close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

86

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
/ -i/M
Академия
наук
Эстонской ССР
Совет по биологическим наукам
На правах рукописи
ХЁДРЕЯРВ
УЛРИХ ГУСТАВОВИЧ
ОЧИСТКА ВИРУСОВ М и Н
КАРТОФЕЛЯ И ИЗУЧЕНИЕ
НЕКОТОРЫХ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
(Диссертация написана на.эстонском языке)
0 3 . 0 0 . 0 6 - Вирусология
А в т о р е ф е р а т
диссертации на соискание ученой степени
кандидата
биологических наук
Таллин
1973
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Академия
наук
Эстонской ССР
Совет по биологическим науках
На правах рукописи
ХЁДРЕЯРВ УЛРИХ ГУСТАВОВИЧ
ОЧИСТКА ВИРУСОВ М и N КАРТОФЕЛЯ И ИЗУЧЕНИЕ
НЕКОТОРЫХ ИХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
(Диссертация написана на эстонской языке)
03.00.06 -Вирусология
А в т о р е ф е р а т
диссертации на соискание ученой степени
кандидата
биологических наук
1ш
"
!!в-нт№нАя
НАУЧНАЯ БИБЛИОТЕКА
Моск. o'Vb-..лОлСо академии
им. К. Ал'1и«яИряэваа
йнв. m!:JZ&££-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа выполнена в секторе вирусологии Института эк­
спериментальной биологии- Академии наук Эстонской ССР.
Рукопись содержит 148 страниц машинописного текста
обычного формата, 15 таблиц и 46 рисунков. Список использо­
ванной литературы включает 147 наименований работ советских
и зарубежных авторов.
Научный руководитель:
кандидат сельскохозяйственных наук Б.Х.НУРМИСТЕ
Официальные оппоненты:
доктор ветеринарных наук,профессор В.В.ТИЛГА,
кандидат биологических наук Х.Э.КАРИС.
Ведущее учреждение - Эстонский научно-исследователь­
ский институт земледелия и мелиорации.
Автореферат разослан "ZO* февраля 1973 г.
Зашита диссертации состоится "&Л," марта 1973 г.
ъЛ4.00
час. на заседании Совета по биологическим наукам Академии
наук Эстонской ССР в г.Тарту, ул.Фр.Р.Крейцвальда, I.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Инсти­
тута зоологии и ботаники АН ЭССР /г.Тарту.ул.Ванемуйне,21/.
Отзывы просим присылать по адресу: Эстонская ССР,г.Тал­
лин - 200103, ул.Кохту,6. Президиум Академии наук Эстонской
ССР, Совет по биологическим наукам.
Ученый секретарь совета
З.Х.ПАРМАСТО
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 3 Вирусные заболевания культурных растений получают все
более широкое распространение и значительно снижают их уро­
жаи. Особенно сильно страдают от вирусов вегетативно размно­
жаемые растения, к числу которых принадлежит одна из важней­
ших сельскохозяйственных культур - картофель. Наибольший
ущерб урожаям картофеля наносят так называемые мозаичные ви­
русы» в отношении которых пока не разработаны эффективные
меры борьбы. Попытки получать путем селекции сорта картофе­
ля, устойчивые к важнейшим возбудителям мозаики - вирусам X,
S, М и У„ не увенчались успехом. Налаженная по всем правилам
система семеноводства, со строгим контролем и удалением
больных растений, не гарантирует получения безвирусного по­
садочного материала.
Установление мер борьбы с мозаичными вирусами картофе­
ля в значительной мере затруднено тем, что свойства их недо­
статочно изучены. В первую очередь это относится к вирусу М
/ВМК/, ареал которого постепенно расширяется. Из общего
убытка в сумме около 5 млн.рублей, причиняемого ежегодно ви­
русным вырождением картофелеводству Эстонской ССР, на долю
ВМК приходится 2 Г 9 млн.рублей /Randalu, I966/. Этот вирус
все более широко распространяется и в РСФСР, где снижение
урожая, вызываемое им, составляет 15-30$ /Шмыгля,Абрамова ,
1971/.
Наряду с ВМК заслуживает внимания и вирус Я картофеля
/В N К/, изолированный Б.Х.Нурмисте в Эстонии в I960 году из
мозаигных сеянцев картофеля /ТЗурмисте, 1960а/ о значительной
распространенности которого на исходном селекционном матери-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
_ 4 але, в особенности: на гибридных сеянцах, сейчас уже накопи­
лось много данных /Йурмисте, 19506, 19626;Agur, 1967/.Установлено также, что этот вирус имеет широкий круг растений -хозяев/Agur,Villemson,I970,1971,1972/. О свойствах ВНК име­
ются пока лишь самые общие" сведения, не выясненными остаются
и его распространенность на посевах картофеля и размер нано­
симого им ущерба.. М.Агур / Agur, 1968a/ на основе изучения
инфекционных свойств ВПК и резулвтатов наших электронно-ми­
кроскопических исследований высказала предположение, что он
представляет собою одну из форм /штаммов/ широкораспростра­
ненного вируса огуречной мозаики /ВОМ/.
Для установления эффективных мер борьбы с вирусными
заболеваниями необходимо выяснить источники инфекции и пути
ее- распространения на всех этапах селекции и семеноводства .
В отношении варусов ВМК и ВДК некоторые соответствующие дан­
ные получены Б.Нуршсте, П.Тамм и М.Агур. Работа с ВПК за­
труднена тем, что пока не удалось получить для него антисы­
воротки, которая дала бы возможность его быстро индентифицвровать.
Более углубленное выяснение вопросов, касающихся воз­
никновения инфекции, ее распространения и интенсивности про­
явления, требует всестороннего изучения физических и химиче­
ских свойств вирусов на молекулярном уровне и изменений этих
свойств в зависимости от условий жизни растения-хозяина и
физиологического его состояния.
В литературе пока имеются лишь самые общие сведения о
физических свойствах ВМК /Brandeaи др. .1959; Bode, I968/.Хи­
мические свойства этого вируса не изучены. О щ к до наших
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 5 исследований не было никаких данных, характеризующих его /•зические и химический свойства.
Изучение свойств вирусов на молекулярном уровне воз^
можно лишь при наличии чистых их препаратов. Имея такие пре­
параты мокно подойти к выяснению возможного сродства между
отдельными вирусами и их формами и вообще к более глубокому
пониманию сущности инфекционного процесса и проявления всего
комплекса признаков заболевания.
Получение чистых препаратов вирусов необходимо и для
производства высококачественных диагностических сывороток.
В нашей диссертационной работе были поставлены следую­
щие задачи.
1. Изучить динамику концентрации вирионов в инокулированных листьях и в верхушках растений при заражении в ж , БМК
и ВХК, и физиолого-биохимическую реакцию листьев Nicotiana
glutinosa L. после инокуляции ВПК и ВХК.
2. Выработать методы получения чистых препаратов В Ж
*ЯМК.
3. Изучить некоторые физические и химические свойства
БНК
и ВМК.
Материал и методика
В качестве объекта исследований, по указанным выше
причинам, были взяты следующие формы вирусов.
I. Форма N H вируса н картофеля /BHgK/
которая бы­
ла изолирована М.Агур /jkgur, I966/ при культивировании ис­
ходной формы в ж
на виде Hicotiana rustica и поддерживает­
ся в лабораторных условиях на индикаторных растениях,при
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 6 этом в растениях Jticotiana glutinosa она обычно содержится
в высоких концентрациях, что обусловило ее выбор.
2. Форма М п вируса М картофеля /BMjjK/, изолированная
Б. Нурмисте из репродукции гибридного сеянца картофеля
382/48х Приекульский ранний Йыгеваской селекционной станции.
3. Форма Х 3 вируса X картофеля /ВХдК/ полученная
из
репродукции гибридного сеянца картофеля Камераз х Агрие /У/
Йыгеваской селекционной станции. Этот вирус был взят в каче­
стве контрольного при электрофоретической очистке, определе­
нии динамики концентрации вирусов и изучении динамики содер­
жания минеральных элементов в зараяеняых растениях. Поведение
ВХК при электрофорезе довольно хорошо изучено /van Regenmortel, 1964B/.
Вирусы размножали на следующих системно заражающихся
растениях: BNgK И ВХдК на Nieotiana glutinosa, В М ц К
на
Solamm deaissum Lindl. И S.aeaule L.
Для определения относительной концентрации; вирионов ис­
пользовали; следующие локально реагирующие индикаторные расте­
ния: для BNgK Cheaopoditm amarantleolor L.H Vlgna sinenels L.,
для B M J J K И ВХдК GoMphrena globosa L.
Растения выращивали в теплице при температуре 20-25°С,
летом в условиях естественного освещения, зимой при дополни­
тельном искуственном освещении /лампы накаливания и люминес­
центные лампы/ в течение 20 ч. в сутки.
Чтобы получать вирусные препараты из материала» содер­
жащего вирус в возможно более высокой концентрации, изучалась
динамика концентрации вирионов в системно заражающихся расте­
ниях указанных выше видов, после их инокуляции. Через каждые
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 7 два-три дня после заражения брали средние пробы инокулнроваянъпс листьев и листьев верхушки. Пробы растирали в ступке
до образования однородной кашицы. Отжатый из нее сок разба­
вляли водой в отношении 1:4. Затем шпателем, смоченным в по­
лученном инокулше, осторожно натирали половинки листьев ло­
кально реагирующих растений. Другие половинки тех ле листьев
заражали соком здоровых растений, разбавленным водой в том
же отношении-. Через пять дней подсчитывали число некрозов.
Концентрацию вирусов ВМтуК и: ВХ^К в системно заражаю­
щихся растениях и степень загрязненности очищенных разными
методами препаратов определяли с помощью электронного микро­
скопа ЭМ-7. Под электронным микроскопом устанавливали также
форму и размер вирионов BNgK, при этом препараты наносилж на
сетки с формваровой шшжкой, сушили и оттенялг нихромом. Для
негативного контрастирования использовали 2% растворы уранилацетата или фосфорвольфрамата»
Физиолого-биохимическую реакцию растения-хозяина н-. ви­
русную инфекцию изучали на растениях Niootiana glutinosa,
зараженных BNgK и BXQK. Растения инокулировали разбавленным
водой соком, полученным от зараженных вирусами растений этого
же вида. Другую группу растений инокулировали соком, получен­
ным от здоровых растений. Через каждые два-три дня, с третье­
го по семнадцатый день после заражения, брали средние пробы
инокулированных листьев. Листья собирали утром в одно и то же
время. Растения всех сравниваемых вариантов в каждой серии
опыта выращивали и исследовали одновременно, чем обеспечива­
лись одинаковые внешние условия.
У зараженных и контрольных растений изучались изменения
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
-8 в содержании сухого вещества, золы и некоторых минеральных
элементов в течение первых семнадцати дней после заражения.
Содержание сухого вещества определяли путем высушивания
листьев при Ю 5 ° С до постоянного веса. Для определения со­
держания золы сухие листья озоляли при температуре 550 С до
постоянного веса. При определении содержания минеральных
элементов использовали метод спектрального анализа. Спектры
получали высоковольтной искрой при помощи генератора ИГ-3 и
фотографировали на спектрографе ИСП-28 в спектральной облас­
ти 2000-5000 А . Оптические плотности спектральных линий и
фона вблизи них измеряли при помощи микрофотометра МФ-2.Для
введения поправки на фон значения оптических плотностей пе­
реводили в единицы интенсивности при помощи характеристиче­
ской кривой спектральной пластины /Прокофьев, I95I/.B каче­
стве величины пропорциональной концентрации элементов в заве
растений использовали отношение интенсивностей спектраль­
ных линий и фона. Все данные перечисляли на сухое вещество я
выражали в отношении здоровых растений.
В целях получения характеристики B N R К и B M J J K изуча­
ли ряд их физико-химических свойств. Электрофоретическую
подвижность вирионов определяли в буферных растворах с ион­
ной силой 0,1 /Miller, Goia©r, I950/ в приборе для аналити­
ческого электрофореза /Цейсе, йена / при температуре 4°С.При
этой же температуре определяли рЖ и удельную электропроводи­
мость растворов. В определенные моменты времени пик на нис­
ходящей стороне фотографировался при помощи шлирен-оптической системы. Измерительным микроскопом МИР-12 измеряли рас­
стояния лнкоя о* старта в разное время после начала опыта и
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
рассчитывали среднюю подвижность вирионов в данных условиях.
Ультрафиолетовые спектры поглощения препаратов измеря­
ли' при помощи спектрофотометра СФ-4А в области 200-400 им.
На основе оптических плотностей вирусных препаратов при 260
нм и соответствующих сухих весов вирионов /определенных
пу­
тем сушки препарата при 90°С до постоянного веса/ вычисляли
абсорбционный индекс вируса.
Влияние солей / Ы С 1 , ЫСЕЦСОО, NaCl.KCi, MgClj.CaCl^
на устойчивость вирионов в растворе in vitro
изучали
при
помощи спектрофотометра СФ-4А.
Влияния неорганических солей /LiCl, NaCl,KCl/ на инфекционность Ш-гХ изучали путем определения количества не­
крозов на листьях растений Chenopodivm amaranticolor.
Для
втого половинки листьев растений этого вида инокулировали ви­
русными растворами, содержащими соответствующие соли, а дру­
гие половинки листьев в качестве контроля соответствующими
растворами солей. На пятый день после заражения подсчитывали
число некрозов, измерят площадь листьев при помощи планиме­
тра и рассчитывали среднее число некрозов на I кв.см»
Белок оболочки вируса отделяли фенольным методом
/Knight,I963/• Для определения состава аминокислот этот бе­
лок подвергали гидролизу в растворе 5,6 н. НС1 в течение 24
часов при П 0 ° С . Аминокислоты разделяли и определяли при по­
мощи анализатора аминокислот /ф-ма Микротехна, Прага/.
Нуклеиновая кислота вируса отделялась фенольным мето­
дом /Gierer, Schramm, I956/. Для установления типа нуклеи­
новой кислоты применяли цветные реакции на дезоксирибозу и
рябозу, соответственно дифениламином и орадном /Лише.1957/.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
. - 10 НуклеотядннЯ состав вирусной РНК определяли стандар­
тным методом / Smith, I955/. РБК подвергали гидролизу
в
растворе 0,3 я КОВ в течение 18 часов при 37°С. Нуклеотиды
разделяли в формиатном буфере при помощи электрофореза,элюировали 0,1 н. НС1 и определяли спекрофотометряческим мето­
дом.
Содержание фосфора в
BHgK определяли колориметриче­
ски при помощи молибдата аммония /Allen, I940/, Содержание
РНК в вирионах вычисляли исходя из содержания фосфора и нуклеотидного состава РНК.
Содержание нуклеиновой кислоты и приблизительный мо­
лекулярный вес BMJJK определяли на основе спектрофотометрических данных /paul, 1959a,б/.
При очистке вирусов использовали ультрацентрифугу
ТГАС-60.
Чистоту я гомогенность вирусных препаратов, получен­
ных после очистки, проверяли методами электронной микроско­
пии, УФ-спектрофотометрии, аналитического электрофореза
и
ультрацентрифугирования.
Концентрация вирионов и физиолого-биохимическая
реакция растения-хозяина при вирусной инфекции
I. Концентрация вирионов. Приступая к очистке вируса
нужно сначала найти время, при котором концентрация вирио­
нов выбранной комбинации вирус-хозяин будет максимальной .
При этом часто не обращают внимания на скачкообразный ха­
рактер динамики концентрации вирионов и ориентируются по
признакам болезни. При наших исследованиях было установлена.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- II «
что пряэяма болезни не коррелируют с концентрацией виргояов,
часто концентрация вирионов падает по мере обострения болез­
ни. Пс—вицимому имеется некоторая корреляция между появлени­
ем первых признаков болезни на листьях верхушки и максимумом
концентрации вирионов. Брать листья для получения очищенных
препаратов надо при максимальной концентрации вируса. Если
не учитывать концентрации вирионов, нельзя надежно получать
достаточно большое количество очищенного препарата хорошего
качества. По некоторым вирусам /например Ш д К
/, имеющим
кратковременный максимум концентрации, ориентируясь только
по признакам болезни, можно совсем не получить препарата.
Скачкообразный характер изменения концентрации вирио нов известен у многих вирусов, например у вируса мозаики лгаперны /feuhn, Bancroft
,1961; Bell, 1964; Havranek,I967 a/ ,
вируса крапчатости боба конского / Kodama, Bancroft ,1964/ ,
вируса деформирующей козаики гороха Axadapanah, Shepherd,
1966/,вирусов огуречной и табачной мозаики /teavranek, I9676/,
вируса аспермии хризантем /Oertel, I969/.
Произведенное нами изучение динамики концентрации
BMJJK
BHRK
и BXgK также показало ее скачкообразный характер. Кон­
центрация BlfgK в растениях Nicotiana glutinosa достигала
максимальной величшш в инокулированных листьях на десятый
день,а в листьях верхушки на двенадцатый день после зараже­
ния. Концентрация вирионов в инокулированных листьях во вре­
мя максимума была примерно в 3 раза выше, чем в листьях вер­
хушки и оставалась таковой в течение всего периода опыта.До­
стигнув кратковременного максимума, который удерживался в
течение нескольких дней, концентрация вирионов быстро сни*а-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 12 лась и составляла в листьях верхушки на четырнадцатый день
31% от максимальной концентрации, а на двадцатый день пада­
ла почти до нуля. Концентрация вирионов в инокулированных
листьях на четырнадцатый день составляла 17%, а на двадцатый
день - примерно 3% от максимальной концентрации.
Кривая изменения концентрации BMj^K в растениях Solanum demisaum и S.acaule напоминает кривую затухающего коле­
бания. Концентрация вирионов в листьях верхушки имеет макси­
мум на третьей неделе после заражения. В инокулированных
листьях первые вирионы были обнаружены на четвертый день по­
сле заражения, однако концентрация их в течение всего опыта
оставалась низкой. Через две недели после заражения инокулированные листья начинали сохнуть и опадать. На двадцать де­
вятый день концентрация вирионов в листьях верхушки состав­
ляла 30% от максимальной величины и в дальнейшем снижалась.
В зараженных BXgK растениях Nicotiana gluttaosa мак­
симальная концентрация вирионов была отмечена на десятый
день после заражения, причем концентрация в листьях верхушки
превышала концентрацию в инокулированных листьях примерно в
3 раза. На четырнадцатый день концентрация вирионов падала и
составляла лишь 1% от максимальной величины.
2.Содержание минеральных элементов в зараженных
вирусами растениях
Кроме своевременного сбора листьев для получения пре­
паратов вирусов имеет большое значение и состав среды при
выделении вируса /соединения растительного происхождения
и
добавляемые вещества/. В связи с тем, что вирионы уогут ина-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 13 ктивироваться или осатааться не только органическими соепинениями /хкнонами, дубильными веществами и нек.др./, но и
под воздействием минеральных элементов /Johnson, 196*;Francki
Я др. 1966;Takanaei,Tomaru,I969/.мы изучали динамику измене­
ния сухого вещества, золы и содержания некоторых неоргани­
ческих элементов в двух комбинациях вирус-хозяин. Для этого
были проведены 2 серии опытов, в которых использовали лис­
тья растений Nicotiana glutlnosa . Эти растения были зара­
жены соком, соцеркащим BNgK или ВХдК. Контролем служили
растения, инокулированные соком здоровых растений этого же
вида. Анализы проводили с третьего по семнадцатый день пос­
ле заражения. Результаты, пересчитанные на сухое вещество ,
являются средними двух серий опытов и выражены в отношении
здоровых растений.
Содержание сухого вещества в листьях зараженных виру­
сами растений находилось в течение первых пяти дней после
заражения на уровне его содержания в листьях здоровых расте­
ний. После этого содержание сухого вещества в листьях боль­
ных растений значительно возрастало и достигало максимально­
го значения на двенадцатый день после заражения. Как правило,
содержание сухого вещества в больных растениях было выше,чем
в здоровых, что согласуется и с литературными данными других
авторов /Рейфман и др., 1966/.
Содержание золы на третий день после заражения
было
максимальным - г 1,2 раза выше, чем у здоровых растений,после
чего скачкообразно снижалось и на семнадцатый день было при­
мерно в 1,4 раза ниже, чем у здоровых растений.
Содержание минеральных элементов - калия, натрия, каль-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 14 ция, магния, фосфора, железа, меди, цинка, маграяца, коляодена, бора и стронция на третий день после заражения было
наиболее высокое, что согласуется с высоким содержанием зо­
лы.
В растениях, зараженных ВХдК, содержание натрия, каль­
ция и магния после резкого снижения, следовавшего за макси­
мумом, оставалось в дальнейшем относительно постоянным. В
растениях, зараженных BNgK , содержание указанных металлов
изменилось значительно. Ясно выраженные пики имелись на две­
надцатый день после заражения. На десятый день после зараже­
ния во время максимальной концентрации BNgK , когда соби­
рали листья для изготовления препаратов, содеркание кальция,
который способен: осаждать или инактивировать вирионы.было в
1,5 раза выше, чем в здоровых растениях.
В содержании калия и фосфора в опытах с обоими вируса­
ми наблюдались резкие отклонения от содержания этих элемен­
тов в здоровых растениях.
Концентрации марганца, молибдена, бора и стронция ос­
тавались после снижения в больных растениях_в течение всего
периода опытов ниже- их концентраций в здоровых растениях.
Обращает на себя внимание широкий диапазон изменений
концентраций железа, меди и цинка в дальнейшем ходе болезни
/рис.1 и 2/. Содержание железа и меди снова достигало замет­
ной величины на четырнадцатый день, а цинка на двенадцатый
день после заражения. Во время пиков содержание железа.меди
и цинка превышало в 1,5>-2 раза содержание указанных элемен­
тов в здоровых растениях.
Кривые изменения относительной концентрации вирионов
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 15 -
3 5 ? 9 1 Н З 15 »
Дни после эсрахвимя
Рис.1. Динамика относительной концентрации BNpK и содер­
жания Fe, Си и Zn в инокулированных листьях рас­
тений Nicotlana glutlnosa. I - интенсивность спе­
ктральной линии - величина, пропорциональная кон­
центрации элемента в здоровых растениях, в пересче­
те на сухое вещество, lrt - интенсивность спектраль­
ной линии в зараженных вирусом растениях.
9 11 1$ 15 17
Дни после зара** в м ч«
Рис.2. Динамика относительной концентрации ВХ К и содержа­
ния Fe, Си и Zn в инокулированных листьях расте­
ний Nicotlana glutlnosa. I - интенсивность спект­
ральной линии - величина, пропорциональная концент­
рации элемента в здоровых растениях, в пересчете на
сухое вещество, Irt - интенсивность спектральной ли­
нии в зараженных вирусом растениях.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 16 HJJC , определенные по инфекционности сока на растениях
Vlgna sinensis и вирионов BXjK на Gomphrena glotosa ,
одновреуенно с изучением изменения содер;кания минеральных
элементов, имеют скачкообразный вид /рисЛ и 2/.Концентрация вирионоЕ достигала своей максимальной величины на деся­
тый день после заражения. В дальнейшем концентрация падала
и на четырнадцатый день концентрация №$• составляла 18? ,
а концентрация ВХоК 27? от максимального значения.Несмотря
на снижение концентрации вирионов, признаки болезни /хло­
роз/, которые появились при данных комбинациях вирус-хозяин
через 6 дней после заражения, обострялись. Одной из причин
возникновения хлороза считают отсутствие или недостаток же­
леза /Рубин, 1972/. В связи с этим можно было бы ожидать пря
обострении болезни уменьшения содержания железа. Однако ре­
зультаты наших опытов не подтвердили такого предположения.
В опытах с Ш р К /рис.1/ наблюдалось противоположное явление
— содержание железа при обострении болезни начинало увели­
чиваться и при максимуме почти в два раза превышало содер­
жание железа в здоровом растении. Такое же, хотя более скач­
кообразное изменение концентрации железа, отмечалось и в
опытах с ВХдК /рис.2/. Полученные результаты приводят к вы­
воду, что обострение хлороза растений не связано с понижени­
ем общего содержания железа в растениях и,следовательно, в
процессе болезни не возникает какого либо препятствия для
проникновения железа в клетки растений. Воэмоано, что желе­
зо при вирусной инфекции не может быть нормально использова­
но в процессах биосинтеза, что и обуславливает хлороз. К та­
кому заключению приходят и другие авторы /ЧернавинаДЭТО/.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 17 При сравнении изменения содержания железа и относи­
тельной концентрации BNgK выяснилось, что после седьмого
дня содержание железа увеличивается и достигает своей мак­
симальной величины на четырнадцатый день. В то же время от­
носительная концентрация вируса также повышается, проходит
свой кратковременный максимум и к четырнадцатому дню нахо­
дится уже на низком уровне. Аналогичная картина отмечена и
для меди, только увеличение содержания происходит уже с пя­
того дня после заражения.
При инфекции ВХдК динамика содержания железа имела
более скачкообразный характер. Однако к четырнадцатому дню,
когда концентрация инфекционного вируса находилась /анало­
гично BBgK / на низком уровне, содержание железа было при­
близительно в 1,5 раза выше, чем в здоровых растениях.
Кажется,что увеличение концентрации вируса обуславли­
вает увеличение концентрации меди и железа, что наблюдается
некоторое время и после снижения концентрации вируса. Одной
из причин увеличения концентрации железа и меди и уменьше­
ния концентрации вируса при этом может быть, повидимому,
взаимодействие указанных металлов с вирусом или продуктами
синтеза его.
При инфекции ВХдК привлекает внимание обратный ход
кривой концентрации цинка по сравнению с кривой концентра­
ции железа. Концентрация цинка достигает максимальной вели­
чины на 12-й день, когда содержание железа и меди минималь-ное,. а концентрация вируса начинает снижаться. Возможно,что
при взаимодействии металлов с вирусом или продуктами синте8а его.ннзкое содер*ание железа и меди каким то образом
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 18 компенсируется высоким содержанием цинка.
Относительно взаимоотношений между вирусами и металла­
ми в литературе имеются лишь немногочисленные цанные. Ре­
зультаты анализа чистых препаратов растительных вирусов по­
казывают, что вирионы, кроме своих основных компонентов, со­
держат.и некоторые металлы /boring и др.,1962; Тихоненко ,
1966, 1971/.
В некоторых случаях неорганические катионы могут ока­
зывать стабилизирующее действие на структуру вирионов, как
например С а 2 + и M g 2 + y вируса могаики костра /Brakke, I963 /
и Mg 2 + и Sr 2 + у вируса желтой мозаики турнепса /tfohnsoa I964/.
В других случаях те же самые неорганические элементы
могут оказывать инактивирущее и /или/ осаадающее действие на
вирионы, как например K + ,Mg 2 + ,Zn 2 + на вирус табачной мозаики
/Рыжков.Смирнова,1947/, ва 2 + ,Са 2 + ,Мв 2 + на вирус некроза таба­
ка, огуречной мозаики, кольцевой пятнистости табака, вирус
южной мозаики фасоли в Еирус мозаики люцерны /Rossouw,Pulton,
1963; Francki
2+
и др., 1966; Hull, Johnson, 1968/, Са 2 + , M g 2 + ,
2+
Cu , zn Ha вирус огуречной мозаики /Takanami, Tomaru, 1969/
Осаиающее действие ионов двухвалентных металлов изуча­
лось нами
in vitro
в отношении BNRK в присутствии солей
кальция и магния. При этом выяснилось, что вирионы осаждались
даже из растворов с низкой концентрацией солей /до 5'10~4М/
/см.стр. 54- /.
К сожалению отсутствуют данные о совместном действии
указанных" выше катионов, которые позволили бы судить об их
конкурентных взаимоотношениях при осавдении.вирусов.В этом от­
ношении представляют большой интерес опыты, которыми усханов-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 19 лено неодинаковое сродство металлов с различными активным*
группами белка и РНК /Вильяме, 1962/.
Осаждающее и инактивирующее действие металлов и повы­
шенное содержание их в зараженных вирусами растениях дают
основу для понимания пока необъяснимого скачкообразного ха­
рактера изменения концентрации растительных вирусов в про­
цессе инфекции. Такое скачкообразное изменение концентрации
вируса, при котором отсутствует корреляция меаду концентра­
цией вируса и интенсивностью проявления признаков болезни
/хлороз, деформация листьев и т.д./, которые часто при сни­
жении концентрации инфекционного вируса обостряются, можно
объяснить на основе данных об изменениях концентраций метал­
лов в зараженных растениях.
jИсходя из сказанного и экспериментальных данных,пред­
лагается гипотеза о взаимообязанности между ходом болезни ,
вызываемой вирусной инфекцией, скачкообразным характером из­
менения концентрации инфекционного вируса и динамикой содер­
жания минеральных элементов в больном растении.
Главной причиной хлоротических явлений у растений при
вирусной инфекции может быть образование комплексов или солей
меаду вирионами или продуктами синтеза вируса /вирусная РНК,
вирусные белки и т.д./ и уеталлами. Такие соединения с метал­
л а м могут в конечном итоге вызывать кажущееся /а может быть
и действительное/ снижение концентрации вирионов в больном
растении и выводить из процесса обмена веществ нужные для
растения минеральные элементы. При этом признаки и ход бо­
лезни в растении при вирусной инфекции определяются срод­
ством вирионов или продуктов синтеза вируса /или одновремен-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 20 - •
но обоих/ с определенными металлами.
Очистка вирусов М и N картофеля
Очистка Ш д К . Получение чистого препарата BHgK
бы­
ло связано с обширной поисковой работой, т.к. до сих пор
чистые препараты этого вируса не были получены. При изыска­
ний метода очистки мы исходили из того, что BN„K по неко­
торым свойствам /круг растений-хозяев, точка инактивации и
т.д./ входит в группу вирусов огуречной мозаики /ВОМ/
/ Agur, 1968a/. Просматривались методы, используемые
для
очистки BOM /Tomllnson, 1959;van Regenmortel, I96I;I964a,
6; Scott, 1963; Takanaml, Tomaru, 1969/. Из них наиболее
широко используют метод дифференциального центрифугирования
/scott, I963/, возможности приспособления которого для очи­
стки BNgK были нами изучены. Недостатком этого метода яв­
ляется содержание в очищенных препаратах примесей протеина
Ф I / Scott, I963; van Regenmortel, 1964 а/. В наших опы­
тах с ВЯдК .кромк этого недостатка, обнаружились и другие- малый выход препарата и длительность процесса очистки.По­
этому использовать данный метод в неизмененном виде для по­
лучения чистых препаратов BNgK было нецелесообразно.
Нами были внесены некоторые изменения в отдельные
этапы метода Скотта /схема I/. Сначала диализ заменили об­
меном буфера в колонке, заполненной Сефаяексом.Г25, чем со­
кратилось время для очистки вируса. В дальнейшем ходе рабо­
ты во все буфера добавляли хелатируюший агент /ЭДТА/,анало­
гично модификации Таканами-Томару /Takanaml, Tomaru, IS69/,
элиминируя таким образом осаждающее действие многовалентных
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
-21
-
ионов металлов /смотри содержание неорганических элемен­
тов в случае вирусной инфекции стр, 18/. Кроме этого пер­
вое ультрацентрифугирование больших объемов заменили осааденнем вирионов в азоэлектрической точке /рН 5,8/,что да­
ло возможность выделять вирионы из практически неограни­
ченного количества растительного материала.
С целью окончательной очистки препаратов, использу­
емых в дальнейшем для изучения физико-химических свойств
вирионов, применяли метод дифференциального центрифугиро­
вания или электрофорез в градиенте плотности сахарозы.
Электронномикроскопическая проверка чистоты препаратов и
изучение гомогенности методом аналитического электрофореза
и ультрацентрифугирования показали эффективность данного
метода при получении чистых препаратов.
Пригодность отдельных этапов метода проверяли путем
определения инфекционности препаратов ияокулируя ими рас­
тения Cbenopoaiuni anaranticolor. Замена диализа, исполь­
зуемого в методе Скотта, на обмен буфера в колонках Сефадекса Г25 и прибавление ЭДТА в буферные растворы, увеличи­
вали инфекционность препаратов примерно в 4 раза; замена
ультрацентрифугирования больших объемов осаадением в изоэлектрической точке увеличивала инфекционность их примерно
в 2 раза. При дальнейшем дифференциальном улътрацентрифугированяи инфекционность полученных препаратов практически
не изменялась.
Благодаря разработанному нами методу очистки BSLjK
/осаждение в азоэлектрической точке/ были получены препа­
раты. инфекционность которых превышала в два-три раза ин-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 22 -
Схема X I .
Очистка вируса KR картофеля
ЛИСТЬЯ зараженных вирусом растений Hicotiana g l u t l n o s a .
Выдержать при 0 ° - 4°С / 1 8 ч а с . /
+ 0 , 5 М цитратный буфер /рН 6,5/,содеркащий 0 , 1 $ тиогликолевой кислоты и 0 ,01 моль/л ЭДТА
+ хлороформ
Измельчать в разыельчителе при 8000 об./мин. / 2 мин./
Центрифугировать при 5400 g /15 мин./
СУПЕРНАТАНТ
Фильтровать через стеклянный фильтр * 2
ФИЛЬТРАТ
Пропускать через колонку с Сефадексом Г-25
Элвировать 0,005 М боратным буфером /рН 9 , 0 /
ЭЛРАТ
Добавлять конц. соляную кислоту до рН 5,8
Центрифугировать при 5400 g /15 мин./
ОСАДОК
Суспендировать в 0 , 0 1 М ЭДТА-0 ,005 М боратном
буфере /рН $ . 0 /
Центрифугировать при 5400 g / 1 5 мин./
СУПЕРНАТАНТ'^
Диализировать против буфера для электрофореза
ДИАЛИЗАТ
Электрофорез
ФРАКЦИИ
Центрифугировать при 105000 g / 9 0 м и я . /
ОСАДОК
Суспендировать в 0,005 М боратном
буфере
г
/рН 9,0/
'^*
Центрифугировать при 5400 g /15 мин./
=-т-
—
_
' Примечание: Полученный СУПЕРНАТАНТ можно дальше очис­
тить также при помощи двухкратного дифференциального цен­
трифугирования / 9 0 мин. при 105000 g и 15 мин. при 5400g /
Первый раз осадок вирионов суспендируется в 0 , 0 1 U ЭДТА +
+ 0,005 М боратном буфере /рЯ 9/,второй раз в этом же б у ­
фере, но без ЭДТА.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 23 фекщюнность препаратов, получаемых методом Скотт а-Тежанаш-Томару.
Часть метода предварительной очистки BNgK с некото­
рыми изменениями была приспособлена и для очистки
вх^к
который слуотл контролем при электрофоретической очистке
вирусов. Листья растений
Nicotiana glutlnosa
измельча­
ли в 0,05 М цитратном буфере без добавления ЭДТА. Оконча­
тельное выделение производилось не оса«дением в изоэлектрической точке, а ультрацентрифугированием в течение 2 ча­
сов при 55000g .
Очистка вируса MJJ картофеля. Целью всех известных в
литературе /Bagnall и др., 1959; Wetter ,1960; Nohejl,
I960 Щербакова, 1964; Albrechtova, Klir, 1970/ методов
очистки В Щ было получение препаратов для производства ан­
тисывороток. Но ни один из них не обеспечивал достаточной
чистоты препарата, пригодного для физико-химических иссле­
дований вируса, или же выход препарата был очень малым.Поэ­
тому эти методы не могли найти у нас применения. Так как
физико-химические свойства B M J J K не были известны, то раз­
работка метода очистки этого вируса потребовала проведения
многочисленных опытов. Использованные приемы очистки оцени­
вали на основе результатов электронномикроскопического опре­
деления выхода вирионов и полноты отделения вирионов от рас­
тительных примесей.
В дальнейшем рассматривается основная часть накоплен­
ного при разработке метода очистки BMJJK экспериментального
материала в двух этапах: предварительная очистка и дополни-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 24 тельные приемы очистки.
Первоначально ВМттК выделяли из растительного
сока
улътрацекгрифугированием. Полученный препарат, сильно за­
грязненный растительными примесями, суспендировали в буфер­
ных растворах с разным рН. Было установлено, что в фосфат­
ном /рН 7,0/ и боратном /рВ 3,0/ буферах суспендировалось
одинаковое количество вирионов, лишь только с той разницей,
что в боратном буфере суспендировалось несколько меньше ра­
стительных примесей.
В целях освобовдения вирионов от растительных приме­
сей было испытано несколько методов.
Во-первых, был применен метод дифференциального осаж­
дения сернокислым аммонием. При 5^-ом растворе сернокислого
аммония осаждения вирионов не наблюдалось, при 10^-ом
рас­
творе осатаалось до 8G$ и в случае 20%-то раствора осавдались практически все вирионы. Во ясех случаях виряоны былг
загрязнены большим количеством растительных примесей.
Во-вторых, перед выделением вирионов была использова­
на обработка сока хлороформом с последующим нагреванием
до
55° ила 60°С. Из обработанного таким образом сока после оса­
ждения сернокислым аммонием и последующего суспендировали
препарата в 0,005 М боратном буфере /рН 9,0/ выход вирионов
составлял соответственно 25% и 15*. Однако препарат... полу­
ченный при такой обработке, был такие сильно загрязнен рас­
тительным материалом.
В-третьих, применяя дифференциальное осаждение серно­
кислым аммонием /5% и 20?/ в сочетании с четырехкратным диф­
ференциальным пентрифугированием /60 уин при 90000 g и 15мин
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 25 при 17000g / при дальнейшей очистке препарата, окончатель­
ный выход составлял только 3%, но и в этом случае вирионы
были также сильно загрязнены.
В-четвертых, после обработки забуфированно#о нитрат­
ным буфером /рН 6,5/ растительного сока н-бутиловым спир­
том, в растворе оставалось только 50$ вирионов. При даль­
нейшем осаждении вирионов 4$-ным раствором полиэтиленгликоля /м.в.6000/ из обработанного н-бутиловыи спиртом сока
осаждались практически все вирионы, остававшиеся в раство­
ре, при этом из них только половина суспендировалась в бс—
ратном буфере /рН 9,0/ и была загрязнена растительным мате­
риалом.
В-пятых, при осавдении вирионов добавлением этанола в
объемных отношениях 2:1 /сок:этанол/ и последующей адсорб­
цией растительных примесей на активированном угле был полу­
чен относительно чистый препарат, однако с низким выходом
вирионов /несколько процентов/. Опыты разделения раститель­
ных примесей путем адсорбции на гидроксилапатите оказались
безуспешными. Вирионы адсорбировались на гидроксилапатите
так сильно, что освободить их от адсорбента не удавалось при
элюировании ни в растворах с разным рН г ни в растворах раз­
ных концентраций солей.
Ни один из рассмотренных выше методов не обеспечивал
достаточной чистоты и выхода препаратов.
Новая методика очистки В М П К б ы л а в ы р а Я о т а н а н м т н а
основе наилучших полученных результатов предварительной очис­
тки и состояла в следующем /схема * 3/.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
о
- 26 Листья больных растений выдерживали в течение суток
при температуре - Ю ° С , измельчали в мясорубке, мацерат сус­
пендировали в 0,05 М цитратном буфере /рН 6,7/,содержащем
для предупреждения окисления 0,01 моль/л сернистокислого нат­
рия и 0,02 коль/л аскорбиновой кислоты. При дальнейшем пе­
ремешивании с хлороформом отделяли часть растительных при­
месей. Выход вирионов при этом составлял около 90%, а после
однократного дифференциального центрифугирования около 80$.
Для дальнейшей очистки были испытаны два приема:ультрацентрифугирование и электрофорез в градиенте плотности
сахарозы.
Бри ультрацентрифугировании в градиенте плотности са­
харозы /в течение 2 часов при 105000g / основная часть вирионов вместе с растительными примесями передвигалась в
среднюю зону пробирки, а некоторая агрегированная часть
осаждалась. С помощью данного метода невозможно было полу­
чить препарат достаточной чи;тоты. Такой препарат был полу­
чен лишь тогда, когда для отделения вирионов от раститель­
ных примесей был использован метод зонального электрофореза
в градиенте плотности сахарозы.
Очистка Ш р К , BMJJK и ВХдК при помощи электрофореза.
С целью изучения возможностей полной очистки
ШдК,
ВМттК
и ВХдК при помощи зонального электрофореза в градиенте
плотности сахарозы, а также изучения поведения указанных
вирусов при электрофорезе были проведены следующие опыты.
В начале для электрофореза использовали электрофоретическую колонку серийного производства /тип АЭЗ/,приспособлен­
ную нами для зонального электрофореза в градиенте плотности
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 27 Схема R 2. ОЧИСТКА ВИРУСА И
Листья зараженных вирусом растений
п
КАРТОЧКИ
Solanum demissua или
S.acaule
Быдерлшть при -10°С /24 часа/
Измельчать при помощи мясорубки
+ 0,05 М нитратный буфер /рН 6,7/,содержащий 0,01 моль/л
Sa 2 SO, + 0,02 моль/л аскорбиновой кислоты
+ хлороформ
Смесь разменивать в рззмельчителе при 8000 об/мин /30 сек./
Центрифугировать при 5400 g /15 мин./
СУПЕРНАТАНТ
Центрифугировать при 90000 g /60 мин./
ОСАДОК
Суспендировать в 0,005 М боратном буфере /рН 9,0/
Центрифугировать при 17000 g /30 мин./
Супернатант
Диализ против боратного буфера для электро­
фореза /рН 8,6/
ДИАЛИЗАТ
Центрифугировать при 17000g /30 мин./
/при необходимости/
СУПЕРНАТАНТ
Электрофорез
ФРАКЦИИ
При необходимости
*
можно повторять
Пентрифугировать при 90000 g
/60 мин./
ОСАДОК
^~Z „
„ ,.„«- .,
Суспендировать в 0,005 М
боратном буфере /ры 9,0/
Центрифугировать при
I7000 g /15 мин./
!ШШ=ШШ2=8ШШ1
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 28 сахарозы. Для создания буферной системы использовали наи­
более распространенный в практике вирусологии боратный бу­
фер /рН 8,6/ / van Regenaortel
,1964 б; Poison, Russell,
1967/. Вирусный препарат, применяемый для электрофореза,
лиализировали против этого же буфера. Длительность электрофоретического процесса в данных условиях /сила тока
30 мА/ в зависимости от вируса была 30-38 часов. Для всех
вирусов с целью сравнения скорости их движения использова­
ли феноловый красный. При электрофорезе в колонке образо­
вывались три видимые глазом зоны, которые по порядку сни­
жения скорости движения располагались следующим образом:
первая - феноловый красный, вторая, зеленая - растительный
материал и третья, нижняя белая, опалесцирующая зона - вирионы. После окончания электрофореза измеряли расстояния
слоев от исходной линии и собирали фракции по 2 мл каждая
из нижнего выхода колонки. Спектры поглощения фракций оп­
ределяли в области 220-320 нм, проверяли содержание вирис—
нов в них при помощи электронного микроскопа и их инфекционность на индикаторных растениях.
Для лучшего сопоставления результатов с разными виру­
сами нами введена величина а,
, которая показывает во сколь­
ко раз при данных условиях нижний край зоны фенолового
красного передвигается быстрее нижнего края вирусной зоны.
По скорости движения вирусных зон в данной буферной
системе изучаемые вирусы можно расположить в следующий ряд:
BMJJK,
BNgK и ВХдК. Скорость движения
BMJJK
наивысшая
/ &= 5,6/. В связи с этим для отделения растительного ма-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 29 ?ериала от варионов у этого вируса, по сравнению с другими
вирусами, требовалось наибольшее время. При сравнении с ли­
тературными данными скорость движения BMJJK оказалась наи­
более близкой к скоростям движения вируса У картофеля /БУК/,
скорость движения ш г £ / а. = 10,5/ значительно отличалась
от скорости вируса огуречной мозаики /БОМ/, но была близкой
К скоростям движения вируса некроза табака /ВНТ/. Величины
сь , вычисленные по литературным данным /van Regeamortel,
1964 б; Poison,Russell, 1967, соответственно/ следующие: для
БУК - 5,4 и 4,4; ВОМ - 2,5 и 2,8 и ВНТ - 8,8 и 11,3.Скорость
движения ВХдК была незначительной /с* = 36,5/; что согла­
суется и с литературными данными.
Фракции, содержащие вирионыг оказались чистыми от рас­
тительного материала. В дальнейшем эти фракции соединяли и
вирионы выделяли ультрацентрифугированием, /см.схемы №1 и
№2/. Полученные препараты использовали для изучения физико-химических свойств вирусов и для производства высококаче­
ственных антисывороток»
Несмотря на то, что при помощи зонального электрофо­
реза в градиенре плотности можно с успехом очищать вирусные
препараты от растительных примесей, этот метод не нашел ши­
рокого применения в вирусологической практике как препара­
тивный метод. По нашему мнению- имеются по меньшей мере две
причины этого:: длительность электрофоретического процесса
/20-30 часов и более/ я относительно малые очищаемые объе­
мы /1-2 мл/ в случае использования стандартной аппаратуры.
Для преодоления указанных недостатков нами была разработана
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 30 модификация метода зонального электрофореза и создана
простая аппаратура /рис.3/. Эта аппаратура состоит из ко­
лонки диаметром 36 им и длиной 90 мм, двух платиновых
электродов, двух электродных сосудов и изогнутой трубки
диаметром 20 мм для их соединения. В приборе использовали
трис /гидроксиметил/ ашнометан-глищшовкй буфер /рН 8,5/
/Davis
,1964/ и в колонке ступенчатый градиент плотности
сахарозы в этом же буфере.
При проверке нового прибора использовали два пред­
варительно очищенных вирусных препарата / BNgK
и ВХ^К/.
Препараты для электрофореза были приготовлены таким ке
образом как и при предыдущем методе, лишь с той разницей,
что диализ проводили против трис-глицинового буферного
раствора вместо боратного буфера.
Для отделения растительного материала от
BNgK.
и
ВХдК требовалось 4-6 часов. При этом напряжение, наложен­
ное на электроды, составляло 1000 в, сила тока не более
1,5 мА.
При электрофорезе в колонке также образовывались
три зоны, как было показано выше. В ходе электрофореза
отмечалось различие в скоростях движения зон в боратном
и трис-глициновом буферах, что связано, повидимому.с из­
менениями в величинах зарядов поверхности молекул под
действием буферной системы.
Полученные препараты т$.
и ВХ 3 К отличались высо­
кой чистотой. Инфекционность их превышала инфекционность
исходных /введенных в колонку/ препаратов - ВХоК в 2 раза,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 31 -
Рис.3. Прибор зонального электрофореза.
/ 1 к 2 - электродные сосуды, 3 - колонка для
электрофореза, А -трубка для соединения электротных сосудов, 5 и 6 - краны для выпуска раствора/.
a B N H K в 1,3 раза.
Наши экспериментальные данные позволяют предпола­
гать, что этот метод применим и для очистки других вирусов
/в том числе- х ВЩ-тК/, устойчивых в трис-гллциновом буфе­
ре.
Предложенная нами модификация электрофоретического
метода отличается быстротой проведения очистки. Положитель­
ным является также то, что. из-за малой плотности тока на
электродах исключено- нагревание раствора и доведено до ми­
нимума вредное влияние продуктов электролиза.
В процессе выполнения основной задачи - очистки
ви-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 32 русов, нами изучено и распределение вирионов во фракциях,
возникающих при электрофорезе. Таких фракций в каждой зоне
имелось несколько. Проверка инфекционности на индикаторных
растениях, а также электронномикроскопическое просматривание
фракций, полученных в колонке типа АЭВ, показали, что ос­
новная часть вирионов находилась в белой, опалесцирующей
зоне» При этом было установлено, что многие из остальных
фракций, в том числе и из зоны растительного материала бы­
ли такке инфекционными /до 6 см от стартовой линии/. В
связи с тем, что все фракции выпускались из нижней частя
колонки, возник вопрос: не связано ли это явление с загря­
знением указанных фракций. Для проверки этого проводились
повторные опыты с двумя вирусами / BNgK и ВХ^К/. При
этом часть фракций выпускалась из колонки сверху при помо­
щи капилляр-сифона. И в таком случае верхние, быстро движу­
щиеся фракции, оказались инфекционными, что дает основание
предполагать о наличии вирусных микрофракций, отличающихся
от основной фракции по заряду поверхности вирионов. Оста­
лось, однако, неясным, имеются ли эти быстро движущиеся вирионы с таким же зарядом в клетках,или заряд их изменился
только в ходе выделения.
На основании проведенных опытов можно заключить, что
метод зонального электрофореза в градиенте плотности, а осо­
бенно модифицированный нами метод, пригоден для отделения
растительного материала от BNgK. , B M J J K и BXgK. Этот v.eтод обеспечивает достаточную чистоту препаратов, которые
можно использовать для физико-химических исследований. При
этом следует отметить, что явление возникновения микрофрак-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 33 ций вирусов при электрофорезе может мешать разделению этих
вирусов при одновременном присутствии их в исходном матери­
але.
Физико-химические свойства BdgK и BMJJK
Как уже выше отмечалось, до проведения настоящей ра­
боты физико-химические свойства ВПК и ВМК были мало изу­
чены,. так как отсутствовали достаточно чистые их препараты.
Известны были лишь точки термической инактивации ВПК /Нурмисте, 1962 б;
Ар»
. 1966/ и ВМК /Bode
Д968/ и разме­
ры вирионов ВМК / Brandes и др., 1959; Hitchbora, Hills,
1965/. Поэтому изучение физико-химических
СЕОЙСТВ
указанных
вирусов представляло собой задание большой ваотэсти.
Полученные нами чистке препараты дали возможность изу­
чить ряд физико-химических свойств вк-^с
и ВМ-^К .
Свойства BNjjK . Электронно-микроскопические снимки от­
тененных препаратов показали, что этот вирус представляет
собой "сферическую'' частицу со средним диаметров 37 нм.Средний диаметр вирусных частиц на снимках негативно контрастированных препаратов - 30 нм.
Электрофоретическая подвижность вирионов в буферном
растворе с ионной силой 0,1 колебалась в пределах от 10,02*
* Ю - 5 с^/в.сек /рН 3,78/ до - 1,92'Ю"5см2/в.сек/рН 9,34/.
йзоэлектрическая точка ss^s. при рН 5,8.
Растворы BKgK имеют в ультрафиолетовой области света
характерный для нуклеопротеида спектр поглощения с максиму­
мом при 259 нм и минимумом при 241-241 нм. Отношения оптиче­
ских плотностей
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 34 Д
макс
= 1,35-1,40; Л
Д мин-
280
= 0,594 - 0,596.
Д 260
Абсорбционный индекс вируса 4,9 /см^/мг/.
Ш р К является вирусом, содержащим рибонуклеиновую
кислоту /РНК/. Нуклеотидный состав РНК в молярных процен­
тах соответственно: АМФ:ГМФ:ЦЖ:УМФ - 22,2:26,1:22,3:29,4.
Содержание фосфора в вирионах составляло 1,74?,а со­
держание РНК, расчитанное по содержанию фосфора и нуклеотидному составу - 18?.
Аминокислотный состав белка оболочки в к ^ в пересче­
те на остатки аминокислот - Лиз:Гис:Арг:Асп:Тре:Сер:Глу:
Про:Гли:Ала:Вал:Мет:Илей:Тир:Фен:Цис 19:4:23:47:25:38:32:
26:28:26:37:6:20:34:16:12:0.
BNj^c устойчив в растворах солей щелочных металлов
/ LiCl, NaCl, K01, Ы С Н Х О О /
5*10
в пределах концентраций
- 2,0 М, за исключением 2,0 М раствора хлористого
лития, в котором внрионы разлагались на нуклеиновую кисло­
ту, выпадавшую в осадок.и белок.
В 2,0 М растворе уксуснокислого лития вирионы оса,иались г но не разлагались. Это указывает на существенную
роль аниона при разложении вирионов. В опытах с растворами
солей лития, натрия и калия установлена критическая концен­
трация /0,05 М/, при которой вирионы осаадались частично
или полностью.
При изучении влияния солей двухвалентных металлов на
вирионы
выяснилось, что в присутствии ионов магния, при
его концентрации в растворе в пределах 5'Ю - 4 - 2,0 а оса­
ждались все вирионы. Ионы кальция при концентрации наке
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 35 1,0 М вызывали полное ос&иение вирионов, а в 1,0 М раство­
ре кальция вирионы частично разлагались.
Следует такке отметить, что под влиянием вышеуказан­
ных солей щелочных металлов возрастала инфекционность виру­
са в области концентрации солей 5'10~4 - 5 # 10~ г М.
Предполагая, что* в ж
может быть одной из форм вируса
огуречной мозаики /ВОМ/ / Agur
, I968 а/ -мы сравнивали
установленные нами свойства BNgK с литературными данными
о физико-химических свойствах некоторых штаммов БОМ / Миrant , 1965; Карвг и др., 1965; Franckl
и др., 1966;
van Regenmortel ,1967; Linnasalmi ,1966; Takanami,
Tomaru , 1969/. Выяснилось, что эти вирусы имеют одинако­
вую геометрическую форму, размеры и содержание РНК, но они
различались по аминокислотному составу белка оболочки, нуклеотидному составу РНК и поведению в растворах солей ще­
лочных металлов. Следует отметить, что и отдельные штаммы
ВОМ, изучавшиеся разными исследователями, также различались
по аминокислотному составу белка и нуклеотидному составу
РНК.
Все вышеизложенное позволяет заключить, что BNgK пред­
ставляет собою особую, до сих пор не изученную, форму ВОМ,
наиболее близкую по своим физико-химическим свойствам к фор­
ме Q . Расхождение в некоторых химических свойствах и в хи­
мическом составе между Ш д К и формой q BOM, а также между
формами ВОМ позволяют судить о большой химической гетероген­
ности форм ВОМ.
Свойства BMjjK. Растворы чистых препаратов BVj^K имели
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 36 поглощение в ультрафиолетовой части света, которое харак­
терно для нуклеопротеида. Спектры, коррегированные в отно­
шении рассеяния света, имели максимум оптической плотности
при 267 нм, а минимум оптической плотности при 245 нм. От­
ношение оптических плотностей:
Д ма—
Д мин
= 1,29,
Дроп
= 0,958. В некоррегкрованных относительно рассеива­
ли)
ния света спектрах максимум оптической плотности при 257-261 нм, а уинкуум при 245-246 нм.
На основе спектров поглощения вирусов / Paul, 1959a,
б/ установлено, что срепнее содержание нуклеиновой кислотн
в вирионах
BMJJK
равно 4,5$, а молекулярный вес их нахо­
дится в пределах 90 * Ю 6 - 100 *10 6 .
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 37 ВЫВОДЫ
1. При изучении динамики содержания вирионов в расте­
ниях
Nicotiana glutiaosa
, зара«енных
В растениях Solanum demissum
BMJJK
и
BNgK или ВХдК И
S. acaule .зараженных
установлено, что содержание вирионов изменяется скач­
кообразно. Максимальная концентрация BNgK и ВХдК наблюда­
лась на JO-й день, a
BMJJK
через три недели после заражения.
Содержание HNgK -после кратковременного максимума быстро
снижалось почти до нуля. Полученные- в опытах результаты по­
казывают необходимость учитывать происходящие в ходе разви­
тия заболевания большие колебания в концентрации вирионов и
собирать листья для получения вирусных препаратов при макси­
мальном содержании в них вирионов.
2. Содержание макроэлементов
И микроэлементов
/ Na, к, Са, Mg , Р /
/ Fe, Cu, Zn, Mn, Мо, В, Sr /
в за­
раженных BSgK и ВХдК листьях Nicotiana glutinoea также
менялось скачкообразно. Повышение содержания всех этих эле­
ментов наблюдалось на третий день после инокуляции, затем
следовало понижение, которое через несколько дней, в зависи­
мости от элемента и от вируса, сменялось новым повышением ,
при этом во время второго пика концентрация некоторых эле­
ментов в больных растениях превышала концентрацию их в здо­
ровых растениях до 1,5 - 2,0 раз.
Предлагается гипотеза о взаимозависимости между ходом
болезни, вызываемой вирусной инфекцией, скачкообразным ха­
рактером изменения концентрации инфекционного вируса и та-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 38 намикой содержания минеральных элементов в больном расте­
нии.
Главной причиной хлоротических явлений растений при
вирусной инфекции может быть образование комплексов или
солей между вирионами или продуктами синтеза вируса /ви­
русная РНК, вирусные белки и т.д./ и металлами. Такие сое­
динения с металлами могут в конечном итоге вызнвать кажу­
щееся /а может быть и действительное/ снижение концентра­
ции вирионов в больном растении и выводить из процесса об­
мена веществ нужные для растения минеральные элементы.При
этом признаки и ход болезни в растении при вирусной инфек­
ции определяются сродством вирионов или продуктов синтеза
вируса /или одновременно обоих/ по отношению к определен­
ным металлам.
3. Создана несложная аппаратура для быстрой очистки
вирусов от растительных примесей усовершенствованным ме­
тодом зонального электрофореза в градиенте плотности саха­
розы, обеспечивающая хороший выход препарата и удовлетво­
рительное его качество. Длительность процесса с использо­
ванием трис-глицинового буфера при напряжении 1000 в - 46 часов.
4. Впервые получены чистые препараты BNjc
. Для
этого были разработаны два способа их получениягвыделение
вирионов осавдением в изоэлектрической точке и очистка при
помощи а/дифференциального центрифугирования и б/зонально­
го электрофореза в градиенте плотности сахарозы.
5. Разработан метод получения чистого препарата
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 39 BMTJK С использованием дифференциального центрифугирования
а зонального электрофореза в градиенте плотности сахарозы.
Впервые получен этим методом препарат BM-QK достаточной
чистоты и в количестве, позволяющем изучить его физико-хияические свойства.
6. Полученные чистые препараты дали возможность изу­
чить основные физико-химические свойства BNgK • Установ­
лено, что вириогг BNJ5 имеет "сферическую" форму со сред­
ним диаметром при оттененных препаратах 37 нм, а при нега­
тивно контрастированных - 30 нм; содержание РНК в вириопах - 18$, нуклеотидный состав РНК в молярных процентах
АМ:ГМФ:ЦМФгУМФ - 22,2:26,1:22,3:29,4; изоэлектрическая
точка вируса при рН 5,8; состав белка оболочки вируса, вы­
раженный в остатках аминокислот: Лиз:Гис:Арг:Асп:Тре:Сер:
Глу:Про:Гли:Ала:Вал:Мет:Илей:Тир:Фен:Цис - 19:4:23:47:25:
38:32:26:37:6:20:34:16:12:0.
В отношении физико-химических свойств выяснилось не­
которое сходство BNgK с ВОМ: одинаковая геометрическая
форма, размеры и содержание РНК. Однако вирусы различались
по аминокислотному составу белка оболочки, нуклеотидному
составу РНК и поведению в растворах солей некоторых опнои двухвалентных металлов. На основании имеющихся данных
делается вывод, что в случае Ш д К судя по его физико-хи­
мическим свойствам мы имеем дело с до сих пор не изученной
формой ВОМ,. наиболее близкой по своим своРствам к 4<зрме Q.
7. Определены впервые следующие физико-химические
свойства
BMJJK:
спектр поглощения в ультра4иолетовой об-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 40 ластм света / коррегирован в отношении рассеивания света/,
характерный для нуклеопротеида, имеет максимум оптической
плотности при 267 нм; минимум оптической плотности - при
245 нм. Отношения оптических плотностей Л макс = I,29 и
Д мин
-2S = 0,958.
Д
260
Среднее содеркание нуклеиновой кислоты в вирионах рав­
но 4,5?.
8. Открывшаяся в результате проведенных исследований
возможность получения чистых препаратов BNgK позволяет при­
ступить к изготовлению высококачественных антисывороток на
этот вирус и изучить его распространенность на разных эта­
пах селекции и семеноводства, установить степень вреда,нано­
симого им картофелеводству и вьюснить пути инфекции, что не­
обходимо для разработки мер борьбы с ним.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 41 По материалам диссертации опубликованы следующие
работы:
1. Некоторые данные о так наз. вирусе N картофеля.Изв.АН
ЭССР,- Биология, 17 /4/:385-388,1968 /рез.зет.,англ./
/в соавторстве с К.Олсперт и К.Тарасовой/.
2. Методика очистки вируса М картофеля. Изв.АВ ЭССР, Биоло­
гия, 19/3/:231-234, 1970 /на англ.яз.,рез.эст.,русск./
/в соавторстве с К.Олсперт и К.Тарасовой/.
3. Об исследовании так наз. вируса я картофеля электрофоретическим методом. Изв.АН ЭССР, Биология, 20/1/:79-63,1971
/на эст.яз.грез.русск,,англ./ /в соавторстве с К.Олсперт
и К.Тарасовой/.
4. Некоторые данные о физико-химических свойствах вируса N
картофеля. Тезисы докладов У1 Всесоюзного1 совещания по
вирусным болезням растений, ч.11:93, I97I.M. /в соавтор­
стве с К.Олсперт/.
5. Несложный и быстрый метод зонального электрофореза для
окончательной очистки некоторых вирусов растений. Изв.АВ
ЭССР, Биология, 2I/2/:I89-I92,I972.
6. Содержание неорганических элементов в инокулированных
листьях Nicotiana glutinosanpa инфекции вирусами к и X
картофеля. Изв.АВ ЭССР, Биология, 21 /4/:357-365,1972
/рез.эст.,англ./ /в соавторстве с Х.Хё'дреярв/,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Улрих Густавович Хёдреярв. Очистка вирусов М и Н картофеля
и изучение некоторых их физико-химических свойств. Авто­
реферат диссертации. На русском языке. Подписаяо к печати
25/J 1973. ГГеечатнах листов 2,75. Учетва-издательских лис­
тов 1,71. Тираж 250. Заказ * ЧВ.
Ротапринт АН! ЭССР, г . Таллин, ул. Сакала, 3 .
Бесплатно.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
797 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа