close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

1045.ПЦР - ДИАГНОСТИКА КРИПТОСПОРИДИОЗА КУР

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Jh-Ъ ?4£Z
На правах рукописи
frtf
Уеадина Анастасия Викторовна
ПЦР - ДИАГНОСТИКА КРИПТОСПОРИДИОЗА КУР
03.00.19 - паразитология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва - 2008
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа выполнена в лаборатории протозоологии ГНУ Всероссийский
научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени
Я. Р. Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук и
лаборатории молекулярной диагностики Института молекулярной генетики
Российской академии наук
Научный руководитель:
- доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки
РСФСР, Заблоцкий Вячеслав Титович
Официальные оппоненты:
- лауреат премии Совета Министров СССР, заслуженный деятель науки
РФ,
член-корреспондент
Академии
естествознания,
доктор
биологических наук, профессор Дьяконов Л.П. (ВИЭВ)
- доктор биологических наук, профессор Бенедиктов И.И.
Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Московская Государственная Академия
ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»
Защита диссертации состоится « 9 » 0/>р*Л% 2008 г.
в /*/•*- час, на заседании диссертационного совета Д 006.011.01 по защите
диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при
ГНУ Всероссийском институте гельминтологии им. К.И. Скрябина (И7218,
Москва, Б. Черемушкинская, 28).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.
Автореферат разослан« v »
/Чй/^
Ученый секретарь диссертационного совета
2008 г.
В.К. Бережко
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1. Общая характеристика работы.
1.1. Актуальность темы. Птицеводство занимает важное место в
сельскохозяйственном производстве. В условиях интенсивных технологий
ведения птицеводства цыплята с первых дней жизни подвергаются
воздействию факторов как инфекционной, так и неинфекционной природы,
что приводит к снижению общей неспецифической
организма
и вызывает
резкие
морфо-функдиональные
резистентности
изменения
в
желудочно-кишечном тракте, которые влияют на работу пищеварительного
тракта, рост и продуктивность птиц. Серьезную проблему в промышленном
птицеводстве представляет криптоспоридиоз.
Криптоспоридии известны как паразиты преимущественно кишечного
тракта, хотя они были установлены и в других органах и тканях животных
(Fayer R., Ungar B.L., 1986).
В соответствии с определением ВОЗ криптоспоридиоз отнесен к числу
типичных
зоонозов,
возбудители
которых
трансмиссируются
с
позвоночными животными, птицами и человеком.
Несмотря на некоторые успехи в изучении криптоспоридиоза во многих
странах мира, в том числе и в нашей стране, он продолжает оставаться
актуальной проблемой ветеринарии и медицины. При этом следует отметить,
что наиболее сложной стороной в решении данной проблемы является
диагностика криптоспоридиоза.
В
настоящее
время
криптоспоридиоз
широко
распространен
на животноводческих и птицеводческих фермах, особенно в странах
европейского
континента,
где
заболеваемость
телят
этой
инвазией
колеблется от 22 до 40% от числа заболевших с признаками диареи. Наряду с
телятами высокую чувствительность к возбудителю проявляют ягнята и
козлята. Мыши, крысы и морские свинки также заражаются ооцистами
криптоспородий,
но без проявления
клиники болезни, будучи при
этом "резервуаром" для инфицирования домашних животных. У птиц
криптоспоридиоз чаще имеет респирато жую фор
ечную.
имени К. А. Тимирязева
ЦНБ имени Н И . Ж лезнов1а
| Фонд нау;днм£ %у Г ^ 1 У Р Ы
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Частота
поражения
окончательно
не
респираторного
изучена.
Ооцисты
тракта
у
млекопитающих
криптоспоридий
обладают
чрезвычайной устойчивостью к разным лечебным антимикробным и
антипаразитарным веществам, а также дезинфицирующим средствам.
Заражение животных и птиц происходит алиментарно и аэрогенно (Muirhead
S., 1986; Pavlasekl., 2001).
В своих исследованиях мы исходили из интереса к изучению опасного
антропозооноза - криптоспоридиоза птиц.
Актуальность проблемы криптоспоридиоза птиц обусловлена отсутствием
надежных экспресс-методов диагностики, что и определило цель и задачи
наших исследований.
1.2.
Цель
и
задачи
работы.
Изучить
распространенность
криптоспоридиоза кур в Саратовской и Московской областях; разработать
диагностическую тест-систему на основе ПЦР для выявления возбудителя
криптоспоридиоза кур.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие
задачи:
- Подобрать специфические олигонуклеотидные праймеры для выявления
ДНК Cryptosporidium baylei;
- Отработать условия проведения полимеразной цепной реакции с
использованием полевого штамма идентифицируемого возбудителя, включая
подбор методики выделения ДНК;
- Определить оптимальную концентрацию компонентов реакционной
смеси, температурный режим, условия регистрации результатов анализа;
- Апробировать разработанную ПЦР тест-систему в экспериментальных
условиях на таксономическую специфичность, включая использование
клинического и патологического материала от естественно зараженной
птицы и лабораторных животных.
2
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- Провести эпизоотологическое обследование птицеводческих хозяйств и
исследовать
клинический
материал от больной птицы на наличие
Cryptosporidium baylei;
1.3. Научная новизна.
Подобрана методика выделения ДНК из культур клеток простейших
организмов, клинического и патологического материала;
Разработана экспериментальная диагностическая тест-система на основе
ПЦР для диагностики криптоспоридиоза кур: подобраны специфические
оли гону клеотидные
праймеры
для
выявления
ДНК,
определены
оптимальные условия проведения ПЦР.
Проведено
эпизоотологическое
обследование
специализированных
хозяйств Московской и Саратовской областей;
1.4. Практическая значимость. Разработаны методические указания по
применению экспериментальной тест-системы ПЦР для выявления ДНК
Cryptosporidium baylei, которые рассмотрены и одобрены Ученым советом
ВИЭВ 2006 года.
Представленные
результаты
наших
исследований
могут
быть
использованы в практической ветеринарии для прижизненной и посмертной
диагностики криптоспоридиоза птиц.
1.5. Основные положения, выносимые на защиту:
оптимизация условий и конструирование праймеров для выявления
и идентификации криптоспоридий;
разработка и апробация тест-системы на основе ПЦР для
диагностики криптоспоридиоза кур.
эпизоотологическое обследование специализированных хозяйств субьектов РФ.
1.6. Апробация работы. Основные положения диссертационной работы
доложены на научно-производственных конференциях, Ученом совете ВИЭВ
(2007), межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (2007).
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 научных
работы, в том числе одна в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки
РФ.
1.8. Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на
страницах компьютерного текста и
состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов
исследований,
собственных
результатов
исследований,
обсуждения
результатов, заключения, выводов, практических предложений, списка
цитированной литературы. Материалы диссертации иллюстрированы
таблицами,
источников, из них
рисунками.
Список
литературы
включает
зарубежных.
2. Собственные исследования.
2.1. Материалы и методы.
Работа выполнена в период с 2002 по 2005 г.г. в лаборатории
протозоологии ГНУ Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии
им. Я.Р. Коваленко и в лаборатории молекулярной диагностики Института
молекулярной генетики Российской академии медицинских наук.
С целью выявления возбудителя криптоспоридиоза птиц и определения
степени инвазированности цыплят нами было проведено обследование на
четырех птицефабриках и одном племрепродукторе I и порядка:
- Московская область, Нарофоминский район, ЗАО птицефабрика
«Элинар Бройлер »;
- Московская область, г. Люберцы, ЗАО птицефабрика «Мирная»;
- Московская область, Конобеевский р-н, п/ф «Барановское»;
-Саратовская область, Татищевский р-н, ФГУП «Племрепродуктор
Зоринский».
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Специализированные предприятия имели аналогичный тип технологии
содержания, кормления, породы, возраста.
Для разработки экспериментальной тест-системы ПЦР для обнаружения и
идентификации
возбудителя криптоспоридиоза кур мы использовали
полевой штамм Cryptosporidium baylei. Данный штамм был получен от птиц
из хозяйств Московской и Саратовской областей.
Ооцисты- возбудителя имеют овальную форму и тонкую стенку, размер в
среднем составляет 5,0 — 4,6 мкм. В препаратах, приготовленных из свежего
материала и окрашенных методом Циля-Нильсена, ооцисты имеют вид
овальных образований ярко-красного цвета.
Для
проверки
таксономической
специфичности
разрабатываемой
экспериментальной тест-системы нами была использована ДНК различных
близкородственных видов организмов (токсоплазмы, эймерии). Культура
клеток эймерии (Eimeria tenella) в концентрации 1млн. клеток в 1мл,
представленная лабораторией протозоологии ВНИВИП г. Санкт-Петербург;
Toxoplasma gondii предоставлен заведующим лабораторией протозойных
инфекций НИИЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи к.м.н. Д.Б. Гончаровым; полевой
штамм Cryptosporidium baylei и Сг. parvum в концентрации 10 000 м. кл./мл.
Лабораторные животные:
В качестве лабораторной модели для поддержания выделенного нами
экспериментального штамма криптоспоридий использовали беспородных
белых мышей и крыс в возрасте 1-20 дней.
Клинический и патологический материат:
Материалом для исследования служили: фекалии, смывы с носоглотки,
прямой кишки, слюна, ткани кишечника.
Всего исследовано 2021 проба клинического материала от кур и 30 проб
патологического материала от цыплят-бройлеров.
В работе использовано следующее лабораторное оборудование: ламинар
бокс Л-5В; центрифуга Mikro 120, Hettich Eppendorf centrifugo 5415;
термостат Termo 24-15 Biokom; вортекс Fuge-vortex; LABOTER ПЦР бокс
5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ДНК-Технология; амплификатор Biokom; трансиллюминатор; микроскоп
ЛОМО-МББ-1А.
Химические реактивы.
1. Транспортная среда (10 mM Tris HC1; 1 т М EDTA рН 8,0; 2% DDT);
2. Лизирующий раствор;
3. Отмывочный раствор;
4. ТЕ-буфер для элюции ДНК;
5. Раствор фермента протеиназы К;
6. 5хТВЕ (трис; борная кислота; 0,5 m EDTA);
7. Красители: 1% раствор бромистого этидия; бромфенол синий;
8. Хлорид магния (MgCb);
9. Фермент Taq-полимераза;
10. Водонасыщенный хлороформ;
11. Реакционная смесь (Н 2 0; dntp; BxlO; Mg2+).
Материал, используемый нами для экспериментальной работы, получали
от спонтанно
и экспериментально
зараженных
цыплят-бройлеров и
лабораторных животных (мыши, крысы).
Материалом для исследований служили пробы фекалий и смывы с прямой
кишки, носоглотки от птицы из специализированных хозяйств, лабораторных
животных (мыши, крысы).
Выделяли и накапливали биомассу возбудителя (ооцисты Cryptosporidium
baylei) при
помощи
нескольких методов обогащения,
использовали
флотационные растворы. В качестве флотационных растворов применяли
насыщенные растворы различных веществ (соли (NaCl), сахарозу, растворы
сульфата цинка, среду Бреза, сульфата магния, тисульфата натрия), а
вспомогательным средством в достижении поставленной перед нами цели
(накопление ооцист криптоспоридий) служило центрифугирование.
Для длительного хранения выделенную культуру ооцист хранили в
растворе бихромата калия 2,5% концентрации при температуре 7°С.
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Определение наличия ооцист в мазках проводили под имерсионной
системой микроскопа при увеличении 10X90.
Интенсивность инвазии у птицы определяли методом подсчета (В.Ф.
Никитин) в 20 полях зрения микроскопа при увеличении в 600 раз: слабая
инвазия или + -от 1 до 3 ооцист во всех полях зрения; средняя или ++ до 4
ооцист; сильная или +++ - от 5 и более ооцист.
Моделью для воспроизведения
криптоспоридиозной
инвазии и
поддержания штамма Cryptosporidium baylei, Cryptosporidium parvum в
лабораторных условиях служили новорожденные белые мыши и крысы.
Для
экспериментальных
исследований
использовали
4
группы
новорожденных лабораторных животных в возрасте 2 дней по 10 животных в
каждой. Заражение нами проводилось с целью получения биомассы
Cryptosporidium parvum, Cryptosporidium baylei. Животным инокулировали
суспензию возбудетеля per os. Суспензия ооцист двух видов Cryptosporidium
была получена методом флотации с центрифугированием из фекалий
больных криптоспоридиозом птиц и телят. Инокулят, вводимый мышам и
крысам, содержал
10 тыс. ооцист. Ооцисты вводили при помощи
автоматического микродозатора, используя индивидуальные наконечники
для каждого животного.
За экспериментальными животными вели ежедневное наблюдение, а
исследование фекалий начинали с 2-х суток и продолжали по 20-ые сутки
после заражения. Материал, получаемый от экспериментально зараженных
животных, исследовали методом световой микроскопии и ПЦР. Для
подтверждения диагноза использовали патологоанатомическое вскрытие с
последующим приготовлением гистологических препаратов.
Лабораторных
экспериментального
животных
заражали
с
материала,
для
использовали
чего
целью
получения
материал,
полученный от больных криптоспоридиозом птиц и телят путем смыва с
носоглотки и прямой кишки.
7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Образцы клинического материала, используемые нами для выделения
ДНК Cryptosporidium bayilei, С. parvum хранили в морозильной камере при
минус
20°С
до
начала
исследований.
Не
допускали
повторного
замораживания/оттаивания. Клинический материал помещали в пробирку,
содержащую 0,5 мл транспортной среды (10 mM Tris HCL, 1 тМ EDTA рН
8,0,2% DDT) при помощи одноразового стерильного шпателя.
При первичной подготовке клинического материала с целью увеличения
концентрации ооцист в исследуемом материале использовали несколько
модификаций
обогащения
проб
(флотацию,
седиментацию,
центрифугирование). В качестве флотационной жидкости использовали
среду Бреза, которая представляет собой смесь гипертонических растворов
тиосульфата
натрия,
сульфата
магния,
дистиллированной
воды
в
соотношении, равном 3:3:1, 60% раствор сахарозы.
Выделение ДНК осуществляли несколькими методами: сорбентным,
лизирующим с протеиназой К.
Гидролиз ДНК эндонуклеазами рестрикции проводили, как правило, в
соответствии с рекомендациями фирм-изготовителей ферментов. Потерю или
появление рестрикционного сайта определяли соответственно по наличию
или отсутствию рестрицированного ПЦР-продукта.
Амплифицированную ДНК осаждали с применением колонок для гельфильтрации NAP 10.
Разделение
продуктов
амплификации
проводили
методом
горизонтального электрофореза в 1,5% агарозном геле.
Результаты реакции учитывали с использованием трансэллюминатора.
Фрагменты анализируемой ДНК проявлялись в виде красно-фиолетовых
полос при облучении УФ излучением с длиной волны 310 нм.
Положительный контроль для Cryptosporidium baylei: выявлялась полоса
размером 612 н.п.
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Отрицательный контроль: полоса на уровне положительного контроля
должна отсутствовать. Появление полосы в отрицательном контроле
свидетельствует о контаминации компонентов набора для реакции.
Если в анализируемых пробах отмечалось отсутствие полосы строго на
уровне соответствующего контроля, это свидетельствовало об отсутствии
данного возбудителя в пробе. Наличие полосы на уровне положительного
контроля сообщало о наличии данного возбудителя в клинической пробе.
2.2. Результаты исследований.
Изучая распространенность паразитоценозов птиц в специализированных
птицефабриках двух регионов (Московской и Саратовской областей), мы
провели
широкое
обследование
на
наличие
в
них
возбудителя
криптоспоридиоза.
Применение диагностически точных и ускоренных методов детекции
кокцидий рода Cryptosporidium во многом определяет эффективность
противоэпизоотических мероприятий и сокращает экономические потери.
Однако сложность индикации криптоспоридий в объектах, обильно
контаминированных
посторонней
микрофлорой,
может
существенно
затруднять выделение и идентификацию этого паразита. Поэтому остается
актуальной
разработка
и
внедрение
новых
эффективных
методов
обнаружения и идентификации криптоспоридий. Одним из таких методов
является полимеразная цепная реакция. Анализ проб с использованием ПЦР
проводится в течение 2-2,5 часов и позволяет обнаружить от 10 ооцист в 1 мл
исследуемого клинического материала.
Успех разработки ГШР-теста во многом зависит от правильного подбора
праймеров на основе сравнения нуклеотидных последовательностей геномов
Cryptosporidium.
При
сравнении
нуклеотидных
последовательностей
использовали
программу «OLIGO».
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Праймеры подбирали таким образом, чтобы они имели равные или
близкие температуры отжига с соответствующими матрицами. В процессе
работы соблюдали данные условия как для пар наружных, так и внутренних
праймеров.
Также
нами
были
подобраны
праймеры
и
отработана
новая
диагностическая тест-система, основанная на амплификации участка гена
18SrRNA,HSP70.
На следующем этапе работы мы подбирали оптимальный метод
выделения ДНК из клинических образцов. За основу был взят выше
описанный метод, разработанный в Институте молекулярной генетики РАН.
Этот метод отличается простотой, дает высокий выход ДНК и удобен для
массовых исследований.
1
2
3
- л"
«Ни.
!
4
5
6
;
Рис. 1: Определение чувствительности метода ПЦР. Ампликоны, полученные
при nested ПЦР: 1 трек - рестрицированная проба, полученная путем
рестрикции с ферментом Taq-полимераза; 2 трек - рестрицированная ДНК,
прошедшая очистку через колонку NAP 10; 3,4,5,6 - клинические пробы.
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Реакцию проводили в присутствии наружных и внутренних праймеров.
Результаты оценивали по наличию в геле и, соответственно, на фотографии
специфических
фрагментов
ДНК,
рассчитанный
размер
которых
соответствует размеру синтезируемого ампликона Cryptosporidium baylei.
По данным тестирования faeces, смывов обследуемой птицы на
содержание возбудителя, наблюдалось заметное совпадение данных как по
положительным, так и по отрицательным результатам.
Таблица 1
Сравнительные результаты определения Cryptosporidium bailey и С.
parvum в faeces больной птицы и экспериментально зараженных
животных (белые мыши).
Вид животного
Количество
Совпадение результатов при обследовании
и возраст (дни) обследованных
разными методами
животных
(голов)
Мыши 7-10 дн.
Микроскопия
мазка окрашенного
по Циль-Нильсену
полимеразно-цепная
реакция
+
-
+
-
18
15
3
17
1
235
190
45
206
29
220
173
47
202
18
Цыплятабройлеры 3140дн.(ЗАО
«Барановское»)
Цыплятабройлеры 3140 дн.(ЗАО
«Мирная»)
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Подтверждение
эффективности
разработанной
нами
тест-системы
проводили на экспериментально зараженных белых мышах и больных
цыплятах. От цыплят 31-40-дневного возраста брали клинический метериал
(фекалии). Мышей 1-2-дневного возраста заражали суспензией ооцист
Cryprosporidium
parvum,
предоставленной
лабораторией
протозойных
инфекций Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи. На
7-10 день после заражения от мышей брали образцы фекалий. Параллельно с
ПЦР полученные образцы исследовали методом микроскопии мазков,
окрашенных по методу Циль-Нильсена.
При микроскопическом исследовании положительные результаты были
зарегистрированы у лабораторных животных в 80% случаев; у цыплят
бройлеров при аналогичном исследовании - в 79%. В тест-системе ПЦР у
мышей положительный результат - в 94 %, у цыплят - в 89% случаев.
Специфичность
амплификации
фрагмента
нуклеотидной
последовательности в присутствии подобранных праймеров определяли с
помощью
рестрикционного
анализа
соответствующих
ампликонов.
Амплификацию проводили на ДНК, Cryptosporidium baylei и parvum,
выделенных из клинических образцов и полученных от лабораторных
экспериментально зараженных животных.
Рестрикты фрагмента области генома Cr. baylei были позднее применены
для конструирования образца внутреннего контроля (ОВК). Результаты
рестрикционного
анализа продуктов амплификации
представлены
на
рисунке:
12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
« ж » ? •<*
612н.о.
Рис. 2.1 трек - рестрицированная ДНК Cryptosporidium baylei, выделенная
из клинической пробы; 2 трек - рестрицированная ДНК Cryptosporidium
baylei, выделенная из клинической пробы и очищенная переосаждением
спиртом.
Условия
и
режимы
проведения
предварительных экспериментах.
реакции
были
отработаны
в
Для оценки чувствительности и
специфичности ПЦР использовали полевые штаммы: Cryptosporidium baylei
и parvum, эмерий; эталонные штаммы: Toxoplasma gondii.
Одним из наиболее важных параметров, определяющих специфичность и
чувствительность
реакции,
является
отжиг
праимеров.
Температура
проведения отжига праимеров зависит от его длины и содержания в нем пар
нуклеотидных оснований.
Температуру плавления и отжига для каждого праймера в отдельности
рассчитывали по формуле:
Т0™„га = 2 х (Т+А) + 3 х (C+G) - 5 [°С], где
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
А, Т, С, G - число соответствующих нуклеотидов в составе праймера.
Рассчитанная по приведенной выше формуле температура была для нас лишь
ориентиром при выборе температурного показателя. Эту величину наиболее
точно мы определили в серии экспериментов.
Отклонение от оптимальной температуры отжига в сторону понижения
приводило к образованию неспецифических продуктов реакции при
исследовании полевых штаммов, выделенных от больной птицы, а при
повышении более чем на 2°С - чувствительность реакции снижалась.
Параметры реакции зависели от типа термоциклера, объема реакционной
смеси, количества циклов. Увеличение числа циклов более 45 приводило к
образованию неспецифических ампликонов, а при снижении числа циклов
отмечалось заметное уменьшение выхода специфического реакционного
продукта.
В ходе серии опытов установлено, что чувствительность данной реакции, с
выбранными праймерами и определенными нами условиями проведения
ПЦР, составляет от 10 до 10 тыс. м.к./мл. В процессе экспериментов по
проверке специфичности реакции с данной парой праймеров тестировали 5
штаммов криптоспоридий, специфичных для птицы, и 2 штамма возбудителя
криптоспоридиоза млекопитающих, 1 штамм возбудителя эймериоза (Е.
tenella).
Со всеми
представителями
вида Cryptosporidium
были
получены
положительные результаты, но с другими видами кокцидий положительного
ответа не было ни в одном случае.
Нами были обследованы 5 птицефабрик в Московской и Саратовской
областях. Обследование проводилось в птичниках 2 раза в год: в зимневесенний и осенне-зимний периоды. Данные периоды года выбраны не
случайно, т.к. именно в эти сезоны года, по нашим наблюдениям,
преобладает иммунодефицитное состояние птицы, повышенная влажность
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
воздуха, что способствует сохранению инвазионных свойств ооцист
возбудителя во внешней среде.
Всего было подвергнуто исследованию 2021 проба.
В период проведения работы нами был выявлен криптоспоридиоз в 4-х из
5 обследованных хозяйств.
Возраст обследованной птицы составлял 10-60 дней. Материал получали с
птицефабрик как с напольным так и с клеточным типом содержания.
Выделение ооцист отмечалось у птицы в возрастной категории от 30 до 45
дней. Экстенсивность инвазии достигала наиболее высоких показателей на
39-41 день. ЭИ в возрасте 10 дней и 30-40 дней.
Интенсивность выделения ооцист с фекалиями в инфицированных
хозяйствах изменялась в зависимости от сезона года
и возраста, но
преобладала средняя или сильная. Преобладание средней и сильной степени
инвазии зависело от того, что забор фекалий проводили от птицы,
находящейся на разных стадиях заболевания.
В
осенне-зимний
период
экстенсивность
инвазии
на
разных
птицефабриках находилась в пределах от 89 до 92%, но в целом по
Московской области она составляла 90%.
Зимне-весенний период:
Очень высокая степень зараженности кур в зимне-весенний период
связана с ослабленным иммунитетом у птицы в это время года.
2.2.1. Спонтанная криптоспоридиозная инвазия у кур.
Основным клиническим признаком криптоспоридиоза цыплят является
диарея.
Заболевшая птица находится в угнетенном состоянии. Температура тела в
период заболевания часто бывает снижена. При исследовании фекалий от
больной птицы единичные ооцисты обнаруживаются в фекалиях на 7-12 дни
после заражения. В нативных мазках, приготовленных из фекалий больных
цыплят, регистрировали от 7 до 20 и более ооцист в поле зрения микроскопа.
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Для изучения криптоспоридиоза в лабораторных условиях использовали
новорожденных белых мышей и крысят в возрасте 1-20 дней. Лабораторные
животные
такого
возраста
наиболее
восприимчивы
к
заражению.
Лабораторных животных заражали полевыми штаммами, полученными от
больной птицы и телят из хозяйств Московской и Саратовской областей.
Взвесь ооцист криптоспоридий получали вышеописанным флотационным
методом. Доза заражения - 10 -15 тыс. ооцист в 1 мл. Животных
обследовали, начиная со
2
дня после заражения. В течение периода
наблюдений у мышей и крыс, зараженных Cryptosporidium baylei, выделение
ооцист и клинических признаков не наблюдалось, из чего можно сделать
вывод, что данный вид ооцист принадлежит птице. А в опытах с
исследованием материала, полученного от больных телят, в фекалиях
обнаруживались ооцисты криптоспоридий и характерные изменения в тканях
тонкого отдела кишечника.
Таблица 2
Сравнительные
результаты
определения
количества
ооцист
в
носоглоточной слизи и фекалиях птицы, больной криптоспоридиозом методом ПЦР
Количество
обследованных
Результаты обнаружения ооцист криптоспоридий в
фекалиях и носоглоточной слизи.
Отрицательные
Положительные
фекалии
носоглоточная
слизь
фекалии
носоглоточная
слизь
856
759
672
97
184
1203
1195
907
8
296
Из таблицы видно, что ооцисты криптоспоридий обнаруживаются в
фекалиях в 95% случаев, а в носоглоточной слизи — в 76%.
16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Проведенные исследования показали высокую информативность ПЦР при
исследовании носоглоточной слизи и фекалий как биосубстрата для
обнаружения ооцист.
Результаты выявления возбудителя в носоглоточной слизи позволяют
рассматривать ее как удобный биосубстрат при обследовании больной птицы
на инфшшрованность криптоспоридиозом.
Данные, полученные в наших исследованиях, и мнения других авторов
указывают
на
эпизоотологическую
значимость
хронически
больных
животных как возможный источник заражения контактирующих с ними
других животных и обслуживающий персонал.
2.2.2. Патологоанатомические изменения.
Проводя патологоанатомическое исследование трупов, экспериментально
зараженных лабораторных животных, было отмечено, что у мышат и крысят,
зараженных
суспензией
ооцист
Cryptosporidium
baylei,
гистоморфологические изменения отсутствовали, тем самым подтверждая
принадлежность возбудителя к данному виду и его видоспецифичность.
Патологоанатомические изменения присутствовали в желудочно-кишечном
тракте мышей и крыс, зараженных возбудителем криптоспоридиоза телят Cryptosporidium parvum. Наблюдали гиперемию слизистой оболочки
и
катаральное воспаление тонкого отдела кишечника, набухание и увеличение
ворсинок.
При внешнем осмотре трупы цыплят истощены, перьевой покров вокруг
клоаки загрязнен испражениями с примесью крови и слизи, конъюнктива
глаз и слизистая оболочка ротовой полости анемичны.
Макроскопические изменения сопровождались присутствием большого
количества серозного экссудата в конъюнктивальных мешках, носовых
ходах, просвете трахеи. Наблюдалась гиперемия и набухание синусов,
серокрасная пятнистость легких и печени.
При патологоанатомическом вскрытии трупов павших цыплят, у которых
болезнь проявлялась ярко выраженной клинической картиной, основные
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
изменения обнаруживались в желудочно-кишечном тракте: слизистая
оболочка двенадцатиперстной кишки набухшая, покрыта слоем слизи,
Стенки
двенадцатиперстной
кишки
утолщены,
ворсинки
сглажены,
отмечаются точечные кровоизлияния.
При криптоспоридиозной инвазии бронхолегочной системы отмечали
очаги пневмонии, скопление казеозного экссудата. В последующих
исследованиях биоптата методом ПЦР удалось идентифицировать ДНК
Cryptosporidium baylei.
При микроскопии гистопрепаратов было отмечено, что эндогенные стадии
возбудителя локализовались главным образом в подвздошной и 12-перстной
кишке.
Рис.3 Эндогенные стадии Cryptosporidium baylei в ткани подвздошной
кишки больной птицы.
IS
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
выводы.
1. Отработаны и модифицированы методы получения биомассы
возбудителя.
2. Отработан метод выделения специфической ДНК из биологического
материала (faeces, носоглоточной слизи).
3. Подобраны и сконструированы праймеры (CPB-DIAGF, СРВDIAGR, Cyr 558U21, N-DiagRml) на основе консервативной
нуклеотидной последовательности гена для разработки ПЦР по
выявлению и идентификации криптоспоридий.
4. Разработаны
оптимальные
параметры
экспериментальной
полимеразной цепной реакции с данными праймерами, которые
позволяют с высокой чувствительностью и специфичностью (95%)
детектировать Cryptosporidium baylei рода Cryptosporidium.
5. В сравнительных исследованиях установлено, что тест-система на
основе
ПЦР
является
более
эфективной
для
диагностики
спонтанного криптоспоридиоза у кур в сравнении с флотационными
методами и микроскопией.
6. Показано, что экспериментальная тест-система на основе ПЦР
позволяет выявлять возбудителя криптоспоридиоза кур в смывах с
носоглотки и фекалиях больной птицы.
7. Получены
новые
статистические
данные
по
эпизоотологии
криптоспоридиоза птиц в 2-х областях.
19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Практические предложения.
Методические рекомендации по ПЦР-диагностике криптоспоридиоза кур.
Авторы: А.В. Уездина, В.В. Демкин, В.Т. Заблоцкий.
Методические рекомендации рассмотрены и одобрены Ученым советом
ВИЭВ 2006 года и на секции «Инвазионные болезни животных» Отделения
ветеринарной медицины Россельхозакадемии 25 мая 2007 г. протокол №2.
7. Список опубликованных работ по теме диссертации:
Уездина
А.В.
Эпизоотология
и
лабораторная
диагностика
криптоспоридиоза кур / Уездина А.В., Демкин В.В. // Объединенный
научный журнал. - 2006. - №27. - С. 72-74.
Уездина А.В. Применение молекулярно-биологическнх
диагностике
криптоспоридиоза
кур
/
Уездина
методов в
А.В. //
Вестник
Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. - 2007. - Вып. 2. С. 70-71.
Уездина А.В. ПЦР-диагностика криптоспоридиоза кур / Уездина А.В.,
Заблоцкий В.Т. // VI Всероссийская научно-практическая конференция с
международным участием «Молекулярная диагностика - 2007»: Сб.
материалов: В 3 т. - Москва, 2007. - Т.2. -С. 63- 65.
20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Подписано в печать 04.03.200S г.
Печать трафаретная
Заказ № 140
Тираж: 100 экз.
Типография «11-й ФОРМАТ»
ИНН 7726330900
115230, Москва, Варшавское ш., 36
(495) 975-78-56,
(499) 788-78-56
www.autoreferat.ru
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
15
Размер файла
426 Кб
Теги
1045, криптоспоридиоза, диагностика, пцр, кур
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа