжения различных жидкостей проводится тем же порядком, что и определение поверхностного натяжения воды. Затем делают расчет по формуле:
.
Qист. = (Qнайден. ⋅ K ) − K + 1
,
(26)
где Qист – относительное поверхностное натяжение данной жидкости, т.е. отношение ее поверхностного натяжения к поверхностному натяжения воды;
Qнайден. – отношение силы отрыва кольца от данной жидкости к
силе отрыва кольца от воды:
Pх
PН
2О
.
К – эмпирическая константа, определяемая для каждого кольца
экспериментальным путем.
Поверхностное натяжение различных жидкостей определяют
по формуле:
σх = σН2О . Qист. .
(27)
Подставив значение константы К и рассчитанную по формуле
величину Qист. в формулу, определяют поверхностное натяжение
исследуемой жидкости.
Задание 1. Определение поверхностного натяжения различных жидкостей.
Способом, описанным раньше, определяют поверхностное натяжение ацетона, уксусной кислоты, бензола, глицерина, хлороформа. При работе необходимо тщательно следить за чистотой часового стекла, пипеток и кольца. Перед каждым определением их
36
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
промывают водой, спиртом и сушат в сушильном шкафу 5 – 10
минут.
Задание 2. Влияние поверхностно-активных веществ на поверхностное натяжение физиологического и рингеровского растворов.
Помещая 0,5 см3 рингеровского раствора на часовое стекло,
определяют два раза с интервалом 3 – 5 мин. поверхностное натяжение раствора по способу, описанному выше. Добавляют к раствору, находящемуся на часовом стекле, одну каплю 0,1%-ного
раствора олеата натрия и тотчас определяют силу отрыва кольца.
Такие определения производят спустя 1, 3, 5 ,10, 20 мин. Аналогичные измерения производят с физиологическим раствором.
На основании полученных данных вычисляют величины поверхностного натяжения для каждого момента опыта и строят графики, отражающие изменения поверхностного натяжения во времени, откладывая по оси абсцисс время в минутах, а по оси ординат – значение поверхностного натяжения в дин/см (1Н/м = 103
дин/см).
Задание 3. Исследование поверхностного натяжения плазмы
крови.
Помещают 0,5 см3 плазмы крови на часовое стекло, определяют два раза с интервалом 3 – 5 мин. поверхностное натяжение
плазмы. Затем к налитой на часовое стекло плазме добавляют две
капли 0,1%-ного раствора олеата натрия, предварительно разбавленного в 10 раз физиологическим раствором.
Определяют силу отрыва тотчас после добавления олеата натрия, а затем спустя 1, 3, 5, 10, 20, 30 мин.
Точно так же проводят контрольный опыт с 1%-ным раствором
хлористого натрия. На основании полученных данных вычисляют
величины поверхностного натяжения для каждого момента опыта и
строят графики, откладывая на оси абсцисс время в минутах, а по
оси ординат σ . Для очищения от плазмы крови кольцо промывают
особенно тщательно.
37
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Задание 4. Определение поверхностного натяжения водной
вытяжки растений.
Проростки или листья растений (1 – 2 г) растирают в фарфоровой ступке, приливают 10 – 15 мл дистиллированной воды (или
буферный раствор с pH около 7) и фильтруют через бумажный
складчатый фильтр. Из фильтра берут 0,5 см3 вытяжки, помещают
на часовое стекло и определяют силу отрыва кольца. Повторяют
определение через каждые 5 мин. в течение 30 мин. Аналогичные
измерения проводят и с вытяжками растений, которые были предварительно подвергнуты влиянию высоких и низких температур.
Обращается внимание на изменение поверхностного натяжения.
Оформляют результаты способом, описанным выше.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 11
Определение поверхностного натяжения
по методу Ребиндера
Для измерения поверхностного натяжения имеется ряд методов, одним из которых является метод наибольшего давления газовых пузырьков на видоизмененном приборе Ребиндера.
Схема прибора Ребиндера изображена на рисунке 8.
Исследуемая жидкость наливается в сосуд 1. Через пробку этого сосуда проходит капиллярная трубка 2, нижний конец которой
касается поверхности жидкости, а верхний соединен с атмосферой.
Если давление в трубке 2 больше, чем давление на поверхности
жидкости, то на конце капилляра образуется пузырек воздуха, который по мере уменьшения давления над поверхностью жидкости
будет расти до некоторого предела.
Поверхностное натяжение можно найти по величине разрежения, необходимого для прохождения пузырьков. Жидкости в сосуде
должно быть столько, чтобы кончик слегка касался поверхности.
Разрежение в сосуде 1 измеряется микроманометром 3. Оно
создается с помощью аспиратора 4, из которого по каплям вытекает вода. Пузырьки должны проходить со скоростью примерно
один-два в секунду.
38
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 8. Схема прибора Ребиндера
Работа начинается с определения постоянной прибора К, зависящей от угла наклона манометра и размера кончика капилляра.
Для этого измеряется максимальное давление в пузырьке для воды
Ρ H 2 O с известным при данной температуре поверхностным натяжением σ H 2 O (табл. 6). Для этого капиллярные трубки устанавливаются на оптимальный угол наклона трубок. С уменьшением угла
наклона трубок чувствительность прибора повышается, а следовательно, увеличивается и точность отсчета. Поэтому желательно установить трубки на возможно меньший угол, но такой, чтобы измерения давления не вышли за пределы шкалы. Затем рукоятку
крана А повернуть против часовой стрелки до упора. Рукоятка крана В1 должна быть повернута против часовой стрелки, а рукоятка
крана В2 – по часовой стрелке до упора.
Константу прибора рассчитывают по формуле:
K =
σH
2O
Ρ H 2O
.
(28)
Поверхностное натяжение исследуемых жидкостей находится
по формуле:
39
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
σx = К.Рx ,
(29)
где Рx – давление, определяемое по разности между максимальным
показанием микроманометра (появление газовых пузырьков) и минимальным (исходное показание).
Задание 1. Влияние поверхностно-активных веществ на поверхностное натяжение физиологического и рингеровского растворов.
Определить 2 раза с интервалом 3 – 5 мин.
а) определить поверхностное натяжение рингеровского раствора;
б) к рингеровскому раствору добавить 10% 0,1%-го спиртового
раствора олеата;
в) определить поверхностное натяжение раствора через 1, 3, 5,
10, 15, 20 мин.;
Аналогичное измерение провести с физиологическим раствором. Данные занести в таблицу 7.
Таблица 7
Рингеровский
раствор
Начальное
измерение
3 – 5 мин.
После добавления олеата
натрия
1
3
5
10 15 20
Показания
манометра
Поверхностное
натяжение
На основании полученных данных построить графики изменения поверхностного натяжения от времени, откладывая по оси абсцисс время в минутах, а по оси ординат – значения поверхностного
натяжения (дин/см).
Задание 2. Исследование поверхностного натяжения плазмы
крови.
Определять 2 раза с интервалом 3 – 5 мин.
Определить поверхностное натяжение плазмы. Затем определить поверхностное натяжение смеси 10% 0,1%-ного спиртового
40
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
раствора олеата натрия и плазмы. Спустя 1, 3, 5, 10, 20, 30 мин. определять поверхностное натяжение указанной смеси. Данные занести в таблицу по форме 5. На основании полученных данных также
построить график зависимости поверхностного натяжения от времени.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 12
Определение коэффициента
поверхностного натяжения сталагмометрическим
методом (методом отрыва капли)
Контрольная жидкость – вода, исследуемые – этанол, плазма
или их водные растворы. Капля жидкости отрывается от бюретки в
тот момент, когда сила поверхностного натяжения уравновешивается силой тяжести капли (см. рис. 9):
|Fпов.нат.| = |Fтяж.| ; σ l = mg ; σ . 2πR = ρgVкап.,
(30)
где R – радиус перетяжки (в конечной форме не учитывается),
ρ – плотность жидкости,
V – объем одной капли (определить практически).
Берутся две жидкости известных плотностей (ρо и ρx). Для одной известен коэффициент поверхностного натяжения σо (наиболее часто для этой цели используется вода). Для другой – нет (σx).
Его надо определить.
Из соотношения (30) запишем выражение для коэффициента
поверхностного натяжения:
σо =
ρ оV о g
,
2πR
σx =
ρ xV x g
2πR ,
(31)
(32)
где Vо – объем капли известной жидкости (вода).
Vx – объем капли жидкости с неизвестным коэффициентом поверхностного натяжения.
41
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 9. Суммарное действие сил, возникающее в момент отрыва капли
Делим (31) на (32) и получаем:
σ о ρ оVo
=
σ x ρ xV x .
(33)
Получили рабочую формулу для вычисления коэффициента
поверхностного натяжения методом капли:
σx =σо
ρ xV x
,
ρ oVo
(34)
где ρx (кг/м3) – плотность неизвестной жидкости (дана),
ρо – плотность известной жидкости (вода), определяется по
таблице,
Vx (м3) – объем одной капли неизвестной жидкости,
Vo – объем одной капли воды.
Для вычисления σx надо определить Vx и Vo , для этого необходимо:
42
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1. Налить в бюретку воды, выпустить 2-3 см3 = /2-3/ · 10-6 м3 и
сосчитать число капель в этом объеме. Эксперимент провести 3
раза и найти среднее значение числа капель в выпущенном объеме.
2. Найти
объем
одной
капли
по
формуле
выпущенный объем
.
Vo =
число капель
3. То же самое проделать с исследуемой жидкостью.
4. Определить температуру toС воды, найти по таблице значение коэффициента поверхностного натяжения воды σо при данной
температуре.
5. По рабочей формуле найти коэффициент поверхностного
натяжения исследуемой жидкости.
6. Результаты измерений занести в таблицу 8.
Таблица 8
НаименоваВыпущ. Число
ние жидко- объем капель
сти
(м3)
в объеме
Вода
Исследуемая
жидкость
1
2
3
1
2
3
Среднее
значение
1
2
3
1
2
3
43
Объем Плотодной ность
капли
Масса
одной
капли
Коэффиц.
поверх
ностного
натяжения
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 13
Определение поверхностного натяжения жидкости
по поднятию в капиллярной трубке

Допустим F i – силы поверхностного натяжения, направленные
по касательной
кповерхности жидкости.

F пов.нат. =  F i – суммарное действие сил поверхностного натяжения, обусловливающее явление капиллярности, т.е. поднятие
или опускание жидкости в капиллярных трубках. Силы F i складываются по правилу параллелограмма.
Жидкость в капилляре под
нимается до тех пор, пока сила F n.н. не уравновесится силой тяжести столба жидкости в капиллярной трубке (см. рис. 10):




Fn.н. = – F тяж. или
 | F n.н. | = |2F тяж. |;
| F n.н. | = σ · 2πR; | F тяж. | = ρπ R . hg,
ρRhg  Η 
(35)
тогда σ · 2πR2 = ρπ R2 · hg ; σ =
 м  .
2
Получили рабочую формулу для определения коэффициента
поверхностного натяжения методом поднятия жидкости в капиллярной трубке,
где ρ – плотность,
g – ускорение свободного падения,
h – высота поднятия жидкости в капилляре относительно её
уровня в сосуде,
R – радиус капилляра.
Рис. 10. Суммарное действие сил,
обусловливающее явление капиллярности
44
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Для выполнения работы необходимо:
Взять капилляр и опустить его вертикально в широкий сосуд с
жидкостью.
Измерить высоту h поднятия жидкости в трубке (вода, ацетон,
спирт, плазма или их водные растворы). Измерения провести 3 раза
(h1, h2, h3). Найти среднее значение:
hср =
1
(h1 + h2 + h3 )
3
.
3. Найти абсолютную ошибку измерения высоты (Δh):
Δh =
(
)
1
hср − h1 + hср − h2 + hср − h3 .
3
.
4. Зная радиус капилляра и плотность исследуемой жидкости
(ρ), найти среднее значение коэффициента поверхностного натяжения жидкости (σср):
σ ср =
ρRg
Η 
hср  .
2
 м
(36)
5. Определить абсолютную ошибку для коэффициента поверхностного натяжения жидкости:
Δσ =
ρRg
2
Δh.
(37)
6. Записать окончательный ответ в следующем виде:
Η 
σ = σ ср ± Δσ  .
 м
7. Результаты измерений записать в таблицу 9.
(38)
Таблица 9
Измерение h (м)
1. h1=
2. h2=
3. h3=
Δh
σср (Н/м)
45
Δσ
R (м)
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Примечание к пункту 3: Если h1=h2=h3, то Δh берется половина
деления шкалы, т.е. 0,5 мм. Δh = 0,5 ⋅ 10-3 м.
Вопросы
1. Поверхностное натяжение, коэффициент поверхностного натяжения.
2. Способы измерения поверхностного натяжения.
3. Механизм газовой эмболии.
4. Поверхностная буферность как средство поддержания постоянства внутренней среды.
46
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Содержание
Кинетика биологических процессов ................................................................. 3
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 1. Определение температурного
коэффициента и вычисление энергии активации сокращения сердца
лягушки ....................................................................................................... 7
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 2. Влияние температуры на активность
каталазы дрожжевых клеток ..................................................................... 8
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 3. Влияние температуры на активность
каталазы растительных объектов ........................................................... 10
Ингибирование ферментативной функции тяжелыми металлами ......... 11
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 4. Влияние нитрата свинца на активность
каталазы дрожжевых клеток ................................................................... 11
Гемолиз ................................................................................................................. 12
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 5. Определение времени 50-процентного
гемолиза, вызываемого НСl .................................................................... 12
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 6. Влияние токсических веществ липидной
природы на скорость гемолиза, вызываемого HCl ............................... 13
Липофильность биологически активных соединений
и мембранный транспорт .......................................................................... 14
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 7. Определение коэффициента
распределения органических соединений расчетными методами ..... 17
Электропроводность биосистем ....................................................................... 18
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 8. Определение сопротивления
однородных клеточных взвесей ............................................................. 19
Вязкость биологических объектов .................................................................. 22
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 9. Определение вязкости
сыворотки крови ...................................................................................... 27
Поверхностное натяжение................................................................................. 30
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 10. Определение поверхностного
натяжения методом отрыва кольца ........................................................ 34
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 11. Определение поверхностного
натяжения по методу Ребиндера ............................................................ 38
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 12. Определение коэффициента
поверхностного натяжения сталагмометрическим методом
(методом отрыва капли) .......................................................................... 41
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА 13. Определение поверхностного
натяжения жидкости по поднятию в капиллярной трубке .................. 44
47
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Учебное издание
Лабораторные работы
по биофизике
Жандарев Валерий Валентинович
Дигурова Ирина Ивановна
Редактор, корректор А.А. Антонова
Компьютерная верстка И.Н. Ивановой
Подписано в печать 17.03.2006 г. Формат 60х84/16.
Бумага тип. Усл. печ. л. 2,8. Уч.-изд. л. 1,52.
Тираж 100 экз. Заказ
Оригинал-макет подготовлен
в редакционно-издательском отделе ЯрГУ.
Отпечатано на ризографе.
Ярославский государственный университет.
150000 Ярославль, ул. Советская, 14.
48
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
49
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В.В. Жандарев, И.И. Дигурова
Лабораторные работы
по биофизике
Ярославль
2006
50
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
36
Размер файла
611 Кб
Теги
608, биофизика, жандарев, работа, лабораторная
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа