close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

702

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ АН СССР
J-&3P&2-На правах рукописи
А.Е'.Хадизев
ИЗУЧШИЕ СПОНТАННОГО В03НИКН0ВШИЯ МУТАЦИЙ
РЕЗИСТЕНТНОСТИ К АНАЛОГАМ ШУРИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ
В КЛЕТКАХ КИТАЙСКОГО. ХОМЯЧКА И VTTSO.
-( 03,103 ~ генетика )
А в т о р е ф е р а т
диссертации на соисканяе ученой степени
кандидата оиологических наук
Москва
1970
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
S^Jl/S^stW
1АЛЩ ,
О
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ИНСТИТУТ ЕИОЛОПШ РАЗЖИМ АН СССР
На правах ружовкс*
А.В.Халмзвв
ИЗУЧШ» СПОНТАННОГО ВОЗНИКНОВЕНИЯ МУТАЦИЙ
РЕЯКЯЖГНОСТИ К АНАЛОГАМ ШТРИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ
В КЛЕТКАХ КИТАЙСКОГО ХОМЯЧКА ХВ ТГГВО
( 0 3 . 1 0 3 - генетика >
А в т о р е ф е р а т
дшсоертацн* на « я о к а я и е у ч е н о ! стеовня
кандидата б и о л о г и ч е с к и науж
Щеигралыкя Пауэдая Библиотека
iKmogiC2cft ь/д; ,';.;...на Оедшхоз.
М о с к в а
I'.r-'O
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа выполнена в биологическом отделе
Института атомной энергии иы. И.В.Курчатова
Научный руководитель:
Доктор биологических наук, профессор Н.И.Шапиро
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук Б.Н.Сидоров
Кандидат биологических наук В.А.Шевченко
Ведущее учреадение - Институт цитологии и генетики
СО АН СССР ( г.Новосибирск )
Автореферат разослан
п
Jf
" ее^£1&&/>*$ 1970 г.
Защита состоится на заседании Ученого Совета
Института биологии развития АН СССР
(Москва, ул.Вавилова, дом 26 )
п
& /SjjJbpe.
I970 г.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Института биологии развития АН СССР
Ученый секретарь - кандидат биологических наук
К.В.Чудакова
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В В Е Д Е Н И Е
Генетические эксперименты, проводимые на соматических
клетках мдекопятавдих in г И го , отличается очень большой
разрешающей способностью. Они, как и опиты с микроорганизмами,
позволяют в относительно короткий еров подвергать анализу ог­
ромное число клеток и тем самым давать количественную оценку
весьма редких событий, например, мутаций отдельных генов. Ш а т ­
ров развитие генетики соматических клеток млекопитающих обуслов­
лено рядом методических достижений. К их числу прежде всего
следует отнести возможность неограниченно длительного культжвирования клеток вне организма I /flu Quit/fin
и др., 1957;
(Fiihez
и др., 1959; &а<Кеп
к др., 1961 ) . Кроме
того, создание условий,обеслочнвагонх образование колоний из
отдельных клеток ( £ап/огс/
ж др., 1948; PuctC
,
//?ага/у,
1955 ) , позволило весьма аффективно использовать селек­
тивные питательные среды.
Большим успехом генетики соматических клеток млекопитаю­
щих является получение разнообразных генетически маркированных
клеточных линий, столь необходимых практически для любых иссле­
дований в данной области. В настоящее время уже существует зна­
чительный набор мутантных линий различного происхождения
з
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
(человек, обезьяна, крыса, мышь, хомячок), или являющихся реаистентиымн а аналогам п у р ш ю ш х в пиримндиновых оснований, к
аналогам фолаевой кислоты, к антибиотикам, к стероидам, к ана­
логам глскозы, к вирусам, И Л И отличающихся измененными потреб­
ностями в аминокислотах в в сахарах. Заметные успехи достигну­
ты и а изучения мутационного процесса на генном уровне в клет­
ках . in niro.
Изучение его количественных закономерностей и,
в частности, темпа спонтанного мутирования является необходимым
условием для выяснения механизмов, лежащих в основе как спон­
танных, так и индуцированных мутационных изменений генов, а
также для исследования трансформации, гибридизации и др. Работы,
проведенные в атом чрезвычайно существенном направлении, тем не
менее немногочисленны. Можно указать лишь на Несколько исследо­
ваний. посвященных оценке частоты спонтанного возникновения
генных мутаций ( Хсебеттап
, Ore , 1959; J'iu6a£5*it
1959; Шапиро и др., 1966; Варшавер и др., 1969; СЛи и др.,
1969; Маршак, Варшавер, 1970).
Ь настоящей работе изучали закономерности возникновения
признака резистентности к аналогам гуанина. Этот признак ис­
пользован в связи с тем, что его биохимическая природа доста­
точно хорошо известна. Резистентность клеток к аналогам гуанина
обычно определяется потерей активности пирофосфорилазы инозано­
вой и гуаниловой кислот. Отсутствие в клетках этого фермента
приводит к тому, что в ДНК не происходит включения свободных
пуряновых оснований (гуанина или гипоксантина), а следователь­
но, и их аналогов. В таких клетках синтез нуклеотидов может
происходить только Ue noso
, что и определяет их резистент­
ность к аналогам гуанина.
Основная задача работы заключалась в установлении частоты
спонтанного возникновения мутаций резистентности к 8-азагуанину
и 6-меркаптопурину в клетках китайского хомячка in yiizo
,
а такхе в выделении и характеристике мутантных клонов независи­
мого происхождения. Особое внимание было уделено теоретическим
вопросам оценки темпа спонтанного мутирования, некоторым мето­
дическим особенностям соответствующих экспериментов и анализу
так называемого концентрационного эффекта - одного из основных
факторов, которые могут сильно искажать количественную харак­
теристику спонтанного мутагенеза.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ -АНАЛИЗ МЕТОДОВ ОЩНКИ
ТЕША СПОНТАННОГО МУТИРОВАНИЯ.
Задача настоящего раздала - теоретический анализ методов
оценки темпа спонтанного мутирования, разработанных разными
авторами для микроорганизмов, и возможностей их применения для
соматических клеток млекопитающих in fit го : % а также анализ
влияния некоторых факторов на определяемый темп.
Принципиальная схема эксперимента по определение темпа
спонтанного мутирования состоит в следующем. Клетки исследуе­
мой популяции высевают в культуральные сосуды и инкубируют их
в неселективных условиях некоторый промежуток времени ( t ) , в те­
чение которого происходит спонтанное возникновение'мутаций.
Одновременно из этой же суспензия высевают столько же клеток на
селективную среду для определения числа мутантов, присутствующих
в исследуемых культурах в начале эксперимента. Через промежуток
временя •£• в каждом культуральном сосуде подсчитывают. коли­
чество клеток, образовавшихся за время инкубации в неселектжвнчх условиях, и определенное их число переводят в селективные
условия на время, необходимое для образования мутантных колоний.
Полученные тахиы образом данные позволяют вычислить темп спонтан­
ного мутирования, выражающийся как вероятность возникновения
мутаций на клетку.за время одной генерации.
Каждый из шести анализируемых методов в принципе может
быть использован при изучения спонтанного мутагенеза сомати­
ческих клеток. В табл.I даны формулы для вычисления темпа спон­
танного мутирования. приведены основные условия, которые необ­
ходимо соблюдать при использовании отдельных методов, а также
указано влияние некоторых факторов на определяемую величину
темпа. Так, различия в скоростях размножения мутантов и клеток
исходной популяции могут завышать или занижать определяемый
темп, задержка фенотипичесного проявления мутаций может его
занижать, а случайное возникновение ранних мутаций - завышать.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ТаДяец I
Крепи* вфатврсспха мтздп «евв» тиса сшштавното кутжровЕИД
я
метода
••.'
Основные формула '
2 ш а ц и оЕределхавй теш аутврсоавп
•рааичхж 1 евороскхг
задери» февотвлвроста ж в вероатноочесхого арояы»,-твх гжбедж нутаятоз '
EZX кутай!
ж влетав всхода!
ТСЛОЕХЖ
Rt'0
I
(
i
-7
(
Cf<Cfu<*.
\ же axxxsi
о^ а*»..
.4,-0
3
—
5
ввхяовенхд рангах •уташ!
<7< С7««л :
г
4
2ЭГТЧ&23ОГ0 ' M S —
а. 1М&-&)
i
•
i* I иаооах;
ведыа бра» вроби) жухиввхрогяяае вдетая тедко К
твердя» субстрате
^хх)
'
х>¥
ввоза Open вроов .
же ждгсях
jpBBBXe ВЦГТВЦВЖ
. в» UEcer
E l ВЛВВВТ ,
в* возтшии
Ci< Qmm.
же вхвжет •;
Я<#.
вв ваопт
ШИВШЕЕ: х) Л - ексаерпивтшво шгоедедввввж теш яутжрованхв в ваечвтв ва ждетхт ва воволеявм
QzfZzJZFSSLFZL5232SF*
в расчете ва вдетау ва поволевве; С - чвело веквхсвяо хероаеввнх хулиур; а - чжсло геверадвж, про«дихва врем ахевервяввта;
П - маховишвое число tqrnurroB а одво! ва xyxirypj frj - среднее подо вутвдж!, врохвоведякс ж cjmi жуитуре ж ходе авопервмввта;
J"i,Mi- средние «еда ыутавтвнх водовв! ва вудиуру а вачаде в > вовне ахсверваевта)
Л, - доходное чвохо вдето* a xaxxot ва веввввехю
выраденнкх худьтур;
^ - средвее чведо влетов вв жуд&туру a samaa ввслеркмевтв}
Ai.JVi- средаве чхала влетов ва вудтуру в вовне
эжеаержмента;
- долв культур, вв оодерхаввх в ковау ввовервневта вв одвого нутавта; 1
-среднее чхало «утантоа ва вудиуру, оорааоваведхся а ходе ахспертевта;
2, - недваввов чжедо мутаято* а серп веваввевио ввредевавххухьттр! г - врвдвевчлоло «утавто» ва
ггдгтуру, оСфазогаввкхсл а ходе авадервмеита, всхода в* аоех худчур серо, га вавдвченвеа tot, ш осваруввво ft аутагтоа;
RI.RM.- средвве .чвода мутантов ва жудтуру в вачаде ж а жоще вжепервмеата; £ - вдвтаолооп ахсвярамавта; ( + ) - уживьеввде ввкваи
о аозрастанвея t ; ( - ) - увыпевае otson « аосраотаввеш^ t .
хх) Теш аутвровахав arx» методом осредахват ва пожгмпв л^ианд ава
[ аавеж воржож nj'iauiii
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
На определяемый темп при использовании любого из шеста
методов влияют и другие факторы.; К их числу относятся остаточ­
ный рост, эффективность посева клеток я концентрационный аффект.
Явление остаточного роста заключается в том, что чувствительные
клетки продолжают размножаться в течение некоторого временя
после создания селективных условий. В процессе такого роста
также могут возникать спонтанные мутации, которые будут завышать
темп мутирования. Поэтому величина остаточного роста должна
бить установлена экспериментально ( или путей непосредственного
подсчета клеток, или путем определения индекса остаточного роота) и учтена при вычислении темпа. Необходимо учитывать также
я эффективность посева клеток, так как при их пониженной жизне­
способности будут выявлены не все мутанты, что приведет к за­
нижению определяемого темпа. Очень существенным фактором яв­
ляется концентрационный эффекте Он заключается в том, что муталтные клетки при,их выявлении, из большого числа .чувствитель­
ных клеток теряют способность образовывать колония, а это про­
водит к недооценке числа мутантов я, следовательно, к заниже­
нию темпа мутирования.
"•.'>'• "Ч Л
Использование того или иного метода диктуется особеннос­
тями изучаемого объекта я селективного агента, особенностями
проявления мутаций, роста в жизнеспособности мутантов, а также
наличием мутантов, исходно присутствующее в исследуемой популя­
ции. Из рассмотренных методов наиболее простым является метод 6.
Однако для клеток млекошиагтах,возможность его применения ог­
раничена концентрационным эффектом. При одинаковых скоростях
размножения я вероятностях гибели мутантов и клеток.исходной
популяции из первых четырех методов наилучшим является метод 4
(сы.табл.1), хотя установить скорость размножения и жвзвеспособность мутантов непосредственнр после их возникновения очень
трусно. Методы 5 я 6 хороши тем, что соотношение скоростей разм­
ножения мутантов я клеток исходной популяции не влияет на оп­
ределяемую величину темпа спонтанного мутирования. Однако при
их использовании темп мутирования занижается в случае задержки
фенотипнческого проявления мутаций. В то же время эта задержка
не влияет на значение темпа при его оценке мзтодамя;>3 и 4.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
I
Таким образом, при определении частоты спонтанного возникнове­
ния мутациЯ очевидна целесообразность одновременного использо­
вания разных методов, что позволяет не только повысить досто­
верность полученных данных, но и выявить некоторые особенности
мутагенеза, например, оценить величину задержки фенотшшческого
проявления мутаций.
"
•
f
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Работу проводили на фибробластоподобных клетках китайского
хомячка клона 237. В ходе исследований 'эта культура била пов­
торно клонирована, и основные эксперименты ставили на клетках
клона 237т с модальным числом хромосом, равным 18 (62# клеток).
В работе использовали питательную среду Игла с добавлением
пенициллина я стрептомицина. При обычном культивировании клеток
в среду добавляли 10^ сыворотки крупного рогатого скота. Клетки
выращивали в герметически закрытых флаконах Карреля диаметром
50-60 мм в пяти мл среды при температуре 37°С. Посевная концент­
рация составляла 40-60 тыс, клеток на I мл ореды.В опытах, где
необходимо было обеспечить рост отдельных колоний, в среду до­
бавляли 30^ сыворотки; клетки культивировали в чашках Петри
диаметром 60 мы; оптимальное для роста клеток значение рН среды
(7.2-7.4) достигали с помощью сконструированной нами установки,
обеспечивающей соответствующую смесь воздуха и СОоВ качестве селективных агентов использовали 8-азагуанин
и 6-меркаптопурин чехословацкой фирмы " Che та pot". Результа­
ты предварительных опытов позволили выбрать следующие концентра­
ции аналогов: 30 мкг/мл 8-азагуашша и 15 мкг/мл 6-меркаптопурина.
При этих концентрациях доля резистентных клеток, присутствующих
в популяция, не превышала 10 . 0 количестверезистенънлл «ЧАСТОК судили по числу колоний, образующихся на 14-й день инкубации
100 тыс. клеток на чашку с селективным агентом при сменах среды
на 3-й, 7-й и 11-й день. Перед подсчетом колонии фиксировали
смесью Карнуа и окрашивали гематоксилином, приготовленным по
Манеру.' •
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Хромосомный набор клеток изучали н а метафазных пластинках.
Препараты готовили по обычной методике с праыененнеы колхицина
и г ш о т о н и ч е с к о г о раствора. Окрашивание производила однопроцент­
ным раствором орсеива. После установления модального класса в
100 клетках, пртшаддежаших к 'атому классу,.^^ проводили анализ
кариотипа. //./:/.-;;./:•:: -: .\
.;',-;. .":• <U;v-^' .--V/v;>\;; ;.^ ••«... -.?.''".''•••• •
Для определения темпа спонтанного мутирования использовали
первые 5 методов,рассмотренных в предыдущем разделе {метод
6 оказался неприменим в связи с наличием концентрационного
эффекта).
ЭКептМЕВТАЛШАЯ ЧАСТЬ И ОБСУМШИЕ
I. КОНЦИГГРАЦИОННЫЙ ЭФФЕКТ
Концентрационный аффект выражается в нарушении прямой
'
пропорциональной зависимости между количеством клеток,^переве­
денных в селективные условия, и числом выявляемых мутантов;
в случае увеличения численности клеток на культуральшЯ сооуд
выше определенного уровня мутанты теряют способность образовы­
вать колонии.; Концентрационный аффект имеет очень большое зна­
чение при любых исследованиях о использованием селективных
сред, так как он не /только вносит ошибку ори оценке числа му­
тантов, трансформантов или гибриден» но в отдельных, случаях
может привести к невозможности виявлвния соответствующих про­
цессов./:;^; \,-;У^, ;V"::i--h:\:^:;-.:ry. УУ У' :
:... Концентрационный эффект был обнаружен нами в эксперимен­
тах по определению частоты спонтанного возникновения мутаций
резистентности к 8-азагуанину и 6-меркаптопурину. Для его к о ­
личественной^ 1 характеристики были проведены специальные экспе­
рименты, в которых резистентные клетки выявляли и з различного
ч и с л а клеток исходной популяции ( от 5 т ы с . д о 1,2 млн.клеток
н а чашку) i Р е з у л ь т а т этих опытов приведены в табл.2.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 2
Количественная характеристика концентрационного
эффекта
Число посеян­
ных клеток на
чашку,
тис.
•'
'
5 • • • . • " '
10
50
100
200
400
1200
Относительное число резистентных
клеток, х Ю - 4
6-меркаптопурин
8-азагуанин
1,4
0,6
0,6
0,8
0,6
0,3
0,03
1.2
1.4
1.4
0,0
0,6
0,2
0,03
Как видно из этих данных, общей закономерностью при ис­
пользовании обоих селективнцх агентов является резкое уменьшение
относительного числа выявляемых' резистентных клеток с увеличе— ,"
нием инокулша свыше 200 тыс.клеток на чашку. Действительно,.
возрастание численности клеток от 5 тыс.до 200 тыс. на чашку,
т.е. в 40' раз, сопровондается лишь незначительным статистичес­
ким недостоверным (критерий "j(
) уменьшением выявляемого от­
носительного числа резистентных клеток, ;';альнейщее же увеличе­
ние числа клеток на часку (до 1,2 млн.) вызывает резкое (20-ти •.';'
кратное) снижение выживаемости резистентных клеток при исполь­
зовании обоих агентов (различие достоверно).
Концентрационный эффект в данном случае может быть связан
или с истощением питательной среды чувствительными клетками,
не сразу погибающими в селективных условиях, или с ее отравле­
нием какими-то токсическими для резистентных клеток веществами,
образующимися в результате нарушения метаболизма и гибели
ш
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
чувствительных клеток. Для того, чтобы установить, чем именно
обусловлен концентрационный аффект, были поставлены специальные
опыты с 6-ыеркаятояурином, Боли допустить, что резиотентные :;
клетки погибают под влиянием токсических веаеств, то разведение
селективной среды, взятой из чашек, в которых предварительно
в течение трех суток инкубировали по t млн. клеток исходной ^
популяции ("слив" с I ига.), свежей средой в 2,5 раза должно
довестя концентрацию этих веществ до уровня, который наблюдался
бы при посеве 400 тыс. клеток на чалку. Число выявляемых резис­
тентных клеток на такой разведенное среде, очевидно, должно ч
соответствовать их числу при использовании среды, взятой из .;
чашек, на которые предварительно было посеяно по 400 тыс.кле­
ток ("слив"с 400 тыс). Если же концентрационный аффект обус­
ловлен истощением питательной среды, то разбавление свежей
средой должно полностью снять эффект истощения, а тем самым к
концентрационный эффект.
В этих опытах при выявлении мутантов среду меняли на
протяжении всего времени эксперимента. Сливы при этом брали с
одних я тех же чашек, которые каждый раз заливали свежей селек­
тивной оредой. В табл.3 приведены усредненные результат трех
таких опытов. •.'••:'•'.••.••
• .' • • Таблица 3 ""•'•'
Выявляемое число резистентных х б~меряаятопурину
клеток при инкубация 100 тыс.клетои клона 237j на
сливах среда
Используемая среда
Слив с I млн.
Слив с I млн. разве­
денный в 2,5 раза
Слив с 400тыс.
Свежая среда
(контроль)
Число
чашек
Число
колоний
на чашку
Процент к
контролю
21
2,5+0.4
26.Р
24
24
5,9+0,4
5,%0,4
61,5
61,5
25
9,6+0,6
100,0
и
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Во всех опытах выявляеыое число резистентных клеток н а
разведенных сливах было значительно, ниже, чем в контроле, и не
отличалооь со статистической достоверностью от числа резистент­
ных клеток, выявляемых н а сливах о'-400 тыс. Это говорит 6 том,
что в основе концентрационного эффекта лежит действие какого-то
агента, токсичного д л я резистентных клеток,^
;
. Были проведены также аналогичные опыты, в которых клетки
высевали н а сливы (см.табл.З), но. инкубировали их без смен среда.
В атом случае разведение слива.с Г"млн. клеток н а чашку в 2,5
раза
свежей-средой доводит число резистентных колоний практи­
чески д о уровня контроля (89,4$ и 91,6$), что свидетельствует
об истощении питательной среды. Таким образом, было установлено,'
что при выявлении резистентных клеток в экспериментах без смен
среда концентрационный эффект определяется не только отравлением
среды, но и ее истощением по каким-то питательным веществам.
Появление в среде токсических,веществ, вызывающих гибель
резистентных клеток, связано, вероятно, с какими-то специфичес­
кими нарушениями метаболизма чувствительных клеток лишь в опре-.
деленных селективных.условиях. По-видиьюму, потеря жизнеспособ-"
ности резистентных клеток обусловлена веществами, которые обра- :•'..•-'.
зуются в чувствительных клетках из аналогов гуанина и которые : ;
в конечном итоге определяют их гибель. Очевидно, эти вещества
представляют собой кюноцуклеотиды, синтезируемые из 8-азагуанина
и 6-ыеркаптопурииа. Если такие "порченые" мононуклеотиды бу;\ут : ;;,.; •
использованы в метаболизме резистентных клеток, то это вызовет . 7 Ц >
снижение и х жизнеспособности, что и приведет к концентрационно-'...••. *-•
му эффекту.
/.... •!•-. •"•'•'.'.-•,•'
;•
п. МУТАЦИИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ.к 8-ЛЗАГ/ЛШШУ И G-MEFKA-•:.. .':
ПТОПУРИНУ И ЧАСТОТА'ИХ СПОИТАШЮГО ВОЗЛШЮВЕНИЛ
:;
//[Й'
1. Установление наедедствешой природы признака '••:-•
резистентности
Возникновение изучаемого признака монет бить обусловлено
не мутационеым"процессом, а адаптацией клеток к создаваемым
I селективным условиям. Поэтому первоочередная задача заключалась - .
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
с
I-
•
•.-.••
.-
••
• • • - : • • • :
' У :
-..,
..
•
%
в установлении наследственной (мутационной) природы резистентнос­
ти клеток китайского хомячка. Доказательством наследственного
характера данного признака служило его сохранение в раду поко­
лений при культивировании клеток в неселективкых условиях.
Клетки пятя клонов, резистентных к 8-азагуанину, г шести
клонов, резистентных к 6-меркаптоаурину, имевших независимое
происхождение, в течение 30-100 клеточных генераций культивиро­
вали без селективного агента. В качестве критериев наследствен­
ного характера резистентности использовали прирост клеток и
эффективность их посева после перевода на селективную среду.
Полученные данные показали, что устойчивость клеток к
аналогам гуанина является не следствием адаптации, а генети­
чески обусловленным признаком, возникающим благодаря мутациям.
2. Характеристика мутантных клонов независимого
происхождения
Характеристика выделенных мутантных клонов заключалась в
исследовании кариотипа клеток, в изучении перекрестной резистент­
ности мутантов к используемым аналогам и в установлении уровня
их резистентности.
Изучение кариотипов клонов, устойчивых к 8-азагуанину и в
6-меркаптопурину, показало, что возникновение признака резистент­
ности но "связано с каким-либо видимым изменением в хромосомном
наборе клетки. Из четырех клонов, резистентных к 8-азагуанину,
три клона имели кариотип, близкий к кариотипу исходного чувст­
вительного клона;четвертый клон был полиплоидным, т.е. резко
отличался как от исходного, так и от других резистентных клонов.
Шесть клонов, резистентных к 6-меркаптопурину, характеризовались
большей разнородностью кариотипов. В то ке время у них отсутст­
вовала какая-либо единая маркерная хромосома ( в одной группе
клонов маркером являлась телоцентричеокая хромосома, в другой субметацентрическая, и в одном клоне совсем не было маркерных
хромосом). Такой;результат кариологического анализа, несомненно,
является аргументом в пользу представления, что резистентность
обусловлена генной мутацией.
•
'
"
Г is
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
.
Для выявления перекрестной резистентности клетки клонов,
,;'• устойчивых к 8-азагуашшу, подвергали воздействию 6-меркаптоv
^tr/рива в концентрации 15 мкг/мл, и наоборот, клетки клонов,
резистентных к 6-меркаптопурину, испытывали на среде, содержа- щей 8-азагуанин в концентрации 30 мкг/мл. Перекрестная резис­
тентность была обнаружена во soex одиннадцати случаях. Это гово-^
рит об одинаковом механизме резистентности клеток испытанных
клонов к аналогам гуанина и, следовательно, о том, что резистент­
ность в данном случае, очевидно, не связана со специфическим .
нарушением проницаемости клеточной оболочки ( Fbittison
, JforL ,
1962; /hieг
ion
,1962), а определяется потерей активности.
пнрофосфорилазц инозиновой и гуаниловой кислот. Такой вывод подт­
верждается также и тем, что клетки, резистентные к 6-мернаптопурину, не способны включать экзогенный гипоксантин. Об этом свиде­
тельствует не Только факт их гибели на среде, содержащей амкноптерин, гипоксавтин, тимидин и глицин, во и результаты прямых
экспериментов, проведенных в нашей лаборатории (Е.В.Моисеенко, '
Л.Г.Толстых). Вило показано, что клетки китайского хомячка, ре­
зистентные к 6-меркаптопурину, практически не включают в ДНК
гипоксавтин, меченый
Изучение устойчивости клеток мутантпых клонов к повышенным,
концентрациям селективных агентов показало, что жизнеспособность ,_
клеток уменьшается с увеличением концентрации агента. Однако
это снижение у разных клонов различно. У клонов, резистентных к
30 мкг/мл 8-азагуашша, при концентрации аналога140 мкг/мл
выживаемость клеток колеблется от 20 до 74J2. Для клонов, ре­
зистентных к 15 мкг/мл 6-ыеркаптопурина, при концентрации
/140 мкг/мл минимальная жизнеспособность клеток составляет 4#, :
а максимальная - 63/2. Таким образом, разные клоны имеют неодина. • коаый уровень устойчивости к соответствующим селективный агентам,
-что, очевидно, связано с разными уровнями активности пирофосфори­
лазы инозиновой и гуаниловой кислот {Ul£icef£e£ci
, 1963, .
1964; СЛи: \и др., 1969). Вероятно, отдельные мутации приво; дат к различному снижению активности фермента. В то же время,
Еыея ,з заду большую генетическую гетерогенность популяции кле­
ток»-нельзя исключить и ьюдафлцпруиаего влияния разных гено—
. тисов, ва^цроявление мутаций. .
**
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Изучаемые мутации по своему проявлению в клетках 'in ri'i*o,
очевидно, можно рассматривать как доминантные. Забегая вперед,
следует отметить, что частота их спонтанного возникновения ока- :
залась достаточно сходной не только с темпами, установленными
для различных мутаций в соматических клетках млекопитающих
Lr> г Иго , но и с частотой спонтанного возникновения многих
доминантных аутосомных мутаций и рецессивных мутаций, сцепленных
с полом, в терминальных клетках человека (Штерн, 1965). С анало­
гичной частотой возникает также мутации резистентности к 8-азагув>
нину в клетках диплоидной линии, полученной из эмбрионального ,-;'
легкого человека, и в анеуплоидных клетках того же происхождения
(Маршак, Варшавер, 1970). Возражением против предположения о
доминантности изучаемых мутаций является то, что они связаны о
инактивацией определенного фермента, а потеря активности фермен­
та, как правило, вызывается рецессивной мутацией. Однако можно
допустить, что изучаемая резистентность возникает в результате
доминантной мутации, но не структурного, а регуляторното гена '
{SfioiOS
, ftuc{c{(k. ,1968). С другой стороны вполне вероятно,
что данная мутация у китайского хомячка, как и у человека
( £eecjnvi£foL
и др., 1967; %)алс'4
и др., 1969), ре­
цессивна и локализована в половой хромосоме. При этом она будет
проявляться по типу доминантной при условии, что культура полу­
чена от самца. Бели же она получена от самки, то такое.проявле­
ние рецессивной мутации-'можно ожидать в случае инактивации одной
из половых хромосом ( /Mt'oenr/7
и др., 1968; 3e£c.j?
t
8)е Мал*
, 1969). Изложенные гипотезы представляются
нам в настоящее время наиболее вероятными.
3. Доказательство спонтанного характера
возникновения мутаций
Для доказательства того, что данный признак возникает бла­
годаря спонтанным мутациям, а не индуцируется используемыми
селективными агентами, был использован флготуационный тест
( ^utla
, Q)e£fzuck
, 1943). Схема такого эксперимента
представлена на рис.1.
« J
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
KDHTPDAb
'
ВвШНИЕ
-
, OOOO-O
-
' - —
V
0 6 6 6 - 6J
'
»
!
ПОШЕТ КОЛОНИИ
х
V
•
—'
ПОАЖи<0ЛОННЙ
Рво.1. Схема эксперимента по доказательству спонтанного воэ-:
някновення нутаций резистентности в 8-азагуашгау и
6-мернаптопуриву в клетках китайского хомячка
urvttto':
СА г селективный агент. Цифры в кружках обозначают
число клеток на чашку.
-^
;:
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Результаты проведенных по этой схеме экспериментов поз­
воляла сопоставить распределение чисел резистентных колонии в
пробах, взятых из исходной популяции клеток и из независимо вы­
ращенных культур. Отсутствие различий в характере распределе­
ния мутантов свидетельствовало бы о том, что мутации возникают
не спонтанно, а под влиянием используемых селективных агентов.
Однако величина относительной ошибки (т.е. отношение среднего
квадратичного отклонения к среднему числу мутантов на пробу) в .
опытных сериях во всех случаях оказалась выше, чем в контроль­
ных. Это говорит о большей вариабильности числа резистентных
колоний в культурах опытных серий по сравнению с контрольными
и, следовательно, о том, что в ходе эксперимента происходило
спонтанное возникновение мутаций.
4. Определение темпа спонтанного мутирования
Для оценки темпа спонтанного мутирования методами 1-3
(см.табл.I) были использованы данные по числу резистентных коло­
ний в пробах, взятых из независимо выращенных культур (см.рио.1,
опыт). Результаты этих экспериментов представлены в табл.4.
Таблица 4
Частота спонтанного возникновения мутаций резистентности
к гт^алогам гуанина на клетку за время одной генерации,
х 10,-5
метод
оценки
темпа
Селективный агент
8-азагуанин (30 мкг/мл)
оп.Г
i
2
3
4
5
0,6
0,4
0,4
оп.2
средняя
0,8
0,4
0,9
0.7
0,4
0,65
6-меркаптопурин (15 мкг/мл)
оп.1
оп.2 ,
средняя
2,3
1.4
1.0
2.4
2,2
1.6
1.6
4.0
2,25
1,5
1.3
3,2
1.7
I p t p « b a M к ,, ,,.,,„ Глумив I.
IKMSMCKOS ч«.
.•г.х^Ылва.Ь
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Определение темпа мутирования методом I ( ^uzt'a
,
и:Л1Юе^гс/с^
, 1943) основано на наличии связи среднего числа
^образовавшихся в ходе эксперимента мутантов на культуру со сред. виы числом возникших мутаций.1 В основе определения темпа методом
'"2 { Хеа
, СФЦ£З*>Л
, 1949) лежит наличие связи между
:;;';медианой"ранжированного ряда, составляемого из чисел мутантов,
:, которые присутствуют в момент окончания эксперимента в каждой
,-.хз независимо выращенных культур, я средним числом мутаций на
;), культуру. При использовании метода 3 ( JVedeomie
; I948)
'темп мутирования вычисляют, исходя из количества мутантов, прои:
'%зошедвшх от самой первой мутации в оерия независимо выращенных; •-,.-..
.•••'..культур»
. -Д-
Л',; - ; Значения темпа, вычисленные этими тремя методами, оказались
>;;; очень близкими как при использовании в качестве селективного
,/:j агента 8-азагуанина, так и при использовании 6-меркаптопурипа
.4 ~ (см.табл.4), Приведенные цифры указывают на несколько большую
'частоту спонтанного возникновения мутаций резистентности к
; 6-^«еркаптопурину, чем к &-азагуашшу.
I
^'.
Частота возникновения мутаций резистентности к бниерналто.пурину била, кроме того, определена методами 4 и 5 (см.табл.4).
•-:
Метод 4 ( Xsttt'a
, %е£бтис£
, 1943) основан на том,!
•''•'.;. что при одинаковых скоростях размножения и вероятностях гибели
v мутантов и клеток исходной популяции спонтанный мутагенез опре..; деляет линейный характер увеличения доли мутантов, присутствуюfJ-BtHX в популяции, в зависимости от числа прошедших генераций.
'•'IV Поэтому настоящий метод (см.табл.1) мог быть применен лишь в
<£ скучав»,есян соотношение скоростей размножения и вероятностей
[^гибели аутантов не отличается от соответствующих характеристик
'клеток исходной популяции. Результаты специальных экспериментов
У;',показали, что эти клетки но данным показателям существенно не
y~i различаются.
\v|v%
.Ф 11 определении темпа мутирования этим методом, число
>^|П)6шадиах генераций устанавливали, исходя из начального и конеч­
ного .адсла клеток в каждом пассаже. Частота возникновегайЦмута?гга,аычиоленная на основании увеличения доли мутантов в теч«Ш»».>.\,_
"одной велели, оказалась равной 2,4 х I0"5 , а в течение трех
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
недель - 3,3 х 10~° мутаций на клетку за время одной генерации.
Полученные значения темпа практически не различаются и тем са­
мым показывает, что в ходе данных экспериментов имела место ли­
нейная зависимость возрастания доли мутантов от числа прошедших
клеточных генераций.
Определение темпа методом 5 (Sctftt'a
, 'ftegStuck ,
1943) основано на том, что мутации, будучи событиями редкими,
распределяется в серии независимо выращенных культур согласно
закону Пуассона. Это позволяет вычислить среднее число мутаций
на культуру по доле культур, в которых не произошло ни одной
мутации (см.табл.I).
Схема постановки такого опыта аналогична схеме эксперимен- .
та, использовавшейся для доказательства спонтанного характера
возникновения мутаций (см.рис.1). Воздействию селективного
агента были подвергнуты не пробы, как в предыдущих опытах, а
все клетки, чтобы с большей надежностью выявить лишь те.культу­
ры, в которых не произошло ни одной мутации. Из 36 независимо
выращенных культур 6 культур не содержали резистентных клеток.
В соответствии с этим темп спонтанного мутирования оказался рав­
ным 1,7 х 10 мутаций на клетку за время одной генерации. ;
Поскольку на определяемую величину мутационного темпа при
использовании любого метода оказывали влияние такие факторы,
как концентрационный эффект, способность клеток к формированию
колоний "(т.е. эффективность их посева) и остаточный рост, к
установленным значениям темпов следовало внести соответствующие
поправки.. Концентрационный эффект при посеве 100 тыс.клеток на i
чашку проявляется в относительно небольшой степени (см.табл.2).
Анализ всех имеющихся экспериментальных данных показал, что при
этой численности клеток примерно 50% присутствующих среди них
мутантов оказываются невыявлешшми. Значения темпов мутирования,
приведенные в табл.4, даны с учетом этой поправки. Эффективность
посева клеток по многочисленным опытам составляет в среднем
около 70^ и, следовательно, приводит лишь к незначительному
'•'занижению темпов. В то же время имеет место некоторое завышение
темпов за счет возникновения мутаций в период остаточного роста
клеток. Поэтому, имея в виду, что эффективность посева и
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
остаточный poor оказывали.небольшое и противоположно направ­
ленное влияние, можно было не вносить дополнительных поправок к
"установленным значениям темпов.
Нужно остановиться еще на двух факторах, которые в отдельных
случаях могли занизить темпы мутирования: на возможности замед­
ленного размножения только что возникших резистентных клеток
и на задержке фенотипического проявления мутаций. Близость значений частоты возникновения мутаций резистентности к 6-меркап~
топурину, установленных методами 2 и 5 (см.табл.I), говорит об
отсутствия различий в скоростях размножения вновь возникших
мутантов и клеток исходной популяции. Что касается задержки
фенотипического проявления нутаций, то она, очевидно,имела место.
Об этом свидетельствует тот фактi что темп мутирования, опреде­
ленный методом 4, оказался выше темпа, установленного методом 5
(см.табя.1 и 4)..Ейчаслениевеличины задержки фенотипического
проявления мутаций резистентности к 6-меркалтопурину на основа­
нии значений тейпов, определенных этими методами, показало, что !.
она равна одной клеточной генерации. Аналогичные результаты были
получены в наших экспериментах и по индуцированному мутагенезу.
- Било доказано,-что задержка фенотипического проявления мутаций
резистентности к 6-меркалтопурину, индуцировшшых рентгеновски-,
ми лучами и Ж- нитрозометилмочевнной, действительно имеет
место и что величина этой задержки не превышает двух клеточных
генераций (шадиро и др.,1970 ) . Таким образом, приведенные в
табл.4 значения1 темпов мутирования,' -установленные методами 1,2, и
5, очевидно; несколько занижены из-за задержки фенотипического/'•
:. проявления мутаций. .'•'"•,•••:
Рассматривая данные по'частоте спонтанного возникновения
.мутаций (см.табл.4),следует отметить большое сходство в зна­
чениях темпов,' установленных'разными методами при использовании
каждого из аналогов. Однако; анализируя все экспериментальные
данные с учетом особенностей каждого метода и влияния различ­
ных факторов, которые занижаютили завышают.определяемый темп,;.
"можно сказать, что наиболее точные значения темпов дали методы
• 2 и 5, Существенно также, что использование этих методов поз"•.'' волило зачислить доверительные грашэды установленных значений
темпов мутирования. Оказалось, что частота возникновения му- ;
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
тадия резисмнтностн к 8-азагуаяину с достоверность» 0,95 не
превышает 0,8 х 10~ 5 , а в 6-меркаптопурину - 2,2х10П5 мутаций
на клетку за время одной генерации.
В Ы В О Д Ы
1. Проведен теоретический анализ различных методов оценки
темпа спонтанного мутированна и влияния ряда факторов на значе­
ние определяемого темна. Анализ показал целесообразность одно­
временного использования разных методов определения темпа, что
не только повышает достоверность полученных данных, но и поз­
воляет выявить некоторые существенные особенности мутагенеза.
2. Установлена наследственная (мутационная) природа резис­
тентности клеток китайского хомячка In i/ll-to.., к аналогам
гуанина - к 8-азагуашшу (30 мкг/мл) и к 6-меркаптодурину
( 15 мкг/мл). Частота спонтанного возникновения мутаций резис­
тентности к 8-азагуанину составляет. 0,4x10""° , а к 6-меркаптопури­
ну - 1,6 х Ю ~ 5 на клетку за время одной генерации.
3. Выявлена линейная зависимость увеличения доли резистент­
ных к 6-меркаптопурину мутантов, Щ)исутствувдих в исследуемой
популяции, от длительности эксперимента. Это показывает,,что час­
тота спонтанного возникновения мутаций в расчете на клетку за
время одной генерации еать величина постоянная. ...;;.,
4. Установлено существование задерхки фенотнпйческого пров­
идения мутаций резистентности к 6-меркаптопурину, величина ко­
торой не превышает 1-2 клеточных генераций.
5. Обнаружен резко выраженный концентрационный аффект при
числешюстях клеток исходной популяции, превышающих (2-4) х 10 s
на чашку. Показано, что этот эффект -может определяться как
токсическими веществами, образуодишся в результате нарушения
метаболизма и гибели чувствительных клеток в селективных условиях,
так к истощением питательной среды за счет переживания г частич­
ного размножения чувствительных клеток на селективной среде.
21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6. Ввделены клоновне линия независимого происхождения,
резистентные к 8-азагуанину и 6-меркаптопурину. Анализ этих
клонов показал: I) отсутствие связи мезду возникновением рези­
стентности и какими-либо видимыми изменениями кариотшт клеток;
2) наличие перекрестной устойчивости клеток к 8-азагуанину и
к 6-меркаптопурину; 3) существование.мутантных клеток с различ­
ными уровнями резистентности.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО Т Ш Е ДИССЕРТАЦИИ
1. Н.Б.Вартавер, О.Н.Петрова, А.Е.Хализев, Н.И.Шапиро.
Изучение биохимических мутация в клетках человека и млеко­
питающих 1/7 fi.£to
••.-'•. Труды конференции радиобиологи­
ческого отдела Института атомной анергии им. И.В.Курчатова.
• Структура, свойства я генетические функции ДНК, Москва/ 1966г,
; СТр.403. '•/ i -\ •
2. А.Е.Хйлизев. Контроль режима рН питательной среда цри культированни клеток млекопитающих. Вопросы вирусологии, * 5,
610 (1966).
3. А.Е.Хализев, О.Н.Патрова, Н.И.Шапиро. Токсическое действие
продуктов распада клеток шекопиташкх. ( К использованию
селективных сред в работах по генетике соматических клеток
млекопитающих . In
ritzo
) . Генетика, * 13, IB (I966). ,
4. Н.И.Шапиро, О.Н.Петрова, А.Е.Хаяизев. Анализ частоты воз­
никновения нутаций резистентности к аналогам пуриновнх ос­
нований в культуре.клеток млекопитатвдих. Труды конференции
.-•"*, Вадпобиологическозх) отдела Института атомной энергии
; вы.И;В.Курчатова«'Структура, свойства и генетические функции
•iy. ДНК. Москва, 1 X 6 г., стр.359.
5. Н.И.Шахщро,0.И.11етрова, А.Е.Хализев. Изучение темпа спон/ тайного мутирования в' культуре клеток млекопитающих.
, Генетика, Л 12, 5 (1966).
зз
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6. О.Н.Петрова, А.Е.Хализев, Г.А.Григорьева, Н.И.Шапиро,
Изучение мутаций резистентности к аналогам пуриновых осно­
ваний в клетках млекопитающих t» rHio
. Генетика, * I,
74 (1967).
7. N.I.Shapiro, O.N.Petrova, A.B.Khalizev. Studies of spontas*-f
ous and. induced mutagenesis in cultured mammalian cells. Proc.
XII Internet.Congress of Genetics, Tofcyo, Japan, _1, p.98,
N5.7.9, 1968.
8. А.Е.Хализев. К использованию методов оценки темпа спонтан­
ного мутирования при изучении соматических клеток млеко­
питающих. Генетика,2, » 3, 157 (1969).
9. А.Е.Хализев, О.Н.Пегрова, Е.В.Лусс, Н.Б.Варшавер, Н.И.Шапиро.
Изучение концентрационного эффекта в культуре клеток млеко­
питающих. Генетика, У, й I, 58 (1969).
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
3
Размер файла
661 Кб
Теги
702
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа