close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

5292.НУКЛЕОТИД-ЗАВИСИМАЯ ДЕГРАДАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ДНК- И РНК-ПОЛИМЕРАЗАМИ

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
<tf-#ifOZrV
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК
ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В. А. ЭНГЕЛЬГАРДТА
На правах рукописи
СОСУНОВ Василий Валерьевич
Нуклеотид-зависимая деградация нуклеиновых
кислот ДНК- и РНК-полимеразами
03.00.03 - Молекулярная биология
N
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
>
Москва 2003
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа выполнена в Лаборатории химического и биологического анализа биополимеров и
клеток Института молекулярной биологии им. В А. Энгельгардта РАН (Москва) и в
Нью-Йоркском институте здравоохранения (Нью-Йорк, США).
Научный руководитель:
кандидат биологических наук Л. С. Викторова
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Н. Г. Долинная
кандидат химических наук, сне В. Л. Туницкая
Ведущая организация: Институт Экспериментальной Кардиологии ВКНЦ РАМН
Защита состоится " "
2003г. в
на заседании диссертационного совета
Д 002.235.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по
адресу: 119991 Москва, ул. Вавилова, д.32
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии
им. В.А. Энгельгардга РАН.
Автореферат разослан "
Ученый секретарь
Диссертационного совета,
кандидат химических наук
"
2003г.
А. М. Крипын
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Общая характеристика работы
Актуальность темы. Многие ДНК-полимеразы (ДНКП) помимо функции синтеза ДНК
обладают рядом дополнительных активностей. Все ДНКП способны осуществлять
пирофосфородиз - реакцию обратную полимеризации. Кроме того, у многих полимераз
имеется
отдельный
экзовуклеазный
активный
центр,
осуществляющий
3'—+5'-
экзонуклеазную реакцию. Подобная активность описана для прокарнотических ДНКП I типа
(Joyce and Steitz, 1994) и эукариотических ДНКП 8, е, и £ (полимераза а обладает такой
активностью лишь у некоторых видов) (Михайлов, 1999). ДНКП I прокариот обладают также
дополнительной 5'—•З'-экзонуклеазной активностью, осуществляемой отдельным активным
центром.
Клеточные РНК-полимеразы (РНКП) также способны катализировать реакцию
пирофосфоролиза. Кроме этого, они обладают эндонуклеазной активностью, которая
существенно стимулируется в присутствии белковых факторов GreA и GreB у прокариот
(Borukhov et al., 1993) и TFHS у эукариот (Reines, 1992; Izban and Luse, 1992).
Предполагается, что эндонуклеазное расщепление РНК осуществляется в том же активном
центре, что и реакции полимеризации и пирофосфоролиза. Для эукариотической РНКП П
описана также экзонуклеазная активность, которая как и эндонуклеазная стимулируется
белковым фактором TFIIS (Wang and Hawley, 1993). Было показано, что факторстимулируемая экзонуклеазная активность РНКП II играет важную роль в процессе
коррекции синтеза РНК in vitro (Thomas et al., 1998).
Недавно была обнаружена новая реакция, катализирумая различными ДНКполимеразами. Реакция заключается в выщеплении З'-концевого нуклеотида растущей цепи
ДНК в присутствии относительно высоких концентраций некомплементарных r/dNTP либо
r/dNDP (например, величина Кга в этой реакции для rATP ~ 1.6 мМ), с образованием,
соответственно, динуклеозид-5',5"-тетра- и -грифосфатов (Meyer et al.,1998; Sosunov et al.,
2000).
Механизм этой реакции, названной нами реакцией псевдопирофосфоролиза, повидимому, аналогичен механизму реакции пирофосфоролиза; при этом в роли пирофосфата
выступают а,Р-фосфаты стимулирующего NDP, либо р.у-фссфаты стимулирующего NTP:
5'-...pNpNpNpN'0H+ ppp(r/d)N" •» 5'-...pNpNpN0H + (r/d)N"-5'-pppp-5'-N
5'-...pNpNpNpN'oH + pp(r/d)N" -> 5'-...pNpNpN0H + (r/d)N"-5'-ppp-5'-N'
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Предполагается, что эта реакция лежит в основе механизма резистентности вируса
иммунодефицита человека (HIV) к азидотимидину (AZT) - нуклеозидному ингибитору
обратной транскриптазы HTV (HTV RT). Показано (Meyer et al., 1999), что HTV RT,
содержащие замены, обусловливающие устойчивость вируса к AZT in vivo, существенно
эффективней, чем фермент дикого типа, выщепляют 3'-концевой терминирующий остаток
AZTMP ДНК-праймера в присутствии высокой концентрации АТР и смеси четырех
природных нуклеозидтрифосфатов; при этом происходит разблокирование праймера и
продолжение синтеза ДНК.
Кроме этого, роль реакции псевдопирофосфоролиза может заключаться в коррекции
синтеза ДНК, что особенно важно для ферментов, не обладающих корректирующей 3'—+5'экзонуклеазной активностью (например, обратные транскриптазы ретровирусов, в том числе
и HTV RT, эукариотические ДНКП а, р и другие).
Для РНКП реакция псевдопирофосфоролиза не известна Поиск подобной реакции
для РНКП интересен, особенно с точки зрения возможного ее участия в процессе коррекции
синтеза РНК.
Цель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы являлся поиск и выяснение
механизма
реакции
нуклеотид-зависимой
деградации
РНК,
катализируемой
мультисубъединичной клеточной РНКП Е coli.
В работе ставились следующие задачи:
1. Выяснить, являются ли субстратами для ДНК- и РНК-полимераз продукты реакции
псевдопирофосфоролиза-динуклеозид-5', 5"-три- итетрафосфаты.
2. Поиск реакции нуклеотид-зависимой деградации РНК для РНКП Е coli и, в случае ее
обнаружения, выяснение детального механизма этой реакции.
Научная новизна и практическая ценность работы. В работе продемонстрировано, что
динуклеозид-5,,5"-три-
и
-тетрафосфаты,
являющиеся
продуктами
реакции
псевдопирофосфоролиза, могут служить субстратами для четырех классов ДНК-полимераз обратных транскриптаз (HIV RT), ДНКП а и р
эукариот (ДНКП а и р
человека),
прокариотических ДНКП I типа (ДНКП Ecoli и T.aquaticus). Наиболее эффективными
субстратами для всех ДНКП оказались динуклеозид-5',5"-тетрафосфаты. Для HTV RT
субстратная активность этих соединений оказалась близкой к активности соответствующих
dNTP, в то время как для остальных ферментов они были в той или иной степени менее
эффективными, чем dNTP. Показано также, что динуклезид-5',5"-тетрафосфаты являются
субстратами для РНКП фага TJ и мультисубъединичной РНКП Ecoli, при этом их
эффективность оказалась сопоставимой с эффективностью соответствующих NTP. Таким
2
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
образом, в работе обнаружен новый класс субстратов для ДНК- и РНК-полимераз динуклеозид-5' ,5" -олигофосфаты.
Продемонстрировано, что РНКП Е. coli обладает 3'—+5'-экзонуклеазной активностью,
которая существенно стимулируется в присутствии некомплементарных r/dNTP. To есть, в
отличие от ДНКП, в случае РНКП 3'-концевой нуклеотидный остаток растущей цепи РНК в
присутствии некомплементарных r/dNTP выщепляется не в виде динуклеозид-5',5"тетрафосфата, а в виде нуклеозид-5'-монофосфата.
Показано, что для проявления этой активности необходимы два иона Ме2+,
координированных в активном центре фермента.
Демонстрируется, что все каталитические активности РНКП (полимеризация,
пирофосфоролиз, эндо- и экзонуклеазные реакции) осуществляются одним активным
центром.
Полученные результаты свидетельствуют о наличии дополнительного сайта
связывания нуклеотида в районе активного центра РНКП, который, возможно, является
предварительным сайтом связывания входящего NTP при синтезе РНК, участвующим в
процессе отбора субстратов.
На основе трехмерной структуры тройного элонгационного комплекса РНКП П S.
cerevisiae (Gnatt et al., 2001) и полученных экспериментальных данных нами была построена
молекулярная модель активного центра РНКП К coli, включающего в себя два иона Ме +,
который осуществляет как полимеризацию/пирофосфоролиз, так и экзо- и эндонуклеазные
расщепления РНК.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на VI
Международной конференции
"Тонкие химические технологии", 1999, Москва; на
Международной конференции "Современные проблемы молекулярной генетики и клеточной
биологии", 2000, Москва и на Международных конференциях "Prokaryotic transcription
initiation", 2001 и 2003, Saxtons River, Vermont, USA.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания
методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и
списка цитируемой литературы. Работа изложена на
содержит
рисунков. Библиография включает
страницах машинописного текста и
названия.
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Результаты и обсуждение
Работа состоит из двух разделов. Первый посвящен демонстрации NTP-зависимого
вьпцепления 3'-концевого нуклеотида растущей цепи ДНК для ДНКП, а также изучению
субстратных свойств продуктов этого выщепления - динуклеозид-5',5"-олигофосфатов для
ДНКП и РНКП. Второй раздел посвящен детальному изучению обнаруженной экзонуклеазной
активности РНКП К coli, стимулируемой некомплементарными нуклеозидтрифосфатами.
Раздел I. Нуклеотид-зависимое выщепление З'-концевого остатка праймера
ДНК-полимеразами
(псевдопирофосфоролвз).
Продукты
реакции
псевдопиро-
фосфоролиза - динуклеознд-5,,5"-тетра- и -трифосфаты - являются субстратами для
различных
ДНК-полимераз
в
реакции
полимеризации.
Динуклеозид-5',5"-
тетрафосфаты также являются субстратами для некоторых РНК-полимераз
Нами бьшо продемонстрировано, что, по крайней мере, некоторые ДНКП могут
катализировать реакцию, которая заключается в выщеплении З'-концевого нуклеотида
растущей
цепи
ДНК
некомплементарных
в
присутствии
субстратов.
относительно
Механизм
высоких
реакции,
концентраций
названной
нами
псевдопирофосфоролизом, по-видимому, аналогичен механизму реакции пирофосфоролиза,
при
этом
в
роли
пирофосфата
выступают
р,у-фосфаты
стимулирующего
некомплементарного r/dNTP. В данной работе наличие такой реакции показано для обратной
транскриптазы вируса миелобластоза птиц (AMV RT) и ДНКП IК coli (рис. 1) в присутствии
некомплементарного
нуклеотида
£-ряда
P-Z-dTTP.
В
присутствии
природных
некомплементарных нуклеозидтрифосфатов (P-D-NTP) для названных ферментов в нашей
системе (в работе использовался гетерогенный праймер-матячный комплекс, матрицей в
котором служила однонитевая ДНК фага М13) реакция псевдопирофосфоролиза не
наблюдалась (рис. 1А).
Низкомолекулярный продукт выщепления З'-концевого нуклеотида праймера в
присутствии p-i-dTTP (в работе использовался праймер, содержащий радиоактивный
фосфат [ 2Р] на 5'-конце и остаток [32Р]АМР на З'-конце) был идентифицирован с помощью
тонкослойной
хроматографии
низкомолекулярный
продукт
(ТСХ)
реакции
на
PEI-целлюлозе
выщепления
по
(рис.Ш).
Радиоактивный
подвижности
совпадал
с
подвижностью химически синтезированного динуклеозидтетрафосфата dT-5'-pppp-5'-dA, что
позволило предположить структуру образующегося соединения (рис. 1С).
Помимо совпадения подвижностей на ТСХ, продукт реакции псевдопирофосфоролиза
оказался стабильным в присутствии щелочной фосфатазы, что говорит об отсутствии
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
концевого фосфата, но гидролизовался в присутствии фосфодиэстеразы змеиного яда, что
подтверждает предположенную структуру (в тех же условиях [а- 32 Р]АТР гидролизовался
обоими ферментами).
Таким образом, реакция псевдопирофосфоролиза в присутствии P-1-dTTP происходит
согласно схеме, приведенной на рис.Ш.
Ферыевп
AMVRT
Рис 1. Нуклеотид-зависнмое выщегшение 3'концевого нуклеотида праймера
(псевдопирофосфоролиз), катализируемое AMV
КТиЩКШЕсоН.
А. Влияние некомплементарных dNTP на
выщепление 3'-концевого нухлеотида
праймера. Реакционная смесь для ДНКПI
содержала 50 мМ Tris-HCl, pH 7.9,10 мМ
MgCl2,50 мМ КО, 1 мМ DTT, 0.8ад.акт.
ДНКП, 50 нМ праймер-матричный комплекс
и указанные на рис. субстраты; смесь
инкубировали 15 мин при 25°С. Реакционная
смесь для AMV RT содержала 10 мМ Tris-HCl,
рН 8.2,5 мМ MgClj, 40 мМ КО,1 мМ DTT, 3
ед. акт. фермента, 50 нМ праймер-матричный
* ' комплекс и указанные субстраты; смесь
инкубировали 30 мин при 37°С. В.
Идентификация низкомолекулярного продукта,
образующегося в присутствии
некомплементарного p-1-dTTP. Продукты
реакции разделяли с помощью ТСХ на РЕ1целлюлозе в системе: 0.2М Na-фосфатный
буфер (рН 8,0), содержащий 10% этанола.
C. Структура продукта реакции
псевдопирофосфоролиза.
D. Уравнение, согласно которому происходит
реакция псевдопирофосфоролиза
DNAP1 EcfflS
NTP
dCTP Й-L-dTTP
dCTP 1 S-L-tfrrp
—«sraj
[NTPl.|iM
— 5 | М Б 0 0 501500 —SO|50ol 6 0 J S 0 0
' /
^ Х \ \ \ 777;
-dAMP
(-
jw-0-,1
Ч « !
O-f-0-f4>-M-|
H-dT-WPP^IA
dATP
+
H"tfTffW'd*
Параллельно с нашей работой группой W. Scott реакция псевдопирофосфоролиза
была продемонстрирована для HIV RT, AMV RT и M-MuLV RT (Meyer et al., 1998) с
использованием праймер-матричного комплекса, праймер в котором содержал на 3'-конце
терминаторный остаток ddAMP. При этом HTV RT оказалась приблизительно в 100 раз более
эффективной в этой реакции, чем AMV RT и M-MuLV- RT. В той же публикации было
продемонстрировано, что HTV RT способна катализировать эту реакцию в присутствии
природных r/dNTP и r/dNDP, при этом величины Km для этих соединений оказались на
уровне
1-4
мМ.
Это
позволяет
предположить
возможность
существования
псевдопирофосфоролиза in vivo, по крайней мере для АТР, значение Кщ которого в этой
реакции составляет 1.6 мМ, а его концентрация в клетке - более 4 мМ (Gamberucci et al,
1994).
5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Предполагается, что реакция псевдопирофосфоролиза лежит в основе механизма
резистентности HTV к AZT - нуклеозидному ингибитору HTV RT. Показано (Meyer et
al.,1999), что HTV RT, содержащие замены, обусловливающие устойчивость вируса к AZT in
vivo, существенно эффективней, чем фермент дикого типа, выщепляют З'-концевой
терминирующий остаток AZTMP ДНК-праймера в присутствии высокой концентрации АТР
и смеси четырех природных dNTP; при этом происходит разблокирование праймера и
продолжение синтеза ДНК.
Кроме этого, как уже говорилось выше, роль псевдопирофосфоролиза может
заключаться в коррекции синтеза ДНК, что особенно важно для ферментов, не обладающих
корректирующей 3*—»5'-экзонуклеазной активностью.
Продуктами реакции NTP-зависимого выщепления являются динуклеозид-5',5"тетрафосфаты и динуклеозид-5\5"-трифосфаты (в случае NTP- и NDP-стимулируемого
выщепления, соответственно).
Нами была протестирована субстратная активность соединений, приведенных на рис.
2, для четырех классов ферментов: обратных транскриптаз (HTV RT), ДНКП а и р эукариот
(ДНКП а и Р человека), прокариотических ДНКП I типа (фрагменты Кленова полимераз
Е. colt и Т. aquaticus).
А
А
•O-P-0-P-O-f-O-f-O'
он он он он
t.BsAde.B'^TIiy
2. B-Ade, B'-Ads
а 8-T>iy, B'-Thy
. -». ^ .
P о о
Ade
I-O-P-O-P-O-P-O-I
Ade
i-o_p.o-p-o-p-o-|
он он он
Ade ^
"ЧрГ
Рис 2. Структуры соединений, оказавшихся
субстратами для различных классов ДНКполимераз. Соединения были синтезированы
в ЛХБА ИМБ РАН. Тестирование
проводилось в условиях односубстратной
реакции (удлинение праймера в присутствии
одного субстрата) в системе, содержащей
гетерогенный праймер-матричный комплекс
Th
^ _^ Thy
о-снг-P-o-f-o-f-o-j
Thy
он он он
^ " ^ '
\y
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Субстратные свойства этих соединений зависят как от их структуры, так и от природы
фермента. Для HTV RT субстратная активность динуклеозидтетрафосфатов оказалась
близкой к активности соответствующих dNTP (см. табл. 1), в то время как для остальных
ферментов они были в той или иной степени менее эффективными субстратами, чем
соответствующие
dNTP.
Эти
результаты
согласуются
с
тем,
что
реакция
псевдопирофосфоролиза, которая является по сути реакцией, обратной включению в ДНК
динукяеозидтри- и тетрафосфатов, наиболее эффективно осуществляется именно HTV RT.
Таблица 1. Кинетические параметры dAp4dA н dTp4dT и соответствующих
природных dNTP для IHV RT
Субстрат
dAp4dA
dATP
dTp4dT
dTTP
K„„ мкМ
2.6±0.6
0.5±0.3
2.2±0.5
1.2±0.6
Vmax(dNp4dN)/Vmax(dNTP)
0.56
0.96
-
Для всех ферментов динуклеозидтрифосфаты оказались менее эффективными
субстратами, чем динуклеозидтетрафосфаты. При этом, если для HTV RT разница в
активности
между ними не превышала
10 раз, то для ДНКП I активность
динуклеозидтрифосфатов оказалась на два порядка ниже, чем тетрафосфатов.
Теоретически можно предположить два молекулярных механизма удлинения
праймера в присутствии динуклеозидолигофосфатов (dNpxdN'). Первый заключается в том,
что непосредственно dNpxdN' являются субстратами ДНКП; второй механизм предполагает
предварительный гидролиз dNpxdN' до соответствующего dNTP, который является
природным субстратом ДНКП:
I. Праймер + dNp4dN' - • Праймер-pdN + dN'TP
П. 1. dNp4dN' -» pdN' + dNTP
2. Праймер + dNTP ->Праймер-pdN + PPi
Для выяснения, по какому пути проходит реакция, было синтезировано соединение
wooVApadT (рис. 2С), которое содержит устойчивую к энзиматическому гидролизу Р-С связь
во фрагменте С5'-О-СНгР(0)(0Н)-О-. Оказалось, что данное соединение способно
включаться в растущую цепь ДНК обеими нуклеотадными частями в соответствии с
последовательностью матричной цепи. Если бы реакция проходила по второму механизму,
предусматривающему гидролиз до трифосфата, то включение остатка dTMP в ДНК было бы
невозможно, т.к. исходное соединение не может быть гидролизовано до dTTP и diA. Таким
7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
образом, показано, что реакция идет по первой схеме, т.е. субстратами служат
непосредственно динуклеозидолигофосфаты.
Чтобы выяснить, являются ли динуклеозид-5,,5"-олигофосфаты субстратами для
РНКП, было синтезировано соединение Up4U. Его свойства были протестированы для
односубъединичной РНКП фага Т7 и для многосубьединичной клеточной РНКП Exoli в
системе тотального синтеза РНК, содержащей фермент, матричную ДНК, [а-32Р]АТР,
нерадиоактивные ATP, CTP, GTP и либо UTP, либо Up4U в различных концентрациях.
Матрицей при этом служили плазмида pTZ-18 (для Т7 РНКП) и ДНК фага Т2 (для РНКП
ЕсоЩ. Субстратные свойства UTP и Up4U оценивали по количеству образующейся
радиоактивной РНК.
Соединение Up4U оказалось субстратом как для Т7 РНКП, так и для РНКП Kcoli,
причем эффективность его включения оказалась не намного ниже эффективности включения
UTP (при равных концентрациях в присутствии Up4U синтезировалось лишь в 3 раза
меньшее количество радиоактивной РНК, чем в присутствии UTP).
Таким образом, в работе обнаружен новый класс субстратов для ДНК- и РНКполимераз - динуклеозид-5',5"-олигофосфаты.
Раздел П. Нуклеотид-зависимое выщепление З'-концевого остатка РНК РНКполимерами Е. colt - экзонуклеазное выщепление. Единый механизм реакций
полимеризация и деградации РНК, катализируемых одним активным центром РНКполимеразы
В данной работе нами продемонстрировано, что РНКП Е. coli обладает 3*—»5'экзонуклеазной
активностью,
которая
резко
стимулируется
в
присутствии
некомплементарных нуклеозидтрифосфатов.
Детальное
изучение
обнаруженной
экзонуклеазной
реакции проводилось
с
использованием системы остановленного тройного элонгационного комплекса (ТЭК),
состоящего из РНКП Е. coli, ДНК (397 н.п.), содержащей промоторный фрагмент А1
бактериофага Т7, и РНК различной длины, чаще длиной 21 нуклеотид (ТЭК-2Ш, здесь и
далее в обозначении различных ТЭК будет указываться длина РНК и 3'-концевой
нуклеотид); при этом в З'-концевое положение РНК вводился радиоактивно-меченный
остаток [32P]NMP. В экспериментах использовалась РНКП, иммобилизованная на Ni2+-NTAагарозе. Последовательность РНК в составе ТЭК и общая схема обнаруженной
экзонуклеазной реакции приведены на рис. ЗА, В.
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
A. Нуклеотидная последовательность начала
транскрибируемой области Т7А1 промотора
5 , -A , TCGAGAGGG , °ACACGGCGM^4GCCAT a7 CCCAA...-3'
B. Схема экзонуклеазной реакции, катализируемой РНКП
РНК 5'-...pGpCpGpApAp'U
Me 2 *, НгО
—
*- е-...рОрСрврАрАон + р*и
(r/dNTP)
C. Соединения, стимулирующие экзонуклеазную активность
CHs
некомпдементарные rNTP, dNTP
P-0-P-CH2-P-0-N
(нуклеозид-а,Р-метилендифосфонат-у-фосфат)
^ N / ^ N
trNrN^Nw»
(умбеллиферонтрифосфат)
D. Соединения, не стимулирующие экзонуклеазную активность
r/dNDP, rAlNMP
РисЗ
Стимуляция
экзонуклеазной
нуклеошдтрифосфатами.
активности РНКП Е. coli
некомплементарными
Нами было показано, что экзонуклеазная активность резко
стимулируется в присутствии некомплементарных rNTP и dNTP (рис. 4А). Так, при
инкубации ТЭК-2Ш в транскрипционном буфере (см. подпись к рис. 4А) наблюдается
накопление РНК длиной 10 нухлеотидов, которая является продуктом эндонуклеазного
расщепления исходной РНК ТЭК, и радиоактивного UMP, являющегося продуктом
экзонуклеазного отщепления 3'-концевого остатка РНК (дорожка 2). В присутствии высоких
концентраций некомплементарных r/dNTPs накапливается существенно большее количество
UMP (дорожки 5-8). В присутствии комплементарного АТР РНК удлиняется на один
нуклеотид, согласно контексту матрицы (дорожка 3). В пробах, содержащих PPi,
наблюдается классический пирофосфоролиз - выщепление З'-концевого нуклеотида в виде
нуклеозид-5'-трифосфата (дорожка 4). Константа связывания некомплементзрных NTP с
РНКП При стимуляции экзонуклеазной активности составляет 0.8±0.1 мМ. Аналоги
комплементарных NTP, не способные элонгировать цепь РНК (например, рорСНгр-N), также
активируют эту реакцию, хотя и менее эффективно. Нуклеозидди- и монофосфаты не
стимулируют
экзонуклеазную
реакцию.
В
то
же
время,
в
присутствии
умбеллиферошрифосфата (структура приведена на рис. ЗС) наблюдается стимуляция этой
реакции. Таким образом, для стимуляции экзонуклеазной активности природа нуклеозидной
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
части стимулирующего некомплементарного NTP, по-видимому, не важна, в то время как
наличие трифосфатной части абсолютно необходимо.
Экзонуклеазное выщепление З'-концевого нуклеотида не является нуклеотидспецифической активностью - эта реакция наблюдалась в разных комплексах: ТЭК-2 Ш (рис.
4А), T3K-27U (рис. 4D), ТЭК-12С, ТЭК-14С.
А
В
С
D
Рис. 4. Свойства экзонуклеазной реакции, катализируемой РНКП ЯсоИ. А. Стимуляция экзокуклеазной
активности в присутствии некомплементарных NTP. Различные ТЭК получали, как в работе (Kashlev et al.,
1996), путем добавления к открытому комплексу РНКП с промотором праймера (ApUpC) и различных
комбинаций субстратов, с последующими промывками (РНКП иммобилизована на Ni-NTA-агарозе).
Экзонуклеазное выщепление проводили при ЗТС в транскрипционном буфере (ТБ), содержащем 50 мМ TrisНС1(рН7.9), I O O M M K C I , 1 мМ 2-меркаптоэтанол и 10 MMMgClj в присутствии, либо в отсутствие NTP.
Время реакций указано на рисунке. Реакции удлинения РНК и пирофосфоролиза также проводили в ТБ.
Реакции останавливали добавлением равного объема стоп-буфера (7 М мочевина, 20 мМ EDTA, красители:
бромфеноловый синий и ксиленпванол FF - по 0.25%). Продукты реакции разделяли в 20% ПААГе (19:3 акриламижбис-акриламид, lxTBE, 7 М мочевина). Во всех ТЭК З'-концевой нуклеотид содержит
радиоактивную метку 32Р. В. ТЭК-2Ш, содержащий РНК-транскрипт, радиоактивно-меченный как по 3 ' концевому нуклеотиду, так и по длине РНК. Демонстрируется устойчивость T3K-20U как к пирофосфоролизу,
так и к экзонукдеазной реакции. С Влияние стрептолндигина на экзонуклеазную реакцию. D. Влияние
белковых факторов GreA и GreB ва экзонуклеазную реакцию в системе, содержащей T3K-27U
В тоже время, в ТЭК-20А экзонуклеазная реакция не наблюдается при сходных
условиях (рис. 4В). Этот комплекс также слабо подвержен пирофосфоролизу. Из рис. 4В
видно, что начальный транскрипт 2Ш, который в этом случае содержит радиоактивную
метку как в 3'-концевом нуклеотиде, так и по длине РНК, деградирует только до 20-мера как
в присутствии PPi (дорожка 4), так и в присутствии некомплементарных NTP (дорожки 5-7).
В присутствии некомплементарного UTP, после выгдепления З'-концевого радиоактивного
остатка UMP, нерадиоактивный субстрат становится комплементарным и встраивается на
его место, поэтому на рис. 4В (дорожка 5) не исчезает полоса, соответствующая транскрипту
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
21U. Считается, что пирофосфоролиз в ТЭК-20А идет медленно за счет того, что З'-концевой
нуклеотид РНК в этом комплексе находится в активном центре преимущественно в /"-сайте
(реакция пирофосфоролиза возможна только в том случае, если З'-концевой нуклеотид
занимает M-i-сайт). Корреляция между скоростями пирофосфоролиза и экзонуклеазного
выщепления позволяет предположить, что обе эти реакции осуществляются из состояния,
когда З'-концевой нуклеотид находится в i+i-сайте.
Об участии активного центра полимеразы в катализе экзонуклеазной реакции
свидетельствует то, что эта реакция (рис. 4С, дорожки 2, 6-8), так же как и реакция
полимеризации
(дорожки
3-5),
подавляется
стрептолидигином
-
антибиотиком,
блокирующим работу активного центра фермента (McClure, 1980). При этом ингибирование
экзонуклеазной
реакции
происходит
как
в
присутствии
некомплементарных
нуклеозидтрифосфатов, так и в их отсутствие.
Экзонуклеазная реакция не стимулируется в нашей системе белковыми факторами
GreA и GreB, стимулирующими эндонуклеазное расщепление РНК (Borukhov et a!., 1993).
Как видно из рис. 4D, в системе, содержащей T3K-27U, в присутствии Gre-факторов
накапливаются короткие олигонуклеотиды длиной 2-5 остатков (дорожки 5, 6), а количество
UMP не увеличивается. В системе, содержащей ТЭК-2Ш, Gre-факторы также не
стимулируют экзонуклеазное расщепление.
Некомплементарные
нукпеозидтрифосфаты приносят
и ориентируют в
+
активном центре ион Mg* , катализирующий экзонуклеазное еыщепление. Нами
показано, что для экзонуклеазной активности абсолютно необходимо наличие ионов
двухвалентных металлов. Экспериментальные данные демонстрируют, что скорость
экзонуклеазной реакции линейно возрастает в зависимости от концентрации ионов Mg2* в
интервале 0-100 мМ (рис. 5, черные ромбики). Другими словами, константа диссоциации
Mg2* с активным центром фермента в этой реакции выше 100 мМ.
Мд2+
1.10
Рис 5. Зависимость начальной
скорости экзонуклеазной реакции
от концентрации ионов Mg2* и
Mir4 в присутствии и в отсутствие
некомплементарного трифосфата
(dTTP). Время реакции выбиралось
с таким расчетом, чтобы
укорачивалось не более 20% от
исходного количества РНК с
составе ТЭК-2Ш
Мп 2 *
•+dTTP[1mM],Mg z+
•+dTTP[1mM], Mn2*
_ 1.05
О
Ъ
©0.30
0.25-
10
20
30
40
[Ме 2+ ], mM
50
11
60
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Для известного иона Mg2* (ион Mg-Г), который удерживается тремя остатками Asp из
NADFDGD мотива р" -субъединицы и принимает участие в катализе прямой реакции,
величина константы диссоциации с активным центром РНКП составляет около 100 мкМ
(Koren and Mildvan, 1977; Mustaev et al., 1997). Таким образом, в катализе экзонуклеазной
реакции наряду с ионом Mg-I (см. ниже) принимает участие другой ион Mg24, обозначим его
как ион Mg-II. Ионы Мп2+ стимулируют экзонуклеазную реакцию более эффективно, чем
Mg2* (рис. 5, черные квадраты), однако константа диссоциации Мп2+ с ферментом также не
может быть определена экспериментально (выше 15 мМ).
В присутствии некомплементарного dTTP (рис. 5, белые ромбики) сродство к ионам
металла резко возрастает, константа диссоциации Mg2+ с ферментом уменьшается, по
крайней мере, в 30 раз (табл. 2). Мы предполагаем, что механизм стимуляции
экзонуклеазной реакции некомплементарными нуклеозидтрифосфатами заключается в
привнесении и ориентации ими в активном центре фермента второго каталитического иона
Mg2+ (Mg-П). В этом, очевидно, участвуют Р,у-фосфаты NTP, на что указывает
необходимость наличия трифосфатной группы для проявления стимулирующей активности
(как уже упоминалось выше, нуклеозидди- и монофосфаты не стимулируют эту реакцию).
Па аналогии с экзонуклеазным активным центром ДНКПI E.coli, в нашем случае роль
второго иона Mg2+ в катализе экзонуклеазной реакции, вероятно, заключается в активации и
координации молекулы воды с образованием ОН -иона, который, в свою очередь, атакует
фосфат З'-концевого нуклеотида РНК. При этом З'-концевой нуклеотид должен
располагаться в i+1 сайте, т.е. находиться в претранслокационном состоянии. О том, что
реакция
происходит
именно
тогда,
когда
концевой
нуклеотид
находится
в
претранслокационном положении, свидетельствуют данные о корреляции скорости
гидролиза и пирофосфоролиза (см. выше).
Влияние мутаций в РНКП E.coli на экзонуклеазную активность. Недавно в работе
(Сгашег et al., 2001) было показано наличие второго иона Mg2* в активном центре РНКП П S.
cerevisiae в отсутствие лигандов. Авторами высказывается предположение, что в
координации
данного
иона
в
активном
центре
могут
принимать
участие
высококонсервативные остатки Е836 и D837, соответствующие остаткам Е813 и D814
консервативного района F Р-субъединицы РНКП E.coli.
На основании этих данных нами была получена мутантная форма РНКП, содержащая
двойную замену ED813.814AA. Кроме этого, нами была получена РНКП с мутационной
заменой R1106A в консервативном мотиве PSRM Н-района |3-субьединицы (обе мутантные
полимеразы были получены Е. Сосуновой). Из анализа трехмерной структуры РНКП П
12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
дрожжей следует, что боковые грушш остатков D814 и R1106 могут электростатически
взаимодействовать друг с другом (образовывать солевой мостик).
Обе мутантные РНКП проявили сильно выраженные дефекты в активности и
оказались неспособными синтезировать полноразмерный РНК-продукт, но сохранили
способность катализировать образование фосфодиэфирной связи. Основной дефект у
мутангных РНКП проявлялся при переходе от инициации к элонгации. Кроме того, у
мутанта Rl 106A оказалась не менее чем на два порядка завышена величина Km для NTP в
процессе инициации, что согласуется с литературными данными (Polyakov etal, 1999) о
сильном Кт-дефекте у мутанта PSRM1104-1007АААА. Для мутанта ED813.814AA
наблюдается лишь незначительное увеличение величины Km для NTP в инициации по
сравнению с полимеразой дикого типа.
В другой работе (Vassylyev et al., 2002), в которой была разрешена структура
холоферметента Т. thermophilics, авторами было высказано предположение, что второй ион Mg2+
удерживается аминокислотными остатками D460p", D462p" и N458fS\ В связи с этими
данными нами была получена РНКП, содержащая замену N458A. По активности этот мутант
оказался близким к WT РНКП (скорость полимеризации для него оказалась несколько ниже,
а значения Km(NTP) примерно такие же, как у фермента дикого типа).
Нами была протестирована экзонуклеазная активность мутангных ферментов (рис. 6).
[Мд2+], т М
Рис 6. Влияние мутаций на экзонуклеазную активность РНКП. А. Влияние мутаций в системе
ТЭК2Ш, РНК которого содержала радиоактивную метку [3"Р] в З'-концевом остатке UMP. В.
Зависимость начальных скоростей экзонуклеазного выщепления от концентрации ионов Mg для
мутантов и фермента дикого типа
С помощью экзонуклеазной реакции было показано, что константа связывания
второго иона Mg2* с мутантными РНКП, содержащими замены ED813,814AA и N458A, так
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
же, как и в случае полимеразы дикого типа, неизмерима в интервале концентраций Mg*+ от О
до 100 мМ (Ki выше 100 мМ). При этом и скорость экзонуклеазной реакции у этих мутантов
оказалась такой же, как у WT РНКП (рис. 6В). Для РНКП с заменой R1106A скорость
экзонуклеазной реакции оказалась существенно более высокой, чем у WT РНКП, при этом
Kd для Mg-II оказалась равной 10 мМ (рис. 6В, табл. 2).
Таким образом, мы демонстрируем, что в отсутствие лигандов остатки Е813, D814 и
N458 не принимают участия в удержании второго иона Mg2+, вопреки предположениям,
сделанным в работах (Cramer et al., 2001 Vassylyev et al., 2002).
Таблица 2. Влияние мутаций, рН и некомплементарного нуклеозидтрифосфата на константу
связывании Mg-П с РНКП
K^Mg-n^MM
pH7.9(10MMMg")
-dTTP
+ dTTP
>100
2-3
>100
2-3
-10
-10
Фермент
WT
ED813,814AA
R1106A
pH 10.0
-dTTP
50-60
>100
-10
Остаток R1106 препятствует связыванию второго иона Mg
либо за счет своего
положительного заряда, либо благодаря нейтрализации остатка D814, который в отсутствие
R1106, возможно, приближается к сайту связывания второго иона Mg2+ и способствует более
прочному его удерживанию. Вероятность такой "подвижка" вполне можно допустить,
исходя из анализа трехмерной структуры дрожжевой РНКП II.
Ярким качественным отличием мутантов ED813.814AA и R1106A от WT РНКП
является то, что PPj вместо классического пирофосфоролиза стимулирует у этих ферментов
экзонуклеазную активность (рис. 6А, дорожки 10 и 15).
Некомплементарный
dTTP
в
случае
мутанта
ED813.814AA
стимулирует
экзонуклеазную активность в 2-3 раза эффективнее, чем WT РНКП. Это может быть
объяснено повышенным сродством мутантной полимеразы к стимулирующему нуклеотиду:
адТТР) ~ 0.35±0.1 мМ (для WT 0.8±0.1 мМ).
Для мутанта RU06A мы не наблюдали стимуляцию экзонуклеазной активности
некомплементарными NTP (ср. дорожки 14 и 16, рис. 6А).
Для
мутанта
N458A
в
присутствии
пирофосфата
наблюдается
обычный
пирофосфоратиз (дорожка 20), однако при добавлении к этому мутанту некомплементарного
dTTP экзонуклеазное выгцепление практически не стимулируется (лишь в 2-3 раза). При
этом константа диссоциации некомплементарного dTTP с мутантной РНКП, оказалась
существенно выше (более 5 мМ), чем для РНКП дикого типа. Таким образом, данная
мутация, вероятно, нарушает связывание некомплементарого МТР с РНКП (см. ниже).
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Пирофосфат может вызывать либо пирофосфоролиз, либо экзонуклеазный
гидролиз РНК. Как сказано выше, в присутствии РР, у мутантов ED813.814AA и R1106A
наблюдается стимуляция экзонуклеазного выщепления 3'-концевого нуклеотида. Является
ли этот эффект специфичным только для данных мутантов, либо он отражает то, что
пирофосфат в зависимости от условий может стимулировать либо пирофосфоролиз, либо
экзонуклеазное выщепление? На рис. 7 показано действие пирофосфата на мутант
ED813.814AA и полимеразу дикого типа в зависимости от рН.
Как видно из рис. 7А, для мутанта ED813.814AA при рН б в присутствии РР8
пирофосфоролиз (образование UTP) происходит интенсивнее, чем экзонуклеазный гидролиз.
При рН>7 пирофосфат стимулирует исключительно экзонуклеазный гидролиз. В случае WT
РНКП (рис. 7В) пирофосфат также стимулирует экзонуклеазную активность, но только при
рН выше 9 (такой же эффект наблюдается для мутанта N458A). Две эти реакции, повидимому, являются конкурентными, и повышение рН способствует увеличению
стимуляции пирофосфатом экзонуклеазной активности по сравнению с пирофосфоролизом.
Мутации усиливают этот эффект.
А
time, mm
21 1
РН
PPi, 1mM
FTP, 1шМ
В
ED813.814AA
2|
во
1
2|
в.в
1
7.9
*
2|
1
10.0
Шлв, mtn
—- t —
PPI. 1шМ
ТТР, 1пг*"
1
9.0
- + —- +Г - +
—+ - + - + — +
• • • -
t
UMP-»
1ЛР-»-
^
^
9
^
т
:
щ
РН
т
9
во
t —
+
3
••31
в.8
7.0
1
8.0
0.2
10. i
+ —- + —- t —
+- +" - —
+ —+
+
г
\
UMP-»UTP-»-
Рис. 7. Влияние рН на пирофосфоролиз и экзонуклеазную активность мутанта ED813.814AA и WT
РНКП. На рисунке показаны продукты выщепления З'-ковдевого нуклеотида в ТЭК-2Ш
Наиболее простым объяснением этих результатов на наш взгляд является то, что
пирофосфат может связываться в активном центре РНКП двумя альтернативными
способами, зависящими от микроокружения, на которое влияют рН и мутации.
Стимуляция
экзонуклеазной активности
щелочными рН.
рН-зависимости
начальных скоростей экзонуклеазных реакций для мутаятпьгх РНКП и полимеразы дикого
типа приведены на рис. 8 (для мутанта N458A рН-зависимость совпадает с зависимостью для
WTPHKn).
В интервале рН от б до 9 экзонуклеазная активность всех ферментов стимулируется
приблизительно в равной степени, несмотря на то, что из-за высокого сродства ко второму
иону Mg2* исходный уровень реакции у мутанта R1106A существенно выше, чем у мутантов
ED813,814A, N458А и WT РНКП. Вероятно, рост скорости экзонуклеазной реакции в этом
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
интервале рН преимущественно объясняется увеличением степени депротонизации
молекулы воды, участвующей в катализе реакции.
В интервале рН от 9 до 10 обнаруживаются серьезные различия в рН-зависимости
скорости экзонуклеазной реакции у мутантов и WT РНКП (рис. 8). Скорость реакции у
полимеразы дикого типа в этом интервале возрастает в 7-10 раз (для мутанта N45 8А рНзависимость совпадает зависимостью для WT РНКП), тогда как для мутантов R1106A и
ED813,814АА скорость увеличивается лишь в 1.5 и 2 раза, соответственно.
1.35
130]
О
"L <
/
•о- Е0813.814АА
-*- R1106A
г-» <
~2 о.зо'
i>
-*
1.» *—'
1.5 "£. g
"_
'с = 0.25
Е | 0.20
Jib 0.15
Рнс. 8. рН-зависимости
начальных скоростей
экзонуклеазной реакции для
мутантов и полимеразы
дикого типа (для мутанта
N458A рН-зависимость
совпадает с зависимстью
для WT РНКП)
5* о.ю
0.05
Мы полагаем, что причиной этих различий является положительный заряд остатка
R1106, который в этом интервале рН, вероятно, частично нейтрализуется (известно, что
рК<Агй ~ 12.5, но эта величина сильно зависит от белкового окружения и вполне вероятно,
что в нашем случае она снижена за счет находящихся рядом положительно заряженных
аминокислотных остатков). В случае WT РНКП, благодаря частичной нейтрализации при рН
выше 9 положительного заряда остатка R1106, остаток D814, по-видимому, может
придвигаться к сайту связывания второго иона Mg2+, что приводит к усилению связывания
последнего
и,
соответственно,
к увеличению
скорости
экзонуклеазной
реакции.
Возможность такой подвижки и участие остатка D814 в связывании второго иона Mg*+ у WT
РНКП допускается при анализе трехмерной структуры полимеразы. Действительно,
оказалось, что если в интервале рН 7 - 9 величина K<i(Mg-ir) для WT РНКП неизмерима
высокая, т.к. скорость реакции возрастает линейно при увеличении концентрации Mg2'1', то
при рН 10 эту константу удается измерить - она оказалась равной 50-60 мМ (табл. 2). В то
время как для мутантов R1106A и ED813.814AA во всем интервале рН (от 7 до 10) значение
K<j(Mg-ir) не меняется (около 10 мМ и выше 100 мМ, соответственно) (табл.2).
Слабая стимуляция экзонуклеазной активности мутантов R1106A и ED813,814AA в
интервале рН 9 - 10 может быть объяснена, как и для интервала рН 6 - 9, эффектом
повышения степени депротонизации воды.
16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Моделирование активного центра РНК-полимеразы Kcoli.
На основании
вышеизложенных результатов нами предлагается модель активного центра РНКП E.coli (рис.
9, 10). Построение модели основывалось на следующих принципах: 1) реакции
полимеризации, пирофосфоролиза и экзонуклеазного гидролиза осуществляются единым
активным центром; 2) в катализе реакций принимают участие два иона Mg2*, один из
которых прочно связан с активным центром (Mg-I), второй - слабо (Mg-II); 3) в реакции
полимеризации Mg-П стабилизируется в активном центре pVy-фосфатами входящего NTP, а в
случае стимулируемой
экзонуклеазной реакции -
р\у-фосфатами
стимулирующего
некомплементарного NTP; 4) реакции проходят по вгй-механизму (Yee at al, 1979), т.е.
нуклеофильная группа атакует молекулу строго с противоположной стороны от уходящей
группы (атакующий нуклеофил, атакуемая молекула и уходящая группа находятся на одной
линии), при этом направления нуклеофильной атаки при полимеризации и при
экзонуклеазной реакции (и пирофосфоролизе) противоположны; 5) в соответствии с
геометрией реакции два иона Mg2* должны находиться на одинаковом расстоянии от
несвязанного атома кислорода атакуемого фосфата и располагаться на линии, параллельной
направлению нуклеофильной атаки.
Ион Mg-I обнаруживается в каталитическом центре при разрешении кристаллических
структур РНКП. Его удерживают три остатка Asp из консервативного NADFDGD мотива р"субъединицы. Моделирование сводилось к расположению в активном центре второго нона
магния
(таким
образом,
чтобы
он
отвечал
требованиям
реакций
полимеризации/пирофосфоролиза и экзонуклеазного гидролиза), а также входящего NTP при
полимеризации
и стимулирующего
некомплементарного NTP при экзонуклеазном
расщеплении.
В предлагаемых моделях за основу взята структура тройного элонтационного
комплекса РНКП П дрожжей, в котором З'-конец РНК занимает i+1 сайт в активном центре
(Gnattetal.,2001).
1. Структурная модель активпого центра в случае 3'—>5'-экзонуклеазной реакции в
отсутствие стимулирующего NTP (схема приведена на рис. 9А). Расположение РНК,
аминокислотных остатков и иона Mg-I полностью соответствует их расположению в
структуре РНКП П (Gnatt et al., 2001). Ион Mg-П помещен в структуру активного центра в
соответствии с геометрией предлагаемого двуметаллического механизма катализа. По
аналогии с известным двуметаллическим механизмом 3—»5'-экзонуклеазной реакции,
описанным для ДНКП I (Brautigam and Steitz, 1998), оба иона MgJ+ располагаются
параллельно линии нуклеофильной атаки и на одинаковом расстоянии от несвязанного атома
кислорода атакуемого фосфата. Ион Mg-I координируется тремя консервативными
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
остатками Asp из мотива NADFDGD Р'-субъединицы (D460, D462 и D464). Ион Mg-П
координируется двумя из этих аспартатов (D460 и D462). Гидролиз фосфодиэфирной связи
происходит за счет нуклеофильной атаки, осуществляемой депротонированной молекулой
воды. В предлагаемой модели молекула воды координируется и активируется ионом Mg-П и,
в соответствии с механизмом реакции (Sn2), располагается на одной линии с атакуемой
фосфодиэфирной связью. В случае 3'—»5'-экзонуклеазной реакции у ДНКПI в координации
молекулы воды помимо иона Mg2+ принимают участие еще два аминокислотных остатка. В
нашем случае мы не обнаружили подходящих кандидатов для этой роли.
Как сказано выше, в нашей модели мы рассматриваем возможность регуляции
связывания второго иона Mg2+ за счет дополнительной его координации аминокислотным
остатком D814 (рис, 9Е), вследствие чего увеличивается скорость экзонуклеазной реакции.
Согласно исходной структуре, остаток D814 образует электростатическую пару с R1106 и в
таком
состоянии
не принимает участия в связывании
металла.
На основании
экспериментальных данных мы предполагаем, что в определенных условиях (увеличение рН,
мутации) взаимодействие D814 с R1106 нарушается, вследствие чего "высвободившийся"
D814 может принимать участие в связывании второго иона Mgf+. При этом мы допускаем
небольшую подвижку боковой цепи D814, хотя не исключена возможность подвижки всей
петли, на которой находится этот остаток.
2. Структурная модель активного центра в случае 3'-5'-экзонуклеазной реакции в
присутствии стимулирующего некомплементарного NTP (рис. 9С. рис. 10А.
О.
+
Расположение РНК, аминокислотных остатков, ионов Mg* и молекулы воды - как в
предыдущей модели. В координации иона Mg-П помимо остатков D460 и D462 принимают
участие р,у-фосфаты стимулирующего нукяеотида. Их расположение относительно иона
Mg2* выбрано таким образом, чтобы не нарушалось координационное взаимодействие
металла с молекулой воды. При этом у-фосфат оказывается в окружении трех абсолютно
консервативных положительно заряженных аминокислотных остатков р-субъединицы
К1073, R1106 и R678. Нуклеозидную часть и а-фосфат стимулирующего NTP мы
располагаем на дне "вторичного" канала, вдоль NADFDGD сегмента таким образом, что
азотистое основание оказывается в окружении абсолютно консервативных остатков Р'субъединицы N458, Е925 и Q929, а З'-гидроксил рибозы - вблизи остатка Е813 Рсубъединицы (подробнее о сайте связывания некомплементарного NTP говорится ниже).
3. Структурная модель активного пентоа в случае полимеразной реакции в
присутствии входящего NTP (рис. 9В. рис. 10BY Расположение РНК, аминокислотных
остатков и ионов Mg2* - как в предыдущих моделях. В координации иона Mg-U помимо
18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
остатков D460 и D462 принимают участие Р,у-фосфаты входящего нуклеотида. NTP
расположен по аналогии с расположением входящего dNTP в известных структурах
активных центров ДНК-полимераз (Pelletier et al., 1996; Huang et al., 1998; Li et al., 1998).
Расположение у-фосфата при этом приблизительно такое же, как у у-фосфата,
стимулирующего экзонуклеазный гидролиз NTP, в то время как р-фосфат расположен подругому, так что кислород, связывающий а- и Р-фосфаты (bridging oxygen) оказывается на
месте молекулы воды в случае экзонуклеазной реакции. Расположение а-фосфата и
нуклеозида полностью соответствует положению 3'-концевого остатка NMP РНК в исходной
структуре.
<h-1 )-stte
toe
RNA
I
i
e j f tmoM
R11WP
Г
W D814p
1 К10Щ1
Ми*р
Р и с 9. Схемы механизмов различных реакций,
катализируемых активным центром РНКП Kcoli.
А. Механизм 3'—•5,-экзонуклеазной реакции в отсутствие
стимулирующего трифосфата. В. Механизм реакции
полимеризации. Изображено переходное
пентакоординационное состояние атакуемого атома фосфора
входящего NTP. С. Механизм 3'-*5'-экзонухлеазнйй реакции
в присутствии стимулирующего некомплемевтариого NTP.
Схематично обозначено расположение аминокислотных
остатков, образующих Б-сайт. D. Два альтернативных способа
связывания гшрофосфата в активном центре РНКП. Стрелкой
показана возможность перехода гшрофосфата из одного
положения в другое (при этом ион Mg-II остается на месте).
Е. Возможность регуляции связывания второго иона Mg2' за
счет дополнительной его координации остатком D814
19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Модель активного центра удовлетворяет требованиям 8п2-механизма катализа
реакций. При этом ионы Mg2* функционально меняются ролями, а направление
нуклеофильной атаки меняется на противоположное для реакции полимеризации и для
экзонуклеазного гидролиза (и пирофосфоролиза) (рис. 9В). В случае реакции экзонуклеазного
гидролиза ион Mg-П ориентирует и активирует молекулу воды (за счет понижения значения
рКа, что способствует депротонизации) с образованием гидроксил-иона, который атакует
атом фосфора "атакуемой" фосфодиэфирной связи; ион Mg-I взаимодействует с уходящей
группой и, действуя как кислота Льюиса, облегчает разрыв связи и высвобождение 3'оксианиона за счет нейтрализации образующегося на нем отрицательного заряда. В случае
же реакции полимеризации ионы магния, как было сказано, функционально меняются
ролями: ион Mg-I координирует и активирует З'-ОН группу концевого NMP РНК, с
образованием СГ-иона, который атакует а-фосфат входящего нуклеотида, тогда как ион MgП выполняет роль Mg-I в случае гидролиза (взаимодействует с уходящей группой, облегчает
разрыв связи и высвобождение З'-оксианиона за счет нейтрализации образующегося на нем
отрицательного заряда).
Оба иона Mg2* в случае как гидролиза, так и реакции полимеризации
взаимодействуют с несвязанным атомом кислорода атакуемого фосфата, стабилизируют
переходное пентакоординационное состояние атома фосфора и способствуют его
правильной ориентации в активном центре.
На рис. 9D представлена модель, демонстрирующая два альтернативных способа
связывания пирофосфата в активном центре РНКП (см. также рис. 7). При пирофосфоролнзе
положение пирофосфата совпадает с положением Р,у-фосфатов входящего NTP при
полимеризации. В случае, когда PPj стимулирует экзонуклеазное расщепление - Р,уфосфатов стимулирующего некомплеметарного NTP. Из анализа модели следует, что
пирофосфат может перемещаться из одной позиции в другую без изменения положения
(относительно фермента) связанного с ним иона Mg-П.
Сайт
связывания
некомплементарного
нуклеозидтршросфата.
Нами
постулируется наличие сайта связывания некомплементарного нуклеозидтрифосфата (Есайта,
E-site)
(рис.
10А,
С). По
нашей модели, описанной
выше, у-фосфат
некомплементарного NTP занимает примерно такое же положение, что и у-фосфат
входящего нуклеотида в случае реакции полимеризации, и находится в окружении трех
абсолютно консервативных положительно заряженных аминокислотных остатков рсубъединицы К1073, R1106 и R678. Расположение р-фосфата некомплементарного NTP
отличается от положения р-фосфата входящего нуклеотида при полимеризации. Он
расположен относительно иона Mg^+ таким образом, чтобы не нарушалось координационное
20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
взаимодействие металла с молекулой воды (в случае полимеризации на месте воды
расположен атом кислорода, находящийся между а,[}-фосфатами). То, что р\у-фосфаты могут
связываться двумя различными способами (при полимеризации и при стимуляции
гидролиза), подтверждается данными о том, что пирофосфат в зависимости от условий
может стимулировать либо пирофосфоролиз, либо экзовуклеазный гидролиз (рис. 7, рис.
9D).
В
5*1Н«е
Рис 10. Модель активного центра РНКП E.coli.
Модель построена на основе кристаллографических
данных (Cramer et at, 2001) и результатов, получен­
ных в настоящей работе. А. Структура активного
центра в случае стимулированной некомплементарным NTP экзонуклеазной реакции. Щелочные а.к.
остатки выделены синим, кислые - красным цветом.
З'-концевой остаток РНК находится в / + / сайте и
спарен с основанием матричной цепи ДНК. Ион Mg-I
расположен так, как он обнаруживается как в этой,
так к в других структурах (Zhang et al., 1999;
Vassylyev et al., 2002). Ион Mg-II помешен нами на
основании экспериментальных данных и в соответ­
ствии с геометрическими требованиями механизма
катализа реакций. Зеленым цветом показав второй
ион Mg , который обнаруживается в работе
(Vassylyev et al., 2002), фиолетовым - в работе
(Cramer etal., 2001).
(|+1Н>м
l4i
М>*»
"
0*1}«»
Из наших экспериментальных данных следует, что ни тот, ни другой яе принимают участия в экзонуклеазной
реакции; кроме того, их расположение не соответствует геометрии предполагаемого двуметаллического механизма
катализа. Молекула воды не показана. Стимулирующий нуклеотид расположен таким образом, что его основание
оказывается в окружении абсолютно консервативных остатков Р'-субъединицы N458, Е1074 и Q1078, а 3 ' гидроксил сахара вблизи остатка Е813 р-субъединипы, образуя с его карбоксильной группой водородную связь.
Этот сайт обозначен как E-site. В. Стереоизображение активного центра при полимеризации. Верхняя часть:
молекулы показаны в виде палочек. В виде шариков показаны два иона магния (Mg-1 - выделен малиновым цветом,
Mg-II - голубым), входящий NTP, удерживающий и координирующий р.у-фосфатами ион Mg-II показан желтым
цветом, показаны и подписаны важнейшие а.к. остатки. Нижняя часть: молекулы показаны объемными,
демонстрируется отсутствие стерических перекрываний между молекулами. Нуклеотид РНК, занимающий /-сайт,
не показан. На верхнем и нижнем рисунках активный центр показан под разными углами. С. Стереоизображение
активного центра при экзонуклеазной реакции. Верхняя часть: показаны два концевых нуклеотида РНК,
занимающие i и (+/-сайты, стимулирущий нуклеотид, удерживающий и коорди-ннрующий pVr-фосфатами ион MgII и занимающий Е-сайт, выделен желтым цветом. Стрелкой указана молекула воды, которая атакует
фосфодиэфирную связь З'-концевого нуклеотида. Нижняя часть: Нуклеотид РНК, занимающий /-сайт, не показан.
На верхнем и нижнем рисунках активный центр показан под разными углами
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Нуклеозидную часть и а-фосфат стимулирующего NTP мы располагаем на дне
вторичного канала, вдоль NADFDGD сегмента таким образом, что азотистое основание
оказывается в окружении абсолютно консервативных остатков N458, Е925 и Q929 р*субъединицы, а З'-гидроксил рибозы - вблизи остатка Е813 р-субъединицы. Последнее
согласуется с тем, что экзонуклеазная активность мутанта ED813.814AA в присутсвии
некомплементарного NTP стимулируется в 2-3 раза сильнее, чем WT РНКП (вероятно,
имеется небольшое стерическое препятствие между боковой группой остатка Е813 и 3'гидроксилом рибозы некомплементарного NTP). Модель подтверждается и тем, что замена
отстатка N458 на аланин приводит к тому, что экзонуклеазная активность мутанта N458A
практически не стимулируется некомплементарным NTP. При этом константа связывания
некомплементарного NTP оказалась выше 4 мМ (для WT около 0.8±0.1 мМ). Зависимость
скорости экзонуклеазного гидролиза в присутствии стимулирующего NTP оказалась
линейной, так же как и в отсутствие NTP, в то время как для WT РНКП в присутствии
трифосфата быстро достигалось насыщение по Mg (см. рис. 5). Все это говорит о том, что
некомплементарный стимулирующий NTP практически не связывается с мутантным
ферментом.
Мы предполагаем, что Е-сайт является предварительным местом связывания
входящего NTP при синтезе РНК. Анализ модели показывает, что NTP, находясь в этом
сайте, повернувшись вокруг Mg-П и не отрываясь от него, может перейти в i+1 сайт (при
этом сам Mg-П остается на месте). Учитывая, что время, когда i+1 сайт свободен от 3'- конца
РНК, очень невелико (3'-концевой нуклеотид РНК находится в равновесии между i и i+1
сайтами), такое предварительное связывание субстрата должно ускорять синтез (другими
словами, можно сказать, что повышается локальная концентрация NTP непосредственно в
районе активного центра). Вероятно, этим объясняется пониженная скорость элонгации у
мутанта N458A по сравнению с WT РНКП.
Замена каталитических аспартатое в активном центре РНКП блокирует
полимеризацию/пирофосфоролиз и нуклеазный гидролиз, катализируемый РНКП. Для
подтверждения
предложенной
осуществляющего
все
модели
реакции,
единого . активного
катализируемые
этим
центра
ферментом,
РНКП
Kcoli,
нами
были
проанализированы ферменты, содержащие замены P'D460N, p'D462N и P'D464N. Остатки
D460, D462 и D464 входят в состав абсолютно консервативного мотива NADFDGD в Р"субъединице и образуют каталитическую триаду, удерживающую ион Mg-I (Zhang, et al.,
1999; Cramer et al., 2001; Gnatt et al., 2001; Vassylyev et a]., 2002; Zaychikov et al., 1996) и,
согласно нашей модели, принимающую участие в удержании иона Mg-П.
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Все
полимеризующие
ферменты
содержат
в
активном
центре
подобные
каталитические триады, однако в случае ДНКП и односубъединичных РНКП только два
остатка триады находятся рядом в первичной структуре (Brauthigam et al., 1993). Третичная
структура активных центров также заметно отличается для ДНКП и односубъединичных
РНКП, с одной стороны, и для многосубъединичных РНКП - с другой.
Все
три
мутанта,
также
как
и
мутант,
содержащий
тройную
замену
(DDD460,462,464AAA, Zaychikov et al., 1996), оказались не способными инициировать
синтез РНК в системе, содержащей Т7А1 промотор. Этот результат нельзя объяснить
неспособностью этих мутантов связывать промоторный фрагмент - было показано, что все
три мутанта связывают ДНК так же, как и фермент дикого типа.
Была протестирована способность этих мутантов связывать ион (ионы) металла. Для
этого был использован метод "железного расщепления" (Zaychikov et al., 1996), в котором
вместо ионов
к полимеразе добавляются ионы Fe2+, связывающиеся с полимеразой в
том же сайте, что и ионы магния (Mg-I) (Zaychikov et al., 1996). Как уже говорилось выше,
этот сайт образован остатками D460, D462 и D464. При добавлении DTT в качестве
восстановителя, связанные ионы Fe2+ генерируют свободные гидроксильные радикалы
(реакция Фентояа), которые, в свою очередь, разрушают как белок, так и нуклеиновые
кислоты (если они есть) в радиусе около 10 А от иона. С помощью этого метода было
продемонстрировано, что все мутантные РНКП (свободные, а также связанные с ДНК), покрайней мере в 20-30 раз хуже связывают ионы металла.
Так как на промоторном фрагменте все три мутантых РНКП оказались неактивными,
для их тестирования нами была создана искусственная система из синтетических
олигонуклеотидов, показанная на рис. ПА.
Подобная
система (другая последовательность
и длина олигонуклеотидов),
имитирующая в присутствии РНКП элонгационный комплекс, использовалась ранее
(Sidorenkov et al., 1998), однако в отличие от неё в нашей системе мы имеем возможность
изучать помимо реакции полимеризации пирофосфоролиз и нуклеазную активность
(эндонуклеазную активность) (рис. ИВ). Роль нематричной цепи ДНК, как было показано
ранее (Sidorenkov et al., 1998), заключается в увеличении стабильности элонгационного
комплекса.
Все три мутантные РНКП оказались способными монтировать РНК-праймер в такой
системе. Отношение параметра Vmax/Km (для односубсгратной реакции, в присутствии только
одного нуклеотида - СТР) для мутантов и WT РНКП оказалось следующим WT : D460N :
D462N: D464N = 1 : 1.8Х10-4:1.2x10° : AxW4 (табл. 3).
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
TACGAGAQQOACA
J
CGGl
5'-AQQATACTTAGAGC(
IGCTTATCGCTA'S'
3^TCCTATGMTC^CaaOT Q CTCTCCCTGTGCCGc™TCG£rA-5'
t11 i i i i 11 i i
5'-AUCGAGAGGGACA-3'
"
RNA"
•"
Рис 11. Характеристика искусственной системы,
использованной для изучения свойств РНКП,
содержащих мутации по каталитическим
аспартатам активного центра D460N, D462N и
D464N(NADFDGDMoraBp,-cy6be№HHBbi).A.
Последовательность нуклеинового каркаса
искусственного элонгационного компекса (ТЭК).
Последовательность ДНК совпадает с
последовательностью Т7А1 промотора в регистре
-15 нт.... +35 нт. относительно точки начала
транскрипции. ДНК-депи полностью комплемен­
тарны друг другу. РНК-праймер комплементарен
матричной цепи РНК, за исключением двух
нуклеотидов с 5'-конца. В экпериментах
использовалась РНК, содержащая радиоактивную
метку [32Р] на 5'-конце. Дм получения ТЕС13 1
пмол иммобилизованной на Ni-NTA агарозе
РНКП инкубировали с 1 пмол смеси матричной
ДНК и РНК-праймера в течение 5 мин при 37 °С.
После этого РНКП промывалась от
весвязавшихся нуклеиновых кислот холодным ТВ
(см. подпись к рис.4), не содержащего ионов
Me2*, во избежание эвдонуклеолитического
расщепления. После промывки к комплексу
РНКП/матричнаяДНК/РНК добавляли 10-кратный
избыток нематричной нити ДНК, инкубировали 5
мин при 3 7 1 и промывали холодным ТБ без
ионов металла. В. Активности, наблюдаемые в искусственном ТЕС13: эндонуклеазное выщепление (дорожка 2),
эндонуклеазное выщепление, стимулированное белковыми факторами GreA и GreB (дорожки б и 7), реакция
полимеризации (дорожки 3,4), гшрофосфоролиз (дорожка 5)
В
Таким образом, замена любого из трех каталитических аспартагов приводит к резкому
снижению скорости катализа. Для бактериальной ДНКП I, например, замена только двух
остатков триады приводит к практически полной инактивации фермента (скорость падает в
500-1000 раз), в то время как замена третьего остатка приводит лишь к менее чем 10кратному снижению скорости. Для HIV RT все три остатка, так же как и в нашем случае,
абсолютно необходимы для катализа.
Интересно, что зависимости скорости элонгации РНК (в односубстратной реакции) от
концентрации ионов Mg 2 * для мутантных ферментов и WT РНКП отличаются не сильно.
Значения констант диссоциации М ^ + с активным центром РНКП, полученные из этих
зависимостей, оказались следующими: для WT РНКП 100-150 мкМ, для мутантов около 600
мкМ. Разница в величинах Kj(Mg 2+ ) между мутантами и ферментом дикого типа в этом
случае существенно меньше, чем в случае просто связанных с промотором ферментов (20-30
раз, по методу "железного расщепления", см. выше). Таким образом, в присутствия
входящего NTP при полимеризации остатки D460, D462 и D464 не вносят большого вклада в
удержание ионов магния (при этом ион Mg-П, вероятно, привносится в активый центр
трифосфатом, a Mg-I стабилизируется его а-фосфатом, что следует из приведенной выше
модели). Роль каталитических аспартатов в этом случае, вероятно, заключается в правильной
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
коордиинации ионов M g + , нарушение которой может приводить к столь сильному
снижению скорости реакции.
Таблица 3. Кинетические параметры мутантных полимераз и полнмеразы дикого типа в системе
синтетического элонгационного комплекса (ТЕС 13)
RNAP:
1. Элонгация РНК (2 мМ СТР, 2ГС). Kcat, мин':
ОТ
80*
D460N
5.8Х10"1
D462N
1.4
D464N
0.7
100
Т
И
0.07
20-30
0.2x10-
1.8
80-100
1.4x10-
0.9
200
OJxlO-1
относительно WT,% 100
4°. Эндонуклеазное расщепление РНК (10 мМ Mg2*),
0.14
Kobs, мин"1:
относительно WT,% 100
0.8
5°. Расщепление РНК в присутствии 1 мМ PPi
(10 мМ Mg24), Kobs, мин"':
относительно WT,% 100
относительно "нестимулируемого" расщепления:5.7
0.93
6\ Эндонуклеазное расщепление РНК в присутствий
20-краткого избытка GreA, Kobs, мин*1:
относительно WT,% 100
относительно "нестимулируемого"расщепления:6.6
0.6
Т. Эндонуклеазное расщепление РНК в присутствии
20-кратного избытка QreB, Kobs, мин"1:
1
относительно WT,%
относительно "нвстимулируемого" расщепления:4.3
0.018
7x10"*
0.12
2x10"*
0.04
1(Г
0.5
7x10"*
0.14
8x10"*
0.07
0.09
1
2x10"-
0.1
4
2x10"*
0.01
1
3.7x10J
0.2
2.9
10"-
0.02
1
0.2x10""
0.4
37
0.2x10"'
0.17
1.4
0.033
1
0.033
2
относительно WT,%
2. Km(CTP), мкМ
З.Кса1/Ктд-ыСТР:
ю-*
'Все измерения проводились на линейном участке зависимости скорости реакции от времени (не более 20-30%
исходного количества 13-мерной РНК переходило в продукт реакции - 14-мер в случае полимеризации, 11-мер
в случае эндонухлеазного растепления и пирофосфоролиза).
"Величина экстраполирована из величины скорости реакции при 1 мкМ СТР, учитывая, что Кт=7 мкМ.
'Ввиду высокой скорости элонгации величина Km для WT РНКП определена для CTPaS (для мутанта значения
Km для СТР и CTPaS схожи).
"Определялось при 37°С
Скорость эндонуклеазного расщепления также оказалась существенно снижена у всех
трех мутантных РНКП по сравнению с ферментом дикого типа. Относительные скорости
выщепления 3'-концевого динуклеотида РНК оказались следующими: WT : D460N : D462N :
D464N = 1: 5х10' 3 : 1.4х10'3 : 0.7х10' 3 . В присутствии GreA и GreB факторов,
стимулирующих эндонуклеазную активность, скорость расщепления в случае мутантов
оказалась на 3-4 порядка ниже скорости расщепления у полнмеразы дикого типа (табл. 3).
Что
касается
пирофосфоролиза,
то
только у
одного
мутантного
фермента,
содержащего замену D462N, добавление PPi стимулировало деградацию РНК (табл. 3).
Таким образом, данные, полученные при анализе ферментов, содержащих мутации по
каталитическим аспартатам, еще раз подчеркивают то, что как реакция полимеризации
(пирофосфоролиза), так и реакции нуклеазиых расщеплений РНК осуществляются одним
каталитическим центром РНКП.
25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Выводы
1. ДНК-полимераза I К coli и обратная транскриптаза вируса миелобластоза птиц способны
катализировать реакцию выщепления У -концевого нуклеотидного остатка ДНК в
присутствии высоких концентраций некомплементарных нуклеозид-5'-трифосфатов. При
этом З'-концевой остаток выщешшется в виде динуклеозид-5',5"-тетрафосфата.
2. Динуклеозид-5',5'-тетрафосфаты могут служить субстратами для различных классов ДНКи РНК-полимераз. Динуклеозид-5',5"-три- и пентафосфаты также являются субстратами
для ДНК-полимераз, хотя и менее эффективными, чем тетрафосфаты.
3. РНК-полимераза£coli обладает 3'—•5'-экзонуклеазной активностью.
4. Некомплементарные r/dNTP резко стимулируют эту активность.
5. На основе трехмерной структуры и данных, полученных при изучении 3'—»5'экзонуклсазной активности, включающих в себя мутационный анализ, построена модель
активного центра РНК-полимеразы Exoli.
6. Все реакции, осуществляемые РНК-полимеразой Exoli (полимеризация, пирофосфоролнз,
экзо- и эндонуклеазные расщепления РНК), катализируются одним активным центром.
7. Активный центр РНК-полимеразы Exoli включает два иона Mg?+. Один из ионов прочно
связан с активным центром (Mg-I); второй (Mg-П) -
слабо. В случае реакции
полимеризации ион Mg-II дополнительно стабилизируется в активном центре $,уфосфатами входящего NTP, в случае стимулированной экзонуклеазной активности - (5,7фосфатами некомплементарного NTP. В зависимости от типа реакции (синтез либо
деградация) ионы Mg2'1' функционально меняются ратями.
8.
В
работе
постулируется
наличие
сайта
связывания
некомплементарного
нуклеозидтрифосфата (Е-сайт), который может являться предварительным местом
связывания входящего NTP и играть роль в отборе правильного NTP в процессе синтеза
РНК.
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Sosunov V. V., Santamaria F., Victorova L. S., Gosselin G., Rayner В., Krayevsky A. A.
Stereochemical control of DNA biosynthesis. Nucleic Acids Res., 2000,28 (5): 11701175.
2. Victorova L., Sosunov V., Skoblov A., Shipytsin A., Krayevsky A. New substrates of
DNA polymerases. FEBSLett., 1999,453 (1-2): 6-10.
3. Victorova L.S., Sosunov V.V., Skoblov A.Yu., Murabuldaev A.M., Alexandrova L.A.,
Krayevsky A-A. "New substrates of DNA polymerases. New terminating substrates of
HTV reverse transcriptase". Special Issue of "Current problems of molecular genetics and
cell biology". 2000, P. 258-264.
4. Sosunov V., Sosunova E., Mustaev A., Bass I., Nikiforov V., Goldfarb A. Unified twometal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase. EMBO J.,
2003,22(9): 2234-2244.
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Издательство ООО "МАКС Пресс".
Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г.
Подписано к печати 28.10.2003 г.
Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,5. Тираж ПО экз. Заказ 846.
Тел. 939-3890,939-3891, 928-1042. Тел./факс 939-3891.
119992, ГСП-2, Москва,
Ленинские горы, МГУ им. МВЛомоносова.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
V*
21 03 *
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
16
Размер файла
813 Кб
Теги
5292, кислоты, рнк, зависимая, нуклеотид, нуклеиновые, полимеразами, днк, деградация
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа