close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

97

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
ГОУ ВПО
УФИМСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ
ЭКОНОМИКИ И СЕРВИСА
Кафедра «Охрана окружающей среды
и рациональное использование природных ресурсов»
ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ
Методические указания
по выполнению лабораторных работ
Уфа - 2011
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Составитель: Г.М. Абдюкова
УДК 579(075.8)
ББК 28.4я73
О 75
Основы микробиологии и биотехнологии: Методические указания по
выполнению лабораторных работ / Сост.: Г.М. Абдюкова. – Уфа: Уфимская
государственная академия экономики и сервиса, 2011. – 58 с.
В Методические указания по выполнению лабораторных работ по курсу
«Основы микробиологии и биотехнологии» включены задания, цель которых
привить студентам навыки работы в лаборатории с микроорганизмами,
изучить их морфологию и физиологические свойства, а также освоить методы
микробиологического исследования объектов окружающей среды.
Предназначены для студентов специальности 280201.65 Охрана
окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов и
направления подготовки бакалавров 280200.62 Защита окружающей среды.
Рецензент: канд. биол. наук, доцент УфНИИ медицины труда и экологии
человека Хуснаризанова Р.Ф.
© Абдюкова Г.М., 2011
© Уфимская государственная академия
экономики и сервиса, 2011
2
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
СОДЕРЖАНИЕ
Правила по технике безопасности при работе
в микробиологической лаборатории…………………………………………...….4
Тема 1. Микроскоп и техника микроскопирования …………………….……….5
Тема 2. Методы культивирования микроорганизмов……………………..……21
Тема 3. Влияние факторов внешней среды на жизнедеятельность
микроорганизмов…………………………………………………………….……32
Тема 4. Превращение микроорганизмами соединений углерода…………...….37
Тема 5. Микробиологические методы исследования объектов
окружающей среды………………………………………………………………..51
Список литературы……………………………………………………..…………57
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ПРАВИЛА ПО ТЕХНИКЕ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ В
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
Работа в микробиологической лаборатории требует строго соблюдения
специальных правил:
1. Не входить в лабораторию в пальто, головном уборе, не вносить
посторонние вещи.
2. Каждый студент в микробиологической лаборатории работает на
постоянном месте, выполняя задания индивидуально. На рабочем месте не
должно быть посторонних предметов.
3. Приступать к занятиям только надев хлопчатобумажный халат.
Длинные волосы должны быть подобраны, во избежание их попадания в пламя
горелки.
4. В лаборатории не разрешается, принимать пищу, курить, делать
прерывистые движения.
5. Строго соблюдать правила обращения с химическими реактивами и
красителями.
6. С большой осторожностью пользоваться смесью спирта с эфиром, не
переносить ее на столы с горелками.
7. На посуде, применяющейся для культивирования микроорганизмов,
должны быть сделаны надписи, содержащие родовое и видовое название
культуры, дату засева, фамилию студента, номер группы.
8. Поскольку некоторые микроорганизмы, особенно споры грибов,
являются аллергенами, не допускать их распыления.
9. Все предметы, использованные при работе с живыми культурами,
должны быть обезврежены либо обжиганием в пламени горелки, либо
погружены в дезинфицирующий раствор (1% -ный раствор хлорамина или 3%ный раствор фенола).
10. В лаборатории поддерживать порядок и чистоту. По окончании
занятий протирать иммерсионный объектив микроскопа мягкой тканью,
накрывать микроскоп полиэтиленовым чехлом, приводить в порядок рабочее
место, мыть руки.
11. Помнить о том, что студенты несут ответственность за используемые
ими микроскопы, другое лабораторное оборудование, чистоту рабочего места.
12. Перед уходом из лаборатории дежурному проверять, выключены ли
вода, электроприборы.
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ТЕМА 1. МИКРОСКОП И ТЕХНИКА МИКРОСКОПИРОВАНИЯ
Изучение невидимых невооруженным глазом клеток микроорганизмов,
размеры которых не превышают десятков и сотен микрометров (1 мкм = 0,001
мм), возможно только при помощи микроскопов (от греч. mikros – малый,
skopeo – смотрю). Микроскопы позволяют обеспечивать увеличение
исследуемых объектов в сотни (световая микроскопия) и в десятки – сотни
тысяч раз (электронная микроскопия) раз.
Изображение в световом микроскопе формируется вследствие того, что
объект и различные элементы его структуры избирательно поглощают свет с
различной длиной волны (абсорбционный контраст) или вследствие изменения
фазы световой волны при прохождении света через объект (фазовый
контраст).
При
помощи
микроскопа
изучают
морфологию
клеток
микроорганизмов, их рост и развитие, проводят первичную идентификацию
(от лат. identificare – отождествление) исследуемых организмов, ведут
наблюдения за характером развития микробных ценозов в субстратах.
Микроскоп (рис. 1) состоит из двух частей: механической (подсобной) и
оптической (главной). Механическая часть микроскопа относят: штатив,
предметный столик и тубус (трубу).
Рис. 1. Микроскоп МБР-1:
1) – подковообразное основание микроскопа; 2 – предметный столик; 3 – винты для
перемещения предметного столика; 4 – клеммы прижимающие препарат;
5 – конденсор; 6 – кронштейн; 7 – винт укрепляющий конденсор в гильзе;
8 – рукоятка перемещения конденсора; 9 – рукоятка ирисовой диафрагмы конденсора;
10 – зеркало; 11 – тубудержатель; 12 – рукоятка макрометрического винта;
13 – рукоятка микрометрического винта; 14 – револьвер; 15 – объективы;
16 – наклонный тубус; 17 – винт для крепления тубуса; 18 – окуляр
5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Штатив имеет основание в виде подковы и колонку (тубусодержатель)
в форме дуги. К нему примыкают коробка механизмов, система зубчатых
колес для регуляции положения тубуса. Система приводится в движение
вращением макрометрического и микрометрического винтов.
Макрометрический винт (кремальера, зубчатка, макровинт) служит для
предварительной ориентировочной установки изображения рассматриваемого
объекта. Микрометрический винт (микровинт) используют для последующей
четкой установки на фокус. При полном повороте микровинта труба
передвигается на 0,1 мм (100 мкм). При вращении винтов по часовой стрелке
труба опускается по направлению к препарату, при вращении против часовой
стрелки — поднимается от препарата.
Предметный столик служит для размещения на нем препарата с
объектом исследования. Предметный столик вращается и перемещается во
взаимно перпендикулярных плоскостях с помощью винтов. В центре столика
находится круглое отверстие для освещения препарата снизу лучами света,
направляемыми зеркалом микроскопа. В столик вмонтированы два зажима
(клеммы) - пружинящие металлические пластинки, предназначенные для
закрепления препарата. Если необходимо исследовать поверхность препарата,
не допуская пропусков (что важно при подсчете), или же если во время работы
требуется повторное исследование какого-либо определенного участка на
препарате, на предметный столик помещают препаратоводителъ. На нем
имеется система линеек — нониусов, с помощью которых можно присвоить
координаты любой точке исследуемого объекта. Для этого при установке
препаратоводителя следует совместить центр вращения столика и оптическую
ось системы микроскопа с центрировочной пластинкой препаратоводителя.
Тубус (труба) — оправа, в которую заключены элементы оптической
системы микроскопа. К нижней части тубуса прикрепляется револьвер
(объективодержатель) с гнездами для объективов.
Оптическая часть микроскопа состоит из основного оптического узла
(объектив и окуляр) и вспомогательной осветительной системы (зеркало и
кондесор). Все части оптической системы строго центрированы относительно
друг друга. Во многих современных микроскопах зеркало и конденсор
заменены вмонтированным в прибор регулируемым источником света.
Осветительная система находится под предметным столиком. Зеркало
отражает падающий на него свет в конденсор. Одна сторона зеркала плоская,
другая - вогнутая. При работе с конденсором необходимо пользоваться только
плоским зеркалом. Вогнутое зеркало применяют при работе без конденсора с
объективами малых увеличений. Конденсор (от лат. сопdenso – уплотняю,
сгущаю), состоящий из 2–3 короткофокусных линз, собирает лучи, идущие от
зеркала, и направляет их на объект. Конденсор необходим, прежде всего, при
работе с иммерсионной системой. Линзы конденсора вмонтированы в
металлическую оправу, соединенную с зубчатым механизмом, позволяющим
перемещать конденсор вверх и вниз специальным винтом. Для регулировки
интенсивности освещения в конденсоре есть ирисовая (лепестковая)
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
диафрагма, состоящая из стальных серповидных пластинок. Окрашенные
препараты лучше рассматривать при почти полностью открытой диафрагме,
неокрашенные – при уменьшенном отверстии диафрагмы.
Объектив (от лат. objectum – предмет) – наиболее важная часть
микроскопа. Это многолинзовая короткофокусная система, от качества
которой зависит в основном изображение объекта. Наружная линза,
обращенная плоской стороной к препарату, называется фронтальной. Именно
она обеспечивает увеличение. Остальные линзы в системе объектива выполняют преимущественно функции коррекции оптических недостатков,
возникающих при исследовании объектов.
Объективы бывают сухие и погружные (иммерсионные). При работе с
сухими объективами между фронтальной линзой объектива и объектом
исследования находится воздух. Оптический расчет иммерсионных объективов
предусматривает их работу при погружении фронтальной линзы объектива в
жидкую однородную среду. При работе с сухим объективом вследствие
разницы между показателями преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0) часть
световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя. При работе с
иммерсионным объективом необходимо поместить между покровным стеклом
и линзами объектива кедровое масло, показатель преломления которого
близок к показателю преломления стекла.
Окуляр состоит из двух линз, заключенных в общую металлическую
оправу. Верхняя линза называется глазной, нижняя – собирательной.
Биологические микроскопы снабжены тремя сменными окулярами. На оправе
верхней линзы окуляра указано его собственное увеличение. Обычно окуляры
дают увеличение в 7, 10, 15 раз. Окуляр увеличивает изображение, данное
объективом. Микроскоп, таким образом, дает обратное увеличенное
изображение предмета. Общее увеличение объекта, даваемое микроскопом,
равно произведению увеличений объектива и окуляра. Например, применяя
объектив 8 и окуляр 10, общее увеличение микроскопа будет равно 80, при
объективе 40 и окуляре 10–400, при объективе 90 и том же окуляре – 900.
Помимо микроскопии, с помощью биологического микроскопа для
улучшения изображения, расширения границ видимости применяют и другие
методы микроскопирования. Иногда, например, требуется узнать пространственную форму предмета. Чтобы изображение стало рельефно-объемным,
стереоскопическим, предмет нужно рассматривать одновременно двумя
глазами. Для этой цели применяют специальный бинокулярный микроскоп с
парными окулярами (рис. 2).
Широкое распространение в специальных методах исследования
получили фазово-контрастная, люминесцентная и электронная микроскопия.
Для фазово-контрастной микроскопии применяют специальное фазовоконтрастное устройство, позволяющее видеть контрастное изображение
живых микроорганизмов. Устройство состоит из набора фазовых объективов,
обозначенных «О». Метод основан на том, что отдельные участки
исследуемой клетки отличаются по показателю преломления, поэтому свет,
7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
проходящий через них, распространяется с разной скоростью, что выражается
в различной яркости изображения отдельных участков. Вследствие этого
изображение получается контрастным.
Рис. 2. Бинокулярный микроскоп
1 – окуляры; 2 – бинокулярная насадка; 3 – револьверное устройство; 4 – объектив;
5 – предметный столик; 6 – конденсор; 7 – корпус коллекторной линзы
При люминесцентной микроскопии препарат рассматривается в свете,
излучаемом самим объектом во время облучения его ультрафиолетовыми
лучами (явление флюоресценции). При этом наблюдается разнообразное
свечение отдельных элементов рассматриваемого объекта в зависимости от их
химической природы. Если собственное свечение объекта невелико или его
нет, то приходится препарат обрабатывать флюоресцирующими красителями,
т. е. получать вторичную флюоресценцию.
Явление флюоресценции можно вызвать при облучении объекта
коротковолновыми видимыми синими лучами. В последнем случае не
требуется специальной оптики из кварца, можно пользоваться обычным
микроскопом со стеклянной оптикой.
При электронной микроскопии используется поток электронов электронные лучи. Источником электронов служит вольфрамовая проволока,
нагреваемая электрическим током (электронная «пушка»). В электронном
микроскопе применяются электромагнитные линзы, которые создают
электромагнитное поле, управляющее движением электронов. Электронный
микроскоп позволяет увидеть объекты в тысячи и десятки тысяч раз меньше
тех, которые видны в биологическом микроскопе.
Уход за микроскопом
Оптическая система микроскопа, как и его механическая часть, должна
быть в полной исправности. Если микроскоп хранится в деревянном футляре,
то линзы его через несколько недель покрываются пылью, поэтому в
дополнение к футляру следует использовать полиэтиленовый чехол. Таким же
чехлом должны быть накрыты и микроскопы, стоящие на столах.
Загрязнение оптической системы вызывает нечеткость изображения.
Полную чистку микроскопа нужно производить примерно раз в год и
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
обязательно специалистом - оптиком. При работе с иммерсией нельзя
пользоваться смесью масел разных марок, так как они имеют разный
коэффициент преломления, что вызовет искажение изображения.
Правила работы с микроскопом
Обращение с микроскопом требует навыков, поэтому, приступая к
работе с ним, необходимо усвоить основные правила пользования
микроскопом.
1.Вынимая из футляра микроскоп, его держат одной рукой за ручку
штатива, а другой - поддерживают за ножку штатива. Наклонять микроскоп в
сторону нельзя, так как при этом окуляр может выпасть из тубуса.
2.На рабочем столе микроскоп помещают ручкой к себе, на расстоянии
3- 5 см от края стола. Перед началом работы следует осторожно мягкой сухой
тканью удалить пыль с механических и оптических частей микроскопа, не
касаясь пальцами линз.
3.Устанавливают правильное освещение поля зрения микроскопа. Для
этой цели, смотря в окуляр, зеркалом направляют лучи света от настольного
осветителя в объектив. Объекты, подлежащие микросканированию,
рассматривают в проходящем свете. Настройка освещения производится с
объективом. При правильной установке поле зрения мискроскопа – будет
иметь форму круга, хорошо и равномерно освещенного.
4. На предметный столик помещают исследуемый препарат и
закрепляют его клеммами.
5.Сначала препарат рассматривают с объективом 8, а затем переходят к
большим увеличениям.
Необходимо помнить, что чем меньше увеличение дает объектив, тем
больше при установке препарата на фокус будет свободное рабочее расстояние
(расстояние между объективом и препаратом). При работе с объективом 8
расстояние между препаратом и объективом около 9 мм, с объективом
40–0,6 мм и с объективом 90 – около 0,15 мм. Тубус микроскопа необходимо
опускать вниз с помощью микрометрического винта осторожно, наблюдая за
объективом сбоку и приблизить его к препарату (не касаясь его) на
расстояние, меньше рабочего. Затем, глядя - в окуляр, тем же винтом, медленно вращая его на себя, поднимают тубус до тех пор, пока в поле зрения не
появится изображение изучаемого объекта. Микрометрический винт можно
вращать не более чем на пол-оборота в ту или другую сторону. При работе с
иммерсионным объективом на препарат предварительно наносят каплю
кедрового масла и, глядя сбоку, микрометрическим винтом опускают –
осторожно тубус микроскопа так, чтобы кончик объектива погрузился в каплю
масла. Затем, глядя в окуляр, тем же винтом – очень медленно поднимают
тубус до тех пор, пока не увидят изображение. Точную наводку объектива на
фокус производят микрометрическим винтом.
6. При смене объективов следует регулировать интенсивность
освещения рассматриваемого объекта. Желаемую степень освещенности
получают, опуская или поднимая конденсор. При просмотре препарата с
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
объективом 8 конденсор опускают, при переходе на объектив 40 конденсор несколько поднимают, а при работе с объективом 90 конденсор поднимают
вверх почти до предела.
7. Препарат рассматривают в нескольких местах, передвигая
предметный столик боковыми винтами. При изучении препарата следует все
время медленно (в пределах пол-оборота) вращать микровинт по часовой
стрелке и против нее, чтобы просмотреть предмет во всей толще и установить
на фокус то один, то другой участок препарата.
Перед переходом - от одного объектива к другому место препарата, где
расположен изучаемый объект, следует поставить - точно в центр поля зрения
и только после этого повернуть «револьвер» с объективом.
8. Во время микроскопирования необходимо держать оба глаза
открытыми или пользоваться ими попеременно.
9. После окончания работы следует снять препарат с предметного
столика, опустить конденсор, поставить под тубус объектив 8, удалить мягкой
тканью иммерсионное масло с фронтальной линзы объектива 90 и убрать микроскоп в футляр.
Работа 1. Устройство микроскопа, основные приемы микроскопирования
микроорганизмов
Задание
1. Ознакомьтесь с устройством микроскопа.
2. Изучите методы микроскопирования микроорганизмов.
3. Рассмотрите под иммерсионным объективом препарат фиксированных
и окрашенных бактерий в такой последовательности:
а) поставьте на стол микроскоп и найдите наилучшее освещение;
б) поместите на предметный столик фиксированный препарат и
закрепите его зажимами;
в) рассмотрите препарат при сухих объективах и отыщите лучшее место
для детального исследования;
г) поднимите тубус микроскопа, поставьте иммерсионный объектив и
нанесите каплю иммерсионного масла на препарат;
д) погрузите в иммерсионное масло нижнюю фронтальную линзу
иммерсионного объектива, смотря на препарат сбоку;
е) глядя в окуляр, медленно поднимите тубус микроскопа до появления в
поле зрения изучаемого объекта;
ж) уточните фокус микрометрическим винтом;
з) изучите и зарисуйте препарат;
и) поднимите тубус и удалите иммерсионное масло.
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа 2. Приготовление прижизненных препаратов микроорганизмов
В зависимости от объекта и цели исследования живые клетки
микроорганизмов наблюдают на препаратах «раздавленная капля» или
«висячая капля».
Задание
1. Приготовить препараты «раздавленная капля» и «висячая капля»
микроорганизмов с различной морфологией.
2. Промикроскопировать с объективом 10х и 40х.
3. Зарисовать препараты, отметить форму и сочетание клеток.
Материалы и оборудование
Предметные и покровные стекла, предметные стекла с углублениями,
микробиологические петли, полоски фильтровальной бумаги, накопительные
или чистые культуры микроорганизмов.
Ход работы
Метод раздавленной капли
На чистое обезжиренное
предметное стекло наносят каплю
водопроводной воды. В нее микробиологической петлей, с соблюдением
правил асептики, вносят культуру и смешивают с водой. Если в культуре
развилось очень много бактерий, то ее предварительно разбавляют водой.
Покровное стекло ставят на ребро у края капли и постепенно опускают
на нее. При осторожном опускании покровного стекла между стеклами не
остается пузырьков воздуха, мешающих микроскопированию. Капля должна
быть небольшой, чтобы после «раздавливания» жидкость не выступала за края
покровного стекла.
Метод удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, а
также просмотра крупных объектов – микроскопических грибов, дрожжей.
Метод висячей капли
Препарат типа «висячая капля» используют для выявления подвижности
у микроорганизмов, изучения способов размножения, наблюдения за
прорастанием спор. По центру покровного стекла наносят бактериологической
петлей небольшую каплю исследуемой жидкости и опрокидывают его над
углублением специального предметного стекла. Края углубления на
предметном стекле предварительно смазывают вазелином. Капля должна
висеть на покровном стекле над углублением предметного стекла. Препарат
может храниться долго (рис. 3).
Висячую каплю рассматривают под микроскопом, пользуясь плоским
зеркалом. Диафрагму при этом суживают. При малом увеличении находят
край капли, который будет отчетливо виден в затемненном поле зрения. Край
капли передвигают в центр поля зрения микроскопа и переводят на большое
увеличение, расширив при этом диафрагму. Таким образом, устанавливают
подвижность или неподвижность исследуемого микроорганизма.
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 3. Раздавленная и висячая капля
Работа 3. Приготовление фиксированных препаратов
В микробиологии часто готовят фиксированные препараты. Их
рассматривают под микроскопом в окрашенном виде. Под фиксацией
подразумевается такая обработка живого объекта, которая дает возможность
быстро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохранив его
тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к
стеклу и лучше прокрашиваются.
Из основных красителей наиболее часто в микробиологии применяют:
красные – нейтральный красный, сафранин, фуксин, гематоксилин; синие –
виктория, метиленовый синий; фиолетовые – генцианфиолетовый,
кристаллический фиолетовый, метиленовый фиолетовый; зеленые – янус
зеленый, метиленовый зеленый, малахитовый зеленый; коричневые – везувин,
хризоидин; черные – индулин.
Кислые красители могут быть следующие: красные и розовые – кислый
фуксин, эритрозин; черные – нигрозин – конго, пикриновая кислота,
флуоресцин.
Задание
1. Приготовить фиксированные окрашенные препараты из клеток
дрожжей и бактериальных клеток.
2. Промикроскопировать с объективами 10х, 40х и 100 х.
3. Зарисовать препараты, отметить форму и сочетание клеток.
Материалы и оборудование
Обезжиренные предметные стекла, бактериологическая петля,
спиртовка, полоски фильтровальной бумаги, кристаллизатор с мостиком для
препаратов, промывалка с водой, водные растворы красителей, накопительные
или чистые культуры микроорганизмов.
Ход работы
Способы окрашивания делят на простые и сложные. Различные способы
окраски основаны на физико-химических особенностях микробной клетки и
взаимодействии структур и веществ ее с используемыми реактивами.
1. Приготовление мазка. На середину чистого предметного стекла
наносят маленькую каплю воды, в нее вводят немного бактерий, взятых с
плотной питательной среды кончиком стерильной бактериологической иглы, и
12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
тщательно перемешивают; полученную слабомутную бактериальную
суспензию равномерно распределяют (размазывают) тонким слоем по
поверхности предметного стекла на площади 2–3 см2. Полученный мазок
высушивают при комнатной температуре на воздухе или (для ускорения) в
токе теплого воздуха над небольшим пламенем газовой горелки, не допуская
нагрева стекла (стекло при этом держат мазком вверх).
2. Фиксация мазка. Стекло с сухим мазком проводят 3–4 раза над
пламенем газовой горелки, слегка прикасаясь к нему той стороной, где мазок
отсутствует. Фиксация имеет целью убить клетки бактерий и закрепить мазок
(зафиксировать) на стекле. Мертвые клетки прокрашиваются лучше, чем
живые.
3. Окрашивание препарата. При простых способах окрашивания
используют одну краску.
На охлажденный фиксированный мазок наносят 1–2 капли какого-либо
одного красителя, например метиленовый синий, фуксин, генциан фиолетовый
в щелочных или карболовых растворах на 2–3 мин. При этом окрашивается
вся клетка. Затем краситель с мазка смывают водой из промывалки, нижнюю
сторону препарата вытирают полоской фильтровальной бумаги, верхнюю
осторожно обсушивают с боков, не дотрагиваясь до мазка. Препарат
окончательно досушивают на воздухе или высоко над пламенем спиртовки.
Готовый мазок микроскопируют, пользуясь объективом масляной иммерсии.
При сложных способах окрашивания применяют два или более
красящих вещества. Кроме красящих веществ, используют различные
обесцвечивающие вещества (спирт и др.). Такое окрашивание применяют для
выявления деталей строения микроорганизмов и их дифференциации.
Задание
Работа 4. Определение размеров клеток
1. Определить размеры клеток
дрожжей или гриба, препарат
«раздавленная капля». Объектив 40х, либо 100х.
2. Определить размеры бактерий. Препарат фиксированных клеток.
Объектив 100х.
Материалы и оборудование
Предметные и покровные стекла, микробиологическая петля, спиртовка,
0,1%-ный раствор агар-агара, окулярный микрометр, объективный микрометр,
микроскоп, чистые или накопительные суточные культуры микроорганизмов.
Ход работы
Для измерения микробных клеток обычно готовят прижизненный
препарат из суточной культуры микроорганизма. Если клетки микроорганизма
подвижны, препарат немного подогревают или к исследуемой суспензии
добавляют каплю 0,1 %-го раствора агар-агара. Следует учесть, что фиксация
и окраска препаратов приводят к некоторому изменению размеров микробных
клеток.
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Измерение величины микробных клеток ведут окулярным микрометром.
Размеры выражают в микрометрах.
Окулярный микрометр представляет (рис. 4) собой круглую стеклянную
пластинку, в центре которой нанесена линейка длиной 5 мм, разделенная на 50
делений. Окулярный микрометр помещают на диафрагму окуляра делениями
вниз, предварительно отвинтив верхнюю линзу окуляра. Цену деления
окулярного-микрометра при данном увеличении микроскопа определяют,
пользуясь объективным микрометром.
Объективный микрометр представляет собой металлическую пластинку,
по центру которой на стекле нанесена линейка длиной 1 мм. Линейка
разделена на 100 делений так, что одно деление равно 10 мкм.
Рис. 4. Объективный микрометр
Объективный микрометр помещают на предметный стол микроскопа и
фокусируют линейку при малом увеличении центре поля зрения. Далее
объектив малого увеличения заменяют объективом, при котором будут
измерять размеры микронных клеток. Линейки окулярного и объективного
микрометра устанавливают параллельно в поле зрения микроскопа, по
возможности частично совмещая их деления. Затем, определяют скольким
делениям объективного микрометра, соответствует одно деление окулярного
микрометра, и рассчитывают цену деления в микронах. Например, при
увеличении микроскопа с окуляром 15х и объективом 8Х 10 делений
окулярного микрометр; соответствуют 15 делениям объективного микрометра;
если одно деление объективного микрометра равно 10 мкм, тогда одно
деление окулярного микрометра будет равно 15 мкм.
Определив цену деления окулярного микрометра, приступают к
измерению величины микроорганизмов при том же увеличении микроскопа.
По линейке окулярного микрометра подсчитывают, сколько делений
приходится на измеряемый объект. Число делений умножают на цену деления
окулярного микрометра и получают размер объекта в микронах. Для достоверности результатов измерения выполняют не менее 50–100 раз, вычисляют
среднее значение и указывают пределы колебаний от него (максимальные и
минимальные размеры объекта). Измерять величину микробных клеток можно
винтовым окулярным микрометром.
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа 5. Морфология бактерий
Бактерии составляют наиболее обширную и весьма разнообразную
группу
микроорганизмов.
Бактерии
в
основном
представлены
одноклеточными организмами, размножающимися простым поперечным
делением клетки. Морфологически бактерии различают по форме, величине,
взаимному расположению клеток, наличию или отсутствию жгутиков и
капсул, способности клеток к спорообразованию и т. д.
Бактерии бывают шаровидные, палочковидные, извитые и ветвящиеся
(рис. 4).
Рис.
Рис. 5. Основные формы бактерии:
1 – стафилоккоки; 2 – стрептоккоки; 3 – сарцина; 4 – гоноккоки; 5 – пневмоккоки;
6 – капсула пневмококков; 7 – коринебактерии дифтерии; 8 – клостридии;
9 – бациллы» 10 – вибрионы; 11 – спириллы; 12 – трепонемы; 13 – борелии;
14 – лептоспиры; 15 – актиномицеты; 16 – расположение жгутиков: а – монотрихи,
б – лифотрихи, в – амфитрихи, г – перитрихи
Кокковидные бактерии (кокки-Coccus) – шаровидные клетки размером
0,5–1,2 мкм. Направление плоскости деления клетки и характер взаимного
расположения клеток используют как систематический признак при
выделении родов шаровидных бактерий.
Моно- или микрококки (род Micrococcus). Их клетки делятся в любой
плоскости и сразу после деления обособляются, располагаясь одиночно.
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Диплококки (род Diplococcus) и стрептококки (род Streptococcus)
образуются при делении клеток в одной плоскости; у диплококков клетки
располагаются попарно, у стрептококков соединены в цепочки.
Тетракокки (род Tetracoccus) возникают при делении клеток в двух
взаимно перпендикулярных плоскостях, клетки образуют группы по 4 особи
Сарцины (род Sarcina) формируются при делении клеток в трех взаимно
перпендикулярных плоскостях, при этом образуются пакеты из 8–16 клеток и
более.
Стафилококки (род Staphylococcus) представлены скоплениями клеток,
напоминающими виноградные грозди. Деление клеток происходит в любой
плоскости.
Помимо правильной шаровидной формы, клетки могут иметь овальную
или ланцетовидную форму (пневмококки) или бобовидную форму кофейного
зерна (гонококки, менингококки). Шаровидные бактерии, как правило, не
имеют жгутиков, неподвижны и спор не образуют. Исключение составляет
мочевая сарцина (Sporosardna ureae).
Палочковидные бактерии (палочки). Это самая многочисленная и разнообразная группа бактерий. Палочковидные бактерии различают по величине
клеток, их расположению, очертанию концов клетки, по наличию или
отсутствию жгутиков. Длина клетки палочковидных бактерий колеблется от
десятых долей микрометра до 10–15 мкм и более, диаметр клетки от 0,5 до 1,0
мкм. Размер клеток зависит от условий выращивания культуры (состава среды,
значения рН, аэрации, температуры) и возраста культуры.
По способу образовывать споры они подразделяются на бактерии,
бациллы и клостридии.
Бактерии (Bacterium, обозначают Bad или В.)- палочковидные бактерии,
которые не образуют спор (кишечная, дифтерийная, туберкулезная.
Паратифозная и другие палочки). У бацилл (Bacillus, обозначают Вас.) споры
не превышают диаметр клетки (бациллы сибирской язвы), а у клостридии
сорры больше диаметра клетки (клостридии бутулизма, столбняка). Бактерии
и бациллы располагаются одиночно, попарно или соединяются в цепочки, в
последнем случае их называют соответственно стрептобактерии и
стрептобациллы.
По форме палочковидные бактерии бывают короткими, длинными, с
закругленными и заостренными или утолщенными концами. К наиболее
мелким палочковидным бактериям относятся риккетсии - облагатные
внутриклеточные паразиты.
Среди палочковидных бактерий встречаются как сапрофиты, так и
патогенные формы.
Извитые бактерии. В зависимости от формы клетки и количества
витков их делят на три типа клеток.
Вибрионы (род Vibrio) представлены короткими изогнутыми палочками
в форме запятой. Клетки вибрионов изогнуты на 1/3 оборота. Длина клетки
составляет 1–3 мкм.
16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Спириллы (род Spirillum). Клетки их изогнуты на 2–3 оборота и имеют
форму латинской буквы S. Размеры клетки по сравнению с вибрионами
значительно крупнее – 15–20 мкм.
Спирохеты (род Spirochaeta) представлены очень тонкими длинными
клетками штопорообразной формы с большим числом мелких витков, Длина
клетки превосходит ширину в 5–200 раз. Число витков спирали является
одним из систематических признаков при определении вида.
Задание
1. Познакомиться с формой клеток конкретных штаммов кокковидных
бактерий, приготовив фиксированные препараты, промикроскопировать
(100х), зарисовать.
2. Познакомиться с формой клеток палочковидных бактерий
(фиксированные препараты, 100х), зарисовать.
3. Познакомиться с формой клеток извитых бактерий и спирохет,
выявляемых в фиксированном окрашенном препарате из зубного налета
(100х).
4. Познакомиться с формой клеток нитевидных цианобактерий (препарат
«висячая капля», 40х), зарисовать.
Материалы и оборудование
Предметные покровные стекла, микробиологическая петля, спиртовка,
пинцет, капельница с водой, водные растворы красителей (фуксин,
метиленовый синий, генцианвиолет), промывалка с водой, кристаллизатор со
стеклянным мостиком для препаратов, полоски фильтровальной бумаги,
микроскоп, чистые культуры микроорганизмов, настои различных
естественных материалов (мяса, рыбы, муки, овощей, навоза и т. д.).
Ход работы
Для изучения морфологии бактерий следует приготовить настои из
различных естественных материалов: мяса, рыбы, белка яйца, навоза, сена,
муки, овощей, фруктов и др. Небольшое количество материала измельчают,
помещают в склянку, на кончике скальпеля добавляют немного мела и
заливают водопроводной водой на 2/3 объема склянки. Склянку с настоем
выдерживают в термостате при 25–28 °С или в теплом помещении в темноте
3–5 дней. За это время в среде накапливается масса разнообразных бактерий.
Начинать
изучение
морфологии
бактерий
рационально
с
микроскопирования микроорганизмов одного из настоев на выбор (наиболее
богата микрофлора в настоях мяса, рыбы, навоза). Из жидкости настоя готовят
параллельно два препарата: один – прижизненный (раздавленная капля),
второй – постоянный (мазок). Прижизненный препарат микроскопируют,
пользуясь объективом 40х; мазок рассматривают с объективом 100х.
Работа 6. Окраска бактерий по Граму
Для дифференциации микробных клеток, различающихся химическим
составом и структурой клеточных стенок, используется сложный метод
окраски - окраска по Граму (по имени датского ученого). При окраске по
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Граму все бактерии делятся на две группы: грамположительные и
грамотрицательные.
Неодинаковое отношение микроорганизмов к окраске по Граму
связано с различиями в структуре и химическом составе клеточной стенки
бактерий.
У грамположителъных бактерий (Г+) толщина клеточной стенки
составляет 15–80 нм, состоит из пептидогликана (от 60–90 %),
расположенного в несколько слоев, белка (около 1 %) и липидов (около
1%).Обнаружены полимеры особого типа – тейхоевые кислоты, ковалентно
связанные с пептидогликаном. Большое содержание пептидогликана
обеспечивает при окраске по Граму образование комплекса с генциановым
фиолетовым и йодом, устойчивого к спирту, вследствие чего они окрашены
в сине-фиолетовый цвет.
Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий (Г-) 10–15
нм, но структура ее значительно сложнее, чем у грамположительных
бактерий. Основу ее составляют ориентированные внутренне липиды (10–
20%), которые с поверхностно расположенными полисахаридами образуют
липополисахаридный слой. На поверхности клеточной стенки мозаично
расположены белки и полисахариды. Пептидогликан представлен одним
слоем толщиной всего 2–3 нм (около 5–10 %) лежит под
липополисахаридным слоем и плотно покрывает протопласт. Из-за
большого содержания липидов клеточная стенка грамотрицательных
бактерий при окраске по Граму образует с генциановым фиолетовым и
йодом комплекс, разрушаемый при обработке спиртом вследствие чего
клетки обесцвечиваются.
К грамположительным микроорганизмам относятся кокки, бациллы
(спорообразующие
палочки),
актиномицеты,
микобактерии,
клостридиальные бактерии.
К грамотрицательным микроорганизмам относятся: бактерии
(неспорообразующие палочки), спириллы, сальмонеллы, вибрионы.
Имеются грамвариабельные микроорганизмы, отношение которых; к
окраске по Граму меняется на определенных этапах их жизненного, цикла.
Так как способность клеток окрашиваться по Граму зависит от их возраста,
для окраски по Граму используют клетки молодой культуры, чаще всего
односуточной.
Задание
1. Провести окраску по Граму бактерий (по указанию преподавателя)
Материалы и оборудование
Обезжиренные предметные стекла, бактериологическая петля,
спиртовка, полоски фильтровальной бумаги, промывалка с водой, раствор
Люголя, этиловый спирт, краситель карболовый генциановый фиолетовый,
водный фуксин, односуточные культуры бактерий.
Ход работы
Окраску по Граму осуществляют следующим образом:
18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1. Готовят на предметном стекле мазко культуры микроорганизмов: в
центре. Мазки должны быть тонкими, чтобы клетки равномерно были
распределены по поверхности стекла и не образовывали скоплений, так как
от толщины мазка могут зависеть результаты окрашивания.
Высушивают мазки на воздухе, фиксируют над пламенем горелки.
2. Окрашивают мазки карболовым генциановым фиолетовым. Намазки
наносят достаточное количество красителя, выдерживают 1–2 мин,
краситель сливают и, не смывая водой, мазки обрабатывают раствором
Люголя до почернения (приблизительно 1–2 мин).
3. Сливают раствор Люголя и обрабатывают препарат 0,5–1 мин
(строго!) 96 %-ым этиловым спиртом, путем нанесения спирта на мазки
пипеткой (от времени обработки мазка спиртом зависит результат всего
окрашивания: при недостаточной обработке все бактерии сохраняют
окрашивание, при чрезмерной – обесцвечиваются).
4. Препарат немедленно промывают водой и окрашивают его 1–2 мин
водным фуксином. Сливают краситель, препарат промывают водой,
высушивают фильтровальной бумагой.
5. Микроскопируют препарат с иммерсионной системой.
Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый
цвет, грамотрицательные – в красный или розовый цвет фуксина (цвет
дополнительного красителя).
Некоторые бактерии (протей) окрашиваются грамвариабельно, т.е.
часть клеток – как грамположителные, а часть – как грамотрицательные.
Работу проводят очень аккуратно, так как многие используемые в
работе красители не отмываются органическими растворителями и
ПАВ.
Работа 7. Окраска спор у бактерии
Споры
–
своеобразная
форма
покоящихся
бактерий
с
грамположительным типом строения клеточной стенки. Споры образуются
при неблагоприятных условиях существования бактерий, сопровождающихся
высушиванием, дефицитом питательных веществ и т.д. Спорообразование
происходит почти исключительно у палочковидных бактерий. В клетке
бактерий образуется только одна спора. Если диаметр споры не превышает
диаметра клетки, в которой спора образуется, клетку называют бациллярной,
если превышает, то в зависимости от расположения споры в центре или на
19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
конце клетки эту клетку называют соответственно клостридиальной или
плектридиальной.
Форма спор может быть овальной, шаровидной или эллипсовидной.
Плотная оболочка, малое содержание свободной воды, наличие
дипиколиновой кислоты создают большую устойчивость спор к физикохимическим воздействиям. Так, споры некоторых бактерий выдерживают
кипячение в течение нескольких часов, могут длительное время сохраняться
(десятки и сотни лет) в сухом состоянии, более устойчивы по отношению к
действию химических ядов, радиации и других факторов внешней среды. В
благоприятных условиях споры прорастают в вегетативные клетки.
Задание
Провести окраску капсул бактерий по методу
Промикроскопировать. Объектив 40х и 100х. Зарисовать.
Омелянского.
Материалы и оборудование
Обезжиренные предметные стекла, бактериологическая петля,
спиртовка, полоски фильтровальной бумаги, промывалка с водой, карболовый
фуксин Циля, 10 %- ый раствор нитрозина, культура бактерий Azotobacter
chroococcum.
Ход работы
Наносят каплю карболового фуксина Циля и каплю воды на предметное
стекло. Помещают в каплю красителя исследуемую культуру бактерий и
выдерживают 2–3 мин. Добавляют каплю жидкой черной туши или 10 %-го
водного раствора нитрозина и тщательно перемешивают. Накрывают
покровным стеклом и просматривают с объективом 40х либо размазывают
суспензию по стеклу, высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсией.
Красители не проникают в капсулу, поэтому бесцветная капсула хорошо
видна на общем темном фоне препарата и окрашенных в красный цвет клеток
бактерий.
Контрольные вопросы
1. Из каких частей состоит микроскоп?
2. Каково назначение макро-и микрометрического винтов?
3. Что такое сухие и иммерсионные объективы?
4. Как устанавливается общее увеличение микроскопа?
5. Какие различают формы бактерий?
6. Расположение, структура и функция клеточной стенки,
цитоплазматической мембраны, цитоплазмы и других элементов микробной
клетки
7. Как отличить в препарате грамположительные ьактерии от
грамотрицательных?
8. Какое значение имеют бактериальные споры и какими свойствами
они обладают
20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ТЕМА 2. МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Работа 8. Питательные среды, стерилизация питательных сред
Выращивание (культивирование) микроорганизмов используется в
лабораторных и производственных условиях для выделения, накопления и
сохранения микроорганизмов.
Для культивирования микроорганизмов используют специальные
питательные среды, которые должны содержать необходимые питательные
вещества и являться оптимальной средой обитания микроорганизмов.
В состав питательной среды обязательно входят 5 основных элементов
(С, Н2, О2, N) и зольные элементы, микроэлементы, количество воды не менее
60 %.
Универсальных сред, пригодных в равной степени для всех
микроорганизмов, не существует. В закономерности от особенностей
обменных процессов (фотосинтез, способы получения энергии) отдельным
видам микроорганизмам требуются различные составы питательных веществ.
По составу питательные среды подразделяются на 2 группы:
- естественные
- искусственные.
Естественными называются среды, которые состоят из натуральных
пищевых продуктов (молоко, яйца, мясо). Большинство из них применяют в
виде экстрактов или настоев. Эти среды имеют сложный, непостоянный
химический состав и малопригодны для изучения физиологии обмена веществ
микроорганизмов. Они используются главным образом для поддержания
культур микроорганизмов, накопления их биомассы и диагностических целей.
Примерами служат мясопептонный бульон, почвенная вытяжка,
картофельная среда.
Искусственные среды (синтетические среды) – это среды, в состав
которых входят только определенные, химически чистые соединения, взятые в
точно указанных концентрациях. Синтетические среды удобны для
использования обмена веществ микроорганизмов. Зная точный состав и
количество входящих в среду компонентов, можно изучить их потребление и
превращение.
Для разработки синтетических сред необходимо знать потребности
микроорганизмов в источниках питания и основные особенности их обмена
веществ.
В большинстве случаев синтетические среды готовят на водопроводной
воде и микроэлементы не добавляют.
К ним можно отнести: гидролизат козеина, дрожжевой автолизат,
кукурузный экстракт.
По назначению различают элективные и дифференциальнодиагностические среды.
Элективные среды обеспечивают развитие одного вида или группы
микроорганизмов и непригодны для развития других. Элективные среды
21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
применяют главным образом для выделения микроорганизмов из мест их
естественного местообитания или для получения накопительных культур.
Дифференциально-диагностические (индикаторные) среды позволяют
достаточно быстро отличить одни виды микроорганизмов от других. Состав
этих сред подбирают с таким расчетом, чтобы позволить четко выявить
наиболее характерные свойства определенного вида.
Индикаторные среды применяются в клинической бактериологии, при
генетических исследованиях.
По физическому состоянию различают: жидкие, плотные, сыпучие
среды.
Жидкие среды широко применяют для выяснения физиологобиохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы.
Плотные среды используют для выделения чистых культур (получение
изолированных колоний) для хранения культур, количественного учета
микроорганизмов.
Сыпучие среды применяют в промышленной микробиологии. К ним
относятся: отруби, кварцевый песок, разваренное пшено.
Для уплотнения сред применяют агар-агар, желатину и кремнекислый
гель.
Агар-агар - сложный полисахарид, получаемый из морских водорослей.
Агар-агар удобен тем, что большинство микроорганизмов не использует его в
качестве питательного субстрата, в воде агар-агар образует гели, которые
плавятся при 1000С, а затвердевает при 40 0С. Поэтому на агаризованных
средах можно культивировать микроорганизмы при любой подходящей для их
роста температуре.
Методы стерилизации посуды и питательных сред
Основываясь на влиянии внешних условий на рост микроорганизмов, в
микробиологической практике разработан ряд приемов, приводящих
микроорганизмы к гибели. Одним из таких приемов является стерилизация.
Под стерилизацией понимают полное уничтожение микроорганизмов и
их спор в питательных средах, посуде, на инструментах и других предметах
лабораторного оборудования. Для их стерильности наиболее часто пользуются
воздействием высокой температуры.
Стерилизация обжиганием на пламени горелки
Небольшие стеклянные (палочки, шпатель) и металлические предметы
(игла, петля, пинцет, скальпель) проводят несколько раз через пламя горелки.
Стерилизация достигается обугливанием находящихся на их поверхности
микроорганизмов. Обжиганием на пламени пользуются для стерилизации поверхности ватных пробок, горла посуды.
Стерилизация кипячением
Стерилизацию металлических инструментов и резиновых трубок
проводят кипячением. Так как споры некоторых бактерий сохраняют
жизнеспособность при кипячении в воде в течение нескольких часов, то
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
рекомендуется стерилизацию кипячением проводить в 2 %-ом растворе
карбоната натрия в течение 10 мин. В этих условиях споры погибают.
Стерилизация сухим жаром
Сухим жаром стерилизуют в основном стеклянную посуду. При этом
пробирки, колбы предварительно закрывают ватными пробками. Чтобы
избежать заражения простерилизованных предметов из воздуха, их перед
стерилизацией заворачивают в оберточную бумагу и вынимают из, нее только
перед работой.
Пипетки заворачивают полоской бумаги шириной 2,5–3,0 см.
Предварительно в конец пипетки, который берут в рот, вкладывают ватный
тампон. Капиллярный конец пипетки кладут на полоску бумаги под углом 45°
и заворачивают по спирали.
Чашки Петри заворачивают в бумагу в форме квадрата. Чашку Петри
помещают на середину листа, загибают его с двух противоположных сторон
кверху, края дважды загибают швом. Два свободных конца загибают вниз. При
таком обертывании у чашек легко различать верх и низ. Подготовленную
таким образом посуду помещают в сушильный шкаф, в котором нагревают ее
при температуре 160–170 °С в течение 2 ч. При таком нагревании погибают не
только бактерии, но и их споры. Температуру в сушильном шкафу выше
175 °С допускать не следует, так как при этом ватные пробки буреют, а
бумажная обертка становится ломкой.
Пастеризация
В основе пастеризации лежит нагревание жидкостей до температуры
меньше 100 °С. Цель ее — уничтожение неспороносных бактерий в
жидкостях, теряющих питательные свойства при кипячении (молоко, пиво,
вино и др.). Осуществляется пастеризация нагреванием жидкостей при 60 °С в
течение 30 мин, или при 75 °С в течение 15 мин, или при 80 °С в течение 10
мин.
Холодная стерилизация
Органические жидкости, не выносящие нагревания, освобождают от
бактерий, пропуская через стерильные мелкопористые фильтры. Эти фильтры
задерживают микроорганизмы, их называют бактериальными фильтрами.
Бактериальные фильтры имеют разные номера. Фильтры № 1 имеют
средний диаметр пор 0,3 мкм, они наиболее надежны. Фильтры № 5 имеют
самые большие отверстия пор, диаметром 1,2 мкм.
Перед употреблением мембранные фильтры стерилизуют кипячением.
Фильтры помещают в теплую дистиллированную воду и кипятят 30 мин,
меняя ее 2–3 раза.
Стерилизация в автоклаве паром под давлением
Наиболее надежный и универсальный метод стерилизации питательных
сред и материалов – стерилизация их насыщенным паром под давлением.
Производят ее в автоклаве, в котором стерилизуемые объекты нагревают
чистым насыщенным паром при давлении выше атмосферного. Когда
насыщенный пар встречается с более холодным объектом, он конденсируется,
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
превращаясь в воду. При конденсации выделяется большое количество
теплоты, и температура стерилизуемого объекта быстро повышается.
Полная стерилизация питательных сред при 120 оС и давлении 1 атм
обеспечивается нагреванием в течение 20 мин.
Задание
1. Познакомиться с устройствами, используемыми для стерилизации:
посуды, сред, воздуха и т. д. (автоклав, сушильный шкаф, бактерицидные
лампы).
2. Подготовить для стерилизации чашки Петри, пипетки, шпатель.
3. Подготовить для стерилизации пробирки с водопроводной во дой- 9
мл.
Работа 9. Выделение чистых культур микроорганизмов
В микробиологической практике широко используются как чистые
культуры микроорганизмов, так и консорциумы.
Консорциумы – смешанные или ассоциативные культуры, состоящие из
2-х и более микроорганизмов, между которыми существуют различные формы
взаимоотношений.
Чистой культурой называют культуру, состоящую из микроорганизмов
одного вида. Чистая культура микроорганизмов, которая является потомством
одной единственной клетки, называется клоном.
Загрязненная или инфицированная культура – чистая культура, в
которую случайно попали посторонние микроорганизмы.
Чистые культуры микроорганизмов, как правило, выделяют на поверхности или внутри твердой питательной среды.
Существует несколько методов получения чистых культур. Все они
основаны на выделении из популяции одной клетки.
Метод разбавлении Пастера.
Из суспензии, содержащей смесь микроорганизмов, делается ряд
последовательных разведении в стерильной жидкой питательной среде. С
каждым разведением количество микроорганизмов, попадающих в пробирку,
будет уменьшаться и можно таким образом получить такие разведения, когда в
объеме среды в пробирке будет находиться только одна клетка, из которой и
разовьется чистая культура. Однако этот метод не всегда дает возможность
получить чистую культуру.
Выделение чистой культуры из одной клетки капельным методом
Предварительно подготавливается разведение культуры микроорганизма
в питательной среде с таким расчетом, чтобы в небольшой капле этой среды
могли быть единичные клетки. Затем на поверхность стерильного стекла с
помощью простерилизованной иглы и стеклянной палочки наносят ряды
мелких капель среды, содержащей микроорганизмы.
Стекло перевертывают и помещают над лункой предметного стекла.
Края лунки предварительно обмазывают вазелином. Затем все капли
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
просматривают под микроскопом и отмечают те из них, в которых находится
только одна клетка. Стекло помещают в чашку Петри, на дне которой
находится увлажненная фильтровальная бумага, и ставят в термостат; клетка
размножается, образуя микроскопическую колонию.
Полученную колонию снимают стерильной фильтровальной бумагой,
которую держат простерилизованным на пламени пинцетом, и переносят в
пробирку с питательной средой.
Выделение чистой культуры капельным методом используется при
работе с крупными микроорганизмами (дрожжи, плесени).
Выделение чистой культуры с помощью микроманипулятора.
Для выделения под контролем микроскопа одиночных микробных клеток и их посева применяют специально оборудованные микроскопы –
микроманипуляторы. Отдельные микробные клетки в них вылавливаются из
висячей микрокапли микропипеткой и микропетлей, перемещаемыми в поле
зрения микроскопа с микронной точностью с помощью системы винтов и
рычагов.
Метод выделения чистой культуры с помощью твердых сред (метод
Коха)
Наиболее распространен в микробиологической практике. Метод
заключается в получении чистой культуры из отдельной колонии, выросшей
на твердой питательной среде в результате размножения одной клетки. Метод
основан на том, что при нанесении микроорганизмов из посевного материала
на твердую среду отдельные клетки будут закрепляться (иммобилизироваться)
в определенной точке твердой среды и, размножаясь, давать потомство (клон),
представляющее чистую культуру микроорганизма.
Для получения изолированных колоний на твердой среде исследуемый
материал высевают на поверхность твердой питательной среды, наносят
петлей или пипеткой каплю исследуемого материала. Рассев проводят либо
методом истощающего мазка, либо методом истощающего штриха. В первом
случае шпателем равномерно распределяют нанесенную каплю по
поверхности твердой среды. Тем же шпателем делают посев на поверхности
второй пластинки и затем третьей, т. е. перенося последовательно на твердую
среду клетки микроорганизмов, которые остались на шпателе. Таким образом,
количество микроорганизмов, вносимых последовательно на пластинки, будет
уменьшаться: на вторую – меньше, чем на первую; на третью – еще меньше,
чем на вторую и т. д.
При использовании метода истощающего штриха исследуемый материал
наносят петлей в верхнюю часть твердой среды в чашке Петри и аккуратно,
зигзагообразно петлей по поверхности чашки (рис. 6). Затем посев проводят
аналогично на второй и третьей чашке.
После посева чашки необходимо перевернуть вверх дном и поставить в
термостат при температуре, благоприятной для данного микроорганизма.
Инкубируют посевы обычно в термостате в течение 2–3 дней. В результате на
поверхности среды вырастают колонии микроорганизмов Выросшие колонии
25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
сначала рассматривают невооруженным глазом, а затем при помощи лупы или
при малом увеличении микроскопа.
Рис. 6. Метод посева зигзообразной петлей
При описании колоний микроорганизмов отмечают следующие
морфологические и культуральные признаки:
Размер колоний – их диаметр в мм (если колонии не превышают 1 мм, их
называют точечными).
Форма колоний – округлая, неправильная, мицелевидная, ризоидная,
амебовидная, складчатая, концентрическая, сложная и др. (рис. 7).
Цвет колоний – белый, желтый, розовый и т. д. и способность выделять
пигмент в среду.
Поверхность колоний гладкая, складчатая, с радиальной или
концентрической исчерченностью, шероховатая, бугристая и др.
Оптические свойства – прозрачная, полупрозрачная, непрозрачная,
блестящая, матовая, флуоресцирующая и т. д.
Профиль колоний – плоский, слабовыпуклый, сильновыпуклый, вогнутый, кратерообразный и др. (рис. 8).
Край колоний – ровный, извилистый, зубчатый, лопастной, волнистый,
неправильный, реснитчатый, нитчатый, ворсинчатый, ветвистый (рис. 9).
Консистенция колонии - маслянистая, тестообразная, вязкая, плёнчатая.
1
7
2
3
8
4
9
5
10
6
11
12
Рис. 7. Форма колонии
1 – круглая; 2 – круглая с фестончатым краем; 3 – круглая с валиком по краю;
4–5 – ризоидные; 6 – с ризоидным краем; 7 – амебовидная; 8 – нитевидная;
– складчатая; 10 – неправильная; 11 – концентрическая: 12 – сложная
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
изогнутый
кратерообразный
плоский
выпуклый
бугристый
каплевидный
врастающий
конусовидный
Рис. 8. Профиль колонии
гладкий
волнистый
ресничатый
зубчатый
нитчатый
лопастый
ворсинчатый
неправильный
ветвистый
Рис. 9. Край колонии
Для описания колоний из имеющихся чашек Петри берут ту, на которой
колонии достаточно изолированы друг от друга. В отобранной чашке
выбирают хорошо изолированные и различающиеся внешним видом колонии,
которые описывают, указав все характерные признаки их роста.
Из отобранных колоний приготавливают препараты, микроскопируют
для проверки морфологической однородности клеток. При приготовлении
препаратов необходимо соблюдать все правила стерильности (не открывать
широко крышку чашки, хорошо простерилизовать петлю). Далее пересевают
культуру из колонии в пробирку со скошенной плотной питательной средой
(косяк).
Задание
1. Выделить чистые культуры бактерий по методу Коха на среде МПА
или сусло-агар из предоставленной суспензии культур микроорганизмов
Работа 10. Количественный учет микроорганизмов на твердых средах
Метод Коха – наиболее распространенный способ количественного
учета микроорганизмов. Сущность метода заключается в высеве
определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на твердую
среду в чашки Петри и последующем подсчете числа выросших колоний. При
этом принимают, что каждая колония образуется при размножении одной
клетки.
Этот метод позволяет вести учет только жизнеспособных клеток
микроорганизмов.
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Задание
1. Провести количественный учет дрожжей по методу Коха, содер жащихся в суспензии, предоставленной для анализа.
Материалы и оборудование
Стерильная водопроводная вода или физиологический раствор, пипетки
на 1мл., пробирки, чашки Петри, термостат,суспензии микроорганизмов
Ход работы
При анализе берут стерильно 1 мл суспензии и помещают в 9 мл
стерильной водопроводной воды или физиологического раствора (рис. 10),
затем последовательно новой пипеткой (!) переносят по 1 мл в ряд пробирок с
9 мл стерильной водопроводной воды.
Рис. 10. Схема приготовления разведенной суспензии
микроорганизмов и посева
Степень разведения определяется предполагаемым количеством
микроорганизмов в образце, и соответственно число разведений тем больше,
чем больше микроорганизмов в исходном субстрате.
Из полученных разведений, предварительно тщательно перемешанных,
производят высев на поверхность агаровой пластинки в чашки Петри. Посев
производят пипеткой обычно по 0,05; 0,1 или 0,2 мл, начиная с наибольшего
разведения, при этом может применяться для посева одна стерильная пипетка.
Объем внесенной суспензии распределяют по поверхности среды стерильным
шпателем. Если высев проводят, начиная с больших разведений, то
используют новую стерильную пипетку и новый шпатель для каждого
разведения.
Чашки Петри с засеянными средами помещают в термостат при
определенной температуре, благоприятной для развития учитываемых
микроорганизмов.
Подсчет выросших колоний проводят через определенное время после
посева (3–5 суток). Колонии, как правило, считают, не открывая чашки Петри,
повернув их кверху дном. Для счета берут те чашки Петри, на которых
28
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
колонии хорошо отделены одна от другой. Каждую отсчитанную колонию
помечают точкой с нижней стороны чашки Петри чернилами или
стеклографом. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы,
подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты
суммируют. Следует иметь в виду, что точность метода зависит от числа подсчитанных колоний: лучшим разведением считают то, при высеве из которого
на плотной питательной среде вырастает от 50 до 150 колоний. Если число
выросших колоний меньше 10, то эти результаты отбрасывают и для расчета
количества клеток в исходном субстрате не используют. Желательно, чтобы
общее количество подсчитанных колоний при высеве из данного разведения
было не менее 300.
Зная количество выросших колоний и степень разбавления, легко
определить количество микроорганизмов в 1 мл исследуемой суспензии,
пользуясь формулой:
где N – количество микроорганизмов в 1 мл суспензии; К – разведение, из
которого проведен высев; а – среднее количество колоний на чашке Петри при
разведении К; V – объем суспензии, взятый для посева, мл; 2 – критерий при
9 % уровне значимости; стг – среднее квадратичное отклонение, равное ± п –
число повторностей.
Например, если при разведении 1:105 выросло 85 колоний, количество
бактерий в 1 л исследуемого вещества при объеме суспензии, взятой для
посева, равном 0,1 мл, будет равно
Причинами ошибок определения могут быть: негомогенное распределение клеток микроорганизмов в объеме жидкости за счет недостаточной
продолжительности взбалтывания пробы, сорбирование микроорганизмов на
стенке сосудов, ошибки пересчета и др.
Наиболее надежные результаты получаются при соблюдении следующих условий:
- в разведениях для счета число колоний должно быть от 50 до 150. При
большем количестве колоний подсчет становится затруднительным и
неточным.
- количество параллельно засеваемых чашек должно быть не менее 2.
Работа 11. Количественный учет микроорганизмов
с помощью счетных камер
Метод прямого подсчета клеток микроорганизмов в счетных камерах
успешно применяют для определения общего количества микроорганизмов,
содержащихся во взвесях (суспензиях).
29
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Известны счетные камеры разных конструкций, принцип устройства
которых одинаков (Горяева, Фукс-Розенталя, Петрова-Хауссера, Тома-Цейса и
др.).
Метод количественного учета микроорганизмов с помощью счетных
камер имеет ограничения применения, связанные с тем, что в счетных камерах
проводится учет всех клеток микроорганизмов без их дифференциации на
живые и мертвые клетки. Кроме того, счетные камеры могут быть
использованы лишь для подсчета относительно крупных объектов – клеток
водорослей, дрожжей, спор грибов, микроскопируемых при объективе 8-40х.
Счетная камера представляет собой толстое предметное стекло с
нанесенными на нем поперечными прорезами, которые образуют три
поперечно расположенные плоские площадки (рис. 11, а). Средняя площадка
продольным прорезом разделена пополам, причем на каждой половине
нанесена квадратная сетка (рис. 11, а). Две боковые площадки расположены на
0,1 мм выше средней. Эти площадки служат для притирания покровного
стекла.
Рис. 11. Счетная камера Горяева:
а - вид сверху; б - вид сбоку; h -высота камеры;
в - вид при малом увеличении микроскопа
Сетка разделена на определенное число больших и маленьких квадратов,
по-разному сгруппированных.
Постоянной величиной во всех сетках является маленький квадрат
(ABCD, рис. 25, в), сторона которого равна 1/20 мм, площадь его -1/400 мм2, а
объем при высоте камеры 1/10 мм – 1/4000 MMJ или 1/4000000 мл. Так
называемый большой квадрат ABCD, состоит из 16 малых квадратиков.
Камера Горяева имеет площадь 9 мм 2, объем камеры - 9 мм и разбита на
225 больших квадратов (15 рядов по 15 больших квадратов в каждом ряду)
Каплю взвеси наносят на сетку камеры и сверху накрывают покровным
стеклом. Жидкость под покровным стеклом должна равномерно без пузырьков
распределиться по всей сетке, не выступая в желобок между стенками.
Большими пальцами покровное стекло плотно притирают к боковым
площадкам камеры до появления ньютоновских колец.
Задание
1.Провести количественный учет клеток дрожжей, содержащихся в
предоставленной суспензии.
30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. Подсчет клеток дрожжей проводить в исходной (неразбавленной)
суспензии и суспензии, разбавленной в 2, 5 и 10 раз в трехкратной по вторности.
3. Подсчет клеток дрожжей в счетной камере Горяева проводить при
объективе 20х или 40х.
Материалы и оборудование
Счетная камера Горяева, покровные стекла, пробирки, микроскоп,
дрожжи.
Ход работы
Камеру с исследуемым материалом помещают на предметный столик
микроскопа и микроскопируют с объективом 10-40х (в поле зрения должны
быть отчетливо видны как квадратики, так и клетки микроорганизмов).
Просчитывают количество клеток в пяти больших квадратах (т. е. в 80
малых), расположенных по диагонали. Учитывают все клетки, размещенные
внутри квадрата и на пограничных линиях, если они большей частью лежат
внутри квадрата. Клетки, разделенные пограничной лини пополам, считают
только на 2-х из 4-х границ квадрата, а клетки, лежащие большей своей
половиной вне данного квадрата, совсем не учитывают.
Находят среднее количество клеток в одном квадратике. Допустим, в 5
больших квадратах (80 малых) - 240 клеток, тогда в 1 малом квадратике
среднее количество клеток 240:80 = 3. Пересчет на 1 мл суспензии с учетом
разведения производят по формуле:
N = a . 1000 . К,
h.S
где N – число клеток в 1 мл суспензии; а – среднее число клеток в малом
квадрате; h – глубина камеры, мм; S – площадь малого квадрата, мм2;
К – разведение исходной суспензии; 1000 – коэффициент пересчета мм3'вмл(1
мл =1000 мм3).
Контрольные вопросы
1. Что такое естественные и искусственные питательные среды?
2. Каким общим требованиям должна соответствовать любая
питательная среда?
3. Что такое элективные и дифференцированные питательные среды?
4. Назовите основные методы стерилизации посуды и питательных
сред.
5. Что называется чистой культурой микроорганизмов?
6. Назовите методы выделения чистых культур микроорганизмов.
7. Чем могут различаться колонии различных видов бактерии?
8. Зачем производят посевы бактерии на различные питательные среды.
9. Какие морфологические признаки используются для определения
бактерии?
10. Какими
методами
производится
количественный
учет
микроорганизмов?
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ТЕМА 3. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ
НА ЖИЗНЕДЕЯТЕЛЬНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ
Микроорганизмы подвергаются воздействию многих факторов среды.
Несмотря на это, они остаются жизнеспособными в жидком воздухе и
глубоком вакууме, в уксусе, в окружении живых существ и внутри их.
Разнообразие
условий
и
породило
разнообразие
свойств
микроорганизмов под влиянием физических, химических и биологических
факторов.
Решающее значение для роста м/организмов имеет рН среды.
Большинство м/организмов лучше растет, когда концентрации рН – 7,0. Грибы
предпочитают более низкие значения рН.
К температуре различные микроорганизмы относятся по-разному.
Большинство почвенных и водных бактерий лучше растут от 20 до 45 оС –
мезофилы. А спорообразующие бактерии лучше растут при температуре выше
45 оС – термофильные. Термофилы обитают в горячих источниках, гейзерах
Камчатки, самонагревающихся скоплениях различных органических
материалов (в зерне, сене, навозе, кампосте), в продуктах прошедших
тепловую обработку.
Другую крайность представляют психрофильные бактерии, которые
растут при температуре ниже 20 оС (железобактерии). Психрофилы
встречаются в полярных зонах, в северных морях, снегах Арктики, на
охлажденных продуктах.
Термотолерантными называют бактерии, которые могут расти в области
средних температур, но могут переносить и более высокие температуры (мин –
37 С, мах – 50 С).
К осмотическому давлению питательной среды большинство бактерий
проявляет большую устойчивость. Многие бактерии могут расти на средах с
содержанием солей от 0,1 до 10 %.
Всем аэробным бактериям в качестве акцептора необходим кислород.
Для бактерий, которые растут в тонких слоях жидкости в присутствии воздуха
кислорода достаточно. В жидких средах при большом объеме жидкости
аэробные бактерии могут расти только на поверхности, для этого требуется
аэрация.
Для роста строго анаэробных бактерий исключается доступ кислорода
воздуха. В технике применяют: прокипяченные, лишенные воздуха
питательные среды, закрытые без пузырьков сосуды, применение различных
веществ, поглощающих кислород и др.
Работа 12. Влияние света на развитие бактерий.
Рассеянный свет не оказывает заметного отрицательного влияния на
большинство бактерий. Некоторые бактерии, ассимилирующие углерод
посредством бактериального фотосинтеза (пурпурные и зеленые бактерии),
безусловно, нуждаются в свете как источнике энергии для синтеза.
32
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Под действием прямых солнечных лучей погибают многие микробы,
особенно патогенные ( возбудитель туберкулеза в течение 3–5 ч, вирус ящерав течение 2 ч). Сильным бактерицидным действием обладают
ультрафиолетовые лучи. Этим свойством ультрафиолетовых лучей пользуются
для дезинфекции воздуха в закрытых помещениях.
Задание
Выявить и сравнить эффект влияния света на рост и развитие культуры
кишечной палочки.
Материалы и оборудование
Чашки Петри с МПА, чистая культура кишечной палочки, предметные и
покровные стекла, микробиологические петли, спиртовка, черная бумага,
ножницы, клей, стеклянные шпатели, стерильные пробирки с 1 мл воды,
стерильные пипетки.
Ход работы
На поверхность застывшего мясо-пептонного агара обильно засевают
чистую культуру кишечной палочки. Для этого берут петлей бактерии из
чистой культуры и разводят их в 1 мл стерильной воды в пробирке.
Стерильной пипеткой несколько капель разведенной культуры наносят на
поверхность питательной среды и растирают по поверхности стеклянным
шпателем. На дно чашки клеем прикрепляют черную бумагу, в которой
вырезано «окно». Чашки помещают на несколько часов на прямой солнечный
свет таким образом, чтобы освещалась только та часть среды, которая
находится под «окном», в черной бумаге. После облучения чашки помещают в
термостат с температурой 43 °С. На следующем занятии чашки
просматривают и обнаруживают прекращение роста бактерий на тех участках
среды, которые подвергались освещению.
Работа 13. Влияние температуры на развитие бактерий
При
высокой
температуре
растут
только
термофильные
микроорганизмы, приспособившиеся к этим условиям. К высоким
температурам особенно чувствительны вегетативные формы. С повышением
температуры время жизни микроорганизмов сокращается. Так тифозные
бактерии при 47 оС погибают через 2 часа, при 59 оС – через 21 сек.
На устойчивость микробов к температуре оказывают влияние среда
обитания, условия, при которых образовались споры. Белки, жиры
предохраняют микробы от воздействия высокой температуры. Быстрее
наступает гибель микробов в кислой среде и медленнее в нейтральной среде.
Низкие температуры обычно не вызывают гибель микробов, а лишь
задерживают их рост. Жизнеспособность многих микробов сохраняется при
температуре, близкой к абсолютному нулю. Так в жидком воздухе (минус
190 оС) в течение 20 ч остается жизнеспособной кишечная палочка. Еще более
устойчивы к низким температурам вирусы.
33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Задание
Выявить и сравнить эффект действия различных температурных
режимов на рост и развитие культуры сенной и картофельной палочки.
Материалы и оборудование
Чашки Петри с МПА, стерильные пробирки с 1 мл воды, культуры
сенной и картофельной палочки, микробиологические петли, спиртовки,
стеклянные шпатели, пипетки.
Ход работы
Из культур сенной и картофельной палочек петлей переносят материал
в пробирки с 1 мл стерильной воды, тщательно размешивают взвесь,
взбалтывая ее. Затем пипетками берут полученную разводку бактерий и
наносят 2–3 капли на поверхность мясо-пептонного агара. Количество капель,
высеваемых на чашки, должно быть строго одинаковым. Стеклянным
шпателем растирают материал по поверхности агара. Чашки ставят в
термостаты с температурой 20 и 50 °С и в холодильник при температуре +4 °С.
На следующем занятии наблюдают результаты. Делают вывод об
оптимальных температурных условиях для роста данного вида бактерии.
Работа 14. Изучение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
Антибиотики – это специфические продукты жизнедеятельности
микроорганизмов и их модификации, обладающие высокой физиологической
активностью по отношению к определенным группам микроорганизмов,
избирательно задерживая или полностью подавляя их рост.
К синтезу антибиотиков явным образом способны грибы из p.
Penicillium, актиномицеты и некоторые группы бактерий. Процесс
образования антибиотиков тесно связан с развитием организмов-продуцентов
и осуществляется, как правило, в фазу замедления роста. Для определения
спектра антимикробного действия антибиотика или чувствительности
микроорганизмов к антибиотикам используются методы, основанные на
способности антибиотика диффундировать в толщу агара.
Задание
Провести тестирование чувствительности к 3–4 антибиотикам культуры
микроорганизма методом бумажных дисков. Определить степень
чувствительности по величине зоны задержки роста.
Материалы и оборудование
Чашки
Петри
с
МПА,
культура
картофельной
палочки,
микробиологические петли, спиртовки, стерильные пинцеты, бумажные диски,
3–4 антибиотика.
Ход работы
На чашки Петри с подсушенной средой МПА засевают исследуемую
культуру сплошным газоном. Посев производят стерильным ватным
тампоном, смоченным суспензией исследуемой культуры. Стерильным
пинцетом на агар плотно накладывают индикаторные бумажные диски (4–5
34
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
штук), пропитанные раствором определенного антибиотика на равном
расстоянии друг от друга и на расстоянии около 2,5 см от центра чашки.
Диски номеруют на обратной стороне дна чашки. Засеянные чашки с
нанесенными дисками термостатируют (вверх дном) при 37 °С в течение
16–18 ч.
Антибиотики, диффундирующие в толщу агара, предотвращают или
задерживают рост чувствительных к ним культур микроорганизмов, что
проявляется в образовании вокруг соответствующих дисков зоны угнетения
роста, четко выделяющейся на фоне сплошного газона роста тестируемой
культуры.
Величина зоны угнетения определяет степень чувствительности
микроорганизмов к данному антибиотику:
Диаметр зоны задержки
Степень чувствительности к
роста, мм
антибиотику:
более 25
высокочувствительные
15–25
чувствительные
10–14
малочувствительные
менее 10 и полное отсутствие
устойчивые
Работа 15. Изучение фенотипической изменчивости Proteus vulgaris
под действием фенола
Химические вещества могут оказывать различное действие на
микроорганизмы: служить источником питания, стимулировать и подавлять
рост, воздействовать на генетическом уровне, не оказывать какого-либо
влияния.
Химические вещества, уничтожающие микроорганизмы в окружающей
среде, называют дезинфицирующими.
Антимикробные химические вещества могут вызывать повреждение
генетического аппарата, изменение признаков, свойств микробов. Они могут
обладать бактерицидным, вирулицидным, фунгицидным действием и т.д.
К химическим сильнодействующим веществам: отравляющие (иприт),
лекарственные (йод, пероксид водорода), кислоты (азотистая) и др.
Задание
Провести посев культуры протея на среду МПА и МПА с фенолом.
Описать характер роста протея на этих среда. Промикроскопировать с
объективом 100х.
Материалы и оборудование
Чашки Петри с МПА, культура Proteus vulgaris , микробиологические
петли, спиртовки, черная, стерильные пробирки с 1 мл воды, стерильные
пипетки, 01 % раствор фенола.
Ход работы
Для изучения фенотипической изменчивости Proteus vulgaris культивируют на скошенной среде МПА и МПА с фенолом. Для приготовления
среды МПА с фенолом в пробирку с 3 мл МПА, предварительно
35
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
расплавленного на водяной бане, добавляют 0,3 мл 1 % раствора фенола,
готовят скошенный агар.
После затвердения агара культуру Протея засевают петлей в каплю
сконденсированной воды у основания скошенного агара на две питательные
среды. Культуру инкубируют 24 ч при 37 °С.
На чашке с мясо-пептонным агаром без фенола протей дает ползучий
рост, затягивая всю поверхность агара. На второй чашке, где к мясо пептонному агару добавлен фенол, наблюдается рост отдельных очерченных
колоний. Протей в присутствии фенола не образует жгутиков, утрачивает
подвижность. Это пример фенотипической изменчивости. При пересеве на
среду без фенола протей снова дает ползучий рост.
Контрольные вопросы.
1. Как и какие факторы внешней среды влияют на микроорганизмы?
2. Какова природа действия низких и высоких температур на
микроорганизмы?
3. Одинакова ли термостойкость вегетативных клеток разных видов
бактерий?
4. Как влияет на микроорганизм рН среды?
5. В скаких пределах значении рН развиваются бактерии, жрожжи,
грибы?
6. Зачем вводят в питательную среду различные минеральные соли и
сахар?
7. Какие химичекие вещества применяют для дезинфекции?
8. Какие взаимоотношения могут быть между микроорганизмами?
9. Какие способы хранения пищевых продуктов основаны на
использовании низких и высоких температур?
36
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ТЕМА 4. ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ
СОЕДИНЕНИЙ УГЛЕРОДА
Микроорганизмы в основном получают энергию при высвобождении ее
из безазотистых органических веществ. Только небольшая их часть может
использовать солнечную энергию или энергию окисления минеральных
соединений. В зависимости от того, каким путем идет разложение
органических веществ, различают брожение, при котором высвобождение
энергии происходит без доступа свободного кислорода, и дыхание, или
окисление, когда выделение энергии происходит в аэробных условиях. Во
втором случае энергия высвобождается полностью, и в качестве конечных
продуктов окисления выделяются СО 2 и Н2О.
Брожение сопровождается частичным высвобождением энергии,
заключенной в органическом веществе. Поэтому среди конечных продуктов
этого процесса всегда находятся неполностью окислившиеся вещества,
содержащие запасы химической энергии, – спирт, молочная кислота и др. В
зависимости от основного продукта, образующегося в ходе этих процессов,
брожения получили соответствующие названия: спиртовое, молочнокислое,
маслянокислое и др.
Брожения, осуществляемые микроорганизмами, имеют большое
значение в природе и широко используются в практической деятельности
человека. Они лежат в основе пивоварения, виноделия, квашения овощей,
силосования, переработки молока в кисломолочные продукты и сыр, мочения
волокнистых растений (лен) и т. д.
Работа 16. Спиртовое брожение
Спиртовое брожение – это процесс превращения углеводов, вызываемый
дрожжами, некоторыми видами бактерий (Zymomonas mobilis, Sarcina
ventriculi и др.) и отдельными представителями мукоровых грибов. Однако
практическое значение имеет лишь спиртовое брожение, осуществляемое
дрожжами.
Дрожжи встречаются на поверхности растений, плодов, ягод, зерна, в
воздухе, почве. Это одноклеточные, неподвижные организмы диаметром 8–15
мкм (для сравнения: диаметр бактериальной клетки 0,5–0,7 мкм). Клетки
дрожжей округлой, овальной или несколько удлиненной формы, содержат
хорошо заметное под микроскопом ядро. В них встречаются различные
включения: капли жира и волютина, сильно преломляющие свет; гликоген.
Дрожжи сбраживают углеводы (моно- и дисахариды) с образованием
этилового спирта по схеме:
С6Н12О6 = 2СН3СН2ОН + 2СО2.
Источником азота служат пептоны, аминокислоты и аммонийные соли.
Дрожжи дезаминируют аминокислоты, потребляя освобождающийся при этом
азот. Образующиеся в процессе реакции высокомолекулярные спирты
составляют главную часть сивушных масел.
37
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Нормальное брожение протекает в кислой среде, при рН 4–5. В
щелочной среде в результате брожения образуется глицерин. Наибольшая
скорость брожения при температуре 30 оС. При температуре 45–50 оС
брожение прекращается в результате гибели клеток дрожжей. Снижение
температуры замедляет ход брожения, но полностью оно не прекращается
даже при температуре ниже 0 оС.
С энергетической точки зрения брожение — процесс малоэффективный.
Так, если при окислении 1 граммолекулы глюкозы до СО 2 и Н2О в процессе
аэробного дыхания синтезируется 36 моль АТФ, то в процессе спиртового
брожения - всего 2 моль АТФ.
Дрожжи могут переключать один тип обмена веществ (аэробный) на
другой (анаэробный).
По характеру брожения дрожжи подразделяют на верховые и низовые.
Брожение, вызываемое верховыми дрожжими, протекает быстро и бурно при
температуре 20–28 оС. На поверхности бродящей жидкости образуется много
пены и под действием выделяющегося углекислого газа дрожжи выносятся в
верхние слои субстрата. По окончании брожения дрожжи оседают на дно
бродильных сосудов рыхлым слоем.
Брожение, которое вызывают низовые дрожжи, протекает медленно при
температуре 5–10 оС. Газ выделяется постепенно, пены образуется меньше,
дрожжи быстро оседают на дно бродильных емкостей.
Этиловый спирт, образующийся в процессе брожения, неблагоприятно
влияет на дрожжи. Накопление дрожжами спирта в концентрации 2–5 %
действует на них угнетающе. В большинстве случаев брожение прекращается
при накоплении дрожжами 12–14 % (объемных) спирта.
Спиртовое брожение лежит в основе виноделия, пивоварения. В
хлебопекарной промышленности дрожжи выполняют роль биологических
разрыхлителей теста: при брожении и дыхании образуется диоксид углерода
СО2, благодаря чему увеличиваются объем теста при выпечке и пористость
хлеба.
Задание
1. Установить и сопоставить интенсивность спиртового брожения
дрожжей при температуре 25 и 10 оС.
2. Приготовить препарат «висячая капля», найти клетки в стадии
почкования и зарисовать их.
Материалы и оборудование
Питательная среда с сахарозой, дрожжи, колба с раствором Мейссля,
плоскодонные колбы, весы и разновесы, предметные и покровные стекла,
микробиологические петли, спиртовки, микроскоп.
Ход работы
Для изучения спиртового брожения используют синтетическую среду
следующего состава (в объемных процентах): сахароза – 15,0; пептон – 0,5;
КН2РО4 – 0,3; MgSО4 – 0,1.
38
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Опыт ставят в нестерильных условиях, однако благодаря созданию
элективных условий – учету избирательных потребностей возбудителей
спиртового брожения в среде будут развиваться преимущественно дрожжи.
При этом жизнедеятельность других групп микроорганизмов будет подавлена.
В 100 мл среды наливают в колбу Эрленмейера или плоскодонную колбу на
250–300 мл и внося туда около 0,5 г прессованных или щепотку сухих
дрожжей (рис.12). Колбу закрывают каучуковой пробкой, в которую вставлен
затвор Мейссля с резиновым клапаном Бунзена. В состав затвора Мейссля
входят три стеклянные детали: внутренняя стеклянная трубка (1), один конец
которой входит в колбу, а другой – во внутренний стеклянный резервуар (2),
имеющий внизу отверстия, соединяющие его с внешним (основным)
резервуаром (3), который имеет выход вверх и вниз. Выход вверх закрыт
толстостенной резиновой трубкой с небольшим продольным разрезом (клапан
Бунзена). Верхний конец резиновой трубки закрыт стеклянной бусиной.
Затвор легко пропускает выделяющийся при брожении диоксид углерода
(СО2), но испаряющаяся при инкубации в термостате влага, проходя через
слой концентрированной серной кислоты (H2S04), налитой в затвор,
поглощается ею. Клапан также пропускает выделяющийся из колбы СО 2, но не
дает возможности наружному воздуху проникать в колбу.
Рис. 12. Колба с затвором
Колбу взвешивают на технических весах с точностью до 0,01 г и ставят в
термостат при 25 оС (или в холодильник при 10 оС).
Определение СО 2.
Диоксид углерода, образующийся при брожении, определяют по
разности массы колбы при постановке опыта и после его окончания.
Завершение процесса брожения устанавливают по прекращению
газообразования. Брожение обычно продолжается 2–3 дня. Несмотря на то что
колбу взвешивают только на технических весах, учет СО 2 получается
39
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
достаточно точным, так как в процессе брожения его выделяется много. Почти
50% сброженного сахара превращается в диоксид углерода:
С6Н12О6 = 2СН3СН2ОН + 2СО2
180
92 (2x46)
88 (2x44)
В опыте среда содержит 15 г сахара. При этом может выделиться 7–7,5 г
СО2. Расчет количества образовавшегося спирта и сброженного сахара проводят, исходя из массы выделившегося диоксида углерода в соответствии с
уравнением спиртового брожения.
Пример расчет: В процессе брожения образовалось 6 г СО 2. Находим
массы выделившегося спирта (х) и сброженного сахара (у):
88 г СО2 соответствуют 92 г СН3СН2ОН
6 г СО2
x СН3СН2ОН
х = 6 • 92/88 = 6,3 (г);
88 г СО2 соответствуют 180 г С 6Н12О6
6 г СО2
y С6Н12О6
y = 6 • 180/88 = 12,3 (г).
Определение интенсивности брожения.
Под интенсивностью брожения понимают отношение массы
сброженного за определенный промежуток времени сахара к исходному его
количеству в процентах.
Пример расчета. Если бы за время инкубации подверглись брожению все
15 г сахара, то интенсивность брожения составила бы 100%. В результате же
опыта было сброжено 12,3 г сахара:
15 г сахара соответствуют 100% интенсивности брожения
12,3 г сахара
х интенсивности брожения
Х= 12,3 х 100 / 15 = 82 %
Микроскопирование дрожжей
Познакомиться с морфологией дрожжей можно при исследовании
препарата, приготовленного из бродящей жидкости. Для этого ее каплю стеклянной палочкой наносят на предметное стекло, накрывают покровным
стеклом и после нанесения капли кедрового масла микроскопируют с
иммерсионной системой объектива. При микроскопировании препарата в
раздавленной капле конденсор следует немного опустить. На препарате
обнаруживаются клетки (рис. 13) в стадии почкования - это Saccharomyces
cerevisiae.
Рис. 13. Почкующиеся дрожжевые клетки
40
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа 17. Молочнокислое брожение
Молочнокислое брожение – это процесс превращения молочнокислыми
бактериями сахара в молочную кислоту.
Молочнокислое брожение лежит в основе силосования, квашения
овощей, переработки молока в кисломолочные продукты и сыр; кислый вкус
черного хлеба определяется молочной кислотой. Молочнокислые бактерии
обитают на поверхности растений, в молоке, на пищевых продуктах, в
кишечнике человека и животных.
По конечным продуктам брожения молочнокислые бактерии можно
разделить на две группы:
- гомоферментативные, образующие из сахара в основном одну
молочную кислоту
С6Н12О6 = 2СН3СНОНСООН
глюкоза
Молочная кислота
- гетероферментативные, образующие наряду с молочной кислотой
значительные количества побочных продуктов
С6Н12О6 = СН3СНОНСООН + СН3СООН + СН3СН2ОН + СО2
глюкоза
молочная
кислота
этиловый
спирт
уксусная
кислота
диоксид
углерода
2С6Н1206 = 2СН3СНОНСООН + ЗСН3СООН (бифидоброжение)
Молочнокислые бактерии бывают шариковидной (стрептококки) и
палочковидной формы (рис. 14). Они неподвижны, не образуют спор,
являются сапрофитами, факультативными анаэробами. Большинство
палочковидных молочнокислых бактерий образует кислоты больше, чем
шариковидные.
Оптимальная температура развития различных видов молочнокислых
бактерий неодинакова: например, молочнокислого стрептококка (Streptococcus
lactis) 30–35 оС, термофильного стрептококка (Streptococcus thermоhi lus)
40–45оС, ацидофильной палочки (Lactobact. acidophilum) 40 оС.
Рис. 14. Молочнокислые бактерии:
а – Streptococcus lactis; б – Streptococcus thermоhilus; в – Lactobact. acidophilum
Молочнокислые бактерии сбраживают моно- и дисахариды. Чаще
бактерии, обитающие в молоке, сбраживают лактозу, но никак не
воздействуют или слабо воздействуют на сахарозу.
41
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Источниками азота для группы молочнокислых бактерий служат
пептоны, смесь аминокислот. Большинство нуждается в ряде витаминов.
Задание
1. Определить кислотность свежего молока и сравнить его с
кислотностью сквашенного молока
2.Установить накопления молочнокислых бактерий микроскопическим
путем.
3. Сравнить микрофлору молока, заквашенного молочнокислыми
бактериями, и молока, подвергшегося самоскисанию.
4. Провести качественную реакцию на молочную кислоту.
Материалы и оборудование
Свежее молоко, колбы на 100 мл, колбы Эрленмейера, пипетки, бюретка,
плитка, термостат, микроскоп, предметные и покровные стекла,
микробиологические петли, спиртовки, 0,1 н. раствор NaOH, фенолфталеин,
краситель – мителеновая синь, 10 %-ый раствор AgNО3, 5 %-ый раствор
КмnO4, Н2SО4.
Ход работы
Сначала определить титруемую кислотность молока, взятого для
культивирования молочнокислых бактерий.
Количество молочной кислоты устанавливают по разности между
объемами 0,1 н. раствора NaOH, пошедшего на титрование молока в конце
опыта, и при его постановке.
Для титрования берут 5–10 мл (лучше 10 мл) помещают его в колбу на
100 мл, добавляют 20 мл дистиллированной воды, 1–2 капли фенолфталеина и
титруют 0,1 н. раствором NaOH при постоянном взбалтывании до появления
устойчивой слабо-розовой окраски.
Кислотность молока выражают в градусах Тернера (Т) или процентах
молочной кислоты. Так, 1 °Т соответствует 1 мл 0,1 н. раствора щелочи,
пошедшей на титрование 100 мл молока. Следовательно, если на титрование
10 мл молока пошло Х мл щелочи, то для выражения кислотности молока в
градусах Тернера нужно значение Х умножить на 10. Кислотность свежего
молока не должна превышать 22 оТ.
Чтобы выразить кислотность в процентах молочной кислоты, количество
0,1 н. раствора NaOH (в мл), потраченное на титрование 100 мл молока,
умножают на 0,009, так как 1 мл 0,1 н. NaOH нейтрализует эквивалентное
количество молочной кислоты. Молекулярная масса молочной кислоты
составляет 90. Для приготовления 1 л 1 н. раствора требуется 90 г кислоты. В
1л 0,1 н. раствора содержится 9 г, а в 1 мл – 0,009 г молочной кислоты.
Параллельно выполняют второй вариант опыта: в две другие колбочки
(на 50 мл) налить молоко приблизительно на ¾ их объема и закрыть ватными
пробками. Одну колбу с молоком пастеризовать в течение 10 мин на водяной
бане при 80 оС, затем охладить до 30 оС и заразить чистой культурой
молочнокислых бактерий (молочнокислым стрептоккоком или ацедофильной
палочкой).
Молоко,
заквашенное
молочнокислым
стрептоккоком
42
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
термостатировать при 30–35 оС, заквашенное ацедофильной палочко1 – при
40-42 оС. Вторую колбочку с молоком поставить для его самоскисания в
термостат с температурой 30 оС..
Микроскопирование молочнокислых бактерий
Для микроскопических наблюдений за молочнокислыми бактериями
готовят препарат из прокисшего молока. Бактериологическую петлю вводят в
сгусток и, повернув вокруг оси, извлекают, прикасаясь ею к пленке, которую
образует молочная плесень. Сгусток размазывают по предметному стеклу
очень тонким слоем без воды. Сушат на воздухе. Фиксируют смесью спирта с
эфиром (приблизительно 1:1), несколько раз нанося смесь на мазок и сливая
ее. При такой фиксации не только погибают и прикрепляются к стеклу
бактерии, но и с помощью эфира извлекается и удаляется жир, капли которого
на препарате мешают окраске и микроскопированию.
Фиксированный препарат окрашивают метиленовым синим 2–3 мин,
промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией.
Метиленовый синий – лучший краситель для молочнокислых бактерий
молока, так как он слабо окрашивает основной фон (казеин) и хорошо – клетки
микроорганизмов. На препарате преобладают мелкие округлые клетки
Lactococcus lactis, соединенные в короткие цепочки. Эта бактерия – возбудитель естественного скисания молока в средних широтах. Оптимальная
температура для ее развития – 30 оС. Она способствует накоплению в молоке
до 1 % молочной кислоты.
При микроскопировании молока, заквашенного ацидофильной палочкой
выявляется накопление длинных, тонких бесспоровых палочек, в молоке
заквашенном теромофильным стрептококком – длинные цепочки каков, в
молоке самозакисшем – преобладание коротких цепочек или попарно
соединенных кокков.
Если на поверхности прокисшего молока появилась пленка, то в мазке
обнаруживается также и молочная плесень (рис. 15). Прямоугольные или
овальные клетки ее отличаются от молочнокислых бактерий большими
размерами.
Рис. 15. Молочная плесень
43
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Можно приготовить также фиксированные препараты из кисломолочных
продуктов (йогурта, кефира, ацидофилина, ряженки, бифидока и др.) и
зарисовать доминирующие формы.
Качественные реакции на молочную кислоту.
После определения титруемой кислотности оставшееся скисшее молоко
отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр. Фильтрат используют
для качественных реакций на молочную кислоту.
Для проведения реакции «серебряного зеркала» молочную кислоту
превращают в уксусный альдегид. Реакция происходит в кислой среде при
температуре кипения в присутствии КмnО 4. Результатом взаимодействия
уксусного альдегида с аммиачным раствором серебра является образование
металлического серебра (серебристое окрашивание).
Последовательность проведения этой качественной реакции на
молочную кислоту следующая. В коническую колбу на 100 мл набирают
пипеткой 5 мл фильтрата, добавляют 2 мл концентрированной серной кислоты
и нагревают на асбестовой сетке до начала кипения, периодически взбалтывая.
Затем, продолжая кипячение и помешивание, пипеткой по каплям приливают 5
мл 5%-ного раствора КмnO 4, который при этом обесцвечивается. В результате
молочная кислота превращается в уксусный альдегид.
Для распознавания уксусного альдегида горлышко колбы без
промедления накрывают фильтровальной бумагой, смоченной аммиачным
раствором Ag NО 3.
Аммиачный раствор нитрата серебра готовят следующим образом: к
1–2 мл 10%-го раствора AgNО3 в пробирке добавляют по каплям аммиак:
сначала появляется осадок Ag2О, который затем растворяется в избытке
аммиака.
Аккуратно, чтобы не разорвать, фильтровальную бумагу прижимают к
краям горла колбы, продолжая нагревание. Уксусный альдегид улетучивается
и, реагируя с аммиачным раствором AgNО3, вызывает почернение бумаги,
имеющее серебристый оттенок, – это выделяется металлическое серебро.
Работа 18. Маслянокислое брожение
Маслянокислое брожение- это сложный биохимический процесс
превращения сахара маслянокислыми бактериями в анаэробных условиях с
образованием масляной кислоты, диоксида углерода и водорода
4С6Н1206 = ЗСН3СН2СН2СООН + 2СН3СООН + 8С02 + 8Н2
глюкоза
масляная
кислота
уксусная
кислота
диоксид водород
углерода
Кроме масляной, в процессе брожения в заметных количествах
образуется уксусная кислота, а при подкислении среды (до рН 5,5) –
значительные количества бутилового спирта и ацетона.
44
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Возбудители маслянокислого брожения - строгие анаэробы, подвижные
палочки с клостридиальным или плектридиальным типом спорообразования.
Клетки грамположительные, палочковидные, форма клетки может изменяться
в зависимости от условий среды. В молодом возрасте подвижны, образуют
споры, диаметр которых бывает больше толщины клетки. Маслянокислые
бактерии являются облигатными анаэробами, однако существуют все
переходные формы: от строгих анаэробов до почти аэротолерантных.
Маслянокислые бактерии широко распространены в почве (как правило,
содержатся в 90 % почвенных образцов), навозе, загрязненных водоемах, в
разлагающихся растительных остатках, молоке, на поверхности растений и т.
д.
Задание
1. Установить накопление маслянокислых бактерий микроскопическим
путем.
2. Провести качественную реакцию на масляную кислоту.
Материалы и оборудование
Неочищенный картофель, пробирки, мел, плитка, водяная баня,
предметные и покровные стекла, микробиологические петли, спиртовки,
микроскоп, раствор Люголя, 5 %-ый раствор хлорида железа.
Ход работы
Неочищенный картофель нарезают ломтиками, которые могут легко
войти в пробирку. Заполняют ими пробирку на 1/3 объема, добавляют щепотку
мела и заполняют водой почти доверху. Пробирки ставят на водяную баню
при температуре 80 °С на 10–15 мин. Затем пробирки закрывают пробками и
переносят в термостат с температурой 25 °С. В этих условиях уже через 2–3
дня в жидкости обнаруживают бактерии маслянокислого брожения.
Культура маслянокислых бактерий при этом является элективной. Для
их преимущественного развития созданы анаэробные условия, бесспоровые
формы убиты предварительным нагреванием, добавка мела нейтрализует
образующиеся кислоты и способствует развитию бактерий,
На следующем занятии жидкость микроскопируют и обнаруживают
главным образом Cl. Pasteurianum – подвижные палочки с закругленными
концами, одиночные и парные(Рис. 16). В старых культурах у одного из
концов клетки обнаруживают спору. При микроскопировании можно
рекомендовать добавление к капле культуралыюй жидкости капли раствора
Люголя. Маслянокислые бактерии содержат в своих клетках гранулезу, которая окрашивается раствором Люголя в синий цвет.
С культуралыюй жидкостью проводят качественную реакцию на
масляную кислоту. Для этого к 5 мл жидкости добавляют 2 мл 5 %-го хлорида
железа (III). При нагревании образуется маслянокислое железо коричневого
цвета.
45
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 16. Маслянокислые бактерии
Работа 19. Выделение уксуснокислых бактерий
Уксуснокислые бактерии широко распространены в природе. Они
встречаются на фруктах и овощах, в алкогольных напитках. Уксуснокислые
бактерии ведут процесс окисления этилового спирта в уксусный альдегид и
далее в уксусную кислоту. Процесс идет в строго аэробных условиях:
С2Н5ОН + 02>СН3СООН + Н20 + 494 кДж.
Уксуснокислые бактерии легко выделяются из пива. Уксуснокислые бактерии представляют собой грамотрицательные, палочковидные, бесспоровые,
строго аэробные организмы (рис. 17). Среди них есть подвижные и
неподвижные бактерии. Они
кислотоустойчивы, и некоторые могут
развиваться при рН среды до 3,2.
Оптимальная температура роста для различных уксуснокислых бактерий
20-35° С. Некоторые из них способны синтезировать витамины В6 В2, однако
многие сами нуждаются в витаминах и прежде всего в пантотеновой кислоте.
Уксуснокислые бактерии часто встречаются в виде длинных нитей и многие
образуют пленки на поверхности субстрата. Появление пленок связано с
ослизнением клеточных оболочек.
Рис. 17. Уксуснокислые бактерии Acetobacter aceti
Задание
1. Выявить накопление уксуснокислых бактерий по характерному для
них культуральному признаку – образованию пленки на поверхности и по
наличию в пиве уксусной кислоты.
46
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. Сопоставить результаты микроскопического исследования препаратов
пива из обеих колбочек.
3. Провести качественную реакцию на уксусную кислоту.
Материалы и оборудование
Пиво, конические колбы, предметные и покровные стекла,
микробиологические петли, микроскоп, 10 %-ый раствор соды, 5 %-ый
раствор уксусной кислоты, раствор хлорного железа, растворы красителей.
Ход работы
В две конические колбы наливают тонкий слой пива (0,5–1,0 см).
Толщина слоя пива имеет большое значение для исхода опыта, так как для
уксуснокислых бактерий должны быть созданы аэробные условия. В одну
колбу добавляют 1 мл 5 %-ой уксусной кислоты. Подкисление среды не будет
препятствовать развитию уксуснокислых бактерий, но будет ограничивать
рост посторонней микрофлоры. Колбы закрывают ватными пробками и ставят
в термостат при температуре 30 °С на 5–7 суток.
На следующем занятии колбы просматривают, описывают характер
образовавшихся пленок, микроскопируют окрашенные мазки, делают
качественную реакцию на уксусную кислоту. Для этого в пробирку налить 2
мл пива из колбочки, в которой при постановке опыта пиво не подкисляли
уксусной кислотой, добавить 4 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 10 %
раствора соды, 1-2 мл раствора хлорного железа. Смесь нагреть. При наличии
уксусной кислоты появляется красное окрашивание вследствие образования
ацетата железа (III).
Отметить, присутствуют ли дрожжи и как велико их число.
Работа 20. Микроорганизмы, разрушающие клетчатку
Клетчатка составляет от 15 до 60 % сухой массы растений. Отмершие
части растений попадают в почву и там подвергаются разрушению.
Разрушение клетчатки ведут бактерии, грибы и актиномицеты.
Трансформация клетчатковых масс идет в разных условиях аэрации, при
неодинаковой температуре и при различной рН среды.
Процесс разрушения клетчатки начинается с ферментативного
гидролиза. Под действием фермента целлюлазы клетчатка гидролизуется до
целлобиозы, далее целлобиоза под влиянием фермента целлобиазы переходит
в глюкозу.
Глюкоза в аэробных условиях окисляется микроорганизмами до
оксикислот, а затем до конечных продуктов – углекислого газа и воды.
Процесс сопровождается выделением большого количества энергии:
В анаэробных условиях глюкоза сбраживается по типу маслянокислого
брожения:
C6H12O6–CH3CH2CH2COOH+ СО2 + Н2 + х кДж.
Состав конечных продуктов может быть различным в зависимости от
вида микроорганизма, ведущего процесс разрушения клетчатки. В аэробных
47
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
условиях наиболее активно разрушают клетчатку бактерии, которые входят в
порядки Мухо-bacterlales и Cytophagales группы скользящих бактерий.
Род Cytophaga представлен длинными палочковидными клетками с
заостренными концами, несколько изогнутыми (2–10 мкм). В старой культуре
появляется много нитевидных и шаровидных инволюционных форм. Колонии
желтого, оранжевого, коричнево-бурого цвета, гладкие, слизистые. Эти бактерии широко распространены в почве (рис. 18).
Род Cellvibrio представлен мелкими, слегка изогнутыми палочками,
подвижными (2-4 мкм). Колонии охряно-желтые, зеленые, слизистые.
Встречаются в почве.
Род Cellfalcicula имеет вид коротких толстых палочек, серповидно
изогнутых, с заостренными концами (2,0 X 0,7 мкм). Образует слизистые
колонии зеленоватого, буро-палевого цвета. Выделяется из почвы.
Род Sorangium в молодой культуре имеет вид сравнительно толстых,
слегка изогнутых палочковидных клеток с закругленными концами (2–5 мкм).
При старении культуры образуются плодовые тела, состоящие из
микроцист. Палочковидные клетки укорачиваются, покрываются толстой
оболочкой, приобретая неправильные очертания. Колонии ярко-оранжевого,
фиолетового цвета. Легко выделяется из подзолистых луговых и
окультуренных почв, а также из кроличьего и конского навоза.
Род Polyangium представлен почти прямыми палочковидными клетками
с закругленными концами (3,5–8 мкм). При старении формируются овальные
микроцисты, которые соединяются в плодовые тела грушевидной формы.
Плодовые тела желтого, оранжевого цвета, сидят непосредственно на
субстрате. Выделяется из степных почв, заячьего и кроличьего помета, а также
с поверхности сыры деревьев.
Помимо бактерий, в аэробном разрушении клетчатки участвуют
плесневые грибы Aspergiltus, Penicillium, Fusariutn, Cldosporium, Trichoderma и
некоторые актиномицеты рода Streptomyces и рода Micromonospora.
В анаэробных условиях процесс разложения клетчатки идет за счет
мезофильных и термофильных бактерий рода Clostridium. Cl. Omelianskii
имеет вид длинных палочковидных клеток (4–8 мкм), в старых культурах
длина 10–15 мкм, расположены одиночно или соединены в нити. Споры
шаровидные, формируются на конце клетки, клетка принимает форму
барабанной палочки. Выделяется из почвы и воды. Оптимальная температура
роста 25–30 °С.
Из термофильных форм особо активно разрушает клетчатку Cl.
thermocellum. Он представлен прямыми или слегка изогнутыми палочками с
округлой спорой на конце клетки. Оптимальная температура роста 55–60 °С.
48
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 18. Бактерии, окисляющие клетчатку:
а – Cytophaga; б – Cellvibrio; в – Cellfalcicula; г – Polyangium, плодовые тела
Задание
Установить накопление анаэробных клетчаткоразрушающих бактерий
микроскопическим путем.
Материалы и оборудование
Питательная среда Имшенецкого, пробирки, фильтровальная бумага,
комочки почвы, предметные и покровные стекла, микробиологические петли,
микроскоп, растворы красителей.
Ход работы
Выделение анаэробных клетчаткоразрушающих бактерий
Для
получения
накопительной
культуры
анаэробных
клетчаткоразрушающих
бактерий
используют
питательную
среду
Имшенецкого.
Питательную среду разливают высоким слоем в большие пробирки и в
каждую пробирку нарезают 2–3 полоски фильтровальной бумаги длиной
6–8 см, шириной 0,5 см. Пробирки с питательной средой стерилизуют в
автоклаве при давлении 1 атм 20 мин. Пробирки заражают комочком почвы
или навоза. Часть пробирок помещают в термостат при температуре 30–35 °С
для выделения мезофильных форм, остальные пробирки выдерживают в
термостате
при
60–65
°С
для
накопления
термофильных
клетчаткоразрушающих бактерий.
При 60 °С через 3–4 суток в пробирках бурно начинается процесс
разрушения клетчатки, жидкость пенится, выделяются газы. Полоски
фильтровальной бумаги желтеют, ослизняются, постепенно превращаясь в
аморфную массу, и оседают на дно.
Брожение заканчивается на 8–10-е сутки. При температуре 30–35 °С
клетчатка разрушается медленнее и заканчивается через 2–3 недели.
Разрушенные массы клетчатки подвергают микроскопическому анализу.
Микробиологической петлей разрушенную клетчатку переносят на предметное стекло в каплю жидкости из пробирки и делают мазок.
Мазок окрашивают фуксином или генцианвиолетом и микроскопируют,
пользуясь объективом 100х.
В поле зрения микроскопа видны длинные палочки, спорулирующие
клетки типичной плектридиальной формы и свободнолежащие споры
49
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Контрольные вопросы
1. Характеристика возбудителя спиртового брожения
2. Какие факторы среды влияют на интенсивность спиртового
брожения?
3. Чем характеризуются возбудители молочнокислого брожения?
4. Чем отличаются возбудители гомоферментативного брожения от
возбудителей гетероферментативного брожения?
5. Какой тип питания и дыхания у молочнокислых бактерий?
6. Что такое маслянокислое брожение и каково его биологическое
значение для маслянокислых бактерий?
7. Какую форму клетки имеют маслянокислые бактерии и образуют ли
они споры?
8. Способны ли уксуснокислые бактерии образовывать споры?
9. Назовите оптимальную температуру роста для уксуснокислых
бактерий
10. С какого процесса начинается разрушение клетчатки?
50
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ТЕМА 5. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ
Многочисленные микробы окружающей среды участвуют в процессах
круговорота веществ в природе, уничтожают остатки погибших животных и
растений, повышают плодородие почвы, поддерживают устойчивое
равновесие в биосфере. В качестве нормальной микрофлоры они выполняют
ряд функций, полезных для организма человека.
Работа 21. Микробиологические методы исследования воды
Вода – естественная среда обитания многих микробов. Они широко
распространены в озерах, реках, морях и океанах. Численность микробов в
воде зависит от многих факторов: содержания органического вещества,
расположения и степени загрязненности водоема, скорости течения воды,
температуры окружающей среды, времени года и т. д.
Микронаселение воды может быть автохтонное – собственное,
порожденное средой обитания, и аллохтонное, поступившее извне.
Гидросфера водоемов представляет собой сложные взаимоотношения
биоценозов: развивающегося на поверхности воды нейстона, в толще воды –
планктона и на дне – бентоса. Обсеменение воды микробами выражают
сапробностью. По содержанию в воде микробоценозов ее делят на три зоны.
Полисапробная зона характеризуется развитием микробоценозов в
сильнозагрязненной воде, с большим количеством легкоразлагающихся и
легкоусваиваюшихся веществ. Микробиологические процессы проходят в
почти анаэробных условиях, поскольку в такой среде быстро поглощается
кислород. В процессе разложения появляется неприятный запах в результате
образования метана, меркаптанов, сероводорода. Количество микробов в 1 мл
воды достигает нескольких миллионов.
Мезосапробная зона – микробоценозы развиваются в среде с меньшим
содержанием органического вещества. В ней интенсивнее происходят
минерализация, а также процессы окисления и нитрификации. Количество
кишечной палочки уменьшается, а общее число микробов не превышает 100
тыс. в 1 мл воды.
Олигосапробная зона – ее микробоценозы немногочисленны: в 1 мл
воды содержатся десятки или сотни микробных клеток; кишечная палочка
отсутствует. Минерализованы органические вещества; самоочищение воды
закончилось или находится в стадии завершения.
В водах пресных водоемов обнаруживаются палочковидные
(псевдомонады, аэромонады и др.), кокковидные (микрококки) и извитые
бактерии. Загрязнение воды органическими веществами сопровождается
увеличением анаэробных и аэробных бактерий, а также грибов. Особенно
много анаэробов в иле, на дне водоемов. Микрофлора воды выполняет роль
активного фактора в процессе самоочищения ее от органических отходов,
которые утилизируются микроорганизмами. С загрязненными ливневыми,
51
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
талыми и сточными водами в озера и реки попадают представители
нормальной микрофлоры человека и животных (кишечная палочка,
нтерококки, клостридии) и возбудители кишечных инфекций – брюшного
тифа, паратифов, дизентерии, холеры и др. именно поэтому вода является
фактором передачи возбудителей многих инфекционных заболеваний.
Отбор проб воды
В зависимости от задачи исследования определяют место и время отбора
пробы.
Для исследования воды открытых водоемов, а также колодцев отбирают
пробы воды на глубине 10–15 см от поверхности в стерильные флаконы. Для
отбора проб водопроводной воды используют стерильные склянки
вместимостью 500 мл с ватно-марлевыми пробками. Бактериологическое
исследование отобранных проб должно производиться не позднее 2 ч с
момента отбора или не позднее 6 ч при хранении пробы при 1–5° С.
Задание
Определить количество микроорганизмов
водопроводной воде и загрязненных водах.
(микробное число) в
Материалы и оборудование
Предметные и покровные стекла, микробиологическая петля, спиртовка,
0,1%-ный раствор агар-агара, стерильные чашки Петри, объективный
микрометр, микроскоп, образцы воды для исследования
Ход работы
Методы определения микробного числа
В 1 мл исследуемой воды определяют содержание мезофильных аэробов
и факультативных анаэробов, способных при 37 °С в течение суток на
питательной среде образовывать колонии, видимые невооруженным глазом
или при увеличении в 2–5 раз.
При исследовании водопроводной воды в каждую из двух чашек вносят
по 1–0,1 мл чистых вод и по 0,01 и 0,001 мл более загрязненных. При
определении микробного числа сильно загрязненных вод и сточных жидкостей
исследуют по 0,0001 и 0,00001 мл.
Для посева 0,1 мл и меньших объемов исследуемую воду разводят
стерильной дистиллированной водой. Готовят последовательно 10-кратные
разведения
По 1 мл каждого разведения вносят в 2 чашки Петри и заливают тонким
слоем предварительно растопленного и остуженного до 45° С питательного
агара (10–12 мл агара). После интенсивного перемешивания среде дают
застыть па строго горизонтальной поверхности. Посевы выращивают в
течение суток при 37° С. С лупой при увеличении в 2–5 раз подсчитывают все
выросшие колонии. Учитывают результаты только на тех чашках, где число
колоний колеблется в пределах от 30 до 300, и производят перерасчет
содержания бактерии в I мл исследуемой воды.
Общее число микробных колоний, выросших на всей чашке Петри,
умножают на разведения, из которых был сделан высев 1 мл (чтобы перевести
52
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
на 1 мл исследуемой воды). Затем определяют среднее арифметическое число
колоний-микробное число исследуемой пробы.
Работа 22. Микробиологические методы исследования воздуха
Воздух не является благоприятной средой обитания микроорганизмов, а
является транзитной средой. Микроорганизмы находятся в воздухе обычно
вместе с частицами пыли. В воздухе микроорганизмы лишь временно могут
сохранять жизнеспособность, и многие из них более или менее быстро
погибают под влиянием высушивания и солнечных лучей.
Количественный и качественный состав микрофлоры атмосферного
воздуха может существенно изменяться в зависимости от климатических
условий, времени года и других факторов. Над морями, горами, ледяными
полями Арктики воздух содержит очень мало микробов. Значительно больше
их в воздухе населенных местностей, особенно крупных промышленных го родов. Чем больше в воздухе пыли, тем больше в нем микроорганизмов. Каждая
пылинка может нести на себе множество микробов.
Состав микрофлоры воздуха нестабилен. В воздухе находятся обычно
наиболее устойчивые против высыхания и действия ультрафиолетовых лучей
различные микрококки, сарцины, споры бактерий и грибов, дрожжи. Могут
встречаться и болезнетворные микроорганизмы, особенно устойчивые к высушиванию, например туберкулезные палочки, патогенные стрептококки и
стафилококки, вирусы. Человек в среднем за сутки вдыхает 12 000 л воздуха.
При этом в дыхательных путях задерживаются 99,8 % микроорганизмов,
содержащихся в воздухе.
В воздухе закрытых помещений микробов значительно больше, чем в
открытых воздушных бассейнах, особенно зимой, при недостаточном
проветривании. Состав микрофлоры и количество микроорганизмов,
обнаруживаемых в 1 м3 воздуха (микробное число воздуха), зависят от
санитарно-гигиенического режима, числа находящихся в помещении людей,
состояния их здоровья и других условий.
Для микробиологического исследования воздуха пользуются методами,
в основу которых положены оседание (седиментация) и аспирация. При
помощи седиментационных методов можно получить общее представление о
встречающихся в воздухе микроорганизмах. Аспирационные методы дают
возможность определить не только качественное, но и количественное
содержание бактерий в определенном объеме воздуха.
Задание
Определить содержание микроорганизмов в воздухе лабораториых
помещений методом седиментации
Материалы и оборудование
Чашки Петри, питательная среда МПА.
Ход работы
Метод оседания.
53
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Простейший метод бактериологического исследования воздуха - метод
оседания, который основан на оседании бактериальных частиц и капель под
влиянием силы тяжести на поверхности агара открытой чашки Петри. Чашки с
МПА экспонируют 5–10–15 мин в зависимости от предполагаемого
бактериального загрязнения. Метод оседания не дает количественного
представления о содержании микрофлоры в воздухе, так как на открытых
чашках плохо улавливаются тонкодисперсные фракции бактериальных капель
и пылевых частиц, а задерживаются главным образом крупные пылевые
частицы, которые оседают или прибиваются токами воздуха к поверхности
среды. Поэтому перерасчет по Омелянскому (на поверхность 100 см 2 агара
оседает за 5 мин такое количество бактерий, которое содержится в 10 л
воздуха) малопригоден для количественного изучения микрофлоры воздуха
помещений и абсолютно не пригоден для атмосферного воздуха, где имеют
место большие колебания в скорости его движения. Тем не менее метод
оседания может быть использован в тех случаях, когда отсутствуют более
совершенные приборы и методы или когда нет источника электроэнергии. Для
расчета микробного числа воздуха используют следующую формулу:
Х= а . 100 . 1000 . 5
в . 10 . t
где Х – количество микробов в 1 м3 воздуха; а – количество колоний в чашке;
в – площадь чашки; t – время экспозиции: 5 – время экспозиции; 10 – объем
воздуха из которого происходит оседание микробов за 5 мин, л; 100 –
площадь, на которую происходит оседание, см2; 1000 – объем воздуха, л.
Площадь чашки в зависимости от диаметра:
Диаметр чашки, см
Площадь чашки, см'
8
50
9
63
10
78,5
Работа 23. Микробиологические методы исследования почвы
Почва является средой обитания микроорганизмов. Они находят в почве
все условия, необходимые для своего развития: пищу, влагу и защиту от
губительного влияния прямых солнечных лучей и высушивания. В 1 г почвы
содержится от 1 до 10 млрд. клеток микроорганизмов.
В почве активно протекают процессы разложения органических
природных веществ при участии широкого разнообразия сапрофитных
микроорганизмов. Микрофлора почвы представлена разнообразными видами
бактерий, актиномицетов, грибов, водорослей и простейших животных. К
постоянным обитателям почвы относятся различные спороносные бактерии. Из
аэробов чаще встречаются Bacillus mycoides, В. mesentericus, В. megatherium,
из анаэробов Clostridium sporogenes, С. perfringens, С. putrificum.
Для выявления, изучения и учета численности почвенных микроорганизмов используют прямые методы микроскопирования и методы посева
54
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
из разведении почвенной суспензии на плотные и жидкие среды. Для прямого
микроскопического изучения почвы применяется метод Виноградского в
различных модификациях. Суть его заключается в том, что почвенную
суспензию, нанесенную на предметное стекло, фиксируют и окрашивают
карболовым эритрозином. Окрашенные клетки просчитывают под
микроскопом.
Задание
1. Родсчитать общее количество бактерий, количество споровых и
неспоровых форм в почве методом посева на МПА. Промикроскопировать с
объективом 100х.
2. Подсчитать количество актиномицетов в почве методом
поверхностного посева на среду Чапека. Промикроскопировать с объективом
40х.
3. Подсчитать количество грибов и дрожжей в почве методом
поверъностного посева на сусло-агар. Промикроскопировать с объективом
40х.
Материалы и оборудование
Предметные и покровные стекла, микробиологические петли, спиртовки,
стерильные чашки Петри, микроскоп, питательные среды6 МПА, Чапека,
сусло-агар, образцы почвы для исследования
Ход работы
Отбор и подготовка почвенного образца для микробиологического
анализа
При отборе образцов почвы учитывают чрезвычайную макро-, ме-зо- и
микрогетерогенность как микробиологических показателей почвы, так и
других ее свойств. С пробной площадки отбирают 3–10 образцов и
анализируют их отдельно.
Образцы почв для проведения микробиологических исследований
отбирают в стерильные пергаментные пакеты, полиэтиленовые пакеты или
стеклянную посуду с ватными пробками и др.
При отсутствии возможности анализировать образцы непосредственно
после сбора, их в течение нескольких часов высушивают на воздухе,
предохраняя от прямых солнечных лучей.
При подготовке почв к микробиологическому анализу необходимо
провести следующие операции: разрушить почвенные агрегаты;
десорбировать микроорганизмы с поверхности почвенных частиц и из
органоминерального геля и дезагрегировать микроколонии микроорганизмов.
Для разрушения почвенных агрегатов чаще всего используют метод
растирания почвы, увлажненной до пастообразного состояния в течение 5 мин
в стерильной фарфоровой чашечке резиновым пестиком или пальцем в
резиновой перчатке.
Перед посевом влажную или сухую почву высыпают на часовое стекло,
протертое спиртом, и освобождают от посторонних включений.
55
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Техника посева
Навеску подготовленной почвы в 1 г переносят в колбу со 100 мл
стерильной водопроводной воды. Готовят разведения почвенной сус пензии,
для чего 1 мл суспензии из колбы последовательно переносят в ряд пробирок с
10 мл стерильной водопроводной воды.
Посев на плотные среды производится из разных разведении. Разведение
для высева подбирают таким образом, чтобы на чашке развивалось 50–200
колоний. Из каждого образца берут не менее 3-х повторных навесок и каждую
высевают не менее чем на 3 чашках.
На поверхность застывшей и подсушенной среды наносят каплю
почвенной суспензии определенного разведения и с помощью стеклянного
шпателя распределяют ее по всему агару. Засеянные чашки переворачивают
вверх дном и помещают в термостат. Сроки учета микроорганизмов зависят от
состава питательной среды и группы учитываемых микроорганизмов.
На МПА обычно на 2–3 сутки инкубации учитывают споровые и
неспоровые формы бактерий. На среде Чапека на 5–7-е сутки учитывают
колонии актиномицетов, на сусло-агаре на 5–7-е сутки – колонии грибов и
дрожжей.
Подсчет количества колоний на чашке проводят обычно со дна чашки в
проходящем свете. На месте подсчитанной колонии чернилами по стеклу или
маркером ставится точка.
Подсчитав количество колоний на всех параллельных чашках, вычисляют их среднее число на одной чашке и затем делают пересчет для
определения содержания микроорганизмов в 1 г почвы по формуле:
а = б .в . г,
где а – количество клеток в 1 г почвы, б – среднее количество колоний на
чашке; в – разведение, из которого сделан посев, г – количество капель в 1 мл
суспензии.
Результаты обрабатывают статистически, рассчитывают ошибку
среднего арифметического, среднее квадратичное отклонение, коэффициент
вариации.
Контрольные вопросы:
1. Какие микробиоценозы существуют в водоемах?
2. Зоны сапробности и их характеристика.
3. Какие методы исследования используют при определении загрязнения
воды?
4. Какова роль атмосферы в распространении возбудителей
инфекционных заболеваний?
5. Назовите методы микробиологического исследования воздуха?
6. Каковы роль микроорганизмов в формировании почвы?
7. Какие существуют взаимоотношения между микроорганизмами в
почве?
56
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Нетрусов А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов,
М.А.Егорова, Л.М. Захарчук. – М.: Академия, 2005. – 608 с.
2. Жарикова Г.Г. Микробиология продовольственных товаров.
Санитария и гигиена / Г.Г. Жариковам. – М.: Академия, 2005. – 304 с.
3. Домарадскй И.В. Основы биотехнологии / И.В. Домарадский,
А.В. Ермалаев. – СПб.: Высшая школа, 1995. – 600 с.
4. Градова Н.Б. Лабораторный практикум по общей микробиологии /
Н.Б. Градова, Е.С. Бабусенки. – М.: ДеЛи принт, 2004. – 129 с.
5. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З Теппер,
В.К Шильникова. – М.: Дрофа, 2005. – 185 с.
57
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Составитель: АБДЮКОВА Гузалия Мазгаровна
ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ
Методические указания
по выполнению лабораторных работ
Технический редактор: Р.С. Каримуллина
Подписано в печать 21.01.2011. Формат 60×84 1/16.
Бумага писчая. Гарнитура «Таймс».
Усл. печ. л. 3,37. Уч.-изд. 4. Тираж 100 экз. Заказ № 05.
Отпечатано с готовых авторских оригиналов
на ризографе в издательском отделе
Уфимской государственной академии экономики и сервиса
480078, г. Уфа, ул. Чернышевского, 145, к. 227; тел. (347) 241-69-85.
58
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
59
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
60
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
60
Размер файла
1 110 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа