close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

1044

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
На правах рукописи
МАТОРА Лариса Юрьевна
УГЛЕВОДНЫЕ АНТИГЕНЫ И ИХ ВКЛАД В СТРОЕНИЕ КЛЕТОЧНОЙ
ПОВЕРХНОСТИ БАКТЕРИЙ РОДА AZOSPIRILLUM
03.00.07 - микробиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Саратов - 2004
^лАМ
/У
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии растений и микроорга­
низмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН)
доктор биологических наук
профессор Т. М. Тараненко
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук
с.н.с. Т.С. Калебина
доктор биологических наук
профессор В.И. Панасенко
Ведущая организация:
ГНУ
Всероссийский
научно-исследовательский
институт
сельскохозяйственной
микробиологии
Россельхозакадемии (г. Санкт-Петербург — Пушкин)
Защита состоится «22» "декабря 2004 г. в 13.00 на заседании диссертационного
совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и
микроорганизмов Российской академии наук (410049, г. Саратов, просп.
Энтузиастов, 13).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.
Автореферат разослан « /л
» ноября 2004 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук
В.Е. Никитина
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Бактериальная поверхность представляет собой
сложную комбинацию разнообразных иммуногенных компонентов, и точное
устройство этой антигенной мозаики часто зависит от условий культивирования
организма, так же, как и от его генетического потенциала. Это не статичная,
строго очерченная химическая структура, ее состав может являться отражением
условий, в которых организм обнаруживается в какое-то определенное время
(Freer, 1985). Понимание свойств поверхности требуется для адекватного кон­
троля над такими процессами, как бактериальная адгезия, адсорбция и клеточное
разрушение. Изучение поверхностных структур, вовлеченных в контактные
взаимодействия микроорганизмов с растениями, обоснованно занимает одно из
центральных мест в проблеме микробного симбиоза, паразитизма и иммунитета
растений (Dazzo and Brill, 1979; Kato et al., 1980; Noel, 1992; Smit et al, 1987,
1989; 1992; Hrabak et al., 1981; Whatley et al., 1976; Matthysse et al., 1981; Newman
et al., 2000 и др.). Компоненты клеточной поверхности рассматриваются также в
качестве важных хемотаксономических маркеров для идентификации и класси­
фикации бактерий (Hancock and Poxton, 1988).
Хорошую перспективу при исследовании поверхностных бактериальных
структур имеют подходы с применением методов иммунохимии (Кэбот и Мейер,
1968; Кульберг, 1985; Kabat, 1976; Westphal et al., 1983). Однако число работ с
использованием подобных приемов при исследовании представителей почвенной
микрофлоры ко времени начала наших исследований было сравнительно невели­
ко. В том числе это касалось бактерий p. Azospirillum (DSbereiner and Day, 1976),
которые, благодаря их способности увеличивать продуктивность сельскохозяй­
ственных растений, на протяжении последних трех десятилетий являются мо­
дельным объектом в исследовании феномена растительно-микробной ассоциа­
тивности. Изучение деталей строения их бактериальных структур, являющихся
основными поверхностными антигенами, представляет фундаментальный инте­
рес, поскольку дайт возможность выяснить, как в целом организована поверх­
ность бактерий, функционирующих в ризосфере растений. Кроме того, такие
знания необходимы для создания биоспецифических зондов при экологических и
таксономических исследованиях азоспирилл.
Среди мажорных антигенов бактериальной поверхности азоспирилл как
грамотрицательных микроорганизмов особый интерес представляет липополисахарид (ЛПС) или О-антиген. Строение его О-специфического полисахарида (ОПС) определяет иммунохимическую специфичность микроорганизмов, что слу­
жит основой для их надежной внутривидовой классификации (Staub et al., 1959;
Westphal et al., 1983). К моменту начала нашей работы не существовало развитой
системы серологической классификации бактерий p. Azospirillum и отсутствова­
ли сведения об антигенной специфичности их ЛПС как наиболее важного хемотаксономического критерия. Данные углеводные Структуры-ЯВЛЯЮТСЯ' также
важными детерминантами, участвующими в процессах молеУуЯярнб&А«узнавания» при формировании ассоциативных взаимоотношении ,£Ф£дЬ'ненШ<о0йоЖН,
L
/1-35701
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4
2001). В этой связи представляют интерес сведения о степени гетерогенности и о
химическом строении и локализации их антигенных детерминант (эпитопов),
позволяющие судить об «архитектуре» поверхности клеток азоспнрилл. Сочета­
ние результатов иммунохнмического анализа различных ЛПС с результатами их
спектроскопических исследований может дать основания для заключения о
принципиальных различиях (или сходстве) в обшей химической структуре Оспецифических полисахаридов, входящих в состав ЛПС данных бактерий. Кроме
того, несомненный интерес представляют результаты сравнения имчунохимической специфичности ЛИС и капсульных полисахаридов (КИС), на основании
которых можно делать вывод о наличии или отсутствии индивидуального капсульного антигена (К-антигена) у бактерий p. Azospirillum, что является принци­
пиально важным фактом при построении системы серологической классифика­
ции данных бактерий.
После получения доказательств гликозилированности флагеллина поляр­
ного жгутика у различных бактерий (Doig et al., 1996; Brimer and Montie, 1998;
Wyss, 1998 и лр.) стало очевидным, что спектр углеводных антигенов бактери­
альной поверхности должен (или может) расшириться за счет углеводных ком­
понентов жгутика как Н-антигена. В связи с этим представляется актуальным
выяснение иммунохнмической специфичности углеводных структур, выявлен­
ных в составе полярного жгутика азоспнрилл (Moens et al., 1995), и ее сравнение
с иммунохимическими характеристиками ЛПС и капсульных полисахаридов.
Выяснение влияния R-S диссоциации, * характерной для бактерий р.
Azospirillum, на иммунохимические свойства их клеточной поверхности пред­
ставляется нам весьма значимым фундаментальным аспектом, позволяющим
полнее выявить закономерности бактериальной колониально-морфологической
изменчивости и расширить представления о «динамике» и изменчивости бакте­
риальной поверхности. Среди проблем, связанных с оценками возможных функ­
ций ЛПС азоснирилл в реализации растительно-микробных взаимодействий
(связанных, в частности, с их экологическим поведением в прикорневой зоне),
видное место занимает изучение способности ЛПС стимулировать явления агре­
гации разнообразных клеточных суспензий.
Ключевыми методологическими аспектами в практике иммунохимического анализа являются проблема получения специфических антител как основного
исследовательского «инструмента», а также разработка эффективных процедур
выделения бактериальных антигенов.
Целью настоящей работы было изучение углеводных антигенов бактерий
p. Azospirillum и оценка их вклада в архитектуру клеточной поверхности бакте­
рий.
В данной работе были сформулированы следующие задачи:
1. Разработать эффективные методики получения моноспецифических анти­
тел, обеспечивающих направленный скрининг углеводных антигенов кле­
точной поверхности азоспнрилл.
2. Выполнить сравнительное изучение антигенных свойств и установить со­
став антигенов для липополисахаридов и внеклеточных полисахаридов мо-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5
дельных штаммов Л. brasilense.
3. Оценить изменения в структуре ЛПС типового штамма A. brasilcnse при RS диссоциации.
4. Исследовать нммунохимическуто специфичность ЛПС типового штамма А.
brasilense.
5. Провести сравнительный серологический анализ различных штаммов азоспирилл с использованием антител, специфичных к углеводным антигенам
их клеточной поверхности.
6. Сравнить иммунохимические и спектрофотометрнческие характеристики
ЛПС штаммов азосиирилл, принадлежащих к различным серотипам.
7. Оценить нммунохимическуто специфичность углеводных фрагментов гликозилированного флагеллина полярного жгутика азосиирилл.
8. Провести исследования агрегационных эффектов бактериальных ЛПС в
клеточных суспензиях азоспирилл и модельных клеточных суспензиях.
9. Оптимизировать способ получения высокоочишенных препаратов ЛПС.
Научная новизна работы определяется ее следующими основными ре­
зультатами:
•
Впервые выявлена иммунохимическая гетерогенность О-специфических
полисахаридов штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245, сопровождающаяся от­
сутствием у данных бактерий индивидуального капсульного антигена. Оце­
нен вклад отдельных О-специфических полисахаридов в формирование кап­
сульного и экзополисахаридного слоя.
•
Описан новый характер микробной R-S диссоциации, обусловленной изме­
няющимся вкладом двух О-ангигенов в архитектуру клеточной поверхности
в зависимости от возраста культуры.
•
Впервые получены данные о моносахаридном составе эпигонов и серотипе
типового штамма A. brasilense Sp7.
• Обнаружено, что разные О-специфические полисахариды, определяющие
гетерогенность ЛПС A. brasilense Sp245, отличаются по способности к анти­
генной модификации, являющейся результатом изменений условий выра­
щивания бактерий на лабораторных средах.
•
У молельных штаммов A. brasilense впервые выявлено наличие прочно свя­
занного чехла (липо)полисахаридной природы, экранирующего флагеллнн
полярного жгутика.
•
Установлено, что углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина
полярного жгутика типового штамма A. brasilense Sp7 ангигенно идентичны
одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена.
•
Впервые систематизированы структурообразующие свойства ЛПС азоспи­
рилл в клеточных суспензиях.
Практическая значимость работы.
В работе предложен эффективный способ иммунизации животных целы­
ми клетками, обработанными глутаровым альдегидом, обеспечивающий полу­
чение моноснецифических антител на бактернхтьные ЛПС, демонстрирующих
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6
шгаммовую специфичность. Создана биотест-система серологической иденти­
фикации бактерий рода Azospirillum, учитывающая иммунохнмические особен­
ности их липополисахаридных антигенов. Разработан новый способ получения
высокоочишенных препаратов ЛИС, защищенный патентом РФ.
Полученные данные, характеризующие особенности антигенного строе­
ния клеточной поверхности азоспирилл, могут способствовать разработке адек­
ватных представлений о механизме ассоциативных взаимоотношений между
растениями и почвенной микрофлорой. Выполненная в работе идентификация Оспеиифического полисахарида, гомологичного по составу основным внеклеточ­
ным структурам A. brasilense, обеспечивает целенаправленный поиск эффектив­
ных биоспецифических зондов при проведении цитохимических, таксономиче­
ских и экологических исследований азоспирилл.
Результаты диссертационной работы применяются при проведении науч­
ных исследований в Лаборатории генетики, Лаборатории биосенсоров на основе
наноразмерных структур, Лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ
РАН и др. Они используются автором при проведении лекционных занятий по
курсу «Основы аналитической иммунохимии» и практических занятий со сту­
дентами, подготовке ими курсовых и дипломных работ в Учебно-научном центре
физико-химической биологии Саратовского госуниверситета и ИБФРМ РАН.
Материалы диссертации использованы при написании методического пособия
«Практические занятия по физико-химическим и биохимическим методам ис­
следования биополимеров» (Саратов, изд-во Сарат. ун-та, 2003 г.).
Основные положения, выносимые на защиту:
•
Предварительная обработка клеточной поверхности глутаровым альдегидом
исключает иммунный ответ па натнвные мембранные белки и обеспечивает
синтез антител на углеводные соматические бактериальные антигены. Полу­
чаемые при этом антитела имеют шгаммовую специфичность.
• ЛПС штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245 обладают выраженной нммунохимической гетерогенностью, выражающейся в наличии двух фракций Оантигена, регистрируемых в составе бактериального ЛПС.
•
R-S диссоциация типового штамма A. brasilense Sp7 имеет нетипичный ха­
рактер. В этом случае не происходит кардинальных изменений в структуре
О-спенифических полисахаридов, а изменяется лишь их антигенность.
• Иммунодоминантными моносахаридами в составе антигенных детерминант
липополисахарида штамма A. brasilense Sp7 являются галактоза и рамноза.
•
У штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245 отсутствует индивидуальный капсульный антиген, а каисульный слой и экзополисахарид иммунохимически иден­
тичны одному из двух О-специфических полисахаридов, входящих в состав
ЛПС данных бактерий.
•
Полярный жгутик бактерий рода Azospirillum покрыт чехлом (липо)полисахаридной природы, ассоциированным с поверхностью флагеллы и
обладающим экранирующим эффектом.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7
Н-аншген демонстрирует наличие антигенных перекрестов у представителей
видов A. brasilense и A. lipoferum. Углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина полярного жгутика штамма A. brasilense Sp7 антигенно иден­
тичны фрагментам соматического антигена.
•
Спектры поглощения света препаратами ЛПС имеют характерные отличия
для серологически различных штаммов, а изменения спектров, наблюдаемые
внутри одного серотииа, коррелируют с иммунохимическими и биохимиче­
скими различиями штаммов.
•
Препараты ЛПС азоспирилл проявляют различные типы структурообразую­
щих эффектов в суспензиях растительных, бактериальных клеток и эритро­
цитов.
•
Обработка протеиназой К высокомолекулярного ЛПС-содержашего комплек­
са, экстрагированного из наружной мембраны азоспирилл, обеспечивает по­
лучение высокоочищенных препаратов ЛПС, содержащих полный спектр ан­
тигенных детерминант и демонстрирующих эффективное разделение при
электрофорезе в полнакриамидном геле (ПЛЛГ).
Апробация работы. Основные положения диссертации были представле­
ны в виде устных и стендовых сообщений на VIII Всесоюзной конференции
«Химия и биохимия углеводов» (Тбилиси, 1987); Всесоюзной конференции «Ре­
гуляция микробного метаболизма» (Нушино, 1989); II Всесоюзном семинаре
«Химия и биохимия углеводов клеточной поверхности микроорганизмов» (Сара­
тов, 1991); VIII Восточноевропейском симпозиуме по биологической азогфиксации «Nitrogenfix'92» (Саратов, 1992); I Европейской конференции по азотфиксации (Сегед, Венгрия, 1994); VI Рабочем совещании «Azospirillum и родственные
микроорганизмы» (Шарвар, Венгрия 1994); IX Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, 1995); X Международном конгрессе по азотфиксации (СанктПетербург, 1995); VIII Международном конгрессе по молекулярным раститель­
но-микробным взаимодействиям (Ноксвилл, Теннеси, США, 1996); II Европей­
ской конференции но азотфиксации (Познань, Польша, 1996); XI Международ­
ном конгрессе по азотфиксации (Париж, Франция, 1997); III Европейской конфе­
ренции по азотфиксации (Люнтерен, Нидерланды, 1998); X Международном
Конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии «Мир микробов»
(Париж, Франция, 2002); XI Международном конгрессе по молекулярным взаи­
модействиям растений и микроорганизмов (Санкт-Петербург, 2003); Междуна­
родном симпозиуме «Биохимические взаимодействия микроорганизмов и расте­
ний в условиях техногенных загрязнений» (Саратов, 2003); III Всероссийской
школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2004), а также на
отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН.
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании Лаборато­
рии физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН 23 июня 2004 года.
Публикации. По теме диссертации опубликованы 53 работы.
Структура и обьем диссертации. Диссертация состоит из введения, об­
зора литературы, описания материалов и методов исследования, восьми глав с
изложением результатов работы и их обсуждением, заключения, выводов и спи-
•
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8
ска цитируемой литературы, включающего 459 источников. Диссертация ихтожена на 266 страницах машинописного текста, содержит 62 рисунка и 6 таблиц.
Работа выполнена в Лаборатории физической химии клеточных структур
ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Разработка эффективных
тест-систем к антигенным структурам клеток микроорганизмов и растений» (№
гос. per. 01890017743, научный руководитель зав. лаб. д. х. н., профессор Щеголев С.Ю.), а также в соответствии с планом НИР по проекту «Создание эффек­
тивной биотест-системы для мониторинга почвенных азотфиксирующих бакте­
рий, ассоциированных с высшими растениями», выполненному в соответствии с
Госзаказом от Миннауки РФ в рамках ГНТП «Средства обеспечения исследова­
ний по физико-химической биологии и биотехнологии» (Распоряжение № 816ф
от 15.03.95 г. и последующие, научный руководитель зав. лаб. д.х.н., профессор
Щеголев С.Ю.). Работа поддержана грантами Комиссии РАН но работе с моло­
дежью по итогам конкурсов 2002-2004 г.г. по поддержке базовых кафедр и фи­
лиалов кафедр, созданных при институтах РАН, грантом Президента РФ № НШ1529.2003.4 на поддержку молодых российских ученых и ведущих научных
школ, грантом Саратовского Международного центра перспективных исследова­
ний 98-4-04, грантом INTAS 96-1015 и грантами NATO LST.CLG 975040 и
LST.EV 980093.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В обзоре литературы, состоящем из 5 разделов, дано описание бактерий
рода Azospirillum как молельного объекта в исследованиях эффектов ассоциатив­
ности; изложено строение наружной мембраны грамогрицательных бактерий;
дана подробная характеристика липополисахарнлов как мажорных компонентов
мембраны и важнейших углеводных антигенов (О-антигенов); приведено описа­
ние антигенных свойств и структуры кансульных полисахаридов (К-антигенов) и
полярных жгутиков (Н-антигенов); проанализирована роль поверхностных
структур микроорганизмов в растительно-микробных взаимодействиях и в про­
цессах бактериальной агрегации; дано описание иммунохимических подходов в
исследовании поверхности почвенных бактерий.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В данной главе приводится характеристика использованных в работе бак­
териальных штаммов и мутантов. Описаны методики получения антител (Ат),
препаратов углеводных антигенов (Аг) и препаратов полярного жгутика азоспирилл. Дано описание экспериментов, основанных на иммунопрецинитации. При­
ведены методики денатурирующего электрофореза в ПААГ и иммуноблогтинга,
иммуноферментного анализа (вариант ELISA), дот-анализа целых клеток, иммуноэлектронной микроскопии и радиоиндикаторного анализа. Описано использо­
вание конкурентного иммуноанализа при оценке строения углеводных эпитопов
бактерий и определения иммунохимической активности О-ПС с применением
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
метода спектрогурбидиметрии. Дано описание методики опенки подвижности
бактериальных клеток. Описаны приемы исследования агрегации клеток в сус­
пензиях, агглютинации эритроцитов и фазового разделения их суспензий.
ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. Разработка способа получения моноспецифических антител на Оантигены и модификация способа выделения высокоочишенных препара­
тов ЛПС
3.1.1. Опенка эффективности иммунизации животных целыми бакте­
риальными клетками, обработанными бифункциональным реагентом. В
работе предложена новая методика иммунизации
целыми бактериальными клетками, позволяющая
получать антитела на углеводные антигены бакте­
рий, минуя стадии термической обработки клеток
и дополнительной очистки ангисывороток. Пред­
лагаемая методика заключается в иммунизации
животных отмытыми от капсулы бактсрихтьнымп
клетками, обработанными 2%-ным раствором глутарового альдегида (ГЛ). Установлено, что антите­
ла к клеткам, обработанным ГЛ, в отличие от анти­
тел к ннгактным клеткам, не взаимодействуют с
белками, входящими в состав экстракта бактери­
альных мембран, образуя четкую линию преципи­
тации с липополисахаридной фракцией (Оантигеном) (рис. 1). Результаты сравнительного
анализа антител на хроматографически очищенный
Рис. 1. Результат линейпрепарат ЛПС штамма Cd с антителами, получен­
ного иммуноэлектрофоными с помощью предлагаемого нами способа,
реза экстракта наружных
подтверждают, что иммунизация животных целы­
мембран штамма Cd с
ми бактериальными клетками, обработанными ГЛ,
гомологичными антите­
приводит к получению высокоспецифичных анти­
лами, полученными к
тел на ЛПС исследуемых бактерий. При этом в
обработанным ГЛ (1) и к
отличие от антител к интактным клеткам, они де­
интактным (2) клеткам.
монстрируют штаммовую специфичность (рис. 2).
Четкая перекрестная реакция, сравнимая с прямой реакцией по интенсивности,
наблюдается только для близкородственных штаммов (на рис. 2 - для штаммов
Cd и Sp7).
Данный способ иммунизации успешно апробирован на других грамотрицательных бактериях. В частности, получены специфичные антитела к штаммам
Agrobacterium radiobacter P221 и 5D-I. Кроме того, имеется положительный опыт
получения специфичных антител к углеводным антигенам клеточной поверхно­
сти грамположительных бактерий на примере штамма Rhodococcus maris ЛМЗ.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
10
3.1.2. Обсуждение возмож­
ного механизма ингибирования
глутаровым альдегидом иммун­
ного ответа на нативные белко­
вые поверхностные антигены.
Механизм ингибирования глутаровым альдегидом иммунного ответа
к
на нативные белковые поверхност­
Рис. 2. Результаты иммунодиффузионные антигены связан, по нашему
ного анализа экстрактов наружных
мнению, со способностью ГА
мембран штаммов A. brasilense Cd (l),
взаимодействовать со свободными
Sp245 (2), Sp7 (3), JM125A2 (4) и Sp 107
аминогруппами в белках и с хими­
(5) с антителами к штамму Cd, получен­
ческой бифункциональностью это­
ными к интактным (А) и обработанным
го реагента. Мы установили, что
ГА (Б) клеткам.
способность ГЛ перекрестно сши­
вать белки не только исключает
иммунный ответ на нативные белковые антигены, но также обеспечивает устой­
чивость фиксированных клеток к их разрушению под влиянием таких химиче­
ских соединений как додецилсульфат натрия (ДСН) и 2-меркаптоэтанол, являю­
щихся компонентами буфера для приготовления образцов для денатурирующего
электрофореза. Показано, что стандартная процедура получения клеточного лизата, заключающаяся в кипячении бактериальных клегок в буфере для образцов,
в случае предварительной обработки раствором ГЛ не приводит к разрушению
клеток. Можно предположить, что активация глутаровым альдегидом, модифи­
цируя белковые эпигоны, исключает иммунный ответ на нативные мембранные
белки, и, одновременно с этим, перекрестно сшивая их, обеспечивает более дли­
тельную персистсниию бактерий и ходе иммунизации. При этом бактерии могут
более эффективно исполнять роль корпускулярных адьювантов иммунного отве­
та, что приводит к получению антисыворотки, демонстрирующей высокий титр
О-специфнческих антител. Титры антисывороток против обработанных и интактных клеток составляют 1:20000 и 1:5000, соответственно.
3.2. Модификация способа получения высокоочишенных препаратов
JinC. В основу предложенного нами способа быстрого получения высокоочишенных препаратов бактериальных липополисахаридов легли два различных
метода выделения ЛПС. Первый из них основан на экстракции ЛПС из бактери­
альной мембраны с помощью хелатирующего агента ЭДТА в Трис-HCl буфере
(Leive et al., 1968). При использовании второго метола высокоочищенныи, не
содержащий белка препарат ЛПС получается в результате обработки предвари­
тельно лизированных бактерий высокоэффективным протеолитическим фермен­
том протеиназа К (Hitchcock and Brown, 1983).
Предложенный нами упрошенный способ получения высокоочишенных
бактериальных ЛПС заключается к протеиназной обработке не лизата бактерий,
а солюбилизата их наружных мембран. Данный способ позволяет упростить
процедуру выделения чистого ЛПС, минуя стадию разрушения бактериальных
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
11
клеток в присутствии ДСН, что обеспечивает отсутствие примесей этого соеди­
нения в получаемом препарате ЛПС. Кратко предлагаемый способ состоит в сле­
дующем. Бактерии выращивают на соответствующей питательной среде при оп­
тимальной температуре культивирования до логарифмической фазы роста. Затем
их отделяют от среды культивирования с помощью центрифугирования и экстра­
гируют из них комплекс, состоящий из лнпополисахарпда и белка, путем добав­
ления к клеточной массе буферного раствора, содержащего ЭДТЛ в количестве
0.01 - 0.05 мМ на 1 г влажных клеток. Экстракт отделяют от ингактных бактери­
альных клеток с помощью центрифугирования и добавляют к нему протеиназу К
до конечной концентрации 80 мкг/мл. Данную смесь инкубируют в течение 60
мин при температуре 56-60°С. Получаемый ЛПС используют как в растворе, так
и после выделения его из раствора с помощью стандартных процедур осаждения.
Препарат ЛПС, полученный с помощью предложенного нами способа, об­
разует более чёткий трек при электрофоретическом разделении, чем препарат
ЛПС, полученный при протеиназной обработке целых клеток (рис. 3 Л). При
этом ЛПС, полученные всеми тремя способами, идентичны с иммунохимической
точки зрения (рис. 3 Б).
Следовательно, в ре­
зультате протеиназной обра­
ботки экстракта
наружной
мембраны, полученного экс­
тракцией ЭДТЛ, мы получаем
препарат ЛПС, применимый
для анализа в ПЛЛГ и демон­
стрирующий при электрофоре­
зе более чёткое разделение.
При этом данный препарат антигенно идентичен ЛПС, выде­
•.а*
ленному из бактериального
лизага, но выгодно отличается
простотой получения. Выде­
Рис. 3 Л. Результаты электрофореза в
ленный описанным способом
ПЛЛГ препаратов ЛПС Sp245, получен­
препарат, благодаря отсутст­
ных протеиназной обработкой бактери­
вию трудноуловимых примесей
ального лизага (1), экстракцией из целых
ДСН, может быть использован
клеток с помощью ЭДТЛ (2) и протеи­
не только в электрофоретиченазной обработкой экстракта, выделен­
скнх экспериментах, но и в
ного с помощью ЭДТЛ (3). Б. Результа­
широком наборе микробиоло­
ты иммунодиффузионного анализа дан­
гических, биохимических и
ных препаратов с Лт на ЛПС Sp245.
иммунологических исследова­
ний.
г,
r.:fi
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
12
Глава 4. ИммунохимическнП анализ ЛПС молельных штаммов
Azospirillum brasilense
4.1. Анализ строения O-ainшейных детерминант типового штамма А.
brasilense Sp7. По результатам химического анализа в составе ЛПС типового
штамма A. brasilense Sp7 было выявлено несколько О-ПС (Жемеричкин с соавт.,
1989). Для оценки иммунохимической активности отдельных фракций О-ПС мы
применили известный подход с использованием эффекта торможения процесса
образования нерастворимых комплексов Лт+ЛПС при добавлении к смеси реа­
гентов «конкурентных» фракций О-ПС с заранее определенной структурой (Кэбот и Мейер, 1968; Rabat, 1976, 1980). При этом оказалось возможным усовер­
шенствовать традиционную процедуру, используя способность О-ПС лаже при
малых концентрациях (менее 2 мкг/мл) образовывать нерастворимые комплексы
со специфичными антителами. Последние, таким образом, могут быть удалены
из раствора, например, центрифугированием. Мы определяли концентрацию
преципитата, образующегося при взаимодействии препарата суммарного ЛПС,
выделенного с поверхности бактерий, с антителами в растворе, истощенном
предварительной обработкой исследуемым О-ПС. По уменьшению концентра­
ции образовавшегося преципитата (по сравнению с таковой, полученной при
использовании неистощенного раствора Лт) судили об иммунохимической ак­
тивности данного О-ПС.
На рис. 4 приведены ре­
зультаты сиектротурбилиметрического определения концентра­
ции С иммунных комплексов
ЛПС+Лт до истощения (данное
значение С было принято за
100%) и после истощения раство­
ров антител одним из О-ПС дан­
ного штамма, чей моносахаридный состав был определен в рабо­
те Жемеричкина с соавторами
(1989). Можно констатировать,
что этот О-ПС связывает пример­
но до 50% антител, полученных
Рис. 4. Влияние истощения растворов
против целых клеток A. brasilense
антител фракцией О-ПС на массовоSp7. Эта оценка согласуется с
объемную концентрацию С частиц им­
наличием у данного штамма двух
мунных комплексов ЛПС+Лт в зависи­
О-ПС, более детально исследо­
мости от концентрации Со.цс полисаха­
ванных нами в экспериментах,
рида.
представленных в следующих
разделах. Полученные результаты были сопоставлены с данными независимого
метода - ингибирования реакции преципитации в геле. В результате иммуноднффузионного анализа был зарегистрирован выраженный ингибирующий эф­
фект исследуемого О-ПС.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
13
Мы провели оценку валентности данного О-ПС, т.е. числа детерминантных групп (или мест связывания антител) в расчете на одну молекулу антигена.
Это число устанавливали методом Кэбота (Кэбот и Мейер, 1968), определяя мо­
лярное отношение Лг/Лт в преципитате в зоне эквивалентности (максимума кри­
вой осаждения). Анализ состава преципитата показал, что отношение молярных
концентраций О-ПС и Ат составляет приблизительно 1:6. При данных вычисле­
ниях значения молекулярной массы антител и полисахаридов принимали равны­
ми 160 КДа (Кэбот и Мейер, 1968) и 15 К Да (Жемеричкин соавт., 1989), соответ­
ственно. Допуская, что оба активных центра Лт связаны с детерминантами поли­
сахарида, можно получить, что в рассматриваемой молекуле О-ПС имеется 12
мест связывания с антителами. Эти оценки согласуются с числами мест связыва­
ния, приведенными в литературе для других микробных полисахаридов с близ­
ким химическим составом и молекулярной массой (Кэбот и Мейер, 1968; Со­
ловьева с соавг., 1986).
Нами оценен ингибируюший эффект моносахаридов, входящих в состав
исследуемого О-ПС - галактозы, галактуроновой кислоты и рамнозы. Для срав­
нения в качестве ингибиторов были использованы также глюкоза и мальтоза.
Концентрацию моносахаридов W ' M выбирали с заведомым избытком по отно­
шению к концентрации специфических антител. Оптимальное соотношение кон­
центраций Аг и Ат для последующего построения традиционных кривых осаж­
дения подбирали с иомошью
метода спектротурбидиметрии.
С, мкг/мл
Результаты, представленные на
рис. 5 показывают, что по убы­
ванию степени торможения
иммунохимических
реакций
данные моносахариды можно
расположить в следующей по­
следовательности:
галактоза
(кривая 3), рамноза (кривая 4)
и глюкоза (кривая 5). Галактуроновая кислота практически
20
40
60
80
не оказывала влияния на пол­
ноту осаждения комплексов
ЛПС+Ат, и кривая осаждения
Рис. 5. Зависимость концентрации преципи­
для Ат, обработанных этим
тата С в смеси ЛПС + Ат от концентрации
моносахаридом,
фактически
антигена Стс при добавлении до 10"4 М га­
совпадает с контрольной кри­
лактозы (3), рамнозы (4), глюкозы (5) и га­
вой осаждения для необрабо­
лактуроновой кислоты (6) в сравнении с кон­
танных Ат (кривая 6).
тролем (растворы Ат без моносахаров) (6,
темные ромбы).
Следует отметить, что,
несмотря на избыток концен­
трации ингибирующих моносахаридов, степень торможения, характеризуемая
уменьшением С, составляет, например, для рамнозы и галактозы лишь около
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
14
30-7-40%. Однако, эти значения близки к результатам, приведенным в литературе
для других систем с низкомолекулярными ингибиторами реакций ЛПС + Лт
(Jann and Westphal, 1975), не превышающим, как правило, 50%. Можно предпо­
ложить, что существование предела степени ингибирования связано с тем, что
терминальным моносахаридом блокируется только часть объема активного цен­
тра антител, рассчитанного на большую но размеру детерминанту.
В качестве независимого метода для сравнительного анализа ингибнрущей активности моносахаридов использовали двойную радиальную иммунодиффузию. Добавление к раствору Лт галактозы и рамнозы приводило к сущест­
венному ослаблению линий преципитации по сравнению с контролем (без до­
бавления моносахаридов). Таким образом, и в этом случае эффективными инги­
биторами для реакции между ЛПС A. brasilense Sp7 и антителами являются га­
лактоза и рамноза, что свидетельствует об их доминирующем положении в со­
ставе антигенных детерминант. Следовательно, именно эти моносахаридные ос­
татки вносят определяющий вклад в серотип данного микроорганизма, представ­
ляющий собой всю совокупность О-антигенных детерминант, выявляемых в се­
рологическом анализе.
4.2. Выявление нетипичного характера R-S диссоциации штамма А.
brasilense Sp7. Явление колониально-морфологической изменчивости или дис­
социации бактерий известно с 20-х годов прошлого века как своеобразная форма
изменчивости, в основе которой лежат мутации, и изучено, главным образом, на
примере патогенных бактерий. Согласно традиционным представлениям о мик­
робной диссоциации, различие между R- и S-вариантамн обусловлено отсутстви­
ем О-специфических цепей в составе ЛПС R-варианта.
В 1987 г. впервые была обнаружена спонтанная изменчивость морфологии
колоний типового штамма Л. brasilense Sp7 (Матвеев с соавт., 1987). Было пока­
зано, что образование стабильной S-формы штамма Sp7 связано с исчезновением
в его плазмидном профиле плазмиды 115 МДа (р115). Авторы предположили,
что pi 15 может обуславливать диссоциативные переходы у A. brasilense Sp7.
Мы отметили, что по внешнему виду колонии 18-часовых культур Sp7-R и
Sp7-S не отличаются друг от друга, однако по прошествии примерно 72 часов
исходный штамм Sp7-R формирует на твердой среде шероховатые колонии с
неровным краем. В тех же условиях колонии мутантного Sp7-S штамма остаются
гладкими и блестящими и не проявляют даже со временем фенотипических при­
знаков, характерных для исходного штамма. В этой связи нам представлялось
целесообразным проследить за изменением ЛПС R- и S-форм типового штамма
A. brasilense Sp7 в зависимости от возраста культур. В работе использовали куль­
туры, выращенные в течение 18 ч на жидкой малатной среде, а также выращен­
ные в течение 72 ч на среде того же состава с добавлением 1.5% агара. Основным
инструментом анализа служили антитела на ЛПС, полученные для 18-часовых и
72-часовых культур R- и S-форм. Однородность культур контролировали по
плазмидному составу: наличию (у Sp7-R) и отсутствию (у Sp7-S) в плазмидном
профиле pi 15 (анализ плазмидного профиля по методу Экхардта (Eckhardt, 1978)
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
15
проводила старший научный
сотрудник группы генетики
микроорганизмов ИБФРМ РАН
Л.П. Петрова).
Сравнение результатов
иммунизации кроликов 18- и
72-часовыми культурами Rформы штамма Sp7 выявило
исчезновение в иммуноэлектрофоретическом профиле 72•1*
'I*' .
»
часовой R-формы одной из двух
полос преципитации, выявляе­
Рис. 6. Л. Результаты линейного иммуномых антителами к 18-часовой
электрофореза препаратов ЛПС, выделен­
R-форме (рис. 6 Л, с, d). Для Sных из 18-часовой R-формы (2) и из
формы наблюдали обратную
18-часовой S-формы (З), с Лт на ЛПС
картину: одна из двух полос
18-часовой S-формы (а), 72-часовой
преципитации не выявлялась с
S-формы (Ь), 18-часовой R-формы (с) и
помощью антител к 18-часовой
72-часовой R-формы (d); В. Результат
S-форме (рис. 6 Л, а), и только
электрофореза в ПАЛ Г препаратов ЛПС,
антитела к 72-часовой S-форме
выделенных из 18-часовой R-формы (2) и
выявляли оба антигена в соста­
18-часовой S-формы (З).
ве препаратов ЛПС штамма Sp7
(рис. 6 Л, Ь). В то же время, сами препараты ЛПС были идентичны между собой
но числу выявляемых (двух) антигенных компонентов (рис. 6 Л) и демонстриро­
вали одинаковые электрофоретические профили в ПААГ-электрофорезе (рис. 6
В). Также было показано, что спектры поглощения продуктов реакции с фенолом
и серной кислотой у ЛПС R- и S-форм штамма Sp7 практически совпадают. В
соответствии с результатами работы (Dubois et at., 1956), совпадение этих спек­
тров для исследуемых препаратов свидетельствует о близости их тотального моносахаридного состава.
Следовательно, для штамма A. brasilense Sp7 мы обнаружили нетипичный
случай R-S диссоциации, при которой не происходит качественных изменений в
структуре полисахаридных звеньев О-ПС, а изменяется лишь их антигенность.
Полученные результаты позволили нам предположить, что R-S диссоциация А.
brasilense Sp7 состоит в изменении у мутантного S-варианта особенностей синте­
за одного из О-ПС, который мы условно обозначили как R-антиген. Второй из
двух илентифицированных О-ПС мы обозначили как S-антиген. В соответствии
со схемой, представленной на рис. 7, мы полагаем, что основной вклад в форми­
рование характерной морфологии колоний 72-часовой R-формы, очевидно, вно­
сит R-антиген. Преимущественным синтезом именно этого О-ПС на достаточно
поздних стадиях роста дикого штамма и его экранирующим действием по отно­
шению ко второму О-ПС (S-ангигену) можно, по-видимому, объяснить морфоло­
гические и иммунологические особенности R-формы A. brasilense Sp7. У 18-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
16
часовой S-формы
Rантиген, очевидно, экра­
нирован S-антигеном, и
заметно иммуногенным
этот О-ПС становится
только у 72-часовой Sформы бактерий.
Иммуноферментный анализ позволил
нам визуализовать R- и
S-антигены в электрофоретическом профиле
ЛПС штамма Sp7 с по­
мощью антител к ЛПС SРис. 7. Предполагаемая схема распределения Оформы. На рис. 8 можно
антигенов при R-S диссоциации штамма A. brasi­
видеть, что антитела к
lense Sp7 (темные кружки - R-антнген, светлые
ЛПС
18-часовой
Sкружки - S-антиген).
формы четко выявляют
S-антиген и практически не выявляют
В
с
R-антиген, в то время как антитела к
ЛПС 72-часовой S-формы выявляют
оба антигена в составе ЛПС, по­
скольку, как было отмечено выше, у
старой культуры S-формы наряду с SS-Ar
антигеном иммуногенным становится
также и R-антиген.
R-Ar
Имеется достаточно оснований
для заключения о том, что, как R-так
и S-вариант данного штамма имеют
полноценный ЛПС с развитой струк­
турой О-антигена. Переход от R- к Sшт
варианту связан, по нашему мнению,
с перераспределением вкладов двух
Рис. 8. Результат электрофореза в
О-ПС (четко выявленных как у ис­
ПАЛГ препарата ЛПС, выделен­
ходного штамма, так и у его Sного из 18-часовой R- формы (А)
мутанта) в архитектуру клеточной
и визуализация S- и R-антигенов в
поверхности бактерий в зависимости
иммуноблоттинге с Ат к молодой
от возраста культур и коррелирует с
S-форме (В) и старой S-форме (С).
исчезновением из экстрахромосомно­
го состояния плазмиды 115 МДа.
иммунохимическон
гетерогенности
О4.3.1.
Исследование
специфических полнсахарнлов штамма A. brasilense Sp245 Иммунохимические исследования ЛПС, выделенных из наружной мембраны бактерий дикого
штамма A. brasilense Sp245 и его мутантов с измененной структурой ЛПС,
т?ттт?
т ? т ? т?
L4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
17
I» .* к , •;
Рис. 9. Результат
иммунодиффузионного анализа пре­
паратов ЛПС штаммов Sp245
(1), КМ018 (2), КМ252 (3) и
КМ 348 (4) с Ат против ЛПС
исходного штамма (А).
Рис. 10. Результат линейного иммуноэлектрофореза препаратов ЛПС КМ018
(1), Sp245 (2) и КМ252 (3) с Ат против
ЛПС исходного штамма.
позволили установить, что для штамма Sp245 (как и для типового штамма Sp7)
характерно наличие двух О-ПС в составе ЛПС, которые мы обозначили как ОПС1 и 6-ПС2. При иммунодиффузнонном ан&чизе (рис. 9) антитела против ЛПС
исходного штамма выявляют 0-ПС1 в препарате ЛПС мутантного штамма
КМ018 и 0-ПС2 - в препаратах ЛПС штаммов КМ252 и КМ348. По результатам
линейного иммуноэлектрофореза (рис. 10) данные О-ПС отличаются по заряду:
0-ПС1, имеющий анодную подвижность, является кислым полисахаридом, а ОПС2 - нейтральным. Данные химического анализа подтвердили наличие двух ОПС в составе ЛПС данного штамма. ЛПС мутанта КМ252 содержал только ней­
тральный О-ПС, а ЛПС мутанта КМ018 - только кислый О-ПС (Fedonenko et al.,
2002).
Тандемный иммуноэлектрофорез выявил наличие общих антигенных де­
терминант не только в составе ЛПС исходного штамма и его мутантов (рис. 11)
(о чем свидетельствуют сливающиеся пики
преципитации), но и в составе фракций ОПС1 и 0-ПС2 при непосредственном срав­
нении их между собой. При этом на данных
иммуноэлектрофореграммах отчетливо на­
блюдаются и так называемые шпоры - про­
должения линий преципитации, отмеченные
стрелками. Наличие шпор, в свою очередь,
Рис. П. Результат тандемного
говорит о том, что в составе 0-ПС2 имеются
иммуноэлектрофореза препара­
антигенные детерминанты, отсутствующие у
тов ЛПС КМ252 (1), Sp245 (2) и
0-ПС1.
КМ018 (3) с Ат на ЛПС исход­
Результаты химического анализа пре­
ного штамма.
паратов 0-ПС1 и 0-ПС2, полученных с по­
мощью кислотного гидролиза, не выявили различий в строении данных структур.
ИК- и ЯМР-спектры исследуемых полисахаридов оказались идентичными и го-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
18
воряг о том, что данные О-ПС представляют собой гомополимеры D-рамнана
(Fedoncnko et at., 2002). Сумма полученных результатов подтверждает известное
положение о том, что основную роль в определении серологической специфич­
ности О-антигенов играют не мажорные полисахариды, а так называемые Офакторы или антигенные детерминанты в составе О-ПС (LUderitz, 1966; Staub
and Tinelli, 1957; Staub, 1964). В соответствии с этим, главным отличием 0-ПС2
or 0-ПС1 следует, вероятно, признать антигенную гетерогенность этого полиса­
харида, обусловленную присутствием в структуре его пени, по крайней мере,
двух различающихся по химическому строению антигенных детерминант.
4.3.2. Изменение антигенных свойств О-специфических полисахари­
дов штамма Л. brasilense Sp245 при модификации условий культивирова­
ния. Различия двух О-специфических полисахаридов, входящих в состав ЛПС А.
brasilense Sp245, не исчерпываются различиями их антигенных свойств. Мы ус­
тановили, что данные О-ПС отличаются также по способности к модификации
антигенных детерминант под влиянием внешних факторов. В частности, к моди­
фикации, являющейся результатом присутствия катионов Трис в среде культи­
вирования.
Для выделения ЛПС мы, наряду с другими подходами, проводили экс­
тракцию нативного ЛПС с поверхности бактериальной клетки с помощью ЭДТА
в Трис-HCl буфере (Leive et «/., 1968). В данной методике рекомендуется при
выращивании бактерий добавлять в среду культивирования 0.1 М Трис-HCl бу­
фер, поскольку при экстрагировании ЛПС Трис оказывается токсичным для кле­
ток, не адаптированных к его присутствию. Токсический эффект Трис заключа­
ется, в частности, в повышении проницаемости наружной мембраны бактерий,
вероятно, посредством нарушения ионных взаимодействий (Irvin et «/., 1981). До
наших исследований в литературе не было сведений о том, что Трис, широко
используемый для приготовления буферных систем, модифицирует те или иные
бактериальные структуры. Лнапиз возможных антигенных модификаций ЛПС
представлялся нам актуальным в связи с известной способностью катионов Трис
электростатически взаимодействовать с ЛПС (David et al., 1994).
Мы установили, что добавление Трис в среду для культивирования азоспирилл приводит к блокированию взаимодействия отдельных структур в составе
ЛИС со специфическими антителами. Па рис. 12 Л представлены результаты
иммунодиффузионного анализа препаратов ЛПС штаммов Sp245 и КМ018
(имеющего только 0-ИС1 в составе ЛПС), выделенных из бактерий, выращен­
ных до логарифмической фазы роста как на среде, содержащей Трис, так и без
него. В иммунодиффузионном профиле ЛПС штаммов, выращенных на среде,
содержащей Трис, практически не выявляется полоса преципитации, соответст­
вующая О-IICI. Следовательно, Трис, будучи добавленным в среду культивиро­
вания, изменяет структуру антигенных детерминант только одного из двух О-ПС
штамма Sp245. Рис. 12 Л показывает, что подобные изменения картины взаимо­
действия с антителами у данного О-ПС не обнаруживаются ни при внесении в
среду культивирования 0.1 М HEPES, ни при замене среды культивирования.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
19
Кроме того, у ЛПС штамма КМ018, выращенного в присутствии Трис, в
электрофоретическом профиле в ПАЛГ отсутствует серия полос с молекулярной
4> (яГ3
«щи»*»*
3 5
21 а 4 6
А
Рис. 12. А. Результаты иммунодиффузионного анализа препаратов
ЛПС Sp245 и КМ018 с Ат против ЛПС Sp245 (а). 1 - Sp245, 2 КМ018, 3 - КМ018, выращенного в присутствии 0.1 М ТРИС, 4 Sp245, выращенного в присутствии 0.1 М ТРИС, 5 — КМ018, выра­
щенного в присутствии 0.1 М HEPES, 6 — КМ018, выращенного на
среде LB. Б. Результаты электрофореза в ПАЛГ препаратов ЛПС
Sp245 (1), КМ018 (2) и ЛПС КМ018, выращенного на среде, содер­
жащей 0.1 МТРИС(З).
массой около 30 кДа, характерных для дикого штамма и мутанта (рис. 12 Б). В то
же время спектры поглощения света продуктами реакции с фенолом и серной
кислотой препаратов ЛПС штамма КМ018, выращенного как в присутствии
Трис, так и без него, практически не различаются между собой, что свидетельст­
вует о близости их моносахаридного состава.
Таким образом, мы продемонстрировали,
что Трис(гидроксиметил)аминометан не является инертным соединением и может взаимодейство­
вать с исследуемыми объектами — в частности, модифицировать антигенные де­
терминанты бактериальных ЛПС. Нами показано, что разные О-ПС, входящие в
состав ЛПС A. brasilense Sp245 отличаются по способности к антигенной моди­
фикации, являющейся результатом присутствия катионов Трис в среде культи­
вирования.
4.3.3.
Исследование
иммунохимической
гетерогенности
Оспецифических полисахаридов штамма A. brasilense Sp7 и близкородствен­
ных штаммов. Был проведен сравнительный иммунохимический анализ О-ПС,
входящих в состав ЛПС A. brasilense Sp7, генетически родственного ему штамма
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
20
Cd, а также производного от Sp7 штамма 7.К.2. Различия в строении ЛПС дан­
ных близкородственных штаммов позволили оценить иммунохимическую гете­
рогенность двух О-специфических полисахаридов типового штамма Azospirillum
brasilense.
Штамм A. brasilense Cd был выделен из корней Cynodon dactylon после
инокуляции этого растения культурой Sp7 (Eskew et al., 1977). Sp7 и Cd демонст­
рируют выраженные различия роста на плот­
ной среде. Кроме того, у штамма Cd не отме­
чено возрастных изменений морфологии ко;
лоний, и он не претерпевает, в отличие от Sp7,
R-S диссоциацию на минимальных синтети­
ческих средах. Как и в случае штамма Sp7-S
(Матвеев с соавт., 1987), плазмидный про­
филь A. brasilense Cd отличается от такового у
Sp7 отсутствием pi 15 (Петрова с соавт.,
2004).
Результаты линейного иммуноэлектрофореза ЛПС этих штаммов (рис. 13) говорят о
том, что в составе ЛПС штамма Cd имеются
как R-, так и S-O-ПС, характерные для штам­
ма Sp7. Однако оба его О-ПС выявляются
только антителами на ЛПС штамма Sp7, в то
Рис. 13. Результат линейного
время как антитела на ЛПС самого штамма Cd
иммуноэлектрофореза препа­
визуализуют в составе его ЛПС только один
ратов ЛПС штаммов Sp7( I) и
О-ПС. Результаты денатурирующего элек­
Cd (2) с Ат на ЛПС штаммов
трофореза в ПЛАГ позволяют сделать вывод
Cd (3) и Sp7(4).
о том, что в структуре ЛПС A. brasilense Cd
произошли изменения, не позволяющие дос­
тичь разделения двух О-ПС (рис. 14).
ЛПС спонтанного мутанта 7.К.2 отли­
Й4>'
чается от ЛПС Sp7 тем, что в его иммунодиффузионном профиле выявляется только R-OПС. Электрофоретическое разделение ЛПС
7.К.2 в ПААГ демонстрирует отсутствие S-OПС в составе его ЛПС (рис. 14). При этом в
плазмидном профиле данного штамма, как и у
Sp7-S и Cd, не визуализуется плазмида 115
МДа.
1
2
3
В связи с выявленными особенностями
Рис. 14. Результат электро­
строения, получение антител на О-антиген
фореза в ПААГ препаратов
спонтанного мутанта 7.К.2 представлялось
ЛПС штаммов Cd (1), Sp7
нам очень перспективным в плане исследова­
(2) и 7.К.2 (3).
ния имунохимической гетерогенности ЛПС
типового штамма Sp7. Получение антител на
)ф
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
21
ЛПС штамма 7.К.2 и анализ их взаимодействия с различными антигенами позво­
лили нам прийти к заключению о том, что R-O-ПС - это иммунохимически
гетерогенный полисахарид. На рис. 15 приведе­
ны результаты иммунодиффузионного анализа
антител на ЛПС 7.К.2 с препаратами ЛПС
1
21
штаммов Sp7 и 7.К.2. Можно видеть, что анти"ч.
тела на ЛПС 7.К.2 распознают детерминанты,
Лт
характерные для S-антигена. В то время как ре­
акция иммунодиффузии с собственным антиге­
ном завершается образованием одной полосы
преципитации, реакция с ЛПС исходного штамРис. 15. Результат иммунома Sp7 образует весь спектр полос, характерных
диффузионного
анализа
как для R-, так и для S-антигена. Следовательно,
препаратов ЛПС штаммов
на поверхности R-O-ПС выявляются все антиSp7(l) и 7.К.2 (2) с Лт на
генные детерминанты, характерные для полноЛПС 7.К.2 (Лт).
ценного ЛПС штамма Sp7.
Обобщая результаты иммунохимического анализа ЛПС модельных штам­
мов A. brasilense, можно констатировать, что главным отличием двух О-ПС, вы­
являемых в составе ЛПС Sp7 и Sp245, является антигенная гетерогенность одно­
го из полисахаридов, обусловленная наличием в его структуре, по крайней мере,
двух различающихся по своему строению О-факторов или антигенных детерми­
нант. При этом второй О-ПС у обоих штаммов иммунохимически гомогенен и
идентичен одному из О-факторов, выявляемых в составе гетерогенного О-ПС.
Кроме того, результаты исследования различий иммунохимических и физикохимических характеристик ЛПС типового штамма Л. brasilense Sp7 и близкород­
ственных штаммов (выполненные совместно с сотрудниками группы генетики
микроорганизмов ИБФРМ РЛН) позволили прийти к заключению о том, что вы­
явленные различия их ЛПС определяются наличием, а также способом поддер­
жания в клетках фрагмента 115 МДа.
Глава 5. Сравнительный нммунохимическнй анализ ЛПС, каисульных по­
лисахаридов и экзополисахаридов Лг«5/>/>/7/ин» brasilense
Помимо ЛПС, углеводными компонентами клеточной оболочки грамотрицательных микроорганизмов являются внеклеточные полисахариды - полиса­
хариды капсулы и экзополисахариды (ЭПС). В некоторых случаях, по химиче­
ской и антигенной структуре КПС, ЭПС и ЛПС оказываются идентичными (Ботвинко, 1985; Kenne and Lindberg, 1983; Jann and Jann, 1990 и др.). Нами был про­
веден детальный сравнительный анализ антигенных свойств ЛПС A. brasilense
Sp7 и Sp245, их О-ПС, КПС и ЭПС. Препараты КПС и ЭПС были любезно пре­
доставлены Д.А. Жемеричкиным и С.Л. Коновой.
По результатам иммунодиффузионного анализа с антителами на ЛПС
препараты КПС и ЭПС штамма Sp7 образуют сливающиеся полосы преципита­
ции с одним из двух О-ПС, входящим с состав ЛПС данного штамма. Результаты
линейного иммуноэлектрофореза говорят о том, что антигенные детерминанты
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
т>
всех трех препаратов обладают близкими значениями электрофоретической под­
вижности. Рис. 16 демонстрирует результаты перекрестного иммуноэлектрофореза препарата ЛПС (Л), тандемного перекрестного фореза ЛПС и ЭПС (Б) и
слитного ракетного фореза ЛПС и КПС (В). В данном случае КПС и ЭПС обра­
зуют общие пики преципитации с ЛПС, не формируя при этом дополнительных
пиков. Полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что ЛПС
данного штамма имеет аналогичные иммунодетерминантные участки как с КПС,
так и с ЭПС. Учитывая, что согласно данным Конновой с соавторами (Konnova et
«/., 1994), названные полимеры имеют одинаковый моносахаридный состав,
можно говорить об отсутствии у штамма Sp7 специфического капсульного анти­
гена. По-видимому, капсула и ЭПС в данном случае представляют собой Оспецифические фрагменты ЛПС, экскретируемые клеткой в окружающую среду.
)
^
4
31
2-
2
А
Б
В
Рис. 16.
Результат перекрестного иммуноэлектрофореза
(Л), тандемного перекрестного иммуноэлектрофореза (Б) и
слитного ракетного иммуноэлектрофореза (В) препаратов
КПС (2), ЭПС (3) и ЛПС (4) штамма Sp7 с Ат на ЛПС данного
штамма.
Мы обнаружили принципиальное отличие данных внеклеточных полиса­
харидов и О-ПС, являющихся частью липополисахарида исследуемых бактерий.
Изолированный препарат ЭПС штамма Sp7, несмотря на антигенную идентич­
ность полисахаридным структурам ЛПС, проявил в наших экспериментах крайне
низкую иммуногенность. При исследовании сывороток крови кроликов, иммуни­
зированных ЭПС двумя различными способами (внутривенно и подкожно) мы не
обнаружили присутствие антител в концентрации, достаточной для проявления
эффекта иммунопреципитации. Иммунный ответ на ЭПС нам удалось обнару­
жить только с помощью более чувствительного, однако, косвенного приема —
метода бактериальной агглютинации. Значение титров агглютинации и при пер­
вом, и при втором способах иммунизации оказалось одинаковым и достаточно
низким — 160-5-320. Принципиально важным для нас представляется тот факт, что
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
23
сыворотки против ЭПС содержали антитела, агглютинирующие фиксированные
и живые клетки, отмытые от капсулы, в одинаковых титрах. Относительно сла­
бая иммуногенность внеклеточных полисахаридов в сравнении с бактериальны­
ми ЛПС (несмотря на выявленную антигенную идентичность данных структур),
вероятно, объясняется тем, что именно ЛПС с полноценной структурой обладает
способностью взаимодействовать с самыми различными клеточными рецептора­
ми и клетками иммунной системы животных.
Аналогичные результаты, свидетельствующие об антигенной идентично­
сти углеводсодержаших компонентов клеточной поверхности, были получены
нами при исследовании другого модельного штамма — A. brasilense Sp245. В дан­
ном случае для сравнения был использован мутант этого штамма - КМ018, в со­
ставе Jin С которого присутствует только ОПС1. Па рис. 17 показан результат иммунодиффузионного анализа препаратов ЛПС,
КПС и ЭПС штамма Sp245 и ЛПС КМ018.
Необходимо отметить, что терминами КПС
и ЭПС здесь нами обозначены полисахаридлипидные комплексы, выделенные Конновой с соавторами (1994) из капсулы и культуральной жидкости Sp245, соответсРис. 17. Результат сравнительтвенно. Слияние полос преципитации, обраного
иммунодиффузионного
зованных КПС, ЭПС и 0-ПС1, говорит о
анализа препаратов ЛПС (1),
полной идентичности их антигенных детер0-ПС1 (2), ЭПС (3) и КПС (4)
минант. То есть, капсула и ЭПС штамма
A. brasilense Sp245 с Лт к ЛПС
Sp245 состоят из вещества, содержащего
данного штамма (а).
антигенные детерминанты, идентичные та­
ковым у 0-ПС1. Таким образом, из двух О-ПС, выявленных в составе ЛПС ис­
следуемого штамма, именно 0-ПС1, очевидно, формирует вещество капсулы и
ЭПС A. brasilense Sp245.
Имеются все основания предположить, что внеклеточные полисахариды
Azospirillum brasilense, вероятно, представляют собой О-антигенные фрагменты
липополисахаридов, экскретируемые бактериями в культуральную среду, и их
идентификация в качестве капсулы или экзополисахарида зависит от прочности
связи данных полисахаридов с поверхностью бактериальной клетки.
Глава 6. Изучение Н-антпгенов бактерий p. Azospirillum
6.1. Выявление полнсахарилного чехла на поверхности полярного
жгутика. Известно, что полярные жгутики бактерий-монотрихов нередко имеют
на своей поверхности чехол белковой или полисахарндной природы (Тимаков с
соавт., 1983). В некоторых случаях было продемонстрировано участие ЛПС в
формировании чехла, покрывающего полярный жгутик бактерий (Thomashow
and Rittenberg, 1985; Fuerst and Perry, 1988; Doig and Trust, 1994).
С помощью электронной микроскопии и антител на ЛПС нами впервые
было выявлено наличие (липо)полисахаридного
чехла на поверхности
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
24
»•.>» • - * » ,
*v
,J-
* ..;
ft
Рис. 19. Результат имму- "~~
нодиффузионного анализа
Рис. 18. Взаимодействие коньюгатов
препарата ЛПС (1) и препротеин Л-коллоидное золото с Лт на
парата нативного жгутика
ЛПС A. brasilense Sp245 с клетками
(2) A. brasileme Sp245 с
данного штамма. Длина масштабной
Лт на ЛПС данного
метки 200 нм.
штаммма (А).
полярного жгутика типовых штаммов бактерий рода Azospirillum. На рис. 18 по­
казано взаимодействие коньюгатов протеин Л - коллоидное золото и штаммоспсиифичных антител на ЛПС с бактериальной клеткой штамма Л. brasilense
Sp245. Метка выявляет наличие антител на ЛПС не только на самой клетке, но и
на поверхности полярного жгутика. При этом можно видеть, что антитела на
ЛПС взаимодействуют не столько с поверхностью полярного жгутика, сколько с
очехляюшей его субстанцией. На рис. 19 приведены результаты сравнительного
иммунодиффузионного анализа препарата нативного жгутика, не изолированно­
го от чехла, и препарата ЛПС штамма Sp245 с антителами на ЛПС данного
штамма. В данном случае препарат жгутика образует общую линию преципита­
ции с одним из О-ПС, входящим в состав ЛПС Sp245. Второй О-ПС, характер­
ный для ЛПС данного штамма, также присутствует в составе препарата жгутика,
но линия преципитации, соответствующая ему, выражена намного слабее.
Мы полагаем, что (липо)полисахаридный чехол достаточно прочно связан
со жгутиком, поскольку нам не удалось отделить его даже при ультрацентрифу­
гировании препарата полярного жгутика в градиенте плотности сахарозы. Отде­
ление чехла от жгутика оказалось возможным только в результате кислотной
диссоциации полярного жгутика и его последующей реассоциации. Однако
единственной структурой, сохраняющей свою нативность после описанных про­
цедур с полярным жгутиком азоспирилл, был ЛПС, а вместо полимерного флагеллина ассоциировались случайные конгломераты молекул.
6.2. Исследование углеводных фрагментов гликозилированного флагеллина полярного жгутика. Исследование углеводных фрагментов полярного
жгутика штамма A. brasilense Sp7, у которого впервые для азоспирилл было по­
казано наличие данных структур (Moens et a!., 1995), проводили с помощью двух
производных этого штамма - IZ5 и 7.К.2. Первый из этих производных был ото­
бран Г. Александре. Штамм IZ5 характеризовался неподвижностью клеток и от­
сутствием в составе флагеллина полярного жгутика структур, выявляемых с по-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
25
мошью красителей на углеводы. Штамм 7.К.2 был отобран нами с помощью иммунодиффузионного теста с антителами на ЛПС штамма Sp7. Он, как было от­
мечено выше, отличался отсутствием в составе ЛПС одного из двух характерных
для Sp7 О-специфических полисахаридов.
На
1 2
Р|1С" ~® ^ представ­
л
2
лен результат иммуноблотфлагеллин
флагеллмн
тинга препаратов полярного
жгутика штаммов Sp7 и IZ5 с
использованием антител на
жгутик A. lipoferiim 4В, лю­
безно предоставленных Г.
Александре (Alexandre et al,
1999). Взаимодействие анти­
тел на флагеллин штамма,
относящегося к виду A. lipo­
feriim, с препаратами поляр­
ного жгутика штаммов, отно­
сящихся к роду A. brasilense,
свидетельствует о наличии
родоспецифичных
антиген­
ных детерминант в составе НРис.20. А. Результат иммуноблотинга с Ат на
антигена у азоспирилл. Со­
флагеллин полярного жгутика A. lipoferiim 4B
хранившая у мутанта IZ5 спо­
препаратов полярного жгутика Sp7 (1) и IZ5
собность взаимодействовать с
(2). Б. Результат иммуноблотинга с Ат на
данными антителами говорит
ЛПС Sp7 препаратов полярного жгутика Sp7
о том, что его флагеллин, в
(l)n!Z5(2).
отличие от углеводных фрагментов жгутика, очевидно, не претерпел каких-либо изменений. Результаты им­
муноблотинга тех же препаратов полярного жгутика с антителами на ЛПС
штамма Sp7 приведены на рис. 20 Б. В то время как антитела на флагеллин оди­
наково эффективно взаимодействуют с гликозилированным флагеллином дикого
штамма и негликозилированным флагеллином мутанта IZ5, антитела на ЛПС
распознают только препарат жгутика дикого штамма. При этом как у исходного
штамма, так и у его мутанта антитела выявляют сопутствующий жгутику лииополисахарид (чехол жгутика), мигрирующий в электрическом поле отдельно.
Следовательно, антитела на ЛПС распознают некие углеводные структу­
ры, входящие в состав гликозилированного флагеллина полярного жгутика бак­
терий дикого штамма и, очевидно, гомологичные отдельным фрагментам сома­
тического антигена. Для получения ответа на вопрос, какие именно структуры в
составе ЛПС штамма Sp7 антигенно идентичны углеводным компонентам фла­
геллина полярного жгутика, мы использовали штамм 7.К.2.
Сравнительный электрофоретический анализ ЛПС штаммов Sp7 и 7.К.2
(рис.14) выявляет отсутствие S-O-ПС в составе ЛПС штамма 7.К.2. Поскольку
выше было отмечено наличие перекрестной иммунологической реакции между
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
26
жгутиком и ЛПС, в частности — S-O-ПС (рис. 20 Б), логичным представлялось
предположение о том, что углеводные фрагменты полярного жгутика штамма
Sp7 гомологичны фрагментам именно этого О-ПС. Электрофоретический анализ
с последующей иммунодетекцией препаратов полярного жгутика показал, что
мономеры флагеллина у штамма 7.К.2 имеют меньшую молекулярную массу и, в
отличие от Sp7, не взаимодействуют с антителами на ЛПС этого штамма (рис.
21). В составе препарата жгутика исходного штамма антитела выявляют наличие
ЛПС, очехляющего жгутик (мигрирую­
щего при электрофорезе отдельно), а
trti
флагеллин
также
антигенные детерминанты ЛПС в
i *
.
составе собственно полярного жгутика,
образующего в данном случае двойную
k-*f
S-Ar
полосу. При этом хорошо видно, что в
составе препарата полярного жгутика
7.К.2 S-антиген не выявляется ни в со­
ставе собственно жгутика, ни в составе
сопутствующего материала (чехла). В то
R-Аг
же время второй О-ПС (R-антиген) визуализуется очень четко.
Полученные результаты позволи­
1 2
1 2
ли нам прийти к заключению о том, что
Рис. 21. А. Результат электрофореза
углеводные структуры гликозилированв ПААГ препаратов полярного жгу­
ного флагеллина полярного жгутика
тика Sp7 (1) и 7.К.2 (2) (окраска
штамма Sp7 могут являться, по своей
Кумасси). Б. Результат иммуноблосути, фрагментами S-O-ПС данного
тинга данных препаратов с Ат на
штамма. Однако для того, чтобы сделать
ЛПС SD7.
безоговорочный вывод об антигенной
идентичности этих структур, необходимо было получить антитела на мономеры
полярного жгутика данного штамма.
6.3. Получение и анализ антител на флагеллнн Л. brasilense Sp7. Са­
мым важным этапом в решении этой задачи являлось получение флагеллина
штамма Sp7, тщательно освобожденного от полисахаридного чехла. Мы исполь­
зовали схему, предложенную Муравлевым с соавторами (1999), и получили ан­
титела на высокоочишенные субъединицы полярного жгутика, разделенные с
помощью электрофореза в ПЛАГ и извлеченные из геля путем специальной
диффузии.
Результат сравнительной иммунодиффузии полученных антител на изоли­
рованный жгутик штамма Sp7 и антител на ЛПС данного штамма говорит о том,
что субъединицы полярного жгутика имеют общие детерминанты с ЛПС (рис.
22). Мажорная шпора, отмеченная стрелкой на этом рисунке, в свою очередь,
свидетельство того, что основной пул антител, полученных на изолированный
полярный жгутик, специфичен именно Н-антигену. Углеводные детерминанты
вносят очень небольшой вклад в иммунный ответ на изолированный жгутик, что
доказывает картина преципитации при сравнении ггрепараюв жгутиков Sp7 и
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
27
6
I <
0'ч£>1. О
4
Рис. 22. Результат иммуно­
диффузионного
анализа
препарата
флагеллина
штаммма Sp7 (Аг) с Ат на
ЛПС (1) и Ат на флагеллин
(2) данного штамма.
J
|
Рис. 23. Результат иммунодиффузионного
анализа препаратов флагеллина штаммов
A. brasilense Sp7 (I, 4), A. brasilense 7.K.2
(2), A. brasilense Sp245 (3), A. lipoferum
Sp59b (5) и E. coli К12 (6) с Ат на флагел­
лин A. brasilense Sp7.
7.К.2 (рис. 23). Такой вклад данных структур в иммунный ответ может опреде­
ляться, наряду с иными причинами, существенно меньшим их количеством (по
сравнению с флагеллином) в составе полярного жгутика. Данный рисунок также
демонстрирует характер взаимодействия антител на мономеры жгутика А.
brasilense Sp7 с препаратами изолированных жгутиков другого штамма этого же
вида (A. brasilense Sp245), штамма другого вида (A. lipoferum Sp59b) и бактерий
другого рода (£. coli К12). Отсутствие взаимодействия антител со жгутиком Е.
coli — свидетельство родовой специфичности всех антигенных детерминант мо­
номеров полярного жгутика азоспирилл. Различная интенсивность взаимодейст­
вия антител с препаратами жгутиков других штаммов может привноситься как
штаммовой специфичностью детерминант их олигосахаридных фрагментов, так
и наличием, наряду с родоспецифичными, вило- и штаммоспецифичных детер­
минант в составе самого флагеллина.
6.4. Исследование изменений подвижности клеток азоспирилл при
взаимодействии с антителами к О- и Н-антигенам. С целью проверки предпо­
ложения об экранированное™ флагеллина полярного жгутика выявленным нами
(липо)полисахаридным чехлом, мы провели серию экспериментов по исследова­
нию подвижности азоспирилл штаммов Sp7 и Sp245 в присутствии антител на
ЛПС данных штаммов и антител на флагеллин штамма Sp7 (работа выполнялась
совместно с сотрудниками группы генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН).
Мы судили о взаимодействии данных антител с полярным жгугиком азоспирилл,
оценивая подвижность всех клеток в поле зрения микроскопа и определяя сред­
нюю скорость движения у случайно выбранных подвижных единичных клеток.
Во время наблюдений вели видеозапись на видеокамеру.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
28
Диаграмма зависимости процента подвижных клеток и средней скорости
подвижных клеток A. brasilense Sp7 от концентрации штаммоспецифичных анти­
тел на ЛПС (рис. 24)
показывает, что увели­
45
100
чение
концентрации
ее
^->
данных антител приво­
Р 40 80
П х 35 - дило к полному пре­
« \ Pi
1 1 30 - п
кращению
движения
| 60
бактерий. При этом до­
G 1 25 •
rfi
\
В. U 20 •
бавление к клеточной
\
| 40
°Й о
. .5 *
\>
С 1
суспензии как антител
1 5 10-1V ^ч
Г 20
на флагеллин, так и ан­
А •
?•
5
1
\
тител на ЛПС другого
—1—
& о] —-+0
штамма не приводило к
такому эффекту. Из это­
го следует, что мономе­
ры флагеллина у азос— средняя скорость движения клеток
пирилл действительно
изолированы от окру­
—•— % подвижных клеток
жающей среды (липо)полисахаридным
Рис. 24. Зависимость процента подвижных клеток и
чехлом и жгутик, веро­
средней скорости подвижных клеток A. brasilense
ятно, может участвовать
Sp7 от концентрации Ат на ЛПС данного штамма: 1
в процессах прикрепле­
- контроль (без антител); 2 — 1 мкг/мл; 3—10 мкг/мл;
ния данных бактерий на
4 - 100 мкг/мл; 5 - 1000 мкг/мл.
корнях растения только
в качестве носителя субстанции, обеспечивающей адсорбцию.
Поскольку отмечено, что дефект гликозилирования полярного жгутика у
азоспирилл не связан напрямую с утратой бактериальной подвижности, возника­
ет вопрос о роли углеводных структур в составе флагеллы у этих бактерий. Ан­
тигенная идентичность этих структур с О-антигеном исключает предположение
об умножении антигенного бактериального спектра, что присуще, к примеру,
роду Campylobacter (Doig et al., 1996). Кроме того, такому предположению про­
тиворечит наличие у азоспирилл чехла, надежно изолирующего полярный жгу­
тик. Основываясь на данных, полученных для гликозилированных пплинов
(Marceau et al., 1998), а также учитывая тот факт, что традиционные процедуры
диссоциации и реассоциашш полярных жгутиков азоспирилл не приводят к об­
разованию полимерного флагеллина, мы полагаем, что углеводные фрагменты в
данном случае могут обеспечивать, главным образом, структурную стабилиза­
цию флагеллы.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
29
Глава 7. Характеристика некоторых физико-химических свойств ЛПС
азоспирилл
7.1. Сравнение снектрофотометрнческнх характеристик ЛПС различ­
ных серотипов. Для детектирования углеводов и определения их концентрации
широко применяется колориметрический метод, основанный на способности
растворов моно-, олиго- и полисахаридов и их производных приобретать жёлтооранжевую окраску в присутствии фенола и концентрированной серной кислоты.
При этом растворы различных моносахаридов демонстрируют индивидуальные
особенности спектров поглощения света продуктами фенол-сернокислотной ре­
акции (Dubois et a)., 1956). Данный метод может быть также достаточно инфор­
мативным при сравнительном исследовании различных углеводсодержаших
биополимеров, поскольку спектрофотометрические характеристики растворов
гетероолиго- и гетерополисахаридов определяются остатками моносахаридов,
входящими в их состав.
Мы провели сравнение
спектров поглощения света в
интервале длин волн 400-520
нм
продуктами
фенолсернокислотной реакции пре­
паратов ЛПС, выделенных из
различных штаммов Azospirillum brasileme. Были проана­
лизированы препараты ЛПС
четырех штаммов, принадле­
жащих к двум различным серотипам. На рис. 25 приведе­
ны спектры поглощения света
продуктами
фенол-серно­
400 410 420 430 440 460 460 470 490 430 600 610 520
кислотной реакции препара­
У. нм
тов ЛПС (для краткости ниже
Рис. 25. Спектры поглощения продуктов реак­
мы их будем именовать
ции с фенолом и серной кислотой препаратов
«спектрами поглощения») для
ЛПС Sp7, Cd, Sp245 и Spl07.
четырех штаммов азоспирилл,
попарно
демонстрирующих
антигенные перекресты в иммунологе с гомологичными антителами (Глава 8).
Установлено, что спектры поглощения серологически близких штаммов Sp7 и
Cd демонстрируют сходный характер и два пика поглощения (/.тах\ = 410-420 нм
и лтах2 = 485 нм). В то же время, спектры поглощения препаратов ЛПС второй
пары близкородственных штаммов — Sp245 и Sp 107 — имели только один выра­
женный пик поглощения (ктах = 480 нм). Таким образом, принадлежащие к одно­
му виду, но серологически различные штаммы A. brasileme обнаружили четкие
отличия спектров поглощения ЛПС. что говорит о существенном различии их
моносахаридного состава (Dubois et al. 1956).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
30
Проведенное сравнение спектров поглощения препаратов ЛПС A. brasilense Sp7 и Sp245 со спектрами их мутантов, дефектных по одному из двух Оспецифических полисахаридов (О-ПС), выявленных в составе ЛПС показало, что
иммунохимическая гетерогенность О-ПС в пределах одного штамма исследуе­
мых бактерий не связана с радикальными различиями их моносахаридного со­
става. Сходный качественный характер спектров поглощения, выявленный нами
в каждом из рассматриваемых случаев, говорит о принципиальном сходстве мо­
носахаридного состава О-специфических полисахаридов в составе ЛПС данных
штаммов. Отмеченные при этом количественные изменения спектров могут быть
следствием тех тонких структурных различий, которые и определяют иммунохимическую специфичность каждого конкретного О-ПС.
7.2. Оценка структурообразующих эффектов бактериальных липополмсахаридов в клеточных суспензиях азоспнрилл и модельных клеточных
суспензиях. Анализ литературных данных позволил нам предположить, что
ЛПС бактерий p. Azospirillum могут выступать в роли структур, которые опосре­
дуют взаимодействие данных бактерий между собой с образованием агрегатов, а
также взаимодействие бактерий с корнями растений (Sadasivan and Neyra, 1985;
Bashan et al., 1986; Okon and Kapulnik, 1986; Del Gallo et al., 1989; Madi and Henis,
1989; Michiels et al., 1990; Zaady et al., 1993 и др.). В данной части диссертацион­
ной работы представлены результаты исследования структурообразующих
свойств ЛПС н ЛПС-содержащих препаратов, изолированных с поверхности
клеток азоспнрилл, в отношении суспензий растительных и бактериальных кле­
ток (а также животных клеток - эритроцитов). Мы оценивали роль ЛПС как во
взаимодействии между бактериальными и растительными клетками, так и во
взаимодействии бактериальных клеток между собой во флоккулирующих куль­
турах.
При изучении влияния ЛПС данных бактерий на суспензии растительных,
бактериальных и животных клеток нам представлялось целесообразным исполь­
зовать не только высокоочищенные препараты ЛПС, но и препараты липополисахарид-белковых комплексов (ЛПБК), поскольку именно в такой форме ЛПС
азоспнрилл может быть активен in vivo. В дополнение к ЛПС и ЛПБК, мы иссле­
довали также взаимодействие с различными клеточными суспензиями Оспецифических полисахаридов и белковых фракций, выделенных из ЛПБК.
Известно (Matthysse et al., 1987; Eyers et al., 1988), что бактерии родов
Agrobacterium и Azospirillum способны агрегировать суспензии морковных кле­
ток. При использовании данной модельной системы мы обнаружили, что предва­
рительная обработка морковных клеток бактериальным ЛПС приводит к усиле­
нию эффекта сравнительно быстрой (порядка несколько секунд) агрегации сус­
пензий штаммами Sp245 и Cd. Очевидно, что за такие короткие промежутки
времени наиболее вероятно проявление так называемых «неспецифических» свя­
зей между компонентами микробных и растительных клеток по механизмам вандер-ваальсовых, электростатических и/или иных относительно слабых физикохимических взаимодействий без включения специфических ответных реакций со
стороны партнеров.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
31
С целью опенки возможного участия ЛИС азоспирилл на уровне таких неснецифических связей также и в бактериальной агрегации (или самоагрегашш),
мы провели соответствующие эксперименты со штаммом A. brasilcnse Sp245 с
использованием ЛПС, выделенных из штаммов Sp245 и Cd. Ныло установлено,
что во всех случаях непосредственно после добавления к гомогенной суспензии
клеток штамма Sp245 препарата ЛПС до конечной концентрации 15 мкг/мл про­
исходила агрегация бактериальных
клеток (рис. 26). При эюм оба препа­
рата ЛПС, независимо от штамма, из
которого они были выделены, дейст­
вовали одинаково эффективно. Ана­
логичный результат был получен и
при исследовании агрегации бакте­
рий, относящихся к другому роду Agrobacterium tumefaciens R10, иод
действием ЛПС A. brasilcnse Sp245.
Как и в случае агрегации суспензии
морковных клеток, бактериальная
агрегация также имела обратимый
характер - агрегаты разрушались при
Рис. 26. Влияние предварительной
встряхивании суспензий и затем фор­
обработки культур морковных клеюк
мировались вновь.
препаратами
ЛПС
штаммов А.
Представлялось целесообраз­
brasilcnse Sp245 (1-3) и Cd (4-6) на
ным сопоставшь концентрацию ЛПС,
степень их агрегации под действием
использованную во всех эксперимен­
бактерий данных штаммов. Контроль­
тах в данной части нашей работы, с
ные (необработанные) суспензии (1,
концентрацией ЛПС, выделяемого
4), суспензии, агрегированные иод
клетками в культуральную среду. Для
действием бактерий (2, 5), усиление
ее опенки мы применили метод ра­
агрегации за счет предобработки мор­
кетного иммуноэлектрофореза с анти­
ковной суспензии бактериальными
телами прошв ЛПС штамма А.
ЛПС (3,6).
brasilcnse Sp245 (рис. 27). Можно ви­
деть (ср. длину ракет), чго концентрация ЛПС, экскретруемого клетками в
культурхтьную среду, была порядка 10 мкг/мл (в случае 18-часовых культур) и
100 мкг/мл (в случае 48-часовых культур). Следовательно, концентрация ЛПС,
использованная в наших молельных экспериментах, находилась в пределах зна­
чений, обусловленных продукцией бактериального ЛПС in vivo.
Данные, характеризующие способность препаратов ЛПС, ЛПНК, О-ПС и
белковых фракций ЛПБК агрегирован, суспензии морковных клеток и эритроци­
тов, а также суспензии бактерий родов Azospiriltum и Agrobacterium, представле­
ны в Таблице 1. Как ЛПС, так и ЛПБК вызывали агрегацию растительных и бак­
териальных суспензий, но не агрегировали эритроциты. В то же время ни О-ПС,
ни белки, входящие в состав ЛПНК, не агрегировали ни один из видов клеточных
суспензий, использованных в данных экспериментах.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
32
Следующим структурообра­
зующим эффектом исследуемых
препаратов, обнаруженным в наших
опытах, была клеточная агглютина­
ция. В дополнение к морфологиче­
ским отличиям возникающих кле­
точных структур (см. ниже), время
их образования при агглютинации
(несколько часов) существенно пре­
вышало время, за которое происхо­
дила агрегация клеток (секунды).
Результаты исследования агглюти­
нации кроличьих эритроцитов пре­
паратами ЛПС, О-ПС и белковыми
фракциями ЛПБК штамма Sp245
приведены в той же Таблице 1. Тит­
ры агглютинации для ЛПС, О-ПС и
белков составляли, соответственно,
2.5, 0.625 и 1.25мкг/мл.
3
1 2
4
5
Рис. 27. Результат ракетного иммуноэлектрофореза
липополисахаридных
антигенов: препараты ЛПС штамма А.
brasilense Sp245 (1-3) и образцы культуральной среды данного штамма , выра­
щенного в течение 18 (4) и 48 (5) часов,
при концентрации ЛПС 100 (1), 50 (2) и
25 (3) м кг/мл.
Таблица 1. Структурообразующая активность препаратов* наружной мембраны
азоспирилл в клеточных суспензиях
Структурообразую­
щий эффект
Агрегация
Агглютинация
Препараты
Клетки
ЛПС
ЛПБК
О-ПС
Белки
Морковь
+
+
-
-
Azospirillum
brasilense
Sp245
+
+
-
-
Agrobacterium
tumefaciens RIO
+
+
-
-
-
-
-
-
+
-
+
+
-
+
-
-
Эритроциты
Фазовое разделение
«+» - активны,«-» — не активны.
Что касается препарата ЛПБК, то для него был зарегистрирован иной тип
структурообразования в клеточных суспензиях, кинетические параметры которо­
го имели промежуточные значения по сравнению с параметрами, характерными
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
33
для эффектов агрегации и агглютинации клеток. Добавление к 2%-ной суспензии
эритроцитов препарата ЛПБК в интервале его концентраций 10*40 мкг/мл вызы­
вало относительно быстрое (за время порядка 10-20 минут) выделение клеток в
отдельную гомогенную фазу. При этом в контроле (без добавления ЛПБК) на­
блюдалось относительно слабое проявление эффекта осаждения эритроцитов под
действием силы тяжести. Эффект осаждения становился заметным (существен­
ное просветление надосадка эритрошпарных суспензий) за несколько часов, что
сопоставимо со временем проявления эффекта клеточной агглютинации. При
использовании других препаратов (а также при более низких концентрациях
ЛПБК) фазовое разделение суспензий эритроцитов не наблюдалось.
Методом иммунолиффузии была сде­
лана сравнительная оценка концентрации
ЛПБК в обеих фазах (рис. 28). Эти резуль­
таты показали, что ЛПБК в значительной
степени был вытеснен из нижней (эригро<
цитарной) фазы, что доказывает значитель­
но более низкая концентрация иммунопреципитата, образовавшегося в геле. Эти на­
блюдения находятся в хорошем согласии с
iV.;f А..ч
теоретическими и экспериментальными
данными но фазовому анализу многокомпо­
нентных систем с участием полимеров и
коллоидных частиц (Непер, 1986; ЛитманоРис. 28. Результат сравнительного
вич с соавт., 1997).
иммунодиффузионного анализа
Можно заключить, что, в зависимо­
образцов дисперсионной среды,
сти от химического состава препаратов на­
взятых из фазы, обедненной (1) и
ружной мембраны азоспирилл, под влияни­
обогащенной (2) эритроцитами с
ем их добавления к использованным сус­
антителами против ЛПС штамма
пензиям клеток возможно формирование
A. brasilense Sp245 (Л).
агрегационных клеточных структур трех
типов. Они существенно отличаются друг от друга, как по скорости образования,
так и по морфологическим свойствам.
Первый и второй типы связаны с эффектами клеточной агрегации и агг­
лютинации. В соответствии с известным описанием структур, возникающих в
результате агглютинации клеток (что находится в согласии нашими наблюде­
ниями), их общие черты сходны с решеточной структурой иммунопреиипитата
(Bach, 1982). С физико-химической точки зрения в системе такого типа (условно
неограниченного объема) могут возникать кластеры бесконечного размера, со­
стоящие из связанных между собой клеток. Визуально это регистрируется в виде
характерного преципитата, четко отличимого от конгломерата клеток, осевших
на дне лунки под действием силы тяжести.
В противоположность агглютинации, эффект агрегации клеток, но всей
видимости, обусловлен иными молекулярными механизмами. Результатом их
действия является весьма быстрая (несколько секунд) потеря агрегашюнной ус• ' .
,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
34
тойчивости клеточных суспензий. При этом размер образовавшихся кластеров
остается конечным. Внешне это проявляется в формировании хлопьевидного
осадка, видимого невооруженным глазом.
Третий тип структурообразования мы обнаружили при добавлении к сус­
пензии эритроцитов препарата ЛПБК. Он проявляется в фазовом разделении сис­
темы с выделением клеток в хорошо наблюдаемую отдельную гомогенную жид­
кую фазу. Необходимо отметить, что подобное явление ранее было достаточно
подробно описано для суспензий эритроцитов и культур клеток животных, под­
вергнутых действию протеогликанов и их комплексов (Бычков и Кузьмина,
1992), и объяснено, так называемым, эффектом «стерического исключения». По­
следний, по мнению цитируемых авторов, обусловлен возникновением в диспер­
сионной среде специфических пространственных структур, включающих в свой
состав отрицательно заряженные полисахаридные цепи. Считается, что такие
структуры связывают значительное количество молекул воды (что существенно
влияет на термодинамические параметры системы) и уменьшают долю объема
суспензии, доступного для клеток.
ЛПС являются сложными молекулами, содержащими в своем составе гид­
рофобные (лииидные) фрагменты и проявляющими анионные свойства. В препа­
рате нативного ЛПБК (в отличие ЛПС, полученного протеиназной обработкой)
содержатся мембранные белки, а также в них оказывается существенно более
высоким содержание липидов (Leive et al., 1968), что, очевидно, увеличивает
степень гидрофобности молекул. На этом основании можно предположить, чю
бактериальные ЛПБК (подобно нрогеогликанам) могут действовать как неспе­
цифические факторы по механизму стерического исключения (Бычков и Кузь­
мина, 1992), приводящему в наших экспериментах к разделению фаз в суспензи­
ях эритроцитов.
Так называемое, «неспецифическое» (агрегирующее) действие ЛПС и
ЛПБК на клеточные суспензии азоспирилл может иметь вполне определенный
биологический смысл. Известна способность многих видов почвенных бактерий,
в том числе, азоспирилл, образовывать агрегаты при их адгезии на корнях расте­
ний, а также наличие подобных скоплений бактериальных клеток в ризосфере
(Matthysse, 1985; Okon and Kapulnik, 1986; Bashan et al, 1986; Arunakumari et al,
1992). В наших экспериментах (проведенных совместно с научным сотрудником
Лаборатории генетики ИБФРМ РАН Солововой Г.К) было установлено, что
предварительная обработка корней пшеницы препаратом ЛПС штамма А.
brasilense Sp245 не снижает, как в аналогичных экспериментах с агробактериями
(Whatley et al., 1976), а значительно увеличивает количество бактерий данного
штамма, прикрепившихся к корням растений. Результаты радиоиндикаторного
анализа, в частности, показали, что инкубация корней в растворе ЛПС с концен­
трацией 1.5 мг/г корня приводит к увеличению адсорбции азоспирилл на корнях
пшеницы в 10 раз по сравнению с контролем (корнями, не подвергнутыми обра­
ботке ЛПС). С учетом результатов исследования структурообразующих свойств
ЛПС азоспирилл, представляется очевидным, что предобработка корней, прово­
димая при избытке ЛПС, способствует агрегашюнным явлениям в бактериаль-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
35
ной суспензии, что способствует увеличению адсорбции клеток (Zaady et al.,
1993). Вероятно, структурообразующие эффекты ЛПС азосиирилл, обильно экскретируемые данными бактериями в культу рал ьнуто среду, можно рассматривать
как проявление механизма адаптации, в том числе, облегчающего прикрепление
бактерий к корням растений.
Глава 8. Тест-система серологической идентификации бактерий
p. Azosplrillum
О-антигенная специфичность антител, получаемых с помощью предло­
женного нами способа, легла в основу созданной тест-системы серологической
идентификации бактерий p. Azospirillum и эффективного метола скринирования
мутантов по структуре ЛПС. К настоящему моменту получен набор антител ро­
довой и штаммовой специфичности и отработаны эффективные методики выяв­
ления специфических иммунных взаимодействий.
Для определения штаммовой принадлежности азоспирилл мы предлагаем
использовать твердофазный иммуноаначиз целых клеток или иммунодиффузионный анализ углеводных антигенов, выделенных с поверхности клеток или из
культуральной среды исследуемых бактерий. Кроме того, для быстрой штаммо­
вой идентификации может быть использован тест на ингибирование подвижно­
сти азоспирилл при добавлении к клеточной суспензии штаммосиецифнчных
антител на ЛПС.
На рис. 29 приведен пример
a
G в
г
д
с
использования дог-анализа с гомоло­
гичными антителами целых бактери­
1 Сальных клеток шести штаммов азос­
2
пирилл, относящихся к видам А. bra­
silense и A. lipoferum. Специфические
3
^
взаимодействия О-антигенов и анти­
тел в данном случае выявляются с
4
С
помощью конъюгата протеин А коллоидное золото. Перекрестные
реакции отмечаются для двух пар
6
О
штаммов — Sp245 и Spl07, а также
Sp7 и Cd, что объясняется их близ­
Рис. 29. Результат дот-анализа целых
ким родством. Известно, что штамм
клеток
(а-е) с гомологичными антитела­
A. brasilense Sp245, как и Spl07, был
ми (1-6), выявляемыми конъюгатом про­
выделен из корней пшеницы, и их
теин Л-коллоидное золото: A. brasilense
отличия заключатся в том, что пер­
Spl07(a, 1); A. brasilense Cd (б, 2); А.
вый был выделен в полевых, а второй
— в лабораторных условиях (Baldani ipoferum 59b (в, 3 ); brasilense JM125A2
(г, 4); A. brasilense Sp70l, 5); A. brasilense
et al., 1980, 1987). В свою очередь,
Sp245(e, 6).
штамм A. brasilense Cd был выделен
из корней Cynodon dactylon после
инокуляции этого растения культурой Sp7 (Eskew et al., 1977). Таким образом,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
36
иммунохимическнй анализ целых бактериальных клеток с использованием
штаммоспецифичных антител на ЛПС позволяет быстро и достаточно надежно
определять серотип бактерий p. Azospirillum. Дот-анализ целых бактериальных
клеток азоспирилл со штаммоспецифичными антителами возможен также с ис­
пользованием традиционных маркеров специфических иммунных реакций ферментных меток.
Сравнительный иммуноднффузионный анализ О-специфических антиге­
нов азоспирилл со штаммоспецифичными антителами — тест, основанный на ичмунопреципитации, — в некоторых случаях оказывается более информативным
при серологическом анализе, поскольку позволяет выявлять тонкие различия в
строении специфических антигенов у исследуемых штаммов и, в некоторых слу­
чаях, может демонстрировать наличие антигенных перекрестов, не обнаружи­
ваемых в итоге твердофазного анализа. В частности, с помощью иммунодиффузионного анализа выявляется односторонняя реакция между антителами к штам­
му A. lipoferum 59b и ЛПС штамма A. brasilense Sp7. Последнее наблюдение сви­
детельствует о наличии общих О-факторов в составе ЛПС у штаммов, принад­
лежащих к разным видам p. Azospirillum. Эти данные согласуются с результата­
ми сравнения последовательностей рДНК различных видов азоспирилл (Fani et
о/., 1995), говорящими о том, что виды A. brasilense и A. lipoferum среди сравни­
ваемых видов наиболее близки между собой.
Следовательно, для проведения детального серологического анализа того
или иного штамма азоспирилл перспективным представляется именно сочетание
нммунохимических тестов, основанных на использовании метки (коллоидного
золота, фермента и т.д.) в дот-анализе целых клеток, с иммунопрешшитационными экспериментами с использованием изолированных специфических антиге­
нов данных бактерий.
Антитела на ЛПС исследуемых бактерий выявляют специфический анти­
ген не только в составе препарата, изолированного с бактериальной поверхности
конкретного штамма азоспирилл, но также в составе его культуральной среды.
Этот факт позволяет использовать иммуноферментный анализ (метод EL1SA)
для количественного выявления бактерий изучаемых штаммов азоспирилл непо­
средственно в почвенных суспензиях. В результате наших экспериментов уста­
новлено, что способ получения штаммоспецифичных антител на ЛПС азоспи­
рилл в сочетании с эффективным методом детектирования комплексов антитенантитело позволяет изучать динамику численности исследуемых штаммов непо­
средственно в почвенных суспензиях (и иных исследуемых образцах), минуя
стадию высева бактерий на питательную среду.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенный комплексный иммунохимическнй анализ углеводных анти­
генов бактериальной клеточной поверхности позволил впервые для представите­
лей почвенной микрофлоры — азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum —
оценить гетерогенность их углеводных антигенных структур и присутствие дан-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
37
ных детерминант в составе О-, К- и Н- антигенов, получить сведения о химиче­
ском строении иммунодоминантных участков лииополисахарндов бактерий и
выяснить вклады О- и Н- антигенов в архитектуру клеточной поверхности азоспирилл.
Одним из наиболее существенных результатов нам представляется выяв­
ление нового характера микробной R-S диссоциации. Были получены доказа­
тельства неприменимости традиционных представлений о микробной диссоциа­
ции (подробно описанной для энтеробактерий) для типового штамма A. brasilense Sp7, поскольку как R-, так и S-вариант этого штамма имеют в своем составе
полноценный ЛПС с развитой структурой О-антигена. Показано, что R-S - пере­
ход в данном случае (в отличие от энтеробактерий) связан с более тонкими из­
менениями строения клеточной поверхности. При отсутствии радикальных из­
менений в структуре ЛПС, имеет место перераспределение вкладов двух Оантигенов (выявленных как для исходного штамма, так и для его S-варианта) в
строение клеточной поверхности в зависимости от возраста культур. В этой свя­
зи уместно упомянуть известные литературные данные о зависимости эффектив­
ности адсорбции азоспирилл на корнях растения от фазы роста культур (UmaliGarsia et «/., 1980; Kapulnik et о/., 1985). Напрашивается предположение, что осо­
бенности тонкой структурной организации и время экспрессии липополисахаридных антигенов на клеточной поверхности азоспирилл могут являться факто­
рами, определяющими их экологическое повеление.
Сочетание различных иммунохимических методов позволило установить,
что ЛПС бактерий p. Azospirillum представляет собой не индивидуальное хими­
ческое соединение, а ансамбль макромолекул, демонстрирующих антигенные
различия. При этом иммунохимическая гетерогенность соматического антигена
«уравновешивается» отсутствием у данных бактерий индивидуального капсульного антигена. Главным отличием двух О-ПС, выявляемых в составе ЛПС иссле­
дованных штаммов азоспирилл, является антигенная гетерогенность одного из
полисахаридов, обусловленная наличием в структуре полимерной цепи, по край­
ней мере, двух различающихся по своему строению О-факторов (антигенных
детерминант). При этом второй О-ПС но всем тестам гомогенен и антигенно
идентичен одному из О-факторов, выявляемых в составе гетерогенного О-ПС.
Разные О-снецнфические полисахариды, определяющие иммунохимическую
гетерогенность ЛПС A. brasilense Sp245, отличаются также по способности к
антигенной модификации, являющейся результатом присутствия катионов
Трис(гилроксиметил)аминометана в среде культивирования. Следует отметить,
что сама возможность изменений структуры антигенных детерминант Оспецифических полисахаридов ЛПС под влиянием условий культивирования
бактерий на лабораторных средах была выявлена нами впервые.
Продемонстрированная антигенная идентичность иолисахаридного мате­
риала, формирующего капсулу и ЭПС у A. brasileme, одному из двух Оспецифических полисахаридов, выявленных у исследованных штаммов данного
вида, по-видимому, дает основания для уточнения существующих в настоящее
время представлений о самостоятельной роли ЭПС азоспирилл в формировании
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
38
их ассоциативных взаимоотношений с растениями. Знание особенностей струк­
турной организации капсулы и ЭПС азоспирилл может также способствовать
созданию эффективных бноспецифических зондов для цитохимических, таксо­
номических и экологических исследований данных бактерий.
Сочетание результатов иммунохимического анализа с данными спектро­
скопических исследований ЛПС позволило сделать заключения о принципиаль­
ных различиях (или сходстве) в обшей химической структуре О-специфических
полисахаридов, входящих в состав ЛПС азоспирилл. В этой связи представляют­
ся важными результаты, доказывающие, что иммунохимическая гетерогенность
О-специфических полисахаридов в пределах ЛПС одного штамма не связана с
радикальными различиями их моносахаридного состава. Было бы весьма инте­
ресно проверить этот вывод с использованием более детальных структурных
исследований ЛПС соответствующими физико-химическими методами.
Проведенный комплексный анализ поверхностных структур клеток, со­
держащих Оантигены, дает представление о распределении данных антигенов в
пределах клеточной поверхности азоспирилл. В свою очередь, это позволяет су­
дить о возможной роли соматического антигена при контактных взаимодействи­
ях исследуемых бактерий с разнообразными партнерами. Выявление чехла (липо)полисахаридной природы на флагеллнне полярного жгутика бактерий р.
Azospirillum, а также известное описание роли полярного жгутика на этапе ад­
сорбции этих бактерий на корнях растений (Michiels et a/., 1991), позволяют рас­
ценивать поверхностные полисахариды азоспирилл как одну из доминирующих
субстанций, обеспечивающих адсорбцию данных бактерий на корнях растения.
Кроме того, результаты, полученные при исследовании изменений подвижности
азоспирилл под влиянием различных антител и свидетельствующие об экрани­
рующем эффекте иолисахаридного чехла, могут иметь практическое приложе­
ние. В частности, тест на ингибирование подвижности бактерий при добавлении
к клеточной суспензии штаммоспецифичных антител на ЛПС может быть ис­
пользован в качестве быстрого серологического теста.
Обнаруженная иммунохимическая идентичность углеводных фрагментов
гликозилированного флагеллина полярного жгутика штамма A. brasileme Sp7
одному из двух О-специфических полисахаридов соматического антигена пред­
ставляется достаточно важным наблюдением. С учетом полученных нами дан­
ных об идентичности антигенных детерминант в составе капсульных полисаха­
ридов, экзополисахарилов и липополисахарилов азоспирилл, это позволяет
предположить наличие некоего общего пути (либо нескольких перекрещиваю­
щихся путей) биосинтеза углеводных поверхностных структур у бактерий рода
Azospirillum. Представляется целесообразным развитие этих исследований в на­
правлении изучения конкретных химических структур, ответственных за уста­
новленную нами антигенную идентичность углеводных компонентов соматиче­
ского и жгутикового антигенов азоспирилл, с использованием хорошо развитых
современных физико-химических методов анализа строения биомакромолекул.
Исследованное нами агрегирующее действие ЛПС и ЛПБК азоспирилл на
клеточные суспензии может иметь вполне определенный биологический смысл.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
39
Известна способность многих видов почвенных бактерий образовывать агрегаты
при их адгезии на корнях растений, а также наличие подобных скоплений бакте­
риальных клеток в ризосфере. С этой точки зрения структурообразующие эф­
фекты ЛПС азоспирилл, обильно экскретируемых данными бактериями в культуральную среду, можно рассматривать как проявление механизма адаптации,
облегчающего адгезию бактерий на корнях растений.
Экспериментальные данные показали, что развитый подход, использован­
ный при создании биотест-системы серологической идентификации бактерий
рола Azospirillum (учитывающий иммунохимические особенности их углеводных
антигенов) имеет значение для более широкого крута микроорганизмов. Нам
кажется перспективным распространение методологии комплексных иммунохимических исследований клеточной поверхности, развитой на примере азоспи­
рилл, на представителей других родов почвенных микроорганизмов, представ­
ляющих интерес в широком круге фнзиолого-биохимических и экологических
задач (например, агробактерий, родококков и др.). Кроме анализа принципиаль­
ных вопросов, связанных с изучением структурной организации поверхности
клеток, важных для понимания молекулярных механизмов их взаимодействий с
разнообразными партнерами, полученные нами результаты планируются к при­
менению в развитии эффективных методик определения и исследования штам­
мов микроорганизмов непосредственно в растительных и почвенных образцах.
Наконец, следует отметить, что традиционно иммунохнмический анализ
бактерий ограничивается, например, идентификацией исследуемых антигенов на
электрофореграммах или в составе клеточной поверхности с использованием
различных меток. В отличие от этого, антитела были использованы нами для
получения сведений об особенностях структурной организации важнейших по­
верхностных антигенов азоспирилл. В конечном итоге, это делает возможным
построение целостной топографической картины распределения различных
структурных элементов в пределах клеточной поверхности исследуемых микро­
организмов, имеющей большое значение для понимания механизмов взаимодей­
ствия микроорганизмов с растениями.
ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ
1. На основе иммунохимического анализа развиты подходы к изучению
клеточной поверхности почвенных азотфиксирующих бактерии рола
Azospirillum, позволяющие оценить гетерогенность их углеводных антигенных
структур и присутствие данных детерминант в составе О-, К- и Н- антигенов,
получить сведения о химическом строении иммунодоминангных участков лииополисахаридов бактерий и выяснить вклады О- и Н- антигенов в архитектуру
клеточной поверхности азоспирилл.
2. Установлено, что предварительная обработка клеточной поверхности
глутаровым альдегидом исключает иммунный ответ на нативные мембранные
белки и обеспечивает синтез антител на углеводные соматические антигены це­
лых клеток азоспирилл. Предложен способ получения ангисывороток с концен-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
40
трацией моноспецифических антител, достаточной для реализации эффекта иммунопрециннтации с целью выявления и анализа углеводсодержаших полимеров
в сложных смесях клеточных компонентов. Показано, что получаемые при этом
антитела имеют выраженную иггаммовую специфичность.
3. Выявлена иммунохимическая гетерогенность О-специфических полиса­
харидов штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245, проявляющаяся в наличии двух
фракций О-антигена, регистрируемых в составе бактериального ЛПС. Обнару­
жено, что разные О-спецнфические полисахариды, определяющие гетероген­
ность ЛПС A. brasilense Sp245, отличаются по способности к антигенной моди­
фикации, являющейся результатом изменений условий выращивания бактерий
на лабораторных средах — присутствия катионов Трис(гидроксиметил)амннометана в среде культивирования.
4. Обнаружено, что у штаммов A. brasilense Sp7 и Sp245 отсутствует инди­
видуальный капсульный антиген, а капсульный слой и экзополисахарид иммунохимически идентичны одному из О-специфических полисахаридов, входящих в
состав ЛПС данных бактерий.
5. Для типового штамма A brasilense Sp7 установлен нетипичный характер
R-S диссоциации, при которой не происходит кардинальных изменений в струк­
туре полисахаридных звеньев О-ПС, а изменяется лишь их антигенность, что
является следствием перераспределения вкладов двух О-ПС (выявленных как
для исходного штамма, так и для его спонтанного мутанта) в строение клеточной
поверхности в зависимости от возраста культур.
6. С использованием конкурентного иммуноанализа и метода спектротурбидиметрии показана роль галактозы и рамнозы как иммунодоминантных моно­
сахаридов в составе антигенных детерминант О-специфического полисахарида
A. brasilense Sp7.
7. Разработана биотест-система серологической идентификации бактерий
рода Azospirillum, учитывающая иммунохимические особенности их липополисахаридных антигенов.
8. Для серологически различных штаммов азоспирилл установлены харак­
терные отличия спектров поглощения света препаратами ЛПС и отмечены изме­
нения спектров, наблюдаемые внутри одного серотипа, коррелирующие с иммунохимическими и биохимическими различиями штаммов.
9. С использованием антител, полученных на высокоочищенные субъеди­
ницы полярного жгутика, продемонстрировано наличие антигенных перекрестов
у Н-антигена бактерий для представителей видов A. brasilense и A. lipoferum. У
модельных штаммов A. brasilense установлено наличие прочно связанного чехла
полисахаридной природы, экранирующего флагеллин полярного жгутика. Обна­
ружено, что углеводные фрагменты гликозилированного флагеллина полярного
жгутика типового штамма Л. brasilense Sp7 антигенно идентичны одному из двух
О-специфических полисахаридов соматического антигена.
10. Установлено, что, в зависимости от химического состава препаратов
наружной мембраны азоспирилл (лнпополисахарида, О- специфического поли­
сахарида, лиионолисахарид-белкового комплекса или его белковой фракции),
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
41
добавляемых к суспензиям растительных, бактерихтьных клеток или эритроци­
тов, в них возможно формирование структур трех типов, обусловленных эффек­
тами агрегации, агглютинации, а также фазового разделения, наблюдаемого в
суспензиях эритроцитов.
11. Разработан новый способ выделения высокоочишенных ЛПС, заклю­
чающийся в протеиназной обработке экстрактов бактериальных наружных мем­
бран, полученных с помощью ЭДТЛ.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.Л. Твердофазный
иммуноанапиз с использованием коллоидного золота в серогипировании
азоспирилл // Микробиология. - 1991. - Т.60, № 3. - С. 524-528.
2. Матвеев В.Ю., Богатырев В.А., Дыкман Л.А., Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И.
Физико-химические свойства клеточной поверхности S- и R- вариантов
штамма Azospirillum brasilense Sp7 // Микробиология. - 1992. - Т. 61, №. 4. С. 645-651.
3. Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Matora L.Yu., Schwartsburd B.I. The serotyping
of Azospirillum spp. by cell-gold immunoblotting// FEMS Microb. Lett. - 1992. 96.-P. 115-118.
4. Matora L., Solovova G., Serebrennikova O., Selivanov N., Shchyogolev S. Immu­
nological properties and evaluation of the involvement of bacterial lipopolysaccharides in plant-azospirillum contact interaction // Proc. 1st European Nitrogen Fixa­
tion Conference & Workshop «Safe Application of Genetically Modified Microor­
ganisms in the Environment» / Ed. G. Kiss, G. Endre. - Szeged: Officina, 1994. - P.
347.
5. Chumakov M., Solovova G., Velikov V., Kurbanova I., Matora L., Shchyogolev
S. Wheat root-associated Agrobacterium radiobactcr II Proc. 1st European Nitrogen
Fixation Conference & Workshop «Safe Application of Genetically Modified Mi­
croorganisms in the Environment» / Ed. G. Kiss, G. Endre. - Szeged: Officina,
1994. - P.275-279.
6. Matora L., Solovova G., Serebrennikova O., Selivanov N., Shchyogolev S. On the
involvement of lipopolysaccharide in bacteria-plant contact interactions for nitro­
gen-fixing associative bacteria of the genus Azospirillum II Nitrogen Fixation: Fun­
damentals and Applications / Eds. I. Tikhonovich, N. Provorov, V. Romanov, W.E.
Newton. - Dordrecht: Kluwer Academic, 1995. - P. 340.
7. Matora L., Solovova G., Serebrennikova O., Selivanov N., Shchyogolev S. Immu­
nological properties of Azospirillum cell surface: the structure of carbohydrate anti­
gens and evaluation of their involvement in bacteria-plant contact interaction //
Azospirillum VI and Related Microorganisms: Genetics, Physiology, Ecology / Eds.
I. Fendrik, M. Del Gallo, J. Vanderleyden, M. de Zamaroczy. - NATO ASI Series
G: Ecological Studies. - Berlin: Springer, 1995. - Vol. G37. - P. 377-382.
8. Dykman L., Matora L., Bogatyrev V. Use of colloidal gold for obtaining antibiotin
antibodies // J. Microbiol. Meth. - 1996. - 24. - P. 247-248.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
42
9. Матора Л.Ю., Шварцбурд Б.И., Щеголев СЮ. Иммунохимическнй анализ
О-специфических полисахаридов почвенных азотфиксирующих бактерий
Azospirillum brasilense II Микробиология. - 1998. - Т. 67, № 6. - С. 815-820.
10. Katzy L., Matora L., Serebrennikova O., Scheludko A. Involvement of a 120MDa plasmid of Azospirllum brasiense Sp245 in production of lipopolysaccharides// Plasmid. - 1998.-40. - P. 73-83.
11. Kamnev A.A., Antonyuk L.P., Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Sumaroka
M.V., Colina M., Renou-Gonnord M.-F., Ignatov V.V. Spectroscopic characteriza­
tion of cell membranes and their constituents of the plant-associated soil bacterium
Azospirillum brasilense II Journal of Molecular Structure. - 1999. - 480-481. - P.
387-393.
12. Kamnev A.A., Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Antonyuk L.P., RenouGonnord M.-F., Ignatov V.V. FTIR spectroscopic study of lipopolysaccharidecontaining cell components of the bacteria Azospirillum brasilense II Spectroscopy
of Biological Molecules: New Directions / Eds. J. Greve, G.J. Puppels, C.Otto. Dordrecht: Kluwer, 1999. - P. 459-460.
13. Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Shchyogolev S.Yu. Structurization effects of
the Azospirillum lipopolysaccharides in cell suspensions // Biomacromolecules. 2001. - V. 2, №2. - P. 402-406.
14. Бурыгин ГЛ., Матора Л.Ю., Щеголев С Ю . Изменение антигенных свойств
липополисахарилов Azospirillum brasilense при внесении в среду культивиро­
вания Трис(гидроксиметил)аминометана // Прикл. биохим. и микробиол. 2002. - Т. 38, №3.- С 292-294.
15. Матора Л.Ю., Щеголев СЮ. Антигенная идентичность липополисахари­
лов, капсулы и экзополисахаридов Azospirillum brasilense II Микробиология.
- 2002. - Т. 71, №2. - С. 211-214.
16. Капы Е.И., Борисов И.Б., Петрова Л.П., Матора Л.Ю. Использование фраг­
ментов 85- и 120-МДа плазмил Azospirillum brasilense Sp245 для изучения
плазмидной перестройки у этой бактерии и для поиска гомологичных после­
довательностей в плазмидах Azospirillum brasilense Sp7 // Генетика. - 2002. Т.38, №2.-С. 182-189.
17. Матора Л.Ю., Серебренникова О.Б., Петрова Л.П., Бурыгин ГЛ., Щеголев
СЮ. Нетипичный характер R-S диссоциации Azospirillum brasilense II Мик­
робиология. - 2003. - Т. 72, №1. - С. 60-63.
18. Khlebtsov B.N., Burygin G.L., Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu., Khlebtsov
N.G. A method for studying insoluble immune complexes // Biochim. Biophys.
Acta. - 2004. - V. 1670, № 3. - P. 199-207.
19. Khlebtsov B.N., Burygin G.L., Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu., Khlebtsov N.G.
Structure of insoluble immune complexes as studied by spectroturbidimetry and
dynamic light scattering // Coherent Optics of Ordered and Random Media IV / Ed.
D. A. Zimnyakov. - Bellingham, Washington: SPIE, 2004. - Vol. 5475. - P. 26-37.
20. Практические занятия по физико-химическим и биохимическим методам ис­
следования биополимеров: Учебное издание / И.Н. Клочкова, С.А. Коннова,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
43
Л.Ю. Матора, ГЛ. Бурыгин, СЮ. Щеголев / Под ред. СЮ. Щеголева. - Са­
ратов: Изд-во Сараг. ун-та, 2003. - 87 с.
21. Бурыгин ГЛ., Матора Л.Ю., Щеголев СЮ. Способ получения липополисахаридов // Патент РФ № 2237719, Бюл. № 28, 10.10.2004 г., МКИ С 12 Р
19/04
22. Чумаков М., Иванова (Матора) Л., Емиев В. Модифицированный метод
выделения ассоциативных азотфиксируюших бактерий из корней хпаков //
Известия ТСХЛ. -1987, вып.З.- С. 112- 115.
23. Бабердина И., Иванова (Матора) Л., Шварцбурд Б., Матора Л., Скворцов И.,
Игнатов В. Кислые экзополисахариды A.brasilensc Sp7: выделение, очистка и
иммунохимия // Тез. VIII Весе. конф. «Химия и биохимия углеводов» - Тби­
лиси, 1987.- Пущино: ОНТИ НЦБИ АН СССР, 1987.-СИЗ.
24. Bogatyrev V., Ivanova (Matora) L., Schwartsburd В., Khlebtsov N. Use of col­
loidal gold in immunodot technigue // Abstr. XIXth FEBS Meeting. - Rome, 1989.
- P.30.
25. Шварцбурд Б., Щеголев С , Матора Л., Игнатова Е. О-антигенный состав
клеточной поверхности бактерий A. brasilense Sp7 // Тез. Всес. конф. «Регу­
ляция микробного метаболизма» - Пущино, 1989.- С.22.
26. Schwartsburd В., Matora L., Zhemerichkin D., Ignatov V. O-specific polysaccha­
rides of A.brasilensc Sp7: immunochemical activity and structure of immu­
nodominant sites // Abstr. Vth Europ. Carbohydrate Symp. - Prague, 1989. - P.69.
27. Matora L., Bogatyrev V., Dykman L., Katzy E., Schwartsburd. Effect of plasmid
content on cell-surfase antigens of A.brasilense Sp245 // Abstr. Vth Int. Symp. on
Nitrogen Fixation with non-legumes. - Florense, Italy, 1990. - P.97.
28. Schwartsburd В., Shchyogolev S., Matora L., Ignatov V. Cell surface carbohy­
drate antigens of soil nitrogen-fixing bacteria of Azospirillum genus: immuno­
chemical aspects // Abstr. VIth Europ. Symp. on Carbohydrate Chemistry «Eurocarb VI». - Heriot-Watt University, Edinburg, Scotland, 1991. - P. 18.
29. Matveev V., Bogatyrev V., Dykman L., Matora L., Schwartsburd B. Changes of
physico-chemical properties of A. brasilense Sp7 cell surface in consequence of RS dissociation // Abstr. VIIIth Eastern Europe Symposium on Biological Nitrogen
Fixation «Nitrogenfix'92». - Saratov, Russia, 1992. - P.75.
30. Schwartsburd В., Matora L., Bogatyrev V., Dykman L„ Shchyogolev S. Structure
of the cell surface carbohydrate determinants and its dependence on the plasmid
content in bacteria of the genus Azospirillum II Abstr. VIIIth Eastern Europe Sym­
posium on Biological Nitrogen Fixation «Nitrogenfix'92». - Saratov, Russia,
1992.-P.43.
31. Chumakov M., Velikov V., Solovova G., Matora L., Shchyogolev S. Root accociated non-pathogenic agrobacteria from wheat // Abstr. Vх European Nitrogen
Fixation Conference. - Szeged, Hungary, 1994.-Abstr.68.
32. Solovova G., Matora L., Bogatyrev V., Dykman L., Shchyogolev S., Chumakov
M. Short-term colonization and attachment of bacteria of the famely Rhizabiaceae
and of the genus Azospirillum to plant roots // Abstr. NATO Advanced Research
Workshop on Azospirillum and Related Microorganisms. - Sarvar, Hungary, 1994.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
44
33. Matora L., Solovova G., Serebrennikova O., Selivanov N., Shchyogolev S. Im­
munological properties of Azospirillum cell surface: the structure of carbohydrate
antigens and evaluation of their involvement in bacteria-plant contact interaction //
Abstr. NATO Advanced Research Workshop on Azospirillum and Related Micro­
organisms. - Sarvar, Hungary, 1994.
34. Матора Л., Соловова Г., Серебренникова О., Селиванов Н., Щеголев С. О
роли липополисахаридов бактерий при их контактных взаимодействиях с
растениями для ассоциативных азотфиксаторов рода Azospirillum II 9-й Баховский коллоквиум по азотфиксашш: Сб. тез.- Пущино: ОНТИ ПНЦ, 1995. С.58.
35. Matora L., Schvvartsburd В., Shchyogolev S. Lipopolysaccharides from soil bac­
teria of the genus Azospirillum: immunochemical properties and epitopes structure
// Abstr. 1st Intern. Conf. on Polysaccharide Engineering. - Trondheim, Norway,
1994.
36. Petrova L„ Alenkina S., Matora L. Studies of Azospirillum mutants with altered
surface structures // Abstr. 10th Intern. Congr. on Nitrogen Fixation.- St.Petersburg, Russia, 1995. - Abstr. 119.
37. Matora L., Bogatyrev V., Dykman L., Shchyogolev S. Development of an effi­
cient immunoassay system for monitoring soil nitrogen-fixing bacteria associated
with higher plants // Abstr. Intern. Workshop on Assoc. Interactions of Nitr.Fixing Bacteria with Plants. - Saratov, Russia, 1995. - P. 25.
38. Matora L., Schwartsburd В., Shchyogolev S. Comparative immunochemical
analysis of exocellular and somatic Azospirillum polysaccharide antigens // Abstr.
Intern. Workshop on Assoc. Interactions of Nitr.-Fixing Bacteria with Plants. Saratov, Russia, 1995. - P. 68.
39. Matora L., Serebrennikova O., Ponomareva Т., Petrova L., Shchyogolev S. R-S
dissociation in A.brasilense Sp7: immunochemical aspects // Abstr. 2nd European
N2-fixation Conf. - Poznan, Poland, 1996. - P. 181.
40. Kurbanova I.V., Solovova G.K., Matora L.Yu., Shchyogolev S.Yu., Markelova
T.S., Ishin A.G., Chumakov M.I. Behaviour and wheat root colonization by at­
tachment-deficient agrobacterial strains // Abstr. VIIth Intern. Symposium «Nitro­
gen Fixation with Non-Legumes». - Faisalabad, Pakistan, 1996. - P. 131.
41. Matora L., Serebrennikova O., Sumaroka M., Shchyogolev S. Immunochemical
heterogeneity of the lipopolysaccharide from Azospirillum brasilense Sp245//
Abstr. 3 d Eur. N2-fixation Conf. - Lunteren, The Netherlands, 1998. - P. 177.
42. Matora L., Sumaroka M., Dykman L., Serebrennikova O., Shchyogolev S. Re­
vealing a cap on the polar flagellum of Azospirillum brasilense Sp245 // Abstr.
XIIth Int. Congr. on N2-fixation. - Parana, Brasil, 1999.- P.99.
43. Burygin G., Matora L., Shchyogolev S. Structural alteration of lipopolysaccha­
rides from the nitrogen-fixing bacteria Azospirillum brasilense as a result of a
modification of culture growth conditions // Abstr. IVth Eur. N2-fixation Conf. Sevilla, Spain, 2000. - P. 135.
44. Serebrennikova O.B., Matora L.Yu., Bogatyrev V.A., Dykman L.A., Shchyogo­
lev S.Yu. Development of an immunoassay system for monitoring soil nitrogen-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
45
fixing bacteria azospirillum associated with higher plants // Abstr. Vth John Hum­
phrey Advanced Summer Programme and Lecture Series in Immunology - Pushchino, 2000. - P.83.
45. Бурыгин ГЛ., Матора Л.Ю., Щеголев СЮ. Изменение структуры лннополисахаридов почвенных азотфиксируюших бактерий A. brasileme Sp245 при
модификации условий культивирования // Сб. тез. межвузовской конферен­
ции молодых ученых «Растение, микроорганизмы и среда». - СанктПетербург, 2000. - С. 15.
46. Серебренникова О.Б., Матора Л.Ю., Щеголев С Ю . Иммунохимическая ге­
терогенность липополисахаридов почвенных азотфиксируюших бактерий
Azospirillum brasileme Sp7 и Sp245 // Сб. тез. Школы-конференции «Гори­
зонты физико-химической биологии». - Пущино: Путинский научный ненгр
РАН, 2000. - Т. 2. - С. 109-110.
47. Бурыгин Г.Л., Матора Л.Ю., Щеголев СЮ. Изучение липополисахаридов
почвенных азотфиксируюших бактерий рола Azospirillum II Сб. тез. Конф.
«Молодые ученые Волго-Уральского региона на рубеже веков». - Уфа: Баш­
кирский университет, 2001. - Т. 2. - С. 23-25.
48. Бурыгин ГЛ., Матора Л.К)., Щеголев СЮ. Исследование гомологичных
структур в составе липополисахарида и полярного жгутика бактерий рода
Azospirillum II Сб. тез. Первой региональной конференции молодых ученых
«Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой». — Са­
ратов: Изл-во Саратовского университета, 2002. — С. 14.
49. Бурыгин ГЛ., Серебренникова О.Б., Матора Л.Ю., Щеголев СЮ. Быстрый
метод скринирования мутантов по структуре липополисахарида ассоциатив­
ных бактерий рода Azospirillum II Сб. тез. VI Путинской школыконференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Тула: Изл-во
Тул. гос. пед. ун-та им. Л.Н. Толстого, 2002. — Т. 3. - С. 10.
50. Burygin G.L. Matora L.Yu., Shchyogolcv S.Yu. Investigation of homologous
structures that are part of the lipopolysaccharide and the polar flagellum of Azospi­
rillum brasilense II Abstr. Xth Intern. Congr. on Bacteriology and Applied Micro­
biology «The World of Microbes». - Paris, France, 2002. - P. 261.
51. Katzy E.I., Petrova L.P., Shelud'ko A.V., Borisov I.B., Kamneva A.B., Matveeva
E.V., Matora L.Yu., Burygin G.L. Properties of plant-grovvth-promoting rhizobacterium Azospirillum brasileme relevant to colonization of artificial media and
wheat roots and to bioremediation // Abstr. Int. Symp. «Biochemical Interactions
of Microorganisms and Plants With Technogenic Environmental Pollutants». Saratov: Saratov University Publishing House, 2003. - P. 15.
52. Matora L.Yu„ Burygin G.L., Shchyogolcv S.Yu. Immunochemical analysis of
Azospirillum lipopolysaccharides // Abstr. Xl-th Int. Congr. on Molecular PlantMicrobial Interactions «New bridges between Past and Future». - St.-Petersburg,
Russia, 2003. - P. 309.
53. Плешакова Е.В., Матора Л.Ю. Изучение эффективности биоремедиаиии
нефтезагрязненной почвы при интродукции в нее штамма Rhodococcus maris
АМЗ // Научные труды Международного биотехнологического центра МГУ:
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
46
тезисы докладов второй международной научной конференции «Биотехно­
логия — охране окружающей среды» и третьей школы-конференции молодых
ученых и студентов «Сохранение биоразнообразия и рациональной исполь­
зование биологических ресурсов», Москва 25-27 мая 2004 г./ Ред. А.П. Сад­
чиков, С В . Котелевцев. - М: Изд-во «Спорт и культура», 2004. - С . 178.
JSf,
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
У '
ft
<TS/, /£'
4/,<Z22s
/btf&'-i''xJ/ t/,
' - - >•о.
tiL&ey**. /CJ<
•ЪР f>
fa
\
Подписано в печать 05.07.2004. Формат 60x84/16. Гарнитура Times.
Бумага типовая. Объём 2,65 печл.
Тираж 100 экз. Заказ №7
Отпечатано с готового оригинал-макета в ИБФРМ РАН
410049, Саратов, пр. Энтузиастов, 13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
4
Размер файла
1 426 Кб
Теги
1044
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа