close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

956

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Федеральное агентство по образованию
Государственное образовательное учреждение
Высшего профессионального образования
«Казанский государственный технологический университет»
Методические разработки
кафедры промышленной
биотехнологии
БИОХИМИЯ
Методические указания
к лабораторному практикуму
Казань
КГТУ
2010
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
УДК 577.1
Составители: доц. Л.В. Лопухов, ассист. Ю.В. Балакирева.
Биотехнология: лабораторный практикум / Л.В. Лопухов,
Ю.В. Балакирева; Федеральное агентство по образованию. Казан. гос. технол. ун-т. – Казань: КГТУ, 2010. – 67 с.
Составлены в соответствии с государственным образовательным стандартом высшего профессионального образования
по специальности 240901 «Биотехнология» учебным планом и
рабочей программой по дисциплине «Биохимия».
Методические указания содержат необходимый теоретический и практический материал по качественному и количественному определению ряда основных биохимических соединений: белки, аминокислоты, жиры, углеводы. Подробно рассмотрены и сопоставлены различные методы количественного определения белков.
Предназначены для студентов очной, очно-заочной форм
обучения, а также бакалавров и магистров по направлению
550800 «Химическая технология и биотехнология», изучающих
дисциплину «Биохимия».
Подготовлено на кафедре промышленной биотехнологии.
Рецензенты: проф. Ф.Г. Каримова
ст. науч. сотр. С.Т. Минзанова
1
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1. ПРАВИЛА ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ
В ЛАБОРАТОРИИ
Источники опасности при работе в лаборатории:
Ядовитые и раздражающие химические вещества.
1.
2.
Высокая температура и пламя.
3.
Электричество.
4.
Опасность механических повреждений.
Меры предосторожности:
1.
При обращении с химическими веществами не допускать попадания их в организм. Особую осторожность соблюдать при работе с раздражающими и ядовитыми веществами.
Пути возможного попадания химических веществ в организм: вдыхание; проглатывание; контакт с кожей; попадание в
глаза.
При работе с токсичными веществами, концентрированными кислотами и щелочами все работы следует проводить под
тягой.
Следует соблюдать особую осторожность при работе с
пипетками (если воздух втягивается ртом, возможно попадание
отбираемых веществ в рот). Следует не втягивать воздух ртом, а
пользоваться пипеткой с помощью груши или пользоваться дозатором.
Следует пользоваться перчатками и не допускать попадания данных веществ на кожу или одежду. В случае попадания
на кожу – смыть и обработать как необходимо.
В случае работы с опасными веществами не допускать
попадания в глаза, использовать защитные очки.
В случае попадания опасных веществ в глаза промыть
глаза водой (можно в специальной ванночке), держа веки открытыми. При наличии контактных линз следует сначала про2
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
мыть глаза, не снимая контактных линз, а потом снять контактные линзы и продолжить промывание.
Высокая температура и пламя. Соблюдать акку2.
ратность в обращении со спиртовками. Не зажигать спиртовки
одну от другой. Не брать руками горячие пробирки и колбы.
Нельзя нагревать посуду из простого химического стекла
на открытом пламени.
Нагревание огнеупорных пробирок на пламени спиртовки следует производить на уровне верхней границы жидкости,
при этом отверстие пробирки должно быть направлено в безопасную сторону, пробирку держат с помощью держателя.
Огнеопасные вещества следует нагревать только на водяной бане (ни в коем случае не на открытом пламени!), контролируя наличие воды. Спиртовки гасить колпачком и следить за
правильным положением фитиля.
Электричество. Не пользоваться неисправными
3.
приборами. Не касаться электроприборов, вилок, розеток мокрыми руками. Немедленно сообщать инженеру или преподавателю при обнаружении проводов с поврежденной изоляцией или
если прибор при прикосновении «бьет током».
Работу на измерительной аппаратуре следует проводить в
присутствии преподавателя или ответственного лаборанта кафедры.
Распределительный электрический щит, к которому подключены приборы, включается только в присутствии и под контролем преподавателя.
4.
Необходимо аккуратно обращаться с лабораторной посудой, чтобы в случае ее повреждения не получить травму. Не следует пользоваться треснутой или надколотой посудой.
В случае разбивания аккуратно убрать осколки в мусорное ведро (если разбившаяся посуда не содержала опасных или едких
веществ, требующих специальных мер при удалении).
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Общие правила безопасности и грамотной работы
•
Следует использовать реагенты, маркировка которых указана на этикетке (вещество, концентрация, дата изготовления). Нельзя использовать вещества из емкостей без маркировки или пытаться самостоятельно определить (на вкус, запах и
цвет), какое вещество находится в емкости без маркировки.
•
Все приготовленные растворы и образцы должны
быть ясно подписаны.
•
Работа с концентрированными кислотами и щелочами, ядовитыми и огнеопасными веществами проводится в вытяжном шкафу.
•
Реагенты использовать экономно и не загрязнять.
•
В рабочем состоянии крышки термостатов, сухожаровых шкафов, центрифуг должны быть закрыты.
•
В лабораторные центрифуги помещают парное
(четное) количество тщательно уравновешенных пробирок. Ось
симметрии между двумя пробирками должна проходить через
ось ротора. Перед включением и в процессе работы роторная
камера центрифуги должна быть закрыта. Камера может быть
открыта только после полной остановки ротора.
•
Работать в лаборатории обязательно в халате, волосы должны быть убраны.
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ
Белки – природные высокомолекулярные вещества, состоящие из мономеров – аминокислот. Аминокислоты, соединяясь пептидной связью, образуют полипептидные цепи. Белок
может состоять из одной или нескольких полипептидных цепей.
В состав сложных белков кроме полипептидных цепей входят
неаминокислотные компоненты.
В белках карбоксильная группа одной аминокислоты соединена с аминогруппой другой аминокислоты пептидной связью. На рис. 2.1 показано, как из двух аминокислот образуется
дипептид с высвобождением одной молекулы воды.
Рис. 2.1. Образование пептидной связи
При соединении большого числа (обычно более сотни)
аминокислот путем образования пептидных связей формируется
полипептидная цепь, имеющая неразветвленную структуру.
Каждую аминокислоту, входящую в состав полипептидной цепи, называют аминокислотным остатком. Полипептидная
цепь имеет определенное направление, поскольку каждый из ее
строительных блоков имеет разные концы - либо амино-, либо
карбоксильная- группа. Условились считать, что полипептидная
5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
цепь начинается с N-конца, т.е. с конца, несущего аминогруппу.
При изображении последовательности аминокислот в полипептидной цепи начинают с N-концевого остатка. Так, в трипептиде
аланин-глицин-триптофан аланин несет концевую аминогруппу,
а триптофан-концевую карбоксильную группу. Обратите внимание, что триптофан-глицин-аланин - это уже другой трипептид.
Полипептидная цепь (рис. 2.2) состоит из регулярно повторяющихся участков, образующих основную цепь, и вариабельной части, включающей в себя характерные боковые цепи.
Рис. 2.2. Полипептидная цепь
Основную цепь называют иногда скелетом, или остовом,
молекулы.
В ряде белков некоторые боковые цепи остатков цистеина соединены между собой дисулъфидными связями (мостиками), которые образуются при их окислении. Возникающий при
этом дисульфид называют цистином.
Лабораторная работа 2.1
КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ
Методы определения концентрации белков в растворе
могут быть построены на основе собственного поглощения белка в ультрафиолетовой области или на специфических цветных
реакциях на белок (колорометрические методы).
Поглощение при 260 нм и 280 нм. Белки характеризуются
максимумом поглощения в ультрафиолетовой области при 280 нм.
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Измерение поглощения при 260 нм позволяет сделать поправку на поглощение нуклеиновых кислот, находящихся в растворе.
Методика. В односантиметровой кювете измеряют поглощение A (экстинцию, оптическую плотность) раствора белка
при 260 нм и 280 нм. (Поглощение не должно превышать диапазон линейности спектрофотометра, в противном случае образец
следует разбавить.) Концентрация белка (мг/мл) вычисляется по
формуле:
С = 1,55*A280 – 0,76*A260.
Указанная формула подходит для белков с обычным
(близком к среднему) содержанием ароматических аминокислот.
Поскольку поглощение при 280 нм определяется ароматическими аминоксилотными остатками белка, оно различается в зависимости от содержания ароматических кислот в белке. Поэтому
метод определения концентрации белка по поглощению в ультрафиолетовой области, при использовании для белков с содержанием ароматических аминокислот, сильно отличающимся от
среднего, требует корректировки, приведенной выше формулы.
1. Биуретовый метод. Метод основан на образовании в
щелочной среде, окрашенного в фиолетовый цвет, комплекса
пептидных связей с ионами двухвалентной меди. Имеется два
варианта определения концентрации белка биуретовым методом: обычный биуретовый метод и биуретовый метод для определения микроколичеств белка. Обычный биуретовый метод позволяет определять концентрацию белка в диапазоне 2 – 10
мг/мл. Биуретовый метод для определения микроколичеств белка позволяет определять концентрацию белка в диапазоне от 0,1
до 2 мг/мл.
Обычный биуретовый метод. Реактивы:
1.
Биуретовый реактив: 0,15 г CuSO4 *5H2O и 0,6 г
NaKC4H4O6 * 4 H2O (виннокислый натрий-калий или сегнетова
соль) растворяют в 50 мл воды, при энергичном перемешивании
приливают туда 30 мл 10% раствора NaOH (свободного от
Na2CO3), добавляют 0,1 г KI и раствор доводят водой до 100 мл.
7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Хранят в полиэтиленовой или полипропиленовой посуде в течение недели.
2.
Стандартный раствор белка, например сывороточного альбумина с концентрацией 10 мг/мл.
Определение концентрации белка:
К 1 мл раствора, содержащему от 2 до 10 мг/мл белка,
добавляют 4 мл биуретового реактива. Пробы перемешивают и
оставляют при комнатной температуре на 30 мин, после чего
определяют оптическую плотность при длине волны 540 нм с
помощью фотоэлектроколориметра или спектрофотометра. В
кювету сравнения при этом помещают раствор, полученный при
смешивании 1 мл дистиллированной воды и 4 мл биуретового
реактива.
Содержание белка при этом определяют по заранее составленному калибровочному графику. Калибровочный график
строится с помощью нескольких растворов белка с заранее известной концентрацией, приготовленных из стандартного раствора белка. В случае, если определяемая концентрация белка
превосходит 10 мг/мл, образец следует развести.
Биуретовый метод для определения микроколичеств
белка. Биуретовый реактив для микроопределения (реактив Бенедикта): 17,3 г цитрата натрия и 10 г Na2CO3 растворяют при
подогревании в небольшом количестве воды. В раствор добавляют 1,73 сульфата меди, растворенного в 10 мл воды, и доводят
водой до 100 мл.
1.
NaOH – 6% раствор.
2.
Стандартный раствор белка, например сывороточного альбумина с концентрацией 1 мг/мл.
Определение концентрации белка:
К 2 мл раствора, содержащего 0,1 – 2 мг белка, добавляют 2 мл 6 % раствора NaOH и 0,2 мл реактива Бенедикта. Раствор хорошо перемешивают и через 15 мин фотометрируют при
длине волны 330 нм на спектрофотометре. Предварительно
строят калибровочный график по растворам белка с известной
концентрацией, приготовленным из стандартного раствора.
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. Метод Лоури. Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом
Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи.
Метод характеризуется высокой чувствительностью (10-100 мкг
белка в пробе). На развитие окраски влияет большое количество
веществ, например, восстановители, комплексоны, детергенты,
сернокислый аммоний, сахароза и т.д.
В связи с этим при построении калибровочного графика
для определения белка по Лоури в растворитель для стандартного белка необходимо включать все компоненты (мешающие вещества), содержащиеся в анализируемых пробах. В некоторых
случаях целесообразно предварительное осаждение белков из
растворов, например трихлоруксусной кислотой с последующим
растворением их в щелочных растворах (до полного растворения) или очистка белковых растворов от низкомолекулярных
компонентов путем диализа или гель-фильтрации на сефадексе
G-25.
Реактивы:
1.
Na2CO3 – 2% раствор в 0,1 н растворе NaOН.
2.
CuSO4 *5H2O – 0,5 % раствор в 1% растворе цитрата натрия.
Рабочий раствор: 1 мл реактива 2 в день опреде3.
ления смешивают с 50 мл реактива 1.
4.
Реактив Фолина – Чокальтеу: 10 г Na2WO4*2H2O
(перекристализованный) и 2,5 г Na2MoO4 *2H2O помещают в
круглодонную колбу на 200-250 мл, приливают 70 мл воды и
хорошо перемешивают. К полученному раствору добавляют 5 мл
85% раствора фосфорной кислоты и 10 мл концентрированной
HCl (х.ч.). Колбу присоединяют к обратному холодильнику (на
шлифе), ставят на сетку и кипятят 10 ч. Затем в раствор добавляют 15 г Li2SO4, 5 мл воды и одну каплю брома. Раствор перемешивают и нагревают для удаления брома. После охлаждения
доводят до 100 мл водой, фильтруют и разводят водой с таким
расчетом, чтобы получился 1 н раствор кислоты (приблизительно вдвое). Кислотность определяют титрованием, разведенного
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
в 10 раз реактива 0,1 н щелочью, в присутствии фенолфталеина.
Реактив может храниться в темной склянке длительное время.
5.
Стандартный раствор белка с концентрацией 0,25
мг/мл.
Определение концентрации белка:
К 0,4 мл исследуемого раствора, содержащего 10 – 100
мкг белка, приливают 2,0 мл рабочего раствора (3), перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем
добавляют 0,2 мл реактива Фолина - Чокальтеу, содержимое
пробирки тщательно перемешивают и через 30 мин колириметрируют при длине волны 750 нм. Содержание белка определяют
по заранее составленному калибровочному графику.
Метод Бредфорда. Реактивы:
3.
1.
Раствор А. 100 мг кумасси бриллиантового синего
G-250 растворить в 50 мл 96 % этанола. Довавить 100 мл 85 %
Н3РО4 и довести до 1 л бидистиллированной водой.
2.
Раствор В. К 50 мл 96 % этанола добавить 100 мл
85% Н3РО4 и довести до 1 л бидистиллированной водой.
3.
Стандартный раствор белка с концентрацией 1
мг/мл.
Определение концентрации белка:
Перед определением белка растворы А и В разбавляют в
2 раза и готовят раствор С, который состоит из разбавленных
растворов А и В, взятых 1:1.
К 0,1 мл образца белка добавляют 3 мл раствора С. Не
ранее чем через 5 мин и не позднее чем через 1 час измеряют
поглощение при 595 нм – относительно чистого реагента.
Концентрацию белка находят по градуировочному графику (могут быть небольшие отклонения от линейности).
Сопоставление методов определения концентрации белка
приведено в таблице 2.1.
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 2.1
Сравнительная таблица методов определения концентрации белка в растворе
Метод
Принцип метода
Диапазон
определения
Чувствительность
к аминокислотному составу
белка
4
Да
Мешающие вещества
1
Поглощение
в ультрафиолетовой
области
(260 и 280
нм)
2
Поглощение ультрафиолетового излучения ароматическими группами
белка
3
0,1-1
мг/мл
Биуретовый
метод
(обычный)
Образование комплексного соединения ионов меди с
пептидными группами
2-10
мг/мл
Нет
Пептиды, Трис, сахароза и желчные пигменты дают окраску в биуретовой реакции. Соли аммония, Трис, сахароза и
глицерин оказываю влияние на окраску,
даваемую белками. Липиды и детергенты
могут вызывать помутнение
Биуретовый
микрометод
Образование комплексного соединения ионов меди с
пептидными группами
0,1-2
мг/мл
Нет
Те же, что и для обычного биуретового
метода
5
Все вещества, имеющие ароматическую
группу
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Окончание таблицы 2.1
1
Метод Лоури
Метод
Бредфорда
2
Образование окрашенных продуктов
ароматических
аминокислот с реактивом Фолина в
сочетании с биуретовой реакцией на
пептидные связи
Связывание красителя
3
0,025-0,25
мг/мл
4
Да
5
Тирозин, триптофан, фенольные соединения, Трис, HEPES, глицин, цитрат,
гистидин, сахара (глюкоза, сахароза),
глицерин, фикол, поливинилпирролидон, тиольные соединения, восстановители, ЭДТА, сульфат аммония
0,1-1
мг/мл
Да
Сильнощелочные буферы и детергенты,
такие как SDS (додецил сульфат натрия),
и тритон X-100 снижают интенсивность
окраски
12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Лабораторная работа 2.2
КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА БЕЛКИ И АМИНОКИСЛОТЫ
Качественные реакции на белки можно разделить на реакции с основной цепью и на реакции с боковыми группами отдельных аминокислот. Реакции на основную цепь проходят для
всех белков, реакции на отдельные боковые группы зависят от
аминокислотного состава конкретного белка и с некоторыми
белками могут не проходить.
1. Биуретовая реакция на пептидную группу (реакция
Пиотровского). Метод основан на способности пептидной
группы в белках и полипептидах ( -CO-NH- ) образовывать в
щелочной среде с ионами меди комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от
числа пептидных связей в белке. Данная реакция является реакцией на основную цепь белка.
Биуретовая реакция положительна с белками и пептидами, имеющими не менее двух пептидных связей. С ди- и трипептидами она неустойчива.
Биуретовую реакцию дают и небелковые вещества, содержащие не менее двух пептидных групп, например производное мочевины - биурет NH2-CO-NH-CO-NH2, давшее название
этой реакции, и некоторые другие.
В сильнощелочной среде пептидные группы полипептидов переходят в енольную форму, в которой и взаимодействуют
с ионами меди, образуя окрашенный биуретовый комплекс (рис.
2.3).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 2.3. Биуретовая реакция
Реактивы: 1% раствор яичного белка, 1% раствор желатина, 10% NaOH, 1% CuSO4.
Ход работы: Взять три пробирки. В пробирку №1 поместить 5 капель 1% раствора яичного белка, в пробирку №2 поместить 5 капель 1% раствора желатины, в пробирку №3 – 5 капель
раствора воды. Во все пробирки добавить по 5 капель 10% раствора NaOH и по 1 капле 1% раствора CuSO4. Взболтать содержимое пробирок и наблюдать окрашивание. Результаты занести
в таблицу 2.2.
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 2.2
Результаты эксперимента
№ пробирки
1
2
3
Проба
1% раствор
яичного белка
(5 капель)
1% раствор
желатина
(5 капель)
вода (5 капель)
10% NaOH
CuSO4
5 капель
1 капля
5 капель
1 капля
5 капель
1 капля
Окраска
В пробирках 1 и 2 должна развиться фиолетовая окраска,
в пробирке 3 окраска не развивается.
2. Ксантопротеиновая реакция на ароматическое
кольцо аминокислот. Метод основан на способности аминокислот и аминокислотных остатков полипептидов, содержащих
ароматическое кольцо, образовывать при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой динитропроизводные желтого
цвета. В щелочной среде они переходят в хиноидные структуры,
имеющие оранжевое окрашивание. Ксантопротеиновая реакция
характерна для фенилаланина, тирозина, триптофана, имеющих
ароматическое (бензольное) кольцо. Например, в реакции с тирозином образуется динитротирозин; добавление гидроксида
натрия приводит к образованию натриевой соли хиноидной
структуры динитротирозина (рис. 2.4).
OH
OH
O2N
NO2
+2HNO3
-2H2O
H2C
H
C
COOH
H2C
NH2
H
C
COOH
NH2
Тирозин
Желтое нитросоединение
Рис.2.4. Ксантопротеиновая реакция
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Реактивы: 1% раствор яичного белка, 1% раствор желатина, 10% NaOH, концентрированная азотная кислота.
Ход работы: В пробирку №1 поместить 5 капель 1% раствора яичного белка, в пробирку №2 – 5 капель 1% раствора желатины, в пробирку №3 – 5 капель раствора воды. Во все пробирки добавить 3-4 капли концентрированной азотной кислоты
(Осторожно! Не допускать попадания азотной кислоты на кожу!). В пробирках, содержащих белок, выпадает осадок. Все три
пробирки осторожно нагреть на водяной бане 3-5 минут. (В пробирке с яичным белком осадок при нагревании приобретает
желтый цвет). После нагревания на водяной бане пробирки охладить и добавить в них по каплям 10% раствор гидрооксида
натрия до появления в пробирке №1 оранжевого окрашивания.
(Во все пробирки добавить одинаковое количество гидрооксида
натрия). Результаты занести в таблицу 2.3.
Таблица 2.3
Результаты эксперимента
№ пробирки
1
2
3
Проба
1% р-р
яичного
белка
(5 капель)
1% р-р
желатина
(5 капель)
Вода
(5 капель)
Азотная кислота,
конц.
Нагрев
3-4 капли
3-5
мин
3-4 капли
3-5
мин
3-4 капли
3-5
мин
Цвет
осадка
(если
есть)
10%
NaOH
Цвет
раствора
10 или
более
капель
10 или
более
капель
10 или
более
капель
Содержимое пробирки №1 должно стать яркооранжевым. Оранжевая окраска развивается за счет образования
нитросоединений из ароматических аминокислот яичного белка.
В пробирке №2 осадок не желтеет и далее не развивается оранжевая окраска, так как желатин почти не содержит ароматических аминокислот. Сравните с биуретовой реакцией: биурето16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
вая реакция положительна для любого белка, прохождение
ксантопротеиновой реакции зависит от аминокислотного состава белка.
3. Реакции на триптофан. Триптофан, реагируя в кислой среде с альдегидами, образует окрашенные продукты конденсации. Например, с глиоксиловой кислотой (являющейся
примесью к концентрированной уксусной кислоте) реакция протекает по уравнению, приведенному на рис. 2.5.
Рис.2.5. Реакция Адамкевича
По аналогичной схеме протекает также реакция триптофана с оксиметилфурфуролом или формальдегидом.
В указанных реакциях принимает участие серная кислота, являющаяся водоотнимающим средством.
Реакция Адамкевича. Реактивы: а) свежий яичный белок
(неразбавленный); б) желатин, 1% раствор; в) уксусная кислота,
концентрированная; г) серная кислота, концентрированная.
Ход работы: реакция проводится под тягой!
В пробирку №1 налить несколько капель неразбавленного яичного белка, прибавить 1-2 мл концентрированной уксус17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ной кислоты (лучше ледяной) и осторожно нагреть до растворения выпавшего осадка, после чего охладить и (осторожно!) по
стенке пробирки, наклонив ее, наслоить 1 мл концентрированной серной кислоты, следя, чтобы не произошло смешения жидкостей. На границе двух слоев через некоторое время появляется
красно-фиолетовое кольцо.
Эту же реакцию проделать в пробирке 2 с раствором желатина - окрашивания не наступает, так как триптофан не входит в состав желатина. Результаты занести в таблицу 2.4.
Таблица 2.4
Результаты эксперимента
№ пробирки
Белок
1
2
Яичный
белок
5 капель
1% раствор
желатина
5 капель
Ледяная
уксусная
кислота
Нагрев до
растворения
осадка
Серная
кислота,
конц.
(осторожно,
по стенке)
1-2 мл
+
1 мл
1-2 мл
+
1 мл
Окрашивание
на границе
раздела
4. Реакция на аминокислоты, содержащие серу (цистеин, цистин). Известны три серосодержащие аминокислоты:
цистеин, цистин и метионин.
В молекулах цистеина и цистина сера связана относительно слабо и легко отщепляется при щелочном гидролизе в
виде сероводорода, который реагирует со щелочью, образуя
сульфиды натрия или калия. Сульфиды взаимодействуют с уксуснокислым свинцом (вернее, с плюмбитом) с образованием
осадка сернистого свинца черного или буро-черного цвета (рис.
2.6).
18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 2.6. Схема качественной реакции
на аминокислоты, содержащие серу
Реактивы: а) раствор яичного белка б) желатин, 1% раствор; в) NaOH, 15-20% раствор; г) уксуснокислый свинец, 1%
раствор.
Ход работы: в пробирку №1 налить 2 мл раствора яичного белка, в пробирку №2 - столько же раствора желатина. В обе
пробирки добавить по 1-1,5 мл раствора щелочи и осторожно
нагреть до кипения, кипятить 1-2 мин, после чего в каждую пробирку прибавить по 2-3 капли раствора уксуснокислого свинца.
В пробирке с яичным белком появляется буровато-черное
или черное окрашивание, интенсивность которого зависит от
концентрации раствора белка и содержания в нем цистеина и
цистина. Раствор желатина окрашивания не дает. Это свидетельствует о том, что в состав желатина не входят серосодержащие
аминокислоты.
Результаты занести в таблицу 2.5.
19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 2.5
Результаты эксперимента
№
пробирки
1
2
Белок
2 мл
яичного
белка
2 мл 1%
раствора
желатина
NaOH
15%
Нагрев на
водяной
бане
Уксуснокислый
свинец 1%
1,5 мл
3-4 мин
3 капли
1,5 мл
3-4 мин
3 капли
Окраска
Лабораторная работа 2.3
ИССЛЕДОВАНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ
РАСТИТЕЛЬНОГО МАТЕРИАЛА МЕТОДОМ ХРОМАТОГРАФИИ НА БУМАГЕ
Метод хроматографии на бумаге используется для разделения смесей разнообразных органических веществ. Разделение
веществ происходит вследствие различия в распределении их
между двумя жидкими фазами, одна из которых подвижна, а
другая – нет. Неподвижная фаза – вода - удерживается твердым
носителем (в данном случае бумагой), не вступая с ним во взаимодействие. Нанесенные на бумагу вещества переходят в подвижную фазу (органический растворитель), и перемещаясь с
различными скоростями по бумажным капиллярам, разделяются. Скорость передвижения определяется показателем Rf, представляющим отношение величины смещения зоны вещества (X)
к смещению фронта растворителя (Xf) (рис.2.7). Для однотипных веществ при постоянных условиях величина Rf является
ориентиром, позволяющим их идентифицировать. Чем больше
различие в величинах Rf разделяемых веществ, тем лучше их
разделение.
20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Rf=X/Xf
Рис.2.7. Определение Rf вещества. 1 – расположение
вещества на хроматограмме
Оборудование и реактивы: спирт этиловый 70%, смесь
растворителей (н-бутанол : уксусная кислота : вода (в соотношении 12:3:5 соответственно)), растворы аминокислотстандартов (ала, лей, глу, вал, гли, сер), сухой растительный материал для экстракции, 1% раствор HCl; водяная баня, фарфоровые чашки (средние и маленькие), хроматографические камеры
(стаканы соответствующих размеров), хроматографическая бумага, фильтровальная бумага, микропипетки, пипетки, колбы на
50 мл, воронки средние, фильтры, цилиндры мерные, стеклянные палочки, препаровальные иглы с кусочками резины, линейки, весы технические, стаканчики на 50 мл, штативы, пинцеты,
иголки швейные, нитки.
Ход работы: Экстракция: 0.5 г растительного материала
помещают в колбу на 50 мл, заливают 10 мл 70% этилового спирта
и ставят на водяную баню, разогретую до 70-80 0C, на 5 мин. Полученную вытяжку фильтруют через бумажный фильтр в выпарительную чашку, при этом следует стремиться, чтобы частички
материала на фильтр не попадали, поскольку далее этот матери21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ал аналогичным способом экстрагируют еще дважды. При
фильтровании после последней экстракции на фильтр можно перенести все содержимое колбы. Выпарительную чашку помещают
на кипящую водяную баню и выпаривают спирт досуха.
Хроматография. Лист хроматографической бумаги необходимого размера кладут на рабочее место, подложив снизу
лист чистой бумаги. (Размер листа хроматографической бумаги
определяется размерами имеющейся хроматографической камеры.) Отступив 2 см от края узкой стороны, проводят простым
карандашом линию старта. Затем линию старта размечают короткими штрихами: отступив 1,5 см от края, делают первую отметку, следующую через 2,5 см, затем через 2 см и так далее, чередуя отрезки 2,5 и 2 см. Всего 2,5 отрезков должно быть пять.
На три отрезка в 2,5 см будем наносить растворы известных
аминокислот - стандартов. На каждый из отрезков - по две аминокислоты: 1 - глу, ала; 2 - вал, гли; 3 - сер, лей. Аминокислоты
предварительно попарно растворяют на часовом стекле. Для
этого на соответствующее часовое стекло берем по 3-6 мг каждой аминокислоты (несколько кристаллов на кончике стеклянной палочки) и приливаем 1 мл 1% раствора HСl. Перемешивают до растворения. На два отрезка линии старта наносится полученный экстракт. Сухой остаток в выпарительной чашке растворяют в 0,6 мл 1% растворе HCl, тщательно соскабливая его
со стенок кусочком резинки, наколотым на препаровальную иглу. Подготовив исследуемый раствор и стандарты, приступаем к
нанесению. Несколько выше линии старта под хроматограмму
подкладывают линейку или пипетку, добиваясь того, чтобы линия старта не касалась подложки. Для нанесения используем
стандартные микропипетки на 0,1 или 0,2 мл. Все стандарты наносим в количестве 0,01 мл, пробу – 0,01 и 0,02 мл. Набираем в
микропипетку необходимый раствор в нужном объеме и, приведя ее в соприкосновение с началом соответствующего 2,5 см
участка, аккуратно ведем ее до конца. Скорость движения пипетки должна быть такой, чтобы весь объем раствора распределился в интервале 2,5 см в виде ровной полосы. После подсыха22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ния линии старта хроматограмму подвешивают в стакане, в который до соответствующего уровня налита смесь растворителей
так, чтобы нижняя часть хроматограммы была погружена в
смесь растворителей. Сверху стакан закрывается другим, большим, стаканом, чтобы создать насыщенную атмосферу паров
растворителей (рис. 2.8).
Рис. 2.8. Устройство системы для бумажной
хроматографии
При достижении фронтом растворителя положения около
верхнего края хроматограммы, ее вынимают и сушат в сушильном шкафу, предварительно обозначив карандашом позицию,
которой достиг фронт растворителя.
Проявление хроматограммы и идентификация аминокислот. Оборудование и реактивы: раствор нингидрина (0,25%
мас./об.), фарфоровая чашка, стеклянные трубки с ватой, ножницы, линейки, таблицы со значениями Rf.
Ход работы. Высушенную хроматограмму проявляют
0,25% (мас./об.) раствором нингидрина в ацетоне, равномерно
смачивая этим раствором ее поверхность. Для этого используется
кисточка из ваты или пульверизатор. При проявлении нельзя
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
класть хроматограмму на стол, она должна находиться «на весу».
Нельзя браться за смоченную поверхность руками, остаются отпечатки пальцев. Пропитанную хроматограмму помещают в сушильный шкаф на 15 мин при 70 0C. Аминокислоты обнаруживаются в виде сине-фиолетовых пятен. Пролин образует с нингидрином соединение желтого цвета. Идентификацию аминокислот
проводят по совпадению на хроматограмме положения аминокислот пробы и аминокислот-стандартов. Аминокислоты, располагающиеся на одном уровне, являются идентичными. В разделенных парах стандартов ближними к старту будут глу, гли,
сер. Определение аминокислот можно осуществить и по значению Rf. Для этого измеряют с точностью до миллиметра расстояние от линии старта до линии фронта растворителя (если
растворитель дошел до самого верха хроматограммы, то это
верхний край хроматограммы). С такой же точностью измеряют
расстояние от старта до центра цветового пятна идентифицируемой аминокислоты. Отношение последнего расстояния к
первому дает значение Rf для данной аминокислоты в данном
растворителе. В справочной литературе содержатся сведения по
коэффициентам Rf для многих веществ, разделяемых в различных системах растворителей. В настоящей работе, кроме идентификации аминокислот пробы по стандартам, необходимо определить в пробе три аминокислоты, для которых стандарты не
наносились, по Rf. Значения Rf имеются в справочнике по биохимии.
Лабораторная работа 2.4
ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКОВ
Денатурация белка – нарушение уникальной третичной
структуры белка, сопровождающееся изменением его физикохимических свойств и потерей биологической активности.
Денатурирующие агенты и воздействия:
1. Высокая температура.
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. Сильные минеральные кислоты и основания. Разрушают ионные мостики и придают молекуле белка сильный заряд, который дестабилизирует структуру.
3. Хаотропные агенты (мочевина). Данные агенты влияют
на структуру воды и нарушают гидрофобные взаимодействия.
Действуют в достаточно высокой концентрации, например мочевина – при концентрации 7 моль/литр.
4. Ионные детергенты. Образуют с полипептидной цепью
мицеллы.
5. Соли тяжелых металлов.
6. Органические растворители.
Денатурированный белок может выпадать в осадок. Будет ли белок выпадать в осадок при денатурации, зависит от условий и от природы денатурирующего воздействия.
1. Денатурация белка сульфатом меди. Реактивы: 1%
раствор CuSO4 , 1% раствор яичного белка.
Ход работы: к 1 мл 1% раствора яичного белка добавляют 1-2 капли раствора сульфата меди. Образуется осадок, который не растворяется при добавлении избыточного количества
воды.
2. Денатурация белка азотной кислотой. В пробирку
наливают 1 мл концентрированной азотной кислоты и осторожно, наклонив пробирку, по краю наслаивают 1 мл 1% раствора
яичного белка. На границе двух слоев жидкости образуется белое кольцо белкового осадка.
3. Тепловая денатурация. Подготовить растворы в четырех пробирках согласно таблице 2.6.
25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 2.6
№
пробирки
Результаты эксперимента
1% раствор
яичного
белка
Добавить
1
10 капель
-
2
10 капель
1 капля 0,2 М раствора
уксусной кислоты
3
10 капель
1 капля конц. (ледяной)
уксусной кислоты
4
10 капель
1 капля 10% раствора
NaOH
Условия
Наблюдаемый
эффект
Нагрев
до 100 оС
на кипящей водяной
бане
Нагрев
до 100 оС
на кипящей водяной
бане
Нагрев
до 100 оС
на кипящей водяной
бане
Нагрев
до 100 оС
на кипящей водяной
бане
Ожидаемый эффект в пробирке №1 - помутнение раствора. Белок денатурирует и денатурированные молекулы белка
объединяются в более крупные частицы (от этого раствор мутнеет), но заряд белковых молекул препятствует выпадению интенсивного осадка.
Ожидаемый эффект в пробирке №2 – образование плотного осадка, так как разбавленная кислота нейтрализует заряд
белковых молекул.
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ожидаемый эффект в пробирке №3 – отсутствие осадка,
так как концентрированная кислота придает денатурированным
молекулам белка положительный заряд, который не дает им ассоциировать.
Ожидаемый эффект в пробирке №4 - отсутствие осадка,
так как концентрированная щелочь придает денатурированным
молекулам белка отрицательный заряд, который не дает им ассоциировать.
Лабораторная работа 2.5
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКОЙ ТОЧКИ БЕЛКА
(ИЭТ)
Молекулы белков содержат аминокислоты, которые могут приобретать положительные и отрицательные заряды. Заряд,
который приобретают конкретные аминокислоты, зависит от
кислотности среды. Поэтому молекула белка в целом также
имеет суммарный заряд, зависящий от кислотности среды. При
сдвиге pH в кислую сторону, молекула белка приобретает
больший по значению суммарный положительный заряд, а при
сдвиге pH в щелочную сторону молекула белка приобретает
больший по значению суммарный отрицательный заряд. При
этом для каждого конкретного белка имеется такое значение pH,
при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю
(рис. 2.9). Это значение pH называется изоэлектрической точкой
(ИЭТ) данного белка. Изоэлектрическая точка конкретного белка определяется его аминокислотным составом. Изоэлектрическая точка является важной характеристикой индивидуального
белка. Белки могут быть физически разделены по их изоэлектрическим точкам (метод изоэлектрофокусирования).
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 2.9. Изоэлектрическая точка белка
При pH раствора, равной изоэлектрической точке какоголибо белка, данный белок проявляет повышенную склонность к
выпадению в осадок, так как нулевой суммарный заряд белковых молекул позволяет им легче агрегировать (если pH не равна
изоэлектрической точке белка, все молекулы данного белка
имеют одноименный заряд и, соответственно, отталкиваются).
Большая склонность белка к осаждению при pH, равной
изоэлектрической точке белка, может быть использована для
экспериментального определения изоэлектрической точки. В
данной работе будет использована серия буферов с определенной pH, в которые будет добавлен раствор белка и осаждающий
агент – этанол. В тех пробирках, где pH буфера будет наиболее
близок к изоэлектрической точке белка, помутнение раствора/образование осадка будет максимальным.
Ход работы: приготовить серию буферов в пробирках
согласно столбцам 1-3 таблицы 2.7, приведенной ниже. Добавить раствор белка (1% яичный белок или 1% казеин) в каждую
пробирку. Добавить осадитель (этиловый спирт) в каждую пробирку. Зафиксировать пробирку, в которой мутность после добавления осадителя будет максимальной. Основным компонентом яичного белка является белок яичный альбумин. Поэтому в
случае добавления в качестве исследуемого белка 1% яичного
28
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
белка максимальная мутность будет развиваться при pH, равной
изоэлектрической точке яичного альбумина.
Таблица 2.7
1
2
3
4
5
6
1,9
1,8
1,4
1,0
0,6
0,2
0,1
0,2
0,6
1,0
1,4
1,8
Раствор
белка,
капли
3,4
3,8
4,4
4,7
5,1
5,7
20
20
20
20
20
20
Степень
мутности
(0 - +++)
Добавление спирта, мл
pH смеси
№ пробирки
Результаты эксперимента
Состав буферной смеси,
мл
0,2 н
0,2 н
CH3COOH CH3COONa
Степень
мутности
после
добавления
спирта
(0 - +++)
2
2
2
2
2
2
Выполнив эксперимент согласно таблице, воспроизведите таблицу в тетради, заполните ее и проанализировав, определите значение изоэлектрической точки исследуемого белка.
29
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3. УГЛЕВОДЫ. МОНОСАХАРИДЫ
Моносахариды представляют собой полигидроксиальдегиды и полигидроксикетоны, которые называются соответственно альдозами и кетозами.
Все альдозы дают характерные реакции на альдегиды.
По числу атомов углерода в молекуле (обычно оно равно
числу атомов кислорода), среди моносахаридов различают триозы, тетрозы, пентозы, гексозы, гептозы и т.д. К этим названиям
при построении названий моносахаридов присоединяют функциональную приставку (альдо- или кето-) (рис. 3.1).
Рис. 3.1. Структурные формулы альдоз и кетоз
Все моносахариды оптически активны, поскольку в их
молекулах имеются асимметрические атомы углерода. Число
асимметричных атомов углерода в моносахариде растет по мере
удлинения цепи. В зависимости от того, где расположена группа
-ОН y предпоследнего атома С в углеродной цепи, изомерные
углеводы будут D - и L-соединениями (рис. 3.2).
30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис.3.2. Оптические изомеры
Моносахариды существуют в открытой (ациклической) и
закрытой (циклической) таутомерных формах. Поэтому структурные формулы сахаридов изображают двояко (рис. 3.3).
Рис. 3.3. Структурные формулы сахаридов
Углеводы с шестичленными циклами называются пиранозами, а углеводы с пятичленными циклами - фуранозами (от
наименования соответствующих гетероциклических систем пиран и фуран) (рис. 3.4).
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 3.4. Циклические пространственные формулы
моносахаридов
Гидроксил, образующийся в результате циклизации, называется полуацетальным (рис. 3.5). Полуацетальный гидроксил
резко отличается по свойствам от других гидроксильных групп
молекулы. Он легко может замещаться на другие нуклеофильные группировки, в результате чего образуются различные производные сахаров.
Рис.3.5. Полуацетальный гидроксил
32
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Лабораторная работа 3.1
ХАРАКТЕРНЫЕ РЕАКЦИИ НА УГЛЕВОДЫ
Реакция Молиша с α-нафтолом. При взаимодей1.
ствии пентоз и гексоз с концентрированной серной кислотой образуются соответственно фурфурол и оксиметилфурфурол, которые с α-нафтолом дают бесцветное лейкосоединение. Это
лейкосоединение окисляется серной кислотой в окрашенное хиноидное соединение.
Реактивы: а) глюкоза, фруктоза и сахароза, 1% растворы;
б) 10% спиртовой раствор α-нафтола (реактив Молиша), концентрированная серная кислота.
Ход работы: проведите реакцию в 4 пробирках в соответствии с таблицей 3.1 и отразите в ней результаты.
Таблица 3.1
Результаты эксперимента
№ пробирки
Сахар
1
2
3
4
Глюкоза 1%
10 капель
Фруктоза 1%
10 капель
Сахароза 1%
10 капель
Вода
10 капель
Спиртовый
раствор
α-нафтола
(реактив
Молиша)
2 капли
Концентрированная
серная кислота (добавлять осторожно,
по стенке)
2 капли
20 капель
2 капли
20 капель
2 капли
20 капель
Результат
(окраска
границы
раздела
жидкостей)
20 капель
2. Реакция Селиванова на кетогексозы. При нагревании
фруктозы (и других кетогексоз) с соляной кислотой образуется
оксиметилфурфурол, который с резорцином дает соединение,
окрашенное в вишнево-красный цвет (ксантеновый краситель).
С альдогексозами реакция протекает очень медленно, на осно-
33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
вании чего можно считать реакцию Селиванова специфичной
для кетогексоз.
Реактивы: а) глюкоза, фруктоза и сахароза, 1% растворы;
б) реактив Селиванова: 0,05 г резорцина растворяют в 100 мл
20% соляной кислоты.
Ход работы: к 20 каплям реактива Селиванова прибавить
1-2 капли раствора сахара и нагревать в кипящей водяной бане
не более 1 мин. Проведите реакции в четырех пробирках в соответствии с таблицей 3.2 и занесите в нее результаты.
Таблица 3.2
Результаты эксперимента
№ пробирки
Реактив
Селиванова
(р-р резорцина в
соляной к-те)
1
20 капель
2
20 капель
3
20 капель
4
20 капель
Сахар
2 капли
1% р-ра
глюкозы
2 капли
1% р-ра
фруктозы
2 капли
1% р-ра
сахарозы
2 капли воды
Нагрев на
кипящей
водяной бане
Результат
(окраска)
1 минута
1 минута
1 минута
1 минута
Для кетогексоз появляется вишнево-красное окрашивание.
Реакция считается положительной, если окрашивание появляется через 30-60 с. При более длительном нагревании возможна изомеризация альдоз в кетозы.
3. Реакция с реактивом Фелинга. Реактив Фелинга является медным алкоголятом сегнетовой соли. Редуцирующие
сахара при кипячении с фелинговым реактивом восстанавливают его до закиси меди.
34
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
№
пробирки
Реактивы: а) глюкоза, фруктоза и сахароза, 1% растворы; б) реактив Фелинга. Готовят два раствора: раствор I : в мерной колбе емкостью 500 мл растворяют 34,64 г сернокислой меди (CuSO4-5H2O) и доводят водой до метки; раствор II : в 200250 мл воды растворяют 173 г сегнетовой соли (COOK - СНОН СНОН - COONa*4H2O). Раствор количественно переносят в
мерную колбу на 500 мл. Сюда же вливают раствор 50 г едкого
натра в 100 мл воды и доводят водой до метки. Растворы хранят
раздельно. Непосредственно в момент употребления смешивают
равные объемы первого и второго растворов.
Ход работы: к 10 каплям 1% раствора сахара добавить
равный объем реактива Фелинга (5 капель раствора I и 5 капель
раствора II) и нагревать на водяной бане. С восстанавливающими сахарами выпадает красный осадок закиси меди.
Проведите реакции в четырех пробирках в соответствии с
таблицей 3.3 и занесите в нее результаты. Интенсивность осадка
оцените в баллах от 0 до 3.
Таблица 3.3
Результаты эксперименты
1
2
3
4
Сахар
10 капель
1% р-ра
глюкозы
10 капель
1% р-ра
фруктозы
10 капель
1% р-ра
сахарозы
10 капель воды
Р-р Фелинга
(F1 + F2))
Нагрев на
кипящей
водяной
бане
10 капель
4-5 мин
10 капель
4-5 мин
10 капель
4-5 мин
10 капель
4-5 мин
Результат
(интенсивность
и цвет осадка)
Реакция с реактивом Фелинга широко используется при
количественном определении содержания редуцирующих сахаров в животных и растительных тканях.
35
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Лабораторная работа 3.2
ПОЛИМЕРЫ ГЛЮКОЗЫ - ЦЕЛЛЮЛОЗА И КРАХМАЛ
Целлюлоза является природным полимером, выполняющим у растений структурную функцию. Мономером целлюлозы
является глюкоза, до которой целлюлоза может быть гидролизована либо с помощью кислот и щелочей, либо с помощью ферментов – целлюлаз. Крахмал также состоит из остатков глюкозы. Однако в целлюлозе остатки глюкозы находятся в β-Dконформации, а в крахмале – в α-D-конформации. Это определяет различные физико-химические свойства целлюлозы и
крахмала. В данной работе мы путем кислотного гидролиза
крахмала и целлюлозы покажем, что оба этих полимера состоят
из остатков глюкозы.
1. Гидролиз целлюлозы. Реактивы: а) вата (источник
целлюлозы); б) 72% серная кислота (3:1 с водой); в) реактив Фелинга (для приготовления реактива Фелинга и проведения реакции Фелинга (лаб. раб. 3.1); г) Na2CO3 кристаллический.
Ход работы:в пробирку поместить кусочек ваты, залить
его 72% серной кислотой (около 1 мл). После полного растворения (около 15-20 минут) раствор осторожно развести водой в 1015 раз и поставить на кипящую водяную баню на 30 минут. После этого раствор охладить, отобрать 2-3 мл гидролизата, нейтрализовать его добавлением Na2CO3 до прекращения выделения пузырьков. С нейтрализованным гидролизатом проводят
реакцию Фелинга. Положительная реакция Фелинга свидетельствует о том, что при гидролизе образуется восстанавливающий
сахар – глюкоза.
Гидролиз крахмала. Реактивы: а) раствор крах2.
мала 1%; б) 40% серная кислота; в) реактив Фелинга; г) Na2CO3
кристаллический.
Ход работы: смешать 5 мл 1% раствора крахмала и 2-3
мл 40% серной кислоты. Нагревать на водяной бане 20 минут.
Отобрать 10 капель, нейтрализовать Na2CO3 до прекращения
появления пузырьков, добавить каплю йода. Если йод не меняет
36
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
окраску – гидролиз прошел. Из пробирки отобрать еще 10 капель раствора, нейтрализовать его Na2CO3 до прекращения появления пузырьков, провести реакцию Фелинга. Положительная
реакция Фелинга свидетельствует о том, что при гидролизе образуется восстанавливающий сахар – глюкоза.
3. Растворение целлюлозы Реактивы: а) вата (источник
целлюлозы); б) реактив Швейцера (аммиачный раствор гидрооксида меди). Приготовление реактива Швейцера: 10 г сульфата
меди растворяют в 100 мл воды, приливают раствор едкого натра в достаточном для осаждения гидрата окиси меди количестве, собирают последний на фильтре и промывают водой до исчезновения реакции на сульфаты. Влажный осадок растворяют в
минимальном количестве раствора аммиака, необходимом для
полного растворения осадка; в) серная кислота, концентрированная.
Ход работы: в пробирку налить 4-5 мл реактива Швейцера, погрузить в него небольшой кусочек ваты и помешивать
содержимое стеклянной палочкой до растворения. Получается
прозрачная густая вязкая жидкость. Влить тонкой струей полученный раствор целлюлозы в стеклянный стакан с 50 мл теплой
воды, подкисленной 2-3 мл концентрированной серной кислоты.
Целлюлоза при этом выделяется из раствора в виде нитей.
37
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4. ФЕРМЕНТЫ
Ферменты являются биологическими катализаторами.
Почти все ферменты – белки. (На сегодняшний день известно
небольшое число молекул РНК, обладающих каталитической
активностью). Подавляющее большинство реакций, происходящих в организме, катализируется ферментами. Также ферменты
все шире применяются в промышленности в качестве катализаторов различных химических реакций.
Общие свойства ферментов как катализаторов:
1.
Ферменты не сдвигают равновесия реакции
Ферменты снижают энергию активации для ката2.
лизируемых ими реакций.
Особые свойства ферментов как катализаторов:
1.
Высокая каталитическая активность. Ферменты
ускоряют реакции, по крайней мере, в миллион раз.
2.
Высокая специфичность.
3.
Стереоспецифичность.
4.
Лабильность – чувствительность к условиям среды (температуре, рН и др. денатурирующим воздейстиям)
5.
Активность ферментов может регулироваться.
Лабораторная работа 4.1
ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ
1. Ферментативный гидролиз крахмала амилазой слюны. Реактивы: а) разведенная 1:10 слюна (для исследования активности амилазы слюны и ее свойств используют собственную
слюну, разведенную в 10 раз. Для этого в мерную пробирку собирают 1 мл слюны (предварительно полость рта споласкивают
водой) и доводят водой до метки 10 мл.); б) раствор крахмала
1%; в) раствор йода с иодидом калия (аптечный).
38
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ход работы: смешайте 4 мл разведенной 1:10 слюны
и 4 мл 1% раствора крахмала. Поместите пробирку в термостат
на 38 оС. Сразу отберите 5 капель смеси и добавьте 1 каплю раствора йода. Немедленно запишите окраску. Затем из инкубирующейся при 38 оС смеси крахмала и слюны отбирайте по 5
капель каждую минуту. Сразу добавляйте к отобранной пробе
каплю раствора йода и фиксируйте окраску. Продолжайте отбирать пробы в течение 10-15 минут. Результаты занесите в таблицу 4.1.
Таблица 4.1
Результаты эксперимента
Время, минут
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
Окраска пробы с раствором йода
Сначала окраска должна быть темно-синей, так как крахмал еще не гидролизован. По мере прохождения реакции окраска будет меняться.
2. Определение термолабильности амилазы слюны.
Реактивы: а) разведенная 1:10 слюна (для исследования активности амилазы слюны и ее свойств используют собственную слюну, разведенную в 10 раз. Для этого в мерную пробирку собирают
1 мл слюны (предварительно полость рта споласкивают водой) и
доводят водой до метки 10 мл); б) раствор крахмала 1%; в) раствор
йода с иодидом калия (аптечный); г) реактив Фелинга (лаб. раб.
3.1).
39
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Проведите реакцию согласно описанию в приведенной
таблице 4.2. Зафиксируйте в таблице результаты. Сделайте выводы, как влияет на активность фермента его тепловая обработка.
Таблица 4.2
Результаты эксперимента
Количество реагента, капель
Реагенты, условия опытов
Пробирка
№1
Опыт 1
Пробирка
№2
Опыт 2
Пробирка №3
Контроль
Слюна, 1:10
10
-
-
Кипяченая слюна (кипятить 2 мл
разведенной 1:10 слюны
5-8 мин, охладить)
10
Н20
-
-
10
Крахмал, 1%
10
10
10
Термостат, 38° С, 10 мин
Реакция с йодом (5 капель раствора из пробирки + 1 капля I2 в
KI), записать окраску
Реакция Фелинга* (Интенсивность осадка оценить в баллах от
0 до 3)
Вывод:
*Для проведения реакции Фелинга 5 капель содержимого каждой пробирки
переносят в отдельную пробирку и смешивают с 5 каплями раствора Фелинга
(раствор Фелинга готовят заранее, смешивая компоненты F1 и F2), затем нагревают на кипящей водяной бане 3-5 минут и наблюдают интенсивность
осадка.
40
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Лабораторная работа 4.2
СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ.
ИНГИБИТОРЫ И АКТИВАТОРЫ
Специфичность действия ферментов. Это одно из важнейших свойств ферментов, которое в значительной степени отличает их от других катализаторов. Каждый фермент воздействует лишь на определенное вещество или группу веществ, близких по своей структуре. Различают следующие виды специфичности: а) абсолютную, когда ферменты катализируют лишь одну реакцию превращения какого-либо вещества. Например,
уреаза (карбамид - амидогидролаза) катализирует только реакцию гидролитического расщепления мочевины до аммиака и
двуокиси углерода; б) групповую, когда ферментом катализируются реакции превращения близких по своей структуре веществ,
построенных по одному типу. Так, сахараза катализирует реакцию гидролитического расщепления сахарозы с освобождением
молекул глюкозы и фруктозы, но тот же фермент катализирует
также реакцию частичного гидролиза трисахарида рафинозы,
при которой освобождается лишь молекула фруктозы, а связь
между галактозой и глюкозой остается ненарушенной; в) стереохимическую, которая проявляется в том, что фермент катализирует реакцию расщепления или синтеза только одного из стереоизомеров, не воздействуя на другой. Окисление Lмолочной кислоты до пировиноградной катализируется ферментом лактатдегидрогеназой, тогда как тот же процесс для
D-молочной кислоты катализируется другим ферментом —
D-лактатдегидрогеназой.
Специфичность ферментов является важным свойством
для применения их в технологических процессах, поскольку позволяет избирательно катализировать реакции определенных
веществ в смеси для получения только необходимых продуктов.
Кроме того, стереоспецифичность ферментов позволяет избирательно катализировать реакции отдельных стереоизомеров од-
41
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ного и того же вещества, что крайне важно для пищевой и фармацевтической промышленности.
1. Выявление специфичности амилазы слюны. Реактивы: а) слюна, разведенная в 5 раз дистиллированной водой (препарат фермента амилазы); б) фильтрат дрожжей (препарат фермента сахаразы); в) сахароза, 1% раствор; в) крахмал, 1% раствор; г) компоненты реактива Фелинга.
Ход работы: Приготовить разведение слюны в 5 раз (1 мл
слюны + 4 мл воды).
В четырех пробирках смешать реагенты согласно приведенной таблице 4.2. Все смеси инкубировать в термостате при
температуре 37 оС в течение десяти минут. После этого с помощью реакции Фелинга определить появление редуцирующих
сахаров – продуктов гидролиза как крахмала, так и сахарозы.
При гидролизе крахмала образуется восстанавливающий моносахарид глюкоза, а при гидролизе сахарозы – восстанавливающие моносахариды глюкоза и фруктоза. Крахмал и сахароза сами не восстанавливают реактив Фелинга. Для проведения реакции Фелинга 5 капель содержимого каждой пробирки перенести
в отдельную пробирку и смешать с 5 каплями раствора Фелинга
(раствор Фелинга готовят заранее, смешивая компоненты F1 и
F2), затем нагреть на кипящей водяной бане 3-5 минут и наблюдать интенсивность осадка. Интенсивный осадок указывает на
образование редуцирующих сахаров. Результаты заносят в таблицу 4.2. В опыте 1 реакция Фелинга должна быть положительна, так как амилаза гидролизует крахмал. В опыте 2 реакция
Фелинга должна быть отрицательна, так как амилаза не гидролизует сахарозу. В опыте 3 реакция Фелинга должна быть отрицательна, так как сахараза не гидролизует крахмал, в опыте №4
реакция Фелинга должна быть положительна, так как сахараза
гидролизует сахарозу.
42
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 4.2
Результаты эксперимента
Реагенты, условия опытов
Количество реагента, капель
Опыт 1
Опыт 2
Опыт З
Опыт 4
Слюна (амилаза)
5
5
-
-
Фильтрат дрожжей (сахараза)
-
-
5
5
Крахмал, 1%
10
-
10
-
Сахароза, 1%
-
10
-
10
Инкубация при 37° С, 10 мин
Реакция Фелинга*
Прохождение реакции
Фелинга
(интенсивность осадка).
(Интенсивность осадка
оценить в баллах от 0
до 3)
Вывод:
*Для проведения реакции Фелинга 5 капель содержимого каждой пробирки
переносят в отдельную пробирку и смешивают с 5 каплями раствора Фелинга (раствор Фелинга готовят заранее, смешивая компоненты F1 и F2), затем
нагревают на кипящей водяной бане 3-5 минут и наблюдают интенсивность
осадка.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2.
Влияние ингибиторов и активаторов на активность амилазы. Активность ферментов меняется под действием
активаторов и ингибиторов. Ингибиторы уменьшают активность
ферментов, а активаторы – увеличивают. Явление ингибирования ферментов весьма важно для технологии, так как при применении ферментов в технологических процессах приходится
заботиться о том, чтобы в реакционной смеси не было ингибиторов. С другой стороны, ингибиторы и активаторы ферментов
широко используются в медицине в качестве лекарственных
средств. Например, многие антибактериальные препараты – ингибиторы бактериальных ферментов, жизненно важных для бактерий. Действие ингибиторов можно наблюдать как в реакционных смесях, так и непосредственно в живых тканях, если ингибиторы способны туда проникнуть. В данной работе на простейших примерах будет показано действие ингибиторов на
ферменты.
Реактивы: а) Разведенная 1:10 слюна (для исследования
активности амилазы слюны и ее свойств используют собственную слюну, разведенную в 10 раз. Для этого в мерную пробирку
собирают 1 мл слюны (предварительно полость рта споласкивают
водой) и доводят водой до метки 10 мл); б) раствор крахмала 1%;
в) раствор йода с иодидом калия (аптечный).
Ход работы: приготовить реакционные смеси и провести
реакцию в соответствии с таблицей 4.3. Записать результаты в
таблицу. Сделать вывод: какие из тестируемых веществ ингибируют или активируют амилазу.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 4.3
Результаты эксперимента
Количество реагента
Реагенты,
условия опытов
Пробирка №1
Опыт1
Пробирка №2
Опыт 2
Пробирка №3
Контроль
1,0
1,0
1,0
Н2О, капель
-
-
2
NaCl, 1%, капель
2
-
-
CuSO4, 1%, капель
-
2
-
Крахмал, 1%, капель
5
5
5
Слюна, 1:10, мл
Инкубация 5 минут
Раствор йода с
иодидом калия,
капель
1
1
Результат, окраска
Вывод:
45
1
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5. ЛИПИДЫ
Лабораторная работа 5.1
ОМЫЛЕНИЕ ЛИПИДОВ
Омыляемые липиды состоят из какого-либо спирта и остатков жирных кислот. Жирные кислоты могут быть получены в
свободном виде с помощью реакции гидролиза (омыления). Растворимые соли жирных кислот называются мылами.
1.Гидролиз (омыление) жиров. Реактивы: а) растительное масло или животный жир; б) KOH, 30% спиртовой раствор;
в) дистиллированная вода.
Ход работы: В широкую пробирку внести 0,5 мл растительного масла или около 0,5 г животного жира и добавить 10 мл
30% спиртового раствора KOH. Пробирку закрыть пробкой с воздушным холодильником и нагревать на кипящей водяной бане в
течение 30 мин., после чего в пробирку налить горячую воду и
растворить в ней мыло.
2. Выделение свободных жирных кислот. Реактивы:
а) раствор мыла (лаб.раб.2.1); б) раствор соляной кислоты (1:1
по объему с водой).
Ход работы: к 5 мл раствора мыла добавить 1 - 2 мл раствора соляной кислоты. При взаимодействии сильной кислоты с
мылом выделяются свободные жирные кислоты, которые
всплывают на поверхность жидкости.
3. Образование нерастворимых мыл. Кальциевые и магниевые соли жирных кислот нерастворимы в воде.
Реактивы: а) раствор мыла (лаб.; б) хлористый кальций,
5 - 10% раствор.
Ход работы: к 2 - 3 мл раствора калийного мыла добавить 1 мл раствора хлористого кальция. Выпадает нерастворимый в воде осадок стеарата кальция.
46
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4. Свойства мыла как эмульгатора. Реактивы и оборудование: а) раствор мыла; б) нефть; в) вода; г) плотно закрывающиеся колбы.
Ход работы: в первую колбу поместить 1 часть нефти и 9
частей раствора мыла, во вторую – 1 часть нефти и 9 частей воды. Сильно встряхивать обе колбы до образования эмульсии.
Поставить колбы и пронаблюдать за устойчивостью эмульсии.
Сделать выводы.
47
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6. МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К КОЛЛОКВИУМУ
6.1 Белки и аминокислоты
Аминокислота – органическое соединение, имеющее в
своем составе аминогруппу и карбоксильную группу. Обычное
сокращение – АК.
Аминокислоты незаменимые – данным термином обозначаются протеиногенные аминокислоты, которые не синтезируются или недостаточно синтезируются человеческим организмом. К абсолютно незаменимым относятся аминокислоты, которые вообще не синтезируются человеческим организмом: валин,
изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин. Незаменимые аминокислоты человек обязательно
должен получать с пищей в достаточном количестве. Недостаток в пище незаменимых аминокислот приводит к недостаточному синтезу белка, дистрофическим явлениям, задержке в развитии организма, заболеваниям.
Аминокислоты протеиногенные – аминокислоты, входящие в состав природных белков (пептидов). Протеиногенные
аминокислоты являются альфа-аминокислотами, то есть аминогруппу от карбоксильной группы у них отделяет один атом углерода (рис.6.1).
Рис.6.1. Структурная формула
протеиногенной аминокислоты
48
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Структура протеиногенной аминокислоты. R – боковая
группа, различная для индивидуальных протеиногенных аминокислот. Данная структура характерна для всех протеиногенных аминокислот кроме пролина (см. пролин).
Гидрофобные аминокислоты (гидрофобные аминокислотные остатки) – аминокислоты (аминокислотные остатки),
имеющие гидрофобную (ароматическую или алифатическую)
боковую группу. Гидрофобная боковая группа стремится избежать контакта с водой и обычно стремится при формировании
структуры белка оказаться в окружении других гидрофобных
групп (например, в гидрофобном ядре белка).
Гидрофильные аминокислоты (гидрофильные аминокислотные остатки) – аминокислоты (аминокислотные остатки),
имеющие гидрофильную (зараженную или полярную) боковую
группу. Гидрофильная боковая группа стремится к контакту с
водой с водой и обычно стремится при формировании структуры белка оказаться на поверхности белковой молекулы.
Аминокислотный остаток – аминокислота, вошедшая в
состав пептидной (полипептидной) цепи.
Оптическая активность аминокислот. Поскольку протеиногенные аминокислоты имеют по крайней мере один атом
углерода в состоянии sp3-гибридизации с тетраэдрическим расположением связей, имеющий 4 различных заместителя, то они
являются оптически активными. L- и D-формы (изомеры) аминокислот являются по структуре зеркальным отражением друг
друга (рис. 6.2) и их растворы вращают плоскость поляризации
поляризованного света в разном направлении (вращение плоскости поляризации определяется соответствующим прибором поляриметром).
В состав белков входят только L-аминокислоты. Dаминокислоты не могут быть использованы организмом для
синтеза белков. Имеется только одна протеиногенная аминокислота, не имеющая оптических изомеров, – глицин, так как у него
боковой цепью является атом водорода и, соответственно, центральный атом углерода имеет два одинаковых заместителя.
49
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис.6.2. Оптические изомеры протеиногенных
аминокислот
Пролин – протеиногенная аминокислота, имеющая структуру, отличную от базовой структуры всех остальных протеиногенных аминокислот (рис.6.3).
Рис. 6.3. Структурная формула
пролина
Белки – один из важнейших классов биополимеров.
Структурной основой белков являются полипептидные цепи,
состоящие из последовательно соединенных аминокислот. Простые белки содержат только аминокислотные остатки, соединенные в полипептидные цепи. Сложные белки содержат еще и
неаминокислотные компоненты – гем, производные витаминов,
липидные или углеводные компоненты. Эти компоненты могут
быть связаны с полипептидной цепью ковалентно или некова50
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
лентно. В состав молекулы белка может входить одна или несколько полипептидных цепей. Если в состав белка входит несколько полипептидных цепей, они могут быть соединены ковалентно или нековалентно.
Пептидная связь – связь, образующаяся при присоединении аминокислоты к растущей пептидной цепи (рис.6.4). Пептидная связь является частично двойной, чем обусловлены ее
свойства.
Свойства пептидной связи:
1.
Пептидная связь имеет плоскую конфигурацию
(подобно двойной связи).
2.
Вращение вокруг пептидной связи невозможно
(подобно двойной связи).
3.
Однако, в отличие от двойной связи для пептидной связи не свойственны реакции присоединения.
Рис.6.4. Пептидная связь
Пептидная цепь – продукт последовательного соединения протеиногенных аминокислот. Пептидная цепь имеет неразветвленную структуру, является химически стабильной в нейтральной среде, а также может быть гидролизована на отдельные аминокислоты в сильнокислой среде при нагревании с помощью специальных ферментов – протеаз, пептидаз.
Полипептидная цепь – продукт последовательного соединения большого числа (более 50) протеиногенных аминокислот, является химически стабильной в нейтральной среде, а
также может быть гидролизована на отдельные аминокислоты в
51
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
сильнокислой среде при нагревании или с помощью специальных ферментов – протеаз, пептидаз. Иногда полипептидную
цепь называют просто пептидной цепью. Приставка поли- указывает на то, что в образовании цепи приняло большое количество аминокислот.
С - конец пептидной цепи – конец пептидной цепи, на котором находится свободная карбоксильная группа.
N - конец пептидной цепи - конец пептидной цепи, на котором находится свободная аминогруппа.
Уровни структуры белка
Первичная структура – последовательность аминокислотных остатков в полипептидных цепях и расположение дисульфидных мостиков, если они имеются. Первичная структура
полностью описывает ковалентные связи в белке.
Вторичная структура – взаимное расположение АКостатков, расположенных рядом в аминокислотной последовательности. Вторичная структура может быть нерегулярной и регулярной.
Третичная структура– взаимное расположение в пространстве всех АК-остатков белка.
Четвертичная структура – имеется у белков, состоящих
из нескольких полипептидных цепей, соединенных нековалентно. Четвертичная структура – способ укладки полипептидных
цепей относительно друг друга.
Альфа-спираль – тип регулярной вторичной структуры в
белках (рис. 6.5). Имеет следующие свойства и характеристики.
В белках обычно встречается правая альфа-спираль.
Для всех АК-остатков в составе правой альфа-спирали
угол фи = - 57 градусов, угол пси = - 47.
В альфа-спирали CO-группа основной цепи каждого остатка связана водородной связью с NH-группой остатка, отстоящего от него на 4 позиции в полипептидной цепи.
В образовании водородных связей участвуют все пептидные группы.
52
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Гидрофобность альфа-спиральных областей повышена,
так как все атомы кислорода и азота пептидных групп уже вовлечены в водородные связи.
Остатки некоторых АК способствуют образованию
альфа-спирали, других – затрудняют образование альфаспирали. Пролин делает продолжение альфа-спирали невозможным.
Рис. 6.5. Альфа-спираль
Бета-слой – тип регулярной вторичной структуры в белках.
Дисульфидные мостики – связи, которые образуются в
результате окисления остатков цистеина (рис.6.6). Дисульфидные мостики могут связывать отдельные полипептидные цепи
или разные участки одной полипептидной цепи.
53
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис. 6.6 Дисульфидный мостик
Регулярные вторичные структуры. Поскольку оптимальные углы фи-пси для большинства аминокислотных остатков одинаковы, они могут принимать у нескольких следующих
друг за другом остатков одинаковые значения (одно значение –
для фи и другое – для пси). Так возникают элементы регулярной
вторичной структуры (рис. 6.7).
В белках наиболее часто встречаются следующие типы
регулярных вторичных структур: альфа-спирали и бета-слои.
В типичном белке около 60% АК-остатков принимает
участие в формировании регулярных вторичных структур.
54
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Рис.6.7. Вторичные структуры белка субтилизина
Взаимодействия, формирующие третичную структуру
белка.
Гидрофобные взаимодействия. Гидрофобные взаимодействия связаны с тем, что гидрофобные (неполярные и незаряженные) боковые цепи АК стремятся избежать контакта с водой.
Электростатические связи (солевые мостики). Возникают между разноименно заряженными боковыми цепями АК.
Водородные связи.
Дипольные взаимодействия.
Ван-дер-ваальсовы взаимодействия являются наиболее
слабыми, но также вносят свой вклад в стабилизацию белковой
структуры.
Денатурация белка
Денатурация белка – нарушение уникальной третичной
структуры белка, сопровождающееся изменением его физикохимических свойств и потерей биологической активности.
55
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Денатурирующие агенты и воздействия.
1. Высокая температура.
2.Сильные минеральные кислоты и основания. Разрушают ионные мостики и придают молекуле белка сильный заряд,
который дестабилизирует структуру.
3. Хаотропные агенты (мочевина).
Хаотропные агенты влияют на структуру воды и нарушают гидрофобные взаимодействия. Действуют в достаточно
высокой концентрации, например, мочевина – при концентрации 7 моль/литр.
4. Ионные детергенты (например додецилсульфат натрия). Образуют с полипептидной цепью мицеллы.
5. Соли тяжелых металлов.
6. Органические растворители.
Ренатурация белка - процесс, обратный денатурации.
При ренатурации денатурированный белок восстанавливает
свою уникальную структуру и свою биологическую активность.
Ренатурация белка происходит самопроизвольно при возвращении условий к нативному диапазону. Эффективность процесса
ренатурации в растворе может быть разной для разных белков.
(С ренатурацией конкурирует такой процесс как агрегация).
Нативный белок – белок, сохранивший свою уникальную
третичную структуру и биологическую активность (по контрасту с денатурированным белком, утратившим свою уникальную
третичную структуру и биологическую активность).
Нативные условия (для белка) – условия, при которых
белок сохраняет свою уникальную третичную/четвертичную
структуру и биологическую активность.
Фолдинг белка - процесс формирования уникальной третичной структуры белка. Фолдинг может происходить непосредственно после синтеза полипептидной цепи белка или в
процессе ренатурации. Фолдинг белка происходит, в нормальных условиях, самопроизвольно и не требует дополнительных
внешних механизмов. Первичная структура белка полностью
определяет его уникальную третичную структуру.
56
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6.2. Углеводы
Углеводы – вещества, имеющие общую формулу
CmH2nOn (или близкую к ней). Углеводы – один из важных классов биологических веществ. Часть углеводов (моносахариды)
являются важными участниками обмена веществ, источниками
энергии для организма. Другие углеводы (полисахариды) выполняют запасную (крахмал, гликоген) и структурную (целлюлоза, пектин) функции.
Моносахариды. Моносахариды представляют собой полигидроксиальдегиды и полигидроксикетоны, которые называются соответственно альдозами и кетозами.
Моносахариды имеют общую формулу Cn(H2O)n.
Моносахариды играют важную роль как участники метаболических путей, источники энергии и как мономеры, из которых образуются полисахариды.
Полисахариды – полимеры моносахаридов. К важнейшим
полисахаридам относятся крахмал, гликоген и целлюлоза, состоящие из остатков глюкозы, инулин, состоящий из остатков
фруктозы, и гемицеллюлозы, включающие остатки различных
моносахаридов. Полисахариды выполняют запасную (крахмал,
гликоген) и структурную (целлюлоза, пектин) функции.
57
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Полуацетальный гидроксил - гидроксил, образующийся в
результате циклизации моносахаридов (рис. 6.8).
Рис.6.8. Образование полуацетального
гидроксила при образовании циклической
формы глюкозы
Полуацетальный гидроксил резко отличается по свойствам от других гидроксильных групп молекулы. Он легко может
замещаться на другие нуклеофильные группировки, в результате
чего образуются различные производные сахаров.
6.3 Ферменты
Ферменты – биологические катализаторы, т. е. каталитические молекулы, синтезируемые живыми организмами и катализирующие химические реакции, необходимые для этих организмов. Почти все ферменты – белки. (Известно небольшое число молекул РНК, обладающих каталитической активностью. Их
называют рибозимами). Синоним слова фермент – энзим.
Общие свойства ферментов как катализаторов.
1. Ферменты не сдвигают равновесия реакции.
58
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. Ферменты снижают энергию активации для катализируемых ими реакций.
Особые свойства ферментов как катализаторов.
1.
Высокая каталитическая активность. Ферменты
ускоряют реакции, по крайней мере, в миллион раз.
2. Высокая специфичность.
3. Стереоспецифичность.
4. Лабильность – чувствительность к условиям среды.
5. Активность ферментов может регулироваться.
Важный момент! Ферменты не способны сдвигать равновесия реакции, однако многие ферменты в организме могут
сопрягать реакции, требующие затраты энергии с реакциями,
идущими с выделением энергии и за счет этого сопряжения протекают необходимые организму реакции, требующие затраты
энергии. Например, синтез белка в организме сопрягается ферментами рибосом с гидролизом богатого энергией вещества –
ГТФ.
Фермент-субстратный комплекс – комплекс, образуемый
молекулой фермента и молекулой субстрата при специфичном
связывании субстрата в активном центре фермента. Образование
фермент-субстратного комплекса – необходимый промежуточный
этап катализа. Скорость ферментативной реакции всегда пропорциональна концентрации фермент-субстратных комплексов.
Активный центр фермента – участок, который связывает субстраты (и простетическую группу, если она есть) и в котором содержатся аминокислотные остатки, непосредственно участвующие в образовании или разрыве химических связей. Такие
остатки называют каталитическими группами.
Общие свойства активных центров ферментов.
1.
На активный центр приходится относительно малая часть от общего количества аминокислот фермента.
2.
Активный центр – трехмерное образование.
3.
Активный центр имеет форму узкого углубления
или щели. В нем создаются особые, отличные от водной среды
условия.
59
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4.
Специфичность связывания зависит от строго определенного расположения атомов в активном центре.
Аллостеричесие ферменты - ферменты, не подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен. Демонстрируют сигмоидную зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата (рис.6.9) за счет кооперативного связывания
субстрата. Аллостерические ферменты всегда имеют более одного активного центра на молекулу фермента. Молекула аллостерического фермента состоит из нескольких субъединиц. Как
правило, каждый активный центр аллостерического фермента
находится на отдельной субъединице.
Рис.6.9. Сигмоидная зависимость скорости
ферментативной реакции от концентрации субстрата,
характерная для аллостерических ферментов:
V – скорость ферментативной реакции,
[S] – концентрация субстрата
60
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Иммобилизация ферментов - полное или частичное ограничение свободы движения молекул ферментов. Иммобилизованные ферменты широко применяются в биотехнологии, так
как позволяют проводить биотехнологические процессы в непрерывном режиме, легко отделяются от реакционной среды,
отличаются повышенной стабильностью (рис.6.10).
Рис.6.10. Методы иммобилизации ферментов
Ингибиторы – вещества, присутствие которых снижает
скорость ферментативной реакции. (Альтернативное определение: ингибиторы – вещества, снижающие активность ферментов.) Ингибиторы делятся на обратимые и необратимые. Необратимые ингибиторы связываются с молекулой фермента ковалентно или очень прочно. Обратимые ингибиторы делятся на
конкурентные (полные конкурентные ингибиторы и частичные
конкурентные ингибиторы), неконкурентные ингибиторы и
смешанные ингибиторы.
Каталитические группы фермента - аминокислотные
остатки, непосредственно участвующие в образовании или разрыве химических связей. Находятся в активном центре фермента.
61
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Михаэлиса-Ментен уравнение – уравнение, выражающее
зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата.
Вид уравнения Михаэлиса-Ментен:
V = Vmax ⋅
[S ]
[S ] + K м
где V – начальная скорость ферментативной реакции
(скорость измеряемая в период, когда израсходована очень малая доля субстрата);
Vmax – максимальная скорость ферментативной реакции (в
условиях насыщения субстратом). Vmax = k3 [ET] , где [ET] – концентрация активных центров фермента, а k3 - кинетическая константа называемая числом оборотов фермента.
Число оборотов фермента – то количество молекул
фермента, которое превращается в продукт реакции в единицу
времени при полном насыщении фермента субстратом.
k3 является величиной, характеризующей каталитические свойства каждого конкретного фермента.
[S] – концентрация субстрата
KM – константа Михаэлиса-Ментен
Ферменты, подчиняющиеся кинетике МихаэлисаМентен – ферменты, для которых зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата описывается
уравнением Михаэлиса-Ментен. К ферментам подчиняющимся
кинетике Михаэлиса-Ментен относятся все ферменты, которые
имеют один активный центр на молекулу фермента. (Более
сложные ферменты, имеющие более одного активного центра на
молекулу фермента могут не подчиняться кинетике МихаэлисаМентен).
Оксидоредуктазы – ферменты, катализирующие оксилительно-восстановительные реакции. Играют важнейшую роль в
таких метаболических путях как путь Эмбдена-МейергофаПарнаса (путь ЭМП) и цикл Кребса.
62
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6.4 Липиды
Липиды – жиры и жироподобные вещества. К липидам
относятся вещества различной химической природы. Различают
омыляемые липиды (образованные жирными кислотами, спиртами, а также, в некоторых случаях, дополнительными компонентами) и неомыляемые липиды, которые не содержат в своем
составе жирных кислот. Омыляемые липиды при воздействии
щелочи в результате гидролиза образуют мыла – соли жирных
кислот. Характерной чертой липидов является амфифильность
их молекул – наличие у них гидрофобного и гидрофильного
фрагментов.
Жирные кислоты (ЖК). Жирные кислоты имеют алифатическую углеводородную цепь и карбоксильную группу (рис.
6.11). Углеводородная цепь ЖК, как правило, линейная, хотя у
бактерий у некоторых ЖК она может быть разветвленной или
содержать циклический фрагмент. Алифатические цепи ЖК могут быть как насыщенными, так и ненасыщенными. Типичные
жирные кислоты:
Рис.6.11. Типичные жирные кислоты
63
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Триацилглицерины – простые омыляемые липиды, образованные глицерином и тремя жирными кислотами. В организме
играют роль запасных веществ и защитную роль.
64
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Литература
1. Чиркин, А.А. Практикум по биохимии: учебное пособие/
А.А.Чиркин – Мн.: Новое знание, 2002. - 512 с.
2. Практикум по биологической химии. Д.К. Шапиро – 2-е
изд., перераб. и доп. – Мн.: Вышэйшая школа, 1976. - 288
с.
3. Справочник биохимика/ Р.Досон [и др.]. – М.: Мир, 1991.
4. Филиппович, Ю.Б. Основы биохимии: учебник / Ю.Б.
Филиппович. - 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Высшая
школа, 1985. – 503 с.
5. Фердман, Д.Л. Биохимия / Д.Л. Фердман – 3-е изд., перераб. и доп. – М.: Высшая школа, 1966. – 643 с.
6. Березов Т.Т., Биологическая химия: учебник / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – 3-е изд., перераб. и лоп. – М.: Медицина, 1998. – 704 с.
7. Практикум по биохимии: учебное пособие / под ред. С.Е.
Северина, Г.А. Соловьевой. – 2-е изд., перераб. и доп. –
М.: Изд-во МГУ, 1989. – 509 с.
65
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Содержание
1. Правила техники безопасности при работе
в лаборатории
2. Белки и аминокислоты
Лабораторная работа 2.1. Количественные
реакции на белки
Лабораторная работа 2.2. Качественные реакции
на белки и аминокислоты
Лабораторная работа 2.3. Исследование свободных
аминокислот растительного материала методом
хроматографии на бумаге
Лабораторная работа 2.4. Денатурация белков
Лабораторная работа 2.5. Определение
изоэлектрической точки белка
3. Углеводы. Моносахариды
Лабораторная работа 3.1. Характерные реакции
на углеводы
Лабораторная работа 3.2. Полимеры глюкозы –
целлюлоза и крахмал
4. Ферменты
Лабораторная работа 4.1. Исследование свойств
амилазы слюны
Лабораторная работа 4.2. Специфичность действия
ферментов. Ингибиторы и активаторы.
5. Липиды
Лабораторная работа 5.1. омыление липидов.
6. Материал для подготовки к коллоквиуму
6.1. Белки и аминокислоты
6.2. Углеводы
6.3. Ферменты
6.4. Липиды
Литература
66
3
6
7
14
21
25
28
31
34
37
39
39
42
47
47
49
49
58
59
64
66
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
10
Размер файла
1 259 Кб
Теги
956
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа