close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

152

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
J-ЬвШ
На правах рукописи
ШМЫКОВА Наталья Анатольевна
РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ,
НАПРАВЛЕННЫХ НА УСКОРЕНИЕ СЕЛЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА
ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР
Специальности: 06.01.05. - селекция и семеноводство
03.00.23 - биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора сельскохозяйственных наук
МОСКВА - 2006
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Диссертационная работа выполненавГосударственном научном
учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт
селекции и семеноводства овощных культур» в 1991-2005 гг.
Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук,
академик РАСХН В.Ф. Пивоваров
Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук
М.И. Мамедов
доктор биологических наук
А.В. Поляков
доктор биологических наук
Ю.В. Чесноков
Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский
институт сельскохозяйственной биотехнологии
Защита диссертации состоится .•£. октября 2006 года в 10 часов на засе­
дании
диссертационного
совета
Д
220.019.01
при
ВНИИ
селекции
и
семеноводства овощных культур по адресу: 143080, Московская обл., Одинцов­
ский р-н, п/о Лесной городок, пос. ВНИИССОК.
Факс:(095)599-22-77; E-mail:vniissok@mail.ru.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ селекции и се­
меноводства овощных культур.
Автореферат разослан *>г?' ....й^^г^.-г^к^ггЛООб г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 220. 019.01
доктор с.-х. наук, профессор
[f.
j
Е.Г.Добруцкая
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Центральным вопросом селекции является репро­
дукция (воспроизводство) растительного материала. Селекционеры используют
половую и вегетативную репродукцию на различных этапах селекционного
процесса, включая создание исходного материала, отбор, поддержание и раз­
множение перспективного сортолинейного материала или сортов и гибридов
сельскохозяйственных растений.
В связи с этим методы культуры тканей, направленные на размножение
исходного материала, приобретают большое значение для построения рацио­
нальных систем создания гибридных семян в селекции овощных культур.
Важными предпосылками экономически выгодного использования методов
культуры тканей являются высокие коэффициенты размножения при сохране­
нии генетической стабильности, а также экономия времени при размножении in
vitro, что дает возможность включать их в селекционный процесс.
С другой стороны, репродуктивная фаза жизненного цикла растений
представляет своеобразную природную систему «генетической инженерии», в
которой новые комбинации генов, собранные в гаметах, проверяются в систе­
мах гаметофитного отбора. Гаплоидное же состояние генома в отличие от
диплоидного позволяет обнаружить редкие рецессивные аллели, а получение
дигаопоидных растений из микроспор и клеток зародышевого мешка - реализо­
вать гаметоклональную изменчивость в индивидуальные растения и ускорить
процесс получения гомозиготного материала в несколько раз.
Необходимо отметить, что основой селекционного процесса является по­
нимание того, как влияют способы репродукции на изменчивость растений, как
происходит развитие репродуктивной системы у растений. Ограниченность
знаний о репродуктивных особенностях растений - основная причина недоста­
точного использования процессов гаметогенеза. В естественных условиях
отбор мужских гаметофитов представляет еобой цшицш шы^^траненное явление у высших растений.
*
имени К.А. Тимирязева
ЦНБ имени НИ. Железнова
j
Фонднаучн^й^ег^т^у
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4
Таким образом, приведенные аргументы со всей очевидностью показы­
вают, что для ускорения селекционного процесса необходимы
научные
исследования, направленные на детальное изучение процессов микроспорогенеза, микрогаметогенеза, опыления, андрогенеза, гиногенеза
и клонального
микроразмножения ценных овощных культур.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось теорети­
ческое
и
экспериментальное
обоснование
использования
современных
биотехнологических методов в селекции овощных культур, направленных на
ускорение селекционного процесса.
Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи:
1.
Изучить особенности развития пыльников и пыльцы у овощных культур;
разработать принципы оптимизации питательных сред для определения жизне­
способности пыльцы.
2.
Определить морфологические признаки цветков и цитологические осо­
бенности развития пыльников у овощных растений с мужской стерильностью.
3.
Выявить действие биотических и абиотических факторов на жизнеспо­
собность пыльцы овощных культур; определить принципы методики гаметного
отбора.
4.
Оценить и усовершенствовать методику получения дигаплоидных рас­
тений в культуре неопыленных семяпочек лука репчатого.
5.
Изучить проблемы методов получения дигаплоидных растений в культу­
ре пыльников и микроспор/пыльцы овощных культур, выявить перспективы их
использования в селекции.
6.
Разработать
основные элементы технологии
клонального микрораз­
множения овощных культур (состав питательных сред, типы эксплантов) и
изучить влияние индуцирующих факторов на морфогенез.
Научная новизна. Разработана система биотехнологических методов и
показана их перспектива в ускорении селекционного процесса у овощных куль­
тур. Рассмотрены принципы и проблемы разработки таких методов, как
гаметная селекция, андрогенез, гиногенез, клональное микроразмножение.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5
При изучении индукции андрогенеза выявлено, что у овощных растений в
культуре пыльников преобладает соматический эмбриогенез из
эндотеция
(морковь, огурец, капуста), средних слоев (томат, перец) и паренхимных клеток
связника (огурец, укроп, капуста). Каллус и эмбриоиды не могут развиваться
из клеток тапетума овощных растений, так как уже в период микроспорогенеза
наблюдается его деградация, которая резко ускоряется при культивировании
пыльников in vitro.
Установлено, что в большинстве случаев получение пыльцевых дигаплоидов заканчивается на этапах каллусогенеза и раннего эмбриогенеза, что
свидетельствует о нескольких уровнях детерминации, контролирующих этапы
перехода на спорофитный путь развития.
Показано специфическое действие регуляторов роста производных фенилмочевины (тидиазурона и CCPU) на меристематические ткани овощных
культур. Впервые выявлено индуцирующее действие бора на побегообразова­
ние у капусты при клональном микроразмножении, позволяющее увеличить
коэффициент размножения.
Практическая ценность. Разработаны искусственные питательные сре­
ды для проращивания пыльцы у огурца, капусты, редиса, дайкона, перца,
которые могут быть использованы для предварительной оценки жизнеспособ­
ности пыльцы, а также при разработке методов гаметного отбора, позволяющих
ускорить селекционный процесс.
Разработана схема селекционного процесса с использованием мужского
гаметофита на устойчивость к бактериозу у лука репчатого.
Усовершенствована методика получения дигаплоидов лука в культуре
неопыленных семяпочек.
Для получения растений-регенерантов из микроспор с гаметоклональной
изменчивостью у моркови предложено использовать методику культуры пыль­
ников in vitro (Тюкавин, Шмыкова, 2000).
Разработаны элементы технологий клонального микроразмножения ка­
пусты, огурца, редиса, которые могут быть использованы
для размножения
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6
селекционно ценных генотипов.
Положения, выносимые на защиту: Система биотехнологических мето­
дов, позволяющая ускорить селекционный процесс у овощных культур.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы до­
ложены на: международных симпозиумах и научных конференциях: «Биология
культивируемых клеток растений и биотехнология» (Алматы, 1993 г.); «Новые
и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 1995
г.); «Гетерозис сельскохозяйственных растений и перспективы их использова­
ния» (Москва, 1997 г.); « Биология клеток растений in vitro, биотехнология и
сохранение генофонда»( Москва, 1997 г.); «Plant Biotecnology and In Vitro Biol­
ogy the 21 st Century» (Jerusalem, 1998 г.); IV Съезд общ. физиологов растений
России (Москва, 1999 г.); «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и
ветеринарии» (Москва, 2000 г.); «Приоритетные направления в селекции и се­
меноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке» (Москва, 2003 г.);
«Биотехнология и генетическая инженерия микроорганизмов, растений и жи­
вотных» (Ольштын, 2004 г.); «Современное состояние и перспективы развития
селекции и семеноводства овощных культур» (Москва, 2005 г.).
По материалам докторской диссертации опубликована 71 научная работа,
в том числе 7 методических указаний и статьи в международных и отечествен­
ных сборниках научных трудов и журналах, из них 7 статей в ведущих
рецензируемых научных журналах и изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на J6S"
страницах компьютерного текста и состоит из введения, 8 глав, выводов, прак­
тических рекомендаций; включает 73
таблицы,
128 рисунков и список
используемой литературы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
В работе использован селекционный материал из рабочих коллекций се­
лекционных лабораторий ВНИИССОК. Исследования проводили с 1991 по
2005 г. в лаборатории биотехнологии института.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7
Донорные растения, в зависимости от времени года, выращивали в от­
крытом
фунте,
пленочной
теплице
и
в
вегетационной
камере
при
освещенности 7 - 8 кЛк и 16 часовом периоде.
Цитологический анализ пыльников, микроспор, пыльцы и определение
жизнеспособности проводили по методике З.П.Паушевой (1988).
Клональное микроразмножение, культивирование неопыленных семяпо­
чек, пыльников и микроспор проводили по общепринятым методам работы с
культурами растительных тканей (Бутенко, 1984).
Биологические опыты проводили в шестикратной повторности. Стати­
стическую обработку экспериментальных данных выполняли по Б.А.Доспехову
(1985) с помощью прикладных программ Microsoft Excel.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Развитие пыльника и образование пыльцы у овощных растений
Проводимые нами исследования направлены на обобщение литературных
данных и изучение особенностей развития пыльников и образование фертильной пыльцы у целого ряда овощных культур. Знание закономерностей развития
мужского гаметофита служит основой для создания методов, ускоряющих се­
лекционный
процесс
и
способствующих
увеличению
генетического
разнообразия исходного материала, а также понимания проявления мужской
стерильности у растений.
Развитие пыльника может быть разделено на два больших периода. В
конце первого периода пыльник содержит большинство специализированных
клеток и тканей и тетрады микроспор, находящиеся в микроспорангиях. В те­
чение
второго
периода
микроспоры
дифференцируются,
развиваются
пыльцевые зерна. Дифференцированный пыльник имеет несколько высокоспеииализированных тканей: эпидерму, эндотеций, средние слои и тапетум. По
мере развития микроспор и пыльцы они претерпевают изменения. В период
раскрытия пыльника стенки его чаще всего состоят из эпидермы и эндотеция.
Клетки средних слоев у моркови, капусты, огурца уплощаются и лизируются
вместе с тапетумом, а в стенках клеток эндотеция образуются фиброзные
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8
утолщения. У томата, напротив, клетки средних слоев сохраняются, а в клетках
эндотеция не наблюдается фиброзных утолщений.
Микроспоры, образующиеся после распада тетрад, как правило, имеют
ядро, расположенное в центре клетки, плотную цитоплазму и тонкую оболоч­
ку. По мере развития микроспоры в ней образуется крупная вакуоль и
состоящая из двух слоев (интины и экзины) оболочка. На последнем этапе раз­
вития микроспоры ядро смещается в пристеночную позицию, вакуоль занимает
центральное положение. На этой стадии микроспора завершает свое существо­
вание и вступает в асимметричный (дифференцирующий) митоз, в результате
которого образуется новая структура - пыльцевое зерно. Оно состоит из веге­
тативной и генеративной клеток. Вскоре после первого митоза у ряда растений
(морковь, капуста, редис) генеративная клетка вступает во второй митоз и об­
разуются два спермия (трехклеточное пыльцевое зерно). У огурца, томата,
перца, лука, спаржи пыльца двухклеточная, второй митоз наступает при про­
растании пыльцы. На протяжении всего периода существования пыльцевого
зерна происходит его подготовка к прорастанию и оплодотворению.
Развитие цветка управляется взаимодействием гомеотических генов. Ты­
чиночные примордии появляются после того, как появились
примордии
чащелистиков и лепестков, но до инициирования плодолистиков. Эта взаимо­
связь в развитии частей цветка сохраняется на протяжении всего периода его
жизни, поэтому по морфологическим признакам одних частей можно косвенно
судить о степени развития других (табл.1, 2).
Таблица 1
Стадии развития микроспор и пыльцевых черен у огурца
Длина, мм
чашечки венчика
4.0-5.0
2.0
6.0
2.5
6.0
3.0
6.0
4.0
8.0
10.0
8.0
11.0
10.0
15.0
12.0
18.0
13.0
20.0
14.0
22.0
15.0
25.0
Стадии развития микроспор и пыльцы
тетрады, распад тетрад
начало вакуолизации микроспор, ядро в центре
вакуолизированные микроспоры, с пристеночно расположенным ядром
образование вегетативной и генеративной клеток
двукклеточная. сильно ракуолнзиронамная пыльиа
уменьшение вакуоли
тоже
исчезновение вакуоли
зрелые пыльцевые зерна
то же
тоже
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
9
Таблица 2
Стадии развития микроспор и пыльцевых зерен у лука репчатого.
сорт Штуттгартер - ризен
бутона
1.5
2.0
2.5
3,0
3,5
3,8
4.0
4.5
Длина, мм
Стадии развития микроспор и пыльцы
тычинки пестика
1.2
тетрады
1,0
1.5
ранние микроспоры
1,2
1,7
микроспоры с двумя большими вакуолями
1,2
2.0
микроспоры в канун первого митоза, часть их находится в
U
фазе митоза
2.1
двухклеточная пыльца, генеративная клетка округлой (|юрмы
1,4
2.3
двух клеточная пыльца, генеративная клетка смещена к ради­
1,8
альной стенке
3.0
двухклеточная пыльца, генеративная клетка приобретает
1,8
линзовидную форму
3.5
2,0
двухклеточная пыльца, генеративная клетка вытянутой линчовидной формы, удалена от стенки
Например, коэффициент корреляции между размером бутона и стадией
развития мужского гаметофита у капусты составляет 0,85 - 0,94.
Для успешной оценки и отбора генотипов на микрогаметофитном уровне
необходимо быстро и эффективно определять жизнеспособность пыльцы. В на­
учной литературе почти для каждой культуры можно найти несколько
прописей состава питательных сред для оценки жизнеспособности пыльцы. Ос­
новными компонентами этих сред являются сахароза, борная кислота, соли
кальция и магния. Сахароза создает осмотическое давление и может служить
компонентом стенки пыльцевой трубки. По литературным данным в системе
рыльие — завязь существуют градиенты концентрации ионов кальция, бора и
водорода. Концентрация этих компонентов в репродуктивных органах у разных
генотипов индивидуальна, отсюда и индивидуальная концентрация их в средах.
Это хорошо прослеживается на пыльце лука. В популяции пыльцы при­
сутствуют
отдельные
пыльцевые
зерна
способные
прорастать
при
концентрации сахарозы 1% и 30%, однако основная масса пыльцевых зерен
прорастает при оптимальной для этого сорта концентрации (рис. 1 а,б).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
10
70
so J
60
—-p
|
.... - -.
1зо
5 i
10
•-Г
l
0 -
s{Blul
1
3
5 10 15 20 ?5 30
концентрация сахарозы, %
Рис. 1 а. Прорастание пыльцы гуса
репчатого (сорт Штуттгартер риэпн) in vitro
на питательных средах с различным
содержанием сахарозы
50
| 4 - jS
30 {
20 '
20 ]
10
^ 1- ;о
•
0
ш
U^n,
3
5
10 15 20 25 30
концентрация сахарозы, %
Рис 1 б. Прорастание пыльцы гукз
репчатого <сорт Даниловский 301) In vitro на
питательных средах с различным
содержанием сахарозы
Из рисунка 2 видно, что потребность в сахарозе у пьтльцы различных ви­
дов и сортов капусты разная. На способность пыльцы прорастать влияет не
только концентрация сахарозы, но и значение рН среды. Несколько меньше до­
ля влияния рН среды у Представителей семейства капустные из рода Raphanus,
но доля влияние концентрации сахарозы велика и изменяется от 50 до 85%.
Образцы перца сильно различаются по способности пыльцы прорастать
при разных значениях рН среды (рис.3). Одни лучше прорастают в нейтральной
среде, а другие в щелочной. При скрещивании таких сортообразцов можно
ожидать низкую завязываемость семян.
63 •
Рис.2. Доля влияния рН среды и концентрации сахарозы на прорастание
пыльцы капусты in vitro (1 - Белоруская 455. 2 - Спааа 1305, 3 - Малиновка, 4 Тонус. 5 - Номер первый грибовский 147, капуста китайская №939. 7 - капуста
китайская №954)
|ОрН • коми, сахарозы
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
11
i
гР
к
с
5S
с
2S
Г.
о
20
15
10
S
1
в
А
ж
30
0
.
Г*.
1
<
п4 ^нЛГКгГ-
4
6
10
219
220
Сортообраэцы
221
fel
щ-
214
216
219
Рис.3. Прорастание пыльцы перца овощного in vitro на питательных средах с различными
значениями рН
ОрН=7
«pH'S
OpH=9
'•
;
I
Таким образом, для определения жизнеспособности пыльцы у овошных
культур необходимо индивидуально для каждого сортообразца подбирать со­
став питательной среды, включающей бор, ионы кальция и магния, сахарозу и
имеющей оптимальное значение рН .
Мужская стерильность у овощных растений
Явление мужской стерильности представляет большой интерес для полу­
чения
гибридов.
В основе
морфологических
нарушений
в
пыльниках
стерильных растений лежат биохимические изменения, обусловленные генети­
ческими особенностями растений, обладающих мужской стерильностью.
Дайкон. Нами проведено морфологическое и цитологическое изучение
проявления мужской стерильности у выращиваемых в Московской области
стерильных растений дайкона MS Gensuke.
У стерильных растений дайкона (форма MS Gensuke) нарушения прояв­
ляются после распада тетрад, процесс вакуолизации опережает формирование
клеточной стенки. Микроспоры слипаются, образуя конгломераты, которые не
контактируют со стенками пыльника. При утолщении стенки микроспор не об­
разуется характерный скульптурный
рисунок.
Патологические
изменения
наблюдаются и в соматических тканях пыльника, клетки тапетума имеют в не­
сколько раз меньшие размеры (рис.4).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 4. Клетки тапетума в пыльниках дайкона фертильных (а)
и мужских стерильных растениях (б) на стадии развития микроспор
Деструктурирование их начинается на стадии тетрад, а образовавшаяся
из них неклеточная структура сохраняется до момента раскрытия пыльника.
Тапетум в пыльниках фертильных растений сохраняется до образования двух-,
трехклеточной пыльцы с последующим разрушением клеток, и в период рас­
крытия пыльника он отсутствует. Пыльники стерильных растений сильно
отличаются от пыльников фертильных растений по окраске и размерим. Разли­
чия прослеживаются по отношению высоты пестика к высоте тычинок ещё в
нераскрывшихся бутонах. У стерильных растений высота пестика значительно
больше высоты тычинок по сравнению с фертильными. В цветках этот признак
сохраняется.
Перец. В пыльниках перца изменения в тапетуме наступают на стадии
мейоза. Вместо тапетума секреторного типа образуется периплазмодиальный
тип тапетума, то есть
тапетум стерильных растений утрачивает клеточную
структуру (рис. 5). Это затрудняет контакт с микроспорами.
Рис.5. Клетки тапетума в пыльниках перца фертильных (а)
и мужских стерильных растениях (б) на стадии развития микроспор
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
15
Для определения наличия реакции у пыльцы лука репчатого использова­
ли непосредственный контакт её с суспензией трехсуточной культуры Envinia
carotovora в концентрации 10*7 клеток. Эта концентрация полностью подавляла
способность пыльцы к прорастанию. Для дифференциации пыльцы по устойчи­
вости к воздействию бактерий использовали ряд разведений: исходная
суспензия (10+7); 9:1; 8:2; 7:3; 6:4; 5:5; 4:6; 3:7; 2:8; 1:9; дистиллированная вода.
У различных образцов наблюдалась зависимость изменения жизнеспо­
собности пыльцы от бактериальной нагрузки: чем выше концентрация бактерий
в суспензии, тем меньше число проросших микроспор (табл.3). По характеру
этих изменений сорта можно разделить на устойчивые и восприимчивые. К ус­
тойчивым
относятся
сорта Штуттгартер ризен, Одинцовец, последний
отличается большой гетерогенностью, к восприимчивым относятся Данилов­
ский и Стригуновский.
Таблица 3
Жизнеспособность пыльцы лука репчатого под действием
бактериальной нагрузки (Erwinia carotovora)
Концентрация
бактерий
(суспензия : во­
да)
Контроль
(дис­
тиллированная
вода)
1:9
2:8
Проросшая пыльца, %
Арзамас­
ский
Штуттгартер
ризен
Данилов­
ский
Стригу­
новский
68.7+12,3
61,5+10,5
53.0±15.3
40.7+22.3
22.2+7.5
48.4111,5
67.7±7.4
64,3±П.2
42,3±13.7
27.2119.4
23,111.9
41.4120.5
Одинцовец Сквирский
70.4+10.8
25,2+10.9
24,5116,6
32.2+11.3
5.411.2
32.0+14.0
3:7
54.9±12,5
23.0+17.4
9,8+8,9
14.3110.8
8.914.7
7.5+6.8
4:6
29,7±11.9
14.2+11.5
10.7+2,2
19.217,9
15.814.7
11.918.9
5:5
13.0+4.6
2.2±1.2
4.7+3.8
11.217.0
I3J16.6
25.6115.3
6:4
9.9+6.6
4.7+3.7
4.9±2.5
19,718.5
0.0+0.0
3.112.0
7:3
12.0+5.5
5.3±4.2
0.5Ю.0
19.5+6.4
3.513.3
6.214.3
8:2
5,7+1,5
1.8±2.5
1.7+1.9
10.1110.2
11.419.4
3.413.1
9:1
0.5+0.4
0.6+1,3
5.6±5.2
4.6+4.2
3.112.8
5.3+2.6
Исходная
сус­
пензия 1 0 " кл.
3.4+2.1
0.5+1.6
0.0=0.0
0.0+0.0
2.412.6
2.9+2.7
i
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
16
Однако использовать суспензию из живых бактерий в качестве барьера
при опылении растений лука невозможно, так как будет происходить заражение
цветков лука, соответственно и будуших семян. Для этого была разработана
методика, которая заключалась в следующем. Молодые листья лука устойчиво­
го сорта заливали бактериальной суспензией и оставляли на трое суток. Это
приводило к выделению пектолитических ферментов в среду и мацерации ли­
стьев. Полученную суспензию фильтровали первоначально через бумажный
фильтр, а затем стерилизовали путем фильтрации через бактериальный фильтр.
Из фильтрата готовили разведения, концентрацию которых контролировали по
способности подавлять прорастание пыльцы лука устойчивого сорта
Раствор, при действии которого на пыльцу оставалось 3-4 проросших
пыльцевых зерен, использовали для предварительной обработки пыльцы перед
опылением. Количество завязавшихся семян зависело от устойчивости сорта и
концентрации раствора (табл.4).
Таблица 4
Завязываемое! ь семян в зависимости от концентрации в растворе
метаболитов Enrinia carotowora (1993-1 994 гг.)
Завязываемость семян в процентах к контролю
Сорт
Разведение в 40 раз
Разведение в 100 раз
6.2
20.7
Арзамасский
0
21.3
Штуттгартер ризен
Одинцовец
0
6.2
Даниловский
0
3.4
Мячковский
0
4.1
Таким образом, на основании проведенных исследований
предложена
схема селекционного процесса на устойчивость к бактериозу с использованием
мужского гаметофита (рис.7).
Рис. 7. Схема селекционного про­
цесса
на
устойчивость
лука
репчатого к бактериозу с использо­
ванием мужского гаметофита.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
17
Одной из задач селекции является создание новых холодоустойчивых или
менее требовательных к теплу сортов и гибридов огурца. Для изучения холодо­
устойчивости сортов и гибридов необходимы простые, эффективные и
надежные методы оценки растений, позволяющие её прогнозировать. В онтоге­
незе растений выделяется два периода, когда растение наиболее чувствительно
к пониженным температурам. Это фазы развития проростков и бутонизации.
Материалом исследований служила пыльца различных сортообразцов
огурца из лаборатории селекции и семеноводства тыквенных культур.
Пыльца линий №№ 2, 5 и 10 за сутки почти достигла контрольных пока­
зателей, то есть микрогаметофит этих линий менее чувствителен к пониженной
температуре, тогда как линия 9 имела всего 50-60 % проросших пыльцевых зе­
рен от контроля.
Анализ экспериментальных данных, полученных при оценке проростков
этих же линий на холодоустойчивость, показал, что существуют различия меж­
ду ними. Из четырех инцухт-линий
наибольшей
холодоустойчивостью
обладала линия № 10, у которой наблюдался наибольший процент проросших
семян.
Для большей эффективности отбора температура в опыте была понижена
до +12... 14" С. Такое снижение положительной температуры позволило выявить
гетерогенность линии № 10 по холодоустойчивости. При пониженной темпера­
туре у этого образца прорастало всего 10 -20% семян при 100% всхожести. Для
дальнейших исследований внутри этой линии отобрали холодоустойчивые
формы, которые прорастали при температуре +12...14°С, и нехолодоустойчи­
вые, прораставшие при +23...25°С. Из этих проростков получили взрослые
растения, которые различались между собой размерами цветка — у холодо­
устойчивых форм цветок был меньше, а пыльца была более крупных размеров
(рис. 8). При анализе размеров пыльцы следующего поколения видно, что у
холодоустойчивых форм увеличилась доля пыльцы с более крупными размера­
ми. Характер кривой показывает, что популяция холодоусточивых генотипов
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
IS
неоднородна. У теплолюбивых генотипов сохранилась популяция пыльцы с
прежними размерами.
- холодоустойчивые
~ холодонеустойчивые
5
6
7
8
9
1 0 11 12 13
Диаметр пыльцевого зерна
-холодоустойчивы»
- холодонеустойчивые
4
5
б
7
8
9 10 11 12 13
Диаметр пыльцевого зерна
Рис.8. Влияние отбора проростков огурца Л-20 при пониженной
температуре на размеры пыльцевых зерен; А - после первого
отбора; Б -после второго отбора (1992-1994г.)
,
i
Однако при оценке на холодоустойчивость коллекции огурца, выращи­
ваемой
в весенне-летнем
обороте,
когда
температура
в дневные
часы
превышала +30° С. Воздействие пониженных температур в этом случае не по­
давляло прорастание пыльцы, а напротив стимулировало его. Подобную
закономерность наблюдал целый ряд авторов на различных культурах таких,
как кукуруза, японская репа, томат (Лях, Сорока, 1993; Степанов, I998; Салтонович, 1998; Козлова, 1999).
Известно, что влияние высоких температур, приходящееся на последую­
щие стадии микроспорогенеза, приводит к замене асимметричного митоза на
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
19
обычный и синтезу белков теплового шока (Telmer et al. 1995), а на стадии микрогаметогенеза к изменениям углеводного обмена (Aloni et al., 2001).
С другой стороны, период, предшествующий рассеиванию пыльцы, со­
провождается
интенсивным
углеводным
обменом.
Углеводы
являются
главными питательными веществами, из которых идет образование клеточной
стенки пыльцы, в том числе и пыльцевой трубки (Pacini, 1996).
Таким образом, для достоверной оценки генотипов на холодоустойчи­
вость по мужскому гаметофиту необходимым условиям является выращивание
растений при пониженных температурах или близких к ним оптимальных.
Культура неопыленных семяпочек лука in vitro
В современной селекции одной из важнейших задач является быстрое
достижение константности селекционного материала. Наиболее остро эта про­
блема возникает при создании гетерозисных гибридов, для которых требуются
гомозиготные линии с высокой комбинационной способностью. В традицион­
ной селекции гомозиготность достигается путем инбридинга в ряде поколений.
В современной биотехнологии предложен альтернативный метод ускоренного
получения гомозиготных линий через культуру неопыленных семяпочек и
культуру пыльников и микроспор.
Получение гаплоидных растений в культуре in vino неопыленных семя­
почек является
результатом
перехода
клеток зародышевого
мешка с
гаметофитного пути развития на спорофитный с образованием из них эмбриоидов или морфогенного каллуса. На процесс индукции гиногенеза влияет
большое число факторов таких, как генотип растения, стадия развития женско­
го гаметофита, состав питательных сред, условия выращивания донорных
растений.
Наши исследования показали, что 2,4 Д влияет на разрастание интегументов семяпочек лука репчатого. Семяпочки достигают размера полностью
сформированного семени, однако клетки нуцеллуса часто отмирают, и внутри
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
20
образуется полость. На питательных средах с БАП или без гормонов происхо­
дит менее интенсивное разрастание покровов семяпочек, клетки нуцеллуса
сохраняются, а при высоких концентрациях БАП наблюдается разрастание ну­
целлуса. Проростки могут быть получены как на среде с гормонами, так и без
них. Наиболее определяющим фактором исхода эксперимента является стадия
развития семяпочки. Для культивирования неопыленных семяпочек лука оп­
тимальными являются бутоны длиной 5 мм. При этом можно выделить
несколько типов реакции:
- формирование структур подобных семенам, развивающихся из опылен­
ных семяпочек, с черно-коричневой кожурой без формирования зародыша;
- прорастание семяпочек, развитие проростков;
- семяпочки с лизированными зародышевыми мешками.
Для индукции гиногенеза в культуре неопыленных семяпочек лука in vi­
tro был проведен сравнительный анализ следующих способов культивирования
завязей:
- на питательной среде БДС с 2 мг/л 2,4 Д и БАП до полного формирова­
ния побегов;
- на питательной среде, вышеуказанного состава, в течение первых двух
месяцев с последующим переносом на среду БДС с 2 мг/л НУК и 4 мг/л БАП;
- на питательной безгормональной среде БДС в течение двух недель с по­
следующим переносом на среду БДС с 2 мг/л ИМК, 0,12 мг/л БАП, 3,5 мг/л ГК
до формирования побегов.
В каждом варианте было заложено по 250 завязей лука сорта Штуттгартер ризен и по 25-60 завязей межвидовых гибридов. Анализ изменений,
протекающих в завязях и семяпочках (разрастание, образование структур по­
добных семенам, каллуса, проростков), проводили через неделю в течение
первых двух месяцев, а затем с интервалом в один месяц.
Из 2150 завязей или 12600 семяпочек, культивируемых in vitro и относя­
щихся к 19 генотипам, образование единичных эмбриоидов наблюдалось лишь
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
21
у межвидовых гибридов №1, №2, №9, №12, № 14, № 17 и сорта Штутгартер ризен.
Полученные результаты показали, что наиболее значимым фактором в
культуре неопыленных семяпочек является генотип растения.
Культивирование пыльников и микроспор in vitro овощных растений
Накопленный опыт культивирования пыльников и микроспор разнооб­
разных объектов позволяет выявить их общее свойство: низкий выход
гаплоидных растений по отношению к общему количеству высеваемой пыльцы
- в большинстве случаев он не превышает 0,5 % (Sunderland, 1978). Разработка
методики получения гаплоидов в культуре пыльников или микроспор требует
проведения индивидуальных исследований для каждого вида или даже сорта
растения.
Пыльца, способная к образованию эмбриоидов, каллусов в условиях in vi­
tro у многих видов по морфологическим признакам отличается от нормальной
пыльцы, реализующей гаметофитную программу. Микроспоры, прошедшие по
спорофитному пути развития, претерпевают равное или неравное деление, об­
разуя при этом аномальные пыльцевые зерна. Но такие зерна могут
образовываться из микроспор, детерминированных к гаметофитному пути раз­
вития, даже из двухклеточной пыльцы, приступившей к отложению запасных
веществ, но не завершившей его (Ермаков, Матвеева, 1986).
Полученные нами результаты культивирования пыльников и микроспор
овощных культур показали, что критической фазой для перехода с гаметофитного пути развития на спорофитный у исследуемых растений является стадия
развития микроспор, предшествующая первому гаплоидному митозу (морковь,
капуста, томат) и ранняя стадия двухклеточной пыльцы (капуста, огурец, то­
мат). Однако наряду с этим возможен переход и на стадии тетрад у томата
(рис. 9).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
22
Рис. 9. Развитие микроспор и пыльцы у овощных растений по спорофитному пути в
культуре да vitro (I - морковь, 2 - капуста, 3 - томат. 4 — огурец).
Изменение тканей стенки пыльника у ряда овощных растений
в культуре in vitro
Пыльник представляет собой, целостную интегрированную систему. Раз­
витие соматических тканей пыльника и репродуктивных клеток происходит
взаимосвязано. Это отражается на процессах, происходящих при культивиро­
вании пыльников in vitro. Проведенный цитологический анализ показал типы
изменений, протекающие в культуре пыльников in vitro у наиболее распростра­
ненных овощных культур, таких как капуста, томат, огурец, лук, морковь.
Капуста. На период оптимальной стадии для индукции андрогенеза, со­
матические ткани стенки пыльника слабо дифференцированы (рис.10). При
культивировании таких пыльников возможно образование эмбриоидов из кле­
ток эндотеция и паренхимных клеток связника.
Морковь. Отклонения от гаметофитного пути развития начинаются на
стадии поляризации микроспоры, предшествующей митозу. В этот период тка­
ни стенок пыльника моркови сорта Нантская 4 достаточно дифференцированы
(рис. 11). Как правило, такие соматические ткани пыльника каллус не образуют.
Однако степень дифференциации зависит от'генотипа растения. Например, у
сортотипа Флакки эндотеций во время, предшествующее митозу, недостаточно
дифференцирован, поэтому при культивировании пыльников этого сорта мож-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
23
но наблюдать образование каллуса. Развитие каллуса можно было увидеть при
культивировании пыльников отдельных трансгенных растений моркови сорта
Нантская 4 с репортерным геном GUS.
Рис. 10. Схема развития пыльцы и стенок пыльника капусты: А-В - стадии развития
микроспор; Г- Е - стадии развития пыльцы
ж
Рис. 11. Схема развития пыльцы и стенок пыльника моркови
Эп. - эпидермис; Эн. - эндотеций: Ср.сл. - средний слой; Т.- танетум: А- Д - стадии
развития микроспор: Е-Ж- стадии развития пыльцы
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
24
Огурец. Образование каллуса из вегетативной клетки у огурца происходит
на ранней вакуолизированной стадии пыльцы, стенки пыльника слабо диффе­
ренцированы (рис. 12). Образование каллуса
наблюдается,
как из стенок
пыльника, так и клеток связника.
Рис. 12. Схема развития пыльцы и стенок пыльника огурца; А-В - стадия микроспор:
Г-Е - стадия пыльцы;
Перец и томат. Стенки пыльников перца и томата в отличие от выше опи­
санных овощных культур имеют несколько рядов клеток среднего слоя,
которые сохраняются в течение длительного отрезка времени. При культивиро­
вании пыльников происходит интенсивное развитие каллуса из клеток средних
слоев.
Лук и спаржа. При культивировании пыльников лука независимо от сте­
пени дифференциации тканей стенок пыльника мы никогда не наблюдали
образование каллуса из них. Совершенно противоположная картина прослежи­
валась при культивировании пыльников спаржи. Каллус развивался как из
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
25
слабо дифференцированных клеток эндотеция, так и из сильно вакуолизированных клеток, имеющих фиброзные утолщения.
Из вышеизложенного следует, что при культивировании пыльников in vitro
наряду с андрогенными эмбриоидами возможно развитие каллуса и соматиче­
ских эмбриоидов из тканей стенок пыльника. Чаще всего образование каллуса
происходит из клеток эндотеция или средних слоев в зависимости от вида рас­
тения, но, как правило, каллус никогда не развивается из клеток тапетума, так
как в период микроспорогенеза он уже подвергается лизису.
Определение зависимости между размерами бутона и стадией разви­
тия микроспор/пыльцы
Многочисленные исследования, проводимые на культивируемых in vitro
микроспорах и пыльце, показали, что имеются определенные дискретные окна
в их развитии, когда под внешним воздействием возможен переход на спорофитный путь развития (Cheryl et al, 1992; Zarski, 1992; Binarova et al, 1993).
Морфологические исследования, проведенные на рапсе, выявили, что эмбрио­
генез может быть индуцирован на поздней стадии развития микроспор и ранней
стадии двухклеточной пыльцы (Fan et al, 1988; Telmer et al, 1992; Hause et al.
1993). Pechan и Keller (1988) определили, что промежуток времени, в течение
которого возможен переход с гаметофитного пути развития на спорофитный,
составляет менее 8 часов в цикле развития микроспоры. Главная проблема в
создании технологии культивирования изолированных микроспор касается
способности исследователя точно идентифицировать те бутоны, которые со­
держат потенциально эмбриогенные микроспоры. Обычно для этой цели
используют множество характеристик бутона: длина бутона, длина пыльника,
длина цветоножки, положение бутона в соцветии и отношение длины лепестка
к длине тычинки. Задачей наших исследований являлось - найти наиболее ин­
формативный показатель характеристики бутона.
Для выявления информативности морфологических параметров органов
цветка капусты, указывающих на стадию развития микроспор и пыльцы были
промерены их длина у различных бутонов брокколи гибрида Аркадия и опре-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
26
делена доля микроспор (табл.5). Полученные данные показали, что все пара­
метры цветка изменяются более или менее синхронно. Всегда можно
предвидеть, что у более длинного бутона будут более длинные тычинки, лепе­
стки и пестик. В пыльниках более крупных бутонов микроспоры и пыльца
также будут находиться на более поздних стадиях.
Таблица 5
Доля микроспор в пыльниках бутонов брокколи гибрида Аркадия разной длины
Длина бутона, мм
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
Соотношение длины
лепестка к длине ты­
чинки
0.63
0.65
0.77
0.89
1,00
1,02
1.20
Доля микроспор, %
100,0
100,0
97,0
77.0
66.7
10.8
0.9
Доля двух-,
трехклеточной
пыльцы. %
0
0
3,0
23.0
33,3
89,2
99.1
Однако не всегда бутоны одного размера имеют одинаковые по длине ты­
чинки и лепестки, в большей степени изменению подвержено соотношение
длины лепестка к длине тычинки. Для того, чтобы выявить наиболее информа­
тивный показатель, из соцветия одного растения были выделены бутоны
одинаковой длины, но с разным соотношением длины лепестков и тычинок
(табл. 6). При длине бутона 3,0 мм отношение длины лепестка к длине тычинки
изменялось от 0,90 до 1,04, соответственно, доля микроспор в пыльниках со­
ставляла от 32,0% до 97,1%, а пыльцы от 2,9 до 68,0%. По данным Pechan и
Keller (1988) норма удлинения бутона рапса в сутки составляет 0,75 ± 0,02 мм, а
время, в течение которого микроспора у рапса является способной к прохожде­
нию эмбриогенеза, приблизительно равно 8 часам. Это период между стадией
Gi перед митозом и стадией dnocne митоза (Cheryl et al, 1992), поэтому опре­
делить оптимальную стадию развития бутона для культивирования микроспор,
ориентируясь только на его размер, проблематично.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
27
Таблица 6
Доля микроспор в пыльниках бутонов брокколи гибрида Аркадия длиной Змм при разном
соотношении длины лепестка к длине тычинки
№ бутона
Отношение длины
лепестка к длине ты­
чинки
0,90
0.93
0,95
1.04
1
2
3
4
Доля микроспор. %
97.1
89.2
88.9
32.0
Доля двух-.
трехклеточной
пыльцы. %
2.9
10.8
11.1
68.0
Однако при культивировании первого бутона следует ожидать, что обра­
зуется большое количество стерильной пыльцы, так как большинство
микроспор находится на ранних стадиях развития. Оптимальными для культи­
вирования микроспор являются 2 и 3 бутоны, соотношение длины лепестка к
длине тычинки у них составляет 0,93 - 0,95, фракция микроспор, находящихся
перед митотическим делением, будет у них значительной, так как доля пыльцы
приближается к 11%.
У моркови цветки, а тем более бутоны мелкие, проводить их измерения
без специального оборудования невозможно, поэтому необходимо найти такой
морфологический признак, который бы позволял без специальных измерений
визуально выбрать необходимый бутон. На основании проведенного анализа
зонтичков моркови мы пришли к заключению, что таким признаком является
размер завязи (табл. 7).
Таблица 7
Стадии развития мужского и женского гаметофита у моркови, сорт Нантская 4
0.15
0.10
Количество проана­
лизированных
бутонов, шт.
20
0.15
0,13
35
0.20
0.40
0.50
0.60
0.18
0,30
0.40
0.50
40
35
30
25
Длина, мм
завязи
семяпочки
Стадия разви­
тия мужского
гаметофита
двухклеточная
пыльца
двухклеточная
пыльца
трехклеточная
пыльца
Стадия разви­
тия женского
гаметофита
мегаспора
мегаспора
вакуолизация.
митоз, форми­
рование
зародышевого
мешка, увели­
чение объёма
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
28
Так, например, при исследовании зонтичка 54 % бутонов, не имеющих
четко выраженную нижнюю завязь, содержали в пыльниках одноядерные мик­
роспоры, 6% бутонов с небольшой завязью до 1,5 мм были с двухклеточной
пыльцой, и остальные бутоны, завязь у которых превышала 2 мм, имели трехклеточную пыльцу. Количество бутонов в зонтичках с двухклеточной пыльцой
у моркови всегда незначительно, так как эта стадия развития пыльцы занимает
очень короткий промежуток времени.
Влияние генотипа растения на эмбриогенез в культуре пыльников
Были проанализированы 45 образцов различных видов капусты. Для ин­
дукции
андрогенеза
использовали
17
вариантов
индукционных
сред,
разнообразные обработки и условия культивирования. Анализ способности ге­
нотипов к андрогенезу оценивали по доле пыльцевых зерен с нарушенным
асимметричным митозом. Среди исследованных генотипов способность к ин­
дукции андрогенеза была выявлена: у шести генотипов брокколи (Тонус,
Аркадия Fi, Лазер Fi, Emerald F ( , Green Valiant, Бр-21), 2 генотипов капусты бе­
локочанной (К-124-0, К-221-9), 2 генотипов капусты цветной (Цв-1 и Цв-4) и у
капусты китайской сорта Ласточка.
Исследования по влиянию генотипа индивидуального растения было про­
ведено на 56 растениях брокколи сорта Тонус, выращенных в условиях
открытого фунта. По доле делящихся микроспор на седьмые сутки культиви­
рования судили о процессе индукции спорофитного развития в культуре
пыльников in vitro. Только у 14 из 56 растений были обнаружены развиваю­
щиеся по спорофитному
пути микроспоры. Это составляет лишь одну
четвертую часть от общего количества исследованных растений данного сорта.
Кроме того, доля индуцированных микроспор колебалась в широких пределах
(от О.Здо 31,2 % ) . Таким образом, эмбриогенная способность микроспор/ пыль­
цы может сильно различаться между растениями одного сорта.
Количество эмбриоидов, образующихся в культуре пыльников моркови
на среде МСм с 0,2 мг/л 2,4 Д по разработанной нами методике может дости­
гать до 544/100 пыльников (Тюкавин и др., 1999).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
29
Эта методика была апробирована в лаборатории биотехнологии на целом
ряде сортообразцов моркови европейского происхождения, таких как НИИОХ
336, Витаминная, Московская зимняя А-515, Лосиноостровская 13, Леандр,
Шантанэ 2461, сортотип Амстердамская, Нэпе, Рондо, гибридах F| Каратан, Калисто. Среди растений-регенерантов, полученных в культуре пыльников,
прослеживалась гаметоклональная изменчивость. Визуально это можно увидеть
по окраске и форме листовой пластинки и корнеплодов растений-регенерантов,
•
и также подтверждено результатами RAPD- анализа (Тюкавин и др., 2000).
Однако при культивировании пыльников моркови гибрида F| Scarlet won-
•
der, относяшегося к восточному подвиду, растения-регенеранты не были
получены. Чтобы найти различия между двумя контрастными по способности
к андрогенезу генотипами моркови, мы исследовали действие растворов 2,4 Д
на соцветия. У обоих сортообразцов наблюдали нарушения асимметричного
митоза, только процесс образования стерильной пыльцы у гибрида Scarlet won­
der происходил быстрее (табл. 8, 9)
Таблица 8
Развитие микроспор и пыльцы в соцветии моркови сорта Нантская 4.
помещенном в раствор 2,4 Д (1998-1999 гг.)
Время воз­
действия
исходное
состояние
1 сутки
3 суток
исходное
состояние
1 сутки
3 суток
исходное
состояние
1 сутки
3 суток
I I
2
0
1.3±0.6
0
и
0
0
3,511,4
Стадии развития микроспор и пыльцы
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
Крайние ряды бутонов в зонтичке
93,4±1,4
3,7±1,3
0
0
0
50.6±3.3 19.8±2,1 0,1*0.6
0
14.212.9^ 4.6±1.0
6.8*2.1
3 — 4 ряды бутонов в зонтичке
0
0.610-4
|
8
0.9Ю.5
26.412.1 1 3.011.0
50.8+3.3 | 23.512.9
0
0
0.910.9
0
0
1.6±0.9
56.313.5
0.410.0
19.7+0.5
0
0
0
0
0
0.2+0.2
0
0
1.810.3
0.510.3
14.213.4
46.815.4
74,0±4.7
21.6±5.3
0
0
11.317.5
0
86.4±7.7
0.3±0.3
0
5.4±2.6 2.2+0.8
16.4+2.5
5 -6 ряды бутов в зонтичке
97.7±5.1
2J+0.I
0
0
5,911.1
0
63.3±4.1
19.512.8
9.5±1.7
25.213.2
5.3±1.8
3.4Ю.9
•
I - тетрады: 2 — распад тетрад; 3 - микроспора с ядром, расположенным в центре, и двумя
крупными вакуолями: 4- микроспора с ядром, смещенным к полюсу: 5 - двухклеточнан пыльна: 6 трехклеточная пыльца: 7-е нарушенным асимметричным митозом: 8-стерильная пыльна.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
30
Таблица 9
Развитие микроспор и пыльцы в соцветии моркови гибрида F| Scarlet wonder, помешен­
ном в раствор 2,4Д (1998-1999 гг.)
Время
воз­
действия
исходное
состояние
1 сутки
3 суток
исходное
состояние
1 сутки
3 суток
исходное
состояние
1 сутки
3 суток
1
ЮЛ ±2.3
0
0
34.811.4
0.5Ю.З
0
Стадии развития микроспор и пыльцы
|
2
|
3
|
4
|
5
Крайние ряды бутонов в зонтичке
8.5±0.9
|
6
28.212.5
0.6Ю.4
0.910.5
0
75.514.3
1.3±0,2
84.2+2.0
0.2±0.2 ;
0
3 - 4 ряды бутонов в зонтичке
2,111.0
2,0+0.3
21.113,3
13.811.7
24,3±3,2
1.710.6
9,6+1.3
5.311,3
49.415.7
0.1±0.1
8.9+3.6
0.4±0.3
81.813.5
2.1±1.1
Центральные ряды бутонов в зонтичке
20.812,8
1.7Ю.5
20.312.3
13.9+2.7
30,8±2.4
18.6+1,5
56,411,5
43.611,5
0
0
0
0
2.3+0,9
3.4+1.1
2.3±0.8
4,4±1.6
14.9±1,1
6.711.5
8.7+3.0
34.913.2
28.912.0
3.711.0
32,212.0
46.8+2.4
1 - микроспора с ядром, расположенным в центре; 2- микроспора с ядром, смешенным
к полюсу: 3 - двухклеточная пыльца; 4 - трехклеточная пыльца; 5 - е нарушенным асиммет­
ричным митозом; 6 - стерильная пыльца.
По литературным данным 2,4 Д может подавлять соматический эмбриоге­
нез у некоторых видов семейства сельдерейные, поэтому пыльники обоих
сортообразцов были прокультивированы на средах, содержащих ИУК. Здесь
также проявилось нарушение асимметричного митоза, как у моркови сорта
Нантская 4, так и у гибрида Scarlet wonder, но развитие эмбриоидов не проис­
ходило (табл.10). При клональном микроразмножении гибрида F| Scarlet wonder
соматический эмбриогенез не наблюдался, проявлялось лишь побегообразова­
ние.
Это указывает на то, что 2,4 Д индуцирует у сортообразцов моркови евро­
пейского происхождения все этапы эмбриогенеза. ИУК индуцирует лишь
первый этап у сортобразцов этого подвида.
Иная картина наблюдается у гибрида F| Scarlet wonder, когда оба регулято­
ра роста индуцируют лишь первый этап - нарушение асимметричного митоза.
Аналогичные изменения наблюдались при культивировании пыльников укропа,
петрушки и сельдерея.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
31
. Таблица 10
Нарушения асимметричного митоза в культивируемых in vitro пыльниках моркови сор­
та Нантская 4 и гибрида F| Scarlet wonder на средах, содержащих ИУК (1998-1999 гг.)
Пыльца
Микроспоры
Концен­
трация
ИУКв
среде
мг/л
с нормаль­
ным
развитием
1
2
3
4
5
37.0+5.8
40.814.4
28,3+2.9
18.612.8
20.1 ±4.0
1
2
3
4
5
27,8±2,1
20.6+5.0
36,0+3.1
46.3+3.6
61.5+2,3
с нарушен­
двухклеточ- стерильная
ной
ная
вакуолиза­
цией
Сорт Нантская - 4
1ЛЮ,4
2.8+0.5
8.911.6
0
0
6.Ш.6
1.310.6
13.113.4
0.1 ±0,1
6,511,4
9.0+2.6
5.211,3
0.510.1
26.613.7
2.5±1,4
Гибрида F| Scarlet wonder
0
0
7.712.3
1.210.3
7.812.1
0,4+0.2
0
0
12.211,7
0
0
14.31.2.7
0
0
6.611.0
морфогенная. тип
деления
равный
неравный
35,314.3
37,411.5
53.8+2.7
48.313.6
43.314.8
54.912.3
50.514.4
47.712.6
35.711.3
29.712.1
14.211.9
15.6±3.1
3.010.9
1I.2H.6
4.811.0
9.6+2.0
19.3+2.2
3.3+1.3
6.012,6
1.9Ю.7
Как по литературным данным, так и в наших опытах большая часть попы­
ток получения пыльцевых гаплоидов заканчивается на разных этапах каллусо или эмбриогенеза. Можно полагать, что в основе этого лежат объективные при­
чины,
отражающие
существование
нескольких
уровней
детерминации,
специфически связанных со спорофитным развитием. Таким образом, получе­
ние гомозиготных линий в культуре пыльников возможно лишь у отдельных
генотипов овощных культур, у которых возможен переход микроспор/пыльцы
с гаметофитного пути развития на спорофитный.
Полученный в лаборатории биотехнологии исходный материал с примене­
нием культуры пыльников моркови in vitro передан в селекционные
лаборатории в ВНИИССОК, НИИОХ, Западно-сибирскую овощную опытную
станцию. Использование этого материала на Западно-сибирской овощной
опытной
2005).
станции позволило создать сорт моркови Соната (Тюкавин и др.,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
32
Клональное микроразмножение овощных растений
Получение гибридов F| является основой для интенсивной технологии
возделывания овощных культур. Значительную роль в этом процессе могут иг­
рать биотехнологические методы. Они облегчают и ускоряют традиционный
селекционный процесс в создании новых форм и сортов растений. Важная об­
ласть применения биотехнологических методов — это поддержание растений с
мужской стерильностью или самонесовместимостью путем вегетативного раз­
множения с целью получения генетически идентичных клонов для их
использования в гетерозисной селекции.
Важную роль в клональном микроразмножении играют выбор исходно­
го экспланта и гормональный состав сред, индуцирующих побегообразование.
Капуста. В исследованиях использовали стерильные проростки капусты
белокочанной сортов Подарок, Слава 1305, Амагер 611, Зимовка 1474, Москов­
ская поздняя 15, Номер первый грибовский 147. В качестве экспланта брали
фрагменты семядолей пятисуточных проростков.
При подборе среды, индуцирующей побегообразование, составили 12 ва­
риантов, содержащих различные цитокинины и ауксины. Во всех вариантах при
использовании в качестве экспланта фрагментов семядолей через две недели
культивирования наблюдали образование каллусных тканей с последующей ре­
генерацией корней. Наиболее интенсивное корнеобразование происходило на
средах, содержащих НУК и ИУК, развитие побегов было единичным.
При анализе результатов опытов с использованием в качестве эксплантов
участков гипокотилей было отмечено, что образование каллуса в первую оче­
редь происходит из коровой части. Это рыхлый каллус светлой или слегка
буроватой окраски, из которого развиваются корни. В ряде случаев образуется
каллус из клеток сердцевины. Он также рыхлый, светлой окраски, но из него не
наблюдалось регенерации ни корней, ни побегов. Наибольший интерес пред­
ставляет каллус зеленого цвета, плотный с незначительным приростом,
образующийся на границе флоэмы и ксилемы, то есть на месте нахождения
камбия. Из него, как правило, образуются дополнительные побеги.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
33
Большое значение имеет местоположение фрагмента гипокотиля в проро­
стке. У фрагментов, выделенных из верхней части гипокотиля, наблюдается
развитие многочисленных побегов. Если эксплантом служит средняя часть ги­
покотиля, то происходит образование единичных побегов. У эксплантов,
выделенных из нижней части гипокотиля, наряду с появлением каллуса из ко­
ровой части развиваются корни. Экспланты из верхней части гипокотиля
частично захватывают ткани эпикотиля, которые детерминированы на развитие
побега. Побегообразование в этом случае происходит как из апикальной, так и
из периферической меристем.
Из двенадцати использованных вариантов сред оптимальными являются
среды со следующими сочетаниями регуляторов роста: по 0,2 мг/л 2,4 Д и
. CPPU и по 0,2 мг/л НУК и CPPU (табл. 11).
Таблица 11
Каллусогенез и органогенез у эксплантов капусты белокочанной
сорта Номер первый грибовский 147 (2001- 2002 гг.)
Ауксины
ИУК
Цитокинины
НУК
2-ip
1
Каллус,
корнеобразование
Тоже
Кинетин
Тоже
БАП
Тоже
Тидиазурон
2.4 Д
2
Каллус, по­
бегообразо­
вание
Каллус,
корнеобразование
Тоже
1
Каллус.
корнеобразование
Тоже
То же
1
2
Каллус
с Каллус,
небольшим корнеобприростом
разование
Тоже
Каллус
корнеобразование
То же
Тоже
Каллус, по­
бегообразо­
вание
Тоже
Тоже
1о же
2 •
Каллус
побегооб­
разование
Каллус.
корнеобразование
То же
Тоже
1 - эксплантом служили сегменты семядолей; 2 - эксплантом служили сегменты гипокотиля
Использование в качестве экспланта частей бутона позволяет клонально
размножать стерильные или же с низкой завязываемостью семян самонесо­
вместимые растения капусты, выделенные в период цветения
растений.
Эффективность такой методики была показана для размножения стерильных
растений Brassica rapa L.( Yang et al., 2000).
Разработку клонального микроразмножения с использованием различных
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
34
частей бутона проводили на капусте брокколи сорта Тонус. Варианты пита­
тельных сред были составлены по аналогии работы Yang с соавторами (2000).
Для индукции каллусообразования - среда МСм с 1-6 мг/л 2,4 Д и 0,1 мг/л кинетина и побегообразования - среда МСм с 1-5 мг/л БАП и 0,2 мг/л НУ К. В
качестве экспланта использовали пестик с остатками цветоложа.
На всех средах независимо от концентрации 2,4 Д происходило образова­
ние каллуса. При переносе каллуса на регенерационные среды, несмотря на его
глобулярную структуру, развитие побегов не наблюдалось. Из каллуса, пере­
несенного со среды с высоким содержанием 2,4 Д, появлялись корневые
волоски через две недели культивирования, при более низких концентрациях
2,4 Д - позднее.
В следующей серии опытов мы использовали для индукции каллусообра­
зования среду МСм с 0,2 мг/л 2,4 Д и тидиазурона по аналогии с предыдущими
нашими опытами и для сравнения среду МСм с 3 мг/л 2,4 Д и 0,1 мг/л кинетина.
Наличие в среде тидиазурона индуцировало образование плотного зеленого
каллуса. К концу культивирования из крайних тканей цветоложа произошло
образование белого рыхлого каллуса. Для гистологического анализа происхож­
дения
каплусных
тканей
был
сделан
срез
с
цветоложа.
На
срезе
прослеживаются тяжи камбиальных тканей у основания частей околоцветника,
где наблюдалось развитие зеленого каллуса, и рыхлые паренхимные ткани на
месте появления белого каллуса (рис.13). При культивировании пестиков тидиазурон инициировал развитие зеленого каллуса из меристематических клеток
цветоложа, так же, как в опытах с эпикотилем.
Рис. 13. Развитие почек из каплусных тканей, образовавшихся из клеток камбия в осно­
вании околоцветника капусты.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
35
Для индукции побегообразования испытывали следующие среды: МСм с
0,2 мг/ л НУК и тидиазурона, 0,2 мг/л БАП и тидиазурона и в качестве контроля
с 3 мг/л БАП и 0,2 мг/л НУК (табл.12).
Таблица 12
Органогенез в каллусных тканях, полученных из пестиков бутонов капусты брокколи
сорта Тонус (2002-2003 гг.)
Варианты регенеВарианты сред, индуцирующих каллусообразование
рационных сред
МСм с 0,2 мг/л 2,4 Д и тидиазу- МСм с 3 мг/л 2.4 Д и 0.1 мг/л кинерона
тина
МСм с 0.2мг/л НУК Единичные побеги из зеленого Разрастание светлых каллусных
и 3 мг/л БАП
каллуса, ризогенез из светлого тканей, ризогенез.
каллуса, побурение каллусных
тканей через 4 недели культиви­
рования;
МСм с 0,2 мг/л Единичные побеги из зеленого Разрастание каллусных тканей.
НУК и тидиазурона каллуса, ризогенез из светлого появление светло зеленых участ­
каллуса, разрастание каллусных ков, ризогенез.
тканей.
МСм с 0.2 мг/л Множественные побеги из зеле­ Разрастание каллусных тканей, об­
БАП и тидиазурона ного каллуса, ризогенез из разование земно зеленых участков
светлого каллуса.
каллуса. ризр|-енез,
В течение первых двух недель наблюдали появление единичных побегов
из зеленых участков каллуса на средах с БАП и тидиазуроном и на средах с
БАП и НУК. Ризогенез происходил на всех средах из светлого каллуса. Однако
к концу четвертой недели процессы регенерации на средах с БАП и НУК пре­
кратились, началось побурение каллусных тканей. На средах с МУК и
тидиазуроном одновременно происходил прирост, как светлого каллуса, так и
зеленого, но формирование глобулярных структур и почек не наблюдалось,
единичные побеги появились лишь через 4 недели культивирования. На среде,
содержащей тидиазурон в комплексе с БАП, к концу четвертой недели индуци­
ровалось образование побегов из зеленого каллуса (рис. 13), а из светлого
каллуса развивались корни. Из каллуса, полученного на среде с высоким со­
держанием 2,4 Д, на всех регенераиионных средах образовывались корни.
Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности использова­
ния тидиазурона как для индукции каллусообразования, так и для инициации
побегообразования у эксплантов капусты.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
36
Редис. Изучение морфогенетической активности у различных типов эксплантов на примере редиса сорта Фея показало, что органообразовательной и
регенерационной способностью обладали только фрагменты гипокотилей, вы­
деленные из верхней их части, и захватывающие ткани эпикотиля с высокой
меристематической активностью. Клетки семядольных эксплантов были детер­
минированы только на ризогенез (13,6%), а морфогенетическая активность
корневых сегментов и нижних участков гинокотелей вообще не обнаружена.
Огурец. Для индукции каллусообразования, побегообразования и эм­
бриогенеза использовали среду МСм с 30 г/л
сахарозы с различными
комбинациями регуляторов роста: 1 — 0,5 мг/л БАП; 2 — 2 мг/л кинетина; 3 - 2
мг/л 2,4Д и 0,5 мг/л кинетина; 4 - 0,8 мг/л 2,4Д и 2ip; 5 - 1 мг/л НУК. 2,4Д и 0,5
мг/л БАП. Данные представлены в таблице 13, из которой видно, что почти во
всех вариантах происходит ризогенез. Перенос каллуса, полученного из семя­
долей, на регенерационные среды (1 — 1 мг/л НУК и 0,5 мг/л БАП; 2 - 10мг/л
НУК и 0,5 мг/л БАП; 3 - 1 мг/л ИУК и 0,5 мг/л БАП) положительных результа­
тов не дал.
Таблица 13
Каллусогенез и органогенез у эксплантов orypua линии Л-42 (2002-2003 гг.)
Регулягоры
роста
0.5 мг/л БАП
2,0 мг/л кине­
тина
2,0 мг/л 2.4Д и
0,5 мг/л кине­
тина
0,8мг/л 2.4Д и
2ip
1.0 мг/л НУК,
1.0 мг/л 2.4 Д и
0.5 мг/л кине­
тина
Тип экспланта
Семядоли
Гкпокотиль
У 50% эксплантов - побегообра­ Семядоли не использовались
зование
У 30% эксплантов - побегообра­ Тоже
зование
У 25% эксплантов - корнсобразо- Скручивание, образование светлого
вание; у 12%
- образование каллуса по поверхности среза, при­
рост незначительный
каллуса по поверхности среза
У 50% эксплантов - корнеобразо- У всех эксплантов развитие каллуса
вание;
и у всех образование с последующим ризогенезом
бурого каллуса по поверхности
среза
Каллусообразование с последую­ Каллусообразование. каллус рыхлый
с глобулярной структурой, ризогенез
щим ризогенезом
Однако нами было отмечено, что культивирование верхних участков гипокотиля на средах с цитокининами индуцирует побегообразование и
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
37
способствует образованию дополнительных почек. На основании этого нами
были составлены следующие варианты сред: 1 — 1,0 мг/л 2 ip; 2 — 1,0 мг/л БАП;
3 - 1 , 0 мг/л кинетина; 4 - 0,2 мг/л CPPU.
При культивировании верхних отрезков гипокотиля на этих средах про­
явилась зависимость числа побегов от положения экспланта на среде. При
помещении экспланта точкой роста вниз (точка роста в этом варианте оказыва­
ется
погруженной
в
питательную
среду)
происходит
образование
дополнительных побегов. При появлении первого листочка и соприкосновении
его верхней стороны со средой, содержащей 0,2 мг/л CPPU, индуцируется за­
кладка многочисленных почек. Однако если листочек контактирует со средой
нижней стороной, то образование почек не происходит. Предположительно, это
связано с транспортом регуляторов роста, так как только при прямом контакте
мы наблюдаем положительный эффект.
Регенерационную способность можно повысить, воздействуя различными
соединениями, индуцирующими организованный рост в дедифференцированной ткани.
Бор - один из наиболее важных для растений микроэлементов. В нем наи­
более нуждаются двудольные растения. Среди них выделяется ряд семейств, у
которых это явление выражено в большей степени. К ним относится семейство
капустные. Бор необходим для нормальной деятельности верхушечных мери­
стем.
Предобработка эксплантов раствором борной кислоты стимулировала про­
цесс побегообразования у сорта Номер первый грибовский 147 в два раза уже
после двух недель культивирования. У сорта Амагер 611 эффект влияния бор­
ной кислоты был меньше. Вследствие этого было изучено влияние различных
концентраций растворов борной кислоты, используемых для предобработки
эксплантов у разных сортов капусты белокочанной. Полученные результаты
свидетельствуют о том, что экспланты сортов капусты белокочанной различа­
ются по потребности в боре, она изменяется от 1мг/мл до 2 мг/мл.
Аналогичные результаты были получены при культивировании частей бу-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
38
тона. Наилучший эффект получен при двойной обработке эксплантов раство­
ром борной кислоты и пониженной температурой (табл. 14).
Таблица 14
Регенерация побегов капусты брокколи сорта Тонус на среде МСм с 0,2 мг/л БАП
и тидиазурона из каллуса, полученного на среде МСм с 0,2 мг/л 2,4 Д и тидиазурона (20022004 гг.)
№
п/п
1
2
3
4
Тип морфогенетических
изменений
Тип каллуса
Контроль
а). Светлый с
ризоленезом
б). Зеленый
без побего­
образования
% эксплантов с кор100
необразованием
%эксплантов с по­
37,5
бегообразованием
Число побегов на
0-4
эксплант
раствором
борной кисло­
ты
Обработка
пониженной
температурой
а). Светлый с
а). Светлый с
ризогенезом
рнзогенезом
б). Зеленый без б). Зеленый
побегообразо­
без побегооб­
вания
разования
100
100
раствором
борной кисло­
ты и
пониженной
температурой
а). Светлый с
ризоленезом
б). Зеленый
без побегооб­
разования
100
28,5
50.5.
100
0-3
0-5
10-30
Итак, при работе с эксплантами капусты, редиса, огурца прослеживалось
избирательное действие регуляторов роста производных фенилмочевины на
меристематические ткани, которые детерминированы на побегообразование.
Это в свою очередь позволяет успешно разрабатывать технологии клонального
размножения капусты с использование CPPU и тидиазурона.
При использовании разработанных элементов технологии для размноже­
ния самонесовместимых и стерильных образцов капусты белокочанной и
брокколи удалось повысить число побегов, образующихся на одном экспланте
до 50-60 штук. Весь период размножения от выделения экспланта и посадки
растения-регенеранта в почву составляет 2,5-3,0 месяца, что способствует ус­
корению селекционного процесса. Применение этой технологии позволило
размножить самонесовместимые и стерильные формы капусты белокочанной,
капусты броколли, капусты декоративной, которые используются в селекцион­
ном процессе в лаборатории селекции и семеноводства капустных культур
внииссок.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
41
вишенных температур, регуляторов роста на соцветия in vivo позволяет уско­
рить процесс подбора оптимальных условий культивирования.
11. Во время индукции клетки разных тканей одного и того же органа
приобретают детерминацию к специфическому органогенезу (побегообразова­
ние, корнеобразование, каллусообразование или эмбриогенез). Клетки коровой
паренхимы капусты, редиса, дайкона, огурца детерминированы на ризогенез, а
клетки меристематических тканей на побегообразование.
12. Избирательное действие на меристематические ткани эксплантов
овощных культур оказывают регуляторы роста производные фенилмочевины,
индуцирующие из них побегообразование. Это могут быть латеральные мери­
стемы,
или
остатки
маргинальных
меристем
молодых
листочков.
Индуцирующий эффект регуляторов роста для капусты можно усилить, ис­
пользуя
предобработку
эксплантов
пониженными
температурами
или
раствором борной кислоты.
Практические рекомендации
Для предварительной оценки жизнеспособности пыльцы у таких культур,
как капуста, редис, перец рекомендуется использовать питательные среды с
учетом значения рН. Пыльцу лука можно проращивать in vitro только на плот­
ных
агаризованных
средах.
Концентрация
сахарозы
может
быть
индивидуальной для сортообразцов капусты, редиса, лука.
При проведении селекции лука на устойчивость к бактериозу с использо­
ванием
мужского
гаметофита
в
качестве
селектирующего
барьера
рекомендуется использовать смесь пектолитических ферментов, выделившихся
в среду при мацерации листьев лука бактериальной суспензией Erwinia carotovora.
Оценку генотипов овощных культур на холодоустойчивость по мужскому
гаметофиту можно
проводить лишь на растениях, выращиваемых при пони­
женной и нормальной температуре, так как в пыльце, сформированной на фоне
повышенных температур, воздействие низких температур вызывает неадекват­
ную реакцию.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
42
Для получения дигаплоидов лука в культуре неопыленных семяпочек
можно использовать питательные среды, содержащие 2мг/л НУК и 4мг/л БАП
или НУК и тидиазурон.
Для предварительного определения стадии развития микроспор у расте­
ний капусты рекомендуется использовать соотношение длины тычинок к
лепесткам, а у моркови длину завязи.
Сократить количество вариантов предобработок пыльников капусты
можно путем предварительной оценки эффективности воздействия повышен­
ных температур, регуляторов роста на изолированные соцветия in vivo.
Для получения растений-регенерантов моркови из микроспор с гаметоклональной
изменчивостью
рекомендуется
использовать
методику
культивирования пыльников моркови in vitro (Тюкавин, Шмыкова,2000).
При размножении самонесовместимых и стерильных линий капусты и
редиса для индукции каллусообразования и побегообразования рекомендуется
использовать тидиазурон или CPPU, а для увеличения количества образую­
щихся побегов использовать предобработку эксплантов положительными по­
ниженными температурами и 0,1 -0,2 % раствором борной кислоты.
Для индукции побегообразования при клональном микроразмножении
огурца рекомендуется использовать 0,2 мг/л тидиазурона или CCPU.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Шмыкова Н.А. Титова И.В. культура in vitro неопыленных завязей межвидовых гибри
дов лука // Биология культивируемых клеток растений и биотехнология: Тез. докл. 11
Междунар. конф. 28 сент.-2 окт. 1993. - Алматы, 1993.-Т.1. - С . 154.
2. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Каплусо- и эмбриогенез огурца in vitro II Конференция
но генетике соматических клеток в культуре: Тез. докл. - М., 1993. - С. 44.
3. Shmikova N. A.. Tjukavin G.B. Culture of unpollinated ovaries and ovules in bulb onion.
carrot and cucumber // Plant biotechnology and genetic engineering: Abst. Int. Symp.
Ukraine, October 3-6,1994. - Kiev. 1994. - P. 114.
4. Shmikova N. A. Anther culture of Allium сера L. // Plant biotechnology and genetic engi­
neering: Abst. Int. Symp. Ukraine.October 3 -6, 1994.- Kiev, 1994. - P. 113.
5. Gavrilenko T.A.. Dorokhov D.B.,Pavlov A.V.. Sochanova N.M.. Shmikova N.A. A cytogenetical. phenotypic. biochemical and molecular characterization of intergeneric somatic
hybrids of tomato Lycopersicon esculentum Mill, and non-tuberous potato species from
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
43
Etuberosa series // Plant biotechnology and genetic engineering; Abst. Int. Symp. Ukraine.
October 3 -6, 1994. - Kiev, 1994. - P. 52.
6. Настенко Н.В.. Шмыкова Н.А., Балашова Н.Н., Кушнерева В.П. Разработка способа
предварительной оценки растений огурца на устойчивость к: фузариозу // Селекция
овощных культур: Научные труды ВНИССОК. - М., 1994.- Вып. 34. -С.75-79.
7. Настенко Н.В., Шмыкова Н.А. Совершенствование методики определения жизнеспо­
собности огурца // Селекция овощных культур: Научные труды ВНИССОК. - М„
1994.-Вып.34.-С.47-50.
8. Шмыкова Н.А., Хомякова Е.М. К вопросу получения гибридов спаржи // Новые и не­
традиционные растения и перспективы их использования // Труды 1 Междунар. симп.
» -S августа1995. - Пушино, 1995.-С. 333-334.
9. Настенко Н.В., Шмыкова Н.А.. Балашова Н.Н.. Кушнерева В.П. Селекция огурца к
корневым гаилям // Труды ВНИИССОК (к 75 - летию).- М.. 1995. - С. 31 -40.
10. Шмыкова Н.А., Агафонов А.Ф., Шкпяр С.Н. Перспективы использования мужского
i-аметофита в селекции лука репчатого // Труды ВНИИССОК (к 75 — летию).- М..
1 9 9 5 . - С . 170-175.
11. Балашова Н.Н.. Игнатов А.Н., Самохвалов А.Н., Рогачев Ю. Б.. Шмыкова Н.А. Жиз­
неспособность микрогаметофита белокочанной капусты под влиянием возбудителей
бактериозов и килы //С.-х. биология. - 1995.- №5.- С. 115-118.
12. Самохвалов А.Н., Рогачев Ю.Б., Шмыкова Н.А., Настенко Н.В., Перова Т.П. Фитотоксическое действие грибов рода Fusarium // Научные труды по селекции и
семеноводству. М-. 1995. - Т. 1. - С 124 - 125.
13. Шмыкова Н.А. Культура пыльников, нсопыленных завязей и семяпочек лука репчато­
го // Научные труды по селекции и семеноводству. М., 1995. - Т. 1. - С 164 - 170.
14. Настенко Н.В., Шмыкова Н.А., Кушнерева В.П. Разработка методов селекции огурца
на устойчивость к корневым гнилям с использованием мужского гаметофита // Заши­
та растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса, экономика.
эффективность, экономичность. // Сб. докл. Всерос. съезда по защите растений. Санкт - Петербург. 1995. - С. 224..
15. Балашова Н.Н., Шмыкова Н.А.. Шкляр С.Н., Агафонов А.Ф. Использование мужского
гаметофита в селекции репчатого лука на устойчивость к бактериальной гнили // За­
шита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса.
экономика, эффективность, экономичность. //Сб. докл. Всерос. съезда по защите рас­
тений. - Санкт - Петербург, 1995. - С. 158.
16. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Культура неопыленных завязей и семяпочек моркови путь ускоренного получения стерильных линий гетерозисной селекции // Селекш'я
овочевых i бащтанних культур на гетерозис : Тез. допов. Микнар. наук конф. - XapKiB.
1996. С. 82-83.
17. Шмыкова Н.Л.. Тюкавин Г.Б. Использование культуры пыльников ин витро для полу­
чения гомозиготных линий моркови // Гетерозис сельскохозяйственных растений:
Материалы докл.и сообщ. Междунар. симп. 1-5 декабря 1997.-М.. 1997.-С. 174-175
18. Тюкавин Г.Б.. Шмыкова Н.А. Разработка методов андро- и гиногенеза для создания
дигаплоидных линий в селекции F1 гетерозисных гибридов овощных культур // Гете­
розис сельскохозяйственных растений: Материалы докл.и сообщ. Междунар. симп. 15 декабря 1997.-М-. 1997. - С. 1 б I -162.
19. Агафонов А.Ф., Шмыкова Н.А. Использование мужского гаметофита в селекции лука
репчатого на устойчивость к бактериозу // Методические указания по селекции луко­
вых культур. - М. 1997. - С . 2 8 - 31.
20. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А Методы ускоренного получения линий моркови для ге­
терозисной селекции // Гетерозис сельскохозяйственных растений: Материалы докл.и
сообш. Междунар. симп. 1-5 декабря 1997.-М.. 1997. - С.163-164.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
44
21. Монахова М.А.. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Фенотип интерфазного ядра в клеточ­
ной селекции моркови // Биология клеток растений in vilro, биозехнология и
сохранение генофонда: Тез. докл. VI! Междунар. конф. 25-28 ноября 1997. - М.,
1997.- С. 223.
22. Шмыкова Н.А.. Тюкавин Г.Б. Изучение потенциального эмбриогенеза микроспор
моркови // Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофон­
да: Тез. докл. VII Междунар. конф. 25-28 ноября 1997. - М.. 1997. - С. 185.
23. Шмыкова Н.А.. Тюкавин Г.Б. Влияние регуляторов роста на развитие тканей пыльни­
ков моркови // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. Четвертой
Междунар. конф. 24-26июня 1997.-М., 1997.-С. 319.
24. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Гормональная регуляция каллусо- и органогенеза мор­
кови // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. Четвертой Междунар. конф.
24-26 июня 1997. - М„ 1997. - С. 321.
25. Настенко Н.В., Шмыкова Н.А.. Кушнерева В.П. Новый подход в селекции огурца на
устойчивость к фузариозу // Новые и нетрадиционные растения и перспективы их
практического использования. Материалы симп. Пушино. 1997. - Т 4. - С. 469 -470.
26. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Использование методов культуры пыльников и неоплодотворенных семяпочек для создания константных линий моркови // Использование
биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем: Сб. докл.
и сооб. XVH1 Мичуринских чтений 27-29 октября 1997 г. - Мичуринск, 1998. - С. 71 74.
27. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Альбинизм в культуре пыльников моркови in vitro и его
возможные механизмы // 11 Всероссийский съезд фотобиологов (Пушино. 8 -12 июня
1998 .): Материалы съезда. - М.. 1998. - С. 152.
28. Tjukavin G.B.. Shmykova N.A. Anther culture and utipollinated ovules of carrot // Plant
Biotecnology and In Vitro Biology in the 21 s ' Century: Absl. IX Int Cong, on Plant Tissue
and Cell Culture/Israel. June 14-19, 1988. Jerusalem, 1998.-P. 115.
29. Monahova M.A.. Tjukavin G.B.. Shmykova N.A. Change of ploidy during formation regen­
erated plants from androgenous and gynogenous embryos of carrot in vitro // Plant
Biotecnology and In Vitro Biology in the 21 s ' Century: Abst. IX lnt Cong, on Plant Tissue
and Cell Culture/ Israel, June 14-19, 1988. Jerusalem, 1998. - P. 180.
30. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Разработка методов биотехнологии растений для созда­
ния исходного материала в селекции овощных, малораспространенных и цветочных
культур во ВНИИССОК // Материалы докладов, сообщ. Международного симп. но
селекции и семеноводству овощных культур 1 - 4 марта 1999. - М.. 1999. - С. 362 371.
31. Домблидес А.С.. Тюкавин Г.Б.. Шмыкова Н.А. Влияние регуляторов роста на образо­
вание эмбриогенных структур в зародышевых мешках неопыленных семяпочек
моркови // Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. Пятой Международной
конф. 29 июня - 1 июля 1999. - М., 1999. - 4.2. - С.318 - 319.
32. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.В. Влияние предобработки соцветий моркови регулятора­
ми роста на образование «эмбриогенной» пыльцы // Регуляторы роста и развития
растений: Тез. докл. Пятой Международной конф. 29 июня - 1 июля 1999. - М.. 1999.
- 4 . 2 . - С . 354-355.
33. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.В. Влияние регуляторов роста на образование «эмбриогенной пыльцы в культивируемых in vitro пыльниках различных генотипов моркови //
Регуляторы роста и развития растений: Тез. докл. Пятой Международной конф. 29
июня - 1 июля 1999. - М., 1999. - 4.2. - С. 353- 354.
34. Хомякова Е.М., Шмыкова Н.А., Панфилов А.Г.. Циунель М.М. Методические указа­
ния по использованию культуры in vilro при сортоподдержании и размножении
ревеня. М.- 1998.-41 с.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
45
35. Заячковский В.А., Шмыкова Н.А., Старцев В.И. Цитологическое изучение особенно­
стей микроспорогенеза в пыльниках у стерильной формы столовой свеклы / / 1 1 1
Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования: Труды 111 Междунар. симп.21 -25 июня 1999-Пущино, 1999.- Т.З. - С.478 -480.
36. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Монахова М.А. Цитология эмбриогенеза в культуре
пыльников моркови // Физиология растений.- 1999 - Т.46. - №6. - С. 876 - 883.
37. Домблидес Е.Л., Шмыкова Н.А. Попытка идентификации потенциальной эмбриогенной способности микроспор у представителей рода Brassica // IV съезд Общ. Физиол.
Раст. России, «Физиология растений- наука 111 тысячелетия»: Тез. докл. Междунар.
науч. конф.4-9октября. 1999.-М.. 1999.-Т.2.-С. 570.
38. Домблидес Е.А., Шмыкова Н.А. Влияние обработки регуляторами роста соцветий на
развитие микроспор представителей рода Brassica in vivo //Селекция и семеноводство
овощных культур в XXI веке: Междунар. научно-практическая конференция 24-27
июля 2000. М., - Т.2.- С. 392 -393.
39. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А.Биотехнология в селекции овощных культур // Селекция
и семеноводство . - 2000. - № 1 . - С. 42 - 44.
40. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Культура неопыленных семяпочек моркови // Селекция
и семеноводство овошных культур в XXI веке: Международная научно - практиче­
ская конф. 24 - 27 июля 2000. М. 2000. - С. 275 - 277
41. Тюкавин Г.Б., Домблидес А.С., Шмыкова Н.А. Гиногенез моркови in vitro II Селекция
и семеноводство овошных культур в XXI веке: Международная научно - практиче­
ская конф. 24 - 27 июля 2000. М.. 2000. - С.277 - 279.
42. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Методические рекомендации по получению дигаплоидов моркови методом андрогенеза - М. 2000. - 56 с.
43. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Диморфизм пыльцы и андрогенез в культуре пыльников
моркови {Daucus caroia L.) If Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ве­
теринарии: Тез. докл. II Международной научной конференции 1 8 - 1 9 октября 2000.
- М., 2000. - С.55 - 56.
44. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н-А.Методы получения дигашюидов моркови in vitro // Био­
технология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. II
Международной научной конференции 1 8 - 19 октября 2 0 0 0 . - М . . 2000. - С . 1 2 0 - 121.
45. Домблидес А.С., Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Получение гиногенных растений мор­
кови in vitro с использованием тидиазурона // Биотехнология в растениеводстве.
животноводстве и ветеринарии: Тез. докл. II Международной научной конференции
1 8 - 1 9 октября 2 0 0 0 . - М . , 2000.-С. 1 5 4 - 155.
46. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Культура пыльников моркови // Доклады ТСХА..
М.:2000.- Вып. 272 - С. 55 - 60.
47. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Диморфизм пыльцы и оценка эмбриогенной способно­
сти микроспор различных генотипов моркови //Сельскохозяйственная биология. 2001.-№5.-53-61.
48. Тюкавин Г.Б., Супрунова Т. П.. Шмыкова Н.А., Домблидес А.С.. Дорохов Д.Б.. Клыгина Т. Э. Изучение гаметоклональной изменчивости у моркови сорта Нантская 4
//Овощеводство - состояние, проблемы, перспективы: Научные труды (к 70 - летию
ВНИИО)В2т..-М..2000.-Т.1.-С.157-161.
49. Кушнерева В.П.. Гладышко С.Н.. Шмыкова Н.А. Исходный материал для селекции
огурца партенокарпического типа для открытого фунта. // В сб.: Итоги и перспективы
развития плодоводства и овощеводства. Международная конференция, посвященная
90-летию со дня рождения профессора А.Н. Ипатьева Тез. докладов. Горки. 2001. - С.
74-79.
50. Домблидес Е.А., Шмыкова Н.А. Развитие пыльников капусты in vivo и при культиви­
ровании in vinoJI Селекция и семеноводство овошных культур. Сборник научных
трудов ВНИИССОК - М.. 2001. - Вып. 37. - С.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
46
51.Кушнерева В.П., Гладышко С.Н., Шмыкова II.A. Оценка oiypua на холодоустойчи­
вость // Селекция и семеноводство овощных культур. Сборник научных трудов
ВНИИССОК - М-, 2001. Вып. 37. - С. 93 -100.
52. Домблидес А.С., Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Цитологическое изучение модифика­
ции дифференциации тканей пыльников моркови сорта НИИОХ 336 с петалоидным
типом стерильности // Овощеводство — состояние, проблемы, перспективы: Научные
труды (к 70 - летию ВНИИО). - М., 2002.- Т. I. - С.75 - 79.
53. Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А. Технология получения удвоенных гаплоидов моркови //
Материалы научной генетической конференции, посвященной 100 - летию со дня ро­
ждения А.П.Жебрака и 70 -летию образования кафедры генетики в Московской
сельскохозяйственной академии им. К.А.Тимирязева. М.: Изд - во МСХА. 2002. —
С.327 -329.
54. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Морфогенетические изменения в культивируемых ш vi­
n o пыльниках моркови //. Доклады ТСХЛ. - М.: Изд -во МСХА, 2002. - Вып. 274. C.5U -516.
55. Domblides E.A., Shmykova N.A. Embryogenesis in culture of isolated microspore of Broc­
coli (Brassica ohrucea var/ iialica) in vitro II Biotechnology approaches for exploitation
and preservation of plant resources: Abst. Int. Symp. Ukraine. May 2 6 - 3 1 , 2002. - Yalta,
2002. - P. 29.
56. Шмыкова Н.А., Тюкавин Г.Б. Особенности морфогенетических изменений ь культи­
вируемых in vitro пыльниках моркови // Биотехнология. - 2002. - №5. - С.65 - 69.
57. Балашова Н.Н.. Балашова И.Т., Супрунова Т.П., Музыкантов В.П.. Козарь К.Г..
Скворцова Р.В., I уркина Л.К., Добруцкая Е.Г., Домблидес А.С.. Шмыкова Н.А.. Тю­
кавин Г.Б., Пивоваров В.Ф. Применение методов молекулярного анализа в
селекционных программах (овощные культуры) // Inginerie genetica si biotehnologii
modeme: Materialele Simpozionului al II - lea National cu parlicipare Internationala. Chi sinau. 2002. - C . 7 - 1 2
58. Иванушкина Т. В., Шмыкова Н.А., Бунин М.С. Разработка метода клонального мик­
роразмножения культур вида Rciphamts salivus. II Приоритетные направления в
селекции и семеноводстве сельскохозяйственных растений в XXI веке: Междунар.
Научно-практическая конф. 1 5 - 1 8 декабря 2003 г. - М., 2003. - С.З76-379.
59. Бунин М.С, Шмыкова Н.А, Иванушкина Т. В. Методические рекомендации по опре­
делению жизнеспособности пыльцы культур вида Raphanus salivus. - М.- 2003. - 34 с.
60. Беспалько А.В., Козарь Е.Г., Шмыкова Н.А., Балашова Н.Н. // Методические особен­
ности оценки жизнеспособности пыльцы перца сладкого in vitro // Сб. Межлунар.
научно-практ. конф. по пасленовым культурам. - Астрахань. 2003. - С. 45.
61. Бунин М.С, Шмыкова Н.А., Степанов В. А.. Старцев В.И.. Бондарева Л.Л. Методы
репродуктивной биологии в селекции овошных культур рода Brassica L. - М, 2003. 52 с.
62. Иванушкина Т. В., Шмыкова Н.А., Бунин М.С. Влияние нитрата серебра на процесс
побегообразования из гипокотильных эксплантов растений вида Ruphumts salivus in
vitro. II Биотехнология овощных, цветочных и малораспространенных культур. Сбор­
ник научных трудов международной научно-практической конференции (22 - 25
марта 2004 г.) - М., 2004. - С. 206 - 211.
63. Иванушкина Т. В., Шмыкова Н.А., Бунин М.С. Цитологическое изучение особенно­
стей развития пыльника растений вида Raphamis suiivus с ЦМС - Ogura. // Доклады
ТСХА. - М.: Изд -во МСХА. - 2004. - В. 276. - С. 461 -465.
64. Бунин М . С Шмыкова Н.А., Бочарникова Н.И:, Пышная О.Н.. Джое Е.А. Методиче­
ские рекомендации по определению жизнеспособности пыльцы вида Capsicum
иппиит L. - М., 2004. - 32 с.
65. Шмыкова Н.А., Бочарникова Н.И.. Пышная О.Н., Джое Е.А. Искусственная питатель­
ная среда для определения жизнеспособности пыльцы перца Capsicum annmm I.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
47
//Проблемы научного обеспечения овощеводства юга России. Материалы междуна­
родной научно - практической конференции ( 4 - 7 августа). Краснодар, 2004. - С.209
-213.
66. Бунин М.С., Шмыкова Н.А. Использование биотехнологических методов для получе­
ния исходного материала капусты - М., 2004. - 42 с.
67. Tyukavin G. В., Shmykova N.A. Embryogenesis in cultured carrot anthers // Innovation
Towards Modernized Agriculture. Book of Abstracts of AGRICONGRESS 2004. - Malay­
sia 2004.-P. 184 - 186.
68. Левко Г.Д., Шмыкова Н.А., Грубиянова М. И. Определение жизнеспособности пыль­
цы у разных видов из рода Чина (Lathyrus L.) // Доклады ТСХА. - М.: Изд-во МСХА.
- 2004. - В. 276.- С. 491 - 496.
69. Шмыкова Н.А. Разработка методов репродуктивной биологии для селекции овошных
культур // Современное состояние и перспективы развития селекции и семеноводства
овощных культур: Материалы Международного симпозиума.- 9-12 августа 2005г. М..
2005.-Т.1.-С.383-390.
70. Шмыкова Н.А. Перспективы использования клонального микроразмножения в селек­
ции овощных культур // Вестник РАСХН. 2005. - №4. - С. 48-49.
71. Тюкавин Г.Б., Рыбалко А.А., Шмыкова Н.А., Селянин И.Г. Андрогенез in vitro - ме­
тод ускоренного получения сорта столовой моркови Соната // Состояние и проблемы
научного обеспечения овощеводства защищенного грунта: Материалы II Междуна­
родной конференции,- 21-23 ноября 2005 г. М. 2005. -С.144-147.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Верстка, печать ООО "Полиграф Плюс ОК"
г. Одинцово, ул. Комсомольская, 9, т/ф: 593-20-01
Заказ № 172. Тираж 100 экз.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
23
Размер файла
1 030 Кб
Теги
152
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа