close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

427

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
fc-i09?J
ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
:
ИНСТИТУТ 'ЖИВОТНОВОДСТВА
.
•
\
:
'
•
•
-
;
,
-
•
"
. ,
ч
ч
. -
на правах рукописи
Зиновьева Наталия Анатольевна
.•
;
ПОЛУЧЕНИЕ
у
" ••'-•
У
-
. .И МОЛЁКУЛЯРНО-ПЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
'.;":';; : .
.ТРАНСГЕННЫХ КРОЛИКОВ
! С ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИМИ ДЛЯ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
^ Е Н Н Ь Ш И ; КОНСТРУКЦИЯМИ1
ч
. -;-'У.У
03.00.13 .-— ФИЗИОЛОГИЯ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ
А В Т О Р Е - Ф . Е Р А Т••;"•
; ' . ^ : ДИССЕРТАЦИИ..'. •..("" ;. %
. Н А СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ
; КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК
У
ДуОроикцы
:. 19S4 .
s
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
•':' •:' fi:p'QAuiicf\
Работа выполнена в лаборатории клеточной инженерии отдела ••
трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных
животных
Все­
российского научно-исследовательского .института животноводства.
Научные руководители: ' ....;• * \ Y V ; V •
-';-*Ч • ::
' иностранный член РАСХН профессор Г. Брем ''
академик:PACJCH Л..К.Эрнст. : v --.- , ,' •'
', \^-;
Официальные опоненты: .--'...
.... - - , - , . •
- : ' доктор биологических наук профессор ;Е Д,Клинский
\
-С- , \ • ; \ кандидат .: биологических.'..• наук. : С. Т. Джапаридзе '•'-.'/..
'*. 'Ведущая организация:
• . •;
» ; • ' , / . ,. '
/ . Московская ветеринарная академия им. К. И. Скрябина .
.'•' -Защита диссертации состоится "IQl;' ы » л п < У
199Нгода,
в ^ Q часов на заседании специализированного .Совета Д. 020.16. 02 '•
по защите диссертаций на.соискание ученой степени кандидата био- .логических наук при Всероссийском научно-исследовательском инстлтуте животноводства. ч•' .*• ' • '.'v',-••••.-•-' • .'/•
•>"•'."':
•
"
•
/
.
'
-
.
.
•
'
'
•
•
'
'
"
'
.
•
•
•
•
•
'
Адрес института:
' • ' • •
' • ' •
•
142012
"
.
'
•
•
.
'
.
'
•
'
'
•• , •".. .Подольский
.•'.' ' ; ^ . . •'
-
*
'
•
'
'
•
'
.
-
'
.
,
.
•
:
,
'
'
, Московская область •;
'район''-:-' ;.-•; ../•_••"•' '
п.- Дубровицы. * ВИЖ ;•,•.-'.'•;•"'-'.;'• .- '• ; ;
:'-"'•;
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЖа. .." '
•..''• Автореферат разослан " 3 _ " * y £ Q y K N >
.
\
:
'
•
•
'
•
• - • "
'
'
-
.
.
•
'
-
•
•
•
•
'
•
•
"
'
•
19эЦгода. "-,'..: .;
•
•
.
.
"
;
•
•
'
)
.
•
"
'
•
'
• Ученый'секретарь
'
••-..-.•„ - ... ;. .
:-\
cneuisawaiipoBeH^ct'b-.p*^'"^ ''"•' - -'-.'• ;. ..;.'.'..•,
-'••••• '3;>>^^:\^'^:-^-JJ^'Zy
'--*•.•.':../"• ''\
'•..'•• ;\ .''-•-. И. И. Ш.'ЫГИН -'
1
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
• . «-1.1 Актуальность темы,
. '
Традиционным методом'получения протеинов для фармацевтичес­
кого (например, альбумин, факторы свертывания крови), а ТЕ 1 : же
технического использований (химозин) является экстракция из тка­
невых жидкостей и органов человека и животных. Однако, при таком
способе получения кроме недостаточного выхода протеинов существует вероятность контаминации вирусами и другими организмами, а
так же.риск иммунологических реакций. Возможность'получения рекомбинантных протеинов'с помощью генноинженерных методов предс­
тавляет собой источник для экономически оправданного производс­
тва целого ряда протеинов. Но и этот метод имеет недостатки,
такие как небольшой выход функциональных протеинов (вследствие
их неправильной складчатости или отсутствия гликозили тания и
других-посттрансляционных модификаций), а так же трудоемкая и
дорогостоящая процедура очистки.
Альтернативой этим методам может служить использование мо­
лочной железы животных в качестве продуцирующей системы гетерогеньых протеинов, так называемые "генные фермы" ("Gene
farming").
.
'
'
'•'"••
1.2 Цель и вадачи исследования
Целью данной работы было получение трансгенгых жигoiних с
тканеспецифическими для молочной железы гекными конструкциями и
их анализ.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие
задачи:
1. Получить трансгенных кроликов методом ыикрошпекции с
1
ЦЕНТРАЛЬНАЯ
НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА
Ш с к . сельскохоз ачадэмии
^.К.А-Ги^ряз-:
Инв. №
/XZ^UJ-*
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
использованием техники лапароскопии для пересадки зигот. "-.'•..'
2. Отработать методику анализа животных на трансгенность
посредством полимеравной цепной реакции.' .;•
3. Провести анализ экспрессии интегрировавшихся
генных
конструкций химозина на уровне мРНК (RT-PCR) и на уровне протеи- .'
_
на (Western-блот анализ).
•. • ..
. 4. Подтвердить биологическую функциональность синтезируеще- .
гося в молочной железе протеина химовина.
1.3 Научная новизна работы. '. • ' •
•'.
В работе показаны • воёмошости использования техники лапа­
роскопии для пересадки эмбрионов у. кроликов, что значительно ус­
коряет и упрощаетпроцедуру пересадки эигот, применение метода
• полимеразной цепной реакции для анали&а интеграции генных конс­
трукций с использованием капиллярного термоциклера, что позволя- ' .
ет иметь результаты исследований в течение суток.с момента•! взя- .:•
тия проб тканей. Данной работой демонстрируется, • что молочная_
железа сельскохозяйственных животных;; в частности кроликов,.мо-- .
жет служить источником получения биологически-функциональных
протеинов в количествах от нескольких миллиграмм.до более-одного
грамма в литре молока.
• ">/..-." л • .:-:г/ "''.'•
1. 4 Практическая значимость ' ' ' ? -'.'.'.• , . .'
Полученные результаты показывают, возможность использования,,
молочной железы сельскохозяйственных животныхв. качестве проду-"
цента биологически-активных гетерогенных протеинов ,,. что в буду- '•';..
щем может стать новым путем производства' протеинов* применяемых .
в медицине, ветеринарии, а т а к же с техническими целями, (напри- '•;;'
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
мер, для переработки продуктов питания).
1. 5 Апробация работы
'•.'
.Материалы диссертации изложены на 4б-ой научно-методической
конференции аспирантовг и молодых ученых по проблеме.;.! интенсифи­
кации животноводства, Ш Ж , п. Дубровицы, 17-18 июня 1993 г., на
конференции немецкого общества селекционеров и ученых животново­
дов. "Ausder Arbeit der Forschungsstaettea fuer Tierproduktion",
Университет имени Георга-Аугуста; "г. '•'.• Геттинген, .28-29 сентября
1993 года. .J'
•• v..-; .';•-':••".•.По теме диссертации опубликована одна работа, две работы
находятся в печати. Кроме того, за период аспирантуры опублико­
вано три рецензии на книги известных ученых из Германии по спе­
циальности диссертационной работы, две работы находятся в печати.
-
II МАТЕРИАЛЫ И МЗТОДКХА ИССЛЕДОВАНИЯ
• В качестве объекта исследований были выбраны кролики, кото­
рые, с одной стороны, являются лабораторными (модельными) живот­
ными, а с другой стороны. - сельскохозяйственными зшвотными. Бы­
ло проведено три программы по переносу генов/эмбрионов:
08/92 19.07.92-21.08.92
ВОТ.
п. Дубровицы
70 доноров. 40 реципиентов
01/93 04.01.93-07.01.93
ВНИИШ, Г. Ободегск
138 доноров, 108 реципиентов
06/93 07.06.93- 10.06.93 ВНИИПМ. г. Обйгенск
144 донора, 113 реципиентов
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В качестве доноров использовались половозрелые самки пород .
шиншилла и белый великан в возрасте. 5-7 месяцев со средней живой'
массой 3.89 кг.". У,крольчих-доноров за 72 часа до искусственного •
осеменения вызывали суперовуляцию, инъецируя внутримышечно 20 MB "
на кг.живой массы гонадотропина сыворотки-жеребой кобылы (PMSG,
Intergonan, Vemie), дважды с интервалом в один час осеменяли
свежеполученной разбавленной спермой с. внутривенной инъекцией
при первом осеменении 180 ME хорионического гонадотропина чело­
века (HCG, Ekluton; Vemie) для индуцирования овуляции. Через 20
часов после инъекции HCG доноров забивали, половые органы транс­
портировали в лабораторию, вырезали.яйцеводы и промывали их со:
стороны воронки 1-2 мл среды. (PBS+20ZFCS) с целью . извлечения
эмбрионов. Поиск яйцеклеток осуществляли под световым микроско­
пом при увеличении *40, после чего их переносили в каплю той же
среды под.слоем парафинового масла в чашке Петри, где их культи- •
вировали при t- 3S* С до момента, микроинъекции: Микроинъекция
выполнялась при увеличении *400 с использованием интерференцион- :.
но-контрастной оптики,. двух микроманипуляторов, прибора Для ре*- . .
гулирования инъекционного давления и микроинъектооа, . после.чего
зиготы культивировали в капле среды до пересадки их•• в- яйцевод .
. «";; .''.:'v "г ''!..
реципиентов.
Для микроинъекции
струкции:
.
были ислольвованы следующие генные кон-- .
•';_'• ':' '
'..';.; ••:•"•'.'•",'•.
Р15/34 - геномная последовательность гена химозина крупного " ,
рогатого скота под контролем ^sl-казеинового промотора круп- ••'
ного рогатого скота;
Р137, Р138, Р139, Р140. Р159, Р175 - кДНК инсулиноподобного
фактора роста-\ под контролем промотора «^si-казеина крупного'
рогатого скота;
.;',
.••'•
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В -• структурный . ген гормона'роста крупного рогатого скота
под
контролем промотора фосфоэнолпируваткарбоксикиназы (РЕРСК);
Туг4
ного
- структурный г е н тирозиназы под контролем гомологич­
промотора;
"..'".
•.-•/•-'•
•
Реципиенты синхронизировались с донорами путем внутривенной
инъекции 1 2 0 M E HOG (Ekluton,
Пересадка эмбрионов
Vemie) н а 2 часа
позже
доноров.
выполнялась с использованием техники лапа- •
роскопии в о б а яйцевода (Besenfelder U. , В г е т G. 1993). В каждый
яйцевод было пересажено в среднем по 1 0 микроинъецированых эм­
брионов.
•;.':'•''.'.•;'•••.'••'•!''•'
- Н а ll-14-ый день после пересадки проводили пальпацию, реци­
пиентов.с целью диагностики.беременности. Вели четкий.учет числа
окролов и.числа решившихся крольчат. Через четыре недели после
рождения было• проведено.мечение живых крольчат и от всех потом­
ков, ( в том числе, от. абортированных плодов, .мертворожденных и
павших) были . взяты пробы тканей у х а для анализа н а интеграцию .
;
генных конструкций.
'• . . л ' •''..•
',, Из взятых .проб тканей методом.фенольно-хлороформовой зк- .
стракции ( В Н п N.. Stafford D. V. 1976) была выделена ДНК. Кон­
центрация ..ДНК определялась на спектрофотометре при длине волны .
.260 нм,'.".а для 'характеристики степени очистки использовался пока- ;
эатель . соотношения оптической плотности раствора ДНК при длине '.;
волны 260 И 280 нм (Sambrook J. et al. 1989).
Анализ на интеграцию проводился методом полимеразной цепной
реакции (Saiki et al. 1988) с использованием капиллярного термоциклера FTS-1S. Разделение продуктов амплификации выполнялось
электрофоретически в 2Х агарозном геле, а их детекция при рас­
смотрении геля в ультрафиолетовом свете с длиной волны Збб нм.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Для анализа экспрессии были взяты трансгенные самки из ран­
них программ с генными конструкциями Р43^ Р77. Р99 (структурный
ген химозина крупного рогатого скота под контролем промотора.
^si-казеина крупного рогатого скота). Анализ проводился на уров­
не мРНК (транскрипция) и на уровне протеина ,{трансляция). Для
выделения РНК использовался метод кислой экстракции гуанидиук-.
фенол-хлороформом (Chomczynski P. et al. 1987). Доказательство
присутствия специфической мРНК проводилось методом RT-PCR; (по
протоколу B.Brenig), то есть с выделенной мРНК с помощью фермен^
та реверсивной транскриптазы сначала 'была синтезирована кДНК;
которая затем использовалась для амплификации путем полимеразвой
.цепной реакции. Доказательство трансляции мРНК'проводилось мето­
дом Western-блот анализа (Towbin Н. et al. 1979),; а именно пос*
редством иммунологической реакции между имобилизованными на нотроцеллюлозной мембране .(Bio-Rad) . протеинами сыворотки молока".'трансгенных" самок и специфическим к;химоз'ину первым антителом с :
последующей инкубацией мембраны с видоспёцифическим;7'маркирован-.;.
ным пероксидазой вторым антителом (Gt-^-Rb, Signa).. Для ^детекции ^::
продуктов реакции был использован принцип хемилюминисценции (ECL
Detection Reagents, Amersham).
С целью доказательства функциональности синтезирующегося в
молочной железе кроликов химогина выполнялся тест по выявлению
его биологической активности, основанный- на способности этого
протеина после соответствующей активации при низких рН вызывать
осаждение казеиновой фракции молока. С помощью калибровочной
кривой, постороенной с использованием известных концентраций
Х И М О Й И Н Э (зависимость между концентрацией гимозина и временем
сворачивания коровьего молока), была определена концентрация хик.031 <-а г мо.*оке тра ктеньых кроликов.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ill РЕЗУЛЬТАТЫИССЛЕДОВАНИЙ
3,1 Суперовуляция, извлечение эмбрионов, микроинъекция
'.•'•• Реакция доноров на суперовуляцию, характеризующаяся числом
желтых тел на. яичниках, в'среднем на донора составила 33.34.
Степень извлечения яйцеклеток, определяемая как соотношение меж-'
.ду числом извлеченных яйцеклеток и числом желтых тел на яични­
ках, выраженное в процентах, равнялась 81.49Х (Таблица 1).
Таб. 1
Реакция доноров на . суперовуляцию и степень
извлечения яйцеклеток
Программа Число Средняя Число ж. т. Число
Степень
доноров живая
на донора яйцеклеток извлечения
п
масса^ кг
на донора яйцеклеток Z
:
.
j
08/„92
70
3.03
42.04
31. 79
75.60
01/93
138
4.23
32.95
25.62
77.75
06/93
144
а 98
29.49
26.41 „
89.57
Всего
352
а 89
33.34
27.17
81.49
В таблице 2 приведены данные .об оплодотворяемости яйцекле­
ток в трех различных программах. Как показывает таблица, 88.01Z
от общего числа извлеченных яйцеклеток были одноклеточные на
стадии двух пронуклеусов (только такие"зиготы использовались для
микроингекции). Из 8417 таких яйцеклеток 5695 было микроинъецировано.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
-,. 10 Таб. 2
Степень оллодотворяемости яйцеклеток • •-."•'
Программа Число
Число
Число оплодотворенных яйцеклеток
доноров яйцеклеток всего ,
•всего, n
08/92 • • 70
138 '
01/93
05/93
Всего
2225
.
144
352
%
*.•'."'.
3803
1885 84.72 1879
3242 91.69 3140 •
3484 91.61 3 3 9 8 ;
84.45
88.80
69.35
9564
.8611 90.04 8417
88.01
. 3536
;
n
в т. ч. одноклеточных
п
.
Число 'микроинъецированных вигот в зависимости от генной
конструкции распределилось следующим образом (Таб. 3). '
'•
Таб. 3 Генные конструкции, используемые для микроинъекции,
Программа . Генная
' Микроинъецировано . яйцеклеток • : •:,',.'
конструкция всего,
от числа одноклеточных,•
•'•.:'
08/92
••' . ' • " :
п^
X
'••'' •
•'•
Tyr4 P138
144
Туг4 Р139
180
50.23
( 324/702)'
Туг4 РВ137 .
429
64. 71
( 429/663)
310
69.31;;' ( 3 1 0 / 5 1 4 )
Туг4 РВ139
Всего
1063
57. 32
(1063/1879)
'
, :
^sV:
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 11 01/93
PI 5/34
PBUO
PB139
PB15/34
Всего
06У93
•
PB15/34
PB59/75
PB140
PB159
Всего
Всего
424
62.26 . ( 424/ 681)
644
707
619
2394
77.87 О 644/ 827)
80.71 ( 707/ 876)
81.88'.: .( 619/ 756)
76.24! (2394/3140)'
679
604
435
520
2238
77.16 ( 679/ 880)
84.01 ( 604/ 719)
68.72 ( 435/ 633)
• 44.60 ( 520/1166)
65.86 (2238/3398)
5695
67.90
(5695/8417)
3.2 Пересадка эмбрионов
3.2.1 Синхронизация реципиентов
Таб. 4 Влияние статуса реципиентов на синхронизацию
реципиентов
Молодые самки
Рожавшие самки
Всего
Число желтых тел
на реципиента
Число
Статус
реципиента
,.
.
6.26
< 5.84
38
214
252
.
5.90
( 238/38)
(1250/214)
(1480/252)
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
•
'
.
Л
'
.
-
"
•
-
1 2
- - • . , ; . • • • ' • ,
Как показывают данные таблицы 4 число при обработке хорионическим гонадотропияом число желтых тел на'яичниках у молодых
самок было в среднем на: реципиента на 0.42, больше по сравнению с
рожавшими самками'.
'.
Отмечено влияние сезона года на обусловленную гормонами ре­
акцию реципиентов на индукцию овуляции: в зимний период (январь)
число зсазлтых тел на яичниках .было в среднем на самку на 1.08
больше, чем в летний период (июнь, август) (Таб. 5).
Таб. 5
Влияние севонатода на реакцию реципиентов на HCG
Сезон
' Число '•'•
реципиентов
Зима (январь)
Лето.(июнь, август)
113 ..'."'
139 .
Всего
252:
Число желтых тел
на реципиента '
6.50
.5.42
5.90
(734/113)
( 754/139) ;'••''
(1488/252), ••
3.2.2 Беременность
' -.
\
Степень беременности вычислялась как.'отношения числа абор­
тировавших и окролившихся реципиентов к общему!числу реципиентов
выраженное в процентах.
3.2.2.1 Влияние синхронизации реципиентов
В зависимости от времени синхронизации реципиентов (20 ча- ;
сов раньше доноров, 2 часа после доноров, 20 часов после доно­
ров) наблюдались различия в степени беременности реципиентов
(Таб.
б ) .
"
':'' •'•".-'.'• ' • / . ' / • ;
'.'.'
;
/ ,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
.•'...•
-,
;'
••'
- . 1 . 3
-•
'
•
.
•
:
•
•
. Таб. 6 Влияние синхронизации реципиентов на степень бере­
менности при пересадке контрольных эмбрионов
Синхронизация
реципиентов
Число
г. Всего
20 Ч. до доноров
.5
2 ч. после доноров 20 "
1
V 37v.-;V
20.00.
75.00
15
20 ч. после доноров :- 12
Всего'
Степень
беременности,X
реципиентов
Сукрольных
• 9. 25
'••.: •'. 75.00
'•
.67.57
3.2.2.2 Влияние статуса реципиентов
• Проведенные опыты показали, что статус рещшиен^в оказывалвлияние на степень беременности. Как следует из гданных представ­
ленных в таблице 7. сукрольносгь у молодых самок.наблюдалась на
10.84% чаще, чем у рожавших самок.
Таб. 7 Влияние статуса реципиентов на степень беременности
при пересадке микроинъецированных: зигот
Статус
реципиента
Молодые самки
Рожавшие самки
Число реципиентов
Всего
Сукрольных
35
'194 *
. 24
110
Степень
беременности, %
68.57
56.70
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
.
'
'
.
,
.
•
•
.
'
•
. . - . 1 4 ' -
3.2.2.3 Влияние сезона года
У
••
"•'' _
.;
••.-..
•
.••••
•;.
.•'•
-
В степени беременности реципиентов по сезонам года.наблюда- .
лись незначительные различия: на 2.89Z больше в летний, чем в :
зимний периоды (Таблица 8).
Таблица 8
Влияние сезона года на.сукрольность реципиентов
Сезон
года
Зима (январь)
Лето (июнь,'август)
' Число реципиентов
' Всего . : Сукрольных
102
127
59
77
Степень
беременности, %
57.74
60.63
3.2.2.4 Влияние микроинъекции
С целью выяснения влияния микроинъекции на сукрольность ре­
ципиентов кроме микроинъецированных пересаживали конторольные
(немикроинъецированные)• зиготы. Степень беременности самок при
трансплантации контрольных вигот была на 15.61Х выше, чем при
пересадке микроинъецированных вигот (Таблица 9).
Таб. 9 Влияние микроинъекции на степень беременности
Статус
эмбрионов
Число реципиентов"
Сукрольных
Всего
Степень
беременности, Z
Микроинъецированные
Контрольные
229
20
59.39
75.00 .
136
15
~ - синхронизация реципиентов на 2 часа позже доноров
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 15
v 3.2.3 Выживаемость, эмбрионов
; За показатель .выживаемости зигот принимали отношение числа
родившихся крольчат, в том числе мертворожденных, и абортирован-.
; ных эмбрионов к общемучислу •пересаженных зигот, выралвнное в
процентах." . • .
' '
•.•-'•.-.• .',.'•;.
312; 3.1 Влияние статуса реципиентов
.•'.,•'
;;
Анализ показателя; выживаемости вигот по группам молодых и
рожавших самок показал, что выживаемость зигот, пересаживаемых
молодым самкам, была на 2.19% выше по сравнению с рожавшими сам­
ками (Таблица 10). .
Таб. 10 Влияние статуса реципиентов на выживаемость
микроинъецированных эмбрионов
Статус
реципиента
Число пересаженных
эмбрионов
молодые самки
рожавшие самки
696
3735
Число
потомков
Выжив? мость
эмбрионов, %
84
369
12.07
9.88
о
3.2.3.2 Влияние сеэона года
Сравнительный анализ степени выживаемости зиго в зимной
(январь) и летний (июнь, август) периоды (Таблица 11) показал
повышенную выживаемость зигот. (на 3.76%) в зимний период.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
. - 16 Таб. 11 Влияние .сезона года на выживаемость
микроинъециро­
ванных эмбрионов '''.".'
Сезон
года
Пересажено .
Число. '
Выживаемость
эмбрионов
ПОТОМКОВ'
%
246 :
.207
12.28
8.52"
. 2003
2428
Зима
Лето
'•'•'•..''
3.2.3.3 Влияние микроинъекции
В таблице 12 представлены сравнительные данные жизнеспособ­
ности микроинъецированных и "контрольных (немикроинъецированных)
зигот.
Таб. 12 Влияние микроинъекции на выживаемость эмбрионов
•
.-.-..
N •
:.•
Статус
эмбрионов
Пересажено
эмбрионов
Число
потомков
микроинъецированные
4431
453
61
контрольные
236
Выживаемость,
%
10.22
' 25. 85
Поскольку все операции, выполняемые над контрольными эмбрио­
нами, исключая микроинъекцию, были идентичны с микроинъецированными эмбрионами, уменьшение степени выживаемости инъецированных
зигот на 15.63% можно считать следствием микроинъекции.
Анализ этого показателя
в зависимости
ог инъецированных
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
'.
: • - 17 генных конструкций . (таблица 13) выявил широкий спектр изменчи­
вости: "значения степени, выживаемости зигот колебались от 2.39%
до 20.15%.
.
'
•
• Таб. 13 Выживаемость зигот в зависимости от.микроинъецированной генной конструкции ; ' '.•..'•
Программа
Генная . .
конструкция
08/92"
Туг4-Р138
. • Пересажено
8ИГ0Т
Число
потомков
Z
103 . •
12 V
11.65
Туг4-Р139 '._' • : 100
В-Р137
Tyi;4-B-P139
01/93 '
Р15/34
^
•
7
240 "
,.- .
28
7.00
.
11.67
9
80
26
377
Выживаемость
11.25
.
6.90
•
: В-Р140
5 1 0 •; .'•••'.•
' В-Р139 ';'•;•.•'
570'
В-Р15/34"
06/93 .
В-PI 5/34
В-PI59-PI75
: В-Р140 •
; 0 . '•
В-Р159 ";
"71 .
39
'•".'
5 4 6 ' - . -.
445
11
.
6. 84'
.110
:'; 4бо';
.480
13. 92
20.15
2. 39
.
64
•'
- .25
13.33
"..•''•
5.62
9. 81
520 :
:'
5
1
•
. Интересен тот факт, что как минимальная,, так и максимальная
степени выживаемости зигот наблюдались при инъекции одной и той
же генной конструкции (В-Р15/34), причем с различием почти Е Ю
раз. Это дает основания полагать, что жизнеспособность инъециро­
ванных зигот 'зависит. прежде всего, от биологических и физиоло-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
гических показателей-доноров и реципиентов, на которые огромное .
влияние - оказывают внешние -еловия, которые несомненно различа­
лись , поскольку; в каждый из дней во всех ..трех программах инъеци­
ровалась лишь одна; генная', конструкция. .'•'.'
3.3 молекулярно- генетический анализ
3.3.1 Исследование интеграции. ;.
, ;,
;'..• Исследование интеграции методом полимеразной цепной, реакции
выявило у 9-ти'потомков (1.99% от числа родившихся крольчат и .':
0.16% от числа пересаженных зигот) положительный сигнал, что го­
ворит о трансгенносги данных особей (В - два; Р139 - один;
Р15/34- четыре;. В-Р140 - один; Туг4-Р138 - один), в том числе у
двух трансгенных ^кроликов1-произошла коинтеграция двух генных
конструкций. Результаты, полученные методом PCR-анализа. были
подтверждены методом Southern-блот анализа.
а з . 2 Исследование экспрессии . .
Исследование экспрессии проводилось на кроликах, трансген­
ных по гену химозина крупного рогатого скота под контролем
промотора ^sl-казеина крупного рогатого скота.
3.3.2.1 Анализ транскрипции ДНК
.
методом RT-PCR было показано- присутствие специфической мРНК
в молочной железе трансгенных самок во время лактации.. Вило
обнарулсеко. что в молочной железе трансгенных самок присходит
альтернативный сплайсинг* химозин-мРНК, то есть кроме нормальной
мРРК присутствуют транскрипты более короткой длины. Исходя из
длины йыпдыфицируечых фрагментов, был здедак вывод, что в случае
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
' • • • " .
;
'
*
. " . : • • '
J
?
"
•
.
•
•
'
•
'
.
.
'
альтернативного сплайсинга в химозин-мРНК отсутствует
ЭКЗОН.';
.'
' . ••
.
•.'.:.
шестой
г
'
3.3.2. Z Анализ трансляции мРНК
Методом Western-блот-анализа было - установлено присутствие
прохимозина (Мг около, 43 кД) в молоке трансгенных самок. Было
показано, что в результате активации при рН-2.5 происходит уко­
рочение протеина, что соответствует литературным данным, касаю­
щимся сычужного химозина телят, ; а'именно.-что-при активации при
низких рН происходит отшепление на N-конце аминокислотного фраг­
мента. в результате чего малоактивный прохимозин переходит в ак­
тивный псевдохимозин, а затем в химозин. Таким образом, транс­
генный химозин обладает тем же - свойством, что и нативвый химозин
телят. Структура прохимозина представлена на рисунке 1.
•• Рис. 1 Структура прохимозина '
16 27 15
I
323
— число аминокислот
.препрохимозин
прохимозин
. псевдохииозин
"-•'••••.' •'
химозин -J:
I
3.3.2.3 Анализ биологической активности химозина
Биологический тест, .основанный на :способности химозина
". осаждать K W W H U молока, показал, что. находящийся в молоке
. ,трансгенш«; '; -льчих прохимозин обладает незначительной активюностью, и лишь после активации при рН-2.5-(30*С) происходит его
; переход в биологически-активную форму. При более длительной ак-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
• ' ; ' . '
-
2 0
-
.
;.-.,
'• -;•
•:.
тивации (до 48 часов) значительных изменений в активности химо­
зина не обнаружено^ с помощью калибровочной кривой, построенной
по известным концентрациям химозина, в молоке трансгенных самок'
был установлен уровень экспрессии от нескольких миллиграмм до
более 1 грамма в литре молока (Таб: 14).:
•/'•"•,.'
Таб. 14 Концентрация химозина (мг/л) в молоке трансгенных
кроликов
Геньая
N трансгенной
Концентрация химозина
конструкция
самки
(мг/л)
Р43
3332
10
3531
около 1000
2290
10
Р77
Р99
3845
4
3.5
2848
250
3872
1100
2847
75
4382
до 1500
У трансгенной самки N 4382 пробы молока отбирались на каж­
дый второй день лактации в течение 42 дней (21 проба). Как пока­
зал анализ, содержание химозина в молоке колебалось в ходе лак­
тации от 210 до 1500 мг/л молока (Рисунок 2).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 2 Лактационная кривая трансгенного кролика N 4382
иг/л
1800
• ХИМОЗИН
2 1 ДОЕНИЕ - 1 9 4 л МОЛОКА
НАДОЙ ЗА ДЕНЬ
иоо
минимальный
39 и л
иаксииа«1ькый 179 и л
в средней
в2'ил
1200
1000
BOO
воо
400
200
О
10
15
20
ДНИ ЛАКТАЦИИ
От этой самки было получено 1.84 л молока, чао при средней
концентрации химозина около 800 мг/л составляет более 1.5 г хи­
мозина за лактацию. Таким количеством химозина можно осадить
казенны в более 15000 литрах коровьего молока.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 22 - . -.
IV В Ы В О Д Ы — ; "
1. Использование- лапароскопии является эффективным.методом
для трансплантации.' зигот у кроликов и поззоляет сократить время
пересадки от 40-60'минут (при .хирургической пересадке) до 5-10
минут. С применением такой техники пересадки беременность кроль- .
чих составила 59.39% для; микроинъецированных и. 75.00% для конт-— рольных эмбрионов, а выживаемость - 10.22% и 25.85%, соответс-
• твенно.
'
'•'•..'''•.•.'•..'• •>•'•'..<2. метод полимеразной цепной реакции является удобным и на­
дежным методом анализа животных па трансгенность. 9 животных бы­
ли идентифицированы как трансгенные (1.99% от числа родившихся
потомков), в том числе у двух произошла коинтеграция.
3.'Показана возможность.применения метода..RT-PCR для:анали--.
за экспрессии- на уровне мРНК. Доказано присутствие в молочной '
железе трансгенных кроликов специфической мРНК(химозин-мРНК): ,.
При этом установлено, что кроме нормального происходит альтерна- -•.
тивный сплайсинг химозин-1 мРНК (выпадает 6-ой экзон). : :
4. В молоке трансгенных крольчих доказано присутствие'.' химозина крупного рогатого скота в концентрациях от-нескольких.мил- ,
лиграмм до более 1грамма в литре молока.
.' * V
5. Показана биологическая функциональность_химозина, синтё-•_;..;
зирующегося в молочной железе трансгенных кроликов» : ;.
' J*
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
V ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Л
Исходя из полученных результатов могут быть сделаны следую­
щие предложения: .'•' .<
* ".'- ••;;•''.,.
1. С - целью упрощения" процедуры пересадки зигот у кроликов,
а так же.повышения степени беременности самок и выживаемости эм­
брионов рекомендовать использование техники лапароскопии.
2.. Использовать метод полимераэной цепной реакции для быст­
рого анализа, животных на трансгенноль и метод RT-PCR для дока­
зательства экспрессии интегрировавш-псся генных, конструкций
•
; 3.- Использовать кроликов ;в качестве объектов в опытах по
получению трансгенных животных, в частности с тканеспецифическими для молочной желеэы.генными конструкциями.
*••
J-
VI СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ .'
.По теме диссертацим опубликованы следующие научные работы:
•••'•••• 1. Zinovleva Н., :•'. Brem G. ^Molekulargenetlsche Analyse
mUchdruesenspezifischer Genkonstrukte. - Gemeinschaftstagung der
PGfZ/6fT, 28.-29. Septenfcer 1993, Goettingen
2. Зиновьева E А. Применение PCR для тестирования животных
на интеграцию генных конструкции. - Материалы 4б-ой научно-мето­
дической конференции аспирантов и молодых ученых по проблемам
интенсификации животноводства; .17-18 июня '1993 г.,... Бюллетень
ржа,' 1993/ в печати-: •'.
3. Brem G.,. Hartl P.. Besenfelder U., . Wolf E., Zinovieva
M,'» Pfaller R. Expression of syntetic cDNA sequences encoding
human lnsulin-like growth factor-1 (IGF-1) and its analogue
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
'
•
•
'
•
-
2
4
-
•
"
•
•
.
'
•
'
•
,
.
'
'
.
[Gln58]IGF-l in the •mammary gland of transgenic rabbits. Gene, submited '.
. '
Другие работы: .
• '..'/.*
1. Врем Г:, Зиновьева Е , Эрнст Л. К. "Генные фермы" - новый
путь производства биологически активных протеинов трансгенными
животными. - Сельскохозяйственная биология, в печати !
2. Besenfelder U. , Dietrich Е.. Sohnrey В., Zinovieva N.,
Holz W., Brem G. Tubal transfer of goat embryos by way of
endoscopy.- Veterinary Record, .submited
'.."••'.'..'•
а Эрнст Л. К., Холманов А. М., Зиновьева Е А. Рецензия на
книгу: Brem G. . Kreausslich H., Stranzinger G. Experimentelle
Genetik in der Tierzucht. - Генетика.-т. 28, N 8, с. 174-175
; .
4. Холманов A. M.. Зиновьева E А. Рецензия на книгу:, Brem
G., Kreausslich H., Stranzinger G. Expef lmentelle Genetik in der
Tierzucht. - HK3K. 1992, n 5-6. С 58-61
5. Холманов A. U.. Зиновьева Н А. Рецензия на книгу: Brem G.
Genetische Vielfalt von Rinderrassen. - HK3K. 1992. N 5-6,
с 62-63
•"У: •' ..•
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
'.. •
.•-
;
'
'•
:
-
•
-..'•
2 5
.: VII БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК.
1. Besenfelder . U. , Brem G.
(1993) Laparoskoplc embryo
transfer in rabbit.'- J; Reprod. Fertil.. 99, .53-56
2.. Blln ; N., Stafford
D. W.: (1976) A general method for
Isolation of high molecular weight DNA from eucaryotes. - Nuol.
Asivs Res. , 3; 2303-2308
&
•
Chomczynskl P.,. Sacc'l N.
(1087) Single-step method
of
RNA isolation by acid guanidinlum thlocyanatr-phenol-chloroform
extraction.-Anal. Biochem..,! 162. 1Г5-1Б9
. . 4; Sambrook J.,
Fritsch E...
cloning. A laboratory manual.
Press,' New York •
';•*;
Cold
.
Manlatis T. (1989i Molecular
Spring
.."••'•
Harbour Laboratory
./
5. Salkl R.K.,. Gelfand . D. N.. . Stoffel
Higuchi R..
Horn
ат..
.Primer-directed enzymatic
;.
S. , Scharf S. J.,
Mullls K..B/,' Erlich H. A.
amplification
(1988)
of -'. DNA, with
a
thermostable DNA-polymerase.- Science, 239, 487-491
"'•;:;, 6. Towbln H., StaehellnT.,
Acad. Sci; USA. 76; 4350-4354
Gordon J.
'•.'" ;
(1979) roo. Natl.
' .-*_'"''.•
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
•; Шдписано'к.печати:•', 27.01.94 ; 7*. •
" Заказ ;•'• 551 •,
Тираж ..75•'.'",' .-".:','> "•_:.' ..'-Объем 3.Z уч. изд. л...'
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
656 Кб
Теги
427
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа