close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО КАТИОННОГО ПЕПТИДА ВАРНЕРИНА ПРИ КАТЕТЕР-АССОЦИИРОВАННОЙ СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Литвинов Валерий Викторович
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ
АКТИВНОСТИ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО КАТИОННОГО ПЕПТИДА
ВАРНЕРИНА ПРИ КАТЕТЕР-АССОЦИИРОВАННОЙ
СТАФИЛОКОККОВОЙ ИНФЕКЦИИ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ
14.03.02 – патологическая анатомия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва - 2016
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении
высшего профессионального образования «Пермский государственный
медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Министерства
здравоохранения Российской Федерации
Научные руководители:
доктор медицинских наук,
профессор
кандидат медицинских наук,
доцент
Фрейнд Генриетта Герхардовна
Коробов Владимир Павлович
Официальные оппоненты:
Агеева Татьяна Августовна - доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО
Новосибирский государственный медицинский университет Минздрава России
кафедра патологической анатомии, профессор кафедры
Туманов Владимир Павлович - доктор медицинских наук, профессор, лауреат
Государственной премии РФ, ГБОУ ВПО Российский национальный
исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздрава
России, педиатрический факультет, кафедра патологической анатомии и
клинической патологической анатомии, профессор кафедры
Ведущая организация: ФГБНУ
морфологии человека» ФАНО
«Научно-исследовательский
институт
Защита диссертации состоится «___»_____________2016 г. в ____часов на
заседании диссертационного совета Д 208.040.01 при ГБОУ ВПО «Первый
Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова»
Минздрава России (119991 Москва, Трубецкая ул., д. 8, стр. 2).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Первый
Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова»
Минздрава России (119034, г. Москва, Зубовский бульвар, дом 37/1) и на сайте
организации: www.mma.ru
Автореферат диссертации разослан «___»______________2016 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук,
профессор
2
Салтыков Борис Борисович
Актуальность проблемы
Катетер-ассоциированные инфекции (КАИ) являются причиной более 60%
госпитальных бактериемий и до 37% всех нозокомиальных инфекций в
европейских странах (Mermel L. et al., 2001; Safdar N., Fine J., Maki D., 2005).
Важнейшим следствием бактериального обсеменения установленных пациентам
катетеров и имплантов является развитие сепсиса, частота которого по разным
источникам достигает 20-55% (Mermel L. et al., 2001; Warren D. et al., 2001; Bouza
E., 2004; Матвеева Е.Ю. и соавт., 2011; Бережанский Б.В., 2012).
В
последнее
время
интерес
исследователей
к
изучению
проблем
инфицирования имплантатов и катетеров связан с концепцией формирования
биопленок бактерий на искусственных поверхностях (Costerton et al., 1978, 1999),
как
своего
рода
защитного
механизма,
обеспечивающего
оптимальные
возможности развития при прикреплении их к поверхностям различных
материалов (Carper, H. T., et al., 1987; Knudsen, J. D., et al., 2000; Tsuji, M., M., et
al., 2003; Li, D., et al., 2008).
Моделирование КАИ чаще всего осуществляется на лабораторных мышах.
При этом работы, целью которых являлась морфологическая оценка окружающих
катетер тканей – немногочисленны (Rupp M.E., et al., 1999; Tsuji, M.M., et al.,
2003; Hanke M.L., et al. 2012). Учитывая выраженное повышение устойчивости
бактерий в биопленках к антибиотикам, для предупреждения образования таких
структур и их расщепления в последние годы интенсивно исследуются
возможности применения новых химических препаратов (Грузина В.Д., 2003;
Похиленко В.Д., Перелыгин В.В., 2011; Hancock R.E., et al. 1998).
В лаборатории биохимии развития микроорганизмов Института экологии и
генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН из сред культивирования
бактерий
S.
warneri
IEGM
KL-1
был
выделен
низкомолекулярный
антибактериальный катионный пептид варнерин. Молекулярная масса пептида
составляет 2999 Da, а в его составе обнаружено значительное количество остатков
лизина, что определяет выраженную катионную природу этого соединения и
3
высокое сродство к отрицательно заряженным поверхностям бактериальных
клеток.
In vitro установлено, что бактерицидный эффект варнерина во многом,
обусловлен – диссипацией мембранного потенциала клеток различных родов
грамположительных бактерий, которая проявляется с первых минут его
взаимодействия с бактериальной клеткой (Коробов В.П. и соавт., 2010, 2011).
Однако до сих пор практически не исследованы особенности морфологических
проявлений местных воспалительных реакций при КАИ с экспериментальной
оценкой
возможности
применения
низкомолекулярных
катионных
антибактериальных пептидов природного происхождения, для подавления
развития и функционирования биопленок на поверхностях имплантируемых
медицинских устройств.
Цель исследования - морфологическая характеристика модели катетерассоциированной инфекции у лабораторных мышей с оценкой эффективности
использования низкомолекулярного катионного антибактериального пептида
варнерина.
Задачи исследования:
1) Создать модель катетер-ассоциированной стафилококковой инфекции у
лабораторных мышей.
2) Изучить особенности местных воспалительных реакций на имплантацию
катетеров, покрытых биопленками стафилококков, и при введении взвесей
стафилококков в область имплантации отрезков стерильных катетеров.
3) Оценить влияние обусловленной циклофосфамидом иммуносупрессии на
проявления
местной
воспалительной
реакции
окружающих
отрезки
катетеров тканей при различных условиях моделирования катетерассоциированной инфекции.
4) Провести
морфологическую
антибактериального
моделирования
пептида
оценку
эффективности
варнерина
катетер-ассоциированной
мышей.
4
при
инфекции
использования
различных
у
видах
лабораторных
Научная новизна исследования
Разработана новая модель катетер-ассоциированной инфекции лабораторных
мышей при различных условиях инфицирования отрезков сосудистых катетеров с предварительно выращенными на фрагментах катетеров двухсуточными
биопленками стафилококков и при введении взвесей стафилококков в области
имплантации катетеров.
Проведена
сравнительная
морфологическая
оценка
характерных
воспалительных реакций тканей окружающих отрезки катетеров с биопленками
стафилококков, а также при однократном и многократном введениях взвесей
стафилококков в зону имплантации отрезков стерильных катетеров.
Установлены морфологические особенности воспалительной реакции в виде
низкого содержания основных клеточных элементов в тканях, окружающих
отрезки
стерильных
катетеров,
и
интенсивного
роста
скоплений
микроорганизмов при моделировании катетер-ассоциированной инфекции в
условиях иммуносупрессии циклофосфамидом.
Впервые проведено изучение местной воспалительной реакции тканей
мышей в области имплантации отрезков стерильных катетеров до и после
применения низкомолекулярного катионного пептида варнерина. Доказана
эффективность использования варнерина для подавления как предварительно
сформированных на отрезках катетеров биопленок стафилококков, так и в
условиях in vivo при введении бактериальных взвесей в области имплантации
стерильных отрезков катетеров.
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработанная модель катетер-ассоциированной инфекции может быть
использована
для
изучения
эффективности
использования
различных
антибактериальных препаратов для предупреждения формирования, подавления
развития и функционирования биопленок коагулазонегативных стафилококков.
Важным элементом моделирования катетер-ассоциированной инфекции у
лабораторных мышей являлась необходимость супрессии их иммунной системы.
5
На
лабораторных
моделях
выявлена
эффективность
использования
низкомолекулярного катионного пептида варнерина как для предупреждения
образования, так и для ингибирования развития на сосудистых катетерах
биопленок коагулазонегативных стафилококков.
Положения диссертации, выносимые на защиту
1. Исследованиями морфологических проявлений воспалительных реакций
лабораторных животных (белые мыши) на имплантацию стерильных
отрезков сосудистых тефлоновых катетеров, а также со сформированными
на них биопленками бактерий S.epidermidis 33, и при введении взвесей этих
бактерий непосредственно в зону локализации отрезков стерильных
катетеров установлено, что экссудативная фаза воспаления наиболее
выражена при введении бактериальных суспензий непосредственно в ткани,
окружающие импланты.
2. Формирование скоплений бактерий непосредственно на поверхностях
отрезков катетеров наиболее выражено при иммуносупрессивном действии
циклофосфамида.
3. Подавление иммунных реакций циклофосфамидом приводит к отчетливым
различиям морфологических проявлений воспалительных реакций в разные
сроки моделирования катетер-ассоциированной инфекции. Разработанная
экспериментальная модель может быть полезной при исследовании
антибактериальных свойств различных препаратов.
4. Использование низкомолекулярного катионного пептида варнерина при
моделировании
катетер-ассоциированной
инфекции
мышей
ведет
к
уменьшению, вплоть до исчезновения, скоплений стафилококков в тканях,
окружающих катетер, что свидетельствует о проявлении выраженных
антибактериальных свойств этого низкомолекулярного катионного пептида
in vivo.
Степень достоверности и апробация результатов работы
Достоверность и обоснованность результатов и выводов диссертационной
работы подтверждается их репрезентативностью за счет изучения материалов
6
эксперимента от достаточного количества объектов исследования (88) с
использованием адекватных методов статистического анализа.
Апробация
работы
проведена
на
расширенном
заседании
кафедр
морфологического профиля ГБОУ ВПО «ПГМУ им. ак. Е.А. Вагнера» Минздрава
России 02.12.15 г. Материалы диссертационной работы докладывались и
обсуждались на Всероссийской конференции с международным участием
«Актуальные вопросы патологической анатомии» (Санкт-Петербург, 2011),
XXVII
международной
научно-практической
конференции
«Современная
медицина: актуальные вопросы» (Новосибирск, 2014); Юбилейной научнопрактической конференции, посвященной 40-летию ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ»
ФМБА России «Современные проблемы иммунофармакологии, биотехнологии и
цитокиновой регуляции» (Санкт-Петербург, 2014), Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием, посвященной 80-летию
кафедр патологической анатомии и патофизиологии БГМУ (Уфа, 2014),
ежегодных научных сессиях ПГМУ им. ак. Е.А.Вагнера (Пермь, 2012, 2013, 2014).
Связь работы с научными программами и собственный вклад автора
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГБОУ
ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е.А.Вагнера»
Минздрава России (номер государственной регистрации – 0120.0800814). Автор
лично участвовал в проведении экспериментов по созданию и использованию
модели катетер-ассоциированной инфекции у мышей. Весь представленный в
диссертации материал собран, обработан и проанализирован лично автором.
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 12 печатных работ, из них в
рецензируемых научных изданиях – 4, в других специализированных журналах и
изданиях – 1, в материалах международных конгрессов – 2, в сборниках
российских научных конференций – 5.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 142 страницах машинописного текста, состоит из
введения,
обзора
данных
литературы,
7
описания
материалов
и
методов
исследований, двух глав собственных исследований, обсуждения, выводов и
списка цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 11 таблицами, 68
рисунками. Библиографический список включает 224 источника, из них 53
отечественных и 171 зарубежных авторов.
Соответствие диссертации паспорту научных специальностей
Диссертация соответствует шифру научной специальности 14.03.02 –
патологическая анатомия, и области исследования согласно пунктам 3, 4.
Внедрение результатов исследования в практику
Результаты исследований включены в курсы лекций и практических
занятий на кафедре патологической анатомии с секционным курсом для
студентов ГБОУ ВПО «Пермский государственный медицинский университет
имени
академика
экспериментальная
Е.А.
Вагнера»
модель
Минздрава
катетер-ассоциированной
России.
Разработанная
инфекции
у
мышей
используется в научно-исследовательской работе лаборатории биохимии развития
микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Исследование одобрено локальным этическим комитетом Пермского
государственного медицинского университета им. ак. Е.А. Вагнера (протокол №3
от 25.03.15). Эксперименты выполнены на 88 самцах белых беспородных мышей
массой 25-30 г. Животных содержали в виварии Института экологии и генетики
микроорганизмов
Уральского
отделения
РАН1.
Все
манипуляции
с
лабораторными животными проводили в соответствии с правилами, принятыми
Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для
экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).
Процессы образования бактериями Staphylococcus epidermidis 33 биопленок
предварительно были изучены на венозных катетерах различных фирм.
Выражаю благодарность старшему научном сотруднику лаборатории биохимии развития
микроорганизмов института экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН
к.м.н. Л.М. Лемкиной за организацию и помощь в проведении экспериментов на животных
8
1
Результаты этих исследований показали, что формирование бактериальных
пленок наиболее интенсивно проявлялось на катетерах фирмы Apexmed
International (Нидерланды). Это послужило основой выбора катетеров данной
фирмы для использования в экспериментах на животных.
Животные были разделены на три группы: мыши без иммуносупрессии
(первая группа), мыши с иммуносупрессией циклофосфамидом (вторая группа) и
иммуносупрессированные мыши с изучением антибактериальных эффектов
варнерина (третья группа).
Наркотизированным животным (20% раствор Ксилазина «Interchemie»
Нидерланды 0,15 мл/кг веса) сбривали шерсть на участке спины и глазным
скальпелем делали прокол кожи. В образовавшийся раневой канал под кожу
имплантировали фрагменты пластиковых катетеров длиной 1.0 см и кожные
дефекты заклеивали медицинским клеем БФ-2. В зависимости от вида
предварительной обработки фрагментов катетеров животных в каждой группе
делили на подгруппы. Первой подгруппе животных имплантировали отрезки
стерильных катетеров. Второй подгруппе мышей - вводили отрезки катетеров с
предварительно
сформированными
на
них
биопленками
Staphylococcus
epidermidis 33, полученными инкубацией катетеров в суспензиях этих бактерий
(109 КОЕ/мл) в течение 48 ч при 37°C. Третьей подгруппе животных вводили
отрезки стерильных катетеров с последующим однократным подкожным
инокулированием в операционную рану 0,5 мл суспензии бактерий Staphylococcus
epidermidis 33, содержащей 109 КОЕ/мл. Четвертой подгруппе мышей - отрезки
стерильных катетеров с последующим ежесуточным в течение трех дней
введением в операционную рану 0,5 мл бактериальной суспензии той же
концентрации.
Для формирования иммуносупрессивного состояния животным второй
группы внутримышечно вводили циклофосфамид («Veropharm», Россия) в дозе
200 мг/кг ежедневно в течение пяти суток. Выбор данной дозы был обусловлен
наибольшим изменением веса вилочковой железы у мышей того же веса и
возраста, выявленным нами в предварительных экспериментах.
9
В экспериментах использовали препарат низкомолекулярного катионного
пептида варнерина серии 54 (лаборатория биохимии развития микроорганизмов
ИЭГМ УроРАН) с активностью 512 тысяч условных единиц (128 мг/мл). Часть
отрезков катетеров подвергали предварительному инкубированию в растворе
варнерина для сорбции на них пептида. В зависимости от особенностей
предварительной обработки отрезков катетеров и способов применения варнерина
животные были разделены на четыре подгруппы. Животным первой подгруппы
имплантировали стерильные отрезки катетеров, предварительно обработанные
варнерином. Животным второй подгруппы подкожно вводили отрезки катетеров
со сформированными на них in vitro биопленками S. epidermidis 33 и в те же зоны
ежесуточно вводили стерильный водный раствор варнерина в количестве 1 мл. В
третьей подгруппе животным вводили предварительно обработанные пептидом
отрезки стерильных катетеров, с последующим однократным инокулированием в
операционную рану бактериальных суспензий в количестве – 0.5 мл (109 КОЕ/мл).
Животным четвертой подгруппы
вводили отрезки стерильных катетеров с
последующим ежесуточным инъекцированием в операционные раны суспензий
бактерий S. epidermidis 33 в количестве 0.5 мл и одновременно в эту же зону
ежесуточно вводили раствор варнерина в количестве 1 мл.
Объектами морфологических исследований являлись участки мягких тканей
области имплантации отрезков катетеров. Забор материала для гистологического
исследования
производили
в
конце
первых,
вторых
и
третьих
суток
экспериментов. Ткани, извлеченные из зон локализации имплантированных
отрезков катетеров, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в
течение 24 ч. Далее материал обезвоживали, обезжиривали и заливали в парафин
по общепринятой методике (Автандилов Г.Г., 1994). С парафиновых блоков
готовили срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином,
пикрофуксином по ван Гизону, по Броун-Хоппсу и основным коричневым по
Шубичу. Для окрашивания микропрепаратов применяли растворы красителей,
приготовленные в соответствии с рекомендациями по гистологической технике
(Меркулов Г.А., 1969).
10
Схема моделирования катетер-ассоциированной инфекции
белых лабораторных мышей
Изучение процесса биопленкообразования на венозных катетерах
Первая группа
Интактные животные
Подгруппа 1
Имплантация
стерильных
катетеров
n=3
Подгруппа 2
Имплантация
катетеров с
биопленками
n=6
Подгруппа 3
Однократное
введение взвеси
бактерий в область
имплантации
отрезка катетера
n=6
Подгруппа 4
Ежесуточное
(3 суток) введение
взвеси бактерий в
область имплантации
отрезка катетера
n=4
Определение дозы циклофосфамида, вызывающего иммуносупрессию n=8
Вторая группа
Животные с иммуносупрессией
Подгруппа 1
Имплантация
стерильных
катетеров
n=9
Подгруппа 2
Имплантация
катетеров с
биопленками
n=6
Подгруппа 3
Однократное
введение взвеси
бактерий в область
имплантации
отрезка катетера
n=6
Подгруппа 4
Ежесуточное
(3 суток) введение
взвеси бактерий в
область имплантации
стерильного катетера
n=6
Третья группа
Животные с иммуносупрессией и применением варнерина
Подгруппа 1
Введение
животным
отрезков
катетеров
предварительно
обработанных
варнерином
n=6
Подгруппа 2
Ежесуточное
введение
варнерина в зону
имплантации
катетеров,
инфицированных
бактериальными
пленками
n=6
Подгруппа 3
Однократное
введение мышам
взвеси бактерий в
зону имплантации
предварительно
обработанных
варнерином
катетеров
n=6
11
Подгруппа 4
Ежесуточное
(3 суток) введение
взвеси бактерий и
варнерина в
область
имплантации
стерильного
катетера
n=6
Для иммуногистохимических исследований тканевые образцы фиксировали
в 10% растворе нейтрального забуференного формалина в течение 18-24 часов,
заливали
в
парафин
по
общепринятым
методикам,
а
затем
готовили
гистологические срезы толщиной 4-5 мкм. Использованные в исследованиях
моноклональные антитела были предназначены для работы с парафиновыми
срезами. Вариант обработки депарафинированных срезов выбирали в зависимости
от вида моноклональных антител с учетом инструкций фирмы-производителя.
Для
иммунного
пероксидазный
окрашивания
метод
и
использовали
соответствующий
стрептавидин-биотиновый
набор
детекции
(«Diagnostic
BioSystems», USA). Срезы инкубировали во влажной камере 60 минут при
температуре 37°C с моноклональными антителами к рецепторам клеток эндотелия
(CD34 - «Diagnostic BioSystems», USA), виментину (Vimentin - «Spring Bioscience»
USA), рецепторам макрофагов (CD68 - «Diagnostic BioSystems», USA),
рецепторам T-лимфоцитов (CD3 - «Diagnostic BioSystems», USA) и рецепторам Bлимфоцитов (CD20 - «Diagnostic BioSystems», USA). В качестве хромогена
использовали тетрахлорид 3,3-диаминобендидина, входящий в вышеуказанный
набор детекции. Во всех случаях в течение 0,5-2 минут проводили докрашивание
ядер клеток гематоксилином Майера. Контрольные реакции выполняли без
первичных специфических антител.
В связи с особенностями исследуемого материала (воспалительный
инфильтрат
и
ткань
иммуногистохимического
вокруг
пластикового
исследования
оценивались
катетера)
результаты
полуколичественным
методом на основании наличия или отсутствия положительной окраски
соответствующих клеточных элементов инфильтрата и тканей вокруг катетера.
Так, положительный результат оценивали знаком «+», отрицательный знаком «-»,
промежуточный «+/-».
Морфометрические исследования гистологических образцов проводили
согласно основным принципам морфометрии (Автандилов Г.Г., 1990; Weibel E.R.
et al., 1979). На световом уровне стереометрические параметры тканей,
окружающих катетер, высчитывали при увеличениях микроскопа х400 или х1000
12
с использованием закрытой тестовой системы из 25 точек.
морфометрического
анализа,
выполненного
в
программе
Для проведения
Image
Pro+,
просматривали по 10 верифицированных полей зрения, оценивая соотношение
клеточного состава. Для оценки воспалительных реакций в тканях определяли
макрофагально-гранулоцитарный коэффициент, как соотношение количества
макрофагов к количеству нейтрофильных гранулоцитов в воспалительном
инфильтрате
(МФ/ГФ).
Просмотр
и
фотографирование
микропрепаратов
проводили на микроскопе Axioimager A1 («ZEISS», Германия) с использованием
цифровой фотокамеры Axiocam MRc5 («ZEISS», Германия).
Статистическую обработку результатов проводили на персональном
компьютере с помощью лицензионных программ статистической обработки
данных Statistica MS Excel и BioStat 5.8 на операционной системе Windows 7.
Поскольку распределение в группах исследования отличалось от нормального,
применялись методы непараметрической статистики. Достоверность различия
величин в группах по изучаемым факторам осуществляли с помощью критерия
Манна-Уитни для двух независимых выборок (при сравнении количественных
параметров). Различия сравниваемых величин считали достоверными при p≤0,05
(Гланц С., 1999).
Результаты экспериментальных исследований и их обсуждение
Первая
группа
животных:
моделирование
катетер-ассоциированной
инфекции у белых мышей с интактной иммунной системой
Имплантация
животным
отрезков
стерильных катетеров
(первая
подгруппа).
На первые сутки наблюдений в окружающих отрезки катетеров тканях
отчетливо проявлялась лейкоцитарная фаза воспалительного процесса, которая
характеризовалась выраженной инфильтрацией зоны расположения имплантата
нейтрофильными гранулоцитами, макрофагами и клетками лимфоцитарного ряда
с единичными тучными клетками и плазмоцитами (CD20+). На вторые и третьи
сутки, по сравнению с первыми сутками, наблюдалось увеличение количества
макрофагов среди нейтрофилов и лимфоцитов (макрофагальная фаза). На третьи
13
сутки в тканях зоны катетера регистрировалось также образование значительного
количества грануляционной ткани, состоящей из тонкостенных сосудов и тонких
коллагеновых волокон, незначительного количества фибрина, фибробластов, а
также макрофагов и лимфоцитов. Все это свидетельствовало о наступлении
фибропластической фазы воспаления. Данная патогистологическая картина и
сроки смены фаз являются характерными для развития воспалительных реакций
на инородные тела в мягких тканях, в том числе и у мышей, которые были
детально описаны ранее (Серов В.В., Пауков В.С., 1995; Майборода А.А., 2006).
Имплантация
животным
отрезков
катетеров
с
предварительно
выращенными на них биопленками бактерий S.epidermidis 33 (вторая подгруппа)
На поверхностях отрезков катетеров со вторых суток отмечались небольшие
скопления микроорганизмов. В
выраженность
воспалительной
отличие от данных первой подгруппы,
реакции
проявлялась
за
счет
увеличения
количества нейтрофилов, тучных клеток с достоверным возрастанием количества
фибробластов и толщины ограничительного вала, состоящего из волокон
соединительной ткани (Vimentin +) и фибрина (p<0,05 критерий Манна-Уитни).
Данные изменения, по-видимому, обусловлены особенностями иммунного ответа,
индуцированного присутствием бактериальных пленок в очаге воспаления.
Имплантация стерильных отрезков катетеров с однократным введением
взвеси стафилококков в зону имплантации (третья подгруппа)
Скопления микроорганизмов на наружной поверхности имплантированных
отрезков катетеров наблюдались в течение первых двух суток. Воспалительная
реакция
в
инфильтратом
этих
условиях
(нейтрофилы,
свидетельствующим
о
была
представлена
макрофаги,
выраженном
полиморфноклеточным
лимфоциты
воспалительном
(CD20+,
ответе
на
CD3+),
введение
бактериальных взвесей.
Имплантация отрезков стерильных катетеров с ежесуточным введением
в операционные зоны взвесей стафилококков (четвертая подгруппа)
Формирование и увеличение скоплений микроорганизмов наблюдалось на
наружных поверхностях отрезков катетеров в течение всех трех суток
14
экспериментов. В клеточном инфильтрате вокруг имплантов отмечалось
выраженное возрастание количества макрофагов (CD68+) с незначительным
изменением содержания нейтрофилов, в этих условиях наблюдались также слабая
фибропластическая реакция (Vimentin+), и небольшое количество тучных клеток.
Имеющиеся данные об особенностях развития катетер-ассоциированных
инфекции у иммунокомпрометированных больных (Мазуров В.И. и соавт., 2002;
Новицкий А.В. и соавт., 2009; Юркин А.К. и соавт., 2011; Pascual A. et al., 2002;
Blot F. et al., 2004), свидетельствуют о необходимости и подтверждают
целесообразность проведения специальных исследований с использованием
иммуносупрессированных животных.
Вторая
группа
животных:
моделирование
катетер-ассоциированной
инфекции белых мышей с иммуносупрессией
Имплантация
животным
отрезков
стерильных катетеров
(первая
подгруппа).
По сравнению с аналогичной подгруппой интактных животных, в образцах
тканей мышей при развитии иммуносупрессии отмечалась выраженная клеточная
реакция с преобладанием нейтрофилов и увеличением количества тучных клеток,
но резким снижением содержания лимфоцитов (CD3-, CD20-) и фибробластов
(рис. 1). Выявленные изменения содержания клеточных элементов в тканях
животных
этой
подгруппы
по-видимому
отражают
характер
иммуносупрессивного действия циклофосфамида, так как известно, что этот
препарат обладает стимулирующим эффектом в отношении гранулопоэза,
одновременно вызывая угнетение лимфопоэза (Malet-Martino M., et al. 1999).
Важно также отметить, что стимуляция гранулопоэза через некоторое время
сменяется его угнетением и развитием эффекта нейтропении (Malet-Martino M., et
al. 1999; Baumann F., Preiss R.J., 2001). Снижение количества фибробластов может
быть обусловлено также прямым лимфопеническим эффектом циклофосфамида и
его влиянием на иммунокомпетентные клетки, оказывающими регуляторное
влияние на фибробласты (Davies M., et al. 1992; Hogaboam C.M., et al., 1998).
15
8
*
Количество клеток в полях зрения
7
*
6
5
4
3
Фибробласты
2
Лимфоциты
1
0
1
2
3
1
Без иммуносупрессии
2
3
Иммуносупрессия
циклофосфамидом
Сутки
Рис. 1. Изменение количества фибробластов и лимфоцитов в клеточном инфильтрате при
имплантации отрезков стерильных катетеров на фоне иммуносупрессии.
* Различия достоверны (p<0,05), критерий Манна-Уитни
Имплантация отрезков катетеров с предварительно выращенными на них
биопленками стафилококков (вторая подгруппа)
Введение животным отрезков катетеров со сформированными на них in
vitro биопленками стафилококков приводит к их дальнейшему развитию in vivo со
значительным
возрастанием
скоплений
микроорганизмов
на
наружной
поверхности имплантов в течение последующих трех суток экспериментов.
Важно отметить в этих условиях увеличение в окружающих зонах количества
тучных клеток, а также уменьшение толщины ограничительного вала вокруг
отрезков катетеров, и резкое снижение к третьим суткам содержания в этой зоне
нейтрофилов (рис. 2).
Значительное
падение
в
этот
период
количества
нейтрофилов
и
превалирование макрофагов, вероятно, связано с нейтропеническим действием
циклофосфамида.
Известно,
иммунокомпетентными
что
клетками
в
условиях
медиаторов
дефицита
воспаления,
выделения
окружающее
биопленки пространство, характеризуется резким ограничением проникновения в
него гранулоцитов, функциональная активность которых в значительной степени
подавлена (Cassat J.E. et al., 2007; James D.B., 2008). Таким образом, все
16
перечисленные
выше
факторы,
по-видимому,
способствуют
увеличению
численности клеточных элементов биопленок с активным ростом скоплений
Количество клеток в полях зрения
стафилококков на поверхностях отрезков катетеров.
12
*
10
8
6
*
Нейтрофилы
4
Фибробласты
2
0
1
2
3
1
Без иммуносупрессии
2
3
Иммуносупрессия
циклофосфамидом
Сутки
Рис.2. Изменение количества нейтрофилов и фибробластов в клеточном инфильтрате вокруг
отрезков катетеров с биопленками S.epidermidis 33 на фоне иммуносупрессии
* Различия достоверны (p<0,05), критерий Манна-Уитни
Имплантация стерильных катетеров с однократным введением взвеси
стафилококков
в
окружающие
отрезки
катетеров
ткани
иммуносупрессированых мышей (третья подгруппа)
Принципиальных отличий от изменений, обнаруженных в аналогичной
подгруппе без иммуносупрессии, выявлено не было за исключением роста на
поверхностях отрезков катетеров скоплений микроорганизмов обусловленное
иммуносупрессивным действием циклофосфамида.
Имплантация отрезков стерильных катетеров с ежесуточным в течение
3 суток введением взвеси стафилококков в окружающие отрезки катетеров
ткани (четвертая подгруппа)
Отличия от аналогичной подгруппы животных без иммуносупрессии
заключались в продолжающемся росте скоплений микроорганизмов как снаружи,
так и в просветах отрезков катетеров. При этом со вторых суток отмечалось также
17
резкое снижение количества макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов (рис. 3). В
данном случае, очевидно, также проявлялись изменения, обусловленные
сочетанием
действия
как
самого
циклофосфамида,
так
и
массивного
бактериального обсеменения зоны имплантации катетера.
Третья группа: моделирование катетер-ассоциированной инфекции на фоне
иммуносупрессии при введении животным низкомолекулярного катионного
пептида варнерина
Имплантация
стерильных
отрезков
катетеров,
предварительно
обработанных варнерином (первая подгруппа).
Подкожное введение обработанных варнерином отрезков катетеров,
приводит на первые сутки экспериментов к достоверному увеличению в
окружающих импланты тканях содержания количества нейтрофилов (рис. 4). На
третьи сутки в этих зонах иммуногистохимически отмечалось также наличие Т- и
В-лимфоцитов (CD3+. CD20+).
Известно, что антибактериальные пептиды помимо активации литического
разрушения бактерий, обладают непосредственным влиянием на защитные
механизмы организма хозяина, привлекая в очаг воспаления тучные клетки,
способствуя
миграции
нейтрофильных
гранулоцитов,
а
также
дифференцированных форм лимфоцитов (Hancock R.E., Diamond G., 2000; Ganz
T., 2001).
18
10
*
Количество клеток в полях зрения
9
8
7
6
5
Макрофаги
4
Нейтрофилы
3
Лимфоциты
2
*
1
*
0
1
2
3
1
Без иммуносупрессии
2
3
Иммуносупрессия
циклофосфамидом
Сутки
Рис. 3. Изменения количества макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов в клеточном
инфильтрате при ежесуточном введении взвесей стафилококков в область имплантации
отрезков катетеров на фоне иммуносупрессии
Количество нейтрофилов в полях
зрения
*Различия достоверны (p<0,05), критерий Манна-Уитни
12
*
10
8
6
Без варнерина
4
Варнерин
2
0
1
2
3
Сутки
Рис. 4. Изменение количества нейтрофилов в клеточном инфильтрате при имплантации
отрезков стерильных катетеров и введении варнерина
*Различия достоверны (p<0,05), критерий Манна-Уитни
19
Имплантация отрезков катетеров с предварительно выращенными
биопленками стафилококков и с ежесуточным введением варнерина (вторая
подгруппа)
В
данной
подгруппе
наблюдалось
увеличение
роста
скоплений
микроорганизмов на наружных поверхностях отрезков катетеров в течение всего
периода экспериментов. Отмечались также выраженные реакции со стороны
макрофагов (CD68+) и тучных клеток с резким снижением количества
нейтрофилов на третьи сутки. Ежесуточное введение варнерина со вторых суток
приводило к исчезновению скоплений микроорганизмов, а также к достоверному
возрастанию содержания нейтрофилов в инфильтрате зон локализации отрезков
катетеров (рис. 5). Важной особенностью результатов изучения данной
подгруппы животных является установление выраженного расщепляющего
бактериальные пленки действия варнерина.
МФ/ГФ коэффициент
1,2
1
0,8
0,6
Без варнерина
0,4
Варнерин
0,2
0
1
2
3
Сутки
Рис. 5. Изменение макрафагально-гранулоцитарного коэффициента при имплантации отрезков
катетеров с бактериальными пленками и ежесуточном введении варнерина
Имплантация
предварительно
обработанных
варнерином
отрезков
катетеров и однократное введение взвеси стафилококков (третья подгруппа).
При имплантации отрезков катетеров с сорбированным на их поверхности
варнерином выявлялись особенности клеточного состава окружающих импланты
тканей, которые проявлялись выраженным увеличением количества нейтрофилов
и
незначительным
изменением
количества
20
макрофагов.
Рост
скоплений
микроорганизмов в этой подгруппе также продолжался на протяжении всех
сроков эксперимента, в связи, с чем можно сделать вывод о слабом
антибактериальном эффекте варнерина при предварительной обработке пептидом
отрезков катетеров.
Имплантация отрезков стерильных катетеров с ежесуточным введением
взвесей стафилококков и варнерина (четвертая подгруппа)
Отмечался рост скоплений микроорганизмов снаружи и в просвете отрезков
катетеров, сопровождавшийся увеличением количества тучных клеток в составе
инфильтрата. Ежесуточное введение варнерина приводило к изменению состава
воспалительного инфильтрата с возрастанием количества
нейтрофильных
гранулоцитов, а также сопровождалось выраженной тенденцией к уменьшению
скоплений микроорганизмов.
Таким образом, использование варнерина как в виде инъекций, так и при
предварительной обработке им отрезков катетеров не оказывает значительного
влияния
на
клеточный
состав
окружающего
имплантаты
инфильтрата.
Ежесуточное введение варнерина в область имплантации отрезков катетеров с
биопленками, а также при одновременном введении взвеси стафилококков с
варнерином в область имплантации отрезков стерильных катетеров приводит к
резкому уменьшению, скоплений микроорганизмов на поверхностях имплантов.
ВЫВОДЫ
1. Разработана модель катетер-ассоциированной инфекции, позволяющая
оценить морфологические проявления воспалительных реакций зоны
имплантации отрезков катетера при различных условиях инфицирования
катетера.
2. Ответная реакция окружающих тканей на предварительно инфицированные
биопленками катетеры протекает с наличием относительно небольших
скоплений
стафилококков на поверхностях отрезков катетеров и
формированием выраженного ограничительного вала, состоящего из
фибрина и клеток воспалительного инфильтрата (нейтрофилы, макрофаги,
21
лимфоциты,
фибробласты).
Скопления
бактериальных
клеток
в
инфильтратах окружающих тканей и на поверхностях отрезков катетеров
наиболее выражены при ежесуточном введении бактерий в область
локализации импланта.
3. На
фоне
иммуносупрессии
при
ежесуточном
введении
взвесей
стафилококков в зону имплантации стерильных отрезков катетеров в
воспалительном инфильтрате отмечается незначительное содержание всех
основных клеточных элементов – макрофагов, нейтрофилов и лимфоцитов.
Скопления бактерий на имплантах и в окружающих их тканях наиболее
выражены при подавлении иммунных реакций циклофосфамидом с
формированием
воспалительных
инфильтратов
и
скоплений
микроорганизмов как снаружи, так и внутри просвета отрезков катетеров.
4. Ежесуточное введение низкомолекулярного катионного пептида варнерина
в область имплантации отрезков катетеров со сформированными на них
бактериальными пленками ведет к исчезновению скоплений стафилококков,
а при одновременном ежесуточном введении взвеси стафилококков и
варнерина
вызывает
уменьшение
бактериальной
обсемененности
поверхности имплантов. Использование варнерина при моделировании
катетер-ассоциированной инфекции приводит к увеличению количества
нейтрофилов в воспалительном инфильтрате.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. Разработанная модель катетер-ассоциированной инфекции у мышей может
быть использована для экспериментального изучения эффективности новых
лекарственных препаратов, направленных на подавление образования и
функционирования биопленок коагулазонегативных стафилококков на
имплантируемых изделиях из полимерных материалов.
2. Низкомолекулярный катионный пептид варнерин обладает выраженной
антибактериальной
активностью
в
отношении
биопленок
коагулазонегативных стафилококков при моделировании инфицирования
22
бактериями тканей вокруг катетеров, что подтверждается анализом
морфологических проявлений воспалительной реакции в окружающих
тканях.
3. Имплантация катетеров, предварительно обработанных варнерином, не
оказывает
выраженного
микроорганизмов
на
влияния
их
на
поверхностях,
образование
что
скоплений
свидетельствует
о
необходимости поиска путей повышения сорбции этого пептида на
поверхностях имплантируемых материалов.
ПУБЛИКАЦИИ
1. Морфологическая
оценка
состояния
мягких
тканей
вокруг
катетеров
при
моделировании катетер-ассоциированной инфекции / В.П. Коробов, Г.Г. Фрейнд, В.В.
Литвинов, Л.М. Лемкина, А.Р. Максимова // Четвертые научные чтения, посвященные
памяти член-корр. РАМН, з.д.н. РФ, профессора О.К.Хмельницкого «Актуальные
вопросы
патологической
анатомии»:
Сборник
научных
трудов
Всероссийской
конференции с международным участием. СПб. - 2011. – С. 116-118.
2. Экспериментальные подходы к созданию модели катетер-ассоциированной инфекции
обусловленной биопленками стафилококков / В.В. Литвинов, Л.М. Лемкина, Г.Г.
Фрейнд, В.П. Коробов // Вестник уральской медицинской академической науки. –
2011. - Том 38, №4-1. - С. 106-107.
3. Морфологическая
оценка
модели
катетер-ассоциированной
инфекции
на
фоне
иммуносупрессии / В.В. Литвинов, Л.М. Лемкина, Г.Г. Фрейнд, Э.В. Яковлева, В.П.
Коробов, Н.М. Никонова // Материалы IV Всероссийского съезда патологоанатомов:
Сборник научных трудов Всероссийской конференции с международным участием.
Белгород. – 2013. – С. 77-78.
4. Морфологическая характеристика действия низкомолекулярного катионного пептида
варнерина на модели катетер-ассоциированной инфекции в условиях иммуносупрессии /
В.В. Литвинов, Л.М. Лемкина, Г.Г. Фрейнд, В.П. Коробов // Современная медицина:
актуальные вопросы: Сборник статей по материалам XXVII международной научнопрактической конференции. Издательство «СибАК». Новосибирск. – 2014. - № 1 (27). –
С. 114-120.
5. Морфологическая оценка катетер-ассоциированной инфекции в эксперименте / В.В.
Литвинов // Пермский медицинский журнал. – 2014. – Том 31, №2. - С. 109-116.
23
6. Морфологическая
характеристика
модели
катетер-ассоциированной
инфекции
в
условиях иммуносупрессии на фоне действия низкомолекулярного катионного пептида
варнерина / В.В.Литвинов // Фундаментальные исследования. – 2014. - №7. - С. 92-96.
7. Возможности применения низкомолекулярных катионных пептидов при моделировании
катетер-ассоциированной инфекции / В.В. Литвинов, Л.М. Лемкина, Г.Г. Фрейнд, В.П.
Коробов // Актуальные вопросы патологической анатомии в мирное и военное время:
Сборник научных трудов Всероссийской конференции посвященной 155-летию кафедры
патологической анатомии Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова / ВМедА.
СПб. - 2014. – С. 138-140.
8. Морфологическая картина модели катетер-ассоциированной инфекции на фоне действия
низкомолекулярного катионного пептида варенрина / В.В. Литвинов, Л.М. Лемкина,
Г.Г. Фрейнд, В.П. Коробов // Актуальные вопросы патологоанатомической практики:
Материалы научно-практической патологоанатомической конференции Южного Урала
посвященной 30-летию основания Челябинского областного патологоанатомического
бюро. Издательство Южно-Уральского государственного медицинского университета.
Челябинск. – 2014. – С. 52-54.
9. Морфологическая характеристика модели катетер-ассоциированной инфекции / В.В.
Литвинов, Л.М. Лемкина, М.Л. Кононова, Г.Г. Фрейнд, В.П. Коробов // Медицинский
вестник Башкортостана. - 2014. – Том 9, №5. - С. 29-33.
10. Возможности
морфологической
оценки
антибактериальной
активности
низкомолекулярных катионных пептидов при катетер-ассоциированной инфекции в
эксперименте / В.В. Литвинов, Г.Г. Фрейнд, Л.М. Лемкина, В.П. Коробов // Здоровье,
демография, экология финно-угорских народов. – 2014. - №3. - С. 75-76.
11. Влияние циклофосфамида на клеточный состав инфильтрата вокруг катетера при
катетер-ассоциированной инфекции в эксперименте / В.В. Литвинов, Г.Г. Фрейнд, М.Л.
Кононова, Л.М. Лемкина, В.П. Коробов // Аллергология и иммунология. – 2014. Том 15,
№2. - С. 153.
12. Морфологическая оценка модели катетер-ассоциированной инфекции на фоне действия
низкомолекулярного катионного пептида варнерина / В.В. Литвинов, Л.М. Лемкина,
Г.Г. Фрейнд, В.П. Коробов // Цитокины и воспаление. – 2014. Том 13, №1. - С. 108.
24
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа