close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Изучение эффективности средств растительного происхождения при токсических поражениях печени в условиях повышенной физической нагрузки

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
ПЕЧЕНКИНА Ирина Геннадьевна
ИЗУЧЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ СРЕДСТВ РАСТИТЕЛЬНОГО
ПРОИСХОЖДЕНИЯ ПРИ ТОКСИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЯХ ПЕЧЕНИ В
УСЛОВИЯХ ПОВЫШЕННОЙ ФИЗИЧЕСКОЙ НАГРУЗКИ
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва - 2015
Работа выполнена в НИИ Фармации ГБОУ ВПО Первый Московский государственный
медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздрава России (ГБОУ ВПО ПМГМУ
им. И.М. Сеченова Минздрава РФ).
Научный руководитель:
кандидат биологических наук
Козин Сергей Валерьевич
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук,
Ученый секретарь
ГАУЗ «Московский научно-практический
центр медицинской реабилитации,
восстановительной и
спортивной медицины ДЗМ»
Доктор медицинских наук, доцент,
заведующий отделом № 6
ФГБУ Государственного научного
центра РФ Федерального медицинского
биофизического центра
им. А.И. Бурназяна ФМБА России
Рожкова Елена Анатольевна
Алехнович Александр Владимирович
Ведущая организация: ОАО «Всероссийский научный центр по безопасности биологических активных веществ» (ОАО «ВНЦ БАВ»)
Защита состоится « » ………………. 2015 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.001.024.01, созданного на базе ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» по адресу: 125315 Москва, ул. Балтийская, д.8.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ученой части ФГБНУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова», по адресу: 125315 Москва, ул. Балтийская, д.8 и на сайте
www.academpharm.ru
Автореферат разослан «
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор медицинских наук,
профессор
»
2015 г.
Вальдман Елена Артуровна
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Последнее время в общей структуре заболеваний значительную долю занимают патологии гепатобилиарной системы. Одной из наиболее распространенных причин данных заболеваний являются воздействия гепатотоксических агентов
(Шульпекова Ю.О., 2010; Kondo K. et al., 2012; Sarkar C. et al., 2014). К ним относятся многие
лекарственные препараты, алкоголь, вещества, загрязняющие окружающую среду и др. Помимо токсических поражений отрицательное влияние на печень могут оказывать также другие неблагоприятные факторы, в частности, интенсивная физическая нагрузка (Pettersson J. et
al., 2007; Kan N.-W. et al., 2013; Davies K.J. et al., 1982).
В работах ряд авторов (Михайлов С.С., 2004; Huang C.C.et al., 2013; Vina J. et al.,
2000; Yoon Mi.Y. et al., 1997) показано, что функциональная нагрузка на печень, а следовательно, и тяжесть ее токсических поражений, увеличивается в условиях повышенной физической нагрузки. Ввиду того, что широкий круг специалистов (спортсмены, военнослужащие, работники сельского хозяйства и промышленности, персонал аварийно-спасательных
формирований и т.д.) подвергается воздействию профессиональных экстремальных факторов
и не изолированы от контактов с гепатотоксическими веществами, можно предположить, что
в формировании патологических процессов в печени участвуют оба этих фактора. В свою
очередь, нарушение функциональной сохранности печени снижает физическую работоспособность и выносливость организма, тем самым формируя «порочный круг».
В связи с этим, изыскание методов профилактики и лечения токсических поражений
печени на фоне повышенной физической нагрузки с одновременным сохранением физической выносливости является актуальной задачей современной медицины и фармакологии в
частности.
Одним из способов решения данной проблемы является применение ряда фармакологических средств, повышающих неспецифическую резистентность и адаптационные возможности организма, названных Н.В. Лазаревым адаптогенами (Лазарев Н.В. и др., 1959).
Среди них особое внимание стоит уделить препаратам растительного происхождения – фитоадаптогенам (женьшень, элеутерококк, родиола розовая и др.). Основными преимуществами этой группы препаратов являются низкая токсичность и высокая безопасность даже при
длительном систематическом применении, а также возможность их превентивного использования (Брехман И.И., 1969; Лупандин А.В., 1990; Синяков А.Ф., 1990; Смагулова Т.Б., 2013).
В ряде экспериментов, фитоадаптогены доказали свою безопасность и высокую эффективность в отношении различных ядов, обладающих разнонаправленным токсическим
действием на организм (Марина Т.Ф., Прищеп Т.П., 1964; Молоковский Д.С., 1990; Alhassan
M.S.et al., 2009; Glenn C., Gum S.I. et al., 2007; Feldman S.R., 2011; James L.P.et al., 2003; Wu
Y.L. et al., 2009 и др.).
В настоящей экспериментальной работе в качестве объектов исследования были выбраны хорошо известные фитоадаптогены (элеутерококк и женьшень), протекторные свойства которых в отношении различных повреждающих агентов были изучены ранее (Брехман
4
И.И., Дардымов И.В., 1966; Водолазский Ю.В., 2000; Дардымов И.В., 1973; Дардымов И.В.,
1976; Симонова Н.В., 2004; Park E.J. et al., 2004; Yokozawa T. et al., 2003). Однако до сих пор
эти исследования проводились преимущественно в условиях воздействия только одного экстремального фактора. Оценка протекторного действия фитоадаптогенов при сочетанном воздействии направленного гепатотоксического агента, такого как четыреххлористый углерод,
на фоне повышенной физической нагрузки не проводилась.
Цель исследования - экспериментальное изучение эффективности применения настойки женьшеня и экстракта элеутерококка при токсических поражениях печени в условиях
повышенной физической нагрузки.
Задачи исследования:
1. Выявить различия в токсическом действии гепатотоксина на экспериментальных животных в условиях относительного функционального покоя и при повышенной физической
нагрузке.
2. Изучить возможность предупреждения CCL4-индуцированных нарушений физической
выносливости при курсовом применении настойки женьшеня, экстракта элеутерококка и
препарата сравнения, карсила.
3. Изучить гепатопротекторную активность настойки женьшеня и экстракта элеутерококка по сравнению с карсилом (препарат сравнения), по ряду биохимических, энзимологических, гистоморфологических, гистохимических показателей.
4. С помощью иммуногистохимического исследования выявить изменения содержания
фермента NO-синтазы 2 и цитокина TNF-α при CCL4-индуцированных поражениях печени
на фоне повышенной физической нагрузки и изучить их значение в реализации гепатопротекторного действия исследуемых препаратов.
Научная новизна. Впервые проведено исследование гепатопротекторного действия настойки женьшеня и экстракта элеутерококка в условиях комплексного воздействия токсического повреждения печени гепатотропным ядом CCL4 и повышенной физической нагрузки
на мышах. Физическая нагрузка выступила в роли не только дополнительного повреждающего агента, наряду с гепатотоксином, но и в качестве интегрального показателя состояния
здоровья экспериментальных животных.
В комплексном исследовании морфологического и функционального состояния печени
мышей с оценкой биохимических, энзимологических, гистоморфологических, иммуногистохимических показателей выявлено, что повышенная физическая нагрузка усиливала тяжесть
токсического поражения печени экспериментальных животных четыреххлористым углеродом. Ежедневное введение настойки женьшеня 47 мг/кг и экстракта элеутерококка 48,5 мг/кг
(в пересчете на сухой остаток) в течение 5 недель оказывало гепотопротекторный эффект в
условиях сочетанного воздействия CCL4 и повышенной физической нагрузки сопоставимый
с эффектом препарата сравнения - карсила.
В иммуногистохимическом исследовании впервые изучено влияние тетрахлорметана,
физической нагрузки, исследуемых препаратов на количественный уровень фермента NOсинтазы 2 и цитокина TNF-α в условиях данной экспериментальной модели. Установлено
5
повышенное содержание NOS2 и TNF-α в печени после воздействия CCL4 , возрастающее
при сочетании с интенсивной физической нагрузкой. Показано, что настойка женьшеня и
экстракт элеутерококка при курсовом применении в течение 5 недель препятствуют повышению NOS2 и TNF-α в печени.
Научно-практическая значимость. С использованием различных методических подходов получены данные, подтверждающие потенцирование гепатотоксического действия четыреххлористого углерода повышенной физической нагрузкой.
Полученные экспериментальные данные о наличии у экстракта элеутерококка и настойки
женьшеня гепатопротекторных свойств в отношении комплексного повреждающего действия на печень подострой интоксикации тетрахлорметаном и повышенной физической нагрузки создают основу для дальнейшего исследования с целью расширения показаний их
клинического применения.
Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы ГБОУ ВПО
Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по теме: «Развитие научных и научнометодических основ, базовых и инновационных подходов при разработке, внедрении и применении лекарственных средств»; номер государственной регистрации 01201261653.
Положения, выносимые на защиту:
1. При сравнительной оценке динамики массы экспериментальных животных, ряда
биохимических, энзимологических, гистоморфологических и гистохимических показателей
установлено, что повышенная физическая нагрузка в виде еженедельного плавания до полного утомления с грузом 7 % от массы тела животного увеличивает тяжесть токсических повреждений ткани печени тетрахлорметаном.
2. Ежедневное введение в течение 5 недель настойки женьшеня 47 мг/кг и экстракта
элеутерококка 48,5 мг/кг (в пересчете на сухой остаток) в условиях сочетанного воздействия
на печень гепатотоксина – CCL4 и повышенной физической нагрузки оказывает выраженный
гепатопротекторный эффект, сопоставимый с таковым при применении препарата сравнения
– карсила.
3. Экспериментально установлено, что CCL4-индуцированное поражение печени приводит к повышению содержания фермента NOS2 и цитокина TNF-α в печени, а интенсивная
физическая нагрузка усугубляет этот процесс.
4. Введение настойки женьшеня 47 мг/кг и экстракта элеутерококка 48,5 мг/кг (в пересчете на сухой остаток) (ежедневно в течение 5 недель) предупреждают накопление как
фермента NOS2, так и цитокина TNF-α.
Личный вклад автора. Автор провел анализ отечественной и зарубежной литературы по теме диссертационной работы, самостоятельно выполнил экспериментальную часть
исследования. При активном участии автора были проведены гистологическое, гистохимическое, иммуногистохимическое исследования ткани печени экспериментальных животных.
Непосредственно автором выполнена статистическая обработка, описание и анализ полученных результатов, сформулированы выводы и научно-практические рекомендации. Публика-
6
ции по основным положениям диссертационной работы подготовлены при активном участии
автора.
Апробация работы. Основные результаты исследования представлены на научнопрактическом семинаре «Использование этно-медицинских практик народов Тувы в создании лекарственных препаратов и биологически активных добавок» (декабрь 2012 г., Москва); на первой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации» (ноябрь 2013 г., Санкт-Петербург); на XX международной научно-практической конференции «Научная дискуссия: Вопросы медицины» (декабрь
2013 г., Москва); на X Международной научно-практической конференции «Современная
европейская наука - 2014» (июль 2014 г., Шеффилд); на Международной научнопрактической конференции «Роль медицины в развитии общества» (август 2014 г., Уфа); на
расширенном заседании лаборатории биологически активных соединений НИИ Фармации
ПМГМУ им. И.М. Сеченова (28 октября 2014 г., Москва).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 7 статей, в том
числе - 4 в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации для публикации научных результатов диссертаций, 3 статьи и 5 тезисов в материалах российских и международных конференций.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 130 страницах печатного текста. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования,
двух глав собственных исследований, заключения, выводов, научно-практических рекомендаций и списка литературы, включающего 91 отечественных и 113 зарубежных источников.
Работа содержит 8 таблиц и 32 рисунка.
Материалы и методы исследования
Исследования проведены на белых беспородных мышах-самцах массой 20-25 гр., полученных из питомника лабораторных животных «Андреевка» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России (Московская обл.). Экспериментальные животные содержались в условиях вивария при
12-часовом световом режиме со свободным доступом к воде и стандартному корму (ГОСТ Р
9.804-2006 и РД-АПК 3.10.07.02-09). Все эксперименты проведены в соответствии с правилами лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ №
51000.3-96 и 51000.4-2008, ГОСТ Р-53434-2009) и Приказом МЗ и СР РФ № 708н от
23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» и с соблюдением правил и
Международных рекомендаций Европейской конвенции о защите позвоночных животных,
используемых для экспериментов или в иных научных целях от 18.03.1986 г. (в соответствии
с Протоколом ETS № 170 от 2.12.2005 г.). Подопытные мыши были разделены на 7 групп
(см. Таблицу 1).
В работе были использованы официнальные стандартизованные жидкие (спиртовые)
экстракт элеутерококка (серия № 221113) и настойка корней женьшеня (серия № 020913)
производства ЗАО «ВИФИТЕХ» (г. Москва). Для исключения влияния алкоголя на организм
экспериментальных животных, непосредственно перед введением препараты упаривали на
роторном испарителе при 37°С под вакуумом и разводили в дистиллированной воде.
7
Таблица 1.Схема проведения экспериментального исследования гепатопротекторного действия препаратов элеутерококка, женьшеня и карсила при подострой
интоксикации CCL4 на фоне повышенной физической нагрузки.
№ группы/
название
введение экстракта элеутерококка
48,5 мг/кг (в
пересчете на
сухой остаток)
с 1-5 неделю
введение
настойки
женьшеня,
47 мг/кг (в
пересчете
на сухой
остаток) с
1-5 неделю
введение
карсила,
100 мг/кг с
1-5 неделю
введение
10% раствора CCL4,30
мл/кг с 3-5
неделю
физическая нагрузка,
плавание
с 1-5 неделю
1.Пассивный
Контроль
2. Пассивный
+
Контроль (ФН)
3.Активный Кон2р/неделю
троль (CCL4)
4. Активный Кон2р/неделю
+
троль (CCL4+ФН)
5.Карсил
ежедневно 2р/неделю
+
6.Элеутерококк
ежедневно
2р/неделю
+
7.Женьшень
ежедневно
2р/неделю
+
Деалкоголизированные экстракт элеутерококка и настойку женьшеня в виде водной
взвеси вводили внутрижелудочно через зонд в дозах 48,5 мг/кг и 47 мг/кг (в пересчете на сухой остаток) соответственно (доза по объему для обоих жидких препаратов составила 2,5
мл/кг) (Брехман И.И., 1968; Брехман И.И., 1969; Крендаль Ф.П. и др., 2007; Молоковский
Д.С., 2004). В качестве препарата сравнения согласно рекомендациям Руководства по проведению доклинических исследований лекарственных средств (под ред. А.Н. Миронова и
соавт., 2012) был взят препарат с доказанным гепатопротекторным действием – карсил
(производства «Софарма», Болгария, серия № 2450613), в дозе 100 мг/кг, который также вводился внутрижелудочно через зонд в виде водной взвеси.
Животные групп «Элеутерококк», «Женьшень», «Карсил» ежедневно внутрижелудочно получали исследуемые препараты и препарат сравнения соответственно в течение
двух недель перед началом интоксикации, а также в течение последующих трех недель на
фоне введения CCL4. Гепатотоксин (10 % раствор CCL4 на оливковом масле комнатной температуры) вводили мышам внутрижелудочно в дозе 30 мл/кг (в пересчете на масляный раствор) 2 раза в неделю в течение трех недель (6 введений с 3ей по 5ую экспериментальную
неделю). Группы «Пассивный Контроль» и «Пассивный Контроль (ФН)» получали внутрижелудочно эквивалентные объемы дистиллированной воды и оливкового масла вместо исследуемых препаратов и токсина соответственно, группы «Активный Контроль (CCL4)» и
«Активный Контроль (CCL4+ФН)» - воду и масляный раствор CCL4. На фоне введения препаратов и токсина все группы экспериментальных животных, за исключением групп «Пассивный Контроль» и «Активный Контроль (CCL4)», подвергались еженедельному плаванию
до полного утомления с грузом 7 % от массы тела животного при температуре воды 28 °С.
Использованные нами методики исследований различных показателей, характеризующих
8
гепатопротекторное действие изучаемых препаратов, изложены в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (под ред. А.Н. Миронова и соавт.,
2012), а также в специальных руководствах.
Оценка физической выносливости (ФВ) экспериментальных животных проводилась по показателю продолжительности плавания животных с грузом 7% от массы тела животного до полного утомления (Раднаева Д.Б., 2009; Чубарев В.Н., 1987; Tang W. et al., 2008).
Влияние изучаемых препаратов на динамику массы тела и на относительную
массу печени экспериментальных животных взвешивание мышей проводили еженедельно
на протяжении 5-ти недель эксперимента. Забор печени и ее взвешивание проводились сразу
после выведения мышей из опыта на 36-е сутки эксперимента, относительная масса печени
рассчитывалась как отношение массы печени к массе тела мыши в %.
Исследование влияния препаратов элеутерококка и женьшеня на некоторые энзимологические и биохимические показатели сыворотки крови мышей. Определяли активности АЛТ, АСТ, ЩФ содержание общего билирубина, общего холестерина на автоанализаторе Siemens-ADVIA 1800 Chemistry System (Германия), активность ЛДГ определяли на
автоанализаторе Olympus AU 680 (США), по соответствующим методикам, предусмотренным фирмами-изготовителями для этого оборудования.
Концентрацию восстановленного глутатиона (ВГ) в ткани печени экспериментальных животных оценивали с использованием 5,5'-дитиобис(-2-нитробензойной) кислоты (ДТНБ) по методике G.L. Ellman (Ellman G.L., 1959). Пробы фотометрировали на спектрофотометре CARY 100 Scan («Varian», США) против дистиллированной воды при длине
волны 412 нм.
Определение концентрации продуктов ПОЛ (диеновых конъюгатов и малонового
диальдегида (ДК и МДА) в ткани печени экспериментальных животных спектрофотометрически. Концентрацию ДК определяли по методике И.Д. Стальной (Стальная И.Д.,
1977), в модификации С.И. Глушкова (Глушков С.И., 2006). Оценку содержания МДА проводили по спектрофотометрическому тесту с 2-тиобарбитуровой кислотой (Гаврилов В.Б. и
др., 1987).
Для гистоморфологического и гистохимического исследований ткани печени мышей использовали традиционный метод парафиновой заливки. С каждого парафинового блока с помощью микротома готовили 2-3 среза толщиной 3-4 мкм. Гистологические срезы были окрашены следующими гистологическими и гистохимическими методами с соблюдением
стандартных методик: гематоксилином и эозином (Maynard R. et al., 2014), 0,1% сулемовым
раствором бромфенолового синего (Елисеев В.Г. и др., 1967; Hornatowska J., 2005), проводили ШИК-реакцию (Cooksey C., Dronsfield A., 2009).
Иммуногистохимическое исследование ткани печени мышей осуществляли на срезах с парафиновых блоков толщиной 3-4 мкм полимерно-протеиново-пероксидазного метода
с использованием систем визуализации: iVIEW DAB Detection Kit™ (Ventana™, USA);
NOVOLINK™ (Novocastra™, UK) и концентратов первичных моноклональных мышиных
антител: NOS2 (C-11) (Santa Cruz Biotecnology™, USA), TNF-α (52B83) (фактор некроза опу-
9
холи –α (ФНО-α) (Santa Cruz Biotecnology ™, USA) по соответствующим методикам, предусмотренным фирмами-изготовителями. Выявление антигенных эпитопов осуществляли с
помощью хромогена, 3'3-диаминобензидина из набора Ultra View Universal DAB Detection
Kit и DAB Enhancer (Novocastra™, UK). Исследование проводили с помощью иммуностейнера: BenchMark ULTRA™ (Ventana™, USA) с применением Covertile™ технологии (Leica
Biosystems™).
Визуализацию гистологических препаратов осуществляли с использованием микроскопа Nikon Eclipse 50i, микрофотосъемку проводили цифровой фотокамерой Scan Scope
Aperio.Фотографии обрабатывались в программе Aperio Image Scope версия 11.1.2.760. (исследования по гистоморфологии и иммуногистохимии проведены совместно с к.м.н. Булановым Д.В. на базе гистологической лаборатории Европейского медицинского центра).
Статистическую обработку результатов исследования проводили на персональном компьютере с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Exсel 2010».
Достоверность отличий с соответствующими контрольными группами оценивали по tкритерию Стъюдента, (р≤0,05), за исключением бальной оценки морфологических признаков
патологии печеночной ткани, где проверка достоверности отличий результатов проводилась
по U-критерию Уилкоксона-Манна-Уитни (р ≤ 0,05) (Герасимов А.Н., 2007).
Результаты исследования и их обсуждение
Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на интегральные показатели состояния здоровья мышей.
Физическая выносливость (ФВ) экспериментальных животных. Экспериментальные животные, не получавшие CCL4 (группа «Пассивный Контроль (ФН)»), на 1-й недели
эксперимента продемонстрировали повышение продолжительности плавания на 9%, на 2-й,
3-й,4-й недели происходило ее снижение на 12%, 24%, 16% соответственно (р≤0,05).
Установлено, что введение тетрахлорметана приводило к резкому достоверному снижению ФВ животных группы «Активный Контроль (CCL4+ФН)», которое продолжалось на
протяжении всего периода введения CCL4. Продолжительность плавания составила к 5-й неделе 29,7% (см. таблицу 2).
Начиная с 1-й недели эксперимента мыши групп «Женьшень» и «Элеутерококк», в
отличие от группы «Карсил», показали достоверное (р≤0,05) увеличение продолжительности
плавания, продемонстрировав выраженное актопротекторное действие (Козин С.В., 1998;
Молоковский Д.С., 2004; Петунова А.Н., 2004; Рябов А.Н., 2008; Huang LZ et al., 2011; Lee
FT et al., 2009).
В ходе эксперимента было выявлено, что курсовое введение исследуемых фитоадаптогенов (ФА) полностью предупреждало CCL4-индуцированное снижение физической работоспособности. Более того, после 2-й недели введения гепатотоксина было зафиксировано
достоверное (р≤0,05) увеличение продолжительности плавания мышей по сравнению с группой «Карсил» (112,7% и 118,3% у животных, получавших элеутерококк и женьшень соответственно). И хотя эти показатели к 5-й неделе эксперимента снижались до 75,9% в группе, по-
10
лучавшей элеутерококк, и 83,5% - женьшень, они не имели статистически значимых различий с «Пассивным Контролем (ФН)» и значительно превышали у мышей группы «Активный
Контроль(CCL4+ФН)» (29,7±7,0 %).
Таблица 2. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на физическую
выносливость мышей при подострой интоксикации CCL4.
Время от
начала
эксперимента,
недели
1
Пассивный
Контроль
(ФН)
Активный
Контроль
(CCL4+ФН)
Карсил
Элеутерококк
Женьшень
109,0±3,1
108,6±4,0
108,7±6,2
120,7±5,0*
122,1±6,2*
2
88,4±4,2
84,9±5,0
90,1±7,9
134,1±6,0*
139,6±7,0*
3
75,6±6,0
33,5±6,2*
60,4±8,6**
74,5±7,0**
82,3±7,7**
4
83,6±7,1
38,0±7,1*
78,8±8,7**
112,7±7,5*,**,#
118,3±8,5*,**,#
5
93,4±8,9
29,7±7,0*
63,3±6,1*,**
75,9±8,7**
83,5±8,6**
Продолжительность плавания в % от исходного значения, M±m, n=12
Примечание: * - достоверное отличие от группы «Пассивный Контроль (ФН)» (р≤0,05);
** - достоверное отличие от группы «Активный Контроль (CCL4+ФН)»
(р≤0,05);
# - достоверное отличие от группы «Карсил» (р≤0,05);
- жирным шрифтом выделены результаты, полученные на фоне введения CCL4.
Изменение динамики массы тела мышей.
На протяжении всего эксперимента в группе «Пассивный Контроль», находящейся в
условиях относительного функционального покоя, наблюдалась стабильная прибавка в массе
мышей (126,92% к 5-й неделе эксперимента). У животных группы «Пассивный Контроль
(ФН)» при выполнении повышенной ФН наблюдалась устойчивая тенденция к уменьшению
прироста массы тела и к 4-й неделе это показатель имел достоверное отличие (р≤0,05) от
группы «Пассивный Контроль» (117,92%) (см. таблицу 3). При введении CCL4 (группа «Активный Контроль (CCL4)») отрицательная динамика данного показателя сохранялась в течение всего периода введения гепатотоксина (с 3й по5ю неделю).
Было выявлено, что сочетание физической нагрузки (ФН) с подострой интоксикацией
тетрахлорметаном вело к более выраженному достоверному (р≤0,05) снижению массы экспериментальных животных, достигая к концу эксперимента 87,62±1,02% и 90,28±0,80% для
групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)» соответственно.
Ежедневное введение как изучаемых препаратов (настойки женьшеня и экстракта
элеутерококка), так и препарата сравнения (карсил), достоверно предупреждало снижение
массы тела мышей при интоксикации CCL4 на фоне повышенной физической нагрузки, причем и элеутерококк, и женьшень по этому действию не уступали препарату сравнения - карсилу (97,40%, 96,87% и 99,50% для групп мышей, получавших женьшень, элеутерококк и
карсил соответственно, к 5-й неделе эксперимента).
Расчет относительной массы печени мышей проводился на основании ее взвешивания на 36-е сутки эксперимента.
11
Было выявлено, что подострая интоксикация CCL4 вызывала у мышей достоверное (р≤0,05)
повышение относительной массы печени по сравнению с животными, не получавшими гепатотоксин почти в 2 раза (см. таблицу 4). Наблюдалось достоверное (р≤0,05) увеличение относительной массы печени мышей в группе «Активный Контроль (CCL4+ФН)» по сравнению с группой «Активный Контроль CCL4», не получавшей ФН (11,04% и 10,07%, соответственно).
Таблица 4. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на относительную
массу печени при подострой интоксикации CCL4 в условиях повышенной физической
нагрузки, M±m, n=12.
Группа экспериментальных
животных
фактическая
масса печени, г
относительная
масса печени, %
Пассивный Контроль
масса тела мыши
в конце эксперимента, г
28,06±0,56
1,53±0,08
5,46±0,27
Пассивный Контроль (ФН)
26,83±0,39
1,44±0,07
5,35±0,22
Активный Контроль (CCL4)
20,77±1,39*
2,09±0,06*
10,07±0,12*,#
Активный Контроль
(CCL4+ФН)
Карсил
20,03±1,49*
2,22±0,07*
11,04±0,10*
22,28±1,66*,**
1,66±0,05*,**
7,45±0,07*,**
Элеутерококк
21,92±1,92*,**
1,66±0,06*,**
7,57±0,10*,**
Женьшень
22,54±1,40*,**
1,67±0,04*,**
7,42±0,08*,**
Примечание: * - достоверное отличие по сравнению с группами «Пассивный Контроль
(ФН)» и «Пассивный Контроль» (р≤0,05);
** - достоверное отличие по сравнению с группами «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и
«Активный Контроль (CCL4)» (р≤0,05);
# - достоверное отличие по сравнению с группой «Активный Контроль (CCL4+ФН)»
(р≤0,05);
Применение женьшеня, элеутерококка и карсила значительно (р≤0,05) снижало изучаемый показатель (7,42%, 7,57%,7,45% соответственно).
Исследование некоторых энзимологических и биохимических показателей сыворотки крови мышей.
В ходе эксперимента было установлено, что у мышей, получавших повышенную ФН,
еженедельное плавание до полного утомления приводило к достоверному (р≤0,05) повышению активности ЛДГ в сыворотке крови (218,9 ед./л и 260,3 ед./л для групп «Пассивный
Контроль» и «Пассивный Контроль (ФН)», соответственно). Также в этих же группах отмечена тенденция к увеличению активности ферментов АЛТ (55,4ед./л и 51,1ед./л) и АСТ
(147,5ед./л и 136,3ед./л), (р≤0,05) (см. таблицу 5).
Подострая интоксикация экспериментальных животных тетрахлорметаном приводила
к значительному повышению ряда энзимологических и биохимических показателей сыворотки крови мышей группы «Активный Контроль (CCL4)» по сравнению с группой, не получавшей гепатотоксин («Пассивный Контроль»): АЛТ в 28 раз, АСТ в 9 раз, ЩФ в 4 раза, ЛДГ
в 2,5 раза, общий билирубин в 4 раза, холестерин более чем в 2 раза.
12
Таблица 3.
Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на динамику массы мышей при подострой интоксикации CCL4 в условиях
повышенной физической нагрузки.
Время от
начала
эксперимента, нед.
Масса животных в % от исходного значения, M±m, n=12.
Пассивный
Контроль
1
104,67±0,61
Пассивный
Контроль
(ФН)
104,40±0,55
Активный Контроль (CCL4)
Карсил
Элеутерококк
Женьшень
105,64±0,44
Активный
Контроль
(CCL4+ФН)
105,08±0,31
105,81±0,51
105,13±0,60
104,83±0,38
2
112,17±0,81
110,20±0,72
111,38±0,72
109,43±0,60
112,51±0,80
111,03±0,63
111,07±0,64
3
117,94±1,29
114,67±1,02
103,8±0,76*
101,35±0,75*
109,04±0,86*,**
106,5±0,71*,**
107,02±0,61*,**
4
122,61±1,09#
117,92±1,07
97,14±0,79*,##
94,71±0,89*
104,26±1,07*,**
99,93±0,90*,**
101,62±0,81*,**
5
126,92±1,43#
121,88±1,21
90,28±0,80*,##
87,62±1,02*
99,50±1,02*,**
96,87±0,95*,**
97,40±0,82*,**
Примечание: * - достоверное отличие от групп «Пассивный Контроль (ФН)» и «Пассивный Контроль» (р≤0,05);
** - достоверное отличие от групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4) (р≤0,05);
# - достоверное отличие от группы «Пассивный Контроль (ФН)» (р≤0,05);
## - достоверное отличие от группы «Активный Контроль (CCL4+ФН) (р≤0,05);
- жирным шрифтом выделены результаты, полученные на фоне введения CCL
13
Важно отметить, что сочетание ФН с интоксикацией CCL4 достоверно (р≤0,05) ведет к более выраженным, чем у затравленных не плававших мышей, нарушениям показателей сыворотки крови: АЛТ - 1533,2 ед./л и 1407,2 ед./л, АСТ - 1266,7 ед./л и 1166,7 ед./л
и ЛДГ - 612,4 ед./л и 536,0 ед./л для групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)».
Лечебно-профилактическое применение настойки женьшеня и экстракта элеутерококка в условиях комплексного воздействия CCL4 и повышенной ФН показало выраженное защитное действие в отношении изучаемых энзимологических и биохимических показателей сыворотки крови мышей. При этом оба изучаемых ФА продемонстрировали по
этим показателям эффективность, сопоставимую с препаратом сравнения – карсилом.
Лишь по показателям АЛТ, ЩФ, холестерин имелись отличия (р≤0,05) между показателями групп «Элеутерококк» и «Карсил» (722,1 ед./л., 373,6 ед./л., 4,8 ммоль/л и 637,4 ед./л.,
293,5 ед./л., 3,7 ммоль/л соответственно) и ЩФ, холестерин – между группами «Женьшень» и «Карсил» (350,6 ед./л. и 4,4 ммоль/л, 293,5 ед./л. и 3,7 ммоль/л). Они не имели
принципиального значения, что подтвердилось остальными использованными в эксперименте тестами.
Влияние изучаемых препаратов на концентрацию ВГ и продуктов перекисного
окисления липидов (ПОЛ) в ткани печени мышей.
В ходе эксперимента нами была отмечена тенденция к снижению уровня ВГ в ткани печени у пассивной контрольной группы мышей, получавшей повышенную физическую нагрузку, «Пассивный Контроль (ФН)».
3-х недельное введение мышам тетрахлорметана приводило к значительному истощению уровня ВГ в гепатоцитах. Его концентрация в печени мышей, получавших тетрахлорметан, снижалась более чем в 2 раза по сравнению с пассивным контролем и составила 5,90±0,14 и 2,35±0,14 мкмоль/г ткани для групп «Пассивный Контроль» и «Активный Контроль (CCL4)» соответственно (см. таблицу 6, рисунок 1). Сочетанное воздействие CCL4 и повышенной ФН приводило к предельному истощению ВГ (1,77 мкмоль/г
ткани). Применение исследуемых фитоадаптогенов хотя и не полностью, но в значительной мере предупреждало снижение ВГ в ткани печени, вызванное введением CCL4 на фоне повышенной ФН. При этом препараты элеутерококка и женьшеня практически не уступали препарату сравнения – карсилу: содержание ВГ в ткани печени составило 4,28,
4,32 и 4,63 мкмоль/г ткани соответственно. В ходе эксперимента нами было зафиксировано, что еженедельное плавание до полного утомления в течение 5-ти недель достоверно
(р≤0,05) приводило к увеличению интенсивности процессов ПОЛ о чем свидетельствовала
более высокая концентрация ДК (22,24 нмоль/ г ткани) в группе «Пассивный Контроль
(ФН)» по сравнению с группой «Пассивный Контроль» (18,27 нмоль/ г ткани) и МДА
(40,48 мкмоль/г ткани и 36,09 мкмоль/г ткани соответственно) (см. рисунки 2 и 3). Также
было выявлено, что подострая интоксикация CCL4 вызывала активацию процессов ПОЛ, о
чем свидетельствовало накопление как начальных продуктов ПОЛ – ДК, так и конечных –
МДА. Так у животных, получавших CCL4 («Активный Контроль (CCL4)»), отмечался рост
14
Таблица 5.
Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на некоторые энзимологические и биохимические показатели сыворотки
крови мышей при подострой интоксикации CCL4 в условиях повышенной физической нагрузки, M±m, n=12.
Показатели
Пассивный
Контроль
Пассивный
Контроль
(ФН)
Активный Контроль (CCL4)
Активный
Контроль
(CCL4+ФН)
Карсил
Элеутерококк
Женьшень
Аланин
аминотранс51,1±1,24
55,4±1,86
1407,2±38,97*,##
1533,2±33,71* 637,4 ±11,96*,** 722,1±26,98*,**,^
703,7±27,17*,**
фераза, ед./л
(АЛТ)
Аспартат
аминотранс136,3±4,28
147,5±4,25
1166,7±29,19*,##
1266,7±41,29* 569,5±13,71*,**
619,9±22,04*,**
613,1±17,64*,**
фераза, ед./л
(АСТ)
Щелочная
фосфатаза,
110,0±9,22
109,3±8,47
481,8±29,75*
479,2±28,66*
293,5±9,57*,**
373,6±13,73*,**,^ 350,6±14,44*,**,^
ед./л (ЩФ)
Лактатдегидрогеназа,
218,9±7,40# 260,3±12,18
536,0±16,57*,##
612,4±13,53*
368,8±20,03*,**
411,5±18,27*,**
408,9±19,85*,**
ед./л (ЛДГ)
Общий билирубин,
5,9±0,4
5,6±0,38
22,5±0,87*
22,3±0,88*
10,9±1,17*,**
13,9±1,09*,**
13,7±1,04*,**
мкмоль/л
Холестерин,
2,82±0,15
2,43±0,12
5,86±0,42*
6,01±0,32*
3,7±0,31*,**
4,8±0,26*,**,^
4,4±0,30*,**,^
ммоль/л
Примечание: * - достоверное отличие от групп «Пассивный Контроль (ФН)» и «Пассивный Контроль» (р≤0,05);
** - достоверное отличие от групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)» (р≤0,05);
# - достоверное отличие от группы «Пассивный Контроль (ФН)» (р≤0,05);
## - достоверное отличие от группы «Активный Контроль (CCL4+ФН)» (р≤0,05);
^ - достоверное отличие от группы «Карсил» (р≤0,05).
15
Рисунок 1. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на концентрацию ВГ в ткани
печени мышей при подострой интоксикации CCL4 в условиях повышенной физической
нагрузки.
Примечание: * - достоверное отличие от групп «Пассивный Контроль (ФН)» и «Пассивный Контроль» (р≤0,05);
** - достоверное отличие от групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)» (р≤0,05);
# - достоверное отличие от группы «Пассивный Контроль (ФН)» (р≤0,05);
## - достоверное отличие от группы «Активный Контроль (CCL4+ФН)») (р≤0,05).
значений показателей ДК и МДА более чем в 2 раза по сравнению с группой «Пассивный
Контроль» (см. таблицу 6).
Сочетанное воздействие на организм мышей CCL4 и ФН (группа «Активный Контроль (CCL4+ФН)») приводило к интенсификации CCL4-индуцированного ПОЛ, что было
продемонстрировано достоверным повышением концентраций и ДК, и МДА (60,0 нмоль/
г ткани и 89,3мкмоль/г ткани соответственно) по сравнению с группой «Активный Контроль (CCL4)».
Лечебно-профилактическое введение изучаемых фитоадаптогенов при интоксикации CCL4 на фоне повышенной ФН в значительной степени предупреждало гиперактивацию ПОЛ. Так, для мышей, получавших экстракт элеутерококка, показатели ДК и МДА
составили 33,21 нмоль/г ткани и 58,18 мкмоль/г ткани соответственно, а для настойки
женьшеня – 34,68 нмоль/г ткани и 58,78 мкмоль/г ткани соответственно и не имели достоверных отличий от концентраций изучаемых показателей у мышей, получавших препарат
сравнения – карсил (33,21нмоль/г ткани - ДК и 56,15 мкмоль/г ткани - МДА).
16
Таблица 6.
Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на концентрацию восстановленного глутатиона и продуктов ПОЛ в ткани печени
экспериментальных животных при подострой интоксикации тетрахлорметаном.
в условиях повышенной физической нагрузки, M±m, n=12.
Показатели
Восстановленный глутатион,
мкмоль/г ткани
Малоновый диальдегид,
мкмоль/г ткани
Диеновые
конъюгаты,
нмоль/г ткани
Пассивный
Контроль
Пассивный
Контроль
(ФН)
Активный
Контроль
(CCL4)
Активный
Контроль
(CCL4+ФН)
Карсил
Элеутерококк
Женьшень
5,90±0,14
5,51±0,16
2,35±0,14*,##
1,77±0,18*
4,63±0,14*,**
4,28±0,17*,**
4,32±0,20*,**
36,09±0,70#
40,48±1,49
81,62±1,38*,##
89,32±2,18*
56,15±1,94*,**
58,18±2,45*,**
58,78±2,59*,**
18,27±0,74#
22,24±1,04
53,97±1,51*,##
60,02±2,33*
33,21±2,06*,**
35,73±2,66*,**
34,68±2,31*,**
Примечание: * - достоверное отличие от групп «Пассивный Контроль (ФН)» и «Пассивный Контроль» (р≤0,05);
** - достоверное отличие от групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)» (р≤0,05);
# - достоверное отличие от группы «Пассивный Контроль (ФН) (р≤0,05);
## - достоверное отличие от группы «Активный Контроль (CCL4+ФН)» (р≤0,05).
17
Рисунок 2. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на концентрацию МДА в
ткани печени мышей при подострой интоксикации CCL4 в условиях повышенной
физической нагрузки.
Рисунок 3. Влияние препаратов женьшеня и элеутерококка на концентрацию ДК в ткани
печени мышей при подострой интоксикации CCL4 в условиях повышенной физической
нагрузки
Примечание: * - достоверное отличие групп «Пассивный Контроль (ФН)» и «Пассивный
Контроль» (р≤0,05);
** - достоверное отличие от групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)» (р≤0,05);
# - достоверное отличие от группы «Пассивный Контроль (ФН)» (р≤0,05);
## - достоверное отличие от группы «Активный Контроль (CCL4+ФН)») (р≤0,05).
18
Изучение гистоморфологических и гистохимических показателей печени мышей. Для объективного сравнения морфологических изменений ткани печени экспериментальных животных была использована бальная шкала оценки ряда признаков патологии печеночной ткани по методике профессора А.Б. Шехтера:
№
1
2
3
4
5
6
7
Признак патологии печеночной ткани
изменение общей структуры печени
полнокровие центральных вен и сосудов триад
расширение полнокровия межбалочных капилляров
изменение ядер гепатоцитов
изменение (вакуолизация) цитоплазмы гепатоцитов
изменение количества купферовских клеток
воспалительная инфильтрация стромы
Каждый пункт оценивался по 6-ти бальной системе:
отсутствие изменений
0
слабовыраженные изменения
1
умеренно выраженные изменения
2
выраженные изменения
3
сильно выраженные изменения
4
максимально выраженные изменения
5
Изучение морфологической картины печени у групп подопытных животных, не
получавших гепатотоксин, показало, что в целом архитектоника печени у мышей группы
«Пассивный Контроль (ФН)» сохранена и печеночная ткань практически не отличается от
таковой у группы «Пассивный Контроль», за исключением небольших участков с зернистой и просветленной цитоплазмой гепатоцитов.
Подострая интоксикация CCL4 приводила к развитию подострого, субтотального,
паренхиматозно-интерстициального токсического гепатита с частичной узелковой трансформацией. Наблюдались признаки компенсаторно-приспособительных реакций печени
на токсическое воздействие в виде формирования нодулей, участков мелкоузловой перестройки печеночной паренхимы. При этом сохранялись зоны альтерации, которые характеризовались вакуольной дистрофией, изменениями ядер гепатоцитов, увеличением количества купферовских клеток и их гиперплазией.
Следует обратить внимание, что морфологическая картина печени мышей из группы «Активный Контроль (CCL4+ФН)» характеризуется более выраженными изменениями
(массивный цитолиз, крупнокапельная вакуолизация цитоплазмы гепатоцитов в центральной части паренхимы) по сравнению с животными группы, не получавшей ФН («Активный Контроль (CCL4)»).
У животных из группы «Элеутерококк» общая структура печени значительно более
сохранна: ядра гепатоцитов характеризуются присутствием минимальных изменений; сохраняется зернистость цитоплазмы гепатоцитов; присутствующая вакуолизация была слабо выраженной и мелкокапельной; наблюдается умеренная гиперплазия купферовских
клеток; воспалительная инфильтрация практически отсутствует. Морфологическая структура печени мышей, получавших настойку женьшеня при сочетанном воздействии CCL4 и
19
повышенной физической нагрузки, по сохранности практически сопоставима с таковой у
мышей группы «Карсил»: отсутствует тенденция к микронодулярности; ядра гепатоцитов
характеризуются отсутствием морфологических изменений, однако зернистость цитоплазмы сохранена, присутствуют небольшие участки с признаками мелкокапельной вакуолизации. Количество купферовских клеток в норме.
В качестве критерия функциональной сохранности печени, а также интенсивности
протекания биоэнергетических процессов использовалась оценка содержания гликогена в
ткани печени, которая проводилась по реакции Шифф-йодной кислотой (ШИКреакция) (Cooksey C., Dronsfield A., 2009; Kierman J.A., 2008).
Так, в группе животных «Пассивный Контроль», не получавшей ФН, наблюдалось
достаточно однородное насыщенно-малиновое окрашивание, что свидетельствует о сохранности печеночной паренхимы и высоком содержании в ней гликогена. У мышей, получавших физическую нагрузку («Пассивный Контроль (ФН)»), отмечены участки с менее
ярким окрашиванием цитоплазмы гепатоцитов, наличие которых обусловлено расходом
гликогена на выполнение плавательной нагрузки.
Обращает на себя внимание то, что во всех опытных группах, получавших CCL4,
утрата гликогена гепатоцитами происходила неравномерно, участки с наибольшими повреждениями расположены преимущественно в центролобулярном отделе печеночных
долек, что соотносится с имеющимися данными о механизме гепатотоксического действия четыреххлористого углерода (Венгеровский А.И., 2002; Omar M.E. et al., 2005). Зоны
дегликогенизации имеют бледно-розовое окрашивание, в отличие от гепатоцитов с нормальным содержанием гликогена, имеющих ярко-малиновое окрашивание, которое тем
интенсивнее, чем большее количество гликогена содержится в гепатоците. На фоне повышенной физической нагрузки и интоксикации CCL4 в группе «Активный
Контроль(CCL4+ФН)» зафиксирована более выраженная по сравнению с группой «Активный Контроль (CCL4)» дезорганизация цитоплазмы и снижение содержания в ней гликогена.
У подопытных мышей, подвергавшихся сочетанному воздействию CCL4 и повышенной
ФН на фоне лечебно-профилактического введения протекторных препаратов, наблюдались зоны с сохранной паренхимой, насыщенной гликогеновыми включениями, которые
были более обширные и располагались преимущественно в периферических отделах долек. При этом женьшень проявил более выраженные гликогенсберегающие свойства, приближаясь к карсилу.
Окрашивание сулемовым раствором бромфенолового синего (Елисеев В.Г. и др.,
1967; Hornatowska J., 2005) позволило оценить степень белковой дистрофии ткани печени
в рамках данной экспериментальной модели. Изменение содержания суммарного белка
прямо коррелирует с интенсивностью окрашивания бромфеноловым синим (чем больше
белка, тем интенсивнее окрашивание).
20
Таблица 7.
Бальная оценка морфологических признаков патологии печеночной ткани мышей в исследовании гепатопротекторного действия
препаратов элеутерококка, женьшеня, карсила при подострой интоксикации CCL4 в условиях повышенной физической нагрузки.
№ животного
1
2
3
4
Пассивный
Контроль
5
5
4
4
Группы животных \ сумма балов по семи признакам, n=4#.
Пассивный
Активный
Активный
Карсил
Элеутерококк
Контроль
Контроль
Контроль
(ФН)
(CCL4)
(CCL4+ФН)
6
5
4
5
14
16
15
15
р1 ≤ 0,05*
р1 ≤ 0,05##
19
17
19
18
р1 ≤ 0,05*
7
6
8
7
р1 ≤ 0,05*
р2 ≤0,05**
13
12
8
9
р1 ≤ 0,05*
р2 ≤0,05**
Женьшень
12
9
7
8
р1 ≤ 0,05*
р2 ≤0,05**
Примечание: * - достоверное отличие от животных групп «Пассивный Контроль (ФН) » и «Пассивный Контроль» (р≤0,05);
** - достоверное отличие от животных групп «Активный Контроль (CCL4+ФН)» и «Активный Контроль (CCL4)» (р≤0,05);
## - достоверное отличие от животных, получавших физическую нагрузку, группа «Активный Контроль (CCL4+ФН)» (р≤0,05);
Достоверность отличий результатов бальной оценки морфологических признаков патологии печеночной ткани оценивалась с помощью Uкритерия Уилкоксона-Манна-Уитни (р ≤ 0,05).
# - рандомизированный выбор животных из каждой группы проводился с использованием генератора случайных чисел («Microsoft
Exсel 2010»).
21
В группе «Пассивный Контроль» отмечено однородное насыщенно-синее окрашивание, что свидетельствует о сохранности печеночной паренхимы и высоком содержании
в ней белка. Гистохимическая картина печени мышей группы, получавшей ФН, не имела
достоверных отличий от таковой у мышей, находившихся в условиях относительного
функционального покоя.
Изучение по этому показателю микропрепаратов ткани печени мышей групп «Активный Контроль (CCL4)» и «Активный Контроль (CCL4+ФН)» выявило существенное
негативное влияние подострой интоксикации CCL4: наблюдалась обширная вакуолизация
печеночной паренхимы, а также низкое содержание белка в некротизированных перипортальных зонах (бледно-голубое окрашивание). При этом не было отмечено достоверной
разницы между мышами, получавшими гепатотоксин на фоне повышенной ФН, и животными, которым вводили CCL4 в условиях относительного функционального покоя. Во
всех группах мышей, получавших протекторные препараты в условиях подосторой интоксикации тетрахлорметаном при повышенной ФН, также наблюдалась вакуолизация печеночной паренхимы, обусловленная воздействием CCL4, однако она была значительно менее выраженная по сравнению с группами, не получавшими изучаемых препаратов. Содержание белка в ткани печени мышей, получавших настойку женьшеня, приближалось к
таковому у животных, которым вводили препарат сравнения - карсил.
При иммуногистохимическом исследовании проведена качественная и полуколичественная оценка содержания фермента NO-синтазы 2 (NOS2) и цитокина TNF-α (фактор
некроза опухоли –α (ФНО-α) в ткани печени мышей по интенсивности окрашивания (см.
таблицу 8). При ИГХ-реакции с антителами к NOS2 и TNF-α иммунопозитивное окрашивание было ассоциировано с цитоплазматическим компартментом гепатоцитов, что согласуется с имеющимися экспериментальными данными, свидетельствующими о локализации NOS2 и TNF-α в цитозоле клеток и отсутствием их в ядерном компартменте. Для подтверждения корректности проведения ИГХ-реакции применяли внутренние позитивные
контроли антигенов (иммунопозитивное окрашивание синусоидов портальных трактов,
эндотелия сосудов, лимфоидных клеток).
В ткани печени у животных, находившихся в состоянии относительного функционального покоя (группа «Пассивный Контроль»), слабовыраженное ИГХ-окрашивание
наблюдалось в основном в контрольных зонах портальных трактов, эндотелии и лимфоидных клетках и только в малых группах дискретно расположенных гепатоцитов отмечалось слабое коричневое окрашивание цитозоля. В группе мышей, получавших ФН (группа
«Пассивный Контроль (ФН)»), наблюдались зоны, с выраженным иммунопозитивным окрашиванием к NOS2 и TNF-α, что возможно обусловлено влиянием повышенной физической нагрузки.
Необходимо отметить, что подострая интоксикация CCL4 в группах мышей «Активный Контроль (CCL4)» и «Активный Контроль (CCL4+ФН)» приводила к появлению в
ткани печени обширных участков с сильными повреждениями печеночной паренхимы,
часто - с исходом в вакуольную дистрофию с настолько сильной деструкцией цитоплаз-
22
мы, что изучаемые белки, локализующиеся в цитозоле, тоже оказывались разрушенными
и не визуализировались. Причем ядра гепатоцитов сохранны, а действие токсина было направлено на разрушение цитоплазматического компартмента клетки.
Таблица 8. Результаты И.Г.Х.-исследования содержания NOS2 и TNF-α в
сохранных гепатоцитах в исследовании гепатопротекторного действия препаратов
элеутерококка, женьшеня, карсила при подострой интоксикации CCL4 в условиях
повышенной физической нагрузки.
Группа животных
% сохранных
гепатоцитов#
Фактор некроза опухоNO-синтаза 2
ли-α (TNF-α)
(NOS2)
Оценка по полуколичественной шкале
+*
+*
++
++
Пассивный Контроль
100
Пассивный Контроль (ФН)
100
Активный
Кон30
++++
++++
троль(CCL4)
Активный
Контроль
10
++++
++++
(CCL4+ФН)
Карсил
90
++
++
Элеутерококк
80
+++
+++
Женьшень
80
++
++
Примечание: Полуколичественная шкала оценки иммуногистохимической реакции: 0 –
негативное окрашивание;+* - позитивный внутренний контроль; + - слабое окрашивание;
++ - умеренное окрашивание; +++ - выраженное окрашивание; ++++ - максимально выраженное окрашивание (Тюренков И.Н. и др., 2012).
# - процентная шкала визуальной оценки сохранных клеток (Allred D.C., 2008).
Этим может быть обусловлено то, что в группах, получавших гепатотоксин, не было отмечено ожидаемого интенсивного окрашивания, за исключением небольших групп
гепатоцитов с сохранившейся цитоплазмой и поэтому, имеющих насыщенно-коричневый
цвет. Сравнивая группу «Активный Контроль (CCL4+ФН)» с сочетанным воздействием
тетрахлорметана и ФН с группой «Активный Контроль (CCL4)», можно сказать, что морфологические и иммуногистохимическое исследования подтвердили еще более глубокие
некробиотические повреждения печеночной паренхимы.
Применение ФА (элеутерококка и женьшеня) способствовало значительному снижению уровней фермента NOS2 и цитокина TNF-α, и сохранению цитоплазматического
компартмента гепатоцитов, практически не уступая препарату сравнения - карсилу, что
свидетельствует о клинически значимых гепатопротеторных свойствах изучаемых препаратов.
Было обнаружено, что участки печеночной ткани, иммунопозитивные по NOS2,
оказывались колокализованными с TNF-α-иммунопозитивными зонами. Основываясь на
литературных данных, свидетельствующих о взаимосвязи и взаиморегуляции изучаемых
белков, можно предположить присутствие данной взаимозависимости и в проводимом
эксперименте. На основании полученных данных по содержанию фермента NOS2 и цитокина TNF-α можно, предположить, что механизм гепатопротекторного действия изучаемых препаратов связан и с регуляцией уровней этих белков.
23
ВЫВОДЫ
1. Физическая нагрузка в виде еженедельного плавания до полного утомления с
грузом 7 % от массы тела животного потенцировала повреждающее действие тетрахлорметана в дозе 30 мл/кг в отношении печени. Это проявлялось в более выраженных CCL4индуцированных изменениях на фоне повышенной физической нагрузки, а именно в
снижении динамики массы тела, повышении относительной массы печени, нарушениях
морфологической структуры печеночной ткани, изменениях некоторых биохимических и
энзимологических показателей сыворотки крови, а также показателей, характеризующих
работу антиоксидантной системы печени у мышей.
2. Ежедневное введение настойки женьшеня 47 мг/кг и экстракта элеутерококка
48,5 мг/кг (в пересчете на сухой остаток) в течение 5ти недель предупреждало CCL4индуцированное нарушение физической работоспособности. Защитное действие в отношении физической выносливости препаратов женьшеня и элеутерококка выше, чем у препарата сравнения карсила.
3. Настойка женьшеня 47 мг/кг и экстракт элеутерококка 48,5 мг/кг при ежедневном введении в течение 5 недель оказывали гепатопротекторный эффект в условиях сочетанного воздействия гепатотоксина CCL4 и повышенной физической нагрузки по ряду
биохимических, энзимологических, гистоморфологических, гистохимических, иммуногистохимических показателей сравнимый с эффектом карсила.
4. Подострая интоксикация CCL4 (в дозе 30 мл/кг в течение 3х недель) сопровождалась увеличением содержания фермента NO-синтазы 2 и цитокина TNF-α в ткани печени.
Применение исследуемых фитоадаптогенов (женьшеня (47 мг/кг) и элеутерококка (48,5
мг/кг) в пересчете на сухой остаток) и препарата сравнения – карсила (100мг/кг), приводило к значительному снижению уровня этих белков. На основании полученных данных
можно сделать вывод о том, что влияние на содержание NO-синтазы 2 и TNF-α является
одним из механизмов гепатопротекторного действия изучаемых препаратов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Полученные экспериментальные данные о наличии у экстракта элеутерококка и настойки женьшеня гепатопротекторных свойств в условиях воздействия гепатотоксического соединения и повышенной физической нагрузки могут быть использованы для дальнейшего исследования с целью расширения показаний их клинического применения. Изученные препараты могут быть рекомендованы в качестве лечебно-профилактического
средства лицам, чья жизнь и трудовая деятельность связана с контактами с гепатотоксическими веществами в условиях повышенной физической нагрузки.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи
1. Печенкина, И.Г. Опыт и перспективы экспериментального изучения гепатопротекторного
действия фитоадаптогенов при хронических токсических поражениях печени [Текст] / И.Г.
Печенкина, С.В. Козин, Л.А. Павлова, Е.Д. Рыбакова // Традиционная Медицина. – 2013. - № 4
(35). - С. 25-32.
24
2. Печенкина, И.Г. Гистоморфологическая оценка гепатопротекторного действия фитоадаптогенов при токсическом поражении печени мышей четыреххлористым углеродом на фоне
интенсивной физической нагрузки [Текст] / И.Г. Печенкина, С.В. Козин, Д.В. Буланов //
Вестник ВолгГМУ. – 2014. – Вып. 2 (50). – С. 78-81.
3.Печенкина, И.Г. Гликогенсберегающие свойства средств растительного происхождения как
фактор неспецифической защиты от гепатотоксического поражения CCL4 в условиях интенсивной физической нагрузки [Электронный ресурс] / И.Г. Печенкина, С.В. Козин, Д.В. Буланов //
Вестник новых медицинских технологий. – 2014. – № 1.
Публикация 2-104.
URL:http://www.medtsu.tula.ru/VNMT/Bulletin/E2014-1/4967.pdf
4. Печенкина, И.Г. Иммуногистохимическое исследование с использованием моноклональных
антител к NO-синтазе 2 и ФНО-α ткани печени мышей при токсическом поражении тетрахлорметаном [Текст] / И.Г. Печенкина, С.В. Козин, Д.В. Буланов // Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2015. – Т.78, № 2. – С. 88-91.
Статьи в сборниках материалов конференций
1. Печенкина, И.Г. Влияние фитоадаптогенов на некоторые биохимические и энзимологические показатели сыворотки крови мышей при интоксикации CCL4 [Текст] / И.Г. Печенкина,
С.В. Козин // Сборник статей Международной научно-практической конференции «Роль
медицины в развитии общества». – Уфа. - 2014. – С. 25-27.
2. Печенкина, И.Г. Влияние препаратов элеутерококка и женьшеня на концентрацию продуктов ПОЛ в ткани печени мышей при интоксикации CCL4 [Текст] / И.Г. Печенкина // Сборник
статей Международной научно-практической конференции «Роль медицины в развитии
общества». – Уфа. - 2014. – С. 28-30.
3. Rybakova, E.D. Chemical study of the raw materials used in the Tuva Ethnomedicine [Текст]/ E.D.
Rybakova, L.A. Pavlova., I.G. Pechenkina // Materials of International Conference «Global Science
and Innovation», Conference Area: Medicine and Pharmacology, Chicago, USA. - 2013. – Vol. 1, - P.
343-345.
Тезисы
1. Печенкина, И.Г. Перспективы применения растительных средств неспецифического
действия при хронических токсических поражениях печени [Текст]/ И.Г. Печенкина, С.В.
Грецкий, С.В. Козин // Материалы I Всероссийской научно-практической конференции с
международным участием «Инновации в здоровье нации». - Санкт-Петербург. - 2013. - С. 184185.
2. Печенкина, И.Г. Влияние экстракта элеутерококка на физическую выносливость мышей на
фоне хронической интоксикации CCL4 [Текст] / И.Г. Печенкина, С.В. Козин // Сеченовский
Вестник. – 2014. – Вып. 2 (16). – С. 93.
3. Печенкина, И.Г. Влияние препаратов элеутерококка и женьшеня на динамику массы тела
мышей при подострой интоксикации CCL4 [Текст] / И.Г. Печенкина, С.В. Козин // Материалы
Х международной научно-практической конференции «Современная европейская наука». –
Шеффилд, Великобритания. – 2014. – С. 30-32.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа