close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

413

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
АКАДЕМИЯ НАУК СССР
ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А. Н. БАХА
На правах рукописи
J-3WSU
УДК 581.19:633
КОНАРЕВ
Алексей Васильевич
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
БЕЛКОВ ЗЛАКОВ
03.00.04 -г биологическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
МОСКВА
1987
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа выполнена в отделах молекулярной биологии, генетики н био­
химии Всесоюзного научно-исследовательскою института растениеводства
им. Н. И. Вавилова.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
В. В. Мосолов; доктор биологических наук, профессор 1А. fc. 1 'урвичд
доктор биологических наук М. А. Белозеоский.
доотов ToxEH^ecKzsjiayKj профессор Ю.Попов ц
Ведущее учреждение"П1н"стйтут физиологии растенйПмТ К. А. Тими­
рязева АН СССР.
Защита состоится «
1987 г. в 10 час.
на заседании специализированного совета Д 002.96.01 по защите диссер­
таций на соискание ученой степени доктора наук при институте биохимии
им. А. Н. Баха АН СССР (117071, Москпа, Ленинский проспект, 33,
корп. 2).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической ли­
тературы АН СССР (Ленинский пр., 33, корп. 1).
Автореферат разослан «
"П"^ VU^JfVlJfU)
*,>»
Ученый секретарь
специализированного совета,
доктор химических наук
Ч-КЛЛЛ VW TV)
1987 г.
К. Л. Гладилин
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В биохимии белков зерна злаков веду­
щая роль всегда принадлежала исследованиям, связанным с про­
блемами качества урожая (Кретович, 1958, 1973, 1981; Козьмина, 1959; Княгишгчев, 1959; Вакар, 1961; Пенс и др., 1968). •
Такая направленность вполне объяснима, поскольку среди злаков
основными объектами чаще всего являются рис, пшеница, рожь,
.ячмень, овео п кукуруза, зерно которых служит главным источ­
ником пищевого белка. Большинство других злаков дают очень
мелкие семена* не имеющие пищевой или кормовой ценности.
Главным образом поэтому биохимия белков семян ьшогих культур­
ных и дикорастущих злаков, например, кормовых злаковых трав
разработана очень слабо или совсем не разработана.
В последние десятилетия белки семян злаков привлекают
внимание биохимиков в связи с перспективами использования их '
как биохимических маркеров для решения различных теоретиче­
ских и практических задач прикладной ботаники, генетики и
еажекции.
В настоящее время можно выделить два основных направле­
ния, по которым эти исследования развиваются наиболее успеш­
но. Одно из них - идентификация и регистрация генетических
ресурсов пшеницы и ее ближайших сородичей по спектрам проламина (Конарев и др., 1970; Созинов и др., 1973; Конарев,
1980, 1983; Созинов, 1985; Autran and Bourdet , 1975). Дру­
гое направление - решение проблемы происхождения геномов по­
липлоидных пшениц и выявление геномных отношений пшениц о их
дикими сородичами. Значительные успехи достигнуты здесь бла­
годаря использованию в качестве филогенетических маркеров
неглиадиновых белков спирторастворимой фракции семян (Кона­
рев И др., 1970, 1976; Johneon , 1969, 1972, 1975).
Вопросы родства видов, идентификации и регистрации сор­
тов, биотипов и популяций - узловые для современной селекции,
в основе которой - использование всего разнообразия ресурсов
культурных растений и их диких сородичей. Они актуальны как
для зерновых, так и для всех других возделываемых Б Л О К О В , в
том ,чи~ле, кормовых и пастбищных злаковых трав - представи­
телей триб овсовых, тимофеевковых и мятликовых. В последние
тода интерес к этим культурам в нфгей етран§>1ВД$1ф$<ЖАвязи
имени К.А. ТямируйсЕЗ
Ц Н Б имени Н.И.^&глезновг
Фонд научннй^литературы
•а^г
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
о необходимостью создания прочной кормовой базы для животно-водства.
Прогресс в использовании современных биохимических и ш лекулярно-биологических подходов к изучению ресурсов злаков
одерживается из-за недостаточной изученности белков их семян.
Так, к настоящему времени сравнительно хорошо исследованы
лишь проламины пшеницы, ржи, ячменя и кукурузы. Слабо изучены
проламины овса, риса и просовидиых и практически не изучены
эти белки у других злаков. Что касается природа непролоиановых белков спирторастворимой фракции, включающих вндоспецифичныв антигены, то она оставалась неясной даже у пшеницы.
Цель нантей работы - изучить белки семян видов злаков для
эффективного использования их в генетическом и филогенетиче­
ском анализе этих растений и освоения ресурсов семейства Роаoeae Barnh. как исходного материала для селекции.
Научная новизна и практическая значимость. Выявлены и
охарактеризованы видо-(ген<эмио-)специфичные белки - аптигены
семян пшеницевых, обосновано использование их в идентификации
геномов и геномном анализе полиплоидных злаков; во фракции
альбуминов идентифицированы и охарактеризованы как антигены
ингибитор ' ос-амилаз - альбумин 0,19 и "специфический альбу­
мин" мягкой пшеницы, по которому в иммунохимичёскшс реакциях
отличаются ее белки от таковых твердой пшеницы. Показана воз­
можность использования этих бачков в оценке степени родства
между видами в пределах трибы пшеницевых. Выяснен компонент­
ный состав проламияов и сопутствующих им белков спиртораство­
римой фракции семян представителей основных триб злаков. Изу­
чены свойства проламинов представителей трибы мятликовых. Об­
наружена и охарактеризована новая группа проламинов - быстрые
проламины ( Ш ) , характерные для представителей ряда триб зла­
ков, но отсутствующие у пшеницевых. Изучен полиморфизм прола­
минов представителей трибы мятликовых. Получены доказатель­
ства в пользу родства проламинов (проламиновых генов) пшени­
цевых, овсовых и мятликовых. Предаожены номенклатура и единый
эталонный спектр электрофоретических компонентов проламина,
позволяющий записывать в виде белковых (проламиновых) формул
сорта и биотипы всех видов семейства злаков.
В ходе изучения природы и свойств видо-(геномно-)специ­
фичных белков антигенов приготовлены выоокоспецифичные вммун4 ' '
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ные сыворотки на оти белки, обеспечивающие более надежную
идентификацию генома. В результате изучения антигенного со­
става геношоелеяифичных белков семян и альбуминов ингибито­
ров ос -амилаз получены новые данные о родстве и происхожде­
нии геномов ВИДОВ Triticum , Elytrigia , Elymue , Agropyron,
Leymuo , Loiium и Festuca . Показана высокая эффективность
использования таких иммунных сывороток для определения геном­
ного состава искусственно получаемых амфпдиялоидов. Разрабо- .
тана методика посемейного анализа компонентного состава про­
ламинов келкосемянных злаков, что дает возможность анализиро­
вать сортовые, природные и гибридные популяции злаковых трав.
На основе изучения компонентного состава проламинов злаков
существующий эталонный электрофоретический спектр глиадина
дополн-л псПЕНИЯМИ быстрых проламинов. Номенклатура и единый
эталонны?! аяектрофоретичесхий спектр проламинов,'предложенный
в результате сравнительного изучения их у разных видов, родов
и триб злаков, могут быть использованы как основа для разра­
ботки единой системы регистрации и документации генетических
ресурсов семейства
Агпобатая работы. Материалы диссертации были доложены:
на П Всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1974), ХП Мавдународлом ботаническом конгрессе (Ленинград, 1975), Всесоюзных
совещаниях "Белковые маркеры и их использование в решении про­
блем прикладной ботаники, генетики и селекции" (Ленинград,
1978, IG83), Всесоюзных совещаниях по хемосистематикв и эволю­
ционной бярхихш высших растений (Ялта, 1979, 1982; Москва,
1936), Советско-Французских симпозиумах по биохимии и генети­
ке белков-зерна ппеницы (Одесса, 1977; Ленинград, 1983), 62-м
ежегодном съезде американской ассоциации химиков злаков (СанОракциско, 1977), Всесоюзном совещании "Актуальные задачи фи­
зиологии и биохимии растений в ботанических садах'ЧЗвенигород,
1934) .
Публикации. По материалам диссертацик опубликовано 45 ра­
бот.
Структура и объем работы, диссертация состоит из введения,
обзора литературы, результатов исследования, обсуждения ре­
зультатов, выводов, практических рекомендаций и списка цитиро­
ванной литературы (385 наименований на русском и иностранных
языках). Работа изложена на 317 страницах машинописного текста,
5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
•включающих 53 рисунка и 16 таблиц. В обзоре литературы дана •
краткая характеристика семейства злаков, а т ш ш е представлены
сведения о белках семян и их использовании в изучении родства
видов и внутривидового полиморфизма злаков.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалом для проведения исследований послужили семена
около 1000 образцов приблизительно 300 видов семейства злаков.
Семена получали из коллекции ВНИИ растениеводства иы.Н.И.Ва­
вилова, Главного ботанического сада АН СССР, университета
штата Юта (США), других учреждений, а также от отдельных оте­
чественных и зарубежных исследователей.
Выделение белков семян. Белки из семян злаков экстраги­
ровали: IM Kaci на фосфатном буфере рН 7,0 для получения
альбумшо-глобулиновой фракции (АГФ), 70# этанолом для полу­
чения спирторастворпыой фракции (СФ), 0,2$ iTaOH для получе­
ния глгагелиновой фракции, 21,1 мочевиной для получения АГФ и СФ
(Гаврилюк и др., 1973).
Получение иммунных С Ы В О Р О Т О К . Использовала охеглу иммуни­
зации, принятую в ВИРа (Гаврилюк и др., J973). Кроликов ш м у низировали суммарными препаратами АГФ, СФ или глютелинов, а
также фракциями или компонентами, полученными хроматографией,
препаративным электрофорезом или иммунной аффинной хромато­
графией. Для поддержания необходимой концентрации антител жи­
вотному через 20-30 дней дополнительно вводили антиген. В хо­
де работы было получено более 250 иммунных сывороток на белки
семян злаков.
Ишунохимичеокие методы. Иммунохимический анализ белков
семян проводили в основном методом двойной имыунодиффузии в
геле (Ouohterlony , I958) в микромодификации, предложенной
Гусевым и Цветковым (Цветков, 1961; Гусев, 1968). Использова­
ли 1% раствор агар-агарозы или Q,Q% раствор агарозы на мединал-цитратном или трис-барбитуратном буфере рН 8,6. Иммуноэлекгрофореэ проводили в геле 1% агарозы на предметных стек­
лах размером 5 х 5 см с использованием одного из упомянутых
выше буферов. Электрофорез вели в течение 3 часов 15 минут
при оиле тока 45 мА и напряжении 4В/ом. Для количественного
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
. определения антигена проводили ракетный (количественный) им~
муноэлектрофорез (Laurell , 1966). Длительность иммуноэлектрофореза 4 часа 40 минут при 4В/ом.
Антигенные овойства гетерогехшого белка изучали следую­
щим образом. После электрофореза гели ПАЛ инкубировали в
трис-барбитуратном буфере рН 8,6 в течение 60-90 минут. Да­
лее гель заплавляли в агарозу на предметном стекле и прово­
дили двойную иммунодиффузию.
Сыворотки, которые в двойной иммунодиффузии давали о
суммарным препаратом белка одну линию преципитации, получали
иммунизацией соответствующим препаратом белка или истощением.
При постановке реакций двойной иммунодиффузии чаще всего
пользовались методом истощения в бороздке, предложенным Клозом (Барисашаила и др., 1979). Истощение иммунных сывороток
проводили также обычным опоообом, т.е. в растворе.
Для очистки антител сыворотку при необходимости предва-'
рителыю потощали, а затем отделяли иммуноглобулины типа igo
от всех ооталышх белков сыворотки крови бесколоночным мето­
дом на ДЕАЕ-сефадекое. Очищенные иммуноглобулины использова­
ли для приготовления кммуносорбента для иммунной аффинной
хроматографии.
.
При приготовлении иммунооорбента использовали оефарозу,
активированную бромистым цианом производства фирмы " Pharma­
cia Pine Chemicals ", а также сефарозу 4В,активированную в
лабораторных условиях (Туркова, 1980; Остерман, 1983). Белки
злюировали о колонки О Д М укоусной кислотой.- Раотвор концен­
трировали на роторном испарителе или электродиализом.. Исполь­
зовали также иммунооорбент, приготовленный на основе ультро- •
геля, активированного глютаральдегидом. Иммунооорбент готови­
ли по прописям методик (Туркова, 1980; Остерман, 1983). Элюцию антигена проводили 0,2 М глицин-Ш1-буфером, рП 2,9.
фракционирование белков методами хроматограйтот. электро­
фореза и изоэлектрического Фокусирование. Для фракционирова­
ния белков СФ семян злаков использовали гель-фильтрацию через•
оефадеко а-100 . Колонка 3 х 100 см, буфер 0,1 М уксусная
кислота ( Oharbonnier , 1971). фракционирование альбуминов.
мягкой пшеницы проводили следующим образом. Фракцию водо-солерастворимых белков получали экстракцией из муки фосфатным бу\7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
. фером рН 6,6 (NaH2P04 - 0,025 М, KgHE^ - 0,041 М, NaCl - .
- 0,48 М ) . Альбумины осаждали из экстракта сульфатом аммония
в пределах концентрации последнего 0,93-1,33 М. Полученный
осадок диализовали против воды при +4°С. Гель-фильтрацию
альбуминов осуществляли через сефадоко о-wo в колонке раз- •
мерой 3 х 100 ом. Использовали фосфатный буфер рН 6,6 приве­
денного выше'состава (silano'et al. , 1973). Для очистки
фракций и компонентов ос- ад -проламинов и быотрых проламинов злаков использовали методику ионообменной хроматографии
на сульфопропил-сефадексе С-50 ( charbonnier and Mosse, 1980).
Электрофорез проламинов в трубках проводили по принятой
в ЕИРе методике (Гаврилкж и др., 1973). Гелевая оистема со­
держала 7,5?5 акриламида, 30% уксусной кислоты и 5М мочев1шу.
Буфер 0,013 U уксусная кислота, рН 3,2. Время электрофореза
5 часов 30 мин. Для получения спектров белков СО семян зла­
ков, включающих компоненты непроламиновых белков, время элек­
трофореза сокращали до 2 часов 15 глин. Белковые зоны окраши­
вали 0,2-0,5# амидовыгл черным, приготовленным на 7,5% уксус­
ной кислоте или фиксировали в растворе 7-12$ ТХУ. Электрофоретический анализ альбуминов семян злаков проводили по методу
Орнштейна и Девпса (Omstein , 1964; Davis , 1964). Для опре­
деления относительной молекулярной маооы белков проводили
электрофорез в ПААГ о DS-Wa по методике Леммли (Laemmll ,
1970). Для исследования свойотв отдельных электрофоретпческих.
компонентов белки извлекали из геля по описанному способу
(Конарев, 1974).
Электрофорез проламинов мелкоеемянных злаков проводили в
вертикальной пластине ПААГ в приборе производства эксперимен­
тальной лаборатории "Хийу Калур" (г.Таллин). Толщина геля Ълм.
Гель готовили по прописи методики для разделения глиадина
(Гаврилюк и др., 1973), но содержание уксусной киолоты в геле
у м е н ь ш и до Б%. Семена елей, плевела, овсяницы растирали в
ячейках 4 x 8 мм, высверленных в диоках из орготекла. Проламины извлекали 60$ (для ежи) или 7С# этанолом при комнатной
температуре. Количеотво экотрагента на зерновку - 25-35 мкл.
Пробы'утяжеляли раствором 10 М мочевины, центрифугировали и
полноотью нанооили на гель. Электрофорез проламинов 'овсяниц и
плевелов вели 3,5-4 часа при 10 мА'на пластину геля в течение
'первого часа и 30 мА в оставшееся время. Белковые зоны фикси0
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ровали и окрашивали раствором 0,75$ кумасси 0-250,, приготов­
ленным на 3,5/» хлорной кислоте (Остерман, 1983).
Изоэлектрическое фокусирование Щелков проводили в труб­
ках (wrigley and Shepherd , 1973) z в пластине ПААГ в прибо­
ре "Multiphor ", согласно руководству, выпущенному фирмой ЛКБ
(Winter et al. , 1977).
>
Выявление ингибиторов протеаз в препаратах проламина
осуществляли по методу, предложенному Ал.Конаревым (Конарев,
1985, 1986). •
Анализ аминокислотного состава белков проведен в отделе
молекулярной биологии ВИР (З.В.Чмелвва), определение л -кон­
цевых аминокислотных- последовательностей - в .Институте моле­
кулярной биологии АН СССР (С.В.Шляпников).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .
Непроламнновые белки опиртораотворимой
фракции семян пшеницевых
В главе рассмотрены данные по непроламиновым (нПБ) бел­
кам (для пшеницевых - неглиадиновые белки - нГБ) с которыми
связана видовая и геномная антигенная спепдфйганооть спирто- •
растворимой фракции (СО). Эти белки мы назвали геномноопецифичными (ГСБ). Здесь же рассмотрены свойства белков антиге-1
нов, относящихся к ингибиторам ос-амилаз. \
ГСБ семян глчентаевых. Белки, обладающие геномной специ­
фичностью в ЕммунохЕмических реакциях (ГСБ), были обнаружены
в СФ семян пшеницевых. В АГФ маркеры ГСБ выявлены не были
(Губарева, 1971; Конарев, 1980). С помощью соответствующих
иммунных оывороток ГСБ были выявлены нами, в водных и водо-оолевых (ATS) экстрактах из муки. То, что в сыворотках, полу­
ченных иммунизацией белками АГФ или водными экотрактами, не
обнаружено достаточного количества антител на. ГСБ в основном
вызвано, по-видимому, неспособностью ГСБ конкурировать о ос­
тальными белками при формировании популяции антител.. В со­
ставе белков СФ компоненты ГСБ не имеют конкуренции со сто­
роны антигенно мало активных цроламинов или. ингибиторов ос-амилао. В.ряде случаев сыворотки, полученные иммунизацией
белками СФ,содержат небольшие количества антител на проламины
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
(Пенева, Мигушова, 1973; Митрофанова, 1977) а альбумины ин-,
гябиторы ос -амилаз. Получение сывороток, формирующих в ре­
акции преципитации о оуммарнш белесом только один компонент,
соответствующий антигену маркеру, отало возмозошд пооде выяонения компонентного ооотава, а также получения очищенных ГСБ
(Конарев, Чмелев, 1986).
Антигвпныа овойотва компонентов злекттдойзотгетичаокте;
рпектгов белков С<5 семян злаков трибн пстеницевых,. Ишунохимический анализ балков, выделенных из зон электрофоретического спектра СФ диплоидной пшеницы T.boeoticum , показал,
что ГСБ, соответствующие геноыу А ь , локализованы во 2-5-ой
вонах £рио.1,а). Аналогичные результаты были получены при
шлмунохимьчеоком изучении компонентов спектра СФ даплоидного
пырея Elytrigia elongata (рио.1,6). Приведенные дашше полу­
чены для белков диплридашх видов - носителей геномов» У тетрашгоида Е,elongate* антиген генома Е в спектре преципитации
гораздо слабее такового гомологичной реакции (Конарев,1979а).
2п«14
2п-28
2п-70
Рио.1. Спектры преципитации белков спиртовой фракции
( ос - со -глиадинов и неглиадановых белков - нГБ)
С8ШШ Trittoum boeoticum
(а) И Elytrigia elongate
2n-14,28,70 (б, в ) . Проявлено сыворотками на ГСБ
генош А° T.boeoticum
(а) и на ГСБ генома Б
E.elongata (б и в ) . 1-7 - зоны, на которые разре­
зали гели после электрофореза (рН 3,2).
10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Компоненты о антигенными овойотвамн маркера генома Е присутт
ствуют в основном в зонах 3 и 4 спектра (рао.1,6). У декашгоддной формы этого.вида из пяти геномов только один или
два родственны геному Е. В белках семян этого вида антиген
маркер геногла Е выявляется слайее, чем у тетраплоидной формы
(Конарев, 1979а). Компоненты о антигенными свойствами, идентачными маркеру генома Е, обнаруживаются только в одной 4-ой зоне спектра (рио.1,в). Следовательно, ослабление ин­
тенсивности антигена маркора в спектре преципитации мокет
быть связано о уменьшением числа компонентов, несущих сход­
ные, соответствующие данному маркеру, антигенные детерминан­
ты. Число таких компонентов максимально в белках диплоидного
донора генома. У других видов, в том числе у полиплоидных,
генотип ксторых оодеряат още и другие геномы, число компонен­
тов ГС5, как правило, меньше (Конарев, 19796; Konarev, I98I).
Компонентный состав Сгетерогеннооть) ГСБ мы исследовали'
татаэ полаивая гели ЛАА пооле электрофореза в агарозный гель
с последующим проведением двойной пммунодиффузпи. На осноэа1пи полученных данных было высказано предположение о многокомпононтнооти фракций ГСБ - белков, обусловливающих форми­
рование в спектре преципитации СФ антигена маркера (Конарев
и др., 1979; Конарез, 1979 б; Konarev , I98I), а также слож­
ной генетической природе ГСБ (Конарев, 1979 б; Konarev,
1981). Необходимым условием выяснения природы и свойств ГСБ
являлось получение очищенных препаратов соответствующих ГСБ.
Для изоляции фракций ГСБ от всех остальных, компонентов
СФ и нГБ был применен метод тактикой аффинной хроматографии
( M X ) . Использование ИАХ отало возможным, когда были получе- •
ни мопоспецифическив иммунные сыворотки, обладающие высокой
активностью против ГСБ. Электрофоретичеокий и иымунохимический анализ состава элюата после ИАХ показал, что в нем нет
других белков кроме ГСБ. Электрофоретичеокий спектр ГСБ еще одно доказательство гетерогенности фракции ГСБ СКонарев,
Чмелев, 1986).
О хатактетэе генетического К О Н Т Р О Л Я ГСБ. Белки СФ семян
нудлисомно-тетрасомных линий мягкой пшеницы сорта Chinese
Spring были тестированы иммуиными сыворотками на - ГСБ гено­
мов в 1 и D этой пшеницы. Реакция преципитации отсутотво. вала полностью только в варианте постановки с белками СФ
II
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
.линии n7D-t7A . Ослабление антигена генома D наблюдали в
варианте постановок иммунохимических реакций о белками линий
n6D-t6B и n5D-t5A . Анализ проявления антигена генома в 1 в
белках СФ оемян нуллиоомно-тетраоомных линий не показал до­
стоверных различий ни в одном из вариантов постановок. По
поводу отсутствия антигена генома D в спектра щюпдаштацни
белков СФ линии n7D-t7A можно сказать оладующее. В Еммунохимичеокой реакции о белками линии n7D-t7B антиген D в
спектре преципитации не только не исчезает, но а не ослабе­
вает. Есть основание предположить возможность подавления
признака учетверенной дозой хромосомы 7А (Aragonollio et ai.t
1975). Ингибирувдий аффект может не сказываться в присутст­
вии хромосомы 7D . На основании оказанного выше, а также
сведений, полученных ранее нами (Конарев, 1979 а,б; Konarev,
1981) и другими исследователями ({Митрофанова, 1977; Агаеопoiiio et ai. , 1975), можно принять версию о более пли менее
равномерном распределении генетического контроля компонентов
ГСБ (признака оерологический маркер генома) между нескольки­
ми хромосомами ооответствувдего генома (Конарев, Чмелев,
1986).
Аминокислотный состав и повода ГСБ. Анализ данных по •
аминокиолотному составу ГСБ выявил сходство по этому призна­
ку между ГСБ геномов в 1 и D Стабл.1). Очевидно, что здесь
мы имеем дело о гомологичными белкагди. Для ГСБ характерно
низкое содержание заряженных аминокислот - лизина, гистидина и аргинина (12-13$) и довольно высокое неполярных (39-40$).
Среди неглиадиновых белков такой аминокислотный соотав имеют
так называемые хлороформ-метанольные белки (СМ-белки) - гид­
рофобные белки, связанные о липидами клеточных мембран (Saleodo at al. , 1978). Кроме этого ГСБ и СМ-белки содержат при­
мерно равное и довольно большое количество глютаминовой
кислоты Стабл.1).
Кроме Ш-белков во фракции неглиадиновых белков в значи­
тельном количестве присутствуют компоненты ингибиторов ос-амилаз, в частности, альбумины 0,19 и 0,28 (Kaearda et al.,
1976; Конарев, Гаврилш, 1978). Аминокислотный соотав послед­
них значительно отличается от такового СМ-белков и ГСБ
(табл.1). Сравнительный анализ данных по аминокислотному со­
ставу ГСБ геномов в 1 и D , СМ-белков, альбуминов ингибито12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица I
Аминокислотный состав фракций ГСБ геномов в 1
Ae.longiesima И- D Ae.tausohil , а также СМ-бвЛКОВ
и компонента 0,28 альбуминов ингибиторов ос-амилаз
T.eestivum (в % К белку)
А1лшюкислота
Д?ЗКН.
1ЕСТДДШ1
ЛРГИРКЧ
Асп. к-та
Треонин
Серии
Глго. к-та
2ййлин_
Глицил
Ал^щн_
Г.едцз
М®2И2№1Н_
й 3 £Д§1^ид
Де2цда_
Тирозин
£ендааланин,
ГСБ ге номов СМ-белки*
В1
D
T.&estlvum
5,0
5,2
3,3
2,6
2,8
2,5
4,3
5,0
8,9
8,8
9,5
8,0
3,6
3,8
5,6
6,3
5,7
5,7
19,9
16,7
19,7
11,3
12,1
9,9
: 6,3
6,3
5Д
4,8
5,7
3,5
4,9
5,3
5,8
1.9
1,5
1.4
4,5
.4,1
4,2
7.4
7,5
10,1
2,0
3,5
5,2
4.5
4,8
3,7
]Подчеркнуты:
* - Salsedo e t a l . , 1978
** - F e r n e t and Nimiao, 1970
Альбумин 0,28**
T.aeetivua
7,7
0,2
16,8
5,6
1.9
5,3
' 7,6
.
7.9
6,0
6,1
8,1
1.3
1,3
5,4
2,3
0,0
- основные
аминокислоты
- - - - - неполярные
аминокислоты
ров ос-амилаз, а также других белков оемян злаков дает оонование предположить, что ГСБ относятся к группе гидрофобных
белков (СМ-белков). Аргументом в пользу такого предполояения
является то, что характер распределения компонентов ГСБ в
электрофоретических спектрах неглиадиновых белков совпадает
с таковым СМ-белков.
Идентификация и характеристика альбумина Q.I9 и специ­
фического альбумина мягкое пренины T.aestivum . Антиген аль­
бумин и,ГЭ-ш предполагали использовать при анализе, родства
видов злаков аналогично антигеншл ГСБ. Практическое значение
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
.имеет поотановка и усовершенствование метода различения му­
ки твердой и мягкой пшешщ с использованием антигена альбу­
мина 0,19 (Piazzi at ai. , 1972). Для осуществления постав­
ленных задач необходимо было уточнять характер специфичности
этого компонента и изучить распространение его в белках се­
мян других злаков.
Хроматографией через софадекс а-юо альбумины мягкой
пшеницы и твердой т.durum били разделены на 4 фракции.
Электрофоретнческий анализ СрН 8,6) состава полученных фрак­
ций показал, что альбумин 0,19 максимально представлен во
фракции Ш мягкой пшеницы <рио.2,г). В спектре соответствую­
щей фракции твердой пшеницы указанный компонент' обнаружен
не был (Шаяхметов, 1974; Конарев, Гаврилок, 1978; Siiano et
al., 1973; Konarev , 1978). Анализ компонентного состава
альбуминов фракций 1-1У методом электрофореза в кислом буфе­
ре позволил идентифицировать альбумшш 0,19 и 0,28 в спектре
неглиадиновых белков CS мягкой пшеницы (рис.2,б).
Пиасои с соавторами (Piazzi et al. , 1972) сделали вы­
вод о специфичности антигенных свойств альбумина 0,19 мягкой
пшеницы о попользованном иммунной сыворотки против белков
фракции Ш Срио.2,г). Кроме нее мы приготовили сыворотку к
електрофоретичаскому компоненту 0,19 (рис.2,г). Иммунной сы­
вороткой на альбумин 0,19 1лы проанализировали белки семян
мягкой и твердой пшениц, других видов Tritioum , а также ви-,
ДОВ Seoale , Hordeum , Elytrigia , Aegilops И др. В резуль­
тате белки о антигенными свойствами альбумина 0,19 были об­
наружены не только у мягкой и твердой пшениц, но и у всех'
представителей этого рода (исключение - диплоидные пшеницы
Т.Ъоео-tioum и T.monococeum ) , а также у многих представите­
лей перечисленных выше родов трибы пшеницевых (Konarev ,
1978). С помощью той же иммунной оыворотки на альбумин 0,19
ш ^ооледовали антигенные свойотва компонентов спектров не­
глиадиновых белков, соответствующих альбуминам ингибиторам
ос -амилаз и ооботвенно альбуминов. Компоненты спектров как
T.aeotivum , так и т.durum давали реакцию шлмунохимической
идентичности о альбумином 0,19 (рио.2,в). Очевидно, что не­
идентичность антигенных свойотв' альбуминов семян мягкой и
твердой пшениц связана о какими-то другими белками. Для
' идентификации этих компонентов мы применили ракетный иммуно14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
СУ.
1г
2г Альб.,^ I
i •
ос
g_ 0,19" e-ai
нГБ
pll
3,2
6,19
=
4r
га
4Д
ш .
2д
Зд
szs
РН'
8,6
?
3
**ш
4
Рио.2. Элекгрофоретнчеокий (а,б,в,д) и иммунохимичеокий (а)
анализ белков опиртораотворимой фракции твердой (а) и
мягкой (б) пшениц и фракции Ш альбуминов этих пшениц
(д,г). Сыворотка на компонент 0,19 мягкой пшеницы 1г).
1-4 - 8оны, на которые разрезали гели пооле электро­
фореза альбуминов.
~
д
г
1д
2д 2г
4г г
4Д Зг
Рис.3. Ракетный иммуноэлектрофорез альбуминов твердой (д) и
мягкой пшениц (г) и белков зон электрофоретичеоких
спектров альбуминов мягкой и твердой пшениц (рио.2,
1г-4г, 1д-4д). Сыворотка на фракцию Ш альбуминов мяг­
кой пшеницы (Еонарев, Гаврилане, 1978; Piazzi et al.,
1972).
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
электрофорез. Этим методом, о использованием иммунной сыво­
ротки на фракцию Ш альбуминов мягкой пшеницы, нагл удалооь вы­
явить анодный компонент, по которому спектр преципитации аль­
буминов T.aestivum отличается от такового Т.durum (рио.З.г,
указан отрелкой). Пики белков с антигенными свойствами альбу­
мина 0,19 в спектре ракетного иммуноэлектрофореза несколько
ниже и значительно интенсивнее.
Иммуиохпмически специфичный альбумин мягкой пшеницы был
обнаружен среда компонентов зоны 4 электрофоретического опектра альбуминов Tiaeatirum (рио.2 и 3 ) . В заключение отметим,
что этот компонент имеет pi в области 4,6-4,8 и, тем самым,
отличается от альбумина 0,19, имеющего pi при рН 7,3 (Конарев, 1978; Konarev
r
I978).
Выше 'были рассмотрены свойства ГСБ, а также некоторых
. компонентов ингибиторов ос-амилаз. Ряд признаков объединяет
ГСБ и альбумины ингибиторы '«.-амилаз: о одной стороны - их
гетерогеннооть, о другой - оходство антигенных свойств компо­
нентов соответствующих фракций ГСБ, а также ингибиторов ос-амилаз. Эти, а также некоторые другие особенности ГСБ и аль­
буминов ингибиторов ot-амилаз дают основание предполагать,
что белки о такими характеристиками могут быть использованы
в качестве маркеров генетического материала (в частности,
геномов) при изучении исходного и селекционного материала.
Антигенный состав геномноспецифичных белков
и родство видов злаков
Характеристика ГСБ злаков из т ш б ы гтюшшевых. Антиген
А ъ характерен для белков семян диплоидных пшениц т.ЪоеоПсит
и т.топоооооит . Обнаружен в белках -полиплоидных пшениц- фило­
генетической группы T.timopheevii (Конарев и др., 1971; Ке­
наров , 1974, 1975).
•,
Антиген A U _ характерен для белков оемян диплоидной пше­
ницы. T.urartu , а также тетраплоидных пшениц группы Эмглера и
N
гексаплоадных пшениц СКонарев, 1974, 1975).
b u
Антиген A A найден в белках семян воах диплоидных пше­
ниц, а также некоторых дикораотущпх тетраплоидных пшениц (Ко­
нарев, I975j Барисашвили и др., 1979).
Антиген в 1 характерен для белков семян диплоидного эги' лопса Ae.longieaima. Обнаружен в белках полиплоидных, пшениц
16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Зммера и гексаплоидшк пшениц (Пенева, Мигушова, 1973).
Антиген D характерен для белков дшлоида Ae.taueohii.
Обнаружен в белках гексашюидных пшениц (Хакимова, 1973).
Антигены B ^ - B ^ D . Два антигена общих для белков видов
эгилопса и полиплоидных пшениц (Конарев и др., 1979).
Антиген альбумин 0,19 характерен для белков семян всех
пшениц и эгилопсов, кроме T.boeoticum и T.monocoocum (Кона­
рев, Гаврилюк, I978;Konarev , I978).
Антиген Е характерен для белков семян диплоидного пырея
удлиненного Е.elongate (Конарев, 1979 a; Konarev , I98I).
Антиген s характерен для белков диплоидных видов пырея
E.stipifolia , E.spicata п др. (Конарев и др., 1979; Ва­
сильева, 1980).
Антиген J характерен для белков семян диплоидного пы­
рея морского E.juncea СКонарев, 1981).
Выявление антигенов ГОБ Tritium и д о н о с я в белках •
сеЮТН ВИДОВ Elvtrird* . В 1 У Р Ш З . А Е Г О В У Г О П
И Ьеутшд . В ДИО-
оертации приведены данные Св виде фотографий спектров преци­
питации и таблиц антигенного состава) о распределении пере­
численных выше антигенов в белках семян видов пшеницы, эгилопса, пырея, житняка и др. (Конарев и др., 1979; Конарев,
Васильева, 1979; Конарев, 1981). Оказалось, что наиболее пол­
но пшеничные антигены представлены в белках семян полиплоид­
ных ВИДОВ пырея Е.elongate (2n=56,70 ) , E.trlchophora ,
Е.intermedia , E.juncea
(2n-42 ) , E.muoronata
(2n»42 ) .
Другая группа включает вида пырея, в белках которых обнаруже­
но достаточное число пшеничных антигенов, чтобы судить о бли­
зости генетического материала их геномов к тем или иншл гено-.
мам Triticum . В белках большого числа видов пырея антигены
пшэничных геномов практически отсутствуют. Среди видов Elymua
и beymuo также модно назвать форгш о наибольшим числом вше-.
ничпых антигенов в белках, например E.canlnua", Е.ПЪгоаиа
и ряд других. Очевидно, что геномы таких видов имеют большее
сходство с соответствующими геномами пшениц, чем видов, в
белках которых пшеничные антигены представлены слабо.
Выявление антигенов Е . s и J диплоитлнх пноеев в
белках ПОЛИПЛОИДОВ Bly^ipiia-. Elvnus . АГГГОРУГОП- . Levroua .
С помощью моноспецифических иммунных сывороток на ГСБ дипло­
идных носителей геномов Е СЕ.elongate ) , J (E.juncea) и
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
9 (Е.в-tipifolia) были проанализированы белки семян злаков
из трибы ишеницевых. Выяснилось, что антиген Е присутствует'
в белках очень небольшого числа видов. Кроме хромосомных рас
самого вида Е.elongate (рио.1) антиген обнаружен в белках
неокольких полиплоидных видов пырея и элимуоа. Антиген гено­
ма J был обнаружен только в белках упомянутых уке выше по­
липлоидных ВИДОВ E.elongata-E.muoronata (Конарев, 1981).
Широкое распространение у видов Elytrigia , Elymua имеет
антиген s (Конарев, Васильева, 1979; Конарев и др., 1979).
Полученные данные позволили оделать ряд заключений о родстве
и происхождении геномов многих полиплоидных видов злаков
(Конарев И др., 1979; Konarev , I98I).
Антигенные свойства белков и, связи между йодами Ъпн»т
и featuca'. Проблемы идентификации и родотва геномов и видов
плевела и овсяницы встают в связи с перспективами ооздания
межродовых амфидишюидов, объединяющих ценные признаки роди­
тельских форм. По наличии геношоспецифичных антигенов ь 1 и
1° в белках оемян все виды плевела были разделены на две
Группы: L»perenne , L.multiflorum , L.rigiduM , l.loliaceum,
О ОДНОЙ Стороны, И L.remotum , L.temulentum , L.perslcum , с
другой, соответственно. Такое деление совпадает о ботаничеокой и генетичеокой дифференциацией видов рода (Буткуте, Ко­
нарев, 1980).
Белки семян около 120 образцов, представляющих 50 видов.
и подвидов рода Festuca, были тестированы на наличие антиге­
нов I 1 и Ь° , характерных для геномов видов Lolium , а так­
же антигенов,специфичных для геномов диплоидных видов Festuоа (Буткуте, Конарев, 1982).
Антигенный состав ГСБ амйилишюидов гтаениды и эгилопоа.
Выяснение геномного состава искусственно полученных амфидиплоидов - практически важная область применения серологиче­
ских маркеров ГСБ. Примерами такого анализа могут олужить
исследования природы эгилопоо-пшеничных аьфадиплоидов САД)»
синтезированных Жировым (Конарев и др., 1985).>
Как видно из таблицы, антигенный состав ГСБ семян ам­
фидишюидов не всегда представляет собой сумму такового ро­
дительских форм (табл.1, J6 1,10,12). У АД типа Ae.eharonensla x T.tioeotioum идентифицировать антиген генома однозер­
нянки невозможно, поскольку антиген А ъ присутствует в бел18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
.' Таблица 2
Антигенный состав ГСБ сеьсш амйадашюгдов г их родительских фо$т ж наличие
в электрофоретических спектрах гх глиадшов «-компонентов (Кснарев к др., 1985)
&
и/и
А1фздиплоида и их
. родительские формы
1» Ae.sharonensis х T.urartu
2. Ae.sharonensis х T.boeoticum
3. Ae.speltoides x T.boeoticum
4» Ae.speltoides x T.urartu
5» Ae.tauschii x T.boeoticum
6. Тетра-Аврора x Ae.sharonensis
7. Тетра-Аврора х T.boeoticum
8. Тетра-Аврора х Ae.speltoides
9. T.boeoticum
!0« T.urartu
1. Ae.speltoides
2. Ae.sharonensis
13» Ae.tauschii subsp.strangulate
4. T.aestivum
2п=
28
29
28
ъ
А
Наличие антигенов
д и в 1 D • ъ1в3?ъ
+
+
+
+
+
+
28 • ... + ' 28
+? +
+
42
+
+
42
42
... +
14
+
14
... 14
+
+
14
.+
14
42
- ... ...
АъАи
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+?
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+'
+
+
+
+
•
Спектр
ос-глиадана
3 56
.3 56
34567
3 56
34567'
-
567
+
34567
-
567
+
34567
34567
+
+
-
34
567
Примечание: "+" - наличие антигена в спектре преципитации, "-" - отсутствие антигена...,
"..."- следы антигена..., "+?" - неуверенное выявление антигена в спектре
И
Ф
ТТрАЦЦЦ И Т А Л И И .
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ках этого эгплопоа (табл.2, й 2). Наличие генетического
материала генома диплоидной пшеницы можно показать, испольвун другие белки, например, компоненты глиадаша, характер­
ные для пшеницы (табл.2, J5 1-5).
В белках АД Ae.epeltoides x T.urartu
обнаружены ВСв
антигены ГСБ родительских форм (табл.2, J6 4,10,11). В бел­
ках АД Ae.tauschii х T.boeotioum ОДИН ИЗ антигенов эгилопса - антиген D - не всегда выявляется четко. Другой анти­
ген - в 1 выявляется хорошо (табл.2, $ 5) и так далее. В
данном случае геномный состав изученных АД в целом соответ­
ствовал теоретически ожидаемому. Еоли белки родительоких
форм имеют хотя бы частично сходный набор маркерных анти­
генов, приходится использовать другие методы и маркерные'
белки, например электрофорез глкаданов или антигены, имею­
щие более широкое распространение у видов - А ъ А и и B ^ ^ D ,
альбумин 0,19 и др.
До сих пор мы рассматривали свойотва белков в связи о
отношениями на уровне геномов, видов и родов злаков. Поли­
морфизм а связи внутривидового уровня решаются о использо­
ванием других белков и методических подходов.
Проламаны: компонентный состав,
биохимическая характеристика и полиморфизм
Раздел посвящен свойствам нролаьашов и использованию
этих белков для идентификации и характеристики сортов широ­
ко культивируемых злаковых трав - ежи, овсяницы и плевела.
Пролаюшы - основной компонент фракции опирторастворимых
белков, поэтому на первом этапе был осуществлен анализ со­
става белков СФ семян злаков.
СФ белков семян злаков. Методом электрофореза в ПААГ
би..л изучены в общей сложности белки СФ и пролашны около
100 видов - представителей 16 триб семейства. Выяснилооь,.
что в СФ белков семян практически всех изученных злаков
присутствуют белки, соответствующие по электрофоретической
подвижности пролашшшд и непроламиновым белкам пшеницы.
Увеличивая время электрофореза, например, с 2,5 чаоов до
3,5 и далее, можно довольно четко разграничить белки типа
проламинов и непроламиновые белки (Shepherd , 1968; Aragon20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
.cillo et al.*, 1975; Kasarda et al. , 1976; Гаврилюк И др.,
1973; Пенева, Мигушова, 1973). На рис.4 обозначена нижняя
граница сх -зоны глиадика пшеницы, что соответствует, со­
гласно номенклатуре глиадинового спектра (Конарев и др.1976),
Виды
Трибы
Бородаче вннковые
— Andropogoneae
Просовыа
— Panicеае
Саслариавыа
— Sealerieae
Ыягликовые
— Роеае
Тммофеевковые
— Phleeae
Овсовые
- Aveneae
|
ППП'Н
rwin
1
1
1
1
1
I
' n'liT")
-
ь
•t.
ШГЙПГ"
1
Brachiaria decumbens
1
Daotylis glomerate
1 Eohinaria c a p i t a t a
1 Festuca gigantea
\штт i
t]lHGiI.I38
т^ч-ш
пиггяг^з
|
Лгсеннцовыв
- Triticeae
Setaria italica
TnTi^nm
0
1
1
•1
Phleum .phleoides
Agroatis alba
Koeleria n i t i d u l a
Hordeum Jubatura
Triticum aestivum
v f> * • ш
Рис.4. Элвктрофоретические спектры проламинов злаков, рН 3,2.
компоненту oci, т.е. компоненту глиадина о наибольшей электрофоретической подвижностью в кислом буфере. Компоненты
спектров проламинов рада злаков, подвижность которых оказа­
лась выше таковой компонента otl, были обозначены нами как
быстрые_щолтшш_йлц_сокд)аценно БД (Конарев и др., 1983 а,
1984 а ) . Больше всего компонентов БП оказалось в спектрах
проламинов злаков триб овсовых, канареечниковыхТ^йло^евковнх, мятликовых и ряда других (рис.4). Основная часть компо­
нентов в спектрах~шадов~эТшс"~триб сосредоточена, как прави­
ло , в ос. - и _ р>гзонах_сЕектра .и. в зоне Щ.Большая группа злаков - представителей триб свинороевых,
лросовых* бородачеЕНиковых характеризуется спектрами прола­
минов о- довольно интенсивными компонентами _ос- -р-зоны и
бедной со-зоной. Лишь небольшое число компонентов их~э~лекгрофоретических спектров гояно отнести к БП. Состав спектров
21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
,проламинов этих злаков близок к таковому представителей пшеницввых Срио.4). Таким образом, для изученных злаков можно
выделить два основных типа спектра проламина - спектр типа
овоовых и мятликовых и спектр типа пшеницевых.
Идентификация компонентов проламинов злаков ттатб овоовых
(Ауепяая ) и мятликовнх (Роеае). Идентификация компонентов
белка это, в первую очередь, привязка их к существующей сис­
теме обозначений аналогичных белков. Необходимо было иденти­
фицировать компоненты «. - со -проламшюв в спектрах злаков
триб Aveneae и 3?оеае и дополнить существующий эталонный
спектр глиадина позициями Ш , входящих в состав проламиновой
фракции этих злаков. Образцы для проведения идентификации
подбирали на основе данных по компонентному составу проламинов
и Ш , полученных н а ш ранее (Конарев и др., 1983 а, 1984 а ) .
Особое внимание было уделено подбору форм, в спектрах которых
наиболее полно представлена зона Ш .
На рис.5 дан эталонный электрофоретичеокий опектр глиа­
дина, дополненный позициями компонентов Ш . При электрофорезе
в трубках максимальное число позиций когшонентов HI оказалось
равным 6. Эталонный спектр мажет быть использован для идентй^"
фикации позиций компонентов проламинов я Ш злаков триб
Triticeae , Aveneae И Роеае (Конарев, Введенская, 1984).
Р и с 5. Эталонный электрофоретичеокий спектр проламинов
Злаков ИЗ триб Tritioeae , Aveneae , Роеае .
Электрофорез в ПААГ в трубках, рН 3,2 (Конарев,
>
Введенокая, 1984).
Прежде, чем приступить к изложению данных о гетероген­
ности проламинов и ее использовании для идентификации и реги­
страции ресурсов злаковых трав, необходимо выяснить вопрос о
свойствах проламинов и Ш этих злаков и степени их родства с
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
•глиадинаыи и другими ужа изученными проламинами.
Пролашнн мятлнковых СРоеае). Объектами исследования
служили широко культивируемые представители трибы мятликовых:
овсяница луговая (Festuoa prateneie ) , датлик луговой (Роа
pratensis ), мятлик болотный (P.paluetrie ) , ежа сборная (Daotylie gloiierata ) . .
.
Для фракционирования проламинов мятликов и овсяниц при­
менен обычный вариант хроматографии белков СО семян на колон. ке о оефадекоом Q-юо . Из большого числа обследованных мят­
ликов и овсяниц были выбраны образцы о характеристиками проламинового спектра, наиболее отвечающими поставленным зада­
чам. В качестве контроля служили белки СФ мягкой пшеницы
T.eeBtlvum (Конарев, Примак, 1984).
Для белков СФ пше1пщы была получена ^гигшчна^картина де­
ления па фракции: низкомолм^лярного_^лкдошща_-^ I, со -глиадина - П, у -глиадина - Ш, р> - и ос -глиадина - 1У и неглиа-"
диновых белков - у (рио.б.А). Белки СФ овсяницы разделилиоь
на 4 фракции, а мятликов - на 2. Только для белков овсяницы
характерен пик, соответствующий фракции"низкомолекулярного
глютенкна. Компоненты, соответствующие ос- и^ р, -пролаюшам,
идентифицированы во фракции П, а компоненты БП - во фракции Ш
(рис.6,Б). У мятлика лугового компоненты ос-проламина и БП
вошли в состав первой фракции (рис6,В). В опыте с мятликом
болотным во фракции I были обнаружены только компоненты Ш
(рпо.б.Г).
В проламшюх и Ш овсяницы и мятликов лизина оказалось
несколько больше, чем в глиадинах пшенини (табл.3); причем в
БП содержание лизина выше, чем в ос- и уь -проламинах. Про- •
лаглини и БП овсяницы и мятликов содержат довольно много глютамановой.кислоты -_от 37 до 43# (250-290 моль аминокислотных
остатков на 10 г болка) и пролина, что свидетельствует в
пользу проламиновой гпигроды анализируемых белков. Необычайно
высоким оказалось содержание фенилаланина в проламинах и,
особенно, в БП М Я Т Л Е К О З и овсяницы (табл.3). Высокое содержа- •
ние фенилаланина_в суммарной СФ мятликов и овсяниц отмечал
Семахов (Семихов~и ~дри; 1981). Несмотря'на'некоторою специфи­
ку аминокислотного соотава, компоненты всех изученных нами
фракций проламинов_и БП овсяницы и мятликовпо лэтому признаку
^казаиись_близктщ_к'^ос'-"и "jbj-глиадинам "пшеницы (Конарев,"
'.
'
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
^ 8 0 :им
^БОнм
I .
F
В
нПБ
Б
п ш
?.80HU
17 У
мл
мл
мл
^вОнм
Рио.6 Фракции спиртораотворимых белков
мягкой пшеницы (А), овсяницы лу­
говой (Б), мятлика лугового (В)
и мятлика болотного (.Г), полу­
ченные гель-фильтрацией на оефамл
дексе о-юо . 1-У - номера фракШ - фракции проламинов, н1Б - неций. ос- со
глиадпновыа белки, нПБ - непроламиновые белки.
Примак, 1984).
Определение относительной молекулярной массы компонен­
тов проламинов* овсяницы, и мятликов при электрофорезе в при­
сутствии DS-Na показало, что.молекулярная масса компонентов
1
БП значительно ниже, чем таковая <х - и /ь -^с»лашнов. Так
для компонентсГШ овсяницы она определена в"23000 Да, а для
компонентов ос - и jb -проламинов этого вида получены значе- •
ния 38000, 46200 и 47800 Да. Молекулярная маоса компонентов
' 1вд1йтлйса болотного определена в 22200, 19240, 15600 и
10660 Да. Более выоокие значения мблёкулярно'й маосЁГполучени
для ос-проламинов и БП мяддика дугового - от 26200 до 16300
Да соответственно (Конарев, Примак, 1984).
П Р О Л З М И Н Ы ежи оботой CPP.ctviia glorcerata ),. В резуль­
тате изучения свойств проламинов и БП овсяницы и мятлика бы­
ли получены свидетельства в пользу дроламиновой природы этих
белков. Для получения более очищенных препаратов проламинов
была использована ионообменная хроматография в сочетании о
:
. препаративным электрофорезом;" ~~
При фракционировании белков.СФ ежи оборной на СП-сефадекое С-50 было получено 6 фракций. Компонентный состав по' лученных фракций анализировали электрофорезом.в ПЛАТ в кислой
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ч
Таблица 3
Аминокислотный состав а. - , р -глиадинов пшеницы и фракций, кошонентов
нролашшов овсянвды, штлика, еки. Результаты представлены' в моль амино­
кислотных остатков на 10 г белка а на I коль белка (в скобках)
Аминокислота
Мягкая
пшеница
СХ+/2.
Лизин
Гистидин
Аргинин
Асл. к-та
Глю. к-та
Пронин
Глицин
Алания
Валин
Метионин.
ИЗОЛбИЦИН
Лейцин
Тирозин
Фениладанин
Овсяница
луговая
«•£
Ш
Мятлик
луговой
<х «+Ш • Ш
9
и 6 9
8
7
8
8
20
20
14
16
15
14
18
17
272 263 284 290
, 308
151 130
53
82
105
68
40
41
32
36
29
24
24- 26
20
34 •39
21 38
. 34
ел. ел.
ел.
9
5
29
25
28
'
2
3
19
72
37
60 47
69
6
12
7 . 12
. 9
67
65
39 • 54 67
4 .
•19
17
20
Мятлик
болотный
10
14
2423
254
60
52
32
41
2
34
.61 .
7
75
Еаа сборная
«3
• 8(2)
7 (2)
27 (7)
26 <7)
197 (53)
101 (27)
48 (10)
48 (10)
50 (13)
13 (4)
25 (7)
53 (14)
12 (3)
76 (21)
«I
•
Ш4-
3 (I) .• 6 (I)
7(2)
7 Ц)
25 С6)
30 (5)
26 (4)
21 (5)
197 (46) 204 (35)
96 (17)
П О (26)
37 (6)
44 СЮ)
45(8)
49 (12)
56 (10)
50 (12)
13 (3)
17 (4)
27 £5)
28 (6)
73 (12)
57 £13)
12 £3)
•7 II)
79 £13)
90 (21)
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
' .буфере в трубках (Конарев, Введенокая, 1985). Фракция I со­
держала, Очевидно, пиэкомолекулярные глюталииы. При пропус- '
кании-через колонку с оефадексом раствора, с о л и д н е е _до6ле. довательносмывались белки, соответствующие компонентам ос I.
и ос 3 Сфрадощя П ) , Ы К Г и Н И о примесями других-компонентов
(Ш), Н И с примесями других компонентов С1У) и Н И СУ). По­
следними о колонки элюпровалисъ непроламиновые белки СФ
(фракция ух), ддд получения более чистых препаратов компонен­
тов « I и ос 3, а также Н И проводилась повторная хромато­
графия в тех же условиях. Данный метод не позволил разделить
компоненты ос I и осЗ (рис5). Их отделение друг от друга
было достигнуто о помощью препаративного электрофореза.(Кона­
рев, 1974; Konarev , I978).
Известно, что в препаратах_глиадиЕа часто присутствуют
ингибиторы различных ферментов, а такае другие белки (strumeyer and Fischer , 1973; Gerzman , 1975). Примеси ингибито­
ров ферментов мы выявляли после изоэлектрического фокусирова­
ния в геле компонентов проламинов, полученных по выше приве­
денной схеме.
При электрофорезе о DS-Ha компоненты ос I и ос 3 дают
по одной полосе оо значениями молекулярных масс 23000 и 27000
. Да соответственно. В препаратах этих белков не были обнаруже­
ны ингйбиторьГферментов (Конарев, Введенская, 1985). Компо­
нент Н И при электрофорезе о DS-Ha формирует две полосы раз-,
ной интенсивности о молекулярной массой около 17000 Да. В
изоэлектрическом спектре компонента Н И в облаоти о рН при- •
мерно равной 8,0 были обнаружены минорные пригласи ингибиторов
трипсина. Очиотка компонента Н И с помощью препаративного
электрофореза онпжала содержание в нем ингибиторов трипсина.
Из оказанного следует, что методы гель-фильтрации, ионо• обменной хроматография, электрофореза и другие, используемые
для фракционирования глиадана, секалина, гордеина и др.,
вполне.пригодны для разделения и очиотки проламинов предста­
вителей мятликовых. Было также обнаружено, что препараты про-"ламиновттюлученные о иопользованиеи данных методов, иногда
содержат небольшие примеси других белков, в чаотнооти, инги> биторов трипоипа. Даже такие минорные примеси могут-затруд­
нить интерпретацию результатов определения молекулярной маосы,
• а также.последовательности аминокислот. Понятна, УовязиГо"
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
, этим, необходимость контроля за наличием примеоеи и очиотки
от них препаратов пролашша (Конарев, Введенская, 1985).
* В табл.3 приведены данные по аминокислотному ооотапу
компонентов проламкна ежи сборной л з , ос 1.и БП4. Как и
для проламинов мятликов и овсяницы представлены оредние ре­
зультаты по трем повторноотям, полученным для трех навеоок
каждого образца. При значительном отклонении одного из трех
показателей ого отбрасывала.
•Общая- оценка приведенных в табл.3 данных дает основа­
ние предполагать, пролшдановую природу компонентов осЗ, ос!
и Ш 4 . Более детальный анализ позволяет выявить опоцифику
" аминокислотного состава каждого из этих компонентов и, в
целом, 'пролампнов ежи (Конарев и др., 1986 б ) .
Для продаминов характерно низкое содержание остатков
основных аминокислот - лизина, гиотидина и аргишша. Так
для пшеницы оно составляет от 6 до 12 остатков всех этих
аминокислот на одну молекулу-у - ot-глиадпнов соответствен­
но (Kasarda et al. , 1976). У проламинов ежи эта сумма ко.леблетоя от 7 (для БП4) до II (для _осЗ) оотатков (табл.3).
. Итак,"аргументами в пользу пролампновой природы компо­
нентов осЗ, « I и БП4 являются: имкая^лектрофоретическая
подвижность в киолом буфере, высокое содержание оотатков
глютаминовой кислоты и пролина наряду о низким ооновных ами­
нокислот и т.д. Основываясь на,этих характеристиках можно
судить 6~оходстве молекул белков и родстве генов таких бел­
ков (пролампнов ежи и глиадпнов и т.д.). Более достоверная
информация о_родстве генов может быть получена при определе­
нии аминокиолотной; последовательности белков.
Анализ N-концевой аминокиолотной последовательности
пролампнов представителей мятликовых стал возможен после по­
лучения очищенных препаратов.компонентов « 3 , <xl и БП4
ежи сборной. Для молекул этих белков была определена после­
довательность 23-х, 29-и и 24-х оотатков аминокислот соот­
ветственно (Конарев и др., 1986 а, б; Введенская и др.,1986).
Как видно из табл.4 последовательности аминокислот ком­
понентов осЗ и <xl оказались полноотью идентичными. Исклю­
чение - позиция 16 в л1-проламине ежи. На атом цикле дегра­
дации вафикопрован одновременный выход двух аминокислот:
пролина и глютаминовой кислоты. Последовательности аминокио'
• 27 •
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 4
н-концевыэ аминокислотные последовательности
компонентов ос 3, ocl-и Ш 4 проламина ежи сбор­
ной, авенина'овоа и Х- гл иадина мягкой пшеницы
Проламин ежи сборной
«3
ocl
HI4
Цикл
дегра­
дации
АаИ
Val
1..
2
3
4
5
6
7
8
Gin •
I>eu
Aep
Pro
Phe
Phe
Gin
Olu
Ola
Gin
Gin
Tyr
Tyr
Gin
Gin
Gin
Gin
Ala
Phe
Phe
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
1$ .
20
21
22
щ
в
Bietz, 1982|
AalT
Val
Gin
Leu
Asp
Pro
Phe
Phe
Gin
Olu
Gin
Gin
Gin
Tyr
Туг
Pro/Glu
Gin
Gin
Gin
Ala
Pha
Phe
AeN
Val
Gin
Leu
Aap
Pro
. Phe
Gin
Glu
Glu
Gin
Glu
Phe
Phe
Leu
Gin
Gin
Gin
Pro
Phe
Phe
Leu
Авенин»
•у -глиздин**
Thr
Thr
Thr
Val
Gin
Tyr
Asn
Pio
Ser
Glu
Gin
Tyr
Gin
Pro
Tyr
Pro
Glu
Gin
Gin
Glu
Pro
Phe
AeN
lie Ala t
Gin
Val
Aen
Pro
Ser
Gly
Gin
Val
Gin
Thr
Pro/Glu
Gin
Gin
Gin
Leu
Val
Pro
Gin
** — Kasarda et al., 1983I.
лот ос-пролашшов и БП4 имеют сходство по первым II остат­
кам (крома позиции 8,9).а также по остаткам на позициях 16-18
и 21 Стабл.4).
Особенностью приведенных в табл.4 последовательностей
аминокислот компонентов <*&, <*1 и Ш 4 является наличие в
них полиглютаминовых участков с последующими остаетлма фенилаланина, пролина, тирозина. Такого рода последовательности
'28
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
.аминокислот ранее были найдены в глиадинах пшеницы. Например,
отрезок -Gin-Gin-ain-Pro-Ehe- был обнаружен в н-концевой
последовательности оо-глиадана пшеницы (Kasarda et al. ,
1983). Сходный участок идентифицирован yJHM- (табл.4, остахки 16-20).
; Сравнение и-ковцевых последовательностей авенина ( B I etz , 1932), у-глиадана (Kasarda et al. , 1983), проламинов
и Ш ежи показало следующее. Из_23-Х_остатков аминокислот
авенина 7 соответствуют таковым_ <х -пролашна ежи (табл.4,
позиции 10,II, 13_Д5718,19,22) н~3 такевш Ш 4 (позиции 10,
11,18). Следовательно, и-кокцевая последовательность авеннна~более сходна о таковой ос-проламинов ежи, чзм о Ш . Очевидным является сходство и-концевой аминокиолотной последо­
вательности ff -глиадина и ос -проламинов я Н14 ахи. На се-" "
мл позициях последовательноотей этих белков выявлены иден­
тичные аминокислоты (табл.4).
Характер и-концевых последовательноотей осЗ, ocl и
Ш 4 свидетельствует в пользу цроламиновой природы этих бел­
ков. Принципиальное значение этот вывод имеет для компонента
Ш 4 -v представителя новой группы проламинов - быстрых прола­
минов '(Конарев и др., 1983'а, 1984 а, 1986 а, б ) .
Полиморфизм птюламинрв п его использование в мгектт&ика,пии ооптов злаковчх став. При электрофорезе в плаотине ЯААГ
число компонентов в спектрах пыенщ практически не отличаетоя
от такового при электрофорезе в трубках (Конарев, Введенская,
1986).'Иначе обстоит дело о компонентный составом проламинов
овоовых и мятлпковых. Разница в числе компонентов.в спектрах
проламинов связана, в основном, о компонентами Ш . Бели число
позиций компонентов Ш,_адентифицировашшх по результатам
"электрофореза в трубках равно 6 Срио.5),~тов плаотине"Ъно
возрооло~до 19 (рио.7). " "
Эталонный опектр на рио.7 включает позиции проламинов
и Ш , идентифицированные при электрофореземз^пластине ПААГ.
Данный*эталон был использован нами при определении позиции и
обозначении компонентов проламина в ходе анализе впутриоортовой гетерогенности по спектрам этого белка. Объектами ис­
следований явились сорта и линии ежи сборной, овсяницы дуго­
вой и плевела многолетнего.
Был"проведен^ооёмёкной анализ компонентного состава
29 •
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ш
ос
/s» ; у
со
Рис.7. Эталонный электрофоретический спектр проламинов
Злаков триб Tritioeae , Aveneae , Poeae . Электро­
форез в плаотине ПААГ, рН 3,2 (Конарев, Введенская,
1986).
пролшлина двух оортов кот сборной - Петрозаводская и Ашенковская 18. Анализировали спектры проламинов ив менее 100 зерно­
вок кавдого сорта. Всего для двух сортов было выявлено 46 типов спектра проламипа. Наименее вариабельной оказалась зона
ск-проламнна (табл.5). Для спектров проламина обоих сортов ха­
рактерна выоокая степень гетерсгеннооти зоны Ш., Число компоненгов в данной зоне колеблется для оортягАЕпепковская 18 от
2-х до 7, а для сорта Петрозаводская - от 3-х до 7.
Число типов спектра проламина, характерных для оортов,
оказалооь приглерно равным 29 - для Анненковокая 18 и 27_^_для ,
Петрозаводская. Обычно специфика сорта пли линии проявляется
в "неодинаковсм соотношении чиола спектров определенного типа.
Для сорта Петрозаводская спектры типов I и 2 составили 505».
У сорта Аипенковокая 18 указанные типы спектра составляют воего Ъ% от общего числа спектров. Здесь преобладают опектры ти­
пов 19 и 26. Для этого сорта 4 типа спектра соотавляют 53$ упомянутые уже типы 19 и 26, а также 29 и 46 (табл.5). Ооталь,ные 50/S спектров представлены у обоих сортов равным числом
типов спектра проламина - 25 (Конарев, Введенская, 1986).
Анализ внутривидовой гетерогеннооти овсяницы луговой по
спектрам проламина был проведен на трех сорта: Восточная,
Йыгева 47, и Дотнува I. Из-за высокой гетерогенности спектров
проламина отдельных оемян овсяницы целесообразным оказалооь
анализировать состав этих белков по группам компонентов. Сле­
дует отметить, что, визуально, хорошо идентифицируемые группы
компонентов I, П и Ш не вполне соответствуют зонам я*-, /ьи ос.-пролагяшов (Конарев и др., 1986 в ) .
30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица б
Типы спектра проламина ежи сборной (Daotylie
glomerate ) и чаотота их встречаемости, %
Тип
спектра
Белковая формула
Чаотота встречаемости
ос
Петрозавод- Анненковокая
окая 18
Ш
I , . -2 3 ЫЧ
2
123
б S *?
3
12
5 6?
4
2
567
1412 3 4 5 6 7
19
I 3 55 7
26
I 34 5S 7
12 3 Б 6
29.
23 56
4S
спектров, %
I2 з
I2 з
12
12
12
12
12
12
12
37
13
8
5
I
I
I
-
3
3
3
3
3
3
3
2
I
—
6
16
21
8
8
В таблице 6 распределение по типам спектра осуществлено
о учетом компонентов П и Ш групп.. Общее число типов'спектра
равно 24.
'
>
Таблица 6
Типы спектра проламина овсяницы луговой CPestuoa
pratensie ) и частота их вотречаемооти, %
.piоп™?ра
Белковая формула
<х.
I
2
3
7
10
14
22
2
•
2
2
2
2
2
I2
7
6
6
.6
6 7
6 7
6 7
л
1
3
3
2
23
3
23
3
Чаотота вотречаемооти
спектров, 1?
.
йыгева 47 Вое- Дотнува I
точная
13
10
I
16
14
II
II
9
14
8
10
13
•18
3
20
6
7
7
28
15
4
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
У всех трех сортов концентрация общих доминирующих типов
спектра проламина - 1,2,7,10,14 - оказалась близкой при ин­
дивидуальном соотношении числа спектров кавдого типа для
сорта. Последнее и является основой для различения и иденти­
фикации сортов овсяницы.•Следует подчеркнуть, что упомянутые
сорта овсяницы могут быть различены при анализе гетероген­
ности только компонентов группы П.С р> -проламан).
Несколько иная задача стояла при анализе гетерогенности
образца Loiium perenne и выведенного на его основе сорта
Сиверокая. Из табл.7 видно, что популяция образца урожая
1968 г. может быть охарактеризована по трем доминирующим ти­
пам спектра проламина: 17 (26$), 22 С14#) л 23 (П#)« Состав
популяции 1975 г., судя по результатам ее оценки по спектрам
проламина, оказался совершенно иным (табл.7). Представлен­
ность опектров, которые доминировали в I960 г. лишь 7$.
Таблица 7
Типы спектра проламина плевела многолетнего
(Loiium perenne ) и частота их встречаемости, %
(учитывали компоненты . р - и у -проламинов)
Частота встречаемости, %
Образец L.perenne
Сорт Сиверская
J2JJ
спектра
I-I3
15 .
17
22
19
23
24
25-35
1968
1975
1977
1981
1983
_
6
26
14
I
II
2
35
55
15
I
I
II
5
5
-.
6
13
49
_
51
15
2
2
I
8
«.
12
36
13
3
10
2
8
13
3
6
'
В 1977 г. встречаемость биотипов, у которых типы спек­
тров проламина являются общими с таковыми популяции 1968 г.,
возросла до 86JJ. В популяции 1977 г. резко снизился процент
спектров типов I-I3 - до &%. В 1975 г. т-аких спектров было
•55;?. В популяции IS68 .г.,, спектры о' та1П1м~составом коглпонентов
32
" ~".
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
проламина отсутствовали Стабл.7).
* ~ ' Популяция оорта Сиверская урожая 1981 г. характеризует-'
ся составом биотипов со спектрами главным образом тех жэ ти­
пов, что и у образца в 1968 и 1977 гг. (табл.7). Характерным
для'; популяции этого года является высокая концентрация (51$)
биотипа со спектром проламина типа 15. В 1983 г, в популяции
произошли изменения. Ее состав'приближается к таковому 1968
и 1977 гг. (табл.7). Свидетельство тому - сходство концентра­
ций \биотипов со сходными спектрами проламинов.
Формирование популяции 1975 г. происходило, по-видамому,
в зависимости от того, какие обмена сохранили свою всхожесть
в ходе хранения 1968-1974 гг. В 1977 г. происходит как бы
восотановление утраченного равновесия в соотношении биотипов
в популяции. Сходные процессы наблюдаются в популяциях сорта
Сиверская в I98I-I983 гг. В 1981 г. три биотипа оо спектрами
проламина типов 14,15 и 17 составили 81% популяции. Очевидно
при таком соотношении биотипов популяция не отабильна. Анализ
компонентного ооотава пролаыинов семян последующей репродук. ции сорта свидетельствует о том, что состав популяции оорта
изменяется в сторону исходного образца. В нашем случае это
семена урожая 1968 г. Стабл.7). •
^
О Б С У Д Щ Ж Е РЕЗУЛЬТАТОВ
Направление филогенетической характеристика белков семян
злаков определено в нашей работе важнейшими проблемами" при­
кладной ботаники, генетики и селекции - а шенво уродство видов^и_геномов, внутривидовая гетерогенность, атаюке идентифшсация^и регистрация всего многообразия образцов, оортов, ли1 ний7 биотипов злаков. Достижения и перспективы использования
белковiсемян для решения этих вопросов проанализированы во
многих работах. Следует отметить, что в ряде случаев, даже у
пшеницы природа некоторых белков семян, которые успешно ис­
пользовались в филогенетических исследованиях, оставалась не­
ясной. Таковыми, в частности, являлись неглиадш.овые белки,
антигенный состав которых специфичен для видов и геномов.
Уж£Гна"первых этапах работы с вТБ было обнаружено, что
существует связь медцу степенью представленности антигена а
.генетической близостью видов или соответствующих геномов (Ко33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нарев и др., 1971, 1972). Предотояло выяснить природу и свой­
ства этих белков и объяснить почему наличие антигена ГСБ свя­
зано, как правило, о присутствием целого генома.
Ответы на эти вопросы были получены поело того, когда
стало ясно, что фракцияГСБ гетерогенна и представлена_множеством электро$оретич^1шх_^мпон.ент^в_о_р^зной подейжноотью.
^^"^акйх^кошонентов характерно наличие о'бших'щгоЕгешшх де­
терминант, соответствующих данному антигену, например А Ъ или
Б. Били получены доказательства тому, что генетический кон­
троль комаонентовТ^ёоущих сходные антигенные детерминанты,
осуществляется разными хромосомами генома (Конарев, 1979 а,б;
"Конарев, Чмелев, 1986; Konarev , 1981)Г'В'белках полиплоидных
злаков, имеющих геномы в разной степени родственные геному
диплоида, число компонентов ГСБ уменьшается пропорционально
степени родства_геномов вплоть дЬ~одабгб;:ДБух""1сош6нент6в,
локализованных в узкой зоне спектра нГБТ'Из сказанного следу­
ет, что штеТюивность~антиге~на~в~спвктре преципитации связана
о наличием (числом) компонентов ГСБ. Последнее же зависит от
того, насколько изменился геном анализируемого вида по срав­
нению о таковым диплоидного вида СКонарев, 1979 а, б; Konarev,
1981).
Изоляция фракции ГСБ оказалась возможной после примене­
ния иммунной аффинной хроматографии. Сравнение данных по ами­
нокислотному составу ГОБ геномов в 1 и D о уже имевшимися
для основных групп нГБ - альбуминов 0,28 и 0,19, хлороформ-метапольных белкоз (СМ-белхи) и др. позволило предположить,
что ГСБ на что иное как гидрофобные белки, связанные о липидами клеточных мембран. Их гетерогенность, сложная генетиче­
ская природа, а главное, функциональная принадлежность вполне
соответствуют тем требованиям, которые предъявляются к марке­
рам такого уровня.'
В последнее' время гидрофобные белки (лпполротеиды и гликопротёиды), связанные с клеточными мембранами, привлекают
внимание исследователей в связи с их важной ролью в осущест­
влении специфических взаимоотношений между клетками в орга­
низма. Эти белки играют важную роль в специфических процес­
сах транспорта, осуществляемого по мембранным каналам. По­
верхностные, белки _мембр^н_представляют_особый интерес как ан• тигены потому, что участвуют в клеточном узнаванйй~¥'"взаи1Я034
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
действии клеток, т.е. являются рецепторами (Такач, Птелан,
1983). В таком случае вполне понятен ш к е т быть геномный уро-^
вень антигенной специфичности ГСБ и, соответственно, совпаде­
ние-данных цитогекетических исследований родства геномов (и •
также данных по скрещиваемости) с таковыми по антигенному со­
ставу ГСБ. Мембранные белки, вследствие высокого содержания .
гидрофобных аминокислот, высоко нммуногенны, что справедливо
для ГСБ. При фракционировании мембранных белков обычными био­
химическими методами возникают препятствия из-за того, что'
приходится разделять много белков со сходной молекулярной
массой, зарядом (Такач, Штелин, 1983). Обойти эти препятствия
помогает применение моноспецифических иммунных сывороток (что
и было сделано в нашей' работе).
. В варианте маркирования белками такой олоиной генетичеокой системы, какой является геном, наличие белкового марке­
ра должно коррелировать с присутствием всего генома как сиотемы или какой-то его части, способной отражать специфику
этого генома. Такой маркер не модет быть моногенным. Наличие
. компонента - электрофоретического или серологического, нахо­
дящегося под контролем какого-нибудь одного локуса, может
коррелировать как с присутствием всего генома, так и о при­
сутствием хромосомы или ее локуса. Как геномный маркер такой
признак ненадежен, особенно при анализе анеуилоидов, гибрид- ..
ногой любого генетического и селекционного материала, где
может иметь место потеря отдельных хромосом пли их добавление.
.'Маркерами, более или менее соответствующими таким тробованиям, очевидно, являются антигены ГСБ или другие серологи­
ческие маркеры альбумина 0,19. Последний отличается еще.и тем,
что белки о антигенными свойствами альбумина 0,19 контролиру­
ются, очевидно, хромосомами разных геномов, как в олучае, на­
пример, О T.aeetivum , T.durura И Др. В геНОТИПв_ МЯГКОЙ ПШеницы вое три генома неоут генетический материал,детерминирующий
появление.белков с антигенными свойствами альбумина.О,19. 3
данном случае речь может идти о маркировании всего генотипа и
выяснении степени его близости по белкам к генотипам других
видов. Здесь особое значение приобретает возможность количе­
ственного определения антигена, например,, о помощью ракетного
иммуноэлектрофореза или кмцуноферментного анализа.
Антиген альбумин-О,I9-оказался удобным серологическим
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
маркером - показателем родства видов злаков к мягкой пшенице
и другим пшеницам группы аммера. Виды, окрещявающиеся с мят-"
кой пшеницей о трудом, имеют компонент в спектре преципита­
ции (или пик в ракетном иммуноэлектрофорезе), ослабленный
(меньшей высоты) по-'сравнению с гомологичной реакцией. Нако­
нец, виды генетически еще более удаленные от- мягкой пшегащы
{речь идет только о злаках трибы пшенщевых) этого антигена
в спектрах не имеют (Конарев, Гаврилгок, 1978; Konarev ,1978).
Согласно существующему сейчас мнению, формы ингибиторов
ос-амилаз о молекулярный массами 60000, 24000 и 12000 Да
образуются при взаимодействии субъединиц с~ меньшей молекуляр­
ной маосой - в данном случае субъедишщы 11000-12000 Да. По­
следние близки между собой по ряду биохимических характерис­
тик и, по-видимому, кодируются структурно родственными гена­
ми (Deponte et al. , 1976; Silano , 1978; Petruooi et al. ,
1978). Как было сказано выше, компоненты.О,28 п 0,19 (12000
и 24000 Да соответственно) имеют_сходные антигенные свойства.
Очевидно все семейства белков ингибиторов "ос-амилаз имеют в
структуре своих молекул субъедшицы о участками первичных по­
следовательностей, обусловливающими общие антигенные характе­
ристики. Благодаря этому серологический маркер альбумин 0,19
может отражать свойства области генома, ответственней за вою
систему белков ингибиторов ос-амилаз пшеничного зерна. Такое
предположение обосновано нашими экспериментатеными данными и
вполне согласуется о мнением других авторов (Silano , 1978).
Причина расхоздений Ш ЖХ. результатов (Konarev , I978)
И Итальянских бИОХИМИКОВ (Bozzini et al. , 1970; Piazzi et
al. , 1972), по-видимому, заключается в том, что в работах
этих исследователей не была осуществлена строгая идентифика­
ция компонента 0,19 в спектрах иммунохимпческих реакций. Им­
мунная козлиная антиоыворотка была получена (riazzi et al.,
1972) на белки фракции Ш, в состав которой, как известно,
входят"не менее 10 анодных компонентов (из семейства 0,19)
и двух катодных. Кроличья антисыворотка была фактически по­
лучена на суммарные растворимые белки зерна мягкой пшеницы
Oiazzl and Cantacalll , 1969; Bozzini et al. , 1970).
В порядке обсуждения следует отметить, что сам факт по­
лучения специфической иммунной сыворотки на альбумин 0,19
находился в несоответствии с успезшо раззиваемой италъянски36
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ми биохимиками идеей родотва генов и соответствующих им
субъединиц белков, составляющих молекулы всех классов ингиби­
торов ос-амилаз пшеничного зерна. Наша данные о налички об­
щих антигенных детерминант у большинства компонентов ингиби­
торов согласуются о концепцией происхождения всех субъединиц
ОТ обдах, предковых генов CPetruoci et al. , 1974; Vittoaal
and Silano , 1976; Deponte et al. ,1976; Silano , 1978).
, Принципиален вопроо - наоколько объективно отражают та­
кие антигены наличие генома или его генетичеокого материала,
или степень представленности последнего в анализируемом ге­
нотипе. Помимо тех доказательств, которые были приведены вы­
ше, важным критерием оценки белков как маркеров является
практика их применения в геномном анализе и, в чаотнооти,
совпадение результатов о таковыми, полученными другими мето­
дами, например, цитогенетическим. Хорошим примером служит
дифференциация по серологическим маркерам двух генетических
групп видов Triticum (Конарев и др., 1971, 1972, 1974). В
пользу серологических маркеров в анализе родотва генетическо. го материала свидетельствуют результаты тестирования генома
_j3__y полиплоидов Elytrigia , Elymus (Конарев и др., 1979;
Конарев, Ваоильева, 1979).-Здесь •зарегистрировано полное со­
впадение данных по антигенному родству ГСБ о результатами
патогенетических исследований. На примерах многих видов зла­
ков о геномом s было показано, что интенсивность проявления
антигена s в спектрах преципитации коррелирует со степенью
генетического родотва генома диплоидного носителя с соответ­
ствующим геномом полиплоида по данным цитогенетичеокого ана­
лиза (Васильева, 1980).
Наибольшее^ чиоло пшеничных антигенов обнаружено выбел­
ках полиплоидных видов пырея, которые уже в течение более
.50 лет о успехом попользуются для получения пшенично-пырейных гибридов и амфидиплоидов (цицин, 1954; Цвелев,.1976;
Dewey , 1977, 1984). Многие виды Elytrigia , а также Elymue,
leymus и др. никогда в этом отношении оболедованы не были.
В связи jo_ этим, полученные нами в 1979 году (Копаров и др.,
1979; Конарев, Ваоильева, 1979)j данные о родотве. видов
Elytrigia-Eeymue~ и их геномов~о таковыми пшениц'носили в
известной степени характерпрогноза. Так, например, мы
- предположили, что мало вероятно будет ожидать успеха от
• 37 •
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
скрещиваний видов пшеницы о видами пырея Е Л И элимуса, в бел­
ках которых были идентифицированы только с а ш е общие антиге­
ны, например B 1 B S P D .
Показательны результаты Шармы и Дкила tsharma and о т ,
1983), которые продемонстрировали мадуга_гомологию между ге­
номами T.aestiyum И Л.уевоепае . Ряд ВИДОВ Elymua , ЕОХОДЯ
из данных по антигенному ооотаву ГСБ,' должны скрещиваться о
видами Tritioum . В течение многих лет все попытки скреотить
виды этих родовбнля неудачными. Полсжительнке результаты
были достигнуты (причем о теми же видами) всего несколько
гЛет^назад (Kazl and Bernard , 1982; Sharma and-Gill~rl983).
Благодаря возмоянооти охватить большее число форм, об­
разцов, полнев представляющих вид как сложную систему, ге­
номный анализ по антигенагл ГСБ иногда, видимо, способен фик­
сировать генетическое родство такого уровня, который пе все­
гда доступен другим методам. Примеры тому - обнаружение род­
ства _генома T.urartu о одним из геномов полиплоидов Эмглёра
и гекоаплойдных"пшениц (Конарез, 1974, 1975), геномов E.elongata , junoea о геномами ряда видов пырея и элимуса и т.д.
Исследование антигенного состава ГСБ семян злаков пред­
ставителей трибы мятликовых показало, что и здесь имеет мес­
то совпадение данных по белкам о результатами генетических
и цитогенетических исследований, что дает дополнительные аргументы в пользу серологических маркеров ГСБ как показателей
степени родства генетического материала видов' злаков. Неваж­
но при этом, принадлежат ли виды в соответствии с современ­
ной классификацией к одному роду или к разным (Буткуте, Конарев, 1980, 1982).
Существенным практическим выходом из работ по геномному
анализу о помощью серологических маркеров ГСБ является воз­
можность их использования в исследовании геномного состава'
искусственных.амфядаплоидов и гибридов.(Конарев и др., 1985).
Итак, непроламинрвые^белки СнГЕ)_^^г^ероге1шая_групда,
включающая компоненты разной природы и функциональной принад­
лежности. Большпнство_входящих в_состав этой фракции белков
представляют _штерес_как_маркеры пр^_прозедении филогенетиче­
ских исследований на уровне геномов,_вздов и родов злаков";
Такое заключите"'экспериментально обосновано, в первую"оче.редь, для злаков трибы пшеницевых и датлшсовых. Недавно (Ко38 "
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
нарев и др., 1983 б, 1984 б) мы получили аргументы в пользу
того, что и у остальных злаков анализ родотва видов может '
проводится^ о использованием,^!^ При исследовании антигонно"~го состава этих белков у приблизительно 300 видов злаков вы­
яснилось, что оерологичеокие свойства нПБ сравнимы, как пра­
вило, для представителей одного рода или группы близких ро­
дов.
.i
.
• Большой теоретический и практический интерес представля­
ет внутривидовая специфичность компонентного ооотава электро-'
форотичеоких опектров глиадина и ряда других проламинов. До
^недавнегд.вреиени_ сведения_о ооот£шв_фракции проламинов име­
лись только для отдельных представителей семейства злаков,
главным образом зерновых» Исследуя электрофоретические овонства проламинов большого числа представителей семейства СКонарев и др., 1983 а, 1984 а ) , мы убедилиоь, что для многих
злаков необходимы индивидуальные условия эксперимента - на­
чиная от экстракции белков и кончая длительностью электро- •
^p^sj^gZiTSrltKoHapeB, Введенская;"1984," 1986;"Конарев и'
•др., 1986 в; Darmenoy et el. , 1981). Проведенные нами ис­
следования состава проламинов и белков СО семян злаков поjBOHHaH^TBjaraimbjrpjibKo на'вопросы самого общего характера.
Так было установлено, что компонентный ооотав проламинов~
обусловлен принадлежностью тех или иных влаков к разным три- •
бам семейства. Принципиальным явилооь обнаружение в проламинах злаков пз триб овоовых, 1сш1аревчниковыхТ-тимофеёвковых и
мятликовых компонентов быстрых проламинов - БД. Свойотва БП,
характер их родства о проламинаш Сглиадином, секаликом,
гордеином и др.) были изучены нами на примере широко распро­
страненных представителей трибы мятликовых; овсяниц, мятли­
ков, ежи.
Инализ данных по аминокислотному ооотаву позволил заклю­
чить;' что БП являются типичными проламинами. Необычайно_выоокое содержание фенилаланина оближаег БП о о -глиадинами (Конарев и др., 1986 б ) , однако,"по-видимому, это вообще харак­
терно для проламинов мятликовых (Семихов и др., 1981; Конарев,. Примак, 1984).
Наряду о аминокиолотным ооотавом в последние годы важной
и обязательной характеристикой проламинов отала N-концевая
чпоследовательность аминокиолот. Излишне доказывать, что для
39-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
получения достоверных данных о последовательности аминокис­
лот нужны чистке препараты белка. Выоокая степень гомогенно­
сти полученных нами препаратов проламинов и Ш езш была под­
тверждена в ходе осуществления дэградацйй по Эдазлу (Конарев
и др., 1986 б; Введенская и др., 1986).
Данные по н-ковдевой а»линокиолотной последовательности
проламина и Ш ела могут быть-обсуждены в "таких аспектах:
оходство о последовательностями, положенными для проламинов
пшеницы, ржи, ячменя, овса, а такзе организация пролакиновых
генов. По первому пункту важными являются два обстоятельства.
_Во-первых, дозольно хорошее совпадение и-концевых последо­
вательностей проламина и Ш ежи сборной и у-глиадона. B O - B T O J
рых, в последовательности ^шнокислот Ш 4 кайден пентаоотаток, ра11ее"обнаруаентй у ^ о ^ л и а д и н а (Kaaarda et al. ,1983),
"а'также у'авенйна (Biota , 1982). В последовательности авени- •
на этот участок как бы сдвинут на два положения вглубь моле­
кулы по сравнению о таковым в Ш 4 (позиции 18-22 и 16-20,
табл.4). Кроме этого во всех трех последовательностях амннокислот щголашна ели вшвлены по 2-3 участка из 5-? аминокис­
лотных остатков, сходных или близких таковым,найденным ранее
у проламинов пшеницы, ржи, ячменя и др. Вое сказанное выше
свидетельствует, по нашему шению, в пользу родства проламиновых генов, по крайней мере для фестукоидных злаков (Конарев и др., 1986 а ) .
Особенностью строения генов проламинов является наличие
коротких повторяющихся участков генетического материала С'Каsarda , 1980; Shewry et al. , 1984; Kreia et al. , 1985). Для
аминокислотных последовательностей проламина ежи характерной
особенностью как раз и является чередование полиглютаминовых
учаотков со следующими за ними остатками пролина, фенилаланина или тирозина. Даже на таких коротких отрезках молекул про­
ламинов и Ш (около 10-20^ длины молекулы) было обнаружено по
2-3 таких повтора. Такая структура согласуется с существующей
моделью молекулы (гена) проламина, а именно: начальный учас­
ток, представляющий некоторое разнообразие по составу амино­
кислот и следующие за ним короткие повторяющиеся последова­
тельности аминокислот типа .^Gln-Gln-Gln-Pro-Ehe- . И Др.
То, что компоненты спектров СФ представителей мятликовых,
соответствующие по электрофоретической подвижности проламинам
40
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
и Ш , действительно представляют собой белки типа проламинов i
яшшюь^основанием для'вх'гспользованкя'в изучении внутривидово2_неод11ородкости, идентификации и регистрации мятл1п:овых,
аналогично хппеницёйкм. Полиморфизм электрофоретичеокого спе­
ктра проламинов был изучен у широко культивируемых злаковых
трав - ежи, овсяницы, плевела. Конечная цель таких иоследова-.
ний - разработка подходов к идентификации и регистрации сор- >
тов,^линий, образцов этих злаков. •-••••
-"Хорошо известно наокольк6""трудно идентифицировать не
только вида, но и"р^ди~злаховых"трав^ Еще сложнее дело обсто­
ит о-сортами. Вариабельнооть морфологических признаков в за­
висимости от условий произрастания может быть веоьта значи­
тельной. Теп не менее, идентификация сортов этих культур осу­
ществляется на основе анализа морфологических признаков. Решение проблемы -^использование более надежных маркеров, проявление_которых^не"зависит от условий среды, а их идентифика­
ция модат^ыть_ооуществлена_ достаточно ^надежно.
Проламины хорошо"'зар^комондовали себя в сортовой иден'ти. фикации зерновых злаков, поэтов именно эти белки были выбра­
ны .найи_для решен^я_анало1тноа_проблеш_у злаковых трав. По­
ложительную роль сыграло то, что электрофоретичеокие спектры
проламинов этих злаков оказались довольно многокомпонентными. .
Анализ компонентного состава проламинов отдельных семян вы­
явил высокую степень гетерогенности спектров этого белка. Да­
же ограниченное число приведенных в работе примеров иденти.фикации сортов ежи, плевела и овсяницы позволило продемон­
стрировать, большие потенциальные возможности и преимущества
использование для""этих целей проламинов.'В ряде случаев для
* различения сортов овсяницы или плевела оказалось достаточным
раосмотреть_тетерогб1шоать^олько^^
—
_нов., .
Полученные результаты свидетельствуют о том, что разра­
батываемый "подход может быть полезным не.только для собствен­
но идентификации сорта ила"образца, но, в случае необходимо­
сти, может явиться единственно возможным споообсм контроля
за ходом.селекционного процесса - за изменениями, происходя­
щими в популяции.под влиянием искусственного отбора, а также
пооле_ его* окончанияТ Возможность объективного контроля за со• ставом популяции'сортов этих перекрестноопыляющихся культур
•
":
'
•
•
4 1
•
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
в комплексе с сортовой идентификацией позволит решать целый
ряд практически важных проблем семеноводства, семенного кон­
троля, а также пршшмать непосредственное учаотие в"создании
новых сортов.
" "
ОСНОВНЫЕ
вывода
Белки семян злаков охарактеризованы в связи о проблема­
ми филогении, генетики и селекции. На основе полученных дан­
ных и анализа работ других авторов сделаны следующие вывода.
1. Семена злаков трибы пшеницевых содержат гетерогенную
группу белков, обладающих хорошо выраженной ввдовой антиген­
ной специфичностью. Синтез этих белков находится иод контро­
лем нескольких генов, локализованных в разных хромосомах ге­
нома. Благодаря наличию активных видо- (геношо-) специфич­
ных антигенных детерминант и множественности кодирующих ге­
нов, они представляют собой эффективные маркеры генома. С
помощью этих белков методами иммунохимии идентифицированы
ооновные геномы пшеницы и ее культурных и диких сородичей,
исследованы геномные отношения в трабе пшеницевых.
2. По своей природе видо- или геношоопецифичные белки
представляют собой гидрофобные белки, связанные, по~вйдимо- •
му, о липидами клеточных мембран. При электрофорезе белков
семян в кислом буфере геномноспецифдчные белки двигаются
впереда проламинов и входят в состав'зоны так называемых
неглкадиновых белков ~- бех:;ов типа альбуминов и глобулинов.
3. В белках семян злаков присутствуют альбумины ингиби-торц ос -аишлаз, включающие электрофоретпчоские компоненты'
альбумин 0,19~ и 0,28 и др. В сравнительных шмунохиглических
анализах в~сочетании~с геномноспецифичными гидрофобными бел­
ками эти альбумины являются эффективными серологическими
маркерами для выявления отепени родства видов и геномов пше­
ницы й родственных злаков, а также в оценке геномного соста­
ва искусственно полученных" амфидиплоидов.
4. Электрофорезом в кислом~буфере белков спиртораотворимой фракции семян злаков установлено, что проламины злаков
представителей триб овсовых, тимофеевковых, канареечниковых
и мятликовых наряду о ос -, р> - и т -проламинамп содержат
' компоненты^ большей злектрофоретической подвижностью", чем
42" """ '
"
"
"
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ос-глиадины. Эти компоненты названы быстрыми проламинами»
По данным электрофореза о вз-Иа их молекулярная масса со*
ставляет от 12000 до 23000 Да. Пролашяовая природа к о ш о - .
нентов быстрых прси^ампнов подтверждена данными по ооотаву и
н-ковдево'^оодадоштельноотй амшгоййлот'Г *"*""
•-^5ГТезультаты~сравнення~свойств~пролшштов и быотрых
пролаюнсв иятлпковых о таковыми проламинов пшеницевых и
овоовых_указывают, на^общность происхождения проламиновых
генов у предотавителеа этих триб злаков.
6. Дутем. сравнительного электррфоретического анализа
установлена опедифичнооть оостава спектров ^быстрых проламинов~у~сЬртов и'биотипов,"что"свидетельствует о.наличии у
этих бблков_внутривадовой изменчивости и генетического поли­
морфизма.; Определены основные"возможные позиции кошонентов
'быстрых"пролашшов з_спектре и предложен'единый эталонный
спектр пролаглйнов, позволяющий зашгсывать"!-виде формулы
прсьяаминов оор'та и биотипы злаков перечисленных выше триб
(СМ.ВЫВ0Д 4 ) , включая пшеницёвые.
7. На проламинах овсяницы, плевела и еда показана воз­
можность использования электрофореза этих белков в решении
тагане вопросов прикладной ботаники и растениеводства, как
идентификация оортов и биотипов, анализ состава природных и
сортовых популяций, определение подлинности а оортовой чиототы семян злаковых грав, выяснение проиохолдвния'оорта в
хТдТ' ^
Полученные результаты указывают на перспективность ис­
пользования геномноопецифичных белков-антигенов о е ш я и про­
лашшов в идентификации геномов, оценке родотва видов, оор­
товой идентификации и регистрации генетических ресурсов' зла­
ков, а;также на необходимость дальнейшего развития биохимичеоких и молекулярно-биологических исследований белков оемяц
злаков»
Список работ, опубликованных по теме диссертации
I. Конарев А.В., Мигушова Э.Ф., Гаврилюк И.П., Конарев В.Г.
О природе пшениц группа T.timopheevii Zhuk. по данным
электрофореза и иммунохимического анализа.- Докл. ВАСХНИЛ,
1971, & 4, о.13-16.
43 •
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
JZ. Конарев А.В., Мигушова Э.Ф., Гаврилюк И.П., Конарев В.Г.
Дифференциация диких двузернянок по данкш электрофореза
и тглунохимического анализа глиадина.- Докл. ВАСХНИЛ,
1972, .* 8, 0.4-6.
3. Магушова Э.О., Конарев А.В. Генетическая разнокачественнооть дикорастущей двузернянки Закавказья.- Генетика,
1972, т.8, JS6, о.148-150. .
4. Мигупова Э.Ф., Конарев А.В. Внутривидовая неоднородность
T.araratioum Jakubz. - Труды ПО Прикл. бот., ген. И сел.,
1973, т.52, вып.1, с.206-213.
5. Конарсз А.В., Гаврилюк И.П., Магушова Э.Ф. Дифференциация
диплоидных пшениц по данным иимунохлшгчвского анализа
-. гдиадана.- Докл. ВАСХНИЛ, 1974, # 6, о. 12-14.
6. Конарзв А.В., Гаврилок И.П., Мигушова Э.Ф. Популяции ди­
ких однозернянок Закавказья,- Докл. ВАСлНКЛ, 1975, J5 5,
с.6-8.
.
'
v
7. Конарев А.З. Дифференциация первого генома полиплоидных
пшениц по данным клиунсхимического анализа спиртовой
фракции белков зерна.- Бюл. ВИР, 1975, .'г 47, с.6-11. .
8. Катушева Э.О., Конарев А.В. Генетическая неоднородность
дикой двузернянки Ирака,- Вестник с.-х. науки, 1975, № 9,
с. 18-22.
9. Конарев А.В., Губарева Н.К. Биохимические данные о проис­
хождении T.pereicumVav. - Докл. ВАСХНИЛ, 1977, № 6, С.13.
10. Конарев А.В. Анализ родства геномов пырея, житняка о ге­
номами А, В и D мягкой лшеницы по белкам зерна.- Тезисы
3-го съезда ВОГиС, Л., 1977, о.257-258.
11. Конарев А.В. К вопросу о T.urartu и отличии этого вида
от других однозернянок. - Бил. ВИР, 1977, & 70, с.9-11.
12. Конарев А.В., Гаврилюк И.П. Идентификация альбумина 0,19
в белках зерна пшениц и ряда других злаков,- Биохимия,
IS78, т.43, А I, с.28-33.
13. Конарев А.В. Электрофоретические и ивдунохимические свой­
ства альбумина 0,19 и специфического альбушна мягкой
паеницы. - Биохимия, 1978, т.43, й 4, с.622-624.
14. Gavriljuk I.P., Gubareva U.K., Geneva T.I., Konarev A»V.
Wheat genome origination on the data of biochemical and
• serological studies of seed proteins.- Abatr. XII Int.
Bot. Congr., Leningrad, 1975, p.507.
44
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
15. Konarev A.V. The identification of albumin 0,19 in grain
protein of cereals.- Abatr. 62nd enn. meeting AACO, San
Frandieoo, 1977, p.175.
16. Konarev A.V. The Identification of albumin 6,19 In grain
protein of cereele.- Cereal Chemistry, 1973, v.55, p.927-
-936.
17. Конарев А.В., Васильева Т.Н., Бухтаева А.В. Антигенный '
,состав болков зерна и связи между родами Triticum L.,
Agropyron Gaertn., Elytrigia Desv. , Elymua 1.
- Труди
по прикл. бот., ген. и сел., 1979, т.63, вып.З, 0.7G-85.
18. Барисаашилд М.Д., Губарева Н.К., Конарев А.В. Изучение
вида T.perelcun Vav. по белкам зерна.- Труды по прикл.
бот.,-ген. и сел., 1979, т.63, вып.З, 0.32-37.
19. Конарев А.В. О природе геномов пырея удлиненного Е.elon­
gate. - Генетика, 1979 а, т.ХУ, № 3, о.510-515.
20. Конарев А.В., Васильева Т.Н. Геномный анализ в роде Eiymus'L.
- Бюл. ВИР, 1979, J5 92, 0.18-22.
21. Конарев А.В. Электрофоретическое и пммунохимическое изу­
чение геношоспецифичвых белков пшеницы и пырея,- Бил.
ВНР, 1979 б, В 92, 0.5-10.
22. Конарев А.В. Антигенный состав белков серна и овязи меж­
ду родами Triticum I. , Elytrigia Desv. , Elymua 1. ,
Agr'opyron Gaertn. - В кн.: Хемосистематика и эволюцион­
ная биохимия высших растений, 1979, о.33.
23. Буткуте Б.Л., Конарев А.В. Иглмунохгшческое иоследованиа
белков семян Loiium L. в связи о филогенией этого рода.
__- Ботанический журн., 1980, т.65, J* 10, O.I453-I458.
24'. Конарев А.В. О распространении генетичеокого материала
E.juncea C2n-u ) У полиплоидных видов пырея,- Докл.
ВАСХНИЛ, 1981, И 5, с.25.
25. Konarev A.V» The genome epeolfio grain proteins and phylogenatic interrelation between Triticum Ь., Elytrigia
Desv», Elymua L., Agropyran Gaertn,- Theoretical and
Appl. Genet., 1981, v.59, N 2, p.117-121.
26. Конарев А.В. Геномный анализ в родах Eiytritjia и Elymua
по белкам семян.- В кн.: Хемосистематика и эволициошгая
биохимия высших раотений, 1982, о.67-69.,
27. Конарев А.В., Свмахов В.Ф., Примак С П . Серологическое
исследование белков семян некоторых фестукоидных злаков,
•
•
:••
- 4 5 - '
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
v
- В ки.: Хешсистеыатика л эволюционная биохимия высших
растений, 1982, 0.69-72.
28. Буткуте Б.Л., Конарев А.В. Серологическое и электрофоретическое исследование белков семян Lolium ъ. и Pestuoa
Ь. - 3 кн.: Хемоопстематика и эволюционная биохимия выс­
ших раотений, 1982, 0.49-52.
'
29. Буткуте Б.Л., Конарев А.В. Исследование' белков оеыян ро­
дов Lollwa L, И Peetuoa L. (Poaceae) в СВЯЗИ о ИХ фи­
логенией.- Ботанический яурн., 1982, т.67, № 6, о.812-819.
, 30. Конарев А.В., Сошзсов В.З., Примак С П . , Арефьева Л.П.
Электрофоретическпй анализ белков спиргорастворимой фрак­
ции сеыящ злаков. - Рук. деп. в ВИНИТИ 23.03.83 г.,
J6 1454-83.
31. Конарев А.З., Семихов В.Ф., Примак С П . , Арефьева Л.П.
Серологическое исследование белков семян злаков Роаоеае.
- Рук. Деп. в ВИНИТИ 23.03.83 г., № 1455-ЬЗ.
32. Конарев А.В., Семкхов В.Ф., Примак С П . , Арефьева Л.П.
Серологический подход к оценке родотва видов в сем.
Роасеае.- Растительные ресурсы, 1984, JS I, о.9-17.
33. Конарев А.В., Семихов В.Ф., Примак С П . , Арефьева Л.П.
О составе спирторастворимой фракции белков семян злаков.
- С.-х.биология, 1984, й 7, о.13-17.
34. Конарев А.В., Сешасов-В.'В. Использование белков оемян в
решении вопросов филогении, систематики и идентификации
злаков.- В кн.: Актуальные задачи физиологии и биохимии
растений в ботанических задах, 1984, с.84.
35. Конарев А.В., Примак С П . Характеристика проламинов мят­
ликов и овсяниц.- Прикл. биох. и микрсбиол., 1984, т.20,
. . № 6, 0.751-757.
.
'
36. Конарев А.В., Введенская И.О. Идентификация компонентов
в электрофоретических спектрах проламинов злаков из
триб Aveneae Dum.
Й Joeae K.Br»
- Докл. ВАСХНИД, 1984,
а п . с.16-18.
37. Конарев А.В., Введенская И.О. Фракционирование и очиотка
компонентов проламинов Dactylle glomerata L. - С.-х.био­
логия, 1985, J6 7, O.II6-I20.
38. Конарев А.В., Цикало Н.В., Киров Е.Г. Анализ геномного
. состава амфидашлоидов по белкам семян,- Бюл. ВИР, 1985,
» 149, о.70-77..
46
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
39. Конарев А.В., Введенская И.О., Шлшшшсов С В . О гомологии
и -концевых аминокислотных последовательностей проламинов
•злаков ИЗ триб Poeae R.Br,
, Aveneae Dum. , Tritlcoae
Dum. - Докл. ВАСХВМ, I986a,J& 3, о.9-Ю..
40. Конарев А.В., Введенская И.О., Шляпников.С.В. О свойствах
проламинов еки сборной Daotyiia glomerate L. - Биохимия,
1986, т.51, № 5, с.754-761.
41. Конарев А.В., Чмелев В.М. Гетерогенность геномноспецифичных белков - серологических маркеров геномов В и D
пшениц и эгилопсов.- Докл. ВА.СХНИЛ, 1986, J* 5, о.7-9.
42. Конарев А.В., Введенская И.О., Шляпников С В . Характе­
ристика к-концевой аминокислотной последовательности
КОМПОНвНТОВ проламина ежи Сборной - D.glomerata L.
-
Биохимия, I9866.T.5I, "й 9, с.1519-1522.
43. Конарвв А.В. Серологический подход к филогении и-систе­
матике растений; проблемы и перспективы.- В кн.: Хемосистематшса и эвол. биох. высших растений, 1986.
44. Конарев А.В., Введенская И.О. Полиморфизм проламинов и
его использование в идентификации оортов злаковых трав.
Анализ внутрисортовой гетерогенности еаи сборной - Da0_
tylis glomerata 1.
- С.-х.биология,'1986, J* 12, 0.42-47.
45. Конарвв А.В., Перчук И.Н., Наоонова Е.А. Анализ компо­
нентного состава проламинов в связи о идентификацией и
регистрацией сортов, линий овсяницы а плевела,- Труда по
прикл. бот., ген. и сел., I986BiT.I07, 0.83-87.
У0^ .
47
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Ртп.Тт.Вир;Зак.гОО.Доп.Тир.вШ:01- I50.M-I9725.IQ.0E .87.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
5
Размер файла
1 310 Кб
Теги
413
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа