close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

190

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2,2, №
ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ АН СССР
На правах рукописи
А.В.ЗЕЛЕНИН
РЕАКЦИЯ ЖИВОЙ КЛЕТКИ НА ИНОРОДНЫЕ ТОКСИЧЕСКИЕ
ВЕЩЕСТВА АКРИДИНОВОГО РЯДА
К IC4 - цитология
Автореферат диссертации
на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва - 1968
*1
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
С
•
^\
t
{
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ АН СССР
На правах рукописи
А.В.ЗЕЛЕНИН
РЕАКЦИЯ ЖИВОЙ КЛЕТКИ НА ШОРОДНЫЕ ТОКСИЧЕСКИЕ
ВЕЩЕСТВА АКРИДИНОВОГО РЯДА
№ 104 - цитология
Автореферат диссертации
на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Централизуя Научи:я «1блиотека
Mociwuj.:,".'! орд. •П..-'з.-j-.iaСальхвз.
Акад;;::!1 и и . / h . A Уеивзазева
Москва - 1968
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа выполнена в лаборатории функциональной морфо­
логии клетки (заведующий лабораторией член-корреспондент
АН СССР М.Н.МЕЙСЕЛЬ) Института молекулярной биологии АН
СССР (директор института академик В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТ).
Официальные оппоненты:
член-корреспондент АМН СССР И.Б.ЗБАРСКИЙ
член-корреспондент АМН СССР В.В.ПОРТУГ АЛОВ
член-корреспондент АМН СССР А.А.ПРОКОФЬЕВА-БЕЛЬГОВСКАЯ
Официальный отзыв о научно-практической ценности
диссертации дает Институт биологической физики АН СССР
Защита состоится в Институте биологии развития АН СССР,
Москва, ул. Вавилова, д . 26
Автореферат разослан V / " & eJiaaJtr.lt 1968г.
Защита состоится <7у?$/я$л<С6 ~ *€*ск&У 1969г.
Ученый секретарь Института
канд. биол. наук
И.В.ЧУДАКОВА
T I 7 4 I 3 . Тираж 250ЭКЗ. Заказ 16 505.
ОКМЛ Статупраьления Московской обл.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
t
)
<
Любал клетка, будь-то одноклеточный организм или состав­
ная часть организма многоклеточного, в течение своей жизни
постоянно подвергается воздействию разнообразных инородных
и чуждых для нее веществ. Эти вещества оказываются одним из
весьма важных, а в некоторых случаях и решающих факторов
внешней для клетки среды, определяющих особенности ее жизне­
деятельности. В процессе эволюционного развития в клетках
современных организмов выработались определенные приспособительные механизмы, позволяющие им адекватно реагировать на
многие химические факторы внешней среды.
Однако число инородных химических^ факторов токсических
для клетки неисчерпаемо и увеличивается с каждым днем особен­
но в связи с возрастающими успехами синтетической химии и
современной промышленности. К числу химических факторов тако­
го рода относятся, в частности, многочисленные лекарственные,
а также канцерогенные вещества.
Исследование закономерностей, которым подчиняется реак­
ция клеток на инородные токсические факторы химической приро­
ды, представляется поэтому важной задачей современной биоло­
гии.
Изучение этих закономерностей позволяет, в первую очередь,
выявить некоторые наиболее общие черты клеточной жизнедеятель­
ности, в частности,.клеточные механизмы защиты от чужеродных
токсических веществ, пути проникновения этих веществ в клетку,
способы их внутриклеточного распределения, отграничения, детоксикации и выведения. В ходе таких исследований могут быть
также получены ценные сведения, касающиеся особенностей строе­
ния и функционирования отдельных клеточных структур и выясне­
ния значения в клеточных реакциях многих цитофизиологических
процессов, хорошо известных из литературы, многократно описан­
ных, но остающихся недостаточно ясными как с точки зрения сво­
его физиологического значения, так и конкретных механизмов
своего протекания. К таким процессам можно отнести процессы
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4
гранулообразования, а также возникновения под влиянием обра­
ботки витальными красителями так называемого кринома (Хлопин,
1927; Кедровский, 1937).
Исследование закономерностей взаимодействия с клеткой
инородных для нее соединений является важным и для современ­
ной фармакологии, поскольку инородные для клетки токсические
вещества во многих случаях вмешиваются в определенные стороны
клеточного метаболизма и .успешно используются в качестве дос­
таточно специфических лекарственных препаратов. Со времени
первых попыток проведения направленных поисков специфических
лекарственных препаратов (Романовский, 189I; Ehrlich , I9II,
1913) перед исследователями со всей остротой встал вопрос,
каким образом эти вещества взаимодействуют с клетками микро­
бов и человека (животного) и имеется ли специфика в их дейст­
вии на клетки, подлежащие уничтожению, т . е . предпринимались
попытки теоретически решить вопрос о природе избирательной
токсичности.
История современной медицины, ветеринарии и сельского
хозяйства богата примерами успешных находок высоко селектив­
ных веществ направленного действия. Однако практически все
эти Еещества были обнаружены именно в результате счастливых
находок, а не были созданы вследствие направленных исследо­
ваний, проводимых как итог развития теоретических представ­
лений, хотя недостатка в таких общих теоретических концепциях
нет.
Значение разнообразных биологически активных веществ
не исчерпывается нуждами медицины и сельского хозяйства. В
последние годы эти соединения получили чрезвычайно широкое
распространение в качестве "рычагов", "инструментов", с помо­
щью которых специфически выключаются или модифицируются те
или иные стороны клеточного метаболизма. Среди областей приме­
нения специфических ингибиторов следует, в частности, назвать
попытки направленного вмешательс'тва в некоторые процессы инди­
видуального развития животных. Однако проводя исследования та­
кого рода, обычно принимают во внимание лишь специфическое
действие биологически активного вещества, часто забывая, вопервых, о том, что у этого вещества может быть не одна, а две
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
•5
и даже несколько точек его действия на клетку, и во-вторых,
что клетка реагирует на проникшее в нее инородное вещество
как целое.
К сожалению, приходится констатировать, что общецитологическне исследования клеточной реакции на инородные для нее
в том числе биологически активные вещества оказались явно
отодвинутыми на второй план. Между.тем несомненно, что на фо­
не современных блистательных успехов аналитических подходов
исследования клеточной жизнедеятельности особую актуальность
приобретает синтетический подход, в частности, принимающий
во внимание все стороны реакции клетки на биологически актив­
ные соединения.
Учитывая все сказанное, мы поставили своей целью провес­
ти экспериментальное цитологическое исследование по выяснению
некоторых общих сторон взаимодействия с клеткой инородных для
нее биологически активных веществ. Необходимым условием про­
ведения такого исследования было ограничение его предмета и
в связи с этим выбор наиболее подходящего круга изучаемых
веществ.
мы остановились при этом на группе аминопроизводных ак­
ридина, о которых было известно, что они:
1. Легко проникают в клетку, соединяясь с отдельными кле­
точными структурами.
2. Обладают ясно выраженным биологическим действием как
на микробную клетку, так и на клетки животных и растений.
3 . Чрезвычайно ярко лгаминесцируют, что позволяет выяв­
лять их в составе отдельных частей клетки.
4. Специфически соединяются с нуклеиновыми кислотами,
причем этот процесс тщательно изучен в экспериментах с чисты­
ми веществами.
5. Имеются в виде большого числа разнообразных и в об­
щем достаточно доступных аналогов.
Из многих сотен описанных в литературе (Albert , I95I,
1966) и испытанных с точки зрения биологического действия
(Lewis,Goland , 1948) аминопроизводных акридина мы избрали
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6
в качестве основных 3,6-диам.иноакридиш. При этом ыы исходи­
ли из тех соображений, что эти вещества обладают наибольший
сродством к структурам животной и растительной клетки
( Ellinger, Hirt
, 1929, 1930; Bukatsch.Haitinger
,
1940,- strugger . 1940; Мейсель, 1947, 1950; De Bruyn et al ,
1950), оказывают явное антимитотическое действие ( D u s t i a ,
1925; Bucher » I9S9), были использованы в качестве ингибито­
ров процессов индивидуального развития ( Bracbet , 195?) и
особенно хорошо изучены с точки зрения их взаимодействия с
нуклеиновыми кислотами (Мейсель, Корчагин, 1952; ре&соске •
Skerrett , 1956; Stelaer,Bears
, i959jbermaB.
, 1961;
Борисова, Тумерыан, 1964; Гурский, 1966).
Из других аминопроизводных акридина (акридины, не содер­
жащие хотя бы одной аминогруппы, биологически не активны Lewis,Golanu
. 1948) мы остановились, на двух: акрихине
(атебрине) и риваноле. Эти вещества, с одной стороны, имеют
различное химическое строение, а с другой, обладают выражен­
ным биологическим действием, отличным от действия 3,6-диаминопроизводных акридина, и используются в качестве химиотерапевтических агентов (Albert , I95I).
На рис. I представлены формулы- аминопроизводных акридина,
использованных в нашей работе.
Основная задача работы - детальное изучение общеклеточ­
ных реакций на инородные токсические вещества - побудила из­
брать в качестве основного объекта исследования животные клет­
ки, так как только на их примере представлялось возможным
провести детальное исследование взаимодействия акридиновых про­
изводных с отдельными клеточными структурами.
Диссертация состоит из введения, восьми основных глав,
заключения, литературного указателя и приложения, в котором
в свете результатов собственных экспериментов обсуждаются
некоторые вопросы люминесцентномикроскопического исследования
живой клетки.
Ниже излагаются основные материалы диссертации.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
н^N,
.И
NН
Н"
Профлавин
Ht
Н'
А/
N
сн,
снл
.н
*ь
Аурофосфин
Эухризин 2GHX
И'' 41
Риванол
Акридиновый оранжевый
5ГЖ yst
Этилакридиновый оранжевый
• (
>
• Аурофосфин Б
(patent phosphlne)
ж
W
/
\
J
N-CH-CH-CH.-CH.
II
i
*
Н Ср£ N*CtHs
Акрихин /атвбрин/
Рис. I. Производные акридина, использованные в шботе.
В + обозначена их способность проникать в
лизосоыы (см. стр. 22).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8
Биологическое действие аминопроизводных
акридина
В литературе, как уже упоминалось, имеются довольно мно­
гочисленные сведения о действии некоторых аминопроизводных
акридина на различные клетки. Однако эти работы в значитель­
ной своей части касаются микробных клеток ( Browning,Gilmour ,
1913; Dean.Hinsbeljsood
, I952;Bogen, Keser
, 1954 и
д р . ) . Кроме того в них обращается внимание в основном на внеш­
ние стороны клеточных реакций, и в то же время мало изученны­
ми остаются многие весьма существенные стороны влияния амино­
производных акридина на клеточный метаболизм. Поэтому мы ре­
шили подвергнуть детальному исследованию вопрос о действии
аминопроизводных акридине на аивотные клетки. В качестве ос­
новного объекта исследования были использованы клетки ткане­
вых культур. Было изучено действие аминопроизводных акридина
на митотическую активность клеток культуры, на синтез в них
ДНК, РНК и белка и на прохождение клетками G2 и S периодов
ыитотического цикла.
Эксперименты показали,- что изученные нами аминопроизводные акридина могут быть поделены на две группы.
К первой группе относятся 3,6-диаминопроизводные акриди­
на (профлавин, акрифлавин, корифосфин, акридиновый оранжевый,
эухризин 2GNX ) . Для веществ этой группы характерен сильный
антимитотический эффект, проявляющийся сразу после начала
воздействия, и резкое угнетающее влияние на синтез белка
(рис. 2 ) . На примере акридинового оранжевого удалось показать,
что подавление синтеза белка 3,6-диаминопроизводными акридина
наступает, уже начиная с первых минут после внесения этого
вещества в культуральн'ую среду. Для соединений разбираемой
группы характерно также частичное торможение синтеза нуклеи­
новых кислот (табл. I) и резкое угнетение прохождения клерка­
ми G2 периода митотического цикла.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
9
/ i » •
l л в * f f
ft
Концентрация
3 мкг/мл
V
пе Концентрация
2 мкг/мл
/ Л 4 + f
t
Концентрация
2 мкг/мл
s»
i 4 «
лАкридиновый
оранжевый
/ Z 5 *
ft
/#>[ Концентрация
I мкг/мл
.г « «
г*
Профлавин
/ .1 i * Г С
Концентрация
6 мкг/мл
4 ( t*
Корифосфин
/ Л 3 * Г 4
Срнцентрация
Л1КГ/МЛ
Z t
Акрифлавин
Акрихин
Л*
1*
Л<1
Риванол
Гис. 2. Влияние аминопроизводных акридина на синтез белка
и митотическую активность культуры ацниотического
эпителия
А. По оси ординат - -включение радиометки (
) и
митотическая активность (
) в %,
По оси абсцисс - концентрация вещества в мкг/мл.
Б. По оси ординат - митотическая активность в 1.
По оси абсцисс - время от начала опыта в часах.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
10
Таблица I
Влияние обработки амниотических клеток
производными акридина в течение 1-1,5
часов на интенсивность синтеза в них
ДНК и РНК
(по результатам авторадиографического
исследования включения в клетки Н 3 -тиыидина и Н^уридина). В % к контролю.
Название
вещества
Контроль
Акридиновый
оранжевый
3 ыкг/ыл
Профлавин
2 ыкг/мл
Акрифлавин
I мкг/мл
Акрихин
6 мкг/ыл
Риванол
6 мкг/ыл
Включение
Н3-тимидина
Число гранул
серебра
на I ядрд
Включение Н -уридина
Число гранул серебра
На I ядро
целиком
На I ядрышко
100
80
100
48
100
10
41
64
18
93
52
15
51
42
17
89
52
21
На примере акридинового оранжевого показано, что 3,6-диаыинопроизводные акридина не оказывают непосредственного дей­
ствия на протекание самого ыитоза и не влияют на его продол­
жительность.
Наши эксперименты подтвердили такиы образом имевшиеся в
литературе сведения ( Dustin.
, 1925; Bucher , I939;Lettre,
1941; Brodersen
, 1943) о сильном актимитотическом действии
акрифлавина (трипафлавина) и показали, что совершенно аналогич­
ный эффект оказывают и другие 3,6-диаминопроизводные акридина.
Проведенное исследование показало, что так называемый трипафлавиновый антимитотический эффект Дустена (Dustin
, I925)
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
II
является следствием непосредственного вмешательства акрифлавина (трипафлавина) и других 3,6-диаминопроизводных акридина
в процесс биосинтеза белка в клетках. В пользу этого заключе­
ния говорят следующие полученные нами факты:
I) Полный параллелизм в антимитотическом действии 3,6-ди­
аминопроизводных акридина с их тормозящим влиянием на биосин­
тез белка (рис. 2А). 2) Значительно более сильное влияние*
этих веществ на синтез белка, чем на синтез нуклеиновых кис­
лот. 3) Резкое падение митотичёской активности, проявляющееся
уже в течение первого часа^от начала воздействия (рис. 2Б).
4-) Резкое торможение G2 периода митотического цикла. Две
последних черты характерны, как известно, для действия на
митотическое деление именно ингибиторов синтеза белка (Taylor,
1963; Tobey.Petersen
, 1966). На основании анализа литера­
турных данных представляется весьма вероятным, что и все дру­
гие виды токсического, в том числе противоракового (Lettre ,
1941, I952jLewis,Goland
, I9WjKorgaonkar f Sukhatankar
.
1963) действия 3,6-диаминопроизводных акридина на клетки свя­
заны с их тормозящим влиянием на биосинтез белка.
В связи со сказанным представлял интерес детальный ана­
лиз действия 3,6-диаминопроизводных акридина на биосинтез
белка. Такой анализ был проведен на примере акридинового оран­
жевого.
Наиболее логичным и простым было допущение, что действие
акридинового оранжевого на синтез белка является опосредован­
ным через действие на синтез РНК, в первую очередь, информа­
ционной. Однако анализ экспериментальных данных заставил от­
бросить это предположение, против которого говорили следующие
факты:
1. Значительно более сильное влияние акридинового оранже­
вого на синтез белка, чем на синтез РНК. Об этом обстоятельст­
ве уже упоминалось.
2 . Преимущественное влияние акридинового оранжевого на
синтез рибосомной РНК, в то время как синтез информационной
РНК угнетается этим веществом значительно слабее. Этот факт
отчетливо демонстрируется результатами как авторадиографичес-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
12
ких (см. табл. I),- так и биохимических исследований, проведен­
ных методом термального фракционирования нуклеиновых кислот
(Георгиев, 1961).
3. Действие акридинового оранжевого на синтез белка
проявляется уже в первые минуты после начала обработки клеток
акридиновым оранжевым. В то же время такие вещества, как ан­
тибиотики актиномицин D и оливомицин, влияющие, по современ­
ным представлениям?•на синтез белка, в первую очередь,путец
подавления синтеза информационной РНК, начинают тормозить
включение в клетки меченых аминокислот лишь спустя 6-8 часов
после начала воздействия.
Совокупность этих фактов заставила отказаться от пред­
ставлений о том, что влияние акридинового оранжевого на синтез
белка опосредуется через действие на синтез РНК. Казалось бо­
лее вероятным, что этот эффект связан непосредственно с вме­
шательством в синтез белка на ранних стадиях и зависит от
инактивации акридиновым оранжевым транспортной РНК. Для про­
верки этого предположения была предпринята серия эксперимен­
тов, выполненных с применением метода (Платова, 1962), позво­
ляющего выявлять в структурах гистологического препарата ами­
нокислоты, находящиеся там в виде комплексов с транспортными
рибонуклеиновыми'кислотами (аминокислоты, находящиеся в виде
комплексов с тРНК, удаляются из препаратов гидроксиламином,
в то жа время аминокислоты, включившиеся в белки, при такой
обработке на затрагиваются). Эксперименты показали, что под
влиянием акридинового оранжевого резко уменьшается содержание
в клетках меченых соединений, удаляемых гидроксиламином. Ана­
лиз экспериментальных и литературных данных позволил прийти к
заключению, что акридиновый оранжевый в используемых дозах
не отражается заметно на процессах клеточной энергетики (ды­
хание, окислительное фосфорилирование) и, следовательно, тор­
можение синтеза белка под влиянием акридинового оранжевого
наступает непосредственно в результате нарушения процесса об­
разования комплексов аминокислот с тРНК.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
13
Это заключение, сделанное нами в отношении акридинового
оранжевого на основании цитологических опытов if некоторых
косвенных соображений, было подтверждено приыенительно к профлавину в опытах Верена и др. ( ТГеггепе et al , 1965, 1966),
показавших, что в бесклеточной среде это вещество тормозит
соединение аминокислот с тРНК, не отражаясь на процессах их
активации.
Сделанный вывод не исключает, впрочем и возможности того,
что акридиновый оранжевый и другие 3,6-диаыинопроизводные ак­
ридина влияют на биосинтез белка, связываясь также и с рибо­
сомами живой клетки. Однако эта возможная точка приложения
исследуемых веществ в наших опытах не могла быть выявлена,
т . к . процесс биосинтеза белка был блокирован на более ранней
стадии.
Проведенные эксперименты таким образом показали, что
для действия 3,6-диаиинолроизводных акридина на животные клет­
ки характерны два типа действия. Первый тип действия заключа­
ется в торможении синтеза ДНК и РНК. Этот эффект акридиновых
производных на клеточный метаболизм связан с их свойством
проникать в живую клетку и комллексироваться там с ДНК, час­
тично подавляя ее способность к редупликации,' а также способ­
ность служить в качестве матрицы для синтеза рибонуклеиновых
кислот различных типов. Молекулярные механизмы взаимодействия
аминопроизводных акридина с молекулой ДНК хорошо изучены и
подробно рассмотрены в ряде работ ( Peacocke,Skerretrt
,
1956;Beers et a l
, I958;Lerman , 1961, 1963; Борисова, Tyмерман, 1964; Гурский, 1966).
Второй тип действия акридинового оранжевого и других
3,6-диаминопроизводных акридина заключается в их непосредст­
венном вмешательстве в биосинтез белка на ранних стадиях и,
по всей видимости, зависит от инактивации транспортных РНК,
однако, возможно, что он связан также и с изменением функции
рибосом.
Ко второй группе акридиновых производных мы относим ве­
щества, отличающиеся по своему действию от 3,6-диаминоакриди-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
14
нов. Наиболее резко эти отличия выражены у риванола и заклю­
чаются в следующем:
1. Отсутствие параллелизма в действии на митотическую
активность и синтез белка (рис. 2А).
2. Отсроченное^ во влиянии на митотическую активность,
которая начинает заметно снижаться только через 6-10 часов
после начала воздействия (рис. 2Б).
3 . Отсутствие непосредственного влияния на прохождение
клетками G2 периода митотического цикла.
Все эти факты дают основания для утверждения, что непос­
редственное вмешательство в процесс биосинтеза белка не лежит
в основе антимитотического действия риванола. Антимитотическое действие этого вещества может быть объяснено за счет его
влияния на синтез РНК (табл. I ) , как это имеет место у-актиHOMKUHHaD , примененного в малых дозах (Kishlsioto.Lieberman,
196*; Baserga et al , 1965).
Несколько иными оказались результаты опытов по определе­
нию механизма биологического действия акрихина. Это вещество
обладает совершенно четким действием на синтез нуклеиновых
кислот (табл. I ) , между тем результаты экспериментов по иссле­
дованию непосредственного влияния акрихина на синтез белка
оказались недостаточно определенными: у акрихина наблюдается
расхождение в характере его действия на'митотическую актив­
ность и синтез белка.(рис. 2A)f в то же время он резко тормо­
зит прохождение клетками G2 периода митотического цикла. В
части опытов торможение митотической активности под влиянием
акрихина начиналось сразу же после начала воздействия, в дру­
гих оно оказалось отсроченным (рис. 2Б). Для уточнения меха­
низма антимитотического действия акрихина необходимы дополни­
тельные опыты.
Наши эксперименты показали, что не только акридиновый
оранжевый, но и все другие испытанные нами аминопроизводные
акридина оказывают однотипное действие на синтез рибонуклеино­
вых кислот. Наибольшей чувствительностью к действию акридино­
вых ингибиторов обладает синтез рибосоыной (ядрышковой) РНК,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
15
в то же время на синтезе информационной РНК эти вещества отра­
жаются слабее (табл. I ) . Таким же действием характеризуется,
как известно (Perry , 1963), актиномицинD , а также антибио­
тик оливомицин (Гаузе, 1965; Залманзон, Зеленин и д р . , 1965).
Все эти вещества значительно различаются по своему химическо­
му строению. В отношении некоторых из них показано, что они
обладают преимущественным сродством к аденину ( scMldixaut
et al , 1962). Совокупность этих {актов дает основание выс­
казать сомнение в правильности принятой в настоящее время
точки зрения на природу преимущественного влияния актиномицина D на синтез рРНК. По-видимому, в основе этого явления ле­
жит не сродство актиномицина D к гуанину, а какой-то иной
фактор, делающий синтез рРНК чувствительным к разнообразным
воздействиям.
Изложенный в настоящем разделе автореферата материал поз­
воляет высказать также некоторые- соображения о соотношении
между химическим строением аминопроизводных акридина и их дей­
ствием на синтез нуклеиновых кислот и белка.
Для всех исследованных нами веществ характерно вмешатель­
ство в синтез ДНК и РНК. Этот эффект, зависящий, по всем приз­
накам, от соединения ингибиторов с молекулой ДНК, присущ, по
нашим данным, различным производным акридина, имеющим различ­
ное количество аминогрупп, находящихся в разных положениях.
По иному обстоит дело с непосредственным вмешательством
аминопроизводных акридина в процесс биосинтеза белка. Это дзйствле, как уже говорилось, связанное главным образом с инакти­
вацией тРНК, а возможно и рРНК, характерно для 3,6-диамянопроизводных акридина и совершенно не проявляется у риванола.
Видимо, необходимым условием для взаимодействия с РНК (тРНК)
является симметричное расположение аминогрупп в молекулах ак­
ридиновых производных. Наиболее ярко это свойство выражено у
3,6-диаминопроизводных акридина. Однако и симметричная молеку­
ла акрихина (имеющего аминогруппу в 9 положении) может, по-ви­
димому, при определенных условиях реагировать с дитоплазматической РНК, хотя это свойство у акрихина и выражено плохо.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
16
Соединение аминопроизводных акридина с
клеточными структурами
В многочисленных работах (Ellinger.Hirt , I930;Bukatsch,
Haitlnger
, 1940; Strugger , 1940; Ыейсель, 1947; Нейсель
и др., 1950 и др.) было показано, что различные производные
акридина проникают в животные, растительные и микробные клет­
ки, придавая им и•их отдельным структурам яркую люминесценцию.
Недостаточно ясным, однако, qciaBancn вопрос о цитохимической
и цитологической интерпретации люминесцентномикроскопических
картин, т . е . о том, с какими химическими компонентами клетки
и с какими клеточными структурами соединяются при этом произ­
водные акридина. Ш подвергли этот вопрос подробному рассмот­
рению на примере акридинового оранжевого - вещества наиболее
часто применяемого в люминесцентной микроскопии в качестве
люминесцирующего красителя (флуорохрома).
Наиболее яркой чертой клеток, прижизненно обработанных
акридиновым оранжевым, является наличие в них цитоплазматических гранул, располагающихся преимущественно в околоядерной
зоне и обладающих ярко-красной люминесценцией. Несмотря на
большое количество работ, посвященных изучению красных гранул
(VonkeimeliWiedemanii , 1944, Мей сель и д р . , 1950, 1951,1952,
I953;Zeieer e t . a l
, '1951, 1954,'Weissmann , I953;Wolf,
Aronson , 1961), вопрос об их морфологической и цитохимичес­
кой природе оставался практически открытым.
В своих исследованиях мы в первую очередь подвергли изу­
чению возможную связь этих гранул с цитоплазматической РНК
клетки. Результаты опытов, проведенных с помощью различных
методов исследования (табл. 2), показали, что цитоплазматическая рибонуклеиновая кислота не является субстратом красных
гранул. На основании их изучения не представляется никакой
возможности судить о состоянии и количестве цитоплазматичес­
кой РНК живой клетки.
С помощью цитохимических опытов удалось прийти также к
заключению, что красные гранулы не представляют собой и комп­
лекса акридинового оранжевого с кислыми мукоподисахаридами
клетки.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
17
Таблица 2
Факты, показывающие, что в основе красных цитоплазыаткческих гранул не лежит соединение акри­
динового оречжевого с цитоплазнатической РНК
1. Рибосомная РНК равномерно распределена по всей
цитоплазме, в то время как красные гранулы в основном
сконцентрированы в околоядерной зоне клетки
2. Красные цитоплазматические' гранулы образуются
обычно при таких условиях флуорохромирования, при ко­
торых ье наблюдается красной флуоресценции в структу­
рах, несомненно богатых РНК
3 . Многочисленные гранулы очень быстро образуются
в цитоплазме нейтрофильных лейкоцитов, несмотря на прак­
тически полное отсутствие в этих клетках цитоплазнати­
ческой РНК
4. В клетках тканевых культур, помещенных в гипо­
тоническую среду, оказывается возможным обнаружить од­
новременно красные гранулы и красную люминесценцию ос­
тальной цитоплазма (люминесценцию рибосомной РНК)
5. Актиномицин D и родственные препараты даже в
высоких концентрациях не меняют способности клеток к
гранулообразованию
6. Прижизненная обработка клеток Entamoebae
invadeas РНК-азой приводит к почти полной утрате эти­
ми клетками базофилии; в то же время их гранулообразовательная способность не меняется
7. Красные гранулы играют защитную роль в реакции
клеток на акридиновый оранжевый и некоторые другие
3,6-диаминопроизводные акридина - чем больше гранул
образуется под влиянием того или иного вещества, тем
менее токсичным оно оказывается для клетки (подробнее
см. следующий раздел)
В следующей серии экспериментов была изучена возможность
того, что красные цитоплазматические гранулы представляют со­
бой флуорохромированше акридиновым оранжевым митохондрии.
Комбинированное фазово-контрастное и люминеоцентномикроскопическое исследование заставило отбросить и это предположение.
Удалось четко показать, что красные цитоплазматические гранулы
и митохондрии являются совершенно различными структурами.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
18
Для получения позитивных данных о природе красных цито­
плазматических гранул было решено использовать методы, биохи­
мического анализа.
ЖИВОТНЫМ (мышам) внутривенно или внутрибрюшинно вводили
акридиновый оранжевый в концентрации 0,5/J-0,2 мл. Как показа­
ло люминесцентномикроскопическое исследование, в клетках пе­
чени при этом появляются типичные красные цитоплазматические
гранулы. Оказалось, что эти гранулы не разрушаются при гомо­
генизировании печени в сахарозном растворе на холоду. С по­
мощью метода дифференциального центрифугирования удалось вы­
делить субклеточную фракцию, максимально обогащенную красны­
ми цитоплазмагическими гранулами.
С помощью метода негативного контрастирования было про­
ведено электрояномикроскопическое исследование гранул, выде­
ленных в виде фракции. Исследование показало, что мы имели
дело с довольно однородной и чистой фракцией округлых и не­
правильной формы телец, окруженных тонкой однослойной мембра­
ной, по своему виду напоминающей лиелиновую. В некоторых слу­
чаях гранулы представляли собой гомогенные образования, в дру­
гих содержали внутри множество канальцев, тяжей и складок,
создающих своеобразную сеть. Размер гранул колебался от 0,6
до 5 мк.
Сопоставление результатов исследования со сведениями,
имеющимися в литературе ( NovUcoff et a l , 1956; de Duve ,
1959, 1963), позволило беа сомнения отнести красные цитоплаз­
матические гранулы к разряду лизосом. Несколько большие раз­
меры и больший вес красных цитоплазматических гранул, по срав­
нению с "классическими лизосомами", зависят, по нашему мнению,
главным образом от того, что аккумуляция в лизосомах акриди­
нового оранжевого в больших количествах приводит к изменению
их свойств.
Одновременно с нами к выводу о лизосомной природе крас­
ных цитоплазматических гранул пришли на основании цитохимичес­
кого исследования Робине и др. ( Bobbins et a l , 1964), иден­
тифицировавшие эти гранулы о цитоплазматическими структурами,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
19
содержащими кислую фосфатазу. Приблизительно в то не время
были опубликованы убедительные сведения ( cohn,viener
,
1964), показывающие, что близкий по своим свойствам к акриди­
новому оранжевому витальный краситель .нейтральный красны!
также аккумулируется в цитоплазме в составе л из осой. Имеются
как экспериментальные, так и литературные сведения (Румянцев,
1959;Allison,Tovmg
, 1964; Tang e t a l , 1965), носящие, ?
правда, более косвенный характер, но дающие основание счи­
тать, что и гранулы, в составе которых в клетках локализуют­
ся многие другие основные красители и вещества (акрихин, корифосфин, аурофосфин, метиленовый синий, толуидиновый синий,
новокаин и д р . ) являются лизосомами.
Остается, однако, не ясным вопрос о химическом субстрате
цитоплазматических гранул, т . е . о веществе, с которым специ­
фически комплексируются, проникнув в л из осош, инородные в е ­
щества и красители. Как было показано выше, ато гипотетичес­
кое вещество не является рибонуклеиновой кислотой или кислым
мукополисахаридом. В качестве наиболее вероятного химического
субстрата гранул могут выступать либо гидролазные ферменты
лизосом, либо какие-то иные полианионы (например, фосфолипиды). Для характеристики возможных свойств этих полиавинов мо­
жет представить интерес то обстоятельство, что краевую люми­
несценцию л из осомы приобретают при обработке живой клетки ак­
ридиновым оранжевым только при рН 6 , 5 и выше. Не исключена,
впрочем, возможность и того, что в лизосомах1 не существует
никакого специфического субстрата, о которым соединяются про­
никающие туда вещества» Изменение спектральных свойств краси­
телей (метахромаэия), часто происходящее при их проникновении
в лизосомы, может быть объяснено не за счет особенностей сое­
динения красителей с субстратом, а как результат ах накопле­
ния в лизосомах в высокой концентрации (концентрационный эф­
фект).
Анализ литературных данных и частично результатов собст­
венных экспериментов позволяет сделать следующее заключение
о характере соединения акридинового оранжевого с остальными
структурами живой клетки.
/
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
20
Люминесценция ядра (зеленое свечение хроматина и ядрыш­
ка при низких и средних концентрациях акридинового оранжево­
го, зеленое хроматина и красное ядрышка - при высоких концен­
трациях) являются результатом соединения этого флуорохрома с
ядерными нуклеиновыми кислотами (нуклеопротеидами).
Диффузная зеленая (при низких концентрациях акридинового
оранжевого) и красная (при высоких его концентрациях) люминес­
ценция цитоплазмы, очевидно, имеет в своей основе соединение
флуорохрома с рибосомами. Однако природа этой диффузной цитоплазматической люминесценции выяснела менее четко, чем природа
люминесценции ядерных структур или красных цитоплазыатических
гранул.
Взаимосвязь биологического действия апинопроизводных акридина с их накоплением в
лизосомах в виде цитоллазнатических гранул
Сопоставление результатов изучения механизмов биологичес­
кого действия акридинового оранжевого с результатами исследо­
вания его распределения в структурах живой клетки показало,
что тормозящий эффект этого вещества на синтез белка находит­
ся в определенной связи с процессом накопления его в лизосо­
мах в виде красных цктоплазматических гранул. Можно было пред­
ложить два объяснения обнаруженного явления:
I) Концентрация акридинового ораниевого в лизосомах име­
ет для клетки защитное значение, так как вредное вещество
хотя бы отчасти удаляется из клеточного метаболизма. 2) В про­
цессе концентрации красителя в лизосомах вместе с ним из клет­
ки удаляется и какой-то чрезвычайно важный-для ее нормальной
жизнедеятельности метаболит (например, один из видов РНК).
Токсическое действие акридинового оранжевого проявляется в
полную меру лииь тогда, когда процесс грапулообразозанил,
сопровождающийся удаленном этого метаболита, достигнет своего
максимума,
Для выяснения того, какое из высказанных предположений
более соответствует действительности, были предприняты экспе­
рименты по исследованию действия па клетк'и 3,6-дкаминопроиз-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
21
водных акридина с одинаковым характером биологического дейст­
вия» ко с различной способностью аккумулироваться в лизосона:..
В первой серии таких экспериментов было проведено срав­
нение действия на культуру амниотических клеток двух веществ!
не накапливающегося в лизосомах (эухризкн 2<ШХ ) и интенсив­
но в них аккумулирующегося (акридиновый оранжевый). Эти опы­
ты показали, что биологическая активность вещества находитсяв обратной зависимости от его свойства аккумулироваться в
лизосомах.
Для уточнения сделанного вывода была проведена следующая
серия опытов, в качестве объекта которых были взяты клетки
различных амеб» Amoebae .jsroteua , лияенной способности акку­
мулировать акридиновый оранжевый в лизосомах, и Entamoeba»
invadens , полноценно накапливающей акридиновый оранжевый в
виде цитоплазма!ических гранул. В еще одной серии эксперимен­
тов те и другие клетки были подвергнуты обработке эухризином
2GNX , не накапливающимся в лизосомах ни A.proteus , ни
Knt.invadens • Результаты опытов представлены на рис. 3, из
которого видно, что A.proteus , не накапливающая акридиновый
400
О
S
1й
1Г
Рис. 3 . Действие акридинового оранжевого на выживаемость
Amoebae p r o t e u s ( — — ) И
Entamoebas invadens ( - - - ) .
По оси ординат - число амеб в % от контроля
По оси абсцисс - концентрация акридинового
оранжевого в мкг.
оранжевый в лизосомах, гибнат при более низких концентрациях
этого вещества, чем Е.invadens
, аккумулирующая акридино­
вый оранжевый в лизосомах в виде цигоплазматических гранул.
Интересно, что по отношению к эухрнзкну 2GHX , не накапливаю-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
22
щемуся в лизосомах клетками обоих типов, различий в токсич­
ности не обнаружено.
' Проведенные исследования таким образом однозначно под­
твердили предположение о защитном значении для клеток процес­
са концентрации в лизосомах аминопроизводных акридина. Полу­
ченные результаты находятся в полном согласии с установленны­
ми ранее фактами ( P o l i t z e r , 1926,- Александров, 1939; Фельд­
ман, 1949) в отношении некоторое других красителей, хотя в
этих работах, естественно,речь" шла об аккумуляции веществ прос­
то в составе гранул без упоминания о лизосомах.
Сопоставление этих сведений с результатами наших экспе­
риментов дает основание считать, что аккумуляция в лизосомах
инородных для клетки веществ с частичной,по крайней мере, их
элиминацией из клеточного метаболизма представляет собой
биологическое явление, имеющее достаточно широкое распростра­
нение. Избирательность в проникновении в лизосомные структура
может в определенных случаях оказаться причиной неодинакового
действия на различные клетки некоторых токсических веществ,
в том числе специфических ингибиторов. Это обстоятельство
может оказаться ценным при поиске веществ с избирательной
токсичностью.
Энергетические и-химические механизмы сегрега­
ционного процесса
Существенная роль, которую играет в реакции клеток.на
производные акридина и другие инородные токсические вещества
их аккумуляция в лизосомах, побудила нас подробно исследовать
закономерности, которым подчиняется этот процесс. Основные
эксперименты были проведены на примере акридинового оранжево­
го и клеток различных культур тканей.
Было испытано действие различных метаболических ингиби­
торов на аккумуляцию акридинового оранжевого в лизосомах.
Эксперименты показали, что этот процесс подавляется в резуль­
тате обработки клеток ингибиторами гликолиза - натриевой солыэ
монойодуксусной кислоты и фтористым натрием. В то же время
оказалось, что этот процесс не тормозится ингибитором цито-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
23
хромоксидазы цианистым калием и разобщителями окислительного
фосфорилирования и дыхания - 2,4-д«нитрофенолом, азидом и арсенатом натрия. Было показано, что обнаруженная закономер­
ность присуща не только клеткам культур перевиваемых штаммов,
для которых характерна особая интенсивность гликолиза, но
и клеткам первичных культур с нормально протекающим дыханием
и окислительным фосфорилированием (клетки почки обезьяны,
фибробласты цыпленка).
На основании проведенных экспериментов может быть сделан
вывод о том, что энергетическая потребность процесса накопле­
ния инородных для клетки веществ в лизооомах достаточно полно
обеспечивается за счет гликолитического фосфорилирования.
Уместно вспомнить» при этом, что такие процессы как фагоци­
тоз и пиноцитоз тоже обеспечиваются энергией в основном за
счет гликолиза и не тормозятся ингибиторами дыхания или ра­
зобщителями дыхания и окислительного фосфорилирования (Пуч­
ков, 1955; Woods et a l , 1961; Kaxnovsiy > 1962» 0 r e n e t "^ »
1963; Брауде, 1966). Очевидно, теснейшая связь с гликолизом
характерна для всех процессов, протекающих на мембранных
структурах клетки и при их непосредственном участии.
В следующей серки экспериментов был подвергнут изучению
вопрос о зависимости накопления инородных веществ в лизосомах
от температуры. Наши эксперименты показали, что этот процесс
является зависимым от температуры и не протекает при +2 - +*°С
Обработанные в этих условиях акридиновым оранжевым клетки
приобретают лишь диффузную зеленую люминесценцию без какихлибо признаков аккумуляции акридинового оранжевого в лизосо­
мах в виде красных цитоплазыатических гранул. Однако доста­
точно небольшого прогревания препаратов, чтобы процесс гранулообразования восстановился. Обнаруженная закономерность ха­
рактерна для клеток разного происхождения и находящихся в
виде различных клеточных штаммов.
Мы подвергли также исследованию вопрос о защитной роли
глюкозы в реакции :иеток ьа акридиновый оранжевый. Наши экс-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
24
перименты подтвердили сведения ( Robt>ins,Iiarcue,I963) о том,
что внесение глюкозы в среду стимулирует процесс накопления
акридинового оранжевого в лизосомах и тем сашм понижает пов­
реждение этим веществом других клеточных структур. Однако,
защитная роль глюкозы проявляется только в оштах, проведен­
ных при нормальной температуре, и не реализуется при темпера­
туре +2 - +4° . SJTH факты свидетельствуют в пользу того, что
свойство глюкозы способствовать аккумуляции инородных веществ
в лизосомах связано с ее участием в активно протекающих кле­
точных процессах.
Далее было показано, что обнаруженные закономерности
(зависимость от температуры, чувствительность к действию ин­
гибиторов гликолиза) характерны для процесса накопления в
лизосомах не только акридинового оранжевого, но и других.ве­
ществ (нейтральный красный, толуидиношй синий, новокаин, ак­
рихин и д р . ) .
Представлялось необходимым исследовать некоторые хими­
ческие механизмы сегрегационного процесса. Прежде всего речь
шла об избирательности накопления инородных веществ в лизосо­
мах. Этот процесс отличается высокой специфичностью: чрезвы­
чайно близкие по своему химическому строению вещества разли­
чаются по способности проникать (акридиновый оранжевый, акри­
хин и др.) и не проникать (профлавин, эухризин 2GNX , рива­
нол) в лизосош. Эксперименты показали, что неспособность
клетки аккумулировать в лизосомах упомянутые вещества не свяаана с их общетоксическим действием. Обработанные профлавином
и риванолом клетки не утрачивают способности концентрировать
в лизосомах в виде цитоплазматических гранил' нейтральный крас­
ный и акридиновый оранжевый.
На примере целого ряда производных акридина мы подвергли
изучению вопрос о возможной взаимосвязи между химическим стро­
ением веществ и их"способностью проникатг внутрь лизосом. Про­
веденные эксперименты, результаты которых представлены на
рис. I , позволили сделать заключение, что одним из важных ус-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
25
ловий проникновения вещества в лизосош является наличие в
нем по крайней мере одного третичного или вторичного ашша.
Для проверки этого предположения было проведено сопоставление
химического строения различных неакридиновых красителей и
некоторых других веществ, свойство которых накапливаться в
лизосомах в виде цитоплазматических гранул было известно из
литературы (Фельдман, 1948,- Румянцев, 1959). Оказалось, что
полученные факты по крайней мере не противоречат сделанному
нами предположению - в виде цитоплазматических гранул накап­
ливаются только те вещества, которые имеют в своем составе
вторичные или третичные амониевые основания.
Этот вывод является сугубо предположительным, и вполне
возможно, что приведенные факты найдут себе другое более глу­
бокое объяснение. Однако основное заключение о связи между
химическим строением вещества и способностью клетки накапли­
вать его в составе лизосом вряд'ли окажется при этом поколеб­
ленным.
Из других черт, характерных для процесса аккумуляции
инородных веществ в лизосомах, следует назвать также проте­
кание его против градиента концентрации (особенно четко эта
черта выявляется на примере акридинового оранжевого) и нали­
чие конкурентного торможения. Последнее хорошо выявилось в
опытах с акридиновым оранжевым и новокаином. Одновременная
обработка клеток смесью новокаина с акридиновым оранжевым
резко уменьшает способность последнего придавать лизосомам
красную люминесценцию. В случае, когда клетки сначала обраба­
тывали новокаиноы, а потом акридиновым оранжевым, эффект тор­
можения был выражен значительно меньше.
Из изложенного материала ясно, что процесс накопления
в лизосомах инородных веществ характеризуется следующими
чертами:
1. Зависимость от клеточной энергетики и теснейшая связь
с гликолизом.
2. Зависимость от температуры.
3 . Накопление веществ определенного химического строения.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
26
4. Конкурентное торможение.
5. Протекание против градиента концентрации.
Сопоставление этих фактов дает основание выдвинуть пред­
положение, что на границе цитоплазма - лизосома (конкретнее
на лизосомной мембране) существует система активного перено­
са веществ через мембрану. Не представляется пока возможным
сколько-нибудь подробно охарактеризовать эту систему. Впрочем
подобные сведения отсутствуют и в отношении практических всех.
других механизмов, которые уже давно принято считать "актив­
ными клеточными насосами". Можно надеяться, что дальнейшие
исследования закономерностей накопления инородных веществ в
лизосомах позволят уточнить развиваемые нами представления
и выявить роль, которую играют постулируемые нами "насосы"
в осуществлении специфической функции лизосом.
Освобождение клетки от проникших в нее
производных акридина
Исследование путей освобождения клеток от проникших в
них посторонних веществ представляет интерес прежде всего с
точки зрения развития знаний о том, как клетка приспосабли­
вается к действию инородных токсических факторов химической
природы. Ванные сведения такое исследование может дать и для
решения некоторых вопросов относительно природы приобретенной
лекарственной устойчивости.
При исследовании путей выработки нечувствительности
клеток к действию определенных химических агентов наибольшее
внимание уделяют обычно селекционно-генетическим механизма!».
Однако не вызывает сомнения наличие и непосредственного при­
способительного механизма, связанного с выработкой понижен­
ной чувствительности всеми или большей частью клеток популя­
ции и, по крайней мере, частично зависящего от повышения спо­
собности клеток выводить проникшие в нее инородные вещества
( Dean.Hinshelwood
, 1952).
Lli исследовали судьбу акридинового оранжевого и профлавина, проникших в клетки тканевых культур в результате кратко
временного или длительного с ними контакта.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
27
После обработки клеток акридиновым оранжевым в течение
15 минут препараты помещали в большой объем кулыуральной
среды, не содержащей флуорохромов. Оказалось, что уже через
15 минут, в течение которых среду меняли несколько раз, из
клеток выводится практически весь флуорохром. Этот процесс
является активным, так как не проходит при температуре +2-+40.
Аналогичные результаты были подучены и в опытах с клетками,
находившимися в контакте с акридиновым оранжевым в течение
длительного промежутка времени. Отличие заключается только в
том, что выведение акридинового оранжевого из таких клеток
идет медленно (в течение нескольких дней), что, очевидно,
связано с изменением лизосом (их мембран), наступившим в ре­
зультате длительного воздействия на них акридинового оранже­
вого.
Наши выводы находятся в полном согласии со сведениями,
полученными другими авторами ( GUillienBond.Gauteret , 1937;
Buchy , 1942; Мвйсель, Помощникова, 1952) и так же, как и
они, свидетельствуют о том, что клетки активно выводят наружу
проникшие в них инородные вещества.
Иными оказываются закономерности взаимодействия акриди­
новых производных с клетками, находящимися с ними в постоян­
ном контакте в течение длительного промежутка времени. Для
постановки экспериментов такого рода в культуральную среду с
растущими клетками тканевых культур, вносили акридиновый оран­
жевый и профлавин в низкой концентрации (0,1 - 1,0 мкг в мл).
Клетки подвергали визуальному люминесцентномикроскопическому
и цитофлуориметрическому исследованию в течение 7 суток.
Оказалось, что ни визуально, ни цитофлуориметрически не
наблюдается сколько-нибудь заметных изменений клеток, обрабо­
танных профлавином и находящихся с ним в длительном контакте.
Иные результаты были получены в опытах с акридиновым оранже­
вым: на 5-6 день исследования интенсивность люминесценции кле­
ток резко падала (на 30-405?). Визуальное изучение показало,
что на эти же сроки резко меняется и люминесцентномикроскопи-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
28
ческая картина этих клеток, которые значительно бледнеют и
лизосош в которых оказываются неокрашенными или окрашенными
очень слабо.
Для выяснения природы полученных фактов в культуральную
среду с акридиновым оранжевым, в которой в течение недели на­
ходились препараты культуры клеток, были помещены аналогичные
препараты, но не бывшие до этого в контакте с флуорохромом.
В этих "свежих'* клетках л из о сош обладал и нормальной способ­
ностью накапливать содержащийся в среде акридиновый оранжевый
в виде обычных цитоплазматических гранул.
Зти факты свидетельствуют в пользу того, что в результа­
те длительного контакта с акридиновым оранжевым в клетках вы­
рабатывается какой-то новый, отсутствующий в норме механизм
для выведения веществ в окружающую среду. Ведущую роль в этом
механизме играют, очевидно, лизосоыы, так как в отношении
профлавина,-вещества с одинаковым, что и у акридинового оран­
жевого биологическим действием, но не проникающим в лизосомы,.
подобный механизм выведения не вырабатывается.
В заключительной серии экспериментов, проведенных в этом
направлении, была подвергнута изучению возможность переработки
клетками культуры ткани проникших в них производных акридина.
Количество акридинового оранжевого и профлавина и их состоя­
ние в среде до контакта и после контакта с клетками определя­
ли спектрофлуориметрически. Исследование показало, что в ре­
зультате контакта с живыми клетками интенсивность люминесцен­
ции профлавина значительно падает, а акридинового оранжевого
несколько возрастает. Эти данные с трудом поддаются интерпре­
тации и, во всяком случае,однозначного вывода о том, что акри­
диновые производные подвергаются активной переработке клетка­
ми, как это показано в отношении нейтрального красного (Мейсель
Помощникова, 1952; Morgan , I966) и некоторых канцерогенных
углеводородов (Данильцева, Петрикевич, Мейсель, 1965), сделать
на их основании пока не представляется возможным.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
29
Изменения клеточных структур под влиянием
акридиновых производных
Полеченные данные, касающиеся механизмов биологического
действия аьшнопроизводных акридина и закономерностей их взаи­
модействия с отдельными клеточными структурами, дают основа­
ние полагать, что под воздействием этих веществ в клетках
должны возникать значительные изменения. Однако литературные
сведения, имевшиеся по этому вопросу (Мейсель и др., 1951;
Stokinger
, 1954; WUrtekind , 1958,* Bobbins et ей
, 1964),'
были разрозненными и касались практически одного лишь акриди­
нового оранжевого.
Наши эксперименты были проведены, в основном, с использо­
ванием двух веществ, обладающих одинаковым механизмом дейст­
вия на синтез белка и нуклеиновых кислот, но различающихся
по своей способности аккумулироваться в лизосомах - акридино­
вого оранжевого (активно аккумулируется в лизосомах) и профлаьина (в лизосомах не накапливается).
Морфологическое (электронномикроскопическое, светооптическое и люминесцентномикроскопическое исследование) показало,
что под влиянием этих веществ в клетках развиваются, в основ­
ном, однотипные изменения.
Изменения ядерных структур возникают при обработке клеток
веществами в различных концентрациях и заключаются в преобра­
зовании хроматина (структуризация ядра) и прогрессивном умень­
шении РНК-содержащего компонента ядрышка. При обработке клеток
малыми дозами акридинового оранжевого и профлавина (1-3 мкг в
мл) в течение нескольких дней наблюдается также пекоторое
уменьшение цитоплазматической базофилии. Эти изменения возни­
кают под влиянием как акридинового оранжевого, так и профлави­
на, и могут быть интерпретированы как результат соединения этих
веществ с ДНК и торможения вследствие этого ДНК-зависимого
синтеза ГНК.
Для действия .'обоих веществ в высоких концентрациях
(20-30 мкг в ил) характерно появление в цитоплазме базофильных
образований, отсутствующих в нормальных клетках, и резкое
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
30
уменьшение базофилии в остальных участках цитоплазмы. Эти
базофильные цитоплазматические образования, представляющие
собой, по нашим данный, агломерат рибосом, ш идентифицирова­
ли с так называвши кркноиом (Хлопин, 1927). Подробное обсуж­
дение природы криноыа и клеточных механизмов его возникнове­
ния будет проведено в следующем разделе автореферата. Здесь
же лишь укажем на то, что, по нашим данным,возникновение кри­
ноыа тесно связано" с непосредственным действием акридинового
оранжевого и профдавина на синтез белка на ранних его стадиях
и, очевидно, является результатом соединения этих веществ с
цитоплазмагическими нуклеиновыми кислотами.
Исследование препаратов, -обработанных акридиновым оран­
жевым, обнаружило возникновение в клетках изменений, не раз­
вивающихся под влиянием профлавина. Эти изменения касаются
мембранного аппарата клетки и заключаются впшвдтрофии струк­
тур лизосомного аппарата, сопровождающейся как бы мобилиза­
цией всех резервов мембранных структур. При атом происходит
практически полное исчезновение из клеток мембранного компо­
нента аппарата Гольджи. Гипертрофия, структур лизосомного аппа­
рата, выражающаяся,в первую очередь,в развитии в них миелиновых фигур, особенно отчетливо выражена в клетках, подвергну­
тых воздействию низких-концентраций акридинового оранжевого
в течение нескольких суток.
Экспериментальный материал заставляет считать, что в
реакции клетки на различные токсические для нее соединения,
кроме изменений, строго специфичных для данного вещества,
т . е . связанных с вмешательством в определенные стороны клеточ­
ного метаболизма, значительную роль играют изменения более
общего, менее специфического характера, зависящие от взаимо­
действия этих веществ с другими структурными и химическими
компонентами клетки. Среди таких изменений более общего харак­
тера важное место занимает реакция лизосомного аппарата клет­
ки на проникновение в его структуры инородных соединений'.
морфологическому исследованию было подвергнуто также
действие на клехкв риванола и акрихина. Эксперименты показали,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
31
что для обоих веществ характерны те же изменения ядерных
структур, что и развивающееся под влиянием акридинового
оранжевого и профлавина. Это свидетельствует в пользу сущест­
вования у всех этих веществ общего характера действия на ядер­
ные нуклеиновые кислоты. В то же время цитоплазыатические из­
менения в клетках, обработанных риванолом, сильно отличается
от изменений, развивающихся под влиянием акридинового оранже­
вого и профлавина. Под воздействием риванола не возникает
кринома и не происходит сколько-нибудь существенного падения
цитоплазматической базофилии. Эти факты находятся в полном
согласии со сделанным ранее выводом о том, что для' риванола
не характерно непосредственное действие на синтез белка. •
Результаты опытов с'акрихином оказались противоречивыми.
В некоторых экспериментах обработка этим веществом не приво­
дила к развитию существенных изменений в цитоплазме, в других
же вызывала образование типичного кринома. При анализе этих
данных необходимо напомнить, что они находятся в соответствии
с результатами исследования биологического действия акрихина.
Эти результаты также оказались до известной степени неопреде­
ленными и не поддающимися пока четкой интерпретации.
О природе так называемого кринома
Под названием кринома в литературу вошло понятие о
базофильных структурах, заново возникающих в клетках после
их прижизненной обработки основными витальными красителями
(нейтральный красный, тулуидиновый синий и др.) и выявляющих­
ся на фиксированных гистологических препаратах. Впервые опи­
санный Хлопиши (1927) крином впоследствии был обнаружен и
изучен в работах ряда других исследователей. Наиболее важный
вклад в проблему кринома внесли Насонов (1930), Шлендорф
(«Ollendorff , 1936), Кедровский (1937, 1948) и Шмидт {Schmi­
dt , 1958, 1962). Возникновение типичных криномных структур
в клетках перевиваемых штаммов тканевых культур, подвергнутых
воздействию акридинового оранжевого и профлавина, было показано
и в наших опытах (см. предыдущий раздел). Таким образом, само
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
32
существование кринома является строго доказанным фактом. В
то же время многие вопросы, касающиеся природы кринош и
механизмов его возникновения, оставались неясными и требовали
экспериментального решения.
Нерешенным.оставался, в первую очередь, вопрос о соотно­
шении процессов образования кринома и накопления витальных
красителей в лизосоиах в виде цитоплазматических гранул. По­
давляющее большинство исследователей кринома признавало нали­
чие прямой связи такого рода и рассматривало крином как "за­
старелые гранулы", в составе которых накопился какой-то базофильный субстрат.
Проведенные нами эксперименты показали, что такое положе­
ние не соответствует действительности. По нашим данным, кри­
ном возникает без прямой связи с накоплением веществ - криноыообразователей в лизосомах. Основные факты, свидетельствую­
щие в пользу нашего утверадения, следующие:
1. Красные цитоплазиатические гранулы, выявляемые в клет­
ках, прижизненно обработанных акридиновым оранжевым, имеют
инув локализацию,по сравнению с криномными структурами, выяв­
ляемыми в тех же клетках после их фиксации и последующей ок­
раски.
2. Крином образуется под влиянием профлавина, не накап­
ливающегося в лизосомах в виде цитоплазматических гранул.
3 . Электронноиикроскопически крином представляет собой
скопления рибосом, не окруженные какой-либо мембраной и не
находящиеся в прямом контакте с лизосоками.
Таким образом, образование кринома и проникновение ви­
тального красителя в лазосош - два не зависимых друг от друга
процесса. Однако накопление витального красителя в лизосомах
может отразиться на характере кринома. Б частности, более мел­
кий и раздробленный характер кринома, возникающего под влияни­
ем акридинового оранжевого, по сравнении с криномом, образуюцш1ся под воздействием профлавина, связан, по нашим представ­
лениям, с накоплением акридинового оранжевого в лизосомах, что
препятствует агрегации кринома в виде крупных гранул.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
33
Наши эксперименты позволили ответить и на другой вопрос,
касающийся связи двух процессов - образования кринома и паде­
ния цитоплазматической базофилии. Можно было предположить,что
эти процессы также являются в значительной степени независи­
мыми и падение цитоплазматической базофилии происходит не
вследствие образования кринома, а в результате торможения под
влиянием вещества - криношобразователя синтеза рибосомной
РНК. Однако оказалось, что обработка клеток риванолом, оказы­
вающим на синтез рибосомной РНК то же действие, что акридино­
вый оранжевый и профлавин, но не приводящим к образованию кри­
нома, не вызывает и сколько-нибудь существенного падения цито­
плазматической базофилии. Эти опыты позволяют нам присоедини- j
тьсп к мнению Кедровского (1937, 1948) о том, что падение ци­
топлазматической базофилии является прямым следствием агрега­
ции базофильного материала в виде кринома. Отдельные стадии
процесса агрегации рибосом отчетливо прослеживаются на электроннограммах клеток тканевых культур, обработанных акридино­
вым оранжевым и профлавиноц.
Представляло интерес сопоставить химическое строение кра­
сителя и его способность вызвать крином. Такое сопоставление
было проведено нами на примере акридинового оранжевого, профлавина, риванола и акрихина. Эксперименты показали, что свой­
ство красителя вызывать образование кринома связано с наличи­
ем у него непосредственного действия на синтез белка на ранних
стадиях. Оказалось, что крином быстро и отчетливо возникает
под влиянием профлавина и акридинового оранжевого - веществ
с ясно выраженным влиянием на синтез РНК и ДНК и не зависимым
от этого непосредственным эффектом на синтез белка,не образу­
ется под влиянием риванола - вещества, для которого характерно
только действие на синтез нуклеиновых кислот,и непостоянно и
плохо образуется под воздействием акрихина, непосредственное
влияние которого на синтез белка выражено, как упоминалось
выше, непостоянно и нечетко.
Как было показано ранее, для веществ с непосредственный
действием на синтез бзлка характерно симметричное расположение
аминогрупп в их молекулах. Представляло интерес сопоставить
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
34
формулы веществ, в отношении которых из литературы или из
наших данных было известно, что они обладают свойством обра­
зовывать крином, Оказалось (рис. 4), что все эти вещества
(нейтральный красный, акридиновый оранжевый, толуидиновый си­
ний, профлавин, метиленовый синий, акрихин., и некоторые дру­
гие имеют) симметричную молекулу с симметричным расположением
аминогрупп.- Как было показано в отношении производных акриди­
на, такое расположение аминогрупп присуще веществам с непос­
редственным действием на синтез белка, так как, по-видимому,
способствует их соединению с цитоплазматическими рибонуклеи­
новыми кислотами - тРНК и рРНК. Видимо, способность активно
соединяться с рибосомами является нричиной криномообразующего
действия этих веществ.
Некоторые вопросы люминесцентномикроскопического
исследования живой клетки
Полученные в ходе нашей работы результаты позволяют.
подвергнуть критическому рассмотрению некоторые стороны люиинесцентномикроскопйческого изучения живой клетки.
Прежде всего представляет интерес обсудить возможности
исследования нуклеиновых кислот в живой клетке, обработанной
акридиновыми производными.
Сопоставление литературных сведений (Мейсель и др.,1951;
Мейсель, Корчагин, 1952; Loeser et al , 1955, I960; Wolf ,
Aronson , 1961) с результатами проведенных нами эксперимен­
тов позволяет заключить, что:
I . Обработка живых (переживающих) клеток акридиновым
оранжевым дает определенные возможности для исследования ядер­
ных нуклеиновых кислот (нуклеопротекдов). Такое исследование,
однако, является не истинно прижизненным, а суправитальным,
так как в его. ходе.ингибируготся некоторые важные стороны кле­
точного метаболизма (в первую очередь, биосинтез белка).
2 - Исследование цитоплазматических нуклеиновых кислот в
клетках, прижизненно обработанных акридиновым оранжевым, пред­
ставляет значительные трудности. Только диффузная зеленая лю­
минесценция цитоплазмы является, по-видимому, результатом сое-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
35
faW'V
Яркий крезиловый синий
Vs
Акридиновый оранжевый
и /ч
*«*|ЛЛ-| нЗД н>
Нейтральный красный
<н
Профлавин
tf-CH-CHfCHiCh
Толуидиновый синий
Акрихин
^C2HS
Рис. 4. Формулы важнейших веществ - криномообраэователей
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
36
динения акридинового оранжевого с рибосомной РНК. Изучение
люиинесцирующих красный цитоплазматических гранул, возникаю­
щих в результате аккумуляции акридинового.оранжевого в лизосомах, не дает никакой возможности для суждения о цитоплазиатиче
ской РНК.
3 . При использовании высоких, резко токсических концен­
траций акридинового оранжевого наступает денатурация клеточ­
ных рибонуклеопротеидов, в результате чего клетки приобретают
диффузную красную люминесценцию. При этой красная люминесцен­
ция рибонуклеопротеидов мертвой или предварительно поврежден­
ной клетки возникает при применении меньших концентраций акри­
динового оранжевого, чем при обработке живой клетки. Это об­
стоятельство позволяет дать цитохимическую интерпретацию ме­
тода Штруггера для различения живых и мертвых клеток.
Проведенные эксперименты показали, что обработка клеток
акридиновым оранжевым и другими производными акридина не дает
практической возможности для прижизненного люминесцентномикроскопического изучения кислых нукополисахаридов. В то же са­
мое время оказывается возможным люминесцзнтномикроскопическое исследование лизосом в живой клетке.
Наиболее существенными условиями прижизненного люминесцентноыикроскопического изучения лизосом являются следующие:
I . Проведение исследования в условиях, минимально повре­
ждающих клетку и максимально способствующих аккумуляции акри­
динового оранжевого в лизосомах (нормальная температура, ней­
тральная или слабо щелочная среда и д р . ) .
2". Использование •минимальных концентраций акридинового
оранжевого (обычно 5-10 мкг в мл), позволяющих выявлять все
краевые цитоплазматические гранулы (лизосомы) при флуорохромировании в течение не более, чем 10-20 минут.
3 . При желании выявить потенциальные возможности лизосомно-сегрегационного аппарата клетки целесообразно применять
длительное флуорскромирование в низких концентрациях акриди­
нового оранжевого (концентрация 0,5-1,0 мкг в ыл, время .флуорохромирования 1-2 суток).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
37
Наше исследование подтвердило целесообразность примене­
ния люминесцентной микроскопии для изучения процессов взаимо­
действия с клеткой инородных люминесцирующих соединений. Ре­
шающим условней успешности такого исследования является нали­
чие у изучаемых веществ люминесценции, достаточно яркой для
того, чтобы вести наблюдения при работе с концентрациями, по
крайней мере не превышающими тех, которые необходимы для дос­
тижения характерного для данных веществ начального биологичес­
кого эффекта.
Заключение
Экспериментальный материал нашей работы дает основание
для рассмотрения некоторых общих вопросов, касающихся действия
на клетку инородных для нее токсических, в том числе биологи­
чески активных веществ.
Хорошо известно, что хотя большинство биологически актив­
ных веществ характеризуют обычно по действию на какую-то одну
точку клеточного метаболизма, в действительности они являются
активными по отношению ко многим из них. Это положение отчет­
ливо демонстрируется и нашими опытами, в которых показано,
что 3,6-диаминопроизводные акридина обладают, по крайней ме­
ре, двумя точками приложения в отношении клеточного метаболиз­
ма - действием на синтез ДНК и РНК и независимым от него дей­
ствием на синтез белка на ранних его стадиях. Однако как уда­
лось установить в результате проведенных экспериментов, опре­
деляет биологическое (антимитотическое) действие этих веществ
лишь одна из точек их приложения, а именно первичное торможе­
ние синтеза белка.
Анализ литературы показывает, что положение о наличии
одной главной, т . е . определяющей биологическое действие точки
приложения того или иного биологически активного вещества
справедливо и по отношению к самый различным соединениям. Ска­
занное позволяет заключить, что исследуя действие биологичес­
ки активного соединения на клетку и закономерно стремясь выя­
вить все стороны этого действия, никогда нельзя забывать о
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
38
том, что обычно существует одна наиболее важная сторона, оп­
ределяющая биологический эффект данного вещества. В каждом
конкретной случае эту ведущую сторону приходится выявлять
эксперимзнтально. Как показывает наш опыт, важное место в
установлении такой ключевой точки действия на животные клетки
биологически активных веществ могут занимать эксперименты по
выявлению их влияния.на прохождение клетками различных стадий
митотического цикла.
Такого рода эксперименты приобретают особое значение в
связи с начавшими развиваться в последнее время представле­
ниями относительно того, что ключ к проблеме поиска веществ
с избирательной противоопухолевой токсичностью лежит в выяс­
нении их действия не непосредственно на клеточное деление, а
на неделящиеся в данный момент клетки (Rerenbaum
,Calley,
1962), в частности, находящиеся в стадии G0 митотического цик­
ла (Bruce et al
, I966;Roll,Homan
, 1967).
Другая сторона проблемы взаимодействия клеток и токсич­
ных для нее инородных веществ касается выяснения характера
и механизмов общей клеточной реакции на эти соединения. С
нашей точки зрения, на эту сторону вопроса обращается в насто­
ящее время явно недостаточное внимание, и больше всего сил
уделяется выяснению действия исследуемых веществ на конкрет­
ные стороны клеточного метаболизма.
В то же время не вызывает сомнений, что клетка реагирует
на инородные для нее токсические вещества как единое целое.
Эти вещества проникают в клетку или в отдельные ее структура
как правило, в результате активной клеточной жизнедеятельнос­
ти, активно перераспределяются внутри клетки, активно из нее
выводятся, а в некоторых случаях и перерабатываются.
Ш надеемся, что нам хотя бы до известной степени удалось
продемонстрировать, каким образом закономерности проникнове­
ния веществ внутрь клетки, их внутриклеточного перемещения и
выведения определяют характер и интенсивность клеточных реак­
ций на токсические, в том числе биологически активные вещества.
Как показали наши эксперименты, в определении более общей
реакции клеток на инородные токсические (биологически актив-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
39
ные) вещества, не связанной со вмешательством в строго кон­
кретные точки клеточного метаболизма, значительную роль могут
играть процессы, заключающиеся во взаимодействии этих веществ
с лизосомами и родственными образованиями, которые ш считаем
целесообразным объединить под названием структур лизосомносегрегационного аппарата клетки.
Обнаруженные закономерности, касающиеся накопления-в лизосомно-сегрегационном аппарате инородных для клетки веществ,
могут лечь в основу нового направления поиска соединений с
избирательной токсичностью по отношению к определенным клет­
кам. С другой стороны, использование веществ, изменяющих актив­
ность самих лизосом, может оказаться удобным экспериментальным
подходом для вмешательства по многие клеточные процессы, свя­
занные с участием лизосом, в частности, в некоторые клеточные
реакции, протекающие в процессе индивидуального развития жи­
вотных.
Исследование процессов взаимодействия с лизосомами инород­
ных для клетки соединений позволило выявить некоторые новые
закономерности, касающиеся процесса переноса веществ через лизосомную мембрану. На основании проведенных экспериментов выс­
казано предположение о наличии на этой мембране системы "ак­
тивного переноса". Данный пример демонстрирует положение о
том, что использование веществ, избирательно соединяющихся с
определенными клеточными структурами и специфически вмешиваю­
щихся в их жизнедеятельность, позволяет получать новые сведе­
ния, касающиеся закономерностей строения и функционирования
этих внутриклеточных образований.
Наши эксперименты позволяют сделать и некоторые более
частные выводы, касающиеся действия на клетку инородных для
нее веществ. В частности, оказывается возможным подвести итоги
спору, в течение многих лет продолжавшемуся между различными
авторами, изучавшими клетку, прижизненно обработанную основны­
ми витальными красителями. Одна группа исследователей (MJlleaMf
1920, I936;parat • 1926) считала, что витальные красители от­
кладываются при этом в составе предсуществующих цитоплазматических структур (гранул),а вторая (Хлопин, 1927;Кедровский, 1927,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
40
1948; Насонов, Александров, 1940) полагала, что эти гранулы
возникают в клетке под влиянием красителя заново в виде криношых образований. По нашим представлениям, определенная до­
ля истины содержится в обоих взглядах. Как оказалось, основ­
ные витальные красители(акридиношй оранжевый, нейтральный
красный и др.) откладываются в клетке в составе предсуществую­
щих структур -. лизосоы. Однако при некоторых условиях обработ­
ка клеток этими веществами может Приводить к появлению совер­
шенно нозых не существующих в нормальной клетке структур криномных образований.
Наши исследования позволили пролить определенный свет на
цитохимическую природу гранул криномы и интерпретировать их
как результат агрегации цитоплазмагических рибосом. Как пока­
зали наши опыты, процесс образования криномы не имеет при
этом непосредственной связи q накоплением вещества - криномообразователя в лизосомах. Выяснение цитологических механизмов
возникновения криномы представляется интересным, в частности,
для оценки значения криномообразования как фактора, приводя­
щего к экспериментальной задержке процесса индивидуального
развития животных (Кедровский, 1937).
Ш надеемся, что наше исследование хотя бы до известной
степени продемонстрировало плодотворность применения комплек­
са цитологических методов для исследования проблемы взаимодей­
ствия с клеткой токсичных для нее инородных веществ. Ни в коей
мере не отрицая важности для экспериментальной фармакологии и
химиотерапии подходов, предлагаемых современной биохимией и
молекулярной биологией, мы полагаем, что общецитологические
подходы представляются не менее существенными. В литературе
можно найти примеры, показывающие, что эта точка зрения в пос­
леднее время завоевывает определенное признание. Это положение,
и частности, можно продемонстрировать на примере книги Альбер­
та "Избирательная токсичность". Если в первом издании этой книг
га (Albert , I95I) в главе, посвященной биологическим и физикохимический обоснованиям избирательной токсичности, приводятся
шь саше общие сведения относительно закономерностей обмена
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
41
веществ в организме, то в последнем, третьем издании этой кни­
ги ( Albert , 1965) соответствующая глава содержит достаточно
подробные сведения, касающиеся строения клеток и их отдельных
составных частей.
Есть основания надеяться, что дальнейшие углубленные ци­
тологические исследования процессов взаимодействия клетки с
инородными для нее биологически активными веществами, важное
место среди которых будут и впредь занимать витальные"краси­
тели и особенно различные люминесцирующие соединения, позво­
лят обнаружить ноше существенные черты общи* реакций клеток
на инородные для них активные вещества и дадут возможность,
с одной стороны, разрешить некоторые вопросы, касающиеся выяс­
нения детальных механизмов функционирования отдельных клеточ­
ных структур, а с другой, разработать новые подходы к решению
проблем избирательной токсичности и лекарственной устойчивос­
ти.
Выводы
I . Для действия аминопроизводных акридина на клеточный
метаболизм характерны две основные точки приложения. Первая
из них имеет в своей основе соединение акридиновых производных
с ДНК, в результате чего наступает частичное торможение ее
синтеза, а-также торможение ДНК-зависимого синтеза РНК. Вторая
т-очка приложения не связана с первой и состоит в непосредствен
ном вмешательстве акридиновых производных в процесс биосинтеза
белка на уровне ранних его стадий и, по всей видимости, зави­
сит от соединения этих веществ с цитоплазматическими рибонук­
леиновыми кислотами, в первую очередь, с транспортной РНК, а
возможно, и рибосоыной РНК.
Действие- на синтез РНК и ДНК присуще всем из испытанных
аминопроизводных акридина вне зависимости от числа и располо­
жения в них аминогрупп. В то же время непосредственное вмеша­
тельство в процесс биосинтеза белка на уровне ранних его ста­
дий характерно только для веществ с симметричным расположением
аминогрупп (аминогруппы) и в наиболее яркой форме выражено у
3,6-диаминопроизводных акридина.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
42
2. Биологическое (антимитотическое) действие 3,6-диаминопроизводных акридина является следствием непосредственного
вмешательства в синтез белка на ранних стадиях. Биологическое
действие на клетки таких веществ.как акрихин и риванол,связано
с воздействием на иные этапы клеточного метаболизма.
3 . Все изученные-производные акридина обладают избиратель'
ным тормозящим действием на синтез рибосомной (ядрышковой)
РНК. Это позволяет высказать предположение, что преимуществен­
ное тормозящее действие на синтез рибосомной РНК актиномицина
D • оливомицина, акридиновых производных и некоторых других
веществ имеет в своей основе иные механизмы, чем обычно посту­
лируемое избирательное сродство- актиномицина D к гуанину.
.. 4 . Акридиновые производные, проникая в живую клетку,
соединяются там с различными структурными и химическими ком­
понентами ядра и цитоплазмы. В ядре акридиновые производные
связываются с нуклеиновыми кислотами хромосом и РНК ядрышка.
В цитоплазме диффузное зеленое свечение, по-видимому, приобре­
тают рибосомы.
Наиболее яркой чертой люминесцентноыикроскопической кар­
тины живой клетки, прижизненно обработанной акридиновым оран­
жевым и некоторыми другими производными акридина, является
возникновение люмйнесцнрующих ярко-красным цитоплазматических
гранул. Проведенными экспериментами показано, что эти гранулы
не являются результатом комплексообразования акридинового оран­
жевого (и некоторых других веществ) с цитоплазматической РНК.
В результате опытов, проведенных с помощью методов дифферен­
циального центрифугирования, выделена субклеточная фракция,
максимально обогащенная гранулами, которые идентифицированы
с лизосомами;
5 . Подтверждено на примере производных акридина, что
процесс аккумуляции инородных для клетки веществ в лизосоыах
носит для нее защитный характер..
6. Процесс аккумуляции инородных для клетки веществ в
лизосомах является зависимым от энергетики (чувствителен к дей­
ствию ингибиторов гликолиза) и температуры, протекает против
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
43
градиента концентрации, подчиняется правилу конкурентного
торможения и характерен только для веществ определенного
химического строения. На основании этих фактов высказано пред­
положение, что на лизосомной мембране локализована „система ак­
тивного переноса "через нее различных веществ.
7. Клетки обладают способностью активно выводить некото­
рые проникшие в них производные акридина. В выработке активных
механизмов выведения из клетки инородных для нее веществ зна­
чительную роль играет дизосомный аппарат.
8. Значительная часть морфологических изменений, возникаю­
щих в клетках под влиянием различных производных акридина,
связана с их вмешательством в синтез нуклеиновых кислот. Эти
изменения заключаются в структуризации хроматина, исчезнове­
нии РНК-вого. компонента ядрышек, некотором падении цитоплазматической базофилии.
9 . В результате воздействия 3,6-диаминопроизводных акри­
дина ( и в меньшей степени акрихина) в клетках происходит рез­
кое уменьшение цитоплазматической базофилии и образование в
цитоплазме новых базофильных структур, выявляемых на фиксиро­
ванных препаратах и идентифицированных с так называемым криноноы.
10. Процесс криномообразования воспроизведен на клетках
перевиваемых штаммов тканевых культур. Показано, что крином
представляет собой результат агломерации рибосом в виде обра­
зований, свободно лежащих в цитоплазме и не окруженных мембра­
нами. Получены факты в пользу того,' что процесс образования
кринома не находится в прямой связи с накоплением веществ криномообразователей в лизосомах.
Обнаружено, что для веществ-криномообразователей характер
но симметричное расположение аминогрупп в их молекулах и нали­
чие непосредственного действия на синтез белка на ранних ста­
диях.
11. Проведенные на примере производных акридина исследова­
ния показали, что клетка реагирует на инородные для нее токси­
ческие (биологически активные) вещества как единое целое. Од-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
44
нако в большинстве случаев удается выявить главную точку при­
ложения данного вещества, определяющую его биологическое дей­
ствие. Среди более общих форм ответа клетки на инородные ве­
щества важное место занимает реакция ее лизосомно-сегрегационного аппарата.
Исследование закономерностей накопления в лизосомах раз­
личных соединений может оказаться важным подходом к поиску
веществ с избирательной токсичностью.
12. Детальное изучение закономерностей взаимодействия
аминопроизводних акридина с живой клеткой позволило разрабо­
тать и уточнить некоторые.стороны прижизненной люминесцентной
микроскопии. Предложен метод прижизненного люминесцентномикроскопического исследования лизосом, разобраны а детализированы
возможности люминесцентномикроскопического изучения нуклеино­
вых кислот в живой клетке, подвергнута критическому рассмотре­
нию природа так называемого эффекта Итруггера.
Основные материалы диссертации отражены в следующих
публикациях:
1. А.В.Зеленин. Люминесцентная микроскопия в гистохимии нуклеи
новых кислот. Архив анатомии, гистологии и эмбриологии,
1961, 40, 3, 88-98.
2. Ь.В.Зеленин, Е.А.Ляпунова. Люминесцентномикроскопическое
исследование делящихся клеток. ДАН СССР, 1961, 141, 4,
963-965.
3 . М.Н.Ыейсель, А.В.Гуткина, А.В.Зеленин, М.М.Огиевецкая,
Н.Е.Воротницкая, Е.А.Ляпунова, В.Е.Барский, флуоресцент­
ная цитохимия раковой клзтки. В кн. "8 Международный
противораковый Конгресс". Тез. докладов, 1962, стр. 124.
4. М.Н.Мейсель, А.В.Гуткина, А.В.Зеленин, М.М.Огиевецкая,
Н.Е.Воротницкая, Е.А.Ляпунова, В.Е.Барский. Флуоресцент­
ная цитохимия раковой клетки. В кн. "8 Международный
противораковый Конгресс"..Труды. 1963, т . 4 , стр. 71-73.
5.
M.N,Meissel,A.V.Gutkina,A.V.Zeleniii|M.M.Ogievetslcaya,
N.E.Vorotnitskaya,E.A.Liapunova,V.E.Barslcy.Pluoresceiioe
cytochemistry of t h e cancer c e l l . I n t e r n . A c t a c o n t r a
cancrum,1964,20,6-7,1326-1528.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
45
6. А.В.Зеленин, Н.Г.Хрущов, Е.А.Ляпунова, В.Е.Барский, Н.Е.
Воротницкая. О природе комплексообразования акридинового
оранжевого с цитоплазштическими структурами. В кн. "Те­
зисы докл. XI Совещания по люминесценции". 1962,стр.27-28,
7.:А.В.Зеленин, Н.Г.Хрущов. О природе красных гранул, выявляе­
мых с помощью люминесцентной микроскопии в цитоплазме
нейтрофильных лейкоцитов. Проблемы гематологии и перели­
вания крови. 1964, № 3, 26-31.
8. A.V.Zelenin,N.G.Khrushchov.Nature of the red granules
demonstrated by fluoreseence microscopy-in cytoplasm of
neutrophilic leucocytes. Fader.„Proceed.,1965.24,2(p I I ) ,
T-309- T-3I2.
9. Н.Е.Воротницкая, А.В.Зеленин, Е.А.Ляпунова, М.Н.Мейсель.
Люминесцентномикроскопическое исследование нормальных
и опухолевых клеток, флуорохромированкых акридиновый
оранжевым при различных значениях рН. ДАН СССР, 1963,
152, 3, 724-726.
10. А.В.Зеленин, Е.А.Ляпунова. Влияние акридинового оранжевого
на синтез белка (люминесцентномикроскопическое исследо­
вание). В кн. "Тезисы докладов Первого Всесоюзного био­
химического съезда", 1963, вып. I, стр. 43-44.
11. И.Я.Тимофеева, Е.С.Залманзон, К.А.Кафиани, А.В.Зеленин,
Л.С.'Лобарева, Е.А.Ляпунова. Действие некоторых антибиоти­
ков на синтез рибонуклеиновых кислот и репродукцию виру­
сов в культуре амниотических клеток человека. В кн. "Те­
зисы докладов Первого Всесоюзного биохимического съезда",
12.63, шп. 2, стр. 84.
12. A.V.Zelenin,E.A.Liapunova.On t h e n a t u r e of cytoplasmic
granules having red fluorescence and produced i n l i v i n g
c e l l s t r e a t e d with a c r i d i n e orange . В fflrf'Secon(i i n t e r n a ­
t i o n a l Congress of h i s t o - and cytochemistry ",1964,
p.217-218.
13. А.В.Зеленин, Е.А.Ляпунова. Влияние'акридинового оранжевого
на включение в клетки тканевых культур S с^-метионина.
ДАН СССР, 1964, 158, 221-224.
14. А.В.Зеленин, Е.А.Ляпунова. Исследование люминесцирующих
красным цитоплазматических гранул в обработанных акридиНОЕЫМ оранжевым живых клетках. В кн. "Тезисы докладов
ХШ Совещания по люминесценции", 1964, стр. 39-40.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
46
15. А.В.Зеленин, Е.А.Ляпунова, С.Б.Петрикевич. О прижизненное-:
ти некоторых видов люшшесцентномикроскопического иссле­
дования. В кн. "Тезисы докладов ХШ Совещания по лгоминесденции", 196.4,, стр. 40. .
16. A.V.Zelenln,E.A.Liapunova.Inhibition of protein-synthesis
by acridine orange. Nature,1964,204,4953,45-46.
17. А.В.Зеленин, В.И.Бирюзова, Н.Е.Воротницкая, Е.А.Ляпунова.
Выделение субклеточной фракции, обогащенной цитоплазматическими акридиновыми гранулами. ДАН СССР, 1965, 162,
4, 925-927.
18. Е.С.За'лыанзон, А.В.Зеленин, К.А.Кафиани, Л.С.Лобарева,
Е.АЛяпукова, М.Я.Тимофеева. Влияние некоторых противог
опухолевых антибиотиков на синтез нуклеиновых кислот и
репродукцию вирусов в культуре клеток амниона человека.
.Антибиотики, 1965, 10, 7, J6I3-62I.
. _
. .
19. E.S.Zalmanzgn,4.V.Zelenin,K.A.Kafiani,L.S JLobareva,E.A.IiiapTmova,U.Ya.Timofeeva.Effect of some antineoplastic an­
t i b i o t i c s on nucleic acid synthesis and virus reproduc­
t i o n Jn a culture of human amniotic c e l l s ( s t r a i n FL ) .
Feder.Proceed,1966,25,4, T-695 - T-700.
20. Д.В.Зеленин. Морфологическая и цитохимическая природа крас­
ных акридиновых гранул. Изв. АН СССР, серия биол., 1965,
№ 6, 977-980.
2 1 . Е.А.Ляпунова, С.Б.Петрикевич, А.В.Зеленин. О прижизненное- •
ти люминесцентномикроскопических исследований, проводи­
мых „с помощью флуорохромов акридинового оранжевого и
3,4-бензпирена. Изв. АН СССР, серия биол., 1965, № 6,
980-984.
22. Е.С.Залманзон, А.В.Зеленин, К.А.Кафиани, Л.СЛобарева,
Е.А.Ляпуяова, Н.Я.Тимофеева. К механизму действия антибио
тика оливомицина. Вопросы медицинской химии, 1966, № I,
58-62.
23. Е.А.Ляпунова, А.В.Зеленин. Действие акридинового оранжево­
го на ранние этапы биосинтеза белка в клетках тканевых
культур. Вопросы медицинской химии, 1966, № 2, 224-226.
24. А.В.Зеленин, Е.А.Ляпунова, Н.Н.Беляева. Взаимосвязь биоло­
гического действия некоторых диаминопроизводных Акридина
с образованием под их влиянием цитоплазмагических гранул
ДАН СССР, 1966, 167, I, I95-I97.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
47
25. А.В.Зеленин, Е.А.Ляпунова, Н.Г.Степанова, Е.А.Кирьянова,
Н.Н.Беляева. Люминесцентномикроскопическое и авторадио­
графическое исследование животных клеток, подвергнутых
воздействию некоторых "витальных" красителей. В кн. "Тв''зисы докладов Л1 Всесоюзного съезда анатомов","Тбилиси,
1966, стр. 304.
26. А.В.Зеленин, Е.А.Ляпунова. Влияние акридинового оранжевого
на синтез нуклеиновых кислот'в животной клетке. Фармако­
логия и токсикология, I96G, й 4, 481-484.
27. A.V.Zelenln.On the fluorescence microscopy of lysosomes
and r«lated structures in living c e l l s . Nature, 1966,212,
5060,425-426.
28. А.В.Зеленин. Применение флуоресцентной микроскопии для ис­
следования действия на клетку биологически активных ве^
ществ. В кн. International Conference on.luminescence,
.Budapest,Preprints,suppl. ,I966,p.I45-I48i
29. A.V.Zelenin. Fluorescence — microscopical examination
of the action of biologically active substances ( BAS )
.
30.
31.
32.
33.
34.
n
on the c e l l . В KH.Proceed. Internet. Conference on l u ­
minescence" Budapest,ЕЭб^зд. Академии наук Венгрии, 1966,
565-570.
М.Н.Мейсзль, А.В.Зеленин. Люминесцентная цитохимия нуклеи­
новых кислот и белка. Успехи современной биологии, 1967,
64, (2), 5, 223-247.
А.В.Зеленин, Е.С.Залманзон, С.Б.Петрикевич. О применении
люминесцентной микроскопии для исследования процессов про
никновения в клетку и внутриклеточного распределения антибиоткков. Фармакология и токсикология,1967,№6,751-753.
А.В.Зеленин. Люминесцентная цитохимия нуклеиновых кислот.
"Наука", U., 1967.
А.В.Зеленин, Н.Г.Степанова. Люминесцентномикроскопическое
исследование полисахаридов. В кн. "Тезисы докладов Все­
союзного совещания по органическим люминофорам". Харьков,
1967, стр. 34-35.
А.В.Зеленин, Е.А.Кирьянова. Закономерности взаимодействия
витальна флуорохромов со структурами живой клетки. В
кн. "Тезисы докладов Всесоюзного совещания по органичес­
ким люминофорам". Харьков, 1967, стр. 35-36.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
48
35. А.В.Зеленин, Н.Г.Степанова. Люминесцентная гистохимия кис­
лых мукополисахаридов. Архив анатомии, гистологии и эм­
бриологии. 1968, 54, 2, 82-89.
36. А.В.Зеленин. Роль лизосомного аппарата клетки в реакции на
биологически активные и токсические вещества. Симпозиум
"Значение лизосом в физиологических и патологических
процессах". Москва, 1968, стр. 8.
37. Е.А.Кирьянова, А.В.Зеленин. Характеристика процесса накоп­
ления з лизосомах основных витальных красителей и некото­
рых других веществ. Симпозиум "Значение лизосом в физио­
логических и патологических процессах". Москва, 1968,
стр. 34.
38. Н.Г.Степанова, А.В.Зеленин. Соотношение процессов образова­
ния криномы и накопления витальных красителей в лизосо­
мах. Симпозиум "Значение лизосом в физиологических и
патологических.процессах". Москва, 1968, стр. S5.
39.
40.
A«V.Zelenin,E.A.Kirianova, H.G.Stepanova.Regulaxities.of
acridlne fluorochromes lnteractin with living cells.
В кн. "Third International Congress of Histo- and Cyto.cbenistrytM.HT,I9^,P«905 -306.
M.U.Meissel,A.V.Zelenin,Fluorescence cytochemistry.of nuc­
leic
acids С present s t a t e and perspectives ) .
В кн., посвященной 65-летию Л.Берталанфи. Канада (в пе­
чати) .
Материалы диссертации были доложены на 8 Международном
противораковом конгрессе (Москва, 1962), XI Совещании по люми­
несценции (Минск, 1962), I Всесоюзном биохимическом съезде
(Ленинград, 1964), ХШ Совещании по люминесценции (Харьков,1964),
П Международном конгрессе по гисто- и цитохимии (ФРГ, 1964),
УП Всесоюзном съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Тби­
лиси, 1966), Международной конференции по люминесценции (Вен­
грия, 1966), Всесоюзном совещании по органическим люминофорам
(Харьков, 1967), Московском обществе цитологов (Москва, 1968),
Московском обществе испытателей природы (Москва, 1958), Симпо­
зиуме "Значение лизосом в физиологических и патологических про­
цессах" (Москва, 1968), Ш Международном конгрессе по гисто- и
цитохимии (США, 1 9 6 8 ) .
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
6
Размер файла
1 225 Кб
Теги
190
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа