close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

515

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
id5
АКАДЕМИЯ
НАУК С С С Р
Институт биологической физики
Г. А. ДВОРКИН
ОПТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
И НУКЛЕОПРОТЕИДОВ В РАСТВОРЕ
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических паук
СГ
ЛЮСКВА 1964 г.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
nuC-H1 »
\Cli ttA-
liaic^uu
fc- v
C
d
r\
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
А К А Д ЕМИ Я Н А У К С С С Р
Институт биологической физики
Г. Л. ДВОРКИН
ОПТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
И НУКЛЕОПРОТЕИДОВ В РАСТВОРЕ
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
C t C T W r t »t>*. Делим С*лъхез.
Ь Ц. A. Tm
Л*
ж
МОСКВА 1964 г.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Защита диссертации состоится в институте биологической фи­
зики Академии наук СССР (г. Л\осква, Профсоюзная ул. д. 7).
С JL^J,
Автореферат разослан
'
•
•
.
-
•
,
-
.
•
'
/2^Г->.
\
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В последние годы в связи с быстрым развитием молекулярной
биологии особенно возросло значение исследований строения и
свойств важнейших биополимеров — белков и нуклеиновых кис­
лот. О строении этих макромолекул мы имеем представление глав­
ным образом по данным рентгеноструктурного анализа, который
является единственным методом полного изучения трехмерной
структуры макромолекул. К сожалению, этот метод не применим
к изучению макромолекулярных структур в растворе. В то же вре­
мя нзз'ченне строения биополимеров в растворе является весьма
важным. Во-первых, многие макромолекулярные вещества вообще
не кристаллизуются или плохо кристаллизуются, так что метол,
рентгеноструктурного анализа не может быть применим к этим
веществам. В тех случаях, когда рентгеноструктурнын анализ воз­
можен, исследование строения биополимеров в растворе необходи­
мо для того, чтобы выяснить, сохраняется ли и растворе конфигу­
рация макромолекул, характерная для твердого состояния. Кро­
ме того, физические методы исследования макромолекул в раство­
ре часто являются единственным источником сведений о молеку­
лярных весах, о распределении макромолекул по молекулярным
весам, их жесткости и др. При исследовании разбавленных раст­
воров анализ строения и свойств макромолекул не осложняется их
взаимодействием. Водные растворы являются естественной средой,
» которой осуществляется функция биополимеров. В растворе
можно легко изменять условия среды и изучать кинетику и харак­
тер физико-химических превращении исследуемых веществ.
Однако исследование конформацнп и свойств макромолекул в
растворе встречается с рядом трудностей. Как правило, исследова­
ние свойств макромолекул в растворе требует ряда предположе­
нии, экстрополяцип и т. д., законность которых должна быть уста­
новлена при помощи других, независимых экспериментов. Таким
образом, свойства макромолекул в растворе могут быть установ­
лены, как правило, только путем сравнения данных, полученных:
разными методами.
Особенность методов исследования конфигурации макромоле­
кул в растворе в значительной мере обусловлена характером изу­
чаемых объектов. Поскольку в работе изучались молекулы нуклеи­
новых кислот и нуклеопротепдоп, рассмотрение будет относиться
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
именно к этим объектам. Применение методов физического анали­
за молекулярного веса, формы, конфигурации и размеров макро­
молекул в растворе во многих случаях ограничивается отсутст­
вием адекватных теории для столь больших молекул, необходи­
мостью принятия заранее некоторой модели макромолекулярпой
конфигурации, а также трудностями измерения тех или иных фи­
зических величии в разбавленных растворах, при отсутствии взаи­
модействия между макромолекулами.
Последнее условие представляет особые требования к чувстви­
тельности применяемых методов н сильно ограничивает примене­
ние ряда важных физических методов исследования, таких как
седиментация, светорассеяние, поляриметрия, особенно в области
полос поглощения и др.
В работе предпринята попытка преодолении этих трудностей и
проведено экспериментальное изучение физико-химических и опти­
ческих характеристик и конформацпонных превращений нуклеи­
новых кислот и нуклеопротепдов в растворе. Наряду с широко
прнменямымп методами, использовались аномальная дисперсия
оптического вращения нуклеиновых кислот в области полос погло­
щения, а также электрооптпческне методы, разработанные нами
применительно к изучению биополимеров. Указанные методы под­
робно рассмотрены, включая описание аппаратуры и техники изме­
рений.
Объектами исследования служили Д Н К и Р Н К (вирусная,
рпбосомная и транспортная) из разных источников, дезоксирибонуклеопротеид из зобной железы теленка, вирус табачной мозаи­
ки, различные фракции рибосом из Escherichia coli, а также нуклеотиды и апуриновые и апирпмпдиновые нуклеиновые кислоты.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Методы измерения
Измерения вязкости растворов нуклеиновых кислот мы прово­
дили обычно в капиллярных вискозиметрах различной конструк­
ции.
Для измерения вязкости растворов Р Н К употреблялся обычный
вискозиметр Оствальда. Для изучения Д Н К применялся многоша­
риковый низкоградиентный вискозиметр с градиентами скорости
течения воды при 25°С, равными 30, 40 и 50 с е к - 1 . При работе с
изолированными от воздуха растворами ДНК, в атмосфере раз­
личных газов был изготовлен специальный капиллярный вискози­
метр. Нижний конец капилляра этого вискозиметра погружался в
сосуд с исследуемой жидкостью. Весь прибор помещался в водя­
ной термостат, питаемый от ультратермостата. Этот прибор, по­
мимо возможности работы в замкнутой атмосфере различных! га­
зов, позволяет легко производить операции с исследуемым раство­
ром (его титрование, разбавление, производить добавки к нему
и т. п.). Время от времени могут отбираться пробы для определе4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нпи вязкости, которые затем, мосле.измерения вязкости, вновь
возвращаются в раствор.
Измерение вязкости растворов Д Н К проводилось при ионной
силе раствора ц^-0,2 и концентрациях 0,002% для Д Н К из зобной
железы и 0,0007% для фаговой ДНК. Растворы Р Н К при исследо­
вании вязкости использовались в концентрации 0,3%. н различ­
ных ионных силах раствора (0,1—0,001). Молекулярный вес
тканевой ДНК. мы определяли по формуле Доти и др. (1958).
[п,] = 1,45" Ю~6М1,12 ^ где [п.] -— характеристическая вязкость раст­
вора.
Седнментационный анализ проводили при помощи аналитиче­
ской ультрацентрнфуги Сппнко, модель Е. В опытах с Д Н К и
Д Н И оптическая регистрация подвижной границы осуществлялась
с помощью абсорбционного метода путем
фотографирования
раствора в ультрафиолетовом свете на фотопластинку п последую­
щего ее фотометрнрованпя. При исследовании Р Н К и рибосом ре­
гистрация подвижной границы производилась по методу Фильпста-Свенсона с наклонной струной. Седнментационные коэффи­
циенты рассчитывали из результатов компарированпя негативов и
приводили к стандартным условиям S^o.w (20°, вода).
Поглощение света растворами нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов измеряли на спектрофотометре СФ-4. При снятии за­
висимости поглощения от температуры использовались кюветы с
термостатированном.
Другие оптические методы исследования — дисперсия оптиче­
ского вращения, двойное лучепреломление н дихроизм растворов в
электрическом поле описаны ниже в соответствующих разделах.
ИССЛЕДОВАНИЕ ДИСПЕРСИИ ОПТИЧЕСКОГО ВРАЩЕНИЯ
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ
Измерения оптического вращения нуклеиновых кислот произ­
водились на специально изготовленном фотоэлектрическом спектрополярпметре.
Анализ факторов, определяющих чувствительность приборов
этого типа показывает, что с уменьшением интенсивности света,
попадающего на приемник, резко падает чувствительность прибо­
ра, особенно при малых, абсолютных значениях углов вращения
плоскости поляризации. Это создает большие трудности для иссле­
дования дисперсии оптического вращения в области поглощения.
Измерение оптического вращения нуклеиновых кислот в обла­
сти поглощения является особенно трудной задачей. Трудности
связаны с весьма сильным поглощением в области 260 ммк при
относительно малых абсолютных значениях углов вращения раст­
воров, имеющих оптическую плотность порядка 1,0. Ни один из
выпускаемых до последнего времени отечественных н зарубежных
5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
поляриметров без специальной переделки не справляется с этой
задачей.
Описанный нами прибор позволяет производить подобные из­
мерения благодаря использованию мощного источника света, узко­
полосного усиления и чувствительной системы регистрации.
а) Описание прибора и метода измерений
Свет от источника (ксспоновая лампа ДК.СШ-1000) проходит
через монохроматор, поляризатор, кювету модуляторного блока
(ячейку Фарадея), исследуемый образец и анализатор и падает
на фотоумножитель. Если частота модуляции в катушке (в ячей­
ке Фарадея) f, и поляризатор и анализатор скрещены, то при от­
сутствии оптически активного образца на фотоумножитель будет
попадать свет, модулированный удвоенной частотой 2 f. При на­
личии вращения в исследуемом образце появляется сигнал разба­
ланса с частотой f, причем фаза этого сигнала зависит от знака
поворота плоскости поляризации образцом, а величина сигнала —
от величины поворота. Для выделения сигнала разбаланса приме­
нен узкополосный усилитель, настроенный на частоту модуля­
ции f. Сигнал с резонансного усилителя поступает через дополни­
тельный усилитель на следящую систему, а также на фазовый де­
тектор. Напряжение с задающего генератора модуляторного
устройства (опорное напряжение) также подается на фазовый де­
тектор, где оно сравнивается по фазе с напряжением, поступаю­
щим с резонансного усилителя. Результат сравнения фаз регистри­
руется визуально микроамперметром. Угол поворота определяется
по компенсации разбаланса, вносимого исследуемым объектом.
Эта компенсация достигается вращением анализатора.
В приборе предусмотрена возможность автоматической записи
дисперсии оптического вращения. Для этого на самописец ЭПП-09
подается напряжение от потенциометрического датчика угла, свя­
занного механически с вращающимся от следящей системы анали­
затором. Следящая система все время поддерживает анализатор
в положении, при котором отсутствует сигнал разбаланса с часто­
той f. Одновременно от специального привода вращается шкала
длин волн монохроматора, и механизм меток выдает отметки длин
волн на самописец.
При работе с образцами, обладающими большой оптической
плотностью, целесообразно уравнивать интенсивность света, па­
дающего на фотоумножитель, и его спектральный состав при срав­
нительных измерениях образца и бланка (например, раствора и
растворителя). С этой целью, при снятии нулевого отсчета (бланк)
кювета с исследуемым образцом (раствор), устанавливается перед
поляризатором. Таким образом, свет всегда проходит через раст­
вор и растворитель, и селективное поглощение света раствором не
изменяет интенсивность света, падающего на фотоумножитель при
измерении бланка.
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Связь оптического вращения с конфигурационными превраще­
ниями нуклеиновых кислот исследовалась в ряде работ. При этом
обычно измерялась естественная оптическая активность к видимой
области спектра. Дисперсия оптического вращения нуклеиновых
кислот в ближнем ультрафиолете (в области максимума поглоще­
ния) впервые недавно описана лишь в двух сообщениях Фреско
и др. (1961). В этих работах наблюдалась аномальная дисперсия
вращения и отмечалась возможность использования аномальной
дисперсии вращения в области поглощения — «эффекта Коттона»
(по терминологии Джерассп (1962) -— для исследования нуклеи­
новых кислот. Из указанных сообщений видно, что абсолютные
величины вращения плоскости поляризации и различия в оптиче­
ской активности между нативнымн и денатурированными нуклеи­
новыми кислотами в ультрафиолетовой области выражены силь­
нее, чем в видимой части спектра. Однако приведенные авторами
условия измерений заставляют предполагать, что в ультрафиоле­
товой области дисперсия оптического вращения снята неверно,
что и было установлено в наших опытах.
Объектами исследования служили Д Н К из бактериофага Т2 и
зобной железы .теленка, Р Н К из вируса табачной мозаики, транс­
портная РНК, апуриновая и апирпмидпновая Д Н К и различные
пуклеотнды. Измерения проводились с нетермостатированной кю­
ветой длиной 3 см и 5,6 см при комнатной температуре. Концентра­
ция нуклеиновых кислот выбиралась так, чтобы пропускание света
раствором было не менее 16%.
При измерениях дисперсии оптической активности в области
полос поглощения, при длинах воли 210—300 ммк, использовались
растворы с концентрацией 0,001—0,003%, а в области, далекой
от поглощения, при Х=285—350 ммк — вчетверо большие концент­
рации (0,004—0,01%)- Растворителем для ДНК. служили 0,14 М
NaCl -t-0,015 М цитрат натрия, рН 7,0 и 0,001 М NaCl +0,0015 А\
цитрат натрия, рН 7,0. Р Н К исследовалась в различных раствори­
телях: 0,14 М N a C l + 0,015 М цитрат натрия, деионнзованная води
2% раствор формалина. Использовался также раствор цетплтриметиламмониевой солиТ- Р Н К в метаноле. Растворителями для
нуклеотпдов были 0,14 М NaCl + 0,015 М цитрат натрия рН 7,0 и
0,15 М цитратный буфер, рН 7,0. Точность, с какой обеспечивалось
измерение оптической активности в области, далекой от поглоще­
ния, составляла 4"f а наблюдаемое вращение для большинства
препаратов составляет Г—5'. Таким образом, относительная ошиб­
ка измерения равна 2—8%. В области поглощения точность изме­
рений составляла 8", а относительная ошибка — 10—15%. Изме­
рения в области 360—555 ммк производились через 40 ммк, в
области 310—350 ммк — через 10 ммк, а в области полос погло­
щения — через 2 ммк.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
б) Результаты и обсуждение
Дисперсия оптической активности Д Н К в области 350—550 ммк
находится в полном согласии с литературными данными (Фреско)
и следует одночленному уравнению Друде, >с = 2 4 0 ммк. Диспер­
сия оптического вращения в области поглощения (240—300 ммк)
является аномальной и характеризуется положительным эффектом
Коттона с экстремумами при 290 ммк (максимум) и 260 ммк (ми­
нимум) и средней точкой 275 ммк. При этом удельное вращение
для тнмусной и фаговой Д Н К в экстремумах составляло, соответ­
ственно [а] 2 9о=+2200° и +1800°, [a]2fi0 = — 1500° и — 1700°. Эти дан­
ные были позднее подтверждены в работах Янга и др. (1963, 1964).
При денатурации Д Н К кривые аномальной дисперсии сдвигаются
на 5 ммк в красную область и амплитуда эффекта Коттона умень­
шается. При этом в максимуме при295ммк [а] = 900°, а в минимуме
при 265 ммк [а] = —800°. Дисперсия оптического вращения Р Н К
(вирусной и транспортной) п области 310—350 ммк, как и Д Н К ,
следует одночленному уравнению Друде, %с =265 ммк. В области
поглощения выявляется положительный эффект Коттона с мак­
симумом при 280 ммк, минимумом при 245 ммк и средней точкой
270 ммк. При этом [а]28с = 3800° и [a]245 = —3400°. Эти данные так­
же были позднее подтверждены работами Янга и сотр. При раст­
ворении Р Н К в деионизованной воде и 2% формалине ( Р Н К пред­
варительно нагревается в присутствии формалина и затем охлаж­
дается до комнатной температуры) максимум смещается к 285—
290 ммк п падает удельное вращение. Раствор цетавлоновой со­
ли т — Р Н К в метаноле, как известно, полностью лишенной вто­
ричной структуры, обладает ничтожной оптической активностью.
Для исследования происхождения аномальной дисперсии опти­
ческого вращения нуклеиновых; кислот, наряду с последними, изу­
чалась дисперсия оптического вращения нуклеотидов, а также
оптическая активность специально полученных Д Н К , не содержа­
щей пуринов (апуршювой кислоты — АПУК) и Д Н К , лишенной
ппримидинов (апиримидиновой кислоты — А П И К ) .
Пуриновые нуклеотнды в области, далекой от поглощения, ха­
рактеризуются отрицательным, а пиримпдиновые нуклеотиды —
положительным вращением плоскости поляризации света. В види­
мой области нуклеотиды в эквимолекулярных соотношениях при­
близительно компенсируют друг друга. Однако при переходе в
ультрафиолетовую часть спектра компенсации уже нет.
Все кривые дисперсии оптического вращения нуклеотидов в
области выше 300 ммк подчинаяются одночленной формуле Друде,
т. е. спрямляемы в координатах %2а — а. Это указывает на то, что
оптическая активность нуклеотидов в этой области связана с
одним электронным переходом в основаниях, которые становятся
асимметричными под влиянием углеводного компонента нуклеоти­
дов. Величина Хс для ппримидиновых нуклеотидов равна 280—
290 ммк, а для пуриновых нуклеотидов — 230—240 ммк. Эти зна8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
чения кс соответствуют положению аномальной дисперсии для
указанных нуклеотидов. Пнрпмидиновые нуклеотиды в области по_
лосы поглощения дают эффекты Коттона, которые по величине и
положению сходны с аналогичным эффектом для Д Н К : максимум
при 290 ммк, а минимум при 2G0 ммк. В то же время дисперсия
оптического вращения пурпновых нуклеотидов остается монотон­
ной до 280 ммк. Поэтому уже прстая сумма эффектов от равных
количеств нуклеотидов должна давать положительный
эффект
Коттона в области 280 ммк. Апуриновая кислота в области, дале­
кой от поглощения, обладает положительным вращением, а кривая
дисперсии вращения спрямляется по Друде с кс = 2 7 5 ммк. Что
касается вращения апиримпдиновой кислоты, то ее удельное вра­
щение положительно н очень невелико ([а]зоо= +200°) и кс близка
к 230 ммк. В области поглощения апуриновая кислота давала по­
ложительный эффект Коттона с максимумом при 290 ммк, мини­
мумом при 260 ммк и средней точкой при 275 ммк, т. е. положение
эффекта, как в случае Д Н К .
Таким образом, все исследованные соединения, имеющие в сво­
ем составе ппримидпновые нуклеотиды характеризуются сходными
кривыми аномальной дисперсии оптической активности со средпен точкой 275 ммк. Вещества, не содержащие ииримидпновых
нуклеотидов (пуриновые нуклеотиды, апиримпдиновая Д Н К ) не
дают эффектов Коттона. При сравнении оптической активности
нуклеотидов видно, что вращение цитидиловой кислоты (ЦМФ)
значительно превышает сумму эффектов от эквимолекулярных ко­
личеств всех - остальных нуклеотидов. Поэтому раствор, содер­
жащий равное количество всех нуклеотидов, дает максимум вра­
щения при 2У0 ммк. Приведенные факты позволяют предполагать,
что эффект Коттона с максимумом при 290 ммк связан с оптиче­
ской активностью цитидиловой кислоты. Именно в области наблю­
даемого эффекта Коттона (280 ммк) имеется п — л* — переход в
молекуле цптозина. По-видимому, этот переход оптически активен
и он обусловливает наблюдаемый нами эффект Коттона. Расчет
силы вращения ЦМФ показывает, что она равна 8" Ю - 4 0 и в 3 ра­
за превышает силу вращения ТМФ. Анализ и сопоставление на­
ших и литературных данных показывает, что сила вращения ЦМФ
при образовании спирального полимера поли Ц возрастает в
5 раз. Поэтому можно полагать, что оптическая активность п — л*
перехода в ароматическом пиримпдпновом кольце ЦМФ должна
сильно возрастать при образовании даже такой несовершенной
спирали, как в Р Н К и денатурированной Д Н К . Э ю т переход для
Д Н К не дает оптического вращения в видимой части спектра и ле­
жит в ультрафиолете, поскольку при спрямлении кривой диспер­
сии Д Н К в видимой области получается Кс «=230 ммк. Поэтому,
несмотря на значительную амплитуду эффекта Коттона для дена­
турированной Д Н К , вращение последней в видимой области близ­
ко к нулю. Что касается минимума на кривой аномальной диспер­
сии оптического вращения нуклеиновых кислот, то возможно, что
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
он обусловлен л—л*—переходами в пуриновых
нуклеотидах.
Однако интерпретация этого минимума в настоящее время затруд­
нительна, поскольку здесь могут накладываться другие оптически
активные переходы, лежащие п более коротковолновой области.
Следует отметить, что наши кривые аномальной дисперсии
оптического вращения нуклеиновых кислот в области поглощения
заметно отличаются от данных Фреско и др. Мы не наблюдали
вторых максимумов, полученных американскими авторами. Эти
вторые максимумы похожи, по терминологии Джерассп, на «мни­
мые эффекты Коттона» и явились результатом методической ошиб­
ки указанных авторов. Эта ошибка, вероятно, была связана с не­
учетом рассеянного света, выходящего из монохроматора. Даль­
нейшие исследования подтвердили правильность полученных нами.
данных (Янг и др., 19G3, ПН>4).
ЭЛЕКТРООПТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ
КИСЛОТ И НУКЛЕОПРОТЕИДОВ
Общая характеристика электрооптических методов
Электрооптпческпе методы исследования основаны на регистра.
ции изменений свойств раствора под действием приложенного к
нему электрического поля. Эти изменения являются следствием
ориентации в электрическом поле молекул, находящихся в раство­
ре. Из-за ориентации молекул оптические свойства раствора ста­
новятся различными по направлению приложенного поля и пер­
пендикулярно к нему. Обычно анизотропия раствора проявляется
в различии скоростей распространения (показателях преломления)
света, а также в различии в поглощении (истинном поглощении
или рассеянии) света, поляризованного в указанных направлениях.
В первом случае регистрируется двойное лучепреломление раство­
ра в электрическом поле ( Э Д Л П ) , а во втором — электрический
дихроизм (ЭДХ). В работе подробно рассмотрены именно эти два
метода исследования растворов.
В обычной схеме измерения Э Д Л П (эффект Керра) свет ог ис­
точника проходит через скрещенные николи и раствор с электро­
дами (ячейку Керра), помещенный между ними, и попадает на
регистрирующее устройство. В отсутствии электрического поля
раствор является оптически изотропным, и свет через систему не
проходит. При наложении поля раствор становится анизотропным,
двупреломляющим, и через систему скрещенных ннколей и р а е т
вор начинает проходить свет. Для получения максимального
эффекта направление распространения светового пучка выбирает­
ся перпендикулярным к силовым линиям электрического поля, а
плоскость поляризации составляет с ними угол в 45°. Величина
Д Л П характеризуется разностью показателей
преломления
Дп=п„
n J.» г Д е и г » " п
—показатели преломления света,поляризованного соответственно параллельно и перпендикулярно
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
полю. Возникающая разность фаз о между колебаниями обоих
2тс1
.
лучей равна и ~ — ; — Л,П
где к — длина волны света н 1 — длина участка светового пути,
на протяжении которого электрическое поле действует на раствоп.
При измерениях ЭДХ из схемы для измерения Э Д Л П уда­
ляется анализатор. Таким образом, свет постоянно попадает на ре­
гистрирующее устройство, но его интенсивность меняется в мо­
мент положения поля на раствор, если в последнем возникает ани­
зотропия поглощения, т. е. дихроизм. При этом плоскость поляри­
зации поляризатора устанавливается поочередно параллельно и
перпендикулярно силовым линиям приложенного поля, и при каж­
дом из этих положении измеряется коэффициент экстинкцпи растнора (г„ н s ± ) .
Величина дихроизма, возникшего при наложе­
нии поля, обычно характеризуется дихроичным
отношением
D = -Z}L, и задача, таким образом, сводится к фотометрической
задаче измерения экстинкцпи двух различно
поляризованных
компонент световой волны.
Точность измерения ЭДХ существенно зависит от выбора кон­
центрации исследуемого раствора. Было показано, что максималь­
ная величина сигналов ЭДХ для различных
поляризованных
компонент света достигается при некоторых оптимальных концент­
рациях (точнее, оптических плотностях растворов), для расчета
которых получены соответствующие формулы. Специально иссле­
дован вопрос об оценках Э Д Л П и ЭДХ в случае совместной
их регистрации.
Особенности электрооптических измерений в растворах
макромолекул
Большая часть электрооптнческих исследований была проведе­
на на растворах, имеющих очень малую удельную электропровод­
ность (нитробензол, сероуглерод, дистиллированная вода и т. п.).
В этих условиях наложение постоянного или переменного (сину­
соидального) электрического напряжения на длительное время,
естественно, не вызывает никаких осложнений.
Иначе обстоит дело с растворами биологически важных макро­
молекул. Все эти макромолекулы являются полиэлектролитамн,
причем, в некоторых случаях они могут быть растворены лишь в
солевых растворах и, следовательно, растворы обладают ма/шм
удельным сопротивлением. Очевидно, что в этом случае приложе­
ние постоянного электрического поля невозможно из-за нагрева­
ния раствора, поляризации электродов н т. п. Поэтому единственно
возможным является импульсный режим измерений. При этом
времена релаксаций макромолекул при наложении и снятии поля
становятся доступными экспериментальному исследованию.
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Степень ориентации малых молекул в доступных; эксперимен­
ту полях обычно очень невелика. В случае же раствора макромо­
лекул весьма заметная ориентация может быть достигнута уже
при напряженностях в несколько десятков или сотен в/см. Более
того, при изучении макромолекул часто легко дойти до состояния
почти полного насыщения эффекта (в функции от поля), т. е. добиться почти 100% ориентации макромолекул. При этом, если
ориентация макромолекул п р и наложении внешнего электриче­
ского поля обусловлена индуцированным дипольным моментом, то
такая макромолекула будет располагаться своим максимальным
размером вдоль приложенного ноля.
До начала нашей работы механизм ориентации макромолекул
в электрическом поле подробно исследовался лишь на одном
объекте—растворах вируса табачной мозаики (ВТМ). Полученные
данные свидетельствуют в пользу теории, приписывающей основ­
ной вклад в поляризуемость молекулы полиэлектролпта поляри­
зуемости ее ионной атмосферы. Под поляризуемостью ионной атмосферы имеется в виду смешение центра заряда противоионов
(«ионной атмосферы»)
относительно центра заряда молекулы
полиэлектролпта. Как показали наши исследования, такой же ме­
ханизм ориетации, как у ВТМ, по-видимому справедлив и для дру­
гих исследованных молекул биополимеров. Ниже мы увидим, что
процессы релаксации поляризуемости макромолекул в электриче­
ском поле характеризуются много меньшими временами, чем
ориентацнонные процессы и поэтому не оказывают заметного влия­
ния на ход последних.
Исследование электрического двойного лучепреломления по­
зволяет в ряде случаев определить важные характеристики макро­
молекул. Так, анализ кривой исчезновения оптической анизотропии
раствора после снятия электрического поля позволяет оценить раз­
меры жестких; частин (макромолекул), а также полидпсперсность
препарата (О'Конскпй, Зимм). По кривым нарастания Д Л П при
наложении электрического поля можно исследовать не только гео­
метрию, но и электрические свойства молекул, ее. дппольные мо­
менты, анизотропию электрической и оптической поляризуемостей
(Бенуа, Шварц, О'Конскпй, Тиноко).
Изучение ДХ может, также как и изучение Д Л П , быть исполь­
зовано для нахождения геометрических и электрических характе­
ристик частиц. Однако, для всех исследованных нами объектов ре­
гистрация ДХ осуществлялась в сопоставимых условиях лишь со
значительно меньшей точностью. Это является причиной того, что
с указанной целью мы изучали Д Л П , а не ДХ макромолекулярных
растворов.
Однако в ряде случаев изучение ЭДХ имеет значительные пре­
имущества по сравнению с Э Д Л П . Так, при исследовании собственого (консумптивного) дихроизма в области поглощения можно
судить об ориентации хромофорных групп молекул. В работе пс12
»
%
^
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
следована зависимость поглощения поляризованного и естествен­
ного света от ориентации поглощающих; групп.
Полиэлектролптный характер бпомакромолекул делает необ­
ходимым анализ возможных факторов и процессов, осложняющих
измерения ЭДХ и Э Д Л П . В первую очередь к таким процессам от­
носятся нагревание раствора и конвекционные потоки в жид­
кости, эффект Теплера, электролиз, электрокпнетическпе явления.
Проведенные исследования позволили заключить, что принятые
меры предосторожности оказались достаточными для измерения
Э Д Л П и ЭДХ без учета перечисленных выше осложняющих фак­
торов.
Описание прибора
Для измерения Э Д Л П и ЭДХ была сконструирована установ­
ка, позволяющая производить импульсные измерения оптической
анизотропии растворов в диапазоне длин волн 240—600 ммк. Па­
раллельный пучок света проходил через систему поляризатор—
ячейка Керра - - анализатор и падал на фотоумножитель (ФЭУ
18А). Сигнал с ФЭУ усиливался и поступал на вертикальные пла­
стины осциллографа (ЭНО-1). Сигналы на экране осциллографа
фотографировались. В качестве ориентирующих
импульсов ис­
пользовались прямоугольные
импульсы напряженностью до
15 кв/см п длительностью 50 мксек — 12 мсек. Времена нараста­
ния и спада электрических импульсов составляли 1—С мксек, а
постоянная времени регистрирующей системы в зависимости от за­
дачи измерения менялась в пределах 1 мксек — 2 мсек. Для
эффективного термостатировання ячейки Керра применялись по­
лые электроды из нержавеющей стали, через которые циркулиро­
вала вода от ультратермостата. Точность измерения Э Д Л П для
разности фаз о>10' составляла 5%.
Электрооптическое изучение дезоксирибонуклеиновой кислоты
В работе исследовалось Э Д Л П водных и солевых растворов
Д Н К из тимуса теленка и из бактериофага Т2. Все исследуемые
препараты давали кривые плавления, т. е. зависимость вязкости и
поглощения света при длине волны 260 ммк от температуры, харак­
терные для натнвной Д Н К . Непосредственно перед измерением
Д Н К растворялась на холоду в соответствующем растворителе.
Растворителями обычно служили либо 0,001 М раствор NaCl в
0,0015 М нитратном буфере рН 7 («солевые» растворы Д Н К ) , либо
дистиллированная вода («водные» растворы). (Поскольку осажде­
ние Д Н К производилось из солевых растворов, то так называемые
«водные» растворы содержали достаточное количество ионов для
предотвращения денатурации молекул Д Н К ) . Денатурация Д Н К
проводилась, согласно Мармеру и др. (1961) с помощью выдер­
живания разбавленных водных растворов при 95° п течение 30 мп13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нут. Полнота денатурации контролировалась по величине гипохромизма.
В качестве ориентирующих импульсов использовались одиноч­
ные прямоугольные импульсы длительностью от 0,3 мсек до
10 мсек. Опыты обычно проводились с 0,004% раствором Д Н К .
При исследовании солевых растворов Д Н К анализ спада Д Л П
после снятия импульса показал, что времена релаксации для фа­
говой и тнмусной ДНК, взятых в одинаковых условиях, совпадают.
Так, для компонент, дающих максимальный вклад в величину
эффекта (до 65%) при напряженности Е = 3 кв/см и продолжи­
тельности импульса 700 мкеек, времена релаксации составляли
500 ± 100 мкеек. Поскольку молекулярные веса указанных образ­
цов отличаются более чем в 10 раз, можно заключить, что времена
релаксации в данном случае не зависят от молекулярного веса.
Для изучения связи молекулярного веса Д Н К с временем релсксацни были изучены образцы Д Н К различного молекулярного
веса, полученные с помощью ультразвука. Д л я этого вначале были
исследованы физико-химические изменении Д Н К под действием
ультразвука.
Озвучивание растворов производилось на пьезокварцевом гене­
раторе. Частота ультразвуковых волн 780 кгц, интенсивность
15 вт/см 2 . Озвучиванию подвергали 0,01% и 0.001% растворы Д Н К
в 0,01 М N a d . Осуществлялось оно в стеклянном сосуде, дном ко­
торого служила тонкая пленка (— 15 ц) из перфоля, практически
полностью пропускающая падающую ультразвуковую
энергию.
С целью изучения механизма действия ультразвука исследуемый
раствор перед озвучиванием насыщался различными газами -—
кислородом, азотом, гелием и водородом.
Продолжительность
озвучивания составляла от 1 до 120 мин. Во время озвучивания со­
суд охлаждался проточной водой. Изучались вязкость и гипохромизм Д Н К , а также изменение этих характеристик при нагрева­
нии растворов (кривые «плавления Д Н К ) . Показано, что деполи­
меризация Д Н К осуществлялась даже в присутствии таких газов,
которые преимущественно угнетают химические процессы, идущие
в ультразвуковом поле (Эльппнер, 1963) и, по-видимому, вызвана
преимущественно механическими силами, возникающими в озву­
чиваемой водной среде при наличии кавптацпонных явлений. Было
установлено, что под действием механических сил поперечные раз­
рывы возникают одновременно в обеих полпнуклеотидных цепях
Д Н К «напротив» друг друга, что приводит к уменьшению молеку­
лярного веса молекул до нескольких сот тысяч при сохранении натнвности их структуры.
С целью исследования зависимости времени релаксации Д Н К
от ее молекулярного веса мы озвучивали Д Н К из бактериофага
Т2 в атмосфере азота. Как и ожидалось, уменьшение молекуляр­
ного веса фаговой ДНК. приблизительно на 2 порядка не приво­
дило к значительному уменьшению времен релаксации.
Н
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таким образом, времена релаксации, наблюдаемые при изуче­
нии раствров ДНК, не зависели от молекулярного веса последней.
Это означает, что в электрическом поле не происходит ориентации
макромолекулы Д Н 1 \ как целой жесткой частицы, как это принято
было считать ранее. По-видимому, релаксационные процессы опре­
деляются способностью молекулы к деформации, ее гибкостью.
Такое предположение подтверждается опытами по влиянию ион­
ной силы раствора и денатурирующих воздействий на релаксацноные процессы. Времена релаксации при переходе от водных
растворов к солевым и при денатурации резко падают, что соот­
ветствует наблюдаемому в этих условиях увеличению гибкости
макромолекул. Мы полагаем, что время релаксации пли показа­
тель экспоненты, соответствующей экспериментальной кривой ре­
лаксации, может служить удобной формальной характеристикой
жесткости макромолекулы. При этом неясно, идет ли речь о мак­
ромолекуле с равномерно распределенной жесткостью пли в моле­
куле существуют жесткие участки, соединенные между собой гиб­
кими связями. Против второй возможности говорит, однако, ана­
лиз литературных данных.
При исследовании зависимости о от напряженности поля для
0,004% раствора Д Н К наблюдалось насыщение эффекта Д Л П
(индекс «нас») при 4500 в/см. При этом о1МС = — 7,76°.
Отсюда Д п
и в с
^ - | ^ - - 5 , 1 • 10 \
поскольку Х = 4500 А и 1 = 1,9 см.
Из величины онос была рассчитана оптическая анизотропия
единицы объема, равная — 4,6' 103.
В достаточно больших полях по времени нарастания импульса
фототока при положении поля, согласно Шварцу, была рассчитана
анизотропия
электрической
поляризуемости ДНК,
равная
1,1 - Ю - 1 4 см 3 — 2 , 3 - Ю - 1 4 см 3 .
После денатурации Д Н К сигнал Д Л П сильно уменьшался и
времена нарастания.и спада сигнала Д Л П становились меньше
6 мксек. Знак Д Л П становился положительным. Так, в поле
2200 в/см для натнвнои Д Н К о = — 24°, а после денатурации
£ = + 3 0 ' . Таким образом электрическое двойное лучепреломле­
ние является исключительно чувствительным к различию между
натнвнои и денатурированной Д Н К .
Ориентация молекул Д Н К в электрическом поле, повидпмому,
обусловлена поляризацией ионной атмосферы. Была исследована
возможность влияния процессов релаксации поляризуемости (ион­
ной атмосферы) на процессы ориентационной релаксации Д Н К .
Анализ литературы и наши опыты показали, что время релакса­
ции поляризуемости молекул Д Н К составляет десятые доли мксек,
в то время как наблюдаемые нами времена — порядка 1 мсек. По­
этому можно заключить, что мы на самом деле изучали орпента•*15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
циониую релаксацию макромолекул практически без
со стороны релаксации ионной атмосферы.
искажении
Двойное лучепреломление растворов рибонуклеиновых
кислот в электрическом поле
Изучалось электрическое двойное лучепреломление растворов
Р Н К из вируса табачной мозаики, рибосомалыюй Р Н К из Е. coli
суммарной Р Н К из асцитпой карциномы Эрлиха, из печени крысы
и тимуса теленка. Все указанные препараты Р Н К при исследова­
нии Э Д Л П дали однотипные результаты.
Исследовалось Э Д Л П при наложении на растворы одиночных
прямоугольных импульсов длительностью 50 мкеек — 2 мсек и на­
пряженностью до 8,5 кв/см.
При наложении прямоугольного ориентирующего импульса на
раствор наблюдается импульс фототока, который является суммой
двух сигналов: положительного (Ап>о) с временами релаксации
порядка сотен мкеек и отрицательного ( Д п < о ) , обычно е мень­
шими временами релаксации. Соотношение между этими сигнала­
ми зависело от температуры, ионной силы, присутствия двухва­
лентных катионов, т. е. от условии, определяющих степень спнрализацпп и конформацию макромолекулы (Спирин, Фреско). При
повышении температуры отрицательная компонента Э Д Л П умень­
шалась и одновременно увеличивалась (или появлялась) положи­
тельная компонента. При некоторой температуре, (обычно выше
50°С) наблюдался только положительный сигнал. Удаление'двух­
валентных: катионов путем переосаждення Р Н К из 0,01—0,005 М
раствора ЭДТЛ приводило к увеличению положительного и умень­
шению отрицательного сигнала и к снижению температуры, при
которой сигнал становился чисто положительным. Таким обра­
зом, факторы, увеличивающие сппрализацию РНК, приводили к
увеличению отрицательной компоненты Э Д Л П и уменьшению по­
ложительной компоненты, а факторы, уменьшающие сппрализа­
цию — к увеличению положительной компоненты и уменьшению
отрицательной компоненты Э Д Л П .
Па основании этих данных можно предполагать, что отрица­
тельная компонента Э Д Л П растворов Р Н К обусловлена вкладом
спиральных участков молекулы, а положительная компонента обу­
словлена вкладом деспиралпзованнон полинуклеотидноп цепи, обра­
зующей в растворе клубок. Количественная интерпретация полу­
ченных данных основана на некоторых предположениях и сопо­
ставлении результатов электрооптических измерений с данными,
полученными другими методами, и позволяет оценить размеры
спиральных участков в молекуле Р Н К в среднем в 30—50 нуклеотидных пар.
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Электрическое двойное лучепреломление
дезоксирибонуклеоиротеида
Исследовались молекулярно-дпсперсные растворы дезоксири­
бонуклеопротеида ( Д Н П ) , выделенного из зобной железы теленка
по методу Зюбе и Доги. Целью являлось изучение применимости
метода измерения Э Д Л П к Д Н П .
На электроды ячейки Керра подавались одиночные прямо­
угольные импульсы длительностью 300 мкеек — 12 меск и ампли­
тудой до 500 в. Расстояние между электродами составляло 2,5 мм.
Знак Д Л П оказался отрицательным. Совпадение знаков Д Л П
растворов Д Н П и электрическом поле и в потоке показывает, что
частицы Д Н П ориентируются длинной осью в направлении поля.
Поскольку знак Д Л П , обусловленный анизотропией формы, дол­
жен при этом быть положительным, то отрицательное Д Л П обу­
словлено собственной (внутренней) анизотропией частиц. Таким
образом, как и в случае растворов Д Н К , знак Д Л П в растворе
Д Н П определяется особенностями внутреннем структуры молекул,
очевидно, упорядоченным расположением плоских азотистых осно­
ваний в Д Н К перпендикулярно длинной оси молекулы.
При сравнении зависимости Д Л П от ионной силы для раство­
ров Д Н П и Д Н К установлено, что величина эффекта, наблюдае­
мого на растворе Д Н П , примерно вдвое меньше получаемого в
аналогичных условиях на растворе тимусной ДНК. Указанное раз­
личие может быть результатом различий в значениях электриче­
ской, или оптической анизотропии иолярпзуемостей. Последнее
является более вероятным ввиду того, что сравнение проводилось
в условиях, когда ориентация обоих объектов была весьма близка
к полной. Уменьшение значения оптической анизотропии у Д Н П по
сравнению с Д Н К может быть результатом большей величины
эффекта формы у Д Н П , являющегося, в отличие от ДНК, компакт­
ным жестким телом. Поскольку в данном случае эффект внутрен­
ней оптической анизотропии п эффект анизотропии формы имеют
обратные знаки, то увеличение эффекта формы должно приводить
к уменьшению общего эффекта. Анализ кривых спада Д Л П пока­
зал большую полидиспсрсиость препарата в результате агрегации
макромолекул Д Н П , что было подтверждено результатами седпментационного анализа.
Электрооптическое исследование рибосом.
Как и в случае Д Н П , исследовалась применимость метода
Э Д Л П для изучения нуклсопротепдов. Рибосомы выделяли из
Е. coli по методу Тнссьсра. Исследовались растворы нативных и
формалинизпрованных рибосом. Для характеристики рибосом,ис­
пользовали седпментацнонный анализ, а также, для контроля пативностн рибсомалыюй РНК, определяли температурную зависи­
мость вязкости рибосом в 0,5% растворе додецнлеульфата натрия.
RjjiyjuitM Наутя Пнблиотем*
'
ПмхмсиоЯ Ч'А- Я*»яилСмм©з.
1к*«мя* им. К. к. Тиьмфяэем
*» 1Ь№
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ил электроды ячейки Керра подавались одиночные прямоуголь­
ные импульсы напряжения длительностью 50—400 мкеек п ампли­
тудой до 2600 в. Напряженность электрического поля в опытах
достигала 13 кв/ем.
Удельные константы Керра для формалинизированных рибо­
сом с константами седиментации 100 s и 70s имеют значения
0,45- 10 15 — 1,8- Ю- 5 (в системе CGS).
Величина Д Л П , как оказалось, существенно зависит от кон­
центрации ионов в растворе. Добавление соли к раствору рибосом
существенно уменьшает эффект Д Л П при данной величине напря­
женности электрического поля. Эти данные находятся в согласии с
теорией, приписывающей поляризации ионной атмосферы основ­
ную роль в ориентации макромолекул в электрическом поле.
Знак Э Д Л П оказался положительным в соответствии с ожи­
даемым дли Э Д Л П формы.
Естественно предположить, что основной вклад в наблюдаемы!!
эффект дают частицы 100 s, составляющие 60% от всех рибосом в
растворе и обладающие значительно большей ассиметрней, чем
рибосомы 70 s, также присутствующие в этом препарате. Это под­
тверждено измерением времен релаксации ( ~ 3 мкеек) после сня­
тия электрического поля, которые соответствуют размерам рибо­
сом 100 s, определяемым электронно-мпкроскопически. Анализ
спада Д Л П показал, что наряду с частицами, обусловливающими
время релаксации, близкое к указанному, в растворе содержатся
также агрегаты (димеры и тримеры, соединенные конец в конец),
дающие значительно большие времена релаксации.
Столь же большое (по порядку величины) Э Д Л П
наблюда­
лось у препаратов рибосом, содержащих компоненты 70 s, 50 s и
30 s, как иатнвных, так н формалинизированных. Знак Э Д Л П для
указанных препаратов был также положительным. На растворах
рибосом нами наблюдался наряду с Э Д Л П , также электрический
ДХ положительного знака в области 260—570 ммк. В видимой и
ближней ультрафиолетовой областях ДХ сильно падает но сравне­
нию с дальним ультрафиолетом и его вклад is общий эффект изме­
нения интенсивности при измерениях в видимой области весьма
мал.
Наблюдаемые электрооптпческне явления, несомненно, были
обусловлены рибосомами. После осаждения рибосом из клеточ­
ного экстракта надосадочная жидкость давала
незначительное
Э Д Л П отрицательного знака, возможно обусловленное присутст­
вием следов Д Н К . При разрушении натпвных рибосом с помощью
обработки 4 М мочевиной Э Д Л П раствора резко уменьшалось (п
30 р а з ) .
Таким образом, приведенные данные показывают, что рибосо­
мы способны к ориентации. Наблюдаемые при этом электрооптпче­
скне явления очень велики и могут быть использованы для изуче­
ния строения и физико-химических характеристик рибосом. Опре18
• • • • • : • ; . :
•
•••
..*,..,,?-•->..»-:
V ^ V . N T . ; .
• .ч:л
• >
'Л
-
««1
.•:
»
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
делены размеры рибосом в растворе. Измерены удельные констан­
ты Керра и дихроизм рибосом.
***
Итак, в работе представлены результаты физико-химического
изучения нуклеиновых кислот н нуклеопротеидов в растворе, полу­
ченные главным образом при исследовании дисперсии оптического
вращения и электрооптпческого поведения биополимеров. Интерес
к рассмотренным методам в последние годы сильно возрос. По­
явилось значительное число сообщений из крупных исследователь­
ских центров, в которых были подтверждены основные результаты
нашей работы и их интерпретация. Что касается изучения ано­
мальной дисперсии оптического вращения, то недавно удалось по­
лучить данные для более коротковолновой части спектра (Янг
и др., 1963, 1964), что еще больше расширяет возможности изуче­
ния электронной структуры нуклеиновых кислот. Электрооптическне методы исследования в последнее время также начали ши­
роко применяться для изучения конформации нуклеиновых кислот,
квантосом, вирусов, а также для изучения многочисленных белков
(О'Конский, Кальвин, Морган, Джерард и др.). Авторам удалось
изучить ряд важных свойств указанных объектов, и, прежде всего
определить их размеры в растворе. Эти результаты оказались в
блестящем согласии с данными измерений другими методами,
когда такие данные были известны.
Однако следует отметить, что теория рассмотренных оптиче­
ских методов в настоящее время разработана слабо, и к количе­
ственной интерпретации измерений следует относится с осторож­
ностью. В этом смысле указанные методы не являются исключе­
нием. К сожалению, в настоящее время почти нет методов, которые
при исследовании биомакромолекул допускали бы одиазначную
интерпретацию измерений. Поэтому так актуальна и необходима
разработка теоретических и экспериментальных основ методов мо­
лекулярной биофизики.
ВЫВОДЫ
I. Исследование дисперсии оптического вращения нуклеиновых
кислот
Исследована дисперсия оптической активности ДНК. и РНК,
апуриновон п апиримидиновой нуклеиновых кислот и нуклеотндов
в области 240—550 ммк.
1. Дисперсия оптической активности в области, далекой от по­
лосы поглощения.
Дисперсия оптической активности ДНК и РНК в области
310—550 ммк
следует
одночленному
уравнению
Друде,
Хс ==240 ммк. В случае нуклеотндов все кривые также следуют
19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
одночленному управлению Друде в области 310—550 .ммк, т. е.
оптическая активность обусловлена одним переходом при длине
волны, близком к Хс . Вращение пурииовых нуклеотндов отрица­
тельно, и >.с находится в области 230—240 ммк, а вращение ппрпмидпновых нуклеотндов положительно и Xz лежит в области
280—290 ммк. Кривая дисперсии для апурнновой Д Н К спрямляе­
ма по Друде, Кс = 275 ммк и вращение положительно. Удельное
вращение аппрпмпдиновой Д Н К положительно и очень мало, Хс
близка к 230 ммк.
2. Дисперсия оптической активности в области полос поглоще­
ния.
Дисперсия оптического вращения нуклеиновых кислот харак­
теризуется положительным эффектом Коттона с экстремумами дли
Д Н К при 290 ммк и 260 ммк и средней точкой при 275 ммк, а для
Р Н К 280 ммк и 245 ммк и средней точкой 270 ммк. Силы враще­
ния для этих переходов, соответственно 6" Ю - 4 0 CGS и 1 4 - 1 0 - 4 0
CGS. При денатурации Д Н К эффект Коттона сдвигается в крас­
ную область на 5 ммк, а сила вращения падает в 2,5 раза. При
растворении Р Н К в денонизованной воде сила вращения падает
вдвое, а цетплтриметиламмонневая соль Р Н К , которая полностью
десппралпзована, оптически неактивна. Дисперсия
оптического
вращения
пиримидиновых нуклеотндов обнаруживает эффект
Коттона, положение которого совпадает с положением эффекта
Коттоиа Д Н К . Дисперсия вращения пурииовых
нуклеотндов
остается монотонной при уменьшении длины волны до 280 ммк.
При меньших длинах волн не удалось получить надежных резуль­
татов. Это относится и к апиримидиновой нуклеиновой кислоте.
Лпуриновая кислота давала положительный эффект Коттона
с экстремумами при 290 ммк и 260 ммк и средней точкой при
275 ммк.
3. Обсуждается происхождение аномальной дисперсии оптиче­
ского вращения нуклеиновых кислот, оценивается вклад некоторых
оптически активных электронных переходов. Рассматривается воз­
можность использования поляримстрнп и, в частности, измерения
аномальной дисперсии оптической активности для изучения конформацнонных и электронных переходов в нуклеиновых кослотах.
4. Описана аппаратура п техника измерений оптической актив­
ности в области поглощения, позволившие впервые исследовать
аномальную дисперсию вращения нуклеиновых кислот и нуклео­
тндов.
II. Элгктрооптические исследования нуклеиновых кислот и
нуклеопротеидов
1. Исследованы электрооптпческпе свойства Д Н К из зобной
железы теленка и бактериофага Т2. Показано, что времена релак­
сации, определяемые по скорости исчезновения двойного лучепре­
ломления после снятия электрического поля, одинаковы для тка­
невой н фаговой Д Н К и не зависят от ее молекулярного веса.
20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Предполагается, что время релаксации молекулы Д Н К опреде­
ляется не ориентацией макромолекулы как целого, а относитель­
ным смещением отдельных участков молекулы, ее деформацией.
Способность к такой деформации (или в этом смысле жесткость)
макромолекулы предложено характеризовать измеряемым в опыте
временем релаксации или длиной эквивалентного жесткого сег­
мента, независимая дезориентация которого дала бы наблюдае­
мое в опыте время релаксации. Такой формальный способ оценки
жесткости Д Н К является удобным- и весьма чувствительным при
изучении конформации макромолекул.
Исследованы времена релаксации в зависимости от температу­
ры и ионной силы раствора, а также анизотропия оптической и
электрической полярнзуемостей Д Н К . При денатурации электри­
ческое двойное лучепреломление изменяет знак и резко падает по
величине. Сильно уменьшается также время релаксации. Растворы
Д Н К в электрическом поле обнаруживают двойное лучепреломле­
ние отрицательного знака, что связано с внутренней анизотропией
молекул Д Н К , обусловленной упорядоченным
расположением
плоских ароматических колец азотистых, оснований перпендику­
лярно длинной осп молекулы.
. 2. Изучалось электрическое двойное лучепреломление раство­
ров Р Н К различного происхождения. Все исследованные нативныс
препараты Р Н К в растворе при наложении электрического поля
давали сигнал двойного лучепреломления, состоявший из двух
компонент разных знаков н формы. Соотношение между этими
компонентами зависело от температуры, ионной силы и концент­
рации двухвалентных катионов в растворе, т. е. от условий, опре­
деляющих степень спнрализацпи РНК. При увеличении спирализации увеличивалась компонента отрицательного знака (увеличи­
вались величина сигнала и времена релаксации) н уменьшалась
компонента положительного знака, а при уменьшении спиралпзацпи — наоборот. Высказано предположение, что компонента Д Л П
отрицательного знака определяется ориентацией спиральных уча­
стков РНК, а компонента Д Л П положительного знака — ориен­
тацией всего макромолекулярного клубка.
Исследованы характеристики обеих компонент сигналов Э Д Л П
и дана предположительная опенка длины спиральных участков
РНК.
3. Изучены электрооптпческпе эффекты на растворах нуклеопротепдов-молекулярно-дисперсного
дезокспрнбонуклеопротенда
из зобной железы теленка и рибсом (с константами седиментации
100 s, 70 s, 50 s и 30 s) из Е. coli. В случае ДНП'электрическое
двойное лучепреломление имело отрицательный знак и обуслов­
лено в основном внутренней анизотропией ДНП-частнц. Рибосомы
давали электрические двойное лучепреломление и дихроизм поло21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
жительного знака, что, по-видимому, связано с анизотропией фор­
мы. Измерены размеры Д Н П и рибосом в растворе, удельные
константы Ксрра и анизотропии поляризуемости исследованных
нуклеопротепдных частиц.
•1. Разработаны электрооптнческие методы исследования в при­
менении к изучению биополимеров. Рассмотрены условия измере­
нии, соотношение между двойным лучепреломлением и дихроиз­
мом в электрическом поле, а также возможности методов. Подроб­
но описана аппаратура, техника измерении и расчетов.
III. Показано, что ультразвуковая деградация Д Н К в отсут­
ствие кислорода вызывается механическими воздействиями, приво­
дящими к поперечным разрывам молекулы с сохранением двухтяжного строения фрагментов.
/Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:
1. Физико-химические изменения дезокенрнбонукленновой кис­
лоты, вызванные действием ультразвуковых волн. Докл. АН СССР
134, 702, 1960 (совместно с И. Е. Эльпинером).
2. Электрооптнческие свойства растворов дезокенрнбонуклен­
новой кислоты. Биофизика 6, 403, 1961.
3. Применение элсктрооптических методов для исследования
физических свойств п структуры бпомакромолекул. 5-й Междунар.
бнох. конгресс. Рефераты секционных сообщений, 1961.
4. Исследование некоторых физико-химических свойств Д Н К
при помощи элсктрооптических методов. Труды 1-й Всесоюзной
конференции по нуклеиновым кислотам п нуклеопротеидам. 1961.
5. Электрический дихроизм растворов Д Н К . Докл. АН СССР
135, 739, 1960.
6. О конфигурации молекул инфекционной вирусной рибонук­
леиновой кислоты в растворе по данным измерения электрического
дихроизма. Докл. АН СССР. 135, 987, 1960. Совместно с А. С. Спи­
риным.
7. Поглощение света раствором дезокспрнбонуклепновой кис­
лоты, ориентированной в электрическом поле. ,Докл. АН СССР
140, 942, 1961. Совместно с В. И. Кринским.
8. Дисперсия оптического вращения
дезокенрнбонукленновой
кислоты, выделенной из бактериофагов Т2. Докл. АН СССР, 151,
1211, 1963. Совместно с Е. И. Голубом. Л. П. Горбачевым,Л. Г.Ко­
реневой и М. II. Мекшенковым.
9. Дисперсия оптического вращения нуклеиновых кислот п
нуклеотидов. Докл. АН СССР 1964 (в печати).
10. Физические свойства и ориентация молекул нуклеиновых
кислот в электрическом поле. Труды Московской конференции мо­
лодых ученых' 1962. Совместно с Е. И. Голубом.
11. Двойное
лучепреломление растворов дезоксирибонуклеопротенда в электрическом поле. Докл. АН СССР, 151, 224, 1963
совместно с Е. И. Голубом.
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
12. Двойное лучепреломление растворов дезоксприбонуклсиновой кислоты в электрическом поле. Биофизика 8, 301, 1963 (сов­
местно с Е. И. Голубом).
13. Об оценке жесткости молекул ДНК в растворе. Биохимия
28, 1041, 1963 (совместно с Е. И. Голубом и В. Г. Назаренко).
14. Конфигурация молекул ДНК в растворе. 1-й Всесоюзный
биохимический съезд. Тезисы докладов, 1964 (совместно с Е. И. Го­
лубом и В. Г. Назаренко).
15. Изучение рибосом Е. coli при помощи электрооптических
методов. Докл. АН СССР, 149, 446, 1963. Совместно с Г. Г. Гаузе,
Е. И. Голубом и А. С. Спириным.
16. Строение и физико-химические свойства нуклеиновых кис­
лот. Химия и биохимия нуклеиновых кислот, 1965 (в печати).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Т16984 от 28/X1I-1964 г.
Объем 1,5 п. л.
Заказ 1958. Тираж 200.
Типография Метроснаба. Дальний пер., д. 8
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
3
Размер файла
702 Кб
Теги
515
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа