close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

107

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
УНИВЕРСИТЕТ»
СОВРЕМЕННЫЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ
И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
Учебное пособие
Составители:
О. А. Сафонова
А. В. Семенихина
Т. И. Рахманова
Т. Н. Попова
И. Ю. Степанова
Издательско-полиграфический центр
Воронежского государственного университета
2009
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета 13 ноября 2008 г., протокол № 3
Рецензент: д-р биол. наук, проф. О. В. Путинцева
Учебное пособие подготовлено на кафедре медицинской биохимии и микробиологии биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.
Рекомендовано для студентов 3, 4, 5 курсов дневного и 4, 5, 6 курсов вечернего отделения биолого-почвенного факультета.
Для специальности: 020201 – Биология
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ...........................................................................................................5
1. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В ЛАБОРАТОРНОЙ
ДИАГНОСТИКЕ ...................................................................................................6
1.1. Реакция агглютинации (РА)................................................................7
1.1.1. Ориентировочная РА для идентификации микроба ..............8
1.2. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) ...................................8
1.3. Иммуноферментный анализ ............................................................. 10
1.3.1. Общие принципы метода гетерогенного ИФА..................... 16
1.3.2. Динамика изменений показателей ИФА-тестов
при инфицировании .......................................................................... 19
2. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ............................................. 22
2.1. Выделение и анализ нуклеиновых кислот....................................... 23
2.1.1. Качественный анализ.............................................................. 24
2.1.2. Количественный анализ нуклеиновых кислот ..................... 24
2.2. Некоторые ферменты, применяемые в молекулярной
диагностике ............................................................................................... 25
2.2.1. Нуклеазы и их применение .................................................... 25
2.2.2. Ингибиторы РНКаз и их практическое применение............ 25
2.2.3. Рестриктазы ............................................................................. 26
2.3. Гибридизационные методы .............................................................. 26
2.3.1. Получение зондов ................................................................... 29
2.3.2. Метод гибридизации в растворе ............................................ 31
2.3.3. Метод гибридизации на твердом носителе........................... 32
2.3.4. Гибридизация in situ................................................................ 32
2.3.5. Блот-гибридизация.................................................................. 35
2.3.6. Метод сэндвич-гибридизации................................................ 36
2.3.7. Метод разветвленной ДНК..................................................... 37
2.4. Методы амплификации нуклеиновых кислот ................................. 37
2.4.1. Полимеразная цепная реакция ............................................... 38
2.4.2. Лигазная цепная реакция........................................................ 56
3. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ .......................... 57
3.1. Метод ПЦР/ЛОЗ ................................................................................ 57
3.2. Методы первичной идентификации мутаций ................................. 58
3.2.1. Секвенирование ДНК ............................................................. 59
3.2.2. Метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (Single Strand Conformation Polymorphism – SSCP)........ 60
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3.2.3. Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза (Denaturation Gradient Gel Electrophoresis – DGGE) .......... 61
3.2.4. Метод гетеродуплексного анализа (Heteroduplex
analysis – HA)..................................................................................... 62
3.2.5. Метод химического расщепления мест (нуклеотидного)
несоответствия (Сhemical Mismatch Cleavage – СМС) .................. 62
3.3. Молекулярное сканирование известных мутаций .......................... 63
3.3.1. Амплификация – рестрикция ................................................. 63
3.3.2. ПЦР-опосредованный сайт-направленный мутагенез ......... 64
3.3.3. Обнаружение мутаций в разных сайтах одного гена........... 65
3.4. Использование ДНК-биочипов......................................................... 65
ЛИТЕРАТУРА ................................................................................................... 68
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ВВЕДЕНИЕ
Молекулярная клиническая диагностика – наука, выявляющая причины и механизмы инфекционных и соматических заболеваний на молекулярном уровне, который включает в себя определение генов и продуктов
их деятельности – протеинов и нуклеиновых кислот. Как отдельное направление она начала бурно развиваться в начале 1970-х годов после фундаментальных открытий в области молекулярной биологии:
создания моноклональных антител, взаимодействующих только с
определенными эпитопами (антигенными детерминантами);
изобретения метода гибридизации на фильтрах (Саузерн-блотт), названного так по фамилии ученого, предложившего данный способ разделения нуклеиновых кислот (НК).
Еще одним «критическим» научным событием стало открытие в
1985 году метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Эти достижения
коренным образом изменили содержание всей молекулярной клинической
диагностики.
5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1. ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
В ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ
Многие иммунологические системы детекции обладают высокой чувствительностью и специфичностью, являясь в то же время достаточно простыми. Они широко используются для тестирования лекарственных препаратов, оценки и мониторинга различных онкологических заболеваний, определения специфических метаболитов, идентификации и контроля патогенных
микроорганизмов. Применение данных систем возможно при условии, что
анализируемый компонент обладает свойствами антигена (АГ), то есть способностью вызывать в организме человека или животных синтез особых белков – антител (АТ), с высокой специфичностью связывающих антиген.
В качестве антигена могут выступать клетки микроорганизмов, вирусы,
белки и полисахариды. Это полноценные антигены. Антитела образуются не
против всей молекулы белка или бактериальной клетки, а только к небольшим
участкам на их поверхности – антигенным детерминантам (эпитопам). Такие
участки у белков включают не менее пяти аминокислотных остатков. Антигенные детерминанты разветвленных молекул полисахаридов представлены
цепочками из четырех-шести остатков. Существуют также неполноценные антигены – гаптены. Антитела к гаптенам образуются лишь при их посадке на
полимерную матрицу, в качестве которой используются белки, полимеры клеточных стенок бактерий, синтетические полиэлектролиты. Таким способом
можно получить антитела к антибиотикам и другим лекарственным соединениям, стероидным и пептидным гормонам, витаминам, пестицидам и т.д. Гаптены представлены не только низкомолекулярными соединениями. Так, нуклеиновые кислоты сами по себе неиммуногенны. Однако антитела к нуклеиновым кислотам синтезируются, если они находятся в комплексе с белками.
Антигенные детерминанты нуклеиновых кислот – три- и тетрануклеотиды.
Выделение и очистка антигена для создания диагностикума – достаточно трудоемкий процесс. В настоящее время данные задачи решаются с помощью методов биотехнологии путем создания генноинженерных (трансгенных)
бактерий или дрожжей, синтезирующих антиген в необходимых количествах.
Иммунный ответ на введение одного антигена сопровождается синтезом антител, различающихся по структуре и функциональному предназначению. Это иммуноглобулины (Ig) классов G, D, E, A, M, из которых
первые три могут связать по две молекулы антигена, то есть двухвалентны,
IgA четырех- или восьмивалентны, IgM десятивалентны. С учетом того,
что антиген, используемый для иммунизации животного, содержит не одну, а несколько антигенных детерминант, можно представить, какое множество антител вырабатывается в организме на введение одного антигена.
Такие антитела называются поликлональными. Они гетерогенны по сродству к антигенам. Их состав непостоянен и зависит от вида животного, его
генетических особенностей и физиологического состояния.
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Антитела получают путем иммунизации животных соответствующим антигеном: в лабораторных условиях это мыши, морские свинки, кролики, на производстве – овцы, козы, лошади. Пригодны куры: антитела после иммунизации выделяют из желтков яиц.
Для очистки и стандартизации поликлональных антител используется аффинная хроматография. Сыворотка крови от иммунизированного животного пропускается через колонку с полисахаридным носителем, к которому ковалентно пришит антиген. Специфические антитела связываются
антигеном, все другие белки, и в том числе антитела с низким сродством к
антигену, проходят через колонку, вслед за этим специфически связанные
антитела смывают с колонки кислым или щелочным раствором: связь антигена с антителом нековалентна. Один цикл аффинной хроматографии
позволяет очистить белки в 1000 раз и более.
Однако даже такой способ очистки не позволяет полностью избавиться
от гетерогенности препарата антител. Антитела с одной специфичностью,
реагирующие с единственной антигенной детерминантой (моноклональные)
получают методами клеточной инженерии путем гибридизации иммунокомпетентных B-лимфоцитов и клеток миеломных опухолей, способных к быстрому размножению, неограниченному числу делений (в отличие от большинства неопухолевых клеток, у которых число делений ограничено). Препараты
моноклональных антител характеризуются постоянством состава и физикохимических свойств, низкой вероятностью перекрестной реакции с «чужими» антигенами. Это высокотехнологичный продукт. Его недостаток – сравнительно низкое сродство к субстрату, низкая аффинность.
Все иммуномикробиологические методы (ИМ) можно разделить на
3 группы:
– основанные на прямом взаимодействии антигена с антителом (феномены агглютинации, преципитации, гемагглютинации, иммобилизации и др.);
– основанные на опосредованном взаимодействии антигена с антителом (реакции непрямой гемагглютинации, коагглютинации, латексагглютинации, угольной аггломерации, бентонит-агглютинации, связывания комплемента и др.);
– с использованием меченых антител или антигенов (метод флюоресцирующих антител, иммуноферментный и радиоиммунный анализы,
спиниммунологический и другие методы).
1.1. Реакция агглютинации (РА)
Реакция основана на взаимодействии поверхностных антигенов бактерий и других корпускулярных частиц с антителами и протекает в две фазы:
специфическая фаза – связывание детерминантной группы (эпитопа)
антигена с паратопом – активным центром иммуноглобулина (невидимая
фаза);
7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
неспецифическая (видимая) фаза – образующийся комплекс
(АГ+АТ) утрачивает растворимость и выпадает в осадок в виде хлопьев.
Однако это явление возможно лишь в электролитной среде, например в
0,85 % растворе натрия хлорида.
РА можно применять для обнаружения специфических антител в сыворотке крови и, наоборот, при помощи стандартной агглютинирующей
сыворотки можно идентифицировать выделенные микробы.
1.1.1. Ориентировочная РА для идентификации микроба
Реакция служит для предварительного определения вида микроба.
На предметное стекло наносят каплю узкоспецифичной адсорбированной
сыворотки (т.е. сыворотку, содержащую только специфические антитела).
Сыворотку наносят в разведении 1:10 и рядом – каплю физиологического
раствора (контроль). Исследуемую культуру микроба петлей вносят в обе
капли и размешивают. Через 2–4 мин учитывают результат. При положительной реакции (соответствие исследуемой культуры диагностической
сыворотке) наблюдается скучивание бактерий в виде хлопьев на фоне прозрачной жидкости. В контроле – равномерная муть.
Кроме специфической агглютинации бактерий, вызванной антителами, возможна спонтанная агглютинация (в отсутствие иммунной сыворотки). Спонтанную агглютинацию дают L-формы бактерий, не образующие
гомогенной взвеси в изотоническом растворе хлорида натрия и осаждающиеся в виде клеточных агрегатов. При кислой реакции среды в результате
снятия одноименного заряда с поверхности бактериальных клеток в изоэлектрической зоне также происходит склеивание – наступает «кислотная»
агглютинация. Чтобы исключить возможность учета ложноположительных
результатов спонтанной агглютинации, всегда ставят контрольную пробу с
изотоническим раствором хлорида натрия.
1.2. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)
РНГА является своеобразной модификацией РА. Сущность реакции
состоит в том, что молекулы антигена адсорбируются на поверхности
эритроцитов. Такие «нагруженные» антигенами эритроциты приобретают
способность агглютинироваться иммунной сывороткой, специфичной для
данного антигена. Эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя
на дне пробирки гемагглютинат. В последнее время РНГА получила широкое распространение благодаря высокой чувствительности, экспрессивности и простоте постановки.
В лунках полистироловых планшетов готовят ряд последовательных
двукратных разведений сыворотки. В предпоследнюю лунку вносят 0,5 мл
заведомо положительной сыворотки и в последнюю – 0,5 мл физиологического раствора (контроль). Затем во все лунки добавляют по 0,1 мл разве8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
денного эритроцитарного диагностикума, встряхивают и помещают в термостат на 2 ч. В положительном случае эритроциты оседают на дне лунки
в виде ровного слоя клеток со складчатым или зазубренным краем (перевернутый зонтик), в отрицательном – в виде пуговки или колечка (табл. 1).
Таблица 1
Постановка реакции непрямой гемагглютинации
Ингредиенты
1
Номера лунок панели
2
3
4
5
Контроли
1
2
Изотонический
раствор натрия 0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
–
0,5
хлорида, мл
Исследуемая
Иммунный
сыворотка в раз- 0,5® 0,5® 0,5® 0,5® 0,5- диагностикум
0,5
ведении 1:25, мл
Полученное разведение
сыво- 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800
ротки
Эритроцитарный
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
диагностикум, мл
Инкубация при 37 °С в течение 2 ч. в термостате.
Примечание. Титр сыворотки 1:100.
На эритроцитах можно адсорбировать не только антигены, но и антитела. В данном случае РНГА можно применять для индикации патогенных микробов во внешней среде. Для этого IgG сыворотки фиксируют па
поверхности бараньих эритроцитов. Разрешающая способность экспрессиндикации антигенов составляет несколько тысяч микробных тел в 1 мл.
Наряду с представленными выше методами в микробиологической диагностике используют следующие иммунологические методы: реакция преципитации в геле, реакция лизиса, реакция связывания комплемента, реакция
Кумбса, реакция флоккуляции, антистрептолизиновая реакция, реакция торможения гемагглютинации, принципы методов которых представлены ниже.
Так, в основе реакции преципитации в геле лежит иммунодиффузия в
агаровом геле растворов антигенов и антител, залитых в разные лунки, навстречу друг другу в случаях соответствия их специфичности, что приводит к
образованию специфического преципитата в виде полосок и дуг в местах
встречи реагентов. Как правило, в центральную лунку заливают стандартный
раствор антигена, а в периферические – испытуемые сыворотки.
Для постановки реакции лизиса и реакции связывания комплемента
(РСК) используют комплемент, который содержится в сыворотке крови
морских свинок. Гемолитическая активность комплемента термолабильна
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
и полностью утрачивается при прогревании сыворотки в течение 30 мин
при 56 °С. При адсорбции комплемента на комплексе антиген–антитело
его действие проявляется реакцией лизиса антигена, если антиген корпускулярный или не сопровождается никакими видимыми изменениями, а
также если это мелкодисперсные или растворимые антигены.
Для учета результатов РСК вводят вспомогательную (индикаторную)
гемолитическую систему. Она состоит из взвеси эритроцитов барана в изотоническом растворе хлорида натрия и гемолитической сыворотки кролика, полученной путем его иммунизации упомянутыми эритроцитами. Положительная РСК характеризуется задержкой гемолиза вследствие адсорбции комплемента системой антиген–антитело. Отрицательная РСК характеризуется наличием гемолиза, поскольку свободный комплемент связывается с системой эритроциты барана – гемолитическая сыворотка кролика.
РСК обладает высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет использовать ее для серодиагностики многих заболеваний.
Для постановки РСК требуется точное определение количественных
соотношений всех ингредиентов, участвующих в реакции: исследуемой
сыворотки, антигена, комплемента, гемолитической сыворотки кролика и
эритроцитов барана. Поэтому постановке основного опыта предшествует
титрование гемолитической сыворотки и выбор ее рабочего разведения,
титрование других ингредиентов.
В результате взаимодействия токсина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята. Наиболее интенсивная и
ранняя («инициальная») флоккуляция происходит в пробирке, где антиген
и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях.
Антистрептолизиновая реакция основана на феномене нейтрализации гемолитического действия микробного токсина (О-стрептолизина) антитоксическими антителами иммунной сыворотки.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на том, что
при взаимодействии вирусных антигенов (гемагглютининов) со специфическими антителами иммунной сыворотки происходит блокирование (нейтрализация) гемагглютинирующей способности вируса, т. е. торможение
гемагглютинации.
Развернутая РТГА проводится в лунках пластмассовых пластин. При
положительной РТГА образуется плотный осадок эритроцитов на дне лунки в виде диска или кольца с ровными краями.
1.3. Иммуноферментный анализ
Одним из наиболее чувствительных методов выявления антител считается иммуноферментный анализ (ИФА), который не уступает по чувствительности радиоиммунному анализу (РИА) и в то же время отличается
от него большей доступностью для обычных диагностических лабораторий. Высокая чувствительность в сочетании с быстротой анализа (от не10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
скольких минут до нескольких часов), возможностью одновременного тестирования большого количества образцов и отсутствием особой необходимости предварительных операций по очистке и концентрированию анализируемого соединения в образце придают ИФА неоспоримые преимущества перед другими аналитическими методами. Поэтому сегодня ИФА
находит широкое применение в здравоохранении, различных областях
сельского хозяйства, промышленной биотехнологии, природоохранной
деятельности и научно-исследовательской работе.
Любое заболевание человека и животных можно быстро и точно диагностировать путем идентификации возбудителя, его отдельных антигенных компонентов, антител к этим компонентам или веществ, не свойственных здоровому организму и синтезируемых при его патологических состояниях (рак, сердечно-сосудистые и эндокринные заболевания). Диспансеризация населения, эпидемиологические обследования, выявление отравлений, наличия наркотиков в крови, определение содержания лекарственных соединений в тканях, вирусные заболевания растений, определение
антибиотиков, витаминов и других биологически активных соединений
при отборе активных штаммов-продуцентов в промышленной биотехнологии, контроль за качеством медицинских препаратов из донорской крови
на отсутствие вирусов-возбудителей СПИДа и гепатита B – это лишь небольшой перечень практического применения ИФА. Современные фундаментальные исследования в биохимии, клеточной физиологии и иммунологии, микробиологии, вирусологии, онкологии трудно представить без
ИФА. Реагенты для проведения ИФА сегодня стали коммерческими продуктами и могут быть приобретены по каталогам известных фирм.
Данное исследование проводят с использованием планшетов из полистирола (поливинилхлорида), на поверхности лунок которых адсорбируют специфический антиген. Фиксированный на пластине антиген инкубируют с испытуемыми человеческими сыворотками. После отмывания от
не связавшихся белков связанные иммобилизованными антигенами иммуноглобулины выявляют с помощью антивидовой (античеловеческой) антииммуноглобулиновой сыворотки, к антителам которой ковалентно прикреплен фермент – пероксидаза. После инкубации с субстратом (пероксидом
водорода) и индикатором (диаминобензидином) оценивают ферментативную активность по интенсивности окраски. Интенсивность окраски, пропорциональную количеству сорбированных на антигене антител, можно
оценить визуально или с помощью спектрофотометра. В данной модификации удобна универсальность меченого реагента, который позволяет выявлять антитела к разным антигенам.
Использование фермента в качестве индикатора дает ряд преимуществ, однако имеет некоторые ограничения. Необходимо подобрать такой
фермент, который длительно сохраняет свою активность, не теряет ее при
операции связывания с антигеном или антителом, обладает высокой спе11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
цифичностью к субстрату. Широко используются пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза и β-галактозидаза Escherichia coli. Перспективны люциферазы светлячков и светящихся бактерий. Активность ферментов детектируют по изменению оптической плотности, флуориметрически и электрохимически. Люциферазные реакции сопровождаются высвечиванием
фотонов, поэтому их регистрируют по биолюминесценции. Приведем несколько примеров.
Пероксидаза катализирует следующую реакцию:
AH2 + H2O2
A + 2H2O.
В качестве AH2 могут выступать разные соединения. Так, восстановленный бесцветный о-фенилендиамин в пероксидазной реакции превращается в окисленную окрашенную форму с максимумом оптического поглощения при 435 нм, регистрируемую фотометрически.
Щелочная фосфатаза катализирует гидролиз фосфорных эфиров:
4-нитрофенилфосфат превращается в 4-нитрофенол, регистрируемый по
оптической плотности при 405 нм; 4-метилумбеллиферилфосфат превращается в 4-метилумбеллиферон, флуоресцирующий с высоким квантовым
выходом при 450 нм (флуоресценцию возбуждают при 365 нм).
β-галактозидаза катализирует гидролиз лактозы с образованием глюкозы и галактозы. Если вместо природного субстрата взять 4-метилумбеллиферил-β-D-галактозид, то при гидролизе образуются галактоза и 4метилумбеллиферон, регистрируемый флуориметрически.
В люциферазных реакциях детектируют биолюминесценцию:
АТФ + люциферин + O2
ФМНН2 + О2 + R-CHO
АМФ + Фн + оксилюциферин + hn560 нм ,
ФМН + R-COOH + H2O + hn490 нм ,
где АТФ – аденозинтрифосфат; АМФ – аденозинмонофосфат; Фн – ортофосфат; ФМН и ФМНН2 – окисленный и восстановленный флавинмононуклеотид; R-CHO и R-COOH – жирный альдегид и соответствующая кислота.
Для связывания ферментной метки с антителом или антигеном без
потери активности фермента и нарушения свойств антитела и антигена
существуют три группы методов: биохимические, иммунологические и
генноинженерные.
В биохимических методах используется сшивка фермента (E) с антителом или антигеном при участии свободных реакционноспособных групп:
-NH2 , -COOH, -SH, -OH. Например, E-NH2 + HOOC-Аг
E-NH-CO-Аг + H2O.
Если прямое взаимодействие реализовать не удается, в ход идут бифункциональные сшивающие агенты: глутаровый диальдегид, п-бензохинон. Функциональные группы реагентов могут быть активированы. Так,
гидроксигруппы в углеводном компоненте пероксидазы хрена можно
окислить с помощью периодата натрия до альдегидных, через которые за12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
тем пришиваются антиген или антитело при участии аминогрупп с образованием основания Шиффа:
E-CHO + H2N-Аг
E-CH=N-Аг.
Витамин биотин исключительно прочно связывается с яичным белком авидином – ингибитором биотинсодержащих ферментов. Если приготовить комплексы Аг-биотин и авидин-E, а затем смешать их, то образуется комплекс Аг-биотин-авидин-E.
Иммунологические методы получения антигенов или антител, меченных ферментами, основаны на применении антител или их составляющих в качестве сшивающих звеньев. Антитела всех пяти классов построены по единому плану. Антитело построено из четырех полипептидных цепей: двух тяжелых H (от англ. heavy – тяжелый) и двух легких L (от light –
легкий) с молекулярными массами соответственно 50 и 25 кДа. Тяжелые
цепи связаны друг с другом двумя дисульфидными связями через остатки
цистеина. Легкие цепи образуют с тяжелыми по одной дисульфидной связи. Обе цепи состоят из доменов, по ~110 аминокислотных остатков в каждом: в тяжелой цепи – четыре, в легкой – два домена. N-концевые домены
H- и L-цепей, обозначаемые VH и VL (V от variable – вариабельный), определяют специфичность антител, их первичная структура вариабельна. Остальные домены характеризуются постоянством структуры и обозначаются
CH1, CH2, CH3 и CL (C – от constant – константный). По форме молекула антитела напоминает букву Y, ножка которой связана с отростками шарнирным участком (рис. 1).
Рис. 1. Антитело класса G: действие папаина и пепсина
В исследовании структуры антител применяются протеолитические
ферменты. Папаин расщепляет молекулу на три фрагмента. Два из них
идентичны: одновалентны в реакции связывания антигена и названы
Fab-фрагментами (Fab – от Fragment antigen binding – фрагмент, связывающий антиген); третий фрагмент не связывает антиген, легко кристаллизуется и поэтому назван Fc-фрагментом (Fc от Fragment crystallizable –
кристаллизуемый фрагмент). Пепсин расщепляет молекулу антитела подругому. При этом образуются двухвалентный F(ab′)2-фрагмент и не13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
сколько осколков Fc-фрагмента, из которых наиболее крупный назван
pFc′-фрагментом (см. рис. 1).
Метод гибридных антител для сшивки антигена с ферментом включает несколько этапов (рис. 2): получение F(ab′)2-фрагментов к антигену и
ферменту путем обработки соответствующих антител пепсином, их разъединение путем восстановления дисульфидных связей меркаптоэтанолом,
смешивание полученных Fab-фрагментов, удаление меркаптоэтанола диализом, ведущее к реассоциации с образованием гибридных
F(ab′)2-фрагментов, связывающих антиген и фермент в единый комплекс.
Рис. 2. Получение комплекса антигена Аг
и фермента Е методом гибридных антител
Fc-фрагменты антител образуют прочный комплекс с белком A стафилококка. При наличии антител к ферменту и конъюгата белок
А – антиген можно получить комплекс E-Ат-белок А-Аг.
Генноинженерный метод получения меченого антигена основан на
синтезе гибридных белков с помощью микроорганизмов. Таким методом,
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
используя трансгенную E. coli, в лаборатории Е. С. Северина получены
гибридные белки, содержащие полную аминокислотную последовательность бактериальной β-галактозидазы и специфическую последовательность белка от вируса иммунодефицита человека или вируса гепатита B.
Сохранение нативной структуры и функции сшиваемых реагентов зависит
от их индивидуальных особенностей, поэтому здесь не может быть применен какой-либо стандартный прием. Конкретный метод сшивки подбирается в индивидуальном порядке.
Таким образом, нами рассмотрено получение необходимых компонентов диагностикума для проведения иммуноферментного анализа. В основе данного анализа лежит иммунохимическая реакция взаимодействия
АГ–АТ:
aАг + bАт* →a(Аг-Ат*) + (b – a)Ат*
(1)
или
аАг* + bАт + cАг → d(Аг*-Ат) + e(Аг-Ат) + (a – d)Аг* + (c – e)Aг (2)
В первом варианте (уравнение (1)) из антигена Аг, находящегося в
тестируемом образце, и меченого антитела Ат*, добавленного в концентрации, превышающей концентрацию Аг, образуется комплекс Аг–Ат*.
Количественный анализ реакции (1) может быть проведен по образованию
комплекса Аг–Ат*, детектируемого с помощью ферментной метки, или по
Ат*, оставшемуся в свободном состоянии. Это неконкурентный вариант
ИФА. Во втором варианте (уравнение (2)) лимитирующим субстратом является антитело Ат. Меченый антиген Аг*, будучи добавленным в анализируемый образец в известной концентрации, связывается с антителом, образуя комплекс Аг*–Ат. В этой реакции Аг* будет конкурировать с немеченым антигеном Аг, содержащимся в образце. Концентрация Аг*–Ат будет обратно пропорциональна концентрации Аг. Таким способом по заранее известной концентрации Аг* можно определить неизвестную концентрацию Аг. Это конкурентный вариант ИФА. В обоих вариантах ИФА надо решить важную задачу – разделить связанную фракцию меченого реагента (Аг–Ат* или Аг*–Ат) от несвязавшегося, свободного реагента (Ат*
или Аг*), чтобы определить долю специфического связывания.
Количественный анализ иммунохимических реакций (см. уравнения
(1) и (2)) может быть проведен по продуктам (Аг–Ат* и Аг*–Ат) или по
субстратам реакций, оставшимся в свободном состоянии (Ат* и Аг*). Для
этого используют два основных подхода.
Первый подход – направленное воздействие на ферментативную активность комплекса Аг–E посредством связанного Ат, ведущее к торможению или, напротив, к возрастанию скорости ферментативной реакции. Такой ИФА может быть реализован в однофазной системе – в растворе – и
поэтому называется гомогенным или жидкофазным. Это ИФА без предва15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
рительного физического разделения меченых лигандов (Ат* или Аг*) от их
иммунохимических комплексов – продуктов реакций (1) и (2).
Второй подход – физическое разделение с помощью твердой фазы,
связывающей меченый реагент. Это гетерогенный или твердофазный ИФА
(тИФА). В качестве твердой фазы используются стенки сосудов, в которых
проводится анализ. Эти сосуды изготавливаются в виде специальных
планшетов из непористых прозрачных полимерных материалов: полистирола, поливинилхлорида, полиметакрилата. Белки (антигены или антитела)
адсорбируются на поверхности пластика – и в этом основа твердофазного
ИФА. Для увеличения прочности связывания белков пластик подвергается
модификации (проводится обработка глутаровым альдегидом, поли-L-лизином, толуол-2,4-диизоцианатом; способ модификации – ноу-хау фирмыпроизводителя) таким образом, что активированная поверхность приобретает способность к ковалентному связыванию белков. К режиму модификации предъявляются жесткие требования: однородность связывающих
свойств поверхности пластика, его оптическая прозрачность (результаты
ИФА регистрируются фотометрически). По окончании процедуры связывания с поверхностью пластика несвязанный меченый реагент просто смывается с поверхности планшета. В англоязычной литературе твердофазный
ИФА именуется ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) – определение
фермента, связанного с иммуносорбентом.
1.3.1. Общие принципы метода гетерогенного ИФА
1.3.1.1. Определение антител
Рассмотрим принцип определения специфических Aт методом
тИФА. На рис. 3, а показана общая схема метода, состоящего из трех
стадий, соединенных на рисунке знаком плюс. Во время каждой стадии в
систему добавляется очередной компонент, инкубируется некоторое
время, необходимое для образования иммунного комплекса. Затем ячейка промывается для удаления не связавшихся компонентов. После этого
переходят к следующей стадии реакции, которая обозначена следующим
знаком плюс на схеме. Рассмотрим подробнее процесс образования иммунного комплекса, который представлен на рис. 3. На твердой поверхности пластиковой лунки, изображенной на рисунке слева, сорбирован
Аг любого инфекционного агента (фрагмент вируса, бактерии, простейшего и т.п.). В эту лунку вносится исследуемый биологический материал, чаще всего сыворотка крови больного. Если в ней содержатся Aт к
инфекционному агенту (на рисунке обведены), то они закрепляются на
соответствующих Aг и остаются связанными при промывке. На этом
первая стадия заканчивается. Это основная – «специфическая» стадия
процесса. Последующие стадии нужны лишь для выявления образовавшегося иммунного комплекса.
16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
а
б
в
Рис. 3. Определение антител методом твердофазного иммуноферментного анализа: а – последовательность анализа; б – положительный результат теста; в – отрицательный результат теста
На второй стадии анализа в лунку вносят Aт с заранее прикрепленным
к ним ферментом, способные связаться с Aт человека, закрепившимися на
инфекционном агенте. Это так называемый конъюгат. Если в ячейке имеются образовавшиеся на первой стадии процесса иммунные комплексы, то
возникает «молекулярная цепочка», на конце которой находится фермент.
На следующей стадии в лунку добавляется раствор бесцветного вещества –
хромогена. Это вещество приобретает окраску после расщепления его присутствующим в ячейке ферментом, т. е., если все элементы цепочки присутствуют, в лунке образуется окрашенный комплекс (рис. 3, б). Если на первой стадии анализа иммунных комплексов не образовалось (рис. 3, в), то отсутствует и вся последующая часть «молекулярной цепочки», вследствие
чего хромоген не окрашивает раствор. В нашем случае ключевым элементом является специфическое Aт из сыворотки крови больного к инфекционному агенту. По сути, мы анализируем способность некоторых из Aт в исследуемом материале связаться с интересующим нас Aг.
Хотелось бы особо подчеркнуть, что положительный результат теста
показывает только наличие в исследуемом образце (обычно сыворотке
крови больного) Aт, способных связываться с поверхностными Aг, сорбированными на твердой фазе. Результат анализа может существенно зависеть от свойств самой тест-системы и от особенностей иммунного ответа
больного. Тест-системы на основе моноклональных Aт позволяют дости17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
гать более высокой чувствительности и избирательности. Однако чрезмерно узкая избирательность может приводить к ложноотрицательным результатам при некоторых особенностях иммунного ответа организма больного. Многое зависит от того, какого рода Aг используется для сорбции на
твердой фазе. Важна и степень очистки, и количество различных Aг, доступных для образования иммунных комплексов, и многое другое. Разумеется, все сказанное относится к полностью пригодным для использования
тест-системам и безошибочному проведению процесса анализа.
1.3.1.2. Определение антигенов
Для обнаружения самих инфекционных агентов, а точнее – их Aг,
применяется другая модификация метода тИФА, которая представлена
на рис. 4. В этом случае на поверхности планшета (твердой фазе) сорбируются Aт к искомому агенту. Образующаяся в ходе анализа цепочка
выглядит так: Aт, инфекционный агент, а далее, как и в предыдущем
случае, следует комплекс Aт–Аг. То есть, если в исследуемом образце
присутствует искомый Aг, то образуется иммунный комплекс. В ячейке
присутствует фермент, который способен расщеплять хромоген с образованием окрашенного продукта. Это возможно только при наличии
полной цепочки (рис. 4, б). Если в исследуемом образце искомый Aг (обведен на рис. 4, а) отсутствует, то цепочка не образуется, и окрашивание
не происходит (рис. 4, в).
Ключевым элементом, от которого зависит, сформируется цепочка
или нет, является искомый агент, точнее его Aг, способные связываться
с соответствующими Aт диагностической тест-системы. Так же, как и в
предыдущем случае, не следует забывать, что мы определяем только наличие Aг, которые могут быть связаны в такой системе. Например, целую (не разрушенную) бактерию, Aг которой мы ищем, нельзя обнаружить в подобном тесте. Она слишком велика для того, чтобы ее можно
было удержать в подобной молекулярной системе. Все особенности, о
которых говорилось применительно к предыдущему варианту анализа,
сохраняют свою актуальность и в этом случае. Кроме того, имеются дополнительные особенности, обусловленные необходимостью связывания
диагностических Aт c различными поверхностными Aг исследуемого
объекта. Все эти особенности необходимо учитывать при анализе результатов, получаемых с помощью ИФА. Только понимание того, что
именно на самом деле определяет тест, позволяет правильно трактовать
результат. Кроме того, необходимо учитывать динамику изменений этих
показателей. Они, в общем, адекватно отражают течение инфекционного
процесса, но не всегда синхронны с ним и не во всех деталях совпадают.
18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
а
б
в
Рис. 4. Определение Aг методом твердофазного иммуноферментного анализа: а – последовательность иммуноферментного
анализа; б – положительный результат теста; в – отрицательный
результат теста
1.3.2. Динамика изменений показателей ИФА-тестов
при инфицировании
В связи с тем, что различные тест-системы дают возможность получить информацию о различных сторонах взаимодействия инфекционного
агента и организма человека, возникает вопрос: каким образом значения
отдельных показателей связаны с развитием исследуемых процессов.
В случае острого инфекционного процесса, характеризующегося быстрым развитием инфекции и полным уничтожением инфекционного агента, выявлено несоответствие по времени в изменении числа бактерий и
уровне поверхностных Аг, определяемых методом ИФА (рис. 5). Увеличение уровня поверхностных Aг может существенно отставать от роста числа бактерий. Некоторое запаздывание этой кривой может объясняться тем,
что чувствительность методов не бесконечно высокая, и ограниченной
доступностью инфекционного агента в исследуемом материале, а также
рядом других причин. Возможно, сказывается то, что тест-системы, как
правило, лучше реагируют на антигенноактивные фрагменты, в то время
как Aг непосредственно на поверхности живой клетки могут оставаться
недоступными для тест-системы. Даже при адекватном заборе материала
для лабораторного исследования с соблюдением всех предосторожностей,
как правило, отмечается подобного рода несовпадение. Таким образом, да19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
леко не всегда результат лабораторного теста по определению поверхностного Aг инфекционного агента полностью соответствует содержанию биологически активного инфекционного материала. Результат теста зависит от
многих составляющих инфекционного процесса и от конкретной реализации тест-систем. Имеют значение технология получения диагностических
Aг и некоторые другие факторы, в том числе описанные выше.
Рис. 5. Динамика изменения уровня антигена при развитии
острого инфекционного процесса, определяемого методом
ИФА: 1 – изменение числа бактерий; 2 – уровень поверхностных Aг, определяемых методом ИФА
Еще более неоднозначной может быть трактовка результатов теста
на наличие Aт к антигенам инфекционного патогена. Часто результаты такого теста могут, в общем, достаточно хорошо описываться известной
кривой иммунного ответа на иммунизацию чужеродными Aг (рис. 6).
Рис. 6. Динамика изменения уровня антител, специфичных к инфекционному агенту: 1 – содержание инфекционного
агента; 2 – иммунный ответ на иммунизацию чужеродными Aг,
определенный методом ИФА
Необходимо отметить, что кривая 2, которая, по сути, является кривой
иммунного ответа, запаздывает по отношению к кривой, отражающей содержание инфекционного агента. Иногда это бывает очень существенно. Уровень
специфичных иммуноглобулинов (Ig), который, собственно, и определяется в
нашем тесте, может сохраняться высоким и после подавления инфекции. Хотя
это и не является абсолютным правилом. Кроме того, при анализе результатов
20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
такого теста необходимо помнить о том, какого класса Ig определялись в применявшемся тесте, поскольку при развитии иммунного ответа происходит закономерная смена классов Ig. В типичных случаях Ig класса М (первичный
иммунный ответ) сменяются на Ig класса G (вторичный иммунный ответ).
Вместе с тем, при реактивации хронической инфекции, «серологический профиль» пациента может имитировать первичный иммунный ответ (рис. 7).
Рис. 7. Динамика образования антител
Таким образом, тесты, определяющие непосредственно уровень Ag в
исследуемом материале, более адекватно отражают уровень содержания
инфекционного патогена или другого агента, однако результаты анализа
сильно зависят от выбора материала для исследования, условий его забора
и др. Причем невозможность забора необходимого материала может поставить под вопрос и применимость теста вообще. Особенно важно, что во
многих случаях при исследовании наиболее доступного биологического
материала, которым является сыворотка крови, такие тесты закономерно
дают отрицательные результаты.
Вторая группа тестов, достоинство которых заключено в возможности определения инфекции или опухоли вне зависимости от локализации
патологического процесса, основана на выявлении Aт различного класса, а
также их субпопуляций к антигенам инфекционного агента, раковой клетки, гормона и т.п. В клиническом понимании эта информация дает сведения о стадии иммунного ответа.
Рассмотрим возможные варианты результатов определения Aг и Aт методом тИФА на примере успешного лечения бактериальной инфекции. Через
некоторое время после начала лечения содержание поверхностных антигенов
начинает увеличиваться, иногда значительно. Затем уровень медленно падает
до низких значений. Показатели тестов, определяющих содержание Ig, вообще
не имеют на начальном этапе лечения четких тенденций. Может наблюдаться
как снижение, так и увеличение уровня. Причем это зависит не только от применявшегося препарата, но и от ряда других факторов. Хотя можно отметить,
что при использовании некоторых препаратов имеется тенденция к снижению
данного показателя, в то время как при назначении других – нет.
21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Необходимо подчеркнуть, что в указанном случае речь идет только
об изменении отдельных показателей, полученных определенным методом. Изменение содержания АГ инфекционного агента в исследуемом материале не обязательно коррелирует, а часто – вовсе не совпадает с содержанием патогена в организме пациента.
Уровень специфических Aт к Aг инфекционного агента не отражает состояние общего иммунного статуса, и тем более динамику изменения концентрации специфических Ат нельзя рассматривать в качестве показателя эффективности терапии, т.е. элиминации или сохранения в организме инфекционного агента. Оценка результатов любых лабораторных исследований должна
проводиться врачом с учетом особенностей метода диагностики, своеобразия
патогенеза болезни и индивидуальных особенностей конкретного пациента.
Таким образом, современные лабораторные технологии предъявили новые
требования к квалификации врача и еще более повысили значимость клинического мышления в понимании результатов лабораторных анализов.
2. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Среди большого числа исследовательских методов и новых технологий, обогативших клиническую медицину за последние десятилетия, важное место принадлежит разработке и практическому внедрению современных молекулярно-генетических методов. Они основаны на непосредственном анализе молекул ДНК и РНК. На основании анализа данных молекул
возможно проведение ранней и более полной диагностики ряда инфекционных заболеваний, идентификация организмов (в частности по следам
крови, спермы и других тканей), а также выявление генных (хромосомных)
мутаций (в том числе и пренатальное), что необходимо для решения ряда
клинических и фундаментальных задач.
Исходным материалом для проведения ДНК-диагностики заболеваний, обусловленных мутациями ядерных генов, могут служить любые
клетки организма, содержащие ядро. Обычно для этих целей используют
лейкоциты, выделяемые из 5–20 мл периферической крови. В некоторых
случаях (например при митохондриальных болезнях, обусловленных мутациями митохондриальной ДНК с преимущественной экспрессией мутации в мышечной ткани) более адекватным источником ДНК являются
биоптаты мышц. Генодиагностика может также проводиться на основе исследования ДНК, выделяемой из клеток эпителия полости рта, кожных
фибробластов и др. При проведении пренатальной ДНК-диагностики у
плода (обычно на 10–21-й неделе беременности) источником ДНК служат
биоптаты хориона, плаценты, клетки амниотической жидкости или лимфоциты пуповинной крови плода.
При выявлении инфекционных заболеваний исходным материалом
может служить сыворотка крови, моча, мокрота, соскобы мочеполовых путей и т.п.
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Большинство методов анализа структуры фрагментов ДНК и РНК
осуществляется с помощью различных методик электрофореза (ЭФ) в агарозном или полиакриламидном (ПАА) гелях. В подобранных стандартных
условиях именно подвижность молекул нуклеиновых кислот (НК) при
электрофорезе является ключевым анализируемым параметром, зависящим
от конкретных характеристик изучаемого фрагмента (например от его величины или конформации).
Для визуализации молекул ДНК по результатам проведенного ЭФ могут использоваться окраска их нитратом серебра, бромистым этидием (дающим характерное красноватое свечение при исследовании в проходящем УФсвете) или мечение различными флюорохромами (дающими флюоресценцию
определенной длины волны при возбуждении лазерным лучом). Для окраски
РНК можно также применять толуидиновый синий, метиленовый синий.
Более сложный метод визуализации ДНК – авторадиография – основан
на введении радиоизотопной метки в состав анализируемых макромолекул;
по окончании ЭФ на гель с радиоактивно мечеными молекулами ДНК накладывается рентгеновская пленка, и положение различных фрагментов ДНК в
геле определяется в виде соответствующих полос на проявленной пленке.
2.1. Выделение и анализ нуклеиновых кислот
Для выделения ДНК (РНК) из клеток их необходимо предварительно лизировать (например, с помощью воздействия высокой температуры или детергентами). Пробоподготовка проводится также с целью
удаления клеточных белков, в частности, различных РНКаз. Для депротеинизации используют 2 метода: 1) обработка белков протеазами (например, протеиназой К) в присутствии ЭДТА и детергентов (например,
саркозила); 2) денатурация и экстракция органическими растворителями
(например фенолом и хлороформом). Из водных растворов геномную
ДНК можно осадить добавлением этанола или изопропанола. К настоящему времени также разработаны специальные сорбенты для осаждения
ДНК (РНК) из раствора.
Для одновременного лизиса клеток и денатурации всех клеточных
белков (в том числе РНКаз) можно использовать гуанидинтиоцианат –
сильный денатурирующий агент.
Конечный размер получающихся фрагментов ДНК (РНК) зависит от
действия клеточных нуклеаз и механического разрушения НК в процессе
выделения.
После выделения ДНК и/или РНК и до проведения дальнейших исследований необходимо определить чистоту препаратов и размер молекул.
При наличии загрязнений повторно проводят обработку протеиназой К и
экстракцию фенолом/хлороформом. ДНК должна быть достаточно высокомолекулярной, чтобы можно было проводить планируемые эксперименты, а РНК должна быть интактной.
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2.1.1. Качественный анализ
ДНК (одно- и двухцепочечные) и РНК при ЭФ движутся в геле со
скоростью, обратно пропорциональной десятичному логарифму их молекулярной массы. При этом одноцепочечные молекулы движутся быстрее,
чем двухцепочечные той же длины. Поскольку молекулярная масса НК
пропорциональна их длине (в парах нуклеотидов или в тысячах пар нуклеотидов), можно построить стандартную кривую зависимости расстояния,
на которое перемещается маркерный фрагмент, от десятичного логарифма
длины этого фрагмента. С ее помощью можно определять размеры фрагментов нуклеиновых кислот в данном препарате по расстоянию, на которое они перемещаются при электрофорезе.
2.1.2. Количественный анализ нуклеиновых кислот
Для определения концентрации ДНК и РНК в растворе наиболее широко используются 2 метода. Более простым и точным является спектрофотометрический метод, однако он обладает сравнительно малой чувствительностью. Если общее содержание нуклеиновых кислот невелико, то
концентрацию ДНК и РНК можно определить по интенсивности их флуоресценции в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.
1. Спектрофотометрический метод
Концентрацию нуклеиновых кислот в растворе можно рассчитать,
измерив его оптическую плотность (D) при 260 нм. Одна единица D примерно соответствует концентрации двухцепочечной ДНК 50 мкг/мл и концентрации одноцепочечной ДНК и РНК 40 мкг/мл. Для оценки чистоты
образцов можно использовать отношение между D при 260 и 280 нм. Для
чистых препаратов ДНК и РНК оно должно быть равно соответственно
1,8 и 2. Если это соотношение меньше, значит, препараты загрязнены белками или фенолом, и оценка концентрации будет неверна.
2. Окрашивание бромистым этидием
А) Электрофоретический метод
Для примерной оценки концентрации препаратов ДНК или РНК на
гель наносят разные количества маркерных нуклеиновых кислот. Концентрацию исследуемых ДНК или РНК в образце оценивают, сравнивая интенсивность флуоресценции образца и стандартных маркеров с известной
концентрацией. При этом важно, чтобы образцы ДНК и РНК сравнивались
с соответствующими маркерами, поскольку при одинаковом количестве
ДНК и РНК интенсивность их флуоресценции в УФ-свете различается.
Б) Метод пятен
Концентрацию нуклеиновых кислот в растворе можно определить, окрасив раствор бромистым этидием, измерив интенсивность флуоресценции в
УФ-свете и сравнив ее с флуоресценцией маркеров известной концентрации.
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Как и при электрофоретическом методе, маркеры должны представлять собой нуклеиновые кислоты соответствующего типа (т.е. ДНК или РНК).
Для количественного определения РНК можно использовать также
орциновый метод, для ДНК – дифениламиновый.
2.2. Некоторые ферменты,
применяемые в молекулярной диагностике
2.2.1. Нуклеазы и их применение
Нуклеазы – ферменты, расщепляющие нуклеиновые кислоты до моно- и олигонуклеотидов, по характеру своего действия относятся к фосфодиэстеразам. Концевые мононуклеотиды отщепляются экзонуклеазами;
расщепление внутри полинуклеотидной цепи осуществляют эндонуклеазы.
Нуклеазы могут расщеплять РНК или ДНК (в соответствии с чем разделяют РНКазы и ДНКазы), а также и те и другие (неспецифические нуклеазы).
В лабораториях нуклеазы применяют для очистки препаратов от
нуклеиновых кислот определенного вида, для установления структуры исследуемых нуклеиновых кислот, изучения механизма их распада и синтеза.
Нуклеазы в молекулярной клинической диагностике применяют:
1) для обеспечения отрицательного контроля в результате удаления
нуклеиновой кислоты-мишени;
2) для повышения специфичности гибридизации ДНК-ДНК (при обработке РНКазой), или специфичности анализа РНК (при обработке ДНКазой);
3) для проверки специфичности зонда – обработка перед гибридизацией РНКазой должна приводить к исчезновению сигнала, возникающего
при связывании РНК с зондом, а ДНКазой – не должна влиять на РНКспецифичный сигнал.
2.2.2. Ингибиторы РНКаз и их практическое применение
РНК по сравнению с ДНК гораздо более лабильна и чувствительна к
действию нуклеаз. Кроме того, РНКазы менее чувствительны к действию денатурирующих белки веществ, чем ДНКазы. Все это затрудняет получение
полноразмерной РНК и заставляет проводить инактивацию РНКаз одновременно с лизисом клеток. Вся используемая вода должна быть обработана
0,1 % диэтилпирокарбонатом (ДЭПК). Ингибиторы РНКаз должны использоваться везде, где это возможно: в буферах для выделения РНК, при последующих экспериментах, при хранении РНК в водных растворах. Можно выделить белковые и небелковые ингибиторы РНКаз. Белковые ингибиторы
РНКаз производятся несколькими фирмами (в частности фирмой «Sigma»),
однако они могут денатурировать под действием определенных агентов или
деградировать под действием протеаз. Некоторые фирмы («Sigma») произво25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
дят ванадил-рибонуклеозидные комплексы. Это комплексы, образованные
ионом оксованадия и любым из четырех рибонуклеозидов, которые связываются со многими РНКазами и практически полностью их ингибируют. Однако они ингибируют трансляцию РНК в бесклеточной системе синтеза белка.
2.2.3. Рестриктазы
Рестрикционная эндонуклеаза (рестриктаза) – это фермент бактериального происхождения, распознающий специфическую нуклеотидную
последовательность длиной от 4 до 10 н.п. и разрезающий двунитевую молекулу ДНК в этом месте (сайте рестрикции).
В зависимости от частоты встречаемости сайтов рестрикции в молекуле ДНК различают 3 класса рестриктаз: часто-, средне- и редкощепящие.
Сайты рестрикции могут быть использованы в качестве генетических маркеров ДНК. Образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быть упорядочены по длине путем электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле, и тем самым может быть определена их молекулярная масса, а значит, и физическое расстояние между сайтами.
Рестриктазы широко используются при определении первичной
структуры ДНК, для картирования генов и в генетической инженерии для
создания и клонирования гибридных молекул ДНК.
2.3. Гибридизационные методы
Гибридизационный анализ, или генное зондирование, – это направление по определению специфических нуклеотидных последовательностей
ДНК и РНК.
В основе гибридизационных методов лежит способность нуклеиновых кислот к гибридизации – образованию двухцепочечных структур за
счет взаимодействия комплементарных нуклеотидов.
Зонд – меченая молекула ДНК (РНК), гибридизующаяся с изучаемым
комплементарным участком геномной ДНК или РНК.
Выделяют 3 основных типа зондов:
а) фрагменты комплементарной ДНК (кДНК), входящие в состав
плазмидного вектора или изолированные;
б) комплементарная РНК (кРНК), встроенная в плазмидный вектор,
который содержит сайт инициации транскрипции, распознаваемый бактериальной РНК-полимеразой (обычно SP6);
в) синтетические некодирующие олигонуклеотиды, полученные с
помощью автоматического ДНК-синтезатора.
В зависимости от используемой метки выделяют:
1) радиоизотопно меченые зонды. Традиционно для получения РНКили ДНК-зондов используют радиоактивно меченые с помощью 32Р, 35S,
125
I, 3H нуклеотиды, которые после гибридизации зонда с нуклеиновой
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
кислотой-мишенью выявляют методом авторадиографии. Преимущества:
обеспечивают высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов. Недостатки: имеют малый период полураспада,
требуют соблюдения строгих мер безопасности.
2) нерадиоактивно меченые зонды. В основе большинства методов
нерадиоактивного мечения лежат ферментативные реакции с участием
нуклеозид-трифосфатов, ковалентно связанных с молекулой-свидетелем,
обычно биотином – витамином Н – или дигоксигенином. Использование в
качестве метки дигоксигенина обеспечивает большую специфичность, так
как биотин присутствует в большинстве тканей. Для их детекции используют гистохимические методы.
После гибридизации такие нерадиоактивно меченые зонды можно
выявить:
во-первых, с помощью неиммунологической системы детекции на
основе авидина и стрептавидина (белков, имеющих высокое сродство к
биотину) – аффинный метод;
во-вторых, с помощью конъюгированных с флуоресцентным красителем или ферментом антител к зонду – иммуноцитохимический метод.
Зонды можно метить и химическими методами, используя биотин,
пришитый к высокоактивным молекулам (например фотобиотин, биотингидразид, эфир биотина).
В качестве неизотопной метки можно использовать и другие соединения (ртуть, ацетиламинофлуорен, динитрофенол и др.), но не все из
них являются безопасными.
Один из недавно разработанных нерадиоактивных методов детекции основан на использовании зонда – «молекулярного маяка» (рис. 8).
Такой зонд состоит из 25 нуклеотидов. Средние 15 из них комплементарны ДНК-мишени и не спариваются друг с другом, а 5 концевых нуклеотидов взаимно комплементарны и образуют шпильку. К 5′-концу
присоединен флуоресцентный хромофор (флуорофор), а к 3′-концу – нефлуоресцентный хромофор (тушитель), на который передается энергия
возбуждения флуорофора. В растворе при комнатной температуре «маяк» имеет такую конфигурацию, при которой флуорофор и тушитель находятся в тесном контакте, и флуоресценция флуорофора тушится. Когда же 15 средних нуклеотидов зонда гибридизуются с комплементарной
последовательностью ДНК- или РНК-мишени, происходит пространственное разделение флуорофора и тушителя, и зонд испускает свет. Температура реакционной смеси должна быть близка к комнатной, поскольку при ее повышении шпилька денатурирует, флуорофор и тушитель
расходятся и происходит флуоресценция. Необходимо также, чтобы все
15 нуклеотидов зонда были комплементарны соответствующей последовательности ДНК- или РНК-мишени.
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 8. Зонд – «молекулярный маяк»
Кроме вышеописанных, в качестве нерадиоактивных меток могут выступать вещества, рассеивающие электроны; бактериофаги; эритроциты; металлы (коллоидное золото); флуоресцентные красители; хемилюминесцентные и биолюминесцентные вещества; липосомы; простетические группы и
субстраты ферментов; модуляторы ферментов; а также сами ферменты.
Предложенная в начале 1970-х годов ферментная метка получила
наиболее широкое применение.
Преимущества ферментной метки:
1) многократно усиливает сигнал (в присутствии одной молекулы
фермента за короткое время образуются миллионы и миллиарды молекул
продукта реакции);
2) позволяет в некоторых случаях проводить анализ без разделения
вошедших в комплекс и не связавшихся компонентов;
3) позволяет регулировать свою каталитическую активность.
Перед проведением ферментативной реакции необходимо разделить
свободную и связанную фракции ферментной метки. Количество образовавшихся комплексов, а таким образом и содержание определяемой последовательности, оценивают по содержанию ферментной метки. Количество
метки определяют по ее каталитической активности.
В зависимости от типа регистрируемого сигнала в продуктах фермент-субстратной реакции все субстраты можно разделить на 4 группы:
1. Хромогенные субстраты, при использовании которых продукты
реакции – хромофоры – поглощают свет в видимой области, то есть их
растворы окрашены.
2. Пероксид водорода. При его каталитическом расщеплении образуется атомарный кислород, который окисляет присутствующий в растворе
хромоген с образованием хромофора.
3. Флуоресцентные субстраты. В результате воздействия фермента из
них образуются продукты, которые имеют свойство поглощать свет одной длины волны, а испускать – другой. Такое явление называется флуоресценцией.
28
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4. Хемилюминесцентные субстраты, при использовании которых
продукты реакции поглощают кванты света, переходят в возбужденное состояние и затем испускают свет определенной длины волны, то есть их
растворы светятся.
Наибольшее применение в качестве ферментной метки нашли 3
фермента: пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, β-D-галактозидаза.
При использовании пероксидазы в качестве ферментной метки субстратом выступает пероксид водорода, в комбинации с которым чаще всего используют хромогены орто-фенилендиамин (ОФД) и тетраметилбензидин (ТМБ). Продукт окисления ОФД окрашен в золотисто-коричневый
цвет и поглощает свет при длине волны 490 нм. Продукт окисления ТМБ
имеет желтый цвет, поглощает свет с длиной волны 450 нм.
Субстратом для щелочной фосфатазы является, например, п-нитрофенилфосфат, который превращается в п-нитрофенол (максимум поглощения при длине волны 405 нм). Для β-D-галактозидазы в качестве субстрата
применяют о-нитрофенил-β-D-галактопиранозид. При отщеплении онитрофенола образуется цветной продукт.
2.3.1. Получение зондов
2.3.1.1. ДНК-зонды
Эти зонды используются прежде всего для выявления ДНК, но могут
применяться и для гибридизации с РНК.
Двухцепочечные ДНК-зонды обычно представляют собой бактериальные плазмиды со встроенной специфической последовательностью
(чужеродной ДНК). В лаборатории плазмидную ДНК (двухцепочечная
кольцевая замкнутая молекула размером от 1 до 200 т.н.) можно ввести в
бактериальную клетку с помощью искусственного процесса трансформации. Для этого клетку обрабатывают смесью двухвалентных катионов, и
она временно становится проницаемой для малых молекул ДНК.
Для выделения плазмид разработано несколько методов, большинство из которых основано на том, что плазмиды имеют ковалентно замкнутую кольцевую форму и гораздо меньшие размеры, чем бактериальная
хромосома. Бактериальные клетки лизируют обычно с помощью ЭДТА и
лизоцима, разрушающего клеточную стенку. Можно использовать и органические растворители, нагревание, неионные детергенты.
Для выделения плазмидной ДНК чаще всего используют щелочной
метод. В щелочных условиях происходит денатурация и осаждение только
линейных молекул ДНК. Клеточная РНК и белки тоже осаждаются в результате использования детергента додецилсульфата натрия.
Для дальнейшей очистки выделенной плазмидной ДНК можно провести центрифугирование в равновесном градиенте плотности хлористого
цезия CsCl в присутствии красителя (бромистого этидия) – в этих условиях
29
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
плавучая плотность плазмидной ДНК выше плотности хромосомной, и она
концентрируется в полосе, расположенной ниже, чем полоса хромосомной
ДНК. Обычно эта полоса имеет красный цвет.
Одноцепочечную ДНК можно получить из последовательностей, клонированных, например, в нитчатых фагах типа М13.
Мечение ДНК можно проводить следующими методами:
1) метод нуклеотидного замещения (ник-трансляция) включает внесение в двухцепочечную ДНК случайных разрывов ДНКазой. Далее с
5′-стороны от точки разрыва происходит последовательное отщепление
нуклеотидов за счет 5′® 3′-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы I
(E. сoli) и одновременно за счет 5′® 3′-полимеразной активности этого же
фермента происходит присоединение нуклеотидов к свободному
3′-гидроксильному концу. В итоге точка разрыва перемещается вдоль молекулы ДНК. Заменяя обычные нуклеотиды на радиоактивно меченые, можно
получить ДНК с высокой удельной радиоактивностью. Эта процедура пригодна и для нерадиоактивных молекул-свидетелей биотина и дигоксигенина. Метод эффективен для линейной и кольцевой двухцепочечной ДНК;
2) метод рассеянной (случайной) затравки, в основе которого, как и
предыдущего, лежит синтез новой комплементарной матрицы цепи с помощью ДНК-полимеразы при наличии свободной 3′-гидроксильной группы. Эту группу «поставляет» короткий олигонуклеотидный праймер, отожженный с матрицей. В дальнейшем происходит ферментативная элонгация цепи путем присоединения меченых (радиоактивно или нерадиоактивно) нуклеотидов. В качестве матрицы может выступать как ДНК (двухцепочечная или одноцепочечная), так и РНК (в этом случае вместо
ДНК-полимеразы I E. сoli (фрагмента Кленова) используют РНК-зависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу));
3) получение зондов с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР)
позволяет получать in vitro большое число копий специфических фрагментов ДНК, располагая малым количеством сложной и часто загрязненной
матрицы. Если в ПЦР-реакции используются меченые трифосфаты, то амплифицированная ДНК, размер которой варьирует от 180 п.н. до 2000 п.н.,
может иметь высокую удельную радиоактивность – 5×109 имп/мин на
1 мкг. Это больше, чем дают методы ник-трансляции (0,5×109 имп/мин на
1 мкг) и рассеянной затравки (2×109 имп/мин на 1 мкг).
Для получения ПЦР-зондов также можно использовать радиоактивные и нерадиоактивные (например биотин) метки. ПЦР-зонды имеют заданную длину, определенную нуклеотидную последовательность, они высокоспецифичны и могут быть как одно-, так и двухцепочечными. Метод
ПЦР позволяет получать на основе ДНК-матрицы как одно- и двухцепочечные ДНК-, так и РНК-зонды. Еще одним достоинством метода является
то, что метку можно ввести в зонд непосредственно в ходе ПЦР без предварительного его клонирования.
30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2.3.1.2. Одноцепочечные РНК-зонды
В последние годы РНК-зонды (рибо-зонды) стали широко использоваться для выявления мРНК как при изотопной, так и при неизотопной гибридизации in situ. Это связано с более высокой стабильностью гибридов
РНК-РНК по сравнению с гибридами РНК-ДНК и доступностью плазмидных
векторов и векторов других типов, содержащих промоторы для РНКполимераз. Мечение РНК-зондов проводят с помощью транскрипции in vitro.
2.3.1.3. Олигонуклеотиды
Олигонуклеотиды широко используются для выявления мРНК, особенно в тех случаях, когда последняя присутствует в больших количествах. Это самые короткие из используемых зондов и обычно их метят путем
химического или ферментативного достраивания с одного или обоих концов мечеными нуклеотидами, а также методами фотомечения и включения
меченых нуклеотидов в ходе синтеза.
Для повышения чувствительности при гибридизации используют
смесь примерно 20 разных олигонуклеотидов (обычно длиной более 16
звеньев). Олигонуклеотиды можно быстро синтезировать с помощью автоматического синтезатора.
Различают 2 типа гибридизационного анализа:
1. Методы гибридизационного анализа, проводимые в растворе (гомогенные);
2. Методы гибридизационного анализа, проводимые на твердом носителе (гетерогенные).
2.3.2. Метод гибридизации в растворе
При гибридизации в растворе искомая НК и зонд свободно взаимодействуют в водной реакционной смеси, что повышает скорость процесса
гибридизации. Детекцию результатов гибридизации в растворе осуществляют путем нуклеазного гидролиза одноцепочечных ДНК и выделения оставшихся двухцепочечных гибридов, содержащих меченый зонд.
Для успешного проведения реакции гибридизации в растворе необходимо применять одноцепочечные зонды, не способные к самогибридизации. Метод хорош еще и тем, что требует минимальных объемов и количеств биологического и клинического образцов, поэтому может быть использован в диагностических целях. В то же время этот метод имеет один
существенный недостаток – на его основе можно создать диагностические
тест-системы для выявления специфических фрагментов небольших участков ДНК при условии достаточно высокой концентрации искомых фрагментов или участков в исследуемом образце. Это снижает порог чувствительности до уровня ИФА и даже ниже.
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2.3.3. Метод гибридизации на твердом носителе
Принцип метода основан на гибридизации зонда на твердой поверхности. В качестве твердой поверхности чаще всего используют полимерный мембранный фильтр, например нейлоновую мембрану.
Процедура гибридизации нуклеиновых кислот в общих чертах состоит в следующем:
1. Фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре (обычно путем инкубации от 10 мин до 4 ч при 80 °С в вакууме).
2. Нанесение меченого одноцепочечного ДНК-зонда, который при
определенных условиях (температуре и ионной силе) спаривается с
ДНК-мишенью.
3. Промывание фильтра для удаления избытка несвязавшегося меченого ДНК-зонда.
4. Детекция гибридных молекул зонд/мишень. Система детекции
должна быть в высшей степени специфичной и высокочувствительной.
2.3.4. Гибридизация in situ
Гибридизация in situ (ГИС; in situ hybridization, ISH) – это метод
прямого выявления нуклеиновых кислот в клеточных структурах в условиях, позволяющих одновременно исследовать их морфологию.
Метод гибридизации in situ основан на способности хромосомной
ДНК образовывать устойчивые гибридные молекулы с ДНК(РНК)-зондами
непосредственно на препаратах фиксированных хромосом и интерфазных
ядер. С помощью этого метода можно определить точное местоположение
практически любой последовательности ДНК или РНК непосредственно в
клетке, клеточном ядре или на хромосомах (рис. 9).
Задача осложняется тем, что при проведении ГИС приходится иметь
дело с самыми разными объектами – от индивидуальных хромосом в метафазных пластинках до архивных, залитых в парафин биоптатов. Чувствительность метода ГИС ограничена возможностью проникновения зондов
внутрь клеток для связывания с искомой мишенью.
Выбор конкретной методики гибридизации, оптимальной для данного эксперимента, зависит от следующих факторов:
– природа НК-мишени (методики выявления ДНК и РНК с помощью
ГИС различаются);
– чувствительность;
– специфичность;
– вопросы практического характера (стоимость, безопасность, наличие оборудования и реактивов).
С помощью ГИС можно исследовать срезы толщиной 3–10 мкм.
32
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 9. Схема процедуры ГИС
Предварительная обработка срезов включает:
– депарафинирование срезов тканей, залитых в парафин;
– демаскирование НК-мишени (необходимо разрушить сшивки
НК-мишени с другими нуклеиновыми кислотами и белками, например, с
помощью ограниченного протеолиза протеиназой К и пепсином-HCl);
– обработку РНКазой или ДНКазой;
– предгибридизацию срезов (инкубирование в не содержащей зонда
гибридизационной смеси, проводится не всегда).
Для денатурации используют химические (щелочная денатурация) и
физические (термоденатурация) факторы. Денатурацию обычно проводят в
33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
присутствии формамида (ослабляет внутримолекулярные водородные связи)
и солей, что позволяет снизить температуру денатурации и гибридизации.
Для проведения гибридизации иногда достаточно просто снизить
температуру смеси ниже температуры плавления гибрида зонд/мишень и в
этих условиях выдержать образец в течение 2–16 ч. В целом же подбор условий для проведения гибридизации (температура, время) индивидуален
для каждого отдельного случая.
Оптимальная температура ренатурации (или отжига) примерно на
25 °С ниже температуры плавления (Tm) гибридной молекулы. Tm двухцепочечной молекулы ДНК – это температура, при которой 50 % дуплексов
денатурировано. Один из вариантов условий гибридизации (общепринятые
«жесткие» условия: 50 % формамид, 2хССР (стандартный солевой раствор), 42 °С) соответствует температуре гибридизации Tm – 12 °С. Жесткость условий можно повысить, увеличив концентрацию формамида, снизив концентрацию солей и повысив температуру.
В зависимости от нуклеотидного состава и числа копий исследуемой
последовательности ДНК, а также поставленных задач, может изменяться
содержание формамида (от 0 до 60 %), концентрация солевых буферов
(от 2х до 0,1хССР), температурный режим (от 37 °С до 42 °С), время
(2–16 ч) проведения гибридизации.
Необходимым условием проведения гибридизации является то, что
меченый зонд должен иметь подходящий размер и присутствовать в нужной концентрации.
После гибридизации проводят отмывание образцов и детекцию гибридизовавшегося зонда (метод детекции зависит от типа используемого зонда).
Чтобы убедиться в специфичности наблюдаемого сигнала, во всех
случаях необходимо ставить адекватные контрольные опыты, как положительные, так и отрицательные.
Частный случай ГИС – флуоресцентная гибридизация in situ (FISH).
В качестве зондов в данном случае используют последовательности, меченые флуорохромами, что сокращает проведение процедуры до 7–9 часов.
Данный метод имеет ряд преимуществ по сравнению с изотопными вариантами гибридизации: большую разрешающую способность, быстроту и
безопасность для здоровья исследователя.
Гибридные молекулы можно выявлять с помощью различных систем
иммунохимической детекции, используя флуорохромы – детекторы разных
цветов. Это делает возможным выявление одновременно нескольких последовательностей ДНК в одной клетке. Существует множество вариантов
флуоресцентной детекции, например, возможно «раскрасить» таким способом все хромосомы человека, каждую своим цветом.
Анализ препаратов после FISH проводят с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного набором соответствующих светофильтров.
34
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2.3.5. Блот-гибридизация
Блот-гибридизация (блоттинг) – метод идентификации макромолекул, разделенных гель-электрофорезом и фиксированных на твердом матриксе, путем гибридизации содержимого образцов с мечеными комплементарными зондами.
Виды блоттинга:
1) вестерн-блоттинг (иммуноблоттинг) – идентификация искомого белка путем гибридизации разделенных гель-электрофорезом белковых
молекул с меченым антителом;
2) нозерн-блоттинг – идентификация искомой последовательности
РНК путем гибридизации разделенных гель-электрофорезом молекул
мРНК с меченым комплементарным ДНК-зондом;
3) саузерн-блоттинг – идентификация участка ДНК, содержащего
искомую нуклеотидную последовательность, путем гибридизации разделенных гель-электрофорезом фрагментов ДНК с меченым комплементарным ДНК-зондом.
2.3.5.1. Блот-гибридизация по Саузерну
Блот-гибридизация по Саузерну – это классический метод блотгибридизации; назван по фамилии автора, предложившего его в 1975 г.
Первым этапом саузерн-блоттинга является выделение суммарной
геномной ДНК. Затем геномная ДНК обрабатывается одной или несколькими рестрикционными эндонуклеазами, после чего образующиеся фрагменты разделяют по относительной молекулярной массе в агарозном геле. Далее, после денатурации ДНК, проводится процедура блоттинга –
переноса фрагментов ДНК с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый
фильтр (это осуществляется за счет действия осмотических сил, вакуума
или электрического поля), в результате чего на фильтре фиксируется точная реплика ДНК-рестрикта (рис. 10).
Денатурированные фрагменты ДНК гибридизуют с радиоактивномеченым зондом – молекулой ДНК длиной несколько сотен нуклеотидов.
После отмывки фильтра и авторадиографии на рентгеновской
пленке можно оценить точное положение и длину фрагментов ДНК,
комплементарных использованному зонду.
Таким образом, блот-гибридизация позволяет идентифицировать
специфические последовательности нуклеотидов в общем наборе рестрикционных фрагментов геномной ДНК. При наличии макроперестроек ДНК,
затрагивающих исследуемый участок, набор или размер фрагментов, с которыми гибридизуется меченая проба, будет отличаться от нормы.
35
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 10. Схема саузерн-блоттинга
Нозерн- и вестерн-блоттинг проводятся аналогичным образом.
Метод блот-гибридизации обладает высокой чувствительностью, однако он является весьма трудоемким, предполагает использование радиоактивных зондов (хотя в последнее время нередко используют различные
варианты нерадиоактивного мечения или окраску ДНК нитратом серебра),
предъявляет высокие требования к качеству анализируемой ДНК и требует
для проведения больших количеств геномной ДНК (5–10 мкг). Тем не менее, во многих случаях он играет ведущую роль в прямой ДНК-диагностике, в том числе в сочетании с другими методами.
2.3.6. Метод сэндвич-гибридизации
Метод является одной из разновидностей зондовой технологии. При
его использовании применяются два зонда, гомологичные различным участкам искомой нуклеиновой кислоты. Один зонд фиксируют на мембране,
для того чтобы связать искомую нуклеиновую кислоту, присутствующую в
исследуемом образце. После осуществления гибридизации мембрану отмывают от исследуемого материала и добавляют раствор, содержащий
второй зонд, который имеет определенную метку. Процесс гибридизации
проводят повторно, и при этом зонд с меткой взаимодействует с искомым
участком ДНК (РНК). Дальнейший процесс детекции проводится стандартным методом (ферментно-гибридизационным, авторадиографическим,
флуоресцентным, хемилюминесцентным).
Например, если второй зонд был связан с биотином, то его выявление может быть проведено ферментно-гибридизационным методом. Для
этого в систему добавляют авидин (белок куриного яйца) или стрептави36
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
дин (бактериальный аналог авидина). После отмывания добавляют биотинилированный фермент – щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена. В
зависимости от используемого фермента добавляют хромогенный или хемилюминесцентный субстрат и регистрируют изменение окраски либо
люминесценцию, сопровождающую превращение субстрата в продукт.
В качестве альтернативы после гибридизации ДНК со вторым, биотинилированным зондом можно добавлять уже готовый комплекс стрептавидин – фермент, имеющий сайт связывания с биотином.
Как авидин, так и стрептавидин связываются с биотином очень
прочно (константа диссоциации (Кd = 10-15); кроме того, каждый из белков
имеет четыре независимых биотинсвязывающих сайта, благодаря чему одна молекула авидина или стрептавидина может одновременно присоединять фермент и зонд, меченные биотином. Биотинилирование и связывание со стрептавидином не приводят к снижению ферментативной активности. В хромогенных системах детекции в том месте, где находится гибридная ДНК, под действием фермента образуется нерастворимый краситель, а
в хемилюминесцентных системах – продукт, который испускает свет.
2.3.7. Метод разветвленной ДНК
Искомая НК связывается с улавливающим зондом, один конец которого комплементарен мишени, а другой – определенному концу усиливающего
зонда. При этом усиливающий зонд может быть комплементарен следующему зонду и т.д. Количество зондов может быть велико, и все они связаны с
несколькими (от одного до нескольких десятков) люминофорами, которые по
мере увеличения количества связанных зондов усиливают (хеми-, флуоро-)
люминесценцию. Преимуществом данного метода является возможность использования в одной реакции нескольких улавливающих и связывающихся с
мишенью зондов, что обеспечивает выявление агентов, характеризующихся
значительной геномной гетерогенностью (например ВИЧ).
2.4. Методы амплификации нуклеиновых кислот
До изобретения методов амплификации нуклеиновых кислот для доказательства наличия инфекционного возбудителя или идентификации генетической мутации использовали гибридизационные методы. Однако
ДНК-зондовая диагностика имеет существенные ограничения как по своей
чувствительности, так и по трудоемкости и длительности: для ее осуществления необходимо выделить ДНК из не менее чем 10 000 клеток, а сам
процесс гибридизации не может быть полностью автоматизирован. Предварительная быстрая амплификация in vitro позволяет детектировать единичные микробные или мутантные клетки и в большинстве случаев делает
необязательным применение для детекции ДНК-гибридизации.
37
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Открытие Карри Мюллисом в 1983 году (США) метода полимеразной цепной реакции послужило толчком к активному развитию разнообразных технологий амплификации нуклеиновых кислот.
По сути, все методы амплификации имитируют природную возможность репликации ДНК. При этом in vitro происходит изолированное умножение гена или его фрагментов (амплификация) в миллионы раз.
Все методы амплификации могут быть разделены в зависимости от
изменения температурных режимов на:
1) методы амплификации с циклической сменой температурных параметров: методы ПЦР, лигазной цепной реакции (ЛЦР) и их модификации;
2) изотермальные методы амплификации нуклеиновых кислот: метод
изотермальной транскрипционной амплификации (TAS), самоподдерживающая репликация последовательностей (3SR, NASBA), амплификация с
вытеснением цепи (АВЦ), амплификация с использованием QB-репликазы.
Все методы амплификации состоят из трех основных этапов:
1) Подготовка исследуемого образца в целях выделения ДНК (РНК) из
клеток;
2) Непосредственная амплификация выделенных участков (копий) ДНК
(РНК);
3) Детекция продуктов, полученных на втором этапе.
2.4.1. Полимеразная цепная реакция
В современной лабораторной диагностике ПЦР занимает особое место. Метод ПЦР поднял клиническую лабораторную диагностику на принципиально иную высоту – уровень определения нуклеиновых кислот
(ДНК и РНК), что позволяет провести прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации в любой биотической или абиотической среде. При этом способом ПЦР, теоретически, может быть обнаружена всего одна искомая молекула НК среди миллионов других молекул НК.
Чрезвычайно важную роль играет этот метод в диагностике инфекционных заболеваний. Внедрение данного метода в практику наряду с серологической диагностикой существенно расширило возможности современной клинической микробиологии, основу которой до сих пор составляют методы выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах или в культуре клеток.
В тех случаях, когда использование культуральных методов является
проблематичным или связано с недостаточной диагностической эффективностью, возможность замены биологической амплификации (то есть роста на искусственных средах) на ферментативное удвоение нуклеиновых кислот in vitro
с помощью ПЦР представляется особенно привлекательной. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР (specific PCR) предусматрива38
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ет использование праймеров, комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизма. Например, ПЦР-амплификация специфического участка гена, кодирующего главный белок наружной мембраны (МОМР) Chlamydia trachomatis, в сочетании с нерадиоактивной гибридизацией для детектирования продуктов реакции позволяет обнаружить единичные копии хламидийной ДНК в исследуемых образцах. При этом ПЦР значительно превосходит по диагностической
эффективности культивирование и методы прямого обнаружения хламидийного антигена (микроиммунофлюоресценцию и иммуноферментный анализ),
традиционно используемые для выявления C. trachomatis.
2.4.1.1. Принцип метода ПЦР
Полимеразная цепная реакция – искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК,
осуществляемый in vitro (рис. 11). Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом – ДНК-полимеразой, как и в клетках живых
организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице),
синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Для начала
синтеза цепи ДНК ДНК-полимеразе необходима РНК-затравка (праймер), к
которой она может начать присоединять нуклеотиды. Основной принцип
ПЦР состоит в том, что реакция полимеризации (синтеза полимерной цепи
ДНК из мономерных нуклеотидных звеньев) инициируется специфическими праймерами (короткими фрагментами «затравочной» ДНК) в каждом из
множества повторяющихся циклов. Специфичность ПЦР определяется способностью праймеров «узнавать» строго определенный участок ДНК и связываться с ним согласно принципу молекулярной комплементарности.
В обычной реакции ПЦР используется пара праймеров, которые «ограничивают» амплифицируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-матрицы (рис. 11). Для многократного увеличения
количества копий исходной ДНК нужна цикличность реакции. Как правило,
каждый из последовательно повторяющихся циклов ПЦР состоит из трех
этапов:
1. Денатурации, или «плавления» ДНК, когда двухцепочечная ДНК
под действием высокой температуры (92–95 °С) переходит в одноцепочечное состояние;
2. Связывания (отжига) праймеров с одноцепочечной матричной
ДНК (температура 45–60 °С);
3. Элонгации – полимеризации, или удлинения цепи. При температуре 65–72 °С происходит синтез комплементарной цепи на ДНК-матрице,
начинающийся от места гибридизации праймера и происходящий в направлении 5′®3′.
Смена этапов каждого цикла осуществляется путем изменения температуры реакционной смеси. Сначала праймеры могут связаться только с оп39
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ределенной последовательностью исходной ДНК, но в последующих циклах
они связываются с копиями этой последовательности, синтезированными в
предыдущих циклах (рис. 11). При этом количество основного продукта ПЦР
(копии последовательности ДНК, ограниченной праймерами) теоретически
удваивается в каждом цикле, то есть растет с числом циклов экспоненциально. Число указанных циклов в ПЦР составляет обычно от 25 до 40 (через n
циклов будет 2n копий исходной молекулы ДНК-мишени).
В реакции используются термостабильные ДНК-полимеразы, выдерживающие высокую температуру на всех этапах цикла ПЦР в течение нескольких десятков циклов. Количество коммерчески доступных термостабильных ДНК-полимераз, отличающихся некоторыми своими свойствами,
достаточно велико. Наиболее часто используется Taq-ДНК-полимераза, первоначально выделенная из термофильного микроорганизма Thermus aquaticus.
Другие полимеразы чаще применяются для особых приложений ПЦР. Современные коммерческие препараты термостабильных полимераз обеспечивают,
как правило, стабильную воспроизводимую активность, что позволяет использовать технологию ПЦР в стандартной лабораторной практике.
Таким образом, ПЦР позволяет осуществлять амплификацию в пробирке при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы (TaqДНК-полимеразы) из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов (dNTP), являющихся структурными элементами ДНК, и коротких олигонуклеотидных 20–30-членных затравок (праймеров), комплементарных 3′-концевым
последовательностям антипараллельных цепей ДНК гена.
Рис. 11. Механизм полимеразной цепной реакции
40
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Кинетика ПЦР имеет экспоненциальный характер только на начальном этапе (20–25 циклов), после чего начинается выход на плато (после
40–45 циклов) в силу:
1) истощения dNTP и праймеров;
2) нарастающего температурного повреждения Taq-ДНК-полимеразы;
3) конкуренции за фермент амплификонов, когда их число начнет превышать число молекул Taq-ДНК-полимеразы. При содержании в ПЦРпробирке около 10 молекул ДНК-матриц, как правило, достаточно 35 циклов.
2.4.1.2. Подготовка проб для ПЦР-амплификации ДНК-матрицы
Благодаря пробоподготовке происходит концентрирование исследуемой ДНК-матрицы в малом объеме и удаление ингибиторов Taq-ДНКполимеразы (например гемоглобина). При отсутствии такой необходимости подготовка пробы может быть полностью исключена. Например, вирус
гепатита В в сыворотке крови и многие возбудители инфекционных менингитов в спинномозговой жидкости можно детектировать методом ПЦР
без всякой подготовки, без предварительного выделения из них ДНК. В
большинстве же случаев из исследуемой пробы крови, сыворотки, лейкоцитов, биоптатов тканей, мочи, мокроты для исключения ложноотрицательного результата следует выделить ДНК тем или иным способом. При этом необходимо учитывать, что содержание ДНК в геномах клеток человека, грибков, бактерий и вирусов различается в десятки раз (например, содержание ДНК в геноме диплоидной клетки человека составляет примерно 7·10-12 г, а в геноме СМV (цитомегаловируса) – 0,25·10-15 г).
В последние годы ряд фирм производит наборы для быстрой экстракции ДНК или РНК из различных материалов, подвергаемых анализу
методом ПЦР, обычно включающие специфические сорбенты НК. Общее
количество ДНК, вносимой в пробирку для ПЦР, не должно превышать
1 мкг, поскольку большой избыток неспецифической ДНК снижает специфичность и чувствительность ПЦР-амплификации ДНК-матрицы.
Подготовка пробы материала (выделение ДНК или РНК) должна
проводиться в условиях, исключающих перекрестное загрязнение исследуемых проб выделяемыми нуклеиновыми кислотами.
2.4.1.3. Постановка ПЦР
Пятью основными компонентами (реактивами) ПЦР являются следующие:
а) фермент Taq-ДНК-полимераза;
б) пара олигонуклеотидных праймеров (смысловой и антисмысловой);
в) 4 типа dNTP;
г) копируемая ДНК;
д) ионы Mg2+.
41
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Вспомогательными компонентами являются буферный раствор и
минеральное масло.
Фермент Taq-ДНК-полимераза получен из термостабильных организмов Thermus aquaticus, при оптимальных условиях ПЦР содержится в
50–100 мкл реакционной смеси в количестве 0,5–2 единицы. Она и синтезирует цепь ДНК до 1000 пар оснований в минуту до заданной длины в несколько сотен или тысяч пар нуклеотидов.
Праймеры каждый раз встраиваются в амплифицируемые фрагменты
ДНК-матрицы (амплификоны), поэтому они в реакционной смеси ПЦР
присутствуют в избытке: концентрация их составляет 0,5–1,0 мкМ. Специфичность получаемого продукта ПЦР в значительной степени определяется так называемой температурой отжига праймеров, при которой они
взаимодействуют с комплементарными участками ДНК-матрицы, образуя
двухцепочечные структуры. Температура отжига определяется длиной
праймера и содержанием ГЦ-пар. Как правило, праймеры для
ПЦР-детекции инфекционных возбудителей создают на консервативные
участки их ДНК, которые редко подвергаются генетическим перестройкам.
Дезоксинуклеозидтрифосфаты: dATP, dTTP, dGTP, dCTP – в реакционной смеси содержатся в эквивалентных концентрациях от 200 до 500
мкМ, т.к. избыток какого-либо из них увеличивает ложное спаривание
нуклеотидов в ПЦР.
Магний необходим для функционирования фермента Taq-ДНК-полимеразы, но оптимальная его концентрация устанавливается путем титрования, поскольку концентрация свободных ионов магния зависит не только
от добавленного его количества, но и от концентраций нуклеиновых кислот, праймеров и dNTP, которые связывают эти ионы. Средние величины
концентрации магния в ПЦР составляют около 2–3 мМ.
Буфер должен обеспечивать оптимальные условия для работы фермента. Наиболее распространен трис-НСl-буфер, который удерживает рН во время
ПЦР между 6,8 и 7,8, содержит желатин или бычий сывороточный альбумин и
неионные детергенты для стабилизации фермента, а также 50 мМ KCl.
Минеральное масло наслаивается на поверхность реакционной смеси
в количестве 30–40 мкл для предотвращения испарения в процессе ПЦР.
Кроме этих компонентов, необходим образец ДНК исследуемой биологической системы – положительный контроль.
Специфичность ПЦР и количество амплифицируемой ДНК, которое
определяет чувствительность, могут значительно варьировать в зависимости от концентрации и количества пяти основных компонентов реакционной смеси и температурного режима ПЦР, в частности – от температуры
отжига праймеров (2 стадия ПЦР).
Важным фактором воспроизводимости реакции амплификации является приборное обеспечение. Основным прибором для проведения ПЦР
является амплификатор (термоциклер), представляющий собой аппарат, в
42
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
гнезда которого устанавливаются специальные амплификационные пробирки, изготовленные из особого термопроводимого пластика, с реакционной смесью или предметные стекла с образцами тканей.
Амплификаторы изменяют температуру автоматически на основе заданной программы. В термоциклерах температура металлического блока, в
который помещаются пробирки, изменяется с помощью элемента Пельтье.
Элемент Пельтье позволяет изменять температуру блока с большой скоростью, что сокращает продолжительность каждого цикла ПЦР. Современные термоциклеры приспособлены для использования специальных тонкостенных пластиковых пробирок для реакционной смеси, что позволяет ускорить теплообмен между блоком прибора и реакционной смесью и в конечном итоге дополнительно сократить время проведения реакции.
К настоящему времени выпущено много разнообразных моделей амплификаторов. Наиболее удобными являются приборы с несколькими
платформами, каждая из которых может работать по отдельной программе,
что дает возможность одновременно анализировать пробы на наличие нескольких типов возбудителей или нескольких мутаций. Многие приборы
позволяют программировать специальные усложненные температурные
профили, необходимые для специфических модификаций процесса ПЦР.
Также для проведения исследования методом ПЦР необходимы:
1) микроцентрифуга типа Эппендорф (10–12 тыс. об./мин.); 2) камера для ЭФ
в гелях; 3) УФ-трансиллюминатор; 4) встряхиватель пробирок типа Эппендорф; 5) микротермостат; 6) фотоаппарат; 7) ламинарный шкаф и т.д.
После подготовки реакционной смеси для ПЦР пробирки плотно закрывают крышками и ставят в амплификатор, задают программу смены
температурных режимов, соответствующую амплификации исследуемого
участка ДНК. Каждый цикл амплификации включает 3 температурных режима: денатурацию ДНК (92–95 °С) – примерно 1 мин, отжиг праймеров
(45–60 °С) – 0,5–2 мин, синтез комплементарной цепи (65–72 °С) –
1–3 мин. После прохождения необходимого количества циклов процесс
останавливают. Таким образом, стандартная ПЦР может быть осуществлена за 1–3 ч. При необходимости оставить пробы на ночь их помещают в
холодильник при +4 °С или вводят дополнительный цикл на амплификаторе: +4 °С – 12 часов или более.
2.4.1.4. Детекция продуктов амплификации
Детекция методом гель-электрофореза. Выявление или детекцию
наработанного продукта ПЦР (амплификата) чаще всего проводят при помощи его электрофореза в 2–3 % геле агарозы или полиакриламидном геле, содержащем бромид этидия (специфический флуоресцентный ДНК и
РНК-краситель). Поглощая УФ-свет с максимальной длиной волны 256 нм,
бромид этидия, связанный с участком ДНК, способен флуоресцировать,
43
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
что регистрируется в видимом спектре (610–620 нм) в виде оранжевой полоски. Получаемые результаты элекрофореза амплификонов оценивают в
проходящем УФ-свете на специальных приборах – трансиллюминаторах –
и сравнивают с положительным контролем (ДНК выявляемого микроорганизма или известная ДНК). При положительном результате светящаяся полоска ДНК находится на том же уровне, что и положительный контроль
вследствие одинаковой молекулярной массы наработанных амплификонов
в контроле и изучаемом положительном образце. В отрицательном контроле должны отсутствовать компактные светящиеся полоски ДНК. Для
такого выявления необходимо не менее 20 нг ДНК.
Детекция гибридизационно-ферментативным методом с измерением интенсивности окраски образовавшегося продукта колориметрическим, флуоресцентным или хемилюминесцентным методами. Другим способом качественной и количественной оценки ПЦР является ферментногибридизационный метод. Для его проведения на твердом носителе иммобилизуют ДНК-зонд, с которым в результате гибридизации взаимодействует продукт амплификации. В дальнейшем в результате аффинного взаимодействия происходит связывание биотина и авидина с образованием
биотин-авидинового комплекса. При этом меченый пероксидазой авидин
выявляется ферментной реакцией с субстратом и дальнейшей регистрацией оптической плотности. В случаях, если вместо пероксидазы в авидин
встроено флуоресцентное вещество, детекция должна осуществляться с
использованием флуоресцентной техники. Возможны варианты, когда в
авидиновый комплекс встраивается рутений или другие вещества, способные к хемилюминесценции, и тогда оценка результатов проводится с использованием метода хемилюминесценции.
Использование одного или нескольких внутренних стандартов с известным количеством копий позволяет рассчитать содержание возбудителя
в исследуемой пробе.
Использование гибридизации с внутренними ДНК-зондами позволяет
в ряде случаев значительно повысить чувствительность и специфичность
детектирования ПЦР-продуктов. Благодаря отсутствию необходимости в
подготовке и проведении электрофоретического разделения, возможности
автоматизации для анализа большого количества образцов и использования нерадиоактивного формата детектирования, этот метод становится все
более распространенным. В некоторых случаях применение специальных
флюоресцентных «маркеров» позволяет контролировать проведение амплификации или детектирование конечных продуктов ПЦР непосредственно в реакционной пробирке.
Перспективной в настоящее время видится разработка для детекции
продуктов амплификации методов лантаноидного иммунофлуоресцентного
анализа. Данный метод основан на использовании в качестве метки положительно заряженных ионов редкоземельных элементов – европия, самария,
44
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
тербия и прозеодима, являющихся флуорохромами, причем их атомы способны существовать в возбужденном состоянии продолжительное время.
Весьма перспективной является также детекция продуктов амплификации с использованием флуоресцирующих моноклональных антител к специфическим амплификонам (цепочкам ДНК), характеризующим тот или иной
геном возбудителя или участок гена с определенными искомыми свойствами
(генные мутации, наследственные и онкологические заболевания и т.д.).
2.4.1.5 Модификации ПЦР
ПЦР в реальном времени. Один из методов количественной ПЦР базируется на использовании ДНК-зонда, комплементарного амплифицируемой последовательности и меченного двумя флуоресцентными метками,
одна из которых в исходном состоянии «поглощает» спектр флуоресценции другой. Далее в каждом цикле ПЦР (а именно, в фазе синтеза) за счет
5′-нуклеазной активности ДНК-полимеразы используемый зонд расщепляется и высвобождает 5′-метку, нарастание флуоресценции которой после
возбуждения лазерным лучом регистрируется в реальном режиме времени
и отражает нарастание числа молекул ПЦР-продукта (рис. 12).
Рис. 12. Количественная ПЦР в реальном режиме времени
45
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Гнездная ПЦР. Разработана в целях повышения чувствительности и
специфичности и проводится в 2 этапа. На первом этапе осуществляется
амплификация определенного гена искомой ДНК с «внешними» праймерами: проводится от 30 до 35 циклов. После этого часть амплификата (аликвоту) помещают во вторую пробирку с ПЦР-смесью и проводят
30–35 циклов амплификации с так называемыми «внутренними» праймерами (участки нуклеотидных последовательностей, отстоящие от внешних
праймеров на их длину). Получаемый продукт отличается высокой специфичностью и в дальнейшем подвергается детекции.
Обратно-транскрипционная ПЦР. Методика позволяет осуществлять ПЦР с РНК-содержащими возбудителями, считывая информацию с
РНК и создавая подобную ей ДНК. Выполнение данного процесса возможно при использовании специальных ферментов, обладающих обратнотранскрипционными свойствами и дезоксинуклеотидфосфатов. При помощи фермента обратной транкриптазы или ревертазы и одного цикла амплификации по специальной программе (+42 °С – 30 мин., +99 °С – 5 мин.,
охлаждение до +4 °С) осуществляется обратная транскрипция РНК: одна
нить РНК превращается в двойную комплементарную ДНК, а дальше ДНК
может быть амплифицирована «классической» или «гнездной» ПЦР.
ПЦР in situ (PRINS – polymerase reaction in situ). Метод сравнительно
недавно предложен для практики, аналогичен методу ГИС и позволяет
проводить ПЦР на срезе или в мазке. Метод хорошо себя зарекомендовал и
используется, в частности, в онкологии.
В данном методе отсутствует пробоподготовка. При этом используется
та же ПЦР-смесь, что и в «классическом» методе, однако сама реакция проходит на поверхности среза. Для проведения данной методики требуется специальный амплификатор, в котором изменяется температура воздушных потоков, создаваемых в микроколориметре, куда устанавливаются предметные
стекла со срезами и реакционной смесью. Детекцию результатов проводят с
использованием ферментативно-гибридизационного метода с визуальной
оценкой полученных результатов в обычном световом микроскопе.
Данный метод позволяет определить:
1) типы клеток, в которых произошли изменения;
2) распределение измененных клеток в ткани, т.е. оценить степень
повреждения;
3) провести сравнение с результатами гистологических и цитохимических исследований в адекватных условиях.
Мультиплексная ПЦР (multi-PCR, multiplex PCR). Методика позволяет проводить ПЦР с двумя-четырьмя и более не перекрещивающимися
праймерами нескольких возбудителей. Мультиплексная ПЦР позволяет
определить в одной пробе нуклеиновые кислоты сразу нескольких возбудителей, что особенно актуально, так как часто при диагностике обнаруживаются смешанные формы инфицирования.
46
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Так, например, описаны варианты применения множественной ПЦР
для одновременного обнаружения двух (Chlamidia trachomatis и Neisseria
gonorrhoeae при заболеваниях урогенитального тракта) или даже четырех
возбудителей (Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Moraxella
catarrhalis и Alloiococcus otitidis при хроническом гнойном отите).
Метод часто используется для выявления нескольких экзонов исследуемого гена. Например, для быстрой диагностики носительства делеций в
гене дистрофина у больных прогрессирующей мышечной дистрофией
Дюшенна и Бекера проводится одновременная амплификация набора наиболее часто мутирующих экзонов данного гена.
Альтернативный подход в ПЦР-диагностике связан с использованием универсальных праймеров, которые позволяют амплифицировать фрагменты генов, присутствующих у всех микроорганизмов определенной таксономической группы. Количество видов, которые могут быть выявлены с
помощью этого метода, может ограничиваться как рамками небольших
систематических групп (рода, семейства), так и крупных таксонов на уровне порядка, класса, типа. В последнем случае мишенью для ПЦР чаще всего являются рибосомные гены (16S и 23S рРНК), которые имеют сходную
структуру у различных прокариотических микроорганизмов.
Использование праймеров, комплементарных консервативным участкам этих генов, позволяет амплифицировать ДНК большинства видов
бактерий. Полученные в результате ПЦР фрагменты рибосомных генов
могут быть затем проанализированы с помощью различных лабораторных
методов с целью идентификации бактерий, которым они принадлежат.
Наиболее точным методом «молекулярной» идентификации является определение полной нуклеотидной последовательности (секвенирование)
амплифицированной ДНК и сравнение ее с соответствующими последовательностями известных видов.
Несмотря на наличие автоматизированных систем, использующих
описанный принцип идентификации, на практике обычно используются
менее трудоемкие и дорогостоящие методы, которые, тем не менее, позволяют достоверно выявлять определенные различия в последовательности
ДНК-фрагментов. Наиболее распространенными являются методы, основанные на анализе расположения в ДНК участков расщепления ферментами-рестриктазами – метод ПДРФ (RFLP) – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов, или на определении электрофоретической подвижности ДНК в одноцепочечной форме (метод SSCP – анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК).
ПЦР с использованием универсальных праймеров может применяться как для идентификации выделенных в чистой культуре микроорганизмов, так и для прямой диагностики широкого спектра возбудителей непосредственно в клинических образцах. Следует, однако, отметить, что чувствительность ПЦР «широкого спектра», как правило, ниже по сравнению
47
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
с «видоспецифическими» тест-системами. Кроме того, ПЦР с универсальными праймерами обычно не используется для исследования образцов, в
которых может находиться большое количество различных микроорганизмов, из-за трудности анализа продуктов реакции, полученных в результате
амплификации ДНК разных видов.
2.4.1.6 Методы предотвращения контаминации.
Устройство ПЦР-лаборатории
Потенциально высокая чувствительность ПЦР делает совершенно
необходимым особенно тщательное устройство ПЦР-лаборатории. Это
связано с наиболее острой проблемой метода – контаминацией.
Контаминация – попадание из внешней среды в реакционную смесь
молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и
давать ложноположительные результаты.
Такими мишенями могут быть продукты реакции, попадающие во
внешнюю среду на этапе электрофореза из пробирок, в которых успешно
прошла амплификация, либо специфическая ДНК из образцов на этапе
пробоподготовки.
Существует несколько способов борьбы с этим неприятным явлением.
Одним из них является использование фермента N-урацилгликозилазы (УГ).
В основе этого метода лежит способность УГ расщеплять молекулы ДНК со
встроенным урацилом. Реакцию амплификации проводят с использованием
смеси dNTP, в которой dTTР заменен на dUTP, и после проведения ПЦР все
образующиеся в пробирке амплификоны будут содержать урацил. Если до
амплификации в реакционную смесь добавить УГ, то попавшие в реакционную смесь амплификоны будут разрушены, тогда как нативная ДНК останется целой и будет в дальнейшем служить мишенью для амплификации.
Другим способом инактивации амплификонов служит фотохимическое воздействие на молекулы ДНК. Для этого используют псорален или
изопсорален, которые активируются кратковременным облучением
УФ-светом. Модифицированные этими соединениями молекулы ДНК не
могут участвовать в реакции амплификации.
Однако, как известно, ни одна биологическая или химическая реакция
не идет со 100 % эффективностью и, соответственно, после инактивации
продуктов амплификации из миллиардов копий амплифицированного фрагмента хотя бы несколько останутся целыми. Кроме того, всегда остается риск
кросс-контаминации от образца к образцу в процессе пробоподготовки.
Даже при таком способе, как значительное уменьшение количества
циклов реакции (до 25–30 циклов), риск получения ложноположительных
результатов велик.
Таким образом, наиболее радикальным средством является заранее
продуманная организация лаборатории. Для уверенности в отсутствии
48
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
контаминации необходимо каждую серию экспериментов сопровождать
отрицательными контролями. Все реактивы рекомендуется хранить разлитыми на отдельные порции (аликвоты).
Если несмотря на принятые меры следы контаминации всё же обнаружены, необходимо все поверхности помещения, оборудования, пипеток
и прочее обработать 0,1 М HCl, а все используемые порции реактивов следует заменить на новые.
ПЦР-лаборатория должна быть разделена на 3 зоны – по числу технологических операций:
1) зона подготовки реакционной смеси («чистая зона»);
2) зона пробоподготовки;
3) электрофоретическая комната.
[Стрелками показаны возможные направления перемещения по зонам ПЦР-лаборатории].
Все 3 зоны должны быть изолированными комнатами, снабженными
предбоксниками. Полезно иметь устройство фильтрации воздуха.
Если первую и вторую зоны, в крайнем случае, допускается объединить
(при наличии специальных боксов), то комната для электрофореза должна
размещаться как можно дальше от двух других зон (другой этаж, другое здание) и иметь не связанную с другими зонами систему вентиляции. Это является одним из наиболее важных требований при организации ПЦР-лаборатории.
Кроме того, желательно предусмотреть отдельные помещения для
переодевания и хранения верхней одежды, приема пища, складское помещение для лабораторных материалов. Все производственные комнаты
должны быть снабжены коротковолновыми УФ-лампами.
Инактивацию биологического материала проводят в автоклаве в течение 1 часа при 1,5 атмосферах.
2.4.1.7. Преимущества ПЦР
как метода диагностики и его применение
Одним из важнейших критериев диагностической эффективности
любого лабораторного анализа является показатель «чувствительности».
При этом следует различать аналитическую и диагностическую чувствительность. Аналитическая чувствительность, применительно к ПЦР, представляет собой то минимальное количество копий (геномных эквивалентов – г/э) ДНК или РНК в одном миллилитре раствора образца, которое
может быть определено данной тест-системой. Большинство коммерческих
амплификационных тест-систем позволяет обнаружить в биологической
пробе искомую НК, если ее концентрация составляет не менее нескольких
сот г/э копий в 1 мл образца. Например, аналитическая чувствительность
большинства тест-систем для ВИЧ-1 составляет 300–500 копий ДНК в 1 мл
49
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
образца. Диагностическая чувствительность определяется количеством пациентов с данным заболеванием, дающих истинно положительные результаты при использовании конкретного набора и оценивается в процентах. В
этом аспекте имеется общее положение, определяющее клиническую пригодность любых лабораторных способов диагностики или тест-систем, –
диагностическая чувствительность метода не должна быть ниже 95–98 %.
Второй универсальный критерий лабораторной эффективности –
«специфичность» – определяется процентом здоровых людей, имеющих
истинно отрицательные результаты анализа. Метод ПЦР обладает высочайшей специфичностью, которая достигает 99–100 %.
Диагностическая чувствительность и специфичность ПЦР сопоставимы, а зачастую и превосходят те же характеристики, обеспечиваемые
культуральным методом, которые являются «золотым стандартом» в диагностике инфекционных заболеваний. Если учесть продолжительность процедуры выращивания культуры клеток (от нескольких недель до нескольких месяцев), то преимущество метода ПЦР становится несомненным. Результаты ПЦР-анализа можно получить в течение одного рабочего дня,
при этом отобранные для анализа пробы могут храниться (накапливаться)
в течение даже нескольких недель при соблюдении соответствующих температурных норм. Проведенная недавно в нескольких зарубежных исследовательских центрах суммированная оценка чувствительности различных
методов диагностики показала, что «быстрые» или экспресс-тесты имеют
чувствительность 40–60 %, ИФА – 50–70 %; прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) – 55–75 %; культуральное исследование – 60–80 %; а ПЦР –
от 90 до 100 %. Отсюда следует, что ПЦР, по сравнению с другими способами, обладает двумя важными преимуществами: высокой чувствительностью и непродолжительностью по времени анализа, т.е. «актуальностью»
получения результата исследования врачом и пациентом.
Таким образом, приведенные выше факты позволили отметить следующие преимущества ПЦР перед другими методами клинической лабораторной диагностики:
1. Универсальность. Метод принципиально позволяет обнаруживать
любые ДНК и РНК даже в тех случаях, когда другими способами это сделать невозможно. Вне зависимости от объекта и области применения ПЦР
(клиническая медицина, криминалистика, ветеринария, генетика, молекулярная биология) используется стандартный комплект приборов. Это обуславливает универсальность процедуры постановки ПЦР при исследовании любых биологических объектов.
2. Специфичность. Высокая специфичность (100 %) метода обусловлена тем, что в исследуемом материале определяется уникальный фрагмент
НК (нуклеотидная последовательность), характерный только для данного возбудителя или гена. Таким образом, ПЦР-диагностикумы дают возможность
избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами.
50
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3. Чувствительность. Возможность проведения не только качественной (наличие), но и количественной (концентрация) оценки содержания
НК. В настоящее время реальный порог чувствительности коммерческих
амплификационных тест-систем позволяет определять несколько сот копий в исследуемом образце.
4. Актуальность ответа (быстрота получения результата). Высокая технологичность и автоматизация метода позволяют врачу и пациенту
получить результаты исследования в день проведения анализа.
5. Возможность доклинической и ретроспективной диагностики.
ПЦР позволяет осуществить определение патогена или дефектного гена в
организме еще до развития заболевания. Например, при инфекциях в инкубационном периоде, т.е. серонегативной фазе или при латентном характере заболевания. Кроме того, возможно проведение ПЦР в архивном
(фиксированном) материале или биологических остатках, что важно для
идентификации личности или отцовства.
6. Проведение анализа возможно в минимальном объеме пробы (до
нескольких микролитров), что крайне важно в неонатологии, судебной медицине, клинической генетике и т.п.
7. Возможность одновременной диагностики нескольких возбудителей заболеваний или аномальных генов в одной пробе без ущерба
для чувствительности или специфичности результата.
8. Возможность экспертизы. Полученные результаты ПЦР возможно вносить в компьютерные информационные носители или фотографии для оценки независимыми экспертами.
Несмотря на вышеуказанные достоинства, метод ПЦР все же не лишен недостатков, которые следует учитывать при оценке результатов исследований. В настоящее время выделяют следующие две группы:
Первая – технологическая, подразумевающая под собой высочайшие
требования к оснащению лаборатории, качеству тест-наборов и строжайшее соблюдение регламента исследования во избежание получения ложных результатов. Решение проблемы качества анализов возможно при соответствующей квалификации персонала и обязательной сертификации
лаборатории. В связи с этим врачи должны требовать от лаборатории, проводящей исследования методом ПЦР, государственный сертификат.
Вторая – клиническая, заключающаяся в неоднозначной прогностической оценке положительного результата ПЦР. Именно этот факт зачастую вызывает сомнения у практических врачей в полученном результате и
эффективности метода ПЦР. Поясним на примере. Показано, что только у
40 % – 60 % лиц с обнаруженной в крови методом ПЦР ДНК цитомегаловируса клинически может развиться заболевание. В данной ситуации при
оценке результатов исследования совершается типичная ошибка, заключающаяся в отождествлении двух принципиально различных понятий –
«инфицированность» и «инфекционная болезнь».
51
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таким образом, недостатки ПЦР лежат не в сути метода, а в неправильном методическом подходе (алгоритме лабораторной диагностики)
при обследовании пациента и неверной клинической интерпретации полученных результатов.
Возможности применения метода ПЦР в лабораторной диагностике
Наиболее эффективно и обоснованно использование метода ПЦР ДНК:
- в урологической и гинекологической практике – для выявления
хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллеза, микоплазменной инфекции, ВПЧ – вируса папилломы человека;
- в пульмонологии – для дифферециальной диагностики вирусных и
бактериальных пневмоний, туберкулеза;
- в гастроэнтерологии – для выявления геликобактериоза;
- в клинике инфекционных заболеваний – в качестве экспресс-метода
диагностики сальмонеллеза, дифтерии, вирусных гепатитов B, C, G.
- в гематологии – для выявления цитомегаловирусной инфекции,
онковирусов.
Примером использования ПЦР для прямой диагностики и идентификации возбудителей инфекционных заболеваний может служить ВИЧ-инфекция.
Этиологическим фактором ВИЧ-инфекции являются вирусы HIV-1 и
HIV-2 (от англ. Human Immunodeficiency Viruses) из семейства Retroviridae.
Патогенез ВИЧ-инфекции заключен в инфицировании вирусом клеток с
фенотипом CD-4, присущим Т-лимфоцитам хелперам и некоторым другим
клеткам организма человека. Прямое цитопатическое воздействие, оказываемое вирусом иммунодефицита на указанные клетки, в конечном итоге
приводит к летальному исходу за счет активации оппортунистических инфекций или развития опухолей.
Лабораторная диагностика ВИЧ-инфекции проводится в трех направлениях:
1. Серологическая диагностика маркеров вируса методами иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга, заключающаяся в определении в
сыворотке крови антигенов и антител против ВИЧ.
2. Определение вирусной НК (провирусной ДНК или РНК) методом
ПЦР, как в крови, так и в клетках крови.
3. Исследование иммунного статуса (количественная оценка CD-4
лимфоцитов), которая наиболее адекватно осуществляется методом проточной цитофлюориметрии.
Особо необходимо отметить значение ПЦР в диагностике
ВИЧ-инфекции у детей первого года жизни. Ранняя диагностика
ВИЧ-инфекции у детей этого возраста в принципе невозможна без применения ПЦР. Это обусловлено тем, что ребенок, родившийся от
ВИЧ-инфицированной матери, обязательно имеет антитела к вирусу иммунодефицита. Различить материнские и собственные антитела к ВИЧ не
представляется возможным. У неинфицированного ребенка данные антите52
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ла элиминируются под влиянием собственной иммунной системы к возрасту 6–9 месяцев, хотя в отдельных случаях могут циркулировать до 18 месяцев жизни, но не более этого срока. Необходимо отметить, что обследование методом ПЦР имеет смысл только при полном отказе от грудного
вскармливания ребенка ВИЧ-позитивной матерью с момента рождения, поскольку риск заражения довольно высок и составляет около 5 %. Таким образом, ПЦР позволяет проводить дифференциальную диагностику ВИЧ-статуса у детей раннего возраста. Так, если имеет место положительный результат ПЦР на НК вируса иммунодефицита в первые 48 часов жизни, то
ВИЧ-инфицирование произошло in utero. Если имеет место отрицательный
результат ПЦР в первые 48 часов, но становится положительным в возрасте
7–14 дней жизни, то инфицирование произошло intrapartum. В настоящее
время ПЦР позволяет осуществлять не только диагностику, но и мониторинг лечения ВИЧ-инфекции путем определения концентрации РНК в
плазме, а также выявления резистентных к химиотерапии штаммов вируса
иммунодефицита. Определение «вирусной нагрузки» в плазме крови является наилучшим прогностическим критерием течения ВИЧ-инфекции и
оценки эффективности антиретровирусной терапии. Таким образом, в настоящее время метод ПЦР является основным лабораторным критерием диагностики, прогноза и оценки эффективности лечения ВИЧ-инфекции.
Методы молекулярного типирования микроорганизмов на основе ПЦР
ПЦР широко используется не только для диагностики и идентификации, но также и для субвидового типирования и анализа генетического
родства (клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, особенно
при проведении эпидемиологических исследований. По сравнению с традиционными фенотипическими методами (био-, фаго- и серотипированием), генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более
глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов и высокой воспроизводимостью. Описано много методов генотипирования, которые
можно рассматривать как производные технологии ПЦР (табл. 2).
На практике выбор определенного метода типирования зависит от
характера и целей проводимого эпидемиологического исследования с учетом видовой принадлежности штаммов, их количества, источника выделения, требуемого уровня дифференциации, необходимости сравнения результатов с данными, полученными из других источников, а также от возможностей конкретной лаборатории.
Несмотря на разнообразие методов ПЦР-типирования общим для
большинства из них является использование гель-электрофореза для разделения фрагментов ДНК разной длины, полученных от каждого отдельного штамма. При этом сравнительный анализ индивидуальных электро53
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
форетических профилей, проводимый визуально или с помощью компьютера, позволяет оценить степень генетического родства исследуемых штаммов.
Таблица 2
Наиболее распространенные методы генетического типирования
микроорганизмов с использованием ПЦР
Метод
Основной принцип
Область применения
Точность,
воспроизводимость
Трудоемкость
Стоимость
RAPD
(APPCR)
Амплификация произвольных участков генома
в условиях нестрогого
связывания праймеров
Локальные эпидемиологические исследования
любых штаммов микроорганизмов, выделяемых
на искусственных питательных средах
+
+
+
RepPCR
(ERICPCR)
Амплификация участков
генома, ограниченных
консервативными повторяющимися последовательностями ДНК
Типирование многих
грамотрицательных и
грамположительных
бактерий
++
+
+
ПЦРПДРФ
(PCRRFLP)
Амплификация специфических участков ДНК и
их расщепление с помощью рестриктаз
Возможно типирование
возбудителей, находящихся непосредственно
в клинических образцах
или в культуре клеток
++
++
++
AFLP
Расщепление геномной
ДНК рестриктазами, лигирование (сшивание)
фрагментов с ДНКадаптерами и амплификация с помощью комплементарных им праймеров
Широкомасштабные
эпидемиологические
исследования любых
штаммов микроорганизмов, выделяемых на
искусственных питательных средах
+++
+++
+++
Использование ПЦР для выявления
лекарственной устойчивости у микроорганизмов
В последнее время ПЦР все чаще используется для исследования
различных свойств патогенных микроорганизмов, в частности для выявления устойчивости отдельных видов возбудителей к определенным лекарственным препаратам. Как правило, использование ПЦР для определения
чувствительности микроорганизмов является целесообразным лишь в тех
случаях, когда традиционные фенотипические методы неприменимы или
недостаточно эффективны. Например, определение чувствительности
Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам с помощью культуральных методов занимает обычно от 4 до 8 нед. Кроме того,
54
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
результаты фенотипических тестов в подобных случаях могут быть искажены в связи со снижением активности антимикробных препаратов в процессе длительного культивирования микроорганизмов.
Исследование молекулярных механизмов лекарственной устойчивости M. tuberculosis и некоторых других возбудителей позволило разработать методы на основе ПЦР для быстрого выявления генетических маркеров резистентности (табл. 3).
Таблица 3
Примеры использования ПЦР для выявления резистентности
к антимикробным препаратам у различных видов микроорганизмов
Микроорганизм
Антимикробные препараты
Стафилококки
Метициллин, (окса(обычно S.aureus циллин) и другие
и S.epidermidis)
β-лактамы
Генетические механизмы резистентности
Наличие гена mecA, кодирующего дополнительный пенициллинсвязывающий белок
(ПСБ-2a)
Методы обнаружения
ПЦР-электрофорез, ПЦР-гибридизация
Энтеробактерии
(обычно E.coli и
K.pneumoniae)
ЦС III*, другие β-лак- Мутации в генах β-лактамаз,
тамы, кроме карбапе- расширяющие спектр активнонемов
сти этих ферментов
ПЦР-ПДРФ,
ПЦР-SSCP
M.tuberculosis
Изониазид
Мутации в гене каталазыпероксидазы (katG), реже в генах inhA и ahpC
Рифампицин
Мутации в гене субъединицы
РНК-полимеразы (rpoB)
ПЦР-ПДРФ,
ПЦР-SSCP, ПЦРсеквенирование,
другие методы
Этамбутол
Мутации в гене embB, кодирующем синтез арабиногалактана
Стрептомицин
Мутации в генах 16S рРНК
(rrs) и рибосомного белка S12
(rpsL)
Пиразинамид
Мутации в гене пиразинамидазы (pncA)
Фторхинолоны
Мутации в гене A субъединицы ДНК-гиразы (gyrA)
Вирус простого
герпеса (ВПГ)
Ацикловир
Мутации в гене тимидинкиназы (tk), реже в гене ДНК-полимеразы
ПЦР-секвенирование
Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ)
Ингибиторы обратной транскриптазы
Мутации в гене полимеразы
(pol)
ОТ-ПЦР**-секвенирование
* ЦС III – цефалоспорины III поколения (цефотаксим, цефтазидим, цефтриаксон и др.).
** ОТ-ПЦР – обратнотранскриптазная ПЦР.
55
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Для подобного анализа обычно используют ДНК или РНК возбудителя, выделенного в чистой культуре. Однако в некоторых случаях имеется
возможность прямого ПЦР-анализа на антибиотикорезистентность без предварительно культивирования возбудителя. Исследуемый образец клинического материала при этом используется как источник ДНК-мишени для ПЦР,
а откопированный ПЦР-продукт подвергается анализу с целью выявления
мутаций, связанных с антибиотикорезистентностью. Разработан, например,
метод, позволяющий с помощью ПЦР обнаружить у пациентов, страдающих
туберкулезным менингитом, устойчивость возбудителя к рифампицину.
Существуют, однако, естественные ограничения для использования генетических методов оценки лекарственной устойчивости микроорганизмов:
· данные о конкретных генетических механизмах резистентности
могут отсутствовать;
· резистентность к определенным препаратам часто бывает связана
с различными механизмами и мутациями в различных генах, которые независимо влияют на фенотип.
Например, резистентность грамотрицательных бактерий к аминогликозидным антибиотикам может быть вызвана продукцией различных аминогликозидмодифицирующих ферментов или изменением проницаемости клеточной стенки. В этом случае результаты ПЦР-анализа, который всегда характеризует строго определенный специфический участок ДНК, не могут
служить основанием для оценки чувствительности микроорганизма в целом.
Кроме того, отсутствие международных стандартов и рекомендаций по
использованию ПЦР для определения чувствительности к антимикробным
препаратам является дополнительным фактором, ограничивающим возможность широкого применения этого подхода в практической диагностике.
2.4.2. Лигазная цепная реакция
Метод впервые описан в 1989 г. ЛЦР – это метод амплификации,
включающий последовательные циклы лигирования (соединения) четырех
олигонуклеотидных праймеров, комплементарных цепям ДНК-матрицы. В
нем используется способность ДНК-лигазы соединять 2 пары комплементарных олигонуклеотидов после их гибридизации с последовательностями
мишени in vitro.
Основными компонентами ЛЦР являются: лигаза, 2 или 4 специфических праймера и буфер для цепной реакции.
Линейная амплификация специфических праймеров происходит при лигировании одной пары олигонуклеотидов. При использовании двух пар олигонуклеотидов, одна из которых комплементарна верхней цепи ДНК-матрицы, а
вторая – нижней, достигается экспоненциальная амплификация. На первом
этапе происходит гибридизация двух пар олигонуклеотидных праймеров с
ДНК-матрицей при температуре +65 °С. Затем происходит лигирование олигонуклеотидов в месте их соединения с образованием более длинного продук56
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
та, связанного с матрицей. Специфичность реакции обеспечивается тем, что
любое нарушение гомологии в области стыка двух олигонуклеотидов сразу же
предотвращает их лигирование. На втором этапе реакционную смесь нагревают до +94 °С. При этом происходит денатурация и отделение лигированного
продукта от матрицы. При последующем охлаждении до +65 °С процессы
гибридизации и лигирования повторяются. Вновь образованные продукты лигирования выступают в качестве матриц в последующих циклах реакции. В
ходе ЛЦР происходит экспоненциальное увеличение количества исходных
продуктов лигирования. Выявление продуктов амплификации можно проводить с использованием ферментных меток.
3. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА ГЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ
К настоящему времени на хромосомах человека картировано около
800 генов, мутации которых приводят к различным наследственным заболеваниям. Молекулярная клиническая диагностика генных заболеваний
дает ответ на вопрос, входят ли обследуемые индивидуумы или их потомки в группу повышенного генетического риска. ДНК-анализ можно использовать для выявления носителей генов наследственных заболеваний, а
также для пренатальной и пресимптоматической диагностики генетических нарушений. Раньше применялись биохимические методы, основанные на выявлении продукта анализируемого гена. Решающим преимуществом молекулярной диагностики является то, что объектом исследования
является непосредственно молекула ДНК больного. ДНК-тесты не требуют
экспрессии мутантного гена для его выявления, что позволяет разработать
системы скрининга для всех заболеваний. Для молекулярной клинической
диагностики генных болезней можно использовать, например, методы
блот-гибридизации по Саузерну, ПЦР и другие.
3.1. Метод ПЦР/ЛОЗ
Не все генетические нарушения, приводящие к появлению дефектных генов, сопровождаются утратой или изменением сайтов рестрикции,
поэтому для обнаружения однонуклеотидных замен применяют и другие
подходы. В одном из них объединены ПЦР и метод, основанный на лигировании олигонуклеотидных зондов (ЛОЗ), – ПЦР/ЛОЗ.
Предположим, что в определенном сайте нормального гена (скажем, в
106-м положении) находится пара А-Т, а в том же сайте мутантного гена –
G-C. Зная нуклеотидные последовательности, фланкирующие 106-й нуклеотид, можно синтезировать два коротких (20-нуклеотидных) фрагмента, прилегающих к данному сайту и комплементарных противоположным цепям.
Основная особенность этой пары олигонуклеотидов состоит в том, что
3′-концевой нуклеотид одного из них (зонд X) комплементарен основанию,
находящемуся в 106-м положении нормальной последовательности, а
57
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5′-концевой нуклеотид второго (зонд Y) комплементарен нуклеотиду, примыкающему к 106-му нуклеотиду. При отжиге этих зондов с содержащей
нормальную последовательность ДНК-мишенью (амплифицированной методом ПЦР) происходит их полная гибридизация, и при добавлении в реакционную смесь ДНК-лигазы зонды Х и Y ковалентно сшиваются. Если же эти
зонды отжигаются с мутантной ДНК, в которой произошла замена 106-го
нуклеотида, то некомплементарный ему 3′-концевой нуклеотид зонда Х не
может образовать с ним пару. И хотя зонд Y по-прежнему гибридизуется
полностью, ДНК-лигаза не может сшить зонды Х и Y. Можно синтезировать
и другие олигонуклеотидные зонды, полностью соответствующие последовательности с мутантным 106-м нуклеотидом. При таком наборе зондов лигирование будет происходить в случае их отжига с мутантной ДНК-мишенью и
не будет – в случае отжига с нормальной мишенью. Таким образом, метод
ПЦР/ЛОЗ различает две ситуации: лигирование зондов и отсутствие его.
Чтобы определить, произошло ли лигирование, 5′-конец зонда Х метят
биотином, а 3′-конец зонда Y – дигоксигенином, низкомолекулярным соединением, связывающимся с соответствующим антителом. После гибридизации
и лигирования проводят денатурацию ДНК для высвобождения гибридизовавшегося зонда и переносят смесь в пластиковую лунку, покрытую стрептавидином. Лунку промывают, чтобы удалить весь материал, кроме связавшегося со стрептавидином биотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку
антитела к дигоксигенину, предварительно соединенные со щелочной фосфатазой. После промывания (удаления несвязанного конъюгата) добавляют бесцветный хромогенный субстрат. Окрашивание раствора в лунке свидетельствует о связывании антитела к дигоксигенину с зондом, меченным дигоксигенином, т.е. о том, что этот зонд был лигирован с зондом, меченным биотином.
Если же окрашивания не происходит, значит, лигирования не было.
Располагая двумя парами зондов, можно установить генетический статус любого человека. Например, ДНК гетерозиготных носителей дает положительный ответ с обеими парами зондов; ДНК лиц, обладающих двумя копиями нормального гена, – только с тем набором зондов, который содержит
нуклеотид, комплементарный нормальному сайту; и, наконец, ДНК индивидов с двумя измененными копиями гена – только с набором зондов, детектирующим мутантный сайт. Чтобы минимизировать необходимое для анализа
количество исходной ДНК, перед гибридизацией участок ДНК-мишени, содержащий тестируемый сайт, амплифицируют с помощью ПЦР. ПЦР/ЛОЗ
является быстрым, чувствительным и высокоспецифичным методом. Все
стадии роботизированы, что позволяет проводить до 1200 тестов в день.
3.2. Методы первичной идентификации мутаций
Наиболее точная информация о природе мутаций может быть получена
с помощью метода ДНК-секвенирования, позволяющего определить первичную последовательность нуклеотидов в определенном фрагменте ДНК. Од58
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нако ввиду сравнительно крупных размеров генов и отсутствия автоматических ДНК-секвенаторов во многих диагностических лабораториях к методу
секвенирования обычно приступают уже после того, как с помощью других
методов обнаружено наличие мутации в определенном фрагменте гена, и остается только выяснить ее нуклеотидную природу. Поэтому сканирование
мутаций обычно начинают с использования методических приемов, позволяющих улавливать нуклеотидные замены сразу в достаточно протяженных
участках ДНК. К таким приемам относят: метод анализа конформационного
полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP), метод электрофореза в денатурирующем геле (DGGE), метод химического расщепления некомплементарных
сайтов (СМС), метод гетеродуплексного анализа (НА).
3.2.1. Секвенирование ДНК
Существует 2 основных метода секвенирования: химический – метод
Максама-Гильберта и дидезоксисеквенирование – метод Сэнджера. В первом случае используют химическое расщепление ДНК по одному основанию, во втором – синтезируют нужную цепь ДНК in vitro, специфически
останавливая синтез на заданном основании (рис. 13).
Рис. 13. Секвенирование ДНК по методу Сэнджера
59
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Чаще при секвенировании используют метод Сэнджера, так как он более надежен и прост в исполнении. На первом этапе ДНК денатурируют, чтобы получить однонитевые молекулы. Затем добавляют секвенирующий
праймер – искусственно синтезированную олигонуклеотидную последовательность, комплементарную определенному участку исходной молекулы
ДНК. Создают условия для гибридизации праймера, т.е. для образования
двухцепочечного участка, и инициируют синтез ДНК, добавляя в реакционную смесь ДНК-полимеразу и дезоксинуклеотидтрифосфаты – dATP, dCTP,
dGTP и dTTР, один из которых является радиоактивным. Синтез ведут параллельно в четырех пробирках, в каждую из которых добавляют один из
специфических дидезоксинуклеотидтрифосфатов, или терминаторов синтеза,
– ddATP, ddCTP, ddGTP или ddTTР (ddNTP). При встраивании ddNTP на место соответствующего нуклеотида синтез ДНК прекращается. Таким образом, в каждой из пробирок получают набор различающихся по длине радиоактивно меченных фрагментов ДНК с одним и тем же специфическим для
данной пробирки дидезокситерминатором на конце молекулы. После одновременного электрофоретического разделения этих фрагментов на четырех
соседних дорожках и авторадиографии размер синтезированных фрагментов
может быть определен, а значит, определена и локализация дидезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле
ДНК. На каждом секвенирующем геле может быть определена первичная
последовательность всего около 500 пар оснований.
3.2.2. Метод анализа конформационного полиморфизма
однонитевой ДНК (Single Strand Conformation Polymorphism – SSCP)
Метод предложен M. Orita в 1989 г., основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности одинаковых по величине, но различающихся по пространственной организации (вследствие нуклеотидных
замен) однонитевых фрагментов ДНК.
Рис. 14. SSCP-анализ (общий принцип)
60
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Скручивание (конформация) небольших однонитевых участков ДНК
существенно зависит от их нуклеотидной последовательности, так что замена даже одного основания в молекулах одинакового размера приводит к
изменению их пространственной структуры. Метод включает амплификацию специфических сегментов ДНК размером от 50 до 300 п.о., обычно в
присутствии меченых динуклеотидтрифосфатов, денатурацию образовавшихся продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий ЭФ в ПААГ. Иногда амплификацию проводят без использования метки, но тогда для выявления ДНК на электрофореграммах используют более чувствительные по
сравнению с окраской бромидом этидия методы, например, окраску азотнокислым серебром. На конформацию оказывают влияние различные
внешние факторы – температура, концентрация акриламида и глицерина в
геле, ионная сила буферных растворов. Оптимальный подбор этих параметров позволяет эффективно разделять амплифицированные фрагменты
ДНК, различающиеся по длине всего на один нуклеотид.
3.2.3. Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза
(Denaturation Gradient Gel Electrophoresis – DGGE)
Метод основан на различиях электрофоретической подвижности нормальных и мутантных амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК
при ЭФ в денатурирующем геле. Денатурация может происходить за счет
разницы температур, различной концентрации мочевины или формальдегида.
При этих условиях одинаковые по величине двухнитевые молекулы ДНК,
отличающиеся по нуклеотидной последовательности, денатурируют поразному. Объясняется это тем, что G-C связь более прочна по сравнению со
связью между нуклеотидами А-Т. Кроме того, наличие участка негомологичного спаривания значительно облегчает денатурацию ДНК. Разработан компьютерный алгоритм, позволяющий предсказывать характер плавления в зависимости от нуклеотидной последовательности ДНК. При электрофорезе
амплифицированных двухнитевых фрагментов ДНК в геле с линейно возрастающим градиентом концентрации денатурирующих агентов плавление нитей ДНК происходит в строго специфичной для данной последовательности
области, эквивалентной температуре плавления – Тm, т.е. такой температуре,
при которой каждая пара оснований с 50 % вероятностью может соединиться
или разойтись. После начала плавления ДНК продвижение ее фрагментов в
геле резко замедляется до тех пор, пока не наступит полная денатурация молекул. В результате будет происходить разделение фрагментов ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Метод очень чувствителен и, в отличие от SSCP, применим для более крупных амплифицированных фрагментов
ДНК. Метод может быть с успехом применен для анализа индуцированных
мутаций, поскольку позволяет улавливать мутации даже в 1 из 100 клеток,
обработанных мутагеном.
61
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
К недостаткам метода следует отнести технические сложности, связанные с трудностями получения хорошего градиента денатурирующего
агента в ПААГ. Это требует специального технического оснащения. Другим недостатком метода является сложность детекции мутаций, расположенных на концах амплифицированных фрагментов. Связано это с тем,
что при прохождении ДНК через гель может начаться частичная денатурация концов молекул еще до достижения оптимальной области плавления.
Поэтому мутации, локализованные недалеко от границ амплифицированного участка ДНК, оказывают меньшее влияние на процесс плавления и за
счет этого могут не выявляться. Во избежание этого к концам исследуемой
амплифицированной геномной ДНК пришивают GC-последовательности
размером в несколько десятков пар оснований. Такие монотонные тугоплавкие участки выполняют роль своеобразных зажимов на концах молекул, и шансы обнаружения мутаций выравниваются независимо от их локализации внутри амплифицированного фрагмента.
3.2.4. Метод гетеродуплексного анализа
(Heteroduplex analysis – HA)
Принцип метода – возникновение (образование) гетеродуплексов между нормальной и несущей точковую мутацию цепочками ДНК в образце
гетерозиготной по данной мутации особи. Такие гетеродуплексные двухцепочечные ДНК благодаря конформационным особенностям в местах несовпадения нуклеотидов имеют иную электрофоретическую подвижность, чем
соответствующие гомодуплексы. Хотя эти различия могут быть обнаружены при электрофорезе в обычном ПААГ, значительно более эффективное
разделение гомо- и гетеродуплексов может быть достигнуто при использовании новых вариантов гелей – Hydrolink либо MDE. Детекция мутаций
осуществляется как изотопным, так и неизотопными методами.
3.2.5. Метод химического расщепления мест (нуклеотидного)
несоответствия (Сhemical Mismatch Cleavage – СМС)
Метод основан на свойствах некоторых химических агентов специфически разрывать нить ДНК в месте нарушения гомологичного спаривания в
результате несоответствия пар оснований вследствие точечных мутаций, т.е.
в местах возникновения гетеродуплексов. С этой целью амплифицированную
нормальную последовательность ДНК смешивают с избытком аналогичной
тестируемой ДНК или РНК, проводят денатурацию (отжиг), после чего нормальная и тестируемая ДНК ренатурируют с образованием гетеродуплексов,
которые подвергаются химическому расщеплению. Цитозин чувствителен к
действию гидроксиламина, а тимин – к тетраоксиду осмия. Последующая обработка пиперидином приводит к полному разрыву молекулы ДНК в модифицированном сайте. Выявление мутаций осуществляют с помощью мече62
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ных ДНК-зондов, соответствующих, как правило, нормальной последовательности ДНК. Такими зондами могут служить синтезированные олигонуклеотиды, клонированные последовательности ДНК или амплифицированные
фрагменты. После обработки соответствующими химическими агентами
идентификация и локализация мутантных сайтов в тестируемом фрагменте
ДНК проводится с помощью электрофореза. Современные модификации метода позволяют идентифицировать до 95–100 % мутаций.
Большими преимуществами этого метода являются: 1) возможность
исследовать протяженные участки ДНК – до 2 тыс. п.о.; 2) способность
одновременно выявить и локализовать несколько мутаций в тестируемом
фрагменте ДНК; 3) возможность одновременного использования нескольких ДНК-зондов для поиска мутаций – мультиплексный вариант методики.
К числу недостатков можно отнести высокую токсичность используемых химических реактивов. Последняя может быть частично ослаблена
использованием карбодимида для идентификации GT-гетеродуплексов.
Все рассмотренные выше методы детекции мутаций предполагают в
качестве обязательного последующего этапа секвенирование содержащих
изменения сегментов ДНК с целью точной идентификации нуклеотидных
замен, оценки их фенотипического проявления и определения причастности
к развитию болезни. Поэтому рассмотренные методы редко используются в
практической диагностике и при популяционном скрининге гетерозигот.
3.3. Молекулярное сканирование известных мутаций
Детекцию уже известных мутаций можно проводить более простыми
способами, не требующими последующего секвенирования.
3.3.1. Амплификация – рестрикция
Мутации, изменяющие длину амплифицированных фрагментов, могут быть выявлены с помощью нативного ЭФ в ПАА или агарозном гелях.
Наиболее просто диагностируются те замены нуклеотидов, которые
приводят к исчезновению или образованию сайта узнавания для какой-нибудь
из рестриктаз, что легко выявляется по изменению длины амплифицированного фрагмента ДНК после его обработки соответствующей эндонуклеазой. Поэтому сразу после идентификации мутации проводится компьютерный поиск
возможных сайтов рестрикции в месте локализации замены основания.
Расщепление амплифицированных ДНК-фрагментов проводится по
прописям, рекомендованным фирмой-изготовителем рестриктаз в буфере,
прилагаемом к ферменту. Данный метод применяют, например, для диагностики серповидноклеточной анемии. Серповидноклеточная анемия – это генетическое заболевание, обусловленное заменой одного из нуклеотидов в кодоне, который соответствует шестой аминокислоте в b-цепи молекулы гемоглобина. У индивидов, гомозиготных по мутантному гену (S/S), эритроциты
63
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
имеют необычную серповидную форму; это связано с искажением конформации молекулы гемоглобина вследствие замены в ней валина на глутаминовую кислоту. Мутантный гемоглобин не может с достаточной эффективностью переносить кислород, вследствие чего у пациентов развивается тяжелая
анемия с прогрессирующим поражением сердца, легких, мозга, суставов и
других органов. У индивидов, гетерозиготных по данному гену (A/S) (носителей генетического заболевания), эритроциты имеют нормальную форму, и
симптомы заболевания проявляются лишь в экстремальных условиях (на
большой высоте над уровнем моря либо при слишком высоких или низких
температурах, когда снижается снабжение организма кислородом). Если оба
родителя гетерозиготны (имеют генотип A/S), то вероятность того, что их ребенок будет гомозиготным по мутантному гену (S/S) (т. е. будет болен серповидноклеточной анемией), составляет 25 %.
Замена одного нуклеотида в b-глобиновом гене, приводящая к серповидноклеточной анемии, сопровождается элиминацией сайта для рестрицирующей эндонуклеазы Cvn1. Этот фермент узнает последовательность CCTNAGG и расщепляет молекулу ДНК между основаниями С и Т
(N – любой из четырех нуклеотидов). В нормальном гене эта последовательность имеет вид CCTGAGG, а в гене серповидноклеточной анемии –
ССТGTGG. На этом различии основывается ДНК-диагностика данного заболевания. Используя праймеры, фланкирующие сайт Cvn1, амплифицируют с помощью ПЦР небольшое количество тестируемой ДНК. Амплифицированный фрагмент обрабатывают Cvn1, продукты рестрикции разделяют с помощью гель-электрофореза и окрашивают их бромистым этидием. При наличии Cvn1-сайта на электрофореграмме появляется специфический набор полос, отличный от такового в отсутствие Cvn1-сайта. Описанным способом можно быстро установить генетический статус обследуемого, не проводя при этом процедуру гибридизации.
3.3.2. ПЦР-опосредованный сайт-направленный мутагенез
Если естественных рестрикционных сайтов в месте мутации найти не
удается, то такие сайты могут быть созданы искусственно. В частности, разработана методика создания с помощью ПЦР новых сайтов рестрикции в мутантных аллелях – метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза.
Для этого амплифицируемый участок ДНК выбирают таким образом,
чтобы 3′-конец одного из праймеров непосредственно примыкал к мутантному сайту. Именно этот праймер не полностью комплементарен матричной ДНК. В нем изменяют один из нуклеотидов с 3′-конца так, чтобы в сочетании с нуклеотидом мутантного, но не нормального сайта в этом месте
образовывался сайт рестрикции для какой-нибудь из известных нуклеаз.
Тогда после рестрикции и электрофореза продуктов амплификации геномной ДНК у индивидуумов, не содержащих данную мутацию, на электрофореграмме будет присутствовать один нерестрицированный фрагмент, у
64
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
гетерозигот появятся два дополнительных фрагмента, соответствующих по
длине рестрицированным сегментам ДНК, и у гомозигот по мутации будут
присутствовать только эти два рестрицированных фрагмента.
3.3.3. Обнаружение мутаций в разных сайтах одного гена
Далеко не все генетические заболевания обусловливаются одним изменением в гене. В большинстве случаев мутации могут возникать в разных
сайтах в пределах одного гена, но приводят к одному генетическому заболеванию. В качестве примера можно привести β-талассемию – наследственное
заболевание, связанное с утратой активности β-глобина. У гетерозиготных
носителей при этом наблюдается небольшая анемия. Индивиды же, гомозиготные по одному из как минимум восьми возможных мутантных сайтов, для
поддержания жизни нуждаются в регулярном переливании крови и другом
лечении. Поскольку мутация в любом из восьми специфических сайтов
β-глобинового гена может приводить к β-талассемии, необходимо провести
по крайней мере восемь разных тестов. Такая диагностика возможна, хотя
дорогостояща. Поэтому для скрининга мутаций в разных сайтах одного гена
была разработана стратегия ПЦР/гибридизация, основанная на проведении
одной реакции. Для этого синтезируют набор специфических
20-нуклеотидных зондов, каждый из которых полностью комплементарен
фрагменту гена-мишени, несущему известную мутацию. К 3′-концу каждого
присоединен гомополимер poly(dT) длиной примерно 400 нуклеотидов, с помощью которого ДНК-зонд связывается с заранее отмеченной точкой на найлоновом фильтре, а остальная его часть остается свободной и может гибридизоваться. Сегменты тестируемой ДНК, каждый из которых включает по
одному из возможных мутационных сайтов, одновременно амплифицируют с
помощью ПЦР, причем один праймер из каждой пары на 5′-конце помечен
биотином. Амплифицированные фрагменты ДНK-мишени гибридизуют с
зондами, пришитыми к фильтру, в условиях, обеспечивающих гибридизацию
только полностью комплементарных последовательностей. В гибридизационную смесь добавляют стрептавидин, связанный с щелочной фосфатазой
(можно использовать пероксидазу хрена или уреазу). После гибридизации
промывают фильтр и добавляют неокрашенный субстрат. Если имеет место
полное соответствие между амплифицированным сегментом ДНК-мишени и
специфическим зондом, то на фильтре появится цветная точка. На один и тот
же фильтр можно нанести несколько точек, соответствующих целому ряду
разных специфических зондов. Проанализировав эту цветную мозаику, можно
идентифицировать один из возможных сайтов мутации.
3.4. Использование ДНК-биочипов
Этот метод является одним из наиболее перспективных в современной молекулярной биологии. ДНК-микрочип (олигонуклеотидный микрочип) представляет собой миниатюрную пластину-матрицу, в ячейки кото65
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
рой с помощью специальных автоматизированных микрометодов нанесен
упорядоченный набор из десятков, сотен и даже тысяч иммобилизованных
олигонуклеотидов.
Данные олигонуклеотиды специфически гибридизуются с разнообразными флюорохромно-меченными молекулами ДНК (например, продуктами амплификации исследуемых генов или молекулами кДНК – продуктами обратной транскрипции тканевых РНК), после чего образовавшиеся
дуплексы облучаются лазером, а результат флюоресценции фиксируется с
помощью сканирующего конфокального микроскопа и анализируется с
использованием соответствующего компьютерного программного обеспечения (рис. 15).
Рис. 15. Технология ДНК-биочипов (общий принцип)
В формате биочипов могут быть реализованы многие из таких методов анализа нуклеотидных последовательностей, как автоматическое секвенирование, «минисеквенирование» и др. Последние достижения в данной области связаны с применением фотолитографических и полупровод66
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
никовых технологий, позволяющих упорядоченно фиксировать на микрочипе до 400000 и более олигонуклеотидов (каждый – на участке площадью
около 20 микрон2!), а также с разработкой методов синтеза олигонуклеотидов in situ, основанных на доставке необходимых реагентов в нужные
сайты микрочипа с помощью устройств, действующих по принципу
струйного принтера.
Применение на практике технологии ДНК-биочипов принципиально
позволяет проводить автоматизированный и эффективный анализ большого числа известных мутаций и полиморфизмов, осуществлять быстрое секвенирование крупных фрагментов ДНК, а также одномоментно анализировать экспрессию большого числа генов изучаемой ткани в заданный интервал времени, что сулит поистине уникальные возможности в изучении основ функционирования генома.
67
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Литература
1. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология / Л. Б. Борисов. – М. : Мед. информ. агентство, 2001. – 734 с.
2. Глик Б. Молекулярная биотехнология: принципы и применение /
Б. Глик, Дж. Пастернак. – М. : Мир, 2002. – 589 с.
3. Иллариошкин С. Н. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование / С. Н. Иллариошкин. – М. : Медицинское информационное агентство, 2004. – 207 с.
4. Иммуноферментный анализ / под ред. Т. Т. Нго, Г. Ленхофф. – М. :
Мир, 1988. – 446 с.
5. Клиническая биохимия / под ред. В. А. Ткачука. – М. : Гэотар-Мед,
2004. – 512 с.
6. Коничев А. С. Молекулярная биология / А. С. Коничев, Г. А. Севастьянова. – М. : Academia, 2003. – 400 с.
7. Лопухов Л. В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике / Л. В. Лопухов, М. В. Эйдельштейн //
Лабораторная диагностика (КМАX). – 2003 – Т. 2, № 3. – С. 96 – 106.
8. Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы) :
справочник / под ред. А. И. Карпищенко. – СПб. : Интермедика,
1997. – 304 с.
9. Медицинская микробиология / А. З. Байчурина [и др.] ; под ред.
В. И. Покровский, О. К. Поздеев. – М. : ГЭОТАР МЕДИЦИНА,
1999. – 1183 с.
10. Медицинские лабораторные технологии и диагностика : справочник : в 2 т. / под ред. А. И. Карпищенко. – СПб. : Интермедика,
1999. – Т. 2. – 656 с.
11. Молекулярная клиническая диагностика. Методы / под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. – М. : Мир, 1999. – 558 с.
12. Теория и практика иммуноферментного анализа / Егоров А. М.
[и др.]. – М. : Высш. шк., 1991. – 288 с.
68
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Учебное издание
СОВРЕМЕННЫЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ
И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ
МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ
Учебное пособие
Составители:
Сафонова Ольга Анатольевна,
Семенихина Анастасия Владимировна,
Рахманова Татьяна Ивановна,
Попова Татьяна Николаевна,
Степанова Ирина Юрьевна
Подписано в печать 04.05.2009. Формат 60×84/16. Усл. печ. л. 4,0.
Тираж 50 экз. Заказ 612
Издательско-полиграфический центр
Воронежского государственного университета.
394000, г. Воронеж, пл. им. Ленина, 10. Тел. 208-298, 598-026 (факс)
http://www.ppc.vsu.ru; e-mail: pp_center@ppc.vsu.ru
Отпечатано в типографии Издательско-полиграфического центра
Воронежского государственного университета.
394000, г. Воронеж, ул. Пушкинская, 3. Тел. 204-133
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
29
Размер файла
1 242 Кб
Теги
107
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа