close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

991

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
/\-Ъ09М
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК
ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА (ВИЖ)
На правах рукописи
ЕРОХИН Анатолий Сергеевич
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
КРИОРЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМЫ БАРАНОВ
И БЫКОВ
Специальность 03.00.13 — физиология человека &,>
и животных
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
п, Дубровицы Московской обл., 1994 г.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа выполнена БО Всероссийском научно-исследователь­
ском институте племенного дела.
Научный консультант:
доктор биологических наук,
профессор В. П. КОНОНОВ
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
профессор 10. Д. КЛИНСКИЙ,
доктор биологических паук,
профессор А. Н. УСПЕНСКИЙ,
доктор биологических наук,
профессор А. И. ЖУРАВЛЕВ
Ведущее учреясдение — Российская академия менеджмен­
та в животноводстве.
^ШШйЯК диссертации-л сг^рся «..<^....»,^?:.^^Д1994 года
в 10 часов "'на заседали» специализированного Совета
Д 020.16.02 при Всероссийском научпо-исследовательском ин­
ституте животноводства.
142012, Московская обл.,
Подольский
зкио ознакомиться в библиотеке инстаАвтореферат разослан «....•Z....».f^.^?.Z?..1994 года.
Ученый секретарь
специализированного совета,
канть;дат биологических наук
И. И. ШМЫГИН
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
• Актуальность темы. В большинстве экономически развитых
стран для искусственного осеменения коров широко используется
• метод криоконсервации спермы.
*
Несмотря на достаточно высокую эффективность этого метода
в скотоводстве, имеется ряд малоизученных вопросов, ответы на
которые смогли бы повысить эффективность осеменения коров. В
частности, в процессе замораживания погибает более половины - :
сперматозоидов. Изучение причин данного явления и разработка
• более совершенных криоразбавителей для спермы быков, позволило
, бы повысить выживаемость сперматозоидов в процессе криообработ. _ ки и их оплодотворяющую способность. Кроме того, это позволит
' увеличить запас спермодоз, заготовляемых от высокоценных в пле­
менном отношении производителей.
Специальными исследованиями доказано, что результативность
осеменения коров замороженной,спермой на 20-30$ ниже, чем от '
•••; свежеполученной (А.Гордон,1988). В этой связи для дальнейшего
развития и совершенствования метода криоконсервации спермы бы­
ков необходимы более основательные теоретические исследования.
.
' В овцеводстве метод глубокого замораживания спермы бара. нов разработан в меньшей степени и пока не нашел широкого при­
менения в практике, хотя значение данного метода для овцеводст: ва актуально не менее, чем в скотоводстве. При этом появилась
бы возможность широко и с большей нагрузкой использовать высо­
коценных племенных баранов, в особенности^ проверенных по ка-честву потомства. В настоящее время по России.нагрузка на од­
ного барана остается,еще достаточно низкой и составляет не бо­
лее 350 овцематок на барана. Внедрение метода глубокого замора.хивания спермы баранов в практику,;позволило бы заготавливать
, от них/сперму, в. течение всего года и'значительно увеличить чис/ до овцематок, осеменяемых'спермой выдающихся производителей.
. Недостаточное.внедрение в практику данного метода обусловлено
-•: пониженной фертильностью крноконсервированной'спермы баранов.
:
•-' Биологические причины данного явления изучены, пока очень
слабо и требуют дальнейших всесторонних исследований.
ЦЕНТРАЛЬНАЯ
. НАУЧ:-!ЛЛ БМЗЛИОТЕКА
f.'cocic. соль;;:о.<оз ачадэмии
и..!. К. А.ж Тимирязева .
Яна. № А ^ Й Й 2 £ .
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
В этой связи особую актуальность приобретают сравнительные
исследования межвидовых особенностей криоустойчивости половых
клеток баранов и быков. Выяснение причин различной криоустойчи­
вости и фертильности оттаянной спермы данных видов животных
на более глубоком уровне, чем это делалось до сих.пор, необходи­
мо для совершенствования методов повышения криоустойчивости
сперматозоидов баранов и разработки способов'повышения эффектив-'
ности использования их криоконсервированной спермы. '•
'•'•.,.
Цель_ работы - совершенствование метода глубокого заморажи­
вания спермы баранов: ..." --/ и внедрение его.в практику, а так­
же повышение эффективности использования криоконсервированной
спермы быков путем улучшения криозашиткых свойств синтетических
разбавителей и разработка метода прогнозирования криоустойчивос­
ти спермы быков.
-'
Задачи исследований:
'"
.,
': .
, I. Выяснить видовые особенности надмолекулярной структуры ч.
плазматических мембран в гаметах барана и быка и влияние на.
данный показатель различных факторов. .
.. *
2. Изучить влияние криообработки на систему регуляции перекисного окисления липидов в сперме животных.
•;
3. Проанализировать особенности криогенных изменений мета­
болизма некоторых фосфатов в сперме..
, •
4. Исследовать криозащитное к антиоксидантное действие не­
которых веществ на половые клетки барана ж быка.
5. На базе результатов теоретических исследовании разработать более эффективные приемы.защиты гамет барана в процессе
их глубокого замораживания.' .'•;•'
•'/••:.
6. Изучить влияние некоторых физиологических факторов на
результативность осеменения овец криоконсервированной спермой.:7. Разработать более эффективную синтетическую среду для замораживания спермы быков. .
_'].-'< '•
'-;
'7
8. Изучить взаимосвязь некоторых физиологических показате- '••..
лей спермы быков с ее криорезистентностью*,•.'/.,/• > •••• ^: .•'•'> •:•"•'•'"'-'.
. 9. Разработать более совершенный метод прогнозирования-..-%
криоустойчивости спермы быков. V \.-'':[
•'._"; ;,.'•..";\ \ •
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
На23ная_ноЕизна. Впервые с помощью ЭПР-спектроскотщ вы­
явлены особенности надмолекулярной структуры плазматических
мембран сперматозоидов барана И'быка и влияние на нее различных
факторов. •
. . .'
Установлено, что криоконсервацая оказывает стимулирующее
действие'на пероксидапию липидов, особенно в гаметах баранов.
Впервые показано, что криообработка индуцирует утечку внут­
риклеточного антиоксвдактного фермента - супероксиддисмутазы из
спермиев барана и быка.
С помощью ЯМР-спектроскопиг обнаружены особенности криогек. Л ' вых изменений метаболизма некоторых фосфатов спермы животных.
В семенной плазме быков выявлено присутствие криостабильноГ" го овуляторйого фактора. Установлены принципиально новые факты
криогенных изменений кммуномодулирувщих свойств семенной плазмы
.••' барана.'--;
'''./._•...
Разработана и внедрена в практику овцеводства новая синтети.;.'. ческая ГЖУК-трис-буферная среда для замораживания спермы баранов
';.: (А.С JH408576.I988 Г.). ". , . .'
. . .
/
Впервые выяснено, что сухие яйцепродукты оказывают высокое .
'. криозащитное влияние на сперму животных и могут использоваться
ч в составе криоразбавителей.спермы (А.с. Я 1501333,1989 г.). •
.• •- '
Выявлен новый синтетический антиоксидант, повышающий крио; устойчивость сперматозоидов барана.'.. -•••
.•'..
Показано, что некоторые, широко применяемые в практике ком­
поненты синтетических сред, обладают выраженным антиоксидантным
. действием и могут ингнбировать процессы пероксидации липидов
: в гаметах животных.
.
На основе комдлексонатов металлов соадака новая синтетнчес-,'-.>. кая среда для-замораживания.спермы быков»;- ', .>-'' -"•'•
Разработан новый способ прогнозирования криоустойчивостн
• нативной спермы быков, основанный на измерении с помощью ЯМР•-. -спектроскопии уровня микровязкостя плазматических мембран га:
; мет (А. е . * 1813424,1992 г. ' ) .
: ; . .
•••';': Основные положения, выносимые,на защиту; .;
•; •.•'", — видовые особенности криорезистентности спермы баранов и
:
- быков обусловлены уровнем микровязкостя плазматических мембран
.;V. половых клеток и разлячноЯ устойчивостью системы регуляции, пе• рекисного окисления липидов в гаметах при лриоконсервации;
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- разработка новой.синтетической ГЖУК-трис-буферной среды
для замораживания спермы баранов и ее практическое применение; ,
, , - физиологические приемы повышения результативности искус­
ственного осеменения овец криоконсервированной спермой путем
использования миорелаксанта и гонадолиберина;
•
- прогнозирование криоустойчивости спермы .различных быков- ••"•
-производителей возможно на основе изучения взаимосвязи ряда
физиологических характеристик гамет с и х устойчивостью к. воздей­
ствию низких температур.
Практическое ^зтачение, работы. Выяснены некоторые видовые
особенности; связанные с неодинаковой криорезистентноотью спер­
мы баранов и быков, которые могут быть полезными при совершен- ствовании методов криоконсервации спермы других видов животных. '••
Экспериментально обоснована возможность применения некоторых :-.•/
современных биофизических методов для анализа биологической пол-'
ноценности нативной и криоконсервированной спермы животных..
'Применение новой ГЯУК-трис-буферной среды для замораживания
спермы баранов, позволяет получать удовлетворительные для прак- •;."••
тики результаты искусственного осеменения овец. ••.;•.•
Показано, что результативность осеменения овец криоконсер-.
вированной спермой может быть улучшена с помощью некоторых фи- '
зиологических приемов. •':'.'
.,•-..
-•_ '''••'•
Созданная синтетическая среда для•замораживания'спермы бы­
ков, позволяет повысить результативность искусственного осеме­
нения коров. .
. *•'.".'•;•:•'
' •"-• -'".v .:':'''•'•'•'''
Разработанный способ прогнозирования криоустойчивости спер- мы быков позволяет увеличить заготовку замороженных спермодоз
на одного производителя и.отбирать для племпредприятнй животных''
с высокой криоустойчивостью спермы.
;•-.•:.л•'••;
'•'.'". .•'..'•••/.
Реализация результатов исследований. Материалы, получен—:;;
ные в экспериментальной работе, использованы при разработке на- ;.
учно-методических и нормативно-технических документов::
I. Методические рекомендации по технологии взятия, глубо-т • •
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
кого замораживания х использования спермы баранов-производителей
п р и искусственном осеменении овец. - Москва,I98S г*
2. Методические рекомендации по технологии кормления,содер­
жания, подготовки высокоценных баранов-производителей к взятии
семени, его глубокому замораживанию и максимальному использова­
нию выдающегося отечественного и зарубежного генофонда. - В Д Ж
СССР,1989 г..'.'-•.
••'•'.'• . ••••••
••''••'•
3; Наставление по применению ГЖУК-трио-буферной среды для
разбавления,замораживания,хранения и использования спермы бара­
нов-производителей. - ВНИИплем,1992 г. Одобрено и рекомендовано
в практику Ветеринарным фармакологическим Советом ГУВ Госагро.прома СССР 13 декабря 1988 г.
•
''
. . 4. Разработанная:ГЖУК-трис-буферная среда для замораживания
спермы баранов используется на племпредприятиях 33 областей Рос­
сии и ближнего зарубежья. •.••
"
•',-'._'
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены
ж одобрены на:
'.•':•'''
• - 1Г Всесоюзном совещании по химии и применению комплексонатов и комплексонов металлов. - Москва,1983 г.;
- Совещаниях-семинарах по искусственному осеменению с.-х. .
животных. - Москва.ВДЖ СССР (1987-1990 г г . ) ;
.'"•';" - Всесоюзной научной конференции "Использование физических
г биологических факторов в ветеринарии и животноводстве". - Ви­
тебск,1991 г. ;
:,•-"/'•'••• ,•'••:;
•;' •:- Л конференции "Биоанткоксидант"-'Москва, 1992 г.;
•'.'- научных чтениях, посвященных памяти академика-Ыилованова
.В.К. -ВИХ.1993 Г.;. V ; ' ''' i'v';'.'••" "
..-••- ежегодных научно-методических конференциях ВНИИплем
: (1986-1993 гг.); ." ":~. ... ••> ' •';•',: V •'•..- на производственном совещании специалистов ПО "Хакасское".
- Абакан, 1993 г.; '."'г
--•". - научно-методической конференции лаборатории биологии вос­
произведения с.-х.животных ВНИИ племенного дела,январь,1994 г.
По материалам диссертации опубликовано 26 печатных работ
в журналах "Доклады ВАСХНИЛ", "Сельскохозяйственная биология",
"Зоотехния",.."Овцеводство" и Трудах ВНИИплем.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
полученных материалов, выводов, предложений производству, спис- • ка литературы и приложения. Работа изложена на Si4 страницах
машинописного текста, содержит .70 таблиц и 7 рисунков. Список
литературы включает 477 источников, из них 288 иностранных,
. 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Экспериментальные исследования выполнены в лаборатории био- .
логии воспроизведения с.-х.животных ВНИИ племенного дела,на ка- ..-.•'
федре биофизики МГУ им.Ломоносова.отделё химической и биологи­
ческой кинетики Института химической физики РАН. ,';•'•
Научно-производственные опыты в период с 1982 го 1993 гг.
были проведены на базе хозяйств Хакасской и.Калмыцкой республик,
а также Московской и Тульской областей. ;..
•
• ' •*
Объектом исследований"служила сперма баранов различных пород и быков - голштино-фризской породы.'
•,'•;•'
-•.,'•
Для изучения видовых особенностей надмолекулярной структу­
ры, плазматических мембран гамет барана и быка'был использован >'
метод электронного парамагнитного резонанса спиновых зондов/
(Л.Борлинер,1Э79). В качестве спинового зонда использовали 5-доксилстеарат.
••'.''.'.'.'.••'•'.•'.•
'.,.".• '
Исследование особенностей пероксвдациилишщов. в с п е р м и я х . " :
барана и быка проводили с помочью метода индуцированной ионами
железа хемялвминесцениии (О.А.Владимиров, М.П.Шерстнев,1989).
Определение концентрации липкдных гидроперекисей в образцах
спермы проводили с помощью спектрофотометра СФ-26 по методу
В.Б.Гаврилова и М.И.Мишкорудной (1983), а концентрации малоново-У .:;
го диальдегида -;По методу K.5*fo«.(I978).. *
"
Анализ активности супероксиддисмутазы в дативной и криокон- : ;
сервированной сперме животных проводили хемилшинесцентным мик­
рометодом {Т. Ним. е.а ,1984). При этом использовали медицинский
хемилюминометр ХЛМ I ц-01, ФЭУ-130.-'..'",';•
•./•-.
Изучение метаболизма.некоторых фосфатов в дативной и крио- '-, , консервированной сперме животных проводили с"помощью метода-:,-''.',..•.'••'"
31
Р-ЯМР высокого разрешения < С . Л « « е.а., 1976). Спектры }
.'. •-.
31
Р-ЯМР высокого разрешения образцов спермы регистрировали на
ЯМР-спектромотре АМ-400 (^рукер",ФРГ). Влияние глубокого замо-.
раживакия на иммуносупрессивдыв свойства семенной плазмы бара-.
" •.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
'
•
'
•
-
7
•
-
•
•
нов исследовали с помощью реакции бласттрансформацни аллоген: ных лимфоцитов крови в присутствии конканавалина - А и семан-.
ной плазмы (A. JaAmt
ЛЦ1985).
Оптимальное соотношение исследуемых компонентов,при раз­
работка синтетических сред для замораживания спермы баранов и
быков, находили методом встречных арифметических рядов с после­
дующим уточнением биологическим методом процента подвижных
:
сперматозоидов и их выживаемости в оттаянных образцах спермы
v-(ВЖ.Ыилованов,1962). Изотоническую концентрацию веществ для
спермы определяли: криоскошческим и биологическим' методами.
Влияние различных веществ на криоустойчивость спермы бара­
нов х быков определяли по подвижности и выживаемости оттаянных '
: образцов спермы и по результатам искусственного осеменения овец
'.' • ж хоров.
-7 •'•;•/'
Для замораживания спермы использовали зякуляты с подваж-.#
востью не менее 80# и концентрацией спермиев - не ыенее 2 млрд/мл
для баранов к I млрд/мл - для быков. Замораживали сперму обоих
видов в форме открытых.гранул объемом 0,2.мл на пластине сухого
• льда иди фторопластовой пластине.
:,
•
При изучении влияния физиологических факторов на рвзульта-'"'•• тхвяосгь осеменения овец криокоясервярованной спермой испытыва­
ли влияние специфического маточного миорелаксанта - утерорелак, - сана, синтетического говадолиберяна ~ сурфагона х антистрессо- вого вещества — углекислого лития. При этом сперму баранов раз:
•. бавляли и замораживали в ГЖУК-трио-буферноЙ среде. Оттаивали
сперму в злектрооттаиватале при 80°С. Овец осеменяли или одно­
кратно, сразу после утренней выборки,, или двухкратно: сразу .
после выборки и повторно, через 8 часов/Результативность осе­
менения учитывали по. ягнению овцематок.
В экспериментах по прогнозированию криоустойчивости нативной спермы быков определяли.хирнокислотный.состав общих лшшдов'
гамет с помощью газо-жидкостной хроматографии (А.Г.Верещагин.'
.. к др. ,1963) и их фосфолкпидный состав по V-SitipSity
• М. Вал'.''Л' с/гу (1982). .
- V
.У
/Механическую резистентность гамет быков к воздействию уль• тразвука определяли по методу В.Б.Акопяна и др. (1991).
Уровень микровязкости мембран,сперматозоидов быков в связи
о их криоустойчивостью определяли о помощью метода протонной
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
магнитной релаксации (Г.В.Архилова и др.,1990).
Биометрическую обработку полученных данных проводила по
Е.К.МеркурьевоЙ (1964).
:' J.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ •
3.1. Видовые особенности криорегистентности спермы
барана к быка
3.I.I. Уровень микровязкости плазматических
. мембран гамет
'•'•.•'[•
Для совершенствования методов глубокого замораживания
спермы о.-х.животных необходимо дальнейшее более глубокое изу• ченае причин ее неодинаковой криоустойчивостн у разных видов
ЖИВОТНЫХ.'
'.';
Учитывая важную роль.плазматических мембран в процессе
криоконсервавди клеток, целью наших исследований было сравните­
льное изучение параметра упорядоченности мембранных л ш ш д о в
сперматозоидов барана и быка до я после крновоздействня..
Доя исследования физического состояния мембран был исполь­
зован метод электронного парамагнитного резонанса спиновых зон-.
дов.'В таблице I.представлены данные по.определению параметра упорядоченности спектра ЭПР в мембранах нативных сперматозоидов.
;;•'.-;•:':-У-::,\: ;/Таблица I- :•":..'/
Параметр упорядоченности зонда в мембранах нативных.
сперматозоидов
. •••:.., У "
•
•
А
Виды животных
'
•Баран
Бык
.
.
} /г
{Подвижность спер^Лараметр упоря(Матозождов (в ?ь)|Доченности зон-,.
|
}
::••'-,
Г
|да,( S
)
•;
10 .' ."• 80
, : 0,663*0,006
Юг
'•'{;', 80 .;-:•. 0*703±0,005 ; ; v
Установлено, что имеются видовые различия молекулярной '..'•'•'!>'••
структуры мембранных липидов: параметр'упорядоченности,'харак­
теризующий подвижность зонда в мембране, в нативных спермато-•*•'•
зоидах барана ниже по сравнению с быком (Р<£0,01). Это свиде- '
тельствует о меньшей микровязкости липидной части мембраны в
сперматозоидах баранов. ..''.- 'У : "{ 7у\.•'..'•'""• vi: •:['•-' ••';"•-•-.•
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
-"' • '•;• Результаты экспериментов но влиянию криообработки на струк­
турное состояние мембран спермиев животных показали, что под
:влияниеы глубокого замораживания происходят изменения конформацнонного состояния их мембраны. Уже в процессе охлаждения до
+4°С происходит увеличение параметра упорядоченности мембранных
липидов,' вероятно, обусловленное нарушениями белково-липидша
связей в мембране и выходом части фосфолипидов из мембраны в ок­
ружающую среду. ' .
.
Процесс 'замораживания-оттаивания приводит к дальнейшему на­
растанию биоповреждений мембраны, о чем свидетельствует повыше­
ние параметра упорядоченности.
'После• замораживания сперматозоидов в среде без желтка, га-ыеты барана'сохраняли довольно высокую подвижность сразу после
оттаивания, в то время как у быка,, подвижность наблюдалась у еди­
ничных сперматозоидов. Но время сохранения подвижности било резко
снижено по сравнению с замораживанием в среде с желтком. Вероятно,
большая разупорядоченаость мембранных липидов у барана и обуслов­
ливает повышение выживаемости сперматозоидов при замораживании
-в среде без желтка. Но с другой стороны, эта особенность их мемб­
раны может быть ответственна за снижение результативности осеме­
нения овец криоконсервированной спермой.
Синтетические среда для разбавления и замораживания спермы
животных содержат различные гидрофильные и гидрофобные компонен.-. ты,: оказывающие криозащитное влияние на гаметы.'
Механизмы защитного влияния .различных компонентов окончатель- '
но пока не выяснены.
~
"• В этой связи актуальным представляется изучение влияния раз• "личных веществ непосредственно на плазматическую мембрану сперма• тозождов. •;..'•.; ;:
.'.;.'-~" „'•'•'.'
.":•'-.
•/.'•' Результаты ваших экспериментов показали, что добавление жел­
тка в. состав разбавляющей среды приводит к снижению параметра : упорядоченности спинового зонда в мембранах сперматозоидов, что *
свидетельствует об 'уменьшении микровязкости липидной части мемб, рана в ответ на добавление желтка. Причем, у быка.отмечается бо­
лее заметный результат разупорядующего действия желтка по сравне­
нию с.гаметами барана (Р<0,01). Возможно, это связано с тем,что
:: мембрана натнвных сперматозоидов барана характеризуется, меньшей
'ыжкровязкостью по сравнению с быком.
.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
_
'
Ю
r
-
_.-
.
;
•
•
•
.
•
>
.
'
•-
>
•
; .
Разупорядочивающее действие желтка на мембрану прекращалось
после отмывания гамет в безжелточном буфера. Это свидетельствует .'
о поверхностном взаимодействии фосфолипндов желтка с плазмати-. ".•"
ческой мембраной сперматозоидов, в результате чего изменяется ее :_•
физинеское состояние. Вероятно, снижение микровязкости мембраны • .
под действием желтка каким-то образом ж позволяет повысить крио- :
устойчивость сперматозоидов. ''• .;
' ч
s
Изучение влияния на мамбрану гамет различных гидрофильных '';•'.:компонентов синтетических сред показало, что они не оказывали
влияние на уровень ее микровязкости.
3.1.2. Особенности перекисного окисления лнпидов .•'.'.•'
1
:
;
' .,• •••''• ' в г а м е т а х •
•"
;:;.' - :
Имеются данные, что криоконсервацня может.оказывать стимули­
рующее воздействие на пероксидацию липидов (ПОЛ) в сперме некото­
р ы х видов животных, что может оказывать отрицательное влияние ва у
ее фертильность (В.Кононов, А.Нарижный,1981; В.Наук, А.Гуськов,
1983). В связи с этим ми изучали влияние криоконсервации на уро- .
вень пероксидации липидов в гаметах баранов и быков с помощью
метода индуцированной хемилюминесценцжн. . . ."''.•
Результаты предварительных экспериментов показали,- что н а и в ­
ные сперматозоиды барана и быка имеют очень слабую спонтанную.хе-'.
мнлюминесценцию (ХЛ). При добавлении же к образцам .гамет ионов' .
железа, происходила инициация ПОЛ, сопровождающаяся характерной
для каждого вида животных кинетикой ХЛ. '.'•••' .
Причем, на кривой ХЛ сперматозоидов быка удается наблюдать
только быструю вспышку свечения после добавления ионов железа,
развития же медленной вспышки Х Л не происходит. В то время, как..
у барака можно было наблюдать быструю и медленную вспышку ХЛ» ./.
Эти результаты свидетельствуют» что в яатжвных гаметах бара­
на ПОЛ инициируется при добавлении ионов железа значительно силь­
нее по сравнению с быком. Мембраны сперматозоидов быка жмеют, в е ­
роятно, более мощные антноксндантныв системы, обеспечивающие ус­
тойчивость системы регуляции ПОЛ к и о д и р у ю щ е м у воздействию •
ионов железа.
.;,.>.'•••.•
В следующем опыте изучали влияние криообработкж гамет ка ки- ;нетжку ХЛ (табл.2). ,'
•''.• ',:• .•;'•;
.'.'.,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- II .' . .
Таблица 2
Величина амплитуды быстрой ( / i ) и медленной (Н)
вспышек ХЛ в суспензии оттаянных сперматозоидов
Пшша опыта
j ,t
j
I
} *
До замораживания 7
Через 10* после
оттаивания
. 9
Через 30'после
оттаивания
9
Через 90' после
оттаивания '
9
Через 120'после
оттаивания . 9
^
•
••} н
0,58*0,04
."••'••
0,51*0.11
.
0,47*0,08
1 '
0,56*0,06
"'''*"'
0,41*0,04
*Р*• 0,05; * * Р 4 0 , 0 1 .
[
Барм • '
j Ч
j н
. 0.
0,74*0,0?
0,83*0,04
•'•••.
' ' • .
х
0,24*0,08 0,34*0,08* 0,96*0,18
,' • • .. • ™
.
„
0,11*0,02 0,29*0,04** 1,00*0,15*
х
.
«,.
„„
0,19*0,02 0,19*0,07** 1,10*0,17**
^
• * '•" '»
^ - «,
0,04*0,010,43*0,14* 1,10*0,15**
.
.
'
•
.
- Из таблицы 2 видно,что процесс криоконсервации сперматозои­
дов оказал стимулирующее влияние на пер&ксидацию липидов. Это
характерно даже для более устойчивых гамет быка. Если в иатхвных
гаметах быков не было отмечено развития медленной вспышки ХЛ, то
после оттаивания- она была четко выражена, но ее амплитуда спяжалась по мере инкубации оттаянных сперматозоидов при 37°С с 0,24
до 0,04 х I0 5 квант/с»45«
V
•
' Амплитуда "быстрой вспышки у этого вида животных после отта­
ивания била практически одинаковой на протяжения всего времени
исследования. Амплитуда медленной вспышка у быков, после-кратко­
временного подъема сразу после оттаивания, уже через 30 минут
инкубации начинала снижаться,и к концу второго часа практически.
исчезла, что свидетельствует.о возрастания активности антнокся- '
даитной системы в гаметах быков в этот период.
• В образцахоттаянных сперматозоидов барана амплитуда свече­
ния быстрой вспышки снижалась сразу после оттаивания и остава­
лась практически на одном уровне/ в течение периода' наблюдения. ,
Амплитуда же медленней вспышки у этого вида животных сразу' "
после оттаиваАня возросла ха 15£ х к концу периода наблюдений t
повысилась на 32^ (Р<0,05). Это свидетельствует как об интевсхфгоацхж компонентов ПОЛ, так х еб еслаблевхи функции автиохси-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
дантной системы в гаметах баранов, подвергнутых криообработка.
В следующем опыте мы изучали влияние криовоздействия на .
скорость спонтанной пероксидащш липидов в образцах спермы жи­
вотных (табл.3).
: ч .'•-'.
~ ' . •' •
V '.-•; ' Таблица 3 *.•.".
Концентрация продуктов ПОЛ в замороженно-оттаянных '
образцах спермы животных '
Продолжительность ин-'.Дипидные гидроперекиси! МП1 m-ni^/un
кубации оттаянной
отн.ед./мл.
•• IВДА,нмоль/мл •.
спермы при 37 С, мин •
•«
'' . I
| ' '• '
. |I- <ц«вУ
баран • {
бык.;
{
б
а
р
а
н
•
бык'
|-;(ц-4)".-{ (*ь*б) } (*и,)
Бативная!сперма.
0,80*0,07
5' после оттаивания •: 0,78*0,07
ЗО'после оттаивания
0,70*0,05
60'после оттаивания
0,64*0,05
120'поеле оттаивания 0,40*0,04*
* Р<0,05.
-————
,_.
0,72*0,01 6,40*0,1 4,9*0,1 :
0,43*0,01 6,2±0;2
5,3*0,1
1,50*0,5* 7,1*0,3^ 4,8*0,3
1,10*0,1 7,7*0,4* 5,1-0,2 0,50*0,06 8,3*0,3* , 5,2*0,4
.-.. '-..;
:•'.•'/•
Показано, что в образцах спермы быка через 5 минут после ;-.
оттаивания концентрация липидных гидроперекисей несколько снизи­
лась. Затем, через 30 минут после инкубации при 37°С она возрос-.:
л а в 2,1 раза (Р^-0,05). После этого и х концентрация начинала
снижаться и через 2 часа после оттаивания ока достигла практи­
чески первоначального уровня. * • . ' • " . " ••
Концентрация мДА в сперме быка после оттаивания в течение :
2-х часов оставалась практически н а том же уровне,-что.и до за- v
мораживания. Вероятно,' эндогенные антиоксидантныв системы спер-'. мы прерывали повышенный уровень пероксидащш липидов путем инак­
тивации повышенной концентрации первичных продуктов ПОЯ.:, •>,•
В сперме же барана концентрацияВДД,через 5 ш ш у т после о т - . :
таявания была такой ж е , как и до замораживания (6,4 и 6,2 нмоль/мл
соответственно). Но в процесс» дальнейшей инкубации оттаянных
сперыиев при 37°С, происходило нарастание концентрации Щ к . Уже -,1.-,
через 3 0 минут после оттаивания его концентрация увеличилась н а ::.?,.:
•14%, а через 2 часа - превышалаНачальный уровень на 34Jf. Кон- > ...цеитрапия же липидных гидроперекисей к концу периода инкубации :
снизилась' на 49%. -~:,. ".;'..:''*-;•. •', .''.*••.:. Ч-: :1;:;-'Чл;'•';:; •-;;v":..v..--v
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
".;ч Полученные результаты свидетельствуют, что крноконсервация
' оказывает стимулирующее влияние на ПОЛ, особенно в сперме бара­
ков. Это может являться одной из причал снижения фортильности
, криоковсервированнон спермы баранов.
' 3 . 1 . 3 . Активность супероксидджсмутазы в сперме
:•..'• •'••".Ч .'•.."..'•:; •;. ' .'животных .'
:
' Известно, что в клетках животных спонтанное ПОЛ может икдупироваться супероксидным радикалом ( 0 £ >, который является родог' начальником всех активных форм кислорода (И.Б.Афанасьев,1988;
'"'• Ю.А.Владимиров и др.,1991). -•:',;
:\
' Большинство аэробных клеток имеет эндогенные антиоксидант.••;• ные ферменты, ключевым из.которых является сушроксвддостлутаза
;V (СОД).;;•>••
;••'-:;> ;.':•-.• /'•'•-".
"-'Ч.
'«'•.•
..,-•. '••!•"' В связи с тем, что „сперматозоиды барана более, подвержены п е Ч : роксидации лилидов, м ы предположили,.что это может быть связано
г с различным уровнем содержания данного фермента в сперме сравни'• ваемых видов' животных. ~j. •
".В связи с этим, нами были проведены эксперименты по сравни- '
'- тельному изучению концевтрации супероксиддасмутазы в нативной и
криоконсервнрованной сперме баранов и быков.
Результаты изучения активности СОД в нативной сперме доказали^: что в гаметах, барана в быка активность фермента была практи­
чески одинаковой: 2 2 и.25 ед.акт/10 9 к л соответственно. ;.
. В с е м е н н о й плазме баранов и быков активность СОД соответст­
венно составляла II и 8,7 ёд.акт/мд. .
.
/'•.:•- - Д а н н ы е о влиянии'процесса замораживания-оттаивания н а актив­
ность СОД в.половых клетках-представлена в табл.4.Результаты этого эксперимента показали, что процесс замора: живания-оттаивания;оказал значительное влияние на потерю внутри­
клеточного фермента половыми клетками,, что сопровождалось его
- у т е ч к о й в.инкубационную-среду.;.
'Г ,
- Установлено.также, что имеются определенные межвидовые р а з ­
личия по скорости утечки внутриклеточной СОД из спермиев после
'. и х кржообработкж; Так, скорость выхода фермента из гамет баранов
была заметно выше, чем у быка. Максимальный выход СОД и з половых
: клеток барана наблюдался уже через 60 минут после оттаивания, в
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
.
•
•
•
•
•
-
.
1
4
- . . • • .
Таблица 4'
Влияние криоконсервации на утечку СОД из спермато­
зоидов в окружающую средуОбразцы спермы
(инкубация при
37'С)
|
Баран ( п =10) |
Бык ('п=8)
1подвижность1активность 1подвижность]активность
!гамет(в %) 1 ' СОД. 1гамет(в %) ! СОД •
!
1(ед.акт/мл !
. !(ед.акт/мл
1
1 сиены) !,.,,,.„ .|.'!
свет)
До замораживания
82*5,7 . 2,2*0,2
80*8,1
2,3*0,1 .
Через 15' после
оттаивания
41*4,8
; 6,7*0,4*?
40*6,2 .5,3*0,3*
Через 6 0 ' после
оттаивания
32*2,8
* 7,5*0,2я*" ;. 30*4,1 . 5,3*0,2*
Через 120' после
оттаивания •
25*3,4
.7,0*0,3** •; 28*5,0
8,2*0,4**
* Р<0,05; ** P4.0.0I.
-;!V'r /. .,
то время как у быка - через 2 часа. Хотя снижение подвижности "
гамет сразу после оттаивания и в течение инкубации у обоих вхдов
животных было практически одинаковым. Следовательво, в плазмати­
ческих мембранах сперматозоидов барана после их оттаивания.быст—
рее развиваются криодеструктивные повреждения, в частности, из­
меняется их проницаемость, следствием чего'к является более
быстрая утечка супероксиддисмутазы из клеток в окружающую.среду.
Снижение активности СОД в спермнях в результате крисконсервацжл
может способствовать увеличению внутриклеточной концентрапди .:'
активных кислородных радикалов, способствующих бнодеструкции и
инициации пероксндапии липидов в спермиях, что может снижать .
фертидьность оттаянной спермы животных.' .•"./'','.
3.1.4. Криогенные изменения метаболизма некоторых
V
фосфатов,спермы '
;'•''''•''
С целью выяснения вопроса о возможности изучения криогенных
изменений метаболизма некоторых фосфатов в сперме животных с по­
мощью метода 3?Р-пЯМР-к;пактроскопии, были проведены опыты на; .• \
сперме баранов и быков. В результате анализа спектров . Р - Ш Р
кативкых образцов спермы баранов и быков было установлено; что
сигналы фосфора в области (+0,35) м.д. обусловлена фосфатной . • ;
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
•' '
'-15группой глжцеро-3-фосфорилхоляна (ГФХ), а в области (+0,6) (+1^3) м . д . - неорганическим фосфатом ( Р£ ) .
Результаты измерений интенсивностей сигналов ГФХ и Pi в еб: разцах спермы до н после крноконсервацни показали', что в н а и в ­
ной сперме барана концентрация ГФХ и Pt" была выше по сравнению
с таковой у быка, на 35 и 40? соответственно (Р>- 0,05). Криообработка не оказала влияния на содержание в сперме обоих видов
животных глицеро-3-фосфорилхолина.
Более.заметной была тенденция изменения концентраты в от; таянной:сперме неорганического фосфата.
Так, в сперме быков концентрация Pi через 2 часа после от­
таивания и инкубации.при 37°Сувеличилась на 22?, а в сперме
баранов, за тот же период наблюдения, его концентрация возросла
на 50? (Р>0,05). Динамика содержания изучаемых веществ в сперме
после оттаивания практически не коррелировала с подвижностью га­
мет. Снижение их подвижности после замораживания-оттаивания бы­
ло сходным у обоих видов животных. Результаты данных эксперимен­
тов свидетельствует, что в сперме баранов.имеется более выражен. нал.тенденция варастаяия концентрации неорганического фосфата
после заморажжванхя-чтаивания. Не исключено, что пониженная
фертяльность криоконсервированной спермы"баранов может быть свя. зава с этим фактом. '
•• ' у
3.1.5. Гоиадотрошаая активность семейной плазыы
. • . . - • животных, .
С целью повышения результативности осеменения овец криокон­
сервированной спермой актуальным является изучение биоактивных
веществ семейной плазмы я хх сохранности в процессе заморажива­
ния-оттаивания. Недавно установлено, что в семенной плазме вер­
блюдов содержатся вещества, индуцирующие овуляцию у самок этого'
вида ( &. СА.еп.
,1985). В этой.связи мы предположили, что и
в семенной плазме баранов и'быков может содержаться подобное
вещество, ж не исключено, что.неодинаковая криостабильность дан­
ного вещества может быть связана с фертилькостью оттаянной спер­
мы(ЭТИХ ЖИВОТНЫХ.'
" Д л я выяснения этого вопроса были проведены эксперименты на
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
-16 - ,
крольчихах, которым вводили внутривлагалищно натквнуп, или криоконсервированную семенную плазму различных видов ;животных(табл.5).
•
Таблица 5
Влияние нативной семенной плазмы животных
ч
:
на овуляцию у крольчих'
I1
,|
;
<'
"
Г
'
'
'
••• •
i I
Вид
{Объем вве-{Число кроЧ-Число крольтОбнаружено][Количество .
животных (денной
{льчих в {чих с овуля-гжвлтых тел;желтых тел
(Плазмы(мл)}опыта
|цией .
j (всего) '.на самку
I
!
*
!
Баран
Бык
Жеребец Кролик >
Хряк
*
Т О
1.2
.
1.0
1,0 '
1.2
I.I
'
ТП
10
12
10
9
13
*
'
-. • -
I -
.'••
'
"
I *
.
•
• " '
•
•
'
-
'
.
'
-
•
•
-
'
.
.
-
•
•
-
-
-
"
• ' - .
7.5
.-'.••'3
•; V
.
•
'
-
•
6
.--•45
. .; J.:.'"
3
•
II
-----
-
•
•
•
'
.
•
•
'
•
•
'
•
' '
'•-
"
•
'
—
•
-
Из таблицы видно, что семенная плазма быков оказала стиму- .
лирующее влияние на овуляцию у крольчих. Овуляция наступила у.
• 50£ самок. Это свидетельствует о том, что в семенной плазме бы­
ков содержатся какое-то вещество, индуцирующее овуляцию у кроли­
ков.
•
'.'.•.
•".:•
У , :.
--•" .'•.'.".-•:.';" "-"•;'
Опыты по изучению сохранности биоактивного вещества семенной плазмы быков после крио- и высокотемпературной обработки по­
казали, что процесс глубокого замораживания семенной плазмы бы- ка не оказал ииактивирупцего влияния на активность ее овудятор- .
ного фактора. ••'•. •.••'. '" ".'_- . -.-...-•;. -;•'•Нагревание же семенной плазмы до 90°С привело к подвой инак­
тивации данного фактора. Представляет несомненный практический.
интерес выяснение природы данного фактора я его влияния да репродуктивную функцию у КРС. '-.'..ч •
.::'.,',
3.1.6. Иммуномодулирующие свойства семенной плазмы •••,:'•
Известно, что в семенной плазме животных содержатся хыыунодепрессаяты (В.И.Говалло,1987Ь -. ;.'; ;' •;- „-у . . . . , " : / . ;
В связи с проверкой гипотезы о возможных криогенных кемене* киях иммунорегулирующих свойств семенной плазмы баранов мы исот- •
ледовали иммувосупрессивное влияние их ватяввой и кржоконсерви-г
рованной плазмы на аллогенные лимфоциты крови, ;у • '":
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 17.-' " .
... Результаты экспериментов показали, что добавление нативной
семенной плазмы баранов к культуре клеток крови при.разбавлении
1:200 и 1:400 оказало некоторое супрессивное влияние на бласт- •
трансформацию лимфоцитов, при атом включение ^Н-тимидина в лим­
фоциты по сравнению с контролем било ниже на 18 и 12$ соответст­
венно (Р<С0,05). При снижении концентрации семенной плазмы в
культурной среде, начиная с разбавления 1:800, отмечено ее стиму­
лирующее действие на включение монокуклеарами мечоног.о предшест­
венника. При добавлении же в среду культивирования плазмы в раз­
ведении 1:3200, стимуляция включения 3Н-тигл1Дина составляла 350£
по сравнению с контролем (Р^-0,01). "
.'_.•-./Культивирование мононуклеаров в Гфисутствии заморожешш-оттаянной семенной плазмы при всех разбавлениях привело к значите­
льной стимуляции включения 3Н-тимидина.
•
При.этом.максимальный уровень включения метки был в культу­
рах с разбавлением плазмы 1:600 и 1:1600 и превышал таковой в
контроле в 6,1 и 6,2 раза соответственно (Р-^-0,01). Резкое уси­
ление иммуноактивирующих свойств семенной.плазмы после криообработки, вероятно,.может быть связано с понижением фзртильности
криоконсервированной спермы баранов.
-".••'= 3.2. Влияние различных веществ на криоустойчивость
спермы барана
3.2.1. Действие неэлектролитных и электролитных
компонентов средыВ технологии длительного хранения спермы баранов первосте­
пенное значение отводится разработке более совершенных криозаюжтных разбавятелей.
На основе комбинации различных соотношений ксилита, лакто­
зы, трис-(оксиыетжл)-аыиноыетана, декстрина, глицерина и желтка
куриных яиц, трнлона-Б вами была разработана новая синтетичес­
кая среда для замораживания спермы баранов, названная ПШС-тржс-буферной средой (глжцернно-жвлточно-углеводно-комплвксонатнотрис-буферная среда).
.
м
Оптимальный состав данной среды следующей, г/100 си 3 дис­
тиллированной веды: лактоза - 8,4; декстрин кукурузный - 5,0;
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
••--•'"-
i e >
;.
•
х о л и т - 0,26; трнс-(оксиметил)-аминометан - 0,105; трилон-Б - 0,133; глицерин - 6,0; ж е л т о к - 20,0.
Проверка крнозашитного влияния различных декстринов, при
их введении в состав новой среды, показала, что лучшими защит­
ными свойствами на спермин барана обладает кукурузный декстрин
с растворимостью 67£. '. ' ' ' " •
При изучении криофилактического действия на сперму барана
различных концентраций глицерина в составе ГЖУК-трпс^уферной
среды было выяснено, что наивысшие показатели подвижности и в ы ­
живаемости оттаянных слермиев получены при концентрации глице­
рина 4-6%.
:•-.•••.'.': "
Выяснение оптимального срока эквилибрации глицерина со.
сперматозоидами показало, что различная продолжительность вкспознцди глицерина с половыми клетками барана (5, 15, 3 0 , 60 и
120 мин до замораживания) не оказывает значительного влияния на
их подвижность сразу после оттаивания. Однако, срок выживаемос­
ти оттаянных сперматозоидов резко снижается при сокращении вре— .;
ыени их экспозиции с глицерином до 5-15 минут. Поэтому оптималь­
ный период инкубации спермы барана с глицерином в ГНУК-трис-буферной среде должен быть не менее 60 минут. "^
После установления оптимальных дозировок различных компо­
нентов и способов их введения в состав новой среды/.мы проанали-;
зировали криозащитные свойства новой среды по сравнении с гуммиарабиковой, которая применяется в практике осеменения овец.
Было установлено, что при замораживании спермы бараков в н о ­
вой сроде, подвижность оттаянных сперматозоидов и их выживаемость
; была выше, чем в гуммиарабиковой среде .(Р•£0,05).".Это позволяет
увеличить степень разбавления"свежеполученвой спермы.без снижо—
'ния числа биологически полноценных гамет в дозе дляосеменения. \
Одномоментное разбавление спермы в опытной среде не оказа- .
ло отрицательного влияния на подвижность гамет по сравнению с
двухмоментным разбавлением в гуммиарабиковой среде. :;:.'•_-:-'^~у:
В следующем эксперименте изучали результативность искусст- '
в в ш ю г о осеменения овец спермой, замороженной в ПЕУК-трно-^уферной и гуммиарабиковой среде-(табл.6). .••'*-'"••••'•' 'V.
•:
'•'• ''-у'•':•'/
Было установлено, что в опытной группе объягнился такой ж е . ' ,
процент маток, как и в контроле, несмотря на уменьшенное число. .
сперматозоидов в дозе для осеменения. Многоплодие маток также :
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
не.отличалось до группам.
•
'-''•;'.':
Таблица 6
;_; ;;> v'••-••''
Эффективность искусственного осеменения овец •
./ \ спермой,замороженной в различных средах ,
1Ствпень!концен- }0с&- {УчтвтОбъ-1,? объягА!Чнсляо
• разбав-i грация {мене-} но {ягнит-нившихся} ягнят
Состав среды {ления {сперма- {но {
{лось:
{на мат{спермы |Тозоидов|овец |
j
j
|ку
'-'•""•
-|-'•••'-
jB д о з е "
i
t
i
,|
|
после от*.
'таивания-
. ....,.,. , . , • . , , . '
_'
'
i
. -i
ГКУК-трис-бу.. •
-. • •
ферная -.
.1:3
60-70 109 101 52 51*4,9
1,4*0,3
:онтрольная , '""
~-"~г .'.-'••:
,гуммиараОико- - • . -' - •
. '
вая) ^
1:2
80-90 ; 103 99
51 52*5,0
1,5*0,2
Преимуществами новой ГЖУК-трис-нЗуферной среды для заморажи­
вания спермы баранов, по сравнению с гуммиарабиковой, является
. возможность снижения числа сперматозоидов в дозе для осеменения.
При этом можно на 20-25? увеличить количество заготовленных
• спермодоз, получаемых при замораживании спермы от одного барана.
•' Это позволит повысить коэффициент племенного использования особо
ценных производителей. Кроме того, использование данной среды
более технологично по сравнению с гуммиарабиковой, т.к. допуска­
ется ,одномоментное разбавление спермы.
..~ •..':
Данная среда одобрена и рекомендована к практическому при• менению Ветеринарным фармакологическим советом ГУВ СССР (прото.; кол * В от 13 декабря 1988 г.).
.
I
3.2.2. Криозащнтные свойства сухих яйцепродуктов
В задачу наших исследований входило изучение криозащитного действия сухих яйцепродуктов при замораживании спермы баранов.
: Было установлено, что сухой желток и яичный порошок куриных
яиц оказывает выраженное криозащитное влияние на гаметы барана.
Лучшие показатели' по подвижности и абсолютному" показателю ..
: выживаемости были'получены при использовании сухих яйцепродук­
тов в концентрации Л%. Поэтому, именно с этой концентрацией яй­
цепродуктов в составе ПОГК-трис-буферной среды были проведены
дальнейшие лабораторные ж производственные испытания. •' ••'
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
-
20
-
'
•••••
В следующем эксперименте изучали возможность совместного г.' •
хранения сухих яйцепродуктов с другими компонентами синтетичес- '
кой ГЖУК-трис-буферной среды при различных температурах, а так- ,
же влияние сроков хранения.на юс криопротективнне.свойства. Изучение возможности совместного хранения сухих яйцепродук­
тов с другими компонентами ПКУК-трис-буферной среды при различ­
ных температурных режимах показало, что температурный режим
хранения оказывает значительное влияние на биологическую полно­
ценность препаратов. При температуре 4°С срок хранения сухого
порошка и желтка удлиняется^ Совместное хранение яйцепродуктов
с другими компонентами синтетической среды неблагоприятно вли- -••
лет на биологическую полноценность криоконсервировакной спермы. •••'
Максимальный срок хранения сухого желтка составляет 6-Э месяцев,'
а яичного порошка - 3 месяца при температуре 4°С. •: ••'•-.
'
Затем.были проведены производственные опыты по осеменению
овец спермой, замороженной с сухими яйцепродуктами в составе,
ГЖУК-трис-буферной среды (табл.7). •
••.' "'
•-..: '•. •• Таблица 7 •:'- >
Результативность осеменения овец спермой,замороженной
с сухими яйцепродуктами • • v ' .. . • •
.
••
,' ;
!концен-|Осеме|Выбыдо|Учте(Объяг-ч£ объяг-чПолучеГруппа опыта {традая ,нено {из опытно }нилось!нившихся!но я г }яЙцепро*сввц {та.
}
i
!
,{нят на
. |дуктов.)
,{ у j
|
{ .;..••• {овцу
Сухой желток
4
Яичный порошок 4
Контроль
(нативный жел­
ток)
20
72
128-
2
70
4 '. 124
181 .- 8
33 47±5,9 1,42^0,1:
65 52,4±4,5 1,45*0,3
• 173 , 87
50±3,8
I,45±0,I
;
Из таблицы 7 видно, что замораживание спермы баранов о су- .
хими яйцепродуктами не оказало отрицательного влияния на биоло­
гическую полноценность сперматозоидов. В опытных группах про- .
цент ягиения овец был практически одинаков с контролем/что сви-;
дотольствует о высоком криозащитном влиянии испытанных препара­
тов.
";'.'''•.: :'•.;;.'."
:•'". ,.i ;'•:": ;.\
Экономический эффект от применения сухих яйцепродуктов в \..' :"составе синтетических сред для спермы животных складывается из .
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
•••;
••.-.
.
."- 2 i
-
снижения себестоимости среды и сокращения расхода куриных яиц
для долей искусственного осеменения.
•3.2.3."Влияние антибиотиков '• '
Одним из факторов, оказывающих влияние на результативность
осеменения овец является степень 'ее микробной загрязненности.
Использование антибиотиков при крноконсервации спермы ба­
ранов сдерживалось тем,. что -спермин барана более чувствительны
к токсическому влиянию антибиотиков по сравнении с быками. В
9той связи актуальны поиски менее токсичных антибиотиков-для
их спермы.
' ; .'
•.'•.:--'
•'••
В задачу.наших исследований входило сравнительное изуче­
ние влияния антибиотика "Спермосан-З" и нового антибиотика "Спермосая-ШК" на биологические показатели криоконсервированной спер^
Результативность искусственного осеменения овец спермой»
замороженной о различными антибиотиками, представлена в табл.8.
4
•:"•:'•..••,;.•'"••'-'•,-"'
•Таблица 8 /
...-,'', Влияние антибиотиков на результативность осеменения
•:••• • '.
овец криоконсервированной спермой
-'.'• j
[Доза антигОсеменетОбъягни}^ объягнив|получено
Использование .{Оиотика,
}шихся , {ягнят на
антибиотиков тыс.ед./ {но овец;лось
.
{
-.матку -..
100 мл
'сваны
'
** • • • « • • •
•»
Спермосан-З
25
53
, 2 3 .43*6,8
. 1,4*0,2
..',: 50
32
9 . 28±7,9*
1,3*0,1
25
.'56
28
50*6,7
1,4*0,1.
Спермосан-ШК
•'..•. :'. 50.'-. •
58
26
45*6,5
1*5*0,2
.100 :
33 ..'•'.'•'•; 14
42*8,6—1,5*0,1
Контроль (без
- :'
"59. ..' *:29; 49*6,5
1,5*0,2
антибиотика) :
• - ; • - ' •
-
"
-
,
• p ^ o . o s .
'•
••••''.,:"'.'-
';'•.'.,
'••
Испытания показали, что при использовании Спермосана-3
в дозе 50 тыо.ед. резко снизилась результативность осеменения:
28£ объягнившихся овец против 49/S в контроле' <Р<£0,05).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 22 ":--v".'
. Применение же нового антибиотика, даже в повышенных: дозах.
ц« привело.к резкой? снижению оплодотворяемости маток. Л!учтев
влияние на результативность осеменения оказал Спармосан-ППК
в доза 25 тыс.ед.ЛОО мл среды. При этом, оплодотворяемое» бы­
ла такой же, как в контроле. Использование данного антибиотика
в дозах 25-50 тыс.ед. на 100 ыл среды не оказывает отрицатель- .
цого влияния на результативность осеменения овец замороженной. ".:
олермой, в связи с чем он рекомендован для практики нскусст-'
венного осеменения овец.
:_•":•
. •• . ; ,
.
3.2.4, Действие различных антиоксидантов
В данном разделе работы было проверено криозащитное влия­
ние некоторых кизкомолекулярных тиолов при замораживании спермы бараков в простой лактозо-*алточяо-»глнцериновой и более
сложной - ГХУК-трио~4уферной средах. При этом препараты ксполь- .
зевались в оптимальных дозировках для спермы баранов.
Установлено, что при заморахивании спермы баранов в прос­
той лахтозо-гдйцериночжелточной среде с $% желтка некоторые ,
тиолы оказали высокое криозащитное действие. Так, подвижность •--"
гамет, замороженных в присутствии унитиола, была выше на I I J ,
о плетейном - на 8J и о глутатионом- на S i по сравнению о
контроляем. Абсолютный показатель выживаемости оттаянных с п е р - .
матозоидов при использовании унитиола повысился в 5 раз, а в
группе с глутатионом и цистеином-в 3 раза по сравнению о
контролем ( Р < 0 , 0 1 ) .
.
:
При замораживании спермы с I0J желтка жриозащнтное влия­
ние тиолов выражалось в меньшей степени^ Подвижность"половых
клеток после оттаивания во всех группах была практически одина­
ковой о контролем. Абсолютный показатель выживаемости гамет в
группе с глутатионом превышал контроль на 2Ь%.;
• V .'
. Ирн повышении концентрация желтка в ЛГж-среде до 20£» з а ­
щитного влияния тиолов на хриоустойчивость сперматозоидов от­
мечено не было.'Вероятно, повышенные концентрации желтка ( 1 0 -20$) оказывают положительное влияние на хриоустойчивость спер­
матозоидов, защищая JH-грушш гамет от окисления благодаря ,
содержанию в нем эвдогевных тносоединений, в частности, евросо-.
дёржанэп аминокислот,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
••••
- • . " . -
2
3
-
• • : • :
:
.
.
.
•
•
.
•
В следующем опыте по замораживанию спермы баранов в более
слохпой Г2УК-трис-буферной среде было установлено, что защитно-го влияния тиолы.на половые клетки в данной среде по сравнешш
с ДЛС-средой практически не оказали.
Это свидетельствует о том, что использование для заморажи­
вания спермы баранов более совершенных синтетических сред, в е ­
роятно, оказывает самостоятельное'защитное влияние на сохран- '-~ность ' ^Н-групп сперматозоидов, подобно высоким концентрациям
•желтка.'.-'- '. V 7 ; •-.••'••• " "•'•
"
'•
•; •-...
. В следующей серии экспериментов изучалось влияние новых •
синтетических воднорастворимых антиоксидантов на криоустойчи-вость спермы баранов. Испытано действие следующих препаратов: .анфека-натрия,- феноксана, ИХФАН-2 и ИХФАН-3. Все они являютсяфенольными антиоксидаятами.ч В предварительных опытах были ус- ' '
тановлены минимально токсичные дозировки'изучаемых препаратов -.-'
для спермы-баранов- Оказалось, что таковыми являются для анфе­
ка-натрия - 0,05 мг/мл, феноксона - 0,005, ИХФАН-2 - 0,01 и
ИХФАН-3'- 0,02 иг/ил. .;
-_..'••.
Затем было изучено защитное действие этих препаратов па
живучесть нативной спермы баранов при добавлении к ней экзоген., кых липидных перекисей. :.'••'.'.;
- •'--.:.
Было установлено, что, лучшим защитным влиянием на живучесть
' нативной спермы при добавлении к ней переокисленного раститель.; ного масла, обладал феноксан. При его добавлении абсолютный по­
казатель выживаемости сперматозоидов был в два раза-выше по'
сравнению с контролем (Р< 0,05).
.; , Испытание криозащитного действия воднорастворимых антиок­
сидантов в составе ГЕУК-трис-буферноЙ.среды на спермин барапа
показало, что ни один препарат не оказал положительного влияния
на подвижность оттаянных сперматозоидов или абсолютный показа- '
.таль их выживаемости. Вероятно, гидрофильные антиоксиданти не .
препятствуют процессам ПОЛ в мембране и внутренних структурах .
гамет при их криоконсервации.• '-'^ ;...''
'..•.'
.,:';! В связи с тем,' что в последнее время для оттаивания спер­
мы баранов применяют повышенные температуры (75-80°С), которые
:-'могут ускорять'ПОЛ при перегреванин-спермы, было проверено за*- '
• щйтное действие гидрофильных антиоксидантов на сперматозоиды,
:• при их инкубации при повышенных температурах • (+44°С). :
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
..- 2 4 Результаты этого эксперимента показали, что в условиях по­
вышенной температуры феноксан оказал наибольшее защитное воздей­
ствие на гаметы. При этом абсолютный показатель выживаемости '•_,•
сперматозоидов увеличился на 25£ по сравнению с контролем
(Р<0,05). '
. : ••*
Затем было изучено криозавитяое действие на сперму баранов .
новых жирорастворимых синтетических антиоксядантов фенольного..'
ряда: ИХФГАН-1, ИХФГАН-2, ИХФГАН-3, ИХФАН-26. Предварительное
изучение различных дозировок препаратов на живучесть спермато­
зоидов барана показало, что оптимальные нетоксичные дозировки •
этих препаратов находятся^ пределах 0,02-0,08 мг/мл среды, Результаты изучения криозащитного действия отих препаратов
на сперматозоиды барана, при их замораживании в ГЖУК-трис-<5уферпой среде, на-фоне различной концентрации желтка показали, •'.'•;.
что из всех испытанных препаратов, заметным криозащитным деист-вием обладает только ИХФГАН-3, Причем, его положительное влия- :
ние на живучесть оттаянной спермы отмечено при всех концентра- -.
цкях желтка в составе среды. Оптимальное защитное действие пре­
парат оказал в концентрации 0,04 мг/мл. Использование препа­
рата в данной дозе при 55» желтка повысило абсолютный показатель
живучести оттаянной спермы на 33#; при 10£ желтка - на ЛЬ% и •
при 20# желтка - на 33£ (Р<.0,05). Затем были проведены опыты .
по искусственному осеменению овец спермой, замороженной с опти­
мальной дозой ИХФГАН-3 (табл.9). Овец осеменяли однократно в
течение эструса. •
•
Таблица 9
Влияние ИХФГАН-3 на результаты осеменения овец
криоконсервированяой спермой
Г ~
1 Ж о к с Ж ^ ! и С о в е 5 е Н ° I Объягнилось
V^Jf
Вариант опыта - |^уиоксидан-! овец
• , |*°т*£
:
f
. . .ч
I
I
1 ^ - 1 * ,
»матку
Среда с ИХФГАН-3
0,004 >
33
13
39*8,5 1,5*0,1
Контроль
0
27
8
30*8,8 1,5*0,1
Результаты эксперимента показали, что при использования '
антиоксидаята обьягналось на 9£ больше овец, чем в контроле.
' (Р>0,05).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
' Л ' - "
.'".'•*
••'-
' '"••
,:
-
2 5 ' - .
•:•-:'
•'.•
" •
Следовательно, использование ИХФГАН-3 в оптимальных дозах
повышает подвижность, выживаемость и оплодотворяющую способ­
ность криоконсервированной спермы баранов.
3.2.5. Антиокислительная активность различных
компонентов синтетических сред
Механизмы протективного действия многих веществ, входящих
в состав различных криоразбавителбй спермы, окончательно пока
не выяснены и требуют дальнейшего изучения.
' ..." Поэтому в задачу наших исследования входило изучение аяти- \
окислительного влияния на сперматозоиды барана некоторых компо.вентов, широко применяемых в составе различных криоразбавигвлей
спермы: глюкозы, лактозы, цитрата натрия, хелатона, трис-(окси- '
метил) -аминометака, ксилита, глицерина к декстрина.
';'•'.; Антноксидантжэе действие веществ изучали хемилюминесцентныы методом, при индуцировании переклсного окисления лишдов
в образце сперматозоидов барана с помощью ионов железа.
• . Результаты анализа кривых хемалюминесцендди в образцах
'
"•• сперматозоидов при добавлении различных соединении показали,
что они оказывают существенное влияние на характер протекания
-' свободно-радикальных окислительных реакция при индуцировании
ПОД ионами железа.
Все исследуемые вещества' снижала амплитуду свечения мед. ленной вспышки. Наиболее эффективными ингибиторами развития'
медленной вспышки оказались декстрин и цитрат натрия. В их при­
сутствии интенсивность свечения данной вспышки снижалась соот­
ветственно в 10 и 7,3 раза по сравнению с контролем (Р<0,01).
Глюкоза я лактоза оказали практически одинаковое ингибирующее
/влияние на свечение этой вспышки. '
. - - На основании полученных результатов можно заключить, что
;
все испытанные в данном опыте вещества, помимо их известных
криозащктвых механизмов действия на гаметы, обладают также вн-: радекпыа антдоксидантным действием, у «
Компоненты синтетических сред для спермы животных могут
оказывать, ве только антиоксидактное, но в прооксидантное дейст'.-. -v виз. В частности, в состав большинства криозащитных сред вхвзшт .
':.-.'' желток куриных яиц. В зависимости от сроков хранения яиц/лили-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
'
• • '.
•
-
-
26
-
. . ' " ' . . •
' 't
•"•
. ...
да желтка могут подвергаться перекисному окислению. При атом
продукты реакции ПОЛ, попадая в состав разбавителей для спер­
мы животных, могут оказывать отрицательное влияние на биоло­
гическую полноценность гамет. В связи с этим мы выясняли вопрос
о накоплении продуктов пероксидации липидов в нативвом желтке .
в зависимости от сроков хранения куриных яиц яри температуре ••'.•.
. Анализ проведенных исследований показал, что концентрация
в желтке липвдкых гидроперекисей и малонового днальдегида' уве­
личивалась в 2 раза после десяти дней хранения яиц при 4°С.
В этой связи, при использовании желтка в составе синтетических
сред для спермы животных, желательно использовать куриные яйца,
сохраняемые не более 5-^10 дней при 4°С.
" ' .
'
•
"
'
"
-
*
.
3.3. Влияние физиологических факторов на результа- .
тивность осеменения овец замороженной спермой
3 . 3 . 1 . Увеличение глубины введения спермы в церви- '
калыша канале помощью утерорелаксава '
, веются данные, что глубокоцервихадьное. осеменение овец
замороженной спермой повышает результативность их осеменения •
(В.К.Ыидованов,1984; И.Н.Шаядуллин,1Э79). .
. ; . ' . :
Нами изучалась возможность более глубокого введения спер» .
мы в цервикалышй.канал овец при использовании специфического
миорелаксанта-утероредаксава.
В предварительных экспериментах изучали влияние различных
дозировок препарата на глубину введения катетера в цервикальный
какал овец. Било установлено, что оптимальной дозой является
3-4 мл препарата на самку. Посла введения данной дозы утерорелаксана овцам, удалось в 2-раза увеличить глубину введения ка­
тетера в цервикальный канал (3,5 см против 1,6 см в контроле,
при р 4.0,05).
•'•';,' :;
':. : - ••.-/.'; --.г
Но полностью пройти шейку матки у овец и ввести обычный "•'•'
катетер вкутриматочяо, как вто.возможно у коров,.таким спосс—'
бом не удалось. •
,
!-;• Л
•'•
Влияние глубокоцервихального осеменения овец криоконсервировавной спермой с применением данного метода представлено ~
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
, .,';•• - 27 в табл.10.
'..'•'•'
'"'..'•.'•'
.';•/.-.
' \. - . Таблица 10
Влияние глубокоцервикального введения спермы
. ••
• на суягность овец
• '• . • .'; '•
Труппа опыта
{Доза уте- |ОсемеТУчте-1обьягни|2 обьяг{рорелак{вено {но
[лось
|Нившихся
сана,
Jмл/на
на овцу| • . { • • ' { •
1
•Однократное осеменение:
16 : 40±7,6
4 ;. 42
40
вкспериментальная
0
- 46
46
14 /30*6,7
контрольная
Двухкратное осеменение:
18
'экспериментальная
4 '' '•36•' 36 •
50±8,4
: контрольная, .
45
42
22
0
52*7,7
v
Установлено, что при однократном осеменении в опытной груп­
пе наблюдалась тенденция к повышению результативности осемене­
ния: 402 объягнившихся маток" против 302 в контроле-(Р> 0,05). _
.'' ' При двухкратном осеменении и.двухкратном введении препара­
та не отмечено повышения результативности осеменения. Поэтому,
наиболее целесообразным является однократное введение релаксан­
та' перед осеменением овец. '/:.. •'••,
3.3.2. Влияние сурфагона на результаты осеменения'
В связи.с пониженной выживаемостью заморохенно-оттаянных
сперматозоидов в половых путях овец большой интерес.представ­
ляет изучение возможности регуляции.овуляции у самок с целью',
. осеменения овец криоконсервированкой спермой в оптимальное по
отношению к овуляции время.
.; >
.,-''"'
... Нами было изучено влияние синтетического гокадолиберинасурфагона на результативность'осеменения овец криоконсервиро—
. ванной спермой.. •: ;V\'.'; 'v>'v'.: .•'-;••.';•,' .'''.•'•.' • ' : • • . •'•'
В предварительных .экспериментах была отработана опткмаль- .
ная дозировка препарата.> При использовании сурфагона в дозе
I мкг/па животное, число объягнившихся маток повысилось л а 8%' •
по сравнению с контролем. Повышение дозы препарата привело к;
достоверному снижению результативности осеменения, многоплодие
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
•
-
2 8
-•
.'•..
.;
'.
-
маток было практически одинаковым во всех группахВ следующем опыте мы'сравнивали действие однократного вве- .
докия оптимальной дозы сурфагона при одно- или двухкратном осе­
менении овец в течение эструса (табл.11). , . . , . .
'
•; Таблица II
' v
Результаты осеменения овец в зависимости от
кратности введения замороженной спермы•и при- ' ~ ;
. ' менения сурфагона
"- " :
..'-:.'•;<- •
' ;Доза сур+ОсомегВыбЫтУчтено]Объягни-:^ объягкивГрушта -{фагона, нено }ло }
{лось
{пихся . ;
животных ;мкг/ка :
; . { ••"••. }
.{:•••.
••••••
!
0 В 1
^ ••••
I
I
I
!
I
;
/ . - • : ' •••"•
.
Одшк£а2Ное_осеменекие
"' .
Опытная
:
I
35
- •" 35 . 10. ..'. >?±7,6
Контрольная- '',-/. 42
2 ' 40 '• 12
.30-7,2
••
Двухкратное осеменение
''
Опытная -.
I
129 . : 5 ; 124 . 60 .':. 49^4,5 /
Контрольная" : '.-• 114 :
2
112 • 48
43*4,6 ' ;/
Оказалось, что использование сурфагона при однократном осе­
менении овец не оказало положительного влияния на резулътатив-'
ность ягнения.:При двухкратном же осеменении в течение эструса
в опытной группа объягнилось на &% овец больше, чем в контроле
; :
(Р>0,05).
\ '; У ./-'':•",' -'•••; c'-v •-•"'••
. Повышение результативности осеменения маток в опытной
группе при двухкратном осеменении можно объяснить тем,'что при ...
утренней однократной выборке овец в.охоте, некоторая часть из .'
них попадает в начальный период эструса, когда еще.не произо­
шел предовуляторный выброс ЛГ." Введение же им сурфагона стиму-,'
лирует более ранний выброс 1Г, ускорял тем самым наступление •
овуляции, что благоприятно сказывается на оплодотворяемости
ОВОЦИТОВ.
.:';'\ .; .•" ':
/;" .;'-\ ^ ' . • ..- •'
• Кроме того, у некоторых овец может происходить запаздывание
предовуляторного выброса ЛГ, что-увеличивает время до овуляции.
В этом случае сурфагон также оказывает положительное влияние."
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 29 -
.3.5. Разработка криоконсервируицей среда для ,
;.;
...-.•'-..•••.
спермы быков
. Учитывая положительное влияние некоторых металлов на криоустойчиво.оть спермы животных "(В.П.Кононов, 1982; В.К.Милованов,
Л.С.Жильцова,1982; В.А.НаукД982), целью наших исследований .
было создание.новой синтетической среды для замораживания, спер­
мы быков на основе комплексонатов металлов.
.
В предварительных экспериментах проверяли влияние различ­
ных комплексенатов металлов на живучесть'нативных спермиев бы­
ка. Изучалось действие кальция,.цинка.а меди, закомвлексовакных с этилендиаминтетрауксусной, зтилентриаминпентауксусной,. ]. •'
нктрилотриметидфосфоновой и с оксиэтилендифосфоновой кислотами.
• *. Было установлено, что самая высокая живучесть сперматозон- •
. дов быка отмечалась в комплексонатах металлов с этилендлаыин- •
тетрауксусной кислотой. Поэтому в дальнейшем мы работали с пре­
паратами на основе"данной кислоты. ;'..•'•".-'.'
•";*;
Результаты криоустойчивости сперматозоидов быка при замора; живакии ах в отдельных растворах комплексонатов показали, что '
. подвижность и живучесть сперматозоидов после оттаивания были
' лучший в 5*-ном растворе (.&.).. ЭДТА; 5,1#-ном - (&<-) .ЭДТА и
'.5J5^-HOM - (Ле.).ЗД1А'.;.;.'••,.',;:'-,.
;'/..'•
У ' -'•':•'".-•*•'•
- ' Затем в лабораторных опытах изучали.криозащиткое действие
ва сперму быков различных сочетаний трех комплексонатов метал­
лов: кальция, цинка и меди с ЭДТА. Было установлено; что луч­
шая подвижность и выживаемость оттаянных сперматозоидов получе­
на ери следующих процентных соотношениях изотоничиих ковцевтравдй комплексонатов: (.?«-) ЭДТА - 60^; ( £ U ЭДТА - 20*; ( &*•)
ЭДТА - . 2 0 * илиЛСц.) ЭДТА - 602; Х & . ) ЭДТА - Щ\ ( £ t ) ЭДТА - .
20*. Переведя процентную концентрацию препаратов в весовые со от-.
Ношения было получено два оптимальных варианта синтетической
: среды для замораживания сперма быков. В состав среды J4 t входи­
ли следующие компоненты/ на, 100.мл дистиллированной воды:( -£ц.)
ЭДТА - 3 г , (С*.) ЭДТА - 1,18 г , (Л*.). ЭДТА - 1,1 г , глицерин - "-;
5 мл, желток куриного яйца - 20 ил. Состав вреди'* 2V (* £*•)
ЭДТА Ч"з,06."г, (.Со.) ЭДТА- 1,18 Г / (&д ЭДТА - 1,0 г , .глнае-,
ржн.-*5.»м,.Жблгт6к - 20: Mii/"\:.•[:
':'"••. '":'<•"-'-'•
•
•
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
-
3 0
-
• ' ' • _ . - •
Изучение влияния данных сред на криоустойчивость спермы 'Л
быков показало, что при замораживании спермы в опытных средах '
подвижность сперматозоидов и абсолютный показатель их выживае......
мости после оттаивания были выше, чем в контроле.
' Результаты осеменения коров спермой, замороженной в новых •
средах, приведены в табл.12.
.;• .
Таблица 12 ••.'
• • ' Результативность осеменения коров спермой,замо-"
.
роженноа в комплексе ватных средах
'•
Испытуемые'среды .
•
.
'•
'
,•:Осеменено Tj Отелилось \% оплодотво- •
} коров
,
;ряемости
•
i
i
-
..
.
t
.
.
..
ОпытшяйД
. 51',
."37'
72*5,1 .'
Опытная J* 2
67 ;• •
39 '-.;."'* 58*5,3
Контроль (лактозная)
100
.:' 60 ,
60*4,5
: ~
"
Анализ результатов показал, что лучшая оплодотворяемость
животных была получена при осеменении коров спермой, заморожен--.
ной в среде Я I. При этом отелилось на 12£ коров больше, чем, .
в контроле (Р<£0,01). Это свидетельствует о перспективности .
использования новой среды для замораживания спермы быков! '-'. ••
3.6. Разработка метода прогнозирования криоустой'•'•', ; чивости спермы Оыков.
-. 3.6.1. Взаимосвязь жирнокислоткого и фосфолипидного состава липидов спермц с ее криоус-. ,
' ' .ТОЙЧИВОСТЬЮ
'-'•''
•/'.'-
_'.•'•'
С целью дальнейшего совершенствовакая методов прогнознро- '•.•'
вания устойчивости спермы быков к глубокому замораживанию не- "•
обходимо изучение физиологических механизмов' данного явления ' .
-животных с высокой и низкой криоустойчивостью гамет.
В данном разделе мы изучали взаимосвязь жирнокислотного
' состава общих липидов сперматозоидов и семенной плазмы у бы­
ков с различной криоустойчивостью спермы. Было отобрано две
группы быков: с высокой и низкой устойчивостью гамет к глубок •
кому замораживанию. Результаты исследований содержания жирных
кислот в липидах гамет у быков различных групп показали, что : „
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
• / • ' •' .}/.•;•
'л
V
•..-'•-
31
;-
. из насыщенных тарных кислот у быков обеих групп основная доля
приходится на пальмитиновую. В составе ненасыщенных - преобла­
дает докозагексаеновая кислота.
Было также установлено, что в группе с высокой криоустой..чивостью-спермы в липидах гамет содержалось на 7,1% больше'до'козагексаеновой кислоты: 25,12 против 18,2% в другой группе
(RC0.05).
:
*
В группе быков с низкой криоустойчивостью в их гаметах •
было повышено содержание пальмитиновой и пентадекановой кислот
• (Р<сО,05). По остальным жирным кислотам существенной разницы
.". между группами не отмечено. .
•.
- ••-'[',''•'• При изучении жирнокислотного состава липидов семенной плаз­
мы у.быков с высокой и низкой криоустойчивостью не было выявле­
но различий, как в суммарном содержании кислот, так и по отдель'.., ным жирным кислотам.
' -'
•',' Результаты проведенного исследования свидетельствуют, что
' повышенное суммарное содержание.ненасыщенных жирных кислот в
лищдах гамет.оказывает положительное влияние на устойчивость .
: ;. половых клеток быков к замораживанию.
• Анализ фоофолихидкого состава общих липидов в спермиях
/двух групп быков показал, что существенных изменений'по данному '
... показателю между группами, за исключением фосфатидилсерина, не
отмечено. В гаметах с высокой криоустойчивостью содержание фос. фатидилсерина было на 45% выше по сравнению с другой группой
V. "(P-i0,05)..•;•••'• ;.•::•.•;
:'--.'- • '-••'- ;- •..
. .'••'• ' . ' .
'•';_•' 3.6.2..Механическая резистентность гамет к воз; у . . '
/'. действию ультразвука •
., : • В данном эксперименте изучали параметры ультразвуковой ус-'
; тойчивости половых клеток быков с различной криоустойчивостью
•"'•'•'•.:• • " . Ч т а й я . 1 3 ) . ••;';:.'"•'•';".''/• : .
.'.; .•-.'-
,.••.••..••
Из "таблицы видно,., что между, группами быков имеются опреде­
ленные различия. Так, время полного цатолизиса сперматозоидов
• • в группе с высокой криоусточивостью было на 28% короче по срав—
' -'нению с другой группой (Р-£0,05). В этой группе также на 19#
была выше средняя скорость цитолизиса сперматозоидов: 5,19 и
- . 4 , 2 4 отн.ед. соответственно (Р4.0,05). Вероятно, различия физи-
•С'
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
''.•'."
" • Таблица 13
Ультразвуковая резистентность сперматозоидов . *
быков в связи с их хриоустойчивостью
~ '. -г.
•".
—
Гоупла
опыта .
yj
.• .••
- -• '
'
" " I
'
I I
1
1
iЧисло {Исследо-гСредняя
'{Время
• -.'быков {вано - скорость
{полного
JB групмякуля-|1нтоллзиса,,цитоли|Пе
jTOB
jзиса.мин
( оти.ед.
Высокая криоустойчивость .,
.
.
спермы
5
15
5,2±0,3
1,9±0,2 .
Низкая криоустоСчивость
'
_
.'
. •
спермы.
.
5
15
4,2±0,2
2,7=0,3
чесхого состояния илаодатичсшсис мимарам слот-^атззолаов у бы— ,
ков различных'"груди ответственны за неодинаковую их устойчи- :
вость х воздействию ультразвука ж низких температур.'
3 . 6 . 3 . Уровень микровязкости мембран сперматозои­
дов в связи с их криоустойчивость» I
Следующим этапом наших исследований было изучение уровня
; микровязкости мембран сперматозоидов быков в связи с их кряоустойчивостью. .
-": •
Для изучения микровязкости мембран мы применили метод
протонной магнитной релаксации, поскольку ядра 'Н составляют
большинство в молекулах липидов, которые являются основой кле­
точной мембраны.' .
:, ;
•Мы изучали время спин-спиновой релаксации,(Т2) неводной .
фракции протонов в сперматозоидах быков о различной криоустой- •
ЧИВОСТЬЮ.
Величина Tg является характеристикой молекулярной;подвиж­
ности в образце и служит показателем уровня микровязкости.мем­
бран изучаемых объектов.
• Результаты этого аксперкмента представлены в табл.14.
• Анализ таблицы показал, что в группе быков с высокой крио. устойчивостью спермы, время спин-спиновой релаксации было на
16% большв'по сравнению, с другой' группой: 0,272 мсек против'"
0,233 мсек (Р<0,01). Это свидетельствует о меньшей микровяз­
кости плазматических мембран сперматозоидов с высокой хриоус-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
':
•
•
.
•
' •'•
.
•.-_'•
-
3
3
-
''
тойчшзостью, так как.большее время Т 2 соответствует меньшей
. мшсровязкости мембран...
-.•_--'
- Таблица 14
; Время протонной спин-спиновой релаксации в образцах
.
;сперматозоидов быков в связи с их криоустойчивостью •
I
•'•
| I"*'
" 1
' '
' '
V
'
I
"
•
• {Число Исс-,Подвижность {Абсолютный ,
• - {быков {ледо+сперматозоидов}показатель }
Группа опыта) в {ваяо;
-%;
'.живтчас.ти }T?i мсек
. {группе{эяку-рдо за- ! „„--я {оттаянных }
{
• }ля--{моражв-!{|1Г2Н }сперматозо-{
-••.••
{|тов {ваши - | ° ™ {идов.усл.ед)
Высокая крио- ' :"'•'-•
, •
. .
^
устойчивость 6
36 82±2,5 48±0,4 20±0,5 .. 0,272^0,009
Низкая крио- '
•••'•'-*
j.
л.'-'
' жустойчивость: 5 ' .38 81±5,1 39*2,1 15,2*0,3 0,233*0,006
' .'"При этом подвижность оттаянных сперматозоидов и абсолют­
ный показатель их живучести в этой группе были достоверно вы­
ше (Р<с0,01). Следовательно, пониженная мзкровязкость плазматической мембраны сперматозоидов быков обусловливает повышен- .'
ную их устойчивость^к глубокому замораживании,
: . На основе определения времени слив-спиновой релаксации в
образцах сперматозоидов ; нами разработан способ прогнозирова­
ния крлоустойчивости спермы быков (А.с. № 1813424,1991).
Использование данного способа позволяет увеличить коли­
чество заготовляемых.спермодоз, получаемых от быков о высокой
криоустойчивостьп гамет.
Данный метод может иметь также большое значение для отбо-*
ра быков с высокой криоустойчивостьюспермы при комплектовании
животными плвыпредприятий и станций по искусственному осемене­
нию животных.
.
*'•''.••
• При этом экспресс-прогноз криоустойчивости сперматозоидов
различных производителей можно осуществлять на основе предвари­
тельныхизмерений времени протонной спин-спиновой релаксации
в нескольких образцах их спермы.-;.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 34 ВЫВОДЫ
.'I. Уровень ыикровязкости плазматических мембран спермато- ,
зоидов барана ниже, чем у быка.. В процессе криообработки проис-.
ходит увеличение микровязкости мембран в гаметах обоих видов
животных. Гидрофильные компоненты сред не оказывают влияния на,.
данный показатель. Желток куриного яйца снижает уровень ыикро­
вязкости мембран сперматозоидов, что способствует повышашш их
криорезистентности.
'
2. Криоконсервация оказывает стимулирующее влияние на пе-'.
роксидацип липидов в гаметах барана.
Отличительной чертой сперматозоидов барана является мень­
шая устойчивость к. инициации перехисного окисления липидов по
сравнению с быком.
,,..'.
3. Семенная плазма и сперматозоиды баранов и быков содер­
жат практически одинаковую активность антиоксидантного фермента-супероксиддисмутазы.
. •
Криоооработка индуцирует значительную утечку внутриклеточ­
ной СОД. Одной из особенностей гамет баранов, сопряженных о
криоустойчивостью,' является, более высокая проницаемость их нем- :
Оран для СОД.
V
' •. •
' 4. Специфической особенностью хриоконсервированной спермы
барана является более высокая скорость нарастания в-ней после ~
оттаивания концентрации неорганического фосфата по сравнению со
спермой быка. Через 2 часа после оттаивания спермы концентрация
неорганического фосфата увеличилась на 50 и 22£ соответственно.
5. В семенной плазме быков обнаружено присутствие криостабильного гонадотропного фактора, способного стимулировать овуля­
цию у крольчих. В плазме барана, жеребца, хряка и кролика дан­
ного фактора не обнаружено.
6. Катимая семенная плазма барана в зависимости от степе­
ни ее разбавления, оказывает.кммуносупрессивное или иммуноактивирующее влияние на аллогенные лимфоциты крова вне организма. 'N Глубокое замораживание семенной плазмы резко усиливает ее иммуноактивирующие свойства. "
.•'•_
?. Разработанная ГХУК-трнс-б5фэрная синтетическая среда
для замораживания спермы баранов~повышает криоустойчивость и •
"
*
•
•
•
•
'
.
'
•
•
'
' :
•
'
•
:
.
•
'
.
•
'
•
'
.
'
•
•
•
•
.
'
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 35 биологическую полноценность оттаянных сперматозоидов ,и позволя­
ет получать результативность осеменения овец на практически ,
удовлетворительном уровне (40—50?» ягнения).
8. Сухие яйцепродукты обладают высокими криозаиитными
.свойствами на сперматозоиды барана и способствуют значительному
-. снижению (более чем в 2 раза) себестоимости синтетических сред
• .':' для спермы животных.
'•••.:.•
•
9. Замораживание спермы барана со "Спермосаном-Ш1К",в до­
зе 25-100 тыс.ед. на 100 см? среды,не оказывает отрицательного
влияния на криоустойчпвость гамет и их оплодотворяющую способ­
ность...
"_ • ' •
•'•''.••' • •
; . 10. Низкомолекулярные тиолы оказывают криозащитное деист-.вие на сперматозоиды барана при их замораживании в простых ере-'
. дах с низкой концентрацией желтка. Наиболее эффективное зашит- '
.нов,действие проявляют унитиол и восстановленный глутатаон.
•
"•-';. Воднорастворимые синтетические фенолызые антиоксиданты но
оказали криозащитного влияния на-сперматозоиды барана. Из жиро"•-растворимых синтетических антиоксидантов лучшее криозащитное .
действие на сперматозоиды барана.оказывает препарат ИХФГАН-3
. в концентрации 0,004-0,008?. При его введении в состав ГЕУК-трис-буферной среды оплодотворяемость овцематок повысилась на
•'.'.•_•
s % .
'•;':•'••.
•
[••:••
,.',
, : . . " • : •
'••
•
'
'
.
•-.. II. Отдельные, широко используемые компоненты синтетических
• • :сред, оказывают выраженное антиокислительное влияние на сперма'•'•'••." тозоиды барана. Наиболее эффективное действие проявляют декстрин
и натриевая соль этилен-диамин-тетрауксусной кислоты.
-У.
12. В зависимости от сроков и условий хранения куриных яиц,
в их желтке может происходить значительное накопление продуктов
. •" пероксидапии липидов, которые могут попадать в состав разбавите­
лей для спермы и оказывать отрицательное влияние на биологичес-•
- кую полноценность гамет.v
Через 20 дней хранения яиц при 4?G концентрация МДА в желт­
ке повышается в два раза. .. . -"•'•-. 13., Глубокоцервикальное осеменение овец замороженной спер­
мой при .использовании специфического маточного утерорелаксана
-.'•••. з дозе • 1 мл препарата на животное, повысило результативность
однократного осеменения овец на 10?. .
'
'"•• 14; Однократное вяутржмнавчвое введение овцам перед о семе-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
.-'•'•
' -зе­
ванием синтетического гонадолиберина-сурфагока в дозе X мхг/на
животное, повысило результативность их осеменения криоконсерви- .
рованной спермой на 6-8#.
••'."'•*..
.16. Использование при осеменении овец антистрессового ве" шества - углекислого лития, не оказало положительного влияния
на результаты осеменения.
' , ..
16.' Синтетическая среда для;спермы быков, разработанная на
основе комплексонатов металлов, повышает криоустойчивость спер­
матозоидов и их оплодотворяющую способность на 12£-(72/£ отелив­
шихся коров по сравнению с 60£ в контроле}.
17. Раздельное замораживание эякулятов быков снижает бакте. риальную контаминации оттаянной спермы.
18. Криорезистентность гамет у отдельных быков в значитель- код мере обусловлена жярнокислотным составом их липидов." Поло: житольное влияние на устойчивость сперматозоидов к глубокому
замораживании, оказывает повышенное содержание в ихлипндах полиненасыценной докозагексаеновой кислоты.
-••.'-:••.
19. Предложенный способ оценки качества спермы быков позво­
ляет отбирать быков с высокой криорезистентностью спермы и прог­
нозировать криоустойчивость их эякулятов, путем измерения с по­
мощью метода протонной магнитной релаксации микровязкости мемб­
ран половых клеток.
-"..
.# ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЮХЕНИЯ
'.
1. С целью повышения результативности искусственного осе—
.
менекия овец кркокоясервированной спермой рекомендуем племпред- .
приятиям для замораживания спермы баранов использовать ГЕУК-трис-<3уфсрлую синтетическую среду следуадаго состаьа,г/100 см 3
воды: лактоза-8,4; декстрин-5,0; ксилит - 0,26; трис-(оксиметил)-аминометан - 0,105; трилон-Б - 0,135; глицерин - 6,0;
желток - 20,0; спермосан-ППК-50-100 тыс.ед. '
•"•.;'••
2. С целью.снижения себестоимости синтетических сред для
.замораживания спермы баранов, рекомендуем использовать в качест­
ве криопротектора сухой яичный желток иди яичный.порошок в кон- .
центрации 4-5/f.'-.'••'.-''•"'"'.• '"••••;
3. Для повышения эффективности осеменения овец заморожен­
ной спермой предлагаем вводить сперму глубокоцервккальяо путем /..•
.»
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
- 37 - '•
использования однократной внутримышечной инъекции овцематкам
."' за 30-60 минут до осеменения утерорелаксана в дозе 3-4 мл пре­
парата на самку. ••.'-'•
..'•'."•••' '
4." Для повышения криоустойчивости и оплодотворяющей спо- :
собкости спермы быков предлагаем комплексонатнуп синтетическую '
среду для ее замораживания. Состав среды, г/100.см3 воды: %„, •
(ЭДТА) - 3,0; Со. (ЭДТА) - 1,18; Си. (ЭДТА) - 1,1; глицерин.- 5,0;
желток - 20,0.
5. С целью прогнозирования криоустойчивости спермы быков
^предлагается метод оценки качества спермы, основанный на изме­
рении времени протонной спин-спиновой релаксации в сперматозои­
дах. .. • ••
,'-'':''•''.:"
••."•.
':•» • ''•• .•
;
Список основных работ, опубликованных по теме
• ;';'• /диссертации
'•••':•••-••': I. Кононов В. П., Ерохин А.С., Нарижный А.Г. Действие мно­
говалентных металлов на воспроизводительную функцию животных
//Доклада Б А С Х Ш Л , - 1 9 8 3 . - № 5.-С.28-30.^
^
:: 2. Жильцова Л.С.-, Ерохин А.С., Селиверстова И.А. Замора­
живание спермы быка в средах с комзлексонатами металлов. //Дон- '
лады В А С Х Ш Л . . - 1 9 8 5 . - * 1 . - С . 3 3 - 3 4 .
'- "'
••'•;;'•..•'•'-3» Ерохин А . С ' Снижение бактериальной загрязненности спер­
мы быков-производителей //Биология воспроизведения и технология
искусственного осеменения с.-х.животвкх:.-М.,1986.-- С.45-4Э.
• ч 4. Платов Е.М.,-Дерякенцзв В.И., Ерохин А.С. и др. Мето­
дические рекомендации го технологии взятия, глубокого заморажи­
вания и использования спермы баранов-произврдителеи при искусс­
твенном осеыека кии овец, - U. ,1986. - 16 с.
.;5. Ерохин А.С. Глубокоцервикалькоа осеменение овец замо- '
рожеквой спермой с использованием релаксанта //Селекция с.-х.
животных по технологическим признакам. - М.,1987. - C.16I-I64.
• 6. Ерохин А.С., АвановН.Я. Замораживание спермы баранов
в среде с декстрином //Зоотехния.'•-•* 1988. - Л 10. - С.46-47.
".''::У."'.:?..'.Платов Е.М., Балашов Н.Г. ,v Деряжанцев В.И., Ерохин А'.С. /
ц др.>. Синтетическая среда для разбавления и замораживания • спер1Ш жавотша //Авторское свидетельство А 1408576,1988.
. .:
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
' • ' • • • -
-
3
8
-
8. Ерохин А . С , Платов E.U., Тимофеев К.Н., Кондаков Е.В.
". Структурное.состояние мембраны сперматозоидов барана и быка
• "после криовоздеиствия //Доклады ВАСХНИЛ. - 1989. - Л 3. - С.30-31,
'
9. Ерохин А . С , Петрова Т.И., Тхачева О.П. Использование .
"яичного порошка в средах для замораживания спермы //Зоотехния. —
, 1989. - » 8. - С.65-67. -...'
''-у :
ч 10. Ерохин А . С , Семенова В.А., Тимофеев К.Н.,'Кондаков Е.В. .
О влиянии компонентов синтетических сред на плазматическио меы- :
'•• брани сперматозоидов быка и барана //Сельскохозяйственная био- '.-.
логия. - 1969. - » 6. - С.35-38. :
.'.".'•.':;-у;.V :•" II. Платов Е.М., Ерохин А . С , Деряженцев В.И. и др.:.Среда->ц
для замораживания спермы животных //Авторское свидетельство. .„:Л"."
: ;
.' '* I50I333.I989. '• •
" -•'-'-:•."/ '. • :-.:'-/'Г::0л.;,'-:;:'.
.'. 12. Ерохин А . С . Криозааатное-действие сухих яйцапродуктов •
• н а сперматозоиды барана в зависимости от условий и х хранения . . ; '
//Биология воспроизведения и биотехкологкческие методы разведе­
ния с.-х.животных.,- Ц.,1989. - С.28-32.'.''•. : .-- : ','.'
. 1 3 . Ерохин А.С. Замораживание спермы в среде о сухим х е л - ."-.
тком //Овцеводство. - 1990. -.* I. - С.22-23.
;'•;•->.
14. Ерохин А . С , Деряжекцев В.И. Использование сурфагона
при осеменении овец //Овцеводство. - 1990» - Ш 4. — С.Зб-37. .:
15. Ерохин А . С , Кучкина К.Д., Турбин В.Ф. Криоустойчи:
вость сперматозоидов быка в связи с хирнокислотныы составом их
' . дипидов //Доклады ВАСХКИЛ. - 1 9 9 1 . - й 5. - С45-47.
• 16. Ерохин А.С., Черных В.Я. Влияние плазмы спермы.сельо• нехозяйственных животных ва овуляцию у кроликов //Доклады ВАСХНИЛ.
;' -1991.--Д.6. - с.48-50. v
•-..
•.••••-Л: ;•'•;•/:;:•'•••..
i
1 7 . Ерохин А.С., Деряжекцев В.И. Перекисное окисление л ж - v видов в сперме баранов //Овцеводство. - 1991.- * 3; - С.17-19.
|
18. Ерохин А . С , Деряженцев3.И. Антибиотики при осемёяе- ^
- нжя замороженной спермой.//Овцеводство. -1991. - J* 5. - C.2I-22. ~
г19. Ерохин А . С , Деряженцев В.И., Ахсвтина М . С , Барсель
В.А. Изучение перекисиого окисления дипидов в сперматозоидах
барана и быка методом индуцированной хемилилшеспонциа //Дохла- :
•'• ды ВАСХНИЛ. -1992. - * I. - C.50-S3. ,
..;* '• • '•••-•"'•'•-У-:. '••'^ •"•
20. Ерохин А . С , Деряжекцев В.И. Защитное действие федак: сана на. спермжи барана //Зоотехния. - 1992,. - * 2. - С. 17-19." .
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
•
.
- 39 -. .-.
• , . 21. Ерохин А.С., Мурза 1.И., Сергеев А.И. О крирустойчивости сверматозоддов быков в связи с микровязкостью плазмати­
ческих мембран //Сельскохозяйственная биология. - 1992. - Л 2.
. - с.56-61.. •'•:
':
22. Деряженцев В.И., Ерохин А.С. Наставление по примене­
нию ГЖУК-трис-буферной среды для разбавления, замораживания,
хранения н использования спермы баранов-производителей. -.
ВНИИплем. - 1992, г II с.
.
:.'•••.'
23. Ерохин А . С , Чернова И.Е. Влияние тиолов'на криоустойчивооть спермы//Овцеводство. -1992.''-.*' 4. - С.22-23.
24.Брохин А1С, Деряженцев В.И., Кучкина К.Д. и.др. Спо­
соб оценки качества спермы быков //Авторское свидетельство . .* I8I3424.I992.
^
' 2 5 . Ерохин А.С. Изучение пероксидации липадов в компонен­
тах разбавителей спермы животных //Доклады ВАСХНИЛ. - 1992. * 6 . - С.42-44. .-'.,
"••;.'•/:.""'/':
26. Ерохин А.С., Никольская Т.А. Изучение иммуносупресснвных свойств семенной плазмы баранов //Доклады Российской
академии с.-х.наук. - 1993. — J» 2 . - C.67-7I.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Подп. к печ. 17.02.94.
Объем 2,5 п. л.
Зак. 86.
Тппографпя МПГУ пмопп В. И. Лспппа
Тпр. 100
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
8
Размер файла
1 230 Кб
Теги
991
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа