close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

9322.Микробная контаминация сырья и полупродуктов бродильных производств.

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Казанский государственный технологический университет»
Т.А. Ямашев, Н.Н. Симонова, О.А. Решетник
МИКРОБНАЯ КОНТАМИНАЦИЯ СЫРЬЯ И
ПОЛУПРОДУКТОВ БРОДИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДСТВ
Монография
Казань
КГТУ
2010
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
УДК 663.5
ББК 36.87
Ямашев, Т.А.
Микробная контаминация сырья и полупродуктов
бродильных производств: монография / Т.А. Ямашев,
Н.Н. Симонова, О.А. Решетник. – Казань: Изд-во Казан. гос.
технол. ун-та, 2010. – 254 с.
ISBN 978-5-7882-0922-7
Освещаются проблемы, связанные с микробной контаминацией сырья и полупродуктов бродильных производств,
оценивается влияние микроорганизмов-контаминантов на
технологические и физико-химические показатели спиртового
производства и рассматриваются меры, предотвращающие их
развитие. Приводятся технологические решения по применению
пероксида водорода для снижения микробной контаминации
зернового сырья и полупродуктов в спиртовой промышленности.
Предназначена для студентов, обучающихся по специальностям: 260204 – «Технология бродильных производств и
виноделие», 240902 – «Пищевая биотехнология», 240901 –
«Биотехнология», а также для аспирантов и специалистов
отрасли.
Подготовлена на кафедре технологии пищевых производств
Казанского
государственного
технологического
университета.
Печатается по решению редакционно-издательского
совета
Казанского
государственного
технологического
университета.
Рецензенты:
канд. биол. наук, доц. КГУ В.И. Вершинина
канд. хим. наук, с.н.с. УРАН ИОФХ
им. А.Е. Арбузова Каз. НЦ РАН А.А. Гурылева
ISBN 978-5-7882-0922-7 © Ямашев Т.А., Симонова Н.Н.,
Решетник О.А., 2009
© Казанский государственный
технологический университет, 2009
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Список использованных сокращений………………………….. 6
Введение………………………………………………………..... 7
1. Зерновое сырье………………………………………………... 10
1.1. Строение зерна…………………………………………..... 10
1.2. Химический состав зерна………………………………… 13
1.3. Классификация и характеристика микробиоты зерна…..23
1.4. Пути проникновения микроорганизмов в зерновую
массу…………………………………………………………….33
1.5. Влияние микроорганизмов на качество зерна………….. 34
1.6. Способы снижения микробной обсемененности
зернового сырья……………………………………………….. 38
1.6.1. Механические способы……………………………… 38
1.6.2. Физические способы………………………………….40
1.6.3. Обработка соединениями антимикробного и
микробостатического действия……………………………. 44
2. Пероксид водорода…………………………………………… 59
2.1. Физические и химические свойства……………………... 59
2.2. Действие на органические соединения………………….. 64
2.3. Антимикробные свойства………………………………... 70
2.4. Применение в пищевой промышленности……………… 73
3. Основные стадии производства этилового спирта…………. 75
3.1. Подготовка сырья………………………………………… 75
3.2. Измельчение зерна………………………………………... 75
3.3. Гидротермическая обработка……………………………. 76
3.4. Осахаривание разваренной массы………………………..80
3.5. Сбраживание сусла……………………………………….. 82
3.6. Выделение спирта из бражки……………………………. 85
4. Микробная контаминация в технологии этилового спирта.. 87
4.1. Микроорганизмы-контаминанты бродильных
производств……………………………………………………. 87
4.2. Меры, предотвращающие развитие микроорганизмовконтаминантов………………………………………………… 96
4.3. Влияние антимикробной обработки целого зерна на
основные показатели производства спирта…………………..106
4.4. Технология получения этилового спирта с
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
использованием пероксида водорода на стадии воднотепловой обработки сырья……………………………………. 114
4.4.1. Предпосылки применения пероксида водорода на
стадии водно-тепловой обработки зернового замеса…….. 114
4.4.2. Антимикробное действие пероксида водорода,
вносимого на стадии водно-тепловой обработки
зернового замеса……………………………………………. 119
4.4.3. Влияние пероксида водорода на содержание
нерастворенного крахмала в зрелых бражках……………..123
4.4.4. Влияние антимикробной обработки на изменение
кислотности сусла в процессе брожения………………….. 125
4.4.5. Влияние антимикробной обработки на содержание
несброженных углеводов в зрелых бражках……………… 138
4.4.6. Влияние антимикробной обработки на содержание
этилового спирта в зрелых бражках………………………. 143
5. Адаптация микроорганизмов к стрессовым условиям
окружающей среды……………………………………………… 148
5.1. Состояние стресса………………………………………… 148
5.2. Стрессовые воздействия и способы адаптации к ним…..150
5.3. Тепловой шок……………………………………………... 154
5.4. Гиперосмотический стресс………………………………. 157
5.5. Окислительный стресс…………………………………… 160
5.6. Влияние стрессоров на внутриклеточную
сигнализацию
168
5.7. Перекрестная устойчивость……………………………… 171
5.8. Образование протекторных экзометаболитов………….. 176
6. Образование летучих органических соединений при
производстве этилового спирта………………………………… 181
6.1. Факторы, влияющие на накопление летучих
органических соединений в этиловом спирте………………..181
6.2. Механизмы образования основных групп летучих
органических соединений, сопутствующих этиловому
спирту………...............................................................................183
6.3. Летучие органические соединения, образуемые
микроорганизмами, контаминирующими спиртовое
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
производство…………………………………………………... 198
6.4. Влияние антимикробной обработки зернового замеса
пероксидом водорода на содержание примесей в зрелых
бражках………………………………………………………… 206
Литература……………………………………………………….. 210
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АОБ – алкилоксибензолы;
АТФ – аденозинтрифосфат;
АФК – активные формы кислорода;
ВФА – внеклеточные факторы адаптации;
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота;
ИК – инфракрасный;
КОЕ – колониеобразующая единица;
МАФАМ – мезофильно-аэробные и факультативно-анаэробные
микроорганизмы;
МКБ – молочнокислые бактерии;
мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота;
НАД+ – никотинамидадениндинуклеотид окисленная форма;
НАДН·Н+ – никотинамидадениндинуклеотид восстановленная
форма;
ОАС – общий адаптивный синдром;
ОВП – окислительно-восстановительный потенциал;
РГС – регулируемая газовая среда;
РНК – рибонуклеиновая кислота;
РПА – роторно-пульсационный аппарат;
СВЧ – сверхвысокочастотный;
ТГФО – тепловая гидродинамическая и ферментативная обработка;
ТМТД – тетраметилтиурамиддисульфид;
УФ – ультрафиолетовый;
цАМФ – циклический 3',5'-аденозинмонофосфат.
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ВВЕДЕНИЕ
Контаминация субстратов посторонней микробиотой является одной из наиболее актуальных проблем для промышленных технологий, связанных с биоконверсией растительного сырья. В особенности для таких крупнотоннажных производств,
как получение пищевого этилового спирта, где доля затрат на
сырье составляет до 55 % от общей стоимости продукции и потери от развития посторонних микроорганизмов могут нанести
значительный экономический ущерб. В условиях постоянно растущих цен на ресурсы разработка эффективных способов антимикробной обработки сырья и полупродуктов биотехнологических производств становится приоритетной задачей, стоящей
перед исследователями различных стран мира.
Увеличение объемов мирового выпуска этилового спирта,
рост инвестиций в биотехнологические предприятия и научные
исследования по переработке растительного сырья в этанол создали предпосылки для динамичного развития спиртовой промышленности.
На современном этапе в спиртовой отрасли активно внедряются схемы механико-ферментативной обработки сырья, исключающие стадию высокотемпературного разваривания зернового замеса под давлением [1, 2], что серьезно обострило проблему развития микроорганизмов-контаминантов в ходе технологического процесса. В результате жизнедеятельности посторонней микробиоты в сусле накапливаются метаболиты, негативно влияющие на бродильную активность дрожжей и подавляющие их размножение, что приводит к снижению выхода и
ухудшению качества этанола. Основной причиной микробной
контаминации в технологии спирта является недостаточная очистка зернового сырья и воды.
На современном этапе развития научно-технической базы
спиртовой отрасли активно внедряются способы механикоферментативной обработки сырья, исключающие стадию высокотемпературного разваривания зерна под давлением [1]. Дан7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ные способы позволяют снизить расход теплоресурсов, упростить аппаратное оформление процесса, уменьшить потери
сбраживаемых веществ и улучшить качество спирта [2], но при
этом серьезно обостряется проблема микробной контаминации
технологического процесса.
При применении низкотемпературного разваривания сырья необходим строгий контроль микробиологических параметров [3–6]. Микроорганизмы-контаминанты утилизируют питательные вещества сусла и образуют метаболиты, токсичные для
дрожжей, в результате чего происходит снижение выхода спирта
и ухудшение его качества [1, 3–11].
Основной причиной микробной контаминации в технологии спирта является недостаточная очистка зернового сырья
[3, 12, 13]. При использовании низкотемпературной схемы разваривания посторонние микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность. В связи с этим актуальным является поиск новых
способов обеззараживания сырья в спиртовом производстве.
Для борьбы с микробной контаминацией в спиртовой
промышленности применяются различные методы: использование антибиотиков [7–9, 14–17]; ультразвукового [4], инфракрасного [6, 18] и гамма-излучений [19]. Недостатками этих способов является высокая стоимость антибиотиков и вероятность появления антибиотикорезистентных штаммов бактерий [20]; усложнение технологической схемы, низкая производительность
дезинфицирующих установок.
Распространенным способом антимикробной обработки
является химическая дезинфекция. В пищевой промышленности
в этих целях применяется соединение окислительного действия
– пероксид водорода.
Пероксид водорода обладает бактерицидным и фунгицидным действиями и не загрязняет обрабатываемые материалы
продуктами своего разложения [21, 22].
В данной монографии мы постарались отразить современное состояние вопроса обеспечения микробиологической
стабильности в технологии этилового спирта. Представлены
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
собственные и литературные данные, касающиеся снижения
микробной контаминации сырья в спиртовой промышленности.
Отдельные главы монографии посвящены вопросам образования
примесей в ходе брожения и влияния микроорганизмовконтаминантов на данные процессы.
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1. ЗЕРНОВОЕ СЫРЬЕ
Основным сырьем для производства этилового спирта в
Российской Федерации является зерно. При этом качество используемого зерна не регламентируется. Допускается прием зерна, непригодного для пищевых и кормовых целей, морозобойного, суховейного, подгоревшего, очень влажного и перезимовавшего в поле [1]. По данным [1] годовой объем переработки зерна
на спирт составляет (%): пшеницы (Triticum) – 50 (преимущественно дефектной); ячменя (Hordeum) – 20; ржи (Secale) – 12; кукурузы (Zea mays) – 8; овса (Avena) – 2; прочих культур (проса,
гречихи, вики, гороха, риса и др.) – 3 [1]. В нашей стране наиболее перспективными видами сырья для производства спирта являются пшеница, как наиболее распространенная культура, и
рожь в силу своей зимостойкости и нетребовательности к условиям произрастания.
1.1. Строение зерна
По ботанической классификации пшеница и рожь относятся к семейству злаковых, или мятликовых. Плод хлебных злаков – зерновка – состоит из нескольких основных частей: зародыша, оболочек, алейронового слоя и эндосперма [1, 23–26].
Весовое соотношение анатомических частей зерна пшеницы и ржи представлено в табл. 1.
Таблица 1. Весовое соотношение анатомических частей
зерна, % [23]
Части зерна
Пшеница
Рожь
Оболочки (плодовая и се5,5–8,0
6,5–12,2
менная)
Алейроновый слой
6,8–8,8
8,4–12,0
Эндосперм
77,0–85,0
72,8–78,0
Зародыш
1,5–3,0
2,5–5,6
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Зерновки пшеницы и ржи (рис. 1) имеют схожую удлиненную форму с ясно выраженным опушением (бородкой) на
верхней части и продольной бороздкой, идущей вдоль брюшной
стороны (выпуклая дорсальная часть зерновки называется спинкой, противоположная вентральная часть – брюшком) [23]. Зерно ржи имеет более вытянутую форму по сравнению с зерном
пшеницы [26].
1
2
плодовые оболочки
3
4
семенные оболочки
алейроновый слой
5
6
7
эндосперм
8
9
10
Рис. 1. Строение зерна: 1 – бородка; 2, 3, 4 – оболочки (плодовые и
семенные); 5 – алейроновый слой; 6 – эндосперм; 7 – щиток; 8 – зачаточные листы; 9 – зародыш с зачатками корешка;
10 – зачаточный корешок
Оболочки защищают зерно от неблагоприятных воздействий внешней среды: механических повреждений, проникновения вглубь зерна токсичных соединений и микроорганизмов
[23, 25, 26]. Оболочки разделяются на плодовую (околоплодник)
и семенную (перисперм) [25]. В пшенице содержание плодовой
оболочки составляет 3,3–6,8 %, семенной – 1,3–2,6 % от массы
сухих веществ зерна [26]. Плодовая оболочка состоит из трех
слоев клеток: продольного (эпикарпий), поперечного (мезокарпий) и трубчатого (эндокарпий) [26]. Семенная оболочка также
состоит из трех слоев клеток: первый слой из прозрачных клеток, плотно соединенный со средним слоем, второй слой – пигментный, содержащий красящие вещества, придающие окраску
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
всему зерну, третий слой – гиалиновый из непрозрачных набухающих клеток, примыкающих к алейроновому слою
[23, 25, 26]. В оболочках содержится много клетчатки и гемицеллюлоз (более 50 %). В состав оболочек зерна входит также
некоторое количество лигнина, образующегося в растениях при
одревеснении тканей [24].
Алейроновый слой – периферический слой эндосперма,
состоящий из резко очерченных крупных клеток с сильно утолщенными стенками. Клетки алейронового слоя содержат большое количество белков и жиров. Основной функцией алейронового слоя является обеспечение зародыша питательными веществами при прорастании зерна [23–26]. Клетки алейронового
слоя сохраняют свою жизнедеятельность при хранении, они обладают живым ядром и протоплазмой и участвуют в регуляции
процессов тепло- и массообмена зерна с окружающей средой
[27].
Под алейроновым слоем расположен эндосперм, составляющий основную часть зерна. Клетки эндосперма подразделяются на периферийные (небольшие сферические клетки, прилегающие к алейроновому слою), призматические (вытянутые
клетки, образующие несколько рядов с внутренней стороны периферийных клеток) и центральные.
Клетки эндосперма – тонкостенные, многогранные, с высохшей протоплазмой – плотно заполнены зернами (гранулами)
крахмала (крупные зерна – пластидный крахмал, мелкие зерна –
хондриосомный). Крахмальные гранулы со всех сторон окружены белковыми веществами (комплекс белков глиадина и глютенина), которые служат им цементирующей матрицей. Наибольшее количество белка содержится в периферических слоях эндосперма. От плотности упаковки гранул в матрицу зависит такой показатель зерна, как стекловидность. Так, при сравнении
микрофотографий центральной части эндосперма пшеницы и
ржи было установлено, что крахмальные гранулы ржи упакованы рыхло и непрочно связаны друг с другом. Плотная упаковка
гранул крахмала пшеницы обеспечивала высокую стекловид12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ность зерна, а при рыхлой упаковке луч света рассеивался на дефектах структуры, и она определялась как мучнистая [27]. Стенки клеток эндосперма состоят из гемицеллюлоз, β-глюканов и
минеральных веществ. Клетки склеены между собой пектином и
водорастворимыми белками.
В нижней части зерна расположен зародыш, из которого
при благоприятных условиях развивается растение. В нижней
части зародыша находится зародышевый корешок, в верхней
части – зародышевая почечка. Часть зародыша, плотно прилегающая к эндосперму и называемая щиток, служит для передачи
питательных веществ из эндосперма в зародыш при прорастании
зерна [25, 26]. В зародыше содержится большое количество белков, низкомолекулярных углеводов, витаминов и жиров. Белки
зародыша по своей природе, составу и питательной ценности
отличаются от белков эндосперма. Крахмала в зародыше нет, а
углеводы представлены в основном сахарозой. Клетчатки в зародыше немного, гемицеллюлоз около 10 %. Зародыш содержит
наибольшее количество витаминов по сравнению с остальными
частями зерна. Так, в щитке сосредоточено приблизительно 60 %
витамина В1, содержащегося в зерне пшеницы [24].
1.2. Химический состав зерна
Зерно по своему составу многокомпонентно; оно содержит белки, углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты, пигменты,
витамины, минеральные вещества. Химический состав зерна
пшеницы и ржи представлен в табл. 2.
Азотистые вещества зерна представлены главным образом, белками. Небелковые азотистые вещества – аминокислоты,
амиды, алкалоиды и аммиачный азот – содержатся в здоровом
зерне в незначительных количествах – не более 3 %. В недозрелом, подвергшемся самосогреванию, морозобойном и проросшем зерне количество небелковых азотистых веществ увеличивается [1, 23]. По строению белки зерна разделяются на две
группы: протеины (простые белки) и протеиды (сложные белки).
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 2. Средний химический состав зерна, % от сухого
вещества [24]
Культура Белок Крах- Моно Клетчатка Гемицел- Липиды Зола
мал и олилюлозыгосапентозаны
хариды
(гексозы)
Пшеница 16,07 63,07 4,32
2,76
8,10
1,96 2,18
Рожь
14,03 61,30 4,80
2,36
10,00
1,74 1,90
Сложных белков особенно много содержится в тканях зародыша: это нуклеопротеиды и липопротеиды. Другие части зерна
содержат в основном простые белки: альбумины – белки, растворимые в воде (большинство ферментов зерна) [26], глобулины – белки, растворимые в слабых (3–10 %) растворах нейтральных солей, проламины – белки, растворимые в 60–80 % растворах этанола (глиадин пшеницы и ржи), и глютелины – белки,
растворимые в слабых (0,1–0,2 %) растворах щелочей [1, 23, 26].
Около 80 % общего количества белков в зерне приходится на
проламины и глютелины. Содержание различных белков в зерне
представлено в табл. 3.
Таблица 3. Cодержание различных видов белка в зерне, % мас. [1]
Культура Альбумины Глобулины Проламины Глютелины
Пшеница
4
8
40
48
Рожь
28
22
32
18
Приблизительно половина всех белковых веществ зерна
составляет матрицу, в которую включены крахмальные гранулы [28].
Крахмал (С6Н10О5)n – сложный полисахарид, основной
резервный углевод зерна, состоит из смеси двух полимеров, построенных из остатков глюкопиранозы: амилозы и амилопекти14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
на. Кроме того, крахмал также содержит высокомолекулярные
жирные кислоты (до 0,6 %) и минеральные вещества (0,2–0,7 %),
главным образом фосфаты, фосфорную кислоту и азотистые соединения.
Амилоза – линейный полимер с молекулярной массой
50 тыс. – 2 млн, состоящий из остатков глюкозы, соединенных
α-1,4-гликозидной связью. Молекула амилозы представляет собой растянутую спираль [29], внутренняя поверхность которой
обладает гидрофобными свойствами, а внешняя – гидрофильными. Благодаря чему амилоза образует комплексные соединения
(клатраты) с йодом, органическими кислотами и спиртами.
Амилопектин – разветвленный полимер с молекулярной
массой от 1 до нескольких сотен млн, также состоящий из остатков глюкозы. В среднем на 25 остатков глюкозы, связанных
α-1,4-гликозидной связью приходится один центр разветвления
за счет образования α-1,6-гликозидной связи [29–31].
В зерне крахмал содержится в виде гранул аморфнокристаллической структуры, по форме напоминающих линзы
размером от 2 до 180 мкм, состоящих из концентрических слоев,
где молекулы амилопектина образуют трехмерную сетку, ячейки
которой заполнены амилозой [29–31]. Крахмальные гранулы могут быть сферическими, овальными, полигональными и т.д.;
форма крахмальных гранул зависит от происхождения крахмала
[24–26]. Гранулы крахмала не растворяются в холодной воде,
при повышении температуры крахмал набухает, гранулы разрушаются, и образуется вязкий коллоидный раствор. Данный процесс называется клейстеризацией крахмала. В процессе нагревания усиливаются колебания крахмальных молекул, ослабляются
межмолекулярные связи. Далее молекулы воды проникают
вглубь макромолекул крахмала, разрывают водородные связи,
отдаляя друг от друга полимерные цепи и вызывая увеличение
объема гранул. При достижении определенной температуры
(температуры клейстеризации) процесс становится необратимым, происходит разрыв вторичных водородных связей,
удерживающих полимерные цепи крахмала в кристаллической
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
структуре, что приводит к полной потере кристалличности и
разрушению крахмальных гранул [29, 30]. Крахмал, содержащийся в растительных тканях клейстеризуется при более высокой температуре по сравнению с очищенным крахмалом [1].
Большие крахмальные гранулы клейстеризуются при более низкой температуре [25, 26, 29]. Вследствие наличия в зерне гранул
различного размера полная клейстеризация крахмала всегда
происходит в некотором температурном интервале, зависящем
от происхождения крахмала [29].
Моно- и олигосахариды зерна представлены пентозами
(арабиноза, ксилоза, рибоза и т.д.), гексозами (D-глюкоза, Dфруктоза и т.д.), сахарозой, мальтозой и раффинозой. Содержание моно- и олигосахаридов в полностью созревшем не проросшем зерне невелико – 2–3 % (главным образом сахароза и раффиноза) [24]. Наибольшее количество моно- и олигосахаридов
(16–23 %) обнаруживается в зародыше. Низкомолекулярные углеводы необходимы зародышу на начальном этапе развития для
активации ферментного комплекса, гидролизующего крахмал. В
недозрелом, проросшем и морозобойном зерне содержится
большое количество мальтозы – промежуточного продукта гидролиза крахмала [24–26].
Целлюлоза (клетчатка) – полисахарид, состоящий из остатков β-D-глюкопираноз, соединенных β-1,4-гликозидными
связями, что определяет его линейное строение [26, 29]. Целлюлоза является основным структурным элементом растительных
клеток, в зерне содержится главным образом в оболочках и в
клеточных стенках алейронового слоя [25, 26]. Целлюлоза нерастворима в воде и в большинстве других растворителей. При
окислении целлюлозы гидроксильные группы глюкозных остатков трансформируются в кетонные, альдегидные и карбоксильные группы. Устойчивость целлюлозы объясняется кристаллической структурой и особой «упаковкой» ее молекул [30]. В результате возникновения внутрицепочечных и межцепочечных
водородных связей между гидроксильными группами глюкопираноз и ацетальными кислородными атомами из отдельных це16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пей целлюлозы формируются надмолекулярные структуры –
кристаллиты. Молекулы целлюлозы сгруппированы в микрофибриллы. В высокоупорядоченных кристаллических областях
целлюлозы микрофибриллы упакованы так плотно, что в них с
трудом проникают даже молекулы воды. Менее упорядоченные
аморфные участки составляют около 15 % микроструктуры целлюлозы, что делает ее чрезвычайно устойчивой к действию
внешних факторов [26, 30]. Кластеры микрофибрилл окружены
молекулами гемицеллюлозы, а эти сложные образования в свою
очередь окружены оболочкой из лигнина [30].
Гемицеллюлозы – короткие разветвленные гетерополисахариды, построенные из молекул пентоз – пентозаны (арабан,
ксилан) или гексоз – гексозаны (галактан, маннан). Гемицеллюлозы смешанного состава дают при гидролизе гексозы, пентозы
и уроновые кислоты (продукты окисления одной из первичных
гидроксильных групп моносахарида до карбоксильной группы).
Мономерные звенья гемицеллюлоз связаны между собой 1,5-,
1,6- и 1,4-гликозидными связями [30]. В зерне пшеницы и ржи
содержится 8–10 % гемицеллюлоз, в том числе 5–8 % пентозанов. Гемицеллюлозы в зерне сосредоточены главным образом
в периферийных и оболочечных частях [25, 26].
Лигнин – полифенол переменного состава с разветвленными макромолекулами [30], в одревесневших клетках играет
роль цементирующего вещества – скрепляет полисахаридные
структуры и заполняет пустоты между микрофибриллами целлюлозы и гемицеллюлозы [28], снижает проницаемость клеточных стенок для воды и питательных веществ. Микрофибриллы
придают зерну прочность на растяжение, а лигнин – на сжатие
[28]. Лигнин травянистых растений состоит из остатков замещенных фенолоспиртов (монолигнолов): 3-метокси-4-оксикоричного (кониферилового), 3,5-диметокси-4-оксикоричного
(синапового, синапинового), и p-оксикоричного (p-кумарового),
соединенных между собой эфирными и углерод-углеродными
связями. Производные коричной кислоты синтезируются из
ароматических аминокислот фенилаланина и тирозина и явля17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ются промежуточными соединениями в биосинтезе некоторых
специфичных для растения фенольных метаболитов, в том числе
и лигнина. Способностью использовать тирозин для биосинтеза
лигнина обладают только растения, относящиеся к семейству
gramineae, так как только энзиматическая система трав может
дегидратировать p-оксифенилмолочную кислоту до p-оксикоричной кислоты [32]. Начальным этапом образования монолигнолов является дезаминирование фенилаланина и тирозина, при
этом образуются коричная и p-оксикоричная (p-кумаровая) кислоты соответственно [32–34]. Коричная кислота под действием
фермента циннамат 4-гидроксилазы трансформируется в p-оксикоричную кислоту [33–35], из которой в результате протекания
энзиматических реакций образуются кофейная, феруловая, 5оксиферуловая и синаповая кислоты [32–35]. Восстановление
p-оксикоричной кислоты циннамоил-КоА редуктазой дает
p-кумаровый альдегид, феруловой кислоты – конифериловый
альдегид, синаповой кислоты – синаповый альдегид. Далее полученные альдегиды под действием циннамил алкоголь дегидрогеназы восстанавливаются до p-кумарового, кониферилового и
синапового спиртов [33–35].
Пектины – гетерогенные полимеры, основной структурной единицей которых является галактуроновая кислота, с
включением в состав боковых цепей нейтральных составляющих: арабинанов, галактанов, арабиногалактанов [26]. Нерастворимые пектины (протопектины) входят в состав клеточных стенок и межклеточного вещества, а растворимые содержатся в
клеточном соке [26].
Слизи (гумми) – полисахариды, в большинстве случаев
растворимые в воде, состоящие главным образом из остатков
пентоз (арабинозы и ксилозы). В состав слизей входят также
глюкоза, фруктоза и галактоза. Слизи легко набухают в воде и
образуют чрезвычайно вязкие растворы. Особенно много слизей
содержит зерно ржи – 2,5–7,4 % сухого вещества [24–26], вследствие чего разваренная масса, получаемая при ее переработке на
спирт, характеризуется повышенной вязкостью [1]. Наибольшее
18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
количество слизей содержится в периферийных частях зерна, в
центральной части содержание слизей в два раза меньше, но относительная вязкость слизей, выделенных из центральных областей зерна, в 50 раз выше, чем из периферийных. Вязкость
слизей возрастает с увеличением доли пентозанов и уменьшением доли гексозанов [25].
Левулезаны – сложные полисахариды, чаще всего растворимые в воде, состоящие из остатков левулезы (фруктозы) и незначительного количества глюкозы [24, 25]. В зерне ржи содержание левулезанов доходит до 1,5 % сухого вещества, в пшенице –
около 0,3 %. Левулезаны в больших количествах образуются на
ранних фазах созревания зерна из углеводов, синтезируемых в
листьях при фотосинтезе. Из листьев левулезаны различной молекулярной массы поступают в стебель, затем в созревающий
колос и непосредственно в зерновках превращаются в крахмал
[24, 25]. В недозрелом зерне содержание левулезанов достигает
35 % сухого вещества [24, 25].
Липиды – большая группа эфироподобных органических
соединений, объединяемых по нескольким признакам: гидрофобность, растворимость в органических растворителях, неполярных (бензол, диэтиловый эфир и др.) и полярных (этанол,
ацетон, хлороформ и др.). Наибольшее количество липидов в
зерне содержится в зародыше и алейроновом слое, наименьшее –
в эндосперме. По строению липиды подразделяются на простые
(жиры, воски), сложные (фосфолипиды, гликолипиды) и циклические (стерины, стериды). По способу извлечения и применяемого растворителя – на свободные, связанные и прочносвязанные. Свободные липиды относятся, главным образом, к запасным веществам, связанные и прочносвязанные – к структурным.
Содержание свободных липидов в зерне составляет от 65 до 89 %
от общего количества липидов, связанных – 3,3–24 %, прочносвязанных – 4,3–13 % [25, 26].
Жиры – сложные эфиры глицерина и высокомолекулярных жирных кислот (триацилглицериды). В составе триацилглицеридов зерна преобладают ненасыщенные жирные кислоты,
19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
содержащие одну или несколько двойных связей (олеиновая,
линолевая, линоленовая и др.) [24]. Из насыщенных жирных кислот преобладает пальмитиновая. Ненасыщенные жирные кислоты легко окисляются, образуя перекиси и гидроперекиси, которые затем окисляют жирные кислоты (прогоркание жира).
Триацилглицериды являются запасными веществами зерна и содержатся главным образом в зародыше и алейроновом слое [24–26].
Воски – сложные эфиры жирных кислот и высокомолекулярных одноатомных спиртов. Жирные кислоты представлены
как обычными для жиров соединениями (пальмитиновая, стеариновая, олеиновая кислоты), так и характерными для восков
(карнаубовая, церотиновая, монтановая кислоты). Из высокомолекулярных одноатомных спиртов, наиболее часто входящих в
состав восков, можно отметить цериловый (гексадеканол-1), цетиловый (н-гексакозанол). В зерне воски содержатся в основном
в оболочках, они покрывают зерновку тонким слоем, предохраняя ее от высыхания, смачивания и поражения микроорганизмами. При перемещении убранного сухого зерна восковая
пленка быстро разрушается [25].
Фосфолипиды – жироподобные соединения, включающие
в свой состав фосфорную кислоту. В зерне фосфолипиды содержатся по преимуществу в зародыше. Фосфолипиды образуют
комплексы с белками – липопротеиды, которые входят в состав
клеточных мембран и регулируют транспорт веществ [25, 26]. В
процессе разваривания зернового замеса при производстве спирта фосфолипиды подвергаются гидролизу с образованием фосфорной кислоты, определяющей кислотность разваренной массы
[1]. Наиболее часто встречающимся фосфолипидом в злаках является лецитин: 0,3–0,7 % к массе зерна [1]. Молекула лецитина
представляет собой триглицерид, в котором две спиртовые
группы глицерина связаны с остатками жирных кислот (в основном линолевой, пальмитиновой, олеиновой), а третья – с остатком фосфорной кислоты, в свою очередь связанной с азотистым
основанием – холином [24, 25]. В состав фосфолипидов входят
различные азотистые основания (коламин, серин и др.). Сущест20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
вуют фосфолипиды не содержащие азотистых оснований – фосфатидные кислоты. В алейроновом слое и оболочках злаков содержится калий-, кальций-, магниевая соль инозитфосфорной
кислоты – фитин, в основе которой лежит циклический шестиатомный спирт миоинозит [25].
Гликолипиды – разнообразные соединения углеводов и
липидов, в пшенице представлены главным образом моно- и дигалактозилглицеридами [24, 26].
Циклические липиды (стероиды) – производные циклопентанопергидрофенантрена – подразделяются на стерины (стеролы) – высокомолекулярные циклические спирты – и стериды –
сложные эфиры стеринов. В пшенице содержится 0,03–0,07 %
стероидов. Стероиды в комплексе с белками входят в структуру
биологических мембран и регулируют обмен веществ в клетке [25].
Жирорастворимые пигменты – каротиноиды, хлорофиллы –
находятся в оболочках зерна, с их присутствием связана та или
иная окраска зерна. Пшеничные зерна содержат в основном каротиноиды, чем обусловлена их желто-красная окраска, а зерновки ржи содержат также хлорофилл, придающий им зеленый
оттенок [24–26].
Витамины – органические соединения, являющиеся биорегуляторами процессов, протекающих в живом организме. Витамины делятся на две группы: жирорастворимые и водорастворимые. Из жирорастворимых витаминов в зерне содержится
только витамин Е (токоферол), по преимуществу локализованный в зародыше. К водорастворимым витаминам зерна относятся тиамин (В1), рибофлавин (В2), никотиновая кислота (РР), пантотеновая кислота (В3), пиридоксин (В6) и биотин (Н); в проросшем зерне обнаруживается также аскорбиновая кислота – витамин С [24–26].
Минеральные вещества (зола). Все элементы, входящие в
состав зерна подразделяются на макроэлементы, которые содержатся в количестве от десятых до сотых долей процента (10-1-10-2) –
Р, К, Mg, Na, Fe, S, Al, Si, Ca; микроэлементы – от тысячных до
стотысячных долей процента (10-3-10-5) – Mn, B, Sr, Cu, Zn, Ba,
21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ti, Li, I, Br, Mo, Co и др.; ультрамикроэлементы, содержание которых измеряется миллионными долями процента и ниже (≤10-6)
– Cs, Se, Cd, Hg, Ag, Au, Ra и др. [25]. Зольность и состав золы
пшеницы и ржи представлены в табл. 4.
Таблица 4. Зольность и состав золы пшеницы и ржи [26]
Куль- ЗольСостав золы, % от общей массы
тура
ность, P2O5 K2O MgO CaO Na2O SiO2 SO3 Fe2O3
%
47,2 30,7 12,8 4,3 1,7 1,6 1,4 0,2
Пше1,71
ница
Рожь
1,76
43,0 32,6 13,5 6,4 1,3 1,8 1,1 0,2
Содержание минеральных веществ определяют, сжигая
навеску зерна при температуре 650–850 °С. Зола, полученная
при сжигании, образуется главным образом из разных органических соединений, содержащих те или иные элементы. Серный
ангидрид SO3 образуется при сгорании белков зерна из серы, которая входит в состав серосодержащих аминокислот. Фосфорный ангидрид Р2О5 образуется из нуклеопротеидов, фосфолипидов, фитина [24].
Отдельные части зерна различаются по содержанию элементов, дающих при сжигании золу. Наиболее высока зольность
оболочек и алейронового слоя, несколько ниже – зародыша и
самая низкая – эндосперма [24].
Кислоты зерна представлены фосфорной кислотой, которая в виде различных соединений содержится в зерне в значительном количестве; свободными жирными кислотами, образующимися при гидролизе жиров под действием фермента триацилглицероллипазы (повышенное содержание свободных жирных кислот свидетельствует о биохимической порче зерна); низкомолекулярными органическими кислотами: уксусной, яблочной, молочной и другими, содержание которых резко возрастает
при микробиологической порче зерна [24, 25].
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Вода содержится в зерне в двух состояниях: свободном и
связанном. Свободная вода имеет низкую энергию связи с тканями зерна и легко из него удаляется. В присутствии свободной
влаги в зерне резко интенсифицируются дыхание и другие биохимические процессы. Свободная влага способствует развитию
микроорганизмов и насекомых, жизнедеятельность которых
приводит к значительным потерям зерна [25]. Связанная вода
обладает высокой энергией связи с тканями зерна, она прочно
химически и физически связана с составными частями зерна.
Содержание связанной воды в зерне составляет 14–15 % [24, 25].
При такой влажности все процессы в зерне затухают, и оно становится стойким при хранении.
Содержание воды существенно влияет на механические
свойства зерна, сухое зерно имеет свойства хрупкого тела, а
влажное – пластичного [28].
При помещении в воду зерно начинает поглощать влагу и
набухает. Вода проникает в зерно в первую очередь через зародыш и бороздку [24]. Первоначально вода насыщает плодовые
оболочки, полная влагоемкость которых обеспечивает скачкообразное повышение влажности зерна примерно на 4 % в течение
короткого отрезка времени. Вода накапливается в пустотелых
омертвевших клетках и в области деградировавшего слоя трубчатых клеток. Данная влага связана слабо и при изменении
внешних условий легко испаряется. Более прочное удерживание
воды в зерне обеспечивается благодаря высокой гидрофильности
тканей семенной оболочки, алейронового слоя и зародыша. В
данных анатомических частях вода задерживается на время, вероятно, необходимое для активации ферментного комплекса
зерна, после чего создаются условия для проникновения воды
вглубь эндосперма и последующего прорастания [27].
1.3. Классификация и характеристика микробиоты зерна
Зерно является благоприятным субстратом для развития
микроорганизмов. Микробиота зерна отличается большим раз23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нообразием, однако, как правило, одновременно в отдельной
партии преобладает ограниченное число видов микроорганизмов
[36, 37]. В состав микробиоты зерна входят бактерии, мицелиальные грибы, актиномицеты и дрожжи [14, 37–41].
Литературные данные о количественном содержании
микроорганизмов в зерновой массе разнообразны, что объясняется влиянием большого числа независимых факторов (сорт зерна, условия произрастания, проведение предпосевной обработки,
своевременность уборки и многое другое). Общее число микроорганизмов зерна полной уборочной стадии зрелости колеблется
от нескольких тысяч до нескольких миллионов КОЕ на 1 г
[14, 38]. В зависимости от условий, способа уборки и своевременности послеуборочной обработки зерна пшеницы зараженность внутренней микробиотой, а именно мицелиальными грибами изменяется в пределах от 20 до 100 % на 100 шт. [14].
В табл. 5 представлены данные о микробной обсемененности пшеницы и ржи урожаев 2003, 2004 гг., полученные нами
в ходе работ по снижению микробной контаминации сырья в
технологии этанола. Зерна пшеницы и ржи урожая 2004 г. были
сильно обсеменены микроорганизмами, а исследуемые образцы
пшеницы и ржи урожая 2003 г. характеризовались незначительной степенью зараженности поверхностной микробиотой, что,
вероятно, связано с постепенным отмиранием неспоровых форм
микроорганизмов при хранении [14, 39, 40]. В то же время контаминация зерен внутренней микробиотой была на высоком
уровне для всех исследованных образцов, в некоторых случаях у
единичного зерна одновременно отмечались признаки как грибного, так и бактериального поражения (табл. 5).
Бактерии – наиболее многочисленная группа микроорганизмов зерна, по разным данным количество бактерий в одном
грамме зерновой массы колеблется в пределах 102–2·107 колониеобразующих единиц (КОЕ) [38], 3·103–4·108 КОЕ [14]. На
свежеубранном зерне часто обнаруживают бактерии родов Flavobacterium, Micrococcus, Lactobacillus, Bacillus, Clostridium,
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 5. Уровень микробной обсемененности зерна
Микробиота
зерна
Поверхностная
микробиота
Внутренняя микробиота
Число микроорганизмов,
КОЕ/г
Зараженность,
% на 100 семян
Рожь
Пшеница
25
2003
2004
2003
Пшеница
Рожь
Общее количество микроорганизмов, КОЕ/г
Рожь
Пшеница
2004 2003 2004 2003 2004 2003 2004
2003 2004
Мицелиальные
грибы
1,0·102 1,8·103 4,4·102 1,0·103 70,0 85,0 72,0 87,0 1,2·102 8,1·103 4,8·102 1,9·103
МАФАнМ*
7,9·103 4,2·108 2,7·103 1,8·107 31,0 15,0 24,0 20,0 1,0·104 6,0·108 2,9·103 2,4·107
Непораженные
зерна
-
-
-
-
2,0
-
4,0
-
-
* Мезофильно-аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы
-
-
-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Alcaligenes [36], Xanthomonas (X. phaseolivar. saiense, X. campestris) [37], но преобладают, как правило, грамотрицательные виды бактерий Erwinia herbicola, Pseudomonas fluorescens – до 90
% от общей численности [14, 37]. Микробная обсемененность
зерна, при хранении которого были допущены нарушения, составила 3,2·109 КОЕ/г, в том числе Bacillus subtilis –
4,2·107 КОЕ/г [42].
В условиях повышенной влажности бактерии довольно
быстро проникают внутрь зерна (особенно Pseudomonas) [41].
При правильно проведенной сушке и соблюдении условий хранения в составе микробиоты зерна начинают доминировать
грамположительные бактерии, так как грамотрицательные бактерии в силу строения клеточной стенки менее стойки к обезвоживанию, легче отдают влагу и гибнут [14]. Так, среди бактерий
хранящегося ячменя было выявлено 13 таксонов, в основном
грамположительные бактерии: Aureobacterium flavescens, Bacillus spp., Brevibacterium linens, Corynebacterium spp., Clavibacterium
iranicum,
Microbacterium
imperiale,
Oerskovia
xanthineolytica. Наиболее часто встречались виды Corynebacterium spp. (18 % от общего количества) [37]. Сообщается также,
что от 1,6 до 20 % жизнеспособных бактерий хранящегося ячменя относилось к семейству Enterobacteriaceae, преобладали виды, типично связанные с растительными тканями: Enterobacter
agglomerans, Serratia odorifera, а содержание молочнокислых
бактерий, таких как Lactococcus lactis, Lactobacillus coprophilus,
Lb. plantarum, Leuconostoc mesenteroides составляло менее
0,01 % [37].
Мицелиальные грибы – вторая по численности составляющая микробиоты зерна. Один грамм зерновой массы может
содержать от нескольких сотен до нескольких десятков тысяч
спор грибов [14, 39]. Грибы считаются основной причиной порчи продовольственного зерна в мире [40]. С экологической точки зрения мицелиальные грибы принято разделять на две группы: полевые грибы и плесени хранения [14, 36, 39, 40].
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Полевые грибы контаминируют и инфицируют зерно в
поле во время его формирования и созревания [36], как правило,
они обладают пигментированным мицелием, что делает их устойчивыми к действию ультрафиолетового излучения Солнца
[14]. Полевые грибы – гидрофиты (гидрофилы), для их развития
необходимо, чтобы влажность зерна находилась в равновесии с
относительной влажностью воздуха 90–95 %, то есть влажность
зерна должна составлять 20–25 % из расчета на сырую массу или
30–33 % из расчета на сухое вещество [14, 36, 39, 40]. Наиболее
распространенные представители данной группы в составе микробиоты зерна – несовершенные грибы родов Alternaria,
Cladosporium, Fusarium, Helmintosporium (Bipolaris, Drechslera),
Stemphylium, Trichoderma [14, 36, 39, 40].
Плесени хранения практически не обнаруживаются на созревающем и свежеубранном зерне. Основная контаминация
происходит на стадии хранения зерна. К плесеням хранения относятся грибы родов Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus,
Wallemia (Sporendonema). Все плесени хранения являются в той
или иной степени ксерофитами (ксерофилами) и способны расти
в материалах с влажностью, равновесной относительной влажности воздуха от 70 до 90 %, что соответствует влажности зерна
14,0–20,3 % [37]. Типичные ксерофиты Aspergillus restrictus и
Asp. glaucus способны развиваться на зерне с влажностью, равновесной относительной влажности воздуха 78–80 % и ниже, и
практически всегда являются инициаторами процесса порчи
зерна [14, 39, 40]. Медленный рост гриба Aspergillus restrictus
отмечался даже при активности воды aw = 0,65–0,70, то есть при
равновесной относительной влажности 65–70 % [39, 40]. К ксерофитам, вызывающим первичную порчу зерна, относится также
плесневый гриб Wallemia sebi (Sporendonema sebi), способный
расти при aw = 0,69 [37]. В результате развития Aspergillus restrictus и Asp. glaucus происходит увеличение влажности зерновой массы, что создает условия для жизнедеятельности более
требовательных к влаге плесеней хранения Asp. candidus, Asp.
flavus, Asp. ochraceus, Asp. versicolor и Penicilliun spp [14, 39, 40].
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Некоторые виды рода Aspergillus, такие как Asp. fumigatus и
Asp. niger, являются слабыми ксерофитами; они начинают развиваться, когда влажность зерновой массы становится равновесной относительной влажности выше 90 %, то есть 20,3 % и выше
[14, 37, 39, 40], и завершают процесс порчи зерна.
По преобладанию того или иного вида микроорганизмов
можно судить о качестве зерна, условиях и продолжительности
его хранения. Важным показателем, характеризующим технологические свойства и питательную ценность зернового сырья, является родовой состав микромицетов.
В табл. 6 представлен родовой состав сообщества микромицетов пшеницы и ржи урожая 2003, 2004 годов.
Таблица 6. Структура сообщества микромицетов исследуемого
зерна
Частота встречаемости, %
Поверхностная микроВнутренняя микробиота
биота
Род микПшеница
Рожь
Пшеница
Рожь
ромицетов
2003 2004 2003 2004 2003 2004 2003 2004
г.
г.
г.
г.
г.
г.
г.
г.
Aspergillus
70
20
25
19
91
5,0
28
3
Penicillium
25
33
50
20
5
4,0
53
7
Mucor
5
14
25
6
10,0
12
11
Stachy2
1,0
botris
Helminto20
1
48,0
1
7
sporium
Cladospo10
14
1
20,0
1
12
rium
Alternaria
3
41
7,0
5
56
Tricho5,0
4
derma
28
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В структуре родового состава микромицетов пшеницы и
ржи урожая 2003 года основную долю составляли представители
группы плесеней хранения р. Penicillium, Aspergillus, Mucor. Незначительное содержание полевых грибов было характерно
лишь для внутренней микробиоты. Многие авторы в своих работах отмечают, что при хранении в зерновой массе начинают преобладать плесневые грибы р. Penicillium, Aspergillus, Mucor, вытесняя тем самым полевые микромицеты. Данный факт объясняется тем, что плесени хранения менее требовательны к условиям
среды, необходимым для развития; они способны расти в условиях низкой влажности в широком диапазоне температур и образуют в процессе своей жизнедеятельности значительно больше спор по сравнению с полевыми грибами [14, 37, 39, 40]. В
партиях зерна урожая 2004 года преобладали полевые грибы,
причем в структуре микромицетного сообщества ржи доминировали полевые грибы рода Alternaria, а для пшеницы наиболее
характерными были представители родов Helmintosporium и
Cladosporium.
Высокий процент зерен, пораженных плесневыми грибами, в особенности представителями родов Penicillium, Aspergillus, Mucor, называемыми также плесенями хранения, может негативно сказаться на выходе и качестве спирта.
Плесени хранения в процессе своей жизнедеятельности
синтезируют высокоактивные ферменты, которые снижают питательную ценность зерна и вызывают накопление низкомолекулярных продуктов распада белков, липидов и полисахаридов,
неустойчивых к действию высоких температур. На стадии разваривания данные продукты вступают в реакции взаимодействия, разложения, конденсации с образованием различного рода
соединений [29, 43, 44], некоторые из них, такие как фурфурол,
акролеин, пиразин и другие, обнаруживаются в дальнейшем в
составе примесей этилового спирта [12]. Продукты реакций меланоидинообразования и термической дегидратации углеводов
адсорбируются на поверхности дрожжевых клеток, вызывая их
гибель [1, 45]. Кроме того, развитие плесневых грибов сопрово29
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ждается выделением ими в среду микотоксинов, также негативно влияющих на жизнедеятельность дрожжей [46–48].
Актиномицеты содержатся в зерне в незначительных количествах, наиболее часто встречаются актиномицеты рода Septomyces (S. griseus, S. albus, S. thermoviolaceus), а также Thermoactinomyces vulgaris [37].
Дрожжи. На поверхности зерна обнаруживаются представители различных родов дрожжей. Сообщается [37], что к моменту уборки ячменя колонии дрожжей могут присутствовать на
50–85 % зерен. На ячмене преобладают пигментированные
дрожжи Sporobolomyces и Rhodotorula, выделяются также Hansenula, Torulopsis и Candida [37]. В пшенице были выявлены
дрожжи Cryptococcus и Trichosporon [37].
По воздействию на зерно все обнаруживаемые на нем
микроорганизмы можно разделить на три группы: сапрофитные,
фитопатогенные и патогенные для животных и человека [14].
Наиболее широко представлены сапрофитные микроорганизмы,
данная группа присутствует практически во всех партиях семян
и преобладает численно [36]. К сапрофитам относятся эпифитные микроорганизмы, которые существуют на поверхности вегетирующих растений и осуществляют свою жизнедеятельность
за счет поверхностных выделений растительных клеток, и микроорганизмы, попадающие на зерно случайно с пылью и брызгами дождя, при хранении и т.д. [14, 36]. Эпифитная микробиота
на 80–99 % состоит из неспорообразующих бактерий [36]. К типичным эпифитам относятся бактерии Erwinia herbicola (травяная палочка) и Pseudomonas fluorescens [14, 36]. Состав эпифитной микробиоты зависит от вида растения и климатических условий его произрастания, на растениях, выделяющих большее
количество воды и продуктов обмена, микробиота разнообразнее [36]. При теплой влажной погоде на поверхности растений
преобладают бесспоровые палочковидные бактерии, в сухую и
жаркую погоду – спорообразующие бациллы Bacillus subtilis, B.
mycoides и др., а при влажной и прохладной погоде активно развиваются мицелиальные грибы Alternaria и др. [14]. Как прави30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ло, эпифиты не внедряются в ткани растений и семян и не оказывают отрицательного воздействия на их жизнеспособность, но
при благоприятных условиях (высокая влажность и температура)
данные микроорганизмы способны вызывать порчу убранного
зерна, способствуя процессу его самосогревания, вследствие выделения большого количества тепла при дыхании [14, 36]. К сапрофитам, попадающим на поверхность зерна случайно, следует
прежде всего отнести мицелиальные грибы хранилищного родов
Aspergillus, Penicillium, Mucor, Rhizopus и другие, активное развитие которых способно причинить большой экономический
ущерб [36].
Фитопатогенные микроорганизмы являются возбудителями заболеваний растений. Они способны проникать в ткани
растений и развиваться там, приводя к снижению урожайности и
вызывая гибель растений. В зависимости от природы возбудителя болезни растений делятся на бактериозы, микозы и вирусные
заболевания [14, 36, 49]. Наиболее распространенными бактериозами злаков являются «ожог», «черный зародыш», щуплость
зерна, вызываемые бактериями Xanthomonas translucens, Pseudomonas atrofaciens [49]. Возбудителями микозов являются головневые грибы Tilletia spp., Urocystis spp., Ustilago spp. класс
Basidiomycetes. Спорынью ржи вызывает гриб Claviceps
purpurea, относящийся к классу Ascomycetes, а различные виды
корневых гнилей – большая группа грибов Fusarium spp.,
Cladosporium spp., Helmintosporium spp. (Bipolaris, Drechslera),
Ophiobolus spp., Cercosporella spp. и другие [49]. В процессе хранения зерна большинство фитопатогенных микроорганизмов не
развиваются, но наличие некоторых из них влияет на продовольственные, семенные и фуражные качества зерна [36]. Следует
также отметить, что разделение микроорганизмов на сапрофитные и фитопатогенные формы весьма условно, многие
сапрофиты при определенных обстоятельствах способны вызывать заболевания растений, а фитопатогенные микроорганизмы
становиться сапрофитами [36]. К полупаразитам относятся некоторые виды грибов рода Alternaria [36, 49].
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Микроорганизмы, патогенные для животных и человека,
являются случайными спутниками зерновых масс, но их возможное присутствие необходимо учитывать. Зерно может содержать возбудителей туляремии, сапа, бруцеллеза, сибирской
язвы, туберкулеза, столбняка, газовой гангрены и т.д. [39]. Потенциально патогенными для человека могут являться и типичные представители микробиоты зерна; так, вдыхание спор плесневых грибов Cladosporium и Alternaria способно вызвать аллергические альвеолиты, бронхиты, бронхиальную астму [41].
Сообщается, что частой причиной респираторных заболеваний
фермеров является актиномицет Thermoactinomyces vulgaris,
присутствующий на созревающем и свежеубранном ячмене [37].
В составе микробиоты зерна часто обнаруживаются и возбудители кишечных инфекций. При исследовании образцов ячменя и
овса их общее микробное загрязнение колебалось от 7,2·105 до
4,3·106 КОЕ/г, в том числе колиформных бактерий 7,8·104 и
1,5·104 КОЕ/г для ячменя и овса соответственно [41]. Среди колиформных бактерий было идентифицировано 13 видов: Enterobacter agglomerans (30–75 %), E. cloacae (10–40 %), Klebsiella
pneumoniae (4–15 %), Citrobacter freundii (6–10 %), Escherichia
coli (1,2 %) [41]. Опасность для человека могут представлять
бактерии родов Staphylococcus, и Salmonela, а также спорообразующие бактерии Bacillus и Clostridium. В работе [50] сообщается о контаминации ржаной муки бактериями Salmonela molade.
Обсемененность поверхности свежеубранного зерна бактериями
рода Bacillus составила от 102 до 9·103 КОЕ/г, Clostridium – от 0
до 3,2·102 КОЕ/г, внутри зерна количество бактерий рода Bacillus было от 0 до 2·102 КОЕ/г, Clostridium отсутствовали [41].
Бактериологическое исследование 150 образцов муки показало
наличие в некоторых пробах бактерий Bacillus cereus
(до 102 КОЕ/г), Clostridium perfringens и Staphylococcus aureus [41].
32
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1.4. Пути проникновения микроорганизмов в зерновую
массу
Инфицирование зерна фитопатогенными микроорганизмами происходит главным образом в период развития растения,
наиболее часто в период цветения [36]. Различают эмбриональную инфекцию, когда патогенный агент поражает какую-либо
часть зародыша, и экстраэмбриональную инфекцию, когда патогенный микроорганизм обнаруживается в других анатомических
частях зерновки: эндосперме, оболочках, перикарпии, перицветниках [36].
Микробная контаминация протекает на всех этапах жизненного цикла зерна: в поле, во время уборки, при транспортировке и хранении.
Основным источником микроорганизмов является почва,
а точнее ризосфера – прикорневая зона, богатая питательными
веществами [14]. Один грамм ризосферы содержит от 109 до
4·109 колониеобразующих единиц микроорганизмов [14]. В процессе вегетации микроорганизмы ризосферы переходят на зеленые части растений и семена.
В поле микроорганизмы часто попадают на зерно с ветром и насекомыми. На общее количество микроорганизмов
влияет строение зерна и характер его поверхности. Бородка, бороздка, шероховатые семенные и цветковые оболочки, характерные для зерен злаков, задерживают большое количество пыли и
соответственно микроорганизмов [14].
Механическая уборка, сопровождающаяся перемещениями больших масс пыли, существенно повышает уровень микробного загрязнения зернового сырья. В ходе машинной уборки
и послеуборочных операций возможно повреждение оболочек
зерна, что приводит к проникновению микроорганизмов вглубь
зерна [14].
Уровень микробной контаминации зернового сырья зависит от содержания минеральных примесей (песок, пыль, комочки почвы), испорченных зерен и семян сорных растений, содер33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
жащих в несколько сотен, а иногда и тысяч раз больше микроорганизмов по сравнению со здоровыми зернами [14].
Загрязнение зернового сырья микроорганизмами может
происходить при контакте с необработанными поверхностями
тары и транспортных средств во время доставки его на зернохранилища [14].
Разносчиками микроорганизмов при хранении зерна являются грызуны и насекомые, повреждающие семена, повышающие влажность зерновой массы и загрязняющие ее своими
экскрементами [39, 40]. Так, при поражении зерна клопом черепашкой поврежденная область зерновки отличается резко повышенной микробной обсемененностью [51].
1.5. Влияние микроорганизмов на качество зерна
Активное развитие сообщества микроорганизмов изменяет
биохимический состав зерен: уменьшается содержание крахмала
и белкового азота, накапливается аминный азот, органические кислоты и другие метаболиты, ухудшающие вкус, цвет и запах [41],
снижается всхожесть и энергия прорастания зерна [14, 52]. Большинство видов мицелиальных грибов в ходе своего развития образуют микотоксины [53, 54]. Зерно, загрязненное микотоксинами
становится непригодным для пищевых и кормовых целей [41, 53].
И хотя при использовании такого зерна в спиртовой промышленности микотоксины в ректификованном спирте не обнаруживаются [37, 52, 55], тем не менее их присутствие в сусле
может негативно сказаться на жизнеспособности дрожжей [47, 48]
и снизить выход спирта [46]. Токсические вещества накапливаются во всех элементах тела гриба (мицелии, конидиеносцах) их
содержание достигает максимума в период спорообразования, в
наибольших количествах токсины локализуются в репродуктивных органах [53]. Афлатоксины, продуцируемые грибом Aspergillus flavus, часто концентрируются в дробленых и поврежденных зернах, а также в сорной примеси. Афлатоксины стойки к
нагреванию, уровень их содержания в продуктах значительно
34
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
снижается лишь при нагревании до 150–300 ºС [56]. В.Л. Кретович показал, что спиртовые экстракты, выделенные из ядовитого
зерна и внесенные в бродильную среду, угнетали спиртовое
брожение и размножение дрожжей.
Жизнедеятельность микроорганизмов в зерновой массе
приводит к потерям в весе сухого вещества зерна. Размеры этих
потерь зависят от интенсивности и длительности воздействия
микроорганизмов на зерно. По некоторым далеко не полным
данным они составляют 1–2 % мирового производства зерна в
год, не считая финансовых потерь, связанных со снижением цен
на зерно низкого качества [37]. Потери в весе происходят в основном за счет углеводов. Общее количество азота остается неизменным, однако состав азотистых веществ претерпевает существенные изменения. В результате жизнедеятельности микроорганизмов уменьшается процент белкового азота, сильно увеличивается количество аминного и аммиачного азота [39, 40]. Высокая липолитическая активность плесневых грибов приводит к
накоплению в зерне большого количества продуктов распада
жиров. В испорченных зернах кислотное число жира всегда превышает норму [40].
По мере развития микроорганизмов в зерновой массе
происходит изменение органолептических показателей свежести
зерна. Установлено, что прежде всего наблюдается потеря блеска, появление пятен или потемнение зерна. По мере развития
микроорганизмов изменение цвета идет в следующей нарастающей последовательности: появление тусклых зерен, появление
пятнистых и потемневших зерен, появление колоний плесневых
грибов и бактерий, видимых невооруженным глазом, потемнение большого числа зерен, появление испорченных (прогнивших
или проплесневевших) зерен, появление обуглившихся зерен
или массы обуглившегося зерна черного цвета, потерявшей сыпучесть [14]. Обугливание зерна происходит на последних стадиях самосогревания. Микроорганизмы способствуют накоплению в зерне аминокислот, которые реагируют с углеводами и
дают темноокрашенные продукты – меланоидины, напоминаю35
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
щие гуминовые соединения почвы [14, 40]. Самосогреванием
зерновой массы называют явление повышения ее температуры
вследствие протекания в ней физиологических процессов и плохой теплопроводности. В зависимости от исходного состояния
зерновой массы и условий ее хранения в каком-либо участке насыпи температура может подниматься до 55–65 ºС, в редких случаях до 70–75 ºС [14]. Ведущая роль в процессах самосогревания
принадлежит микроорганизмам [39, 40], в особенности плесневым
грибам, обладающим огромной интенсивностью дыхания [39, 40].
Однако только 5–10 % освобождаемой плесневыми грибами из
потребляемых веществ энергии используется для синтетических
целей, остальная энергия в виде тепла выделяется в окружающую среду [39].
Большая часть запахов разложения, образующихся в зерновой массе при хранении, также является следствием развития
в ней микроорганизмов. Установлено, что плесневый и затхлый
запахи в зерне возникают в результате развития грибов. Плесневый запах наблюдается в случае, когда грибы в зерновой массе
активно размножаются. Если процесс развития грибов приостановить сушкой, активным вентилированием или другими способами, то плесневый запах не исчезает, а переходит в затхлый.
Затхлый запах очень стойкий и прочно удерживается зерном,
имеющим сорбционные свойства [14]. Компонентами плесневого запаха являются летучие органические вещества, среди которых преобладают восьмиуглеродные соединения 3-октанон, 1октанол, 1-октен-3-ол, 3-метил-1-бутанол [37, 57, 58], стирен, 2пентилфуран, 3-метиланизол, 2-(2-фурил)пентаналь, 2-этил-5метилфенол [57]. 1-октен-3-ол образуется в результате ферментативного разложения липидов [59]. В работе [60] показана способность плесневых грибов видов Penicillium farinosum, P. citrinum, P. camemberti, P. chrusogenum продуцировать при культивировании на солодовом сусле соединения, обладающие ярко
выраженным грибным (1-октен-3-ол) и плодовым (гексаналь, 2гексеналь) запахами. Авторы статьи предполагают, что предшественником данных соединений является линоленовая кислота,
36
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
так как ее добавление стимулировало накопление 1-октен-3-ола
и 2-гексеналя. Виды P. farinosum и P. citrinum образовывали
также геосмин – вещество с неприятным землисто-плесневым
запахом [60]. Penicillium aurantiogriseum при росте на овсе продуцирует 3-метилфуран, 1-пропанол, 2-метил-1-пропанол, 3метил-1-бутанол, 3-октен-2-ол, 1-октен-3-ол, уксусную кислоту
и сесквитерпены [58]. При анализе летучих метаболитов шести
видов плесневых грибов Penicillium brevicompactum, P. glabrum,
P. roqueforti, Aspergillus flavus, A. versicolor, и A. candidus было
установлено, что все они образуют примерно одинаковое количество 3-метилфурана независимо от вида и субстрата (овес,
пшеница) [59].
Кроме затхлого запаха при хранении зерна образуются и
другие: гнилостный, «амбарный» и «клещевый», связанные с
жизнедеятельностью микроорганизмов и насекомых. Гнилостный запах наблюдается только в случаях полной порчи зерна.
Появление «амбарного» запаха относится к влиянию анаэробных
процессов дыхания зерна. Этиловый спирт и промежуточные
продукты, образующиеся при таком дыхании, сорбируются зерновой массой и придают ей специфический запах. В образовании
«амбарного» запаха в зерне могут участвовать и дрожжи, при
анаэробном дыхании выделяющие спирт и другие летучие вещества [14]. В начале массового развития клещей появляется специфический приторный «клещевый» запах, который в ходе их
жизнедеятельности переходит в гнилостный [14].
В партиях головневого зерна пшеницы и ржи наблюдается «головневый» запах – запах триметиламина, который содержится в спорах мокрой головни [14].
Снижение посевных и товарных качеств зерна происходит в результате поражения зародышей [39]. Зародыш зерна
наиболее богат питательными веществами, гигроскопичен и
имеет большую влажность по сравнению с остальными частями
зерна. Зародыш покрыт сравнительно тонкой оболочкой и, менее
защищен от действия микроорганизмов, поэтому мицелиальные
грибы в первую очередь начинают развиваться на зародыше.
37
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Мицелий грибов разрушает ткани зародыша и угнетает его токсичными продуктами своей жизнедеятельности [14]. Снижение
всхожести зерна могут вызывать как полевые грибы Fusarium,
Helminthosporium, так и плесени хранения Aspergillus, Penicillium [39].
1.6. Способы снижения микробной обсемененности зернового
сырья
1.6.1. Механические способы
К механическим способам снижения микробной обсемененности зернового сырья относятся сухая и влажная очистка.
Известно, что повышенное содержание примесей в зерновой массе свидетельствует о значительном уровне ее микробной
контаминации. Проход через сито с диаметром отверстий 1 мм –
испорченные зерна, минеральный и органический сор – наиболее обсеменен микроорганизмами [14], поэтому целесообразным
считается применение сухой очистки зерна перед подачей на
производство.
Для удаления сорных и зерновых примесей применяют
различные машины. Принцип действия этих машин основан на
разделении зерновой массы на составные части по физикомеханическим свойствам и морфологическим признакам [1].
Примеси, отличающиеся от зерна данной культуры толщиной
(шириной) и аэродинамическими свойствами (парусностью), отделяют на воздушно-ситовом сепараторе. В очищенном зерне
содержание примесей не должно превышать 1 % [1].
С помощью сит зерно можно разделить только по толщине и ширине. Примеси, отличающиеся от зерен основной культуры по длине, выделяют на машинах, называемых триерами.
Рабочий орган триера – цилиндр или диск с ячейками, выбирающими из зерновой массы короткие частицы. В зависимости
от назначения различают два вида триеров: куколеотборники,
выделяющие из основной культуры половинки зерен и шаро38
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
видные примеси, например семена куколя; овсюгоотборники,
выделяющие зерно основной культуры, например ячменя, ржи,
из смеси его с длинными зернами овса и овсюга [1].
С помощью целенаправленных технологических операций (удаление примесей, аспирация, сортировка и обоечный
процесс) на первом этапе зерноочистки можно удалить до 70 %
бактерий. Чем больше сепарировано щуплого, битого, мелкого
зерна и пыли, тем выше эффект обеззараживания [61].
Удаление из зерна макропримесей значительно улучшает
показатели качества сырья. Однако находящиеся на поверхности
основной культуры микропримеси (микробиологические и химические) лишь частично удаляются с использованием методов,
предназначенных для выделения из обрабатываемой массы зерновых и сорных примесей [3].
Для удаления пыли, грязи и примесей, отличающихся
удельным весом (песка, гальки, щуплых и изъеденных зерен, семян сорных растений), в мукомольной промышленности широко
применяется мокрый способ очистки зерна [23]. При промывке с
поверхности зерна удаляются плесневые грибы и бактерии [23].
Споры мокрой головни и склероции спорыньи могут быть удалены только при мойке [23]. Мокрый способ очистки с технологической точки зрения считается более совершенным. Так, если
при поступлении на мойку количество бактерий на 1 г зерна было равно 10·109, то при подаче на щетку оно уменьшилось до
3·109, то есть в 3,3 раза. Этот показатель в зависимости от образца зерна может изменяться в пределах 1,85–4,00 раза. Об эффекте мойки зерна можно судить и по бактериальной насыщенности
моечных вод до и после его обработки. Общее количество микроорганизмов в 1 мл воды до и после мойки зерна увеличивалось
для различных образцов зерен на 2,9·105–4,7·106 КОЕ. При этом
количество споровых бактерий повысилось в 900 раз, плесеней –
в 500 раз, гнилостных бактерий – приблизительно в 1000 раз.
Эффект мойки значительно возрастает при использовании стерильной воды или воды с добавлением антисептиков. Существенное влияние на качество работы моечных машин оказывает
39
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
температура воды. Так, повышение температуры воды до 40 ºС и
подогрев зерна до мойки способствуют лучшему отмыванию поверхности зерна [23].
В работе [3] для снижения микробной обсемененности
предложен способ последовательной обработки зерна, включающий мойку и пропаривание. При этом в процессе мойки
происходит очистка поверхности бороздок зерна от определенной части приставшей пыли и микроорганизмов, из зерновой
массы выводятся примеси, отличающиеся от него гидродинамическими свойствами, а последующее пропаривание в течение
6–8 минут обеспечивает значительное, примерно на 96 %, снижение уровня обсемененности проб. Известен метод мойки зерна с гашеной известью [1]. Хотя известь мало действует на микроорганизмы, тем не менее она вследствие щелочной реакции
хорошо растворяет слизь на поверхности зерна и тем самым способствует при промывке удалению спор, находящихся в этой
слизи.
1.6.2. Физические способы
К физическим способам снижения микробной обсемененности относятся сушка, охлаждение, УФ-лучи, токи СВЧ, ионизирующее облучение, инфракрасное облучение зерна.
Среди физических методов снижения микробной обсемененности зернового сырья широко распространена сушка [62]. В
процессе сушки происходит удаление свободной влаги, в результате чего замедляются обмен веществ в клетках микроорганизмов и их развитие.
Обычно влагу удаляют одним из следующих приемов: 1)
применением в качестве агента сушки нагретого воздуха или
смеси топочных газов с воздухом; этот метод сушки получил
название теплового; 2) обогреванием зерновой массы солнечными лучами (метод солнечной сушки, по своей природе тоже является тепловым); 3) использованием сухого воздуха атмосферы,
то есть воздуха с низкой относительной влажностью (метод воз40
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
душной сушки). Тепловая сушка партий зерна в зерносушилках
не оказывает существенного стерилизующего действия, то есть
не приводит к массовой гибели микроорганизмов. В результате
тепловой сушки происходят лишь некоторые изменения в количественном и качественном составе микробиоты и ее состоянии.
Эти изменения зависят от исходной влажности зерна, состояния
самой микробиоты (наличия вегетативных клеток или спор),
температуры агента сушки, температуры и продолжительности
нагревания зерновой массы [14].
Иные результаты получаются в процессе тепловой сушки
зерновых масс, в которых наблюдается активное развитие микроорганизмов и самосогревание. В этих случаях обильно развившаяся микробиота в значительной степени подвергается
действию агента сушки, наблюдается значительное снижение
общей численности микроорганизмов, в том числе плесневых
грибов [14].
Установлено, что значения летальных для внутренней
микробиоты температур находятся в обратной зависимости от
начальной влажности зерна. Если в зерне влажностью 10–11 %
микробиота полностью отмирает при температуре 80–85 ºС, то в
зерне влажностью 22, 28 и 32 % при 65, 60 и 55 ºС соответственно, то есть чем быстрее и при более высоких температурах вести
сушку зерна, тем более резко будут нарушаться процессы метаболизма в клетках микроорганизмов и тем быстрее они будут
отмирать [14].
При сушке зерна в пневмогазовых сушилках, когда температура агента сушки достигает 400–600 °C и более, наблюдается заметное снижение численности микробиоты даже в зерне с
влажностью порядка 16 %. По данным ВНИИЗ, в таком зерне
количество бактерий по сравнению с первоначальным снижалось в 3 раза, а плесневых грибов в 7–8 раз. В процессе сушки в
газовой рециркуляционной сушилке ДСП-50 зерно, находясь во
взвешенном состоянии, периодически подвергается кратковременному действию высоких температур (до 300–350 ºС), получаемых от агента сушки [14]. Снижение числа микроорганизмов
41
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
при таких способах происходит не только в результате действия
высоких температур, но главным образом и оттого, что споры и
клетки микробов уносятся с поверхности зерна потоками горячей газовоздушной смеси [14].
В процессе солнечной сушки в результате ультрафиолетового облучения происходит частичная стерилизация зерновой
массы. Снижение численности микробиоты может достигать
20–40 %. При этом солнечные лучи оказывают избирательное
действие на отдельные виды грибов. Полевые грибы имеющие
пигментированный мицелий практически не подвержены действию солнечного облучения, в отличие от плесеней хранения,
мицелий которых не окрашен. По наблюдениям О.П. Подъяпольской после солнечной сушки не выявлялись грибы из родов
Aspergillus и Penicillium, то есть наиболее нежелательные грибы
при хранении. При этом в процессе сушки не погибали менее
опасные для хранения роды: Dematium, Cladosporium, Alternaria
и дрожжи [14].
С целью снижения активности микроорганизмов в условиях, когда невозможно проведение сушки зерна, применяется
его охлаждение. Хранению зерновых масс в охлажденном состоянии способствует их плохая теплопроводность. Данный способ является надежным средством, обеспечивающим сокращение потерь зерна, он основан на чувствительности всех живых
компонентов зерновой массы к пониженным температурам.
Жизнедеятельность семян основной культуры, семян сорных
растений, микроорганизмов, насекомых и клещей при пониженных температурах резко снижается или приостанавливается совсем [14].
Одним из способов консервации и стерилизации зерновых масс является применение различных излучений, то есть лучевой или холодной стерилизации. Установлено, что все известные излучения (инфракрасные, ультрафиолетовые, рентгеновские и гамма-лучи) в той или иной степени действуют на микробиоту зерновой массы, находящихся в ней клещей и насекомых,
а также на жизнеспособность зерна. Эффект стерилизации и уг42
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нетающего действия на зерно зависит от рода применяемых лучей, дозы облучения и состояния зерновой массы. Наибольшим
стерилизующим эффектом обладают бета- и гамма-лучи. Отдельные группы микроорганизмов проявляют различную устойчивость к ионизирующим излучениям. Наиболее устойчивы к
воздействию этих излучений грибы. В целом при воздействии на
пшеницу рентгеновскими и гамма-лучами происходит снижение
численности микроорганизмов. Отмечено также, что с увеличением дозы облучения понижается интенсивность дыхания зерна
и отделенных от него зародышей.
В настоящее время активно разрабатываются способы
снижения микробной обсемененности зернового сырья посредством воздействия на него инфракрасными лучами. При этом
обработка зерна ИК-лучами приводит к практически полной его
стерилизации [6, 63]. Стерилизующее действие ИК-излучения
основано на изменении кинетики биохимических реакций под
воздействием тепла и внешнего электрического поля.
Обработка пивоваренного ячменя ультразвуком при частоте 29,5 кГц повышала способность зерен к прорастанию и
снижала количество патогенной микробиоты. Полностью устранялся мицелиальный гриб Mucor chiemales, снижалась обсемененность грибами Aspergillus candidus и Trichoderma albius [64].
Перспективным способом снижения микробной обсемененности зерна является использование СВЧ-энергии. Снижение
содержания микроорганизмов обусловлено высокой скоростью
нарастания их температуры при воздействии СВЧ (за 1 с она повышается на несколько градусов, причем нагрев идет во всем
объеме организма). Гибель микробиоты происходит в результате
денатурации белка либо за счет диэлектрического разрушения
клеток. Однако эффект 100 % обеззараживания зерна достигается лишь при достаточно высоких температурах (76–100 °С), что
приводит к разрушению белков клейковины [6]. Г.Н. Лысовым
предлагается способ, включающий формирование в разрядной
камере рециркулирующего газового потока, ввод СВЧ-энергии в
43
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
эту камеру с созданием плазмы в объеме камеры и пропускание
через эту камеру обрабатываемого зерна [65].
К электрофизическим способам снижения микробной
контаминации следует отнести обработку зернового сырья в
электростатическом поле высокой напряженности. В процессе
данной обработки зараженность семян корневой гнилью снижалась в два и более раз, что позволило повысить урожайность от
0,3 до 5,3 ц/га [66].
1.6.3. Обработка соединениями антимикробного и
микробостатического действия
При обработке зерновой массы соединениями антимикробной природы обычно могут преследоваться две цели: консервирование и обеззараживание.
Под химическим консервированием понимают направленное замедление жизненных функций отдельных компонентов
зерновой массы при хранении посредством обработки ее различными химическими средствами.
Химическое обеззараживание представляет собой обработку зерновой массы химическими соединениями с целью полного уничтожения микроорганизмов и вредителей.
Для снижения микробной обсемененности зернового сырья используют формалин, органические кислоты и их соли, неорганические соединения, пестициды и др.
Различают антимикробную обработку зерна при хранении, перед посевом и перед пуском на производство. В зависимости о поставленной цели изменяются и требования, предъявляемые к действующим веществам.
При проведении предпосевной обработки используются
хлорпикрин, ТМДТ, пестициды. Введение хлорпикрина в зерновую массу позволяет в короткий срок ликвидировать процесс ее
самосогревания. В малых концентрациях хлорпикрин не влияет
на продовольственные качества зерна, хорошо удерживается в
зерновой массе и предупреждает развитие вредителей. Дихлорэ44
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
тан хорошо подавляет жизнедеятельность плесневых грибов, однако его пары не останавливают самосогревание. Тиомочевина и
8-оксихинолинсульфат вызывают полное угнетение микробиоты
и в значительной степени зерна пшеницы, но при использовании
тиомочевины в количестве 1 % от веса зерна тиомочевина эффективно действует на плесневые грибы, а при влажности зерна
до 24,3 % не влияет на его жизнеспособность. Несмотря на некоторые положительные результаты, фумиганты являются сильнодействующими токсичными веществами, вступают в химическое
взаимодействие с белками, липидами, углеводами, витаминами
зерна, в результате чего возникают нежелательные и необратимые изменения [14].
С целью промежуточной консервации зерна применяют
способы хранения в условиях недостатка кислорода – в герметичных хранилищах, регулируемой газовой среде (РГС), атмосфере азота и СО2. При хранении зерна в герметичных условиях
и в газовых средах основную консервирующую роль играет недостаток кислорода. Отсутствие конидий при развитии мицелиальных грибов в герметично закрытых сосудах наблюдается при
недостатке кислорода, накоплении летучих токсичных продуктов обмена и углекислоты, неблагоприятных влажностных и
температурных параметрах. В условиях недостатка кислорода
аэробная и факультативно-аэробная микробиота зерновой массы
прекращает активное развитие, но не отмирает. По данным
Т.А. Смирновой, в герметичных сосудах на зерне наблюдалось
развитие преимущественно стерильного мицелия и дрожжевых
грибов [14]. Производственные опыты по хранению зерна пшеницы в герметичных башнях показали, что зерно с влажностью
не более 20 % в течение 6,5–7,5 месяцев сохраняет светлый цвет
и приятный запах. Пищевые и фуражные достоинства, а также
нормальный цвет, запах, сыпучесть сохраняются при герметичном хранении лишь у зерна влажностью не более 16–17 %. Высоковлажное зерно быстро приобретает солодовый запах, а иногда горький вкус, неустранимые при последующей сушке и вентилировании [14].
45
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Так как необходимый недостаток кислорода в герметичных емкостях достигается лишь спустя некоторое время, в течение которого возможно протекание микробиологических процессов, для лучшего сохранения качества зерна применяют искусственные газовые среды. В настоящее время применяют РГС,
представляющую смесь азота, углекислого газа с минимальным
содержанием кислорода. При хранении зерна с различной влажностью в герметичных условиях в РГС с содержанием кислорода
от 1 до 15 %, N2 = 100 % и СО2 = 100 % интенсивность развития
микроорганизмов находится в прямой зависимости от содержания влаги в зерне и кислорода в РГС. Микробиологический анализ зерна влажностью 15,5–19,0 %, хранившегося в РГС с 1–3 %
кислорода, показал наличие как в составе поверхностной, так и
внутренней микробиоты, слаборазвитых колоний стерильного
мицелия плесеней хранения. На зерне влажностью 22 и 25 % независимо от содержания кислорода наблюдалось развитие
дрожжей рода Candida и молочнокислых бактерий. В сосудах с
содержанием кислорода от 1 до 7 % отмечено слеживание зерна,
образование белого налета и неприятного кисловато-солодового
запаха [14].
С целью обеззараживания зерна пшеницы предложен
способ замачивания зерна в течение 1–2 ч в анолитной фракции
электрохимически обработанного раствора хлорида натрия с
рН 2,0–2,5; ОВП 1000–1180 мВ и содержанием активного хлора
0,03–0,05 % [67].
Бактерицидные свойства анолита связаны с наличием так
называемого «активного» хлора, выделяющегося в раствор в
процессе электролиза, и вторичных продуктов электролиза –
хлорноватистой кислоты и гипохлорита натрия. Анолит при
концентрации «активного» хлора 0,03 % (300 мг/л) вызывает необратимое повреждение клеточных стенок большинства микроорганизмов уже через 1 мин [68]. При нормальных условиях и
рН 2,0 в растворе преобладают хлорноватистая кислота и свободный хлор [67].
46
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В связи с тем, что использование хлорсодержащих препаратов в пищевой промышленности нежелательно, предусмотрена операция удаления хлора путем промывания обработанного
зерна питьевой водой. Обнаружено уменьшение количества
внешней микробиоты в 100 раз [67].
Сотрудниками Московского государственного университета пищевых производств показана возможность применения
анолита для снижения микробной обсемененности и улучшения
качества пивоваренных ячменей [68]. Анолит при концентрации
активного хлора 644 мг/л при 30-минутной обработке уничтожал
до 96 % внешней микробиоты ячменя, а раствор перманганата
калия, приготовленный на анолите, уже при 15-минутном воздействии сокращал внешнюю микробиоту на 80 %, внутреннюю – до
31 %. Обработка ячменя плохого качества анолитом приводила к
увеличению энергии его прорастания до 108 % [68].
Для консервирования влажного зерна широко применяют
низкомолекулярные органические кислоты (пропионовую, уксусную, муравьиную, сорбиновую) и их смеси в различных соотношениях. Использование органических кислот связано с их
высокой фунгицидной активностью и незначительной токсичностью для человека и животных. Преимущество консервации с
помощью кислот – это возможность длительного хранения
влажного зерна после обработки в обычных негерметизированных силосах [14]. В результате обработки зерна органическими
кислотами происходит резкое снижение, а часто и полное отмирание внешней и внутренней микробиоты и абсолютная потеря
всхожести [14]. Наиболее активным фунгицидным действием
обладает сорбиновая кислота, немного меньше пропионовая,
фунгицидное действие уксусной почти не проявляется [14].
Губительное действие на микробную клетку и, в частности, фунгицидная активность слабо диссоциирующих органических кислот зависит не от рН и титруемой кислотности, а от индивидуальных антимикробных свойств кислот и разной степени
токсичности их недиссоциированных молекул. Более эффективное фунгицидное действие сорбиновой кислоты по сравнению с
47
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пропионовой обусловлено наличием в ее молекуле двойных связей [14].
Однако в настоящее время для консервации зерна и кормовых продуктов используют главным образом пропионовую
кислоту. Эта кислота дешевле, чем сорбиновая, легко растворима в воде. Процесс пропионовокислого брожения, основным
продуктом которого является пропионовая кислота, представляет собой комбинацию молочнокислого и спиртового брожения
(естественных процессов, постоянно протекающих в пищеварительном тракте животных) [14].
Для обеззараживания зерна, взятого сразу после обмолота
и инфицированного преимущественно полевыми грибами, достаточны дозы кислоты, не превышающие 0,5 %. Для зерна, зараженного десятками тысяч плесеней хранения, необходимы более высокие концентрации [14].
Консервирующий эффект органических кислот должен
определяться по степени их фунгицидного действия на наиболее
устойчивую и нежелательную микробиоту зерна – грибы из
группы плесеней хранения. Решающую роль в данном случае
играет исходная количественная обсемененность зерна плесневыми грибами. Консервация трех образцов зерна пшеницы влажностью 22 %, но в разной степени обсемененных плесенями хранения, показала, что в образце с исходным числом грибов около
2 тыс. на 1 г спустя 60 мин после обработки 0,5 % раствором
пропионовой кислоты зерно оказалось стерильным и сохраняло
стерильность до 30 суток. Зерно, имевшее признаки плесневения
и обсемененности микроорганизмами численностью 208 тыс. на
1 г, после обработки 0,8 % раствором пропионовой кислоты осталось практически стерильным, однако приобретало при этом
черный цвет и горький вкус [14].
Наименее устойчивы к действию кислот полевые грибы
(роды Alternaria, Helminthosporium, Fusarium), а также зигомицеты. Указанные грибы полностью отмирают в течение 60 мин
после обработки зерна растворами пропионовой и сорбиновой
кислот в концентрации от 0,2 % и более к массе зерна. Более вы48
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
сокая устойчивость к действию кислот обнаружена у плесеней
хранения, особенно у грибов рода Aspergillus [14].
Существуют различные варианты использования органических кислот для консервации зерна.
В патенте [69] описан способ подготовки зерна к хранению, предусматривающий добавление в пропионовую кислоту
0,1–0,01 % по массе арахидоновой и/или эйкозапентаеновой кислоты и/или их низших алкиловых эфиров и обработку зерна полученной смесью до образования пленки на поверхности каждой
зерновки. В качестве источника хитозана, арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот предлагается использовать препарат, полученный посредством экстрагирования биомассы микромицета
Mortierella humilis [70].
В патенте [71] предложен способ консервации свежеубранного зерна, включающий создание потока зерна в виде падающего дождя, распыление пропионовой кислоты бескислородным газом-носителем с созданием потока аэрозоля и контактирование зерна и аэрозоля в противопотоке, в качестве газаносителя используют азот. Возможно также растворение хитозана в пропионовой кислоте перед ее распылением. Воздействие
на зерно указанными веществами повышает надежность его хранения за счет биохимических изменений в зерне, нарушающих
трофическую связь с фитопатогенной микробиотой.
Патент [72] предусматривает разбавление пропионовой
кислоты анолитом и нанесение полученного раствора на зерно.
В качестве нетрадиционных средств, применяемых для
снижения микробной обсемененности зерна, можно отметить
замачивание его в водных отварах деревьев, кустарников и трав
с целью повышения пищевой безопасности зернового хлеба [73].
При замачивании зерна в отварах черноплодной рябины и рябины обыкновенной число колоний мезофильно-аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (МАФАМ) уменьшилось на 66,7 и 61,6 %, спорообразующих бактерий – на 87,9 и
79,2 %, плесневых грибов и дрожжей – на 57,0 и 44,8 % соответственно по сравнению с контрольным вариантом. Внесение 5 %
49
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пюре из рябины обыкновенной, облепихи и калины в воду, используемую для замачивания зерна, способствовало подавлению
жизнедеятельности ряда микроорганизмов золотистого стафилококка, кишечной и картофельной палочки. Антимикробное действие проявили по отношению к микроорганизмам зерна отвары
из композиций: шалфей, мята, рябина обыкновенная и шалфей,
зверобой, рябина обыкновенная в соотношениях 3:3:4, а также
хмелевой отвар, который показал наиболее эффективный результат в подавлении роста и развития МАФАМ, спорообразующих бактерий и плесневых грибов. Полученный эффект объясняется присутствием веществ с выраженным фитонцидным и
бактерицидным действием [73]. В данной работе исследовались
также отвары и экстракты лекарственных трав (шалфей, ромашка, зверобой, мята) и чеснока. Наибольшей антимикробной активностью обладали зверобой, мята, чеснок. Остальные отвары и
экстракты трав оказались малоактивными [73].
Для дезинфекции семян используют пероксид водорода.
Стерилизующее действие пероксида водорода изменяется в зависимости от характера оболочки семян и вида микроорганизмов. Установлено, что семена злаков можно полностью или
частично стерилизовать 15–30 % растворами пероксида водорода [22]. Шероховатые семена, покрытые шелухой или слипшиеся в комки, труднее или даже совсем невозможно стерилизовать. Те виды обработки, которые благоприятствуют прониканию раствора пероксида водорода в семена, снижают их всхожесть. Для дезинфекции зерна, зараженного головней, при длительности контакта 5 минут требовались растворы пероксида
водорода примерно 20 % концентрации; в этом случае, однако,
немного снижалась всхожесть [22].
Исследована возможность применения озона и пероксида
водорода для дезинфекции ячменя, используемого для производства солода и контаминированного грибами рода Fusarium.
Показано, что при обработке озоном в концентрации 11 и 26 мг/г
в течение 15 минут наблюдается снижение выживаемости Fusarium на 24–36 %, а после 30 минут данной обработки значитель50
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
но уменьшалась энергия прорастания зараженного ячменя. На
энергию прорастания здорового ячменя обработка озоном влияния не оказывала. Обработка зерна растворами пероксида водорода в концентрации 5, 10 и 15 % уже при 5-минутной экспозиции вызвала снижение выживаемости Fusarium на 50–98 % и не
влияла на энергию прорастания [74].
Применение пероксида водорода для снижения микробной контаминации пищевого сырья перспективно в силу
ряда его преимуществ: неспецифичность действия, хорошая
растворимость в воде, относительно низкая стоимость, отсутствие загрязнения обрабатываемого вещества продуктами разложения и т.д.
Нами было исследовано влияние водных растворов пероксида водорода (0,5 %, 1,0 %, 2,0 % и 3,0 % мас.) и перманганата калия (0,05 %, 0,1 % и 0,5 % мас.) на микробную обсемененность пшеницы и ржи. При выборе концентраций дезинфектантов руководствовались данными литературных источников.
Пероксид водорода в концентрации 3,0 % мас. широко применяется в медицине [75], а перманганат калия в концентрации
0,05 % мас. используют на пивоваренных заводах для обеззараживания солода [76].
Данные о влиянии пероксида водорода и перманганата
калия на поверхностную микробиоту зерна представлены на
рис. 2 и 3.
Эксперименты показали, что все исследуемые концентрации пероксида водорода эффективно подавляли поверхностную
микробиоту зерен пшеницы и ржи. При обработке зерна 2,0 % и
3,0 % мас. растворами Н2О2 после первых 7 мин экспозиции выживаемость микроорганизмов составила менее 10 %. Увеличение времени выдержки зерна в растворах пероксида водорода
приводило к снижению выживаемости поверхностной микробиоты до 0 %. Для раствора с минимальной концентрацией пероксида водорода (0,5 % мас.) время, необходимое для полного
подавления микроорганизмов, составило 120 мин.
51
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ðî æ ü
Âû æè âàåì î ñòü, %
Ï ø åí è ö à
100
100
80
80
0,5 % Í 2 Î
60
1,0 % Í 2 Î
2,0 % Í 2 Î
3,0 % Í 2 Î
40
0,5 % Í 2 Î
2
1,0 % Í 2 Î
2
2
2,0 % Í 2 Î
2
2
3,0 % Í 2 Î
2
2
2
20
0
60
40
20
0
20
40
60
80 100 120
0
0
20
40
60
80 100 120
Ï ð î äî ë æ è òåë üí î ñòü î áð àáî òê è , ì è í
Рис. 2. Выживаемость поверхностной микробиоты зерна
в процессе обработки различными концентрациями
пероксида водорода
Âû æè âàåì î ñòü, %
Ï ø åí è ö à
Ðî æü
100
100
80
80
0,05 % KM nO 4
60
0,05 % KM nO 4
60
0,10 % KM nO 4
0,10 % KM nO 4
0,50 % KM nO 4
40
20
0,50 % KM nO 4
40
20
0
0
0
20
40
60
80
100 120
0
20
40
60
80
100 120
Ï ð î äî ë æè òåë üí î ñòü î áð àáî òê è , ì è í
Рис. 3. Выживаемость поверхностной микробиоты зерна
в процессе обработки различными концентрациями
перманганата калия
52
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Растворы перманганата калия обладали менее выраженным антимикробным действием. При выдержке зерна в
0,05 % мас. растворе KMnO4, применяемом на пивоваренных
заводах, в течение 120 мин выживаемость поверхностной микробиоты снижалась до 16 и 20 % для ржи и пшеницы соответственно. При повышении концентрации KMnO4 наблюдалось
снижение выживаемости микроорганизмов, но ни один из исследованных растворов не обеспечивал 100 % эффект (рис. 3).
Несмотря на выявленное антимикробное действие в отношении поверхностной микробиоты, растворы Н2О2 и KMnO4
не оказали значительного влияния на внутреннюю микробиоту
зерна (рис. 4, 5).
Некоторое снижение микробной контаминации зерен наблюдалось лишь при применении высоких концентраций действующих веществ. Так, содержание обеззараженных зерновок после 120 мин обработки 3,0 % раствором Н2О2 увеличивалось с
нуля до 29 % и 44 % для пшеницы и ржи соответственно, в основном за счет снижения бактериальной контаминации (рис. 4).
Обработка 0,5 % раствором перманганата калия давала
13 % и 15 % обеззараженных зерновок для ржи и пшеницы соответственно также за счет снижения численности бактерий (рис.
5). Из литературных данных известно, что плесневые грибы обладают большей устойчивостью к действию активных форм кислорода, к которым относится пероксид водорода, по сравнению
с бактериями. Так, летальная концентрация Н2О2 для клеток
Penicillium piceum F-648 в стационарной фазе роста составила
40 мМ (≈ 0,136 %) [77], в то время как выживаемость вегетативных клеток Bacillus subtilis после 20-минутной обработки
1 мМ (≈ 0,0034 %) раствором Н2О2 составила только 5 % [78].
Высокая устойчивость внутренней микробиоты к действию дезинфицирующих растворов, по всей видимости, обусловлена низкой скоростью их диффузии вглубь зерна и особенностями строения семенных оболочек.
Действие пероксида водорода может также тормозиться
тем, что при его разложении на поверхности зерен образуется
53
100%
80%
60%
40%
20%
3
2
1
0,5
0
(контроль)
3
2
0,5
1
0%
0
(контроль)
Зараженность, %
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Пшеница
Рожь
Концентрация пероксида водорода, %
микромицеты
МАФАнМ
обеззараженные зерна
Рис. 4. Действие пероксида водорода на внутреннюю
микробиоту зерна (обработка 120 мин)
80%
60%
40%
Пшеница
0,5
0,1
0,05
0
(контроль)
0,5
0,1
0%
0,05
20%
0
(контроль)
Зараженность, %
100%
Рожь
Концентрация перманганата калия, %
микромицеты
МАФАнМ
обеззараженные зерна
Рис. 5. Действие растворов перманганата калия на внутреннюю
микробиоту зерна (обработка 120 мин)
54
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
множество мельчайших пузырьков выделяющегося кислорода,
которые, вероятно, играют роль газового барьера и препятствуют дальнейшему проникновению Н2О2 вглубь зерна. Это предположение косвенно подтверждается различиями в изменении
влажности зерна в процессе обработки дистиллированной водой
и пероксидом водорода (рис. 6, 7).
Вид полученных кривых наглядно демонстрирует, что
зерно, выдержанное в растворе пероксида водорода, поглощает
меньшее количество воды, чем зерно, обработанное дистиллированной водой.
В первые 15-20 мин выдержки зерна в воде или растворе
пероксида водорода, влажность его резко возрастала. Увеличение времени обработки зерна приводило к постепенному снижению количества поглощенной влаги в единицу времени.
Из литературных источников известно, что вода проникает в зерно в первую очередь и главным образом через зародыш и
бороздку. Первоначально вода насыщает плодовые оболочки,
полная влагоемкость которых обеспечивает скачкообразное повышение влажности зерна примерно на 4 % в течение короткого
отрезка времени. Вода накапливается в пустотелых омертвевших
клетках и в области деградировавшего слоя трубчатых клеток.
Данная влага связана слабо и при изменении внешних условий
легко испаряется. Более прочное удерживание воды в зерне
обеспечивается благодаря высокой гидрофильности тканей семенной оболочки, алейронового слоя и зародыша. В данных
анатомических частях вода задерживается на время, вероятно,
необходимое для активации ферментного комплекса, после
чего создаются условия для проникновения воды вглубь эндосперма [25, 27].
Проведенный сравнительный анализ показал, что растворы пероксида водорода снижают микробную контаминацию
зернового сырья эффективнее, чем растворы перманганата калия. Минимальная исследованная концентрация пероксида водорода (0,5 % мас.) снижала выживаемость поверхностной микробиоты зерна до 0 % за 120 мин обработки, а в случае с перман55
Влажность, %
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
0
10
20
30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Продолжительность обработки, мин
дистиллированная вода
3 % пероксид водорода
Влажность, %
Рис. 6. Изменение влажности зерна пшеницы
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 110 120
Продолжительность обработки, мин
дистиллированная вода
3 % пероксид водорода
Рис. 7. Изменение влажности зерна ржи
56
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Выживаемость, %
ганатом калия при аналогичных условиях обработки (концентрация KMnO4 – 0,5 % мас., продолжительность обработки –
120 мин), выживаемость поверхностной микробиоты зерна составляла порядка 4 % [79]. Дополнительными преимуществами
обработки зерна пероксидом водорода является то, что он не загрязняет зерно продуктами своего разложения и не обладает окрашивающей способностью [21, 22].
Несмотря на то, что растворы пероксида водорода проявляли слабо выраженное действие на внутреннюю микробиоту
зерна, использование Н2О2 для обеззараживания зерна представляется целесообразным. Исходя из данных табл. 5, на основании
разности количественного содержания микроорганизмов в измельченных зернах и смывах с них можно предположить, что
доля внутренней микробиоты в общей численности микроорганизмов исследуемых партий зерна невелика и составляет примерно 5–20 %. Микробная контаминация измельченных зерен,
предварительно выдержанных в 3 % растворе Н2О2 уже после
30 мин обработки снижалась со 100 % до 8 % и 12 % для ржи и
пшеницы соответственно, а после 120 мин обработки выживаемость микроорганизмов составила лишь 1–1,2 % (рис. 8) [79].
14
12
10
8
6
4
2
0
30
60
90
120
Продолжительность обработки, мин
Пшеница
Рожь
Рис. 8. Выживаемость микроорганизмов исследуемых зерен в
процессе обработки 3 % раствором пероксида водорода
57
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что обработка зерна 3 % раствором пероксида водорода в
течение 120 мин позволяет эффективно снижать его микробную контаминацию.
На основании данного заключения дальнейшие исследования по изучению влияния процесса обеззараживания зернового сырья на основные показатели производства спирта проводились после обработки зерна раствором пероксида водорода
концентрацией 3 % мас. в течение 120 мин [79].
58
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. ПЕРОКСИД ВОДОРОДА
2.1. Физические и химические свойства
Безводный пероксид водорода представляет собой бесцветную, вязкую жидкость, смешивающуюся с водой в любых
соотношениях. Пероксид водорода является слабой кислотой и
диссоциирует на ионы Н+ и ООН- [21]. Он широко применяется
в медицине, пищевой, целлюлозно-бумажной, косметической
отраслях промышленности в качестве антисептика и отбеливающего вещества [21, 22, 75]. По физическим свойствам он напоминает воду. Пероксид водорода и его растворы представляют
собой превосходные ионизирующие растворители.
Химические реакции, протекающие с участием пероксида
водорода, можно разделить на несколько групп:
1) процессы разложения согласно уравнению
2Н2О2→2Н2О+О2;
(1)
в начальный период изучения свойств пероксида водорода эта
реакция трактовалась как саморазложение пероксида водорода,
но впоследствии было установлено, что самопроизвольное протекание данной реакции возможно лишь под действием высоких
температур в паровой фазе, а в остальных случаях реакция разложения происходит под действием другого вещества, которое
либо остается в неизменном виде, либо его изменение не носит
стехиометрического характера [22];
2) реакции окисления или восстановления, в ходе протекания, которых кислород молекулы пероксида водорода и второе
реагирующее вещество изменяют свои валентности:
окисление:
Н2О2 + 2Fe2+ + 2H+→2Fe3+ + 2H2O;
59
(2)
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
(в кислых растворах окисление пероксидом водорода протекает
медленно, в щелочных – быстро);
восстановление:
2KMnO4 + 5H2O + 3H2SO4→2MnSO4 + K2SO4 + 8H2O + 5O2; (3)
3) перенос перекисной группы, при этом изменения валентности кислорода не происходит:
Н2О2 +Ва(ОН)2→ВаО2 + 2Н2О;
(4)
при действии концентрированной Н2О2 на серную, уксусную и
другие кислоты образуются мононадкислоты, в которых одна
гидроксильная группа замещена группой ─ООН:
СН3СООН + НООН↔СН3СОООН + Н2О;
(5)
4) образование аддитивных соединений, при этом происходит присоединение молекулы пероксида водорода как целого
к другой молекуле с образованием пероксогидратов [22]:
3Н2О2 + 2Na2CO3→2Na2CO3·3H2O2;
(6)
В силу своего кислотного характера пероксид водорода
присоединяется к основаниям, в особенности к перекисям щелочных и щелочноземельных металлов [21].
С точки зрения дезинфекции наибольший интерес представляет реакция разложения пероксида водорода:
Н2О2→Н2О + 1/2О2 + 23450 кал.
(7)
При разложении пероксида водорода выделяется значительное количество тепла. Существует несколько механизмов
разложения пероксида водорода в водной среде: радикальноцепной, ион-молекулярный, а также гетерогенно-каталитический
60
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
на поверхности реактора [80]. Пероксид водорода склонен к самопроизвольному разложению на воду и кислород, однако мнение, что он является нестойким соединением ошибочно. Современные методы получения Н2О2 электрохимическим способом,
позволяют вырабатывать высокочистый продукт, не содержащий вредных каталитических примесей. Повышению стойкости
Н2О2 способствует также добавление различных стабилизаторов [21].
В качестве стабилизаторов используют:
1) кислоты – устойчивость раствора Н2О2 повышается,
если в нем поддерживать кислую реакцию, при добавлении кислот понижается степень диссоциации Н2О2, что, вероятно, обусловливает его стабильность;
2) неорганические соединения: соли фосфорной кислоты
(дифосфат натрия, однозамещенный фосфорнокислый натрий),
соли щелочноземельных металлов, для стабилизации щелочных
растворов Н2О2 применяют силикат натрия (жидкое стекло);
3) органические соединения также способны оказывать
более или менее выраженное стабилизирующее действие на растворы Н2О2 в течение короткого промежутка времени до 6 месяцев, при более длительных сроках хранения происходит их
окисление и полная деградация. Органические стабилизаторы
Н2О2 очень разнообразны. Это фенол, салициловая кислота, хинин, этанол, ацетанилид, гуммиарабаик, амилаза, декстрины,
гликоген, сухой пшеничный крахмал, резорцин, глюкоза, анилин, желатин, лецитиновый экстракт из куриного желтка, протеины (казеин, кератин, глютенин, глиадин, альбумин) [22].
Существует несколько гипотез, объясняющих механизмы
стабилизирующего действия различных веществ. Образование
стойких адсорбционных или перекисных соединений, некоторые
вещества образуют также нерастворимые защитные пленки на
поверхности каталитически активных частиц, являясь тем самым
катализаторными ядами. Защитные коллоиды (желатин, гуммиарабик, яичный белок, декстрины, крахмал) уменьшают скорость
диффузии платинового золя и тормозят каталитическое разло61
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
жение Н2О2. Тормозящие свойства коллоидов объясняют также
повышением вязкости или изменением свойств поверхности, но
главным образом образованием адсорбционного соединения
Н2О2 на коллоиде, обладающего большей стойкостью, чем растворенный Н2О2 [21, 22].
Совместное действие двух стабилизаторов больше суммы
действия каждого в отдельности. Стабилизирующее действие
усиливается с увеличением дисперсности стабилизатора. Наиболее эффективно применение стабилизатора в коллоидном состоянии, данный эффект объясняется связью каталитического
действия с адсорбционными явлениями [21].
Стабилизаторы замедляют скорость протекания реакции
разложения, но не сдвигают химического равновесия и не изменяют механизм реакции, сохраняя ее мономолекулярный характер. Предположительно стабилизаторы способны устранять образование активированных молекул или препятствовать их образованию [21, 22].
Стойкость растворов Н2О2 снижается в присутствии многих металлов и их солей (особенно меди, железа, хрома, титана),
а также механических примесей, катализирующих разложение
Н2О2. Повышение температуры также способствует ускорению
разложения Н2О2. Согласно некоторым данным, скорость разложения Н2О2 удваивается на каждые 10 ºС повышения температуры. Термическое разложение Н2О2 сильно ускоряется органическими коллоидами, шероховатостями стенок сосуда, пылью. На
скорость разложения Н2О2 влияет также рН среды (при изменении значения рН с 5 до 9 скорость разложения многократно увеличивается).
Наиболее сильными катализаторами разложения Н2О2 являются ферменты пероксидаза и каталаза. На скорость ферментативного разложения Н2О2 оказывает влияние дисперсность катализаторов и степень гомогенности среды, увеличение данных
показателей ускоряет реакцию [21, 22].
62
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ферменты образуют с Н2О2 активные комплексы, которые затем распадаются на фермент и продукты реакции. В упрощенном виде данные реакции выглядят следующим образом:
Фермент + Н2О2→ Фермент·Н2О2;
(8)
Фермент·Н2О2 + Субстрат → Фермент + Продукт.
(9)
Согласно данной схеме все ферментативные реакции являются пероксидатическими; каталитическое действие представляет собой частный случай, при котором субстратом является вторая молекула Н2О2 [22].
Пероксидаза катализирует следующую реакцию [29]:
Н2О2 + АН2 пероксидаза 2Н2О + А.
(10)
Пероксидаза широко распространена в растительных тканях, а также в молоке и крови [22]. Пероксидаза – двухкомпонентный фермент, представляющий собой сочетание гемма и
глюкопротеида. Пероксидаза обладает широкой субстратной
специфичностью по отношению к донорам водорода (ими могут
быть фенолы [81], амины, аминокислоты) и строгой специфичностью по отношению к акцептору водорода – пероксиду водорода [29].
Каталаза катализирует разложение Н2О2 по уравнению
2Н2О2 каталаза О2 + 2Н2О.
(11)
При этом происходит окисление одной молекулы Н2О2 до
кислорода с одновременным восстановлением другой молекулы
Н2О2 до воды. Каталаза относится к группе гемопротеиновых
ферментов и содержит 0,009 % железа в виде геминовой группировки. Она защищает клетки живых организмов от негативного
действия Н2О2 [29], и также способна оказывать пероксидатическое действие, однако для этого требуется непрерывное поступ63
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ление Н2О2 [22]. В отличие от пероксидазы каталаза действует
пероксидатически лишь на первичные и вторичные спирты и
нитриты, то есть обладает субстратной специфичностью в отношении донора водорода. В зависимости от концентрации Н2О2
изменяется и действие каталазы. Так, небольшие концентрации
Н2О2 способствуют проявлению пероксидатического действия, а
высокие концентрации – каталитического.
2.2. Действие на органические соединения
В водном растворе пероксид водорода реагирует с органическими веществами преимущественно по радикальноцепному механизму. Доказательством этого является ингибирование таких процессов ненасыщенными мономерами и другими
акцепторами свободных радикалов [80]. Радикально-цепное
окисление кислородсодержащих органических веществ инициируется либо вследствие гомолиза Н2О2 по реакции (12), либо путем непосредственного взаимодействия Н2О2 с органическим
соединением [80].
H2O2 → 2•ОН.
(12)
Энергия активации гомолиза Н2О2 составляет примерно
202 кДж/моль, но в водной среде она значительно ниже –
84 кДж/моль [80]. Снижение энергии активации может быть обусловлено образованием комплекса Н2О2 с растворителем. Участие молекулы Н2О2 в образовании водородных связей в качестве донора протона приводит к ослаблению связей Н–О и О–О
[80]. Разложение Н2О2 в воде протекает через стадию образования комплекса Н2О2·2Н2О:
H2O2 + 2H2O ↔ H2O2·2H2O;
(13)
H2O2·2H2O → 2•ОН·H2O.
(14)
64
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Помимо воды способностью образовывать комплексы с
Н2О2 обладают гидроксилсодержащие органические соединения,
следствием чего также является снижение энергии активации
разложения Н2О2 по сравнению с энергией разрыва О–О связи в
молекуле пероксида водорода [80]. Кетоны образуют с Н2О2 пероксиды и гидропероксиды, скорость мономолекулярного разложения которых намного выше скорости распада Н2О2 [80].
Взаимодействие органических веществ с гидроксильными
радикалами •ОН может происходить через их присоединение по
кратной связи либо посредством отрыва лабильного атома водорода от органического вещества с образованием молекулы воды,
либо в результате «прилипания» гидроксильного радикала к
ароматическому кольцу [80].
Гидроксильные радикалы реагируют с акролеином и метакролеином посредством присоединения по двойной связи, а с
кротоновым альдегидом – через отрыв атома водорода от метильной группы. В результате реакции между •ОН-радикалами и
алифатическими кислотами происходит в основном отщепление
атома водорода и образование радикала с неспаренным электроном на атоме углерода в α-положении к карбоксильной группе.
Однако в случае муравьиной и малоновой кислот происходит
отрыв атома водорода от карбоксильной группы. Кислоты, содержащие двойные связи (малеиновая, метакриловая), присоединяют •ОН-радикал по кратной связи и образуют радикал с неспаренным электроном на соседнем атоме углерода. Простые
эфиры реагируют с •ОН-радикалами с образованием радикалов с
неспаренным электроном на α-углеродном атоме по отношению
к атому кислорода. Спирты взаимодействуют с •ОН-радикалами
согласно реакциям (15), (16), (17). Реакция (15) протекает в небольшой степени, в случае метанола, этанола и пропанола-2
преобладает процесс (16) (более чем на 90 %), а для
н-пропанола, н-бутанола и изобутанола возможна также реакция
(17) [80].
65
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
R2CH–CH(R´)–O• (15)
R2CH–C•(R´)–OH (16)
R2C•–CH(R´)–OH. (17)
R2CH–CH(R´)–OH + •ОН
При взаимодействии •ОН-радикалов с фенолом в зависимости от рН раствора образуются следующие продукты: радикалы (I) при рН ≈ 1 и гидроксодиенильные радикалы (II), (III) при
рН 3,9-7 [80].
H
O
H
O
O
H
H
O
H
O
H
O
H
O
(I)
(II)
(III)
Отщепление воды от гидроксодиенильных радикалов
приводит к образованию феноксильных радикалов:
+
H
O
2
H
+
(18)
H
O
H
Каталитическое окисление фенолов пероксидом водорода
под действием пероксидазы хрена также протекает с образованием свободных радикалов [81]:
E + H2O2 → E1 + H2O;
(19)
E1 + PhOH → E2 + PhO•;
(20)
E2 + PhOH → E + PhO•;
(21)
66
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
n(PhO• + PhO•) → полимерный продукт;
(22)
где Е – пероксидаза хрена; Е1 и Е2 – активные формы пероксидазы хрена; PhOH – фенол.
Механизмы реакций фенольных соединений с •ОНрадикалами зависят от природы и расположения заместителей в
бензольном кольце [80]. Гваякол окисляется до хинона за счет
деметилирования по схеме
O
-
O
H
O
H
C
O
+
3
3
H
C
O
H
O
3
H +
C
O
(23)
O
H
O
+
H
O
2
O
2
H
+
H
O
3
H
C
+
3
3
H
C
O
H
C
O
+
O
O
O
-
(24)
Окисление гидроксильной и метоксильной групп ванилина пероксидом водорода приводит аналогично гваяколу к образованию хинонов, а карбонильная группа окисляется до карбоксильной. Одним из продуктов окисления ванилина является ванилиновая кислота [80]. В случае взаимодействия •ОН-радикалов
и ванилинового спирта метоксильная группа и фенольный гидроксил остаются неизменными, а спиртовый гидроксил окисляется до карбонильной и карбоксильной групп [80].
Феноксикарбоновые кислоты (феруловая, сиреневая, галловая) реагируют с •ОН-радикалами с образованием, наряду с
феноксильными, реакционноспособных карбоксильных и арильных радикалов [80].
67
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Свободные радикалы, образующиеся в результате реакций органических соединений с пероксидом водорода, вступают
в реакции ди- и полимеризации с обрывом цепи или вызывают
индуцированный распад Н2О2, трансформируясь при этом в более окисленные продукты [80].
Жиры и масла относительно устойчивы к действию Н2О2,
имеются данные о применении Н2О2 для отбелки жиров, масел,
восков [21], но, вероятно, жиры, содержащие радикалы ненасыщенных жирных кислот значительно менее устойчивы, так как
их окисление относительно легко происходит даже под действием кислорода воздуха [29]. Первичными продуктами окисления
жиров являются разнообразные по строению гидропероксиды,
неустойчивые соединения, которые в результате сложных превращений переходят во вторичные продукты окисления: окси- и
эпоксисоединения, спирты, альдегиды, кетоны, кислоты [29].
На моно- и олигосахариды Н2О2 при комнатной температуре не действует, но в присутствии катализатора – сернокислого железа – они очень быстро разрушаются. У глюкозы сначала
окисляется группа СН2ОН при дальнейшем окислении образуются уксусная, муравьиная кислоты, СО2 и Н2. β-глюкозан,
стойкий к действию Н2О2, при комнатной температуре в присутствии сульфата двухвалентного железа разлагается с образованием летучих и нелетучих кислот и большого количества глюкозы [21]. Н2О2 вызывает разложение пектиновых веществ, полисахаридов и глюкозидов. На скорость этих процессов влияет наличие щелочи, железа, меди [22]. Крахмал переводится пероксидом водорода в растворимую форму, данный эффект применяется при отбелке тканей или при применении Н2О2 в качестве
средства для удаления шлихты [21]. При обработке целлюлозы и
крахмалов происходит их деполимеризация и частичное окисление [22]. При применении Н2О2 для отбелки древесной массы на
смесь целлюлозы и гемицеллюлозы тратится около 60 % Н2О2,
на лигнин – 40 %. Высокая эффективность перекисной отбелки,
вероятно, обусловлена специфичностью и реакционной способностью в отношении наиболее окрашенных лигниновых фрак68
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ций. Реакция Н2О2 с лигнином происходит в результате взаимодействия с карбонильными, а возможно и с фенольными гидроксильными группами [22]. Скорость отбелки возрастает с ростом
рН, действующей частицей в данном случае является ион пергидроксила Н О -2 , образующийся в результате ионизации Н2О2:
Н2О2 ↔ Н+ + Н О -2 .
(25)
Повышение щелочности раствора Н2О2 снижает концентрацию водородных ионов и увеличивает концентрацию пергидроксильных. Тогда как кислород, выделяющийся при разложении Н2О2, лишен отбеливающего действия и может вызвать порчу отбеливаемого материала [21, 22].
Следует отметить, что большинство реакций Н2О2 с полисахаридами изучалось при рН > 7, в литературе отсутствуют
данные о влиянии Н2О2 на полисахариды в кислых средах.
Обработка Н2О2 вызывает агрегацию или желатинирование альбумина, желатина, тканевых экстрактов и даже разложение их до аммиака, кетонов и альдегидов [22]. Н2О2 угнетает активность ферментов. Под действием Н2О2 разрушаются гормоны
гипофиза и эритроциты. Волосы, шерсть сравнительно устойчивы к действию Н2О2, что делает его пригодным для их отбелки.
Тем не менее Н2О2 вызывает ослабление и разрушение волоса.
Степень повреждения волос зависит от времени контакта, температуры, концентрации, рН и присутствия ионов тяжелых металлов [22].
Н2О2 действует на восстановленные сульфгидрильные
группы белка R-SH с образованием дисульфидных связей R-S-SR [82, 83]. Аминокислоты реагируют с Н2О2 в присутствии иона
окисного железа с переходом в кетокислоты [21, 22].
Первичные амины RNH2 разлагаются пероксидом водорода, вторичные амины R2NH окисляются до гидроксиламинов
R2NOH, третичные R3N – до окисей аминов R3NO [21].
В литературе имеются данные о детоксицирующем действии Н2О2 при обработке продуктов, загрязненных микотокси69
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нами [47]. Биологическими испытаниями подтверждена способность Н2О2 активно разрушать афлатоксины групп В и G. Пероксид водорода широко применяется для инактивации афлатоксинов в пищевых продуктах и кормах [55, 84]. В Индии Н2О2 используется для обезвреживания белковых изолятов из арахиса,
предназначенных для пищевых целей. Стоимость обработки составляет около 15 % стоимости белковых изолятов [53]. Пероксид водорода вызывает размыкание эпоксидного кольца в трихотеценовых микотоксинах, что сопровождается полной потерей
их биологической активности [53]. Обработка загрязненной кукурузы 0,01 % раствором Н2О2 приводит к разрушению микотоксина зеараленона [53].
2.3. Антимикробные свойства
Пероксид водорода широко применяется для дезинфекции в медицине и пищевой промышленности благодаря сильному микробоцидному действию и безвредности продуктов разложения [21, 22, 75]. Дезинфицирующие свойства Н2О2 известны
давно. В результате опытов, проводимых in vitro, установлено,
что Н2О2 в концентрациях порядка 0,001–0,1 % при комнатной
температуре угнетает рост микроорганизмов, а при концентрации 0,1 % и выше убивает микроорганизмы [22]. В отношении
чувствительных микроорганизмов летальное действие Н2О2 проявляется и в более низких концентрациях. При культивировании
клеток Lactococcus lactis в среде, содержащей 15 мМ (≈ 0,05 %)
Н2О2, выживаемость клеток снижалась со 100 до 0,1 % [85], выживаемость вегетативных клеток Bacillus subtilis после
20-минутной обработки 0,001 М (≈ 0,0034 %) раствором Н2О2
составила только 5 %. Споры B. subtilis были на порядок устойчивей вегетативных клеток [78]. Установлено, что выживаемость
клеток B. subtilis при культивировании в течение 6 ч в присутствии 10 мМ (≈ 0,034 %) Н2О2 снижается со 100 до 0,1 % [86].
Растворы Н2О2 эффективнее действуют на грамположительные, чем на грамотрицательные микроорганизмы [22, 78, 87].
70
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Пероксид водорода в интервале концентраций 0,1–0,0001 М оказывал на вегетативные клетки B. subtilis более выраженное действие, чем на Escherichia coli [78].
На чувствительность микроорганизмов к Н2О2 влияют:
фаза роста культуры, количество клеток, температура, время
контакта, физическая доступность клеток [22, 78], активность
каталазы и/или пероксидазы [78, 87].
Обработка дрожжей Yarrowia lipolytica, взятых в экспоненциальную фазу роста, Н2О2 в концентрации 120 мМ (≈ 0,4 %)
снижала выживаемость клеток со 100 до 1 %. Клетки фазы стационарного роста были более устойчивы к Н2О2 [88]. Дрожжи
Saccharomyces cerevisiae более чувствительны к действию Н2О2.
Выживаемость трех штаммов S. cerevisiae после 30-минутной инкубации с 10 мМ Н2О2 (≈ 0,034 %) колебалась от 42 до 6 % [89].
Аналогичная обработка штамма S. cerevisiae, дефектного по каталазе приводила к полной гибели клеток [89]. Тепловой шок
(37–40 °С, 60 мин), рост в аэробных условиях, недостаток углеродного питания повышают устойчивость S. cerevisiae к пероксиду водорода [90]. Сублетальные стрессовые условия вызывают
метаболические изменения, которые делают клетки микроорганизмов более резистентными к агрессивным факторам среды:
синтезируются белки теплового шока и антиоксидантные ферменты [90].
В работе [77] показано, что Н2О2 в концентрации 15 мМ
(≈ 0,05 %) в течение 24 ч не подавлял рост клеток Penicillium
piceum F-648 в стационарной фазе роста, в то же время в экспоненциальной фазе при аналогичной концентрации Н2О2 за тот же
период времени рост клеток снижался на 80 %. Значения летальной концентрации Н2О2 также различались и составили 40 мМ
(≈ 0,136 %) и 20 мМ (≈ 0,068 %) Н2О2 для стационарной и экспоненциальной фаз роста гриба соответственно. Авторы связывают
это с увеличением активности каталазы в стационарной фазе
роста. Предварительная обработка клеток микроорганизмов нелетальными дозами Н2О2 повышает их устойчивость к действию
Н2О2, что также связывается с увеличением активности ферментов
71
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
окислительного стресса (каталазы, супероксиддисмутазы, глюкозо6-фосфатдегидрогеназы и глутатионредуктазы) [77, 88, 90].
Устойчивость клеток микроорганизмов к действию Н2О2
может повышаться при выделении ими в среду культивирования
соответствующих экзометаболитов [91], осуществляющих химическую коммуникацию бактерий. Белковый экзометаболит,
выделенный из культуральной жидкости Luteococcus japonicus
subsp. сasei, оказывал реактивирующее действие на клетки, подвергнутые окислительному стрессу. Выживаемость клеток Luteococcus japonicus subsp. сasei после 15 мин инкубирования в присутствии 400 мМ (≈ 1,36 %) Н2О2 снижалась лишь до 17 % [91].
Механизм антимикробного действия Н2О2 связан с его
высокой окислительной способностью, а также с действием токсичных продуктов, образующихся при перекисном окислении
липидов [78]. Пероксид водорода окисляет основания ДНК до
N-окисей, инициирует свободнорадикальные процессы, приводящие к разрушению молекулы ДНК [77, 78, 91]. Обработка клеток Escherichia coli 0,01 М (≈ 0,034 %) раствором Н2О2 в течение
15 мин индуцировала в геноме 34,2 однонитевых разрывов ДНК,
а при увеличении концентрации Н2О2 до 0,1 М (≈ 0,34 %) количество однонитевых разрывов ДНК увеличивалось до 65,6.
У мутантов rec A кинетика накопления однонитевых разрывов
ДНК не отличалась от дикого типа, но была значительно подавлена репарация этих повреждений [78].
Пероксид водорода вызывает также локальные нарушения клеточной стенки бактерий и разрушение цитоплазматической мембраны вследствие окисления ненасыщенных жирных
кислот липидного бислоя [78, 83]. Пероксид водорода вызывает
окисление сульфгидрильных групп белков [83, 87], что приводит
к инактивации некоторых ферментов (дегидрогеназ) [78].
Обработка дрожжей S. cerevisiae пероксидом водорода
вызывает образование карбонильных групп у некоторых аминокислот. Это приводит к инактивации многих ферментов, в частности митохондриальных белков, пируваткиназы, α-кетоглутаратдегидрогеназы, аконитазы и глицеральдегид-3-фосфат72
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
дегидрогеназы [92]. Инкубация дрожжей в 1,5 мМ растворе пероксида водорода вызывала снижение активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы на 80 % [93]. Негативное влияние
Н2О2 на один из ключевых ферментов гликолиза проявлялось в
уменьшении внутриклеточной концентрации АТФ [94].
Согласно современным представлениям о механизмах антимикробного действия Н2О2 наибольшую опасность представляет не прямое взаимодействие Н2О2 с компонентами клетки, а
образующийся, в результате реакций
О2¯ • + Н2О2 + Н+ → О2 + Н2О + ОН•;
(26)
Н2О2 + Fe2+ → Fe3+ + OH¯ + ОН•.
(27)
гидроксидный радикал ОН•, который является самым сильным
из всех известных окислителей, он вызывает радиационные поражения многих типов биополимеров [83].
2.4. Применение в пищевой промышленности
Пероксид водорода широко применяется в пищевой промышленности как консервирующий агент (молоко и молочные
продукты, рыба и др.) [22]. При добавке Н2О2 в количестве около 0,1 % мас. к сырому молоку количество бактерий в нем снижается на 95 % и устраняется скисание при хранении при комнатной температуре в течение нескольких дней [22]. Добавка
0,05 % Н2О2 к молоку эффективна против Clostridium butiricum,
Streptococcus lactis и молочнокислых термофильных бактерий
[22]. Кроме того, пероксид водорода используется для стерилизации емкостей, труб, дезинфекции воды. Для быстрой дезинфекции воды необходимо добавлять не менее 5 % мас. Н2О2,
концентрацию добавляемого пероксида водорода можно снизить, увеличив продолжительность обработки (0,5 % мас. Н2О2
достаточно для дезинфекции воды за 24 ч) [22].
73
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Промывка моркови в 5 и 10 % растворах пероксида водорода в течение 2 мин обеспечивала микробиологическую стабильность приготовленных из нее салатов [95].
Существуют также другие виды применения Н2О2 в пищевой промышленности, не связанные с его дезинфицирующим
действием: отбелка муки, модификация крахмалов, ускорение
созревания вин и коньяка (посредством окисления сивушных
масел в альдегиды), устранение неприятных вкусов и запахов в
различных продуктах [22].
74
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3. ОСНОВНЫЕ СТАДИИ ПРОИЗВОДСТВА ЭТИЛОВОГО
СПИРТА
Этиловый спирт является одним из важнейших технических продуктов и видов сырья. Он используется во многих отраслях промышленности: химической, электротехнической,
парфюмерной, фармацевтической и др. Более 150 различных
производств используют спирт как сырье или как вспомогательный материал [1].
3.1. Подготовка сырья
Все виды зерна, поступающего в производство, очищают
от пыли, земли, камней, металлических и других примесей при
помощи воздушно-ситовых и магнитных сепараторов и триеров. Зерно, предназначенное для приготовления солода, освобождают также от щуплых зерен, половинок и семян сорных
растений. В очищенном зерне содержание примесей не должно
превышать 1 % [1].
3.2. Измельчение зерна
Измельчение зерна осуществляется сухим или влажным
способом [96]. При влажном помоле зерно, погруженное в воду
обрабатывают SO2 при 52 °С в течение 20–40 ч [96].
В нашей стране применяется только сухой помол. Измельчение проводят на специальных установках, оборудованных
дезинтегратором и сепарирующим устройством, молотковых
дробилках или вальцовых станках [1].
Измельченное зерно поступает в смеситель, в котором
смешивают измельченную массу с водой при соотношении 1 кг
зерна на 2,5–3,5 л воды; после чего зерновой замес подогревают
и направляют в аппараты для разваривания [1].
75
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3.3. Гидротермическая обработка
Основная цель водно-тепловой обработки сырья – это
разрушение клеточной структуры зерна и подготовка крахмала к
осахариванию амилолитическими ферментами солода или микроорганизмов. Осахаривание наиболее полно и быстро происходит тогда, когда крахмал доступен для действия ферментов (не
защищен клеточными стенками), оклейстеризован и растворен.
Растворения крахмала можно достичь следующими способами:
развариванием – тепловой обработкой цельного сырья при повышенном давлении; сверхтонким механическим измельчением
сырья на специальных машинах; механическим измельчением
сырья до определенных размеров частиц и последующим развариванием под давлением или без давления (комбинированный
способ) [1].
При тепловой обработке происходят сложные структурно-механические, физико-химические изменения сырья. При нагревании с водой белки набухают и денатурируют, крахмал
клейстеризуется и переходит в коллоидный раствор. Набухание
и клейстеризация обусловлены поглощением воды высокомолекулярными соединениями. В зависимости от происхождения
клейстеризация крахмала начинается в диапазоне температур
55–65 °С и сопровождается увеличением вязкости среды. С постепенным возрастанием температуры клейстеризованный крахмал разрушается, и вязкость среды резко снижается. Химические
изменения, происходящие при разваривании, связаны с увеличением содержания сахаров и декстринов в связи с частичным кислотным и ферментативным гидролизом крахмала, с образованием пептидов и аминокислот при гидролитическом расщеплении белков, а также с дегидратацией гексоз и пентоз до фурфуролсодержащих веществ [1]. Пектиновые вещества при разваривании гидролизуются с образованием метанола [1, 28]. Данный
процесс протекает тем интенсивнее, чем выше температура и
жестче режим разваривания [1].
76
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Меланоидинообразование – второй по значимости после
дегидратации процесс, приводящий к снижению содержания
сбраживаемых углеводов [1, 28]. Это взаимодействие низкомолекулярных углеводов и аминокислот наиболее интенсивно протекает при нагревании [29]. Меланоидины отрицательно влияют
на жизнедеятельность дрожжей, подавляют активность их ферментов инвертазы и каталазы. Благодаря наличию положительного электрокинетического ζ-потенциала меланоидины адсорбируются на поверхности дрожжевых клеток, имеющих отрицательный ζ-потенциал, затрудняя тем самым поступление в
них питательных веществ [45]. С понижением рН среды степень
адсорбции меланоидинов возрастает [1, 45].
Суммарные потери сбраживаемых веществ (в том числе
от неполноты растворения крахмала) в ходе разваривания составляют от 2,5 до 4 % [1].
В последнее время на стадии приготовления замеса для
более полного и глубокого гидролиза крахмала и снижения вязкости среды применяют α-амилазу, ксиланазу, β-глюканазу и
целлюлазу. Таким образом, облегчается доступ к крахмалу осахаривающих ферментов [1].
При периодическом способе водно-тепловой обработки
зерно разваривают в целом виде, при непрерывных схемах сырье
предварительно измельчают. Степень дробления влияет на температуру и продолжительность разваривания [97].
На спиртовых заводах страны применяют в основном непрерывные способы разваривания измельченного крахмалистого
сырья под повышенным давлением в аппаратах колонного и
трубчатого типов. Широко распространен способ механикоферментативной обработки крахмалистого сырья, предусматривающий совмещение водно-тепловой и ферментативной обработки измельченного сырья в непрерывном процессе при температуре не выше 100 ºС в горизонтальных и вертикальных цилиндрических аппаратах с мешалками [1].
С технологической точки зрения основными недостатками способа обработки зерна под давлением являются высокая
77
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
температура разваривания, длительность процесса сбраживания,
высокие тепло- и энергозатраты на нагрев зернового замеса [98];
кроме того, эксплуатация варочных аппаратов, работающих под
давлением, требует высокой квалификации рабочих и особого
внимания с точки зрения техники безопасности [99]. Решающим
отрицательным фактором служит низкий выход спирта, который
обусловливается потерями сбраживаемых сахаров за счет протекания на стадии разваривания высокотемпературных процессов
с образованием продуктов оксиметифурфурольного разложения
и меланоидинов [100]. Кроме низкого выхода этиловый спирт,
полученный по данной технологии, характеризуется плохим качеством из-за наличия большого количества примесей (альдегиды и т.д.). Они образуются в результате химических превращений веществ сырья под влиянием высокой температуры [98].
В основу технологии низкотемпературного разваривания
положен метод гидроферментативного растворения веществ
зерна, где технологический фактор растворения этих веществ –
не температура обработки сырья, при которой протекают процессы термогидратации и термогидролиза крахмала, а фактор
времени протекания ферментативных и гидродинамических
процессов [2]. В результате внедрения такого способа уменьшаются расход пара на разваривание (на 40 %) и потери сбраживаемых веществ при снижении температуры разваривания до
100 ºС. Данный технологический процесс успешно осуществляется при степени измельчения зерна, характеризуемой проходом
через сито с отверстиями диаметром 1 мм, не менее 75–85 %.
Остаток на сите с отверстиями диаметром 3 мм не должен превышать 0,2 % [1].
Практика работы многих спиртовых заводов показывает,
что снижение температуры тепловой обработки зернового замеса ниже 100 ºС (использование гидродинамической обработки
зернового замеса) приводит к повышению вкусовых и ароматических свойств спирта. В этом случае в 1,5–2 раза уменьшается
содержание в нем метилового спирта и других примесей [12].
Так, исследования, проведенные на ГУП «Тюрнясевский спир78
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
товой завод», показали, что по мере снижения температуры разваривания сырья в ряду 145, 135, 110 и 70 ºС происходит уменьшение количества микропримесей в спирте, причем наименьшее
их число обнаружено в конечном продукте процесса, проведенного при 70 ºС [2].
Однако у способа низкотемпературного разваривания
имеется и ряд существенных недостатков:
● повышенный расход дорогостоящих ферментных препаратов;
● низкие значения выхода спирта с 1 т условного крахмала при переработке ржи, наличие в составе которой большого
количества слизей и пентозанов приводит к образованию высоковязких заторов и сусла, с трудом подвергающихся гидроферментативной обработке и сбраживанию [2].
Низкий выход спирта (не превышающий 65,5 дал с 1 т условного крахмала сырья) связан с наличием больших количеств
несброженных сахаров в зрелой бражке, что в свою очередь обусловлено недорастворением крахмала в режиме тепловой гидроферментативной обработки из-за высокой вязкости перерабатываемых водно-зерновых масс [101].
Устранение этих недостатков является одной из основных
задач, стоящих перед спиртовой промышленностью. В настоящее
время наметилось несколько перспективных направлений усовершенствования данной технологии. Это создание новых, более
эффективных и устойчивых ферментных препаратов [102, 103];
сочетание ферментативной обработки сырья с механической (использование роторно-пульсационных аппаратов [2] и виброкавитационных мельниц [104–106]), которые обеспечивают получение сверхтонкого помола сырья [107]; применение хелатирующих агентов (солей полифосфорных кислот), которые интенсифицируют процессы гидратации и набухания крахмальных гранул
и ускоряют тем самым их клейстеризацию [108]; электрофизическая обработка сырья [60, 61, 99, 109].
79
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3.4. Осахаривание разваренной массы
Осахаривание заключается в обработке охлажденной массы солодовым молоком или ферментными препаратами для гидролиза полисахаридов, белков и других сложных веществ. Основным и наиболее важным процессом при этом является ферментативный гидролиз крахмала до сбраживаемых сахаров, поэтому процесс и называют осахариванием [97].
Известно, что сусло, полученное при осахаривании солодом, содержит 71–76 % мальтозы и 24–29 % глюкозы от суммы
сбраживаемых сахаров, а осахаренное ферментными препаратами – 14–21 % и 79–86 % соответственно. Целлюлоза, гемицеллюлоза и другие некрахмалистые полисахариды почти не гидролизуются ферментами солода и в большей степени гидролизуются ферментами микробного происхождения [97]. В процессе
осахаривания уменьшаются средняя молекулярная масса углеводов, вязкость раствора, удельное вращение, возрастает редуцирующая способность [1]. Сообщается, что процесс осахаривания можно интенсифицировать ультразвуковой обработкой, в
результате чего в сусле повышается содержание редуцирующих
сахаров на 4,8 %, декстринов на 30,4 % [110].
Использование солода для осахаривания разваренной
массы приводит к значительным потерям сбраживаемых углеводов (≈ 30 % от всех потерь), вследствие недорастворения крахмала самого солода. Для получения солода требуется высококачественное зерно, что увеличивает затраты на производство. С
солодом в сусло вносятся посторонние микроорганизмы, вследствие чего в большей мере протекают и другие виды брожения,
отрицательно сказывающиеся на выходе спирта [1].
В настоящее время на большинстве спиртзаводов крахмалсодержащее сырье осахаривают ферментами плесневых грибов [1].
Процесс осахаривания включает в себя следующие операции:
- охлаждение разваренной массы;
80
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- смешивание массы с осахаривающим материалом;
- осахаривание и охлаждение сусла.
Готовое сусло содержит 16–18 % сухих веществ, рН среды – от 5 до 5,3 [1].
Гидролиз крахмала при осахаривании осуществляется ферментами: α-амилаза, β-амилаза, декстриназа и глюкоамилаза [1].
Из гидролаз наибольшее производственное значение
имеют амилазы – ферменты, катализирующие гидролиз крахмала – α- и β-амилазы. Данные ферменты катализируют разрыв
только α-1,4-глюкозидных связей. Под действием α-амилазы
связи разрываются беспорядочно, но преимущественно в середине, внутри цепей крахмала. В результате чего образуются
главным образом низкомолекулярные декстрины, небольшое количество мальтозы и олигосахаридов, в том числе олигосахаридов с разветвленной цепью [1]. Действие β-амилазы направлено
на концевые связи в амилозе и амилопектине, при этом последовательно, начиная с нередуцирующих концов цепей, отщепляются по два остатка глюкозы. β-амилаза не может обойти в амилопектине места ветвления, поэтому гидролиз прекращается на
предпоследней α-1,4-глюкозидной связи и остаются высокомолекулярные декстрины, окрашивающиеся йодом в синий цвет.
При гидролизе β-амилазой амилоза полностью превращается в
мальтозу, а амилопектин – только на 50–55 % [1].
Глюкоамилаза катализирует разрыв α-1,4- и α-1,6-глюкозидных связей в крахмале, панозе, изомальтозе и α-1,3- связей
в нигерозе. При катализе этим ферментом от нередуцирующих
концов амилозы и амилопектина последовательно отщепляются
остатки глюкозы, являющейся конечным продуктом гидролиза [1].
Определенный интерес представляет такой амилолитический фермент, как пуллуланаза, способный гидролизовать внутренние α-1,6-гликозидные связи в пуллулане, амилопектине и
предельных декстринах с образованием мальтоолигосахаридов.
Установлено, что ферментативный комплекс амилолитических
ферментов совместно с пуллуланазой катализирует более глубо-
81
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
кое расщепление крахмала, способствует интенсификации процесса сбраживания зернового сусла [111].
Отечественными и зарубежными исследователями ведутся
активные разработки по созданию новых ферментных препаратов
и их применению в спиртовой промышленности [103, 111–115].
В настоящее время на рынке осахаривающих материалов существует большой выбор препаратов амилолитического, целлюлолитического и протеолитического действия, позволяющих наиболее
полно гидролизовать углеводный комплекс сырья, и получать
сусло с высоким содержанием аминокислот, легко усваиваемых
дрожжами.
3.5. Сбраживание сусла
Осахаренную массу, называемую суслом, направляют в
бродильные аппараты, где содержащиеся в ней сахара сбраживаются дрожжами в спирт. Часть сусла идет на воспроизводство
культуры дрожжей. При сбраживании сусла одновременно происходит доосахаривание декстринов. Бродящее сусло называют
бражкой, или культуральной жидкостью [1].
На отечественных заводах применяют в основном непрерывно-проточный, проточно-рециркуляционный и циклический
способы брожения. Периодическое сбраживание проводят только на малых заводах [97].
Сущность непрерывно-проточного способа заключается в
непрерывном притоке осахаренного сусла и вводе дрожжей в
головной аппарат бродильной батареи, состоящей из нескольких
последовательно соединенных между собой сосудов, в непрерывном сбраживании этого сусла и оттоке зрелой бражки из последнего аппарата. При данном способе ускоряется процесс и
увеличивается мощность бродильного цеха на 30 %, повышается
выход спирта на 0,5 % из 1 т условного крахмала, облегчается
труд, снижаются затраты и создаются условия для автоматизации процесса.
82
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Серьезной проблемой непрерывно-проточного способа
является контаминация сусла посторонними микроорганизмами,
которые продуцируют токсичные для дрожжей метаболиты,
инактивируют ферменты, что приводит к значительным потерям
конечного продукта [116]. При движении бродящего сусла по
переточным трубам из одного аппарата в другой происходит неравномерное распределение скоростей, следствием чего является
задержка сусла у стенок труб и аппаратов, что способствует развитию микроорганизмов-контаминантов. В этом отношении периодическое сбраживание сусла имеет то преимущество, что оно
строго ограничено во времени и от начала до конца проводится в
одном аппарате, который по завершении цикла стерилизуют паром [1].
Модификацией непрерывно-поточного способа является сбраживание высокоплотного замеса (до 26 % глюкозы),
позволяющее получать бражку с содержанием этилового
спирта до 17 % об. [117].
В качестве возбудителей спиртового брожения используют производственный штамм дрожжей Saccharomyces serevisiae,
такие дрожжи должны обладать высокой бродильной активностью, уметь сохранять анаэробный тип обмена, обладать стойкостью к продуктам обмена, к посторонним микроорганизмам и к
изменению состава питательного субстрата [1, 97].
При сбраживании сахара диффундируют в дрожжевую
клетку, где вовлекаются в цепь ферментативных процессов, конечным результатом которых является образование спирта и углекислого газа. При брожении образуются также вторичные и
побочные продукты [1, 97].
Зрелая бражка содержит от 8 до 10 % об. спирта и от 0,25
до 0,4 г/л несброженных сахаров [1].
Спиртовые дрожжи утилизируют глюкозу по гликолитическому пути (путь Эмбдена–Мейергофа–Парнаса), но, в отличие от высших организмов, на последнем этапе образуют этиловый спирт вместо молочной кислоты [118]. Пировиноградная
кислота, образующаяся в ходе гликолиза декарбоксилируется
83
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пируватдекарбоксилазой до ацетальдегида. Затем ацетальдегид
восстанавливается до этанола под действием фермента алкогольдегидрогеназы, содержащего в качестве кофермента
НАДН·Н+, восстановленный в реакции гликолитической редукции процесса гликолиза. Образование этилового спирта обусловлено необходимостью регенерации окисленного НАД+, необходимого для продолжения процесса гликолиза, так как содержание НАД+ в клетках ограниченно [82]. На начальном этапе
спиртового брожения, пока в среде не накопится достаточное
количество ацетальдегида, необходимого для окисления
НАДН·Н+, регенерация НАД+ происходит в ходе восстановления
дигидроксиацетонфосфата до глицерин-3-фосфата, который затем превращается в глицерин [118].
Суммарная реакция спиртового брожения выглядит следующим образом:
С6Н12О6 → 2С2Н5ОН + 2СО2.
(28)
В присутствии молекулярного кислорода дрожжи переключаются с брожения на дыхание (эффект Пастера). Тем не менее спиртовое брожение может происходить в условиях значительной аэрации при высоком содержании глюкозы в среде
(1,5–2 %) [118], согласно другим данным спиртовое брожение
идет до тех пор, пока концентрация глюкозы не станет меньше
5 г/л (0,5 %) [37]. Данный процесс, называемый аэробной ферментацией, обусловлен высокой скоростью усвоения глюкозы [118],
которая вызывает подавление митохондриальных генов, регулирующих цикл трикарбоновых кислот, перенос электронов и
окислительное фосфорелирование, в результате чего происходит
неполное развитие митохондрий [37]. Подавление аэробного
дыхания при высокой концентрации глюкозы называется эффектом Крэбтри, или катаболитной репрессией [118, 119].
Дрожжи используют кислород не только для дыхания, но
и в некоторых реакциях биосинтеза. Молекулярный кислород
необходим для синтеза ненасыщенных жирных кислот и эрго84
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
стерина – важнейших компонентов цитоплазматической мембраны. Для анаэробного роста дрожжей в течение более двух генераций ненасыщенные жирные кислоты и эргостерин должны
поступать из сусла. Поскольку содержание данных компонентов
в сусле незначительно, рекомендуется насыщать сусло кислородом до уровня, необходимого для роста и размножения дрожжей [37].
3.6. Выделение спирта из бражки
Бражка – сложная многокомпонентная система, состоящая
из воды (82–90 % мас.), сухих веществ (4–10 % мас.) и этилового
спирта с сопутствующими летучими примесями (5–9 % мас., или
6–11 % об.). В бражке всегда содержится некоторое количество
диоксида углерода: в 1 л ее, взятом непосредственно из бродильного аппарата, – 1–1,5 г. При перекачке бражки в ректификационное отделение 35–45 % СО2 теряется. Кислотность бражки – 0,5º, pH – 4,9–5,2. Состав в значительной мере изменяется в
зависимости от вида исходного сырья и принятых технологических режимов приготовления бражки [1].
Спирт из бражки выделяют с помощью ректификации на
сырцовых ректификационных установках. При этом вместе с
ним отгоняется и значительная часть сопутствующих летучих
примесей. Получаемый при этом продукт называется спиртомсырцом (ГОСТ Р 52193-2003). Ректификованный спирт получают посредством очистки спирта-сырца от примесей ректификацией. В зависимости от степени очистки этиловый ректификованный спирт подразделяют по ГОСТ Р 51652-2000 на: 1 сорта,
высшей очистки, «Базис», «Экстра», «Люкс», «Альфа». Кроме
спирта-сырца и ректификованного спирта спиртовая промышленность вырабатывает небольшое количество абсолютного спирта, в
котором допускается содержание воды до 0,2 % об. [97].
Ректификация – процесс разделения жидких летучих смесей на компоненты или группы компонентов (фракции) посредством многократного двустороннего массо- и теплообмена меж85
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ду противоточно движущимися паровым и жидкостным потоками. Необходимое условие процесса ректификации – различная
летучесть (упругость пара) отдельных компонентов [1].
При взаимодействии противоточно движущихся потоков
в процессе ректификации происходит диффузия легколетучего
компонента из жидкости в пар и труднолетучего компонента из
пара в жидкость [1].
В спиртовой промышленности ректификованный спирт
получают исключительно из бражки, что считается экономически целесообразным. Получение ректификованного спирта непосредственно из бражки осуществляется на непрерывно действующих брагоректификационных установках, на которых можно
выделить спирт из бражки и освободить его от сопутствующих
летучих примесей [1].
86
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4. МИКРОБНАЯ КОНТАМИНАЦИЯ В ТЕХНОЛОГИИ
ЭТИЛОВОГО СПИРТА
4.1. Микроорганизмы-контаминанты бродильных
производств
К основным микроорганизмам-контаминантам спиртового
производства относятся: молочнокислые, уксуснокислые, маслянокислые и гнилостные бактерии, а также дикие дрожжи [1, 96].
Как правило, уровень микробной контаминации колеблется в
пределах 105–109 КОЕ/мл [96].
Причинами контаминации зачастую становятся несоблюдение технологических режимов и графиков санитарнопрофилактического обслуживания оборудования. В зависимости
от используемой схемы технологического процесса и оборудования существуют многочисленные возможности для сохранения микроорганизмов-контаминантов и их активной жизнедеятельности [96]. Например, в ходе комплексного микробиологического исследования работы спиртового завода было
установлено, что контаминация замочной воды, используемой
для приготовления замеса, после пастеризации увеличилась на
порядок (с 105 КОЕ/мл до 106 КОЕ/мл), что, вероятно, связано с
повторной контаминацией ее через теплообменники [96].
Наибольшую опасность для производства представляют
бактерии. Они могут развиваться за счет сахара и за счет спирта.
Основным источником проникновения микроорганизмовконтаминантов на производство является зерновое сырье, особенно дефектное. Анализ микробиологического состояния различных культур показал, что общее количество микроорганизмов в дефектном зерне в 4–5 раз выше по сравнению с кондиционным, что приводило к ускоренному закисанию осахаренного
сусла [5].
На спиртовых заводах часто используют воду из открытых водоемов и прудов, в которых находится значительное количество различных микроорганизмов: Escherichia coli, Es87
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
cherichia freundi, Klebsiella aerogenes, Actobacter cloacae, Bacillus
subtilis, Baсillus mesentericus, Pseudomonas nonliguefaciens. В 1
мл прудовой воды может находиться несколько сот кислотообразующих бактерий [1].
В воздухе часто встречаются Bacillus mesentericus, Bacillus megatherium, Bacillus mycoides, Bacillus subtilis, бактерии родов Pseudomonas, Sarcina (Sarcina lutea), споры плесневых грибов родов Penicillium и Aspergillus, дрожжеподобные грибы рода
Candida и редко – молочнокислые бактерии [1].
Попадая в дрожжевые и бродильные аппараты, эти микрорганизмы могут накапливаться в значительных количествах и
даже вытеснять производственную культуру дрожжей. Контаминирующие микроорганизмы потребляют из сусла часть питательных веществ, снижая выход спирта. Кроме того, они образуют органические кислоты и другие метаболиты, инактивирующие ферменты осахаривающих материалов, снижающие
бродильную активность дрожжей, в результате чего в зрелой
бражке повышается количество несброженных сахаров и крахмала [1] и ухудшается качество этилового спирта [5].
Микроорганизмы-контаминанты могут образовывать на
поверхности оборудования трудно удаляемые биопленки,
придающие им устойчивость к действию неблагоприятных
факторов окружающей среды, в частности к антибиоткам
[120]. Способность образовывать биопленки была обнаружена
у молочнокислых бактерий Lactobacillus amylovorus, L.
fermentum, и L. vaginalis – типичных контаминатов спиртового
производства [120].
Причиной микробной контаминации технологического
процесса может служить неправильная подготовка сырья, так
при несоблюдении режимов огневой сушки влажного сырья на
поверхности зерновки могут происходить значительные повреждения, на месте которых начинается интенсивное развитие
микроорганизмов, а следовательно, ускоряются неблагоприятное
биохимические и микробиологические процессы, что приводит к
ухудшению качества зерна. Кроме того, при длительном нагреве
88
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
сырья при высокой температуре происходит снижение содержания белковых веществ и, как следствие, резкое ухудшение технологических свойств зерновых культур при дроблении. Денатурированные белки в таком зерне при дальнейшей переработке
на спирт оседают на технологическом оборудовании и трубопроводах, становясь новыми очагами развития микроорганизмов-контаминантов [5].
Молочнокислые бактерии (МКБ) – это грамположительные, неспорообразующие (за исключением Sporolactobacillus)
палочки или кокки, факультативные анаэробы и микроаэрофилы. Метаболизм МКБ бродильного типа с образованием в качестве конечного продукта молочной кислоты (гомоферментативные бактерии) либо смеси молочной кислоты с СО2, уксусной
кислотой и/или этиловым спиртом (гетероферментативные бактерии) [37, 121]. Некоторые МКБ обладают способностью гидролизовать крахмал, например Lactobacillus amylolyticus, выделенные из пивного сусла, и Lb. manihotivorans, выделенные из
продуктов брожения крахмала маниоки [37]. Многие МКБ устойчивы к температуре, минеральным кислотам и этиловому
спирту.
Группа МКБ включает несколько родов: р. Lactobacillus
(типовой представитель Lb. delbrueckii) – клетки палочковидной формы, но иногда почти кокковидные, встречаются как гомоферментативные, так и гетероферментативные представители; гомоферментативные кокки р. Enterococcus (типовой представитель E. faecalis, прежнее название Streptococcus faecalis),
р. Lactococcus (типовой представитель L. lactis), р. Pediococcus
(основной представитель P. damnosus); гетероферментативные
кокки р. Leuconostoc (типовой представитель Leuc. mesenteroides) [37, 122]. Согласно последним данным род Leuconostoc
составляют три филогенетически разных рода: Leuconostoc sensu
stricto, Oenococcus oenos (прежнее название Leuconostoc oenos) и
Weissella, в который входят Leuconostoc paramesenteroides и некоторые гетероферментативные лактобациллы (например,
89
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Lb. confusus и Lb. kandleri, называемые теперь W. confusa и
W. kandleri) [37].
МКБ являются частыми контаминантами производственных процессов, связанных со спиртовым брожением, до 44–87 %
от общего количества выделенных бактерий [96, 117, 123].
С жизнедеятельностью МКБ связаны такие «заболевания»
вин, как: скисание вина (накопление молочной и других летучих
кислот), «ожирение», или «болезнь тягучих вин», разложение
глицерина – прогоркание, разложение винной кислоты [124].
«Заболевания» вин вызывают гетероферментативные (Lb. fermentum, Lb. buchneri, Lb. brevis, Lb. cellobiosus, Lb. viridescens,
Lb. fructivorans, Lb. hilgardii, Lb. desidiosus) и гомоферментативные (Lb. plantarum, Lb. casei) лактобациллы, а также гомоферментативные (Pediococcus cerevisiae, P. pentosaceus) и гетероферментативные (Leuconostoc oenos) кокки [125].
Примерно 60–70 % микробиологических инцидентов в
пивоваренном производстве связано с МКБ [126]. МКБ развиваются на солоде, в сусле и в готовом пиве [37, 127]. Многие МКБ,
обнаруживаемые в полупродуктах и пиве, устойчивы к антимикробному действию горьких кислот хмеля, к ним относятся
штаммы Lactobacillus brevis, Lb. lindneri, Lb. paracollinoides, и
Pediococcus damnosus [126]. Неустойчивые к хмелю МКБ могут
развиваться в неохмеленном сусле [127]. Возбудителями порчи
полупродуктов пивоваренного производства (затор, неохмеленное и охмеленное сусло) являются бактерии р. Pediococcus
(Ped. pentosaceus, Ped. inopinatus) [127], а готового пива – р. Lactobacillus (Lb. brevis, Lb. brevisimilis, Lb. casei, Lb. collinoides,
Lb. coryneformis, Lb. curvatus, Lb. lindneri, Lb. plantarum [127],
Lb. paracollinoides [126]) и р. Pediococcus (Ped. damnosus,
Ped. inopinatus) [37, 121, 127, 128]. Последствия развития МКБ в
полупродуктах и пиве – ухудшение вкусовых и ароматических
показателей готового продукта, помутнение [37, 121, 127]. МКБ
могут играть и положительную роль в пивоварении: предлагается использовать их на стадии солодоращения для подавления
развития плесневых грибов [127, 129]. Данное применение осно90
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
вано на способности многих МКБ синтезировать антимикробные
вещества, некоторые из которых имеют белковую структуру и
являются антибиотиками (низин и др.), другие представляют собой низкомолекулярные соединения (органические кислоты, диацетил и др.) [127, 129]. МКБ также могут быть добавлены в неохмеленное сусло для подкисления, при этом рН среды снижается до значения 4,5 и ниже и создаются условия, неблагоприятные для развития других микроорганизмов, способных ухудшить качество пива, а также ускоряются ферментативные процессы и улучшается вкус пива [129]. Для биологического подкисления используют штаммы Lactobacillus delbrueckii, Lb. amylovorus и Pediococcus acidilacti [127, 129].
Контаминация МКБ представляет серьезную проблему
при производстве саке. Данная группа МКБ, называемая в Японии Hiochi bacteria, способна расти при концентрации этилового
спирта 15 % об. и более. В нее входят отдельные штаммы видов
Lactobacillus heterohiochii, Lb. homohiochii, Lb. plantarum, Lb. japonicus, Lb. casei subsp. rhamnosus, Lb. casei subsp. casei [130].
При производстве шотландского виски МКБ попадают в
сусло вместе с экстрактом соложеного ячменя. Экстракт готовят,
обрабатывая размолотый солод горячей водой с температурой
около 63 °С в течение 30 мин. Если количество МКБ превышает
≈ 106 КОЕ/мл, они вступают в конкуренцию с дрожжами за питательные вещества и снижают выход спирта, но при правильном управлении всеми процессами МКБ начинают развиваться
только после того, как дрожжевые клетки перешли в стационарную фазу. Такой процесс, называемый «позднее молочнокислое
брожение», даже поощряется многими производителями виски,
так как улучшает вкусовые качества продукта [131]. В ферментационной среде при производстве виски обнаруживаются следующие виды МКБ: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus brevis, Lb. fermentum, Lb. casei, Lb. ferintoshensis, Lb. acidophilus,
Lb. delbruekii [131], Weissella confusa, W. kimchii [132].
В спиртовом производстве обнаруживаются следующие
МКБ: Lactobacillus plantarum [133], Lb. paracasei, [134] Lb. fer91
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
mentum [135, 136], Lb. casei [137], Lb. brevis [138], Lb. delbrueckii,
Lb. collinoides, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. crispatus
[96, 139, 140], Leuconostoc mesenteroides, Leuc. agglutinans, Lactococcus sp., Pediococcus sp., Weissella sp. [1]. Бактерии Leuc.
mesenteroides образуют слизистую капсулу, которая придает им
устойчивость к температуре и кислотам. В жидких средах они
погибают при 112–120 °С в течение 20 мин, а в 0,5 % растворе
H2SO4 сохраняют жизнеспособность в течение часа [1]. Потери
от развития МКБ в спиртовом производстве могут составить до
22 % конечного продукта [140]. МКБ образуют большое количество органических кислот, которые оказывают негативное воздействие на жизнедеятельность дрожжей: замедляют рост, снижают жизнеспособность клеток, вызывают флокуляцию дрожжей [141], уменьшая тем самым выход спирта [135, 137, 140].
Некоторые МКБ усиливают образование глицерина дрожжами
[140]. Молочная кислота в концентрации 4,8 г/л значительно замедляет почкование дрожжей, а свыше 6 г/л снижает выход этилового спирта [135]. Бактерии рода Leuconostoc (например, Leuc.
agglutinans) продуцируют слизистый полисахарид декстран, который обволакивает клетки дрожжей, препятствуя тем самым
поступлению питательных веществ, а также склеивает клетки
друг с другом, вызывая их агглютинацию [1, 142].
Для эффективного предотвращения развития МКБ в бродильных производствах требуются высокие начальные концентрации дрожжей в сусле – 3·107–4·107 КОЕ/мл [134].
В экспериментах [139] с искусственной контаминацией
сусла бактерии Lactobacillus plantarum, Lb. fermentum, Lb. rhamnosus при концентрации ≈ 106 КОЕ/мл снижали финальную концентрацию спирта примерно на 2 % по сравнению с контролем,
Lb. paracasei вызывали подобный эффект уже при концентрации
≈ 105 КОЕ/мл. Авторы объясняют этот эффект большей толерантностью к спирту, более короткой стадией адаптации и/или
интенсивным метаболизмом данной бактерии. При сильной контаминации сусла ≈ 109 КОЕ/мл снижение выхода спирта составило от 3,8 до 7,6 % в зависимости от штамма [139].
92
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В то же время D. Bayrock и W.M. Ingledew показали, что в
условиях непрерывного сбраживания высокоплотного сусла бактерии Lb. paracasei не способны оказывать существенного влияния на жизнеспособность дрожжей и количество образуемого
ими этилового спирта даже при 70-кратном численном превосходстве [117].
Маслянокислые бактерии – грамположительные спорообразующие палочки, облигатные анаэробы. Споры маслянокислых бактерий устойчивы к нагреванию. Продуцируемая ими
масляная кислота в очень малых концентрациях (0,0005 %) подавляет развитие дрожжей [1]. При концентрации кислоты 0,024
% размножение дрожжей составляет только около 3 % от первоначального. Под влиянием этой кислоты дрожжи сильно ослабевают, в результате чего в бражке остается много несбродившего
сахара. Наряду с масляной кислотой маслянокислые бактерии
могут образовывать уксусную, молочную, капроновую, каприловую и другие кислоты, а также этиловый и бутиловый
спирты и ацетон. Наиболее распространены следующие виды
маслянокислых бактерий: Clostridium butyricum, C. pasterianum,
C. saccharobutyricum [1], C. aerotolerans, C. clostridiiforme [96].
Оптимальная температура для роста бактерий – 30–40 ºС, при рН
ниже 4,9 они не развиваются [1]. Как анаэробы эти бактерии обнаруживаются в самых недоступных местах: в трубопроводах,
насосах, запорной арматуре и т.д.
Уксуснокислые бактерии – грамотрицательные палочковидные бесспоровые, строго аэробные организмы, развивающиеся в тех же условиях, что и дрожжи. Они вызывают порчу
вина, пива, сидра и т.д. [37, 121]. Данные бактерии способны
окислять этиловый спирт в уксусную кислоту, пропиловый
спирт – в пропионовую кислоту, бутиловый спирт – в масляную
кислоту. При накоплении в сбраживаемом сусле 0,01 % уксусной кислоты задерживается, а при 0,2 % подавляется жизнедеятельность дрожжей. Некоторые виды этих бактерий способны окислять также глюкозу в глюконовую кислоту, ксилозу и
арабинозу – в ксилановую и арабановую кислоты. Этиловый
93
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
спирт – главный источник жизнедеятельности уксуснокислых
бактерий [1].
Наиболее распространенные виды уксуснокислых бактерий: Acetobacter aceti, Acet. pasteurianum, Acet. oxydans. Они имеют форму палочек длиной 1–3 мкм, часто соединены в цепочки.
Оптимальная температура для роста – 20–35 ºС [1]. При концентрации спирта выше 6 % размножение большинства уксуснокислых бактерий прекращается, но некоторые штаммы (Acetobacter
sp. BS05, Gluconobacter oxydans NCIB 9013) способны расти при
10 % и даже 12–13 % концентрации спирта [37].
Бациллы – грамположительные спорообразующие палочки, аэробы или факультативные анаэробы [122]. Они подвижны,
образуют споры, отличающиеся высокой термоустойчивостью,
температурный оптимум для их развития – 36–50 ºС [1]. Наиболее часто встречаются Bacillus subtilis, B. mesentericus. B. subtilis,
B. mesentericus, B. megatherium являются нитритообразующими
бактериями (редуцирующими нитраты в нитриты). Нитриты в
концентрации 0,0005 % задерживают размножение дрожжей [1].
Сообщается, что некоторые виды Bacillus вызывают порчу неохмеленного пивного сусла [37].
Бактерии семейства Enterobacteriaceae – грамотрицательные палочки, факультативные анаэробы, обладающие дыхательным и бродильным типами метаболизма, большинство представителей восстанавливают нитрат [143]. Данное семейство включает большое количество родов бактерий, многие из которых
являются потенциальными контаминантами бродильных производств. Так, на пивоваренных предприятиях обнаруживаются
следующие: Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Obesumbacterium, Proteus, Rahnella, Serratia, Erwinia [37, 121]. Наиболее
часто в неохмеленном сусле развиваются Rahnella aquatilis,
Citrobacter freundii, Klebsiella terrigena, K. oxytoca, Obesumbacterium proteus, в охмеленном – Rahnella aquatilis, Obesumbacterium
proteus [127]. Энтеробактериальная контаминация сусла происходит чаще всего на начальном этапе брожения. Энтеробакте-
94
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
рии продуцируют различные метаболиты, ухудшающие вкус
пива [37, 121].
Obesumbacterium proteus устойчива к спирту и способна
расти при его концентрации до 6 % об. Бактерии данного вида
размножаются вместе с дрожжами и тормозят процесс ферментации. O. proteus – контаминант засевных дрожжей [37].
Rahnella aquatilis хорошо развиваются в сусле независимо
от присутствия дрожжей, аккумулируются в повторно используемых засевных дрожжах. R. aquatilis гибнут при концентрации
спирта 11–12 % об. [37].
Citrobacter freundii понижает жизнеспособность дрожжей,
чувствителен к высоким концентрациям спирта [37].
Дикие дрожжи представляют значительную опасность
для спиртового брожения. Они потребляют большое количество
сахара и образуют мало спирта, снижая тем самым его выход.
Многие из них превращают сахар в органические кислоты и другие метаболиты и окисляют спирт [1, 144]. В настоящее время
известно, по крайней мере, 24 вида диких дрожжейконтаминантов родов Candida, Torulaspora, Kluyveromyces,
Pichia, Brettanomyces, Dekkera, Williopsis и др. [37, 121, 145–147].
Из них наибольшую опасность представляют Dekkera bruxellensis, Pichia galeiformes и Candida tropicalis, обнаруженные в самых серьезных случаях контаминации (до 30 % от общего количества дрожжевой биомассы) на спиртовых заводах Бразилии,
США и Канады [146]. Оперативное выявление контаминации
сусла дикими дрожжами может быть осуществлено при помощи
ПЦР-анализа [146, 148, 149].
Согласно другим данным дикие дрожжи, в частности
Brettanomyces и Dekkera, не способны оказывать существенного
влияния на процесс спиртового брожения [150, 151], так как
скорость их роста в нормальных условиях сусла ниже скорости
роста Saccharomyces cerevisiae, а инциденты с участием дрожжей родов Brettanomyces и Dekkera связываются со злоупотреблением некоторыми спиртовыми заводами практикой аэрирования [150]. В аэробных условиях дрожжи Brettanomyces bruxel95
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
lensis ферментируют глюкозу в уксусную кислоту вместо этанола [150]. Для нормального спиртового брожения концентрация
кислорода в сусле должна составлять примерно 8–20 мг/л, что
соответствует скорости аэрации 0,00011–0,00028 мл воздуха на
мл сусла в минуту, но предприятия обычно добавляют кислород
в большом избытке, создавая тем самым благоприятные условия
для размножения дрожжей родов Brettanomyces и Dekkera и синтеза ими уксусной кислоты [152].
Мицелиальные грибы не представляют непосредственной
угрозы спиртовому брожению, так как оно протекает в анаэробных условиях. Хотя некоторые плесневые грибы способны расти
в микроаэрофильных условиях [39], литературные данные об их
жизнедеятельности в бродящем сусле отсутствуют. Тем не менее
микотоксины – вторичные метаболиты плесневых грибов – подавляют жизнедеятельность дрожжей и способны замедлить
процесс брожения [46–48].
4.2. Меры, предотвращающие развитие
микроорганизмов-контаминантов
Жизнедеятельность микроорганизмов контаминантов на
предприятиях бродильной промышленности наносит значительный ущерб: нарушается нормальный ход технологических процессов, уменьшается выход готовой продукции, ухудшается ее
качество, поэтому прежде всего необходимо предупредить возможность их развития. На предприятиях бродильной промышленности должна соблюдаться чистота – это одно из условий
профилактики микробной контаминации производства [1].
Наиболее эффективными средствами борьбы с нежелательными для спиртового брожения микроорганизмами являются стерилизация и дезинфекция [1]. В спиртовом производстве
применяется тепловая стерилизация оборудования и сырья паром, обработка химическими соединениями, применение биологически активных веществ, физико-химическая обработка сырья.
96
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Существенное снижение микробной контаминации полупродуктов происходит в процессе разваривания зернового замеса, однако к концу брожения количество бактерий увеличивается
в 50 раз [153].
Для поддержания микробиологической чистоты в спиртовом производстве при переработке зернового сырья в условиях
пониженных температур проводят стерилизацию разваренной
массы, основная цель которой заключается в инактивации микроорганизмов. Кроме того, наличие стерилизатора в аппаратурно-технологической схеме позволяет получать максимально
прогидролизованное сусло благодаря возможности изменять
температурный режим обработки (прежде всего в сторону его
снижения) в зависимости от используемого зернового сырья и
ферментного препарата [5]. В настоящее время на спиртовых
заводах, как правило, применяются два режима стерилизации
разваренной массы: кратковременная (5–10 мин) при температуре
115–120 °С в трубчатом стерилизаторе и длительная (30–40 мин)
при 105–110 °С в емкостном [5].
Наибольшим бактерицидным эффектом обладает насыщенный водяной пар под давлением. При стерилизации паром время гибели спор наиболее устойчивых термофилов при
121 °С – 25 мин, при 132 °С – 4 мин, тогда как при использовании сухого жара время гибели при 160 °С – 60 мин. Инактивация
таких спор в кипящей воде при 100 °С происходит чрезвычайно
медленно, они гибнут через 8–9 ч. При температуре ниже 100 °С
теряют жизнеспособность лишь 2 % термоустойчивых спор [154].
Гибель микроорганизмов под действием высоких температур
происходит в результате коагуляции белков. Особое значение
при этом имеет содержание воды в клетке: чем больше воды, тем
ниже температура коагуляции белков [155].
Чем меньше длительность стерилизации, тем выше должна быть температура среды. Некоторые споры даже при высокой
температуре не погибают, лишь ослабевает их способность к
быстрому прорастанию. Отмирание микроорганизмов под действием высокой температуры происходит неравномерно. Среди
97
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
массы клеток встречаются более устойчивые и менее устойчивые к действию температуры [155]. Режим стерилизации зависит
от количественного содержания микроорганизмов в среде и от
ее объема. Чем больше микроорганизмов в среде и больше ее
объем, тем дольше необходимо ее нагревать для полного уничтожения микроорганизмов. Действие температуры в кислых средах сказывается сильнее, чем в нейтральных [155].
Необходимо подчеркнуть, что в промышленных ферментерах имеются труднопрогреваемые зоны (запорно-регулирующая арматура, открытые трубные окончания, тупиковые полости), температура в которых может отличаться от заданной на
10–15 °С, а иногда даже на 50 °С [155].
Многие химические вещества угнетают развитие микроорганизмов и при определенных концентрациях убивают их.
Этим широко пользуются для борьбы с микроорганизмами. Эффект дезинфекции в значительной степени зависит от концентрации химического вещества и времени контакта его с микроорганизмами. В малых дозах многие ядовитые вещества не только не подавляют и не убивают микроорганизмы, но, напротив,
стимулируют их биохимическую активность. С повышением
концентрации дезинфектантов проявляется их бактерицидное
действие, вначале в отношении вегетативных форм микроорганизмов, а затем и в отношении спор. Продолжительность контакта находится в обратной зависимости от концентрации антисептика: с повышением концентрации необходимая длительность воздействия уменьшается. Чем больше микроорганизмов в
среде, тем большая концентрация антисептика должна быть
применена для их уничтожения.
В качестве антисептиков применяют хлорную известь,
негашеную известь, формалин, антиформин, сернистый газ,
серную кислоту, четвертичные аммонийные соединения, надуксусную кислоту, пероксид водорода, глутаровый альдегид
и др. [156, 157]. Некоторые из этих антисептиков прибавляют в
небольших количествах в продукты, предназначенные для брожения, другие используют для мойки трубопроводов и аппара98
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
туры. Часто для борьбы с вредными микроорганизмами сочетают оба способа: стерилизацию и дезинфекцию [1, 97].
В пивоварении применяют кислоты и щелочи, обеспечивающие одновременно и мойку, и дезинфекцию оборудования. К
дезинфектантам, используемым в пивоварении, относятся: неорганические и органические хлорсодержащие вещества, используемые для обработки воды (гипохлорит натрия, хлорированный
фосфат натрия, трихлоризоциануровая кислота), йодофоры
(комплексные соединения йода и поверхностно активных веществ), надуксусная кислота, пероксид водорода для распрыскивания из моющих головок при асептическом розливе, четвертичные аммонийные соединения, биогуанидины, изотиазодины
и т.д., большинство из них применяются при мойке оборудования и помещений [37, 156].
Сернистую кислоту в виде слабого водного раствора сернистого ангидрида применяют для дезинфекции зеленого солода, солодового молока и в редких случаях осахаренной массы, а
также для дезинфекции помещений [1].
Хлорную и обыкновенную известь, формалин, каустическую соду применяют для дезинфекции аппаратов, посуды и помещений [1].
Формалин и сернистая кислота являются более сильными
средствами дезинфекции, чем известь, но они дороже и оказывают нежелательное действие на стенки аппаратов и посуды: под
их воздействием металл корродирует [1].
При дезинфекции, независимо от использования того или
иного антисептика, положительный результат достигается лишь
в том случае, когда со стен, полов, аппаратов и из трубопроводов будет удалена грязь, остатки солода, сусла, бражки и т.д.,
поэтому сначала необходимо очистить и промыть поверхность
водой, а затем дезинфицировать ее [37, 156].
Для обеззараживания солода применяют гашеную известь, хлорную известь, сернистый ангидрид, марганцевокислый
калий или двухромовокислый калий, формальдегид, пероксид
водорода [76]. Формальдегид вносят в количестве 1,0–1,5 кг на
99
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1 т ячменя, перманганат калия добавляют в количестве 10–15 г
на 1 м3 воды, 30 % раствор пероксида водорода вносят в количестве 3 л на 1 м3 замочной воды [76]. Добавление пероксида водорода способствует также лучшему прорастанию водочувствительных ячменей [76].
С целью повышения микробиологической чистоты зернового сырья предлагается использовать мойку и пропаривание [3], ИК-обработку [6, 63]. При этом ИК-обработку используют не только для снижения содержания микроорганизмов,
но и для изменения биохимических и технологических
свойств зерна [6, 63].
Очень часто для контроля уровня микробной контаминации в спиртовом производстве сусло подкисляют до рН 4,0. Однако согласно последним данным это сопровождается также
снижением продуктивности дрожжей по этанолу. При низких
значениях рН большая часть органических кислот в сусле находится в недиссоциированной форме, наиболее токсичной для
дрожжей [158].
С увеличением концентрации растворенных веществ в
сусле наблюдается линейное снижение скорости роста молочнокислых бактерий, вероятно, вследствие осмотического стресса,
следовательно, альтернативным решением проблемы микробной
контаминации может быть предложенное N.V. Narendranath и
P. Power сбраживание высоконцентрированного сусла (содержание сухих веществ > 30 %) при рН 5,0–5,5 [158].
Уменьшения содержания микроорганизмов в зерновом
замесе можно добиться механическим гидроизмельчением зернового сырья аппаратами роторно-пульсационного типа. Гомогенизирующий эффект суперкавитационного роторно-пульсационного аппарата (РПА) типа «S-эмульгатор» основан на активном совместном механическом и сонокавитационном воздействии на высоковязкие среды. Согласно представленным в работе [4] данным замес на основе тонко измельченной ржаной обдирки, разваренный при 125 ºС в течение 45 мин, становится
практически стерильным, если он подвергался однократной об100
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
работке S-эмульгатором. Для заторов с большим средним диаметром частиц дробины, по мнению авторов, надежной деконтаминации можно добиться, увеличив кратность его обработки.
Снижение температуры разваривания гомогенизированных замесов с 135 до 125 ºС привело к увеличению выхода спирта в
среднем на 0,11 дал/т условного крахмала при нормативном закисании бражки [4].
Для уменьшения содержания посторонних микроорганизмов воду, поступающую в технологический процесс, желательно подвергать какой-либо дополнительной обработке: хлорированию, ионизации, обработке УФ- или ИК-лучами и т.д. Это
особенно важно в схемах переработки зерна при низких температурах [5, 10].
Alcarde и другие [19, 159] предлагают использовать гамма-излучение для снижения микробной обсемененности сока сахарного тростника, используемого для производства спирта. Показано, что данная обработка снижает микробную обсемененность сока, в результате чего снижается конечная кислотность
сброженного сока и повышается выход спирта.
На ряде спиртовых заводов в Бразилии для предотвращения развития диких дрожжей, контаминирующих производство
топливного этанола, используется фунгицид – полигексаметил
бигуанидин [145].
Эффективным средством, снижающим уровень бактериальной контаминации спиртового производства, является 3,4,4трихлоркарбанилид [136].
Метабисульфит натрия в концентрации 0,25 % предотвращал микробную контаминацию при производстве топливного
этанола [160].
В результате использования химических антисептиков,
таких как формалин и хлорная известь, в спирте увеличивается
содержание альдегидов и некоторых других побочных продуктов, ухудшающих качество готового продукта. В связи с этим
проводится активная работа по разработке новых высокоэффективных и безопасных препаратов антимикробного действия [17].
101
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Одним из направлений в исследованиях по снижению
уровня микробной контаминации в спиртовом производстве является применение биологически активных веществ: антибиотиков, ферментов и их продуцентов.
Штаммы дрожжей, характеризующиеся повышенным образованием янтарной и винной кислот, способны замедлять развитие молочнокислых бактерий [133].
В работе [138] предлагается использовать в качестве продуцентов этанола лактаттолерантные дрожжи Candida glabrata,
и добалять в среду культивирования молочную кислоту до концентрации 2 %. Данная концентрация эффективно угнетает рост
молочнокислых бактерий, но не оказывает влияния на образование этилового спирта дрожжами C. glabrata.
В результате скрининга дрожжей с выраженной антибактериальной активностью и малой склонностью к флокуляции
был выделен штамм Saccharomyces sp. M26, ингибировавший
рост Lactobacillus fermentum, использование которого позволит
лучше контролировать уровень микробной контаминации процесса брожения [161].
Хитозан в концентрациях 3–6 г/л увеличивал продолжительность лаг-фазы диких дрожжей р. Brettanomyces и не оказывал влияния на скорость роста дрожжей S. cerevisiae при их
смешанном культивировании [162].
На основе штаммов актиномицетов, проявляющих специфический антагонизм по отношению к молочнокислым бактериям, был разработан препарат, названный лактоцидом, и технология его применения в спиртовой промышленности. Данный
препарат подавляет размножение и жизнедеятельность молочнокислых бактерий [125].
Для подавления роста бактерий и удаления присутствующих в бражке микроорганизмов-контаминантов предложено
применение фермента лизоцима. Лизоцим обладает мурамидазной активностью, он расщепляет β-1,4- связи между N-ацетилмурамовой кислотой и остатком 2-ацетамидо-2-дезоксиглюкозила в мукополисахаридах или мукопептидах, образующих кле102
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
точную стенку бактерий, что приводит к ее разрушению [113].
Лизоцим в концентрации 700 ррm был эффективен против
L. plantarum [163].
В настоящее время на отечественном рынке биологических продуктов представлено несколько антимикробных препаратов широкого спектра действия: Каморан [7], Лактозид 247
(смесь антибиотиков, подавляющих развитие таких микроорганизмов, как Lactobacillus, Acetobacter, Streptomyces, Pediococcus,
Leuconostoc) [8], рекомендуемых для применения в спиртовой
промышленности.
В спиртовой промышленности применяются различные
антибиотики: бацитрацин [15], вирджинамицин [16, 164], пенициллин G [116], низин [163], пеницилловая кислота V, клиндамицин [157] монензин [165] т.д. Антибиотик вирджинамицин,
выделенный из микроорганизма, известного как Streptomyces
virginiae, относится к классу стрептограминов. Механизм его
действия основан на связывании двух активных центров на рибосомальной субъединице 50S, что влечет за собой необратимые
нарушения синтеза пептидов в клеточной стенке бактерий. Благодаря тонкой природной организации рибосом их кардинальной
перестройки посредством мутаций довольно трудно достигнуть.
Именно этот факт обеспечивает замедленный механизм развития
резистентности у чувствительных микроорганизмов и позволяет
применять препарат даже в отношении штаммов, резистентных к
другим бактериальным ингибиторам [9, 17].
B 1994 г. на основе вирджинамицина был создан продукт,
получивший название Лактрол, в настоящее время производимый фирмой PhibroChem [9, 17]. Действующий компонент Лактрола придает препарату высокую активность против широкого
спектра бактерий, относящихся к родам Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Sarcina, Clostridium, Bacillus. Особенно
эффективен Лактрол в отношении представителей рода Lactobacillus – основных инфекционных контаминантов спиртового
брожения [9, 17]. При применении препарата наблюдается значительное подавление роста грамположительных бактерий и
103
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
существенное увеличение скорости утилизации глюкозы среды.
Использование препарата Лактрол на спиртовых заводах США и
Бразилии позволяло снизить потенциальные потери от микробной контаминации до 11 % от количества произведенного этанола [9, 17].
Пеницилловая кислота V (0,1–0,2 мкг/мл), клиндамицин
(0,05–0,40 мкг/мл) эффективно подавляли рост бактерий L. fermentum и Leuc. mesenteroides [157].
Низин (8,6 ppm) в сочетании с эмульгатором Tween 20
(0,1 %) задерживали лаг-фазу L. fermentum на 12 ч, не влияя при
этом на дрожжи [163].
Антибиотики могут добавляться в сусло непрерывно
или периодически. При добавлении пенициллина G в среду
культивирования до концентрации 2,475 Е/л количество бактерий Lactobacillus paracasei снижалось: с 8·109 КОЕ/мл до
1,02·105 КОЕ/мл при непрерывной подаче антибиотика и до
2,77·105 КОЕ/мл – при пульсирующей подаче с интервалом 6
ч. При этом жизнеспособность дрожжей увеличивалась вдвое,
а потери спирта сокращались на 40 % [116].
В патенте [166] предложен способ задержки роста бактерий в средах спиртовой ферментации, которую осуществляют добавлением полиэфирного ионофорного антибиотика в
ферментационную среду в концентрации 0,3–3,0 частей на
миллион (ppm).
Некоторые короткие синтетические пептиды, производные лактоферрицина В, проявляют фунгицидное действие в
микромолярных концентрациях и могут быть использованы для
подавления жизнедеятельности диких дрожжей Dekkera
bruxellensis, Zygosaccharomyces bailii и Zygosaccharomyces
bisporus в виноделии и спиртовом производстве [167, 168].
Следует отметить, что у антибиотиков есть ряд недостатков: высокая стоимость и возникновение антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов [20], в связи с чем в последние
годы активно ведутся поиски новых эффективных и недорогих
химических дезинфектантов, безопасных для производства.
104
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В тестировании ряда соединений на предмет возможности
их использования для снижения микробной контаминации в производстве этилового спирта наибольшую эффективность показали
сульфит натрия (10–40 мкг/мл), нитрит натрия (<117 мкг/мл),
сульфат меди (75–300 мкг/мл) [157].
В работе [169] показано влияние совместного действия
мета-бисульфита натрия и пероксида водорода на жизнеспособность дрожжей и молочнокислых бактерий Lactobacillus fermentum 7-1 и Lb. casei 4-3. Установлено, что метабисульфит натрия в
концентрации 100–400 мг/л снижал жизнеспособность бактерий,
но не влиял на дрожжи. На основании данных, что метабисульфит натрия проявлял свое антимикробное действие только в
присутствии кислорода и был более эффективным против Lb.
casei 4-3 с высокой активностью пероксидазы, чем против Lactobacillus fermentum 7-1 с низкой активностью данного фермента,
авторы статьи выдвинули гипотезу, согласно которой бактериальная пероксидаза катализирует окисление сульфита в свободные радикалы трехокиси серы SO3-•, HSO3-•. Данные радикалы очень реакционноспособны и обладают сильным бактерицидным действием. Клетки дрожжей не подвержены действию
метабисульфита натрия, так как содержат каталазу, разлагающую пероксид водорода. Исследование спиртового брожения с
рециркуляцией клеток и искусственной контаминацией молочнокислыми бактериями Lactobacillus fermentum 7-1 (концентрация клеток бактерий в ферментере 3,1·108 КОЕ/мл) показало,
что после обработки концентрата клеток смесью метабисульфита натрия и пероксида водорода количество жизнеспособных
клеток Lb. fermentum 7-1 снижалось до 1,9·107 КОЕ/мл, а концентрация спирта возрастала с 57,2 (контроль без обработки) до
78,1 г/л [169].
Добавление пероксида карбамида до концентрации
30–32 мМоль/л снижало количество жизнеспособных клеток
пяти видов молочнокислых бактерий (Lactobacillus plantarum,
Lb. paracasei, Lb. sp. штамм 3, Lb. rhamnosus, Lb. fermentum) с
≈ 107 КОЕ/мл до ≈ 102 КОЕ/мл в течение 2 ч обработки пше105
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ничного сусла при 30 °С перед внесением дрожжей. При сбраживании необработанного сусла, содержащего Lb. paracasei в
количестве ≈ 107 КОЕ/мл, выход спирта снижался на 5,84 % по
сравнению с суслом, в которое был добавлен пероксид карбамида. Антимикробная активность пероксида карбамида зависела от
содержания твердых частиц в сусле, так для дезинфекции
фильтрата сусла, не содержащего твердых частиц, действующая
концентрация пероксида карбамида составила только 2 мМоль/л.
По мнению авторов статьи, пероксид карбамида позволит не
только эффективно снижать микробную контаминацию в технологии спирта, но и будет способствовать развитию дрожжей, т.к.
является легкоусваиваемым источником азота [170].
4.3. Влияние антимикробной обработки целого зерна на
основные показатели производства спирта
Для оценки влияния предварительной дезинфекции цельного зерна пероксидом водорода на показатели процесса брожения и выход этилового спирта были поставлены соответствующие эксперименты. Зерно пшеницы и ржи обрабатывали 3 %
раствором пероксида водорода в течение 120 мин, затем размалывали, добавляли воду с учетом количества, поглощенного при
замачивании, ферментный препарат амилосубтилин Г3Х. Полученный зерновой замес подвергали развариванию, осахариванию
и сбраживанию согласно технологии. В контрольных опытах
зерно в течение 120 мин выдерживали в дистиллированной воде,
далее измельчали, смешивали с водой, разваривали, осахаривали
и сбраживали.
Проведение дезинфекции на стадии подготовки сырья
оказывало положительное влияние на процесс производства
спирта. Опытные бражки характеризовались меньшим нарастанием титруемой кислотности в процессе брожения по сравнению
с контрольными (рис. 9).
106
8
7
6
5
4
3
2
1
Пшеница
контроль
зрелая
бражка
осахаренная
масса
зрелая
бражка
0
осахаренная
масса
Концентрация кислот в пересчете на
уксусную, г/л
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рожь
3 % пероксид водорода
Рис. 9. Влияние антимикробной обработки зернового сырья
пероксидом водорода на изменение титруемой кислотности в
процессе брожения
Титруемая кислотность зрелых бражек, полученных из
обеззараженного зерна, была на 1,03–1,10 г/л (в пересчете на уксусную кислоту) ниже данного показателя в контрольных образцах. Данный эффект, вероятно, связан с инактивацией кислотообразующих микроорганизмов при обработке зерна пероксидом
водорода. Между тем, разница в значениях рН контрольных и
опытных вариантов была слабо выражена (рис. 10).
107
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6
5,5
рН, ед.
5
4,5
4
3,5
3
осахаренная
масса
зрелая
бражка
Пшеница
контроль
осахаренная
масса
зрелая
бражка
Рожь
3 % пероксид водорода
Рис. 10. Влияние антимикробной обработки зернового сырья
пероксидом водорода на изменение рН в процессе брожения
Четкой корреляции нарастания титруемой кислотности в
процессе брожения от снижения рН не существует вследствие
высокой буферности среды [1, 97, 171, 172].
Проведенная антимикробная обработка зерна пероксидом
водорода позволила снизить содержание нерастворенного крахмала (рис. 11) и несброженных углеводов (рис. 12) в зрелых
бражках.
108
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Нерастворенный крахмал, г/100 мл
0,34
0,32
0,3
0,28
0,26
0,24
0,22
0,2
Пшеница
контроль
Рожь
3 % пероксид водорода
Рис. 11. Влияние обработки зернового сырья пероксидом
водорода на содержание нерастворенного крахмала
в зрелой бражке
Вероятно, при таком способе дезинфекции наряду со
снижением микробной обсемененности происходит также гидратация биополимеров зерна, что приводит к ускорению клейстеризации крахмальных гранул, повышению качества процесса
разваривания, в результате чего в разваренной массе остается
меньше нерастворенного крахмала.
109
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4,6
Несброженные углеводы, г/л
4,1
3,6
3,1
2,6
2,1
1,6
1,1
0,6
0,1
Пшеница
контроль
Рожь
3 % пероксид водорода
Рис. 12. Влияние обработки зернового сырья пероксидом
водорода на содержание несброженных углеводов
в зрелой бражке
Уменьшение содержания несброженных углеводов в
опытных бражках (рис. 12) может быть связано с меньшим нарастанием титруемой кислотности среды. Из литературных данных известно, что органические кислоты подавляют рост дрожжей, ускоряют их отмирание [1, 139].
Влияние антимикробной обработки зернового сырья на
содержание этилового спирта в зрелых бражках представлено на
рис. 13.
110
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
9,5
9,3
Этанол, % об.
9,1
8,9
8,7
8,5
8,3
8,1
7,9
Пшеница
контроль
Рожь
3 % пероксид водорода
Рис. 13. Влияние обработки зернового сырья пероксидом
водорода на содержание этилового спирта в зрелой бражке
В результате проведенной антимикробной обработки зерна пероксидом водорода содержание спирта в опытных зрелых
бражках повышалось относительно контроля на 0,3 % об. для
ржи и на 0,4 % об. для пшеницы.
Увеличение содержания этилового спирта, по всей видимости, обусловлено, с одной стороны, снижением прямых потерь сбраживаемых углеводов на развитие посторонних микроорганизмов, с другой – устранением негативного влияния их метаболитов на клетки дрожжей.
Разработанная технологическая схема производства этилового спирта с обеззараживанием цельного зернового сырья
пероксидом водорода представлена на рис. 14.
111
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
112
Рис. 14. Схема производства этилового спирта, включающая антимикробную обработку
зернового сырья пероксидом водорода
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Зерно со склада поступает в воздушно-ситовой сепаратор 1,
где происходит его очистка от примесей, отличающихся толщиной и аэродинамическими свойствами (парусностью). Далее
зерно очищается от металлических примесей в магнитном сепараторе 2 и подается на триерную установку 3, где происходит
отделение примесей, отличающихся от основной культуры по
длине. Очищенное зерно взвешивается на автоматических весах 4
и поступает в моечно-замочные аппараты 5, где смешивается с
водой и раствором пероксида водорода, поступающим из сборника 6 при помощи насоса 7. В моечно-замочных аппаратах 5
зерно выдерживается в течение времени, необходимого для его
обеззараживания.
Затем зерно подают на вальцовый станок 8 для измельчения. Измельченное зерно поступает в форсмеситель 9, где смешивается с ферментными препаратами и водой, поступающими
из сборников 10 и 11 при помощи насосов 12 и 13 соответственно. Далее зерновой замес поступает в смеситель-предразварник
14, из которого подается плунжерным насосом 15 через контактную головку 16, в которой нагревается острым паром, в аппарат
тепловой гидродинамической и ферментативной обработки
(ТГФО) I ступени 17. В аппарате ТГФО I ступени замес выдерживается при постоянном перемешивании, осуществляемом механической мешалкой и рециркуляцией с помощью насоса 19, в
течение заданного времени, затем подается при помощи насоса 20
через контактную головку 21 в аппарат ТГФО II ступени 22, где
также выдерживается при постоянном перемешивании мешалкой и рециркуляцией насосом 23 в течение определенного времени. Пар в контактные головки 16 и 21 подается из коллектора
острого пара 18. Из аппарата ТГФО II ступени разваренная масса насосом 24 подается в паросепаратор 25 и далее в осахариватель 26; туда же при помощи насосов 27 из сборников 28 подаются осахаривающие ферментные препараты.
Готовое сусло при помощи насоса 29 через теплообменник 30 поступает в дрожжегенераторы 31 и бродильные аппара-
113
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ты 32. По окончании брожения зрелая бражка направляется на
брагоректификацию.
Отличие данной схемы от существующих заключается в
том, что нами предлагается введение в технологию пищевого
этилового спирта стадии обработки цельного зерна пероксидом
водорода в моечно-замочных аппаратах. Измельчение обработанного зернового сырья производится на вальцовых станках,
применяемых в мукомольной промышленности.
Внедрение предложенной схемы позволит эффективно
снижать микробную обсемененность зернового сырья и повысить выход этилового спирта.
К достоинствам схемы следует отнести также более качественное отделение крахмала от оболочек зерна. При экспозиции
зерна в воде, а следовательно и в водном растворе пероксида водорода повышаются пластические свойства оболочек зерна, а
эндосперм сохраняет хрупкость [23]. Данное свойство зерна используется в мукомольной промышленности при сортовом помоле [23, 27]. При размоле зерна это улучшает отделение крахмалистой части зерна от оболочек, что приведет к повышению
качества разваривания.
Дополнительным плюсом применения обработки цельного зерна растворами пероксида водорода является предотвращение пыления на этапе его измельчения, что позволит улучшить
условия труда на производстве.
4.4. Технология получения этилового спирта с
использованием пероксида водорода на стадии воднотепловой обработки сырья
4.4.1. Предпосылки применения пероксида водорода на стадии
водно-тепловой обработки зернового замеса
Повсеместное распространение в спиртовой промышленности механико-ферментативной схемы разваривания зернового
замеса, характеризующейся пониженными температурами обра114
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ботки, серьезно обострило проблему развития микроорганизмовконтаминантов в ходе технологического процесса [5, 6]. Развитие посторонних микроорганизмов пагубно сказывается на жизнедеятельности дрожжей: снижается их бродильная активность,
подавляется размножение. В результате развития микроорганизмов-контаминантов происходит повышенное накопление органических кислот, а также других метаболитов, способных повлиять на брожение или ухудшить качество этанола [1, 12].
Основное количество микроорганизмов-контаминантов попадает на производство вместе с зерном и водой [5, 6, 10, 12, 63].
Существующие в настоящее время режимы гидротермической
обработки водно-зерновых замесов предусматривают в случае
необходимости их стерилизацию при 105 ºС в течение 30 мин,
что явно недостаточно для таких грубодисперсных систем [4].
Вместе с тем на многих заводах исходя из экономических соображений температуру разваривания не поднимают выше 95 ºС,
в результате чего микроорганизмы-контаминанты сусла сохраняют жизнеспособность, снижается бродильная активность
дрожжей, возрастают потери крахмалсодержащего сырья с несброженными углеводами.
Для предотвращения развития микроорганизмовконтаминантов в спиртовой промышленности применяются антибиотики (лактоцид, лактрол, вирджинамицин) [7–9, 15–17] и
химические дезинфектанты (формалин, сернистая кислота,
хлор) [1, 28]. Тем не менее в случае нарушений режимов использования антибиотиков велика вероятность появления антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов [20], а формалин и сернистая кислота токсичны для дрожжей [1].
Очевидно, что для эффективного снижения уровня микробной контаминации полупродуктов спиртового производства
требуется вещество, обладающее широким спектром антимикробного действия, но при этом не оказывающее негативного
воздействия на клетки дрожжей. Подобное сочетание трудноосуществимо, следовательно, необходимо интенсифицировать
поиск иных способов решения проблемы микробной контамина115
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ции в спиртовой промышленности. Таким способом может быть
применение антимикробного соединения на более ранних стадиях производства спирта, до внесения дрожжей.
Анализ научных публикаций показал, что антимикробную обработку в технологии этилового спирта проводят на стадиях подготовки сырья и брожения. В литературе отсутствовали
данные о возможном проведении данной обработки на стадии
разваривания.
Нами были проведены исследования по применению пероксида водорода на стадии разваривания зернового замеса для
снижения микробной контаминации полупродуктов спиртового
производства [173–175].
На начальном этапе работы было установлено, что пероксид водорода целесообразно добавлять на финальной стадии
разваривания, когда каталаза зерна, вызывающая бурное разложение пероксида водорода и, как следствие, обильное пенообразование, полностью инактивирована в ходе предшествующей
температурной обработки. Отсутствие сильного вспенивания
полупродукта делает возможным промышленное применение
данного способа антимикробной обработки. Кроме того, при такой схеме антимикробной обработки пероксид водорода не препятствует ферментативному гидролизу зернового замеса
α-амилазами.
Тепловую гидродинамическую и ферментативную обработку (ТГФО) проводили по двум режимам. Первый режим
предложен В.Л. Яровенко с соавт. [1] и представляет собой в некотором роде классическую схему ТГФО зернового замеса. Измельченное зерно смешивали с водой температурой 50–55 ºС,
после чего полученный замес нагревали до температуры 70 ºС и
проводили тепловую гидродинамическую и ферментативную
обработку (ТГФО) I ступени в течение 150 мин, ТГФО II ступени проводили при 95 ºС в течение 30 мин [1]. В опытные образцы разваренной массы на II ступени ТГФО вводили пероксид
водорода до концентрации 0,03; 0,05; 0,1 % в водной фазе полупродукта;
116
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Однако практика работы спиртовых заводов выявила ряд
недостатков данной схемы ТГФО: 1) повышенный расход острого
пара в процессе нагрева и выдержки зернового замеса при 95 °С;
2) температура 95 °С не является оптимальной для действия αамилазы [176].
Э.Н. Колдиным с соавт. [176] была предложена схема, оптимальная с точки зрения технологических показателей, экономии теплоресурсов и эффективности работы термостабильных
ферментных препаратов, включающая смешивание помола с водой при температуре 50–55 °С, последовательный нагрев и выдержку массы при 72–75 °С в течение 90 мин, при 80–83 °С в
течение 90 мин и стерилизацию при 105 °С в течение 30 мин.
Данная схема была положена нами в основу второго режима
ТГФО [175].
При проведении разваривания по второму режиму ТГФО
использовали два контроля: первый контроль подвергали стерилизации 30 мин при 105 °С, второй контроль осахаривали непосредственно после выдержки при 83 °С. Опытные варианты вместо стерилизации обрабатывали пероксидом водорода.
Технологическая схема производства этилового спирта с
проведением обеззараживания зернового замеса на стадии тепловой гидродинамической ферментативной обработки представлена на рис. 15.
Очищенное зерно поступает в молотковую дробилку 1.
Далее измельченное зерно поступает в форсмеситель 6, где смешивается с ферментными препаратами и водой, поступающими
из сборников 2 и 3 при помощи насосов 4 и 5 соответственно.
Далее зерновой замес поступает в смеситель-предразварник 7, из
которого подается плунжерным насосом 8 через контактную головку 9, в которой нагревается острым паром, в аппарат тепловой гидродинамической и ферментативной обработки (ТГФО) I
ступени 12. В аппарате ТГФО I ступени замес выдерживается
при постоянном перемешивании, осуществляемом механической
мешалкой и рециркуляцией с помощью насоса 11, в течение
заданного времени, затем подается при помощи насоса 13 через
117
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
118
Рис. 15. Схема производства этилового спирта с проведением антимикробной обработки на
стадии тепловой гидродинамической ферментативной обработки зернового замеса
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
контактную головку 14 в аппарат ТГФО II ступени 18, где также
выдерживается при постоянном перемешивании мешалкой и рециркуляцией насосом 17 в течение определенного времени. Пар
в контактные головки 9 и 14 подается из коллектора острого пара 10. Из аппарата ТГФО II ступени разваренная масса насосом 19 подается в паросепаратор 20 и далее в осахариватель 23;
туда же при помощи насосов 22 из сборников 21 подаются осахаривающие ферментные препараты. Готовое сусло при помощи
насоса 24 через теплообменник 25 поступает в дрожжегенераторы 26 и бродильные аппараты 27. По окончании брожения зрелая бражка направляется на брагоректификацию.
Антимикробную обработку зернового замеса проводят в
аппарате ТГФО II ступени раствором пероксида водорода, поступающим из сборника 15 при помощи насоса 16.
Новым в предложенной схеме является проведение антимикробной обработки зернового замеса на стадии тепловой гидродинамической ферментативной обработки посредством введения в него раствора пероксида водорода.
4.4.2. Антимикробное действие пероксида водорода,
вносимого на стадии водно-тепловой обработки
зернового замеса
Исследования показали, что без добавления пероксида
водорода микробная контаминация разваренной массы сохраняется на высоком уровне вне зависимости от режима ТГФО
(табл. 7).
Известно, что эффективность тепловой стерилизации зависит от активности воды: чем она выше, тем быстрее погибают
микроорганизмы [155]. Зерновой замес содержит большое количество водосвязывающих веществ, таких как белки и полисахариды, снижающих активность воды. Данные вещества оказывают протекторное действие на микроорганизмы, обволакивают их
и препятствуют проникновению воды внутрь клеток, повышая
тем самым их резистентность к действию высоких температур.
119
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 7. Влияние режима ТГФО на количественное
содержание микроорганизмов в разваренной массе
Наименование
1 Режим ТГФО
2 Режим ТГФО
показателя
Контроль
Контроль 1
Контроль 2
Количество микроорганизмов,
КОЕ/мл
6,8·105±35000
3,1·103±15000 8·105±35000
Некоторые бактерии, например Leuconostoc mesenteroides,
образуют слизистую капсулу, благодаря которой они способны
выдерживать температуры 112–120 °С в течение 20 мин [1].
Из представленных данных следует, что низкотемпературная гидротермическая обработка зернового замеса в производстве спирта не обеспечивает необходимый уровень стерилизации полупродуктов. Следовательно, для повышения эффективности деконтаминации зернового замеса требуется сочетание
различных методов стерилизации.
Нами были проведены эксперименты по изучению влияния пероксида водорода, добавляемого на стадии ТГФО, на микробную контаминацию разваренной массы [175].
Выживаемость микроорганизмов в разваренной массе в
зависимости от концентрации пероксида водорода в водной фазе
и режима ТГФО представлена на рис. 16, 17.
В результате проведенных исследований было установлено, что пероксид водорода за короткий промежуток времени эффективно снижал выживаемость микроорганизмов в разваренной массе.
Так, добавление в разваренную массу пероксида водорода
до концентрации 0,1 % мас. в водной фазе приводило к снижению выживаемости микроорганизмов со 100 до 0,38 % за 5 мин
при температуре 95 °С (1 режим ТГФО) и со 100 до 1,88 % за
10 мин при температуре 83 °С (2 режим ТГФО). Минимальная
исследованная концентрация пероксида водорода 0,03 % в вод120
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ной фазе полностью подавляла микроорганизмы разваренной
массы в течение 30 мин при температуре 95 °С (1 режим ТГФО).
Известно, что пероксид водорода проявляет антимикробные свойства, начиная с концентрации 0,1 % [21, 22]. В нашем
случае даже наименьшая концентрация Н2О2 0,03 % вызывала
практически 100 % гибель микроорганизмов в разваренной массе после 30 мин обработки при 95 °С. Снижение действующей
концентрации пероксида водорода, вероятно, обусловлено совместным действием пероксида водорода и температуры.
100
Âû æèâàåì î ñòü, %
80
60
40
20
0
0
2
4
6
8
0,03 % Í 2Î
2
0,05 % Í 2Î
2
0,10 % Í 2Î
2
10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Ï ðî äî ëæèòåëüí î ñòü î áðàáî òêè, ì èí
Рис. 16. Выживаемость микроорганизмов в разваренной массе,
полученной по 1 режиму ТГФО, в зависимости от концентрации
пероксида водорода в водной фазе разваренной массы [175]
121
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
100
Âû æèâàåì î ñòü, %
80
60
40
20
0,2 % Í 2Î
2
0,3 % Í 2Î
2
0
0
2
4
6
8
10
12
14
Ï ðî äî ëæèòåëüí î ñòü î áðàáî òêè, ì èí
Рис. 17. Выживаемость микроорганизмов в разваренной массе,
полученной по 2 режиму ТГФО, в зависимости от концентрации
пероксида водорода в водной фазе разваренной массы [175]
Таким образом, в результате проведенных исследований
было установлено, что добавление пероксида водорода на финальной стадии разваривания приводило к снижению выживаемости микроорганизмов со 100 до 0 % за короткий промежуток
времени (5–30 мин в зависимости от концентрации Н2О2 в водной фазе полупродукта и использованного режима ТГФО). Следовательно, применение пероксида водорода позволит отказаться от термической стерилизации разваренной массы и, следовательно, приведет к экономии энергоресурсов.
Более низкая температура тепловой гидродинамической
ферментативной обработки позволит также снизить потери сбраживаемых углеводов, происходящие при протекании реакций термической дегидратации и меланоидинообразования [1, 28, 100].
122
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Замедление реакции меланоидинообразования положительным образом влияет на бродильную активность дрожжей.
Известно, что меланоидины отрицательно влияют на жизнедеятельность дрожжей, подавляют активность их ферментов инвертазы и каталазы. Благодаря наличию положительного электрокинетического ζ-потенциала, меланоидины адсорбируются на
поверхности дрожжевых клеток, имеющих отрицательный ζпотенциал, затрудняя тем самым поступление в них питательных
веществ [45]. С понижением рН среды степень адсорбции меланоидинов возрастает [1, 45].
4.4.3. Влияние пероксида водорода на содержание
нерастворенного крахмала в зрелых бражках
Помимо несброженных растворимых углеводов в бражке
всегда присутствует некоторое количество нерастворенного
крахмала; при нормальном ведении процесса его содержание находится в пределах 0,050–0,200 г/100 мл [1, 171, 172].
На рис. 18 представлены данные о влиянии пероксида водорода, вносимого на стадии разваривания, на содержание нерастворенного крахмала в бражках.
Исследование содержания нерастворенного крахмала в
зрелых бражках показало, что оно также зависит от количества
вносимого пероксида водорода и, следовательно, от его концентрации в развариваемой массе. Опытные образцы бражек
содержали меньшее на 0,04–0,17 г/100 мл (лабораторные условия) и на 0,02–0,14 г/100 мл (пилотная установка) количество
нерастворенного крахмала. С повышением концентрации пероксида водорода в разваренной массе количество нерастворенного
крахмала снижалось. Минимальное содержание нерастворенного крахмала в бражках составило 0,09 г/100 мл независимо от
режима и условий разваривания (рис. 18).
123
0,3
0,2
0,1
0,3
0,2
0
(контроль2)
0
(контроль1)
0,1
0,05
0,03
0
0 (контроль)
Нерастворенный крахмал,
г/100 мл
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1 Режим ТГФО
2 Режим ТГФО
Концентрация пероксида водорода, %
Рис. 18. Содержание нерастворенного крахмала в зрелых
бражках, полученных на пилотной установке, в зависимости от
начальной концентрации пероксида водорода
в разваренной массе
По всей видимости, пероксид водорода вызывает более
полную деструкцию крахмальных гранул, происходящую при
разваривании, и ускоряет их клейстеризацию. Из литературных
источников известно, что пероксид водорода деполимеризует
крахмал за счет уменьшения размеров кристаллических областей
и переводит его в растворимую форму [21, 22]. Способность пероксида водорода ускорять растворение крахмала связана с малым размером молекулы, что позволяет ему глубоко проникать в
трехмерную сетку набухших крахмальных гранул и тем, что он,
как и вода, может образовывать водородные связи с гидроксильными группами крахмала [21, 22]. Более полное растворение
крахмала ускоряет его гидролиз амилолитическими ферментами,
в результате чего в сусле повышается содержание сбраживаемых
углеводов.
124
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4.4.4. Влияние антимикробной обработки на изменение
кислотности сусла в процессе брожения
Нарастание кислотности сусла в процессе брожения обусловлено накоплением органических кислот, основное количество которых образуется в результате жизнедеятельности микроорганизмов-контаминантов [1, 139]. Спиртовые дрожжи Saccharomyces cerevisiae продуцируют значительно меньше кислот.
Слабые органические кислоты обладают широким спектром антимикробного действия и используются для консервирования зерна [14, 69–72], пищевых продуктов и т.д. Их присутствие в питательной среде негативно влияет на жизнедеятельность
дрожжей [139, 177–180]. Дрожжи S. cerevisiae в аэробных условиях могут использовать короткоцепочечные органические кислоты (молочную, уксусную) в качестве единственного источника углерода. При этом происходит индукция определенных ферментов анаболических путей и специфических механизмов
транспорта, однако присутствие в среде глюкозы репрессирует
данные пермеазы и пути их биосинтеза [180].
Антимикробные эффекты слабых органических кислот
связаны со снижением внутриклеточного значения рН ниже физиологического оптимума [181]. Второй составляющей токсического действия органических кислот является внутриклеточная
аккумуляция анионов. Цитоплазматическая мембрана непроницаема для ионов органических кислот. Высокая концентрация
анионов повышает внутриклеточное давление (тургор). В аэробных условиях анионы могут вызывать образование свободных
радикалов, приводящих к окислительному стрессу [179].
Органические кислоты вызывают изменения в структуре
клеточных мембран, в частности в жирнокислотном и фосфолипидном составе, и транспорте питательных веществ и ионов, а
также влияют на синтез белков [182]. В результате стресса, вызванного слабыми органическими кислотами, подавляются гены,
кодирующие локализованные в цитоплазматической мембране
транспортные белки, которые отвечают за поглощение клетками
125
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
дрожжей: фосфатов, серосодержащих аминокислот, цинка, пуринов [183], ароматических аминокислот [184].
Адаптивный ответ дрожжей S. cerevisiae на действие слабых органических кислот включает сильную индукцию Pdr12 –
АТФ-зависимого трансмембранного белка транспортера (ATPbinding cassette transporter (ABC)), который катализирует откачку
анионов органических кислот из цитоплазмы в окружающую
среду [185–187].
Наиболее сильно токсическое действие слабых органических кислот и этилового спирта проявляется при низких значениях рН [133]. В кислой среде органические кислоты находятся
в недиссоциированной форме и поступают в клетку посредством
свободной диффузии [179, 180]. В то время как транспорт анионов данных кислот через цитоплазматическую мембрану регулируется специальными белками [180]. Попав в клетку, органические кислоты быстро диссоциируют вследствие высоких значений рН на протон и анион. Образование протонов снижает
внутриклеточное значение рН, что приводит к подкислению цитоплазмы. Изменение рН играет важную роль в регулировании
многих клеточных процессов. С повышением рН в пределах физиологического диапазона возрастает скорость синтеза ДНК и
РНК [181], активность ключевых ферментов гликолиза также
зависит от значения рН [188].
Микроорганизмы способны поддерживать внутриклеточное значение рН в узком диапазоне, несмотря на значительные
изменения рН среды [180]. Так, при рН среды, равном 3,0, внутриклеточное рН дрожжей S. cerevisiae находится в пределах
5,5–5,75 [188]. Схема регулирования внутриклеточного значения
рН клетками дрожжей S. cerevisiae представлена на рис. 19.
Регулирование рН осуществляется активным транспортом
протонов Н+-АТФ-азой Pma1p, локализованной в цитоплазматической мембране (протонный насос) [179].
126
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 19. Схема регулирования внутриклеточного рН клетками
дрожжей S. cerevisiae [179]
Повышенная активность Н+-АТФ-азы увеличивает толерантность дрожжей к высокой температуре, этанолу, органическим
кислотам и солям [189]. Однако ее деятельность может серьезно
истощить клетку, особенно при длительном воздействии стрессора,
поэтому дрожжи синтезируют мембранный белок Hsp30, снижающий активность Н+-АТФ-азы. Основная функция Hsp30 – сохранение энергии, осуществляемая, через ограничение чрезмерной Н+АТФ-азной активности, например в условиях дефицита глюкозы
[189]. Hsp30 помогает адаптироваться к росту в стрессовых условиях, сопряженных со значительным потреблением энергии АТФ.
Потеря Hsp30 не влияет на толерантность к стрессору, но увеличивает время, необходимое для того, чтобы адаптироваться к росту в
стрессовых условиях [189].
127
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Трансмембранный градиент рН является движущей силой
перемещения питательных веществ (мальтозы, аминокислот) через
цитоплазматическую мембрану [188]. Функционирование протонного насоса является энергозависимым процессом: удаление из цитоплазмы 1 моля протонов требует затраты 1 моля АТФ. Интенсификация работы насоса вследствие высокого уровня протонов, образующихся при внутриклеточной диссоциации органических кислот, приводит к увеличению затрат метаболической энергии АТФ,
в результате чего замедляется рост клеток и снижается выход биомассы на один моль потребленного субстрата [180, 190]. При снижении рН среды ниже 4,0 активность мембранной Н+-АТФ-азы
увеличивается в три раза [133], при этом может поглощаться до 60
% клеточной АТФ [191]. Существует предел, до которого повышенная активность Н+-АТФ-азы может противодействовать внутриклеточному подкислению. Это связано с тем, что повышенная
концентрация накапливающихся анионов изменяет заряд на внутренней стороне клеточной мембраны и, следовательно, электрохимический потенциал [179]. Для устранения этой проблемы дрожжи
синтезируют транспортный белок Pdr12p, функцией которого является выкачивание анионов через цитоплазматическую мембрану
с использованием энергии АТФ [179, 191, 192]. Таким образом, для
выведения из клетки одной молекулы органической кислоты требуется две молекулы АТФ.
Для противодействия изменению заряда на внутренней стороне мембраны дрожжи могут также поглощать из окружающей
среды ионы калия (K+) [193].
Адаптированные к органическим кислотам дрожжевые
клетки, вероятно, уменьшают коэффициент их диффузии через цитоплазматическую мембрану, предохраняя себя от реаккумуляции
выведенного консерванта [179, 192]. Данный эффект более характерен для дрожжей Zygosaccharomyces bailii, чем для Saccharomyces cerevisiae [179].
Липофильные кислоты более токсичны для дрожжей. Концентрация гидрофильной уксусной кислоты необходимая для того,
чтобы полностью подавлять рост дрожжей S. cerevisiae при рН 4–5,
128
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
составляет 80–150 мМ (4,8–9 г/л), а сорбиновой, имеющей аналогичную константу диссоциации, – только 1–3 мМ. Антимикробное
действие липофильных кислот: сорбиновой, октановой, декановой,
бензойной – обусловлено их способностью нарушать упорядоченную структуру клеточных мембран [177, 179]. Кроме того, сорбиновая и бензойная кислоты ингибируют фосфофруктокиназу, что
приводит к серьезному истощению запасов АТФ [179, 194]. В присутствии кислорода липофильные кислоты влияют на процессы
мембранного транспорта и сопряжения окисления в дыхательной
цепи, то есть являются разобщителями. Дисфункция митохондриального электронного транспорта повышает образование супероксидных свободных радикалов в клетках S. cerevisiae, обработанных
сорбиновой или бензойной кислотами [179].
Недостаток некоторых питательных веществ может усиливать цитотоксическое действие органических кислот. Бензойная
кислота в условиях недостатка усваиваемого азота ингибирует
макроавтофагию – процесс повторного использования внутриклеточного азота при наличии доступного источника углерода [195].
Токсичное действие кислот зависит не только от их концентрации, но и от скорости их накопления в среде [178], а также от
концентрации растворенных веществ, состава среды культивирования, температуры и значения рН [196–198]. Одинаковые концентрации молочной и уксусной кислот были более токсичны для дрожжей
S. cerevisiae на минимальной среде с глюкозой, чем на зерновом сусле. Данное явление связано с повышенной буферной емкостью зернового сусла, снижающей концентрацию недиссоциированных кислот [180, 196]. Высокая концентрация растворенных веществ увеличивала восприимчивость дрожжей к действию органических кислот [197]. Концентрация уксусной кислоты, ингибирующая рост
дрожжей и образование ими этанола, снижалась с 1,6 % до 0,4 % при
соответствующем снижении рН замеса с 5,5 до 4,0 [197]. Значения
минимальных концентраций молочной и уксуной кислот, ингибировавших образование этанола дрожжами, снижались с повышением
температуры среды с 30 ºС до 37 ºС [198].
129
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Незначительные количества уксусной (≤ 0,2 %) и молочной
кислот повышают скорость образования этилового спирта. Это
связано с тем, что удаление из цитоплазмы катионов и анионов органических кислот является АТФ-зависимым процессом и для
компенсации возросшей потребности в АТФ дрожжи вынуждены
интенсифицировать гликолиз с соответствующим ускорением образования конечного продукта [179, 190, 197].
Этанол и высшие спирты способны усиливать отрицательное воздействие органических кислот. Они изменяют проницаемость цитоплазматической мембраны и повышают пассивную
диффузию органических кислот в клетку [199]. Органические кислоты в свою очередь снижают толерантность дрожжей к этиловому спирту и температуре. Этим объясняется то, что спирт, полученный в ходе брожения, токсичнее для дрожжей, чем спирт, искусственно добавленный в среду [200].
При нормальном протекании процесса брожения кислотность сусла нарастает не более чем на 0,20 град [28]. Сверхнормативное увеличение кислотности на 0,1 град соответствует затратам
0,6 % от всех сбраживаемых углеводов и вызывает снижение выхода спирта на 0,2–0,23 дал из 1 т условного крахмала [28]. Кроме
того, органические кислоты подавляют размножение дрожжей и
ускоряют их отмирание. Так, масляная кислота в концентрации
0,0005 % ингибирует рост дрожжей [1]. При снижении рН сусла
ниже 4,2 происходит частичная инактивация α-амилазы [1, 28]. Все
это приводит к повышенному содержанию в зрелой бражке несброженных сахаров и нерастворенного крахмала.
Все вышесказанное обусловливает необходимость тщательного контроля изменения рН и нарастания кислотности сусла в
процессе брожения.
Влияние обработки разваренной массы пероксидом водорода на нарастание титруемой кислотности сусла в процессе брожения представлено на рис. 20, 21.
Изменение рН сусла в процессе брожения, проводимого на
пилотной установке, в зависимости от концентрации пероксида водорода в водной фазе разваренной массы представлено на рис. 22, 23.
130
Концентрация кислот
в пересчете на уксусную, г/л
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0 (контроль)
0,03%
0,05%
0,10%
Концентрация пероксида водорода, %
осахаренная масса
зрелая бражка
К о нцентр ация кисл о т
в пер есчете на у ксу сну ю , г/л
Рис. 20. Влияние обработки разваренной массы пероксидом
водорода на изменение титруемой кислотности сусла в процессе
брожения (1 режим ТГФО)
12
10
8
6
4
2
0
0 (контроль 1) 0 (контроль 2)
0,2%
0,3%
Концентрация пероксида водорода, %
осахаренная масса
зрелая бражка
Рис. 21. Влияние обработки разваренной массы пероксидом
водорода на изменение титруемой кислотности сусла в процессе
брожения (2 режим ТГФО)
131
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6,0
ðÍ , åä.
5,5
5,0
ê î í òðî ë ü
0,03 % Í 2 Î
2
4,5
0,05 % Í 2 Î
2
0,10 % Í 2 Î
2
4,0
3,5
0
24
48
72
Ï ðî ä î ë æ è òåë üí î ñòü á ðî æ åí è ÿ, ÷
Рис. 22. Влияние обработки разваренной массы пероксидом
водорода на изменение рН сусла в процессе брожения
(1 режим ТГФО)
6,0
5,5
êî í òðî ëü 1
êî í òðî ëü 2
0,2 % Í 2Î 2
ðÍ , åä.
5,0
4,5
0,3 % Í 2Î
2
4,0
3,5
3,0
0
24
48
72
Ï ðî ä î ëæè òåëüí î ñòü á ðî æåí è ÿ, ÷
Рис. 23. Влияние обработки разваренной массы пероксидом
водорода на изменение рН сусла в процессе брожения
(2 режим ТГФО)
132
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Как видно из представленных данных, все образцы бражек, полученных с применением пероксида водорода, характеризовались меньшим нарастанием титруемой кислотности по
сравнению с соответствующими контролями. С увеличением
концентрации пероксида водорода в водной фазе разваренной
массы нарастание титруемой кислотности сусла уменьшалось.
Снижение уровня рН в опытных бражках также было менее выражено. Следует отметить, что добавление пероксида водорода сдвигает рН осахаренной массы в кислую сторону, по всей
видимости, это связано с тем, что пероксид водорода является
слабой кислотой и диссоциирует на ионы Н+ и ООН- [21, 22].
Известно, что продолжительность тепловой стерилизации
зависит от объема аппарата: чем он больше, тем дольше должна
проводиться температурная обработка [154, 155]. По всей видимости, с увеличением объема реактора «вклад» температуры в
антимикробное действие снижался, и определенное количество
микроорганизмов сохраняло свою жизнеспособность.
Из данных литературы известно, что основными продуктами метаболизма молочнокислых бактерий – наиболее частых
контаминантов в технологии спирта [139, 169, 170] – являются
молочная и уксусная кислоты [139, 140]. Некоторые штаммы
Lactobacillus plantarum продуцируют из фенилаланина и пировиноградной кислоты фенилмолочную и р-гидроксифенилмолочную кислоты, проявляющие противогрибковую и антимикробную активность [201, 202]. Штамм Lactobacillus sanfrancisco CB1 образует смесь уксусной, капроновой, муравьиной,
масляной и н-валериановой кислот [203]. Дикие дрожжи родов
Brettanomyces и Dekkera при избыточной аэрации сусла также
образуют значительные количества уксусной кислоты [150, 179].
Нами было исследовано накопление уксусной и молочной
кислот в процессе брожения осахаренных зерновых замесов, обработанных на стадии разваривания различными концентрациями
пероксида водорода, данные представлены на рис. 24–27 [175].
133
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1000
Óêñóñí àÿ êè ñëî òà, ì ã/ë
800
600
400
200
0
0
24
ê î í òðî ë ü
0,03 % Í 2 Î
2
0,05 % Í 2 Î
2
0,10 % Í 2 Î
2
48
72
Ï ðî ä î ë æ è òåë üí î ñòü á ðî æ åí è ÿ, ÷
Рис. 24. Влияние антимикробной обработки на накопление
уксусной кислоты в процессе брожения (1 режим ТГФО) [175]
1600
Ì î ëî ÷í àÿ êèñëî òà, ì ã/ë
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
0
24
ê î í òðî ë ü
0,03 % Í 2 Î
2
0,05 % Í 2 Î
2
0,10 % Í 2 Î
2
48
72
Ï ðî ä î ë æ è òåë üí î ñòü á ðî æ åí è ÿ, ÷
Рис. 25. Влияние антимикробной обработки на накопление
молочной кислоты в процессе брожения (1 режим ТГФО) [175]
134
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1200
Óêñóñí àÿ êèñëî òà, ì ã/ë
1000
800
600
ê î í òðî ë ü 1
ê î í òðî ë ü 2
0,2 % Í 2 Î 2
400
200
0
0,3 % Í 2 Î
0
24
48
2
72
Ï ðî ä î ë æ è òåë üí î ñòü á ðî æ åí è ÿ, ÷
Рис. 26. Влияние антимикробной обработки на накопление
уксусной кислоты в процессе брожения (2 режим ТГФО) [175]
3500
Ì î ëî ÷í àÿ êèñëî òà, ì ã/ë
3000
ê î í òðî ë ü 1
ê î í òðî ë ü 2
0,2 % Í 2 Î 2
2500
2000
1200
1000
800
600
400
200
0
0,3 % Í 2 Î
0
24
48
2
72
Ï ðî ä î ë æ è òåë üí î ñòü á ðî æ åí è ÿ, ÷
Рис. 27. Влияние антимикробной обработки на накопление
молочной кислоты в процессе брожения (2 режим ТГФО) [175]
135
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Как видно из представленных данных, обработка разваренной массы пероксидом водорода приводит к снижению количества органических кислот, образующихся в ходе брожения.
Содержание уксусной кислоты в опытных зрелых бражках при
проведении разваривания по 1 режиму ТГФО было ниже, чем в
контрольной, на 79–116 мг/л, молочной на 330–556 мг/л в зависимости от концентрации пероксида водорода рис. 24, 25.
Содержание органических кислот зависело от условий
применения пероксида водорода. При разваривании зернового
замеса согласно 2 режиму ТГФО в контрольной бражке, полученной из нестерилизованной разваренной массы, образовывалось 3360 мг/л молочной кислоты, что значительно превышает
аналогичный показатель для контрольной бражки, при получении которой использовался 1 режим ТГФО – 1457 мг/л или 2
режим со стерилизацией – 1158 мг/л. Вероятно, это связано с
тем, что более низкая температура тепловой обработки (83 °С)
не обеспечивает качественную стерилизацию зернового замеса,
вследствие чего большое количество микроорганизмов сохраняет свою жизнеспособность и образует больше кислот в процессе
брожения. Титруемая кислотность контрольной зрелой бражки,
зерновой замес которой разваривали по 2 режиму ТГФО, но не
стерилизовали, также была наибольшей (рис. 21) среди всех исследуемых бражек. Напротив, в опытных бражках, произведенных с использованием 2 режима ТГФО зернового замеса, образовывалось минимальное количество как уксусной, так и молочной кислот даже по сравнению с опытными бражками, зерновой
замес для которых разваривали по 1 режиму ТГФО. Причем содержание кислот в данных бражках слабо зависело от концентрации пероксида водорода и варьировало для уксусной кислоты в
пределах 603–628 мг/л, а для молочной – 292–357 мг/л (рис. 26, 27).
Содержание органических кислот является косвенным
показателем уровня микробной контаминации бражки. Следовательно, несмотря на то, что микробиологический анализ разваренной массы (рис. 16, 17) не показал значимых различий
между действующими концентрациями пероксида водорода к
136
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
концу обработки, можно предположить, что при температуре
83 °С (2 режим ТГФО) пероксид водорода эффективнее действует на микроорганизмы разваренной массы, чем при 95 °С (1
режим ТГФО).
Вероятно, в ходе антимикробной обработки зернового
замеса при температуре 95 °С (1 режим ТГФО) происходит нецелевое расходование пероксида водорода вследствие его быстрого разложения под действием высокой температуры, что приводит снижению его концентрации в водной фазе полупродукта.
Уксусная кислота по своей токсичности для дрожжей
превосходит молочную и начинает действовать при больших
значениях рН среды [197, 204]. Это связано с тем, что константа
диссоциации уксусной кислоты рКа = 4,74 выше, чем молочной
рКа = 3,86, то есть при одинаковом значении рН в среде будет
содержаться больше недиссоциированных молекул уксусной кислоты, чем молочной. А как было уже сказано ранее, органические кислоты проявляют антимикробное действие в недиссоциированной форме. В этом состоянии они легко диффундируют через фосфолипидный бислой цитоплазматической мембраны во внутриклеточное пространство и уже там диссоциируют на ионы вследствие высокого значения рН цитоплазмы [204].
Литературные данные о концентрациях органических кислот, оказывающих негативное воздействие на клетки дрожжей
и выход этилового спирта, противоречивы. P. de Oliva-Neto и
F. Yokoya показали, что молочная кислота в концентрации свыше 4800 мг/л замедляет почкование и снижает жизнеспособность
дрожжей, а в концентрации выше 6000 мг/л снижает выход этанола [135].
K.C. Thomas et all. установили, что уксусная и молочная
кислоты в концентрации 167 мМ (10020 мг/л) и 548 мМ (49320
мг/л) соответственно полностью подавляли рост дрожжей S. cerevisiae [180]. И хотя содержание данных кислот, определенное
нами в исследуемых бражках, было существенно ниже, они все
равно могли оказывать негативное воздействие на активность
дрожжей. Кроме того, этанол и высшие спирты способны усили137
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
вать токсические эффекты органических кислот и снижать их
летальные дозы [199].
Минимальная концентрация уксусной кислоты, ингибирующая рост дрожжей S. cerevisiae, на синтетической питательной среде составила 0,6 % (6000 мг/л; 100 мМ), а молочной –
2,5 % (25000 мг/л; 278 мМ) [204]. И даже очень низкие концентрации данных кислот 0,05–0,1 % (500–1000 мг/л) уксусной и
0,2–0,8 % (2000–8000 мг/л) молочной снижали скорость потребления глюкозы и образования этанола. При одновременном
присутствии молочной и уксусной кислот в среде их негативное влияние на дрожжи усиливается (эффект синергизма действия) [198, 204].
С другой стороны, такая сложная среда, какой является
зерновой замес, оказывает существенное протекторное действие
на клетки дрожжей за счет минорных компонентов (витаминов,
микроэлементов, биологически активных веществ) и повышенной буферной емкости и увеличивает устойчивость дрожжей к
действию кислот и других неблагоприятных факторов [196, 197].
Выявленное нами более низкое нарастание кислотности в
опытных бражках по сравнению с контрольной, по всей видимости, обусловлено подавлением пероксидом водорода жизнедеятельности посторонних кислотообразующих микроорганизмов.
4.4.5. Влияние антимикробной обработки на содержание
несброженных углеводов в зрелых бражках
Об эффективности проведения стадий разваривания, осахаривания и брожения судят по количественному содержанию
несброженных углеводов и нерастворенного крахмала в зрелой
бражке. При содержании несброженных углеводов в зрелой
бражке менее 0,250 г/100 мл технологический процесс можно
считать отличным, 0,251–0,350 г/100 мл – хорошим, и нормальным, если их содержание не превышает 0,450 г/100 мл [171, 172].
На содержание несброженных углеводов в бражке влияет фер-
138
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ментативная активность осахаривающих ферментов и бродильная активность дрожжей [1, 171, 172].
Влияние антимикробной обработки на содержание несброженных углеводов в бражках, полученных в лабораторных
условиях, представлено на рис. 28.
4,5
4
3
2,5
2
1,5
1
0,5
Рожь
0,1
0,05
0,03
0
(контроль)
0,1
0,05
0,03
0
0
(контроль)
Несброженные углеводы, г/л
3,5
Пшеница
Концентрация пероксида водорода, %
глюкоза
мальтоза
Рис. 28. Содержание несброженных углеводов в зрелых бражках,
полученных в лабораторных условиях, в зависимости
от начальной концентрации пероксида водорода
в разваренной массе
139
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Проведенный нами анализ содержания несброженных углеводов показал, что внесение пероксида водорода на стадии
разваривания приводит к снижению их содержания в бражках, в
основном за счет глюкозы. Содержание несброженной мальтозы,
напротив, было даже выше, чем в контрольных бражках. Данный
эффект может быть объяснен более высоким содержанием глюкозы в осахаренной массе, полученной с применением пероксида водорода на стадии разваривания. Повышенные концентрации глюкозы (свыше 0,5 % мас.) подавляют в дрожжевой клетке
гены, ответственные за синтез ферментов, при помощи которых
происходит поглощение и утилизация глюкозы [37]. При очень
высокой концентрации глюкозы в сусле переключение клеток
дрожжей на метаболизм мальтозы в цикле брожения может существенно задержаться, и, если среда к этому моменту будет содержать недостаточно питательных веществ, данный процесс
может либо замедлиться (мальтозная лаг-пауза), либо вообще не
произойти [37].
Вероятно, в бражках, полученных с добавлением пероксида водорода на стадии разваривания, переключение дрожжей
на метаболизм мальтозы происходило позднее, чем в контрольных бражках, когда в среде накапливалось достаточно большое
количество этанола. Данный фактор в сочетании с низким содержанием питательных веществ в сусле, достигаемым к этому
моменту, ослаблял способность дрожжей сбраживать мальтозу.
При получении спирта на пилотной установке мальтозу в
зрелых бражках выявить не удавалось. Это может быть связано с
различным соотношением глюкозы и мальтозы в осахаренной
массе при проведении гидролиза в лабораторных условиях и на
пилотной установке.
Содержание несброженной глюкозы в зрелых бражках
представлено на рис. 29
140
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4
2
0,3
0,2
0
(контроль2)
0
(контроль1)
0,1
0,05
0,03
0
0 (контроль)
Глюкоза, г/л
6
1 Режим ТГФО
2 Режим ТГФО
Концентрация пероксида водорода, %
Рис. 29. Содержание несброженной глюкозы в зрелых бражках в
зависимости от начальной концентрации пероксида водорода в
разваренной массе [175]
Согласно полученным результатам содержание несброженной глюкозы во всех исследованных бражках лежало в пределах нормы (кроме контрольной, полученной с применением 2 режима ТГФО без стерилизации). Вероятно, высокие концентрации
органических кислот, образовавшихся в данной бражке, снижали
бродильную активность дрожжей вследствие токсических эффектов, обсужденных ранее. В связи с этим в качестве контроля для
сравнения содержания несброженной глюкозы в опытных бражках, полученных из зернового замеса, разваренного по 2 режиму
ТГФО, использовали бражку, полученную из стерилизованного
зернового замеса, разваренного по 2 режиму ТГФО.
В опытных бражках содержание несброженной глюкозы
было ниже, чем в контрольных на 1060–1612 мг/л, в зависимости
от концентрации пероксида водорода и режима ТГФО (рис. 29).
141
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Меньше всего несброженной глюкозы было обнаружено в бражках, полученных с применением 2 режима ТГФО (530–288 мг/л).
Вероятно, проведение антимикробной обработки оказывает положительное влияние на бродильную активность дрожжей. Подобное действие пероксида водорода может быть объяснено
снижением уровня микробной контаминации полупродуктов, в
результате чего в сусле происходит меньшее накопление органических кислот, токсичных для дрожжей. Так, О.С. Журба с
соавт. [18] показали, что улучшение микробиологического состояния зерна в результате мойки и пропаривания приводит к
снижению содержания несброженных углеводов в зрелой
бражке.
Повышение бродильной активности дрожжей также возможно за счет более высокого содержания в сусле растворенного кислорода, образующегося при разложении пероксида водорода [21, 22]. На начальном этапе брожения это приводит к более быстрому накоплению необходимого количества клеток
дрожжей, устойчивых к неблагоприятным воздействиям внешней среды и способных более полно сбраживать углеводы сусла.
Дрожжи могут использовать кислород для синтеза ненасыщенных жирных кислот и эргостерина – важнейших компонентов
цитоплазматической мембраны, содержание которых в сусле незначительно [37].
Присутствие в свежем сусле кислорода не будет снижать
количество образующегося этилового спирта вследствие того,
что спиртовое брожение может происходить даже в условиях
значительной аэрации при высоком содержании глюкозы в среде (эффект Кребтри) [37, 118]. Данный процесс, обусловлен высокой скоростью усвоения глюкозы [118], которая вызывает подавление митохондриальных генов, регулирующих цикл трикарбоновых кислот, перенос электронов и окислительное фосфорелирование, в результате чего происходит неполное развитие митохондрий [37].
Третьей причиной, способной повлиять на эффективность
процесса брожения, является возможная окислительная деструк142
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ция пероксидом водорода токсичных для дрожжей компонентов
среды. Так, в литературе имеются данные о способности пероксида водорода разрушать некоторые микотоксины [53, 55, 84].
4.4.6. Влияние антимикробной обработки на содержание
этилового спирта в зрелых бражках
Содержание этилового спирта в бражке является основным показателем процесса брожения. При строгом соблюдении
регламента и технологической инструкции оно должно быть
8–9,5 % об. [1, 171, 172]. Данные о содержании спирта в бражках, полученных с применением пероксида водорода на стадии
разваривания, представлены на рис. 30, 31.
Этанол, % об.
10
9,5
9
8,5
8
7,5
0 (контроль)
0,03%
0,05%
0,10%
Концентрация пероксида водорода, %
Рожь
Пшеница
Рис. 30. Содержание этилового спирта в зрелых бражках,
полученных в лабораторных условиях, в зависимости от
начальной концентрации пероксида водорода
в разваренной массе
143
10,5
9,5
8,5
0,3
0,2
0
(контроль2)
0
(контроль1)
0,1
0,05
0,03
7,5
0 (контроль)
Этанол, % об.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1 Режим ТГФО
2 Режим ТГФО
Концентрация пероксида водорода, %
Рис. 31. Содержание этилового спирта в зрелых бражках,
полученных на пилотной установке, в зависимости от начальной
концентрации пероксида водорода в разваренной массе [175]
Как видно из диаграмм, при увеличении концентрации
пероксида водорода в водной фазе зернового замеса наблюдалось повышение концентрации этилового спирта в зрелых бражках на: 0,5–0,7 % об. (лабораторные условия) и на 0,3–0,9 % об.
(пилотная установка). Полученные результаты согласуются с
представленными и обсужденными ранее положительными эффектами влияния пероксида водорода на уровень микробной обсемененности, накопление органических кислот и сивушных масел, содержание несброженных углеводов и нерастворенного
крахмала в опытных бражках по сравнению с контрольными.
Максимальное количество спирта в зрелой бражке образовывалось при добавлении пероксида водорода до концентрации 0,3 %
в водной фазе и проведении тепловой гидродинамической и ферментативной обработки по 2 режиму ТГФО.
Как уже было сказано ранее, эффективность процесса
брожения может повышаться вследствие возможной окислительной деструкции пероксидом водорода токсичных компонентов среды.
144
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Пероксид водорода способен реагировать с производными коричной кислоты, феруловой и р-кумаровой кислотами, которые входят в состав оболочек зерна в виде сложных эфиров с
арабанами и ксиланами [205], а также присутствуют в структуре
лигнина. Данные кислоты образуются в свободном виде при разваривании [205, 206]. Феруловая и р-кумаровая кислоты проявляют токсическое действие в отношении дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Феруловая кислота в концентрации 5 мМ снижала
продуктивность дрожжей по этанолу в 2,3 раза [207]. В анаэробных условиях ингибирующее действие феруловой кислоты на
дрожжи усиливалось [207].
Пероксид водорода может окислять фенольные соединения по радикально-цепному механизму с образованием нерастворимых в воде полимерных продуктов [80, 81]. Радикальноцепное окисление кислородсодержащих органических веществ
инициируется либо вследствие гомолиза Н2О2 по реакции (12),
либо путем непосредственного взаимодействия Н2О2 с органическим соединением [80].
Феноксикарбоновые кислоты (феруловая, сиреневая, галловая) реагируют с •ОН-радикалами с образованием, наряду с
феноксильными, реакционноспособных карбоксильных и арильных радикалов [80].
Известен способ детоксикации ферментируемой среды от
фенольных соединений пероксидом водорода и реактивом Фентона (FeSO4 – катализатор разложения пероксида водорода)
[208]. Данный процесс может также катализироваться растительными пероксидазами по реакциям (19, 20, 21, 22) [81].
Пероксидазы широко распространены в растительных
тканях, а также в молоке и крови [22]. Они обладают широкой
субстратной специфичностью по отношению к донорам водорода, которыми могут быть фенолы [81], амины, аминокислоты и
строгой специфичностью по отношению к акцептору водорода –
пероксиду водорода [29]. Феруловая кислота является специфическим субстратом для растительных пероксидаз in vivo [209].
145
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Повышенная концентрация спирта в бражках, зерновой
замес для которых разваривали по 2 режиму ТГФО, может быть
связана с тем, что при температуре 83 °С пероксидазы зерна сохраняли некоторую активность и катализировали более полное
окисление фенольных соединений, что в свою очередь повысило
эффективность брожения.
Повышение концентрации этилового спирта в зрелых
бражках может быть также связано с окислительным стрессом,
вызываемым пероксидом водорода у клеток дрожжей.
Из данных литературы известно, что при обработке клеток нелетальными дозами различных стрессоров у них развивается устойчивость к более высоким концентрациям этих веществ [88, 90]. Кроме того, возможно появление перекрестной
устойчивости, когда обработка клеток одним соединением повышает их резистентность к другим [88, 90]. Обработка этанолтолерантного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae этиловым спиртом повышала его резистентность к действию осмотического, температурного и окислительного стрессов [210].
A.P. Gasch et all. показали, что в ответ на различные изменения
окружающей среды: температурный шок, обработка пероксидом
водорода, менадионом (супероксидгенерирующий агент), диамидом (сульфгидрилокисляющий агент), гипер- и гипоосмотический шок, рост в условиях недостатка аминокислот и источников азота – дрожжи экспрессировали большой общий набор генов (≈ 900) [185]. Авторы предполагают, что данный эффект
может объяснять явление перекрестной устойчивости [185].
При проведении качественной реакции на пероксид водорода нами было установлено, что некоторое его количество содержалось в сусле к моменту внесения дрожжей. Это связано с
тем, что защитные коллоиды (желатин, гуммиарабик, яичный
белок, декстрины, крахмал) тормозят каталитическое разложение Н2О2. Подобные свойства коллоидов объясняют повышением вязкости или изменением свойств поверхности, но, главным
образом, образованием адсорбционного соединения пероксида
146
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
водорода на коллоиде, обладающего большей стойкостью, чем
растворенный Н2О2 [21, 22].
Вероятно, дрожжи, развивающиеся в сусле, содержащем
нелетальную концентрацию пероксида водорода, становились
более устойчивы к неблагоприятному действию органических
кислот, высших спиртов и этанола, в результате чего они эффективнее сбраживали углеводы и образовывали больше спирта.
При воздействии на клетки дрожжей пероксид водорода
вызывает индукцию синтеза белков теплового шока – шаперонов
[185], которые помогают правильной сборке трехмерной белковой конформации, защищают расплавленные глобулы от агрегации и переносят новосинтезированные белки в различные локусы клеток [82]. Адаптивный ответ дрожжей на стресс, вызванный действием органических кислот или этилового спирта, также включает индукцию синтеза шаперонов [183].
147
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5. АДАПТАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ К СТРЕССОВЫМ
УСЛОВИЯМ ОРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
5.1. Состояние стресса
Клетки дрожжей в процессе спиртового брожения постоянно подвергаются действию различных стрессовых факторов
(высокая концентрация растворенных веществ в сусле, температура, органические кислоты, этиловый спирт). В связи с чем они
выработали специфические механизмы защиты и адаптации к
ним. Замечено, что нелетальные действия стрессоров повышают
физиологическую активность микроорганизмов и делают их более устойчивыми к действию последующих стрессоров. Выше
нами был описан подобный эффект, когда клетки дрожжей, развивавшиеся в сусле, содержащем на начальном этапе брожения
незначительные количества пероксида водорода, образовывали
больше этилового спирта по сравнению с контролем. Причем
полученные результаты невозможно было объяснить исключительно подавлением жизнедеятельности микроорганизмовконтаминатов в сусле, так как даже самая низкая концентрация
пероксида водорода эффективно снижала микробную контаминацию во всех опытных образцах разваренной массы (рис. 16, 17).
Данная глава посвящена влиянию различных стрессоров на микроорганизмы, в основном дрожжи, и механизмам их адаптации.
Впервые понятие стресса в биологическом значении этого
слова ввел канадский врач и физиолог Ганс Селье, по праву считающийся отцом стрессологии. Согласно ему «стресс есть неспецифический ответ организма на любое предъявленное к нему
требование» [211]. Эффект от действия неблагоприятного фактора зависит от интенсивности требований к приспособительной
способности организма [211]. Еще в XIX в. Клод Бернар высказал гипотезу, что для нормальной жизнедеятельности клетка
должна сохранять постоянство внутренней среды при любых
изменениях среды внешней. Позднее Уолтер Б. Кеннон предложил термин «гомеостазис», означающий способность сохранять
148
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
постоянство [211]. Состояние стресса связано с необходимостью
организма поддерживать постоянство внутренней среды (гомеостаз) в ответ на действие стрессовых факторов.
В молодости Селье обратил внимание на то, что различные неблагоприятные воздействия на организм (инфекционные
заболевания, кровопотеря, действие высоких и низких температур) вызывают одинаковую ответную реакцию. Последующее
изучение данного явления привело к формированию концепции
«общего адаптивного синдрома» (ОАС). Было установлено, что
ОАС имеет три фазы:
1) реакция тревоги (под действием стрессора организм
начинает изменять свои характеристики, но сопротивление его
на данном этапе мало, и, если неблагоприятное воздействие окажется сильным, может наступить смерть);
2) фаза сопротивления (организм оказывает сопротивление, если действие стрессора сопоставимо с возможностями
адаптации, при этом уровень сопротивления поднимается намного выше обычного);
3) фаза истощения (если действие стрессора продолжается длительное время, запасы адаптационной энергии истощаются, в организме происходят необратимые изменения, и наступает
смерть).
Продолжительность фазы сопротивления зависит от врожденных качеств организма и силы стрессора.
Долгое время считалось, что стресс вреден для организма.
Между тем стресс может оказывать как положительное, так и
отрицательное влияние на организм [211–213]. В условиях
стресса происходит перестройка в метаболической активности и
химическом составе клеток, позволяющая выжить в неблагоприятных условиях внешней среды [212]. Так, длительное голодание приводит к остановке клеточного цикла и синтезу набора
стрессовых белков [214].
У многоклеточных организмов регуляция стрессового ответа осуществляется на уровне нервной системы, у микроорганизмов – на биохимическом уровне. Более простая регуляция
149
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
позволяет микроорганизмам быстро адаптироваться и выживать
в условиях стрессового воздействия [215]. Это делает их интересным объектом для изучения стрессовых ответов и стратегий
выживания.
5.2. Стрессовые воздействия и способы адаптации к ним
Все живые клетки реагируют на изменения окружающей
среды. Микроорганизмы вынуждены постоянно адаптироваться
к колебаниям в содержании питательных веществ, температуры,
осмотического давления и рН среды, а также ультрафиолетовому излучению и токсичным соединениям.
Промышленно используемые дрожжи часто подвергаются действию различных стрессоров [216–224]. Хотя, как правило, они более устойчивы по сравнению с лабораторными
штаммами [223, 225], современные условия производства
предъявляют к ним повышенные требования.
Анализ уровня экспрессии генов винных дрожжей S. сerevisiae показал, что при накоплении биомассы индуцируются
гены как общего стрессового ответа, например HSP12, так и некоторые другие – GPD1 и TRX2, характерные для окислительного и осмотического стрессов [216]. В процессе винного брожения существенно изменялась экспрессия 40 % генома дрожжей
[217], а также наблюдалось повышение экспрессии некоторых
стрессовых генов (HSP26, YPR127w, SSA4, UBC4, MSN4) [219].
223 гена были идентифицированы как ответ дрожжей на стрессовые условия брожения (fermentation stress response (FSR)). При
этом 20 % этих генов экспрессируются также при генеральном
стрессовом ответе, 18 % – при недостатке азота, осмотическом,
этанольном и окислительном стрессах [217].
Стресс, вызываемый у дрожжей S. сerevisiae этанолом,
приводит к увеличению содержания ненасыщенных остатков
жирных кислот в составе мембранных липидов, накоплению эргостерина в цитоплазматической мембране, активации транс-
150
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
мембранного протонного насоса (Н+-АТФазы), усилению синтеза трегалозы и белков теплового шока [37, 217, 221, 226–230].
Токсичное действие этилового спирта проявляется в повышении проницаемости цитоплазматической мембраны и последующими за этим нарушениями в трансмембранном транспорте различных соединений [37].
В условиях спиртового брожения этанол является серьезным стрессовым фактором и уже в концентрации 2 % об. вызывает переход культуры в стационарную фазу роста даже при наличии доступных источников азота и углерода. Исследование
дрожжей, растущих в средах, содержащих 6–7 % об. этанола, показало, что он вызывает индукцию генов: общего стрессового ответа, целостности клетки, вакуольного транспорта, митохондриальных, транспортеров белков и белков теплового шока (HSP104,
HSP26, HSP30, HSP42, HSP78, SSA1, SSA4, и SSE1) [217].
Недавние исследования показывают, что белок Hsp26p
может играть важную роль в поддержании жизнеспособности
клеток дрожжей в процессе брожения. Пивоваренные дрожжи в
ходе брожения попадают в условия повышенного осмотического
и гидростатического давлений, подвергаются действию этилового спирта и температурных изменений [220]. В подобные же условия дрожжи попадают и при производстве саке [221]. Уровни
экспрессии генов, кодирующих белки теплового шока (HSP12,
HSP26, HSP42, HSP104, SSA1 и SSA4), повышались на начальных этапах спиртового брожения при получении саке и практически не изменялись до окончания процесса. На заключительных этапах брожения саке увеличились уровни экспрессии генов
(CHS1, GSC2, PIR3, SED1, и SPI1), связанных с биосинтезом
клеточной стенки, продукты которых повышают толерантность
дрожжей к этанолу [221].
Недавние исследования показали, что на толерантность
дрожжей S. сerevisiae к этанолу влияет также аминокислота
триптофан. Штаммы со сверхэкспрессией генов биосинтеза
триптофана были более устойчивы к 5 % этанолу по сравнению
с контрольными. Добавление триптофана в среду и сверхэкс151
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
прессия гена триптофанпермеазы также повышали резистентность дрожжей к этанолу [224].
В ходе эволюции микроорганизмы приобрели способность противодействовать стрессорам на разных уровнях клеточной организации. Механизмы адаптации к стрессу разнообразны: включение систем репарации ДНК, синтез и/или активация ферментов, в первую очередь антиоксидантных, образование внутриклеточных протекторных соединений и экзометаболитов, индукция транскрипции стрессовых белков, посттрансляционная модификация белков, изменение липидного состава
клеточных мембран, изменение формы клеток и клеточной поверхности, формирование биопленок, цитодифференцировка,
изменение трансмембранного транспорта, регуляция экспрессии
различных генов [212, 214, 215, 231–236].
В общем случае механизмы стрессовых ответов включают несколько систем:
а) сенсорную систему (отвечает за ощущение клеткой
стрессового сигнала), это могут быть белки цитоплазматической
мембраны или внутриклеточные ферменты, изменяющие свою
активность при изменении некоторых параметров среды (температура, давление);
б) сигнальный путь, осуществляющий трансдукцию сигнала в ядро клетки для запуска экспрессии стрессовых генов;
в) факторы, активизирующие транскрипцию стрессовых
генов.
В ответ на действие различных стрессовых факторов изменяется текучесть цитоплазматической мембраны. Это происходит в результате изменения соотношения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот [227] или взаимодействия с различными соединениями, например, эргостерин изменяет текучесть
цитоплазматической мембраны, а сахара (сахароза, трегалоза),
взаимодействуя с полярными группами фосфолипидов, стабилизируют таким образом липидный бислой. Одним из наиболее
быстрых ответов в стрессовых условиях является изменение вяз-
152
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
кости мембран вследствие цис-транс-изомеризации ненасыщенных жирных кислот [234].
Штамм дрожжей Saccharomyces cerevisiae var. capensis
показал наибольшую устойчивость к этиловому спирту благодаря высокой концентрации эргостерина и олеиновой кислоты в
цитоплазматической мембране и активации H+-ATФазы [230].
Приобретение дрожжами S. cerevisiae сопротивления к
уксусной кислоте связано с деградацией трансмембранного белка Fps1p акваглицеропорина, который облегчает диффузию данной кислоты в клетку [237].
Признаком стрессового состояния является его обратимость, то есть возможность возврата к нормальной жизнедеятельности при соответствующих изменениях окружающей
среды [213].
Адаптационный ответ дрожжей на действие стрессоров
включает экспрессию более 200 генов, как специфичных к определенному неблагоприятному воздействию, так и универсальных [238].
Действие стрессоров вызывает активацию чувствительных факторов транскрипции, которые изменяют экспрессию генов и соответственно активность метаболических процессов [239].
Под действием стрессоров происходит перестройка в метаболизме, формируются новые пути, снижается экспрессия генов, необходимых в нормальных условиях, и повышается экспрессия генов, кодирующих стрессовые белки, синтезируются
защитные молекулы [214].
На чувствительность к стрессору влияет фаза роста культуры. Клетки стационарной фазы роста более устойчивы к неблагоприятным воздействиям по сравнению с клетками экспоненциальной фазы [240].
Выживанию в стрессовых условиях способствует также
формирование в микробной культуре клеток персистеров. Это
фракция специализированных «переживающих» клеток, более
устойчивых к действию стрессоров за счет замедления роста и
153
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
перехода в покоящееся состояние. В стационарной культуре
клеток содержится, как правило, от 1 до 10 % клеток персистеров [233].
5.3. Тепловой шок
Воздействие высоких температур на микроорганизмы
(тепловой шок) приводит к замедлению роста и последующей
гибели клеток. Губительное действие температуры вызвано повреждением биомембран, агрегацией и денатурацией белков, образованием активных форм кислорода (АФК) [241].
На развитие устойчивости дрожжей S. сerevisiae к высокой температуре влияют убиквитин (белок, обеспечивающий деградацию белков), малые цитоплазматические РНК (обеспечивают селективный синтез мРНК в условиях стресса), полиолы
(глицерин, маннит, эритрит и т.д.), полиоксиуглеводы и сахара
(трегалоза и сахароза), а не шапероны [212, 242]. Одним из
свойств трегалозы является ее способность замещать воду и стабилизировать макромолекулы и клеточные органеллы, что приводит к повышению их термоустойчивости [212].
В состоянии теплового стресса в дрожжах происходит
снижение внутриклеточного значения рН и активация синтеза
белков теплового шока (heat shock proteins (hsp)), называемых
также шаперонами [241, 243].
В зависимости от молекулярной массы шапероны подразделяются на пять основных классов Hsp100, 90, 70, 60 и малые
Hsp (small Hsp, sHsp), каждый из которых выполняет свои функции [244].
Шаперон Hsp90 катализирует заключительный шаг активации многих важных регуляторных белков эукариотических
клеток [245].
Hsp70 участвует в фолдинге вновь синтезированных полипептидных цепей и транспорте их к различным органеллам [244].
154
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Hsp60 эссенциальный митохондриальный шаперон способствует фолдингу многих белков в митохондриальном матриксе и защищает их от окисления [246].
Hsp104 катализирует пересворачивание денатурированных высокой температурой белков [243].
В нормальных условиях содержание шаперонов в клетке
составляет 5–10 % от общего количества белка [246]. Синтез
шаперонов усиливается в ответ на тепловой шок и другие виды
стрессовых воздействий. Они обеспечивают правильную сборку
и стабилизацию конформаций различных белков в процессе их
созревания in vivo, участвуют в трансмембранном транспорте
белков и деградации короткоживущих белков цитозоля, защищают белки от неспецифической ассоциации (денатурации) в
стрессовых условиях и нормализуют функции клеток после прекращения действия стрессора [82, 244, 246–250]. В ответ на повышение температуры происходит быстрая (через несколько секунд) индукция синтеза белков теплового шока [232]. Например,
количество шаперона GroEL в первые 10 с нагревания бактерий
Lactococcus lactis увеличивается в 45 раз [232].
Шапероны связываются с несвернувшейся пептидной цепочкой благодаря высокому сродству к экспонированным гидрофобным участкам, это позволяет защитить новосинтезированный белок от агрегации с другими белками и обеспечить условия
для правильного сворачивания растущего пептида [249]. Контроль экспрессии шаперонов обеспечивается физическим состоянием мембран [212]. Шапероны являются консервативными
белками, некоторые участки белков теплового шока бактерий и
человека сохраняют до 90 % гомологии [232].
Поврежденные белки, нативная конформация которых не
может быть восстановлена шаперонами, подвергаются протеолизу, катализируемому неспецифическими лизосомными пептидазами и высокоспецифичными пептидазами, локализованными
в различных компартментах клетки [251]. Селективная деградация поврежденных и ненужных протеинов осуществляется связыванием их с белком убиквитином, что является пусковым ме155
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ханизмом для АТФ-зависимого протеолиза данных белков. Ген
UBI4, кодирующий предшественника убиквитина, содержащего
5 убиквитиновых единиц, экспрессируется в условиях голодания
и окислительно стресса [251].
Экспрессия белков теплового шока регулируется фактором транскрипции Hsf1 – консервативным белком, обнаруженным у всех эукариотических организмов от дрожжей до человека. Белок Hsf1 связывается с промоторным элементом HSE (Heat
Shock Element (nGAAn)) и активирует экспрессию генов в ответ
на: тепловой стресс, переход в стационарную фазу, голодание по
азоту, действие токсичных химических соединений, вызывающих накопление поврежденных белков в клетке [252, 253, 254].
При температурном стрессе фактор Hsf1 активизирует транскрипцию генов типа STI1, которые кодируют белки, препятствующие денатурации и агрегации белков [255].
Экспрессия генов HSE улучшает способность дрожжей к
росту при повышенных температурах, но практически не влияет
на приобретение ими устойчивости к более высоким температурам или другим стрессорам, тогда как экспрессия STRE-генов
приводит к повышению резистентности дрожжей к более существенным уровням различных стрессов и перекрестной устойчивости [253].
В дрожжах S. сerevisiae имеются и другие факторы транскрипции индуцируемые тепловым шоком – это белки Msn2 и
Msn4, которые активизируют экспрессию генов, кодирующих
некоторые белки теплового шока, ферменты углеводного обмена
и белки, вовлеченные в защиту клетки от окислительного стресса, их активность регулируется цАМФ-зависимой протеинкиназой [252, 253]. Белки Msn2 и Msn4 связываются с промоторным
элементом STRE (Stress Responsive Element). Экспрессия генов,
содержащих элемент STRE, активируется не только тепловым
шоком, но также и в условиях осмотического, окислительного
стрессов, при азотном голодании, под действием органических
кислот, этилового спирта, ионов тяжелых металлов, агентов ал-
156
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
килирующих ДНК, формируя, таким образом, генеральный
стрессовый ответ [252, 253, 256].
Основной причиной гибели клеток при тепловом шоке
считается образование АФК. Мутанты дрожжей, не способные
синтезировать каталазу, супероксиддисмутазу и цитохром с пероксидазу, были более чувствительны к летальному действию
высокой температуры, чем клетки дикого типа. Сверхэкспрессия генов каталазы и супероксиддисмутазы или рост в анаэробных условиях приводили к повышению термоустойчивости
дрожжей [257].
На термоустойчивость дрожжей влияет значение рН
внешней среды. Прединкубация при низких рН (3,0 и 4,5) повышала терморезистентность дрожжей Yarrowia lipolytica [241].
Авторы предполагают, что полученный эффект может быть обусловлен повышением способности клеток поддерживать необходимое внутриклеточное значение рН.
Тепловой шок оказывает влияние и на состав мембранных
липидов, увеличивается содержание насыщенных трудноокисляемых липидов: цвиттериона фосфатидилхолина и сфингомиелина [212].
5.4. Гиперосмотический стресс
Высокие концентрации солей снижают активность воды
за счет гидратации ионов, вызывают отток воды из клетки, агрегацию белков за счет усиления гидрофобных взаимодействий,
препятствуют электростатическому взаимодействию внутри
и/или между макромолекулами [258, 259]. В ответ на действие
осмострессоров клетки синтезируют и/или поглощают органические и неорганические вещества протекторного действия [259].
Существуют две стратегии адаптации к гиперосмотическому
стрессу.
1. Стратегия «соль внутри», когда осмотическое давление
среды уравновешивается высокими внутриклеточными концентрациями солей. Основным внутриклеточным катионом является
157
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ион калия (К+), а анионом – ион хлора Cl-. Ион калия в значительно меньшей степени связывает воду по сравнению с ионом
натрия, что позволяет клеткам осуществлять метаболические
процессы. Аминокислотный состав белков при использовании
данной стратегии претерпевает существенные изменения, увеличивается доля остатков кислых аминокислот (глутаминовой и
аспарагиновой), расположенных, как правило, на поверхности
белка. Заряженные кислые группы сильно гидратируются и
обеспечивают защиту белка от агрегации. В качестве противоионов, необходимых для компенсации большого количества отрицательных зарядов и поддержания метаболически активного
состояния, используются ионы калия. Вследствие чего микроорганизмы, использующие данную стратегию, нуждаются в высоких концентрациях солей для поддержания своей жизнедеятельности [259].
2. Микроорганизмы поддерживают низкие концентрации
солей в цитоплазме и аккумулируют соединения – осмолиты,
которые либо синтезируются внутри клетки, либо поступают из
внешней среды. Осмолиты – это небольшие гидрофильные органические молекулы совместимые с клеточным содержимым
(глицерин, трегалоза, сахароза, пролин, маннит, бетаин и т.д.),
способствующие поддержанию клеточного объема и защищающие белки и мембраны от неблагоприятных факторов (повышение концентрации солей, нагревание, высушивание и т.д.). Избыток ионов солей активно откачивается в окружающую среду
при помощи специальных транспортных систем [232, 259].
Под действием высоких концентраций NaCl у дрожжей
S. cerevisiae усиливается экспрессия генов, вовлеченных в углеводный обмен и производство энергии [260]. Сверхэкспрессия
генов GPD1 (кодирует глицерол-3-фосфатдегидрогеназу), ENA1
(кодирует белок откачки ионов натрия) и CUP1 (кодирует белок
металлотионеин, связывающий ионы меди) повышала толерантность дрожжей S. cerevisiae к гиперосмотическому стрессу [260].
158
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В условиях гиперосмотического стресса дрожжи S. cerevisiae синтезируют и аккумулируют осмолиты – глицерин и трегалозу [232, 261].
Глицерин образуется дрожжами в два этапа, вначале
фосфодиоксиацетон восстанавливается до 3-фосфоглицерина,
который затем дефосфорелируется до глицерина [83]. Данные
реакции катализируются глицерол-3-фосфатдегидрогеназой
(Gpd) и глицерол-3-фосфатазой соответственно (Gpp) [262].
В работе [263] при исследовании 24 коммерческих штаммов винных дрожжей было показано, что вначале спиртового
брожения у всех штаммов повышался уровень экспрессии гена
GPD1, необходимого для синтеза глицерина. Уровень экспрессии других стрессовых генов TRX2, HSP104, SSA3 оставался на
низком уровне. Предположительно высокие концентрации глюкозы подавляют экспрессию генов общего стрессового ответа.
Это связано с тем, что несброженное виноградное сусло – это
среда с высокой концентрацией растворенных сухих веществ,
попадая в которую дрожжи начинают сопротивляться наиболее
значимому на данный момент стрессу – гиперосмотическому –
«не отвлекаясь» на другие.
Установлено, что высокие концентрации глицерина и уксусной кислоты, обнаруживаемые в вине, полученном при сбраживании сока из мороженого винограда1, также являются следствием ответа дрожжей на гиперосмотический стресс [264]. Образование уксусной кислоты при гиперосмотическом стрессе позволяет поддерживать окислительно-восстановительный баланс
в клетках. Для синтеза глицерина необходим НАДН·Н+. Дрожжи
поддерживают баланс НАД+/НАДН·Н+ за счет окисления ацетальдегида до уксусной кислоты при помощи НАД+-зависимой
______________
1
Вино из мороженого винограда (icewine) – традиционный канадский алкогольный напиток – получают из поздно собранных
ягод винограда, подмороженных на лозе, при этом вода в ягодах
превращается в лед, что позволяет получить высококонцентрированное сусло.
159
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
альдегиддегидрогеназы Ald3p, при этом происходит восстановление НАД+ до НАДН·Н+ [264].
Гиперосмотический стресс ощущается дрожжами посредством белков Sln1p и Sho1p, локализованных в цитоплазматической мембране и регулирующих сигнальный путь HOG (high
osmolarity glycerol), представляющий собой каскад митогенактивируемых протеинкиназ (MAPK (mitogen-activated protein
kinase)) [261, 262, 265]. Активация HOG-пути приводит к тому,
что белок Hog1 фосфорилируется и мигрирует из цитоплазмы в
ядро, где взаимодействует с факторами транскрипции, которые
повышают уровень экспрессии стрессовых генов, что впоследствии приводит к увеличению концентрации стрессовых белков.
Продукты HOG-пути активируют фосфофруктокиназу,
стимулируя тем самым гликолиз, и усиливают экспрессию
генов глицерол-3-фосфатдегидрогеназы и глицерол-3-фосфатазы [261, 262].
Поглощение глицерина из межклеточного пространства
осуществляется при помощи белков-акваглицеропоринов (Fps1),
образующих каналы в плазматической мембране и транспортирующих глицерин и другие полиолы [262].
5.5. Окислительный стресс
Все организмы, живущие в аэробных условиях, подвержены токсичному действию «активных форм кислорода» (АФК).
К АФК относятся супероксидный радикал, пероксид водорода,
гидроксильный радикал и различные органические пероксиды.
Данные вещества активно вступают в реакции с липидами, белками и ДНК клетки, нарушая их структуру и функционирование.
Дрожжи S. cerevisiae осуществляют защиту от АФК при
помощи: ферментов, нейтрализующих АФК (супероксиддисмутаза, каталаза, пероксидаза); низкомолекулярных антиоксидантов (глутатион, тиоредоксины, глутаредоксины); секвестрантов
ионов металлов; систем репарации ДНК [266].
160
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Окислительный стресс связан с накоплением внутри клеток АФК и/или нарушением окислительно-восстановительного
статуса клетки [267], когда количество образующихся кислородных радикалов превышает способности клетки к их нейтрализации [214].
К АФК относятся: кислород в возбужденном синглетном
состоянии (*О2), супероксидный радикал (О2¯ •), пероксидный радикал (НО2•), пероксидный ион (НО2–), пероксид водорода
(Н2О2), гидроксильный радикал (ОН•). Время жизни АФК чрезвычайно мало О2¯ • – 10-6 с, ОН• – 10-9 с, однако ввиду высокой
реакционной способности они могут вызвать серьезные повреждения клетки [214, 268].
Факторы, вызывающие окислительный стресс, могут
быть как внешними, так и внутренними [267]. Внутриклеточная
генерация АФК происходит следующим образом:
1) супероксидный анион-радикал образуется при неполном восстановлении кислорода, катализируемом ксантиноксидазами, монооксигеназами, липоксигеназами, и в ходе взаимодействия с различными клеточными компонентами (восстановленные флавины, тиолы, Fe-S белки):
О2 + 1ē → О2¯ •;
(29)
2) пероксид водорода – также при неполном восстановлении кислорода катализируемом флавиновыми оксидазами, при
дисмутации супероксидного анион-радикала, а также под действием света и радиации:
О2 + 2ē + 2Н+ → Н2О2;
(30)
3) гидроксильный радикал ОН• – при взаимодействии супероксидного анион-радикала с пероксидом водорода:
О2¯ • + Н2О2 + Н+ → Н2О + О2 + НО•;
161
(31)
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
и в результате реакции пероксида водорода с двухвалентным
железом и другими переходными металлами (реакция Фентона):
Н2О2 + Fe2+ → Fe3+ + НО– + НО•;
(32)
4) синглетный кислород – при активации молекулярного
кислорода под действием кванта света, в результате взаимодействия фотосенсибилизаторов1 (порфиринов, флавинов и т.д.) в
триплетном состоянии с молекулярным кислородом (фотодинамический эффект), а также при взаимодействии супероксидного
анион-радикала с гидроксильным радикалом [83, 269]:
О2¯ • + НО• → НО– + *О2;
(33)
5) гидропероксидный радикал – при протонировании супероксидного анион-радикала [83]:
О2¯ • + Н+ → НО2•.
(34)
АФК могут образовываться и вне клетки в водных растворах при воздействии на них ультразвуком, в результате фотохимических, химических и электрохимических реакций [83].
Ионизирующее (α-, β-, γ-, рентгеновские лучи) и ультрафиолетовое излучения, повышенная температура и многие другие стрессоры способствуют образованию АФК в клетках [270].
Токсичное действие окислителей приводит к нарушению
целостности биомембран (перекисное окисление липидов), окислению сульфгидрильных групп белков и (4Fe-4S)-кластеров с высвобождением железа, повреждению ДНК [268]. Органические
пероксиды, образующиеся в результате первичного окисления,
инициируют цепную реакцию окисления липидов [232, 268].
______________
1
Фотосенсибилизаторы – соединения (многие природные пигменты), способные поглощать свет и индуцировать химические
реакции, которые в их отсутствие не происходят.
162
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Пероксид водорода вызывает снижение внутриклеточного содержания АТФ [94]. Продукты окисления углеводов и липидов,
например альдегиды, могут ковалентно связываться с функциональными группами белков, вызывая их инактивацию.
Ответ микроорганизмов на действие данных стрессоров
включает различные механизмы защиты: синтез соединений и
ферментов, обладающих антиокислительным действием (глутатион, трегалоза, тиоредоксин, глутаредоксин, супероксиддисмутаза, каталаза [271, 272], пероксидаза, глутатионредуктаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа [273], изоцитратдегидрогеназа, глутатионпероксидаза) [89, 268, 274, 275], которые позволяют дрожжам поддерживать окислительно-восстановительный гомеостаз,
а также активация систем репарации ДНК [276]. Для эффективного функционирования металлоферментов, таких, например,
как Cu/Zn- и Mn-содержащие супероксиддисмутазы, активируются пути транспорта соответствующих ионов [277, 278].
АФК в зависимости от концентрации могут либо увеличивать, либо уменьшать активность антиоксидантных ферментов [89].
Супероксиддисмутаза катализирует диспропорционирование двух супероксидных анион-радикалов с образованием
кислорода и пероксида водорода, каталаза – разложение пероксида водорода до кислорода и воды. Пероксидаза катализирует реакции окисления подходящих органических субстратов (аминов, производных фенола и т.д.) пероксидом водорода. Глутатионпероксидаза катализирует разложение гидропероксидов с использованием глутатиона в качестве восстановителя [232, 270, 274, 279, 280].
Каталаза защищает клетки дрожжей от токсичного действия пероксида водорода [272] и уксусной кислоты [281]. Это
связано с тем, что уксусная кислота вызывает образование пероксида водорода в клетках дрожжей [282].
Белок Lys7p, участвующий в биосинтезе лизина, осуществляет также защиту клетки в условиях окислительного стресса посредством переноса ионов меди к Cu/Zn-супероксидисмутазе [283].
163
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Действие АФК вызывает снижение активности основной
дыхательной цепи митохондрий и переключение потока электронов на альтернативную оксидазу [270].
Дрожжи, культивируемые в аэрируемых средах, более устойчивы к действию АФК, чем те, которые культивируются в
анаэробных условиях. При аэробиозе дрожжи синтезируют
больше защитных молекул (цистеин и глутатион), так как синтез
данных веществ активируется наличием кислорода в среде [284].
В липидном составе мембран клеток, выращенных в
аэробных условиях, содержится больше ненасыщенных и слабо
насыщенных остатков жирных кислот (пальмитиновой и олеиновой), что также делает их более устойчивыми к действию
окислителей и высокой температуры [240].
Дисахарид трегалоза накапливается в клетках дрожжей
при различных типах стрессов (тепловой, окислительный, осмотический и др.), он стабилизирует клеточную мембрану и нативные белки, а также подавляет агрегацию денатурированных белков [274].
Трегалоза повышала жизнеспособность дрожжей S.
cerevisiae при обработке менадионом, но не третбутилгидропероксидом. Особенно заметное защитное действие трегалоза оказывала на клетки с дефицитом супероксиддисмутазы [285].
Трипептид глутатион и небольшие белки тиоредоксин и
глутаредоксин присутствуют в клетке в высоких концентрациях
и действуют, как восстановители [270, 274, 280, 286–289]. Они
обеспечивают защиту важных макромолекул клетки благодаря
наличию легкоокисляемых тиоловых (-SH)-групп.
Глутатион играет важную роль в защите клеток дрожжей
от действия пероксида водорода [289, 290]. Инкубация дрожжей
с аминокислотами, входящими в состав глутатиона, способствовала повышению его внутриклеточной концентрации и приобретению дрожжами устойчивости к пероксиду водорода [290].
Тиоловые группы способны непосредственно вступать в
реакцию с супероксидным анион-радикалом и пероксидом водорода, окисляясь до тиильного радикала (-S-), дисульфида (-S-S-),
164
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
сульфеновой (-SOH), сульфиновой (-SO2H) и сульфоновой кислот (-SO3H) [270, 291]. Сульфоновая кислота, в отличие от других продуктов окисления, в клетке не восстанавливается, и ее
образование приводит к протеасомной деградации белка [287].
Тиоредоксины и глутаредоксины – небольшие высококонсервативные термостабильные белки, играющие важную роль в
защите клеток от окислительного стресса [270, 280, 288, 292].
Тиоредоксин и глутаредоксин участвуют в синтезе дезоксирибонуклеотидов, восстановлении поврежденных белков, фолдинге белков и метаболизме серы [280]. Дрожжи содержат два гена,
кодирующие дитиоловые глутаредоксины (GRX1, GRX2), и три
гена, кодирующие монотиоловые глутаредоксины (GRX3–GRX5),
а также два гена, кодирующие цитоплазматические тиоредоксины (TRX1, TRX2) [270, 280]. Продукты данных генов несколько
отличаются по чувствительности к различным окислителям. Например, дрожжи, мутантные по гену GRX1, были чувствительны
к супероксидному аниону, а мутантные по гену GRX2 – к пероксиду водорода [280].
Тиоредоксин поддерживает каталитическую активность
глутатионпероксидазы и пероксиредоксина, а также способен
непосредственно восстанавливать пероксид водорода и окисленную форму глутатиона [274, 280, 287, 288, 292]. НАДФН+зависимые ферменты глутатионредуктаза, тиоредоксинредуктаза и глутаредуктаза поддерживают необходимый уровень восстановленных глутатиона, тиоредоксина и глутаредоксина в
клетке [270, 274, 280, 286, 287].
Обработка дрожжей S. cerevisiae 200 мМ пероксидом водорода вызывала семикратную индукцию гена TRX1 [293].
Глутатион содержится в клетках в одной восстановленной форме и двух окисленных (дисульфид глутатиона и смешанный дисульфид глутатиона с белками). В нормальных физиологических условиях концентрация восстановленного глутатиона в 10–100 раз больше, чем окисленного. Образование в
стрессовых условиях смешанных дисульфидов белков с глутатионом обеспечивает им защиту тиоловых групп от окисления,
165
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
при этом происходит обратимое ингибирование активности белков, которая восстанавливается по окончании действия стрессора [270, 274, 291]. Начальным этапом образования смешанных
дисульфидов является прямое окисление цистеиновых остатков
до реакционноспособных производных (тиильного радикала или
сульфеновой кислоты), которые затем реагируют с глутатионом
[291]. Образование и восстановление смешанных дисульфидов
катализируется тиоредоксином и глутаредоксином [280, 291].
При этом в нормальных условиях преобладает процесс восстановления смешанных дисульфидов, а в условиях окислительного
стресса – их образования [287].
Помимо выполнения основных функций глутатион является кофактором антиоксидантных ферментов, осуществляет детоксикацию и транспорт меди и эндогенных токсичных метаболитов (метилглиоксаль, формальдегид) [270]. Удаление многих
токсичных липофильных соединений и ионов тяжелых металлов, например кадмия, во внеклеточное пространство происходит только после их соединения с глутатионом. Данный транспорт осуществляется при помощи белка Ycf1, так называемого
GS-X АТФ-зависимого насоса. Белок Ycf1 входит в суперсемейство АТФ-зависимых кассетных белков и сильно гомологичен
человеческому белку MRP1, отвечающему за множественную
лекарственную устойчивость [280].
Под действием окислителей происходит снижение уровня
восстановленного глутатиона, для противодействия данному явлению в клетках происходит активация глутатионредуктазы и
γ-глютамилцистеинсинтетазы, катализирующей синтез глутатиона, а также экскрекция дисульфида глутатиона во внеклеточное пространство [270].
От соотношения количеств восстановленного глутатиона
и дисульфида глутатиона в значительной мере зависит внутриклеточный окислительно-восстановительный потенциал (Ehc).
Существует зависимость между значением Ehc и биологическим
статусом клеток. Так, пролиферация высших эукариот происхо-
166
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
дит при –240 мВ, дифференцировка – при –200 мВ, апоптоз –
при –170 мВ [270].
Защита клеток дрожжей S. cerevisiae от АФК обеспечивается также белками пероксиредоксинами, локализованными во
многих клеточных органеллах и восстанавливающими гидроперекиси до спиртов. К ним относятся тиоредоксинпероксидазы (Tsa1,
Tsa2) и алкилгидропероксидредуктазы (Ahp1) [270, 280, 288].
Данные белки обладают пероксидазной активностью по отношению к пероксиду водорода, пероксинитритам и органическим
перекисям. В результате протекания пероксидазной реакции
цистеин активного центра пероксиредоксина окисляется до
сульфеновой кислоты, а субстрат (пероксид) при этом восстанавливается. Содержащийся в дрожжах пероксиредоксин Tsa1
(thiol-specific antioxidant) помимо антиокислительного действия
обладает также свойствами шаперона. Пероксиредоксин Ahp1
защищает дрожжи от токсического действия ионов тяжелых металлов [270]. Пероксиредоксин играет роль во внутриклеточной
сигнализации, использующей молекулу пероксида водорода в
качестве вторичного мессенджера. Пероксиредоксин может поддерживать низкий уровень пероксида водорода в клетках. При
повышении уровня пероксида водорода в клетке пероксидазная
активность пероксиредоксина снижается, что приводит к активации пероксидом водорода определенных редоксзависимых
сигнальных путей [287].
Установлено, что дрожжи S. cerevisiae в ответ на действие
Н2О2 изменяют экспрессию генов, кодирующих не менее
167 белков, в их числе Cu-, Zn- и Mn-содержащая супероксиддисмутазы, цитозольная каталаза Т, глутатионредуктаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, данный процесс контролируется белками Yap1 и Skn7 [89, 274, 275, 293–295].
Yap включает восемь членов, связывающихся с основаниями ДНК при помощи «лейциновой молнии» [254].
Регулирование активности Yap осуществляется через
внутриклеточную локализацию. В норме белок Yap1 находится в
цитоплазме, но в условиях стресса он связывается с белком
167
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Crm1, экспортирующим его в ядро, что приводит к индукции
экспрессии Yap1-зависимых генов [254, 295]. Несмотря на наличие общих механизмов защиты от АФК, каждый окислительный
фактор имеет свой профиль экспрессии генов [235, 275].
Окислительный стресс у дрожжей индуцирует экспрессию генов пентозофосфатного пути основного источника восстановительных эквивалентов НАДФН+, при этом происходит
переключение метаболического потока с гликолиза на пентозофосфатный путь [296, 297].
Шаперон Hsp60 защищает железо- и серосодержащие
белки (аконитазу и сукцинатдегидрогеназу) дрожжей S. cerevisiae в условиях окислительного стресса, препятствует образованию опасных для клеткок несвязанных ионов железа. Мутантные штаммы дрожжей, образующие больше Hsp60 по сравнению
с диким типом, были более устойчивы к действию пероксида водорода и супероксидного радикала [246].
Митоген-активируемые протеинкиназы Rck1 и Rck2 повышают оксидо- и металлорезистентность дрожжей S. cerevisiae [298]. Rck1 воздействует на белок Yap2 (фактор транскрипции, функционально аналогичный Yap1), способствуя его
ядерной локализации, а Rck2 – на транспортер ионов Zn2+ Zrc1.
Ионы цинка играют важную роль в защите клеток от окислителей, так как являются кофакторами антиоксидантных ферментов [298].
5.6. Влияние стрессоров на внутриклеточную сигнализацию
Передача стрессовых сигналов в клетке осуществляется
посредством активации соответствующих сигнальных путей,
возбуждение которых приводит к увеличению активности специфических факторов транскрипции и далее к повышению экспрессии, зависящих от них генов [265]. Важнейшими стрессактивируемыми сигнальными путями являются каскады митоген-активируемых протеинкиназ [265]. Они обнаружены у всех
168
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
эукариотических организмов от дрожжей до человека и мало изменились в процессе эволюции.
Стрессоры изменяют концентрацию вторичных мессенджеров, прямо или опосредованно влияющих на факторы транскрипции и через них на экспрессию генов [214]. Вторичные
месссенджеры – внутриклеточные вещества, концентрация которых контролируется внеклеточными сигналами. Они образуются из доступных субстратов и имеют короткий биохимический период. АФК могут играть роль вторичных мессенджеров и
тем самым опосредовать действие внешних факторов на экспрессию генов [214].
Важным переносчиком сигналов в клетке является циклический 3',5'-аденозинмонофосфат (цАМФ) [214, 299]. Нуклеотид цАМФ синтезируется мембранными аденилатциклазами, катализирующими реакцию циклизации АТФ с образованием
цАМФ и неорганического пирофосфата, а расщепляется фосфодиэстеразами [249]. Внешний сигнал взаимодействует с рецептором и через так называемые G-белки активирует аденилатциклазу [299]. Нуклеотид цАМФ является аллостерическим эффектором протеинкиназ А и ионных каналов [249]. Протеинкиназы
А являются посредниками общего стрессового ответа и могут
фосфорелировать остатки серина и треонина во многих ферментах и факторах транскрипции, изменяя функциональную активность этих белков [261]. Фосфорелирование белков является одним из основных способов передачи сигналов, контролирующих
различные клеточные процессы [299]. Система цАМФ индуцирует быстрый ответ на стрессовые воздействия [214].
Внутриклеточная концентрация цАМФ изменяется под
действием стрессоров [214]. У дрожжей в результате воздействия различных неблагоприятных факторов происходит снижение
уровня цАМФ. Это связано с механизмом действия цАМФ на
стрессовые гены, которые содержат регуляторную последовательность CREs (cAMP-responsive elements). Снижение уровня
цАМФ приводит к дефосфорелированию CREs-связывающего
169
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
фактора (белка CREB), его диссоциации от элемента CREs и активации транскрипции гена [214, 241].
В ответ на действие слабых органических кислот в клетках дрожжей происходило снижение уровня фосфатидилинозит3,5-дифосфата и повышение уровня фосфатидилинозит-4,5дифосфата, также являющихся сигнальными молекулами стрессового ответа. Фосфатидил-3,5-дифосфат способствует поддержанию внутриклеточного рН-гомеостаза, а фосфатидилинозит4,5-дифосфат вызывает изменения актина цитоскелета. Внутриклеточные содержания фосфатидилинозитдифосфатов изменяются в стрессовых условиях (высокая температура, гипо- и гиперосмотический стресс) [261, 300].
В ответ на действие различных стрессоров клетки для
предотвращения и восстановления повреждений регулируют
транскрипцию генов и трансляцию белков. Передача сигнала от
поверхности клетки к ядру часто осуществляется через каскады
митоген-активируемых протеинкиназ – высоконсервативных
сигнальных модулей обнаруживаемых у всех эукариот [261].
Данный сигнальный путь мало изменился в процессе эволюции,
так как играет важную роль в регуляции экспрессии генов и модуляции активности белков. Действие разнообразных стрессоров
приводит к активации стресс-активируемых протеинкиназ
SAPKs (Stress-Activated Protein Kinases), которые затем фосфорелируют и активируют факторы транскрипции, регулирующие
эспрессию генов [301].
Многие гены, продукты которых повышают устойчивость организмов к различным стрессам, содержат последовательность STRE (Stress Responsive Element (5'-АГГГГ-3' или
5'-ЦЦЦЦТ-3')) в промоторном участке. STRE активизирует экспрессию генов в ответ на многие стрессовые воздействия: присутствие этанола, голодание, снижение рН, окислительный и
осмотический стресс [265]. Под действием стрессора в клетке
происходит синтез факторов транскрипции Msn2p и Msn4p, которые, связываясь с последовательностью STRE, начинают или
усиливают экспрессию соотвествующих генов [256]. Msn2p и
170
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Msn4p являются цитозольными белками, но в условиях стресса
они перемещаются в ядро [261].
К генам, регулируемым STRE, относятся: СТТ1, кодирующий цитозольную каталазу; DDR2, связанный с репарацией
ДНК; HSP12 и HSP104, кодирующие белки теплового шока;
CYC7 – цитохром с; SOD2 – митохондриальная супероксиддисмутаза; TSP1/2 – синтез трегалозы; GPD1 – синтез глицерина и
т.д. [265]. Метаболизм трегалозы в клетках дрожжей находится
под контролем белков Msn2p и Msn4p и протеинкиназы А [302].
ЦАМФ-зависимая активация протеинкиназы А снижает
экспрессию STRE-зависимых генов. Это объясняется тем, что
активная протеинкиназа А препятствует перемещению факторов
транскрипции Msn2p и Msn4p из цитоплазмы в ядро [265]. Протеинкиназа А участвует в процессах восстановления нормального метаболизма клеток после снятия стрессовых условий.
5.7. Перекрестная устойчивость
Из данных литературы известно, что при обработке клеток нелетальными дозами различных стрессоров у них развивается устойчивость к более высоким концентрациям этих веществ
[88, 90, 213, 232, 303]. Предобработка дрожжей S. cerevisiae низкими концентрациями пероксида водорода (0,4 мМ) повышала
их устойчивость к более высоким, ингибирующим рост необработанных клеток, концентрациям Н2О2 [303]. Во многих случаях
наблюдается также так называемая перекрестная устойчивость,
когда действие одного стрессора повышает резистентность микроорганизмов к другим [88, 90, 213, 254, 261, 304].
Дрожжи S. cerevisiae, выращенные в присутствии сублетальных концентраций октановой кислоты, приобретали устойчивость к смертельным концентрациям этой кислоты, тот же
эффект, хотя и в меньшей степени, достигался при подвергании
клеток действию этанола [305].
Перекрестная устойчивость может быть связана с образованием общих защитных соединений, действием ключевых фер171
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ментов, изменениями в составах цитоплазматической мембраны
и клеточной стенки.
В условиях теплового, осмотического стрессов, при
больших концентрациях этанола и ацетальдегида в дрожжах повышается уровень белков теплового шока [306].
Обработка дрожжей S. cerevisiae сорбиновой кислотой
приводила к сильной индукции белка цитоплазматической мембраны Hsp30 [189]. Аналогичный эффект вызывает тепловой
шок, обработка этанолом и слабыми органическими кислотами,
гиперосмотический стресс, недостаток глюкозы [189].
Предобработка клеток дрожжей S. сerevisiae 0,4 мМ пероксидом водорода или 6 % этанолом способствовала приобретению ими устойчивости к высокому давлению 220 МПа [307].
Многие изменения, происходящие в клетках дрожжей S.
сerevisiae при обработке их сублетальными концентрациями
этанола, схожи с действием высокой температуры и включают
индукцию белков теплового шока и активацию трансмембранной АТФазы [306].
Локализация белка теплового шока hsp70s дрожжей
S. сerevisiae чувстивительна к нескольким формам стресса: 6 ч
при 37 °C, 1 ч при 42 °C, голодание, этанол (10 мин, 10 %), NaCl
(10 мин, 0,4 M) или H2O2 (10 мин, 0,3 мМ; 60 мин, 0,3 мМ;
10 мин, 2 мМ). В нормальных условиях hsp70s находится в цитоплазме, но под действием высокой температуры, окислителей,
этанола и голодания происходит перелокализация его в ядро
клетки при помощи ядерного траспортера Msn5p [308].
Обработка этанол-толерантного штамма дрожжей S. cerevisiae этиловым спиртом значительно повышала внутриклеточные уровни каталазы, глицерина и трегалозы – соединений,
оказывающих протекторное действие при различных стрессах,
в результате чего возрастала его резистентность к высокой
температуре (50 °С), пероксиду водорода (3 мМ) и хлориду натрия (3М) [210].
172
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Дрожжи S. cerevisiae, выращенные в среде с повышенной
концентрацией NaCl, были более устойчивы к этиловому спирту
по сравнению с контролем [309].
Белки Yap вовлечены в клеточные ответы на действие различных стрессоров: окислителей, мышьяка, лекарств, высоких
концентраций солей, металлов и высокой температуры [254].
Делеция гена YAP1 у дрожжей S. cerevisiae вызывала
их гиперчувствительность к окислительному стрессу, солям
кадмия, метилглиоксалю и циклогесимидину [254, 265]. Фактор транскрипции Yap1 регулирует экспрессию генов: TRX2
(тиоредоксин), TRR1 (тиоредоксинредуктаза) – и некоторых
ABC-транспортных белков, например YCF1 (выведение или
связывание кадмия) [265].
Сверхэкспрессия белка Yap2 повышала резистентность
дрожжей S. cerevisiae к кадмию и лекарственным препаратам, а
сверхэксперессия Yap4 – к цисплатину (препарат, блокирующий
ТАТА-бокс). Разнообразие белков Yap способствует формированию расширенной устойчивости дрожжей S. cerevisiae к различным стрессорам [254]. Взаимодействуя друг с другом, белки
Yap способны усиливать свое действие. Так, мутанты, дефектные по Yap1 и Yap2, более чувствительны к кадмию, чем дефектные только по одному из них [254].
Дрожжи S. cerevisiae, подвергнутые действию высокой
температуры (38 °С, 30 мин), обработанные хлоридом натрия
(0,3М, 60 мин) или этиловым спиртом (8 %, 60 мин), становились более устойчивыми к кислороду и менадиону по сравнению
с контролем. Наибольшая резистентность наблюдалась у дрожжей подвергнутых действию высокой температуры. Осмотический и температурный стресс повышали активность каталазы Т
и увеличивали продолжительность жизни клеток дрожжей [310].
Устойчивость дрожжей к этанолу зависит от экспрессии
STRE-регулируемых генов [311]. Из 41 гена, сверхэкспрессия
которых наблюдалась у этанол-толерантных дрожжей, 30 экспрессировались и в условиях других стрессов (высокая температура, осмотический шок, голодание) [311].
173
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
К STRE-регулируемым генам относится и ген малого
белка теплового шока Hsp12, синтезируемого дрожжами в
больших количествах при тепловом, осмотическом и окислительном стрессах, а также при высоких концентрациях этилового спирта в среде [312].
В ответ на различные изменения окружающей среды:
температурный шок, обработка пероксидом водорода, менадионом (супероксидгенерирующий агент), диамидом (сульфгидрилокисляющий агент), гипер- и гипоосмотический шок, рост в условиях недостатка аминокислот и источников азота – дрожжи
экспрессировали большой общий набор генов (≈ 900) [185]. Продуктами данных генов являются большинство соединений и ферментов антиоксидантной защиты (трегалоза, глутатион, каталаза,
супероксиддисмутаза и т.д.), так как в основе многих стрессов
лежит образование АФК.
Экспрессия генов S. cerevisiae, индуцированная в условиях осмотического и окислительного стрессов, контролируется
общим белком Yap1 [261, 294].
Белок циклофилин предположительно помогает дрожжам
противодействовать различным типам стрессов: высокой температуре, действию окислителей, влиянию этанола и органических
кислот [313].
Высокая температура и окислительный стресс индуцируют в клетках дрожжей ген OXR1, белок которого локализуется в
митохондриях и защищает их от повреждения АФК [314].
Гены дрожжей S. cerevisiae, индуцируемые в условиях
гиперосмотического и окислительного стрессов, показывают
существенное наложение [315]. Причинами этого могут быть:
сокращение объема клетки в условиях гиперосмотического
стресса, что приводит к повышению внутриклеточной концентрации ионов и может повлиять на функционирование дыхательной цепи и вызвать образование АФК; увеличение энергозатрат клетки в стрессовых условиях, приводящее к интенсификации метаболизма и также образованию АФК [315].
174
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Сенсоры осмотического стресса – двухкомпонентные белки Sln1p-Ssk1p – участвуют также в ощущении дрожжами S. cerevisiae окислительного стресса, вызываемого пероксидом водорода и диамидом, но не другими окислителями [316].
Фосфорилирование белка Hog1, осуществляемое митогенактивируемыми протеинкиназами, повышает устойчивость дрожжей не только к осмострессорам, но и к окислителям (Н2О2, третбутилгидропероксид) и ионам металлов (Cd2+, Zn2+) [298, 317]. Однако ядерная концентрация Hog1 во время окислительного стресса растет существенно медленнее, чем при осмотическом стрессе,
максимум достигается через 45 минут против 5 [298].
При активации HOG-пути белок Hog1 фосфорилируется и
мигрирует из цитоплазмы в ядро, где взаимодействует с факторами транскрипции: Hot1 (тепловой шок), Msn2/Msn4 (генеральный стрессовый ответ), Smp1 (выживание в фазе стационарного
роста), которые повышают уровень экспрессии стрессовых генов, что впоследствии приводит к увеличению концентрации
стрессовых белков [298].
Экспрессия генов GRX1 и GRX2, кодирующих глутаредоксины, осуществляется через HOG (high-osmolarity glycerol) и
через стресс-респонсивный элемент STRE (stressresponsive elements) в ответ на различные стрессы: тепловой, окислительный,
осмотический и голодание [280]. Ген GRX1 содержит один
STRE-элемент, и его индукция происходит под действием высокой температуры и при повышении осмотического давления, а
ген GRX2 содержит два STRE-элемента и индуцируется при переходе в стационарную фазу роста и под действием АФК [280].
Инкубация клеток дрожжей Y. lipolytica в присутствии
пероксида водорода и менадиона (супероксидгенерирующий
агент) повышала их резистентность к тепловому воздействию, а
мягкая тепловая обработка в свою очередь приводила к повышению их устойчивости в условиях окислительного стресса [241].
С началом спиртового брожения дрожжи быстро теряют
способность сопротивляться стрессовым воздействиям [318, 319],
следовательно, клетки, подвергшиеся нелетальному действию
175
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
какого-либо стрессора и содержащие определенное количество
протекторных соединений, окажутся в более выгодных условиях, так как будут более устойчивы к неблагоприятным факторам
внешней среды по сравнению с необработанными клетками.
Перекрестная устойчивость может быть также связана с
действием экзометаболитов, накапливающихся в среде культивирования и оказывающих защитное действие на микроорганизмы [213].
5.8. Образование протекторных экзометаболитов
Согласно популяционно-коммуникативному направлению в микробиологии микроорганизмы способны взаимодействовать при помощи различных экзометаболитов [213, 232, 320].
Химическая коммуникация между микроорганизмами осуществляется при помощи маленьких пептидов, аминокислот, белков,
гомосериновых лактонов, органических кислот, нуклеотидов,
алкилоксибензолов, биогенных аминов и других небольших молекул, выделяемых ими в среду [213, 231, 232, 320–322]. Основными свойствами данных соединений являются низкая метаболизируемость, действие в низких концентрациях, устойчивость к
внешним воздействиям, дозозависимый эффект действия и чувствительность к ним клеток реципиентов [231, 321].
Внеклеточные концентрации экзометаболитов зависят от
клеточной плотности популяции [321]. Было замечено, что при
достижении определенной плотности клеток в культуре сигнал,
вызываемый действием стрессора, становится доступным всей
популяции. Данное явление было названо «процессы общего
ощущения» (Quorum sensing processes). Это особый тип регуляции экспрессии генов [232, 320, 321, 323–325]. В частности, процессами общего ощущения объясняется остановка роста культуры и ограничение численности популяции при достижении определенной плотности клеток и истощении питательных ресурсов среды [322]. Плотность популяции влияет на регуляцию
176
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
экспрессии генов, связанных с синтезом антибиотиков, ферментов и т.д. [323, 324].
Обязательными компонентами quorum sensing систем являются низкомолекулярный регулятор (аутоиндуктор), легко
проходящий через клеточную мембрану, и взаимодействующий
с ним рецепторный регуляторный белок. При некоторой критической численности микроорганизмов концентрация внеклеточных аутоиндукторов достигает пороговой величины, что приводит к резкой активации (индукции) определенных генов и оперонов [323].
Клеточные популяции способны регулировать свою выживаемость при помощи экзометаболитов. Так, скорость гибели клеток Escherichia coli была наибольшей при низких (2·106 КОЕ/мл и
ниже) и сверхвысоких (более 20·109 КОЕ/мл) концентрациях.
Удаление низкомолекулярных метаболитов из культуральной
жидкости повышало выживаемость клеток в суспензиях высокой
плотности и наоборот снижало ее в суспензиях низкой плотности [322]. Установлено, что различные концентрации одних и
тех же метаболитов могут как стимулировать, так и ингибировать клеточные процессы (рост, выживаемость и т.д.) [322].
Экзометаболиты, называемые также внеклеточными факторами адаптации (ВФА), могут выполнять различные функции,
такие как передача сигнала тревоги (алармоны), защита от неблагоприятных воздействий (протекторы), регулирование активности
микроорганизмов (ауторегуляторы), нейтрализация повреждающих молекул (противоядия), антиадгезины (биосурфактанты и
т.д.), перевод клетки в покоящуюся форму (аутоиндукторы анабиоза), межвидовая кооперация в сообществах [213, 231, 233].
Механизмы защитного действия ВФА разнообразны, это
индукция синтеза новых белков, липидов и других соединений,
стабилизация клеточных структур и макромолекул за счет физических и химических взаимодействий и диссипации (рассеяния)
энергии повреждения [213].
Фарнезол – термостабильная, устойчивая к протеолитическим ферментам и резким изменениям рН quorum sensing моле177
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
кула – синтезируется дрожжами Candida albicans, выделяется
ими в среду и стимулирует защитный ответ в условиях окислительного стресса [325].
Культуральная жидкость пропионовокислых бактерий
снижала мутагенный эффект 4-нитрохинолин-1-оксида благодаря содержащимся в ней термоустойчивым низкомолекулярным
соединениям непептидной природы [326]. Способность образовывать подобные соединения показана у лактобацилл, стрептококков, бифидобактерий и кишечной палочки [231].
ВФА контролируют обратимую адгезию клеток погруженных культур, защищают поверхность биопленки от колонизации другими микроорганизмами, обеспечивают процессы реактивации клеток в пост-стрессовый период, стабилизируют
клеточные биополимеры (белки, ДНК) и мембраны, являются
перехватчиками АФК и т.д. [231, 320].
Некоторые предшественники ВФА образуются при нормальных условиях функционирования клетки, при переходе
клетки в стрессовое состояние они активируются и индуцируют
адаптационный ответ [213].
Биогенные амины дофамин и норадреналин, продуцируемые многими микроорганизмами, стимулировали рост и дыхание дрожжей S. cerevisiae [320].
Наиболее изученным классом ауторегуляторов адаптогенов являются производные алкилоксибензолов (АОБ) [231, 321].
АОБ относятся к сигнальным метаболитам quorum sensing систем, являются аутоиндукторами анабиоза и контролируют процессы перехода культуры в стационарную фазу и образования
покоящихся форм [213, 321]. При достижении их внеклеточной
концентрации определенного критического уровня происходит
прекращение деления клеток, а дальнейшее увеличение концентрации переводит часть клеток в анабиотическое состояние.
АОБ повышают стабильность структуры белковых молекул к
действию физических и химических стрессоров, за что их называют химическими шаперонами, модифицируют структурную
178
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
организацию клеточных мембран (мембранотропные свойства) и
проявляют антиоксидантную активность [213, 321, 327, 328].
Восприимчивостью к действию экзометаболитов могут
обладать не только клетки продуцента, но и другие микроорганизмы. В смешанных культурах экзометаболиты снижают выживаемость конкурентов. Низкомолекулярные метаболиты
культуры Escherichia coli М-17 (колибактерин), выделенные при
помощи диализа или ультрафильтрации, в зависимости от фракции увеличивали антагонистическую активность, стимулировали
рост или ускоряли гибель других микроорганизмов [322]. Причем стимулирующее действие было избирательным и проявлялось в отношении нормальных симбионтов человека Lactobacillus acidophilus (штаммы Д-75 и Д-76) и Bifidobacterium adolescentis MC-42, тогда как скорость роста бактерий Lactobacillus
bulgaricus ATCC 21815, не являющихся симбионтами, под действием экзометаболитов E. coli M-17 не изменялась. Основными
компонентами комплекса стимуляторов роста являлись янтарная
и глутаминовая кислоты [322].
Наибольшая активность экзометаболитов проявляется не
в виде индивидуальных компонентов, а в составе композиции,
что свидетельствует о синергичности их действия. Композиция
метаболитов E. coli M-17, состоящая из стимуляторов роста, ингибиторов роста и нейтральных веществ, оказывала наибольшее
воздействие (стимулирование или ингибирование роста), чем
отдельная фракция стимуляторов. Разделение фракции стимуляторов роста на индивидуальные вещества приводило к еще
большему снижению эффективности их действия [322].
Культуральные жидкости микроорганизмов, подвергнутых в процессе инкубации воздействию стрессора, обладают
протекторным действием [213, 232]. Показано, что данное явление обусловлено выделением внеклеточных компонентов индукции.
Низкомолекулярный термостабильный белковый экзометаболит (реактивирующий фактор), выделенный из культуральной жидкости Luteococcus japonicus subsp. сasei, оказывал реак179
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
тивирующее действие на клетки, подвергнутые окислительному
стрессу. Выживаемость клеток Luteococcus japonicus subsp. сasei
после 15 мин инкубирования в присутствии 400 мМ (≈ 1,36 %)
Н2О2 снижалась лишь до 17 % [91]. Положительное влияние
белкового реактивирующего фактора распространялось и на
клетки дрожжей S. cerevisiae, подвергнутые действию различных
стрессоров (тепловой шок, ультрафиолетовое облучение) [329].
Дрожжи S. cerevisiae также синтезируют аналогичный по структуре и действию белок [329].
Обратимая адгезия, являющаяся распространенной защитной реакцией микроорганизмов на действие стрессоров,
также регулируется при помощи экзометаболитов [213, 231].
180
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6. ОБРАЗОВАНИЕ ЛЕТУЧИХ ОРГАНИЧЕСКИХ
СОЕДИНЕНИЙ ПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ
ЭТИЛОВОГО СПИРТА
6.1. Факторы, влияющие на накопление летучих
органических соединений в этиловом спирте
Существенное влияние на качество спирта оказывают летучие органические соединения, переходящие в дистиллят при
перегонке бражки [1].
К основным факторам, влияющим на образование летучих примесей в зрелой бражке, следует отнести качество воды,
сырья и вспомогательных материалов, способы тепловой обработки зернового замеса, концентрацию сухих веществ сусла,
применение различных рас и видов дрожжей, количество производственных дрожжей, температуру и продолжительность сбраживания [12].
Низкое качество перерабатываемого сырья обусловлено
сорностью зерна, содержанием токсичных примесей, зараженностью вредителями хлебных запасов, излишней влажностью и
инфицированием зерна фитопатогенной микробиотой, а также
эпифитными микроорганизмами (плесневыми грибами, дикими
дрожжами и бактериями) [112].
Применение в производстве спирта некондиционного
зерна (морозобойной и суховейной пшеницы; щуплого зерна с
мучнистыми пятнами; поврежденного насекомыми и при сушке;
загрязненного головней, спорыньей; горелого; с затхлым запахом; пораженного фузариозом; обработанного химикатами) увеличивает содержание в бражке всех примесей, сопутствующих
спирту [12].
При переработке дефектного сырья часть токсичных веществ, адсорбированных зерном, не разрушается в процессе водно-тепловой обработки, а переходит в сбраживаемое сусло, что
приводит в определенной степени к замедлению брожения, ингибированию роста и развития дрожжей и накоплению побочных
181
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
продуктов в бражке. Низкое качество зерна оказывает также значительное влияние на органолептические свойства спирта, придавая ему излишнюю горечь, жгучесть, жесткость и резкость [13].
В зерне III и IV степени дефектности в результате самосогревания и гниения накапливается значительное количество кислот (молочной, уксусной, масляной) – продуктов жизнедеятельности различных микроорганизмов. Под их влиянием при
разваривании сырья происходит усиление гидролитических реакций в зерне, способствующих накоплению сахаров, их распаду
и потере в процессе приготовления сусла. Продукты жизнедеятельности микроорганизмов зерна в сусле оказывают существенное влияние на метаболизм дрожжей и образование примесей
в бражке [13].
При концентрации сусла выше 15 % в бражке увеличивается содержание альдегидов. Сбраживание сусла при температуре выше 30 ºС приводит к повышенному содержанию в бражке
альдегидов, эфиров, сероводорода (особенно при наличии в сусле ионов меди и цинка). За счет ускоренного роста дрожжей
увеличивается количество диацетила. Необоснованное увеличение времени сбраживания сусла приводит к увеличенному содержанию в бражке всех примесей, сопутствующих спирту [12].
Правильность выбора рас дрожжей и условий брожения
обеспечивает получение спирта с низким содержанием основных примесей (ацетальдегида, метилацетата, этилацетата, пропанола, изопропанола, изобутанола, бутанола, изоамилола) [10].
При применении низкотемпературных схем тепловой обработки зернового замеса в этаноле уменьшается содержание
метилового спирта и других примесей [12].
При производстве спирта большое внимание необходимо
уделять качеству воды, поскольку она является частью субстрата
для приготовления сусла и от ее чистоты (то есть от количества
присутствующих в ней микроорганизмов, растворенных химических веществ и т.д.) зависит качество выпускаемой продукции. На
некоторых заводах забор воды производится из водоемов, куда
попадают и сточные воды, в которых могут содержаться акроле182
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ин, пропиловый спирт, кротоновый альдегид. В связи с этим лучше использовать воду из артезианских скважин [12].
В спирте могут обнаруживаться и нетипичные примеси,
которые случайно могут попасть в продукт на разных стадиях
технологического процесса. К таким примесям относится бензол
и его производные, пестициды, микробные и иные токсины, краун-эфиры и т.д. [12].
6.2. Механизмы образования основных групп летучих
органических соединений, сопутствующих этиловому спирту
Образование примесей происходит в результате протекания сложных химических и биохимических реакций. Наиболее
активно этот процесс идет на стадиях гидротермической обработки сырья, сбраживания сусла и перегонки бражки. Дополнительными источниками примесей могут быть зерновое сырье,
вода, вспомогательные материалы [1, 28, 97].
Примеси, обнаруживаемые в спирте подразделяются на
несколько классов органических соединений: альдегиды, высшие спирты, эфиры, органические кислоты, кетоны и дикетоны,
серо- и азотсодержащие соединения.
На разнообразие и количественное содержание примесей
спирта влияют: качество сырья, раса и количество дрожжей, рН,
температура и продолжительность процессов гидротермической
обработки и брожения, степень микробной контаминации процесса брожения, состав микробиоты.
В этиловом спирте обнаруживается до 12 альдегидов, содержащих от 2 до 12 атомов углерода: уксусный (ацетальдегид),
пропионовый, коричный, изомасляный, изовалериановый, к этой
группе также относятся диацетилметилкарбинол и метилглиоксаль СН3-СО-СНО и др. Основную долю составляет уксусный
альдегид – предшественник этанола, вкусовая граница – 25 г/л,
но уже при содержании 12 г/л вкус спирта ухудшается. Ацетальдегид вызывает привкусы, характеризуемые терминами «зеленый», «травянистый» [330].
183
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Образование альдегидов связано с ростом дрожжей; максимальная скорость их образования совпадает с протеканием
наиболее интенсивного спиртового брожения [330]. Максимальное содержание альдегидов (38 мг/л) отмечалось при сбраживании сусла, содержащего 19 % сухих веществ, оно достигалось за
трое суток брожения, а при сбраживании сусла с низким содержанием сухих веществ (6 %) максимальное количество альдегидов достигалось уже на первые сутки брожения и составляло
лишь 11 мг/л. Повышение температуры брожения, а также аэрирование и увеличение количества посевных дрожжей усиливало
накопление в среде альдегидов [330]. При непрерывном способе
брожения ацетальдегида получается меньше, чем при периодическом.
Альдегиды образуются также как побочные продукты
синтеза аминокислот [43, 330], вероятно они являются предшественниками высших спиртов (пропионовый альдегид – пропанол, изовалериановый альдегид – изоамиловый спирт, изомасляный альдегид – изобутанол, α-метилмасляный альдегид – оптически активный амиловый спирт [43, 330].
Образование альдегидов происходит также на стадиях
гидротермической обработки зернового сырья и перегонки бражки. На данных этапах происходят реакции дегидратации и термической деградации углеводов, реакции редуцирующих сахаров с
аминами, аминокислотами, пептидами и белками (меланоидинообразование), распад аминокислот по Стреккеру [29, 43].
Известно, что большое количество летучих соединений
образуется при тепловой обработке дефектного сырья, так как
оно содержит большое количество термолабильных продуктов
гидролитического распада природных полимеров [10, 29].
Основным продуктом дегидратации пентоз является фурфурол [29]. Пентозы образуются в результате гидролиза пентозанов, содержащихся в зерне [25]. Гексозы в качестве продуктов
дегидратации дают оксиметил фурфурол и другие соединения:
2-гидроксиацетилфуран, изомальтол (2-ацетил-3-гидроксифуран), мальтол (3-гидрокси-2-метилпирен) [29, 43, 44]. Фрагмен184
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
тация углеродных цепей этих продуктов приводит к образованию левулиновой, молочной, муравьиной, уксусной кислот, метилглиоксаля, ацетола, ацетальдегида и ряда других соединений [29, 43]. На устойчивость моносахаридов к реакциям дегидратации влияют рН среды и температурный режим разваривания. Минимальное количество глюкозы распадается при рН 3,4,
фруктозы – при рН 3,6. При естественном рН сырья (около 6,5) в
условиях высокотемпературного разваривания под давлением
разлагаются 80 % глюкозы и 90 % фруктозы, а в условиях мягкого
режима разваривания разлагаются 0–11 % глюкозы и 9–36 %
фруктозы [1].
Вторым путем образования альдегидов в процессе гидротермической обработки сырья является реакция меланоидинообразования (реакция Майара), которая начинает протекать уже
при 20–37 °С, а согласно некоторым данным протекание данной
реакции возможно даже при 0 ºС [43, 44]. Реакция Майара начинается с конденсации альдозы и амина в глюкозиламин рис. 32.
Рис. 32. Образование глюкозиламина [29]
185
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Если в начальной стадии присутствует кетоза, то также
имеет место образование глюкозиламина за счет перегруппировки Хейтса. Глюкозиламин подвергается перегруппировке по
Амадори и переходит в аминокислоту – фруктозамин (рис. 33).
Рис. 33. Образование кетозамина [29]
Продукты реакции, полученные при перегруппировке по
Амадори, могут далее превращаться по двум путям:
1) через дикарбонильные промежуточные соединения
(дифруктозоамин), этот путь проходит через образование 2,3ендиола и после отщепления амина приводит к α,βдикарбонильным соединениям и редуктонам. Далее реакционноспособные α,β-ненасыщенные кетоны могут либо полимеризоваться в высокомолекулярные коричнево-черные меланоидины,
либо расщепляться на простые летучие соединения метилглиоксаль, диацетил, ацетон, ацетальдегид [29, 43, 44] (рис. 34);
186
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 34. Распад продуктов Амадори (2,3-енолизация) [29, 43]
2) через элиминирование гидроксильных групп у
третьего углеродного атома, что приводит к образованию дезоксигексулоз (3-дезоксигексозонов), последние при отщеплении воды замыкаются в кольцо с образованием фурфурола
(пентозы) и 5-оксиметилфурфурола. Этот путь протекает в более мягких условиях, аминокислота освобождается в неизменном виде (рис. 35) [29, 43].
187
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 35. Распад продуктов Амадори (1,2-енолизация) [29, 43]
Третьим путем образования альдегидов в условиях термического воздействия на полупродукты спиртового производства является реакция распада аминокислот по Стреккеру [29],
или Штреккеру [43, 44] (рис. 36).
188
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 36. Распад аминокислот по Стреккеру [29, 43]
Распад по Стреккеру представляет собой взаимодействие
дикарбонильных промежуточных продуктов реакции меланоидинообразования и аминокислот. При этом происходит окислительное дезаминирование и декарбоксилирование аминокислот в
альдегид (или кетон), содержащий на один атом углерода меньше, чем исходная аминокислота. Реакция протекает через Шиффово основание, которое легко декарбоксилируется. Образующийся при этом енаминол может либо полимеризоваться в меланоидины, либо распасться на альдегид и еноламин [29, 43, 44].
Таким образом, в результате протекания данной реакции из лейцина образуется 2-метилбутаналь, из изолейцина – 3-метилбутаналь, из фенилаланина – фенилэтаналь, из цистеина – меркаптоацетальдегид, α-аминокетон, сероводород и аммиак, из метионина – 3-метилтиопропаналь (метиональ) и аммиак и т.д.
Метиональ в дальнейшем в результате термического распада может разлагаться на акролеин и метилмеркаптан [44] – со189
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
единения, крайне негативно влияющие на органолептическую
оценку спирта (рис. 37) [1].
Рис. 37. Термический распад метионина [43]
Акролеин может также образовываться в результате термической дегидратации глицерина, являющегося побочным
продуктом брожения, а также входящего в состав липидов
дрожжей и зерна [331]. Акролеин является очень токсичным
соединением и способен вызывать серьезные повреждения клеток и тканей [287].
Все образующиеся карбонильные соединения могут реагировать с аммиаком и сероводородом, продуктами реакции являются различные гетероциклические соединения [44].
Еноламины, образующиеся при распаде аминокислот по
Стреккеру, могут в дальнейшем конденсироваться с образованием замещенных пиразинов (2,5-диметилпиразин, 2-метилпиразин и др.) – веществ, обладающих ярко выраженными вкусовыми и ароматическими свойствами (рис. 38) [29, 43].
Пиразины образуются также при взаимодействии алифатических карбонильных соединений с аммиаком. При этом образуются α-аминокетоны, интрамолекулярная циклизация которых
приводит к дигидропиразинам, в дальнейшем окисляющимся до
пиразинов [44].
190
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 38. Образование пиразинов [29,43]
Таким образом, в результате протекания реакций дегидратации, Майара, Стреккера образуются алифатические карбонильные и дикарбонильные соединения, аммиак, сероводород,
фураны, пираны, пиразины и т.д. [44].
Кротоновый альдегид образуется при перегонке бражки в
результате кротоновой конденсации уксусного альдегида – две
молекулы уксусного альдегида уплотняются до альдоля (βоксимасляного альдегида), от которого отщепляется вода [332].
В процессе разваривания происходит гидролиз пектинов
зерна с отщеплением метоксильных (-ОСН3) групп, которые затем превращаются в метанол (рис. 39). Чем жестче режим разваривания, тем больше образуется метанола [1, 28].
COOH
H
O H
H
OH
O
H
COOH
OH
H
O
OH
H
H
O H
+ HOH
O
H
H
HO
H
OH
O
O H
H
COOCH3
H
H
OH
OH
H
H
H
O
COOH
H HO
ï åêòèí î âàÿ êèñëî òà
ì åòèëî âû é ýô èð ï î ëèãàëàêòóðî í î âî é
êèñëî òû
Рис. 39. Схема образования метанола [1]
191
O
+ CH3OH
O H
ì åòàí î ë
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Эфиры в бражке могут образовываться в результате самопроизвольной конденсации альдегидов [333] или из спиртов и
кислот в клетках дрожжей при помощи ферментов алкогольацетилтрансферазы, этанолацетилтрансферазы и изоамилалкогольацетилтрансферазы, катализирующих реакцию между спиртом и
каким-либо производным ацил-КоА [37]. Вследствие того что в
бражке преобладают этиловый спирт и ацетил-КоА. наиболее
распространенным эфиром является этилацетат [37, 336]. Эфиры
играют важную роль в образовании вкусо-ароматического букета алкогольных напитков. Так, гексилацетат, этилкаприлат и
этилкапроат придают аромат яблока, изоамилацетат – банана,
2-фенилэтилацетат – фруктовый, цветочный с ноткой меда [337].
На формирование эфиров влияют различные факторы: штамм
дрожжей, температура брожения, количество нерастворенных
твердых веществ, аэрация и т.д. [336, 337]. Считается, что образование эфиров является следствием задержки биосинтеза липидов из-за недостатка кислорода, в результате чего происходит
избыточное накопление ацил-КоА, и ациловые эфиры получаются как побочные продукты реакции, направленной на восстановление свободного ацил-КоА [338]. Аэрация или добавление в
среду культивирования ненасыщенных жирных кислот подавляет активность алкогольацетилтрансферазы и приводит к пониженному содержанию эфиров в конечном продукте [339].
В процессе спиртового брожения дрожжи образуют также
незначительное количество серосодержащих веществ: сероводород, этилмеркаптан [37, 118, 330, 340], 4-меркапто-4-метилпентан-2-он и 3-меркаптогексанол [341]. Образование сероводорода
связано со способностью дрожжей восстанавливать сульфаты до
сульфидов (сероводород) [37, 118]. При взаимодействии этанола
с сероводородом образуется этилмеркаптан [330].
Высшие спирты при брожении образуются главным образом в период размножения дрожжей. Содержание высших спиртов зависит от условий брожения, расы дрожжей, состава среды.
Образование высших спиртов связано как с азотистым, так и с
углеводным обменом веществ в клетках дрожжей [333, 334].
192
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Высшие спирты являются побочными продуктами синтеза аминокислот из их α-кетоаналогов [43, 333, 334]. Схема образования
высших спиртов представлена на рис. 40.
При росте на среде, содержащей все аминокислоты в необходимом количестве, дрожжи непосредственно ассимилируют
их из среды. В таких условиях биосинтез аминокислот в клетках
дрожжей подавляется по механизму катаболитной репрессии,
что приводит к незначительному образованию высших спиртов
[43, 333]. Однако наиболее часто встречаются такие ситуации,
когда в среде отсутствуют определенные аминокислоты, необходимые дрожжам. При этом дрожжи синтезируют из продуктов
метаболизма углеводов (пировиноградная, реже α-кетоглутаровая кислоты) или дезаминирования треонина (α-кетомасляная кислота) углеродный скелет необходимой аминокислоты в
виде соответствующей α-кетокислоты, на которую при помощи
фермента аминотрансферазы происходит перенос аминогруппы
с аминокислоты, содержащейся в избытке. В результате протекания данной реакции переаминирования аминокислота, содержащаяся в избытке, в свою очередь, превращается в α-кетокислоту. Далее образовавшаяся α-кетокислота декарбоксилируется
декарбоксилазой дрожжей в альдегид, который восстанавливается дегидрогеназой дрожжей в высший спирт [37, 43, 118].
В том случае, когда питательная среда содержит мало
доступных аминокислот, а основным источником азотистого питания является небелковый азот, дрожжи вынуждены синтезировать все необходимые аминокислоты из продуктов метаболизма
углеводов посредством образования соответствующих αкетокислот. При этом если содержание азота в среде недостаточно для эффективного аминирования α-кетокислот, то возможно их избыточное накопление [43]. В пользу этой версии говорит то, что добавление в сусло солей аммония приводит к
снижению образования высших спиртов [334]. Согласно другой
гипотезе образовавшаяся аминокислота только частично ингибирует активность ферментов всех стадий своего биосинтеза, что
вызывает накопление промежуточных продуктов биосинтеза,
193
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
194
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
195
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
в частности α-кетокислоты [333]. Излишки α-кетокислот декарбоксилируются до альдегидов, которые восстанавливаются в
спирты [43, 333, 334].
Таким образом, образование высших спиртов может происходить либо за счет дезаминирования поступающих извне
аминокислот, либо при помощи биосинтеза из продуктов метаболизма углеводов и дезаминирования треонина [37, 118]. Однако второй вариант более предпочтителен. Так, при автолизе лишенных гликогена «голодных» дрожжей высшие спирты не образовывались, несмотря на то, что аминокислот в среде накапливалось достаточно много. А при введении в среду пировиноградной кислоты в начале автолиза происходило почти пропорциональное увеличение содержания высших спиртов [333, 334].
При изменении рН сбраживаемой среды от 3 до 5 накопление высших спиртов увеличивается, а при дальнейшем увеличении рН – уменьшается. Аэрация среды благоприятствует синтезу высших спиртов: в аэрируемой среде содержание изобутилового и изоамилового спиртов увеличивается. Образование сивушного масла в культуральной среде возрастает с накоплением
биомассы дрожжей [28]. Накопление высших спиртов протекает
синхронно накоплению биомассы. Чем больше концентрация
углевода в среде, тем больше образуется биомассы дрожжей и
тем больше накапливается в среде высших спиртов. Природа углевода не влияет на образование спиртов [334].
Помимо высших спиртов на пути синтеза аминокислот
происходит также образование гидроксикетона – ацетоина и дикетонов – диацетила и 2,3-пентадиона (см. рис. 40). Данный процесс может идти как в клетках дрожжей [333, 335], так и спонтанно в ходе окислительного декарбоксилирования α-ацетомолочной кислоты и α-ацето-α-оксимасляной кислоты [37, 335].
При избытке валина в питательной среде происходит ингибирование ферментов его биосинтеза, в результате чего диацетила
образуется меньше. При избытке изолейцина наблюдается обратный эффект – диацетила образуется больше [333]. Ацетоин и
диацетил восстанавливаются клетками дрожжей до 2,3196
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
бутандиола, а 2,3-пентадион до 2,3-пентадиола [37, 335]. Диацетил ухудшает органолептические характеристики алкогольных
напитков и спирта. Он придает спирту жгучий вкус и запах, характерный для мелассного спирта. Предельно допустимое содержание диацетила в спирте – не более 6 мл/дм3 [12]. Повышенные концентрации диацетила в вине выше 1 мг/л придают
ему «окисленный» тон, переходящий в «мышиный» [335].
Органические кислоты образуются в ходе метаболизма
дрожжей при гликолизе и цикле трикарбоновых кислот [37, 330].
Другим возможным механизмом образования органических кислот является взаимодействие альдегидов (реакция Канниццаро). Уксусный альдегид может испытывать дисмутацию с
образованием уксусной кислоты и этилового спирта:
CH3COH + CH3COH + H2O → CH3COOH + CH3CH2OH.
(35)
Одна из молекул альдегида окисляется в кислоту, а другая восстанавливается в спирт [28].
Образование молочной кислоты происходит в результате
восстановления пировиноградной кислоты:
СH3СOCOOH + H2 → CH3CH(OH)COOH.
(36)
Однако более вероятный механизм ее образования – гидролиз промежуточного продукта спиртового брожения – фосфоглицеринового альдегида:
CHOCHOHCH2OPO3H2 + H2O →CH3CH(OH)COOH +
+ H3PO4.
(37)
Янтарная кислота образуется дегидрированием и конденсацией двух молекул уксусной кислоты с одной молекулой уксусного альдегида:
197
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2CH3COOH + CH3CHO → COOHCH2CH3COOH +
+ CH3CH2OH.
(38)
В процессе спиртового брожения янтарная кислота образуется также при дезаминировании глутаминовой кислоты. Акцептором водорода в этой реакции является триозоглицериновый альдегид, поэтому реакция дезаминирования сопровождается одновременно накоплением глицерина:
2C6H12O6 + COOHCHNH2CHNH2COOH + 2H2O →
COOHCH2CH2COOH + 2CH2OHCHOHCH2OH + NH3 + CO2.
(39)
Аммиак потребляется дрожжами на синтез белка, а глицерин и янтарная кислота при этом выделяются в среду [28].
6.3. Летучие органические соединения, образуемые
микроорганизмами, контаминирующими
спиртовое производство
Жизнедеятельность
микроорганизмов-контаминантов
способна повлиять на качественный состав и количественное
содержание летучих примесей в спирте [13]. Многочисленные
исследования летучих компонентов, продуцируемых микроорганизмами, позволяют предположить, что состав их строго специфичен для каждого вида микроорганизма [342–346]. Предложены методы, позволяющие идентифицировать микроорганизмы
по образуемым ими соединениям [343–346]. Летучие органические соединения образуются в результате метаболизма углеводов (гексоз, пентоз), аминокислот, пуриновых и пиримидиновых
оснований [83, 118, 347].
Молочнокислые бактерии. К основным продуктам метаболизма МКБ относятся: молочная кислота, этанол, уксусная кислота, манит, диацетил, ацетоин [83, 125, 347, 348]. Бактерии рода Lactococcus способны накапливать в зависимости от культуры
и условий выращивания, от 0,1 до 1,5 мМ α-ацетомолочной ки198
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
слоты [349]. В работе [350] представлены результаты исследования летучих метаболитов, образуемых культурой Lactobacillus
fermentum при ферментации кукурузной пасты. В составе продуктов ферментации были идентифицированы 18 спиртов (в основном этанол, 3-метил бутанол, гексанол, нонанол), 20 альдегидов, 12 эфиров, 7 органических кислот, 2-пентилфуран, 4-винилгваякол.
Многие авторы в своих работах [342, 351–354] подчеркивают преобладающую роль катаболизма аминокислот в процессе
образования летучих ароматических соединений. К начальным
этапам катаболизма аминокислот относятся дезаминирование
либо трансаминирование, в результате чего образуются аминокислоты и α-кетокислоты [82, 354]. Последующее декарбоксилирование кетокислот приводит к образованию альдегидов, которые затем способны окисляться до кислот или восстанавливаться до спиртов [82, 118, 355]. Так, из разветвленных аминокислот
образуются 3-метилбутаналь, 2-метилбутаналь, 2-метилпропаналь, изомасляная и изовалериановая кислоты и их производные – эфиры; из треонина – ацетальдегид; из ароматических
аминокислот – фенилуксусная кислота, фенилацетальдегид, фенилэтанол, n-крезол, индол, скатол, бензальдегид [353, 354]. Бензальдегид может образовываться из фенилаланина или триптофана [354]. Конверсия фенилаланина в бензальдегид видом Lactobacillus plantarum и другими МКБ инициируется пиридоксаль5´-фосфат-зависимой аминотрансферазой, образующаяся фенилпировиноградная кислота химически преобразуется в бензальдегид в присутствии кислорода и ионов марганца [354]. Деятельность аминотрансфераз МКБ требует наличия в среде α-кетокислот, например α-кетоглутаровой, используемой в качестве
косубстрата как акцептор аминогруппы [353, 354].
Сравнительный анализ состава летучих соединений, продуцируемых тремя штаммами молочнокислых бактерий Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis, Lactobacillus helveticus и Streptococcus thermophilus in vitro, на среде с добавлением лейцина фенилаланина и метионина показал, что продуктами метаболизма
199
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
S. thermophilus являлись в основном α-кетокислоты и небольшое
количество кислот и гидроксикислот. Бактерии L. helveticus из
лейцина и фенилаланина продуцировали главным образом кислоты, а L. delbrueckii subsp. lactis большое количество спиртов
и/или альдегидов [353]. Лактобациллы образовывали намного
больше летучих соединений, чем S. thermophilus, но только при
добавлении в среду культивирования α-кетоглутарата, используемого ими в качестве акцептора аминогруппы. Бактерии S.
thermophilus обладали способностью самостоятельно синтезировать α-кетоглутарат из глутамата [353].
Другим путем катаболизма аминокислот является их
декарбоксилирование, при этом образуются первичные амины [342, 351, 355], при алкилировании которых ферментами
микроорганизмов образуются также вторичные и третичные
амины [351]. Следует отметить, что амины являются ароматобразующими соединениями и встречаются во многих продуктах
питания [342, 351], некоторые амины обладают устойчивым
неприятным запахом (триметиламин) и сильным фармакологическим действием (биогенные амины) [82]. Так, МКБ обладают
способностью синтезировать следующие биогенные амины тирамин, гистамин, триптамин, фенилэтиламин – в результате декарбоксилирования соответствующих аминокислот: тирозина,
гистидина, триптофана, фенилаланина [355–357]. Наибольшее
количество аминов образуют МКБ родов Lactobacillus, Pediococcus и некоторые виды рода Oenococcus [355]. В вине оэнококки
по преимуществу образуют гистамин, а лактобациллы – тирамин [355, 357]. В результате скрининга 60 штаммов МКБ было
выделено четыре, обладающих способностью декарбоксилировать тирозин, это Lactobacillus brevis (ATCC 367, IOEB 8511,
IOEB 8907) и Lactobacillus hilgardii (IOEB 9649). Количество образуемого ими тирамина непосредственно зависело от концентрации предшественника – тирозина [357]. Штаммы Lb. brevis
(IOEB 9809) и Lb. hilgardii (IOEB 9649) продуцировали фенилэтиламин [357]. Тирамин способны синтезировать и МКБ родов
Lactococcus и Leuconostoc [356]. Амины также могут образовы200
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ваться микроорганизмами путем трансаминирования альдегидов [342, 351].
В работах [342, 351] показана способность МКБ рода
Streptococcus продуцировать большое количество летучих аминов, состав которых зависел от стадии роста и вида бактерий.
Авторы [342] предлагают использовать хроматограммы летучих
аминов как своеобразные «отпечатки пальцев» при идентификации бактерий.
МКБ также способны образовывать различные летучие
серосодержащие соединения, такие как метантиол (метилмеркапан), 3-метилтиопропаналь, диметилдисульфид, диметилтрисульфид, сероводород, в результате катаболизма серосодержащих аминокислот – метионина и цистеина под действием ферментов – аминотрансфераз и лиаз [352–355].
МКБ Lactobacillus brevis и Lb. buchneri, выделенные из
испорченного вина, метаболизировали глицерин в присутствии
глюкозы или фруктозы с образованием 3-гидроксипропиональдегида, который впоследствии мог восстанавливаться до
1,3-пропандиола (рис. 34) [355].
Рис. 34. Схема метаболической трансформации глицерина
молочнокислыми бактериями Lactobacillus brevis и Lb. buchneri
201
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3-Гидроксипропиональдегид является также предшественником непредельного альдегида акролеина, придающего неприятную горечь алкогольным напиткам [37, 355]. Восстановление
акролеина МКБ приводило к образованию аллилового спирта.
Бактерии рода Oenococcus продуцируют в ходе яблочномолочного брожения токсичные соединения – глиоксаль и метилглиоксаль [355].
Многие лактобациллы в частности, Lactobacillus plantarum, Lb. brevis Lb. collinoides и педиококки способны декарбоксилировать оксикоричные кислоты (p-кумаровую и феруловую)
с образованием летучих фенолов – 4-винилфенола и 4-винилгваякола соответственно [37, 206, 355, 358–360]. Далее при помощи фермента винилфенолредуктазы или винилгваяколредуктазы происходит восстановление данных соединений до 4-этилфенола и 4-этигваякола [37, 206, 355, 358, 359]. Схема образования летучих фенолпроизводных представлена на рис. 35.
Рис. 35. Схема образования летучих фенолпроизводных из
оксикоричных кислот
202
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Подобные реакции характерны для большинства лактобацилл, выделяемых из продуктов брожения солодового виски [37, 206]. Феруловая и p-кумаровая кислоты широко распространены в природе, они являются предшественниками мономеров лигнина [32–35] и неотъемлемыми компонентами клеточных стенок ячменя [206], входят в состав виноградного сока
и вина [355, 361]. Феруловая и p-кумаровая кислоты составляют
до 1,5 % веса клеточных стенок трав [362]. В злаках оксикоричные кислоты присутствуют главным образом в виде сложных
эфиров с полисахаридами клеточных стенок, например с арабиноксиланом [205], и входят в состав белков [32]. В свободном
виде оксикоричные кислоты образуются на этапе разваривания
сырья [206]. Некоторые коммерческие ферментные препараты
(вискозим, шеарзим 500L, церефло, ультрафло L фирмы Novozymes), добавляемые на стадии разваривания в пивоваренной
и спиртовой промышленностях, обладают ферулатэстеразной
активностью и повышают содержание свободной феруловой кислоты в сусле [205].
Из 37 исследованных штаммов МКБ 13 оказались способны продуцировать летучие фенолы из p-кумаровой кислоты,
но 4-этилфенол, конечный продукт метаболизма p-кумаровой
кислоты, образовывали только 3 штамма, принадлежащие к роду
Lactobacillus (Lactobacillus plantarum, Lb. brevis, Lb. collinoides).
Семь из восьми штаммов бактерий рода Pediococcus продуцировали из p-кумаровой кислоты 4-винилфенол, но не 4-этифенол.
Два исследованных штамма Oenococcus oeni и штамм Leuconostoc mesenteroides не образовывали летучие фенолы из
p-кумаровой кислоты [359].
Способность к деградации фенолкарбоновых кислот, обладающих антимикробной активностью, очень важна для микроорганизмов и может осуществляться по различным метаболическим путям. Мутантный штамм Lactobacillus plantarum D1 с
удаленным геном, кодирующим декарбоксилазу p-кумаровой
кислоты, тем не менее метаболизировал p-кумаровую и феруловую кислоты до их винилпроизводных или до замещенных фе203
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нилпропионовых кислот. Данный эффект объясняется наличием
у Lb. plantarum D1 вторичной декарбоксилазы и редуктазы фенолкарбоновых кислот [363].
Летучие фенолы придают пиву заметный фенольный
привкус [37], а вину «медицинский», «аптечный», «пластмассовый» запах и тон выделанной кожи [361]. При высоком содержании 4-этилфенола в белых (около 500 мкг/л), и красных (около 4000 мкг/л) винах возникает неприятный запах «лошадиного
пота», близкий к «мышиному тону» [361].
Маслянокислые бактерии. Продукты метаболизма маслянокислых бактерий разнообразны: масляная кислота, ацетон, бутанол, изопропанол, уксусная и муравьиная кислоты (Clostridium
acetobutilicum [364]), уксусная кислота (C. Butyricum), уксусная и
молочная кислоты, этанол (C. perfringens [83, 118, 347]). Маслянокислые бактерии способны сбраживать различные субстраты:
углеводы (сахаролитические клостридии), белки (протеолитические клостридии) [347]. C. kluyveri образует масляную и капроновую кислоты из этанола и уксусной кислоты [347]. Некоторые
малянокислые бактерии, несмотря на название, не образуют
масляную кислоту. Так, C. sphenoides сбраживает глюкозу до
этанола и уксусной кислоты [347]. Кроме того, маслянокислые
бактерии способны продуцировать пропанол (C. durum), муравьиную (C. durum, C. cellobioparum, C. oroticum, C. nexile, C. ramosum), янтарную (C. coccoides, C. nexile, C. ramosum), пропионовую (C. quercicolum) [83], изомасляную, изовалериановую, валериановую, изокапроновую (C. perfringens) [345] и другие кислоты,
высшие спирты, альдегиды, эфиры, амины [344, 345, 364, 365]. В
работах [344–346] предлагается использовать профили хроматограмм для быстрой идентификации маслянокислых бактерий.
Гнилостные энтеробактерии. Данная группа микроорганизмов осуществляет смешанное и бутандиоловое брожение [347].
При этом образуются муравьиная, уксусная, молочная и янтарная
кислоты, этанол и 2,3-бутандиол. Бактерии родов Escherichia,
Salmonela, Shigella образуют больше кислот, а бактерии, относящиеся к родам Enterobacter, Serratia, Erwinia, – больше этанола и
204
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2,3-бутандиола [347]. Энтеробактерии образуют также диацетил,
диметилсульфид [37]. Представители рода Klebsiella, как и молочнокислые бактерии, обладают способностью последовательно
декарбоксилировать и редуцировать p-кумаровую и феруловую
кислоты с образованием летучих фенолов [37]. Способностью
образовывать 2,3-бутандиол обладают также спорообразующие
бактерии р. Bacillus [335, 347, 366, 367], при этом они образуют
также ацетоин, диацетил, этанол, молочную и уксусную кислоты [335, 366, 367]. Бактерии вида Bacillus subtilis декарбоксилируют феруловую, p-кумаровую и кофейную кислоты до соответствующих летучих фенолов [368]. Некоторые представители р.
Bacillus способны использовать коричную кислоту и ее оксипроизводные в качестве единственного источника углерода. При этом
из коричной кислоты образуются 3-фенилпропионовая, бензойная
и 3-гидроксибензойная кислоты, из p-кумаровой – 4-гидроксибензойная и гентизиновая (2,5-дигидроксибензойная) кислоты, из
феруловой – 4-гидрокси-3-метоксифенил-β-гидроксипропионовая
кислота, ванилин и ванилиновая кислота [369].
Дикие дрожжи. Образуют мало этанола и большое количество побочных продуктов брожения [1]. Качественный состав
данных примесей незначительно отличается от состава примесей, образуемых дрожжами Saccharomyces cerevisiae, и включает
в себя высшие спирты, альдегиды, кислоты, эфиры, амины и некоторые другие соединения [350, 370, 371].
Многие дикие дрожжи, например Saccharomyces bayanus
или представители рода Bretanomyces, декарбоксилируют фенолкарбоновые кислоты (феруловую и p-кумаровую) и восстанавливают винильную группу производных данных кислот с образованием 4-винилгваякола, 4-этилгваякола, 4-винилфенола, 4-этилфенола согласно схеме, представленной на рис. 35 [206, 361, 372].
Большинство штаммов пивных дрожжей Saccharomyces cerevisiae синтезируют небольшое количество декарбоксилаз и соответственно образуют мало 4-винилфенола и 4-винилгваякола,
тем не менее сообщается, что спиртовые дрожжи S. cerevisiae М
(Queast International, Menstirie, United Kingdom) обладают доста205
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
точно высокой декарбоксилазной активностью в отношении оксикоричных кислот [206]. Сухие пекарские дрожжи S. cerevisiae
(Red Star, Universal Foods) в аэробных условиях конвертировали
феруловую кислоту в 4-винилгваякол с 96 % выходом, а в атмосфере аргона восстанавливали часть феруловой кислоты до
4-гидрокси-3-метоксипропионовой кислоты с выходом 54 % [373].
Дрожжи вида Shizosaccharomyces malidovorans образуют
в больших количествах сероводород, который, реагируя с этанолом либо с ацетальдегидом, образует этилмеркаптан. При окислении кислородом воздуха этилмеркаптан конденсируется в диэтилсульфид [361]. Данные вещества обладают неприятным запахом, ощутимым даже при незначительной их концентрации
порядка 0,0000001–0,001 мг/л [361]. Дрожжи Shizosaccharomyces
pombe и Zygosaccharomyces baili образуют больше кислот, чем
Saccharomyces cerevisiae, увеличение происходит за счет таких
кислот, как уксусная, пропионовая, пальмитиновая, стеариновая,
олеиновая, линолевая [374]. В культуральной жидкости дрожжей
вида Kluyveromyces lactis было идентифицированно более 30 летучих соединений, среди которых преобладали изоамиловый
спирт, 2-фенилэтанол и ацетоин (73, 72 и 22 мг/л среды соответственно), кроме того, в значительных количествах также обнаруживались 2-фенилэтил ацетат, изобутанол, изомасляная и изовалериановая кислоты [375].
6.4. Влияние антимикробной обработки зернового замеса
пероксидом водорода на содержание примесей
в зрелых бражках
Известно, что микробная контаминация сусла в процессе
спиртового брожения может привести к повышенному содержанию примесей в конечном продукте [1, 5, 12, 13, 376].
Накопление в зрелых бражках примесей в количествах,
превосходящих их обычные уровни, образующиеся в ходе ферментации сусла дрожжами Saccharomyces cerevisiae, усложняет
процесс ректификации [1]. Существенное влияние оказывают
206
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
примеси и на качество этилового спирта. Бутанол и амилол придают этанолу сивушный запах и жгучий вкус, гексанол – запах и
привкус прогорклого масла, пропанол – серного эфира [1].
В связи с вышеизложенным представилось целесообразным изучить влияние антимикробной обработки разваренной
массы пероксидом водорода на количественное содержание
примесей в отгонах исследуемых бражек (табл. 8).
Таблица 8. Содержание примесей в отгонах бражек в пересчете
на безводный спирт
Примеси
Контроль
Опыт 1*
Опыт 2**
Ацетальдегид, мг/л
94,6289
113,1040
98,5406
Этилацетат, мг/л
119,1442
129,3440
121,6860
Метанол, % об.
0,0054
0,0101
0,0116
Высшие спирты
Изопропанол, мг/л
5,7345
14,4261
12,1902
Пропанол, мг/л
527,3155
471,8769
464,9091
Изобутанол, мг/л
2055,7789
1008,4349 623,4980
Бутанол, мг/л
4,6556
8,1539
Изоамилол, мг/л
1193,6242
1131,0666 1613,7795
Амилол, мг/л
2,6034
2,2900
Гексанол, мг/л
70,8392
40,7545
14,8466
Фенилэтанол, мг/л
174,3993
141,6620
169,3229
Суммарное содержание 4032,3472
2810,8244 2908,9902
высших спиртов, мг/л
* 1 режим ТГФО
** 2 режим ТГФО
Как следует из данных табл. 8, содержание ацетальдегида
и этилацетата в отгонах бражек слабо зависело от проведенной
антимикробной обработки, незначительное повышение концентраций данных компонентов отмечалось лишь для опытной
бражки, полученной с применением 1 режима ТГФО. Отсутствие влияния антимикробной обработки на уровни ацетальдегида
и этилацетата в зрелых бражках, вероятно, связано с тем, что эти
207
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
соединения являются продуктами нормального метаболизма
дрожжей. Ацетальдегид является непосредственным предшественником этанола [330], а этилацетат образуется как побочный
продукт реакции, направленной на восстановление свободного
ацил-КоА и происходящей вследствие задержки биосинтеза липидов в анаэробных условиях [338, 339].
Обработка разваренной массы пероксидом водорода вызывала значительное снижение в зрелых бражках концентрации изобутанола на 1047,344 мг/л (1 режим ТГФО) и на 1432,2809 мг/л
(2 режим ТГФО), а также пропанола на 55,4386 мг/л (1 режим
ТГФО) и на 62,4064 мг/л (2 режим ТГФО). Кроме того, в опытных
бражках было отмечено меньшее содержание гексанола на
30,0847 мг/л (1 режим ТГФО) и на 55,9926 мг/л (2 режим ТГФО) и
фенилэтанола на 32,7373 мг/л (1 режим ТГФО) и на 5,0764 мг/л
(2 режим ТГФО). В опытной бражке, полученной с применением
1 режима ТГФО, полностью отсутствовал бутанол (табл. 8). По
всей видимости, определенное количество высших спиртов в контрольной бражке образовывалось в результате метаболизма микроорганизмов-контаминантов.
Несмотря на некоторое повышение в опытных бражках
количества изопропанола, появление амилола, а также увеличение концентрации изоамилола в бражке, полученной с применением 2 режима ТГФО, суммарное содержание высших спиртов
после антимикробной обработки разваренной массы пероксидом
водорода снижалось на 1221,5228 мг/л (1 режим ТГФО) и на
1123,357 мг/л (2 режим ТГФО). Следствиями данного эффекта
являлись, по всей видимости, меньшее содержание несброженной глюкозы и более высокая концентрация этилового спирта в
опытных бражках.
Известно, что высшие спирты негативно влияют на жизнедеятельность дрожжей: нарушают физиологические функции,
подавляют почкование [1, 333], повышают проницаемость цитоплазматической мембраны и усиливают токсическое действие
других веществ, например органических кислот [199]. Вероятно,
более низкое содержание сивушных масел в бражках, получен208
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ных с применением антимикробной обработки, благоприятно
влияло на бродильную активность дрожжей.
Таким образом, на основании полученных данных можно
сделать вывод, что пероксид водорода проявляет угнетающее
действие по отношению к микроорганизмам зерна и зернового
замеса, в результате чего снижается накопление кислотности в
процессе брожения, уменьшается содержание несброженных углеводов, нерастворенного крахмала и высших спиртов в зрелой
бражке, что в конечном итоге приводит к повышению выхода
этилового спирта. Кроме того, проведение дезинфекции зернового замеса на стадии тепловой гидродинамической ферментативной обработки позволит снизить затраты энергоресурсов на
проведение температурной стерилизации.
Применение растворов пероксида водорода для обеззараживания сырья и полупродуктов на различных этапах производства спирта позволит: эффективно предотвращать развитие посторонних микроорганизмов, сократить уровень прямых и косвенных потерь углеводсодержащего сырья, снизить риски при
переработке дефектного сырья, повысить выход спирта и его качество.
209
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Технология спирта / В.Л. Яровенко [и др.]; под ред.
проф. В.Л. Яровенко. – М. : Колос, Колос-Пресс, 2002. –
464 с.
Способ низкотемпературного разваривания крахмалистого сырья в производстве спирта / В.А. Сотников
[и др.] // Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2002. – № 1. – С. 13-15.
Глубокая очистка зерна от примесей при низкотемпературной обработке сырья / О.С.Журба [и др.] // Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2003. – № 3. –
С. 8-10.
Сотников, В.А. Пути повышения эффективности деконтаминации зернового сырья методом гидрокавитационной гомогенизации / В.А. Сотников, В.В. Марченко,
В.С. Гамаюрова // Хранение и переработка сельхозсырья.
– 2003. – № 7. – С. 39-42.
Гусева, И. Микробиологические аспекты получения качественного зернового сусла при производстве спирта /
И. Гусева, О.А. Калинина, Э.Н. Колдин // Производство
спирта и ликероводочных изделий. – 2004. – № 2. –
С. 12-15.
Журба, О.С. К вопросу о микробиологической чистоте
производства при переработке зерна на спирт /
О.С. Журба, Е.М. Максимова // Производство спирта и
ликероводочных изделий. – 2004. – № 4. – С. 17-19.
Антибактериальное средство Каморан для стабилизации
процесса брожения / Л.В. Римарева [и др.] // Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2001. – № 3. –
С. 14-15.
Использование препарата антисептического действия в
производстве спирта / В.А. Поляков [и др.] // Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2001. – № 3. –
С. 30.
210
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Препарат Лактрол против бактериальной инфекции
спиртового производства / С.В. Пыхова [и др.] // Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2003. –
№ 2. – С. 16-17.
Чередниченко, В.С. Влияние технологических факторов
на органолептические показатели спирта / В.С. Чередниченко // Ликероводочное производство и виноделие. –
2004. - № 6. – С. 10-11.
Анализ взаимосвязи состава образования примесей и
микропримесей в пищевом этиловом спирте от качества
сырья и технологических стадий / Н.Н. Симонова [и др.]
// Современные тенденции развития технологии и аппаратурного оформления процессов ректификации в спиртовом производстве. Пути повышения качества и увеличения выхода ректификованного спирта. – М.: Пищевая
промышленность, 2003. – С. 152-180.
Лихтенберг, Л.А. Влияние технологических приемов на
качество спирта / Л.А. Лихтенберг // Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2001. – № 2. – С. 28-29.
Леденев, В.П. Зависимость образования побочных продуктов в зрелой бражке от качества сырья / В.П. Леденев,
Л.П. Галямова, С.И. Ибрагимова // Производство спирта
и ликероводочных изделий. – 2002. – № 3. – С. 18-19.
Смирнова, Т.А. Микробиология зерна и продуктов его
переработки / Т.А. Смирнова, Е.И. Кострова. – М.: Агропромиздат, 1989. – 159 с.
А. с. 1024503 СССР, МКИ3 С 12 Р 7/06. Способ производства этилового спирта из крахмалсодержащего сырья /
Л.Р. Решетняк, А.М. Куц, Т.П. Слюсаренко (СССР). – №
3310872/28-13; заявл. 30.04.81 ; опубл. 23.06.83, Бюл.
№ 23. – 3 с.
Use of virginiamycin to control the growth of lactic acid bacteria during alcoholic fermentation / S.H. Hynes [et all.] //
J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 1997. – Vol.18, № 4. –
P. 696-703.
211
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
Попова, Т.Г. Новые антимикробные препараты, подавляющие инфекцию в спиртовом брожении / Т.Г. Попова
// Тез. докл. 4 Междунар. научно-практич. конф. «Прогрессивные технологии и современное оборудование
важнейшие составляющие успеха экономического развития предприятий спиртовой и ликероводочной промышленности»: тез. докл., 23-24 апреля 2003 г. – М. 2003. –
С. 75-79.
Журба, О.С. Технология этанола из целого зерна пшеницы на основе интенсивных способов обработки сырья /
О.С. Журба, В.А. Поляков, В.П. Леденев // Производство
спирта и ликероводочных изделий. – 2004. – № 1. –
С. 14-17.
Alcarde, A.R. Fermentation of irradiated sugarcane must /
A.R. Alcarde, J.M.M. Walder, J. Horii // Scientia Agricola. –
2003. – Vol. 60, № 4. – P. 677-681.
Khachatourians, G.G. Agricultural use of antibiotics and the
evolution and transfer of antibiotic-resistant bacteria /
G.G. Khachatourians // Can. Med. Assoc. J. – 1999. –
Vol. 159, № 9. – P. 1129-1136.
Позин, М.Е. Перекись водорода и перекисные соединения / М.Е. Позин. – Л., М: Госхимиздат, 1951.- 476 с.
Шамб, У. Перекись водорода / У. Шамб, Ч. Сеттерфилд,
Р. Вентвортс. – М.: Издательство иностранной литературы, 1958. – 576 с.
Гафнер, Л.А. Основы технологии приема, хранения и переработки зерна / Л.А. Гафнер, В.А. Бутковский,
А.М. Родюкова. – М.: Колос, 1975. – 400 с.
Кретович, В.Л. Биохимия зерна и хлеба / В.Л. Кретович.
– М.: Наука, 1991. – 136 с.
Казаков, Е.Д. Биохимия зерна и хлебопродуктов /
Е.Д. Казаков, Г.П. Карпиленко. – 3-е переработанное и
дополненное издание. – СПб.: ГИОРД, 2005. – 512 с.
212
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
Пучкова, Л.И. Технология хлеба, кондитерских и макаронных изделий. Часть I. Технология хлеба / Л.И. Пучкова, Р.Д. Поландова, И.В. Матвеева. – СПб.: ГИОРД,
2005. – 559 с.
Егоров, Г.А. Управление технологическими свойствами
зерна / Г.А. Егоров. – Воронеж: Воронежский государственный университет, 2000. – 348 с.
Мальцев, П.М. Технология бродильных производств /
П.М. Мальцев. – 2-е изд. перераб. и доп. – М.: Пищевая
промышленность, 1980. – 560 с.
Пищевая химия / А.П. Нечаев [и др.]; под ред. А.П. Нечаева. – 3-е издание, испр. – СПб.: ГИОРД, 2004. – 640 с.
Бейли, Дж. Основы биохимической инженерии: [пер. с
англ. в 2 ч. Ч 1] / Дж. Бейли, Д. Олис. – М.: Мир, 1989. –
692 с.
Rumpold, B.A. Impact of high hydrostatic pressure on wheat,
tapioca, and potato starches: Doktorin der Ingenieurwissenschaften genehmigte Dissertation: - Tag der wissenschaftlichen Aussprache 16 August 2005. – Berlin., 2005. –
132 p.
Запрометов, М.Н. Основы биохимии фенольных соединений: учебное пособие для биол. специальностей ун-тов
/ М.Н. Запрометов. – М.: Высшая школа, 1974. – 214 с.
Red xylem and higher lignin extractability by downregulating a cinnamyl alcohol dehydrogenase in poplar /
M. Baucher [et all.] // Plant Physiol. – 1996. – Vol. 112, № 4.
– P. 1479-1490.
Zhang, X.-H. Molecular cloning of 4-coumarate:coenzyme A
ligase in loblolly pine and the roles of this enzyme in the biosynthesis of lignin in compression wood / X.-H. Zhang,
V.L. Chiang // Plant Physiol. – 1997. – Vol. 113, № 1. –
P. 65-74.
213
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
The last step of syringyl monolignol biosynthesis in angiosperms is regulated by a novel gene encoding sinapyl alcohol
dehydrogenase / L. Li [et all.] // The Plant Cell. – 2001. –
Vol. 13, № 7. – P. 1567-1585.
Семенов, А.Я. Инфекция семян хлебных злаков. Всесоюзная академия с-х наук имени В.И. Ленина / А.Я. Семенов, Р.Н. Федорова. – М.: Колос, 1984. – 95 с.
Микробиология пива / под ред Ф.Дж. Прист, Й. Кэмпбелл; пер. с англ. – СПб.: Профессия, 2005. – 368 с.
Мюллер, Р. Микробиология пищевых продуктов растительного происхождения / Р. Мюллер, П. Литц, Г.Д. Мюнх.
– М.: Пищевая промышленность, 1977. – 343 с.
Кристенсен, К.М. Жизнеспособность семян / К.М. Кристенсен. пер. с англ. Н.А. Емельяновой; под ред. и с предисл. М.К. Фирсовой. – М.: Колос, 1978. – 415 с.
Дашевский, В.И. Хранение зерна и зерновых продуктов /
В.И. Дашевский, Г.А. Закладной. – М.: Колос, 1978. –
427 с.
Пивоваров, Ю.П. Микрофлора пищевых продуктов /
Ю.П. Пивоваров, Р.С. Волкова, Л.С. Зиневич // Итоги
науки и техники ВИНИТИ. Сер. Микробиология. – 1989.
– Т. 22. – С. 1-196.
Тулемисова, К.А. Микробиологические аспекты качества
и безопасности сырья и продуктов питания / К.А. Тулемисова, Г.Н. Дудикова, Ж.К. Тулемисова // Хранение и
переработка сельхозсырья. – 2002. - № 7. – С. 20-22.
Роте, М. Аромат хлеба / М. Роте. пер. с нем. Н.Г. Еникеевой и Э.Я. Вейцель; Под ред. Л.Я. Ауэрмана. – М.: Пищевая промышленность, 1978. – 238 с.
Писарницкий, А.Ф. Роль карбонил-аминной реакции в
биологических системах и технологии пищевых производств (Обзор) / А.Ф. Писарницкий, И.А. Егоров // Прикладная биохимия и микробиология. – 1989. – Т. XXV,
Вып. 5. – С. 579-594.
214
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
Швец, В.Н. Влияние продуктов реакций меланоидинообразования и карамелизации сахаров на дрожжи Saccharomyces cerevisiae / В.Н. Швец, Т.П. Слюсаренко //
Прикладная биохимия и микробиология. – 1976. – Т. XII,
Вып. 1. – С. 73-78.
Fate of fumonisin B1 in naturally contaminated corn during
the ethanol fermentation / R.J. Bothast [et all.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1992. – Vol. 58, № 1. – P. 233-236.
Keith, T.S. Effects of fusariotoxin T-2 on Saccharomyces
cerevisiae and Saccharomyces carlsbergensis / T.S. Keith,
G.G. Khachatourians // Appl. Environ. Microbiol. – 1983. –
Vol. 45, № 3. – P. 862-867.
Keith, T.S. Influence of membrane on T-2 toxin toxicity in
Saccharomyces spp. / T.S. Keith, G.G. Khachatourians //
Appl. Environ. Microbiol. – 1984. – Vol. 47, № 4. –
P. 681-684.
Практикум по сельскохозяйственной фитопатологии /
под ред. К.В. Попковой. – 2-е изд. перераб. и доп. – М.:
Агропромиздат, 1988. – 335 с.
Bacteriological survey of sixty health foods / W.H. Andrews
[et all.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1979. – Vol. 37, № 3.
– P. 559-566.
Ауэрман, Л.Я. Технология хлебопекарного производства:
учебник / Л.Я. Ауэрман. – 9-е изд.; перераб. и доп. –
СПб: Профессия, 2002. – 416с.
Лапина, Т.П. Характеристика микрофлоры пивоваренных ячменей / Т.П. Лапина // Пиво и напитки. – 2001. –
№ 5. – С. 22-23.
Тутельян, В.А. Микотоксины (медицинские и биологические аспекты) / В.А. Тутельян, В.Л. Кравченко. – АМН
СССР. – М.: Медицина, 1985. – 320 с.
Волкова, Т.В. Результаты скрининга зернового сырья на
содержание микотоксинов / Т.В. Волкова, В.С. Исаева //
Пиво и напитки. – 2003. – № 1. – С. 30-31.
215
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
Lillehoj, E.B. The fate of aflatoxin in naturally contaminated
corn during the ethanol fermentation / E.B. Lillehoj,
A. Lagoda, W.F. Maisch // Can. J. Microbiol. – 1979. –
Vol. 25, № 8. – P. 911-914.
Покровский, А.А. Метаболические аспекты фармакологии и токсикологии пищи / А.А. Покровский. – М.: Медицина, 1979. – 184 с.
Wilkins, C.K. Volatile metabolites of some barley storage
molds / C.K. Wilkins, S. Scholl // Int. J. Food Microbiol. –
1989. – Vol. 8, № 1. – P. 11-17.
Borjesson, T. Volatile metabolites and other indicators of
Penicillium aurantiogriseum growth on different substrates /
T. Borjesson, U. Stollman, J. Schnurer // Appl. Environ. Microbiol. – 1990. – Vol. 56, № 12. – P. 3705-3710.
Borjesson, T. Volatile metabolites produced by six fungal
species compared with other indicators of fungal growth on
cereal grains / T. Borjesson, U. Stollman, J. Schnurer // Appl.
Environ. Microbiol. – 1992. – Vol. 58, № 8. – P. 2599-2605.
Писарницкий, А.Ф. Низкомолекулярные метаболиты
продуцируемые некоторыми видами Penicillium /
А.Ф. Писарницкий, Н.А. Егоров // Прикладная биохимия
и микробиология. – 1988. – Т. XXIV, Вып. 6. –
С. 760-764.
Фридрих, Р. Снижение содержания вредных веществ в
процессе зерноочистки / Р. Фридрих // Хлебопродукты. –
2002. – № 7. – С.16-18.
Андросова, В.М. Суховоздушное прогревание семян
озимой пшеницы / В.М. Андросова, В.Т. Садковский //
Защита и карантин растений. – 2000. - № 8. – С. 16-17.
Крикунова, Л.Н. ИК-обработка зерна – перспективный
способ повышения микробиологической чистоты сырья /
Л.Н. Крикунова // Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2006. – № 3. – С. 31-34.
216
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
Смирнова, И.В. Применение ультразвука в спиртовой
промышленности / И.В. Смирнова, А.Н. Кречетникова //
Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2004.
– № 2. – С. 37-38.
Пат. 2143794, Российская федерация, МПК7 А 01 С 1/00,
А 23 L 1/025, 3/01, А 01 F 25/00, А 23 В 9/04, Н 05 В 6/64,
7/18. Способ для дезинсекции и дезинфекции материалов
зернового происхождения и устройство для его осуществления / Г.Н. Лысов. – № 99105300/13; заявл. 17.03.1999;
опубл. 10.01.2000.
Обработка семян в электростатическом поле потоком
ионов / В.Г. Поварницын [и др.] // Защита и карантин
растений. – 2000. – № 8. – С. 18.
Санина, Т.В. Интенсификация процесса биоактивации
зерна и снижение его микробиологической обсемененности в технологии зернового хлеба / Т.В. Санина,
Г.П. Шуваева, Н.И. Алехина // Хранение и переработка
сельхозсырья. – 2003. – № 1. – С. 15-17.
Чернова, Е.В. Влияние активированных растворов на
микрофлору пивоваренных ячменей и их качество /
Е.В. Чернова, А.М. Гернет, Л.Н. Шабурова // Пиво и напитки. – 2003. – № 1. – С.34-35.
Пат. 2102862 РФ, МКИ С А23 В 9/16. Способ подготовки
зерна к хранению / Ю.Ф. Росляков, Т.Н. Прудников,
Н.В. Ильчишина. – № 96105496/13; заявл. 20.03.96;
опубл. 27.01.98.
Пат. № 2221369, Россия, МКИ А 01 F 25/00, А 23 В 9/26,
С 12 Р 1/02. Способ подготовки зерна к хранению /
О.И. Квасенков, С.А. Ермоленко; заявлено 20.08.2002;
опубл. 20.01.2004.
Пат. 2157071 РФ, МКИ А23 В 9/00, 9/26. Способ консервации свежеубранного зерна / О.И. Квасенков,
Е.А. Юшина, Ю.Ф. Росляков. – № 99114626/13; Заявл.
09.07.99; Опубл. 10.10.00.
217
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
Пат. 2102896 РФ, МКИ 6А 23 В 9/16. Способ консервации зерна / О.Л. Костенко. – № 96105349/13; Заявл.
20.03.96; Опубл. 27.01.98.
Кузнецова, Е.А. Способы снижения микробиологической
обсемененности зерна при производстве зернового хлеба /
Е.А. Кузнецова, С.Я. Корячкина, Е.В. Гуляева // Изв. вузов. Пищевая технология. – 2003. – № 4. – С. 30-31.
Kottapalli, B. Evaluation of gaseous ozone and hydrogen
peroxide treatments for reducing Fusarium survival in
malting barley / B. Kottapalli, C.E. Wolf-Hall, P. Schwarz //
Journal of Food Protection. – 2005. – Vol. 68, № 6. –
P. 1236-1240.
Вашков, В.И. Антимикробные средства и методы дезинфекции при инфекционных заболеваниях В. И. Вашков –
М.: Медицина, 1977. – 296с.
Федоренко, Б.Н. Инженерия пивоваренного солода:
Учеб.-справ. пособие / Б.Н. Федоренко. – СПб.: Профессия, 2004. – 248 с.
Устойчивость Penicillium piceum F-648 к действию пероксида водорода в условиях кратковременного и длительного окислительного стресса / Ж.И. Павловская [и др.] //
Прикладная биохимия и микробиология. – 2003. – Т. 39. –
№ 1. – С. 31-36.
Механизмы бактерицидного действия перекиси водорода /
И.И. Самойленко [и др.] // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 1983. – №. 12. –
С. 30-33.
Способ снижения микробной обсемененности зернового
сырья в биотехнологии спирта / Т.А. Ямашев [и др.] //
Хранение и переработка сельхозсырья. – 2006. – № 12. –
С. 57-60.
Кисленко, В.Н. Кинетика и механизм окисления органических веществ пероксидом водорода / В.Н. Кисленко,
А.А. Берлин // Успехи химии. – 1991. – Т. 60, Вып. 5. –
С. 949-981.
218
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
Давиденко, Т.И. Пероксидазное окисление фенолов /
Т.И. Давиденко // Прикладная биохимия и микробиология. – 2004. – Т. 40. – № 6. – С. 625-629.
Комов, В.П. Биохимия: учеб. для вузов / В.П. Комов,
В.Н. Шведова. – М.: Дрофа, 2004. – 640 с.
Гусев, М.В. Микробиология: учеб. / М.В. Гусев,
Л.А. Минеева. – 2-е изд. – М.: Изд-во. Моск. ун-та, 1985.
– 376 с.
Natarajan, K.R. Chemical inactivation of aflatoxins in peanut
protein ingredients / K.R. Natarajan // J. Environ. Pathol.
Toxicol. Oncol. – 1992. – Vol. 11, № 4. – P. 217-227.
UV-inducible proteins and UV-induced cross-protection
against acid, ethanol, H2O2 or heat treatments in Lactococcus
lactis subsp. lactis. / A. Hartke [et all.] // Arch. Microbiol. –
1995. – Vol. 163, № 5. – P. 329-336.
Engelmann, S. Impaired oxidative stress resistance of Bacillus subtilis sigB mutants and the role of katA and katE. /
S. Engelmann, M.E. Hecker // FEMS Microbiol. Lett. –
1996. – Vol. 145, № 1. – P. 63-69.
McDonnell, G. Antiseptics and disinfectants: activity, action,
and resistance / G. McDonnell, A.D. Russell // Clin. Microbiol. Rev. – 1999. – Vol. 12, № 1. – P. 147-179.
Устойчивость дрожжей Yarrowia lipolytica к окислительному стрессу / Е.Н. Бирюкова [и др.] // Микробиология. –
2006. – Т. 75. – № 3. – С. 293-298.
Байляк, М.М. Влияние перекиси водорода на активности
антиоксидантных ферментов Saccharomyces cerevisiae
зависит от особенностей штаммов / М.М. Байляк, Г.М.
Семчишин, В.И. Лущак // Биохимия. – 2006. – Т. 71,
Вып. 9. – С. 1243-1252.
Jamieson, D.J. Saccharomyces cerevisiae has distinct adaptive responses to both hydrogen peroxide and menadione /
D.J. Jamieson // J. Bacteriol. – 1992. – Vol. 174, № 20. –
P. 6678-6681.
219
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
Реактивирующее действие внеклеточного белкового метаболита Luteococcus japonicus subsp. сasei на клетки,
подвергнутые окислительному стрессу / Л.И. Воробьева
[и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 2003.
– Т. 39. – № 2. – С. 202-207.
Oxidative stress promotes specific protein damage in Saccharomyces cerevisiae / E. Cabiscol [et all.] // J. Biol. Chem.
– 2000. – Vol. 275, № 35. – P. 27393-27398.
Hydrogen peroxide-induced carbonylation of key metabolic
enzymes in Saccharomyces cerevisiae: the involvement of
the oxidative stress response regulators Yap1 and Skn7. /
V.M. Costa [et all.] // Free Rad. Bio. Med. – 2002. – Vol 33.
№ 11. – P. 1507–1515.
H2O2, but not menadione, provokes a decrease in the ATP
and an increase in the inosine levels in Saccharomyces cerevisiae / H. Osorio [et all.] // Eur. J. Biochem. – 2003. –
Vol. 270, № 7. – P. 1578-1589.
Hajduk, E. The effects washing carrots in solutions of hydrogen peroxide on the microbial and carotenoid quality of juice
and salads / E. Hajduk, K. Surywka // Food Service Technology. – 2005. – Vol. 5, № 1. – P. 1.
Skinner, K.A. Bacterial contaminants of fuel ethanol production / K.A. Skinner, T.D. Leathers // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2004. – Vol. 31, № 9. – P. 401-408.
Фараджева, Е.Д. Общая технология бродильных производств / Е.Д. Фараджева, В.А. Федоров. – М.: Колос,
2002. – 408 с.
Пат. № 2221872, Россия, МКИ С 12 Р 7/06. Способ производства этилового спирта / Л.Н. Крикунова, О.С. Журба, В.П. Леденев, В.В. Кирдяшкин, Н.В. Елькин; заявлено 23.12.2002; опубл. 20.01.2004.
Бирагова, Н.Ф. Перспективные способы обработки зерна
при производстве спирта / Н.Ф. Бирагова // Производство
спирта и ликероводочных изделий. – 2003. – № 1. – С. 17.
220
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
100. Пат. № 2138555, Россия, МКИ С 12 Р 7/06. Способ производства этилового спирта / А.Д. Федоров, Б.А. Кесель,
П.И. Дьяконский, Р.П. Наумова, С.К. Зарипова, Д.А. Весельев; заявлено 05.12.97; опубл. 27.09.99.
101. Пат. № 2199586, Россия, МКИ С 12 Р 7/06. Способ получения этилового спирта / В.А. Сотников, А.Д. Федоров;
заявлено 29.03.2001; опубл. 27.02.2003.
102. Назарова, П.Г. Мягкая схема производства спирта: современный подход и рекомендации по применению /
П.Г. Назарова, Р.В. Чечнев // Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2002. – № 2. – С. 32-33.
103. Римарева, Л.В. Повышение эффективности биотехнологических процессов спиртового производства / Л.В. Римарева // Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2003. – № 4. – С. 13-18.
104. Технология низкотемпературного разваривания крахмалистого сырья в производстве спирта / А.Н. Аношина
[и др.] // Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2002. – № 4. – С. 37.
105. Гидроизмельчение – эффективный способ подготовки
зерна для всех технологий спиртового производства /
В.П. Леденев [и др.] // Прогрессивные технологии и современное оборудование – важнейшие составляющие
успеха экономического развития предприятий спиртовой
и ликероводочной промышленности. – М.: Пищевая
промышленность, 2003. – С. 6-11.
106. Прогрессивная технология и оборудование приготовления
замеса в производстве спирта / П.К. Кириллов [и др.] //
Прогрессивные технологии и современное оборудование
– важнейшие составляющие успеха экономического развития предприятий спиртовой и ликероводочной промышленности. – М.: Пищевая промышленность, 2003. –
С. 30-34.
221
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
107. Кириллова, Н.П. Гранулометрический состав измельченного зерна при подготовке его к сбраживанию в производстве спирта / Н.П. Кириллова, Н.А. Николаев // Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2005. –
№ 3. – С. 17-18.
108. Сотников, В.А. Способ активации процессов теплового и
ферментативного разрушения крахмалистого сырья некоторыми комплексонами / В.А. Сотников, В.С. Гамаюрова, В.В. Марченко // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2005. – № 12. – С. 32-34.
109. Смирнова, И.В. Влияние ультразвуковой обработки на
компоненты химического состава пшеницы при производстве спирта / И.В. Смирнова, А.Н. Кречетникова //
Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2005.
– № 3. – С. 27-29.
110. Смирнова, И.В. Ультразвуковая обработка сусла на стадии осахаривания / И.В. Смирнова, А.Н. Кречетникова //
Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2006.
– № 1. – С. 29-30.
111. Поляков, В.А. Перспективные биотехнические процессы
для спиртовой промышленности / В.А. Поляков, Л.В.
Римарева, Г.Б. Ксандопуло // Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2002. – № 1. – С. 6-8.
112. Технологические аспекты получения высококачественного спирта / Л.В. Римарева [и др.] // Производство
спирта и ликероводочных изделий. – 2002. – № 3. –
С. 16-19.
113. Хассельбек, Г. Применение ферментных препаратов
фирмы «Эрбсле Гайзенхайм» в спиртовой промышленности / Г. Хассельбек, А.Ю. Плохов, Ю.В. Сахаров //
Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2002. –
№ 3. – С. 22-23.
222
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
114. Римарева, Л.В. Микробные ферментные препараты в
спиртовом производстве / Л.В. Римарева // Производство
спирта и ликероводочных изделий. – 2002. – № 4. –
С. 27-31.
115. Интенсификация спиртового производства на основе использования мультиэнзимных систем / Л.В. Римарева
[и др.] // Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2004. – № 2. – С. 26-28.
116. Bayrock, D.P. Control of Lactobacillus contaminants in continuous fuel ethanol fermentations by constant or pulsed addition of penicillin G / D.P. Bayrock, K.C. Thomas, W.M.
Ingledew // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2003. – Vol. 62,
№ 5-6. – P. 498-502.
117. Bayrock, D.P. Changes in steady state on introduction of a
Lactobacillus contaminant to a continuous culture ethanol
fermentation / D.P. Bayrock, W.M. Ingledew // Journal of
Industrial Microbiology & Biotechnology. – 2001. – Vol. 27,
№ 1. – P. 39-45.
118. Промышленная микробиология / З.А. Аркадьева, [и др.];
под ред. Н.С. Егорова. – М.: Высш. шк., 1989. – 688 с.
119. Бейли, Дж. Основы биохимической инженерии: [пер. с
англ. в 2 ч. Ч 2] / Дж. Бейли, Д. Олис.. – М.: Мир, 1989. –
590 с.
120. Skinner-Nemec, K.A. Biofilm formation by bacterial contaminants of fuel ethanol production / K.A. Skinner-Nemec,
N.N. Nichols, T.D. Leathers // Biotechnol. Lett. – 2007. –
Vol. 29, № 3. – P. 379-383.
121. Меледина, Т. Мойка и дезинфекция на пивоваренных
предприятиях. Ч. 2. Микроорганизмы, контаминирующие производство пива / Т. Меледина // Индустрия напитков. – 2008. – № 1. – С. 20-24.
122. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 2: пер. с англ.
/ под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейнли,
С. Уилльямса. – М.: Мир, 1997. – 368 с.
223
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
123. Contaminant occurrence, identification and control in a pilotscale corn fiber to ethanol conversion process / D.J. Schell
[et all.] // Bioresour Technol. – 2007. – Vol. 98, № 15. –
P. 2942-2948.
124. Квасников, Е.И. Микробиологические процессы в виноделии: некоторые актуальные аспекты (Обзор) / Е.И.
Квасников // Прикладная биохимия и микробиология. –
1995. – Т. 31. – № 2. – С. 149-154.
125. Квасников, Е.И. Молочнокислые бактерии в природе и
народном хозяйстве / Е.И. Квасников, Н.К. Коваленко,
О.А. Нестеренко // Прикладная биохимия и микробиология. – 1982. – Т. XVIII, Вып. 6. – С. 821-834.
126. A review of hop resistance in beer spoilage lactic acid bacteria / K. Suzuki [et all.] // J. Inst. Brew. – 2006. – Vol. 112,
№ 2. – P. 173-191.
127. Vaughan, A. Enhancing the microbiological stability of malt
and beer – a review / A. Vaughan, T. O’Sullivan,
D. van Sinderen // J. Inst. Brew. – 2005. – Vol. 111, № 4. –
P. 355-371.
128. Riboprinting and 16S rRNA gene sequencing for identification of brewery Pediococcus isolates / M. Barney [et all.] //
Appl. Environ. Microbiol. – 2001. – Vol. 67, № 2. –
P. 553-560.
129. Lowe, D.P. The use and effects of lactic acid bacteria in
malting and brewing with their relationships to antifungal activity, mycotoxins and gushing: a review / D.P. Lowe,
E.K. Arendt // J. Inst. Brew. – 2004. – Vol. 110, № 3. –
P. 163-180.
130. Detection of alcohol-tolerant Hiochi bacteria by PCR / T.
Nakagawa [et all.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1994. –
Vol. 60, № 2. – P. 637-640.
131. van Beek, S. Evolution of the lactic acid bacterial community
during malt whisky fermentation: a polyphasic study /
S. van Beek, F.G. Priest // Appl. Environ. Microbiol. – 2002.
– Vol. 68, № 1. – P. 297-305.
224
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
132. van Beek S. Bacterial diversity in scotch whisky fermentations as revealed by denaturing gradient gel electrophoresis /
S. van Beek, F.G. Priest // J. Am. Soc. Brew. Chem. – 2003.
– Vol. 61, № 1. – P. 10-14.
133. Synergism among lactic acid, sulfite, pH and ethanol in alcoholic fermentation of Saccharomyces cerevisiae (PE-2 and
M-26) / C. Dorta [et all.] // World Journal of Microbiology
and Biotechnology. – 2006. – Vol. 22, № 2. – P. 177-182.
134. Narendranath, N.V. Effect of yeast inoculation rate on the
metabolism of contaminating lactobacilli during fermentation
of corn mash / N.V. Narendranath, R. Power // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2004. – Vol. 31, № 12. – P. 581-584.
135. de Oliva-Neto, P. Evaluation of bacterial contamination in a
fed-batch alcoholic fermentation process / P. de Oliva-Neto,
F. Yokoya // World Journal of Microbiology and Biotechnology. – 1994. – Vol. 10, № 6. – P. 697-699.
136. de Oliva-Neto, P. Effect of 3,4,4'-trichlorocarbanilide on
growth of lactic acid bacteria contaminants in alcoholic fermentation / P. de Oliva-Neto, F. Yokoya // Bioresource technology. – 1998. – Vol. 63, № 1. – P. 17-21.
137. Inhibition of beet molasses alcoholic fermentation by lactobacilli / J.J. Essia Ngang [et all.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1990. – Vol. 33, № 5. – P. 490-493.
138. Watanabe, I. A strategy to prevent the occurrence of Lactobacillus strains using lactate-tolerant yeast Candida glabrata
in bioethanol production / I. Watanabe, T. Nakamura,
J. Shima // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2008. – Vol. 35,
№ 10. – P. 1117-1122.
139. Effects of lactobacilli on yeast-catalyzed ethanol fermentations / N.V. Narendranath [et all.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1997. – Vol. 63, № 11. – P. 4158-4163.
225
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
140. Thomas, K.C. Effect of lactobacilli on yeast growth, viability
and batch and semi-continuous alcoholic fermentation of
corn mash / K.C. Thomas, S.H. Hynes, W.M. Ingledew //
Journal of Applied Microbiology. – 2001. – Vol. 90, № 5. –
P. 819-828.
141. Santos, M.T. Characteristics of yeast cell flocculation by
Lactobacillus fermentum / M.T. Santos, F. Yokoya // J. Ferment. Bioeng. – 1992. – Vol. 75, № 2. – P. 151-154.
142. Пономарева, О.И. Влияние инфицирующих микроорганизмов на размножение хлебопекарных дрожжей /
О.И. Пономарева, В.Г. Черныш, Е.В. Соболева // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2005. – № 11. –
С. 36-37.
143. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 1: пер. с англ. /
под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейнли,
С. Уилльямса. – М.: Мир, 1997. – 432 с.
144. Loureiro, V. Spoilage yeasts in the wine industry /
V. Loureiro, M. Malfeito-Ferreira // International Journal of
Food Microbiology. – 2003. – Vol. 86, № 1-2. – P. 23-50.
145. Elsztein, C. Polyhexamethyl biguanide can eliminate contaminant yeasts from fuel-ethanol fermentation process /
C. Elsztein, J.A.S. de Menezes, Jr.M.A. de Morais // J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. – 2008. – Vol. 35, № 9. – P. 967-973.
146. Detection and identification of wild yeast contaminants of
the industrial fuel ethanol fermentation process /
A.C.M. Basilio [et all.] // Curr. Microbiol. – 2008. – Vol. 56,
№ 4. – P. 322-326.
147. Identification of Dekkera bruxellensis as a major contaminant yeast in continuous fuel ethanol fermentation /
A.T. de Souza Liberal [et all.] // Journal of Applied Microbiology. – 2006. – Vol. 102, № 2. – P. 538-547.
226
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
148. Contaminant yeast detection in industrial ethanol fermentation must by rDNA-PCR / A.T. de Souza Liberal [et all.] //
Letters in Applied Microbiology. – 2005. – Vol. 40, № 1. –
P. 19-23.
149. Rawsthorne, H. A real-time PCR assay for the enumeration
and detection of Zygosaccharomyces bailii from wine and
fruit juices / H. Rawsthorne, T.G. Phister // International
Journal of Food Microbiology. – 2006. – Vol. 112, № 1. –
P. 1-7.
150. Aguilar Uscanga, M.G. Brettanomyces bruxellensis: effect of
oxygen on growth and acetic acid production / M.G. Aguilar
Uscanga, M.-L. Delia, P. Strehaiano // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2003. – Vol. 61, № 2. – P. 157-162.
151. Phowchinda, O. Effects of acetic acid on growth and fermentative activity of Saccharomyces cerevisiae / O. Phowchinda,
M.L Delia-Dupuy, P. Strehaiano // Biotechnology Letters. –
1995. – Vol. 17, № 2. – P. 237-242.
152. Abbott, D.A. Growth rates of Dekkera/Brettanomyces yeasts
hinder their ability to compete with Saccharomyces cerevisiae in batch corn mash fermentations / D.A. Abbott,
S.H. Hynes, W.M. Ingledew // Appl. Microbiol. Biotechnol.
– 2005. – Vol. 66, № 6. – P. 641-647.
153. Czarnecki, Z. Starch hydrolysis and its effect on product
yield and microbial contamination in yeast ethanol fermentation / Z. Czarnecki, W. Grajek // World Journal of Microbiology and Biotechnology. – 1991. – Vol. 7, № 3. –
P. 355-358.
154. Гапонов, К.П. Процессы и аппараты микробиологических производств / К.П. Гапонов. – М.: Легкая и пищевая
пром-сть, 1981. – 240 с.
155. Кантере, В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств: учебное пособие для студентов высш. учеб. заведений / В.М. Кантере. – М.: Агропромиздат, 1990. – 271 с.
227
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
156. Меледина, Т. Мойка и дезинфекция на пивоваренных
предприятиях. Ч. 3. Дезинфекция в пивоварении / Т. Меледина // Индустрия напитков. – 2008. – № 2. – С. 28-32.
157. de Oliva-Neto, P. Susceptibility of Saccharomyces cerevisiae
and lactic acid bacteria from the alcohol industry to several
antimicrobial compounds / P. de Oliva-Neto, F. Yokoya //
Brazilian Journal of Microbiology. – 2001. – Vol. 32, № 1. –
P. 10-14.
158. Narendranath, N.V. Relationship between pH and medium
dissolved solids in terms of growth and metabolism of lactobacilli and Saccharomyces cerevisiae during ethanol production / N.V. Narendranath, R. Power // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. – Vol. 71, № 5. – P. 2239-2243.
159. Alcarde, A.R. Effect of γ radiation on physiological parameters of the ethanolic fermentation / A.R. Alcarde,
J.M.M. Walder, J. Horii // World Journal of Microbiology
and Biotechnology. – 2002. – Vol. 18, № 1. – P. 41-47.
160. Gibbons, W.R. Use of potassium meta bisulfite to control
bacterial contaminants during fermentation of fodder beet
cubes for fuel ethanol / W.R. Gibbons, C.A. Westby // Biomass. – 1992. – Vol. 11, № 2. – P. 99-113.
161. de Oliva-Neto, P. Screening for yeast with antibacterial properties from an ethanol distillery / P. de Oliva-Neto,
M.A. Ferreira, F. Yokoya // Bioresour Technol. – 2004. –
Vol. 92, № 1. – P. 1-6.
162. Selective antimicrobial action of chitosan against spoilage
yeasts in mixed culture fermentations / L. Gomez-Rivas
[et all.] // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2004. – Vol. 31,
№ 1. – P. 16-22.
163. Franchi, M.A. The use of biopreservatives in the control of
bacterial contaminants of sugarcane alcohol fermentation /
M.A. Franchi, G.E. Serra, M. Cristianini // Journal of Food
Science. – 2003. – Vol. 68, № 7. – P. 2310-2315.
228
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
164. Bischoff, K.M. Antimicrobial susceptibility of Lactobacillus
species isolated from commercial ethanol plants /
K.M. Bischoff, K.A. Skinner-Nemec, T.D. Leathers // J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. – 2007. – Vol. 34, № 11. –
P. 739-744.
165. Use of penicillin and monensin to control bacterial contamination of Brazilian alcohol fermentations / C.T. Stroppa
[et all.] // Int. Sugar J. – 2000. – Vol. 102, № 1214. –
P. 78-82.
166. Пат. 2104301 РФ, МКИ C12P7/06. Способ задержки роста бактерий в средах спиртовой ферментации / Мишель
де Миниак (FR). - №94027279/13; заявл. 20.10.92; опубл.
10.02.98.
167. Antimicrobial action of synthetic peptides towards wine
spoilage yeasts / M. Enrique [et all.] // Int. J. Food Microbiol.
– 2007. – Vol. 118, № 3. – P. 318-325.
168. Inhibition of the wine spoilage yeast Dekkera bruxellensis
by bovine lactoferrin-derived peptides / M. Enrique [et all.] //
Int. J. Food Microbiol. – 2008. – Vol. 127, № 3. –
P. 229-234.
169. Chang, I.S. Use of sulfite and hydrogen peroxide to control
bacterial contamination in ethanol fermentation / I.S. Chang,
B.H. Kim, P.K. Shin // Appl. Environ. Microbiol. – 1997. –
Vol. 63, № 1. – P. 1-6.
170. Narendranath, N.V. Urea hydrogen peroxide reduces the
numbers of lactobacilli nourishes yeast, and leaves now residues in the ethanol fermentation / N.V. Narendranath,
K.S. Thomas, W.M. Ingledew // Appl. Environ. Microbiol. –
2000. – Vol. 66, № 10. – P. 4187-4192.
171. Инструкция по технохимическому и микробиологическому контролю спиртового производства / под ред. А.П.
Рухлядевой. – М.: Агропромиздат, 1986. – 400 с.
172. Полыгалина, Г.В. Технохимический контроль спиртового и ликероводочного производств / Г.В. Полыгалина. –
М.: Колос, 1999. – 336 с.
229
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
173. Антимикробная обработка ржаного замеса в технологии
этилового спирта / Т.А. Ямашев [и др.] // Вестник Казанского технологического университета. – 2006. – № 4. –
С. 169-175.
174. Дезинфекция пшеничного замеса на стадии гидротермической обработки / Т.А. Ямашев [и др.] // Производство
спирта и ликероводочных изделий. – 2006. – № 4. –
С. 13-15.
175. Влияние пероксида водорода на микробиологические и
физико-химические показатели полупродуктов спиртового производства / Т.А. Ямашев [и др.] // Производство
спирта и ликероводочных изделий. – 2008. – № 2. –
С. 9-12.
176. Колдин, Э.Н. Оптимизация процесса тепловой обработки
зернового сырья / Э.Н. Колдин, О.А. Калинина, Т.И. Гусева // Производство спирта и ликероводочных изделий. –
2003. – № 4. – С. 35-37.
177. Inhibition of yeast growth by octanoic and decanoic acids
produced during ethanolic fermentation / C.A. Viegas
[et all.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1989. – Vol. 55, № 1. –
P. 21-28.
178. Study of the toxic effect of short and medium-chain monocarboxylic acids on the growth of Saccharomyces cerevisiae
using the CO2-auxo-accelerostat fermentation system /
K. Kasemets [et all.] // Int. J. Food Microbiol. – 2006. –
Vol. 111, № 3. – P. 206-215.
179. Weak acid adaptation: the stress response that confers yeasts
with resistance to organic acid food preservatives / P. Piper
[et all.] // Microbiology – 2001. – Vol. 147, № 10. –
P. 2635-2642.
180. Thomas, K.C. Influence of medium buffering capacity on inhibition of Saccharomyces cerevisiae growth by acetic and
lactic acids / K.C. Thomas, S.H. Hynes, W.M. Ingledew //
Appl. Environ. Microbiol. – 2002. – Vol. 68, № 4. –
P. 1616-1623.
230
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
181. Activity of plasma membrane H+-ATPase and optimal glycolytic flux are required for rapid adaptation and growth of
Saccharomyces cerevisiae in the presence of the weak-acid
preservative sorbic acid / C.D. Holyoak [et all.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1996. – Vol. 62, № 9. – P. 3158-3164.
182. Sikkema, J. Mechanism of membrane toxicity of hydrocarbons / J. Sikkema, J.A.M. de Bont, B. Poolman // Microbiol.
Rev. – 1995. – Vol. 59, № 2. – P. 201-222.
183. Global phenotypic analysis and transcriptional profiling defines the weak acid stress response regulon in Saccharomyces cerevisiae / C. Schüller [et all.] // Molecular Biology of
the Cell – 2004. – Vol. 15, № 2. – P. 706-720.
184. Weak organic acid stress inhibits aromatic acid uptake by
yeast, causing a strong influence of amino acid auxotrophies
on the phenotypes of membrane transporter mutants /
B.E. Bauer [et all.] // Eur. J. Biochem. – 1999. – Vol. 270,
№ 15. – P. 3189-3195.
185. Genomic expression programs in the response of yeast cells to
environmental changes / A.P. Gasch [et all.] // Molecular Biology of the Cell. – 2000. – Vol. 11, № 12. – P. 4241-4257.
186. The Pdr12 ABC transporter is required for the development of
weak organic acid resistance in yeast / P.W. Piper [et all.] //
EMBO J. – 1998. – Vol. 17, № 15. – P. 4257-4265.
187. Loss of Cmk1 Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase in
yeast results in constitutive weak organic acid resistance, associated with a post-transcriptional activation of the Pdr12
ATP-binding cassette transporter / C.D. Holyoak [et all.] //
Molecular Microbiology. – 2000. – Vol. 37, № 3. – P. 595-605.
188. Imai, T. The relationship between viability and intracellular
pH in the yeast Saccharomyces cerevisiae / T. Imai, T. Ohno
// Appl. Environ. Microbiol. – 1995. – Vol. 61, № 10. –
P. 3604-3608.
231
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
189. Hsp30, the integral plasma membrane heat shock protein of
Saccharomyces cerevisiae, is a stress-inducible regulator of
plasma membrane H+-ATPase / P.W. Piper [et all.] // Cell
Stress & Chaperones. – 1997. – Vol. 2, № 1. – P. 12-24.
190. Thomsson, E. The effect of lactic acid on anaerobic carbon
or nitrogen limited chemostat cultures of Saccharomyces
cerevisiae / E. Thomsson, C. Larsson // Appl. Microbiol.
Biotechnol. – 2006. – Vol. 71, № 4. – P. 533-542.
191. War1p, a novel transcription factor controlling weak acid
stress response in yeast / A. Kren [et all.] // Mol. Cell. Biol. –
2003. – Vol. 23, № 5. – P. 1775-1785.
192. The Saccharomyces cerevisiae weak-acid-inducible ABC
transporter Pdr12 transports fluorescein and preservative anion from the cytosol by an energy-dependent mechanism /
C.D. Holyoak [et all.] // J. Bacteriol. – 1999. – Vol. 181,
№ 15. – P. 4644-4652.
193. Plasma membrane H+ and K+ transporters are involved in the
weak-acid preservative response of disparate food spoilage
yeasts / N. Macpherson [et all.] // Microbiology – 2005. –
Vol. 151, № 6. – P. 1995-2003.
194. Pearce, A.K. Genetic manipulation of 6-phosphofructo-1kinase and fructose 2,6-bisphosphate levels affects the extent
to which benzoic acid inhibits the growth of Saccharomyces
cerevisiae / A.K. Pearce, I.R. Booth, A.J.P. Brown // Microbiology – 2001. – Vol. 147, № 2. – P. 403-410.
195. Hazan, R. Benzoic acid, a weak organic acid food preservative, exerts specific effects on intracellular membrane trafficking pathways in Saccharomyces cerevisiae / R. Hazan,
A. Levine, H. Abeliovich // Appl. Environ. Microbiol. –
2004. – Vol. 70, № 8. – P. 4449-4457.
196. Abbott, D.A. Buffering capacity of whole corn mash alters
concentrations of organic acids required to inhibit growth of
Saccharomyces cerevisiae and ethanol production /
D.A. Abbot, W.M. Ingledew // Biotechnology Letters. –
2004. – Vol. 26, № 16. – P. 1313-1316.
232
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
197. Effect of pH and lactic or acetic acid on ethanol productivity
by Saccharomyces cerevisiae in corn mash / T. Graves
[et all.] // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 2006. – Vol. 33,
№ 6. – P. 469-474.
198. Interaction effects of lactic acid and acetic acid at different
temperatures on ethanol production by Saccharomyces cerevisiae in corn mash / T. Graves [et all.] // Appl. Microbiol.
Biotechnol. – 2007. – Vol. 73, № 5. – P. 1190-1196.
199. Casal, M. Effects of ethanol and other alkanols on transport
of acetic acid in Saccharomyces cerevisiae / M. Casal,
H. Cardoso, C. Leao // Appl. Environ. Microbiol. – 1998. –
Vol. 64, № 2. – P. 665-668.
200. Ramos, M.T. Effects of acetic acid on the temperature profile
of ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae /
M.T. Ramos, A. Madeira-Lopes // Biotechnology Letters. –
1990. – Vol. 12, № 3. – P. 229-234.
201. Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain
21B / P. Lavermicocca [et all.] // Appl. Environ. Microbiol. –
2000. – Vol. 66, № 9. – P. 4084-4090.
202. Lavermicocca, P. Antifungal activity of phenyllactic acid
against molds isolated from bakery products / P. Lavermicocca, F. Valerio, A. Visconti // Appl. Environ. Microbiol. –
2003. – Vol. 69, № 1. – P. 634-640.
203. Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1 / A. Corsetti [et all.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 1998. – Vol. 50, № 2. – P. 253-256.
204. Narendranath, N.V. Effects of acetic acid and lactic acid on
the growth of Saccharomyces cerevisiae in a minimal medium / N.V. Narendranath, K.C. Thomas, W.M. Ingledew //
Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. – 2001.
– Vol. 26, № 3. – P. 171-177.
233
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
205. Szwajgier, D. The release of ferulic acid and feruloylated oligosaccharides during wort and beer production / D. Szwajgier, J. Pielecki, Z. Targonski // J. Inst. Brew. – 2005. – Vol.
111, № 4. – P. 372-379.
206. van Beek, S. Decarboxylation of substituted cinnamic acids
by lactic acid bacteria isolated during malt whisky fermentation / S. van Beek, F.G. Priest // Appl. Environ. Microbiol. –
2000. – Vol. 66, № 12. – P. 5322-5328.
207. Larsson, S. Effect of overexpression of Saccharomyces cerevisiae Pad1p on the resistance to phenylacrylic acids and lignocellulose hydrolysates under aerobic and oxygen-limited
conditions / S. Larsson, N.-O. Nilvebrant, L.J. Jönsson //
Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2001. – Vol. 57, № 1-2. –
P. 167-174.
208. Application of Fenton’s reaction to steam explosion prehydrolysates from poplar biomass / J.M. Oliva [et all.] // Appl.
Biochem. Biotechnol. – 2005. – № 121-124. – P. 887-899.
209. Газарян, И.Г. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений / И.Г. Газарян, Д.М. Хушпульян, В.И. Тишков // Успехи биологической химии. –
2006. – Т. 46. – С. 303-322.
210. Tolerance mechanism of the ethanol-tolerant mutant of sake
yeast / Y. Ogawa [et all.] // J. Biosci. Bioeng. – 2000. –
Vol. 90, № 3. – P. 313-320.
211. Селье Г. Стресс без дистресса / Г. Селье – М.: Прогресс,
1979. – 124 с.
212. Феофилова, Е.П. Биохимическая адаптация мицелиальных грибов к стрессовым воздействиям / Е.П. Феофилова
// Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского. Вып. XII: Юбилейный сборник к 70-летию Института / отв. ред. В.Ф. Гальченко. – М.: Наука, 2004. –
С. 397-409.
234
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
213. Николаев, Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды / Ю.А. Николаев // Прикладная биохимия и микробиология. – 2004. –
Т. 40. – № 4. – С. 387-397.
214. Соколовский, В.Ю. Действие стрессоров на дифференциальную экспрессию генов в ходе развития Neurospora
crassa / В.Ю. Соколовский, Т.А. Белозерская // Успехи
биологической химии. – 2000. – Т. 40. – С. 85-152.
215. Плакунов, В.К. Множественный стресс у микроорганизмов – зло или благо? / В.К. Плакунов, О.В. Гейдебрехт,
О.В. Шелемех // Труды Института микробиологии им.
С.Н. Виноградского. Вып. XII: Юбилейный сборник к
70-летию Института / отв. ред. В.Ф. Гальченко. – М.:
Наука, 2004. – С. 361-375.
216. Perez-Torrado, R. Monitoring stress-related genes during the
process of biomass propagation of Saccharomyces cerevisiae
strains used for wine making / R. Perez-Torrado, J.M. BrunoBarcena, E. Matallana // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. –
Vol. 71, № 11. – P. 6831-6837.
217. Dynamics of the yeast transcriptome during wine fermentation reveals a novel fermentation stress response /
V.D. Marks [et all.] // FEMS Yeast Res. – 2008. – Vol. 8,
№ 1. – P. 35-52.
218. Zuzuarregui, A. Expression of stress response genes in wine
strains with different fermentative behavior / A. Zuzuarregui,
M.L. del Olmo // FEMS Yeast Res. – 2004. – Vol. 4, № 7. –
P. 699-710.
219. Transcriptomic and proteomic approach for understanding
the molecular basis of adaptation of Saccharomyces cerevisiae to wine fermentation / A. Zuzuarregui [et all.] // Appl.
Environ. Microbiol. – 2006. – Vol. 72, № 1. – P. 836-847.
220. Transcription profile of brewery yeast under fermentation
conditions / T.C. James [et all.] // Journal of Applied Microbiology. – 2003. – Vol. 94, № 3. – P. 432-448.
235
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
221. Global gene expression analysis of yeast cells during sake
brewing / H. Wu [et all.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2006. –
Vol. 72, № 11. – P. 7353-7358.
222. Yeast responses to stresses associated with industrial brewery handling / B.R. Gibson [et all.] // FEMS Microbiology
Reviews. – 2007. – Vol. 31, № 5. – P. 535-569.
223. Metabolite profiling for analysis of yeast stress response during very high gravity ethanol fermentations / R. Devantier
[et all.] // Biotechnol Bioeng. – 2005. – Vol. 90, № 6. –
P. 703-714.
224. Identification of target genes conferring ethanol stress tolerance to Saccharomyces cerevisiae based on DNA microarray
data analysis / T. Hirasawa [et all.] // J. Biotechnol. – 2007. –
Vol. 131, № 1. – P. 34-44.
225. Response to different environmental stress conditions of industrial and laboratory Saccharomyces cerevisiae strains /
A. Garay-Arroyo [et all.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. –
2004. – Vol. 63, № 6. – P. 734-741.
226. Swan, T.M. Stress tolerance in a yeast sterol auxotroph: role
of ergosterol, heat shock proteins and trehalose / T.M. Swan, K.
Watson // FEMS Microbiol Lett. – 1998. – Vol. 169, № 1. –
P. 191-197.
227. Swan, T.M. Stress tolerance in a yeast lipid mutant: membrane lipids influence tolerance to heat and ethanol independently of heat shock proteins and trehalose / T.M. Swan,
K. Watson // Can J Microbiol. – 1999. – Vol. 45, № 6. –
P. 472-479.
228. Alexandre, H. Relationship between ethanol tolerance, lipid
composition and plasma membrane fluidity in Saccharomyces cerevisiae and Kloeckera apiculata / H. Alexandre,
I. Rousseaux, C. Charpentier // FEMS Microbiol Lett. –
1994. – Vol. 124, № 1. – P. 17-22.
236
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
229. Alexandre, H. Ethanol adaptation mechanisms in Saccharomyces cerevisiae / H. Alexandre, I. Rousseaux, C. Charpentier // Biotechnol Appl Biochem. – 1994. – Vol. 20, Pt 2. –
P. 173-183.
230. Relationship between ethanol tolerance, H+-ATPase activity
and the lipid composition of the plasma membrane in different wine yeast strains / F. Aguilera [et all.] // International
Journal of Food Microbiology. – 2006. – Vol. 110, № 1. –
P. 34-42.
231. Ауторегуляция стрессового ответа микроорганизмов /
Ю.А. Николаев [и др.] // Микробиология. – 2006. – Т. 75.
– № 4. – С. 489-496.
232. Воробьева, Л.И. Стрессоры, стрессы и выживаемость
бактерий (обзор) / Л.И. Воробьева // Прикладная биохимия и микробиология. – 2004. – Т. 40. – № 3. –
С. 261-269.
233. Николаев, Ю.А. Биопленка – «город микробов» или аналог многоклеточного организма? / Ю.А. Николаев, В.К.
Плакунов // Микробиология. – 2007. – Т. 76. – № 2. –
С. 149-163.
234. Beney, L. Influence of the fluidity of the membrane on the
response of microorganisms to environmental stresses / L.
Beney, P. Gervais // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2001. –
Vol. 57, № 1-2. – P. 34-42.
235. Outten, C.E. Cellular factors required for protection from
hyperoxia toxicity in Saccharomyces cerevisiae / C.E. Outten, R.L. Falk, V.C. Culotta // Biochem. J. – 2005. –
Vol. 388, Pt 1. – P. 93-101.
236. Gasch, A.P. The genomics of yeast responses to environmental stress and starvation / A.P. Gasch, M. WernerWashburne // Funct. Integr. Genomics. – 2002. – Vol. 2,
№ 4-5. – P. 181-192.
237
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
237. Mollapour, M. Novel stress responses facilitate Saccharomyces cerevisiae growth in the presence of the monocarboxylate
preservatives / M. Mollapour, A. Shepherd, P.W. Piper //
Yeast. – 2008. – Vol. 25, № 3. – P. 169-177.
238. «Кислородная регуляция» состава дыхательной цепи
дрожжей Debaryomyces hansenii при множественном стрессе / О.В. Шелемех [и др.] // Микробиология. – 2006. – Т. 75.
– № 4. – С. 562-569.
239. Активная защита при окислительном стрессе. Антиоксидант-респонсивный элемент (обзор) / В.В. Ляхович [и др.] //
Биохимия. – 2006. – Т. 71. – Вып. 9. – С. 1183-1197.
240. Steels, E.L. Stress tolerance and membrane lipid unsaturation
in Saccharomyces cerevisiae grown aerobically or anaerobically / E.L. Steels, R.P. Learmonth, K. Watson // Microbiology. – 1994. – Vol. 140, Pt 3. – P. 569-576.
241. Адаптация дрожжей Yarrowia lipolytica к тепловому воздействию / Е.Н. Бирюкова [и др.] // Микробиология. –
2007. – Т. 76. – № 2. – С. 184-190.
242. Acquisition of thermotolerance in Saccharomyces cerevisiae
without heat shock protein hsp 104 and in the absence of protein synthesis / C. De Virgilio [et all.] // FEBS Lett. – 1991. –
Vol. 288, № 1-2. – P. 86-90.
243. Seppä, L. Upregulation of the Hsp104 chaperone at physiological temperature during recovery from thermal insult / L.
Seppä, A.L. Hänninen, M. Makarow // Mol. Microbiol. –
2004. – Vol. 52, № 1. – P. 217-225.
244. Панасенко, О.О. Структура и свойства малых белков теплового шока / О.О. Панасенко, М.В. Ким, Н.Б. Гусев //
Успехи биологической химии. – 2003. – Т. 43. – С. 59-98.
245. Sensitivity to Hsp90-targeting drugs can arise with mutation
to the Hsp90 chaperone, cochaperones and plasma membrane
ATP binding cassette transporters of yeast / P.W. Piper
[et all.] // Eur. J. Biochem. – 2003. – Vol. 270, № 23. –
P. 4689-4695.
238
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
246. Mitochondrial Hsp60, resistance to oxidative stress, and the
labile iron pool are closely connected in Saccharomyces cerevisiae / E. Cabiscol [et all.] // The Journal Of Biological
Chemistry. – 2002. – Vol. 277, № 46. – P. 44531-44538.
247. Курганов, Б.И. Оценка активности молекулярных шаперонов в тест-системах, основанных на подавлении агрегации белков / Б.И. Курганов // Успехи биологической
химии. – 2002. – Т. 42. – С. 89-138.
248. Молекулярные шаперонины прокариотических и эукариотических клеток / В.В. Марченков [и др.] // Успехи
биологической химии. – 2006. – Т. 46. – С. 279-302.
249. Кольман Я. Наглядная биохимия: пер. с нем. / Я. Кольман, К.-Г. Рём. – 2-е изд. – М.: Мир, 2004. – 469 с.
250. The molecular chaperone Ssb from Saccharomyces cerevisiae
is a component of the ribosome-nascent chain complex /
C. Pfund [et all.] // The EMBO Journal. – 1998. – Vol. 17,
№ 14. – P. 3981-3989.
251. Hilt, W. Stress-induced proteolysis in yeast / W. Hilt,
D.H. Wolf // Molecular Microbiology. – 1992. – Vol. 6,
№ 17. – P. 2437-2442.
252. Imazu, H. Saccharomyces cerevisiae heat shock transcription
factor regulates cell wall remodeling in response to heat
shock / H. Imazu, H. Sakurai // Eukaryot. Cell. – 2005. –
Vol. 4, № 6. – P. 1050-1056.
253. Seymour, I.J. Stress induction of HSP30, the plasma membrane heat shock protein gene of Saccharomyces cerevisiae,
appears not to use known stress-regulated transcription factors / I.J. Seymour, P.W. Piper // Microbiology. – 1999. –
Vol. 145, Pt 1. – P. 231-239.
254. Rodrigues-Pousada, C. The yeast stress response role of the
Yap family of b-ZIP transcription factors / C. RodriguesPousada, T. Nevitt, R. Menezes // FEBS Journal. – 2005. –
Vol. 272, № 11. – P. 2639-2647.
255. Sorger, P.K. Heat shock factor and the heat shock response /
P.K. Sorger // Cell. – 1991. – Vol. 65, № 3. – P. 363-366.
239
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
256. Schmitt, A.P. Msn2p, a zinc finger DNA-binding protein, is
the transcriptional activator of the multistress response in
Saccharomyces cerevisiae / A.P. Schmitt, K. McEntee //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1996. – Vol. 93, № 12. –
P. 5777-5782.
257. Oxidative stress is involved in heat-induced cell death in
Saccharomyces cerevisiae / J.F. Davidson [et all.] // Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. – 1996. – Vol. 93, № 10. –
P. 5116-5121.
258. Dennis, P.P. Evolutionary divergence and salinity-mediated
selection in halophilic archaea / P.P. Dennis, L.C. Shimmin //
Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 1997. – Vol. 61, № 1. –
P. 90-104.
259. Деткова, Е.Н. Осмоадаптация галоалкалофильных бактерий: роль осморегуляторов и возможности их практического применения / Е.Н. Деткова, Ю.В. Болтянская //
Микробиология. – 2007. – Т. 76. – № 5. – С. 581-593.
260. Comparative analysis of transcriptional responses to saline
stress in the laboratory and brewing strains of Saccharomyces cerevisiae with DNA microarray / T. Hirasawa [et all.] //
Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2006. – Vol. 70, № 3. –
P. 346-357.
261. Hohmann, S. Osmotic stress signaling and osmoadaptation in
yeasts / S. Hohmann // Microbiol. Mol. Biol. Rev. – 2002. –
Vol. 66, № 2. – P. 300-372.
262. Conditional osmotic stress in yeast / S. Karlgren [et all.] //
The Journal Of Biological Chemistry. – 2005. – Vol. 280,
№ 8. – P. 7186-7193.
263. Analysis of the expression of some stress induced genes in
several commercial wine yeast strains at the beginning of vinification / A. Zuzuarregui [et all.] // Journal of Applied Microbiology. – 2005. – Vol. 98, № 2. – P. 299-307.
240
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
264. Pigeau, G.M. Upregulation of ALD3 and GPD1 in Saccharomyces cerevisiae during Icewine fermentation /
G.M. Pigeau, D.L. Inglis // Journal of Applied Microbiology.
– 2005. – Vol. 99, № 1. – P. 112-125.
265. Toone, W.M. Stress-activated signalling pathways in yeast /
W.M. Toone, N. Jones // Genes to Cells. – 1998. – Vol. 3,
№ 8. – P. 485-498.
266. The molecular defences against reactive oxygen species in
yeast / P. Moradas-Ferreira [et all.] // Mol. Microbiol. –
1996. – Vol. 19, № 4. – P. 651-658.
267. Cellular responses to oxidative and osmotic stress /
W.H. Mager [et all.] // Cell stress & chaperones. – 2000. –
Vol. 5, № 2. – P. 73-75.
268. Брюханов, А.Л. Аэротолерантность строго анаэробных
микроорганизмов: факторы защиты от окислительного
стресса (обзор) / А.Л. Брюханов, А.И. Нетрусов // Прикладная биохимия и микробиология. – 2007. – Т. 43. –
№ 6. – С. 635-652.
269. Сравнительное исследование компонентов антиоксидантной защиты в процессе роста мицелия дикого типа
Neurospora crassa и мутантов white collar-1 и white collar-2 / Н.Н. Гесслер [и др.] // Прикладная биохимия и
микробиология. – 2006. – Т. 42. – № 3. – С. 332-337.
270. Белозерская, Т.А. Активные формы кислорода и стратегия антиоксидантной защиты у грибов (обзор) / Т.А. Белозерская, Н.Н. Гесслер // Прикладная биохимия и микробиология. – 2007. – Т. 43. – № 5. – С. 565-575.
271. Izawa, S. Importance of catalase in the adaptive response to
hydrogen peroxide: analysis of acatalasaemic Saccharomyces
cerevisiae / S. Izawa, Y. Inoue, A. Kimura // Biochem. J. –
1996. – Vol. 320, Pt 1. – P. 61-67.
241
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
272. Oxidative stress response in eukaryotes: effect of glutathione,
superoxide dismutase and catalase on adaptation to peroxide
and menadione stresses in Saccharomyces cerevisiae /
P.N. Fernandes [et all.] // Redox Rep. – 2007. – Vol. 12,
№ 5. – P. 236-244.
273. Importance of glucose-6-phosphate dehydrogenase in the
adaptive response to hydrogen peroxide in Saccharomyces
cerevisiae / S. Izawa [et all.] // Biochem. J. – 1998. –
Vol. 330, Pt 2. – P. 811-817.
274. Missall, T.A. Mechanisms of resistance to oxidative and nitrosative stress: implications for fungal survival in mammalian hosts / T.A. Missall, J.K. Lodge, J.E. McEwen // Eukaryot. Cell. – 2004. – Vol. 3, № 4. – P. 835-846.
275. Cells have distinct mechanisms to maintain protection
against different reactive oxygen species: Oxidative-stressresponse genes / G.W. Thorpe [et all.] // Proc. Natl. Acad.
Sci. US. – 2004. – Vol. 101, № 17. – P. 6564-6569.
276. Oxidative DNA damage causes mitochondrial genomic instability in Saccharomyces cerevisiae / N.A. Doudican
[et all.] // Mol. Cell. Biol. – 2005. – Vol. 25, № 12. –
P. 5196-5204.
277. Luk, E.E. Manganese superoxide dismutase in Saccharomyces cerevisiae acquires its metal co-factor through a pathway
involving the Nramp metal transporter, Smf2p / E.E. Luk,
V.C. Culotta // J. Biol. Chem. – 2001. – Vol. 276, № 50. –
P. 47556-47562.
278. Manganese activation of superoxide dismutase 2 in the mitochondria of Saccharomyces cerevisiae / E. Luk [et all.] //
J. Biol. Chem. – 2005. – Vol. 280, № 24. – P. 22715-22720.
279. Метелица, Д.И. Инициирование и ингибирование свободнорадикальных процессов в биохимических пероксидазных системах (обзор) / Д.И. Метелица, Е.И. Карасева
// Прикладная биохимия и микробиология. – 2007. –
Т. 43. – № 5. – С. 537-564.
242
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
280. Grant, C.M. Role of the glutathione/glutaredoxin and thioredoxin systems in yeast growth and response to stress conditions / C.M. Grant // Molecular Microbiology. – 2001. –
Vol. 39, № 3. – P. 533-541.
281. Acid stress adaptation protects Saccharomyces cerevisiae
from acetic acid-induced programmed cell death / S. Giannattasio [et all.] // Gene. – 2005. – Vol. 354. – P. 93-98.
282. Hydrogen peroxide and superoxide anion production during
acetic acid-induced yeast programmed cell death /
N. Guaragnella [et all.] // Folia Microbiol. – 2007. – Vol. 52,
№ 3. – P. 237-240.
283. Gamonet, F. The Saccharomyces cerevisiae LYS7 gene is
involved in oxidative stress protection / F. Gamonet,
G.J.-M. Lauquin // Eur. J. Biochem. – 1998. – Vol. 251, № 3. –
P. 716-723.
284. Saccharomyces cerevisiae cultured under aerobic and anaerobic conditions: air-level oxygen stress and protection
against stress / S. Ohmori [et all.] // Biochim. Biophys. Acta. –
1999. – Vol. 1472, № 3. – P. 587-594.
285. Trehalose protects Saccharomyces cerevisiae from lipid peroxidation during oxidative stress / R.S. Herdeiro [et all.] //
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – General Subjects. –
2006. – Vol. 1760, № 3. – P. 340-346.
286. Роль тиоловых редокс-систем в отклике бактерий Escherichia coli на пероксидный стресс / О.Н. Октябрьский
[и др.] // Микробиология. – 2007. – Т. 76. – № 6. –
С. 759-765.
287. Калинина, Е.В. Участие тио-, перокси- и глутаредоксинов в клеточных редокс-зависимых процессах / Е.В. Калинина, Н.Н. Чернов, А.Н. Саприн // Успехи биологической химии. – 2008. – Т. 48. – С. 319-358.
288. Garrido, E.O. Role of thioredoxins in the response of Saccharomyces cerevisiae to oxidative stress induced by hydroperoxides / E.O. Garrido, C.M. Grant // Molecular Microbiology. – 2002. – Vol. 43, № 4. – P. 993-1003.
243
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
289. Grant, C.M. Glutathione and catalase provide overlapping
defenses for protection against hydrogen peroxide in the
yeast Saccharomyces cerevisiae / C.M. Grant, G. Perrone,
I.W. Dawes // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 1998. –
Vol. 253, № 3. – P. 893-898.
290. Izawa, S. Oxidative stress response in yeast: effect of glutathione on adaptation to hydrogen peroxide stress in Saccharomyces cerevisiae / S. Izawa, Y. Inoue, A. Kimura //
FEBS Lett. – 1995. – Vol. 368, № 1. – P. 73-76.
291. Klatt, P. Regulation of protein function by S-glutathiolation
in response to oxidative and nitrosative stress / P. Klatt,
S. Lamas // Eur. J. Biochem. – 2000. – Vol. 267, № 16. –
P. 4928-4944.
292. Trotter, E.W. Thioredoxins are required for protection
against a reductive stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae / E.W. Trotter, C.M. Grant // Molecular Microbiology. –
2002. – Vol. 46, № 3. – P. 869-878.
293. The essential protein Fap7 is involved in the oxidative stress
response of Saccharomyces cerevisiae / H. Juhnke [et all.] //
Molecular Microbiology. – 2000. – Vol. 35, № 4. –
P. 936-948.
294. Fedoroff, N. Redox regulatory mechanisms in cellular stress
responses / N. Fedoroff // Annals of Botany. – 2006. –
Vol. 98, № 2. – P. 289-300.
295. Crm1 (XpoI) dependent nuclear export of the budding yeast
transcription factor yAP-1 is sensitive to oxidative stress /
S. Kuge [et all.] // Genes to Cells. – 1998. – Vol. 3, № 8. –
P. 521-532.
296. Oxidative stress-activated zinc cluster protein Stb5 has dual
activator/repressor functions required for pentose phosphate
pathway regulation and NADPH production / M. Larochelle
[et all.] // Mol. Cell. Biol. – 2006. – Vol. 26, № 17. –
P. 6690-6701.
244
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
297. Grant, C.M. Metabolic reconfiguration is a regulated response to oxidative stress / C.M. Grant // J. Biol. – 2008. –
Vol. 7, № 1. – P. 1.
298. Rck1 and Rck2 MAPKAP kinases and the HOG pathway are
required for oxidative stress resistance / E. Bilsland [et all.] //
Molecular Microbiology. – 2004. – Vol. 53, № 6. –
P. 1743-1756.
299. Крутецкая, З.И. Механизмы внутриклеточной сигнализации: монография / З.И. Крутецкая, О.Е. Лебедев,
Л.С. Курилова. – СПб.: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2003. –
208 с.
300. Weak acid and alkali stress regulate phosphatidylinositol
bisphosphate synthesis in Saccharomyces cerevisiae /
M. Mollapour [et all.] // Biochem. J. – 2006. – Vol. 395, Pt 1. –
P. 73-80.
301. Dunand-Sauthier, I. Stress-activated protein kinase pathway
functions to support protein synthesis and translational adaptation in response to environmental stress in fission yeast /
I. Dunand-Sauthier // Eukaryot. Cell. – 2005. – Vol. 4, № 11. –
P. 1785-1793.
302. Zähringer, H. Induction of neutral trehalase Nth1 by heat and
osmotic stress is controlled by STRE elements and
Msn2/Msn4 transcription factors: variations of PKA effect
during stress and growth / H. Zähringer, J.M. Thevelein,
S. Nwaka // Mol. Microbiol. – 2000. – Vol. 35, № 2. –
P. 397-406.
303. Davies, J.M. Transient adaptation to oxidative stress in yeast
/ J.M. Davies, C.V. Lowry, K.J. Davies // Arch. Biochem.
Biophys. – 1995. – Vol. 317, № 1. – P. 1-6.
304. Global Transcriptional Responses of Fission Yeast to Environmental Stress / D. Chen [et all.] // Molecular Biology of
the Cell. – 2003. – Vol. 14, № 1. – P. 214-229.
245
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
305. Guadalupe Cabral, M. Mechanisms underlying the acquisition of resistance to octanoic-acid-induced-death following
exposure of Saccharomyces cerevisiae to mild stress imposed by octanoic acid or ethanol / M. Guadalupe Cabral,
C.A. Viegas, I. Sá-Correia // Archives of Microbiology. –
2001. – Vol. 175, № 4. – P. 301-307.
306. Induction of major heat-shock proteins of Saccharomyces
cerevisiae, including plasma membrane Hsp30, by ethanol
levels above a critical threshold / P.W. Piper [et all.] // Microbiology. – 1994. – Vol. 140, Pt 11. – P. 3031-3038.
307. Palhano, F.L. Induction of baroresistance by hydrogen peroxide, ethanol and cold-shock in Saccharomyces cerevisiae /
F.L. Palhano, M.T. Orlando, P.M. Fernandes // FEMS Microbiol Lett. – 2004. – Vol. 233, № 1. – P. 139-145.
308. The carrier Msn5p/Kap142p promotes nuclear export of the
hsp70 Ssa4p and relocates in response to stress / X.X. Quan
[et all.] // Molecular Microbiology. – 2006. – Vol. 62, № 2. –
P. 592-609.
309. Sukesh, C.S. A possible role of trehalose in osmotolerance
and ethanol tolerance in Saccharomyces cerevisiae /
C.S. Sukesh // FEMS Microbiology Letters. – 1997. –
Vol. 52, № 1. – P. 11-15.
310. Effect of stress on the life span of the yeast Saccharomyces
cerevisiae / A. Swiecilo [et all.] // Acta Biochimica Polonica.
– 2000. – Vol. 47, № 2. – P. 355-364.
311. Elevated expression of genes under the control of stress response element (STRE) and Msn2p in an ethanol-tolerance
sake yeast Kyokai No. 11 / M. Watanabe [et all.] // J. Biosci.
Bioeng. – 2007. – Vol. 104, № 3. – P. 163-170.
312. The Saccharomyces cerevisiae HSP12 gene is activated by
the high-osmolarity glycerol pathway and negatively regulated by protein kinase A / J.C.S. Varela [et all.] // Mol. Cell.
Biol. – 1995. – Vol. 15, № 11. – P. 6232-6245.
246
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
313. A knockout strain of CPR1 induced during fermentation of
Saccharomyces cerevisiae KNU5377 is susceptible to various types of stress / I.-S. Kim [et all.] // J. Biosci. Bioeng. –
2006. – Vol. 102, № 4. – P. 288-296.
314. Elliott, N.A. Stress induction and mitochondrial localization
of Oxr1 proteins in yeast and humans / N.A. Elliott,
M.R. Volkert // Mol. Cell. Biol. – 2004. – Vol. 24, № 8. –
P. 3180-3187.
315. The Saccharomyces cerevisiae Sko1p transcription factor
mediates HOG pathway-dependent osmotic regulation of a
set of genes encoding enzymes implicated in protection from
oxidative damage / M. Rep [et all.] // Molecular Microbiology. – 2001. – Vol. 40, № 5. – P. 1067-1083.
316. Singh, K.K. The Saccharomyces cerevisiae Sln1p-Ssk1p
two-component system mediates response to oxidative stress
and in an oxidant-specific fashion / K.K. Singh // Free Radic.
Biol. Med. – 2000. – Vol. 29, № 10. – P. 1043-1050.
317. Haghnazari, E. The Hog1 MAP kinase pathway and the
Mec1 DNA damage checkpoint pathway independently control the cellular responses to hydrogen peroxide / E. Haghnazari, W.D. Heyer // DNA Repair. – 2004. – Vol. 3, № 7. –
P. 769-776.
318. A baker's yeast mutant (fil1) with a specific, partially inactivating mutation in adenylate cyclase maintains a high stress
resistance during active fermentation and growth /
P. van Dijck [et all.] // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. – 2000. –
Vol. 2, № 4. – P. 521-530.
319. Versele, M. The high general stress resistance of the Saccharomyces cerevisiae fil1 adenylate cyclase mutant
(Cyr1Lys1682) is only partially dependent on trehalose,
Hsp104 and overexpression of Msn2/4-regulated genes /
M. Versele, J.M. Thevelein, P. van Dijck // Yeast. – 2004. –
Vol. 21, № 1. – P. 75-86.
247
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
320. Олескин, А.В. Популяционно-коммуникативное направление в микробиологии / А.В. Олескин, Т.А. Кировская //
Микробиология. – 2006. – Т. 75. – № 4. – С. 440-445.
321. Адаптогенные функции внеклеточных ауторегуляторов
микроорганизмов / Г.И. Эль-Регистан [и др.] // Микробиология. – 2006. – Т. 75. – № 4. – С. 446-456.
322. Вахитов, Т.Я. Регуляторные функции экзометаболитов
бактерий / Т.Я. Вахитов, Л.Н. Петров // Микробиология. –
2006. – Т. 75. – № 4. – С. 483-488.
323. Хмель, И.А. Quorum-sensing регуляция экспрессии генов:
фундаментальные и прикладные аспекты, роль в коммуникации бактерий / И.А. Хмель // Микробиология. –
2006. – Т. 75. – № 4. – С. 457-464.
324. Quorum-sensing регуляция у почвенных псевдомонад /
М.А. Веселова [и др.] // Микробиология. – 2006. – Т. 75.
– № 4. – С. 465-467.
325. Westwater, C. Candida albicans-conditioned medium protects yeast cells from oxidative stress: a possible link between quorum sensing and oxidative stress resistance /
C. Westwater, E. Balish, D.A. Schofield // Eukaryot. Cell. –
2005. – Vol. 4, № 10. – P. 1654-1661.
326. Воробьева, Л.И. Антимутагенное действие бактерий против мутагенеза, индуцируемого 4-нитрохинолин-1оксидом у Salmonella typhimurium / Л.И. Воробьева, Т.А.
Чердынцев, С.К. Абилев // Микробиология. – 1995. –
Т. 64. – № 2. – С. 228-233.
327. Разработка способов защиты пивоваренных дрожжей от
осмотического стресса / И.А. Конаныхина [и др.] / Хранение и переработка сельхозсырья. – 2007. – № 3. –
С. 40-41.
328. Стабилизация дрожжей Saccharomyces cerevisiae /
И.А. Конаныхина [и др.] / Хранение и переработка сельхозсырья. – 2007. – № 8. – С. 44-45.
248
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
329. Воробьева, Л.И. Перекрестное действие внеклеточных
факторов адаптации к стрессу у Luteococcus casei и Saccharomyces cerevisiae / Л.И. Воробьева, Е.Ю. Ходжаев,
Г.М. Пономарева // Прикладная биохимия и микробиология. – 2005. – Т. 41. – № 2. – С. 171-175.
330. Коновалов, С.А. Биохимия дрожжей / С.А. Коновалов. –
2-е изд. перераб. и доп. – М.: Пищевая промышленность,
1980. – 271 с.
331. Влияние добавления подсолнечного масла на содержание монокарбонильных ароматических соединений в летучих компонентах пшеничного хлеба / Н.Г. Еникеева и
[др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 1976. –
Т. XIV, Вып. 3. – С. 420-428.
332. Влияние металла на образование ацеталей и кротонового
альдегида в условиях эпюрации / А.Н. Маринич [и др.]. –
М.: ЦНИИТЭИПищепром, 1977. – С. 4-6.
333. Грачева, И.М. Биосинтез высших спиртов дрожжами /
И.М. Грачева // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер.
Микробиология. – 1972. – Т. 1. – С. 97-170.
334. Грачева, И.М. Биохимия образования дрожжами высших
спиртов при брожении / И.М. Грачева // Прикладная
биохимия и микробиология. – 1983. – Т. XIX, Вып. 1. –
С. 33-48.
335. Родопуло, А.К. Биосинтез и метаболизм ацетоина и диацетила (Обзор) / А.К. Родопуло, А.В. Кавадзе, А.Ф. Писарницкий // Прикладная биохимия и микробиология. –
1976. – Т. XII, Вып. 3. – С. 309-317.
336. Calderbank, J. Influence of higher alcohol availability on ester formation by yeast / J. Calderbank, J.R.M. Hammond //
J. Am. Soc. Brew. Chem. – 1994. - Vol. 52, № 2. – P. 84-90.
337. Lilly, M. Effect of increased yeast alcohol acetyltransferase
activity on flavor profiles of wine and distillates / M. Lilly,
M.G. Lambrechts, I.S. Pretorius // Appl. Environ. Microbiol.
– 2000. – Vol. 66, № 2. – P. 744-753.
249
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
338. Bardi, L. Esterase activity and release of ethyl esters of medium-chain fatty acids by Saccharomyces cerevisiae during
anaerobic growth / L. Bardi, C. Crivelli, M. Marzona // Can.
J. Microbiol. – 1998. – Vol. 44, № 12. – P. 1171-1176.
339. Effect of aeration and unsaturated fatty acids on expression
of the Saccharomyces cerevisiae alcohol acetyltransferase
gene / T. Fujii [et all.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1997. –
Vol. 63, № 3. – P. 910-915.
340. Spiropoulos, A. MET17 and hydrogen sulfide formation in
Sacharomyces cerevisiae / A. Spiropoulos, L.F. Bisson //
Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – Vol. 66, № 10. –
P. 4421-4426.
341. Genetic determinants of volatile-thiol release by Sacharomyces cerevisiae during wine fermentation / K.S. Howell
[et all.] // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. – Vol. 71, № 9. –
P. 5420-5426.
342. Головня, Р.В. Изменение состава летучих аминов при
культивировании бактерий Streptococcus lactis и Streptococcus acetoinicus / Р.В. Головня, И.Л. Журавлева,
М.Б.
Теренина
//
Прикладная
биохимия
и
микробиология. – 1986. – Т. XXII, Вып. 2. – С. 217-225.
343. Species-specific bacteria identification using differential mobility spectrometry and bioinformatics pattern recognition /
M. Shnayderman [et all.] // Anal. Chem. – 2005. – Vol. 77,
№ 18. – P. 5930-5937.
344. Mayhew, J.W. Rapid gas chromatographic technique for presumptive detection of Clostridium botulinum in contaminated
food / J.W. Mayhew, S.L. Gorbach // Appl. Environ. Microbiol. – 1975. – Vol. 29, № 2. – P. 297-299.
345. Larsson, L. Detection of alcohols and volatile fatty acids by
head-space gas chromatography in identification of anaerobic
bacteria / L. Larsson, P.-A. Mardh, G. Odham // J. Clin. Microbiol. – 1978. – Vol. 7, № 1. – P. 23-27.
250
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
346. Separation of botulinum-positive and –negative fish samples
by means of a pattern recognition method applied to headspace gas chromatograms / B.G. Snygg [et all.] // Appl. Environ. Microbiol. – 1979. – V. 38, № 6. – P.1081-1085.
347. Готшалк, Г. Метаболизм бактерий / Г. Готшалк. – М.:
Мир, 1982. – 310 с.
348. Образование диацетила и ацетоина производственными
штаммами лактококков в различных условиях выращивания / В.М. Серебренников [и др.] // Прикладная биохимия и микробиология. – 1998. – Т. 34. – № 3. –
С. 276-280.
349. О способности диацетилобразующих молочнокислых
бактерий из рода Lactococcus выделять в среду
α-ацетомолочную кислоту / В.М. Серебренников [и др.] //
Прикладная биохимия и микробиология. – 1999. – Т. 35. –
№ 6. – С. 685-694.
350. Volatile compounds produced by Lactobacillus fermentum,
Saccharomyces cerevisiae and Candida krusei in single
starter culture fermentations of Ghanaian maize dough / N.T.
Annan [et all.] // Journal of Applied Microbyology. – 2003. –
Vol. 94, № 3 – P. 462-474.
351. Морина, Г.В. Газохроматографическое изучение летучих
аминов в метаболитах молочнокислых микроорганизмов
/ Г.В. Морина, М.С. Уманский // Прикладная биохимия и
микробиология. – 1987. – Т. XXIII. – Вып. 2. – С. 275-280.
352. Seefeldt, K.E. Diversity of sulfur compound production in
lactic acid bacteria / K.E. Seefeldt, B.C. Weimer // J. Dairy
Sci. – 2000. – Vol. 83, № 12. – P. 2740-2746.
353. Ability of thermophilic lactic acid bacteria to produce aroma
compounds from amino acids / S. Helinck [et all.] // Appl.
Environ. Microbiol. – 2004. – Vol. 70, № 7. – P. 3855-3861.
354. Flavour formation from amino acids by lactic acid bacteria:
predictions from genome sequence analysis / R. van Kranenburg [et all.] // International Dairy Journal. – 2002. – Vol. 12,
№ 2. – P. 111-121.
251
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
355. Liu, S.-Q. A review: malolactic fermentation in wine – beyond deacidification / S.-Q. Liu // Journal of Applied Microbiology. – 2002. – Vol. 92, № 4 – P. 589-601.
356. Gonzalez de Llano, D. Biogenic amine production by wild
lactococcal and leuconostoc strains / D. Gonzalez de Llano,
P. Cuesta, A. Rodriguez // Letters in Applied Microbiology. –
1998. – Vol. 26, № 4. – P. 270-274.
357. Isolation, properties and behaviour of tyramine-producing
lactic acid bacteria from wine / V. Moreno-Arribas [et all.] //
Journal of Applied Microbiology. – 2000. – Vol. 88, № 4 –
P. 584-593.
358. Ability of wine lactic-acid bacteria to metabolize phenol carboxylic-acids / J.F. Cavin [et all.] // American Journal of
Enology and Viticulture. – 1993. – Vol. 44, № 1 – P. 76-80.
359. Ability of lactic acid bacteria to produce volatile phenols /
J.A. Couto [et all.] // American Journal of Enology and Viticulture. – 2006. – Vol. 57, № 2 – P. 166-171.
360. Inducible metabolism of phenolic acids in Pediococcus pentosaceus is encoded by an autoregulated operon which involves a new class of negative transcriptional regulator /
L. Barthelmebs [et all.] // Journal of Bacteriology. – 2000. –
Vol. 182, № 23 – P. 6724-6731.
361. Писарницкий, А.Ф. Формирование аромата вина: оттенки и пороки, определяемые минорными компонентами
(Обзор) / А.Ф. Писарницкий // Прикладная биохимия и
микробиология. – 2001. – Т. 37. – № 6. – С. 651-659.
362. Metabolism of ferulic acid to vanillin / M.J. Gasson [et all.] //
The Journal of Biological Chemistry. – 1998. – Vol. 273,
№ 7 – P. 4163-4170.
363. Barthelmebs, L. Knockout of the p-coumarate decarboxylase
gene from Lactobacillus plantarum reveals the existence of
two other inducible enzymatic activities involved in phenolic
acid metabolism / L. Barthelmebs, C. Divies, J.-F. Cavin //
Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – Vol. 66, № 8. –
P. 3368-3375.
252
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
364. Гювенилир, В.А. Использование Clostridium acetobutilicum Р262 для получения продуктов ацетон-бутанолового
брожения в процессе периодической ферментации / В.А.
Гювенилир, Н. Девеци // Прикладная биохимия и микробиология. – 1996. – Т. 32. – № 6. – С.643-645.
365. Clostridium gasigenes sp. nov., a psychrophile causing spoilage of vacuum-packed meat / D.M. Broda [et all.] // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.
– 2000. – Vol. 50, № 1. – P. 107-118.
366. Серебренников,
В.М.
Особенности
биосинтеза
2,3-бутандиола и других конечных продуктов брожения
в культурах Bacillus polymyxa / В.М. Серебренников,
О.Н. Новосельцева, А.М. Безбородов // Прикладная биохимия и микробиология. – 1993. – Т. 29. – Вып. 6. –
С. 877-887.
367. Серебренников, В.М. Влияние температуры на биосинтез
2,3-бутандиола и ацетоина в разных условиях периодического культивирования Bacillus polymyxa ССМ 1465 //
Прикладная биохимия и микробиология. – 1995. – Т. 31. –
№ 6. – С.630-636.
368. Cavin, J.-F. Gene cloning, transcriptional analysis, purification, and characterization of phenolic acid decarboxylase
from Bacillus subtilis / J.-F. Cavin, V. Dartois, C. Divies //
Appl. Environ. Microbiol. – 1998. – Vol. 64, № 4. –
P. 1466-1471.
369. Peng, X. Isolation and characterization of thermophilic bacilli degrading cinnamic, 4-coumaric, and ferulic acids /
X. Peng, N. Misawa, S. Harayama // Appl. Environ. Microbiol. – 2003. – Vol. 69, № 3. – P. 1417-1427.
370. Aroma compound production in chesse curd by coculturing
with selected yeast and bacteria / N. Martin [et all.] //
J. Dairy Sci. – 2001. – Vol. 84, № 10. – P. 2125-2135.
253
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
371. Leclercq-Perlat, M.-N. Comparison of volatile compounds in
model cheese medium deacidified by Debaryomyces hansenii or Kluyveromyces marxianus / M.-N. Leclercq-Perlat,
G. Corrieu, H.-E. Spinnler // J. Dairy Sci. – 2004. – Vol. 87,
№ 5. – P. 1545-1550.
372. Chatonnet, P. The influence of Brettanomyces/Dekkera sp.
yeasts and lactic acid bacteria on the ethylphenol content of
red wines / P. Chatonnet, D. Dubourdieu, J.N. Boidron //
Am. J. Enol. Vitic. – 1995. – Vol. 46, № 4. – P. 463-468.
373. Huang, Z. Microbial transformations of ferulic acids by Saccharomyces cerevisiae and Pseudomonas fluorescens /
Z. Huang, L. Dostal, J.P.N. Rosazza // Appl. Environ. Microbiol. – 1993. – Vol. 59, № 7. – P. 2244-2250.
374. Родопуло, А.К. Влияние различных видов дрожжей на
образование ароматобразующих веществ / А.К. Родопуло, И.А. Егоров // Прикладная биохимия и микробиология. – 1987. – Т. XXIII, Вып. 6. – С. 833-836.
375. Jiang, J. Identification of flavour volatile compounds produced by Kluyveromyces lactis / J. Jiang // Biotechnology
Techniques. – 1993. – Vol. 7, № 12. – P. 863-866.
376. Моисеенко, В.С. Образование высших спиртов в ходе
метаболизма дрожжей Saccharomyces cerevisiae /
В.С. Моисеенко, А.Б. Дячкина, О.В. Грачева // Производство спирта и ликероводочных изделий. – 2004. –
№ 1. – С. 11-13.
254
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
311
Размер файла
4 264 Кб
Теги
контаминация, производства, полупродуктов, сырье, бродильных, микробная, 9322
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа