close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

551.Морфологические и гистоэнзиматические изменения в почках при массивной кровопотере и восполнении кровезамещающими растворами

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ТАМАЕВА
Фатима Арслановна
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ГИСТОЭНЗИМАТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ
В ПОЧКАХ ПРИ МАССИВНОЙ КРОВОПОТЕРЕ И ВОСПОЛНЕНИИ
КРОВЕЗАМЕЩАЮЩИМИ РАСТВОРАМИ
14.00.15 - патологическая анатомия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва - 2008
1
Работа выполнена в государственном образовательном учреждении
высшего профессионального образования «Дагестанская государственная
медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и
социальному развитию»
Научный руководитель:
доктор медицинских наук, профессор
Голубев Аркадий Михайлович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор
Трусов О.А.
Российский государственный медицинский университет)
доктор медицинских наук, профессор
НИИ урологии РАМН
Кудрявцев Ю. В.
Ведущая организация:
НИИ морфологии человека РАМН
Защита состоится «29» сентября 2008 года в 14.00 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.072.04 при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по
адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1.
Автореферат разослан «07» июля 2008 года.
Учёный секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук, профессор
2
А.И.Щеголев
Список сокращений
АД – артериальное давление
АТФ – аденозинтрифосфат
ВК – восходящие канальцы петли Генле
Г-6-ФДГ - глюкозо – 6 – фосфат - дегидрогеназа
ГДГ глутаматдегидрогеназа
ДК дистальные канальцы
ЛДГ лактатдегидрогеназа
НАД никотинамидадениндинуклеотид
НАДФ - никотинамидадениндинуклеотид - фосфат
НК – нисходящие канальцы петли Генле
ОПН - острая почечная недостаточность
ОЦК – объем циркулирующей крови
ПК – проксимальные канальцы
ПФОС – перфторорганические соединения
СДГ сукцинатдегидрогеназа
СТ – собирательные трубочки
ЩФ щелочная фосфатаза
ЮГК - юкстагломерулярные клетки
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Кровопотеря является одной из важных
проблем медицины. Высокий уровень травматизма, хирургические
вмешательства, при которых возникает массивная кровопотеря,
требуют соответствующей коррекции. Несмотря на существенные
достижения в решении этого вопроса, выбор кровезамещающего
препарата, количество введения и другие вопросы являются
предметом дискуссии.
Большие надежды были связаны с использованием крови и
препаратов крови, полученных от доноров. Однако, как выяснилось,
кровь, извлеченная из сосудистого русла, теряет свои нативные
свойства. В этом случае она представляет собой суспензию,
состоящую из микросгустков, тромбоцитов и неполноценно
функционирующих эритроцитов (А.И.Воробьев, 2003). Совершенно
очевидно, что вне организма не существует цельной крови. После
разделения крови на составляющие ее компоненты, можно говорить о
разобщенных клетках или белках, которые вводятся в организм
человека. Кроме этого, применение крови и ее компонентов
сопряжено
с
риском
заражения
реципиента
опасными
инфекционными заболеваниями: вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекция
и т.д. Кристаллоиды, крахмалы, альбумин, декстраны, решая
отдельные задачи инфузионной терапии (восполнение объема
циркулирующей крови, поддержание осмотического и онкотического
давления), не обладают очень важным механизмом: способность
обеспечивать транспорт газов.
В связи с этим, в настоящее время ведутся поиски препаратов,
которые способны решать этот важнейший вопрос. Одним из
направлений является создание кровезаменителей, обладающих
газотранспортной
функцией,
на
основе
перфторуглеродов.
Перфторуглероды обладают химической устойчивостью, растворяют
до 50 % кислорода и в 4 раза больше углекислого газа. Созданная
целевая
комплексная
программа,
завершилась
созданием
отечественного препарата «Перфторан», который в 1997 году был
разрешен Министерством здравоохранения Российской Федерации
для
массового
производства,
«как
новое
поколение
кровезаменителей,
обладающих
газотранспортной
функцией»
(Г.Р.Иваницкий, 2001). Для человека с большим запасом
4
безопасности установлена допустимая доза перфторана 30 мл/кг (ЛД
50 для мыши составляет 140 мл/кг перфоторана).
Массивная кровопотеря, сопровождаясь уменьшением объема
циркулирующей крови, снижением артериального давления, ведет к
гипоперфузии органов и тканей, ограничению доставки кислорода к
клеткам и развитию гипоксии. Базисным механизмом гипоксии
является нарушение функции митохондриальных ферментных
комплексов, а восстановление доставки кислорода к клетке при
гипоксии
имеет
положительный
эффект
в
условиях
функционирования дыхательной цепи (Л.Д.Лукьянова, 2001). В
противном случае высокие концентрации кислорода, обладая
токсическим действием, будут усугублять
процессы альтерации
клеток.
В почках при массивной кровопотере отмечаются значительные
нарушения
кровообращении,
в
том
числе
и
на
уровне
микроциркуляторного русла. Особенно уязвим корковый слой почек,
так как при снижении артериального давления кровь по дуговым
артериям, минуя корковый слой, возвращается в сосуды мозгового
слоя. Интенсивность повреждения структур почек связана в
значительной степени с продолжительностью гипоксии (или ишемии)
и своевременным
восстановлением
почечного
кровотока
с
использованием инфузионных препаратов.
Решению указанных вопросов и посвящено настоящее исследование.
Цель работы. Оценка протекторного эффекта некоторых
кровезаменителей
для
коррекции
морфологических
и
гистоэнзимотических изменений почек при острой массивной
кровопотере.
Задачи исследования. Для достижения указанной цели были
поставлены следующие задачи:
1.
Определить морфологические изменения и нарушения
тканевого дыхания в различных отделах почек экспериментальных
животных (крыс) при массивной кровопотере (50% объема
циркулирующей крови).
2.
Оценить структурные изменения и энзимогистохимические
нарушения в различных отделах почек при восполнении кровопотери
физиологическим раствором.
3.
Изучить
характер
изменения
структур
почки
и
метаболические
нарушения
при
восполнении
кровопотери
гепаринизированной аутокровью.
5
4.
Оценить
морфологические
и
гистоэнзиматические
изменения в различных отделах почек при восполнении массивной
кровопотери перфторуглеродной эмульсией «Перфторан».
5.
Провести сравнительный анализ протекторного эффекта
различных кровезамещающих растворов на различные структуры
почечной ткани при острой массивной кровопотере.
Научная новизна. В работе
впервые
количественно
(морфометрически) изучена динамика изменения активности
окислительно-восстановительных ферментов и гидролаз почек при
массивной кровопотере в эксперименте. Впервые на основании
гистологических и количественных энзимогистохимических методов
установлены протективные свойства перфторуглеродной эмульсии
«Перфторан» для различных отделов нефрона при массивной
кровопотере. Впервые, на основе количественной характеристики,
определенны особенности коррекции гипоксических поражений
почек
при
острой
массивной
кровопотере
различными
кровезамещающими
растворами
(физиологический
раствор,
гепаринизированная аутокровь, «Перфторан»).
Научно- практическая значимость работы. Полученные в результате
проведенных количественных энзимогистохимических исследований,
позволили
установить
характер
и
последовательность
метаболических изменений в различных отделах нефронов при
острой массивной кровопотере в эксперименте, которые могут
обьяснить патогенез функциональных нарушений почек.
Сравнительный анализ результатов использования различных
кровезамещающих препаратов
для коррекции массивной
кровопотери, позволил рекомендовать « Перфторан» в качестве
ведущего кровезамещающего препарата при массивной кровопотере,
поскольку он обладает наибольшим протекторным эффектом для
почек.
Практическая значимость работы.
Полученные результаты, свидетельствуют о благоприятном действии
перфторана при острой массивной кровопотере и позволяют рассматривать
его применение в составе лечебных мероприятий гипоксических состояний
почек. Результаты проведенных исследований могут стать основой для
последующих клинико-экспериментальных исследований.
Результаты
исследования будут использованы при чтении лекций и проведении
6
практических занятий на кафедрах патологической анатомии, анестезиологии
и реаниматологии.
Апробация материалов диссертации.
Основные положения
диссертации доложены: на Российской научной конференции
«Перфторуглеродные
соединения
в
экспериментальной
и
клинической медицине» (Санкт-Петербург, 8-10 сентября 2004г); на
межвузовской научной конференции с международным участием
«Современные
проблемы
морфологии»
(Махачкала,
2005);
на
республиканской научно- практической конференции, посв. 90- летию со дня
рожд. проф. М.М.Максудова ( Махачкала, 2006) ; на 4-й научно-практ.
конф. "Новое в хирургии Дагестана» (Махачкала, 2006); на ХIV
Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва,
16-20 апреля 2007).
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 7 научных
работ, из них 1 в центральной печати.
Объём и структура диссертации.
Диссертация изложена на
171страницах. Состоит из введения, обзора литературы, 4 глав
собственных исследований, выводов, практических рекомендаций,
указателя литературы. Список литературы включает 205 публикации,
из них 123 отечественных и 82 иностранных. Диссертация
иллюстрирована 10 таблицами, 22 диаграммами и 58 рисунками
(микрофотографиями).
Содержание работы. В качестве материала исследования мы
использовали белых беспородных крыс, выращенных в виварии ДГМА.
Эксперименты проводились в соответствии с правилами работы с
лабораторными животными (“Principles of laboratory animal care”, 1985,
издание Национального Института Здоровья США, № 88-23).
Рацион питания крыс был стандартный и состоял из комбикорма, хлеба,
крупы, семян кукурузы, подсолнуха, жиров, моркови, капусты, свеклы и
воды. Средний вес крыс составлял до начала экспериментов 200±30 гр.
В соответствие с целью нашего исследования были выделены
следующие экспериментальные серии:
1 серия – интактные крысы (без кровопотери) – 30 крыс.
2 серия – крысы с кровопотерей 50% объема циркулирующей крови (из
расчета 2,5 мл крови на 100 гр. массы тела крысы) в течение 10 мин с
последующей декапитацией крыс и забором материала в сроки 1, 4, 7, 14, 30
суток – 30 крыс.
7
3 серия – крысы с кровопотерей 50% циркулирующей крови в течение
10 мин c возмещением физиологическим раствором (до полного
восстановления объема кровопотери) спустя 1 час от начала кровотечения и
забором материала в сроки 1, 4, 7, 14, 30 суток – 30 крыс.
4 серия – крысы с кровопотерей 50% циркулирующей крови в течение
10 мин c возмещением спустя 1 час от начала кровотечения
гепаринизированной аутокровью (до полного восстановления объема
кровопотери) и забором материала в сроки 1, 4, 7, 14, 30 суток – 30 крыс.
5 серия – крысы с кровопотерей 50% циркулирующей крови в течение
10 мин c возмещением перфторана в дозе возмещающей объем кровопотери
спустя 1 час от начала кровотечения и забором материала в сроки 1, 4, 7, 14,
30 суток – 30 крыс.
Острую кровопотерю под тиопенталовым наркозом (40 мг/кг
внутрибрюшинно) вызывали однократным выпусканием крови из
катетеризированной хвостовой артерии крысы из расчета 2,0 мл крови на 100
гр массы тела крысы в течение 15 -20 мин. Расчет объема кровопотери
основывали на данных литературы (Кожура В.Л. и соавт.,1994; Barbosa S.T.
et al., 1992), согласно которым снижение АД при этом достигает уровня 40 –
60 мм.рт.ст. До начала кровопотери животным вводили через катетер
внутриартериально 0,5 мл гепарина (50 ЕД) (Бастрикова Н.А. и др. 1999).
Восполнение кровопотери производили введением кровезамещающего
раствора через тот же катетер спустя 1 час от начала кровопотери в дозе
возмещающей объем кровопотери.
Всего в эксперименте использовано 186 крыс. В ходе эксперимента в
разных сериях от кровопотери погибло 36 крыс, в течение первых трех часов
после начала эксперимента. Исследование было проведено на выживших 150
животных. Забор материала проводили в сроки 1, 4, 7, 14, 30 суток в
соответствии с Приказом МЗ СССР № 755 от 12.08.77 г. и Международными
рекомендациями по проведению эксперимента.
Таблица № 1. Летальность животных в ходе эксперимента.
Серия
1 серия
2 серия
3 серия
4 серия
5 серия
Всего
Всего крыс
30
50
39
33
34
186
Погибло крыс
20
9
3
4
36
8
Исследовано
30
30
30
30
30
150
Таблица № 2. Распределение экспериментальных животных
Серия эксперимента
1- Интактные крысы
(контроль)
2 - Кровопотеря 50 %
объема
циркулирующей
крови.
3- Кровопотеря 50 %
объема
циркулирующей
крови
с
восполнением
физ.раствором
4 - Кровопотеря 50 %
объема
циркулирующей
крови
с
восполнением
гепаринизарованнной
аутокровью
5 - Кровопотеря 50 %
объема
циркулирующей
крови
с
восполнением
перфтораном
Сроки опыта
1 сутки
4 суток
7 суток
14 суток
30 суток
1 сутки
4 суток
7 суток
14 суток
30 суток
1 сутки
4 суток
7 суток
14 суток
30 суток
1 сутки
4 суток
7 суток
14 суток
30 суток
1 сутки
4 суток
7 суток
14 суток
30 суток
Количество
животных
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
По истечении сроков эксперимента крыс забивали под хлороформным
наркозом. Для изучения брали кусочки ткани почек, с захватом коркового и
мозгового вещества. Для гистоморфологических и гистохимических
исследований кусочки тканей фиксировали в 10% нейтральном формалине и
в жидкости Карнуа, заливали в парафин и готовили срезы на санном
микротоме толщиной 5-7 мкм. Для гистоэнзиматических исследований
кусочки ткани почки, замороженные в жидком азоте, помещали в криостат
при -15° С и готовили срезы толщиной 10 мкм. Мгновенное замораживание
в жидком азоте позволяет избежать превращения воды, находящейся в
клетках и тканях, в кристаллы (Дьёрдь Кисели, 1962), что наблюдалось при
медленном замораживании. Кристаллы эти способны повреждать мембраны
внутриклеточных органелл. Для исключения возможных ошибок, при оценке
гистоэнзиматических реакций, связанных с разной толщиной срезов,
9
качеством реактивов и растворов, температурным режимом и т.д. мы
учитывали рекомендации Журавлёвой Т.Б. и соавт. (1978) и Автандилова Г.Г.
(1984, 1990), которые считают, что в работе патологов на первый план
выступает сравнительная оценка содержания изучаемых веществ в условиях
нормы и в разных фазах патологического процесса. При этом важно, чтобы
исследуемые срезы были одинаковой толщины и обработаны в стандартных
условиях.
Для исследования кусочки органов от подопытного и контрольного
животного монтировали в один блок при замораживании. Таким образом,
один срез или серию срезов с нескольких кусочков подвергали
гистохимической обработке в одинаковых условиях. Этот метод дает
возможность исключить влияние неодинаковой толщины срезов, качества
реактива и растворов, температурного режима и других факторов на ход
гистохимических реакций.
Важную роль играет изучение ферментных систем. Острая массивная
кровопотеря вызывает инактивацию некоторых ферментов, необходимых для
нормального течения обменных процессов в организме, что сказывается на
клинических проявлениях кровопотери (Молоканов К.М. и соавт., 1971;
Рашевская А.М. и соавт.,1971). Поэтому гистоэнзиматические и
гистохимические исследования необходимы для определения патогенеза
действия массивной кровопотери на организм (Тиунов Л.А., 1976).
Микроскопическая гистоморфология включала окраску срезов
гематоксилином и эозином, пикрофуксином по ван Гизону, суданами III, IV и
черным.
Наряду с общеморфологическими методами для проведения
сравнительного анализа полученных результатов использовался комплекс
гистохимических и гистоэнзиматических методик.
Неспецифическую щелочную фосфатазу (ЩФ) определяли методом
азосочетания по Берстону с использованием a-нафтилфосфата и прочного
синего РР. Активность ЩФ была показателем состояния цитомембран
аппарата Гольджи, щеточной каёмки. Об углеводном обмене судили по
активности фермента гликолиза и гликогенолиза: ЛДГ. Для суждения об
уровне
окислительно-восстановительных
процессов
(повреждение
митохондрий) изучали ферменты цикла Кребса – СДГ и терминального
окисления – НАД-диафоразу (маркеры внутренней мембраны).
Для
экстракции липидов, которые могут обуславливать неспецифическое
восстановление соли тетразолия при определении активности НАДдиафоразы, срезы перед инкубацией погружали в ацетон, охлаждённый до
4°С, на 15-30 сек после чего проводили обработку по оригинальной схеме.
10
Рассматривалась активность ГДГ (маркера матрикса). По активности Г6-ФДГ предполагали о степени повреждения эндоплазматического
ретикулума почек (Гайер Г.,1974; Ленинджер А., 1976).
При определении активности ферментов проводился контроль
специфичности гистохимических реакций путём выключения из
инкубационной среды соответствующего субстрата. Кроме того, все
гистохимические и гистоэнзиматические данные в микропрепаратах
подвергались денситофотометрии продукта реакции с помощью аппаратнопрограмного комплекса для определения фотометрических параметров
биоматериалов «Мекос – Ц1» производства ЗАО Медицинские
компьютерные системы (Мекос, г.Москва). Комплекс Мекос – Ц1 позволяет
вводить изображение с гистологических препаратов в цифровом формате jpg
или bmp на магнитный носитель (винчестер компьютера или компакт-диски),
выполнять денситофотометрические измерения и количественный анализ
продукта гистохимических реакций. Программное обеспечение комплекса
Мекос – Ц1 позволяет работать с базой полученных данных, проводить
статистическую обработку результатов исследования с применением
электронных таблиц Microsoft Exel, использованием параметрических
методов исследования с определением среднестатистической М, σ, р. При
анализе результатов гистохимических и гистоэнзиматических исследований,
кроме участия в метаболических процессах, учитывалась также субклеточная
локализация изучаемых ферментов. Благодаря электронной гистохимии и
молекулярной
биохимии
были
установлены
ферменты-маркеры
ультраструктур клеток (Гайер Г.Г., 1974; Ленинджер А., 1976). По
изменению интенсивности энзиматических реакций и по характеру
отложения и распределения продукта реакции, возможно оценить степень
повреждения субклеточных структур (Авцын А.П. и соавт., 1971; Саркисов
Д.С., 1977 и др.).
По данным Авцына А.П. и соавт. (1972) и др. биохимические изменения,
выявляемые гистохимическими методами, при различных патологических
состояниях предшествуют морфологическим. Изменения активности
ферментов являются наиболее ранним морфологическим признаком
повреждения ткани. Следовательно, гистохимические и гистоэнзиматические
исследования ткани почек экспериментальных животных позволили
выяснить глубину нарушения клеточного метаболизма, судить о морфо функциональном состоянии почек при острой массивной кровопотере и
инфузии различными кровезамещающими растворами.
Статистические методы.
Основные показатели вычислялись при
помощи программного продукта Microsoft Excel с использованием методов
11
параметрической статистики. Статистическое исследование было выполнено
на 7 600 фотографиях гистологических препаратов экспериментальных
животных, полученных с помощью комплекса Мекос – Ц1.
Результаты исследований.
Проведенные
нами
экспериментальные
исследования
убедительно свидетельствуют о
выраженных морфологических и энзимогистохимических измениях в
клубочковом и тубулярном аппарате почек при острой массивной (50%
ОЦК) кровопотере. Кроме того, все гистохимические и гистоэнзиматические
данные в микропрепаратах подвергались денситофотометрии продукта
реакции с помощью комплекса аппаратно-програмного определения
фотометрических параметров биоматериалов «Мекос – Ц1». Получены не
только качественные, но и количественные показатели
продукта
гистохимических реакций, поскольку именно количественное гисто энзиматическое
исследование
позволяет с
функционально –
морфологических позиций оценить характер и степень повреждения клеток.
Установлено (в том числе и морфологическими методами), что при
острой массивной кровопотере, без возмещения, у животных в почках
кровоток редуцирован. Клубочковый аппарат обескровлен. Особенно
страдает корковый слой. Таким образом, поражаются кортикальные и
медуллярные канальца, включая функционально важный толстый отдел
восходящей части петли нефрона. К 7 суткам при массивной кровопотере
выделены участки некроза эпителия канальцев, приводящие к развитию
острой почечной недостаточности.
Только в эксперименте с массивной кровопотерей отмечен некроз
эпителия канальцев, развившийся на 4 сутки. Некроз эпителия канальцев
выявлен только в сериях с кровопотерей. Так же в этой серии отмечались
пролиферация фибробластов и отложение извести в участках некроза
эпителия проксимальных извитых канальцев.
Дистрофические изменения отмечались во всех экспериментальных
сериях. Интенсивность этих
изменений варьировала. В наших
экспериментах отмечено проявления жировой и белковой (вакуольной)
дистрофии.
В наших экспериментах отмечался
и интерстициальный отек
(жидкость из разрушенных канальцев) во II и III сериях. Восстановительные
процессы эпителия в разных сериях проходили с различной скоростью. В III
серии отмечались признаки регенерации эпителия на 14 сутки: уплощенные
эпителиальные клетки с гиперхромными ядрами. Во II и IV сериях
восстановительные процессы так и не достигли нормы к 14 суткам. Хотя в V
12
серии с перфузией «Перфтораном» восстановление тканей
настолько
выражены, что не было выявлено признаков повреждения.
При гистофотометрическом анализе активности ферментов выявлены
особенности структурно- метаболической гетерогенности различных отделов
нефрона, проявляющееся различиями активности дегидрогеназ. В условиях
дефицита кислорода происходит нарушение образования богатых энергией
фосфатных соединений и развитие анаэробного метаболизма. Образование
энергии осуществляется в результате анаэробного распада глюкозы, жира,
белка, сопровождающегося накоплением продуктов клеточного обмена: иона
водорода, лактата и кетоновых кислот. Накопление в тканях и крови
органических кислот приводит к развитию метаболического ацидоза.
Результаты исследований свидетельствуют о метаболических нарушениях в
различных структурах почек, как при чистой массивной кровопотере, так и
при восполнении ее различными кровезаменителями. Нарушения имелись во
всех сериях экспериментов, однако степень выраженности при применении
различных кровезаменителей отличалась. На фоне более выраженных
окислительно – восстановительных процессов при чистой кровопотере в
экспериментах с восполнением как физ.раствором, так и гепаринизированной
аутокровью наблюдались так же
значительные нарушения тканевого
дыхания, о чем свидетельствуют показатели СДГ. Фермент прочно связан с
митохондриальной мембраной , с учетом , что их большее количество
находится в эпителии проксимальных канальцев, мы рассматривали
различные локализации структур почки. При массивной кровопотере во всех
структурах почки отчетливо прослеживалось снижение активности СДГ,
достигавшее наибольшей глубины к 4 суткам и сохранявшееся к концу 30
суток.
Диаграмма № 1. Активность фермента СДГ во 2 экспериментальной
серии (острая массивная кровопотеря).
13
При сравнительном анализе активности фермента СДГ во всех сериях
отмечается ранний подъем показателей в V экспериментальной группе (при
восполнении массивной кровопотери перфторуглеродной эмульсией
«Перфторан»). Это свидетельствует о меньшем повреждении
структур почки в этой серии экспериментов, что очевидно связано с
газотранспортной функцией перфторана.
Уже на 4 сутки в этой серии отмечалось частичное восстановление
активности фермента. А к 14 сутки показатели активности фермента
приближались к контрольным значениям, что свидетельствует о
компенсаторных реакциях и более ранней репарации поврежденных
структур. Самые низкие показатели активности СДГ отмечены к 14 суткам во
II серии (при массивной кровопотере (50% ОЦК) и в IV серии ( при
восполнении утраченной крови гепаринизированной аутокровью), что
говорит о слабом восполнении кровопотери, возможно это связано с
образованием «микросвертков» в гепаринизированной аутокрови.
В
эпителии этих канальцев развиваются атрофические и дистрофические
процессы, что сопровождается снижением уровня активности ферментов,
однако обнаруживались канальцы и с высокой энзиматической активностью,
что свидетельствует о функциональном напряжении части нефронов,
направленных на компенсацию деятельности атрофированных нефронов.
Нарушение активности СДГ сочеталось с угнетением другого
митохондриального фермента - НАД-диафоразы. Активность фермента была
умеренной в 3 серии, более сниженной при перфузии аутокровью(4 серия) и
наиболее высокой у крыс 5 серии (перфузия перфтораном). О повреждении
митохондрий (косвенно) судили
так же по количеству и характеру
14
отложений гранул диформазана или диффузии продукта реакции НАДдиафоразы и СДГ (Гайер Г.,1974; Ленинджер А., 1976). Митохондриальные
нарушения при гипоксии - это фазный процесс, зависящий от тяжести и
длительности гипоксического воздействия. Таким образом, изменения в
составе адениннуклеотидов играют ведущую роль в каскаде метаболических
нарушений при гипоксии, а нарушения функции митохондриальных
ферментных комплексов являются базисным механизмом гипоксии.
Положительный эффект, обусловленный доставкой кислорода к клеткам,
регистрируется только в условиях интактности дыхательной цепи. Причем,
его концентрация должна быть оптимальной, так как высокие концентрации
кислорода обладают токсическим действием (Л.Д.Лукьянова, 2001).
Массивная кровопотеря ведет к развитию анемической, а затем
циркуляторной и тканевой гипоксии. Ограничивается доставка кислорода к
клеткам, где он участвует в реакциях аэробного образования энергии, являясь
субстратом терминального фермента митохондриальной дыхательной цепи –
цитохромоксидазы. Тканевая гипоксия – это подавление потребления
кислорода (дыхания) на терминальном цитохром оксидазном участке.
Угнетается НАД-оксидазный путь окисления и сопряженное с ним
окислительное фосфорилирование. Это отражает первую компенсаторную
фазу биоэнергетической гипоксии. Положительный эффект, обусловленный
доставкой кислорода к клеткам, регистрируется только в условиях
интактности дыхательной цепи, о чем свидетельствуют данные наших
экспериментальных исследований. Во всех экспериментальных сериях в
первые сутки после массивной кровопотери отмечалась различная
интенсивность снижения активности фермента. Лишь в IV и V сериях
активность незначительно снижалась. К 7 суткам отмечается подъем
активности фермента в III, IV и V сериях.
Проведенные нами экспериментальные исследования убедительно
свидетельствуют о выраженных морфологических и энзимогистохимических
измениях в клубочковом и тубулярном аппарате почек при острой
массивной (50% ОЦК) кровопотере.
15
Таблица № 3.
Сравнительная активность фермента НАД во всех
экспериментальных сериях.
Структуры почки
ПК
ДК
СТ
Статистический показатель
I серия - контроль
1 сутки
II серия
III серия
IV серия
V серия
4 сутки
II серия
III серия
IV серия
V серия
7 сутки
II серия
III серия
IV серия
V серия
14 сутки
II серия
III серия
IV серия
V серия
30 сутки
II серия
III серия
IV серия
V серия
М± σ
0,9±0,09
0,67±0,02
0,42±0,08
0,38±0,01
0,77±0,05
0,96±0,02
0,93±0,09
0,41±0,08
0,89±0,05
0,87±0,06
1,48±0,03
0,56±0,03
0,7±0,05
1,34±0,01
1,11±0,06
0,75±0,09
0,93±0,05
1,2±0,07
1,2±0,09
1,04±0,06
0,89±0,07
М± σ
0,7±0
0,61±0,03
0,38±0,08
0,47±0,09
0,8±0,07
0,47±0,09
0,47±0,08
0,55±0,06
0,6±0,08
0,84±0,03
1,18±0,06
0,79±0,09
0,68±0,05
0,98±0,02
0,91±0,08
0,5±0,07
0,67±0,06
0,97±0,05
0,9±0,04
1,04±0,02
0,68±0,05
М± σ
0,79±0,08
0,39±0,02
0,6±0,04
0,43±0,06
0,79±0,03
0,71±0,04
0,77±0,07
0,32±0,03
1,71±0,05
0,83±0,06
0,97±0,02
0,78±0,06
0,87±0,03
0,97±0,05
0,41±0,09
0,77±0,05
0,73±0,08
0,91±0,06
1,1±0,04
1,18±0,05
0,78±0,06
Петля
Генле
М± σ
0,53±0,08
0,32±0,02
0,39±0,03
0,57±0,02
0,57±0,06
0,35±0,08
0,51±0,09
0,4±0,02
0,47±0,09
0,48±0,06
0,6±0,07
0,75±0,04
0,73±0,06
0,57±0,09
0,58±0,04
0,67±0,03
0,49±0,05
0,77±0,06
0,72±0,09
1,12±0,08
0,48±0,07
М – показатель среднестатистический, σ - среднеквадратическое
отклонение, р - разница по сравнению с соответствующим показателем
интактной (контрольной) серии , достоверна (р<0,005).
В ходе проведенных исследований, во все сроки, была отмечена
низкая активность фермента НАДФ – диафоразы. Отмечались низкие
показатели активности фермента во II и в IV сериях, что подтверждает наши
данные о том, что кровь, извлеченная из сосудистого русла, теряет свои
нативные свойства. В этом случае она представляет собой суспензию,
состоящую
из
микросгустков,
тромбоцитов
и
неполноценно
функционирующих эритроцитов (Воробьев А.И. 2003). В первые четверо
суток отмечалась низкая активность НАДФ-диафоразы во II и III сериях
эксперимента. В IV серии наблюдалось снижение активности фермента к 7
суткам и ее повышение, начиная с 14 суток. Компенсация гемопоэза в
16
дальнейшем вела к восстановлению окислительных процессов. Активность
НАДФ-диафоразы в 5 серии была умеренно снижена на всем протяжении
эксперимента, но оставалась наиболее высокой среди всех серий.
Такое поведение митохондриальных ферментов, по-видимому,
отражает первую компенсаторную фазу биоэнергетической гипоксии.
Положительный эффект, обусловленный доставкой кислорода к клеткам,
регистрируется только в условиях более сохраненной дыхательной цепи, как
при перфузии перфтораном.
При исследовании ГДГ, фермента азотистого обмена, наблюдали
торможение гликолитической активности постмитохондриальной фракции
ишеминизированной ткани
почек в мозговом слое (собирательных
трубочках), наиболее выраженное в 4 серии, так и не достигающее уровня
контроля к 30 суткам.
Н.М.Назаренко (1989) в опытах на кроликах при острой кровопотере
указала, что в условиях гипоксии происходит угнетение тканевого дыхания в
печени, почках выражено в неодинаковой степени. На примере активности
ГДГ,
мы
наблюдали
торможение
гликолитической
активности
постмихондриальной фракции ишеминизированной ткани почек.
Так, мы наблюдали снижение показателей активности фермента ГДГ в
различных сериях экспериментов. Но отмечаем максимальное снижение
активности в IV серии.
В III, IV экспериментальной серии (при
восполнении
массивной
кровопотери
гепаринизированной
аутокровью), кроме снижения показателей активности ГДГ, мы отмечали
количественное
угнетением
активности
всех
окислительновосстановительных ферментов, что говорит об утилизации кислорода и
снижении анаэробного гликолиза.
Диаграмма № 2. Сравнительная активность фермента ГДГ во всех
экспериментальных сериях.
17
Об углеводном обмене судили по активности фермента гликолиза и
гликогенолиза: ЛДГ. Механизм повышения гликолитических процессов в
первые сроки экспериментов можно объяснить активацией симпатикоадреналовой системы в результате стрессовой реакции - выбросом в кровь
катехоламинов, которые стимулируют фосфорилазу и липазы (А.
Ленинджер,1976).
М.В. Биленко (1988) отмечает, что при ишемии почки происходит рост
активности ЛДГ в лимфе, оттекающей от почки. По данным Szabo, Maqyar
(1982), после 30 – минутной ишемии почки значительно возрастала
концентрация ЛДГ в почечной лимфе и моче. Авторы полагают, что на
основании изменений активности ферментов почечной лимфы и мочи можно
сделать вывод относительно ишемического поражения почек.
В структурах почек во всех сериях эксперимента в первые сутки
отмечалось повышение активности ЛДГ, фермента гликолиза. Однако к 4
суткам активность ЛДГ во 2 и 3 серии значительно снижалась, что, очевидно,
связано с деструкцией эпителия канальцев. В 4 и 5 сериях наблюдалась
более высокая активность ЛДГ, что по-видимому, обусловлено
присоединением процессов гликолиза в условиях умеренной гипоксии,
которая обеспечивалась сохранявшимся газотранспортом за счет аутокрови
или перфторана.
18
Диаграмма № 3. Сравнительная активность фермента ЛДГ во всех
экспериментальных сериях.
При оценке активности Г-6-ФДГ отмечается различная активность
фермента. Во всех серия в первые 4 суток наблюдалось снижение активности
Г-6-ФДГ. Снижение активности во всех структурах почки наблюдаем при
массивной кровопотере, где показатели активности так и не достигают
контрольных значений к 30 суткам. Снижение активности Г6ФДГ так же
создает условия для окисления НАДН и ЛДГ, что сопровождается
восстановлением пировиноградной кислоты в молочную. Различная
активность фермента указывает на возрастание роли пентозного цикла в
метаболизме углеводов, от чего зависела степень развития дистрофических
изменений.
Таблица № 4. Сравнительная активность фермента Г6ФДГ во всех
экспериментальных сериях.
Структуры почки
ПК
ДК
СТ
Статистический показатель
I серия - контроль
1 сутки
II серия
III серия
IV серия
М± σ
0,22±0,02
0,13±0,02
0,27±0,02
0,13±0,08
М± σ
0,28±0
0,19±0,05
0,27±0,06
0,22±0,05
М± σ
0,29±0,08
0,15±0,02
0,17±0,03
0,18±0,05
19
Петля
Генле
М± σ
0,33±0,09
0,19±0,09
0,16±0,05
0,16±0,05
4 сутки
7 сутки
14 сутки
30 сутки
V серия
II серия
III серия
IV серия
V серия
II серия
III серия
IV серия
V серия
II серия
III серия
IV серия
V серия
II серия
III серия
IV серия
V серия
0,14±0,05
0,11±0,05
0,18±0,04
0,29±0,06
0,20±0,05
0,15±0,06
0,20±0,08
0,19±0,09
0,21±0,07
0,17±0,02
0,16±0,04
0,19±0,03
0,20±0,08
0,14±0,09
0,12±0,08
0,06±0,06
0,20±0,05
0,20±0,07
0,19±0,04
0,21±0,06
0,21±0,08
0,24±0,09
0,23±0,05
0,25±0,09
0,25±0,05
0,3±0,4
0,20±0,05
0,17±0,08
0,16±0,08
0,2±0,09
0,21±0,05
0,22±0,09
0,19±0,05
0,27±0,06
0,17±0,06
0,16±0,08
0,17±0,06
0,25±0,08
0,18±0,04
0,23±0,04
0,29±0,02
0,32±0,08
0,21±0,05
0,16±0,05
0,08±0,06
0,09±0,05
0,27±0,09
0,19±0,06
0,18±0,05
0,18±0,06
0,29±0,03
0,17±0,08
0,17±0,05
0,21±0,06
0,2±0,08
0,22±0,09
0,19±0,03
0,27±0,09
0,27±0,08
0,30±0,04
0,2±0,05
0,15±0,08
0,16±0,01
0,33±0,04
0,18±0,08
0,24±0,06
0,13±0,04
0,33±0,09
М – показатель среднестатистический, σ - среднеквадратическое
отклонение, р - разница по сравнению с соответствующим показателем
интактной (контрольной) серии , достоверна (р <0,005).
Темпы восстановления активности различных ферментов варьируют. В
различных отделах нефрона и собирательных трубочках также отмечаются
различные неодинаковая скорость восстановления активности и щелочной
фосфатазы. Так, по данным В.Б.Брин (1983), через 1 час после ишемии почки
у щенков происходило увеличение активности щелочной фосфатазы в
эпителиальных клетках канальцев у 20- дневных щенков, а у 3- х месячных снижалась.
Исследование ЩФ выявило неравномерную активность фермента. У
животных,
подвергшихся
кровопотере
с
перфузией
различными
кровезамещающими растворами, развивались изменения двоякого характера. В
канальцах почек во всех сериях опыта активность фермента снижалась и носила
мозаичный характер, что отражало различную степень повреждения эпителия.
В строме почек разных серий также отмечалось различие активности ЩФ, что,
по-видимому, было обусловлено развитием компенсаторных процессов в виде
огрубение стромы из-за коллагеногенеза. Восстановления активности ЩФ в
эпителии канальцев отмечалось на 4 сутки при перфузии перфтораном,
активность фермента в строме была невысокой, что также свидетельствовало
о сохранности стромы.
20
Диаграмма № 19. Сравнительная активность фермента ЩФ во всех
экспериментальных сериях.
При микроскопическом исследовании почек во 2 серии с первых суток
отмечались дистрофические изменения проксимальных и дистальных
канальцах в виде умеренной вакуольной и жировой дистрофии, слущивание
эпителиальных клеток в просвет канальцев. К 7 суткам в просвете канальцев
отмечались обрывки поврежденного и некротизированного эпителия. К 14
суткам наблюдали участки пролиферации фибробластов и отложение извести
в участках некроза эпителия проксимальных извитых канальцев. На 30 сутки
отмечалась пролиферация интерстициальных клеток между канальцами с
последующим очаговым разрастанием соединительной ткани.
В сериях эксперимента с восполнением кровопотери дистрофические и
некробиотические изменения канальцев почек зависели от вида
кровезамещающего раствора и были менее выражены, чем во 2 серии.
Перфузия физиологическим раствором и гепаринизированной аутокровью
сопровождалась менее грубыми изменениями в структурах почек, однако
наибольшая сохранность канальцев и более выраженные репаративные
процессы были отмечены при перфузии перфтораном.
Таким образом, удалось установить общие закономерности и
морфогенетические особенности репаративного процесса в различных
структурах почек при массивной кровопотере и перфузии различными
кровезамещающими растворами. Полученные данные свидетельствуют о
преимуществе перфторана перед другими кровезаменителями, что позволяет
рекомендовать
его
для
дальнейших
исследований
в
области
гемотрансфузиологии и реаниматологии.
21
Выводы:
1. Острая массивная кровопотеря вызывает глубокие нарушения
энергетического обмена, что ведет к структурным изменениям нефрона и
собирательных трубочках, проявляющимся дистрофией и некрозом эпителия
канальцев, а в более поздние сроки отложением солей кальция и
формированием соединительной ткани в участках повреждения.
Дисэнзиматические нарушения в нефроне сохраняются в отдаленном
периоде.
2. Перфузия физиологическим раствором при острой массивной
кровопотере не обеспечивает в полной мере восстановление кровотока и
поддержание тканевого метаболизма на необходимом уровне, что
документируется угнетением активности окислительно-восстановительных
ферментов с развитием дистрофических и некротических изменений
изучаемых структур почек.
3.
Восполнение кровопотери гепаринизированной аутокровью
сопровождается выраженным угнетением активности окислительновосстановительных ферментов, замедленным восстановлением их активности
и, как следствие, длительно сохраняющимися морфологическими
изменениями тубулярного и клубочкового аппарата почек. При
сравнительной оценке в этой серии сохраняются некоторые нарушения
метаболизма почек после массивной кровопотерей.
4.
Газотранспортная функция «Перфторана»
поддерживает
достаточно высокий уровень энергетического обмена в гистологических
структурах почки, что снижает альтеративные изменения и способствует
раннему развитию репаративных процессов.
5. Сравнительный анализ использования различных кровезаменителей
показывает, что полифункциональный кровезаменитель «Перфторан»
оказывает наибольшее протекторное действие на структуры почки в условия
острой массивной кровопотери.
Практические рекомендации
1. Полученные результаты проведенных исследований могут стать
основой
для
последующих
клинико-экспериментальных
исследований.
2.
Полученные сведения рекомендуются для использования в
учебном процессе в медицинских ВУЗах.
3.
Детальное и углубленное исследование морфологических и
энзимогистохимических изменений в почках при массивной
22
кровопотере и восполнении различными кровезамещающими
растворами позволяют научно обосновать и рекомендовать
использование
перфторана
в
комплексе
противошоковых
мероприятий у больных с массивной кровопотерей.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации
1. А.М.Голубев, Ф.А.Тамаева. Исследование активности дегидрогеназ в
нефроцитах при острой массивной кровопотере и ее возмещении.
//Материалы Российской научной конференции «Перфторуглеродные
соединения в экспериментальной и клинической медицине», СанктПетербург, 2004, с.
2. Ф.А.Тамаева,
А.М.Голубев,
А.С.Алкадарский
.Исследование
метаболических изменений в почках при массивной кровопотере . //Ж.
«Современные наукоемкие технологии», М., 2005, №5 , с. 65-68.
3. Ф.А.Тамаева, А.М.Голубев, А.С.Алкадарский. Изучение характера
метаболических изменений в структуре почек при массивной кровопотере
и ее коррекции
кровезамещающими растворами. //Материалы
межвузовской научной конференции с международным участием.
«Современные проблемы морфологии», Махачкала, 2005, с. 142-144.
4. Ф.А.Тамаева, А.М.Голубев, А.С.Алкадарский. Гистоэнзиматическое
исследование структур нефрона при массивной кровопотере и при
коррекции
различными
кровезаменителями.
//Материалы
республиканской научно- практической конференции, посвященной 90летию со дня рождения проф. М.М.Максудова. Махачкала, 2006, с. 242244.
5. Ф.А.Тамаева, А.М.Голубев, А.С.Алкадарский . Характеристика различных
отделов нефрона при массивной кровопотере. // Ж. «Современные
наукоемкие технологии», М., 2006, №6, с. 89 -90.
6. Ф.А.Тамаева, А.М.Голубев, А.С.Алкадарский . Изучение характера
метаболических изменений в структуре почек при массивной кровопотере
и ее коррекция кровезамещающими растворами.//Материалы 4-й научнопрактической конференции "Новое в хирургии Дагестана».- Махачкала,
2006, с. 166-167.
7. А.М.Голубев, Ф.А.Тамаева. Коррекция метаболических нарушений в
почках при острой массивной кровопотере. Ж. «Общая реаниматология»,
2007, III, 5 -6, с. 38-42.
23
24
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа