close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

732

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
W9/
ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА АН СССР
и
£.
:
На правах рукописи
10. В. БУКИН
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ТОКСИЧЕСКОГО
ДЕЙСТВИЯ НА ЦЕНТРАЛЬНУЮ НЕРВНУЮ
СИСТЕМУ АНТАГОНИСТОВ ВИТАМИНА В6 —
ИЗОНИКОТИННЛГИДРАЗИДА И ТОКСОПИРИМИДИНА
Автореферат диссертации на соискание
ученой степени кандидата биологических
наук
Москва — 1965
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
^>
i
Токсикология
Нитамины
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
\
ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БЛХЛ ЛИ СССР
На правах рукописи
Ю. В. БУКИН
ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМА ТОКСИЧЕСКОГО
ДЕЙСТВИЯ НА ЦЕНТРАЛЬНУЮ НЕРВНУЮ
СИСТЕМУ АНТАГОНИСТОВ ВИТАМИНА В6 —
ИЗОНИКОТИНПЛГИДРЛЗИДЛ И ТОКСОПИРИМНДИИЛ
Автореферат диссертации
па соискание ученой степени кандидата
биологических паук
ш
Москва — 19G5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ИЗ ИНСТИТУТА БИОЛОГИЧЕСКОЙ И МЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ
АМН СССР и ИНСТИТУТА СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТОЙ
ХИРУРГИИ АМН СССР
Научный руководитель — действительный член А Н / С С С Р
А. Е. БРАУНШТЕПН
Защита состоится на заседании Ученого Совета Институ­
та биохимии и.м. А. Н. Баха АН СССР (Москва, Ленинский
проспект, 33) «
»
Автореферат разослан «
1965 г.
»
1965 г.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
I. ВВЕДЕНИЕ
Пиридокснн*) — единственный витамин, при недостатке
которого у животных и человека наблюдаются эпилептиформпыс припадки судорог." Не удивительно поэтому, что изучению
пиридокснна в нейрохимическом аспекте посвящено значи­
тельное число работ. В условиях клиники установлено, что
глубокое нарушение функции ЦНС может быть следствием
нарушения утилизации витамина Be в организме. В опытах
на животных показано, что при алиментарном В6-авитамннозе
в мозге снижается активность ряда ппридоксалевых фермен­
тов (амннотрансфераз, глутаматдекарбоксплазы), падает
концентрация таурпна и глутатнона, накапливается значи­
тельное количество цистатионииа и т. п., однако убеди­
тельных доказательств существования прямой -связи между
обнаруженными биохимическими сдвигами при В6-авитамипозе и изменением физиологической активности мозга полу­
чить до настоящего времени не удалось.
Одним из важных экспериментальных подходов в изуче­
нии молекулярных звеньев патогенетической цепи, лежащей
в основе нарушения функций ЦНС при Вб-авитоминозе, яв­
ляется исследование механизма действия антагонистов пирн;оксипа. Различные по своему химическому строению антаго­
нисты витамина В6 при пероральпом или парентеральном
*) В соответствии с новой терминологией наименование «лнридоксин»
относится ко всем витаминам группы В 6 в целом; спиртовая форма ви­
тамина В 6 обозначается термином «пирндоксол».
В тексте приняты следующие сокращенные обозначения: ПЛЛФ —
киридоксальфоефат, ПОЛФ — пиридоксолфосфат, ПАМФ — пиридоксамннфосфат, ИНГ — изоникотннилгидразид, ИНГПАЛ — нзоникотнпилгндразон гшридокеаля, ИНГПЛЛФ — изоннкотшшлгидразон ПАЛФ, ТП —
токсопирнмнднн (2-метил-4-ами1*о-5-окснметилшфнмндин), ТПФ — токсопиримндинфосфат (2-метнл-4-ашшо-3-окс)1мет11лпнрим1ГДинфосфат), глутаматдекарбоксилаза — 1^-глутамат-1-карбокен-лиаза (КФ 4.1.1.15), ппридоксалькнназа — АТФ: пнридоксаль-5-фосфаттрапсфераза (КФ 2.7.1.33),
ПОЛФ, ПАМФ-оксидаза — пиридокеамин: 0 2 — оксидоредуктаза (дезамннпрующая; КФ 1. 4. 3, 5), истниыми субстратами которой являются,
как выяснилось, ПОЛФ и ПАМФ.
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
введении вызывают у животных характерные конвульсии,
которые при тяжелом отравлении закапчиваются гибелью
животных. Изучение механизма токсического действия анта­
гонистов витамина В 6 на ЦНС приобретает тем большее
значение, что такие антагонисты пиридоксина, как антибио­
тик D —и DL — пиклосерин, карбонильный реагент ИНГ
(медицинские препараты изопназид, тубазид)
и близкий к
ИНГ фтивазпд, находят широкое применение в практике ле­
чения туберкулеза и нередко вызывают у больных функцио­
нальные расстройства со стороны ЦНС и психики. Практиче­
ский интерес представляет также изучение механизма судо­
рожного действия ТП — ппрнмндинового компонента молеку­
лы тиамина. Этот аптиметаболит, проявляющий свойства
структурного аналога и биологического антагониста витами­
на В 6 (Лбдергальдеп, 1954; Макипо и др., 1954), экскретируется в ощутимых количествах с мочой после нагрузок тиа­
мином (очевидно, в результате расщепления витамина Bi в
тканях и бактериальными тнампназамн кишечника) и явля­
ется, таким образом, естественным антагонистом пнридок­
сина.
Задавшись целью провести сравнительное исследование
токсического действия И Н Г и ТП, мы поставили перед собой
три основные задачи: 1) выяснить, в какой мере острое отрав^
ление И Н Г и ТП может быть отнесено па счет аммиачной
интоксикации мозга (н каковы причины этой интоксикации),
2) оцепить возможную патогенетическую роль подавления ак­
тивности глутаматдекарбоксилазы мозга в проявлении судо­
рожного н летального действия И Н Г и ТП и 3) исследовать
возможное влияние ИНГ, ТП и их дериватов, образующихся
в организме, на биосинтез ПАЛФ в мозге.
Работа носила, в целом, поисковый характер. Вопрос об
аммиачном отравлении заинтересовал пас в связи с сообще­
ниями, итальянских авторов (Прециози н Порчелаттн, 1953;
Чедрапголо и др., 1953) о резком повышении уровня содер­
жания аммиака в крови кроликов, отравленных ИНГ, и за­
щитном действии массивных доз глутаминовой кислоты при
отравлении ИНГ. Представлялось целесообразным прове­
рить, не являются ли смертельные судороги при отравлении
ТП также следствием острой аммиачной интоксикации орга­
низма и не связано ли накопление аммиака в крови и ткане­
вой жидкости при отравлении И Н Г (а, возможно, и при от4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
равлешш ТП) с торможением активности пиридоксалсвых
ферментов, играющих ответственную роль п синтезе мочеви­
ны. Результаты соответствующих опытов (см. раздел III,
п. 1—2) не подтвердили представлений итальянских авторов.
Мы не только не обнаружили признаков аммиачной инток­
сикации при отравлении ТП, но и не смогли подтвердить дан­
ные, полученные итальянскими исследователями в отноше­
нии природы токсического действия ИНГ.
Убедившись в опытах с субарахноидальными инъекция­
ми, что токсическое действие И Н Г и ТП обусловлено непо­
средственным влиянием изучаемых антагонистов пнридоксина на мозг, мы сосредоточили наше внимание па глутаматдекарбоксилазе мозга — высокоактивной специфической пирпдоксалевой ферментной системе, которая проявляет высокую
чувствительность к недостатку пиридокспиа в пище. В отли­
чие от японских исследователей (Нишнзава, 1957; Намба,
1957; Томобе, 1958; Нишнзава и др., 1958; 1959) мы пришли
к выводу, что снижение в суммарной ткани мозга активности
глутаматдекарбоксилазы и уровня содержания у а М 1 1 1 1 ° "
масляной кислоты (продукта
декарбоксилнрования L-глутаминовой кислоты) не играет существенной роли в проявле­
нии судорожного и «летального действия ТП (Букин, 1959).
К аналогичным выводам пришли позднее и другие исследо­
ватели (Розен и др., 1960; Макино и др., 19G1, 1963).
Заключительным разделом работы явилось изучение ан­
тагонизма между витамином В 6 , с одной стороны, и И Н Г и ТП
с другой, на уровне биосинтеза ПАМФ и ПАЛФ. ПЛМФ,
как известно, проявляет каталитическую активность в реак­
циях ферментативного переамннировапня; ПАЛФ является
универсальным кофермепто.м пиридоксалсвых ферментных
систем. Американские исследователи Бани и Вильяме (I9G0)
нашли, что при отравлении животных антагонистами пири­
докспиа (ИНГ, ТП, 4-дезоксипиридоксип) в ткани мозга рез­
ко снижается содержание ПЛМФ и ПАЛФ, однако механизм
этого явления ле изучили. По соврсмеиггым представлениям
(Спелл, 1962; Букин, 1964) биосинтез ПАЛФ в ткани пече­
ни, почек и мозга может протекать путем прямого фосфорилирования пирндоксаля пирпдоксалькнпазон (реакция 2 па
рис. 1) и путем фосфорилирования пнридоксола к пиридоксамииа пирпдоксалькнпазон с последующим окислением их фос5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ШфИДОКСОЛ
—J.
5».
ПОЛФ
ппридоксаль
(2)
_—_;».
ПЛЛФ
I H)
(3)
| (о)
пиридоксамни
:>. ПЛМФ
Рис. 3. Пути биосинтеза пирндоксалевых кофсрментоа в
ткани мозга.
фориых эфиров в ПЛЛФ 'под действием специфичной
ПОЛФ,ПЛМФ-оксндазы (реакции 1 + 4 и 3 + 5). Фосфорилирующнм агентом в реакциях пирндоксалькнпазы служит
ЛТФ, активирующим металлом — цинк. или магнии.
ПОЛФ, ПЛМФ-оксидаза в качестве простетпческой группы со­
держит флавпнмопонуклеотнд. По данным Снелла и сотр. не­
которые гидразопы пирпдоксаля, в том числе ИНГПЛЛ, в опы­
тах in Vitro проявляют свойства активных ингибиторов пиридоксалькнпазы (Мак-Кормпк и Снелл, 1959; 1961), а неко­
торые структурные аналоги ПЛЛФ (4-дезоксипиридокеннфосфат, окспм пнридоксальфосфата и фосфоргшй эфир 4-пггридокенловон кислоты) тормозят in Vitro ПОЛФ, ПЛЛ1Ф-оксидазу (Вада и Снелл, 1961). Действие ингибиторов ппридоксалькнназы и ПОЛФ, ПЛМФ-оксидазы in VjVo и их возможная
;роль в симптоматике острого отравления животных ИНГ, ТП
к другими антагонистами пнрндокешга оставались не иссле­
дованными.
П. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Животные, диета и отравление антагонистами пнридоксина. Исследования были выполнены, в основном, на кры­
сах-самцах весом от 70 до 240 г. Помимо крыс (около 550-ти
животных) в отдельных опытах использовали мышей, мор­
ских свинок и кроликов.
Опыты с ИНГ проводились на крысах, содержавшихся
на обычном лабораторном рационе. В наших опытах кон­
вульсии и гибель практически у всех подопытных животных
наблюдались при парентеральном введении 40 мг ИНГ на
100 г веса тела. На фоне этой дозы ИНГ было исследовано
влияние различных агентов на течение отравления. Опыты с
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
отравлением животных смертельными дозами ТП проводили
на крысах, получавших в течение 5-тн —30-ти дней рацион,
лишенный витамина Вб. Абсолютная смертельная доза ТП
для крыс, находящихся в состоянии Вб-гиповптамипоза, со­
ставляла в соответствии с Дозировкой, установленной, япон­
скими исследователями в опытах на мышах (Макино и др.,
1954), 10 мг ТП на 100 г веса тела.
Растворы И Н Г и ТП готовили на дистиллированной во­
де, нейтрализовали до рН 7,0—7,2 и вводили: И Н Г — впутрибрюшпнпо, ТП — годкожно в объеме 2 мл. Д л я субарахноилальных инъекций (по Лнпдбергу и Энслеру, 1950) неболь­
ших доз пиридоксаля, ПАЛФ, ТПФ, ИНГПАЛ, И Н Г П А Л Ф и
ЭДТА центральные растворы перечисленных веществ готови­
ли на 0,9%-ном растворе NaCl. Объемы растворов, вводи­
мых субарахноидалыю, не превышали 0,3 мл; контрольные
крысы после субарахпоидалыюго введения 0,3 мл физиологи­
ческого раствора патологических симптомов в поведении не
обнаруживали.
Определение азотистых экстрактивных веществ крови и
ткани мозга. Содержание N-NH 3 и N амидной группы глутампна и мочевины определяли в нейтрализованных безбелко­
вых фильтратах цельной крови, выпущенной в приблизительно
равный объем 10% ТХУ при отсечении крысе головы (или из
уха кролика). Для исследования содержания N—NH 3 и
N амидной группы глутамина, а также содержания глутамиповой и у-амнномасляноп кислот в мозге крыс, отравлен­
ных И Н Г или ТП, животных (весом от 70 до 90 г) замора­
живали путем быстрого погружения в жидкий N 2 , мозг из­
влекали, растирали в жидком азоте и фиксировали в. охлаж­
денном подкисленном 96%-ном этиловом спирте. Д л я прове­
дения анализов брали водный слой спиртовых экстрактов
ткани, обработанных хлороформом. Азот NH 3 и N амидной
группы глутамина, освобождающийся в виде NH 3 при гидро­
лизе в N растворе H2SO4, определяли гипохлоритпым мето­
дом (Любошипскип и Залт, 1954) после вакуумной отгонки
(Спек, 1949). Содержание глутамиповой и у " а м ш 1 0 м а с л я ной кислот в экстрактах мозга определяли путем количест­
венной фотометрии их медпо-шшгидрпновых комплексов
(Гири, 1953), извлеченных с хроматограммы после двукрат­
ного пропускания смеси бутиловый спирт-уксусная кислотавода ( 4 : 1:5, верхний слой).
7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Содержание мочевины в крови определяли уреазиым ме­
тодом (Балаховский С. Д. и И. С. Балаховский, 1953); осво­
бождающийся NH 3 фотометрировали с реактивом Несслера
после отгонки в чашках Конвея.
Определение активности ферментов. Активность глутаматдскарбоксилазы мозга измеряли в гомогснатах ткапи или
п суспензиях ацетопнрованного препарата ткани мозга мано­
метрическим методом (Роберте и Френкель, 1951). Актив­
ность пиридоксалькпназы в гомогенатах ткани мозга опре­
деляли по степени
активации
глутаматдекарбоксилазы
in Vitro за счет внесения в инкубируемую смесь пиридоксаля
и АТФ. Активность пирндокегмышназы в надосадочноп жид­
кости гомогепатов ткани мозга (30 мин. центрифугирование
при ISOOOXfi; на холоду) измеряли по приросту в инкубируе­
мой смеси ПАЛФ, который определяли в виде фенилгидразона (Вада и Спелл, 1961). Активность ПОЛФ, ПАМФ-оксндазы измеряли по приросту в инкубируемой смеси ПАЛФ за
счет окисления ПАМФ; в качестве источника фермента ис­
пользовали препарат 4-ой стадии очистки; полученный из
печени кролика по Вада и Снеллу (1961).
Краткая характеристика некоторых химических препара­
тов. Пнридоксаль (гидрохлорид мопоэтилацеталя) и ПАЛФ
(моногидрат) —- препараты фирмы Хоффман ля Рош. ПАМФ
(дигндрохлорпд дигидрат) — препарат 99%-ной чистоты
по N, синтезированный и предоставленный нам М. В. Балякиной (ВНИВИ)*. И Н Г — препарат Н И К Ф И ; перекристал­
лизован нами из горячей поды после обработки активирован­
ным углем; темп. пл. 170,5°. ИНГПАЛ (гидрохлорид) — пре­
парат, полученный нами по Мак-Кормику и Снеллу (1961)
путем кратковременного нагревания смеси эквимолекулярных
количеств ИНГ и пиридоксаля в ацетатном буферном раство­
ре; темп. пл. 238—239° (в работе был использован также пре­
парат ИНГПАЛ, полученный из ВНИВИ*; в опытах
in Vitro активность обоих препаратов была практически оди­
наковой). ИНГПАЛФ — препарат ВНИВИ, темп. пл. 242—
243°. ТП — препарат, синтезированный нами из 2-метил-5этоксиметил-6-аминопиримндипа по методу Челннцева и Бе*) Пользуюсь случаем принести благодарность М. В. Балякннон
(ВНИВИ) за предоставленный нам препарат ПЛМФ, а также за образцы
синтезированных ею препаратов ИНГПЛЛ и ИНГПАЛФ.
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
невольскоп (1944)* ; темп. пл. пёрекристаллнзоваиного из
абсолютного спирта ТП — 190—191°. ТПФ (моиокальциепая
соль) — препарат 95%-иой чистоты, любезно предоставлен­
ный проф. Л. Е. Браупштепну доктором К. Макнно (Токио).
Гамма-амипомасляная кислота (гидрохлорид) — препа­
рат 98—99%-поп чистоты по N, полученный нами путем фер­
ментативного декарбоксилировання L-глутамшювой кис­
лоты отмытыми клетками CI.
elcliii по методу Камиена и др. (1953).
L-аргшши (хлоргидрат) и L-глутаминовая кислота —
отечественные препараты, L-глутаминовая кислота была
перекристаллпзована нами из 50%-ного метилового спирта.
АТФ (дпнатриеван соль с четырьмя молекулами воды) —
препарат фирмы Ренал. ЭДТА (дпнатрпевая соль) —
отечественный препарат. Уксуснокислый цинк, использован­
ный для внесения в инкубируемую смесь ионов цинка в опы­
тах с пиридоксалькиназой мозга, —препарат фирмы Кальбаум.
Статистический анализ полученных данных. Результаты
биохимических исследовании подвергались статистической об­
работке по одному из методов, рекомендованных для сравни­
тельно небольшого числа наблюдений > (Беленький, 1959).
Для оценки разности между средними арифметическими
(xi и Хг) вычисляли стандартную ошибку разности (S d ) и
ее доверительные границы Sj t при t, соответствующем в
таблице распределения f = tii + iij — 2 и Р = 0,05. Раз­
ность между сравниваемыми средними величинами в коптроле и опыте выражали в % по отношению к контролю с уче­
том нижней и верхней доверительной границы разности.
Для качественной оценки различия между сравниваемыми
средними величинами в отдельных случаях использовали
также тест t.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ
1. Сравнительное изучение токсического действия
изоннкотинилгидразида и токсопиримидина и поиски
антидотов
При впутрибрюшинпом введении крысам летальных доз
**) За предоставление исходных продуктов для синтеза н денные
советы при получении ТП приношу благодарность И. А. Рубцову
(ЛМИПП) и П. С. Жданович (ШШВЙ).
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ИНГ (40 мг па 100 г веса тела) клонпко-тонические кон­
сульски начинались у животных спустя 30—60 мин., после
введения ИНГ, а гибель животных наступала, как правило,
через 30—60 мин. после первого приступа судорог. Число тя­
желых припадков судорог у крыс, отравленных ИНГ, было
ограничено двумя, реже четырьмя-пятыо приступами остро
протекавших конвульсии. Пиридоксаль в качестве антидота
при остром отравлении крыс ИНГ был не эффективен. Дву­
кратное подкожное введение 0,5 мг пиридоксаля на 100 г ве­
са тела (одновременно с внутрибрюшшшои инъекцией ИНГ
и за несколько мин. до ожидаемого первого приступа судо­
рог) не предупреждало, развития конвульсии и летального
исхода отравления ИНГ.
Токсическое действие ИНГ (30, 35 н 40 мг на 100 г веса
тела) в наших опытах проявлялось лишь в течение двух
часов после парентерального введения крысам; у выживших
крыс конвульсии в дальнейшем не возобновлялись, и живот­
ные никаких внешних признаков интоксикации в свое.м по­
ведении не обнаруживали. Динамика острого отравления
крыс ИНГ свидетельствовала о том, что введенный аптиметаболнт или токсические агенты, действующие на мозг при от­
равлении ИНГ, сравнительно быстро выводятся из организ­
ма или подвергаются в тканях относительно быстрому обез­
вреживанию.
Картина острого отравления крыс летальными дозами
ТП (10 мг на 100 г веса тела при В6-гпповпта.\пшозе) имеет
свои отличительные особенности.
Манежные
движения
(«припадки бега») и развивающиеся вслед за ними жесто­
кие клопико-тонические судороги начинались у крыс на 40-й—
65-и мин. после введения ТП и продолжались почти без пе­
рерыва в течение 50-тн — 60-тн мин. вплоть до гибели живот­
ного. После подкожного введения 5—50 мг ТП на 100 г веса
тела крысам, получавшим соответственно рацион, лишенный
витамина В6, или обычный лабораторный корм, у отдельных
крыс непрерывные конвульсии длились более суток. Таким
образом, ТП или токсические агенты, действующие на .мозг
при отравлении ТП, в отличие от ИНГ являются метаболи­
чески устойчивыми и не подвергаются быстрому выведению
из организма.
Следует подчеркнуть, что пиридоксаль, не предупреждав­
ший в наших опытах острого отравления ИНГ, проявлял
Ю
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
свойства весьма эффективного антидота при отравлении ТП
даже па самых поздних стадиях смертельной интоксикации
организма. Подкожное введение 0,2 мг пиридоксаля на 100 г
веса тела (Ч50 от летальной дозы ТП) за несколько мин. до
неминуемой гибели крыс, отравленных ТП, защищало крыс
от гибели, причем конвульсии у животных прекращались уже
через несколько секунд после инъекции пиридоксаля. Отме­
ченное защитное действие пиридоксаля позволяет заклю­
чить, что метаболический блок или блоки, лежащие в основе
судорожного и летального действия ТП, являются по своему
характеру легко обратимыми.
Нам не удалось подтвердить данных итальянских авто­
ров (Чедранголо и др., 1953) о защитном действии L-глутампновой кислоты (натриевой соли) при смертельном отрав­
лении крыс и кроликов ИНГ. L-Лргпннн, являющийся мощ­
ным средством в борьбе со смертельным аммиачным отрав­
лением (Грипштейн и сотр., 1956), при двукратном внутрибрюшинном введении крысам за 30—60 мин. до введения
ИНГ и вместе с И Н Г в дозе 45 мг на 100 г веса тела также
не защищал крыс от судорог и гибели. L-Глутамнновая
кислота и L-аргннин не оказывали существенного влияния
и на отравление крыс смертельными дозами ТП.
В специальной серии опытов мы изучали токсическое
действие ИНГ и ТП при субарахноидалыюм введении кры­
сам. Субарахиоидальный способ введения позволяет преодо­
леть гемато-энцефалический барьер (мало проницаемый для
таких, например, веществ, как глутамиповая п у " а м н н о "
масляная кислоты) и испытать специфическое действие на
мозг небольших доз тех или иных химических агентов. Как
мы убедились, характерные симптомы отравления животных
антагонистами пиридоксипа развиваются у крыс, получав­
ших обычный лабораторный корм, в первые же минуты пос­
ле субарахноидального введения 4 мг ИНГ или 0,5—1,0 мг
ТП на 100 г веса тела. Чувствительность крыс к ТП, вводи­
мому субарахноидалыю, возрастала в несколько раз при
содержании крыс на рационе, лишенном пиридоксипа. Пиридоксаль снимал токсическое действие ТП и, напротив, за­
метно усиливал токсическое действие ИНГ. Гамма-амнпомасляная кислота при совместном субарахноидалыюм введении
с И Н Г или ТП в дозе 3 мг на 100 г веса тела подавляла
несмертельные судороги, вызываемые ИНГ и.ТП, но не заИ
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
щшцала крыс от судорог и смерти при отравлении летальны­
ми дозами аптиметаболптов. L-Глутамнновая кислота
при
субарахнопдалыюм введении крысам (3 мг па 100 г веса те­
ла,) сама по себе вызывала у крыс судороги и не защищала
животных от токсического действия ИНГ и ТП.
Наиболее существенный вывод, к которому мы пришли
на основании опытов с субарахнондальными инъекциями,
состоит в том, что токсическое действие ТП на ЦНС, а так­
же, очевидно, и ИНГ, обусловлено прямым действием этих
аптиметаболптов пиридоксина на.мозг.
2. Содержание аммиака и глутамииа в крови и мозге
крыс, отравленных нзоникотинилгндразндом или
токсоппримидином
В предварительных опытах мы исследовали содержание
N—NH 3 в крови трех кроликов после внутривенного введе­
ния летальных доз ИНГ (200 мг па кг веса тела). В отличие
от Прециози и Порчелатти (1953) мы не наблюдали замет­
ного прироста содержания N-NH 3 в крови кроликов до нача­
ла конвульсии. В ходе конвульсий уровень аммиака в крови
кроликов повысился приблизительно вдвое по сравнению с
исходным уровнем, однако не превышал 20 мкг N-NH 3 на мл.
Таким образом, смертельное отравление кроликов ИНГ не
является общим аммиачным отравлением организма, которое
наступает, когда содержание N-NH 3 в крови достигает
75—115 мкг на мл (Грнпштейн и сотр., 1956). Повышение
концентрации N-NH 3 в крови кр.олнков, отравленных ИНГ,
наблюдалось лишь после начала конвульсий и, очевидно,
являлось их следствием, но не причиной. Расхождение на­
ших данных с результатами исследований Прециози и Порче­
латти объясняется, возможно, тяжелыми экспериментальны­
ми условиями, в которых находились животные во время
опытов итальянских авторов.
При отравлении крыс летальными дозами ИНГ или ТП
мы, как и в опытах с кроликами, наблюдали некоторое повы­
шение уровня содержания N-NH 3 в крови лишь в ходе кон­
вульсий. Содержание глутамииа крови у крыс, отравленных
ИНГ или ТП, заметных изменений не претерпевало.
В табл. 1 и 2 приведены результаты опытов, в которых
мы изучали содержание N-NH 3 и глутамииа в .суммарной
ткани головного мозга крыс в различные сроки после введе12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пня животным-смертельных доз ИНГ н ТП. Как следует из
полученных данных, при отравлении крыс ИНГ или ТП коли­
чество N-NH3 в ткани головного мозга перед началом кон­
вульсии соответствует нормальному содержанию аммиака в
мозге крыс при относительном покое (Рихтер и Даусоп, 1948;
Владимирова, 1953). Уровень содержания ' аммиака в мозге
значительно возрастает только во время конвульсии, вызван­
ных ИНГ или ТП. Однако, хотя количество аммиака в мозге
во время судорог, вызванных ИНГ или ТП, может увеличи­
ваться в 2—2,5 раза, содержание его не превышает величин,
характерных для состояния возбуждения и конвульсии, выз­
ванных апоксней, пикротокешюм или раздражением электри­
ческим током (Рихтер и Даусоп, 1948; Владимирова, 1953).
Таким образом, повышение уровня содержания N-NH3 в тка­
ни мозга крыс при отравлении ИНГ и ТП является следстви­
ем, по не причиной развивающихся конвульсии.
Таблица 1.
Содержание аммиака и глутамина.в ткани мозга крыс,
отравленных ИНГ (40 мг на 100 г веса тела парентерально)
Содержание N — N H 3
Состояние, в мг на 100 г свежего
крыс перед
веса ткани
заморажи­ Средние ве­ Прирост в
ванием в личины и их % от нормы
о
при
sс; а.
о жидком N 2 стандартные
S" м
ошибки
F = 0,05
4
4
3
з
4
Норма
,За 5—10 мин.
до начала
конвульсии
Первый при<:туп конвуль­
сий
;За 5—10 мин.
до смерти
Содержание глутамина
в мг на 100 г свежего
веса ткани
Средние ве­ Изменение по
личины и их сравнению с
стандартные
нормой
ошибки
(тест t*)
9 4 , 8 + 11,5
0,36 4 - 0,02
0,35 -|- 0,02 изменение не; 89,4 -+- 4,9 t = 1,48 при
достоверно
—
f = 6;
Р > 0,1
0,75 + 0,12
17—200 9 9 , 7 + 6,1 t = 1Л при
~
f = 5;
Р > 0,25
0,75 + 0,12
109,4 + 5,3 t = 3.83 при
17_200
~ •
f = 5;
Р <^ 0,05
0,39 + 0,04 изменение не 9 2 , 7 + 1,9 t = 0,62 при
достоверно
—
f = 6;
Р < 0,5
Через 2 часа
после введе­
ния субтокси
ческой дозы
ИНГ**) •
*) Отличие достоверно, если Р<^0,05.
**) Крысам вводили внутрнбршннно 25 мг
конвульсий у животных не было.
ИНГ на 100 г веса тела;
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 2.
Содержание аммиака и глутамнна в ткани мозга
В6-гиповнтам1шозных крыс, отравленных ТП
(10 мг на 100 г веса тела парентерально)
Содержание N 1\Нз
Состояние
в мг на ЮС) г свежего
крыс перед
тканн
заморажи­
Прирост в
ванием в j1 Средние ве- %
от нормы
личины и их
жидком tsf2 стандартные
при
Р = 0,03
I ошибки
Содержание глутамнна
в мг на 100 г свежего
веса ткани
Средине ве- I
личины и их | Прирост в о/„
стандартные о т нормы при
| ошибки
|
Р = 0.03
6
Норма*) 0,27-1-0,02
73,3 + 3,8
С- За 5—10 MHiiO^O-f-0.012
изменение не 86,6 + 3,8 изменение не
до начала
достоверно
достоверно
конвульсий
6
Начало
0,50-[-0,01
6 7 — 104 123 + 2,8
44 — 72
конвульсий
5 За 5—10 мин 0,82-1- 0,038 167 — 241 134,6 + 7,7
48—98
до смерти
Содержание глутамнна в ткани мозга крыс, отравленных
смертельными дозами ИНГ, не изменяется заметным обра­
зом перед началом конвульсий или во время первого приступа
судорог и лишь незначительно увеличивается перед гибелью
животных. При отравлении Вб-пшовптаминозных крас смер­
тельными дозами ТП содержание глутамнна в мозге, наобо­
рот, значительно увеличивается (па 44—72%) уже во время
первого приступа судорог и может возрастать в два раза по
сравнению с исходным уровнем к моменту гибели животных.
Отмеченное различие связано, возможно, с самим характером
конвульсии: как мы уже указывали ранее, у крыс при отрав­
лении ТП, в отличие от коротких редких припадков судорог,
вызываемых ИНГ, наблюдаются почти непрерывные судоро­
ги.
3. Активность глутаматдекарбоксилазы
и содержание
глутамиповой и у- ашш омасляной кислот в мозге крыс,
отравленных изонмкотиинлгидразидом или токсопирнмидином
В опытах in Vitro ИНГ, внесенный в инкубируемую
смесь вместе с субстратом, ' в конечной
концентрации
*) Крысы получали в течение 5-ти дней корм, лишенный витамина В,
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1,2 X 10~"3М снижал активность глутаматдекарбоксилазы п го­
могеиатах мозга крыс почти па 50%. Сходное по глубине
торможение фермента достигалось при концентрации ИНГ
2,4 X 10~ 4 М, если гомогенат мозга преиикубировали с ИНГ в
течение 25—30 мни. перед
внесением в пробу L-глутампновой кислоты. В условиях преиикубации с тканью мозга
ИНГ в концентрации 1 , 2 Х Ш " 3 М вызывал приблизительно
70%-ное снижение активности глутаматдекарбоксилазы.
В отличие от изонназида, в опытах in Vjtro ТП в конеч­
ной концентрации 1,2 X Ю~ а М в присутствии АТФ и NaF тор­
мозил активность глутаматдекарбоксилазы в гомогеиатах
Таблица 3.
Влияние ИНГ in VjVo на активность глутаматдекарбоксилазы
мозга крыс
Состав проб при определении активности фермента
in Vitro: 500 мг гомогенизированной ткани мозга в 3 мл фос­
фатного буферного раствора, рН 6,2, содержащего 15мкмолеи
L-глутамнновой кислоты. Инкубацию ткани проводили в
сосудиках Варбурга при 37,8° в течение 60 мин. в атмосфере
чистого N2.
.
- ,
Активность фермента в мкл С0 2
за час на 500 мг ткани
Отравление крыс и их
состояние перед декапитацией к извлечением мозга
7
3
Норма
Первые-' признаки приближаю­
щихся конвульсий или начало
конвульсий; через 35—40 мин.
после внутрибрюшинного вве­
дения 40 мг ИНГ на 100 г ве­
са тела
Через 3 часа после внутрибрю­
шинного введения 25 мг ИНГ
на 100 г реса тела; конвульсий
не было
Через 20 мин. после субарахноидалыюго введения 2 мг
ИНГ на 100 г веса тела; кон­
вульсий не было
Средние величи­
ны и их стан­
дартные ошибки
158+1,5
57-f9,7
Снижение
активности фер­
мента в о/,
от нормы при
Р = 0,03
49—78
130+1,6
15—21
784-5,3
43—58
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 4.
Содержание глутаминовой и у-амнномасляной кислот
в ткани мозга крыс, отравленных ИНГ
(40 мг на 100 г веса тела парентерально)
Содержание глутамил^всл"| кислоты, мг%
я м к
О)
Изменение соа ГО\с держания
н «Л
3
о
ог нормы при
о.
Р = 0,03
3
величш
Состояние крыс
перед за.моражнванием в жид­
ком N 2
4 Норма
/63-f- 9
4 За 5—10 мни.
183+10
до начала кон­
вульсий
4 П редкой вульсив- -2214- 3
ная дрожь или
первый приступ
конвульсий
3 За 3—5 мин. до 149 + 7
смерти
4 Через 2 часа
107-4- 9
после введения
—
23 мг ИНГ на
100 г веса тела;
конв. не было
изменение
недостоверно
от -4-20 до
+50
изменение
не достоверно*)
изменение
не достоверно
Содержание v-аминоСредние ве- .
личины и их
стандартные
ошибки
Сниже­
ние со­
держания
в о/п от
ЯОРЧЫ ЩЛ
Р = 0,03
29,6+4,8
23,0+0,9
8—36
21,0+1,2
3—25
21,1+0,6
15—43
19,9+1,3
16—50
ткани мозга мышей, крыс и морских свинок не более, чем
на
12% (Р = 0,01). ТПФ в конечной концентрации 6,5 X Ю~4Л1 ire
влиял па исходную активность глутаматдскарбоксилазы в
суспензиях ацетонироваппоп ткани мозга крыс и не снижал
степень активации
фермента при внесении в пробы ПЛЛФ
(6,3 X 1(Г 3 М).
В табл. 3 л 4 су.мАтироваиы..результаты :опытов, в кото­
рых мы изучали активность глутаматдскарбоксилазы мозга
и содержание глутамиповои и \-амнномаслянон кислот в
ткани, мозга после'парентерального сведения крысалг различ­
ных доз ИНГ. Глутаматдекарбоксилаза мозга in VjVo, как и
in Vitro, проявляет высокую чувствительность к ИНГ. Инте­
ресно, что при отсутствии каких-либо внешних признаков
*) По отношению к величинам, характеризующим начало конвульсии
(221 + 3 мг i\, статистически достоверное снижение на 21—44%.
16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нарушения функций ЦНС активность глутаматдекарбоксила­
зы мозга крыс может снижаться по сравнению с нормой поч­
ти на G0% (табл. 3).
У крыс, отравленных смертельными дозами ИНГ (40 мг
на 100 г веса тела внутрибрюшинно) активность глутамат­
декарбоксилазы мозга ко времени начала конвульсии снижа­
лась на 49—78% (Р = 0,05). На фоне резкого торможения
глутаматдекарбоксилазы в ткани мозга перед началом
конвульсии снижалось содержание .у-амнномасляной кис­
лоты и накапливалась глутамииовая кислота (табл. 4). В
ходе конвульсии содержание глутамиповои кислоты в ткани
мозга вновь уменьшалось,' что могло быть связано как с
усиленным синтезом глутамина во время судорог, так и с
усиленным использованием-глутамиповои кислоты в качестве
дыхательного субстрата. Содержание
у-амнномасляной
кислоты в ткани мозга снижалось ко времени начала кон­
вульсии и к моменту гибели крыс на 8—36% и соответственно
па 15—43% (Р = 0,05). Следует, однако, подчеркнуть,
что еще
более глубокое снижение содержания у а м и и о м а с л я и о п
кислоты в суммарной ткани мозга - наблюдалось через три
часа после введения крысам субтоксических доз ИНГ, не вы­
зывающих судорог. В наших
опытах (I960), я также п опы­
тах Когучи (1962) у " а М 1 1 П 0 М а с л я и а я кислота при субарахпоидальном введении или введении в желудочки мозга не за­
щищала животных от судорог и не предупреждала леталь­
ный исход отравления смертельными дозами ИНГ. Таким
образом, нет основании рассматривать торможение глутамат­
декарбоксилазы и снижение уровня содержания. у аМ111Ю "
масляной кислоты в суммарной ткани мозга крыс в качестве
. фактора, играющего решающую роль в проявлении токсиче­
ского действия ИНГ.
Сказанное в равной мере относится и к опенке механиз­
ма токсического действия ТП. В отличие от японских авторов
(Намба, 1957; Нишизава, 1957) мы работали с Вв-авитамннозными животными, чувствительными к малым дозам.ТП.
Соответствующие опыты показали, что при смертельном от­
равлении крыс ТП (10 мг на 100 г веса тела подкожно) ак­
тивность глутаматдекарбоксилазы мозга ко времени начала.
конвульсий и к моменту гибели крыс не снижается. Уровень
содержания у-амипомасл^шо^ц^кпелоть!,, ft.^Jfti&i
крыс, от1
П
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
равленпых ТП (табл. 5), был снижен перед началом конвуль­
сии и незадолго до гибели на 6—21% н соответственно на
Таблица 5.
Содержание глутаминовой и у-амнномасляной кислот
в ткани мозга В6-гиповитаминозных крыс, отравленных ТП
(10 мг на 100 г веса тела парентерально)
и
о.
ч
Состояние крыс
перед заморажи­
ванием в жид­
ком N 2
*->
Норма; крысы
получали в тече
ние 3-ти дней
корм без вита­
мина В л
За 5—10 мин.
до начала кон­
вульсии
6. Начало кон­
вульсий
За 5—10 мин.
до смерти
Содержание глутамино­
вой кислоты, мг%
* i. = |
а а «">§ Изменение со5 я Э | 'держания в %
2 S 5 ° 1 ог Fнсрмы
при
= 0,03
и|цЯ
175+ 9
Содержание у-амшюмаслипон кислоты, мго/
i 5 3 в '_
ю
Снижение всо= 3- ;°Л5
я S держания
од
5 2 ^ о о т нормы при
| | 5 I
F-0,05
U?5 I
32,9-4-0,8
28,4+0,8
изменение
не достоверно
26,4+0,7
изменение
157+ 5.
не достоверно
145 + 11
от 0 до—34
24,7+0,8
191+ б
6—21
12-27
17—33
17 — 33% (Р = 0,05). Оставляя в стороне вопрос о возмож­
ных причинах этого явления (усиленная утилизация у а м и "
номаслннон кислоты при отравлении ТП, снижение концент­
рации в ткани глутаминовой кислоты — субстрата глутаматдекарбоксилазыа ми1 Шт.О Мп.)
отметим, что абсолютные величины
асллмо 1
содержания у
>
кислоты при смертельном
отравлении ТП (28,4 + 0,8 мг% — 24,7 ± 0,8 мг%) даже пе­
ред гибелью животных находятся'в пределах физиологиче­
ской нормы, которая для целого мозга крыс по литературным
данным колеблется в пределах 25—45 мг% (Эллиот. 1958).
Напомним также, что наиболее глубокое снижение содержа­
ния у-аминомаслянон кислоты в мозге крыс (в среднем до
19,9 + 1,3 мг%) было обнаружено нами в ткани мозга жи­
вотных, получивших субтоксическую дозу ИНГ, не вызвав­
шую у крыс ни конвульсии, пи приступов дрожи, ни какихлибо других заметных отклонении в поведении. Субарахнон18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
дальнос впеденпе у " а м и , | 0 М а с л я И 0 1 1 кислоты не защищало
крыс от судорог и гибели при отравлении смертельными до­
зами ТП.
Полученные данные приводят нас к выводу, что сниже­
ние активности глутаматдекарбоксилазы и уровня содержа­
ния в суммарной ткани мозга у-ампномасляпай кислоты
не может служить причиной судорог и гибели крыс, отрав­
ленных ТП. Тем не менее в настоящее время нельзя исклю­
чить возможное патогенетическое значение резких локальных
изменений активности глутаматдекарбоксилазы
(и других
пиридоксалевых ферментов) в специфических участках моз­
га, проявляющих высокую чувствительность к ИНГ пли ТП.
Равным образом нельзя исключить, что ИНГ или ТП могут
воздействовать па физиологическую активность мозга, оказы­
вая избирательное'влияниз на содержание в различных зо­
нах мозга свободной и связанной форм у-амшюмасляноп
кислоты.
4. Влияние некоторых производных изоникотннилгидразида
и токсопиримидина на ферментные системы, участвующие
в биосинтезе пиридоксальфосфата
В опытах с субарахнондальными инъекциями мы нашли,
что судорожная доза ИНГПАЛ — продукта спонтанной кон­
денсации ИНГ с пиридоксалем — по крайней мере в 40 раз
ниже судорожной дозы И Н Г (табл. G). ТПФ оказался в не­
сколько раз более токсичным, чем ТП. Субтоксичсские дозы
ИНГПАЛ, ИНГ и ЭДТА при субарахноидалыюм введении
крысам вместе с ТП подавляли судорожное и летальное дей­
ствие ТП.
•
Влияние ИНГПАЛ, ЭДТА и ТП на активность пирндоксалькипазы мозга крыс in ViVo отражено в табл. 7. Через
20 мин. после субарахноидальных инъекций крысам субток­
сических доз ИНГПАЛ степень активации глутаматдекарбок­
силазы в приготовленных гомогенатах мозга (за счет био­
синтеза ПАЛФ в присутствии пнридоксаля, АТФ и NaP, угне­
тающего фосфатазу) была снижена па 66 + 22% (Р = 0,05).
Токсические дозы ИНГПАЛ, вызывающие у крыс длитель­
ные конвульсии, тормозили пиридоксалькиназу практически
на 100%. Субтоксичсские дозы ЭДТА (связывающего 7м
и Мо, которые активируют пиридоксалькиназу) также вы­
зывали резкое снижение активности фермента. В отличие от
этого, после субарахноидальных инъекций крысам смертель19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 6.
Токсическое действие ИНГПАЛ и ТПФ по сравнению с ИНГ
и ТП и влияние субтокснческих доз ИНГПАЛ, ИНГ и ЭДТА
на отравление крыс ТП лри субарахноидальном
способе введения
Дола препарата в мг на
Число
крыс
на 100 г веса тела
и порядок введения
2,0 ИНГ
4,0 ИНГ
0,01 ИНГПАЛ*)
0,02,">
»
0,05
»
0,10
>
0,25
»
0,3
ТП
0,5
»
0,8
»
1,0
0,15
ТПФ
1,0 ТП+0,01 ИНГПАЛ одно­
временно с ТП)
10 1,0
ТП+2,0 ИНГ (одновре­
менно с ТП)
12 1,0 ТП+2,0 ИНГ (за 20 мин.
до ТП)
7 1,0
ТП+0,1 ЭДТА (одновре­
менно с ТП)
9 0,8
ТП+0,1 ЭДТА (одновре­
менно с ТП)
9
12
5
5
5
5
5
5
5
9
7
4
9
• »
Отношение числа крыс с судоро­
гами (а) и погибших (б) к общему
числу крыс (в)
а/в
б/в
0/9
11/12
0/5
0/5
0/5
5/5
5/5
0/5
•3/5
8/9
7/7
4/4
0/9
0/12
0/5
0/5
0/5
0/5
1/5
0/5
0/5
7/9
7/7
4/4
0/9
0/9
10/10
2/10
0/12
0/12
7/7
4/7
4/9
1/9
.
пых доз ТП мы не наблюдали заметного снижения актив­
ности пиридоксалькниазы в гомогенатах мозга отравленных
крыс,
Сходные результаты были получены при изучении био­
синтеза ПЛЛФ в надосадочнои жидкости гомогенатов мозга,
подвергнутых центрифугированию на холоду. Через 20 мин.
после субарахпондального введения крысам 10—100 мкг
*) После впутрибрюшинпого введения крысам 1—3 мг ИНГПАЛ на
100 г веса тела никаких патологических симптомов в поведении животных отмечено не было,
20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ИНГПЛЛ или. 100 мкг ЗДТЛ на 100 г веса тела активность
ппридоксалькипазы (измеряемая по приросту в пробах
ПЛЛФ) оказалась сниженной в надосадочнон жидкости гомогенатов мозга соответственно на 45- 74%
и 25%. ТП в опы­
тах in Vitro даже в концентрации 1С~3М снижал прирост в
пробах ПЛЛФ не более, чем на 10%.
Таблица 7.
Активация глутаматдекарбоксилазы, мозга крыс
в присутствии пнридоксаля и АТФ в норме и после
предварительного субарахноидального введения животным
ИНГПАЛ, ЭДТА и ТП
Состав проб: 500 мг гомогенизированной ткани мозга в
3 -мл фосфатного буферного раствора, ipH G,2, содержащего
15 мкмолеи L-глутаминовои кислоты, 30 мкмолеи NaP н
2 мкмоля ЛТФ в присутствии 1,5 мкмолеи пнридоксаля (опыт­
ные пробы, А) или без пнридоксаля (контрольные пробы, Б).
Инкубацию проводили в сосудиках Варбурга при 37,8° в те­
чение 60 мни. в атмосфере чистого N2.
Вещество, введенное субарахиоидально за 20 мин.
до забоя крысы (мкг ил»
мг на 100 г веса тела)
II
4 Норма; 0,2 мл 0,9%-ного
раствора NaCI
4 10 мкг ИНГПАЛ
2 100 мкг
»
4 100 мкг ЭДТА
4 1 мг ТП**)
Степень актива­
ции фермента
Снижение степени
активации фер­
мента в %
от нормы при
редине величины
Р = 0,05
и их стандартные
ошибки
50+4
17+_2
0,5+2,5*
23+4
46+5
С6+22
100
54 + 28
снижение
не достоверно
В специальной серии опытов мы изучали влияние раз­
личных дериватов ИНГ и ТП на активность ПОЛФ,ПАМФ-оксидазы, используя для этой цели очищенный препарат фер­
мента, полученный из печени кролика. ТП и ИНГПЛЛ в ко*) Отклонение не выходит за пределы границ точности метода.
.**) Крысы были забиты через 10 мин. после введения ТП.
21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
печной концентрации 10~ 4 М не тормозили заметным образом
окисление ПАМФ ферментом. ТПФ оказался, однако, актив­
ным ингибитором ПОЛФ, ПАМФ-оксидазы и вызывал при­
близительно 50%-ное снижение активности фермента при
концентрации 5 X 10~'5М (см. табл. 8). Почти 100%-ное тормо­
жение оксндазы наблюдалось при концентрации ТПФ 10"* М.
ИНГПАЛФ — продукт спонтанной конденсации И Н Г с
ПАЛФ — оказался
еще более
активным
ингибитором
ПОЛФ, ПАМФ-оксидазы, чем ТПФ (Ki =
4 X Ю~ч М). Почти
полное торможение фермента наблюдалось при концентрации
ИНГПАЛФ Ю" 5 М. Важно отметить, что эти концентрации
соизмеримы с количеством ИНГПАЛФ, найденным в ткани
мозга Байном и Вильямсом (1960) при отравлении мышей
ИНГ.
Таблица 8.
Влияние ТПФ на активность очищенного препарата
ПОЛФ, ПАМФ-оксидазы из печени кролика
Условия инкубации: 0,14 мл раствора очищенной
ПОЛФ,ПАМФ-оксидазы инкубировали 30 мин. при
37° в 3,7 мл трис-буфера (0,2 М, рН 8,6) в присут­
ствии 1 мкмоля ПАМФ и 0,000388 — 0,37 мкмолей
ТПФ, который вносили в пробы перед добавлением
фермента.
Конечная концентрация
ТПФ в пробе, М
— (контроль)
1,05 X Ю~ 7
10~б
6,3 X Ю "5
9
X Ю~"6
1 0 "*•>
Количество ПАЛФ,
образовавшегося
в пробе, мкг
Активность фермента
по сравнению с конт­
ролем. %
10,0
9,58
8,50
6,53
3,20
0,0-0.53
100
96
85
65
32
0-5
Исследование токсического действия физиологических
дериватов И Н Г и ТП па ЦНС, а также их влияния па актив­
ность пиридоксалькиназы и П О Л Ф , ПАМФ-оксидазы позво­
ляет придти к выводу, что судороги и смерть при отравлении
животных И Н Г и ТП связаны с нарушением биосинтеза пиридоксалевых кофермеитов в мозге. ИНГ, поступая в клетки
мозга, химически связывает пиридоксаль и ПАЛФ. Гидразон
пиридоксаля подавляет
фосфорилирование ппридоксола,
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
лирндоксаля п ппрндоксамина пиридокеалькипазой (реакции
1, 2 и 3 па рис. 2); ИНГПЛЛФ тормозит превращение ПОЛФ
и ПЛМФ в ПЛЛФ (реакции 4 а 5).'Таким образом, взаимо­
действуя с пнридоксалем и ПЛЛФ, изонназид специфически
выключает процессы утилизации пирпдоксина тканью. Со­
держание ПЛЛФ в мозге животных, отравленных ИНГ,
ТП
пиридоксол
ГПФ
(6)
TiT
ПОЛФ
I
(4)
ИНГ
•<: -
(2)
1
"|ПАЛФ
ИНГ'
ннрндоксаль
ИНГПАЛФ
ИНГНАЛ
(5)
т
• ПЛМФ
пиридоксамии
Рис. 2. Влияние изоннкотпнилгидразида и токсопнримиднна
на биосинтез пирндоксальфосфата в мозге
снижается, естественно, прежде всего в результате химиче­
ской реакции образования ИНГПЛЛФ. Однако, по нашему
мнению, решающую роль в симптоматике острого отравления
животных ИНГ может нг.рать резкое угнетение в мозге био­
синтеза ПАЛФ образующимися ингибиторами пирндоксалькиназы и ПОЛФ, ПЛМФ-оксцдазы. Такое предположение
согласуется с весьма высокой сравнительно с ИНГ токсичностью ИИГПЛЛ, а по данным американских фармакологов и
ИНГПЛЛФ (Диксон и Вильяме, 19G2) при введении этих ве­
ществ непосредственно в мозг под паутинную оболочку или в
.
2
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
его желудочки. Примечательно также, что пиридоксаль не
только не является антидотом при отравлении ИНГ, но, на­
против, в ряде случаев заметно повышает его токсичность.
По данным Гоннара (1958) и др. авторов (Вонавита и
Скарди, 1959; Макино и др., 1(JG3) ИНГПАЛФ, практически не
диссоциирующей в водном растворе, обладает способностью
активировать некоторые пиридоксалевые апоферменты в та­
кой же степени, как » эквивалентное количество свободного
ПЛЛФ. Торчннский (1963), детально изучивший механизм
взаимодействия высокоочищенной
аспартат-глутамат-апотрансаминазы с ИИГПЛЛФ, установил, что — -аминогруп­
па лизина, расположенная в активном центре апофермента,
атакует ИНГПАЛФ, присоединившийся к контактной площад­
ке ферментативного белка, и в результате внутримолекуляр­
ной реакции трансальдимннизации с альдегидной группой
ПОЛФ вытесняет гидразид из ИНГПАЛФ. Восстановление
активности аспартат-глутамат-трансамнназы в результате
взаимодействия с ИНГПАЛФ не происходит, однако, в при­
сутствии избытка ИНГ, реагирующего с кофермеитом. Это го­
ворит о том, что ;реактивация пирндоксалевых ферментов в
присутствии ИНГПАЛ может, по-видимому, иметь важное
физиологическое значение лишь на поздних стадиях детокснкацнн организма при несмертельпом отравлении ИНГ. При
остром же отравлении ИНГ гидразоп ПАЛФ функционирует,
очевидно, лишь как ингибитор ПОЛФ, ПАМФ-оксидазы. Не
исключено также, что, подвергаясь в нервных клетках дефосфорированию, ИНГПАЛФ служит источником значительных
количеств ИНГПАЛ.
Взаимодействие ТП с ферментными системами, участвую­
щими в биосинтезе ПЛЛФ, имеет свои отличительные особен­
ности. ТП является,малоактивным ингибитором пнридоксалькнназы и, следовательно, обладает низким сродством к фер­
менту. Тем не менее токсическое действие ТП связано с его
фосфорнлировапием в могзе пиридоксалькиназой (реакция
6 па рис. 2). Умеренное торможение лиридоксалькиназы субтоксическимн дозами ИНГПАЛ или комплексообразователем
ЭДТА подавляет судорожное и летальное действие ТП; фосфоридироваииый ТП при субарахноидальном способе введе­
ния более токсичен, чем ТП. Истиныи токсический агент, дей­
ствующий на ЦНС, — ТПФ, — обладает низкой активностью
как антнкофермеит ПЛЛФ, по проявляет свойства мощного
ингибитора ПОЛФ, ПАМФ-оксидазы. .Полученные данные
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
позволяют придти к выводу, что в основе токсического допет
сия ТП на ЦНС лежит острая недостаточность коферментнон
формы витамина В6 (ПЛЛФ), развивающаяся в результате
угнетения биосинтеза ПЛЛФ ла уровне окисления ПОЛФ и
ПЛМФ (реакции 4 и 5 на рис. 2). Естественно, что при от­
равлении ТП па фоне избирательного т о р м о ж е н и я
ПОЛФ, ПЛМФ-оксидазы ппрндоксаль эффективно устраняет
патологические симптомы, связанные с истощением в нервных
клетках запасов ПАЛФ, в то время как пирпдоксол и ппридоксамни в этих условиях не равноценны пнридоксалю и в фи­
зиологическом отношении значительно менее активны.
В заключение отметим, что высокая токсичность in VjVo
как ИНГПЛЛ, так и ТПФ, наряду с избирательным торможе­
нием этими антиметаболитами соответственно пиридоксалькиназы и ПОЛФ, ПЛМФ-оксидазы, указывает на фундамен­
тальное значение обеих ферментных систем в синтезе ПЛЛФ
в мозге. Разрыв любого звена в биосинтезе ПЛЛФ может при­
вести к судорогам и гибели животных. Судорожное действие
антагонистов витамина В6 и лечебный эффект пиридоксипа
как в эксперименте, так и в клинике при судорогах на почве
алиментарного Вб-авптаминоза проявляются в течение 1—5
мин. Это свидетельствует о высоких скоростях распада н
биосинтеза ПАЛФ в ткани мозга.
IV. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В последние годы достигнуты серьезные успехи в изуче­
нии ферментных систем, участвующих в биосинтезе пиридоксалевых коферментов. На этой основе удалось выявить моле­
кулярную природу некоторых метаболических блоков, играю­
щих ответственную роль в симптоматике острого отравления
ИНГ и ТП. Первичные патогенетические локусы при отравле­
нии мозга ИНГ и ТП лежат, очевидно, на уровне пирпдоксалькиназы и ПОЛФ, ПЛМФ-оксидазы, а нстиными токсиче­
скими агентами и весьма активными антимстаболитамн пи­
ридоксипа являются производные ИНГ и ТП, образующиеся
в организме — ИНГПЛЛ, ИНГПАЛФ и ТПФ. Материальная
предпосылка нарушения функции ЦНС при алиментарном
В6-авнтаминозе и отравлении животных антагонистами пнрпдокенна, по-видимому, едина и заключается в снижении кон­
центрации пиридоксалевых коферментов в ткани мозга. В слу­
чае отравления животных ИНГ и ТП физиологическое состоя25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пне ЦНС может быть квалифицировано как острая недоста­
точность ПЛЛФ в ткани мозга.
Исследование механизма токсического действия ИНГ и
ТП на ЦНС приводит к заключению о важном функциональ­
ном значении для нормальной физиологической активности
мозга обеих ферментных систем, обеспечивающих биосинтез
ПЛЛФ — пиридоксалькиназы и ПОЛФ, ПЛМФ-оксидазы.
Этот вывод представляет определенный практический инте­
рес. Ввиду того, что П О Л Ф , ПЛМФ-оксидазы содержит в
качестве простетической группы флавипмонопуклеотид, при не­
которых функциональных нарушениях ЦНС на почве В6-гиповнтамипоза (токсикозы первой половины беременности,
тиреотоксикоз, острое алкогольное отравление, лучевая те­
рапия, лечение кортизоном, антибиотиками и т. п.) полезной
терапевтической мерой можно считать назначение высоких
доз пиридоксола в сочетании с 'рибофлавином. Совместное
назначение витаминов В 6 и Вг с лечебной или профилактиче­
ской целью показано, очевидно, и при длительном лечении
массивными дозами тиамина. ТП в норме выделяется с мо­
чой в незначительных количествах (около 0,2 мг в сутки), од­
нако его экскреция повышается при нагрузках тиамином, а
чувствительность организма к ТП резко возрастает при
В 6 -гппоавитаминозе.
В медицинском отношении большой интерес представляет
дальнейшее изучение обмена в организме (и в туберкулезной
палочке) гидразонов ПАЛФ и пиридоксаля, которые выде­
ляются с мочой при лечении И Н Г (Внльтер и др., 1954;
Вильяме и Вигланд, 1955) и в значительных количествах на­
капливаются в тканях при введении животным И Н Г (Байн и
Вильяме, 1960) Не исключено, что в основе лечебного дей­
ствия И Н Г лежит высокая фармакологическая активность
его гидразонов, а избирательное действие И Н Г на туберку­
лезную палочку связано с чрезвычайно низкой пиридокеалышиазной активностью, обнаруженной Мак-Кормиком, Грегори и
Снеллом (1961) в ацетонпрованных препаратах этих бакте­
рий.
При обсуждении вопроса о механизме нарушения функ­
ций ЦНС при В 6 -авитампнозе следует напомнить, что еще не­
сколько лет тому назад казалось, что припадки эпилепти-.
формных-судорог при Bo-авитаминозе непосредственно свя­
заны с нарушением процесса дскарбоксилирования L-глута26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
MinioBofi кислоты n мозге и со снижением в нервных
клетках концентрации у " а м ш ю м а с л я Ч ° и кислоты -— тор­
мозного агента ЦНС. В настоящее время такую концепцию
нельзя признать удовлетворительной. Возможная патогенети­
ческая роль снижения активности глутаматдекарбоксилазы в
симптоматике острого В6-авптамшюза мозга сможет быть
оценена только па основе глубокого а шпонимания
действитель­
ного физиологического значения у ' ш о м а с л я и ° 1 ' 1 кислоты
в деятельности ЦНС. На сегодняшний день паши знания в
этой области далеко недостаточны.
• В заключение отметим, что ПЛЛФ относится к числу
полифункциональных химических инструментов живей клет­
ки. ПЛЛФ несет структурную функцию, принимает участие в
активном переносе аминокислот через клеточные мембраны,
участвует в биосинтезе и обмене аминокислот, пурпновых и
пирнмиднновых оснований, гедга, ряда кофакторов, биогенных
аминов и других физиологически активных соединении
(Браунштейн, 1958; 1960; 1963). Широкий спектр каталитиче­
ской активности ПЛЛФ и его ответственная роль в процессах
регуляции обмена веществ позволяют предполагать, что па­
тогенетическая цепь при алиментарном или метаболическом
В6-гпповнтаминозе мозга окажется сложной и разветвленной.
Расшифровка молекулярных звеньев такой цепи, естественно,
сопряжена с целым рядом экспериментальных трудностей, ко­
торые, в частности, определяются высокой степенью функцио­
нальной и морфологической гетерогенности нервной ткани.
Существенный прогресс в этой области может быть достиг­
нут только в связи с общим развитием » достижениями пейрохимин. С другой стороны, дальнейшее изучение процессов
биосинтеза ПАЛФ в различных зонах мозга и субклеточных
структурах нервных клеток наряду с исследованием участия
ппрндоксалевых коферментов в контроле биохимической ак­
тивности нейронов п синаптическнх структур, несомненно,
внесут важный вклад в понимание явлений электрогенеза п
биохимической природы патологически измененной и нор­
мальной физиологической активности мозга.
Проведенная работа позволяет сделать следующие ос­
новные выводы:
1. Нарушение функции ЦНС при остром отравлении ИНГ
н ТП связано с непосредственным действием этих антагони­
стов витамина В$ па мозг,
.
2
7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. Пиридоксаль не подавляет судорожное и летальное
действие ИНГ, а в некоторых случаях повышает токсич­
ность ИНГ. Напротив, при отравлении ТП пиридоксаль яв­
ляется эффективным антидотом, подавляя судороги и пре­
дотвращая гибель животных даже на самых поздних стадиях
отравления.
3. Судороги и смерть животных при отравлении ИНГ н
ТП не обусловлены общей аммиачной интоксикацией организ­
ма пли мозга. Массивные дозы L-глутамнновой кислоты и
L-аргишша не снижают заметным образом токсическое ден-.
ствие ИНГ и ТП.
4. В опытах in Vitro и in ViVo глутаматдекарбоксилаза
мозга проявляет высокую чувствительность к ИНГ и высокую
резистентность к ТП и ТПФ. После субарахпондального вве­
дения крысам субтоксических доз ИНГ, не вызывающих судо­
роги, активность глутаматдекарбокенлазы в суммарной тка­
ни мозга снижается на 43—58% (Р = 0,05). После паренте­
рального введения Вб-гиповитаминозным крысам летальных
доз ТП активность глутаматдекарбокенлазы в суммарной
ткани мозга перед началом судорог и в ходе конвульсии не
снижается.
5. При смертельном отравлении крыс ИНГ и ТП содер­
жание у-ямнномасляпон кислоты в суммарной ткани мозга
по сравнению с нормой снижается ко времени начала кон­
вульсии соответственно на 3 — 35% и 12 — 27% (Р = 0,05),
а к моменту гибели соответственно на 15 — 43% и 17 — 38%
(Р = 0,05). Однако еще более глубокое снижение уровня со­
держания Y-аминомасляной кислоты (па 16 — 50%, Р => 0,05)
наблюдается в мозге крыс через 3 часа после внутрпбрюшииного введения субтоксических доз ИНГ, не вызывающих су­
дороги. При субарахпоидальном введении у-аминомасляиая
кислота Не защищает крыс от судорог и не предотвращает
смертельного исхода отравления летальными дозами ИНГ и
ТП. Полученные данные не позволяют рассматривать сниже­
ние общей активности глутаматдекарбокенлазы мозга и уров­
ня содержания уяминомасляион кислоты в суммарной тка­
ни мозга крыс в качестве основного фактора, играющего ре­
шающую роль в проявлении судорожного и летального дей­
ствия ИНГ и ТП.
G. Хотя активность глутаматдекарбокенлазы и уровень
содержания у " а м 1 Ш о м а с л я и о и кислоты в суммарной ткани
28
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
мозга крыс не коррелируют с функциональным состоянием
ЦНС крыс, отравленных ИНГ или ТП, в настоящее время
нельзя исключить возможное патогенетическое значение рез­
ких локальных изменении активности глутаматдекарбоксилазы (н других лиридоксалевых ферментов) в специфических
участках мозга, проявляющих высокую чувствительность к
ИНГ и ТП. Равным образом нельзя исключить, что И Н Г или
ТП могут воздействовать па физиологическую активность
.мозга, оказывая избирательное влияние на содержание в
различных зонах мозга свободной и связанной форм
у-амииомасляной кислоты.
7. При суба.рахнондалыюм способе введения ИНГПЛЛ—
продукт спонтанной конденсации И Н Г с пнридоксалем — в
несколько десятков раз токсичнее ИНГ и проявляет свойства
активного ингибитора пиридоксалькииазы как in Vjtro, так
п in VjVo. Через 20 мин. после субарахноидалыюго введения
крысам субтоксическпх и токсических доз И Н Г П Л Л (10 и
'00 мкг И Н Г П Л Л на 100 г веса тела) активность пиридок­
салькииазы в гомогенатах мозга и в надосадочной жидкости
гомогенатов мозга, подвергнутых центрифугированию па хо­
лоду, снижена соответственно па 66 + 22%' (Р = 0,05) —
55%" (субтоксические дозы) и на 100% (Р = 0,05) — 75%
(токсические дозы). И Н Г П А Л Ф — продукт спонтанной кон­
денсации И Н Г с ПАЛФ — в опытах in Vitro с очищенным
препаратом фермента из печени кролика проявляет свойства
весьма активного ингибитора ПОЛФ, ПЛМФ-о к с и д а з ы
(Ю =
4 X 10"6М).
8. ТП является малоактивным ингибитором пиридоксаль­
кииазы в опытах in Vitro и in VjVo. Тем не менее проявление
токсического действия ТП связано с его фосфорилированием
пнридоксалькиназой мозга. ТПФ при субарахноидалыюм спо­
собе введения крысам в несколько раз токсичнее ТП. Субтокспческпе дозы ингибиторов пиридоксалькииазы подавляют
судорожное действие и летательный исход отравления смер­
тельными дозами ТП. Истиный токсический агент, ТПФ, в
опытах in Vitro с очищенным'препаратом фермента из печени
кролика проявляет свойства весьма активного ингибитора
ПОЛФ, ПЛМФ-оксидазы (I\i =
5 X 10~ 5 М).
9. Влияние дериватов И Н Г и ТП, образующихся в орга­
низме на основные ферментные системы, участвующие в био­
синтезе ПАЛФ в мозге, позволяет заключить, что в основе
29 .
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
судорожного ii летального действия антагонистов В 6 —
И Н Г и ТП — лежит острая метаболическая недостаточность
ПЛЛФ в ткани мозга. При отравлении И Н Г снижение содер­
жания ПАЛФ в ткани мозга связано не только с угнетением
процессов
биосинтеза
ПЛЛФ,
но и с образованием
ИНГПАЛФ.
10. Высокая токсичность при субарахпоидальном спосо­
бе введения как ИНГПАЛ, так и ТПФ, наряду с нзбиральным торможением этими антнметаболитами • пнридоксипа
соответственно пнридоксалькнназы и ПОЛФ, ПАМФ-оксидазы свидетельствует о важном функциональном значении для
мозга обеих ферментных систем, обеспечивающих биосинтез
ПАЛФ.
11. Учитывая ответственную роль в обеспечении нормальнон физиологической активности мозга ПОЛФ, ПАМФ-оксидазы (содержащей в качестве простетпческой группы флавинмононуклсотид), можно полагать, что при функциональных
расстройствах ЦНС па почве В 6 -гиповнтаминоза полезной
терапевтической мерой окажется назначение высоких доз пнрпдоксола в сочетании с рибофлавином.
Приношу глубокую благодарность академику А. Е.
Браунштенну за руководство выполненным исследованием.
Публикации автора по материалам
экспериментальной
работы:
1. Ю. В. Букин. «Влияние введения антагонистов витами­
на В е (токсопиримндипа и изоникотнпнлгидразида) на содер­
жание NH 3 , глютамина, глютаминов.оп и у " а м ш 1 0 М а с л я 1 1 0 1 1
кислот в мозгу крыс» Укр. биохим, ж., 31, Л» 6, 906 —• 912,
1959.
2. Ю. В. Букин. «К вопросу о судорожном и летальном
действии антагонистов витамина В 6 — токсопиримндипа и
изоникотинилгндразида». Укр. биохим. ж., 32, № 1, 67 — 76,
1960.
3. 10. В. Букин. «Влияние антагонистов витамина В 6 токсопнримпднпа и изоникотнпнлгидразида — па активность
1,-глютамикодекарбоксилазы мозга». Укр. биохим. ж., 32,
No 2, 233 — 238, 1960.
4. Ю. В. Букин. «Изучение механизма токсического дей­
ствия некоторых антнметаболитов пиридоксина на цептраль30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ную нервную систему». Материалы V-ои научи, сессии Йн-та
витаминологии Министерства здравоохр. СССР. М., 1963,
стр. 76 — 77.
5. Ю. В. Букин. «Биосинтез фосфопнридоксаля и су­
дорожное действие некоторых антагонистов витамина В6».
Тезисы докл. I Всес. бпохнм. съезда. М—Л., Изд-во ЛИ СССР,
т. II 1963, стр. 120 — 121.
6. IO. В. Букин. «Биосинтез фосфопнридоксаля и некото­
рые физиологические последствия его нарушения». Успехи
биол. химии, 6, 215 — 239, 1964.
Выступления и доклады по диссертационной теме:
1. Ю. В. Букин. «Процесс биосинтеза фосфопнридоксаля
и физиологические последствия его нарушения». Доклад на
заседании Московского отделения Всес. бпохнм. общества
при АН СССР, 20-е декабря 1962 г.
2. Ю. В. Букин. «Изучение механизма токсического дей­
ствия некоторых антагонистов пнрндокенна на центральную
нервную систему». Доклад на V-oii научной сессии Института
витаминологии Министерства здравоохранения СССР, 3-е ян­
варя 1963 г.
3. Ю. В. Букин. «Биосинтез фосфопнридоксаля и судо­
рожное действие некоторых антагонистов витамина В 6 ». Док­
лад па 1-ом Всес. биохим. съезде, Ленинград, 29-е января,
1964 г.
4. Ю. В. Букин. «Влияние некоторых витаминов группы
«В» па процесс биосинтеза фосфопнридоксаля». Доклад на
Симпозиуме по механизму действия витаминов, Минск., 20-е
августа 1964 г.
5. Ю. В. Букин. «Механизм нарушении функции цент­
ральной нервной системы при В 6 -авитаминозе». Лекция на
семинаре «Молекулярные основы патологии», Москва, 17-е
декабря 1964 г.
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Т—06294
Типография № 2.
зак . 2068
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
4
Размер файла
774 Кб
Теги
732
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа