close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Разработка технологии получения биопрепаратов с использованием клеточных культур in vitro на структурированных носителях

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Буянова Алена Сергеевна
РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ
БИОПРЕПАРАТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР IN VITRO
НА СТРУКТУРИРОВАННЫХ НОСИТЕЛЯХ
03.01.06 – Биотехнология
(в том числе бионанотехнологии)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Красноярск –2014
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Бийского
технологического института (филиала) ФГБОУ ВПО «Алтайский
государственный технический университет им. И.И. Ползунова»
Научный руководитель:
Ламберова Марина Эдуардовна,
кандидат химических наук,
доцент кафедры биотехнологии
Официальные оппоненты:
Канарский Альберт Владимирович, доктор технических наук,
профессор, ФГБОУ ВПО «Казанский национальный исследовательский технологический университет», кафедра пищевой биотехнологии,
профессор
Зобова Наталья Васильевна, доктор сельскохозяйственный наук,
старший научный сотрудник, ФГБНУ "Красноярский научноисследовательский институт сельского хозяйства", заведующая отделом оценки селекционного материала
Ведущая организация: ФГБОУ ВО "Российский государственный
аграрный университет – МСХА им. К.А. Тимирязева"
Защита диссертации состоится «10» апреля 2015 г. в 10.00 ч на заседании диссертационного совета Д 212.253.01 при ФГБОУ ВПО «Сибирский государственный технологический университет» по адресу
660049, Красноярск, пр. Мира, 82, аудитория Ц-110 (зал заседаний).
Отзывы на автореферат в двух экземплярах с подписями, заверенными печатью, просим направлять по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира 82, Сибирский государственный технологический университет, учёному секретарю. E-mail: dissovetsibgtu01@mail.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Сибирского
государственного технологического университета.
Автореферат разослан «____» ___________ 2015 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор технических наук, профессор
Исаева Елена Владимировна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. В условиях перепроизводства синтетических препаратов для повышения плодородия почвы и урожайности сельскохозяйственной
продукции в России и за рубежом, а также при реализации комплексной всесторонней программы по производству безопасной, экологически чистой пищевой
продукции, эффективным считается применение натуральных биопрепаратов
стимулирующего, гормонального и азотфиксирующего действия. Поэтому вопросы, связанные с разработкой новых биотехнологических подходов к технологии их получения являются актуальными.
В настоящее время для сельского хозяйства на полях и в теплицах, а
также для садоводов и огородников выпускается большой ассортимент удобрений химических (минеральных и органических) и препаратов, ускоряющих
рост растений, с гормонами и другими стимуляторами. Важнейшая роль принадлежит азотсодержащим и дефицитным минеральным элементам, которые
выносятся из почвы с каждым урожаем и требуют восполнения. На рынке существуют такие товарные формы препаратов, как жидкие, жидкоконцентрированные, сухие (порошкообразные, гранулированные, таблетированные). Под каждую форму имеются способы применения и агрегаты для
предпосевной обработки семян, внесения в почву вместе с семенами, полива и
опрыскивания растений авиационным или наземным способами.
В последнее время более пристальное внимание уделяется также вопросам экологии, нарушаемой химическими препаратами, возрастает актуальность многокомпонентных высокоэффективных органических биопрепаратов,
сбалансированных по основным биогенным компонентам, макро-, олигосоединениям и набору микроэлементов под физиологические потребности
конкретного растения. К органическим экологически чистым удобрениям относятся препараты азотфиксирующих бактерий - клубеньковых и свободноживущих на почве, торфе и других носителях, такие как ризоторфин, нитрагин и
другие, выпускаемые во всех странах. Почвы, навозы и компосты как носитель
для бактерий имеют нестандартный состав микроорганизмов, которые инфицируют растения, поэтому в промышленности отдается предпочтение стерильному торфу с большой удельной поверхностью и собственными питательными
компонентами. К проблемам относится то, что азотфиксирующие бактерии в
этих препаратах проявляют свою активность в строго анаэробных условиях,
трудно сохраняют жизнеспособность. Некоторые виды торфа изначально содержат компоненты, токсичные для бактерий почвы и растений, накапливают
их при термической обработке и поэтому стерилизуются только радиационным
излучением, в связи с чем предпринимаются попытки заменить их на более
технологичные и стандартизованные носители (бентонит, цеолиты и др.). При
изготовлении этих препаратов питательные среды для азотфиксаторов обычно
готовят на отваре из тех растений, для которых предназначен препарат. Конечная влажность препарата на стерильном торфе, инокулированном бактериями,
должна составлять 50 – 60 %, чтобы обеспечить жизнеспособность бактерий в
количестве 5 млрд клеток на грамм, но в этом случае срок хранения препарата
составляет от месяца до полугода.
Все эти проблемы возможно решить при замене анаэробных азотфиксирующих бактерий на аэробные метилотрофы Methylobacterium mesophilicum,
которые способны к созданию симбиоза с растениями, осуществляя для них
азотфиксацию и синтез фитогормонов. При этом они используют С1соединения в качестве единственного источника углерода и энергии (например, метанол), который вырабатывают растения, что важно для производства.
В данной работе при разработке эффективной производственной технологии вместо полевых растений предложено использовать их клеточные культуры in vitro, к преимуществам которых относится то, что их биомассу можно
производить в необходимых количествах независимо от времени года, посевных площадей, климатических условий и других агрофакторов. В случае производства всех товарных форм биопрепаратов на их основе требуется оптимизировать и интенсифицировать каждую технологическую стадию и заменить
носитель агар на более технологичные, менее дорогостоящие и дефицитные.
Значительный теоретический и практический вклад в разработку и усовершенствование технологии получения растительных клеточных культур, в том
числе симбиотических с метилотрофными бактериями, внесли отечественные
ученые Ю.А. Троценко, Н.А. Величко, А.М. Носов, И.А. Тарчевский,
Е.А. Калашникова, И.Е. Каухова, Н.И. Румянцева.
Цель работы: разработка технологии получения биопрепаратов стимулирующего, гормонального и азотфиксирующего действия за счет использования
растительных клеточных культур и метилобактерий in vitro в симбиозе и без него
на структурированных носителях: микрокристаллической целлюлозе (МКЦ),
целоформе (МХПЦ) и алюмоадсорбенте (F-24) с применением ультразвука (УЗ).
Для достижения этой цели решались следующие задачи:
1. Оценить антимикробные и технологические свойства выбранных структурированных сорбентов и условия их применения в качестве носителей для
получения и размножения культур клеток и тканей in vitro из разного растительного сырья.
2. Разработать методику применения структурированных сорбентов в качестве носителей для иммобилизации клеток метилотрофных бактерий
Methylobacterium mesophilicum в симбиозе с растительными клеточными культурами in vitro.
3. Определить условия и оптимальные режимы УЗ-обработки для получения биомассы in vitro растительных и симбиотических биопрепаратов стимулирующего, гормонального и азотфиксирующего действия на выбранных носителях.
4. Отработать технологические режимы получения разных товарных форм
биопрепаратов на выбранных структурированных носителях.
5. Разработать научно обоснованные рекомендации по оптимизации и интенсификации процесса получения биопрепаратов из разных растительных клеточных культур in vitro в симбиозе с метилотрофными бактериями и без него с
применением структурированных носителей и УЗ, с освоением технологии в
цехе опытно-промышленного производства.
6. Разработать аппаратурно-технологическую схему по производству биопрепаратов в соответствии с современными требованиями энерго- и ресурсосбережения, экологической безопасности.
Объект исследований: растительные клеточные культуры in vitro в симбиозе с метилотрофными бактериями и без него, и технология выращивания их
биомассы на структурированных сорбентах для получения биопрепаратов.
Предмет исследований: условия и закономерности выращивания клеточных культур гороха, гречихи, картофеля, пшеницы, сои in vitro в симбиозе с метилотрофными бактериями Methylobacterium mesophilicum и без него на структурированных носителях МКЦ, МХПЦ, F-24, с применением УЗ; технологические
режимы и технология производства биопрепаратов стимулирующего, гормо-
нального и азотфиксирующего действия с получением жидких и сухих (порошкообразных, гранулированных, таблетированных) готовых форм.
Научная новизна: предложен научно обоснованный подход к разработке
технологии гибкого многопродуктового производства блочного типа для получения разных товарных форм биопрепаратов стимулирующего, гормонального и
азотфиксирующего действия из растительных клеточных культур in vitro в симбиозе с метилотрофными бактериями Methylobacterium mesophilicum и без него
на структурированных сорбентах МКЦ, МХПЦ и F-24 с применением УЗ.
Установлено влияние УЗ, вида, состава и качества сырья, а также структурированных сорбентов МКЦ, МХПЦ и F-24 на показатели всех стадий получения растительных клеточных культур in vitro в симбиозе с метилотрофными
бактериями Methylobacterium mesophilicum и без него при замене традиционных
носителей агара и торфа.
Определены способы и оптимальные режимы УЗ-обработки для регуляции
роста клеток in vitro, накопления ими целевых биологически активных веществ и
их извлечения.
Впервые показана антимикробная активность МКЦ, МХПЦ и F-24, в отношении ряда патогенных и условно-патогенных бактерий и дрожжей, что позволило вести стерилизацию разных растительных эксплантов in vitro с уменьшением расхода антисептиков, оптимизированы условия стерилизации с применением УЗ.
Разработана методика иммобилизации растительных клеточных культур in
vitro в симбиозе с метилотрофными бактериями Methylobacterium mesophilicum и
без него на структурированных носителях МКЦ, МХПЦ и F-24 при замене агара
и торфа, установлены оптимальные составы питательных сред, режимы культивирования и сушки для разных препаративных форм.
Получен патент 2324338 РФ. Способ получения биомассы in vitro.
Практическая значимость работы.
Разработана аппаратурно-технологическая схема по производству разных
товарных форм биопрепаратов для использования ее при получении растительной клеточной биомассы in vitro в симбиозе с метилотрофными бактериями
Methylobacterium mesophilicum и без него, отвечающая современным требованиям энерго- и ресурсосбережения, экологической безопасности.
В цехе опытно-промышленного производства ЗАО «Алтайвитамины», а
также на предприятии ООО «Биоресурс», согласно разработанным рекомендациям по оптимизации и интенсификации технологического процесса, получена
опытная партия сухих гранулированных и таблетированных товарных форм биопрепаратов из разных растительных клеточных культур in vitro в симбиозе с метилотрофными бактериями Methylobacterium mesophilicum и без него на структурированных сорбентах МКЦ, МХПЦ и F-24 с применением УЗ.
Замена агара и торфа на МКЦ, МХПЦ и F-24 на стадиях наращивания клеточной биомассы и получения разных товарных форм биопрепаратов (сухих
порошкообразных, гранулированных и таблетированных) приводит к снижению
сырьевых и энергетических расходов, а также увеличивает срок хранения готового продукта.
Использование симбиоза метилобактерий с растительными клеточными
культурами при их росте на МКЦ, МХПЦ и F-24 позволяет исключить из состава
питательной среды МС синтетические гормоны роста, азотсодержащие компоненты, не добавлять метанол, и оптимизировать по содержанию Fe, Mg, K, Ca.
Применение УЗ позволяет снизить расход антисептиков на стадии стерилизации эксплантов, регулировать рост растительных клеточных культур in vitro
и накопление ими целевых БАВ (белка, аминокислот, пептидов, ауксинов, цитокининов).
Оценка активности полученных биопрепаратов азотфиксирующего, стимулирующего и гормонального действия показала увеличение энергии прорастания и способности прорастания семян, а также скорости роста корней и стеблей
гречихи, гороха, картофеля, пшеницы и сои.
Получены акты внедрения.
Положения, выносимые на защиту: в рамках специальности 03.01.06 –
Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) по п.3. «Изучение и разработка
технологических режимов выращивания микроорганизмов-продуцентов, культур тканей и клеток растений и животных для получения биомассы, ее компонентов, продуктов метаболизма, направленного биосинтеза биологически активных соединений и других продуктов, изучение их состава и методов анализа,
технико-экономических критериев оценки, создание эффективных композиций
биопрепаратов и разработка способов их применения» на защиту выносятся:
- экспериментально установленные закономерности и количественные характеристики выращивания растительных клеточных культур in vitro (гречихи,
гороха, картофеля, пшеницы и сои) в симбиозе с метилотрофными бактериями
Methylobacterium mesophilicum и без него с применением УЗ на модифицированных питательных средах МС со структурированными носителями МКЦ, МХПЦ
и F-24 (эффективность стерилизации эксплантов, эффективность инициации
калусогенеза, эффективность калусогенеза, оценка биологической активности);
- результаты оценки антимикробных и других технологических свойств
структурированных сорбентов, а также условия и режимы их применения в качестве носителей на каждой технологической стадии при замене агара и торфа;
- модифицированные питательные среды МС на всех стадиях технологии с
учетом состава структурированных носителей МКЦ, МХПЦ, F-24 и свойств
симбиотических Methylobacterium mesophilicum;
- экспериментально обоснованные режимы УЗ-обработки на всех стадиях
культивирования растительных клеточных культур in vitro в симбиозе с
Methylobacterium mesophilicum и без него при их иммобилизации на структурированных носителях МКЦ, МХПЦ, F-24;
- результаты изучения стимулирующей, гормональной и азотфиксирующей
активности биомассы растительных клеточных культур in vitro в симбиозе с метилотрофными бактериями и без него с применением УЗ, доказывающие возможность ее использования для получения биопрепаратов;
- технологические режимы выращивания биомассы глубинным, поверхностным способом и в псевдоожиженном слое, технология гибкого многопродуктового производства жидких, порошкообразных, гранулированных и таблетированных биопрепаратов, обогащенных БАВ из растительного и микробного сырья, изменения к ТУ 0392-001-75141787 и Технологическому регламенту, оценка
производственных сырьевых и энергетических расходов.
Апробация работы. Основные положения и результаты диссертации
докладывались и обсуждались на научно-технических конференциях и конгрессах: V Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», (Москва, 2009); X и XII Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнология» (Казань, 2009, 2012); 9-й
и 10-й Международных конференциях-семинарах по микро/нанотехнологиям и
электронным приборам (Новосибирск, 2008, 2009) и других всероссийских и
региональных конференциях Бийска, Барнаула, Казани, Уфы.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 печатных работ, в том числе 7 статей в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК, 1 патент.
Личный вклад автора состоит в постановке цели и задач исследований,
выборе объекта, предмета и методов исследований, непосредственном участии в
проведении основных экспериментов, систематизации и интерпретации полученных результатов, формулировании научных положений и выводов.
Автор выражает искреннюю признательность и благодарность за помощь в
организации производства при выпуске опытной партии биопрепаратов ЗАО
«Алтайвитамины» и ООО «Биоресурс».
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 18 таблицы, 30 рисунков. Она включает: введение, 4 главы, выводы, библиографический список, содержащий 137 наименования, приложения на 41 странице.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обосновывается актуальность работы, цель и задачи исследования.
В первой главе дан анализ современного состояния проблемы производства натуральных сельскохозяйственных стимулирующих, гормональных, азотфиксирующих биопрепаратов; обозначены недостатки использования торфа и
агара при производстве биопрепаратов; биохимические основы действия биопрепаратов; биотехнологические способы выращивания растительного сырья и
симбиотических клеточных культур in vitro для получения биопрепаратов; обзор
и применение структурированных сорбентов в биотехнологических процессах;
обозначены сложности масштабирования технологии получения клеточных
культур in vitro в производстве.
Основные положения предлагаемого нами подхода в следующем:
- разработка схемы гибкого многопродуктового производства блочного типа с использованием растительных и микробных клеточных культур in vitro для
получения широкого спектра биопрепаратов в разных готовых формах на структурированных носителях;
- оптимизация состава питательных сред и режимов каждой технологической стадии при получении биопрепаратов для сельского хозяйства из разных
растительных клеточных культур in vitro в симбиозе с метилотрофными бактериями Methylobacterium mesophilicum и без него на структурированных носителях;
- интенсификация производства биопрепаратов за счет использования симбиотических метилотрофных бактерий, структурированных носителей и УЗ.
Во второй главе дана характеристика объекта и методов исследования.
Объектом исследования являлись клеточные культуры гречихи сорта «Аромат»,
пшеницы сорта «Алтайская», гороха сорта «Альфа», сои сорта «Алтом». Исследуемые экспланты получали из разных частей сельскохозяйственных растений,
стерилизовали и затем культивировали, в том числе в симбиозе с метилотрофными бактериями Methylobacterium mesophilicum штамм В-3352, на модифици-
рованной среде Мурасиге-Скуга (МС) с необходимыми ростовыми факторами.
Варианты модификации среды МС:
- для инициации каллусогенеза: 2,4-Д – 2 мл/г, кинетин – 0,5 мг/л;
- для каллусогенеза: α–НУК – 2 мг/л, кинетин – 0,5 мг/л;
-фитоэкстракт или метилобактерии.
Проводилась корректировка расхода ростовых факторов и основных минеральных компонентов среды МС (Fe, Mg, K, Ca). Выбор контролируемых элементов обусловлен тем, что они дополнительно вносились в питательную среду
МС с фитоэкстрактами и структурированными сорбентами, используемыми для
иммобилизации культивируемых клеток in vitro и приготовления готовых форм
биопрепаратов. Метилобактерии без растительных клеток культивировали на
питательной среде Канеда.
В качестве носителей для иммобилизации клеток вместо традиционного
агара использовали кристаллические структурированные носители, в том числе с
порами и частицами наноразмеров – МКЦ, МХПЦ и F-24 (таблица 1). МКЦ –
микрокристаллическая целлюлоза (производитель – ФГУП ПО «Прогресс», г.
Кемерово); МХПЦ – модифицированная хлопковая порошковая целлюлоза с
длиной волокон 20-50 мкм в виде полупрозрачных игл с очень острыми косо
срезанными краями (ООО «Целоформ», г. Казань); F-24 – алюмоадсорбент со
средним диаметром пор 75 Å (ООО «Катализ», г. Казань).
Таблица 1 – Основные характеристики структурированных сорбентов
Наименование показателя
Картина рентгеновской дифракции
Степень полимеризации
3
Насыпная плотность, г/дм
Сорбционная емкость по воде, г/г
Химический состав, об.%, в т.ч.:
Na2O
K2O
CaO
MgO
Fe2O3
Массовая доля железа, %, не более
Примечание: «-» – отсутствие показателя
МКЦ
кристал.
150
555,60
3,50
МХПЦ
кристал.
300-600
250,00
2,00
F-24
кристал.
769,23
1,00
-
0,50
0,15
0,18
0,86
4,87
1,35
-
В частях нативных растений, эксплантах из них, экстрактах из клеточной
биомассы до и после обработки УЗ и инокуляции суспензией метилобактерий
исследовались такие показатели как содержание общего белка, свободных
аминокислот, фитогормонов (ауксинов, цитокининов); для семян энергия прорастания и способность прорастания; для метилобактерий КОЕ/мл и окраска
по Граму; эффективность стерилизации эксплантов, эффективность инициации
каллусогенеза, эффективность каллусогенеза – стандартными методами с применением титрования, измерения на колориметре фотоэлектрическом концентрационном КФК-2МП, количественного учета микроорганизмов и оценки
структуры сорбентов, в том числе с порами и частицами наноразмеров, а также
клеток на них – путем микроскопирования на БИМАМ Р-11 и др. Содержание
фитогормонов в экстрактах определяли методом ВЭЖХ на хроматографе «Alliance» и «Agilent 1200», основных минеральных элементов – с помощью атомно-абсорбционного спектрометра «Shimadzu AA 6300». Для УЗ-обработки
использовали аппарат «Волна УЗТА-0,4/22-О». Для статистической обработки
результатов применяли компьютерную программу StatSoft Statistica 11 Multilin-
gual. Оптимизацию условий стерилизации ультразвуком и культивирования проводили методом регрессионного анализа с составлением уравнения регрессии и
определением его коэффициентов. Экспериментальная партия биопрепаратов
получена с использованием лабораторного ферментера «BIOSTAT® B plus»
производства ЗАО «САРТОГОСМ».
В третьей главе приведены оосновные стадии получения биопрепаратов
с использованием клеточных культур in vitro при иммобилизации на структурированных носителях и результаты исследований по отработке каждой
отдельной стадии промышленной технологии:
- получение культуры растительных клеток и тканей in vitro;
- выращивание культуры растительных клеток и тканей in vitro;
- каллусогенеза в симбиозе культуры растительных клеток и тканей in
vitro с метилобактериями Methylobacterium mesophilicum;
- получение биопрепаратов стимулирующего, азотфиксирующего, гормонального действия из растительной клеточной культуры in vitro с метилобактериями Methylobacterium mesophilicum;
- получение препаративных форм (жидких, сухих порошкообразных,
гранулированных, таблетированных).
Эксперименты на структурированных сорбентах проводились по трем
направлениям:
- получение биопрепаратов на основе растительных клеточных культур;
- получение биопрепаратов на основе метилотрофных бактерий
Methylobacterium mesophilicum;
- получение симбиотических биопрепаратов из растительных клеточных
культур с метилобактериями.
Стадия получения культуры растительных клеток и тканей in vitro.
На первой стадии отрабатывали процесс приготовления эксплантов из
различных частей растений, их стерилизацию (физическими, химическими
методами), затем инициацию каллусогенеза in vitro на агаре и выбранных
структурированных носителях с УЗ-обработкой и без нее.
Оценивали антимикробные свойства МКЦ, МХПЦ и F-24 по их влиянию
на жизнеспособность Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Bacillus
cereus, Escherichia coli, Candida albicans, Methylobacterium mesophilicum и установили, что МХПЦ и F-24 имели наиболее выраженное антимикробное действие. Это позволило исключить целый ряд химических антисептиков, кроме
70 %-го этанола, но при этом надо было подобрать такие условия, при которых
не погибли бы иммобилизованные растительные клеточные культуры in vitro и
Methylobacterium mesophilicum.
Для определения оптимальных условий стерилизации выживших эксплантов в них оценивали максимальное содержание общего белка. Варьировали факторы, влияющие на эффективность стерилизации: тип культуры, тип
экспланта (гипокотиль корня, меристемы), УЗ (мощность от 80 до 400 Вт и
продолжительность от 1 до 7 мин), а также гидромодуль и концентрацию этанола (от 10 до 90 %), которые важны при извлечении общего белка из эксплантов. Выбранные экспланты (таблица 2) использовались в следующих опытах.
По величине коэффициентов в уравнениях регрессии в таблице 2 можно сказать, что наиболее значимым фактором для стерилизации является продолжительность УЗ-обработки, наименее значимым – мощность УЗ.
Таблица 2 – Оптимальные режимы стерилизации эксплантов
Культура
Тип
экспланта
Х1
Х2
Гипокотиль корня
Гречиха
Меристемы
Гипокотиль корня
Горох
Меристемы
Гипокотиль корня
Картофель
Меристемы
Гипокотиль корня
Пшеница
Меристемы
Гипокотиль корня
Соя
Меристемы
Режимы
СодерУЗ-обработки
жание
Гидропродолобщего
мощмодуль
жительбелка,
ность,
ность,
мкг/мл
Вт
мин
Х3
Х4
Х5
Х6
Y
1:20
10
1
320
74,2
Y = 60,67 -0,35X3 + 0,37X4 + 9,45X5 + 0,0183X6
1:60
60
1
320
81,1
Y = 65,05 -0,35X3 + 0,37X4 + 9,45X5 + 0,0183X6
1:100
40
3
160
68,1
Y = 57,55 -0,35X3 + 0,37X4 + 9,45X5 + 0,0183X6
1:100
60
1
160
62,3
Y = 61,93 -0,35X3 + 0,37X4 + 9,45X5 + 0,0183X6
1:20
10
1
240
74,2
Y = 63,79 -0,35X3 + 0,37X4 + 9,45X5 + 0,0183X6
1:40
60
1
240
89,6
Y = 68,17 -0,35X3 + 0,37X4 + 9,45X5 + 0,0183X6
1:40
10
1
240
61,9
Y = 59,11 -0,35X3 + 0,37X4 + 9,45X5 + 0,0183X6
1:60
40
1
240
70,3
Y = 63,49 -0,35X3 + 0,37X4 + 9,45X5 + 0,0183X6
1:100
10
2
80
51,2
Y = 62,23 -0,35X3 + 0,37X4 + 9,45X5 + 0,0183X6
1:100
60
3
80
84,1
Y = 66,61 -0,35X3 + 0,37X4 + 9,45X5 + 0,0183X6
Концентрация
этанола,
%
Таблица 3 – Оценка эффективности стерилизации эксплантов из частей
нативных растений на структурированных носителях
Агар
МХПЦ
МКЦ
F-24
Эффективность стерилизации, %
Показатель
Носитель,
культура
Горох
Гречиха
Картофель
Пшеница
Соя
Горох
Гречиха
Картофель
Пшеница
Соя
Горох
Гречиха
Картофель
Пшеница
Соя
Горох
Гречиха
Картофель
1
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
Продолжительность культивирования, неделя
2
3
4
5
6
100
100
99
99
98
99
99
98
97
96
99
98
96
96
94
99
99
98
97
97
99
99
98
98
97
100
100
100
98
98
100
100
99
99
98
100
100
98
97
97
100
100
99
99
98
100
100
99
99
99
100
100
99
97
97
100
100
99
98
98
100
100
99
98
98
100
100
99
98
98
100
100
99
99
98
100
100
98
98
98
100
100
99
99
99
100
100
98
97
97
7
98
96
94
96
96
98
98
97
98
98
97
97
97
97
98
97
99
96
Пшеница
Соя
100
100
100
100
100
100
99
99
99
99
99
99
99
98
Эффективность
инициации
каллусогенеза, %
Далее в течение 7-ми недель определяли эффективность стерилизации
эксплантов, чтобы оценить наличие остаточной внешней и внутренней инфекции после оптимальной стерилизации (70 %-м этанолом и УЗ в оптимальных
режимах) на разных носителях (таблица 3). По результатам в таблице 3 можно
сказать, что МКЦ, МХПЦ и F-24 позволяли сохранять 100 %-ю стерильность
эксплантов всех культур более длительно (до 3-х недель), чем агар (1 неделя).
Затем, по эффективности инициации каллусогенеза определяли результативные типы эксплантов для всех культур, наибольшее количество которых на
срезе образовали первичные каллусы желтовато-бежевого цвета в течение 7-ми
суток культивирования на питательной среде МС на всех носителях (агар,
МКЦ, МХПЦ, F-24) (рисунок 1).
100
50
0
Агар (контроль)
Горох
Гречиха
МКЦ
Картофель
МХПЦ
Пшеница
F-24
Соя
Продолжительность культивирования – 7 сут,
Температура (25±2) С, в темноте, влажность 70 %.
Питательная среда МС: 0,5 мг/л кинетина, 2 мг/л 2,4-Д
Экспланты: гречиха, горох, соя – гипокотиль; картофель, пшеница – меристемы
Рисунок 1 – Зависимость эффективности инициации каллусогенеза
от типа носителя
Из диаграммы на рисунке 1 видно, что эффективность инициации каллусогенеза на носителях МКЦ, МХПЦ, F-24 на 1-13 % ниже, чем на агаре. Однако, при культивировании на них достаточно долить новую жидкую питательную среду, состав которой соответствует стадии процесса. Замена носителя и
пересев при этом не требуется. Рыночная стоимость агара в 4,2 раза превышает
стоимость МХПЦ и F-24 и в 33,5 раза дороже МКЦ, поэтому замена агара на
МКЦ, МХПЦ и F-24 позволит снизить стоимость готового продукта.
Стадия выращивания культуры растительных клеток и тканей
in vitro. Оценку эффективности каллусогенеза в культуре растительных клеток
и тканей in vitro в питательной среде МС на агаре и структурированных носителях с УЗ-обработкой и без нее проводили в течение 4-х недель культивирования. Лучшие результаты в оптимальных режимах, представлены на рисунке
2.
Эффективность
каллусогенеза,
%
100
50
0
Агар (контроль)
МКЦ
МХПЦ
Горох
Гречиха
Картофель
Пшеница
F-24
Соя
Продолжительность культивирования – 4 нед.
Экспланты: гречиха, горох, соя – гипокотиль; картофель, пшеница – меристемы
Температура (25±2) С, в темноте, влажность 70 %
Рисунок 2 – Зависимость эффективности каллусогенеза in vitro
от типа носителя питательной среды МС
Результаты на рисунке 2 показывают, что для всех культур клеток и тканей in vitro на выбранных носителях наблюдается рост биомассы каллуса, следовательно, возможна замена носителя агара среды МС на МХПЦ, МКЦ и F24. При этом неорганический носитель F-24 уступает целлюлозосодержащим
МХПЦ и МКЦ. Для гороха (70 %) и гречихи (45 %) был лучшим МХПЦ, для
картофеля (55 %) и сои (40 %) – МКЦ, а для пшеницы одинаковые результаты
(40 %) – на МКЦ и МХПЦ.
Эффективность
каллусогенеза, %
Стадия каллусогенеза в симбиозе культуры растительных клеток и
тканей in vitrо с метилобактериями Methylobacterium mesophilicum. Культивирование растительного каллуса проводили с использованием метилобактерий Methylobacterium mesophilicum В-3352. Учитывали их способность к азотфиксации и синтезу фитогормонов, а также синтез метанола растительными
клетками для метилобактерий, не добавляя их в среду МС.
На рисунке 3 в динамике показано влияние симбиоза с метилобактериями на эффективность каллусогенеза в клеточных культурах гороха in vitro на
безгормональной среде МС без метанола, с азотом и без него.
100
80
60
40
20
1
с азотом
2
3
4
5
6
7
Продолжительность культивирования, сутки
без азота
контроль с азотом
контроль без азота
Питательная среда МС без гормонов.
Температура (25±2) С, в темноте, влажность 70 %.
Контроль – клеточная культура гороха без метилобактерий:
на среде МС с азотом – 20 % и без азота с метилобактериями – 55 %
Рисунок 3 – Зависимость эффективности каллусогенеза в клеточных
культурах гороха in vitro в симбиозе с метилобактериями от наличия
источников неорганического азота в среде МС на агаре
Каллусогенез в симбиотических клеточных культурах гороха на безгормональной среде МС говорит о том, что метилобактерии синтезировали необходимые фитогормоны, а на среде МС без источников неорганического азота
это подтверждает также проявление азотфиксирующей способности метилобактерий в симбиозе с культурой клеток гороха in vitro. Причем симбиотические культуры на среде без азота показали более высокую эффективность каллусогенеза, чем культуры на среде с неорганическим азотом. С другой стороны, растительные клетки синтезировали метанол, обеспечивший в симбиозе
рост метилобактерий. Подобные результаты получены для всех растительных
культур in vitro.
Выявленные оптимальные режимы размножения симбиотической
каллусной биомассы in vitro применяли при промышленном получении биопрепаратов разного действия.
Стадия получения биопрепаратов из растительной клеточной
культуры с метилотрофными бактериями Methylobacterium mesophilicum
Получение биопрепаратов стимулирующего и азотфиксирующего
действия. К неспецифическим стимуляторам относятся аминокислоты и олигопептиды, которые могут быть получены при депептонизации белков сырья
под воздействием внешних факторов, таких как УЗ (таблица 4).
Таблица 4 – Режимы разрушения общего белка до аминокислот в
экстрактах из эксплантов
Культура
Гречиха
Горох
Картофель
Пшеница
Соя
Тип
экспланта
Гипокотиль
корня
Меристемы
Гипокотиль
корня
Меристемы
Гипокотиль
корня
Меристемы
Гипокотиль
корня
Меристемы
Гипокотиль
корня
Меристемы
УЗ-обработка
про
должительность,
мин
Гидромодуль
Концентрация
этанола,
%
мощность,
Вт
1:20
0
320
3
1:20
0
320
5
1:100
10
320
2
1:60
60
240
3
1:20
70
240
1
1:60
60
400
1
1:20
70
320
3
1:60
90
400
2
1:100
60
320
1
1:60
60
320
2
Массовая концентрация свободных аминокислот,
×10-4 мкг/мл
14,0
22,8
1,4
1,0
8,8
1,4
8,8
2,8
4,9
4,6
Сначала оценивали содержание общего белка в экстрактах из разных эксплантов всех культур с вариацией гидромодуля (1:20; 1:40; 1:60; 1:80; 1:100),
концентрации этанола (10-90 %) и режимов УЗ-обработки. Разрушение белков в
экстракте оценивали по изменению содержания общего белка и массовой концентрации свободных аминокислот в тех же экстрактах. При этом установили,
какие режимы УЗ-обработки приводят к максимальному извлечению общего
белка (таблица 2), а какие – к разрушению белка до аминокислот или олигопептидов (таблица 4).
Режимы, приведенные в таблице 2, использовались при получении и накоплении растительной клеточной биомассы в симбиозе с метилобактериями
на структурированных носителях, а режимы из таблицы 4 – на стадии экстрагирования при получении из них биопрепаратов стимулирующего и азотфиксирующего действия. Применяли оптимальные условия культивирования на
структурированных носителях, при которых отмечалось наибольшее накопление общего белка в растительной клеточной биомассе в симбиозе с метилобактериями на среде МС без азота (рисунок 3) с ежедневной УЗ-обработкой (режимы из таблицы 2).
Получение биопрепаратов гормонального действия. На первом этапе
изучали возможность замены синтетических стимуляторов роста в среде МС
на натуральные, полученные в виде экстрактов из различных частей растений.
В них оценили содержание основных минеральных элементов (таблица 5).
Таблица 5 – Оценка основных минеральных элементов в экстрактах растений
Наименование
элемента
Железо
Магний
Калий
Кальций
гречиха
83,00
2,50
258,00
7,74
325,00
9,75
700,00
21,00
горох
94,00
2,82
107,00
3,21
873,00
26,90
115,00
3,45
Содержание, мг/кг
картофель
90,00
2,70
23,00
0,69
568,00
17,04
100,00
3,00
пшеница
51,00
1,53
590,00
17,70
323,00
9,69
500,00
15,00
соя
96,70
2,90
226,00
6,78
160,70
4,82
348,00
10,44
Эффективность
каллусогенеза, %
По результатам таблицы 5 корректировали расход солей для приготовления модифицированной оптимальной среды МС. Учитывали также, что цитокинины синтезируются в корнях и способствуют росту надземных частей растения, а ауксины синтезируют стебли и листья для обеспечения роста корней.
При этом определяли зависимость эффективности каллусогенеза при иммобилизации на структурированных носителях от дозы гормонсодержащего экстракта, которую меняли от 5 до 50 % в модифицированной питательной среде
МС с УЗ. В качестве носителей использовали агар, МКЦ, МХПЦ, F-24 (рисунок 4). Изучалось влияние следующих факторов: содержание Fe, Mg, K, Ca,
ИУК, зеатин.
100
50
0
Агар (контроль)
Гречиха
Горох
МКЦ
МХПЦ
Картофель
Пшеница
F-24
Соя
Температура (25±2) С, в темноте, влажность 70 %
Оптимальная доза цитокининсодержащего экстракта – 10 %
Оптимальная доза ауксинсодержащего экстракта – 10 %
Оптимальная УЗ-обработка: гречиха - 320 Вт 5 мин, горох – 240 Вт 3 мин,
картофель – 400 Вт 1 мин, пшеница – 400 Вт 2 мин, соя – 320 Вт 2 мин
Рисунок 4 – Эффективность каллусогенеза на структурированных носителях
с натуральными фитогормонами в среде МС с УЗ
Анализ результатов на рисунке 4 показывает, что для натуральных фитогормонов при оптимальной дозе экстракта 10 % в среде МС замена агара на
МХПЦ и МКЦ дала лучшие результаты, чем на F-24, несмотря на содержащиеся в нем дополнительные минеральные компоненты Na, K, Ca, Fe и др.
(таблица 1).
УЗ в указанном оптимальном режиме позволил повысить эффективность
каллусогенеза для всех культур на агаре – от 3,4 до 16,7 %; на МКЦ – от 4,4 до
10 %; на МХПЦ – от 2,6 до 11,1 %; на F-24 – от 10 до 26 %.
Стадия получения препаративных форм.
При исследовании свойств структурированных носителей были оценены
технологические свойства сорбентов МКЦ, МХПЦ и F-24 (влажность, насыпная плотность, сорбционная емкость по воде, структура и набухаемость до и
после автоклавирования). Показана возможность многократного использования выбранных сорбентов, так как при автоклавировании (0,15 МПа в течение
1 ч) сохранялись структура частиц и их поверхности. Антимикробную активность показали: МКЦ– в отношении Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus, Methylobacterium mesophilicum; МХПЦ и F-24 – в отношении всех микроорганизмов, кроме Candida albicans.
Затем оптимизировали режимы получения разных товарных форм (сухих
гранулированных и таблетированных) биопрепаратов стимулирующего, гормонального и азотфиксирующего действия на МКЦ, МХПЦ и F-24, обогащенные биомассой растительных клеток и Methylobacterium mesophilicum.При этом
определили остаточную влажность (таблица 6) и количество жизнеспособных
клеток метилобактерий в сухом биопрепарате (рисунок 5).
Таблица
6
–
Оценка
количества
жизнеспособных
клеток
Methylobacterium mesophilicum после сушки биопрепаратов на основе симбиотической
растительной биомассы на структурированных сорбентах
Культура
Гречиха
Горох
Картофель
Пшеница
КОЕ/мл (×10-10)
Соя
Сорбент
МКЦ
МХПЦ
F-24
МКЦ
МХПЦ
F-24
МКЦ
МХПЦ
F-24
МКЦ
МХПЦ
F-24
МКЦ
МХПЦ
F-24
Продолжительность
сушки, мин
390
405
315
320
350
270
300
350
240
300
300
240
360
380
300
Количество жизнеспособных
клеток после сушки при
(45±1) °С, КОЕ/мл (×1010)
6,7
9,5
2,0
6,4
7,4
3,9
7,8
8,2
5,8
7,5
7,1
4,3
7,4
7,3
8,2
8
6
4
2
0
контроль
МКЦ
1
МХПЦ
2
F - 24
Варианты: 1 – температура сушки (35 ± 1) °С;
3
варианты
2 – температура сушки (45 ± 1) °С; 3 – температура сушки (55 ± 1) °С.
Контроль - количество клеток в препарате до сушки: МКЦ – 2,3 ×1010 КОЕ/мл;
МХПЦ – 2,2 ×1010 КОЕ/мл; F-24 - 2,1 ×1010 КОЕ/мл
Рисунок 5 – Зависимость количества жизнеспособных клеток Methylobacterium
Mesophilicum в сухом биопрепарате от типа носителя и режима сушки
Судя по количеству жизнеспособных клеток, лучшим режимом сушки
для всех типов носителей можно считать температуру 45 ºС в течение 300 мин.
Оценка активности полученных биопрепаратов азотфиксирующего, стимулирующего и гормонального действия показала увеличение энергии прорастания и способности прорастания семян, а также скорости роста корней и стеблей
гречихи, гороха, картофеля, пшеницы и сои.
Содержание фитогормонов в препаратах оценили путем биотестов по
длине корней и стеблей проростков, а также по результатам ВЭЖХ. При сравнении с эталоном на хроматограмме время удержания ауксина составляет
34 мин, а цитокинина (зеатин) – 14 мин.
Азотфиксирующую активность оценили по содержанию общего белка и
свободных аминокислот в стеблях, листьях и корнях проростков из семян после их обработки биопрепаратами.
Гранулирование и таблетирование проводили в сушилке-грануляторе
СГ-30. Режимы, отработанные на этой стадии, приведены в рекомендациях и
зарегистрированных изменениях к нормативной документации для ЗАО «Алтайвитамины» и ООО «Биоресурс».
Для получения таблетированной товарной формы гранулированную
форму обычно подвергают дроблению и перемешиванию с тальком и другими
скользящими материалами. В случае применения предлагаемых в работе
структурированных носителей стадия дробления и тальк не требуются из-за
свойств самих носителей. Таблетирование сухих препаратов на выбранных
носителях целесообразно осуществлять на таблеточном прессе РТМ-41. Активность полученных биопрепаратов оценена на прорастающих семенах использованных в работе сельскохозяйственных культур.
В четвертой главе приводятся практические приложения результатов
исследования и рассматриваются экологические и экономические перспективы
внедрения разработки. Сравнительный анализ показывает, что предлагаемая
технология с применением структурированных сорбентов позволяет перерабатывать различное сырье на 100 %, круглогодично нарабатывать его биомассу с
регулируемым биосинтезом в ней БАВ, не используя посевных площадей.
Что касается применения в технологии опасных веществ, то, судя по литературным данным, МКЦ применяется в качестве наполнителя в таблетированных фармацевтических препаратах, МХПЦ используется в медицине как
антимикробное средство, алюмоадсорбенты разрешены к применению в качестве сорбентов в вакцинах, а также для осветления в пищевой и бродильной
промышленности. Паспортные данные показывают, что они не содержат в
своем составе вредных компонентов, нормируемых в показателях химической
безопасности в СанПиН 2.1.4.1074. Кроме того, МКЦ – побочный продукт
производства хлопковой ваты; МХПЦ – продукт, полученный из линта – отхода при переработке хлопка в медицинскую марлю, либо отхода от производства хлопковой ваты. МКЦ, МХПЦ и F-24 являются биоразлагаемыми.
Экономические расчеты на ЗАО «Алтайвитамины» показали, что от реализации предложенного подхода и использования в технологии структурированных сорбентов уменьшаются производственные расходы: сырьевые на
14,7 % и энергетические на 19,3 %, а также транспортные расходы по доставке
потребителю, требования к складским помещениям, условиям хранения, и увеличивается срок хранения с одного месяца до одного года.
По предлагаемой в данной работе аппаратурно-технологической схеме
(рисунок 6) можно реализовать различные способы получения биопрепаратов:
поверхностный твердофазный, глубинный, в псевдоожиженном слое.
1 - приемный бункер; 2 - дозатор; 3 - циклоны; 4, 18- стерилизаторы воды; 5 - стерилизатор среды
Канеда; 6 - ферментер, емкость № 1 для выращивания метилобактерий; 7, 15 - фильтры тонкой
очистки; 8 - шлюзовые питатели; 9 - ультразвуковая установка; 10 - гомогенизатор; 11 - стерилизатор
среды; 12 - ферментер, емкость № 2 для выращивания растительной клеточной культуры;
13 - газодувки; 14 - фильтры грубой очистки; 16 - калориферы; 17 - увлажнители воздуха; 19 - аппарат
для приготовления раствора питательных солей; 20 - сборник культуры; 21 - транспортирующее
устройство; 22 - аппарат для сушки и измельчения; 23 - фильтр рукавный; 24 - вакуум-насос;
25 - бункер для сухой культуры; 26 - бункер-накопитель; 27 - смеситель-измельчитель;
28 - таблеточная машина; 29 - фасовочный автомат
Рисунок 6 – Аппаратурно-технологическая схема получения разных форм
биопрепаратов из растительных клеточных культур in vitro с метилотрофными
бактериями и без них на структурированных носителях с применением УЗ
Для получения, жидких и иммобилизованных на структурированных носителях биопрепаратов на основе растительной клеточной биомассы используются аппараты блока 1 (аппараты 1-3, 7-19).
Наращивание биомассы метилотрофных бактерий ведут в аппаратах блока 2 (аппараты 2-7, 13-17). Биопрепараты на основе растительной клеточной
биомассы с метилобактериями получают в аппаратах блока 1 и блока 2.
Для получения сухих порошкообразных, гранулированных и таблетированных форм биопрепаратов используют аппараты блока 3 (аппараты 3, 13, 16,
20-29).
В доказательство хороших технико-экономических перспектив приводятся следующие аргументы, отраженные в актах внедрения:
- разработанная аппаратурно-технологическая схема позволяет варьировать виды перерабатываемого растительного и микробного сырья, форму и
назначение выпускаемого биопрепарата, а также его активность;
- предложенная технология решает экологические проблемы, так как позволяет выпускать натуральные биопрепараты, является безотходной и предусматривает круглогодичную наработку стандартизованного растительного и
микробного сырья, не требующую посевных площадей, с использованием отходов других производств в рамках приоритетного направления рациональной
переработки растительного сырья.
ВЫВОДЫ
1. Проведена оценка технологических свойств структурированных сорбентов МКЦ, МХПЦ и F-24, определены условия и оптимальные режимы их
применения на каждой технологической стадии при замене агара и торфа, в
том числе способы иммобилизации на них растительных клеточных культур и
метилобактерий in vitro в симбиозе и без него, их культивирования и сушки.
2. Впервые показана антимикробная активность МКЦ, МХПЦ и F-24 по
их влиянию на жизнеспособность Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus
aureus, Bacillus cereus, Escherichia coli, Candida albicans, Methylobacterium
mesophilicum и установлено, что МХПЦ и F-24 имели наиболее выраженное
антимикробное действие. Это позволило на стадии получения клеточных культур in vitro ограничиться при стерилизации разных эксплантов из нативных
растений 70 %-м этанолом и УЗ в оптимальных режимах: для меристем и гипокотиля гречихи – 320 Вт, 1 мин; меристем и гипокотиля гороха – 160 Вт, 1 и
3 мин; меристем и гипокотиля картофеля и пшеницы – 240 Вт, 1 мин; меристем
и гипокотиля сои – 80 Вт, 3 и 2 мин.
3. Определены методика применения УЗ в стерильных условиях и оптимальные режимы на всех стадиях технологии получения биомассы in vitro растительных и симбиотических биопрепаратов стимулирующего, гормонального и
азотфиксирующего действия на выбранных носителях. Впервые показано, что
УЗ в щадящих режимах (80-320 Вт от 1 до 3 мин) стимулирует рост клеточной
биомассы и накопление в ней белка, а в более жестких (240-400 Вт от 1 до
5 мин) – регулирует в ее составе содержание стимуляторов и гормонов.
4. Оптимизированы питательные среды на всех стадиях технологии. Использование симбиоза метилобактерий Methylobacterium mesophilicum с растительными клеточными культурами in vitro при их росте на МКЦ, МХПЦ и F-24 с
добавлением экстрактов из разных частей нативных растений (оптимальная
доза в среде МС цитокининсодержащего и ауксинсодержащего экстрактов –
10 %) позволяет исключить из состава питательной среды МС синтетические
гормоны роста, азотсодержащие компоненты, не добавлять метанол, и уменьшить содержание Fe, Mg, K, Ca.
5. Отработаны оптимальные режимы применения структурированных
сорбентов МКЦ, МХПЦ и F-24 на стадиях сушки (45 °С 300 мин), гранулирования и таблетирования биопрепаратов, обогащенных БАВ из растительного и
микробного сырья. Экономическими расчетами подтверждено, что это уменьшило производственные расходы: сырьевые – на 14,7 %, энергетические – на
19,3 %, а также увеличило срок хранения продукции с 1 месяца до 1 года за
счет уменьшения влажности товарной формы с 50 до 5 %. Оценка активности
полученных биопрепаратов азотфиксирующего, стимулирующего и гормонального действия показала увеличение энергии прорастания и способности прорас-
тания семян, а также скорости роста корней и стеблей гречихи, гороха, картофеля, пшеницы и сои.
6. Предложен научно обоснованный подход к разработке технологии гибкого многопродуктового производства блочного типа для получения разных товарных форм биопрепаратов (жидких и сухих порошкообразных, гранулированных,
таблетированных) стимулирующего, гормонального и азотфиксирующего действия из растительных клеточных культур (гречихи, пшеницы, гороха, сои, картофеля) in vitro в симбиозе с Methylobacterium mesophilicum и без него на структурированных сорбентах МКЦ, МХПЦ и F-24 с применением УЗ; разработана аппаратурно-технологическая схема по производству биопрепаратов в соответствии с
современными требованиями энерго- и ресурсосбережения, экологической безопасности, а также рекомендации по оптимизации и интенсификации каждой
стадии процесса с освоением технологии в цехе опытно-промышленного производства, позволяющей получать биопрепаратов до 320 т/г.
Основное содержание диссертационной работы изложено в публикациях:
В рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК:
1. Косолапова, А.С. Исследование влияния ультразвука на эффективность
стерилизации эксплантов сои, скорость роста и содержание общего белка и лигнина
в культуре клеток и тканей in vitro / А.С. Косолапова, М.Э. Ламберова, Е.П. Маркина, А.А. Ламберова // Ползуновский вестник. – 2006. – № 2-2. – С. 71 – 73, автора
– 0,05 п.л.
2. Косолапова, А.С. Разработка технологии иммобилизации культуры растительных клеток и тканей на целлюлозосодержащих наноструктурированных носителях in vitro / А.С. Косолапова, М.Э. Ламберова // Ползуновский вестник. – 2009.
– № 3. – С. 315 – 318, автора – 0,125 п.л.
3. Буянова, А.С. Исследование влияния ультразвука на отдельные стадии в
технологии культуры растительных клеток и тканей in vitro. I. Стерилизация эксплантов / А.С. Буянова, М.Э. Ламберова // Химия растительного сырья. – 2010. - №
2. – С.179-180, автора – 0,06 п.л.
4. Буянова, А.С. Исследование влияния ультразвука на отдельные стадии в
технологии культуры растительных клеток и тканей in vitro. II. Образование каллуса и его размножение / А.С. Буянова, М.Э. Ламберова // Химия растительного сырья. – 2010. - № 3. – С.189-190, автора – 0,06 п.л.
5. Буянова, А.С. Исследование влияния ультразвука на отдельные стадии в
технологии культуры растительных клеток и тканей in vitro. III. Биосинтез белков
сои / А.С. Буянова, М.Э. Ламберова // Химия растительного сырья. – 2012. - № 3. –
С.163-166, автора – 0,125 п.л.
6. Буянова, А.С. Исследование влияния ультразвука на отдельные стадии в
технологии культуры растительных клеток и тканей in vitro. IV. Биосинтез липидов
сои / А.С. Буянова, А.А. Ламберова, М.Э. Ламберова // Химия растительного сырья. – 2012. – № 3. – С.167-171, автора – 0,1 п.л.
7. Буянова, А.С. Исследование антимикробных свойств структурированного
целоформа / А.С. Буянова, А.А. Ламберова, М.Э. Ламберова, С.С. Ксембаев, В.К.
Половняк // Научно-технический Вестник Поволжья. – 2012. – № 3. – С.13-17, автора – 0,06 п.л.
Патенты и заявки на выдачу патентов РФ:
8. Пат. 2324338 Российская Федерация, МПК A01H4/00 C12N5/04. Способ
получения биомассы in vitro / А.С. Косолапова, М.Э. Ламберова, В.Н. Хмелев, А.А.
Ламберова, А.Н. Хмелева; заявитель и патентообладатель Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова. – № 2007103055/13; заявл.
25.01.2007; опубл. 20.05.2008, Бюл. № 14 – 7 с.: ил, автора – 0,0875 п.л.
Прочие публикации и материалы конференций:
11. Kosolapova, A.S. Ultrasonic application during reception of biostimulators
from vegetative raw material for cells and tissue culture in vitro / A.S. Kosolapova, M.E.
Lamberova // International Workshops and Tutorials on Electron Devices and Materials
EDM 2009: Workshops Proceedings. – Novosibirsk: NSTU, 2009. – P.212 – 218, автора
– 0,22 п.л.
12. Косолапова, А.С. Получение c помощью ультразвука стимуляторов
роста из картофеля сорта «Луговской» и применение их в культуре клеток и
тканей in vitro, иммобилизованной на МКЦ / А.С. Косолапова, М.Э.
Ламберова, Е.С. Карташова // Технология и оборудование химической,
биотехнологической и пищевой промышленности: сб. материалов II всерос.
науч.-практ. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. – Бийск: БТИ
АГТУ, 2009. – С.160-164, автора – 0,10 п.л.
13. Косолапова, А.С. Пути интенсификации процесса культивирования
клеток и тканей гречихи сорта «сибирячка» in vitro при иммобилизации на
целоформе / А.С. Косолапова, М.Э. Ламберова, А.И. Давыдова // Технология и
оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности:
сб. материалов II всерос. науч.-практ. конф. студентов, аспирантов и молодых
ученых. – Бийск: БТИ АГТУ, 2009. – С.145-149, автора – 0,10 п.л.
14.
Косолапова,
А.С.
Применение
алюмоадсорбентов
для
иммобилизации культуры клеток и тканей сои сорта «Алтом» in vitro / А.С.
Косолапова, М.Э. Ламберова, И.В. Денисова // Технология и оборудование
химической, биотехнологической и пищевой промышленности: сб. материалов
II Всерос. науч.-практ. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых. –
Бийск: БТИ АГТУ, 2009. – С.150-154, автора – 0,10 п.л.
15. Косолапова, А.С. Исследование влияния ультразвука на накопление
общего белка в культуре клеток и тканей в гречихе in vitro / А.С. Косолапова,
М.Э. Ламберова // Пищевые технологии и биотехнология: материалы докл. X
междунар. конф. молодых ученых. – Казань: КГТУ, 2009. – С. 263-265, автора – 0,09
п.л.
16. Косолапова, А.С. Применение ультразвука в процессе получения
биостимуляторов из сои для культуры клеток и тканей in vitro / А.С.
Косолапова, М.Э. Ламберова // Новые достижения в химии и химической
технологии растительного сырья: сб. материалов IV Всерос. конф. - Барнаул:
АГУ, 2009. – Кн.II. - Ч. IV. – С.126-128, автора – 0,09 п.л.
17. Косолапова, А.С. Применение ультразвука в биотехнологии
культуры растительных клеток и тканей in vitro / А.С. Косолапова, М.Э.
Ламберова // Биотехнология: состояние и перспективы развития: сб. материалов V
Москов. междунар. конгресса. – М.: РХТУ, 2009. – Кн.1. – С.325-326, автора – 0,063 п.л.
18.
Косолапова,
А.С.
Применение
наноструктурированных
целлюлозосодержащих носителей в технологии культуры клеток и тканей in
vitro / А.С. Косолапова, М.Э. Ламберова // Юбилейная конференция БТИ
АлтГТУ: сб. материалов науч.-практ. конф. – Бийск: БТИ АГТУ, 2009. - С.349351, автора – 0,09 п.л.
19. Буянова, А.С. Исследование антибактериального действия
целоформа / А.С. Буянова, М.Э. Ламберова // Научное и экологическое
обеспечение современных технологий: сб. материалов VII республ. студен.
науч.-практ. конф. – Уфа: УГАЭС, 2010. – С.93-94, автора – 0,063 п.л.
20. Буянова, А.С. Бактерии рода Methylobacterium в симбиозе с
культурой клеток и тканей гороха in vitro / А.С. Буянова, М.Э. Ламберова,
Т.А. Кочнева // Пищевые технологии и биотехнологии: сб. материалов ХII
междунар. конф. молодых ученых. – Казань: КНИТУ, 2012. – С.156, автора –
0,021 п.л.
21. Буянова, А.С. Получение сухих стимулирующих биопрепаратов из метилотрофных бактерий в симбиозе с растительными клеточными культурами на наноструктурированных сорбентах / А.С. Буянова, М.Э. Ламберова, А.А. Ламберова,
Т.А. Кочнева // Биоматериалы и нанобиоматериалы: актуальные проблемы и вопросы безопасности: сб. материалов всерос. молодеж. науч. шк. – Казань: Отечество,
2012. – С.18, автора – 0,016 п.л.
Подписано в печать
. Формат 60x84 1/16.
Печать – ризография. Усл.п.л. 0,23. Уч.изд.л. 0,25. Тираж 100 экз. Заказ 0612.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа