close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

5001.СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ AZOSPJRILLUM BRASILENSE С РАЗНЫМИ СТЕПЕНЯМИ АДЕНИЛИРОВАНИЯ

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
На правах рукописи
СМИРНОВА
Виктория Евгеньевна
СВОЙСТВА И РЕГУЛЯЦИЯ ГЛУТАМИНСИНТЕТАЗЫ
AZOSPJRILLUM
BRASILENSE
С РАЗНЫМИ СТЕПЕНЯМИ
АДЕНИЛИРОВАНИЯ
Специальности: 03.00.04. — Биохимия,
03.00.07. - Микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов - 2003
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Диссертация выполнена в Институте биохимии и физиологии
растений и микроорганизмов Российской академии наук.
Научные руководители: доктор биологических наук Л.П.Антонюк
доктор химических наук А.А.Камнев
Официальные оппоненты: доктор биологических наук,
профессор А.А. Щербаков;
кандидат медицинских наук,
старший научный сотрудник М.Н. Киреев
Ведущая организация —
Институт биохимии им. А.И. Баха РАН
Защита состоится «21» января 2004 г. в 10 00 на заседании
диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и
физиологии растений и микроорганизмов РАН по адресу 410049, г.
Саратов, проспект Энтузиастов, 13.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.
биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской
академии наук.
Автореферат разослан « /
» декабря 2003
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор биологических наук В.Е. Никитина
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В последние годы проявляется повышенный интерес
к микроорганизмам, обитающим в ризосфере возделываемых человеком расте­
ний. Известно, что высшие растения поддерживают на своих корнях существо­
вание целых бактериальных сообществ, которые, в свою очередь, фиксируют
молекулярный азот атмосферы, передавая связанные его формы растениюхозяину (Becker et al, 2002; Умаров, 1986; Кацы, 2003). Среди ассоциативных
бактерий есть штаммы, способные колонизировать преимущественно внутрен­
ние части корня и проводящую систему растения-хозяина (Dobereiner et al,
1995). Эти бактерии получили название эндофитов. Они оказывают
значительно более выраженное позитивное влияние на рост и развитие
растения-хозяина по сравнению с бактериями, не способными проникать
внутрь корня (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000; Dobereiner and Pedrosa, 1987).
Среди азоспирилл, пожалуй, единственным штаммом, принадлежность
которого к эндофитам строго доказана, является Azospirillum brasilense Sp245,
природный симбионт пшеницы (Baldani et al, 1983; Assmus et al, 1995).
Инокуляция пшеницы в полевых условиях этим штаммом приводила к более
чем двукратному (237 % по сравнению с контролем) увеличению содержания
азота в наземной части растения-хозяина (Dobereiner and Pedrosa, 1987). В связи
с этим изучение азотного обмена азоспирилл, в частности; A. brasilense Sp245,
представляет большой интерес. '
•
Глутаминсинтетаза (ГС) считается ключевым ферментом азотного обмена,
так как с одной стороны, катализируемая данным ферментом реакция'предста­
вляет собой единственный путь синтеза глутамина, а с другой - глутамин явля­
ется донором аминогруппы в биосинтезе целого ряда клеточных метаболитов.
В конце 80-х1 годов прошлого столетия структурный ген ТС A. brasilense был
секвенирован (Bozouklian and Elroerich, 1986); таким образом, аминокислотная
последовательность фермента к настоящему времени уже известна. В'90-х
годах вышел ряд публикаций по ГС Л. brasilense (Pirola et al, 1992; Беспалова и
пр., 1994;.Bespalova et al, 1999; Чернышев, 1999). Усилиями итальянских и
российских ученых ГС азоспириллы была частично охарактеризована: опредетены молекулярные массы мономерной и олигомерной форм фермента,
пучены каталитические особенности среднеаденилированной ГС. В 90-е годы
5ыл описан неизвестный ранее для глутаминсинтетаз тип регуляции активности
фермента - регуляция экстраклеточным сигналом растения-хозяина (Antonyuk
rr al, 1993; Антоюок и др., 1997). Так, было установлено, что при росте А. Ъгаilense Sp245 в условиях азотфиксации связывание агглютинина зародышей
нненицы (АЗП) с клетками азоспириллы приводит к увеличению активности
"С (Antonyuk et al, 1993), а также к активации биосинтеза данного фермента
Антонюк и др., 1997). Оставалось, однако, неизвестным, реализуется ли
(анный тип регуляции фермента только в азотфиксирующих условиях роста
1лн он характерен для ГС азоспириллы независимо от ajoj^rpj(tj^cjiapjaHoxo_.
татуса клетки.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Бактериальные аденилируемые глутаминсинтетазы считаются сложноорганизованными ферментами, как в отношении структурной организации, так
и в отношении регуляции активности и биосинтеза фермента. Важно отметить,
что представления о бактериальных глутаминсинтетазах ограничены понима­
нием строения и функционирования фактически только ГС энтеробактерий Escherichia coli и Salmonella typhimurium (Eisenberg et al, 2000). Таким образом,
важность ГС в азотном метаболизме бактерий, с одной стороны, и недостаточ­
ность сведений о строении и свойствах этого фермента у азоспирилл, с другой
стороны, побудили нас продолжить изучение ГС A. brasilense и предпринять
исследование,' посвященное выделению, очистке и изучению свойств и
регуляции ГС A. brasilense с разными степенями аденилирования.
Цельи задачи исследования
Целью данной работы было исследование свойств и регуляции глутамин­
синтетазы — ключевого фермента азотного" метаболизма почвенной ассоци­
ативной бактерии A.'brasilense. '
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Подобрать условия культивирования A. brasilense Sp245, индуцирующие
образование «глутаминсинтетазы
с
определенной,
степенью^
аденилирования.
2. Получить электрофоретически гомогенные препараты ГС азоспирйллы с.
разной степенью аденилирования для последующего изучения их свойств
и регуляции; изучить термостабильность фермента.
3. Выяснить, зависит ли специфичность глутаминсинтетазы азоспирйллы к
Mg2+, Мп2+ и Со2* от степени аденилирования фермента.
4. Изучить
кинетическое
поведение
неаденилированной
формы
глутаминсинтетазы в биосинтетической реакции.
5. Изучить влияние ' агглютинина зародышей пшеницы на активность
глутаминсинтетазы у бактерий, растущих в аэробных условиях.
6. Исследовать вторичную структуру глутаминсинтетазы и оценить влияние
на нее катионов двухвалентных металлов и степени аденилирования
фермента.
.
7. Изучить связывание катионов в активных центрах фермента методом
эмиссионной спектроскопии ядерного гамма-резонанса с.использованием
радиоактивного изотопа 37Со.
Научная новизна работы. Проведено комплексное исследование струк­
туры и свойств ГС, ключевого фермента азотного обмена азотфиксирующей
бактерии A. brasilense. Впервые получена неаденилированная форма, бактери­
альной ГС без использования мутантов и ковалентной модификации:фермента.
Предложен новый метод определения степени аденилирования ГС, основанный
на компьютерной обработке результатов электрофоретического анализа Впер­
вые охарактеризована вторичная структура глутаминсинтетазы A. brasilense;
установлено, что ГС азоспирйллы является высокоструктурированным белком,
до 78% полипептидной цепи которой может быть представлено а-спиралью и
Р-структурой.1 Установлено, что активный центр ГС A. brasilense имеет два
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3
металлсвязывающих сайта, обладающие различным сродством к катиону Со * и
различающиеся координационной симметрией. Впервые продемонстрирована
возможность использования эмиссионной спектроскопии ядерного гаммарезонанса для изучения организации металлсвязывающих центров ферментов.
Изучены каталитические особенности неаденилированной ГС A. brasilense;
проведен сравнительный анализ кинетических характеристик неаденилирован­
ной и аденилированной ГС азоспирнллы.
Практическая значимость работы. Полученные в работе данные о ГС А.
brasilense имеют существенное значение для понимания одного из важнейших
процессов, протекающих в бактериальной клетке, — усвоения неорганического
азота и, кроме того, расширяют представления об азоспириллах - важных в
практическом отношении бактериях. Полученные сведения о ГС азоспириллы
нашли применение при подготовке студентов старших курсов химического
факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, биологического факультета СГУ им.
Н.Г. Чернышевского.
Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и мик­
роорганизмов РАН в лаборатории биохимии в рамках темы «Изучение молекулярно-генетических механизмов узнавания, контакта и обмена метаболитами
азоспирилл и культурных злаков» (научный руководитель заслуженный деятель
науки РФ профессор дбл. Игнатов В.В., Л'а гос. регистрации 01860024516) и в ла­
боратории биохимии растительно-бактериальных симбиозов в рамках темы «Осо- •
бенности биохимии эндофитных и ассоциативных симбионтов рода Asospirillum» (научный руководитель дбл1.Антх>1ш>кЛГ1,№ гос. регистрации 01200012855).
Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных
исследований (проект Л» 01-04-48755), ИНТАС (проект № 96-1015) и Комиссии
РАН по работе с молодежью (б-й Конкурс-экспертиза проектов, проект Jfe 205).
Апробация работы. Материхчы диссертации представлялись на 20to FEBS
Meeting (Hungary, 1990), XII юбилейной конференции «Ферменты микроорга­
низмов» (Казань, 2001), 2nd International Conference on Trace Element Speciation
in Biomedical, Nutritional and Environmental Sciences (Germany, 2001), 4 INTAS •
Interdisciplinary Symposium on Physical and Chemical Methods in Biology, Medi­
cine, and Environment (Moscow, 2001), 7 й International Symposium on Metal Ions
in Biology and Medicine (St.-Petersburg, 2002), III Съезде биохимического об­
щества (Санкт-Петербург, 2002), Первой региональной конференции молодых
ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой»
(Саратов, 2002), 10th European Conference on the Spectroscopy of Biological
Molecules (Hungary, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ в зарубежных и •
отечественных научных изданиях.
" •
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,
обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения
полученных результатов и их обсуждения (в 3 главах), выводов'и списка
цитируемой литературы, содержащего 304 источника, в том числе - 255
зарубежных. Работа изложена на 141 странице машинописного текста,
содержит 14 рисунков и 9 таблиц.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы исследования
В работе были использованы бактерии штамма A. brasileme Sp245, выде­
ленные из поверхностно стерилизованных корней пшеницы (Baldani ,el at.,
1983). Штамм поддерживался в коллекции культур Института биохимии, и.
физиологии растений и микроорганизмов РАН. Биомассу микроорганизмов для
выделения фермента наращивали аэробно в колбах Эрленмейера объемом 2000
мл при 32°С.:Клеткн'растили на минеральной синтетической среде (Day and
D6bereiner, 1976) с некоторыми модификациями. При выращивании культуры
A. brasilense Sp245 для получения частично аденнлнрованных ГС использовали
хлорид аммония. в . качестве источника азота (5 мМ). Для получения
неаденилированной формы ГС малат натрия заменяли сукцинатом натрия (5
г/л), а в качестве источника азота использовали L-глутамат натрия (5 мМ), а не,
аммоний.
..Разрушение замороженной биомассы проводили двумя способами:
продавливая замороженные клетки через фильеры Френч-пресса или же
растирая их с кварцевым песком в фарфоровой ступке. Гомогенат клеток,
выращенных,в условиях, индуцирующих образование неаденилированной.
формы ГС, суспендировали в экстрагирующем, буферном растворе,.
содержащем MnCfe (1.мМ) и имидазол-НСЬбуфер (25 мМ) при конечном рН^
7,5, а в условиях, индуцирующих образование частично аденидированных ГС —
в растворе, содержащем: фенилметилсульфонилфторид (0,5 мМ), эгилендиаминтетраацетат'натрия (ЭДТА) (1 мМ), Tris-HCl-буфер (75.мМ), Р-меркаптоэтаноя (0,5 мМ), при конечном рН 7,0. Затем для освобождения от нук­
леиновых кислот к полученным суспензиям добавляли ДНКазу I и стрептомицинсульфат до конечной концентрации 0,25 мг/мл и 2 мг/мл соответственно и
инкубировали 30 мин при 4СС. От осадка освобождались центрифугированием.
Ионообменная колоночная хроматография проводилась на анионообменном носителе DEAE-Toypearl 650M ("Toyo Soda"). Колонку (S = 2 см2, h = 18
см) уравновешивали 0,05 М Трис-HCl-буфером (рН 7,0). После нанесения свя­
завшиеся с носителем полимеры подвергали ступенчатой элюции исходным
буфером, содержащим 0,2 и 0,3 М КаС1 соответственно. Выход белковых фрак­
ций регистрировали на приборе Uvicord S-II (LKB) при Х=278 нм. Для осво-.
бождения от солей и смены буфера белковых препаратов проводили гель-филь­
трацию на. сефадексе. G-25. Для проведения высокоэффективной хроматог­
рафии (FPLC) использовали колонки двух типов: Mono-Q и QtSepharose HP.
("Pharmacia Biotech"). В первом случае колонка уравновешивалась 0,02 МЛрисHCl-буфером (рН 7,0). Элюцию проводили исходным буфером в:градиенте
NaCl от 0 до 1 М. Во втором случае колонку уравновешивали 0,05 М Трис-НС1буфером (рН 8,0). Элюцию проводили тем же буфером в градиенте NaCl от 0 до
1 М. Белковые.фракции собирали и тестировали на проявление активности ГС
трансферазным методом. Аффинная хроматография проводилась на носителе
Affi-Gel Blue Gel ("Bio-Rad"). Ферментный препарат наносили на колонку (S^l
см2, h=15 см), уравновешенную 0,02 М имидазол-НС1-буфером, рН .6,3,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
s
содержащим 1 мМ МпС12. После выхода белков, не связавшихся с носителем,
колонку промывали 3-5 объемами исходного буфера, содержащего 1 М NaCl, и
затем элюировали 0,02 М имндазол-НС1-буфером (рН 7,5), содержащим 1 мМ
MnCU и 5 мМ АДФ. Скорость элюции во всех случаях составляла 10-20 мл/ч.
Белковый препарат собирали порционно и каждую фракцию тестировали на
проявление активности ГС трансферазным методом.
Концентрацию белка определяли по методу Бредфорд (Bradford, 1976).
Электрофорез белков проводили в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS) (Laemmli, 1970). Белки окрашивхпи раствором Кумасси G250 (Гааль и др., 1982) или 0,1 % раствором серебра (Блохин, 1988).
Активность фермента в процессе выделения и очистки контролировали
двумя методами: трансферазным (Bender et al, 1977) и биосинтетическим
(Пушкин и др., 1972).
Степень аденилирования ГС определяли двумя способами. Первый - ме­
тод Шапиро и Стэдмана (Shapiro and Stadtman, 1970), основанный на способ­
ности ионов магния ингибировать активность аденилированной формы фер­
мента в трансферазноП реакции. Второй - с использованием программы Sigma
Gel: электрофоретиче'ские гели препаратов ГС сканировали, определяли пло­
щади пиков (%), соответствующих аденнлированным и неаденилированным
субьединицам ГС, и рассчитывали степень аденилирования ; (при п=12; ГС
содержит 100 % аденилированных субъединиц).
Вторичную структуру фермента изучали методом кругового дихроизма
(КД). В работе использовался дихрограф JASCO J-500C (Япония). Измерения
проводили в области 190-250 нм при 20°С в 1-мм кюветах при концентрации:'
белка от 0,35 до 0,8 мг/мл; скорость сканирования - 2 нм/мин. Содержание.
элементов вторичной структуры рассчитывали с помощью программы CONTIN
(Provencher, 1981).
"' .
Изучение металлсвязывающих центров ГС, допированной 57 Со 2 \ •
проводили методом эмиссионной спектроскопии ядерного гамма-резонанса (ЭС .
ЯГР). Измерения проводили при помещении образца, служившего источником
гамма-излучения, .непосредственно в держателе спектрометра в криостат с
жидким азотом (Т •» 80 К); поглотителем служил K4[Fe(CN)6]"3H20.
Результаты исследований и их обсуждение
1. Влияние различных источников азота и углерода в среде
культивирования на степень аденилирования ГС A..brasilense Sp24S
Механизм аденилирования-деаденилнрования дает возможность плавно и
гибко изменять свойства и активность ГС - в зависимости от реальных
потребностей бактериальной клетки в глутамине. Известно, что степень *
аденилирования бактериальных ГС сильно варьирует в зависимости от фазы
роста и состава питательной среды (Pirola era/, 1992; Беспалова и др., 1994).
Необходимо • было подобрать условия культивирования, позволяющие'
вырастить клетки A: brasilense Sp245, содержащие ГС с определенной степенью
аденилирования. В этой связи было исследовано влияние трех факторов:
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
б
источников азота' (KNOj, NHjCl, L-глутамат натрия) и углерода (малат и
сукцинат натрия) в питательной среде, а также время культивирования. . • .
Клетки A, brasilense Sp245 выращивали аэробно в колбах Эрленмейера на
синтетической минеральной среде. При выращивании клеток на малатной среде
(16-18 ч) при использовании KNOj и NH4C1 в качестве источников азота
степень аденилнровзния ГС колебалась следующих пределах: 25 мМ ККОз 4,0-5,5; 50 M M - K N O , - 5,0-6,5; 5 мМ NH4C1 - 2,0-5,5; 50 мМ NH4CI - 7,5-9,0.
Увеличение времени культивирования до 20-24 ч. приводило к возрастанию
степени аденилирования. Проведенные .эксперименты позволили подобрать-.
наиболее удобные условия выращивания A. brasilense Sp245 для последующего
получения препаратов ГС с разной степенью аденилирования. Были отобраны
три режима культивирования: для получения неаденилированной (ГСо), с
низкой степенью аденилирования (ГС2.2) и чуть ниже средней (ГС},з). ГС2.2 и
ГС5.3 получили при выращивании клеток на минеральной синтетической среде,
содержащей малат натрия (5 г/л) и хлорид аммония (5 мМ); при этом время
культивирования бьшо разным - 18 и.22 ч, соответственно. Для получения ГСо
клетки выращивали- на минеральной синтетической среде, содержащей
сукцинат натрия (5 г/л) и L-глутамат натрия (5 мМ), в течение 18-20 ч. Следует
отметить, что впервые были подобраны условия культивирования,
позволяющие получить неаденилированную форму бактериальной ГС.
2. Получение электрофоретическн гомогенных препаратов ГС
A. brasilense и исследование ее термостабнльности- '
Для изучения свойств и регуляции ГС A. brasilense Sp245 были получены
три электрофоретическн гомогенных препарата ГС: неаденилированной (ГСо), с
низкой степенью аденилирования (ГС2д) и чуть ниже средней (ГС3,з).
Получение и очистка частично аденилированных форм ГС A. brasilense
Грубый экстракт клеток И. brasilense высаливали до 50 % насыщения суль- '
фатом аммония. Осадок балластных белков отделяли центрифугированием. К
супернатанту добавляли сульфат аммония до 80 % насыщения. Образовавший­
ся осадок ресуспендировали в минимальном объёме 50 мМ Tris-HCl-буфера (рН
7,0) и обессоливали. Обессоленный ферментный препарат подвергали очистке
методом ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650M и FPLC-xpo-'
матографии на анионообменной колонке Mono Q. Процедуры очистки позво­
лили получить электрофоретическн гомогенные препараты ГС A. brasilense со
степенью аденилирования 2,2 и 5,3 с удельной активностью 150 мМ и. 120 мМ.
у-глутамилгидроксамовой кислоты (у-ГГК) на мг белка соответственно. Актив­
ность фермента определяли трасферазным методом. При электрофорезе в при­
сутствии SDS очищенная ГС мигрировала двумя полосами (М,== 52 кДа, М, =
53 кДа; неаденилированная и аденилированная субъединицы ГС соответствен­
но), что хорошо согласуется с данными по молекулярной массе ГС A. brasilense, .
полученными французскими исследователями при секвенировании гена glnA
(Bozouklian and Elmerich, 1986), а также с данными итальянских ученых (Pirola,,.
ct al, 1992). Для уточнения степени аденилирования гомогенных препаратов
ГС полученные электрофореграммы сканировали и оценивали соотношение
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7
аленилироаанныч и неадгнилированныч субъединиц фермента с помощью
программы Sigma Gel.
Очистка неаденилированиой ГС A. brasilense
Грубый экстракт клеток A. brasilense высаливали до 35 % насышения сульфзтом аммония. Осадок балластных белков отделяли центрифугированием. К
супернаганту добавляли сульфат аммония до 70 % насыщения и оставляли для
формирования осадка, который затем собирали центрифугированием, ресуспенднровали в минимальном объёме 20 мМ Hepes-буфера (рН 7,5) и обессоливали.
Обессоленный ферментный препарат подвергали очистке методами: FPLCхромзтографии на анионообменнон колонке Q-Sepharose HP, ионообменной
хроматографии на DEAE-Toyopearl 650M и FPLC-хроматографии на аннонообменной колонке Mono Q. Полученная ГС содержала незначительное коли­
чество балластных белков и подвергалась аффинной хроматографии на Affi-Gel
Blue, что привело к получению электрофоретически гомогенного препарата пол­
ностью неаденилнрованной ГС, который обладал удельной активностью 375мМ
7-ГГКна мг белка (активность фермента определяли трасферазным методом).
Исследование термостабильности ГС A. brasilense
Известно, что у бактерий встречаются как термостабильные (£. соН,
Bacillus stearothcrmopkilus), так и термолабильные ГС; например, у Rhizobhim
japonicum и R. trifolii одна из двух форм ГС термолабнльна (Пушкин, 1990).
Таким образом, при характеристике ГС того или иного микроорганизма вопрос
о термостабильности фермента требует отдельной экспериментальной провер­
ки. Было исследовано два препарата ГС - электрофоретически гомогенный и
частично очищенный (грубый экстракт клеток A. brasilense высаливали до 50 %
насыщения сульфатом аммония). Было установлено, что при относительно мяг­
ком режиме обработки (50СС, 30 мин) у гомогенного и частично очищенного
препзратов ГС сохранялось около 75% активности фермента. Увеличение вре­
мени обработки снижало активность ГС: неочищенного фермента — до 48,6%, а
очищенного - до 67,8%. При 60°С очищенная ГС проявляла существенно боль­
шую термостабильность по сравнению с неочищенной - 29,3% и 6,9% соответ­
ственно. Двукратное увеличение времени обработки при 60°С обоих препара­
тов не приводило к существенному снижению активности ГС, что в целом гопоргг о существовании в молекуле конформационно жестких участков, обеспечи­
вающих функционирование фермента в неблагоприятных условиях. Учитывая
то, что ГС является ключевым ферментом азотного обменз, логично
предположить, что подобная конформационная стабильность важна для
выживания бактерии в экстремальных условиях.
3. Специфичность фермента к катионам двухвалентных металлов
ГС требуют для проявления активности присутствия катионов двухвалент­
ных металлов, причем наиболее эффективными катионами традиционно счита­
ются Mg : \ Mn2* и Со7* (Eisenberg et ah, 2000; Bespalova et al, 1999). Факти­
чески же ГС разных микроорганизмов существенно различаются по способнос­
ти активироваться этими катионами (Segal and Stadtman, 1972; Matsuoka and
Kimura, 1985). В этой связи интересно было выяснить эффективность данных
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
s
капюнов в поддержании активности ГС азоспириллы. Кроме того, важно было
понять, меняется ли специфичность ГС A. brasilense Sp245 к Mg2*, Co2* и Мп * в
зависимости от степени аденилирования фермента. Эксперименты проводили с
элекгрофоретнчески гомогенными препаратами ГС: неаденилированным (ГСо)
и частичноаденилированным (ГСз.;). Оба фермента после очистки содержали
связанные катионы, от которых не удавалось освободиться с помощью диализа
против буфера (обе формы ГС проявляли активность при исключении катионов
из реакционной среды). Катионсодержащие препараты фермента получили
название «нативной» ГС. Как видно из представленных в табл. 1 данных,
включение в состав реакционной среды катионов двухвалентных металлов —
Mg**, Мп:* или Со2* - приводило к увеличению активности нативной
иеаденилированной ГС, причем Мпг* был менее активен в поддержании
активности ГС по сравнению с Mg;* и Со2*.
Таблица 1. Влияние катионов двухвалентных металлов на активность
нативной и свободной от металла ГС A. brasilense Sp245
Металл в
реакционной
среде?, 1 мМ.
Без металла
Мп**
Мц**
Со**
(Mg'*+Co**)
(Мп**+ Со'*)
Активность ГС в биосинтетической реакции (Р„ мкг/мин)
Нативная ГС
Свободная от металла ГС
п=0
п=0
п = 5,3
9,5 ± 0,2
0
0
13,6 ±0,2
11,0 ± 0,1
6,9 ±0,1
8,5 ± 0,2
24,5 ±0,1
33,0 ±0,1
24,5 ±0,1
19,1 ±0,1
15,0 ±0,1
24,5 ± 0,2
19,8 ±0,2
20,5 ± 0,2
Не определялась
Не определялась
12,8 ±0,3
Примечания: доверительные интервалы даны для надежности 95 %.
•Реакционная смесь содержала 0,5 мМ АТФ, 10 мМ NH«C1 и 20 мМ L-глутамата. Катионы в
смеси были добавлены в равном соотношении до конечной суммарной концентрации 1 мМ.
Так как оставалось неизвестным, какие катионы связаны в активных цент­
рах нативной ГС, была предпринята попытка получения препаратов фермента,
свободных от катионов, что в нашем случае оказалось также необходимым для
корректной оценки специфичности фермента к Mg2*, Мп**и Со2*. Для удаления
связанных с белковой глобулой катионов к препарату ГС (ГСо или ГСз,з)
добавляли ЭДТЛ до конечной концентрации 5 мМ, инкубировали 30 мин при
комнатной температуре, а затем дпализовали против 0,05 М Трис-НС1-буфера
(рН 7,0) для удаления комплексов ЭДТЛ с металлами. Оба препарата ГС после
обработки были свободны от катионов, так как не проявляли биосинтетической
активности при использовании реакционной среды без катионов и проявляли ак­
тивность в катионсодержащей реакционной среде (табл. 1). Необходима отме­
тить, что присутствие связанных катионов оказалось важным для конформационной стабильности фермента. Так, нативные формы ГС A. brasilense храни­
лись в течение нескольких месяцев без потери активности, в то время как сво­
бодные от катионов формы фермента: не восстанавливали полностью
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
9
активность в катионсодержащей реакционной среде (она падала в среднем в 1,5
раза за неделю хранения препарата при +4 С).
Специфичность ГС A. brasilense к катионам была исследована также с ис­
пользованием свободных от металлов препаратов фермента. Как видно из пред­
ставленных в табл. 1 данных, все три исследованных катиона, Mg *, Mn и
Со2*, были эффективны в поддержании активности как незденилированной, так
и аденилированной ГС. Таким образом, ГС A. brasilense существенно отличает­
ся от ГС Е. coli, у которой неаденилированная форма фермента активируется
Mg:* и Со2*, но не активна с Mn2* (Segal and Stadtman, 1972). Важно отметить,
что Мп2* был менее эффективен в поддержании активности ГС азоспириллы по
сравнению с Mg2*n Co2*, причем как в случае TCsj, так и в случае ГС0. ГСо про­
являла максимальную активность с Со2*, ГС5.3 — с Mg .*.
Эксперименты с активацией ГС A. brasilense одновременно двумя катио­
нами (Мд^ + Со^.атакжеМп^ + Со^не показали значительного прироста актив­
ности по сравнению активацией ГС с одним катионом (табл. 1). Важно в этой
связи отметить, что для некоторых бактериальных. ГС описан активирующий
эффект кобальта при субоптимальных значениях катионов магния (Hatanaka et
at., 1987). Основываясь на современных представлениях о механизме действия
бактериальных ГС (Eisenberg et at., 2000), некоторые авторы полагают, что гетеробиядерный катализ более эффективен, чем гомобиядерный (Антонюк, 2002),
но нам не удалось зарегистрировать значительного возрастания активности
фермента.при одновременном добавлении Mg2* и Со2* в. реакционную смесь.
Данный факт, по-видимому, говорит о том, что в выбранных нами условиях
гетеробиядерный катализ, либо не протекает (металлсвязываюшие сайты
связывают только один катион, отличающийся большим сродством), либо
имеет место, но менее эффективен, чем гомобиядерный.
Соотнося полученные нами данные с имеющимися в литературе сведения­
ми, можно отметить, что по специфичности к трем основным катионам ГС А.
brasilense Sp245 не, идентична ни одной из изученных к настоящему времени
глутаминсинтетаз. Учитывая представленные данные, а.также тот факт, что
изученная ранее ГС Л. brasilense Sp245 со степенью аденилирования 6,4 может
при определенных условиях давать большие значения активности с Мп2*, чем с
Mg2* (Беспалова и др., 1994), можно думать, что специфичность ГС азоспирил­
лы к основным катионам все же меняется с изменением степени аденилирова­
ния, однако не так, как это имеет место в случае ГС кишечной пхточки.
4.-. Кинетическое поведение неаденнлнрованной ГС при активации
катионами двухвалентных металлов
В рамках данной работы было предпринято также изучение кинетического
поведения свободной от металлов незденилированной ГС. Зависимость ско­
рости глутаминсинтетазной реакции от концентрации трех субстратов - аммо­
ния, L-глутамата и АТФ - исследовалась при активации ферментаMg2' и Мп2.\ •
Изучение зависимости скорости реакции от концентрации аммония при ак­
тивации Mg2* показало, что максимальные значения активности ГС достигались
при относительно невысоких концентрациях аммония (2,6 мМ). Дальнейшее ее
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
10
повышение приводило к ингибированйю активности фермента, которое дости­
гало 76% (рис. 1а). Кинетическое поведение ГСо по отношению к другому суб­
страту, глутамату^ при активации тем же катионом, сходно с таковым для
аммония. Максимальное значение скорости реакции наблюдалось при концент­
рации субстрата 20 мМ. Субстратное ингибирование составляло 82% (рис. 16).'
Кривая насыщения АТФ имела вид гиперболы. Наблюдалось плавное нарастание
активности фермента с увеличением концентрации данного субстрата'(рис. 1в),
что характерно и для других ГС (Пушкин и др., 1983; Bhandari and Nicolas, 1984).
При смене активирующего катиона с магния на марганец менялся и
характер кинетического" поведения фермента. Так, в случае насыщения
фермента аммонием или глутаматом максимальная активность достигалась в
том же диапазоне концентраций, но субстратное ингибирование было менее
выраженным и составляло лишь б-? % (рис. \г,д). Функция насыщения ГС
АТФ в выбранном нами диапазоне концентраций была представлена прямо
пропорциональной зависимостью (рис. \ё).
Полученные экспериментальные данные анализировались также в коор­
динатах Лайнуивера-Берка и Корниш-Боудена. Ни • в одном из исследованных
случаев использование этих подходов не позволило рассчитать значение
Кщкаж). Сравнение кинетики неаденилированной ГС A: brasilense, активируемой
катионами магнияи марганца (рис. 1), с кинетикой среднеаденилированной ГС
азоспириллы" (ГС«,4), активируемой' теми же1 катионами (изучено ранее,
Беспалова и др., 1994), позволяет увидеть ряд важных черт этого фермента.
Во-первых, во всех исследованных случаях кинетические зависимости
изучаемого фермента сложны и не описываются уравнением Михаэлиса-Ментен, что обусловлено, вероятно, регуляторными функциями'Данного фермента в
метаболизме клетки.
• Во-вторых, степень аденилирования влияет на каталитические свойства
как Мп:*-активируемой, так и Мк^-активируемой ГС азоспириллы. Так, в
случае среднеаденилированной Мл '-активируемой формы ГС не происходило
насыщение глутаматом и аммонием (повышение концентраций этих субстратов
даже до больших, нефйзиологических значений приводило к плавному нараста­
нию активности фермента). В случае ГСо, наоборот, Мп2*-активируемая форма
не только достигала насыщения аммонием и глутаматом, но и демонстрировала
небольшое ингибирование каждым из этих субстратов (рис. 1г, д). При
активации фермента • магнием ингибирование активности фермента его
субстратами наблюдали как для ГСо> так и для ГСв,4, однако а случае
неаденилированной формы оно было ярко выраженным Д82% и 76% для
глутамата и аммония соответственно), в то время как для. аденилированной
формы - умеренным фЬЧ и IWo соответственно).
• В-третьих, активирующий катион способен изменять каталитические
свойства фермента - как неаденилированной, так и среднеаденилированной
формы ГС. При этом характер влияния активирующего катиона, был разным
при разных степенях аденилирования.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
11
s
1
D
30
С
Глугамат, м.М
30
20
43
60
Глутамат, мМ
S
of
1
U
2
25
АТФ, мМ
' Рис. 1. Зависимость активности неаденияированной формы глутаминсинтетазы A. krasilense
при активации Mg2* (а, б, в) и Мп2* (г, д, е) от концентрации: NH<CI - (а, г), L-глутамата
'. натрия - (б, д), АТФ-(в, е).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
12
Таким образом, полученные экспериментальные данные показали, что у А.
brasilense Sp245ГСподвергается сложной внутриклеточной регуляции; активиру­
ющий катион и степень аденилироваиия фермента являются, по-видимому, теми
регуляторными инструментами, посредством которых клетка быстро и гибко
изменяет активность ГС в ответ на меняющиеся условия окружающей среды.
4. Влияние агглютинина зародышей пшеницы на активность и
степень аденилироваиия глутаминсинтетазы
Описанные в предыдущих разделах работы механизмы регуляции актив­
ности ГС A. brasilense Sp245 - регуляция свойств и поведения фермента аденилированнем-деаденилированием и сменой активирующего катиона - реализу­
ются внутриклеточно. Мы исследовали также экстраклеточный тип регуляции
активности ГС азоспириллы.
Характерной особенностью бактерий, живущих в условиях фитосимбиоза,
является появление дополнительных факторов регуляции, исходящих от расте­
ния-хозяина. В случае азоспирилл, образующих ассоциативные и эндофитные
симбиозы с пшеницей, одним из таких факторов регуляции является лектин
пшеницы (АЗП). Накопленные в 90-х годах экспериментальные данные способ­
ствовали формированию представления об АЗП как о молекулярном сигнале
для A. brasilense Sp245, изменяющем метаболизм этой бактерии в направлении,
благоприятном для роста и развития растения-хозяина (Антонюк и Игнатов,
2001). Детальное исследование обнаруженного явления (способности лектина
пшеницы служить молекулярным сигналом для азоспириллы) привело к накоп­
лению фактов, позволяющих думать, %по сигнальные свойства лектина реали­
зуются только в условиях, характерных для симбиоза азоспириллы и пшеницы,
то есть в микроаэробных азотфпксирующнх условиях (Антонюк, 2002). Что
касается глутаминсинтетазы, то установлено, .что связывание АЗП с клетками
азоспириллы, растущей в микроаэробных азотфпксирующнх условиях, приво­
дит к увеличению активности фермента и к активации его биосинтеза (Anto­
nyuk. et al, 1995; Антонюк и соавт., 1997). Учитывая тот факт, что лектин свя­
зывается с поверхностью бактерии (Karpati et al, 1999), мы рассчитали удель-,
ное количество АЗП на клетку азоспириллы для диапазона концентраций, вы­
зывающих активацию ГС. Эти величины находились в диапазоне от 12,5x10"9
до 187,5x10'' мкг/кл. Иотересно отметить, что авторы работы (Antonyuk et al,
1993) наблюдали увеличение активности ГС даже при 10-минутном
воздействия АЗП. .
В связи с этим одной из задач нашей работы была проверка предположе­
ния о том, что при росте A. brasilense Sp245 в условиях аэрации на азотсодер­
жащей среде клетки теряют способность увеличивать активность ГС в ответ на
воздействие АЗП. Были проведены две серии экспериментов. В обоих случаях
культуру растили аэробно в колбах Эрленмейера с использованием качхтки на
стандартной аммонийсодержащей синтетической малатной среде при темпера­
туре 32°С. Так как в проведенных ранее исследованиях (Antonyuk et al, 1993)
было установлено, что активация лектином пшеницы максимально выражена в
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
13
логарифмической фазе роста культуры, то и в нашем случае воздействие АЗП
на клетки азоспириллы оценивали в логарифмической фазе роста.
В первой серии экспериментов клетки после культивирования подвергали
воздействию ЛЗП аналогично тому, как обрабатывали их ранее в азотфиксируюших условиях (Antonyuk eta!., 1993): осаждали центрифугированием,
ресуспендировали в 0,85% NaCl (концентрацию клеток определяли по
стандарту мутности; она составляла 5x10' кл./мл). АЗП добавляли из расчета
62,5x10"* мкг/кл. (удельное количество ЛЗП, вызывавшее максимхчьную
активацию ГС в условиях азотфиксации, Antonyuk ct al, 1993) и инкубировали
без дополнительной, аэрации при комнатной температуре в течение 30 мин.
Активность и степень аденилирования фермента определяли в пермеабилизированных клетках. В суспензию контрольных клеток АЗП не добавляли. Измере­
ние активности фермента показало, что клетки азоспириллы, подвергавшиеся
воздействию лектина, и контрольные клетки имеют практически одинаковую
активность (табл. 2). Степень аденилирования также была одинаковой в опыте
и контроле (п = 3,6 ± 0,5). В описанном эксперименте "воздействие АЗП на
клетки азоспириллы осуществлялось в достаточно жестких условиях - клетки
подвергались сильному стрессу (центрифугирование и смена богатой среды
культивирования на физиологический раствор).
Таблица 2. Влияние агглютинина зародышей пшеницы (АЗП) на
активность глутаминсинтетазы клеток A. brasilense, выращенных в аэробных
условиях на аммонийсодержащей среде
' Активность* ГС, мМ у-ГГК
Варианты активации клеток
Опыт (+АЗП)
Контроль (без АЗП)
1. Клетки, отмытые 0, 85% NaCl,
удельное количество АЗП 62^x10* мкгЛет.
2. Клетки в среде культивирования,
удельное количество АЗП l^xlO^MKnta.
149 ± 3
145 ± 3
2Ю±3*
260±3
3. Клетки в среде культивирования,
удельное количество АЗП 0,625 хЮ9 мкг/кл.
218±4
215±5
,"
•Активность ГС определялась трансферазным методом.
** Доверительные интервалы даны для надежности 95 %.
Во второй серии схема эксперимента была немного изменена: культуру
растили на той же среде и в тех же условиях, что и в первом случае. Далее сте­
рильно отбирали аликвоту суспензии клеток для оценки их количества по стан­
дарту мутности. Концентрация клеток в культуре составляла 109 кл/мл. В опыт­
ные колбы стерильно добавляли раствор АЗП из расчета 12£*Ю* мкг/кл (удель­
ное количество АЗП, также вызывавшее активацию ГС в условиях азотфиксации, Antonyuk et al., 1993). Опытные культуры подвергали активации
лектином в течение часа, контроль растили без добавления АЗП Таким образом,
активацию клеток лектином проводили в ходе культивирования (с иегюльзо-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
14
ванием качалки при температуре 32 'Q. После этого клетки осаждали
центрифугированием и ресуспендировали в 0,85%NaCl. Активность фермента и
степень аденилирования определяли так же, как и: в первой серии экспери­
ментов. • Было устаноа!ено, что-в .клетках A. brasilense, подвергавшихся
воздействию АЗП, регистрировалась более низкая активность, чем в контроль­
ных клетках (табл. 2). Различие составляло 18%. Ингибирующий эффект АЗП
исчезал при 20-кратном снижении'концентрации: добавляемого лектина:
активность в контроле и опыте: были-"равны. Степень аденилирования. ГС
оставалась неизменной (п = 3,4±0,2) и не зависела от присутствия АЗП в среде
культивирования.
• • , • . : •
„
Таким образом, полученные'данные свидетельствуют о том, что у азоспириллы,
выращенной:в аэробных условиях на аммонийсодержащей среде,- АЗП не уве­
личивает активность ГС и не оказывает влияния на степень ее аденилирования.
5. Вторичная структура глутаминсинтетазы A. brasilense Sp24S
'
- Интерес к вторичной структуре ТС азоспириллы был предопределен тем,
что сведения об этом типе структуры бактериальных глутаминсинтетаз единич­
ны (Hachimon et a/., 1974; Colombo and'Villafranca, 1986 Kimura et al.', 19S9,
Kimura and Sugano, 1992; Matsuoka and Kimura, 1985). Как видно из представлен­
ных выше данных, каталитические свойства изучаемого' нами фермента зависят
от степени аденилирования и от активирующего катиона. В'этой связи интересно
было исследовать вторичную структуру ГС A brasilense, а также оценить влияние на
нее катионов двухвалентных металлов истепени аденилирования фермента.
Для исследования были взяты две молекулярные формы фермента, разли­
чающиеся по степени аденилирования - ГСоИ ГСз^.'Для каждого из препаратов
ГС был получен спектр КД нативной формы фермента, содержащей, как было
показано выше, катионы, связанные с белковой глобулой. Кроме того, были
получены спектры свободных от металлов форм ГС азоспириллы, приготов­
ленных обработкой 5 мМ^ЭДГА, и спектры ГС с'добавлением катионов (Ми2*,
Nig2* или Со2*). На основе полученных спектров с использованием программы
CONTIN было рассчитано содержание элементов вторичной структуры. Спектр
КД нативной неаденилированной ГС в диапазоне длин волн 190-240 нм пред­
ставлен на рисунке 2 (спектр а). Спектры нативной ГС, к которой был добавлен
один из исследуемых катионов (Mn2*, Mg2+ или Со2*,'в каждом случае в кон-.
центрации 1 мМ), были очень близки к спектру исходного препарата (не пред­
ставлено). Удаление связанных катионов приводило к изменениям во вторич­
ной структуре фермента (рис. 2/спектр б); Сделанные на основе полученных
спектров КД расчеты по содержанию элементов вторичной структуры-показа­
ли, что нативнаяТСо азоспириллы является высокоструктурированным белком:
59% полипептидной цепи субъединицы представлено а-спиралью,' 13% прихо­
дится на Р-структуру (табл. 3)/ Удаление связанных с нативной ГСо азоспирил­
лы'катионов приводило к изменениям в содержании; элементов вторичной
структуры фермента: доля а-спиральных участков полипептидной цепи снижа­
лась на 21%; а доля р-структур возрастала на 19%.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
15
243
длина
яолкы.нк
Рис. 2. Спектры КД неаденилированной глутаминсинтетазы A. brasilense Sp245: a - нативная
ГС, б - свободная от металлов ГС (обработанная 5 мМ ЭДТА).
[в].
град*
см2х
230
(f5-длина волны , нм
-20000 J
Рис. 3. Спектры КД частично аденилированной формы глутаминсинтетазы A. brasilense
Sp245 (n-5,3): a - нативная ГС, б - свободная от металлов ГС (обработанная 5 мМ ЭДТА).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
16
Таблица
3.
Содержание
элементов
вторичной
. неаденилированной глутаминсинтетазы A. brasileme Sp245
Варианты
обработки
ГС*
ГС**
• rc* + Mg2*
структуры
Элементы вторичной структуры ГСо, %
Р-структура Неупорядоченные фрагменты
а-спираль
28 ± 3
59±2
13±5
30±3
32±4
38±2
52 ± 4
:
21 ± 7
" 13±4
27 ± 7
31 ± 3
ГС* + Мп *
56 ± 2
:
ГС* + Со *
22 ± 4
57 ± 2
21±4
Примечания: доверительные интервалы даны для надежности 95 %.
*ГС —нашвный фермент.
* *ГС - свободный от металла фермент (обработанный 5 мМ ЭДТА).
Полученные данные позволяют предположить, что высокоаффинное связы­
вание катионов в металлсвязывающих участках ГСо азоспнриллы вызывает
структурно-конформационные переходы в молекуле фермента. В случае час­
тично аденилированной ГС A. brasilcnse (TCsj) спектр КД нативного фермента
(содержащего связанные катионы) также отличался от спектра фермента, сво­
бодного от катионов (рис. 3). Расчеты содержания элементов вторичной струк­
туры показали, что нативные ГС0 и ГС5,э статистически достоверно не отлича­
ются по содержанию ос-спиральных и р-участков в молекуле (табл. 2, ср. табл.
3). Удаление катионов из нативной ГС5.з приводило к снижению доли а-спирали в молекуле фермента и возрастанию числа Р-структурированных участков
(табл. 4), то есть характер изменений был таким же, как и в случае ГСо.
Таблица 4. Содержание элементов вторичной структуры частично
аденилированной глутаминсинтетазы A. brasilense Sp245 (n=5,3)
Варианты
обработки
ГС*
ГС**
. ГС** + Mg2f
• ГС** + Мп2*
- - - Элементы вторичной структуры TCsj, %
Неупорядоченные
Р-структура -'
а-спираль
фрагменты
58±2
• 10±2 '
32 ± 2
31±2
49±3
20±2.
57±21
52±3
19±2
•10±2
ТС** + Со2*
58±2
16±2
Примечания: доверительные интервалы даны для надежности 95 %.
•ГС - нативный фермент.
•*ГС—свободный от металла фермент (обработанный 5 мМ ЭДТА).
24 ± 2
38±3
26±3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
17
Добавление двухвалент­
ных катионов (Mn**, Mg**
[в].
или Со2*) к свободной от
град*
катионов r C 5 j приводило
СМ х
к изменению в спектре
КД (рис.4) и, как показхтн
распеты, влияло на вто­
ричную структуру фер150
мента (табл. 4). Характер
влияния зависел от добав­
ляемого катиона. Так,
Mg**H Co2* восстанавлива­
ли уровень содержания о>
спиральных участков до
значений,
характерных
для нативного фермента,
в то время как Мп — нет.
По-разному вели себя ка­
Рис. 4. Спектры КД частично аденияированной тионы и в способности
глутачянсинтетазы • A. brasilense Sp245 (n=5,3): a -восстанавливать — при до­
свободная от металлов TCs^, б - ГС5j + Со2\ в - ГС} j +бавлении к свободному от
Mg 2 *,r-rC 5J + Mn2*.
металлов ферменту — со­
держание Р-структур по­
липептидной цепи до уровня нативного фермента. Так, добавление Мп2* восста­
навливало уровень этого типа структуры, в то время как при добавлении Mg2*
или Со2* подобного снижения в содержании р-структур не происходило (табл.4).
Анализ полученных данных позволяет сделать вывод о том, что в случае
ГС A. brasilense Sp245 регуляторное воздействие двухвалентных катионов соп­
ровождается изменением также и вторичной структуры фермента, что в свою
очередь согласуется с хорошо известным постулатом о взаимосвязи структуры
и функции белка. Так, аденилированная ГС азоспириллы (п=5,3) была наименее
каталитически активна с Мп2*, наиболее активна с Mg2*. Это хорошо коррели­
рует с данными по влиянию Мп2* и Mg2* на вторичную структуру фермента
(табл. 4), Так, Мп2*-содержащая ГС была наименее структурирована (сумма о>
спиральных и р-структурированных участков составляла 62% полипептидной
цепи), и, наоборот, Mg Содержащая ГС азоспириллы была наиболее структу­
рированным олигомером среди всех исследованных' в рамках данной работы
вариантов (а-спиральные и р-структурированные участки в сумме составляли
76%, и только 24% полипептидной цепи имели неупорядоченную конформацию). Способность свободной от катионов ГС при связывании катионов увели­
чивать долю а-спиральных участков и снижать долю Р-структур не является
исключительной способностью ГС A. brasilense Sp245. Ранее такое же свойство
было описано и для Bacillus stearothermophilus (Hachimori et al, 1974).
2
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
IS
Сравнение результатов исследования по вторичной структуре ГС азоспирнллы
с литературными данными по ГС из других источников показало, что молекула
ГС азоспирнллы более структурирована, чем другие к настоящему времени
изученные бактериальные ГС (Данг Хоанг Фыок Хьен, 19S8; Hachimori et al,
1974; Colombo and Villafranca, 1986; Kimura et al., 1989, Kimura and Sugano,
1992; Matsuoka and Kimura, 1995). В случае £. coli суммарная доля сх-спиралн и
Р-структуры в молекуле ГС соста&тяла 52%, для фермента В. stearothermophilus
- 41% (Hachimori ct al., 1974), в то время как для ГС .(. brasikme Sp245 эти
показатели колебхтись от 62 % до 78 %.
6. Изучение металлсвязываюшнх центров методом эмиссионной
спектроскопии ЯГР
Кобальт играет важную роль' в клеточном метаболизме в качестве одного
из существенных микроэлементов, в частности, в составе ферментов (Williams,
Frausto da Silva, 2000). Учзстие кобальта в процессах, протекающих в живых ор­
ганизмах, ограничено обычно весьма малыми, концентрациями, что затрудняет
исследование химических форм его существования и'их превращений. Метод
ЭСЯГР.при возможности получения образцов, содержащих физиологически ак­
тивный кобальт в виде радионуклида J7Co, позволяет получить уникальную
информацию на атомном уровне о химической природе его биокомплексов.
В работе изучали электро' форетически гомогенный
препарат ГС Л. bras Hens e
Sp245 (ГС^), предвари­
тельно освобожденный от
катионов обработкой 5 мМ
ЭДТА (с последующим ди' алнзом для отделения
комплексов ЭДТА-металл),
который был перед измере­
ниями допирован 57Со** (из
расчета не более 24 атомов
кобальта на одну молекулу
ГС в соответствии с макси­
мальным
количеством
металлсвязывающих сай­
тов фермента). На рис. 5 а
Скорое*!, »мЪ
приведен его ЭС ЯГР.
Измерения проводили в
Рис. 5. Эмиссионные спектры ЯГР частично
аденилироводном
ваяной ГС (n«2,2)
A. brasilense Sp245,: активированной замороженном
2
катионами "Со *: а— в замороженном водном растворе; б - в растворе при температуре
твердом виде, (преобразовано в форму, соответствующую 80" К. Соответствующие
абсорбционному варианту). Приведены также отдельные расчетные
мёссбауэровспектральные компоненты, составляющие суммарный спектр ские параметры приведены
(огибающая сплошная линия), полученный аппроксимацией в табл. 5 (образец 1).
экспериментальных данных (точки). Скобками над базовой:
(нулевой) ливней показано положение максимумов отдель­
ных спектральных компонент (квадрупольных дублетов).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
19
Таблица 5. Мёссбауэровские параметры, рассчитанные из эмиссионных
спектров ЯГР глутаминсинтетазы (n=2,2) A. brasilense Sp245, допированной
катионами "Со2*, в замороженном водном растворе и в сухом виде
Д, мм/с
Г, мм/с s r ,%
5, мм/с
1,08±0,02 3,0810,08 0,4810,05 1811
1,0510,02 2,3910,06 0.7510,08 6011
0,3410,10 1,1210,20 1,2510,30 2211
2
1,0810,02 2,9710,06 0,5210,12 2411
2. Раствор ГС + "Со *; вы­
сушен на воздухе (Г-80 К)
1,0710,02 2,2910,06 0,6610,08 5011
+ 3 • 0,3910,10
1,37Ю,20 1,1910,27 2611
Примечания: СО. - степень окисления нуклеогенной компоненты ("Fe), стабили­
зированной после ядерного превращения исходного "Со2*; 5, мм/с - изомерный сдвиг (от­
носительно a-Fe; преобразовано в форму, соответствующую абсорбционному варианту); Д,
мм'с - квадрупольное растепление; Г, мм/с - полная ширина лоренцевской линии на поло­
вине интенсивности; S„ % - относительная площадь спектральной компоненты,
представ­
ляющая относительное содержание
соответствующей химической формы s,Fe, образую­
5
2
щейся при распаде'исходного 'Со \ при условии равенства фактора Месебаугра для всех
форм, содержащихся в образце и дающих вклад в спектр. .
Образец
1. Раствор ГС + "Со2*;
заморожен после 60 мин
инкубации (Г= 80 К)
СО.
+2
+2
-КЗ
+2
+2
Как следует из полученных данных, в спектре присутствуют две
компоненты, соответствующие двум формам высокоспинового нуклеогенного
железа(Н) с различной координационной структурой (Ingalls, 1964), о чем
свидетельствует заметное различие значений квадрупольного расщепления
(3,08 и 2,39 мм/с). В первом приближении можно предположить, что форма Fe",
которой соответствует меньшее значение квадрупольного расщепления, от­
вечает сайгу, характеризующемуся ббльшей координационной симметрией.
Отметим, что в случае ГС 51 typhimurium катион, связанный в сайте nl (пос­
ледний имеет приблизительно в 50 раз более высокое сродство к катиону, чем
п2), координирован тремя остатками Glu, т.е. тремя карбоксильными группами,
тогда как в сайте п2 - остатком His и двумя остатками Glu, то есть одним
донорным атомом азота гетероцикла His и двумя карбоксильными группами
(Eisenberg et al., 2000; Yamashita et al., 1989).
По данным работы (Eads et al., 1988), дополнительными лигандами,
связанными с катионом в активном центре ГС, служат молекулы воды. В таком
случае для ГС из A. brasilense большее значение квадрупольного расщепления
для одной из форм железа(Н) (Д = 3,08 мм/с; табл. 5,- образец 1) может отражать
пониженную координационную симметрию катиона, соответствующую различ­
ным донорным атомам (N, О); при этом, значения изомерных сдвигов для
указанных выше координирующих лигандов в.сайтах nl и п2 достаточно
близки. Аналогичные параметры были приведены в работе (Vertes et al., 1979)
для абсорбционного спектра ЯГР комплекса железа(Н) с ДНК, где имеется ана­
логичный остатку His гетероциклический фрагмент с донорным атомом N.
Таким образом, форма нуклеогенного "Fe11 с параметрами 5 =1,05 мм/с, Л =
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
20
2,39 мм/с (табл. 5, образец 1) соответствует катионсвязывающему сайту nl
активного центра ГС, обладающему более высоким сродством к катиону, чем
сайт п2, которому соответствует форма с параметрами 5 = 1,08 мм/с и Д - 3,08
мм/с,..-.Данный вывод; вполне согласуется с значительно меньшим
относительным содержанием последней (Sr=18% против 60% для формы,
соответствующей сайту nl).
><•
'
. Заслуживает внимания также тот факт,' что выход стабилизированной нуклеогенной формы 57Fe'", образовавшейся в результате пост-эффектов, который
составляет 22% (табл. 5), значительно ниже, чем величина (57%), наблюдаю­
щаяся в сильно разбавленных быстро'замороженных (при Т - 80 К) водных
растворах 37СоСЬ (Вертеш, Надь, 1998), что соответствует аквокомплексам
кобальта(И). Строго говоря, каждой исходной химической форме s7Co2* может
соответствовать образовавшаяся в результате пост-эффектов форма стабилизи­
рованного нуклеогенного s7 Fe w . Однако ввиду недостаточного разрешения ли­
ний 57Fe3* вклад последнего при очевидном отсутствии релаксационных эффек­
тов был аппроксимирован одним квадрупольным дублетом, что в данном слу­
чае, не влияло на- разрешение;полос Fe2* (рис. 5, табл. 5). Данное снижение
выхода стабилизированной формы 57Fe'n отвечает более прочному связыванию
исходного иона S7Co2* вышеуказанными биолигандами, имеющими более силь­
ные электронодонорные свойства, в межсубъединичных пространствах двух
гексамеров молекулы ГС (Eisenberg,et al, 2000).
7 Для проверки стабильности комплекса кобальта с ГС и правильности сде. данных выводов был также снят эмиссионный спектр высушенного образца
(рис. 5 6). Спектр имел аналогичный вид, хотя интенсивность полос была в два
раза больше, что в целом характерно для твердых соединений в отличие от
замороженных растворов. При этом параметры, рассчитанные для высушенного
образца ГС£2 (табл. 5, образец 2), статистически неотличимы от параметров для
образца ГСг,2 в растворе.
.••••.•:•>•
Таким образом, с помощью метода ЭСЯГР, впервые примененного для изу­
чения связывания катионов ферментами,' показано, что ГС'азоспириллы содер­
жит два металлсвязывающих сайта в активном центре, обладающие различным
, сродством- к катиону Со2* "и различной'координационной симметрией.
Полученные данные дают основание полагать,' что ГС A. brasilense блшка по
' организации активных центров ГС Е. coli и S. typhimurium.
.•
'.'.". выводы.
1. Подобраны условия культивирования A. brasilense Sp245, индуцирующие
образование глутаминсинтетазы с определенной степенью аденилнрования.
. 2. Разработаны способы выделения и очистки глутаминсинтетазы A. brasilense
Sp245, позволяющие получить электрофоретически гомогенные препараты с ра­
ной степенью аденилнрования. Исследована термостабильность фермента. •
3. Изучена, специфичность неаденилированной ^и. аденилированной (п-5,3)
форм глутаминсинтетазы Л. brasilense к катионам двухвалентных металлов.
Установлено, что специфичность глутаминсинтетазы к Mg2*, Co 2t и Мп2*
зависит от степени аденилирования фермента.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
21
4. Изучено кинетическое поведение неаденилированной глутаминсннтетазы А.
brasilense. Установлено, что, как и в случае среднеаденилированной формы
фермента,
неаденилированная
глутаминсинтетаза
имеет
сложное
каталитическое поведение, не описываемое уравнением Михаэлиса-Ментен
и зависящее от катиона, активирующего фермент.'
5. Установлено,, что при росте A. brasilense в аэробных аммоннйассимилйрующих' условиях агглютинин' зародышей пшеницы не индуцирует
активации глутаминсннтетазы и не влияет на ее степень аденилирования.
6. Изучена вторичная структура двух молекулярных форм глутаминсннтетазы
A. brasilense: неаденилированной и аденилированной (п=5,3). Показано, что
глутаминсннтетазы азоспириллы независимо от степени аденилирования
является высокоструктурированиым белком: до 78% полипептидной цепи
представлено а-спиралью и Р-структурой. Установлено, что добавление
катиона (Mg2*, Mn2f или Со2*) к свободному от металлов ферменту изменяет
соотношение элементов вторичной структуры белка.
7. Впервые методом эмиссионной спектроскопии ЯГР с использованием
радиоактивного изотопа 37Со изучены особенности организации активного
центра' глутаминсннтетазы А." brasilense. Показано, что активный центр
фермента имеет два метхтасвязываюших сайта, обладающих различным
сродством к катиону Со2" и различающихся координационной симметрией.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Беспалова Л.А., Коршунова (Смирнова) В.Е., Антонюк Л.П., Игнатов В.В.
Выделение, очистка и кинетические свойства глутаминсннтетазы со средней
степенью аденилирования из Azospirillum brasilense Sp245 // Биохимия. 1994.-Т. 59, вып. 1.-С. 55-61.
2. Antonyuk L.P., Smimova V.E., Kamnev A.A., Serebrennikova O.B., Vanoni
МЛ., Zanetti G., Kudelina I.A., Sokolov O.I., Ignatov V.V. Influence of divalent
cations on the catalytic properties and secondary structure of unadenylylated
glutamine synthetase from Azospirillum brasilense // BioMetals. - 2001. - V. 14.
- P . 13-22.
3. Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Smimova V.E., Serebrennikova O.B., Kulikov
L.A., Perfiliev Yu.D. Trace cobalt speciation in bacteria and at enzymic active
sites using emission Mossbauer spectroscopy // Anal. Bioanal. Chem. - 2002. - V.
372, No. 3 , - P . 431-435.
4.. Smimova V.E., Antonyuk L.P., Kamnev A.A., Kulikov L.A., Perfiliev Yu.D. The
role of, cations in the functioning of glutamine synthetase from Azospirillum
.brasilense//Metal Ions in Biology and Medicine/L. Khassanova, Ph.Collery, I.
Mayrriard, Z. Khassanova, J.-C. Etienne (Eds.). John Libbey Eurotext, Paris, 2002.
- V . 7 . - P . 306-311.
5. Камнев А.А., Антонюк Л.П., Смирнова В.Е., Куликов Л.А., Перфильев Ю.Д.,
Кузманн Э., Вертеш А. Использование эмиссионной спектроскопии
ядерного гамма-резонанса для изучения координации кобальта в активных
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
22
центрах бактериальной глутаминсшгтетазы //Докл. РАН, 2003. - Т . 393, N. 3.
-С.407-411.
6. Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Smirnova V.E., Kulikov L.A., Perfiliev' Yu.D.,
. .Kudelina I.A., Kuzmann E., Vertes A. Structural characterization of glutamlne
synthetase fromAzospirillum brasiknse(7/,Biopolymers (Biospectroscopy), 2004
•;.,(принята в печать 16.10.2003 г.).. ..'.'•"
7." Antonyuk L.P., Bespalova L.A., Korshunova (Smirnova) V.E. Some biochemical
properties of Azospirillum ^utzmlns synthetase // Abstr. 20th Meet. FEBS. —
Hungary, 1990.-P.218,P r T4 575. . , . . . , " "
8., Smirnova V.E., Antonyuk L.P., Kamnev A.A., Serebrermikova O.B., Kulikov
L.A., Perfiliev Yu.D. Structure and regulation of glutamine synthetase from the
. endophytic bacterium Azospirillum brasilense Sp245 // In:* Proc. Book.of 4ft
INTAS . Interdisciplinary. Symposium on Physical and Chemical Methods in
Biology,'Medicine, and Environment. Moscow, Russia, 2001. - P. 12-13.
9. См1грнова В.Е., Антонюк Л.П., Камнев А.А., Серебренникова О.Б., Игнатов
В.В. Вторичная структура и каталитические свойства неаденилнрованноП
глутаминсинтетазы Azospirillum brasilense / Сборник, докл. XII юбилейной
конференции «Ферменты микроорганизмов». - Казань, 2001.-С. 30-31., .
10. Antonyuk L.P., Smirnova V.E., Kamnev A.A., Kulikov L.A., Saprykin A.A.,
Perfiliev Yu.D. Cobalt speciation in bacteria and at the enzymic active sites by
emission MSssbauer spectroscopy // Second International Conference on Trace
Element Speciation in Biomedical, Nutritional and Environmental Sciences. —
Munich-Neuherberg,"Germany,2001.-N.38.-P.55. • •'«•
П.Смирнова В.Е., Беспалова • Л.А:, Антонюк Л Д Глутамннсинтетаза
Azospirillum brasilense: некоторые каталитические ирегуляторные свойства
фермента // Стратегия' взаимодействия микроорганизмов с окружающей
средой. Первая региональная конференция молодых ученых. - Саратов,
•2002.-С. 24-25. • /
-.
'•
12.Смирнова'В. Е., Камиев А.А., Куделина И.А.; Куликов Л.А., Перфильев
Ю.Д.," Антонюк Л.П. Глутаминсинтетаза бактерии Azospirillum brasilense:
некоторые особенности структуры и регуляции фермента // Тез. науч. докл.
на III съезде биохимического общества. - Санкт-Петербург, 2002. - С. 605.
13:Smimova V.E., Antonyuk L.P., Kamnev A:Af, Kulikov L.A., Perfiliev Yu.D. The
role of cations in the functioning of glutamine synthetase from Azospirillum
brasilense//7* Int. Symp. on Metal Ions in Biology and Medicine, St.-Petersburg,
Russia, May 5-9, 2002. Abstracts. - Trace Elements in Medicine (Moscow),
:
'•2002.-V.3,N.2.-P.70-71.
•
.
14.Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Smirnova V.E.i Kulikov L.A., Perfiliev Yu.D.,
Kuzmann E., Vertes A. Tw'o-metal-iori active centres in bacterial glutamine
synthetase as probed by emission M5ssbauer spectroscopy // Book of Abstracts.
10ft Eur. Conf. on the Spectroscopy of Biological Molecules, Szeged, Hungary,
-, Aug. 30 - Sept. 4,2003. - P. 5 1 : ' ,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
f/t*
»20333
Подписано в печать 27.11.2003 Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная.
Гарнитура Times. Печать RISO. Объем 1,0 печ.л. Тираж 100 экз. Заказ № 347.
Отпечатано с готового оригинал-макета
Центр полиграфических и копировальных услуг
Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство №3117
410600, Саратов, ул. Московская, д. 152, офис 19
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
7
Размер файла
765 Кб
Теги
brasilense, степенями, глутаминсинтетазы, azospjrillum, аденилирования, 5001, разными, свойства, регуляции
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа