close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

563

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА
И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К. А. ТИМИРЯЗЕВА.
На правах рукописи
НГУЕН ТХИ ЛИ АНЬ
Т^
ПОВЫШЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ
ЯРОВОЙ ПШЕНИЦЫ К АБИОТИЧЕСКИМ
СТРЕССАМ МЕТОДАМИ БИОТЕХНОЛОГИИ
Специальность 03.00.23 — биотехнология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степенк
кандидата сельскохозяйственных наук
МОСКВА
1995
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
//
'
V
/ / -
Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной бно
технологии ТСХА
Научный руководитель — кандидат биологических наук
И. Д. Никифорова.
Официальные оппоненты — доктор биологических наук
3. Б Шамина, кандидат биологических наук Г. В. Рассадина.
Ведущее учреждение — Московский государственный университет (биологический факультет)
..
Защита состоится 6 марта 1995 г в *ii~vO
на заседании
специализированного ученого совета Д 120 35 07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А Тимирязева
Адрес: 127550, г. Москва И 550, ул Тимирязевская, 49,
отдел защиты диссертаций
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ТСХА
-.
Автореферат разослан « ' / » февраля 1995 г
Ученый секретарь
специализированного совета
кандидат биологических наук Swy/nfCi'
J
<
^' *~" ^
осева
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Актуальность проблемы. В современных экологических усло. виях количество тяжелых металлов в почвах и водах техногенных
ландшафтов на несколько порядков превышает фоновые природные
концентрации. Кроме того, глобальное потепление климата планеты, вызванное влиянием жизнедеятельности человека,. ставит
перед селекционерами задачи создания новых . форм культурных
растений, устойчивых к экстремальным факторам окружаюдей ере-.
ды (засухе, засолению почв, низким и высоким температурам,
ионам тяжелых металлов ) . В соответствии с оценками экспертов, по распространенности и опасности для экологических систем тяжелые
металлы занимают второе место, уступая только
пестицидам и значительно опережая такие широко-известные загряэнители, как двуокись углерода и серы. .
Проблема фитотоксического действия свинца, кадмия и цинка на* корневую систему растений в последние десятилетия интенсивно исследуется учеными разных стран мира, поскольку известно, что
не менее половины всего количества тяжелых
металлов техногенного происхождения в конечном итоге поступа-'
•е
тв п о ч в у .
..•'',•',•"•
'
• _
''.
• '•
".."*••.'
,
:;
известно, что расширению арсеналов методов для повышения
генетического разнообразия растений служит привлечение методов биотехнологии.
, >
'
. *.
.
Исходя из вышеизложенного, особенную актуальность приобретает работы по изучению влияния ионов кадмия и повышенных
температур на рост.культивируемых клеток различных видов пше- вицы и созданию на базе сомаклональной вариабельности форм
устойчивых к экстремальным факторам окружающей среды. Кроме
того, чрезвычайно важным является изучение возможности селекции на клеточном уровне форм, обладающих комплексной устойчивостью к стрессам, основываясь на неспецифической реакции на
стресс растительными клетками.
Пель и задачи исследования. Целью данной работы было
Изучение влияния ' ионов кадмия и температурного стресса на
культивируемые клетки двух видов пшеницы(твердой и мягкой). А
также, создание новых форм пшеницы, устойчивых к этим стрессам,- методами клеточной селекции. .''.:••'•'< *
.
,
, •• Для достижения поставленных целей было необходимо: - .
НАУЧ , .i ь -...J:.'-ОТЕКА-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 2 - провести сравнительное изучение влияния теплового
стресса на формирование каллусной ткани и рост уже сформированного каллуса у тверды* и мягких сортов пшеницы;
- отселектировать клеточные линии устойчивые к повышенным температурам и подучить из них растения регенераты;
- провести исследование влияния различных концентрации
ионов кадмия на формирование каллусных тканей и рост каллусных клеток твердых и мягких сортов пшеницы;
- отселектировать устойчивые к повышенным концентрациям
ионов кадмия клеточные линии и получить из них растения регенеранты;
- провести лабораторную оценку растений-регенерантов на
устойчивость к селектиругацэму фактору и проанализировать возможность возникновения перекрестной устойчивости к абиотическим стрессам.
Научная новизна Впервые проведено изучение влияния ионов кадмия и высоких температур на рост и морфогенез в культуре клеток двух видов пшеницы (Triticum aestivum и Tritlcum
durum). Выявлены генотипические различия в ответе каллусных
клеток на тепловой стресс и стресс, вызываемый ионами кадмия.
Установлено, что каллусные клетки сорта Безенчукская 139 обладают большей выносливость!) к повышенной температуре, но наиболее чувствительны к ионам кадмия. Тогда как, клетки сорта
Целинная-21 - более устойчивы к ионам кадмия и чувствителны к
тепловому стрессу. Впервые проведена селекция двух видов пшеницы на клеточном уровне на устойчивость к ионам кадмия и жароустойчивость и из стабильно устойчивых -клеточных линий получены растения регенеранты. Штсдааи индукции каллуса в
стрессовых условиях показано, что "часть растений регенерантов, полученных
из устойчивых клеточных линий, сохраняют
призак устойчивости и передают его следующему поколению. Среди растений-регенерантов выявлены формы, у которых устойчивость к ионам кадмия сочетается с устойчивостью к тепловому
стрессу и наоборот.
Практическая аначимость» Созданные в результате работы
новые формы твердой и мягкой пшеницы могут служить основой
для создания новых сортов, обладающих устойчивостью к ионам
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
;
кадмия и жаростойкость», что позволит сократить потери урожая
от воздействия неблагоприятных факторов онигжаютей среды.
Апробация работы.
Результаты исследования представлены
на Межвузовской конференции по фиаиологии растений и биотехнологии в 1994 году, на конференции молодых ученых Уосковской
сельскохозяйственной академии им. К А. Тимирявева 1993 года,
на заседании кафедры сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА.
Публикации. По материалам диссертации опубликована одна
работа и подготовлено к печати две статьи. '.
Объем и структура диссертации.
диссертационная - работа
состоит из введения, обзора литературы, методической части,
результатов и обсуждения. Материалы диссертации изложены на^
12.0 страницах текста, еодержат//4 таблиц, А 5. рисунков и... 9
фотографий..Библиография содержат ЯРО . источников отечественной и зарубежной литературы.' •"
:
.
,
>
сшьысгы и МЕТОДЫ ИОСЛВЯОВАНИЯ
'•
:
В качестве объектов исследования были использованы сорт
яровой гексаплоидиой пшеницы (Trltioura aestivum) селекции Северо-Казахстанского селекционного центра (Каэ. НИИЗХ)г целинная
-21 , и сорта тетраплоидной пввницы - Бвзенчукская-139 и Дам-
•с я н с к а я - 9 0 . ' '
••:;•;,':';' .-'-';•". ; . v .••'..''; * ; ' : - Ч : '
' •i.*':'*'.,'. ':•:'•';",'•' . • ' ' - ' • ' '"• '•" •
Каллусную ткань получали из незрелых - зародышей (14-16
дней после цветения) на модифицированной среде мурасиге-Скуга
(МС) с добавлением 2 мг/л 2,4Д. Следует отметить, что для индукции каллуса использовали зародыши из зерновок расположенных только я средней части колоса "Культивирование проводили
при температуре : 27° С и постоянном освецэнии. Пересадки на
свежую питательную среду осуществляли каждые 4 недели и суб. культивировали только морфогенный каллус. Интенсивность роста
каллуса обозначали как относительный рост и определяли.
как
отношение прироста каллуса к весуэкспланта. Вес зкспланта
обычно составлял 20-30мг. Прирост биомассы в стрессовых условиях выражали как Z к контролю, т.е. .; к росту каллуса данной
линии на неселективной среде.
•,
* .Морфогенный потенциал ткани оценивали визуально по шее-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 4 тибалыюй системе, по которой морфогенным считался каллус,
состоящий более чем на ЗОХ из плотных структурированных тканей.
Дня изучения влияния ионов кадмия на рост каллусних тканей или проростков пшеницы использовали сернокислый кадмия
CdSO+в концентрациях соответствующих содержанию ионов кадмия
в литре среды - 10,20,20,40 и 50 иг кадмия.
Клеточную селекции на устойчивость к ионам кадмия проводили по различным схемам. Для отбора клеточных линий, устойчивых к повышенным температурам, каллусные ткани помещали
в жидкую питательную среду и прогревали в ультратермостате
при температуре 4Б°С различное время при постоянном перемешивании. Пэсле прогревания ткани помещали на агаризованную среду VC и культивировали в обычных условиях. В дальнейшая прогревание повторяли несколько раз.
Оценку растений-регенерантов на устойчивость к стрессам
проводили методами индукции каллуса в стрессовых условиях.
Кроме того, устойчивость на уровне проростков определяли по
энергии прорастания семян в присутствии 50 ur/л Cd. жароустойчивость определяли по степени депрессии ростовых процессов
поело прогревания семян при 56"С 20 минут.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение влияния ионов кадмия на рост
каллусной ткани трех сортов пшеницы
Влияние различных концентраций ионов кадмия на рост каллусных тканей трех сортов пшеницы изучали на тканях, которые
находились в условиях in vitro более четырех месяцев. В этом
случае мы имели стабильно растущие каллусные ткани, обладающие высокой морфогенной способностью.
Культивирование эксплантов различных сортов пшеницы на
средах, содержащих достаточно высокие ( для пшеницы) концентрации кадмия в среде (10,20,80 и 40 иг/л) в течение одного
месяца дало неожиданный результат (Таблица 1).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
' . . • ' •
-
б
-
'•-'"• Таблица 1.
Влияние кадмия на рост и морфогенез каллусных
тканей трех сортов яровой пшеницы .
1—'—
1 в
Г А
1 Р
1 И
1 А
1 и
| Т
»
1 •.*.- (-90
1
U-21
i
1
1 При-|
I P0CTt
|каллу| X к
1 ЯРИ-t
| рост!
МП (каллу!
(-сов (конт.
1(мг) |
! К
1
1
1373.41 100
1+10.21
1 к .'•'
Г
——1
Б-139
\
| Ц>и-|
.|
| рост\
!
МП |каллу| X к |
.1
1
X К |
(-сов |конт. |
• 1(мг) 1
МП |
!-сов (конт. |
1(мг> 1
•- •
' 1
1
1
1
1
1+ 8,6|
1
1 - 1
1
1
100 |386.6( 100 | 86,6|321,2| 100 | 86.81
1+10.21
1
1
1
1
:
I lOCd (328.21 87.9 •95.01300.21 77.61 7В,б|351,3|109,4| 7t»7{
L+ 6.9J
it 7.3|
1
1
1
1
1+ 8.2|
1
I
1•:•':•'. l
l
. 1+10,11
1
92.3|298.4| 77.2| 68,91356.8Ц11,1| 64.71
I 2OCd |324,3| 86.8
1+6.81
i • '
|
1
• i
I ' .
1
•1
- *•• t
. 1
1 ,
i
1
1
1
1
1
! З О И1304.51 81,5 85,01265.9| 68.81 62.8|289,2| 90.0| 68.31
1+7.9|
|
1±6.4|
1+6.91
1
. 1
4
1
1
1
1
;
• 1
1
.
.
|
•
|
1
1 • . 1
1
1
i 40Cd (195.21 52.7 75.0|218.8( Б6;6| 59,4(258.81 80,6| 44.2 k
|
1+ 7,3|
1+7.41
|
1+7.01
I
II
1
1
1
1
Известно, что кадмий является одним из наиболее токсичных тяжелых металлов для растений. Однако, в нашем эксперименте повышение концентрации кадмия в среде от 10 до 20 иг/л
ве приводит к угнетению роста тканей для всех сортов пшеницы.
Больше того, данные концентрации стимулировали прирост каллусных клеток сорта Везенчукская 139. Только присутствие 40
мг/л Cd в среде приводит к снияению прироста ткани до 521 от
контроле для сорта Целинная-21 и до 56Х для сорта Дамсинская-
i
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 6 90. Рост клеток сорта Беэенчукекая-139 в этих условиях ингиСкровался только на 201.
Анализ морфогеиного потенциала тканей, росших в присутствии ионов кадмия показал, что увеличение концентрации кадмия
в среде приводит к существенному снижению морфогенной способкости тканей сорта Безенчукская-139 (44Z) и в меньшей степени
влияет на морфогенный потенциал тканей сорта Целинная-21
(76Х).
Таким образом, можно предположить, что рост каллусных
тканей сорта Бе8енчукская-139 в стрессовых условиях происходит в основном за счет прироста неморфогенных тканей и возможно, ва счет преобладания процессов растяжения над делением
клеток. Такое предположение мы можем сделать на основании того, что неморфогенная ткань пшеницы всегда состоит из крупных
вакуолизированных клеток. Можно предположить также, что морфогенные клетки сорта Целинная-21 проявляют большую устойчивость к ионам кадмия, чем клетки двух сортов твердой пшеницы.
На ваш взгляд, оценивать ответ культивируемых клеток пшеницы
ва токсическое действие ионов кадмия правильнее не по весовым
характеристикам, а по реакции морфогенных тканей, так как
именно в этих тканях происходит большинство деления клеток.
Больше того, нас интересуют клетки, способные делиться в
стрессовых условиях, а не переживать их.
Из литературных данных известно, что ионы тяжелых металлов могут ингиОировать деление клеток растения. Кроме того,
включаясь в клеточную стенку они могут снижать ее эластичность, что приводит к угнетению роста растяжением. Известны и
различные пути детоксикации ионов тяжелых металлов растительными клетками. Так как мы не научали Оиохимичесих и цитологических основ ответа на стресс, вызванный токсическими концентрациями ионов кадмия, мы вынуждены оценивать влияние
кадмия на клетки пшеницы только по иптегративным процессам
роста и морфогенеза. Можно предположить, что в наших экспериментах ионы кадмия в различной степени угнетают процесс деления клеток, но не ингибируют их растяжения.
Повторное культивирование тканей в стрессовых условиях
(см. диссертацию) подтвердило наше предположение о сортовых
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
различиях в ответеч на стресс, вызванный присутствием в среде
ионов кадмия.
Культивирование тканей в течение двух месяцев на кадмийсодержащих средах показало, что ткани сорта Целинная-21 в
присутствии 30 мг/д кадмия'в среде на 761 состоят из морфогенных тканей, тогда как морфо'генный потенциал тканей двух
других сортов в этих условиях равен нулю. Интенсивность роста
этих тканей равняется 50Х от контроля.
Таким образом,; на основании полученных результатов нами
выявлены сортовые различия в ответе на стресс, вызываемый ио- .
нами кадмия в среде. Исходя из этого, можно ранжировать испытанные сорта пшеницы по устойчивости к ионам кадмия в порядке
возрастания:: Беэенчукская -139, Дамсинская -90,. Целинная-21.
Влияние повышенных температур на рост каллуса
• •
••.••:"- •.-•••' '
• ,т р е х , с о р т о в п ш е н и ц ы .
.;>
•: : .*•:
Так как в нашу задачу входило сопоставление действия
двух стрессов , на рост каллусвых тканей различных сортов пшеницы (теплового и стресса вызываемого ионами кадмия) для изучения влияния тепловой обработки на каллусные клетки мы помешали каллусные ткани (4 пассаж) в жидкую питательную среду и
при постоянном перемешивании прогревали в ультратермостате
при температуре 45°С от 16 до 60 минут. После прогревания экспланты помещали .на свежую питательную среду (агариаованную)
и культивировали как обычно в течении месяца. В конце пассажа
экспланты взвешивали и определяли интенсивность.прироста ткани. Результаты данного эксперимента приведены на рисунке 1.
Иа представленных данных видно, что даже пятнадцатиминутное прогревание : клеток при 45°С приводит к значительному
снижению ростовых процессов у тканей сортов Дамсинская-90 и
Целинная-21 ( на 30Z). В то время как клетки сорта Беэенчукская- 139 снижают. прирост только на 131. Увеличение времени
тепловой обработки каллусных клеток приводит к дальнейшему
снижению ростовых процессов.
. •
Интересно, что наблюдаются сортовые различия по динамике
угнетения роста тканей в зависимости от времени прогревания.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 8 Рис. 1 Влияние высокой температуры на рост
трех сортов яровой пшеницы
15,...60 время экспозиции
о
is
за
«
ео
Так для клеток сорта Дамсинская до характерно равномерное
снижение интенсивности «роста в зависимости от времени тепловой обработки после«редкого спада, вызванного пятнадцатиминутным прогреванием. Клетки сорта Целинная-21 также резко реагируют на перваё 16 минут прогревания, но дальнейшее
увеличение времен» обработки до 45 минут приводит к снижению
ростовых процессов только на вх. Дополнительные 15 минут
прогревания привадят к дальнейшему угнетению роста на 12Х.
Прогревание°какяусных тканей сорта Беэенчукская-139 не приводит к значительному снижению интенсивности ростовых процессов, так •прогревание тканей до 45 минут снижает прирост только на 23R. Увеличение периода прогревания тканей на 15 минут
приводит к угнетению роста на 20Х.
Оценивая полученные данные, мы можем предположить, что
при прогревании тканей часть клеток, чувствительных к температурному стрессу,
погибает и увеличение времени обработки
приводит к увеличению числа погибших клеток. Динамика этого
процесса зависит от термотолерантности сорта. Так клетки сорита Безенчукская-139 проявили наибольшую устойчивость к тепло-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
вому стрессу.
.
Морфогенный потенциал (МП) тканей, образовавшихся после
прогревания, равномерно снижается с увеличением времени обработки, причем снижение морфогенных потенциалов тканей твердых
сортов пшеницы не: различается междусобой. В то время как
прогревание тканей сорта Целинная-21 в течение 4,5 минут приводит к снижению морфогенвого потенциала до 40Х, причем МП
тканей Беэенчукская-139 и Дамсинская-90 ;составляет 58 и 62Х
соответственно.
;
,
На основании результатов по ингибированию ростовых процессов и по изменению морфогеиного потенциала тканей после
прогревания можно предположить, что морфогенные клетки сорта
Целинная-21 более чувствительны к тепловому стрессу, чем морфогенные клетки сортов Беэенчукская-139 и Дамсинская-90.
#
Таким образом нами установлено,- что клетки испытанных
нами сортов обладают различной чувствительностью к двум абиотическим стрессам. Так сорт Целинная-21 проявляет большую устойчивость к ионам кадмия, но более чувствителен к тепловому
стрессу. Клетки твердых сортовпшеницы более устойчивы к тепловому стрессу, чем клетки сорта Целинвйя-21, что подтверждает данные Wang and Nguen ( 1989) о корреляции генотипических
различий в термотолерантности на клеточном уровне я на уровне
целого растения. Ведь известно, что тетраплоидные сорта пшеницы обладают большей жароустойчивостью по сравнению с гекv
:
сапловдными.'
';,,;':- , ч-\- -'
*••*'!-~''"-: -V' .-\'-".Г. -у ''•.
Шэтому постановка задачи создания устойчивых к тепловому стрессу растений /методами селекции', устойчивых клеток
представляется совершенно правомерной.'. Болы» того, существуют исследования, в которых обсуждается возможность приобретения устойчивости к повышенным температурам при клеточной селекции на устойчивость к ионам кадмия (Bin Huang and
P. a Qoldsbrough 1988).
'•
Влияние ионов кадмия на формирование -каллусной ткани
из незрелых зародышей рааличных сортов пшеницы. Нами было изучено влияние сублетальных концентраций ио-
-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 10 нов кодииа ва процесс дедифференциации клеток незрелого зародыша различных сортов пшеницы. Как уже отмечалось, эксплантации служили
ззродьаш шпеницы на 14-16 день после опыления.
Следует отметить, что в это время размеры зародышей составляют примерно 1,6 - 2 мм. и весят они около 6 мг. Результаты
изучения влияния ионов кадмия на процесс дедифференциации
приведены в таблице 2.
Следует отметить, что в отсутствии кадмия в среде индукция' каллуса у всех сортов пшеницы происходит со 100 процентной частотой и вес экспланта в конце пассажа увеличивается в
среднем в 13-16 раз в зависимости от сорта. В присутствии ионов кадмия,также как и в эксперименте с дедиффереяцированными
клетками, не происходит значительного угнетения роста калдусноЯ ткани. Увеличение биомассы в конце пассажа для сортов Целинная- 21 и Дамсинская-90 составляет примерно 80Z от контро<ля. И
только для сорта Везекчукская-139 прирост ткани
составляет 58Z от контроля, что свидетельствует о его чувствительности к данному стрессу.
Таблица 2.
Индукция каллуса в стрессовых условиях
|
Контроль
|
СМ(10мг/Л)
I прирост! Хморф. jприрост |
I
1 (иг) 1 калл.
(мг) 1 кон. !
хморф. |
калл. |
Ц-21
I 60,06 | 63,22
1 ±2.44 ±3,87
66,16
•1,87
32.78 *|
12,93 |
Д-90
| 73.88
1 ±3.00
Сорт
X К !
!
| 81,27
/
1
1
78,60
±2,69
68,93
±2,41
1
В-139 1 81.33 73,33 I 52,36
1 +3.76 1 t3.45 1 +2,76
79,76
20,37 |
±2,35 |
1 16,61 |
1 68,40 1 .+1.40 |
1
Наиболее убедительными данными о генотипических
особен-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
. ••
-.
•'
ч
-
д.
•
•
.
• : . • • • " •
•-
'••••;-•
1
1
-
-
-.
-•
.
. . • ' . -
ностях ответа на ионы кадмия, на наш взгляд, такая» как и в
случае с культивируемыми клетками пшеницы, являются данные о
морфогенетических способностях полученных тканей. Мы видим,
что морфогенный потенциал тканей твердых сортов пшеницы в отсутствии стресса (78 и 73Х) превосходит морфогенный потенциал
ткани сорта Целинная-21 (S3X). Индукция каллуса в стрессовых
условиях (10 мг /л Cd ) существенным образом снижает морфогенный потенциал образующихся тканей, особенно у твердых сортов пшеницы. Так, если морфогенный потенциал тканей сорта Целинная -21 в стрессовых условиях снижается на 20Х, то
морфогенный потенциал сортов Дамеинская-90 и Беэенчукская-139
•
с н и ж а е т с я
н а6 7 - 6 8 2 . %
'.'.'
' ( '.••".".;•-^ ..•'-•'•"•,••"'•
•
•
;•
•••
Результаты этого эксперимента подтвердили наше предполо. иение о различной чувствительности!к ионам кадмия клеток раа; личных сортов пшеницы и, что устойчивость сортов возрастает в
ряду Везенчукская-139, Дамсинская-9О,Целинная-21.
изучение влияния прогревания незрелых зародышей
на формирование каллусных тканей.
•
.
/Для изучения влияния теполового стресса на формирование ,
/каллусных тканей незрелыми зародышами трех сортов пшеницы,
зародыши на 14-16 день после цветения изолировали в стерильных условиях и инкубировали в жидкой питательной среде UC в
ультратермотате при .температуре 46 С в течение 30 или 60 минут. После чего зародыши помещали на агаривованную среду МО
для индукции каллусной ткани и культивировали в течение месяца в обычных условиях. Взвешивание тканей в конце пассажа показало (Таблица 3), что тепловая обработка незрелых зародышей
; приводит к снижению эффективности образования каллусных тканей. Тридцатиминутное прогревание зародышей приводит к игибированию процесса дедифференциации в большей степени у сорта
Беэенчукская 139 (67Х), чем у двух других сортов. Прогревание
в течение часа приводит к дальнейшему угнетению каллусогенева, причем индукция каллуса у сортов твердых пшениц угнетается в несколько большей степени, чем у сорта Целинная-21.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 12 Таблица
Влияние высокой температуры на индукцию каллуса
Контроль!
45вС-30м
45"С-60м
I При-1
I
I При-|
|
| pocrl Z к | МП
|калл. |контр |
I (мг)|
| рост! z к | Ш1
|калл. |контр |
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I
I (мг)1
Ц-21 | б9.57|2д,68|бб,33|79,53|10.93|48,11|б9,15| о
+2,1б|±2,37|+1.47|
|±0,34|+g.63|
|
Д-90 | 61,88155,20|50,16|81.06|35,34|38,40|62,02|28,29|
+1,77|+3,34|+3,22|
U2.391+3,231
|±0.68|
I
I
I
I
I
I
I
I
В-139Ц01,80198,41168,48|67.27|73,81162.90|61,78|б8.18|
+3,691+1,291+3.68|
1+2.031+3,431
1+3.9Ц
I
I
I
I
I
I
I
I
Из представленных в таблице данных видно, однако, что
тепловая предобработка зародышей перед индукцией каллуса существенным образом влияет на морфогенные способности образовавшейся каллусной ткани. Так прогревание зародышей в течение
30 минут приводит к снижению морфогенного потенциала у всех
сортов примерно на 201. Тогда как предобработка в течение часа
приводит к снижению морфогенного потенциала у сортов твердых
пшениц на 7Х, а у сорта Целинная -21 приводит к образованию
только неморфогенного каллуса. Пэвидимому при прогревании зародышей погибают те клетки, которые дают начало морфогенному
каллусу, и вероятно, эти клетки у сорта Целинная-21 более
чувствительны к тепловому стрессу.
Результаты данного эксперимента подтверждают наше предположение о том, что клетки сорта Безенчукская-139 превосходят по устойчивости к тепловому стрессу клетки сортов Дам-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 13 -
синская-90 и Целинная-21.
Клеточная селекция на устойчивость к ионам кадмия.
Основываясь на полученных данных мы провели клеточную
селекцию на устойчивость к ионам кадмия на трех сортах пшеницы. Клеточную селекцию проводили по различным схемам. Основным принципом селекции являлось культивирование в стрессовых
условиях в течение трех пассажей (первый этап), ватем второй
этап селекции - возврат в неселективные условия (три пассажа)
и следупцие три пассажа культивирование в селективных условиТаОлица 4.
Результат селекции клеточных линий,
устойчивых к кадмию
1
1
1
|
1Селективный|Число|
Сорт
фактор
Число
X фертиль. |
| линий | per. раст. растений(1?о)
| Б-139
10мг/л Cd
1
3
0
1
1
1 Д-90
Юнг/л Cd
3
33
36.36
|
1 Ц-21
Юмг/л Cd
5
75
48,00
|
20МГ/Л Cd
3
21
28,67
|
ЗОмг/л Cd
1
3
0
I
1
1
I
1
1
|
ях (третий этап). Первый вариант - селекция в мягких селективных условиях, когда культивирование тканей проводили при
концентрации 10 мг/л Cd в среде на первом и третьем этапах
селекции. Второй вариант селекции состоял в отборе клеточных
линий на концентрации 20 мг/л кадмия на первом и третьем этапах селекции.
Третий вариант селекции начинался с 10 мг/л
кадмия в среде, по в дальнейшем концентрация увеличивалась па
10 мг/л в каждим последующем пасеала (т.е. 20 и 30 мг/д).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
•
•
•
•
•
•
•
•
.
"
•
.
.
•
-
•
"
•
-
:
'
•
•
•
:
•
•
.
.
'
•
•
•
\
-
Пэсле культивирования в неселективных условиях ткани культивировали в присутствии 30 мг/л Cd.
•
В результате клеточной селекции нами были отобраны устойчивые клеточные линии и получены из них растения-регене- •;
ранта Результаты селекции приведены в таблице 4.
Из представленных в таблице данных видно, что для сортов
твердой пшеницы только мягкие условия селекции позволили вы- ,
делить клеточные линии способные расти в присутствии ионов
кадмия. Больше того, растения-регенеранты, полученные ю устойчивой клеточной ' линии сорта Бэзенчукская-139 оказались
стерилиными. Кроме того, проведение селекции в более жестких
условиях на клетках сорта Целинная-21 приводит к уменьшению
числа отобранных линий (но, вероятно, к повышению вероятности
отбора истинно устойчивых линий) и к возрастанию стерильности
полученных растений.
- '-,"•" " ;. \
',
Клеточная селекция на устойчивость к повышенным
температурам.
Для отбора клеточных линий, устойчивых к тепловому
стрессу мы проводили отбор по различным схемам. Первым вариантом была моношаговая селекция, когда экспланты в четвертом
пассаже подвергали однократному прогреванию ( 45°С различные
периоды времени), после чего культивировали эксплант в обычных условиях в течение месяца и затем переносили на среду для
регенерации растений. В этом случае трудно было рассчитывать
на отбор устойчивых форм, но этот эксперимент позволил нам
оценить влияние тепловой обработки на реализацию морфогенетических способностей тканей. Так нами обнаружено, что для сортов Целинная-21 и Беэенчукская-139 прогревание морфогенного
каллуса 45.С в течение 30-45 минут прозволяет повысить выход,
растений-регенерантов. v
, ',
многошаговая селекция/включала трехкратное прогревание,
чередующееся с культивированием в обычных условиях. В первом
варианте многошаговой селекции ткани прогревали при 45 С
трижды по 15 минут. Второй вариант состоял из трехкратного
прогревания по 45.минут и третий вариант селекции состоял в
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 15 постепенноы увеличении времени прогревания т.е.первое прогревание - 16 минут, второе-45 минут и третье -60 минут.
Оценка интенсивности роста каллусных тканей после каждого прогревания (см. диссертацию) показала, что ужа после
третьего прогревания, независимо от длительности, наблюдается
тенденция к селекции клеток с повышенной адаптивной способностью. Это выражается в увеличении прироста ткани в сравнении с интенсивностью роста после предыдущей обработки. В этом
случае мы не можем утверждать, что отобрали термотолерантныэ
линии, но можем говорить оО их повышенных адаптивных способностях. Результаты данного эксперимента проведенного на клетках сорта Целинная -21 приведены в таблице &. Из представленных данных видно, что ужесточение условий селекции приводит к
снижению числа полученных растений-регенерантов.
Таблица 5.
многошаговая селекция клеток сорта Целинная-21
Нэмер
линий
1 Число
1per раст.
Схема селекции
Z фертиль. 1
растений( Ro)
Т6
16MJOF-
0 -1Бмин- 0 -15ыин - 0
22
72,7
|
Т4
45мин- 0 -45мин- 0 -45мия - 0
20
50,0
|
50.0
|
те
| 15мин- 0
-45МИН-
0
-60МИН
-0
14
1
Оценка растений регенератов методом
индукции каллуса в стрессовых условиях.
Как уже отмечалось, анализ растений-регенерантов мы проводили различными косвенными методами. К сожалению ввиду ограниченности во времени нам удалось проанализировать только
часть полученных растений-регенерантов. Кроме того, следует
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
;
-
'
•
•
-
16
-
отметить, что мы не могли иметь материал в достаточном количестве для корректной статистической обработки результатов по
оценке регенерантов. мы были вынуждены использовать по 30-50
семян в экспериментах по энергии прорастания и по 20-30 зародышей для индукции каллуса. Кроме того, мы понимаем, что
оценка растений двумя косвенными методами не позволяет нам
говорить о С истинной устойчивости, н о позволяют оценить тенденцию.'
.*•
•
•• •' "
'-.'.•'.••-•.••'
индукция каллуса из незрелых зародышей растений-регенерантов в стрессовых условиях позволяет оценить растение-регенерант на сохранение признака устойчивости на клеточном уровне и позволяет оценить возможность передачи этого признака
потомству.
-.'>'•'
'
'
мы оценили часть растений регенерантов сортов Целинная 21 и Дамсинская-90 на устойчивость к ионам кадмия при индукции каллуса в присутствии ю мг/л Cd. Результаты проверки
представлены на рисунке 2а. Иа регенерантов, сорта Ц-21, полученных из трех клеточных линий (К-1, К-2 и К-3), только ре- ;
генерант из линии К-3 способен индуцировать каллус в присутствии 10 мг/л Cd так же, как и в контроле. Эта линия была
получена в результате селекции на 20 мг/л Cd. Кроме того, у
регенеранта, полученного из устойчивой линии 0-2 сорта Дам-.
синская-90 индукция каллуса в стрессовых условиях превосходит
по эффективности каллусогенез в контроле. Это обстоятельство ,
свидетельствует об устойчивости клеток этого регенеранта, а
если учитывать, что ткань зародыша является следующим поколением данного регенеранта, то можно утверждать, . что устойчивость к ионам кадмия, проявляющаяся на клеточном уровне, наследуется. Следует -отметить,
что морфогенный •;' потенциал
кадлусных тканей,образовавшихся в стрессовых условиях, у растений регенерантов превышал контроль.т , . * : ; , . ; ;> . '
для анализа растений, полученных из клеток, способных к
делению после трехкратных прогреваний, мы проводили индукцию
каллуса из зародышей после прогревания 45 С в;течение 30 и 60
минут. Из представленных на рисунке 26;данных видно, что у
полученного из линии Т-4 регенеранта сорта Целинная-21, прогревание зародышей - в течение 30 минут не влияет на
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 17 Рис. 2а Анализ растений-регенерантов методом индукции каллуса
в нормальных и стрессовых условиях
Ц-21.О-9О
К-1....С-2
со
исходные сорта
селективные линии
ТУ
ш-
—
у
у —
-
у
у
у
У
*
у
у
У
У
у
У
S
у
у
у
У
у
II
*
—
у
у
j .
у
У
у
у
—
у
У
у
у
V
У
у
—
у
7
у
у
у
*
У
—
*
*
"
у
—
"И
•
*
~
~
~
~
~
—
—
у
у
—
'у
у
у
У
'''
's
у
—
—
у
K-I
К-2
D-eo сн
с-2
ц-а
к-з
Рис.26 Анализ растении-регенерантов методой индукции каллуса
из зародышей,обработанных высокой температурой
Ц-21
Т-4.Т-6
исходный сорт
селективные линии
75
4S
/У
1
• ' у
• ' у
У
'
•у у
У У
•У У
У.
— —
' * У
ча.
^контроль
§4б"С.ЗОм экспозиции
ЕШ45"С,6Ом экспозиции
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
•'
••
.
•
-
•-
.
'
-
•
•
'
•
•
"
1
8
"
•
.'
•
"
•
'
.
?
•
' • •
•
-
.
.
'
•
'
•
"
•
•
каллуса, а прогревание в течение 60 минут только немного снижает эффективность каллусогенеза. Эта линия была выделена
после трёхкратного прогревания каллусных тканей 45° С по 45
минут. Таким образом можно утверждать, что такой способ позволяет отобрать клеточные линии с повышенной термотолерантностью и толерантность на клеточном уровне наследуется. - "••;.•
.
Оценка растений-регенерантов по энергии прорастания
:
семян в стрессовых условиях.
•,'•:
(
, Для нас было необходимо убедиться в том, что признак устойчивости, отобранный на клеточном уровне, экспрессируется
на уровне целого растения. Поэтому устойчивость растений-регенерантов к тепловому стрессу определяли по степени депрессии ростовых процессов после прогревания семян при 66 С 20
мин. ( Волкова и Моткалюк, 1976). На рисунке За представлены
результаты такой оценки, мы обнаружили, что семена регенеран.та сорта Целинная-21, полученного из устойчивой клеточной линии Т-4 и сохранившего признак устойсивости на клеточном
уровне, прогревание •.. не ивтибирует, а стимулирует ростовые
процессы. Так длина корня и длина.побега после прогревания
превосходит не только контроль, но и исходный сорт. На основании этого можно заключить, что прямая селекция на устойчивость к тепловому .стрессу на клеточном уровне позволяет содавать новые формы. превосходящие по /устойчивости исходный
С О Р Т .
•
'
'•
.';
.•'-..••-'
^
•
•
'
.
-
•
'
•
_
•
;
•'".;•;.
..
Устойчивость к ионам кадмия оценивали по энергии прорастания семян растений регенерантов в присутствии 5 0 мг/л СМ и
сравнивали сухой вес корней и побегов в контроле и в опыте.
Результаты экспериментов показали (Рис. 36), что все испытанные растения- регенеранты сорта Целинная-21 обнаруживают
признаки устойчивости. У всех регенерантов накопление биомассы в стрессовых условиях превосходят контроль.. У регенерантов
сорта Дамсинская-90 ионы кадмия не угнетают рост корней, но
немного снижают рост проростка, даже у регенеранта,проявившего признаки устойчивости на клеточном уровне (С-2). Конечно,
для окончательной оценки, растений регенерантов необходимы ис-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 19 -
Рис. За Анализ растений-регенерантов методом прорастания семян
g£] корни: контроль
Ц-21
исходный сорт
§ корни: 66° С. 20м экспозиции
Т-4.Т-Б.Т-6 селективные линии
^ п о б е г и : контроль
gg побеги: 66"С.20м экспозиции
75
ео
Т-5
Т-Ъ
Рис.30
Анализ растений-регенерантов методом прорастания семян
в нормальных и стрессовых условиях
ЕЭ корни воде
Ц-21,0-90 исходные сорта
§ корни в 50мг/я Cd
К-1....С-2 селективные линии
^ п о б е г и в воде
Bffl побеги в БОмг/л Cd
is
12
Т- 9
\1
I
К2
к-з
IKCI
С-1
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
'
,
..- г о -• '
:- •
Рис.4а Оценка перекрёстной устойчивости Cd-селективных линий
Е Э корни: контроль
.
е
Ц-21,0-90 исходные сорта • g корни: 56 С,20м экспоэицин
К-1,,,.0-2 оелективные линии
$ 3 побеги: контроль
| побеги: 66" С, 20м экспозиции
в
д-а.
и
•
СЛ
С-2
Рис. 46 Оценка перекрёстной устойчивости жаро-селективных линий
* Ейкорни в воде
Ц-21
исходный сорт
.
§ корни в БОмг/л Cd
Т-4.Т-6 селективные линии
. ' ^ п о б е г и в воде
Шпобеги в 50мг/л Од
Д.-21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 21 питания, позволяющие
оценить не только устойчивость, но и
продуктивность. Однако уже сейчас можно сказать, что селекция
на клеточной уровне на устойчивость к ионам кадмия позволяет
отбирать генотипы, способные противостоять токсическому действию ионов кадмия.
Оценка растений-регенерантов на наличие
перекрестной устойчивости.
'
Как мы отмечали ранее, в литературе Сыло сообщение о
возможности получения температуроустойчивых клеточных линий
при отборе на устойчивость к ионам кадмия (Bin Huang and
Goldsbrough,1988). Пэзтому для нас было важно оценить растения регенеранты на наличие перекрестной устойчивости, то
есть, оценить растения, полученные из температуровыносливых
линий на устойчивость к ионам кадмия и наоборот. Результаты
такой оценки представлены на рисунке 4 (а)и (б). Как видно из
рисунка 4 (а) ни один из регенерантов сорта Целинная-21, полученных из устойчивых к кадмию клеток, не показал устойчивости к повышенным температурам. Однако регенеранты сорта
Дамсинская-90 и С-1 и особенно С-2 показали, что повышенные
температуры не угнетают ростовых процессов, из чего можно
заключить, что у этих форм устойчивость к ионам кадмия сочетается с устойчивостью к повышенным температурам.
Из регенерантов сорта Целинная-21, полученных из температуровыносливых клеток, только у растения из линии Т-б накопление биомассы в присутствии ионов кадмия почти не угнетается, что может свидетельствовать в пользу его толерантности
к ионам кадмия. Для детального анализа механизмов устойчивости растений-регенерантов необходимы дополнительные исследования.
ВЫВОДЫ
1. На основании изучения влияния ионов кадмия на рост и
морфогенез каллусных тканей пшеницы испытанные в данной рабо-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
i
;
•
.
-
_
•
•
•
' ,
•
-
2
2
:
•
-
•;-•
.
•
•
-
•
,
:
•
.
•
те сорта ю ю расположить в ряд в порядке возрастания устойчивости: Безенчукская-139, Дамснвская-90, Цвлошная-21.
2. Оценка устойчивости к тепловому стрессу на клеточном
уровне позволила ранжировать испытанные сорта а порядке возрастания устойчивости: Целинная-21, Дамсииская-90, Везенчукск а а - 1 Э 9 .
,•;•
.
,.
' \
". • •'
"/
.'•
-'
'
..
•
••'.•,
"
'
'
'
''
а Клеточная селекция на устойчивость к ионам кадмия
позволяет создавать формы, у которых признак устойчивости экспрессируется на клеточной уровне и на уровне целого растения
;
и передется следупаэму поколении:..".,
: ;
:
4. Трехкратное прогревание каыусных тканей пшеницы при
температуре 46 С в течение 46 минут, чередующееся с субкультивированием в обычных условиях, позволяет создать стабильные, наследуемые температуротолерантные формы.
б. На базе сомаклональной вариабельности возможно создание генотипов
с комплексной устойчивостью к абиотическим
с т р е с с а м .
• *•.
•
•
•
- . . ' - .
П у б л и к а ц и и .
-'".•••'..';.••
.''..'•'•'
••'•.,
:
.- " - . , . ' . - /
..,;-.'••-••••••.-..'-•
• "• "
-.-.
-
• .-"• - -
•."'.::
4
.;-..••','.
-'••••,."."'•'-'•
Нгуен Тхи Ли Ань, Юкифорова Л Д.,"Влияние ионов тяжелых
металлов(кадмия) на рост и морфогенез каллусных тканей яровой
пшеницы", тезисы, межвузовской конференции по фивиологии растений и биотехнологии, Москва, 1994. f
; '' •
:
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Объем 1',. п л
Тираж 100
Заказ 14Ь
Типография Московской с х академии им К А Тимирязева
127550 г Москва И 5"0 Тимирязевская ул, 44
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
9
Размер файла
1 046 Кб
Теги
563
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа