close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

772

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
АКАДЕМИЯ
НАУК
СССР
Институт биологической
!Ш1
физики
На правах
рукописи
Л. X. Э И Д У С
ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА
ЛУЧЕВОЙ ИНАКТИВАЦИИ ФЕРМЕНТОВ
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
N
Москва
1Й64 Г.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
J .
/• / У Ь * ' / - ^ ~ ~ С
\УУУ
*—- '-' '-' ^
is\s-*~
.
О
r^
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
А К А Д Е М И Я НАУК С С С Р
Институт биологической
физики
На правах рукописи
Л. X. Э Й Д У С
ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА
ЛУЧЕВОЙ ИНАКТИВАЦИИ ФЕРМЕНТОВ
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Цитриьвач Н*учв1* (ntjfttTexa
Him: >a (.елиМ.
•>'<лзе»а
Л pit,мани «л 1
К»СК*В?2.-Л С?Д
tf *?J
№ 1V Js11
М о с к в а 1964 г
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа выполнена в Институте биологической физики
АН СССР.
Защита диссертации состоится
1964 г. на заседании Ученого Совета
Института биологической физики АН СССР.
Адрес: Москва, Профсоюзная ул., д. 7
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.
Автореферат разослан
1964 г.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Настоящая диссертация представляет собой изложение резуль­
татов исследования, проведенного автором в течение 1955—1963 гг.
в Институте биофизики АН СССР.
К началу пятидесятых годов в радиобиологии был уже накоплен
огромный фактический материал и установлен ряд общих законо­
мерностей действия излучений. Была исследована радиочувстви­
тельность самых различных объектов — от вирусов и бактерий до
высших млекопитающих, установлена зависимость поражающего
эффекта от физиологического состояния объекта, характера радиа­
ции, физических условий облучений, присутствия во время облуче­
ния кислорода и защитных веществ и др. Были сформулированы
теории «прямого» и «косвенного» действия радиации, объясняв­
шие большой круг радиобиологических явлений.
Гораздо слабее были изучены механизмы тех процессов, кото­
рые приводили к нарушению клеточных микроструктур и отдель­
ных макромолекул. В эти годы лишь начинается интенсивное изу­
чение процессов радиационной деструкции основных классов био­
логических макромолекул—йелков, нуклеиновых кислот, полиса­
харидов и др. Подвергаются экспериментальной проверке первые
гипотезы о механизме этой деструкции, раскрываются основные от­
личия в действии ионизирующей радиации и других инактивирующих и денатурирующих агентов, в первую очередь, тепла. Недоста­
точность сведений о строении биомакромолекул затрудняла вскры­
тие истинных механизмов первичных радиобиологических процессов.
Однако трудность состояла не только в этом, но и в самом подходе
к изучению данной проблемы, который господствовал в то время.
В большинстве работ, посвященных анализу «физической ста­
дии» лучевого поражения, рассмотрение обычно ограничивалось
процессами ионизации и возбуждения молекул, а также анализом
путей радиолиза воды и возможного влияния его продуктов. При
всей правильности этих физических представлений такой подход
обладал одним серьезным методологическим недостатком: в радио­
биологию лишь механически переносились известные уже из физи­
ки законы взаимодействия излучений с любыми веществами, рас­
сматривались лишь свойства самих ионизирующих излучений, но
2 Зак.
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
совершенно не учитывались особенности строения биологических
макромолекул.
Между тем биологические макромолекулы и микроструктуры ор­
ганизованы особым образом и могут специфически реагировать на
различные внешние воздействия, в том числе на облучение.
Физический механизм взаимодействия' излучений с биологиче­
скими структурами имеет, грубо говоря, две стороны — поглощение
энергии и дальнейшее использование ее при окончательном по­
вреждении объекта. Рассматривавшиеся в радиобиологической ли­
тературе процессы ионизации и возбуждения отражали лишь одну
из этих сторон, равно справедливую при облучении простых систем
и сложных высокополимерных биологических структур. При этом
вся специфика лучевой реакции биологических объектов относи­
лась исключительно к последующим биологическим реакциям.
Между тем это не так, поскольку в биологических микроструктурах
физический механизм утилизации поглощенной энергии может
иметь характерные особенности, и это вызывает необходимость в
новом подходе к его расшифровке.
Основная задача настоящего исследования заключалась в изу­
чении особенностей первичного акта лучевого повреждения биоло*
гических макромолекул и экспериментальном обосновании пред­
ставлений о двухэтапности механизма лучевого поражения на фи­
зическом уровне размена энергии излучений.
В качестве объекта исследования действия радиации на макро­
молекулы были избраны белки.
Кроме общей значимости в нормальной жизнедеятельности и
лучевой патологии клетки, белки для решения нашей задачи имели
еще ряд преимуществ перед другими макромолекулами. Они могуг
быть получены в виде чистых, индивидуальных, а порой и кристал­
лических «препаратов с достаточно строго воспроизводимыми свой­
ствами. Хорошо разработанные методы определения биологической
активности различных белков позволяют произвести строгие коли­
чественные оценки изменения их свойств в тех или иных условиях
эксперимента. То же относится и к радиобиологическому аспекту,
поскольку у белков имеется ряд критериев поражения, характери­
зующих изменения, происходящие независимо в отдельной моле­
куле и потому проявляющиеся даже в сильно разбавленных
растворах.
Радиационное поражение белков, в свою очередь, многосторон­
не и может характеризоваться различными критериями.
При биологически значимых дозах воздействия вероятность
многократных «попаданий» в одну и ту же макромолекулу в клет­
ке ничтожна. Поэтому наибольший интерес представляют измене­
ния, происходящие при первом «попадании». В связи с этим в ка­
честве критерия нативности белка была взята ферментативная ак­
тивность, как наиболее важное свойство, претерпевающее измене­
ние обычно уже при однократном «попадании», когда уловить мно­
гие другие изменения белка еще практически невозможно.
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Поскольку нас интересовала общая закономерность лучевой ре­
акции белковых молекул, а не особенность какого-либо определен­
ного фермента, играющего особую роль в лучевом поражении клет­
ки, мы в качестве конкретных объектов взяли 2 белка — миозин и
пепсин—, резко различающиеся по своей величине, строению и
функциям. Общность результатов, полученных с этими двумя'фер­
ментами, свидетельствует о справедливости обнаруженных законо­
мерностей для достаточно широкого круга белковых молекул;
Помимо радиобиологического, настоящее исследование имеет
еще и чисто биофизический аспект. Проведенное в работе сопо­
ставление действия на белковые молекулы ионизирующих излуче­
ний, тепла, фотодинамического действия видимого света и других
агентов углубляет наши представления о механизме влияния этих
факторов, с одной стороны, и дает новые данные об энергетических
состояниях и путях миграции энергии по белковым молекулам,
с другой.
Диссертация состоит из введения и двух частей, 'включающих в
себя 14 глав. Она содержит 341 стр. печатного текста, 70 рисунков,
22 таблицы. Цитировано 97 работ отечественных и 250 работ иностраннных авторов.
В общем введении к диссертации формулируется ее задача и да­
ется обоснование выбора конкретного объекта исследования.
В первой части диссертации описывается явление радиационно­
го последействия и определяются основные его количественные ха­
рактеристики (главы 2—4).
При облучении водных растворов миозина (в 0,5 М КС1) или
пепсина (в ацетатном буфере) у — лучами Со60 в аэробных усло­
виях инактивация описывается экспоненциальной зависимостью
с показателем, зависящим от концентрации белка. В интервале
концентрации обоих ферментов от 0,1 до 1,0 мг/мл наблюдается
«эффект разведения», иными словами, абсолютный выход инактивируемых молекул не зависит от концентрации белка. Таким обра­
зом, в этих условиях инактивация осуществляется в результате
косвенного действия радиации.
При облучении растворов миозина в анаэробных, условиях (по­
сле откачки растворенного в них воздуха) ферментативная актив­
ность не теряется, если облученный белок остается изолированным
от доступа кислорода и сама процедура проверки активности осу­
ществляется также анаэробно.
Несмотря на облучение, активность не теряется вплоть до таких
доз, которые вызывают поражение на 50—60% при облучении в
аэробных условиях.
Аналогичное явление обнаружено в отношении прямого дейст­
вия ионизирующей радиации. Сухой пепсин, облученный в анаэроб­
ных условиях, также не теряет своей активности, если результат
облучения проверяется в дальнейшем в анаэробных условиях.
С этой целью запаянные ампулы с сухим пепсином, облученным в
дозах, в 1,5 раза превышающих D37, вводились в специально скон2*
5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
струированную герметическую камеру, наполненную аргоном и
позволяющую манипулировать в бескислородных условиях: В этой
камере и проверялась активность облученного пепсина.
Таким образом, для инактивации ферментов как при «косвен­
ном», так и при «прямом» действии радиации одного лишь облуче­
ния недостаточно, а требуется совместное воздействие излучения и
кислорода. Кислород оказывается необходимым агентом, по край­
ней мере, для некоторых видов поражения.
При этом кислород может оказать поражающее действие, не
только присутствуя непосредственно во время облучения, но и по­
сле его окончания. Если к анаэробно облученному раствору миози­
на или раствора пепсина, облученного анаэробно в сухом виде,
подвести кислород — немедленно происходит инактивация белка,
причем в последнем случае точно такая же, как если бы пепсин
облучался на воздухе: дозовые кривые аэробного облучения и об­
лучения анаэробного с последующим допуском кислорода, совпа­
дают друг с другом.
В случае миозина пострадиационная инактивация кислородом
иесколько слабее, чем при аэробном облучении, так что некоторая
часть поражения требует присутствия кислорода во время самого
облучения. К причине этого различия мы вернемся позднее.
Обнаруженное в этих опытах явление радиационного последей­
ствия на молекулярном уровне доказывает образование при облу­
чении в белковых молекулах скрытых долгоживущих повреждений,
реализующихся в явное поражение лишь при дополнительном воз­
действии кислорода. Время этого воздействия может быть выбрано
достаточно произвольно и измеряется часами и сутками.
Таким образом, еще недавно широко распространенная в радио­
биологической литературе точка зрения об отсутствии постлучевого
действия кислорода неверна. Эта точка зрения базировалась на
экспериментах, в которых результаты облучения зависели лишь от
природы присутствующего в среде газа, но были одинаковыми при
введении после анаэробного облучения кислорода или азота. По­
добные опыты проводились с хромосомными аберрациями в клет­
ках традесканций (Джайлс и Рилей, 1950) и с бактериальной сус­
пензией (Говард — Фландерс и Моор, 1958), а вывод обычно рас­
пространялся на все радиобиологические явления.
Видимое отсутствие постлучевого влияния кислорода связано
с неучетом возможности образования долгоживущих активирован­
ных состоянии макромолекул, способных к взаимодействию с кисло­
родом.
Модифицирующее действие кислорода после облучения в ана­
эробных условиях может быть обнаружено лишь в том случае, если
сама 'проверка степени поражения объекта будет проводиться в
анаэробных условиях. В противном случае кислород, допущенный
к объекту во время этой процедуры, нанесет поражение, воздейст­
вуя на долгоживущие скрытые повреждения, и результаты облуче­
ния в анаэробных и аэробных условиях могут стать одинаковыми.
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
При поверхностном анализе будет 'сделан вывод об отсутствии
постлучевого влияния кислорода. В цитированных выше работах
именно это условие и не соблюдалось.
Недавно явление кислородного последействия было обнаружено
при 'инактивации рибонуклеазы. Авторы (Хант, Тилл, Вилиамс,
1962) вели исследование по той же схеме эксперимента, что и мы.
Таким образом, во всех случаях, когда методика экспериментов
была адекватна поставленной задаче и при этом предусматрива­
лась возможность существования долгоживущих скрытых повреж­
дений в белковой молекуле —кислородное последействие обнару­
живается, что подтверждает общность этого явления.
Наряду со скрытыми повреждениями, реализующимися под воз­
действием кислорода, в белковых молекулах при облучении возни­
кает и другой вид скрытых повреждений, к кислороду индиферентных. Реализация этих скрытых повреждений активируется теплом,
в связи с чем естественно ввеститермин «тепловое» последействие
в отличие от последействия «кислородного», рассмотренного выше.
Повышенная термочувствительность облученных объектов по
сравнению с инта'ктными отме'чалась ранее рядом исследователей,
но количественного анализа характеристик самой реакции тепло­
вого последействия не производилось.
В случае миозина и пепсина пострадиационное тепловое воздей­
ствие на облученные растворы также приводит \к дополнительному
повреждению, осуществляемому со скоростью, зависящей от темпе­
ратуры. Интервал температур, при котором эта скорость удобна
для измерений, различен у разных белков, но во всех случаях он
расположен лишь несколько ниже, чем для инактивации интактного фермента. Поэтому последний процесс в какой-то мере наклады­
вается на реакцию теплового последействия.
Экспериментальные кривые термоинактивации облученных бел­
ков, изображенные в полулогарифмическом масштабе, состоят из
двух участков: резкого спада, переходящего в наклонную прямую
линию (экспоненциальную зависимость).
В облученных растворах миозина показатель этой экспоненты
таков же, как и у интактного, необлученного белка, и он отражает
собой инактивацию части молекул, не затронутых облучением. До­
ля таких молекул (х) определяется экстраполяцией прямолинейно­
го участка кривой к оси ординат. Резкий же спад активности в на­
чале инкубации является результатом реакции теплового последей­
ствия, которой подвержен остальной белок (I — х), сохранивший
после облучения свою активность, но содержащий скрытые повреж­
дения. Эта часть белка более термочувствительна и инактивируется
с большей скоростью, чем неповрежденный белок, по некой зависи­
мости f(t, T). Общий закон термоинактивации белка, частично
инактивированного ранее облучением, может быть записан в виде:
[А % Т.)] = x.e-*'<T)-t
3-1936
+ (1
—X).f(t,
T),
где
ж,7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
константа скорости, характеризующей прямолинейный участок кри­
вой инактивации облученного белка при данной температуре (Т).
Отсюда определяется искомая функция f(t, T).
В растворах миозина к{(Т) = к(Т), где к(Т)—константа ско­
рости инактивации интактного фермента:
A(t,T)=A0.e-HT)t
В растворах пепсина эти величины различаются между собой в
результате образования в облученном растворе токсических про­
дуктов. Об этом свидетельствуют результаты опытов, в которых ско­
рость инактивации интактного пепсина (0,02 мг белка в мл) в об­
лученной воде (доза 70 кр) была больше, чем в обычной, но меньше,
чем в воде, ранее облученной в присутствии пепсина (0,02 мг/мл),
полностью инактивированного дозой 50 кр.
Применение этой процедуры расчета к анализу кривых термоин­
активации облученных ферментов — миозина и пепсина — показало
независимость величины х от температуры, при которой ведется ин­
кубация. Это подтверждает, что в реакции теплового последействия
мы имеем дело с реализацией скрытых повреждении, присутствую­
щих лишь в части молекул, сохранивших после облучения свою ак­
тивность. Доля этих молекул при заданной концентрации белка
определяется лишь дозой облучения, а не условиями пострадиацион­
ных воздействий.
Эта особенность теплового последействия позволяет ввести ве­
личину Г — «глубину» этой реакции, характеризующую собой долю
активности, теряемую при последействии (Г={А 0 ]-(1—х)).
«Глубина» последействия может быть определена при любой
температуре инкубации, поскольку она от нее не зависит. С темпе­
ратурой инкубации связана лишь скорость реакции поледействия.
Было установлено, что «глубина» последействия при облучении
растворов миозина или пепсина растет прямо пропорционально ве­
личине непосредственной инактивации «под лучом»: чем большая
доля активности теряется «под лучом», тем больше и скрытых по­
вреждений «теплового» типа в части фермента, оставшейся актив­
ною. Коэффициент пропорциональности в обоих случаях близок к
1 (исследовалась инактивация, не превышающая 70% от всей актив­
ности: х > 0 , 3 ) .
В растворах пепсина, предварительно облученного в сухом виде,
также наблюдается тепловое последействие, причем «глубина» его
практически та же, что и при облучении в растворе, если сопо­
ставление вести по степени непосредственной инактивации «под лу­
чом», а не по поглощенным дозам, разумеется, резко различным в
этих случаях. Таким образом, соотношение вероятностей образова­
ния скрытых повреждений «теплового» или «кислородного» типа не
зависит от того, растворен ли белок или облучается в сухом виде.
Другая характерная особенность реакции теплового последейст­
вия заключается в том, что функция r-f(t, T), описывающая темпе8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ратурно-временную зависимость этой реакции, представляет собой
экспоненту (по времени) с показателем, зависящим от температу­
ры.
'
Мономолекулярный характер реакции хорошо коррелирует с не­
зависимостью скорости и «глубины» теплового последействия от
концентрации белка (в интервале (0,63—4) мг/мл для миозина и
(0,02—1,0) мг/мл — для пепсина) и отсутствием влияния каприлата
натрия, обладающего антиаггрегационной способностью.
Аррениусова зависимость логарифма константы скорости реак­
ции теплового последействия от обратной величины абсолютной
температуры была определена для миозина в интервале температур
(8—33)°С и для пепсина в интервале (49—59)°С. Она изображает­
ся прямой линией. В этом интервале температур константа скорости
теплового последействия у миозина изменяется в 300 раз.
Соответствующее значение энергии активации составляет
АЕт.п. =>(39,5±3) ккал. моль -1 . Среднее значение энергии акти­
вации теплового последействия у пепсина практически совпадает с
этой величиной; (36±6) ккал. моль -1 и примерно одинаково при об­
лучении в растворе или сухом виде с последующей инкубацией в.
растворе. Энергия активации последействия не зависит от концент­
рации белка и дозы облучения (степени повреждения, «глубины»
последействия). Как показал анализ литературных данных, тепло­
вое последействие у других облученных ферментов характеризуется
теми же качественными особенностями, что и у исследованных нами:
объектов.
Последовательным воздействием кислорода и тепла на анаэроб­
но облученные растворы миозина была доказана независимость в
действии этих агентов. Тепловое последействие осуществляется в
равной степени до и после допуска кислорода к таким растворам.
Это означает, что «точки приложения» тепла и кислорода различны.
В одних и тех же молекулах фермента при облучении образуются
скрытые повреждения как «теплового» так и «кислородного» типа.
Каждый из этих агентов действует лишь на один из двух видов
скрытых повреждений.
Итак, суммирование результатов, изложенных в первой части
диссертации приводит, прежде всего, к выводу о том, что инактива­
ция ферментов под действием ионизирующих излучений как в
растворах, так и в сухом виде осуществляется в два этапа.
Оказывается, одного лишь действия радиации недостаточно для
инактивации белковой молекулы, а обычное представление о «мгно­
венности» физического этапа поражающего действия излучений не­
верно. Это относится лишь к первому этапу — образованию в белко­
вой молекуле «скрытого» повреждения, таящего в себе лишь по­
тенциальную возможность последующей инактивации. Радиация
оказывается неспособной вызвать такие нарушения в структуре
белковой молекулы (в ферментативном центре или третичной струк­
туре), которые сами по себе приводили бы к потере ферментатив3*
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ной активности. Для этого необходимо еще вмешательство допол­
нительных нерадиационных агентов на втором этапе процесса инак­
тивации.
.;. Независимо от конкретного физического механизма действия
этих агентов уже сейчас можно констатировать необходимость их
участия в первичном акте радиационного поражения. Это с отчетли­
востью вытекает из опытов, в которых инактивация отсутствует при
облучении ферментов в анаэробных условиях и на холоду.
Поражающее влияние кислорода и тепла осуществляется путем
их воздействия на облученные белковые молекулы, содержащие
скрытые повреждения. Последние бывают, по крайней мере двух
типов — «теплового» и «кислородного», различающихся тем, под
воздействием какого из этих агентов они реализуются.
Для изученных нами ферментов экспериментально доказано су­
ществование долгоживущих состояний обоих типов.
При облучении сухого пепсина все скрытые повреждения долгоживущие. В соответствии с результатами, приведенными в первой
части, у миозина такими повреждениями обусловлено, по крайней
мере, 3/4 всего радиационного эффекта. В последующих главах бу­
дет, однако, показано, что остальное поражение миозина обусловле­
но образованием короткоживущих скрытых повреждений «кисло­
родного» типа, а не участием кислорода в радиолизе воды.
В дальнейшем предстоит выяснить, в чем заключаются конкрет­
ные физические механизмы образования скрытых повреждений,
установить их природу, способ реализации на втором этапе инакти­
вации, возможность репарации их в промежутке между первым и
вторым этапами и другие вопросы. Некоторые подходы к решению
этих задач и результаты соответствующих исследований приведены
во второй части диссертации.
В настоящее время анализ механизма первичного повреждения
белковой молекулы ионизирующей радиацией немыслим без учета
совокупности данных, свидетельствующих о важной роли миграци­
онных ' процессов в этом явлении.
Необходимость привлечения представлений о миграции энергии
или заряда по белковой молекуле была ясно осознана много лет
тому назад, когда появились сведения о размерах «чувствительных
мишеней» при облучении различных ферментов в сухом виде. Было
показано, что во многих случаях объем мишени для одноударной
реакции инактивации ферментов близок к объему всей белковой мо­
лекулы, определенному иными, нерадиационными методами.
Поскольку поглощение ионизирующих лучей различными атома­
ми, входящими в.состав белковой молекулы, осуществляется прак­
тически одинаково и является чисто статистическим процессом, а
инактивация, по-видимому, связана с нарушением лишь определен­
ных выделенных связей или участков поверхности белковой моле­
кулы и уж-, во всяком случае, не в равной степени с любым атомом
молекулы — внутримолекулярный перенос энергии в акте инактива­
ции должен всегда иметь место.
.10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В 5-и главе' рассматриваются литературные данные, подтверж­
дающие наличие внутри- и межмолекулярной миграции энергии
(заряда) в белках.
О внутримолекулярной миграции энергии по белку свидетель­
ствуют данные о преимущественной локализации неспаренных элек­
тронов на цистине, результаты инактивации мономолекулярного
слоя ферментов электронами малой энергии, не способными проник­
нуть в глубь белковой молекулы, и ряд других фактов. Теоретичес­
кие представления развиты Блюменфельдом (1957) и др.
Помимо данных о миграции энергии внутри белковой молекулы,
в настоящее время имеется много доказательств существования
межмолекулярной миграции в системах из простых и сложных ор­
ганических молекул, включая белки и ферменты.
Если в биологических объектах осуществляется передача энер­
гии от одного компонента комплекса к другому, в радиационных
процессах это может проявляться двумя путями. Одним из них яв­
ляется увеличение эффективного сечения для радиационного пораг
жения при комплексообразовании. В этом случае энергия излуче­
ния, поглощенная одним из компонентов, переносится на другой
компонент, поражение которого изучается. Если же интересоваться
судьбой того компонента комплекса, который передает поглощен­
ную им энергию другому компоненту, то в отношении него будет
наблюдаться защитное действие.
'
На возможность существования подобного «миграционного» ме­
ханизма защиты было указано рядом авторов (Эндус, 1956; Элдъярн, Пил, 1956; Эренберг, Циммер, 1956; Горди, 1958).
Экспериментально обнаружены и усиливающий и защитный миг­
рационные механизмы при облучении как простых органических со­
единений, так и макромолекул.
Межмолекулярная миграция энергии (заряда) оказывает су­
щественное влияние на радиочувствительность белковых молекул.
Имеются многочисленные примеры усиления поражения, а также
защиты белковых молекул в растворах и сухом виде в результате
комплексообразования их с различными примесями органической и
неорганической природы.
Прямым доказательством межмолекулярной миграции заряда
служат опыты Горди с сотр., в которых сравнивались результаты,
полученные с облучением твердых растворов и механических сме­
сей белка с примесью. В первом случае концентрации определенных
примесей в несколько молей на моль белка было достаточно для
полного изменения сигнала белка. Во втором случае сигнал белка
сохранялся неизменным при гораздо большей концентрации приме­
си. Изменение сигнала ЭПР вызывалось, в основном, серусодержащими веществами. При добавлении к альбумину и пепсину цистеина
сигнал облученного препарата был тождественен с сигналом самого
цистеина, хотя в отсутствие белка он не наблюдался вовсе из-за ма­
лого количества вещества. Спектр ЭПР аминокислот и простых по­
липептидов от добавления цистеина не менялся.
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Все эти данные подтверждают способность образуемой в белке
электронной вакансии мигрировать на большие расстояния к сере
или иным ловушкам в боковых группах.
Миграция энергии по белковой молекуле к определенным
«слабым местам» структуры подтверждается данными химического
анализа результатов облучения различных белков. В главе 6 эти
даные
по литературным
материалам систематизированы в
двух аспектах: 1) изменения содержания различных аминокис­
лот при облучении и 2) разрыва определенного вида связей в акте
инактивации.
При действии ионизирующей радиации на растворы или сухие
препараты белков и ферментов в последних могут происходить раз­
личные химические и структурные превращения. Вероятно, при
очень большом числе «попаданий» в белковую молекулу можно до­
биться и сколь-угодно глубоких изменений ее химического состава.
Действительно, в литературе отмечались реакции лучевого дезаминирования и декарбоксилирования, окисления SH-групп и разруше­
ния ароматических'колец, разрыва пептидных связей и S — S-«MOCтиков», и другие химические изменения.
Наряду с этим было зафиксировано изменение ряда физикохимических показателей, в какой-то мере характеризующих нативность структуры белковой молекулы (изменение спектров поглоще­
ния в ультрафиолетовой и инфракрасной областях спектра, флюо­
ресценции в УФ и оптического вращения, снижение гидрофильности
белка и др.).
К сожалению, в подавляющем большинстве подобных исследова­
ний использовались массированные воздействия, по результатам
которых трудно судить о первичном акте, обусловленном одно-двух­
кратной ионизацией белковой молекулы. В нашу же задачу входило
изучение лучевых изменений в белке не при любых воздействиях,
а лишь при тех, которые могут иметь биологическое значение. По­
этому, анализируя химические и структурные изменения белковых
молекул, возникающие при облучении, мы принимали во внимание
лишь те, которые связаны с малоударной реакцией инактивации
белка.
В нескольких работах, в которых применялись дозы, сравнимые
с инактивирующими, наблюдались следующие общие закономер­
ности:
а) поражение отдельных аминокислот в белке осуществляется
не с равной вероятностью, а селективно; чаще других «слабыми
местами» являются цистин, гистидин и ароматические амино­
кислоты;
б) находясь в структуре белка, аминокислоты разрушаются сла­
бее, чем в гидролизате; таким образом, в белковой молекуле име­
ются какие-то компенсаторные механизмы.
Анализ литературных данных о повреждении химических свя•зей различного типа показал, что при инактивирующих дозах пеп12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
тидные связи не рвутся, дисульфидные же связи рвутся с большой
эффективностью, в ряде случаев сравнимой с единицей.
Из сопоставления всех этих факторов делается вывод о том,
что одним из «слабых мест» в белковой молекуле являются S—Sсвязи, 'скрепляющие третичную структуру белка. Разрыв этой связи
влечет за собой частичное развертывание молекулы с потерей той
конформации, которая обеспечивает специфическое строение фер­
ментативного центра.
Если, однако, скрытое повреждение локализовано в области
S — S-связи, разрыва ее на первом этапе инактивации не долж­
но происходить. Это подтверждается анализом данных ЭПР облу­
ченных белков. Возникновение «цистинового» сигнала ЭПР может
быть результатом образования нейтрального радикала RS • в ре­
зультате ( разрыва S — S-связи или же заряженного радикала
R' — S—S+> — R" — при сохранении этой связи.
В последние годы Горди (I960, 1961) отдавал предпочтение
первому варианту. Однако недавно в работах Каюшина и Пулатовой (Л 964) были получены убедительные доказательства локализа­
ции неспаренного электрона на дисульфидной связи.
Поскольку скрытые повреждения белковых молекул длительно
сохраняются даже в разбавленных водных растворах, необходимо
было удостовериться в том,' что и в этих условиях в белке можно
обнаружить долгоживущие неспаренные электроны.
Так как метод ЭПР не позволял производить измерения непо­
средственно в водном растворе, был использован следующий прием.
Белки с концентрацией (4—10) мг/мл. облучались в обычных усло­
виях, после чего растворы высушивались в вакуумэксикаторах, бел­
ковая пленка растиралась в порошок и затем уже подвергалась из­
мерению на радиоспектрометре. Обнаруженные сигналы ЭПР этих
препаратов облученного миозина и пепсина представляют собой
синглетные сигналы, с g-фактором, близким к тому, что у дифенилпикрилгидразина. Расстояние между точками максимального на­
клона для миозина составляло 14,5 гаусс, для пепсина — 17,5 гаусс.
В нескольких опытах облученные растворы ферментов перед вы­
сушиванием подвергались нагреву в таких условиях, когда реакция
теплового последействия успевает завершиться (миозин 24 час.
при 20°, пепсин — 6 час. при 54°).
После теплового воздействия растворы высушивались тем же
способом, и препараты измерялись на радиоспектрометре. После
.инкубации сигнал ЭПР уже отсутствовал. Эти результаты сами по
себе еще не говорят о причинной связи консервации неспаренных
электронов и скрытых повреждений. Однако ими показывается, что
длительная консервация неспаренных электронов в белковых моле­
кулах возможна и в водном растворе, а также что неспаренные
электроны регистрируются в молекулах, содержащих скрытые по­
вреждения, т. е. в ферментативно-активных молекулах, претерпев­
ших лишь первый этап инактивации.
13
«
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Следует заметить, что со скрытыми повреждениями связаны,
по-видимому, не все, а лишь часть неспаренных электронов, посколь­
ку существенное уменьшение сигнала ЭПР в некоторых случаях не
приводит к изменению биологической активности.
В главе 7 приводится независимое доказательство разрыва
S — S-связи на втором этапе инактивации при реализации скры­
тых повреждении «теплового» типа'. В качестве метода исследова­
ния структурно-химических изменении, происходящих в белке на
первом и втором этапах инактивации, здесь используется анализ
кинетических н термодинамических характеристик реакции тепло­
вого последействя.
. '
Как известно, применение теории «абсолютных скоростей реак­
ции» к процессу денатурации интактных белков позволило, в свое
время, сделать определенные заключения о числе и природе свя­
зей, нарушаемых при образовании «активированного комплекса»,
из которого белок уже самопроизвольно переходит в инактивированное состояние (Эйринг, Стирн, 1939; Стирн, 1949). Мы примени­
ли этот же метод анализа к реакции теплового последействия, так­
же приводящей к инактивации, но уже из иного начального состоя­
ния — состояния белка со скрытым повреждением. Это дало воз­
можность сделать определенное заключение о природе и числе свя­
зей, разрываемых на втором этапе инактивации — при реализации
скрытых «тепловых повреждений. Далее сделано естественное
предположение о том, что в обоих случаях состояние «активирован­
ного комплекса» одно и то же. В этом случае по разностному эф­
фекту инактивации интактных белков и белков со скрытым повреж­
дением можно судить о связях, нарушаемых на первом этапе луче­
вой инактивации — при образовании скрытых «тепловых» повреж­
дений. Для этой задачи потребовалось тщательное изучение кине­
тики термоинактивации интактных ферментов, обнаружившее ряд
новых общих закономерностей этого процесса, учет которых необ­
ходим для определения истинных значений кинетических и термо­
динамических характеристик инактивации. Анализу процесса термо­
инактивации интактных ферментов посвящена глава I диссертации,
дающая тот «фон», с которым в диссертации связаны все экспери­
менты с применением теплового воздействия.
Инактивация растворов миозина в интервале 6,5<рН<9,2 и
пепсина при рН<4,8 описывается экспоненциальной зависимостью
с показателем, зависящим от температуры и не зависящим от кон­
центрации белка и рН среды. Достаточно широкий диапазон ис­
пользованных температур: (12—37)°С у миозина, (48—66)°С
у пепсина — позволил исследовать аррениусову зависимость lgK =
=.F(_-)
при изменении константы скорости к термоинактивации
в 100 раз. В результате было обнаружено, что аррениусова зависи­
мость состоит из двух ветвей и претерпевает излом примерно в се­
редине указанных температурных интервалов. Значения констант
14
*t
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
скоростей термоинактивации миозина, приводимые другими авто­
рами, в общем, совпадают с полученными нами, однако они менее
точны и, в связи с меньшим диапазоном исследованных температур,
не позволили ранее обнаружить искривление аррениусовых кривых
термоинактивации ферментов.
В диссертации дается объяснение наблюдаемого искривления
аррениусовых кривых и излагается метод вычисления истинных
значений энергии активации процесса термоинактивации белков.
Объяснение заключается в следующем.
Существует несколько ферментативно-активных состояний мио­
зина и пепсина, различающихся своей термочувствителыюстыо.
Это легко обнаруживается при сдвиге рН вне интервалов, приве­
денных выше. В частности, у миозина при небольшом сдвиге рН
(на 0,2—0,3 единицы) в кислую или щелочную сторону от интерва­
ла (6,0—9,5) быстро образуется термочувствительная компонента,
доля которой растет по мере удаления от этого интервала. Если
сдвиг рН осуществляется на холоду, активность полностью сохра­
няется. Гетерогенность белка обнаруживается лишь при последую­
щем нагреве. Кривые термоинактивации в этом случае не экспонен­
циальны, а состоят из двух ветвей — быстрого спада активности
(термочувствительная компонента) и экспоненциального «хвоста»
с показателем экспоненты, таким же как в интервале рН (6,5—9,2),
где весь белок однороден и термостабилен.
Специальными опытами показана полная обратимость перехода
части белка нз термостабильного в термочувствительное состояние
при восстановлении прежних значении рН, если вся процедура осу­
ществляется до теплового воздействия. Если сдвиг рН от области
тер'мостаб'илыюсти незначителен, образование термочувствитель­
ной компоненты происходит тем медленнее, чем меньше сдвиг рН и
ниже температура. Таким образом, процесс образования термочув­
ствительной фракции идет и во время инкубации, что увеличивает
скорость инактивации белка даже в области его термоустойчиво­
сти. В результате кривые термоинактивации миозина при рН~6,0
и высоких температурах (~30°) имеют сложную форму с двойным
переломом в результате образования термочувствительной компо­
ненты в ходе самой инкубации.
Путем вычленения термочувствительной фракции (Б) и анали­
за кинетики ее инактивации были определены константы скоростей
(КБ) И энергия активации этого процесса. В интервале температур
(20—35)° С скорость инактивации этой компоненты примерно на
два порядка больше, чем в термостабилыюм состоянии. Энергия
активации Д Е + = (55±3) ккал. моль -1 , что значительно меньше, чем
в термостабилыюм состоянии (см. ниже). Резкое различие в скоро­
стях инактивации из термостабилыюго (М) и термочувствительно­
го состояний наряду с различием в 'энергиях активации приводит
к тому, что при низких температурах общая инактивация белка
определяется скоростью перехода из стабильного в чувствительное
состояние (М~~*Б), то-есть имеет место неравенство Км-^Км-б^
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
<^B6, Поэтому наклон нижней ветви аррениусовой кривой харак­
теризует энергию активации перехода из термостабилыюго в тер­
мочувствительное состояние, определяющий, в свою очередь, и
инактивацию всего белка в этом температурном интервале
(<20°С). Величина этой энергии автивации
ДЕ ^ Б = ( 4 2 ± |
± 3 ) ккал. моль -1 .
Экстраполяция аррениусовой прямой с интервала (20—12)° С
в интервал более высоких температур позволяет определить истин­
ное значение констант скоростей инактивации
термостабильного
миозина, пользуясь соотношением к"ст =к£ абл — км-.б
Полученное в результате значение энергии активации
инактива­
ИСТ
ции для
термостабильного
миозина
составляет
ДЕ^
=97
ккал.
моль -1 . Из сопоставления полученных независимым способом зна­
чений АЕ^, ДЕ)? и Д Е ^ Б следует, кстати, что состояние «активи­
рованного комплекса» для процесса термоинактивации миозина од­
но и то же, независимо от того, происходит ли инактивация из термостабильного состояния непосредственно или через стадию обра­
зования термочувствительного белка. Действительно, с хорошей
точностью выполняется равенство
+ ДЕ*
+ ~ДЕ^Б
(В какой-то мере это оправдывает наше предположение о том, что
инактивация облученных молекул со скрытыми повреждениями
проходит стадию образования того же«активированного коплекса».
Инактивация пепсина подчиняется тем же общим закономерно­
стям. Различие лишь о абсолютных значениях интервала рН, где
белок однороден и термостабилен, и констант скоростей при срав­
нимых температурах. При повышении рН выше 4,8—5,0 в белке на
холоду возникает термочувствительная компонента. В переходной
же области рН (4,5—4,8) скорость инактивации при инкубации си­
стематически возрастает с рН в связи с переходом части белка в
термочувствительное состояние. Истинное значение энергии актива­
ции термоинактивации пепсина также близко к 100 ккал. моль -1 .
В то же время даже в области максимальных из использовав­
шихся температур (—35° С +набл
— для миозина и —60° С — для пепсина)
наблюдаемые значения ДЕ
- значительно меньше и составляют,
по данным
разных авторов, в том числе и нашим, 60—70 ккал.
-1
моль . Таким образом, приводимые в литературе данные по акти­
вации денатурации белков требуют в каждом случае тщательного
анализа и, возможно, пересмотра.
Полученные истинные значения энтальпии и энтропии активации
процессов термоинактивации интактных белков и теплового радиа­
ционного последействия использовались для 'суждения о природе и
числе связей, нарушаемых на первом и втором этапах инактивации.
Предполагая, в свете представлений Эйринга и Стирна, что при
инактивации белков разрыву одной водородной
связи соответ­
ствует изменение энтальпии на 4 ккал. моль -1 и энтропии на
12 кал./град. моль, а разрыву S — S-связи — 24 и—0 соответствен16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
но, получаем, что при термоинактиващш исследованных нами ннтактных ферментов из термостабильного состояния рвется один
S — S-«MOCTIIK» и 17—18 водородных связей.
При тепловом последействии рвется также один S — S-«MOстик» и 3—4 водородных связи. Следовательно, на первом этапе —
при образовании скрытого повреждения — S:—S-связи не рвут­
ся, но происходит нарушение —13—15 водородных связей.
Физический процесс, который может привести к одновременно­
му разрыву нескольких водородных связей в облученной белковой
молекуле, был указан Платцманом и Франком (1958). Согласно их
представлениям, разрыв осуществляется в результате внезапной
поляризации среды при образовании электрического заряда вовре­
мя ионизации белковой молекулы.
Однако, как указывают сами авторы, одного лишь поляризаци­
онного эффекта недостаточно для разрыва необходимого для инак­
тивации числа водородных связей, даже если не учитывать разрыв
S — S-связи. Этот вывод в значительной мере обусловлен тем, что
при своем рассмотрении Платцман и Франк не учитывали мигра­
цию заряда к «слабым местам» структуры и оценивали вероятность
инактивации при произвольной локализации возникающего электри­
ческого заряда.
Таким образом, без учета миграции, процесс, рассмотренный
Платцманом и Франком, не может привести к лучевой инактивации
ферментов. Однако положение резко меняется, если учесть возмож­
ность миграции заряда по белку с локализацией неспаренных элек­
тронов в «узловых» местах структуры, ответственных за нативную
конфигурацию, например, на S — S-связи или в центре фермента­
тивной активности. В этом случае поляризация вторичных связей
происходит в окрестности этого участка, что может способствовать
облегчению дальнейшего разрушения.
Соображения о роли миграционных процессов в лучевой инакти­
вации, изложенные выше, дают поэтому возможность связать наши
данные о разрыве водородных связей на первом этапе инактивации
с поляризационным механизмом Платцмана и Франка. В случае
миозина и пепсина число водородных связей, нарушаемых на пер­
вом этапе инактивации, то-есть при образовании скрытого повреж­
дения в макромолекуле, хорошо согласуется с величиной, указан­
ной для поляризационного эффекта Платцманом и Франком.
Условием образования скрытых повреждений, таким образом,
является возникновение электронного «дефекта» в белковой молеку­
ле. Это может осуществляться разными способами. В главах 8 и 9
рассмотрены условия образования скрытых повреждений (первый
этап инактивации) при различных лучевых воздействиях: прямом и
косвенном действии ионизирующей радиации, при облучении УФ и
фотодинамическом эффекте (Ф. Д. Э.) —сенсибилизированной кра­
сителем инактивации ферментов видимым светом.
(
Во всех этих случаях в облученных растворах наблюдалось яв­
ление теплового ппглеяейстпня,_
I Пгзтриъи» RjTictn Ьч»ля»т?ки
jK»n»stx<:.ta 7 a Чеявяа (.«лш.».
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
При Ф. Д. Э. эта реакция по всем исследовавшимся параметрам
совпадала с последействием при ионизирующем облучении. Сов­
падают константы скоростей при равных температурах, значения
энергии активации, а также коэффициенты пропорциональности в
корреляционной зависимости «глубины» последействия от степени
поражения «под лучом». Последнее означает, что независимо от
способа воздействия (ионизация, взаимодействие с возбужденной
молекулой красителя — при Ф. Д. Э.) соотношение между скрыты­
ми повреждениями «кислородного» и «теплового» типов сохраняет­
ся неизменным, и оно обусловлено строением самой молекулы фер­
мента.
Судя по характеристикам теплового последействия у растворов
миозина и пепсина, облученных УФ при Я = 254 и 280 ммк, соответ­
ствующие скрытые повреждения, по-видимому, также близки или
тождественны с теми, что при у-облучении.
«Кислородное» последействие в растворах миозина, анаэробно
освещенных видимым светом в присутствии метиленовои сини
2-10 - 5 М ) , осуществляется так же, как при у-облучении. Различие
между степенью аэробного облучения и «кислородным» последей­
ствием одинаково в обоих случаях. Это свидетельствует в пользу то­
го, что и при у-облучении указанное различие обусловлено не обра­
зованием радикала НСЬ при аэробном радиолизе воды, а возникно­
вением в белке корогкоживущих скрытых повреждений.
При всех перечисленннных воздействиях при облучении раство­
ров в белке возникают и длительно консервируются неспаренные
электроны. При Ф. Д. Э. сигналы Э П Р были тождественны с теми,
что возникали в этих же белках при у-облучении.
Таким образом, общим во всех случаях является создание элект­
ронного «дефекта» в белковой молекуле в результате ионизации
(прямое действие у-лучеи), внутримолекулярного разделения заря­
дов (УФ) или отнятия электрона (косвенное действие у-лучен,
Ф. Д. Э.).
Был определен ионный выход инактивации миозина и пепсина
при косвенном действии с учетом образования скрытых поврежде­
ний «теплового» типа. Показано, что «водные» радикалы инактивируют оба фермента с эффективностью, превышающей (10—15)%,
то-есть значительно сильнее, чем это принять считать.
Меньшая, чем единица, эффективность косвенного действия, псвидимому,' связана с ограниченностью доли тех участков поверхно­
сти белковой молекулы, с которых осуществляется внутримолеку­
лярная миграция заряда.
В диссертации дается обоснование тому, что при облучении бел­
ка в водном растворе поражающим действием обладают не только
радикалы, образующиеся в результате радиолиза воды, но и ради­
калы некоторых низкомолекулярных примесей, возникающие при
облучении. В частности, такими примесями являются молекулы аце­
татного или фосфатного буферов и некоторых других веществ. К
такому выводу приводит анализ явления «обратного» кислородного
18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
эффекта (О. К. Э.) в растворах пепсина, обнаруженного экспери­
ментально.
В радиобиологической литературе имеется несколько исследова­
ний, авторы которых наблюдали О. К. Э., то-есть защитную роль
кислорода, присутствующего в облучаемой среде (Альпер, 1952;
1954; Елоу, 1959; Батлер, 1960; Шалек, 1962, и др.), Альпер объяс­
нила О. К. Э. особенностью бактериофага, поражаемого, якобы, в
отличие от других объектов, не окислительными (ОН-), а восстано­
вительными (Н-) радикалами. Батлер приписал О. К. Э. малой эф­
фективности радикала НОг-, стабильность которого меняется с изме­
нением рН. Это объяснение касается лишь частных условий данных
экспериментов. х
.
' ~
Нами был обнаружен О. К. Э. при облучении буферных раство­
ров пепсина и установлено две закономерности: 1) О. К. Э. исчезает
в чистой воде, подкисленной соляной кислотой до того же рН (4,5),
что и в буфере, 2) величина О. К. Э. резко зависит от концентрации
белка в растворе, уменьшаясь при увеличении ее до (1 —10) мг/мл.
Помимо буфера О. К. Э. возникал при введении в раствор и не­
которых других примесей: р-аланина, нембутала, аминоэтилизотиурония. Анализ литературных данных показал, что и в большинстве
других случаев, наряду с белком,' в растворе заведомо имелись мо­
лекулы буфера или иных низкомолекулярных примесей.
На основании анализа полученных результатов и литературных
данных было выдвинуто следующее общее объяснение причин, вы­
зывающих О.К.Э. (Эйдус, 1963).
В отсутствие примеси радикалы, образующиеся в результате
радиолиза воды («водные» радикалы), атакуют белковые молекулы
и вызывают их повреждение. В присутствии примесей часть «вод-,
ных» радикалов сталкивается с ними и создает при этом радикалы
самой примеси. Последние, в свою очередь, способны взаимодейст­
вовать с белком, повреждая его. Растворенный кислород, взаимо­
действуя с радикалами примеси, дезактивируют их, оказывая тем
самым защитное действие. Скорости диффузии «водных» радикалов
и растворенного молекулярного кислорода, по-видимому, близки
друг к другу. Передача же эстафеты от «водного» радикала к ради­
калам примеси сопровождается резким замедлением скорости диф­
фузии поражающего агента и увеличением вероятности его столк­
новения с растворенными молекулами кислорода. Это и обуславли­
вает О.К.Э.
В диссертации рассмотрены условия, при которых может воз­
никнуть «обратный» кислородный эффект, величина которого за­
висит от соотношения концентраций белка, примеси и растворенно­
го кислорода, от природы, размеров и скорости диффузии примес­
ных радикалов, и т. д.
Наиболее критична величина «обратного» кислородного эф­
фекта к изменению концентрации белка в определенном интервале
19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ее значений. Приближенный количественный расчет подтвердил
возможность возникновения О. К. Э. в конкретных условиях наших
экспериментов.
,
В случае правильности этого объяснения О. К. Э., из него сле­
дует важный вывод о том, что радикалы ряда примесей способны
поражать белок, подобно «водным» радикалам ОН: Тогда в мо­
дельных экспериментах с растворами белка в присутствии различ­
ных примесей можно оценить эффективность поражающего дейст­
вия их радикалов. Так, при облучении пепсина в ацетатном буфере
радикалы примеси поражают белок столь же эффективно, как
«водные» радикалы, о чем свидетельствует совпадение дозовых
кривых инактивации пепсина без примеси и с примесью, но в ана­
эробных условиях. В присутствии же АЭТ или нембутала пораже­
ние даже в анаэробных условиях меньше, чем без примеси, что свя­
зано, по-видимому, с наличием стереохимических препятствий
при воздействии радикалов этих соединений на белковые молекулы.
Глава 10 посвящена вопросам репарации повреждений, возни­
кающих в белковой молекуле в результате облучения. Частично
этот вопрос рассматривался выше при доказательстве внутримоле­
кулярной репарации электронной вакансии, возникающей в белке.
Источниками репарации с одновременным образованием скрытых
«тепловых» повреждений являлись в этом случае S — S — связи
цнстина.
В данном разделе выявляется еще один вид внутримолекуляр­
ных доноров электронов, участвующих в «залечивании» возникаю­
щих вакансий. С этой целью произведен анализ и сопоставление
различных собственных и литературных данных об особенностях
инактивации так называемых «SH — ферментов», т. е. "ферментов,
в состав активного центра которых входит сульфгидрильная груп­
па. К числу таких ферментов относится и миозин — один из наших
объектов. Ранее Барроном с сотр. (1949, 1954) и Танака с сотр.
(1960) была обнаружена возможность пострадиационной реакти­
вации частично, инактивнрованных растворов SH — ферментов
введением цистеина или восстановленного глютатиона. С ростом
поражения степень реактивации уменьшалась, что означает су­
ществование двух видов аэробного повреждения: обратимого'и не­
обратимого (в отношении введения тиолов). Воспользовавшись
данными этих авторов, мы восстановили дозовые зависимости ин­
активации трех SH — ферментов (в том числе миозина), как они
выглядели бы после репарации тиолами. Оказалось, что во всех
случаях дозовые кривые с достаточно хорошей точностью отобра­
жают двухударную кривую инактивации. Соответствующая кривая
одиночных попаданий (в полулогарифмическом масштабе это —
прямая, параллельная наклону «хвоста» двухударной кривой) ха­
рактеризуется большим наклоном, чем дозовая кривая до репара­
ции. Однако, она совпадает с дозовой кривой, построенной с уче­
том скрытых повреждений «теплового» типа после их реализации.
.20
-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таким образом, все поражение SH — ферментов слагается из
трех частей: 1) скрытых повреждений «теплового» типа, 2) репарируемых и 3) нерепарнруемых явных повреждений.
Поскольку частичная постлучевая репарируемость наблюдалась
только у SH — ферментов и репарация осуществлялась только
SH — соединениями, естественно предположить, что инактивация
в этом случае вызвана поражением SH — группы, входящей в фер­
ментативный центр.
Поскольку это поражение происходит с большой вероятностью
при первом попадании в произвольное место белковой молекулы,
отсюда следует, что эта SH — группа, так же как дисульфидные
группы, обладает способностью компенсировать электронные ва­
кансии, возникающие при облучении. Этим и вызывается преиму­
щественное поражение SH — групп ферментативного центра SH —
ферментов (в отличие от представлений Баррона и др. о селектив­
ной атакуемостн SH — групп «водными» радикалами).
Повреждение, возникающее при втором «попадании», уже нерепарируемо тнолами. Поскольку, как говорилось выше, в отсут­
ствие кислорода инактивации вообще не наблюдается, при вторич­
ном попадании образуется скрытое долгоживущее повреждение
«кислородного» типа. Репарируемое же поражение, обусловленное
повреждением SH — групп ферментативного центра, осуществляет­
ся только в присутствии кислорода во время облучения. Это следует
из данных Пасынского и Павловской (1960), показавших отсутст­
вие кислородного последействия в отношении окисления белковых
SH — групп.
Отмеченное в начале реферата различие в степени аэробной ин­
активации миозина и величиной «кислородного» последействия
обусловлено, таким образом, повреждением SH — групп фермента­
тивных центров. Это и есть «короткоживущая» часть кислородозависнмого поражения. Дополнительное доказательство этого
утверждения получено в опытах с постлучевой реактивацией облу­
ченного миозина. Реактивация осуществлялась введением в комп­
лекс с облученным миозином интактного актина. Она возрастала
по мере увеличения степени комплексообразования, регистрируе­
мой по относительной вязкости раствора. Максимальная степень
реактивации совпадала с долей «короткоживущих» скрытых по­
вреждений «кислородного» типа.
Итак, анализ лучевой инактивации SH — ферментов приводит
к заключению об особой лабильности электронов химической груп­
пировки, входящей в ферментативный центр. Одновременно пока­
зано, что «слабыми местами», к которым мигрирует повреждение,
являются как S — S — «мостики», скрепляющие третичную струк­
туру белка, так и сам ферментативный центр.
В главе 10 рассматривается также вопрос о репарируемостн
скрытых долгоживущих повреждений. С этой целью анализируют­
ся причины возникновения «прямого» кислородного эффекта п
растворах ферментов, суспензиях бактериофагов и других системах.
21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В последнее время в радиобиологии развивается гипотеза, связы­
вающая кислородный эффект с репарацией скрытых повреждений
макромолекул
(Говард-Фландерс, 1960; Хатчинсон, 1960; 1961;
Александер, 1962).Она заключается в том, что кислородный эффект
при действии ионизирующей радиации (in vitro и in vivo) обуслов­
лен конкуренцией кислорода и сульфгидрильных протекторов — до­
норов водорода — за скрытые повреждения, возникающие в биоло­
гических макромолекулах. В отсутствие кислорода скрытые по­
вреждения репарируются, в отсутствие протекторов — кислород их
реализует. Это объяснение противоречит наблюдаемой в экспери­
менте резкой зависимости величины кислородного эффекта от кон­
центрации фермента в растворе при постоянной концентрации
примеси и кислорода.
В случае справедливости указанной гипотезы, величина кисло­
родного эффекта не должна зависеть от концентрации белка, пос­
кольку эффект обусловлен конкуренцией кислорода и примеси.
полностью определяемой лишь соотношением коЕщентраций этих
агентов, по условию неизменным. В действительности же, по собст­
венным данным Хатчинсона (1961), величина кислородного эффек­
та при инактивации трипсина в присутствии 1мМ глютатиона изме­
няется от 4,25 до 1,47 при увеличении концентрации белка от 3
до 37 мкМ.
В диссертации рассматривается иное объяснение путей участия
кислорода в лучевом эффекте, также основанное на репарируемости скрытых повреждений, но лишенное недостатков первой гипоте­
зы. Согласно этому объяснению, «прямой» кислородный эффект
обусловлен дезактивацией кислородом примесных радикалов, спо­
собных репарировать скрытые повреждения макромолекул. В от­
личие от первой гипотезы, здесь репарация осуществляется не са­
мими молекулами примеси, а их радикалами, возникающими при
радиолизе; усиление поражения обусловлено взаимодействием
кислорода и этих «репарирующих» радикалов, в то время как в
первой гипотезе молекулы примеси с кислородом непосредственно
не взаимодействуют.
Эффективность репарирующего действия примесных радикалов
обусловлена, по-видимому, их способностью при взаимодействии
с белковыми молекулами обеспечивать сильное перекрытие элек­
тронных облаков, достаточное для передачи электрона от примеси
к белку.
Как и в случае «обратного» кислородного эффекта, «прямой»
кислородный эффект может проявиться лишь в определенном ин­
тервале концентраций белка, примеси и кислорода. Количествен­
ный расчет изменения величины кислородного эффекта с концент­
рацией белка, проведенный для конкретных условий цитировавших­
ся опытов с трипсином, подтвердил правильность предлагаемого
механизма. Тем самым подтверждается н возможность репарации
скрытых долгоживущих повреждений макромолекул. В качестве
«репарирующих» радикалов могут фигурировать продукты облуче22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
пня не только сульфгидрильных веществ (цистёина, глютатиона),
но и других примесей. В частности, в растворах пепсина, в которых
без примеси отсутствует «прямой»-2кислородный эффект, последний •
появлялся
при добавлении 1,4-Ю М метабисульфита натрия или
3-Ю-4 М цистамина. Этим подтверждается, что «знак» кислородного
эффекта зависит лишь от природы примеси и продуктов ее радиолиза, а не от белка. Как при «прямом», так и при «обратном» эф­
фекте кислород воздействует, дезактивируя примесные радикалы,
которые, в зависимости от вещества, могут быть «поражающими»
или «репарирующими».
Защитный эффект от введения примеси будет вызван в этих слу­
чаях совершенно различными причинами: уменьшением эффектив­
ности поражения примесными радикалами по сравнению с радика­
лами ОН; дезактивацией «поражающих» примесных • радикалов
кислородом, увеличением числа «репарирующих» примесных ради­
калов, и т. д. .(Эйдус, 1964).
••; •'
Рассматриваемый механизм возникновения кислородного эф­
фекта, основанный на взаимодействии кислорода с примесными ра­
дикалами, если его распространить и на живые клетки, позволяет
объяснить ряд радиобиологических закономерностей, имеющих бощий характер, в том числе те, которые не находят пока своего объ­
яснения. В свою очередь, такая возможность подтверждает пра­
вильность самого механизма. Одной из этих закономерностей яв­
ляется отсутствие кислородного эффекта и неэффективность хими­
ческих протекторов при действии сильнононизующих излучений.
Причина этого заключается в том, что при облучении сильноионизующими частицами взаимодействуют с макромолекулами; да­
же в присутствии примесей, раньше всего не примесные радикалы,
а «водные». Это обусловлено резким различием в скоростях их
диффузии и большой локальной плотностью последних в треках
частиц, что обеспечивает кратное «попадание» «водных» радикалов
до подхода примесных. Естественно, что защитный эффект примет
си, связан ли он с репарацией или с уменьшением числа поражаю­
щих примесных радикалов не может в этих условиях иметь места.
Результаты этого и предыдущих разделов, относящихся к уча­
стию кислорода в лучевом эффекте, рассматриваются также в гла­
ве 12, посвященной анализу существующих <в. радиобиологии пред­
ставлений о механизме поражающего действия t кислорода. Эта
проблема рассматривается в двух аспектах: а) «точки приложения»
кислорода в лучевом эффекте, б) способы, которым кислород ока­
зывает свое воздействие.
,
Анализ существующих представлений о «точках приложения»
кислорода в лучевом эффекте приводит к выводу о том, что моди­
фицирующее влияние кислорода связано с его воздействием на валентноненасыщенные образования: «водные» или примесные ради­
калы или же макромолекулы со скрытными повреждениями, одним
из признаков которых является длительная консервация неспарен23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ных электронов. Физические механизмы, которыми кислород ока­
зывает свое воздействие еще недостаточно ясны.
Аналогия в действии кислорода и окиси азота на лучевой эф­
фект, спектры ЭПР и тушение флюоресценции свидетельствует о
том,.что влияние кислорода обусловлено парамагнетизмом молекул
этих газов, представляющих собой радикалы в основном, невоз­
бужденном состоянии. Это, в свою очередь, коррелирует с тем, что
они взаимодействуют лишь с радикальными состояниями молекул.
В главе 11 рассматриваются условия, необходимые для реализа­
ции скрытых лучевых повреждений (второй этап инактивации),
а также факторы, препятствующие ей.
Как тепловое, так и кислородное последействие не осуществля­
ется в отсутствие воды. Экспериментально6 это показано на примере
пепсина. Облученный в дозах (5—11) • 10 р сухой пепсин, подверг­
нутый термическому воздействию при температурах (100—140)°С,
инактивируется по той же экспоненциальной зависимости, что и без
облучения, не обнаруживая никаких признаков радиационного по­
вреждения. Инкубация этого же препарата после растворения в
воде (до или после нагрева в сухом виде) выявляет скрытые по­
вреждения «теплового» типа с той же «глубиной» последействия,
что и при облучении в растворе до равной степени поражения.
Специфичность воды как растворителя следует из опытов, в кото­
рых инкубация пепсина, облученного в сухом виде, велась в раство­
ре безводного глицерина.
Интактныи пепсин термоинактивируется в растворе глицерина
достаточно быстро уже при температурах (27—39)° С. Реакция ха­
рактеризуется активациоинымбарьеромДЕ*= (38±2) ккал.моль -1 .
Облученный пепсин инактивируется с теми же скоростями, не об­
наруживая скрытых радиационных повреждений. Однако после
разбавления глицеринового раствора водой реакция теплового по­
следействия идет с обычной интенсивностью и «глубиной».
Необходимость воды для реализации «кислородного» пораже­
ния следует из опытов с облучением сухого пепсина в вакууме или
даже на воздухе при условии достаточной сухости последнего.
В этих случаях Инактивации не происходит, несмотря на присутст­
вие кислорода во время или после облучения, если проверка ак­
тивности в дальнейшем производится в анаэробных условиях. И
лишь при введении кислорода в водный раствор белка, облученного
ранее в сухом виде, осуществляется кислородное последействие.
Таким образом, присутствие воды является необходимым усло­
вием реализации долгоживущнх скрытых повреждений. В то же
время эта реализация может быть предотвращена даже в водной
среде путем введения в 'раствор достаточного количества различ­
ных низкомолекулярных примесей.
Инкубация миозина в присутствии АТФ с концентрацией, пре­
вышающей 0,1%, не приводит к термоинактивации как контроль­
ного, так и облученного белка, который сохраняет активность, не­
смотря на повышенную температуру раствора. Это не означает, од24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нако, устранения скрытых повреждений, которые в полной мере
проявляются при удалении примеси (путем переосаждения раство­
ра миозина со снижением концентрации АТФ в ft) раз).
Аналогичная картина наблюдается при введении в раствор об­
лученного миозина другого (интактного) белка — актина, находя­
щегося в фибриллярной форме и образующего комплекс с миози­
ном. Инкубация растворов миозина и актина в этих опытах прово­
дилась при разных температурах (14°, 31° и 37°), что позволило
установить зависимость защитного эффекта от длительности выяв­
ления скрытых повреждений. По мере снижения температуры и
увеличения длительности инкубации (до 48 час, при 14° С) защита
от реализации скрытых повреждений ослабевала, и все большая их
доля выявлялась при инкубации.
На основании этих данных выдвинуто предположение, что на­
блюдаемый защитный эффект обусловлен адсорбцией примесных
молекул на белке, препятствующей при достаточной концентрации
примеси частичному развертыванию молекул на втором этапе инак­
тивации. Подобная «блокировка» белковых молекул носит динами­
ческий характер, а временная разблокировка в результате тепло­
вого движения позволяет инактивирующим агентам-?-теплу и'кис­
лороду— осуществить второй этап инактивации.
Блокировка от инактивирующего влияния кислорода показанана примере примесей самой различной природы: аминоэтилизотнурония, нембутала натрия, метабисульфита натрия, р — аланина,
циетамина. Методом исследования служил анализ формы дозовых
кривых в присутствии различных концентраций примесей. При до­
статочной концентрации любой из этих примесей (Ю-3—10~2М)
дозовые кривые претерпевают излом, переходящий в почти гори­
зонтальный участок, означающий отсутствие инактивации, несмот­
ря на продолжающееся облучение. Доля защищенных от аэробной
инактивации молекул возрастала с ростом концентрации
примеси
;
и с увеличением мощности дозы.
Проведенный анализ и контрольные опыты показали, что при­
меси не предохраняют от создания скрытых повреждений в белко­
вых молекулах, а лишь препятствуют их реализации. При облуче­
нии миозина в анаэробных условиях без протектора, вводимого за­
тем анаэробно после облучения, защита осуществлялась в той же
мере. По мере же хранения этих растворов после облучения проис­
ходило постепенное осуществление кислородного последействия,
по-видимому, в результате временной разблокировки белковых мо­
лекул с долгоживущими повреждениями «кислородного» типа.
В главе 14 дается описание всех используемых в работе методик
эксперимента (получение ферментов, определение аденозннтрифосфатазной активности миозина и протеолнтической активности пепг
сина, условия облучений и. дозиметрии и-др.). , • v j •..,• ••
25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
.ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Из сопоставления и анализа результатов, приведенных в диссер­
тации, двухэтапный процесс лучевой инактивации ферментов пред­
ставляется следующим образом (глава 13).
' Н а первом этапе инактивации происходит перераспределение
электронного заряда в белковой молекуле с образованием и лока­
лизацией электронной вакансии. При прямом действии излучений
это происходит в результате ионизации белковой молекулы и вы­
бивания из нее одного' из электронов, либо путем межмолекулярной
миграции заряда к ионизованной примеси, находящейся в комплек­
се с белком. При косвенном действии это осуществляется путем
отнятия электрона радикалом ОН- или радикалом примеси, создан­
ным при радиолизе последней.
. В результате миграции заряда по белковой молекуле электрон­
ная вакансия оказывается локализованной в определенных местах,
специфичных для структуры молекул данного фермента. Одним из
мест локализации электронной вакансии у многих белков являются
атомы серы в S — S-связи, поставляющие электроны в различные
участки белковой молекулы при ионизации. При этом связь S — S
не рвется, а в ее окрестности происходит локальное нарушение си­
стемы водородных связей в соответствии с механизмом Платцмана
я Франка. Благодаря сохранению S — 8-«мостика» третичная струк­
тура белковой молекулы, на первом этапе инактивации не нарушает­
ся и поэтому ферментативная активность сохраняется.
Химическая природа других электронных ловушек в белке еще
однозначно не установлена.
В SH-ферментах электронная вакансия, образующаяся при пер­
вом «попадании», компенсируется как атомами серы из SH-rpynn
ферментативных центров, так и другими источниками электронов,
в частности, S — S-связями. В первом случае молекула инактивируется, однако эта, инактивация является обратимой, поскольку она
не связана с нарушением третичной структуры белка, а лишь с ви­
доизменением ферментативного' центра. Активность может быть
восстановлена даже после окончания облучения. Во втором случае
образуется скрытое повреждение теплового типа. Инактивация,
происходящая в результате реализации этих скрытых поврежде­
ний, пострадиационно уже не восстанавливается из-за нарушения
третичной структуры белка, ответственной за уникальную конфигу­
рацию всей молекулы, в том числе ферментативного центра.
При повторном «попадании» в молекулу SH-фермента образует­
ся скрытое долгоживущее повреждение «кислородного» типа, при
реализации которого белок инактивнруется уже необратимо.
До того как скрытое повреждение в белковой молекуле реализо­
валось, оно может быть репарировано при взаимодействии с ради­
калами некоторых примесей.
Наряду с ионизацией, для инактивации белка требуется обяза­
тельное дополнительное влияние тепла или кислорода в присутствии
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
воды. Физический механизм воздействия на белковые молекулы со
скрытыми лучевыми повреждениями кислорода, тепла, воды и др.
агентов на втором этапе инактивации нельзя еще считать одно
значно установленным. Вызываемая кислородом инактивация бел­
ковых молекул со скрытыми повреждениями обусловлена физичес­
кими особенностями электронной оболочки молекул кислорода: его
парамагнетизмом и бирадикальностью. Тепло активирует, по-види­
мому, разрыв S — S-связи, в окрестности которой локализовалась
электронная вакансия и произошло локальное нарушение системы
водородных связен.
Разрыв S — S-связи или других «мостиков» искажает третич­
ную структуру белка, вызывая частичное развертывание белковой
молекулы. При этом нарушается уникальная конфигурация актив­
ного центра и поэтому теряется ферментативная активность. При
достаточной концентрации примесей их адсорбция на белке скреп­
ляет его третичную структуру и препятствует всяким конформацпониым изменениям. «Разблокировка» возвращает возможность реа­
лизации скрытых повреждений.
Представление о двухэтапностн первичного акта с промежуточ­
ным образованием долгоживущих скрытых повреждений позволило
объяснить ряд важных радиобиологических закономерностей и
предсказать существование ранее неизвестных сторон действия
ионизирующей радиации.
Появилась возможность понять и объяснить с единой позиции
совокупность данных по зависимости конечного радиационного эф­
фекта от влияния различных внешних агентов и условий как во
время, так и после облучения.
Принципиальную роль открытие двухэтапностн поражения иг­
рает также в вопросе защиты от действия излучений. Существова­
ние долгоживущей стадии с неосуществленным, лишь потенциаль­
ным повреждением и принципиальная возможность защитного вме­
шательства на этой стадии открывает новые пути в изыскании спо­
собов защиты от радиации-. Правильное понимание возможных пу­
тей защиты имеет большое практическое значение.
Список работ автора, относящихся к диссертации.
Эйдус Л. X. 1956. О первичном механизме биологического действия излучений.
Биофизика I, 544.
Эйдус Л. X., Каламкарова М. Б., Отарова Г. К. 1957. Миграционный механизм
защиты от лучевого воздействия. Биофизика, 2, 573.
Эйдус Л. X., Кондакова Н. В., Отарова Г. К., 1958. О механизме кислородного
эффекта в радиобиологии. Биофизика 3, 215.
Эйдус Л. X., Кондакова Н. В., 1958. О механизме фотодинамического эффекта.
Биофизика 3, 562.
Эйдус Л. X. 1958. О первичном физическом механизме биологического действия
излучений. «Действие ионизирующих излучений на животный организм» (те­
зисы докладов научной конф. 9—13/VII—1958 г.). Госмедиздат УССР стр. 168.
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Эйдус Л. X., Ганасси Е. Э. 1959. Изучение механизма радиационного «последейст­
вия» в белках. Биофизика 4, 215.
Зйдус Л. X., Кондакова Н. В. 1959. Последействие на фотодинамическом эффек­
те. Биофизика 4, 378.
Эйдус Л. X., Отарова Г. К. 1959. О существовании нескольких ферментативноактивных состояний миозина с разной термочувствительностью. Биохи­
мия 24, 982.
Эйдус Л. X., Ганасси Е. Э. 1960. О существовании нескольких типов скрытого
повреждения в облученных молекулах миозина. Биофизика, 5, 334.
Эйдус Л. X., Ганасси Е. Э., 1960. Анализ действия основных физических факто­
ров, изменяющих радиочувствительность. Биофизика. 5, 523.
Эйдус Л. X., Каюшин Л. П. 1960. Длительная консервация неспаренных электро­
нов в макромолекулах после облучения белковых растворов. ДАН СССР 135,
1525.
Эйдус Л. X. 1961. О значении особенностей энергетических состояний макромоле­
кул в понимании радиобиологических явлений. «Физико-химические и струк­
турные основы биологических явлений». Изд. АН СССР, 133.
Эйдус Л. X. 1960. Явление кислородного последействия в радиобиологии. «Роль
перекисей и кислорода в начальных стадиях радиобиологического эффекта».
Изд. АН СССР. стр. 136.
Ганасси Е. Э., Кондакова Н. В., Отарова Г. К., Эйдус Л. X. 1961. Общность в
проявлении радиационного последействия у белков различного строения
.(сравнительное исследование миозина и пепсина). Радиобиология I, 14.
Эйдус Л. X., Ганасси Е. Э., Отарова Г. К. 1961. О роли воды в радиационном
«последействии». ДАН СССР 140, 475.
Ганасси Е. Э., Эйдус Л. X. 1962. О возможном общем механизме действия защит­
ных веществ. Радиобиология, 2, 332.
Эйдус Л. X., Ганасси Е. Э., Кондакова Н. В. 1962. Latent lesions during radia­
tion — induced inactivation of enzymes. (Скрытые повреждения при лучевой
инактивации ферментов). The second intern, congress on radiobiology (abstr.).
Harrogate. England
Ганасси Е. Э., Эйдус Л. Х. 1962. Mode of action of factors modifying the effect of
ionizing radiation on protein. (Изучение действия модифицирующих факторов
при облучении белков ионизирующей радиацией). The second intern, congress
on radiobiology (abstr.) Harrogate. England.
Ганасси Е. Э., Эйдус Л. X., Арифулина Р. А. 1963. Исследование механизма
действия химических защитных веществ. Сообщение I. Радиобиология. 3,-440.
Эйдус Л. X. 1963. «Обратный» кислородный эффект при действии ионизирующих
излучений. Радиобиология. 3. 920.
Ганасси Е. Э., Эйдус Л. X., Арифулина Р. А. 1964. Участие кислорода в лучевой
инактивации сухих ферментов. Радиобиология. 4, 44.
Эйдус Л. X. 1964. Об участии кислорода в радиобиологических эффектах. Радио­
биология, 4, 329.
Л Т-04664
Зак. 1936
Производственно-издательский комбинат ВИНИТИ
Люберцы, Октябрьский пр., 403
Тир. 250
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
950 Кб
Теги
772
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа