close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

821

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
'/
» /
На правах рукописи
г
ГЛАДЫРЬ Елена Александровна
ДНК-ДИАГНОСТИКА ВАРИАНТОВ ГЕНОВ КАППА-КАЗЕИНА И
БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
03.00.23 - Биотехнология
_, АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени.
кандидата биологических наук
Дубровицы- 2001
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа
выполнена
в о - Всероссийском
государственном
научно-
исследовательском институте животноводства (ВИЖ).
Научны*
доктор биологических наук, Н. А. Зиновьева;
руководители:
доктор биологических наук, профессор Н.С. Марзанов
Официальны* олпонанты:
доктор биологических наук, профессор Н.И. Сергеев;
кандидат биологических наук, доцент Л.Ф. Новикова.
Ведущее предприятие:
Московская государственная академия ветеринарной
Медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина
( М Г А В М Б )
';•:,-::':
,
•••'•;,-•
•.
.."•
Защита диссертации состоится *^£^июня 2001 года в 10 часов на заседании
диссертационного совета Д 006,013 01 во Всероссийском государственном научноисследовательском институте животноводства (ВИЖ).
142132, Московская область. Подольский район, пос.
Адрес института:
j Дубровицы, ВИЖ.
i
fffl.
С диссертацией можно о '*)•».»*.•«•.»•-« Р библиотеке <* - * * ,та.
!
' ! ? " i >
i »
? f i
»4' '
!'«|
Автореферат разослан "^ ?'; -«a* ;
t;«
f
Ученый секретарь диссертационного с--' . '
д(
*С
•
, ^ч?
кандидат биологических наук
'•-•*'J ^
"'
-
/
•»•.»"
Ч.П. Губанова
U)\tr- Етгг
/
Ы*
--*._
т Т^***
-,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
оазвития науки и техники до 2005 г.
опли1Ла
О ^ и м из приоритетных н а п р а в л е н и и ^ ^ ™ " и и в генофонда животных с
рвляется мобилизация, сохранение и п »™° п ™** С терсг*в науки и технологии
хозяйственно ценными признаками
^ к « М""
^ ^ П р е г и Д и у М а РАСХНI от
Российской Федерации Минсель" а Р « с и * с к ™
£ актуальной > становится задача
30 декабря 1999 г., № 2 9 5 / 8 9 2 ' ^ В е н н ы Г з Г проявление хозяйственно-полезных
выявления маркерных генов ^ с т в е н н ы х ^ за Р т а н о в я е н и я закономерных связей
признаков, и их анализ с Ц е л ь ю п п " ^ : ^ 7 ^ т и и маркерными генами
крови,А м о р ф н ы м , : системам, % ^ n e ^ ^ е р Г ь ^ л л е л е й , .связанных с .
молекулярно-генетические маркеры. • Выя^внив м Р ^НК-диагностикз), позволит
желательными хозяйственно-полезными - " Р " * » ^ * а ) ^ ш и £ о к о е их использование
проводить селекцию животных на у р о впн е > № $ £Т% £ • ? , ^ к о н е ч н о м итоге повысит
в качестве-' маркеров признаков , Р ° ^ ^ ° | и м у щ е С т в о ДНК-диагностики перед
эффективность ведения с е л е к ц и о н н о й ' Р ^ „ ^ ^ ю ; объясняется тем. что она .
оценкой признаков; по их н фенотипическо м ^
,
пежащей
Se^^^
Среди большого разнообразия ^ « а д . * » ^ м
у
ц е н к е ж и в отных по
еГО в Ы С 0 К Й
• анализа наследственного м а тм е ^т о д
°
генотипу предпочтение отдается
/ ' *^_ " й n D 0 C T 0 T b i исполнения.
• чувствительности, точности, быстроты и м з в ^ с т ^ п р о с т о т ^ ^ ^ ^
рам„
У
Аллельные варианты генов б ^ П " ° " ° ^ а [Geldermann H-. 1989] В связи с
молочай продуктивности крупного ^
в час тности к
возросшими требованиями P b l H , V n I T a так же к сыродельным характеристикам
количеству и состав/ молочного белка а так же к сь Р «
о в а н и й в селекции
Молока, возникает насущна*, н е о б х о д ^ ^ ^ Г связанных с качественными и
XZSZJSSZZJ^^
. Цель и задачи исследованияi
•"^ЯЙ^^
-
• .
.
'
'
проведение
• ••
ДНК-диагностики
работы были поставлань и решены
-
" 2. Оптимизировать " в ^ ^ ^ Л ^ ^ ^ н а основе анализа ПЦР-ПДРФ.
з SrS25SSbrS
и бета-лактоглобулина у различных
* ^
крупного, рогатого
ц Г ТГЛЛЫНАЯ
НАУ>
Мог* •
И-'
Инв.
;:-ОТЕКА
fi-1'ч
« '.
*.
О ' . -кГ^дчмИМ
*-',••„> чЗ'№&
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ч Научная новизна и практическая значимость работы
.......
, Впервые разработаны методики определения шести аллельных вариантов гена, ., ,
V:-•:.:, • калла-казеина,и.четырех аллельных вариантов.гена• бета-лактоглобулина крупногоi ; '..';' : '
J?'•'"'''•'.рогатого скота.:Изучено'генетическое разнообразие четырех пород"крупного рогатого"''-;'.';
> -' ;' : • скота .Российской Федерации,по исследуемым''генам.'' Изучено: влияние аллельных i."-...v
> ~';\' J, вариантов,",' генов - каппа-казеина : и * бета-лаетоглобулина > на признакиг молочной •': • .'••
ч
' '; продуктивности > крупного i рогатого скота Даны рекомендации по возможному
';'•»••:'. ; использованию данных маркеров в селекции животных при проведении популяционно.' : '' ; генетических исследований
>.".-.;. У-Г." ^ у, Апробация работы.
"*
* , '
. » • „ • '
'*.!!•'„•• !<*!.': Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на
" *
Ч ' К >'*..' конференции аспирантов и молодых ученых, ВИЖ, п Дубровицы 2000.* "
fT * « " . * • научно-практической"* конференции
«Повышение
.конкурентоспособности
* ;'^У'5у животноводства и задачи кадрового обеспечение», Быково, 2000,
„ "*
к ';<,\••',•.';. II4 Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве
j . ^ 1 ' животноводстве и ветеринарии», Москва, ВНИИСХБ, 2000,
,.t
' , • ; • ; " • г научных отчётах ВИЖа 1999-2000,
.
.
"" __'
, ; ' ; ^ ? « научной конференции отдела биотехнологии ВИЖ, п Дубровицы, 2001
. .
*•
*
.
.
'.-' ;•„.-, - ' -Основные положения, выносимые на защиту: ч
,
ял;:.-. ••'.- « t Создан банк ДНК четырех пород крупного рогатого скота российской Федерации. - ,г.- ,. •• „
С^-\",; • •'Предложен новый метод выявления б-й полиморфных аллелей гена каппа-казеина;V ? . ,.^
;J:-'V^(A.B.C;E,^G)."";;^
'.;...н •'!• » i Предложен ' новый - метод •'выявления'«4-х'-полиморфных • аллелей .гена^бета- . ч - C i . ^ i . - - ' . , ,'лактоглобулина (А, В, С; D ) . ' ; ^ '•''"': ;."'''^*.\,,:^ 7 > у ^ ' ' ! .-£.-->' .•"•:л!-" ; : : i : v ^ ' •V-i'': : -?' - v..'.\V:-":'t'.;: А-,* *.; Показано, : что частоты встречаемости аллелей'• и 'генотипов исследуемых; генов ,".у' '•*';
'.-=". ?/••"<•'•% различаются в зависимости от породы крупного рогатого скота.' »•'"'г:-';.. p:'::iX^.:'' .'\\''-.-'.^ •'
,'•;"= V;*» ^Установлены • ! тенденции^.: влияния К аллелей - г е н о в \ каппа-каэёина ~" и--бета-'. ;^-4'-'-,
•/{;:'-.?>'с лактоглобулина на отдельные признаки молочной продуктивности короа..\;.--. г.>ч"^-»:;Л'.'";"• : >
.";,•,'•!•••; •.; •;.".;.;.". ;:;,.'.''-"-Д.,%'?••''••<;' >•=;'.. •...;.-'»'•,"•..''•''; ~^;v.-.?%;V'-t"''-'J'^v-.',-,A-i^';'. '.•'"'• \>- v ..«/ >v-' J *-•"-• ?.'-;ч^ "•*' "?7
Г ••У;:;:/-^Публиквции.>;,>;^'^
:'':v"v r ' . По материалам диссертационной работы опубликовано 3 научные работы, в том i, ™ : * b
,*"";*;' числе 1 методические рекомендации.- i'^V";.^t.•v^''-V•-'->'•^/•v'•Vv^'Vv"'™•*•^•X.',*.i "|:i "v.'^ ;'•>-'• V'.p'*'"--*
• ; ; v,'."?,, J. Структура и объем работыД".^" ;"-..'';•''•_ •/.';' ;"'.J;;*?'^fr*~-.,''.-?- *'.У:'•<.;- • ^ ' ^ Ч ^ ; ' ' ; ; ^ ^ ; - - . ' - ' " : •*
•^, •"- • -. ':.-' ч Диссертация изложена ha 103' страницах,' содержит -18 * таблиц, •. 14 рисунков, 7-*., :; s .
, ' -.- состоит ; из' введения, • обзсра литературы * материалов '•'•• и ' методов *• результатов:'i,'• ' ',
исследований, выводов практических предложений списка литературы, который
включает 190 источников, в том числе 133 на иностранных языках <
" * "
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ
*
Экспериментальные исследования проводились в лаборатории молекулярной
генетики и цитогенетики животных в 1999 2000 гг<-в соответствии с планом научноисследовательской работы отдела биотехнологии ВИЖа
__
Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке 1
t
и
\
j
*
^
.
£,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок ]
СХЕМА ИССЛЕДОВАНИЙ
ПОРОДЫ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Красная горбатовская,
ГУП "Зимёнки"
Владимирской области
.
3
Чёрно-пёстрая,
ГУП «ПНО Пойма»
Московской обл. (в-27)
Z
Якутская,
Республика Саха
(Якут*яНп=33)
Швицкая (молочный тип),
• АО "Пригорское"
Смоленской области
(п=7Х>
Разработка и молифккацвя иолекулярно-г енетических
методов анализа аллелышх вариантов генов:
X
г~
бега-ла юогяобу лпн
каппа-казеня
Взятие образцов кровн,"гканиг
молока, спермы ""
Методы
• соями УУстракцш
Выделение ДНК
• Хмаинм
'
'
•свгрхюрттм Лв.
Рестриктазы:
Hindlft,
Tail,
Ара I,
Xbal
Проведение ШДР. Подбор специфических, олисонухлеотндных
праймеров и оптимизация режимов ачплифккаинии "
Рестриктты,
Pvull,
PstI
Рестрикциопный анализ амплифнцнрованных фрагментов
—у-
X
варианты
A,B,C,E,F,G
ьярншты
А,В,С,П
Электрофорез ДНК в агярозном геле
X
* Статистическая обработка получении* данных
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4
В опыте были использованы животные следующих пород'
1, Красная горбатовская (п==187), ГУП «Зиненки» Владимирской области;
2.'Швицкая, молочный тип (п=72), АО «Пригорское» Смоленской области,
3. Якутская (п=33). Республика Саха (Якутия);
4. Черно-пестрая (п=27), ГУП «ПНО Пойма» Московской области
От опытных животных отбирали пробы крови, ткани (ушные выщипы), молока или
спермы. Пробы крови консервировали путем добавления кислого цитратного раствора
(ACD), в соотношении б : 1 [Gustavson, S.'et al., 1987] Пробы ткани, молока, спермы
непосредственно после их взятия замораживали при -20'С и хранили в таком виде до
момента использования, ч Л . ; : , , > : ' : * " * .
Взятые образцы крови, ткани тестировали по 6 аллелям гена каппа-казеина и 4
аллелям гена бета-лактоглобулина методом ПЦР-ПДРФ по методике, разработанной в
ходе выполнения диссертационной работы [Гладырь ЕА. и др., 2001).
Выделение ДНК проводили посредством солевой экстракции {Miller S А., 1988],
лизиса в буфере Кавасаки или перхлоратным методом [Johns et al., 1989] с нашими
модификациями [Зиновьева НА- и др., 1998; Гладырь Е.А. и др., 2001]. Концентрацию
ДНК и степень ее очистки определяли, как описано в методических рекомендациях Н.А.
Зиновьевой с соавторами [1998]. v ; - > ••<"• -'-Ч-:•'".»'.• ;--.~ -•:]-; "' - : ••-•''-.,I 'Амплификацию исследуемых фрагментов ДНК'генов/каппа-казеина и беталактоглобулина проводили стандартным методом ПЦР анализа [Saiki R.K., et al., 1988].
После начальной денатурации; при 95°С в течение 5 минут выполняли 35 циклов
• амплификации в следующем температурно-временном режиме; 94°С - 1 мин, 57°С (для
каппа-казеина) и 60°С (для бета-лактоглобулина) - 1 мин, 72°С*- 1 мин. Температуру
отжига праймеров расчитывали, учитывая их температуру плавления. ;,*: , ; .
,: Реакции проводили в конечном объеме 50 мкп (для каппа-казеина) и 25 мкл (для
: бета-лактоглобулина) с 1«ПЦР буфером (16,6 мМ ( N H ^ S C u , 67,7 мМ Трис-HCI, рН=8,8,
0,1% (v/V) Tween 20), 1,5 мМ MgCIa, 20Q мкМ диоксинуклеозидтрифосфатов, 30 пмоль
;,... каждого из праймеров и 1 Ед Тад-полимеразы. •: ,/-: .-?, ;
^
" . ч Полиморфизм анализируемых генов устанавливали при помощи метода ПДРФ
: анализа [Leveziel et al., 1S88; Medrano J.F., Agular-Gordova E.,1990; Schlieben S., et al.,
1991; Saperstein D.A.; et al., 1991; Schlee p., Rottmann O.,* 1992]. Рестрицирующие
зндонуклеаэы выбирали, V исходя Г' из'.';' последовательности.:-\ амплифицируемых
фрагментов генов каппа-казаина и бета-лактоглобулина. ., . * - • " , ; • . ' •,
Анализ'; амплифицированных фрагментов . ДНК ' и у продуктов"... рестрикции
осуществляли посредством электрофореза при 130 В ' в 1,8-2%, агарозном геле в
буфере ТАЕ с добавлением бромистого димидия до конечной концентрации 30 нг/мл.
> Визуализацию; продуктов ПЦР-ПДРФ анализа; выполняли под ультрафиолетовым
светом. Для обработки и документации результатов использовали программу BioTest. ',
Статистическую обработку-данных проводили' по стандартным методикам
[Плохинский Н.А., 1978; Меркурьева Е.К., Шангин-Березовский Г.И., 1983].
,
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Оптимизация метода выделения ДНК из крови, ткани, молока, спермы с
' использованием перхлората натрия
. Для выделения ДНК из крови, ткани, молока, спермы наряду с методами солевой
• экстракции, Кавасаки, щелочного лизиса [Зиновьева Н.А.'и др.,- 1998], нами было
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
предложено использование модифицированного метода экстракции' с помощью
ч
перхлората натрия.
' >
С этой целью к 300 мкл консервированной крови добавляли 1,2 мл реагента А
(10 мМ Трие-НО, рН»8,0; 320 мМ сахароза; 5 мМ MgCI; 1 % Тритон Х-100, хранить при
+4°), тщательно перемешивали и центрифугировали 2 мин при 7500 об/мин. После
.удаления надосадочной" жидкости -процедуру -очистки клеточных шариков от
гемоглобина • повторяли. Молоко (1,5 ' мл) > помещали - в .1,5 " мл пробирки и
центрифугировали 5 мин при. 3S00 об/мин. Жидкую фракцию и жир удаляли, после чего
промывали /осадок :, соматических^ клеток : реагентом А. : Сперму (100 мкл)
центрифугировали 2 мин при 7S00 об/мин. Осадок тщательно перемешивали с 400 мкл .
реагента А, центрифугировали 2 мин при 7500 об/мин,' супернатант сливали, к осадку
добавляли 13 мкл 1М DTT. Кусочек ткани (2-3 мм г ), сперму, осадок лейкоцитов крови
или соматических клеток молока помещали в 1,5 мл пробирки, добавляли 150 мкл
реагента В (400 мМ Трис-HCl. рН=8.0; 60 мМ ЭДТА, рН=8.0; 150 мМ NaCI; 1 % SDS,
хранить при комнатной температуре), 5 мкл протеиназы К (20'мгЛлл) и инкубировали
при 60°С в течении 5-12 часов или на ночь. К клеточному лиэату добавляли 1/3 об. (50
мкл) 5 М раствора Na-перхпората и 5-7 мин хорошо перемешивали. Затем добавляли 1,5 об. (300 мкл) ОА'(24 об. хлороформа > 1 об. изоамилового спирта), интенсивно
смешивали 3-5 -мин и центрифугировали 5 мин при-15000 об/мин.'Верхнюю ДНКсодержгщую фазу переносили в,чистую пробирку и при необходимости.проводили .
повторную очистку^ CIA/ДНК из раствора осаждали 2 об.'(600 мкл) 100% этилового
спирта. При.; отсутствии ; шарика ДНК У (в случае - деградированной ДНК) пробы
центрифугировали 2-3 мин при 15000 об/мин^ Затем ДНК инкубировали 5-10 мин в 0.51,0 мл 70%: этанола (охлажденного; до -20°С).. После . удаления спирта шарик
высушивали в течение 20-30 мин при комнатной температуре. Содержимое пробирки
реоуспендировали в 50-100 мкл бидистиллированной воды или буфера ТЕ.;
Модифицированный'нами метод повышает эффективность выделения ДНК до ,
92,0-100% и отлично подходит для получения ДНК из деградированных,образцов крови, ,
ткани, а также молока и спермы. Выделенная ДНК'является высокомолекулярной и
может быть непосредственно использована для ПЦР анализа или храниться при -20°С
неограниченное время.'- у •'".'-у ' > 5 - . ' - ^ - <.? • •.: -уу .•>-""'; ";'•.'.. !•.;-•• !.-;•; *'-•''-Л-.'/ ' / 1 ; У- ')> '-у
3.2. Оптимизация. метода ПЦР-ПДРФ анализа гена каппа-казеина крупного
рогатого скота
;* ;' ; .':'':*'? i ; / : ' : '-^ r vJ; : ^v : , ;Л';л .'••'- :>;*•'.•'* :''•' ~-'',~У''"У1'У-\ "••
8 "настоящее время в большинстве научно-исследовательских лабораторий '
России при определении полиморфизма гена каппа-каэеина выявляются только два
основных аллеля: А. и В. Разработанная нами методика позволяет- осуществлять
диагностику шести из десяти известных в настоящее время вариантов каппа-каэеина
Исходя • из •••* наличия -'; и «локализации *; точковых:: мутаций, <: определяющих
принадлежность к различным аллельным вариантам,• нами были выбраны два
олигонуклеотидных праймера (EMBL Х14908 Х14326): VAR5 (ATA GCC AAA TAT АТС
CCA ATT CAG T, позиции 4966-4991) и VAR3 (ТТТ АТТ ААТ AAQ ТСС ATG ААТ СТТ G,..
позиции 5473-5488).'^-,'-\-.••',•'•.;'':;..С' ' : '.• '•> 7v' *"":; • •'•'' ' '"':•' ''•'•• •-'•"•',-';- '• .'-• '." ; ;
- Выбранные праймеры амплифицируют фрагмент экзона IV гена каппа-каэеина
длиной 532 и.о.. содержащий внутри себя соответствующие точковые мутации. В
таблице 1 суммированы данные о точковых мутациях в экзоне IV гена каппа-казеина
крупного рогатого скота с указанием их позиций, наличием рестрикционных сайтов, а
так же аминокислотных заменах, обусловленных мутациями.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
.
.
"
",
Таблица 1. •
. Точковые мутации в экзоне IV гена каппа-казеина крупного рогатого скота и обусловленные ими аминокислотные .'
замены
*
Вариант
и
№EMBL
Позиция
АК-
ДНК
АК
ДНК
АК
ДНК
AK IflHK
97 ; 5191,-2, -3
97,-
5191.-2, -3
(NsplJ*.'
145
5337 (M»0
148
5345 (Hindlll)
155
5365 {Apal)
GCACGTCA
Thr
ACTCTAGA
Asp
AAGATTCT -
Ser
AGAGCCCA
Агд . GCACGTCA
Thr
ACTCTAGA
Ala
His.
СО
GCACACCA
Thr
ACICJACA.
Ala
Агд
GCACGTCA
Thr
ACTCTAGA
Asp AAGATTCT •. Gly
(Та!))
•
A U84230
Агд
GCACGTCA •' Агд
"
Л
В XU326
Агд
С
His
GCACGTCA
•
4
со
GCACACCA
Е AF04U82 Агд' GCACGTCA
A
F AF123250 Агд
GCACGTCA
'
А
О
CAF123251 Cys
,
Агд -
GCACGTCA
Thr
и
AAGCTTCT
A
О
AAGCTTCT
AK |днК
Ser' AGAGCCCA
Ser
•
0
ACGCTAGA- Asp
AAGATTCT .
Ser
AGAGCCCA
О
AGGGCCCA
AGAGCCCA т
i
GCATGTCA • Cys
О
*
•
GCATGJCA
Thr
ACTJIAGA.
Asp
AAGATTCT '. • Ser
AGAGCCCA '
' Показаны участки последовательности ДНК в области точковых мутаций (выделены жирным шрифтом).
' Участки узнавания рестрикционными займами подчеркнуты. *-A/sp/-RCATGY, где R=G или A; Y= С или Т
0
- мутируемый нуклеотид; •* - место разрезания цепЧ ДНК рестрикционным энзимом.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Как следует из данных таблицы 1, вариант В каппа-казеина отличается от
.варианта
А аминокислотной заменой Asp ,4e -*Ala, вызванной соответствующей
Точковой мутацией в позиции 5345 (А-»С) {выявляются рестрикцией по Hindlll). Вариант Е отличается от вариантов А, В, С, F и G заменой Ser^S+Gly, обусловленной >', -.^
- точковой мутацией А-»С в позиции 5365 (выявляются рестрикцией па Apal). Вариант , '";'.
С, который при двухаллельной диагностике ошибочно диагностируется как вариант В,
отличается мутациями двух нуклеотидоа в позициях 5192 и 5193 (GT-»AC), приводящих
к замене Arg,'—>His (выявляется рестрикцией по Tail). Вариант',G. который может
*'.
присутствовать среди вариантов А, отличается от аллеля А в позиции 5191, в которой в •
I
7
;
. результате мутации С-»Т происходит замена Arg' —»Cys (выявляется рестрикцией по
Taif) Отличие варианта С-от. С может быть установлено в позиции 5191, з которой ' ; .
мутация первого.основания в;триплете' (С-»Т) приводит к аминокислотной з а м е н е / "
Arg9'—»Cys ч {выявляется рестрикцией по Nspl): Мутация в (позиции 5337 (Т—»G) '
обуславливает образование; варианта F, который- может.;-присутствовать среди"
.вариантов А (выявляется рестрикцией поXbal): , . . ' . .
' . ; - ' • . '
. Таким'образом, предложенный нами метод ПЦР-ПДРФ анализа фрагмента •'
экзона IV гена каппа-казеина крупного рогатого скота о использованием пяти различных
рестриктаз позволяет диагностировать шесть его вариантов - А, В, С, Е, F и G.
Для.объективной оценки , результатов при постановке каждой ПЦР.нами были
использованы два контроля'- положительный, в качестве которого выступала Д Н К ;
•••
крупного рогатого- скота с известной. концентрацией, и отрицательный, в качестве : л
которого • выступала"/реакционная .у;смесь'. - р • / добавлением -вместо, ; ДНК '...'• у
бидистиллированной воды до конечного объема реакции. V
-.. ~ • >
По завершении ПЦР 8-10 мкл реакционной смеси: наносили в агарозный гель с
целью контроля амплификации,- а также проверки контролей. В случае успешной
амплификации оставшуюся реакционную смесь разделяли на 4 аликвоты по 10 мкл и • •/
гидролизовали рестрикционныМи энзимами Hindlll, Tail, Xbal и Apal в количестве 2-3 Ед
на реакцию. Смеси инкубировали в течение 2,5 - 5 ч при оптимальной для каждого .
фермента температуре..По окончании инкубации проводили их эпектрофоретическое
разделение в 1,8-2% агарозном геле в буфере ТАЕ (130 V) с добавлением бромистого
• димидия до конечной концентрации 30 нг/мл и визуализировали фрагменты под
" ультрафиолетовым светом.. Для отличия '.вариантов G и С каппа-казеина (только для •;.
генотипов АС или BG) проводили дополнительный гидролиз рестриктазой Nspl.
В таблице 2 суммированы результаты рестрикции исследуемого фрагмента гена
каппа-казеина крупного рогатого скота в зависимости от генотипа.
" ' . . ' .
>'
*
Таблица 2
Д Л И Н Ы рестрикционных фрагментов гена крупного рогатого скота в
зависимости от генотипа
Наличие (+) или отсутствие (-) рестрикции и длины фрагментов (п о )
Tail
Nspl Xbal
Hindlll
Apal
532
+ 372 150
532
532 •
А + 228 304
.
•
.
532
532
В + 228 304
.
* 372 150 + 377 155 .
+ 372 150 1 + 377 155
532
532
532
С •
532
+ 372- 150
532
+ 403 129
Е- + 228 304
.
532
532
532
632
F + 228 304
•
•
532
+ 227 305 * 372 150- 532
532G На рисунке 2 схематично представлены результаты ПЦР анализа вариантов гена
каппа-казеина крупного рогатого скота по предложенной нами методике
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рисунок 2
СХЕМА ПЦР-ПДРСР АНАЛИЗА ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА.КРУПН0Г0 РОГАТОГО СКОТА
До рестрикции
12
3 4 5 6
5I2D.O.
После рестрикции 4-ия зндонуклеазаии
-^
_
В
1 2 3 *•5 6
ЕЗЕЯ
•
•
в» «1
12
3 4 5 6
_ 532пл.
zata
• •
377 п.0 ЕЗ 1Ш ЕЯ ES ЕЭ Ш
_ 155 п.о •
• • • с т а
А8 ВВ АА АА ВВ ВВ
Hind III
53 2л .о.
304 по
228 п.0.
^ _
1 2 3 4 5 6
12 3 4 5 6
_532пл.
взсяпвасэ
гага
ш 403 по. вш са ЕЯ а а и
• •
• —129 п о. • • • • • •
Е
Tail
Е
Ара I
ЕЕ
Xbal
-532ПЛ.
"372 п О.
-150по
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- Как показано на рис. 2А, при рестрикции по Hindlll аллель А {а так же Е. F, G) не
подвергается гидролизу и представлен фрагментом 532 п.о, Аллель В (а так же С) .
расщепляется данной рестриктазой с образованием двух фрагментов длиной по 377 и
155 п.о. Т а к и м образом, при использовании рестриктазы Hindlll могут быть четко
визуализированы генотипы АА (дорожки 3,4), АВ (дорожка 1) и ВВ (дорожки 2. 5. 6)..
"• ;
" . Рестриктаза Tail позволяет выявить наличие аллелей; В , и . С (рос. 2 S ) . , .
Отсутствие рестрикции по данному ферменту обусловлено наличием аллеля С среди •'
презумптивных генотипов АВ и ВВ и аллеля G среди генотипов АА и АВ (дорожки 1.5).
.
Для дифференциации. генотипов "; АС и BG "необходимо •. использование
рестриктазы Nspl. В случае наличия аллеля G, использование данной рестриктазы
приводит к образованию двух рестрикционных фрагментов.-Аллель С характеризуется >
отсутствием гидролиза no Nspl. : ; ' - • ; • ; : . . •"''::;>^, .'.':'"'.•'".":"*-у'/.":'•'.;г* -l'';V .• -^ •-..•--> •;
Гидролиз продуктов ПЦР ферментом Apal позволяет'идентифицировать аллель
Е каппа-казеина крупного рогатого скота (рис. 2С), при наличии которого образуется . два рестрикционных фрагмента длиной 403 и 129 п.о. (дорожки 2, 3 и 6).'.,:
' Нерестрицироаанный фрагмент, образующийся при гидролизе с истолкованием
эндонуклеаэы, ХЬа/, (рис. 2D),, является редким для большинства пород аллелем F
. (дорожка 3)./•,-••'..* .v.,- -j"-; 4 ,.'ч'»>; С-':-''--1-'! t* !..:•"."'•'• •'"'"'- Г'о."\ .'•• ~-ч ';•:• ' '' '•'•'"*..• -'".'•:•..
Предложенная' методика' может быть несколько модифицирована посредством
.исключения традиционного гидролиза no;Hindlll и заменой его рестрикцией всех ;
образцов по Taql. В этом случае для выявления шести генотипов каппа-казеина будет
достаточно так же пяти рестрикционных ферментов; Tail, Apal, Xbal, Nspl и Taql. ••:,.
3.3. разработка' метода ПЦР-ПДРФ для идентификации вариантов гена беталактоглобулина крупного рогатого скота . ч > ; \
": - . " * ; • /
', :
Диагностика ч четырех 'наиболее: часто \ встречающихся аллеля - гена - бета- •
. лактоглобулина крупного рогатого скота - А, В,' С и D основана на.определении -,"вллелеспецифических
• точковых . мутаций "- • посредством = ' соответствующих
рестрикционных ферментов. ;•.. .-Чу;',' - : ;., ';.-••" ;-; У Ч у — • ' '••*'.'".',' • -т', : :
; :. .•;
Исследованием .^последовательностей ! ' аллельных" вариантов гена - беталактоглобулина крупного рогатого скота, было установлено, что его полиморфизм ~обусловлен точковыми мутациями . (базовыми заменами) в позициях 2206 в экзоне I, a .
также в позициях 3065 и 3109 экзона II (Gene Bank Access № Х14710). В результате'
этого редкий вариант D отличается от вариантов А,,В и С аминокислотной заменой
Glu->Gln в позиции 45. Отличие варианта В выявляется в позиции 64; где в результате
' мутации второго основания триплета GAT->GGT происходит замена Asp-*Gly. Вариант '•*
С характеризуется заменой последнего основания в триплете CAG на САС, что влечет
за собой образование His вместо Gin в.позиции 59 бета-лактоглобулика^ .
Нами были подобраны . праймеры,' амплифицирующие фрагмент • гена . бета- лактоглобулина длиной 1248 п.о., включающий точковью мутации, обуславливающие '
его полиморфизм: LG5a {СТА TTG ТСС TCG TAG AGG AAG С, позиции 2031-2052) и
LG3a (AGA AAG CCC TGG ATA AGC AGC С, позиции 3257-3278).
• : -"•..
Продукты ПЦР, разделяли на две аликвоты и обрабатывали ферментами Pvull и
Pstl. Рестриктаза Pvull позволяет идентифицировать варианты А, В и D гена беталактоглобулина, в то время как обработка рестриктазой Pstl выявляет вариант С. . ;
Амплифицируемый фрагмент гена бета-лактоглобулина с указанием наличия...
рестрикционных сайтов Pvull, и длин образующихся рестрикционных фрагментов
схематична представлен на рисунке 3.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
10
/\" •
'
.
РисунокЗ
Схема ПЦР-ПДРФ анализа гена бета-лактоглобулина крупного рогатого
скота (EMBL X14710) с использованием рестриктазы Pvu//
'•
•-'•..-'
2207/2208
I
« 4 8 ПО.
2504/2505
V;
3067/3068
1
20:
Pvull
А - , " . • 474
177 п.о.
В, С
177п.о.
D
•
Pvull
ПО.
••'' ' " •
з; 78
t
Pvull
-
774 п.о.
„'•
774 п.о.
297 п.0.
297П.0.
211 п.о.
5вЗ"л.о.
Как видно из представленной схемы (рис. 3),, наличие двух специфических
фрагментов рестрикции по Pvull длиной 774 и 474 'п.о. соответствует аллелю А.
Точковая мутация в нуклеотидной; последовательности варианта В обуславливает
образование дополнительного сайта рестрикции Pvull и приводит к наличию трех
специфических для аллеля В фрагментов длиной 774, 297 и 177 п.о. Результатом
нуклеотидной замены в аллеле D гена бета-лактоглобулина является образование еще
одного специфического для' Pvull сайта и," как следствие, - появление четырех
рестрикционных фрагментов длиной 563,. 297, 211 и 177 п.о.
Рестрикция с использованием эндонуклеазы PstI позволяет диагностировать
аллель С гена бета-лактоглобулина {рис. 4}. .
''.••:,
•'•
В нуклеотидной последовательности варианта С {рис. 4) имеется лишь один
общий для всех аллелей.сайт узнавания PstI, в то время как в вариантах А, В и D
присутствует дополнительный рестрикционный сайт для эндонуклеазы PstI. При
_ гидролизе ло PstI последовательности варианта С в геле визуализируются два
фрагмента длиной 182 п.о. и 1066 п.о., в то время как при гидролизе аллелей А, В и D
помимо общего-фрагмента длиной 182 п.о. образуются два специфических фрагмента
длиной 896 и 170 п.о.
.,
', .
:"•/••;.'
. i '•'•".. г
,•
'..••'"''•.'.
-'".•'.
Рисунок
4..
Схема ПЦР-ПДРФ анализа гена бета-лактоглобулина крупного рогатого
скота (EMBL XI4710) с использованием рестриктазы PstI
i
. .
.
"
.
••
•
• 1248П.О.
2212/2213
.
I
'•'
2 0 il l
С
..
•
:
•
•
"
"
•
3108/3109
'
I
• • • • .
PstI
,*82л.с^,
••••-'
.
*
PstI
Ювв п.о.
782Л.О.
>>•:;
,
•
--л
V
."".'".'"'"
'.'•
'•'•':'-'":
: - . . - 3 i
/
896 п.о.
; . : :.ч
•
170 п.о.
'•
• '
- ' - • •
•
'
'
,
"
'
•
•
••
•
.
•
'
.
-
•
"
•
78
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
На рисунке 5 представлен ПЦР анализ гена бета-лактоглобулина крупного
рогатого скота с указанием длин образующихся фра .иентов а зависимости от генотипа
животных (оригиналы фотографий даны в диссертационной работа).
Рисунок 5
Схематическое изображение образующихся рестрикционных фрагментов в
зависимости от генотипа по бета-лактоглобулину
1
2
3
4
5 6
VB ЕЗЭ ЮЯ ВЯ БЕЗ
1
2
3 4 £ 6
т вя во' са из
S B "' вбм •
ЕВ XEI ЖШ ЕЯ ЕЯ
С З П З С З СП ЕЛ
=
АВВВ А В В В В В М
Pvuii
774 по.
473 по.
297 п о .
— 1248 по.
1 2
3
4
5 6
из ш аз аа ев cs
1066 по.
_ 896 п.о.
177 п.о.
Pstl
, На рисунке 5А показан амплифицированный фрагмент гена бета-лактоглобулина
до рестрикции. После рестрикции no Pvul (рис. 5В) могут быть четко
идентифицированы фрагменты длиной 474 п.о., соответствующие аллелю А (дорожки
1, 3), и 297 п.о. и 177 п.о., соответствующие аллелю В (С) (дорожки 1 -5), а так же общий
для обоих аллелей фрагмент длиной 774 по. (дорожки 1-5). Следует отметить, что при
исследовании животных различных популяций ни в одном случае не было установлено
наличие аллеля D гена бета-лактоглобулина, которому соответствуют фрагменты
длиной 563 п.о. и211 п о .
•• ••••:••.;
Гидролиз по Pstl позволяет дифференцировать аллели В и С (варианты В и С
имеют идентичные сайты узнавания рестриктаэой Pvull, и поэтому редкий аллель С
может быть ошибочно диагностирован как В). О том, что животное имеет аллель С
говорит наличие PsM-фрагмента длиной 1066 п.о. (рис. 5С, дорожка 2), в то время как
вариантам А, В и D соответствуют фрагменты длиной 896 п.о. и сдвоенный фрагмент
длиной 182-170 п.о. (дорожки 1-6). Нанесенная на дорожку 2 (рис. 5С) проба ПЦР-ПДРФ
анализа, генотип которой по рестриктазе Pvull был предварительно диагностирован как
ВВ, имеют фактический генотип ВС,
> .
Для облегчения идентификации фрагментов' в качестве положительного
контроля при постановке каждой ПЦР может быть рекомендовано использование ДНК '•
животных с гетерозиготным генотипом по бета-лактоглобулину - АВ.
Предложенные нами методы диагностики полиморфизма генов каппа-казеина и
бета-лактоглобулина на основе анализа ПЦР-ПДРФ просты в исполнении, достоверны
и отличаются хорошей воспроизводимостью результатов. Они могут быть с успехом
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
\2
.
использованы для, тестирования крупного рогатого скота в рамках популяционногенеыческих исследований, 'дл^ сохранения генетического разнообразия, а так же в
качестве возможных маркеров локусов количественных признаков.
3.4. Популяционно-гвнвтичвский анализ гена каппа-казеина у различных
пород крупного рогатого скота Российской Федерации ' Многочисленными исследователями показано положительное влияние аллеля В
каппа-казеина на содержание белка в молоке, а также на сыродельные характеристики;
молока [Marziali AS.. Ng-Kwai Hang K.F., 1986; Mclean D.M., 1987; Hansen H.,1990;
Jersay Journal, 1990; Borze £., Oohy.J., 1993; Ron M., et al., 1994; Иопчиев Б.С., 1994;
Глазко В.И., 1997; Зиновьева Н А , и др., 1999; Попов А.Н., и др., 1998, Романосова Е Г..
Породы и популяции крупного рогатого скота Российской Федерации мало
изучены - с точки зрения полиморфизма гена каппа-казеина и взаимосвязи его
аппельных вариантов с признаками молочной продуктивности. Результаты
проведенных популяционно-генетических исследований суммированы в таблице 3.
" '
'
' Таблица 3
Частоты аллелей и генотипов гена каппа-казеина f исследованных пород
крупного рогатого скота
ЧАСТОТН АЛЛЕЛЕЙ
Ч А С Т О Т Ы ГЕНОТИПОВ
АА | АВ | В В | АЕ I BE ЕЕ I BF | ВС | AC | AG
А | В I E I F 1С Ю
Красная горбатовская порода, ГУП «Зименки», Владимирской области (п=187)
1•
67 30 17
1
п
56
В
6
2
• .
•
•
% 52,41 38,24 7,2l| 1,61 0,53
29,95 35,83 16,04 9,09 4,28 0,53 3,21 1,07
Швицкая порода, молочный тип, АО «Пригорское», Смоленской области (п»72)
.
„•
.
1
1
2 | 1
п
7
28 I 32
1 39 1 39 2 7Й 1 39
0,69 2,0£ 0,69 9 72 38 8944А4
% 31,25 85,2?
Якутская порода, Республика Саха Якутия (п=33)
. I П"
7 23 3
.
.
*
»
щ
56,06
43,94
9,0!
21,21 69,70
%
Чврно-пест рая пород а, ГУП «ПНО Поймав.Московской области (п=27)
к
18 | 7 • 0 • 2
.
. 66.67i25.92 0
% 83,33 12,©е 3,70 .
7,41
.
Как следует
из данных таблицы! наибольшая
частота
встречаемости
предпочтительного генотипа ВВ, была отмечена у животных молочного типа швицкой
породы (44,44%), что в 5 раз больше, чем в черно-пестрой породе. Частота аллеля В в
данной популяции так же была наивысшей среди исследованных групп и равнялась
qB=65,28%. Красная горбатовская порода характеризовалась более низкой частотой
встречаемости аллеля В и генотипа ВВ (соответственно, 38.24% и 16,04%).
.Заметна отличается от швицкой, и красной горбатоаской пород популяция якутского
скота. При относительно высокой частоте встречаемости аллеля В (рВ=43,94%)-доля
гомозиготных генотипов ВВ составила лишь 9,09%.
Наименьшая
частота- встречаемости
предпочтительного
аллеля В была
установлена а черно-пестрой породе (qB*12,96%).* Гомозиготных генотипов ВВ в
данной популяции обнаружено не было.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
. - • ' - '
-'
' • ' • " . • . ' -
-•
"
.
.
*
•
-
- • ' "
• " •
'"•
, '
'
1
3
Интересным является" тот факт,-что у ' животных красной горбатовской и
молочного типа швицкой пород частота встречаемости гетерозиготного генотипа АВ
была приблизительно одинаковой и составляла, соответственно, 35,8% и 38,8%. В
.'. якутской породе частота встречаемости гетерозиготного генотипа АВ была примерно в
два раза выше (69,7%). Минимальная частота встречаемости генотипа АВ была
отмечена у коров черно-пестрой породы - 25,9%.
..'"•;,'
Наибольшее количество аллелей выявлено у животных красной горбатовской и
молочного типа швицкой пород - пять аллелей из шести диагностируемых. В обеих
популяциях были определены как основные аллели А (соответственно, qA=52,41% и
31,25 %) и В (соответственно, qB=38,24% и 65,28%), так и достаточно редкие аллели F
(соответственно, qF=1,61% и 0,69%) и С (соответственно, qC =0,53% и 2.08%).
Аллель Е был выявлен в красной горбатовской породе с относительно высокой
частотой встречаемости равной 7,21 %J Из двадцати шести животных одно имело
. гомозиготный генотип ЕЕ (0,53%), семнадцать - АЕ (9,09%) и восемь - BE (4,28%). В
черно-пестрой породе этот аллельиый вариант встречался с частотой qE равной
; 3,70%, а частота АЕ генотипа составила 7,41%.
, ;
Среди семидесяти двух голов швицкой породы, молочного типа у одного
животного был установлен генотип AG, что соответствует частоте встречаемости
редкого аллеля G равной 0,69%.
Наиболее гомогенной из исследованных групп животных оказалась популяция
якутского скота. В ней были выявлены только два аллеля - А и В.
'.- Определено, что процент ошибочно интерпретируемых результатов при
двуаллельной диагностике составляет; 6,94% (швицкая порода, молочный тип), 7,41%
(черно-пестрая порода), 18,34% (красная горбатовская порода).
Анализ генетической структуры популяций показал сохранение генного
равновесия по генотипам каппа-казеина в популяциях крупного рогатого скота чернопестрой и молочного типа швицкой пород (Р=0,05).
3.5. Связь генотипов каппа-казеина с молочной продуктивностью у
исследованных пород крупного рогатого скота
Нами были изучены взаимосвязи между различными генотипами локуса каппаказеина и признаками молочной продуктивности у исследованных пород; Результаты
анализа представлены в таблице 4. Для расчетов были использованы данные только
тех животных, по которым имелась продуктивность за 305 дней первой лактации.
Анализируя данные таблицы 4 по красной горбатовской породе, можно
предположить, что наиболее желательными по удою являются животные, несущие в
своем генотипе аллель Е каппа-казеина, причем генотип ВЕ^возможно является более
благоприятным по сравнению с генотипом АЕ. От животных с генотипом BE было
получено больше молока и молочного жира при приблизительно одинаковом
; процентном содержании жира в молоке. Наименьший удой зафиксирован у коров с
генотипом BF каппа-казеина, что вероятно говорит о негативном влиянии аллеля F на
молочную продуктивность в целом. Недостаточное число животных с генотипом ВС не
позволяет сделать определенных выводы о влиянии аллеля С на удой и содержание
жира в молоке крупного рогатого скота.
Данные по продуктивности животных швицкой породы показывают оределенное
преимущество аллеля В по сравнению с аллелем А как по удою, так и по содержанию
жира и белка в молоке. От коров с генотипом ВВ получено на 27% больше молока, чем
от гомозигот АА при прибпизительно одинаковом содержании жира и белка. Аллель G,
диагностированный у одного животного, оказывает, вероятно, неблагоприятное
.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
14
;
влияние на. молочную продуктивность и содержание жира и белка в молоке, хотя по
одному животному сделать конкретный вывод не представляется возможным.
"•.•'.•УS •'/'••'•'••'-•'•
' :*" " ;
"
'
Таблица4
Взаимосвязь генотипов по каппа-казеину с молочной продуктивностью
П о р о д а " Генотип
Кол-во *
Удой за
животных. , 305 дней,
Жир,
Молочный
жир,
Бепок,
%
%
%
кг
Красная
горбато»
вская
АА
' 4 0
41
20>
2962 * 94
АВ
;••3108±109
3019 ± 1 4 0
ВВ
А Е ••••
•-:•>. 1 4 • • • "
3424*213
BE '••' . , • . . - 7 - • • - 3589 ± 3 2 4
BF
3 2864 * 520
• • • - I - . , ,
ВС
3575
6 •>' : 3937 ± 462
Швнцкая, А А
молочный A B ­
20
4445 ± 2 3 5
типBS • • " 2 8
5002 ± 227
A G •••:- ... ' . 1 ' • : - ' .
3483 -
Молочный
бепок,
%
4,22 * 0,03 1 2 5 , 1 * 3 , 9
.
4,20 ± 0,03 130,6 ± 4 , 6
.
4,20 ± 0.04 1 2 6 , 9 * 5 . 6
.
4,10 ± 0 , 0 6 140,5 * 8,3
4,26±0.13 1 5 3 , 0 * 1 5 , 9
.
„
4,26 ± 0 , 1 9 1 2 1 , 9 * 1 6 , 4
.
4,00
143,0
.
.
3,84 ± 0,06 1 5 1 , 0 * 1 8 , 3 3.29*0,02 129,7* 15,8
3.79 ± 0,02 1 6 8 , 5 * 9,1 3.32*0,01 1 4 7 . 6 * 7 , 9 8
3,86 ± 0,02 193,1 * 8,7 3,36*0.01 167,8*13 65
115,29
127,1
3,31
3.65
' ;' Анализ продуктивности животных красной горбатовской породы в зависимости от
; генотипа показал отсутствие достоверной разницы по удою, жиру и молочному жиру
среди коров с разными генотипами (табл. 5).;
Таблица 5
Соотношение генотипов гена каппа-казеина в зависимости от параметров
молочной продуктивности у исследованных пород крупного рогатого скота
Параметр
1
У д о й , кг
Порода
г
Красная
горбато вская
«
.
i
t
"•"'
о
У д о й , кг
*•
ч.'
' '< •
Швицкая,
молочный тип
Молочный Красная
горбатовская
жир, кг
г
Швицкая, молочный тип
-- ' ,
г
-
" '
!--
'
*
Соотношение
генотипов
3
АЕ>АВ>АА
АЕ>А8
АЕ>АА
BE>BB>BF
,
ВЕ>ВВ
BE>BF
ВВ>АВ>АА ВВ>АВ •
*" В В > А А ^ ' "•
BE>BB>BF
ВЕ>ВВ
BE>BF
ВВ>АВ>АА
"
ВВ>АВ
* ВВ >АА '-,
Разница
Td
4
5
-
p
6
+ 316
+ 462
1,32
1.985
v=53
v=52
<0,95
<0,95
+ 570
+ 725
1,615
1,18
w=25.
v-25
<0.95
<0.95
,
+ 557
...
+ 1065"'"*
1,705 ' v=46
2,069 " V=32
+ 26.1
+ 31.1
1 55
1.36
<0,95
>0.95
~
+ 24 6
1,95
+ . 4 2 . 1 ^ " ' 2.078
•
"
v =25
v=8
«0.95
<0.95
v=46
v =32
<0,95
* >0,95 -
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
,
1
Жир, %
Белок, %
2
Красная
горбатовская
Швицкая,
молочный тип
Швицкая,
молочный тип
Молочный Швицкая,
белок, кг молочцый тип
3
-
15
в
5'
4
АА>АЕ
+ 0,12
1,79
v»52
<0,95
ВВ>АВ
+ 0,07
2,47
v =46
>0.95 ,.
+ 0,04
+ 0,07
2,857
3,125
v*46
v=32
>0,99
>0,99
+20.2
+ 38,1
1,278
1,825
v»46
v=32
<0.95
<0,S5
ВВ>АВ>АА
ВВ>АВ
ВВ>АА
ВВ>АВ>АА
ВВ>АВ
ВВ>АА
'
У животных молочного типа шзицкой породы, в - результате статистической < обработки полученных даьных, была установлена достоверная разница между ВВ и АА
генотипами каппа-казеина по удою (+1085 кг, Р>0,95) и молочному жиру (+42,1 кг.
Р>0,95), между ВВ и АВ - по жиру (+0,07%. Р>0.95) и между ВВ и АВ, ВВ и АА
, генотипами по процентному содержанию белка (+0,04% и +0,07% соответственно;
!
Р>0,99).
.
.
3.6. ропуляционно-генетический анализ гена бета-лактоглобулина у
различных гюрод крупного рогатого скота Российской Федерации
В настоящее время частоты встречаемости генотипов и аллелей беталактоглобулина, а также влияние отдельных аллельных вариантов данного гена на
молочную продуктивность различных пород . крупного рогатого скота Российской
Федерации довольно слабо изучены.
' В исследованных породах было выявлено три аллеля гена бета-лактоглобулина
—А, В и С из четырех диагностируемых нами (табл.5).
АЛлели А и В были выявлены у всех пород, при этом частота встречаемости
данных аллелей у исследованных животных, кроме красной горбатовской породы, была
приблизительно одинаковой и составляла, соответственно, в. швицкой породе 40,625%
и 53,125%; в якутской породе - 51,56% и 48.44% и в черно-пестрой породе 48,0% и
$0,0%. Частота генотипа" АА. коррелирующего, как иэеесЧно, с . повышенным
содержанием белка в молоке [Ng-Kwai Hang K.F., 1993], была наивысшей у якутского
скста (18,75%). У животных черно-пестрой и шзицкой пород эта величина была
несколько ниже и составляла, соответственно, 16,0% и 12,5%. Частота встречаемости
гомозиготного генотипа ВВ была максимальной в швицкой (31,25%), а минимальной в
якутской (15,62%) породах. Черно-пестрая порода характеризовалась средним
показателем частоты генотипа 6'J равным 20,0%.
Э трех породах крупного рогатого скота среди В вариантов был выявлен С
аллель гена бета-лактоглобулина. Его аллельные частоты колебались от qC= 0,4% у
красной горбатовской до qC= 6,25% у молочного типа швицкой пород. Черно-пестрая
порода занимала промежуточное положение (qC= 2,0%). В красной горбатовской
породе аллель С встречался в сочетании с аллелем В и частота генотипа ВС
составила 0,8%. Среди животных черно-пестрой породы и молочного типа швицкого
скота аллель С всегда встречался в сочетании с А аллелем, и частота генотипа АС
находилась в пределах 4,0 -12,5% соответственно.
i • '
•-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
16
Таблица 5
Частоты аллелей и генотипов гена бета-лактоглобулина у исследованных
пород крупного рогатого скота
Частоты генотипов
Частоты аллелей
,,
ВС
А
В
|
С .
D
АА
АВ
ВВ
АС
Красная горбатовская порода, ГУП «Зименки», Владимирской области (п= 132)
п
-1
55 | 71
5
75.00.4.
%
41.7 | - 53 8
08
- 24.6
-3.8 ' Швицкая порода, молочный тип, АО «Пригорское», Смоленской области ( 1=16)
* V.\
:
•-.:••• 2
- • - . • -V7-- •
!l^— ' ' "
" '
5"
2
% > 40.625 53.125
6 25
12.50
43.75_^ 31.25
12 50
• " : ' Якутский скот, Республика Саха (Якутия) (п=32)
:
п
'••
.
- • ' - 2 1 ' - ' ••-' 5
48.44 , ' . v ' : . ..:
.%
51.56
18.75
15 62
65 63
. Черно-пестрая порода, ГУП «ПНО Пойма», Московской области (п=25)
\ ч , - -•
v v - : ' . - - . : - . . J >;•;•• :••-• " ; " • д ' • " ' • • - 1 5 — 5
' п'--."
1
I
50.0" " 2 . 0 - 1 - • • : . - : 16.00
%
60.00
20 00 |
4.00
48.0• • . • • « • !
, ;
-
п
•••
>"
У-
•'.
"->*-
'
!
.'
>
• ; ".">
,
:
'
- • ' ' • ; . . « . • • ' •
-'••-"
6 ' - • "
•
•
•.;.'
. :
'
•
•
-
•
'
*
;
,
};-•>.'.' Популяция скота якутской породы оказалась наиболее однородной, с наличием
двух основных аллелей гена бета-лактоглобулина и с преобладающим количеством АВ
гетероэигот (АВ=65,63%).'Аллель С в данной популяции выявлен не был •
" •; ; \ У всех протестированных животных различных пород крупного рогатого скота
России отсутствовал редкий аллель D, образующий после гидролиза ферментом Pvull
. помимо общих фрагментов - 297 и 177 по., фрагменты длиной 563 и 211 п о.
Анализ распределения генотипов показал сохранение генного равновесия по
локусу бета-лактоглобулина (Р=0,05) у исследованных пород, v
'.;' > Исходя из полученных результатов,«можно заключить, что использование
предложенной нами методики ПЦР-ПДРФ анализа позволяет исключить ошибочную
интерпретацию результатов. Как было установлено, процент ошибок при двуаллельной
диагностике составлял в зависимости от породы 0,76,4,0 и'12,5% (соответственно,
красная горбатовская, черно-пестрая и швицкая породы)., I;. JY••<
3.7. - Связь генотипов и аллелей гена бета-лактоглобулина с молочной
продуктивностью , > • ' - ' Л:'.- ::'Y'- V :;< >'' ':'^\\
•^."-^•YK^U
, В ^таблице ' 6 представлен - сравнительный. анализ , параметров молочной
продуктивности коров исследованных пород в зависимости от генотипа по гену беталактоглобулина.
':':;:;'-.-•;,..".'.''•'•; ':С,";>.:<;•'••'••••;;:v.V;'.- ..••••'.-•';,'.'••-:'•!?.••'.•-'.
1
« Приведенные в таблице, 6 данные выявляют, тенденцию по превосходству
•животных с гомозиготным АА генотипом красной горбатовской породы как по удою, так
и по жиру над особями с генотипами АВ и ВВ по гену, бета-лактоглобулина. При
анализе процентного содержания жира в молоке исследованных коров выявлено
преимущество/гомозиготных генотипов над гетерозиготным., АВ гетерозиготы имели
' минимальный процент жира, равный 4,16%.'
, ? .':«;>'
':•':-'". ••* Полученные результаты по продуктивности животных молочного типа швицкой
породы указывают на возможное преимущество
коров с ' А А генотипом беталактоглобулинв над АВ и ВВ по удою, хотя АС гетерозиготы показывают наивысшую
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
•
17
продуктивность по первой лактации. Имея минимальное процентное содержание жира
среди двух исследованных пород, а так же самый низкий процент белка, животные с
этим генотипом в тоже время дали максимальное количество молочного жира {219,6 кг)
и молочного белка (188,9кг).
.,
:V; -V-;, '•••=•';•-' ~''• •"''•".'У •'*.'.'• '•".'^.- "'':>' ^-"* ••.'•*•' ''•• ••*'..
/••'";•'"".Г. •"•'•."• л-~'~':':'.'•'-': •"• •'••''<• '"'••' i/;>?;
Таблица 6
Взаимосвязь генотипов по бата-лактоглобулину с" молочной продуктивностью
Удой за
Порода Генотип Кол-во
Жир,
Молочный . Белок, Молочный
белок,
животных, 305 дней,
"жир; .
л
v к г •"">••'
%
3061 ± 254 4,29 ±0.02| 131,2±10,3:
Красная АА
горбато- А8
34
2959 ± 99 4,16 ±0,03 123,2±0,03
вская
ВВ
2957 ± 84 4,20 ± 0,03 124,1±3,12
46
Швицкая, АА
5543 ± 396 3,87 ± 0,01 214,6±15,9 3,33*0,01 184,5±12.63
молочный АВ
5247 ±317 3,91 ±0,03 205,2±12,8 3,33*0,03 174,8±11,52
тип
ВВ
5399 ±120 4,06 ±0,15 219,1*13,6 3,39±0,04 183,0*6,08
АС
5703 ± 363 3,85 ±0,14, 219,6*6,01 3,31*0,03 188.9±13.71
; '••'
%
•
Коровы швицкой породы, молочного типа, с генотипом ВВ бета-лактоглобулина
• со средним удоем 5399 против 5703 кг у животных с генотипом АС имеют наивысшее
процентное содержание жира и белка в молоке — 4,06 и 3,39 % соответственно, что
согласуется с данными Ron M. etal. [1994].
,
•
Анализ молочной продуктивности
животных в зависимости от генотипа
представлен в таблице 7.
• Таблица 7
Соотношение генотипов гена бета-лактоглобулина в зависимости от,
параметров молочной продуктивности у исследованных пород крупного рогатого
скота
Порода
Td
P
Соотношение Разница
Параметр
генотипов
(D)
6
1
3
4
5
2
АА>АВ>ВВ
Удой, кг Красная
горбатовская
АА>АВ
+ 102
0.374 v=36 <0.95
АА>ВВ
+ 104
0,389 v=48 <0,95
Швицкая, + 296
0,584 v=7 <0.95
АА>АВ
молочный тип
0,946 v=7 0 , 9 5
АС>АВ
+ 456
+ 0,13
Жир, %
Красная
АА>АВ
3,61
v=36 >0,999
горбатовская
АА>ВВ
2,5
v=48 >0,95
+ 0,09
ВВ>АВ
+ 0,04
0,95
v=78 <0.95
ВВ>АВ>АА
Швицкая,
молочный тип
v»10 <0.95
ВВ>АВ
+ 0,15
0,98
+ 0,19
ВВ>АА
1,267
v=5 <0,95
+ 0,04
АВ>АА
1,25 , v=7 <0,95
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1
2
Молочный Красная, . . ,
горбатоеская,
жир, кг
Белок, %
Шаицкая, • молочный тип
Шаицкая, •
молочный тип '"
3
5
4 -
АА>АВ
+8
АА>ВВ '
+ 7.1.
АОАВ
+ 14,4
ВВ>АВ>АА
ВВ>АВ
ВВ>АА
+ 0,06
+ 0,06
6
0,774- v=36
-.
«0,95
<0.95
0,658
1,018
v =48
v=7
1,2
1,463
v=10 <0,95
v=5 <0,95
«0,95 ,
" У животных красной горбатовской породы, при статистической обработке
полученных данных. Была установлена, высоко вероятная достоверность вычисленных
показателей по процентному содержанию жира в молоке, между генотипами АА, АВ иВВ. Разница" между АА/и АВ генотипами бета-лактоглобулина равнялась +0.13%, что
соответствует третьему порогу достоверности (Р=0,999), и АА больше ВВ на 0,09% •
(Р=0,95) что .соответствует:' первому порогу/достоверности.-По удою и. количеству ,
молочного жира достоверных различий в изученной породе выявлено не было.
В отличие от красной горбатовской породы, у коров швицкой породы не было
выявлено достоверной разницы па всём исследованным параметрам. Одной из причин
этого может быть малое количество животных в выборке.
\
Для,того,чтобы сделать' окончательный5 вывод 'об отсутствии или наличии
корреляций между исследуемыми Генотипами бета-пактогпобупина и признаками
молочной продуктивности короз, необходимо проведение исследований на большем
ПОГОЛОВЬв; ЖИВОТНЫХ.
'
.
.
..
.
•*-
ВЫВОДЫ
. *'
.
. '
•
1. Создан банк ДНК крупного рогатого скота красной горбатовской породы (п=187),
молочного типа Швицкого породы (п=72),:якутской породы (п=33), черно-пестрой ~
породы ; (п=27), который может быть использован для проведения различных
молекул^рнолгенвтических исследований/-'/.^^; ;-•.'
*.2. Оптимизирована методика выделения ДНК из крови (п=60), ткани (п=56). спермы
Дп^гО), молока (п=30) К Р С Эффективность выделения высоко молекулярной. ДНК,
пригодной ;для ПиР-ПДРФ анализа фрагментов, длиной более 1 т.п о , составила
- 92.6-100% по сравнению с 70,6% при использовании стандартного солевого метода
экстракции.
- -"
,
3. Модифицирована
и
усовершенствована
методика
рЦР-ПДРФ
анализа,
позволяющая выявлять 6 полиморфных аллелей гена каппа-казеина крупного
рогатого скота. - А, В, С, Е, F, G. Установлено, что при стандартной двуаллельной
диагностике процент ошибок в зависимости от породы составляет: 0,94 % (шаицкая,
молочный тип), 7,41% (черно-пестрая), . 18,34% (красная горбатовская)
4. Разработан/новый метод выявления 4-х ! полиморфных аллелей гена бета. лактоглобулина крупного - рогатого скота > на основе ПЦР-ПДРФ анализа.
• Установлено, ' ч т о .г процент"' 5 ошибочно , интерпретируемых
генотипов при
. двуаллельной диагностике в зависимости от исследуемой породы составляет 0,76%
(красная горбатовская), 4% (черно-пестрая), 12,5% (швицкая, молочный тип).
5. Показано, : что •• частоты • встречаемости аллелей каппа-казеина различались в
зависимости от породы. Частота предпочтительного для сыроделия аллеля В была
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
г ; минимальной (12 96%) у черно-пестрой породы, и максимальной у швицчой породы
" , (65,28%) Наряду с основными аллзлями каппа-казеина А и В в трех из четырех
исследованных породах выявлены редкие вплели С, Е, F. G Относительно высокая
ч частота встречаемости аллеля Е (7,21%) была установлена у животных красной
,.;..- горбатовской,/ породы. -,• Наибольшее -число,.: ; различных ••<.- генотипов .г было.
\j
• диагностировано у животных красной горбатовской - 8 (АА, АВ, ВВ, АЕ. BE, ЕЕ,' BF,.
:.;-"",!.'! ВС) и'швйцкой пород- 7 (АА,'А8, ВВ, 0F, ВС. AC,'AG).'Наименьшим генетическим»
;Ч *7 ' разнообразием (по три генотипа) характеризовались коровы черно-пестрой :(АА, АВ,
,•'->;/АЕ) И якутской пород ( А А , А В , В В ) . 1 } , 1 . ^ ; Ч ; , ; Л ; ^ . Д 1 ; л -:;>"?. ;~у^У?:';~/у:':у.;--'У
^J: г'': У. коров швицкой породы, молочного типа выявлена тенденция, указывающая на.;
У.„';."""*. связь;генотипа ВВ с-исследованными параметрами•• молочной' продуктивности:Г
' .;"1^удсем (ВВ>АА,х + 10в5кгч, Р=0,9Б),-..молочным'жиром' (ВВ>АА,+42,1кг,.Р=0,95),;-:
' " ; Г,,Гпроцентным содержанием жира (ВВ >АВ, +0,07%, Р=0,Э5) и белка (ВВ>АВ„+0,04%.;
•'.'.;;. * - •; р=о,99 : и ,;-• ВВ>АА, +0,07%,: Р=0,99).** Наблюдается ".тенденция положительного \
:' "У ".влияния аллеля Е и отрицательного влияния аллелей G и F гена каппа-казеина на ".
• -"• в... Установлено,•';что частоты ,'встречаемости"ь аллелей !*и": генотипов i'rena\ r бета- '•
: v .';»' лактоглобулина' являются породосяецифичнымИ. Й^ трех ^исследованных. породах _'-•,
-'•'•£ " (красная горбатовская, шеицкая.черно-лестрая) было выявлено три а л л е л я - А , В,'-;
•:":?; "'•••С, с частотой встречаемости редкого аллеля Сот 0,4 (красная горбатовская порода) *;
'':.'.•>"до,'6,25% (молочный '„тип.;швицкой;породы)./ Редкий аллель D"у исследованных
;-^;'-Лживотных'отсутств'овал.'Ч::^;»г::';:г~,:? У У У ?<-:.'•'ГУУ'<УХУ'.У"УУУ
/ -v.'*''."-.si
:
:'"}'я": Выявлены достоверные различила проявлении генетических вариантов гена бета-;,"-.
. " ; . лактогпобупина у коров красной горбатовской породы Установлена"превосходство,.i
""-Г;*., животных с генотипом-АА над животными с генотипами АВ и ВВ по содержанию.;,
'У/.i « ж и р а в молоке (соответственно, +0,13%, Р=0,999 и + 0,09%, Р«0,85). \}^ -,. ;,,'"• • / v ;
* £V : ^, ПРАКТИЧЕСКИ^^
' - ' "Лабораториям, занимающимся ДНК-диагностикой, \ для повышения достоверности,- ;\'
.-.. анализа г генов . каппа-казеинаV. и > бета-лактоглобулина •"•. крупного ; рогатого : скота, < *'
*. ••? рекомендуем'; использовать •••" предложенные,• в '., данной '-диссертационной работе, .л
V;"" методики; >\ .;'''*• >»'» 'y:--»jy.L'\.У,.:уУ:У:Уу,•
^:У-,^К <У'-1:-У' УУ--^:,1УУ'--У -1/У
УУУ
ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ :)уу ?' у--УУ^ ; ^ Я ^ ; Ш . ; ^ 1 ' ^ ^ v - ^ ^ l ^ ^ ' ; . "".•'•"'
"•;"•: 1. Гладырь Е А , Зиновьева H.A.f Марзанов Н.С.;'Букаров Н.Г.ПЦР анализ вариантов: А
-•;.": .Г'каппа-казеина у:' крупного"'рогатого :скота:.--; // Материалы научно-практической •_У}
' ; >.;,- конференции ^«Повышениеч конкурентноспособности* животноводства и задачи v ^
'' .1... -, кадрового обеспечения»';- Быково.'• 2000. - с. 34-35. -у\ •>*•; j ; : . у У ~i's '*"''; У'"
' ;• '
; ; 2..*; Гладырь'EAv Зиновьева Н А , Марзанов Н.С.,'Брем Г. Использование генов б е т а - / ';
' v.:' лактогпобугнлна <л каппа-казеииа в качестве генетических маркеров д л я : крупного;.":.
У'у '••' рогатого " с к о т а : // Материалы - ,11,-'; Международной..'. научной •'••. конференции .-л ~'
• ^ ' : «Биотехнология'в растениеводстве,' животноводстве и ветеринарии».- Москва..'-1"": "•
У:••;• • ,ВНИИСХБ. -20Q0.-с.ев-88..:.«.У-:(-^.'• v -у* i*^УУУ<-_•';•'•:"^;..т;c-v<;'-;4"VУ'ч; 3. Гладырь ВЛ, \Зиновьева Н.А.,'Попов А.Н., Марзанов Н.С.*,' Эрнст. Л.К., • Брем Г." ,
.•".'•"> Методические .рекомендации по определению вариантов каппа-казеина-, и бета- •.: лактоглобулина крупного рогатого скота методом ПЦР-ПДРФ анализа // Дубровицы
-2001 - 1 5 с '
"
л
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
s?..
-:Зв«.«юа,тврлоо. «к».
Тип. ПШИ НПО "Луч?
г . П а д а ш ж М.О. ~
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
3
Размер файла
921 Кб
Теги
821
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа